JPH11239430A - Transgenic mammal - Google Patents
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- JPH11239430A JPH11239430A JP10216410A JP21641098A JPH11239430A JP H11239430 A JPH11239430 A JP H11239430A JP 10216410 A JP10216410 A JP 10216410A JP 21641098 A JP21641098 A JP 21641098A JP H11239430 A JPH11239430 A JP H11239430A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明はトランスジェニック
哺乳動物に関する。より詳細には、ヒトの補体制御因子
(hDAF/CD55)の遺伝子を有するヒト以外のトランスジェ
ニック哺乳動物に関する。さらに詳細には、hDAFの遺伝
子を有する家畜及び実験動物に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a transgenic mammal. More particularly, human complement regulators
The present invention relates to a transgenic non-human mammal having the gene of (hDAF / CD55). More specifically, the present invention relates to livestock and experimental animals having the gene for hDAF.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、動物臓器をヒトへの移植（異種移
植）に供するための研究が欧米を中心に盛んになってき
ている。臓器を提供する動物としては、ヒトに最も近い
点でサルが好ましいが、サルは希少で知性の高い野生動
物であることから、サルの利用は困難な状況にある。そ
こで、家畜、中でも臓器サイズ、形態がヒトに近く、繁
殖や増産技術の確立しているブタの臓器を利用するため
の研究が主に行われるようになってきた。しかし、ブタ
の臓器をヒトに移植した場合には急激に（数分のうち
に）強い拒絶反応（超急性拒絶）が起こり、移植した臓
器は機能を失ってしまうことが知られている。このよう
な現象は一連の反応の結果として生じると考えられてい
る。即ち、（1）ヒトの血液中にはもともとブタの細胞
に対する抗体（自然抗体と呼ぶ）が存在するので、ヒト
の体内にブタの組織が移植されると、自然抗体がブタの
組織を認識し抗原抗体複合物が作られる。（2）抗原抗
体複合物はヒトの血清中に含まれる補体を活性化して補
体カスケード反応を惹起させる。即ち、その抗原抗体複
合物に補体成分C1が、続いてC4、C2が反応し、それらは
C3転換酵素を形成する。C3転換酵素はC3を活性化し、C3
bとC3aに分解する。C3bはブタ組織の細胞膜表面に結合
するとともに、C5転換酵素を形成することでC5を活性化
しC5bとC5aに分解する。C5bも膜に結合し、その後連続
的にC6、C7、C8、C9と補体分子は反応して行く。（3）
補体カスケード反応の結果として膜侵襲複合体（Membra
ne Attack Complex：MAC)が作られ（古典経路と称す
る）、MACが移植されたブタの臓器を侵襲すると共に血
栓も形成される。（4）また、古典経路と共に代替経路
と称する補体カスケード反応のあることも知られてい
る。代替経路の場合でも、C3ステップ以降は上記と同様
のカスケード反応が行われ、最終的にはMACが形成され
る。Miyagawa, S. ら（Transplantation, Vol.46(6), 8
25-830, 1988）はつぎのことを報告した；（1）異種移
植された臓器や器官の超急性拒絶は古典経路及び／又は
代替経路による補体カスケード反応の惹起により生じ
る；（2）CVF（cobravenom factor）の事前投与によりC
3を欠損させておけば超急性拒絶を生じない。これらの
ことから、C3ステップで補体カスケード反応を阻止する
膜結合型の因子であるDAF及び／又はMCP、特にレシピエ
ント種と同種のDAF及び／又はMCPを発現する動物の作成
が望まれていた。2. Description of the Related Art In recent years, research for providing animal organs for transplantation into humans (xenotransplantation) has been actively conducted mainly in Europe and the United States. Monkeys are preferred as animals that donate organs because they are closest to humans, but monkeys are rare and highly intelligent wild animals, so it is difficult to use monkeys. Therefore, research has been mainly conducted on using livestock, especially pigs, whose organ size and morphology are close to those of humans and whose breeding and production increasing techniques have been established. However, it is known that when a pig organ is transplanted into a human, a strong rejection (hyperacute rejection) occurs rapidly (within several minutes), and the transplanted organ loses its function. It is believed that such a phenomenon occurs as a result of a series of reactions. That is, (1) human blood originally contains antibodies against porcine cells (called natural antibodies). When porcine tissues are transplanted into the human body, the natural antibodies recognize the porcine tissues. An antigen-antibody complex is created. (2) The antigen-antibody complex activates complement contained in human serum to cause a complement cascade reaction. That is, complement component C1 reacts with the antigen-antibody complex, followed by C4 and C2,
Forms C3 convertase. C3 convertase activates C3,
Decomposes into b and C3a. C3b binds to the cell membrane surface of porcine tissue and activates C5 by forming C5 convertase, decomposing it into C5b and C5a. C5b also binds to the membrane, after which C6, C7, C8, C9 and the complement molecule react continuously. (3)
The membrane attack complex (Membra) as a result of the complement cascade reaction
A neat attack complex (MAC) is created (referred to as the classical pathway), which invades the transplanted pig organs and forms a thrombus. (4) It is also known that there is a complement cascade reaction called an alternative pathway together with the classical pathway. Even in the case of the alternative route, a cascade reaction similar to the above is performed after the C3 step, and finally a MAC is formed. Miyagawa, S. et al. (Transplantation, Vol.46 (6), 8
25-830, 1988) reported that (1) hyperacute rejection of xenografted organs or organs results from the initiation of the complement cascade by the classical and / or alternative pathways; (2) CVF ( pre-administration of cobravenom factor)
Deleting 3 will not cause hyperacute rejection. For these reasons, it is desired to produce an animal that expresses DAF and / or MCP, which is a membrane-bound factor that blocks the complement cascade reaction at the C3 step, and in particular, expresses DAF and / or MCP of the same species as the recipient species. Was.
【０００３】そこで、ブタの臓器にヒトのC3転換酵素を
分解する作用を有する補体制御因子であるhDAF（CD55）
を発現させたトランスジェニックブタの開発が試みられ
ている（A. M. Rosengardら、Transpalantaion, Vol.59
(9), 1325-1333, 1995：G. Byrneら, Transplantation
Proceedings, Vol.28(2), 759, 1996)。しかし、これら
のトランスジェニックブタが超急性拒絶反応を完全に抑
制することができるか否かは現在までのところ明らかに
なっていない。今後、1）必要な組織に必要な量のhDAF
が発現できているか、2）hDAF以外の別の補体制御因子
の複合発現が必要でないか、さらには3）ブタ細胞上に
発現されていてヒトの自然抗体が結合する抗原（糖鎖抗
原）を減少させる働きを有する糖転移酵素遺伝子の発現
が必要ではないか、4）上記の遺伝子群及びそれら以外
の遺伝子、例えば血栓の形成を阻害する働きを有する蛋
白質をコードする遺伝子を同時に発現させることが必要
ではないか等を検討する必要がある。即ち、超急性拒絶
抑制方法を開発のためには、解明すべき課題が多く残さ
れている。[0003] Therefore, hDAF (CD55), a complement control factor having the action of decomposing human C3 convertase in pig organs, has been developed.
Development of transgenic pigs that express E. coli (AM Rosengard et al., Transpalantaion, Vol. 59).
(9), 1325-1333, 1995: G. Byrne et al., Transplantation.
Proceedings, Vol.28 (2), 759, 1996). However, whether these transgenic pigs can completely suppress hyperacute rejection is not known to date. In the future, 1) the required amount of hDAF for the required organization
Has been expressed, 2) does not require complex expression of another complement control factor other than hDAF, and 3) an antigen (sugar chain antigen) that is expressed on porcine cells and binds human natural antibodies 4) Simultaneous expression of the above genes and other genes, for example, a gene encoding a protein having a function of inhibiting the formation of thrombus, It is necessary to consider whether or not it is necessary. That is, in order to develop a method for controlling super-acute rejection, there are many problems to be elucidated.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】上述の不明な点を解決
するためには、ブタ及び／又はブタより取り扱い易い小
型の実験モデル動物を開発して、種々の検討をすること
が急務である。とりわけ、目的とする臓器や組織に少な
くともヒトと同レベル以上のhDAFを発現するトランスジ
ェニックブタの開発及び／又はブタより取り扱い易い小
型の実験モデル動物の開発は、この分野の研究の遂行上
及び／又は臨床応用法の開発上、有用と考えられる。そ
こで、上述のように、これまでもヒトの補体制御因子を
発現するトランスジェニックブタの開発が試みられてき
ている。そして、その発現は、(1)免疫組織学的方法等
のin vitro試験、(2)トランスジェニックブタの組織を
ヒト血液と接触させるex vivo試験、又は(3)トランスジ
ェニックブタの組織を霊長類に移植するin vivo試験な
どにより確認されている。トランスジェニックブタの組
織をexvivo試験やin vivo試験に供した場合には、非ト
ランスジェニックブタの組織を試験に供した場合に比べ
て、機能保持時間を延長できることが確認されている。
但し、これらのトランスジェニックブタの組織に発現さ
れているヒト補体制御因子の量がヒトの組織に発現され
ている量に比べて同程度かそれ以上であるかについては
必ずしも明確にされていない。In order to solve the above-mentioned unclear points, it is urgently necessary to develop pigs and / or small experimental model animals which are easier to handle than pigs and to carry out various studies. In particular, the development of transgenic pigs that express hDAF at least at the same level or higher than that of humans in target organs and tissues and / or the development of small experimental model animals that are easier to handle than pigs are necessary in conducting research in this field and / or Or, it is considered useful in the development of clinical application methods. Therefore, as described above, the development of transgenic pigs expressing human complement regulatory factors has been attempted. Its expression is determined by (1) in vitro tests such as immunohistological methods, (2) ex vivo tests in which transgenic pig tissues are brought into contact with human blood, or (3) transgenic pig tissues in primates. Has been confirmed by in vivo tests, etc. It has been confirmed that when the tissue of a transgenic pig is subjected to an exvivo test or an in vivo test, the function retention time can be extended as compared with the case where the tissue of a non-transgenic pig is subjected to the test.
However, it is not always clear whether the amount of human complement regulator expressed in the tissues of these transgenic pigs is equal to or greater than the amount expressed in human tissues. .
【０００５】また、これまでに報告されているヒト補体
制御因子遺伝子を発現するトランスジェニックブタを作
成するのに用いられた導入遺伝子コンストラクトのプロ
モーター遺伝子は、(1)ブタを起源とするものではなく
(G.A.Langfordら、Transplant. Proc., 26, 1400,1994;
W.L.Fodorら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1115
3-11157, 1994; G.W.Byrneら、Transplantation 63, 14
9-155, 1997)及び／又は(2)動物の体内の全組織的に分
布している分子に関連するプロモーター(例えば、β-ア
クチン、Ｈ２Ｋb）であった。一方、これまでにもhDAF
を発現するトランスジェニックマウスの開発が試みられ
てきている（N.Caryら, Transplantation Proceedings,
Vol.25(1), 400-401,1993; D.Kaganら, Transplantati
on Proceedings, Vol.26(3), 1242, 1994）。しかし、
開発されたトランスジェニックマウスのhDAFの発現部
位、発現量は、報告例ごとに異なり、厳密に言えば、ヒ
トの補体制御因子を本来、発現しおくべき部位（特に、
血管内皮細胞）にヒトで発現している量を上回るレベル
で発現させたトランスジェニックマウスは開発されてい
なかった。[0005] In addition, the promoter gene of the transgene construct used to prepare transgenic pigs expressing the human complement regulatory factor gene, which has been reported so far, has the following (1) originating from pigs. Without
(GALangford et al., Transplant. Proc., 26 , 1400, 1994;
WLFodor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 , 1115.
3-11157, 1994; GWByrne et al., Transplantation 63 , 14
9-155, 1997) and / or (2) promoters associated with molecules that are systematically distributed throughout the body of the animal (eg, β-actin, H2K b ). On the other hand, hDAF
The development of transgenic mice that express E. coli has been attempted (N. Cary et al., Transplantation Proceedings,
Vol. 25 (1), 400-401, 1993; D. Kagan et al., Transplantati
on Proceedings, Vol.26 (3), 1242, 1994). But,
The expression site and amount of hDAF in the transgenic mouse developed differ from report to report, and strictly speaking, the site where human complement regulatory factor should be expressed (especially,
Transgenic mice expressing vascular endothelial cells at levels higher than those expressed in humans have not been developed.
【０００６】上記課題を解決するために、本発明者らは
補体制御因子が本来発現されるべき器官、臓器、組織や
細胞、特に血管内皮細胞にhDAFを発現したトランスジェ
ニック動物、特にヒト以外の哺乳動物の作製を検討し
た。その結果、本発明者らが先に発明したブタ補体制御
因子（pMCP）プロモーター（特願平9-142961号参照）を
用い、補体制御因子が本来発現されるべき器官、臓器、
組織や細胞、特に血管内皮細胞にhDAFを発現するように
考案した遺伝子を動物の受精卵に導入し、レシピエント
母親動物の卵管又は子宮に移植し、出産させることによ
り所期の目的を達成するトランスジェニック動物を作製
できることが判明した。また、後記の実施例でも示され
るように、本発明のトランスジェニックマウスの場合に
は、hDAFが各種の臓器、組織、その血管内皮細胞と共
に、赤血球並びに中枢及び末梢神経にも発現されてお
り、発現量はヒトの細胞の発現量以上であった。更に、
本発明のトランスジェニックブタの場合にも、赤血球や
神経にもhDAFが発現していることが確認された。本発明
は係る知見に基づいてなされたもので、本発明は医学や
薬学の分野で有用なトランスジェニック動物を提供する
ことを目的とする。[0006] In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have proposed a transgenic animal in which hDAF is expressed in organs, organs, tissues and cells, particularly vascular endothelial cells, in which a complement control factor is to be expressed. The preparation of mammals was studied. As a result, using the porcine complement control factor (pMCP) promoter invented by the present inventors (see Japanese Patent Application No. 9-142961), organs, organs, in which complement control factors should be originally expressed,
Achieve the intended purpose by introducing a gene designed to express hDAF into tissues and cells, especially vascular endothelial cells, into the fertilized egg of the animal, transplanting it into the oviduct or uterus of the recipient mother animal, and giving birth It has been found that transgenic animals can be produced. Further, as shown in the Examples below, in the case of the transgenic mouse of the present invention, hDAF is expressed in various organs, tissues, vascular endothelial cells, erythrocytes and central and peripheral nerves, The expression level was higher than that of human cells. Furthermore,
In the case of the transgenic pig of the present invention, it was confirmed that hDAF was also expressed in red blood cells and nerves. The present invention has been made based on such findings, and an object of the present invention is to provide a transgenic animal useful in the fields of medicine and pharmacy.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明の要旨は、 ヒトの補体制御因子（DAF/CD55）の遺伝子を有し、
当該ヒトの補体制御因子を臓器・組織に発現しているヒ
ト以外のトランスジェニック哺乳動物； ヒトの補体制御因子（DAF/CD55）を血管内皮細胞に
発現している上記記載のトランスジェニック哺乳動
物； ヒトの補体制御因子（DAF/CD55）を全臓器・組織の
血管内皮細胞に発現している上記又は記載のトラン
スジェニック哺乳動物； ヒトの補体制御因子（DAF/CD55）の遺伝子の上流側
にブタ補体制御因子（pMCP）プロモーターを有する上記
〜の何れかに記載のトランスジェニック哺乳動物； ブタ補体制御因子（pMCP）プロモーターが、配列番
号１に示される塩基配列又はその一部である上記記載
のトランスジェニック哺乳動物。 トランスジェニック哺乳動物が、家畜又は実験動物
である上記〜の何れかに記載のトランスジェニック
哺乳動物； トランスジェニック哺乳動物が、トランスジェニッ
クブタ又はトランスジェニックマウスである上記記載
のトランスジェニック哺乳動物； である。Means for Solving the Problems The gist of the present invention made to solve the above-mentioned problems is to provide a human complement regulatory factor (DAF / CD55) gene,
The non-human transgenic mammal expressing the human complement regulatory factor in an organ or tissue; the transgenic mammal described above expressing the human complement regulatory factor (DAF / CD55) in vascular endothelial cells Animal; transgenic mammal as described above or described which expresses human complement regulatory factor (DAF / CD55) in vascular endothelial cells of all organs / tissues; gene of human complement regulatory factor (DAF / CD55) The transgenic mammal according to any one of the above, which has a porcine complement control factor (pMCP) promoter on the upstream side; the porcine complement control factor (pMCP) promoter is a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a part thereof The transgenic mammal according to the above, which is The transgenic mammal according to any one of the above, wherein the transgenic mammal is a domestic animal or an experimental animal; the transgenic mammal described above, wherein the transgenic mammal is a transgenic pig or a transgenic mouse. .
【０００８】[0008]
【発明の実施の形態】上述のように、本発明は、ヒト以
外のトランスジェニック哺乳動物であって、ヒトの補体
制御因子（以下、hDAFという）の遺伝子を有し、当該ヒ
トの補体制御因子を臓器・組織に発現していることから
なり、特に血管内皮細胞に発現していることからなる。
本発明における哺乳動物はヒト以外の哺乳動物であれば
特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスタ
ー、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコな
どが例示される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION As described above, the present invention relates to a non-human transgenic mammal having a gene for a human complement control factor (hDAF), and The regulatory factor is expressed in organs / tissues, particularly expressed in vascular endothelial cells.
The mammal in the present invention is not particularly limited as long as it is a mammal other than a human, and examples include a mouse, a rat, a hamster, a pig, a cow, a horse, a sheep, a rabbit, a dog, and a cat.
【０００９】本発明のトランスジェニック哺乳動物は、
以下の方法により作製することができる。まず、プロモ
ーターとhDAFcDNAを結合した導入用遺伝子を調製する。
この方法としては、適当なベクター(例えば、pGL-3ベー
シックベクター、pBluescript等)の一部を制限酵素で抜
き取り、そのベクター側の末端を常法に準じて平滑化し
ておく。一方、hDAFcDNA（例えば、Medof, M. E.ら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 2007, 1987等参照）
より、hDAF をコードする塩基配列の開始コドンの直前
から終始コドン直後の領域を制限酵素で切り取り、その
末端を常法に準じて平滑化した後、上記のベクターの平
滑化した部分に挿入し、更に適当なプロモーターをhDAF
cDNA挿入部位の上流側に挿入する。上記のプロモーター
としては、hDAFを哺乳動物の体内で発現し得るプロモー
ターであれば特に限定されず、例えば、エンドセリンの
プロモーターなどが例示できるが、本発明者らはブタ補
体制御因子（pMCP）プロモーターが特に好適であること
を見い出している。なお、ブタ補体制御因子（pMCP）プ
ロモーターの塩基配列を配列番号１として示す（特願平
9-142961号参照）。かくして得られたベクター（環状遺
伝子）より、プロモーターとhDAFを含む領域を適当な制
限酵素で切り出すことにより、導入用遺伝子が調製され
る。なお、上記の工程における個々の手法は当業者に知
られており、各工程は常法に準じて行うことができる。[0009] The transgenic mammal of the present invention comprises:
It can be produced by the following method. First, a gene for transduction in which a promoter and hDAF cDNA are linked is prepared.
In this method, a part of an appropriate vector (for example, pGL-3 basic vector, pBluescript, etc.) is extracted with a restriction enzyme, and the end on the vector side is blunted in accordance with a conventional method. On the other hand, hDAF cDNA (for example, Medof, ME et al., Pr.
oc. Natl. Acad. Sci. USA., 84 , 2007, 1987, etc.)
From the region immediately before the start codon of the hDAF-encoding base sequence to immediately after the stop codon, the region was cut out with a restriction enzyme, the ends were blunted according to a conventional method, and then inserted into the blunted portion of the above vector, HDAF
Insert upstream of the cDNA insertion site. The above-mentioned promoter is not particularly limited as long as it can express hDAF in a mammal, and examples thereof include an endothelin promoter, and the like. The present inventors have proposed a porcine complement regulatory factor (pMCP) promoter. Has been found to be particularly suitable. The nucleotide sequence of the porcine complement regulatory factor (pMCP) promoter is shown as SEQ ID NO: 1 (Japanese Patent Application No.
9-142961). From the vector (circular gene) thus obtained, a region containing the promoter and hDAF is cut out with an appropriate restriction enzyme to prepare a gene for introduction. The individual techniques in the above steps are known to those skilled in the art, and each step can be performed according to a conventional method.
【００１０】トランスジェニック哺乳動物は、上記で調
製された導入用遺伝子を哺乳動物の受精卵（前核期卵）
の前核にマイクロインジェクション法などの慣用の方法
で導入し、当該受精卵を必要に応じて培養し、又は培養
せず直に疑妊娠状態に同期化させておいた雌性哺乳動物
（レシピエント哺乳動物）の卵管又は子宮に移植し、産
仔を得ることにより作製される。なお、前核にマイクロ
インジェクションを行う際に、受精卵内の多量の脂肪粒
の存在等により前核の確認が困難な場合には、常法に従
って予め遠心処理を行う。作製された産仔がトランスジ
ェニック哺乳動物であることの確認は、後記のドットブ
ロッテング法、PCR法、免疫組織学的方法、補体抵抗性
試験などにより行うことができる。[0010] The transgenic mammal uses the gene for transfection prepared above as a fertilized egg (pronuclear stage egg) of the mammal.
A female mammal (recipient mammal) that has been introduced into the pronucleus of E. coli by a conventional method such as a microinjection method, and the fertilized egg has been cultured as necessary, or has been directly synchronized with the suspicious pregnancy state without being cultured (recipient mammal). It is produced by transplanting into the oviduct or uterus of an animal) and obtaining a litter. When microinjection is performed into the pronucleus, if it is difficult to confirm the pronucleus due to the presence of a large amount of fat particles in the fertilized egg, centrifugation is performed in advance according to a conventional method. The confirmation that the produced litter is a transgenic mammal can be performed by the dot blotting method, PCR method, immunohistological method, complement resistance test, and the like described below.
【００１１】かくして得られたトランスジェニック哺乳
動物は、常法に準じて交配し、産仔を得ることにより繁
殖させることができる。また、当該トランスジェニック
哺乳動物の細胞を初期化培養し、又はせずに、予め除核
しておいた未受精卵と細胞融合させ、レシピエント哺乳
動物の卵管又は子宮に移植し、クローン産仔を得ること
によっても繁殖させることもできる。後記の実施例に示
されるように、本発明で得られたトランスジェニック哺
乳動物はhDAF遺伝子を有し、また全臓器の血管内皮細胞
にhDAFを発現しており、ヒト補体に対する抵抗性を有す
ることが確認された。本発明に係るトランスジェニック
哺乳動物は、家畜又は実験動物として有用である。The transgenic mammal thus obtained can be bred by mating according to a conventional method and obtaining a litter. Alternatively, the cells of the transgenic mammal may be subjected to cell fusion with an unfertilized egg that has been enucleated in advance or without initializing culture, transplanted into the oviduct or uterus of a recipient mammal, and cloned. They can also be bred by obtaining pups. As shown in the Examples below, the transgenic mammal obtained in the present invention has the hDAF gene, and also expresses hDAF in vascular endothelial cells of all organs and has resistance to human complement It was confirmed that. The transgenic mammal according to the present invention is useful as a domestic animal or an experimental animal.
【００１２】[0012]
【発明の効果】本発明によれば、下記のような効果が得
られ、医学、薬学などの分野で有用である。 （1）本発明のトランスジェニック哺乳動物の臓器、例
えば心臓、肺、肝臓、腎臓などとヒトの血液を接触させ
るか、又はこれらの臓器を霊長類の動物に移植すれば、
hDAFが異種移植に伴う超急性拒絶の回避に有用であるこ
とを確認することができる。 （2）本発明のトランスジェニック哺乳動物の臓器、例
えば心臓、肺、肝臓、腎臓などとヒトの血液を接触させ
るか、又はこれらの臓器を霊長類の動物に移植して異種
移植モデルを作製すれば、異種移植時の超急性拒絶の回
避を補完する薬剤・処置器材等及び／又は超急性拒絶の
後に発生すると危惧されている急性又は慢性拒絶を回避
するための薬剤・処置器材等の開発に資することができ
る。 （3）補体制御因子の発現だけでは解決できない超急性
拒絶に関する問題点を顕在化させるための研究開発を行
うことが可能となる。即ち、超急性拒絶の回避のために
は、補体制御因子の導入と共に、ヒトの自然抗体が結合
するブタ細胞上の糖鎖抗原の発現を減少させる機能を有
する糖転移酵素の導入及び／又は血管内皮の恒常性を維
持する因子（例えば、トロンボモジュリンなど）の導入
が必要か否かの議論に解答を与えることができる。 （4）本発明のトランスジェニック哺乳動物に他の補体
制御因子（ヒトMCPとヒトCD59）を発現するトランスジ
ェニック哺乳動物を交配させるなどすれば、それぞれの
補体制御因子の相乗効果を検討することも可能である。 （5）本発明のトランスジェニック哺乳動物の臓器（例
えば、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓等）、臓器に付属す
る組織（例えば、冠状動脈、脳硬膜等）や細胞（例え
ば、インスリンを産生するランゲルハンス島、ドーパミ
ンを産生する脳黒質線条体細胞等）等をヒト患者に移植
すれば既にダメージを受け機能を失調させた患者臓器等
の補完、あるいはその代用とすることができる。 （6）本発明のトランスジェニック哺乳動物の臓器の細
胞（例えば、肝臓、腎臓などの臓器から採取した細胞、
インスリンを産生するランゲルハンス島、ドーパミンを
産生する脳黒質線条体細胞）を培養し、培養細胞を適宜
器材装置等に組み入れ、対応する臓器の機能が失調して
いるヒト患者と体外循環系を介して接続すれば、失調し
ている臓器の代替や治療として活用することが可能とな
る。According to the present invention, the following effects are obtained and are useful in the fields of medicine, pharmacy and the like. (1) By contacting human blood with organs of the transgenic mammal of the present invention, for example, heart, lung, liver, kidney, etc., or by transplanting these organs into primate animals,
It can be confirmed that hDAF is useful for avoiding hyperacute rejection associated with xenotransplantation. (2) Contacting human blood with organs of the transgenic mammal of the present invention, for example, heart, lung, liver, kidney, etc., or transplanting these organs into primate animals to prepare a xenograft model. For example, in the development of drugs and treatment devices that complement the avoidance of hyperacute rejection during xenotransplantation and / or drugs and treatment devices that avoid acute or chronic rejection that is feared to occur after hyperacute rejection Can contribute. (3) Research and development to clarify the problems related to hyperacute rejection that cannot be solved only by expression of complement regulatory factors can be performed. That is, in order to avoid hyperacute rejection, introduction of a complement transfer factor and introduction of a glycosyltransferase having a function of reducing the expression of a carbohydrate antigen on a pig cell to which a human natural antibody binds, and / or An argument can be answered whether or not it is necessary to introduce factors that maintain vascular endothelial homeostasis (eg, thrombomodulin, etc.). (4) When the transgenic mammal of the present invention is mated with a transgenic mammal expressing other complement control factors (human MCP and human CD59), the synergistic effect of each complement control factor is examined. It is also possible. (5) organs (eg, heart, lung, liver, kidney, pancreas, etc.), tissues (eg, coronary artery, cerebral dura etc.) and cells (eg, insulin) of the transgenic mammal of the present invention; By transplanting islet-producing islets of Langerhans, nigrostriatal cells producing dopamine, etc.) into human patients, they can be used to supplement or substitute for organs of patients who have already suffered damage and have lost function. (6) cells of organs of the transgenic mammal of the present invention (for example, cells collected from organs such as liver and kidney,
Insulin-producing islets of Langerhans, and dopamine-producing cerebral nigrostriatal cells) are cultured, and the cultured cells are appropriately incorporated into equipment and the like, and human patients with dysfunction of the corresponding organs and extracorporeal circulation are used. If it is connected via, it can be used as a replacement or treatment for a dysfunctional organ.
【００１３】[0013]
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。 実施例導入用遺伝子の構築 pMCPプロモーターとhDAFcDNAを連結した導入用遺伝子
を、下記の要領で作製した。即ち、pGL-3ベーシックベ
クター(Promega)より、luc.遺伝子をNcoIサイトとXbaI
サイトで抜き取り、ベクター側の両末端をT4 DNA polym
eraseで平滑化した。次ぎに、第一イントロンを含むhDA
FcDNAを、ATG開始コドンの直前のAscIサイトとTAG終始
コドンの直後のAccIコドンで切り出し、T4 DNA polymer
aseで平滑化し、前述のベクターの末端平滑化した部分
に挿入した。また、ブタゲノムファージライブラリーの
pMCP遺伝子（特願平9-142961号）を含む領域より、プロ
モーターに相当する部分の約5.4kbをEcoRIとFspIサイト
で切り出し、pBluescriptベクターのEcoRIとEcoRVサイ
トに挿入した。次いで、以下の操作を行った。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Example Construction of Transgene for Introduction A transgene was prepared by linking the pMCP promoter and hDAF cDNA in the following manner. That is, from the pGL-3 basic vector (Promega), the luc.
Extract at the site and terminate both ends of the vector side with T4 DNA polym
Smoothed with erase. Next, the hDA containing the first intron
FcDNA was excised at the AscI site immediately before the ATG start codon and at the AccI codon immediately after the TAG stop codon, and T4 DNA polymer
It was blunted with ase, and inserted into the above-mentioned vector with blunted ends. In addition, the pig genomic phage library
From the region containing the pMCP gene (Japanese Patent Application No. 9-142961), about 5.4 kb of the portion corresponding to the promoter was cut out with EcoRI and FspI sites, and inserted into the EcoRI and EcoRV sites of the pBluescript vector. Next, the following operation was performed.
【００１４】（1）pBluescriptベクターに挿入したプロ
モーター部分の約5.4kbをBstEIIとEcoRIで切り出し（配
列番号１の塩基配列2〜5392番の配列を有する断片）、T
4 DNApolymeraseで平滑化し（配列番号１の塩基配列2〜
5397番の配列を有する断片）、前述のベクターのhDAFcD
NA挿入部位のすぐ上流にあるSmaIサイトに挿入した。そ
して、上記のプロモーターとhDAFcDNAを含む領域をNotI
とEco47IIIサイトで切り出し、導入用遺伝子（１）とし
た（図１参照）。 （2）プロモーターを挿入したpBluescriptベクターよ
り、pMCPのATG開始コドンの直前にあるBstEIIサイトとB
ssH2で1.7kbのプロモーター領域を切り出し、末端をT4
DNA polymeraseで平滑化した後、前述のhDAFcDNAを含む
ベクターのSmaIサイトに挿入した。さらに、プロモータ
ー部分よりさらに上流にあるpBluescript由来のBstXIサ
イトとSpeIサイトで切断しプラスミドを直鎖状にし、Ki
lo-Sequence用Deletion Kit（Takara社製）を用いてプ
ロモーター領域が0.9Kbの長さ（配列番号１の塩基配列4
498〜5397番の配列を有する）になるまで短縮したdelet
ionmutantを得た。そして、上記のプロモーターとhDAFc
DNAを含む領域をNotIとEco47IIIサイトで切り出し、導
入用遺伝子（２）とした（図２参照）。 （3）一方、hDAFプロモーターとhDAFcDNAを連結した導
入用遺伝子（３）を次ぎの要領で作成した。即ち、hDAF
プロモーターは、プロモーターに相当する部分の約3.8k
bの領域をHindIIIサイトとAscIサイトで切り出し、末端
を平滑化し、前述のベクターのhDAFcDNA挿入部位のすぐ
上流にあるSmaIサイトに挿入した。そして、上記のプロ
モーターとhDAFcDNAを含む領域をNotIとEco47IIIサイト
で切り出し、導入用遺伝子（３）とした（図３参照）。 それぞれの導入用遺伝子は、リン酸緩衝生理食塩水（PB
S）にて5μg／mlの濃度に調整して用いた。(1) Approximately 5.4 kb of the promoter portion inserted into the pBluescript vector is cut out with BstEII and EcoRI (a fragment having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 5392), and T
4 Smooth with DNA polymerase (base sequence 2 to
Fragment having the sequence of No. 5397), hDAFcD of the aforementioned vector
It was inserted into the SmaI site immediately upstream of the NA insertion site. The region containing the above promoter and hDAF cDNA was
At the Eco47III site to obtain a gene for introduction (1) (see FIG. 1). (2) From the pBluescript vector into which the promoter was inserted, the BstEII site immediately before the ATG start codon of pMCP and B
A 1.7 kb promoter region was cut out with ssH2, and the
After blunting with DNA polymerase, it was inserted into the SmaI site of the vector containing the aforementioned hDAF cDNA. Furthermore, the plasmid was cut at the BstXI site and the SpeI site derived from pBluescript located further upstream of the promoter to linearize the plasmid, and Ki
Using a Deletion Kit for lo-Sequence (manufactured by Takara), the promoter region was 0.9 Kb long (base sequence 4 of SEQ ID NO: 1).
498 to 5397)
I got an ionmutant. And the above promoter and hDAFc
The region containing DNA was cut out at the NotI and Eco47III sites, and used as the gene for introduction (2) (see FIG. 2). (3) On the other hand, an introduction gene (3) in which the hDAF promoter and the hDAF cDNA were linked was prepared in the following manner. That is, hDAF
The promoter has a portion corresponding to the promoter of about 3.8k
The region b was cut out at the HindIII site and the AscI site, the ends were blunted, and inserted into the aforementioned vector at the SmaI site immediately upstream of the hDAF cDNA insertion site. Then, the region containing the above promoter and hDAF cDNA was cut out at NotI and Eco47III sites to obtain a gene for introduction (3) (see FIG. 3). Each transgene is a phosphate buffered saline (PB
The concentration was adjusted to 5 μg / ml in S) before use.
【００１５】トランスジェニック哺乳動物（マウス）
の作成 マイクロインジェクション法による導入用遺伝子のマウ
ス受精卵への導入とトランスジェニックマウスの作成を
下記の要領で行った。即ち、CBAマウスあるいはC3Hマウ
スのオスにC57BL/6マウスのメスを交配させ、産子を得
た。このメスを採卵用マウス（ドナー）に供した。ドナ
ーマウスに過排卵処理（PMSGとhCGの投与）した後、ICR
マウスのオスと交配させ、受精卵（前核期卵）を採取し
た。この前核期卵に、前述の導入用遺伝子（１）又は
（３）をマイクロインジェクション法により、前核が膨
らむのがわかる程度まで注入した。そして、導入用遺伝
子の注入された前核期卵を直ちにレシピエントマウスの
卵管に移植し、あるいは導入用遺伝子の注入された前核
期卵を３日間培養した後にレシピエントマウスの子宮に
移植した。そして、産子を得た。なお、レシピエントマ
ウスは精管結紮マウスと予め交尾させて疑妊娠状態にし
ておいた。 Transgenic mammal (mouse)
Preparation of a transgene was introduced into a mouse fertilized egg by a microinjection method and a transgenic mouse was prepared in the following manner. That is, female C57BL / 6 mice were mated to male CBA or C3H mice to obtain offspring. The female was used as a mouse for egg collection (donor). After superovulation (administration of PMSG and hCG) to donor mice, ICR
The mice were mated with male mice, and fertilized eggs (pronuclear stage eggs) were collected. The above-described transgene (1) or (3) was injected into the pronuclear stage eggs by microinjection until the pronuclei were swollen. Then, the pronuclear stage egg into which the transgene was injected is immediately transplanted into the oviduct of the recipient mouse, or the pronuclear stage egg into which the transgene is injected is cultured for 3 days and then transplanted into the uterus of the recipient mouse. did. And I got a baby. The recipient mouse was mated with a vasectomized mouse in advance to put it in a pseudopregnancy state.
【００１６】トランスジェニック哺乳動物（ブタ）の
作成 マイクロインジェクション法による導入用遺伝子のブタ
受精卵への導入とトランスジェニックブタの作成を下記
の要領で行った。即ち、ランドレース種、大ヨークシャ
ー種及びデュロック種の交雑種の雌豚を採卵用豚(ドナ
ー豚)に供した。ドナー豚に過排卵処理（PMSGあるいはF
SHとhCGの投与）した後、デュロック雄豚の精子を用い
て人工授精法により受精させ、受精卵（前核期卵）を採
取した。この前核期卵を遠心分離機で処理し（12,000 x
g,8分間)、その後、前記導入用遺伝子（２）をマイク
ロインジェクション法により、前核が膨らむのがわかる
程度まで注入した。そして、導入用遺伝子の注入された
前核期卵を直ちにレシピエント豚の卵管に移植した。そ
して、産子を得た。なお、レシピエント豚には、予め前
述の過排卵処理を行いドナー豚と性周期を同期化してお
いた豚、あるいは受精卵を採取した後のドナー豚を供し
た。 Transgenic mammals (pigs)
Preparation The transgene was introduced into a fertilized porcine egg by the microinjection method and a transgenic pig was prepared in the following manner. That is, crossbred sows of the Landrace, Great Yorkshire and Duroc breeds were used as pigs for egg collection (donor pigs). Superovulation treatment (PMSG or F
After SH and hCG administration), fertilized eggs (pronuclear stage eggs) were collected by artificial insemination using sperm of Duroc boar. The pronuclear stage eggs were processed by a centrifuge (12,000 x
g, 8 minutes), and then the transfection gene (2) was injected by microinjection until the pronuclei were swollen. The pronuclear stage eggs into which the transgene was injected were immediately transplanted into the oviduct of the recipient pig. And I got a baby. As recipient pigs, pigs that had been subjected to the above-described superovulation treatment and whose estrous cycle was synchronized with the donor pigs, or donor pigs from which fertilized eggs had been collected, were used.
【００１７】トランスジェニック哺乳動物の同定 レシピエント哺乳動物から得られた産仔の尾部から常法
によりゲノムDNAを抽出し、下記の２方法によりトラン
スジェニック哺乳動物の同定と選抜を行った。 (1)ドットブロッティング法：供試産仔のゲノムDNA(10
μg)をメンブレンに固定し、予めビオチンラベルしてお
いたhDAFcDNAの一部からなる遺伝子とハイブリダイゼズ
させた。アルカリホスファターゼを用いた発色反応（ス
マライト、住友金属社製）を行い、導入遺伝子の組込み
の有無を検出し、トランスジェニック哺乳動物を同定し
た。 (2)PCR法：供試産仔のゲノムDNAをテンプレートとし
て、hDAFcDNA由来の5'-GGCCTTCCCCCAGATGTACCTAATGCC-
3'をセンスプライマー、同5'-TCCATAATGGTCACGTTCCCCTT
G-3'をアンチセンスプライマーとするPCR反応を行った
（条件；94℃ 30秒間、68℃ 2分30秒間、30回）。そし
て、導入遺伝子の組込みの有無を検出し、トランスジェ
ニック哺乳動物の同定を行った。その結果を図４に示
す。図４に示すように、レシピエント哺乳動物から得ら
れた産子の内には、そのゲノム中にhDAFcDNAを有するマ
ウス及びブタの存在することが確認された。なお、図４
中の1と3はそれぞれhDAFcDNAを有することが確認された
ブタとマウスの結果であり、図４中の2と4はそれぞれ同
腹産仔のうちhDAFcDNAを有さないことが確認されたブタ
とマウスの結果である。 Identification of Transgenic Mammals Genomic DNA was extracted from tails of offspring obtained from recipient mammals by a conventional method, and transgenic mammals were identified and selected by the following two methods. (1) Dot blotting method: Genomic DNA (10
μg) was immobilized on the membrane, and hybridized with a biotin-labeled gene consisting of a part of the hDAF cDNA. A color reaction using alkaline phosphatase (Sumalite, manufactured by Sumitomo Metals Co., Ltd.) was performed to detect the presence or absence of integration of the transgene, and the transgenic mammal was identified. (2) PCR method: 5'-GGCCTTCCCCCAGATGTACCTAATGCC-derived from hDAF cDNA using genomic DNA of test offspring as a template
3 'sense primer, 5'-TCCATAATGGTCACGTTCCCCTT
A PCR reaction using G-3 ′ as an antisense primer was performed (conditions: 94 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 2 minutes and 30 seconds, 30 times). Then, the presence or absence of the integration of the transgene was detected, and the transgenic mammal was identified. FIG. 4 shows the results. As shown in FIG. 4, it was confirmed that among the offspring obtained from the recipient mammals, mice and pigs having hDAF cDNA in their genome were present. FIG.
1 and 3 are results of pigs and mice confirmed to have hDAF cDNA, respectively, and 2 and 4 in FIG. 4 are pigs and mice confirmed to have no hDAF cDNA among litters, respectively. Is the result of
【００１８】トランスジェニック哺乳動物（マウス）
の繁殖 トランスジェニックと同定されたマウスを、ICRマウス
と交配させ、導入遺伝子を持つ産子（TgF1マウスとい
う）を作出した。 Transgenic mammal (mouse)
Mice identified as breeding transgenics were crossed with ICR mice to produce offspring carrying the transgene (referred to as TgF1 mice).
【００１９】トランスジェニック哺乳動物（マウス）
における導入遺伝子の発現の確認（mRNAの発現） TgF1マウスの各種臓器からmRNAを抽出し、常法のRT-PCR
法を用いて、臓器中のhDAF由来のmRNAの発現を調べた。
なお、比較例として、hDAFプロモーターとhDAFcDNAを含
む導入用遺伝子（３）を導入して得たトランスジェニッ
クマウス及び通常のマウス（非トランスジェニックマウ
ス）についても、各種臓器からmRNAを抽出し、上記と同
様な方法でhDAF由来のmRNAの発現を調べた。その結果を
図５に示す。なお、図中の記号、B、H、K、Li、Lu、S及
びTは、それぞれ脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓及び
精巣を意味する。その結果、pMCPプロモーターとhDAFcD
NAを含む導入用遺伝子（１）（図１参照）を導入して得
たトランスジェニックマウスの場合には、検討した臓器
(脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓及び精巣）の全てにh
DAFcDNAに由来するmRNAの発現を示す強いシグナルが認
められた（図５のＡ）。このことから、TgF１マウスは
全臓器でhDAF由来のmRNAを発現していることが明かとな
った。一方、hDAFプロモーターとhDAFcDNAを含む導入用
遺伝子（３）（図３参照）を導入して得たトランスジェ
ニックマウスの場合には、精巣のみにhDAFcDNAに由来す
るmRNAのシグナルが認められたが、その他の臓器では、
シグナルは認められないか、認められても非常に弱いも
のであった（図５のＢ）。なお、非トランスジェニック
マウスの場合には、いずれの臓器においても、hDAFに由
来するmRNAの発現は認められなかった（図５のＣ）。ま
た、ヒトリンパ球細胞株（K562）について同様の分析を
した場合には、hDAFに由来するmRNAの発現が認められた
（図５のＣの最右端）。 Transgenic mammal (mouse)
Confirmation of transgene expression in E. coli (mRNA expression) Extract mRNA from various organs of TgF1 mouse and use standard RT-PCR
The expression of hDAF-derived mRNA in organs was examined using the method.
As a comparative example, mRNA was extracted from various organs of transgenic mice and normal mice (non-transgenic mice) obtained by introducing the transgene (3) containing the hDAF promoter and hDAF cDNA, and The expression of mRNA derived from hDAF was examined in a similar manner. The result is shown in FIG. The symbols B, H, K, Li, Lu, S, and T in the figure mean brain, heart, kidney, liver, lung, spleen, and testis, respectively. As a result, the pMCP promoter and hDAFcD
In the case of transgenic mice obtained by introducing the transgene (1) containing NA (see FIG. 1), the examined organs
(Brain, heart, kidney, liver, lung, spleen and testis)
A strong signal indicating the expression of mRNA derived from DAF cDNA was observed (A in FIG. 5). This revealed that TgF1 mice expressed hDAF-derived mRNA in all organs. On the other hand, in the case of the transgenic mouse obtained by introducing the transgene (3) containing the hDAF promoter and the hDAF cDNA (see FIG. 3), the signal of the mRNA derived from the hDAF cDNA was observed only in the testis. In the organs of
No signal was observed, or very weak signal was observed (FIG. 5B). In the case of non-transgenic mice, expression of mRNA derived from hDAF was not observed in any of the organs (C in FIG. 5). When the same analysis was performed for the human lymphocyte cell line (K562), expression of mRNA derived from hDAF was observed (far right end of C in FIG. 5).
【００２０】トランスジェニック哺乳動物（マウス）
における導入遺伝子の発現の確認（免疫組織学的手法に
よるhDAF蛋白質の発現の確認） TgF1マウスの各臓器の凍結切片を作成し、ビオチン化抗
hDAFモノクローナル抗体を反応させた。その後に、ペル
オキシダーゼ標識ストレプトアビジンを結合させた。こ
れに発色基質(ジアミノベンジジン；DAB)を作用させ、
顕微鏡観察によりhDAF蛋白質の発現強度及び発現部位を
検討した。その結果を下記表１に示す。 Transgenic mammal (mouse)
Of transgene expression in E. coli (by immunohistological
Confirmation of hDAF protein expression by TGFF1 mouse )
The hDAF monoclonal antibody was reacted. Thereafter, peroxidase-labeled streptavidin was bound. A chromogenic substrate (diaminobenzidine; DAB) is allowed to act on this,
The expression intensity and expression site of hDAF protein were examined by microscopic observation. The results are shown in Table 1 below.
【００２１】[0021]
【表１】 [Table 1]
【００２２】表１に示されるように、pMCPプロモーター
とhDAFcDNAを含む導入用遺伝子（１）を導入して得たト
ランスジェニックマウスの場合には、観察した全臓器に
hDAFの強い発現が認められた。発現の確認された臓器は
心臓の心房筋、心室筋と中小・毛細血管内皮、腎臓の糸
球体、尿細管と中小・毛細血管内皮、肝臓の肝細胞、胆
管上皮と中小・毛細血管内皮、肺の肺胞、気管上皮と中
小・毛細血管内皮、腸の腸粘膜上皮と中小・毛細血管内
皮、膵臓の外分泌腺細胞、ランゲルハンス島、膵管上皮
と中小・毛細血管内皮、脾臓の白脾臓、赤脾臓、脾柱と
中小・毛細血管内皮、脳の大脳皮質と髄質、小脳皮質と
髄質と中小・毛細血管内皮、精巣の精上皮細胞、間細
胞、精子と中小・毛細血管内皮、及び抹消神経であり、
全臓器にわたっていた。一方、hDAFプロモーターとhDAF
cDNAを含む導入用遺伝子（３）を導入して得たトランス
ジェニックマウスの場合には、精巣のみにhDAFの発現が
認められた。しかし、精巣の血管内皮細胞には発現が認
められなかった。As shown in Table 1, in the case of a transgenic mouse obtained by introducing the transgene (1) containing the pMCP promoter and hDAF cDNA, all the organs observed
Strong expression of hDAF was observed. The organs that have been confirmed to be expressed are atrial muscle of the heart, ventricular muscle and small / medium / capillary endothelium, glomeruli of kidney, tubule and small / medium / capillary endothelium, liver hepatocytes, bile duct epithelium and small / medium / capillary endothelium, lung Alveolar, tracheal epithelium and small / capillary endothelium, intestinal intestinal mucosal epithelium and small / capillary endothelium, pancreatic exocrine gland cells, islet of Langerhans, pancreatic duct epithelium and small / capillary endothelium, white spleen of spleen, red spleen, Splenic column and small / medium / capillary endothelium, cerebral cortex and medulla of brain, cerebellar cortex / medulla and small / medium / capillary endothelium, seminiferous epithelial cells of testis, interstitial cells, sperm and small / medium / capillary endothelium, and peripheral nerves,
It spanned all organs. On the other hand, hDAF promoter and hDAF
In the case of the transgenic mouse obtained by introducing the gene for transfer (3) containing cDNA, hDAF expression was observed only in the testis. However, no expression was observed in testicular vascular endothelial cells.
【００２３】トランスジェニック哺乳動物（ブタ）に
おける導入遺伝子発現の確認（免疫組織学的手法による
hDAF蛋白質の発現の確認） に記載のPCR法によりトランスジェニックであること
が確認されたブタについてhDAF蛋白質の発現を確認し
た。即ち、と同様に、当該ブタの尾部の凍結切片を作
成し、ビオチン化抗hDAFモノクローナル抗体を反応させ
た。その後に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジ
ンを結合させた。これに発色基質（ジアミノベンジジ
ン；DAB）を作用させ、顕微鏡観察によりhDAF蛋白質の
発現強度及び発現部位を検討した。その結果、pMCPプロ
モーターとhDAFcDNAを含む導入用遺伝子（２）を導入し
て得たトランスジェニックブタの組織切片の中小・毛細
血管内皮にhDAFの発現が認められた。その他にも抹消神
経、骨格筋、皮膚重層扁平上皮などの組織でhDAFの発現
が認められた。For transgenic mammals (pigs)
Of transgene expression (by immunohistological method)
Confirmation of hDAF protein expression) The expression of the hDAF protein was confirmed for pigs that were confirmed to be transgenic by the PCR method described in (1 ) . That is, a frozen section of the pig tail was prepared in the same manner as described above, and reacted with a biotinylated anti-hDAF monoclonal antibody. Thereafter, peroxidase-labeled streptavidin was bound. A chromogenic substrate (diaminobenzidine; DAB) was allowed to act on this, and the expression intensity and expression site of the hDAF protein were examined by microscopic observation. As a result, expression of hDAF was observed in the small and medium-sized and capillary endothelium of the tissue section of the transgenic pig obtained by introducing the transgene (2) containing the pMCP promoter and the hDAF cDNA. In addition, hDAF expression was observed in tissues such as peripheral nerves, skeletal muscle, and stratified squamous epithelium.
【００２４】トランスジェニック哺乳動物（ブタ）に
おける導入遺伝子発現の確認（FACS解析によるhDAF蛋白
質の発現と発現強度の確認） に記載のPCR法及びに記載の免疫組織化学的手法に
よりトランスジェニックであることが確認されたブタの
組織を抗hDAFモノクローナル抗体を用いるFACS(Fluores
ence-activated cell sorter, ベクトンディキンソン社
製FACScan）解析に供し、hDAF蛋白質の発現を確認し
た。即ち、当該ブタから血液を採取し、赤血球画分を得
た。この赤血球にビオチン化抗hDAFモノクローナル抗体
を反応させた。その後に、Phycoprobe PE Streptavidin
（Biomeda社製）を結合させ、FACScanにより発現強度を
検討した。その結果を図６（Ａ）に示す。また、同腹産
仔の内、非トランスジェニックであったブタについて同
様のFACS解析を行った結果を図６（Ｂ）に示す。なお、
図６の横軸は各細胞当たりの蛍光強度、即ちhDAFの発現
強度を表わし、縦軸は各強度当たりの細胞数を表わす。
図６が示すように、PCR法及び免疫組織学的手法により
トランスジェニックであることが確認されたブタから採
取した赤血球は、hDAFを発現しており、その発現量も多
いことが認められた。一方、非トランスジェニックブタ
の場合には、hDAFを発現していなかった。図６に示すよ
うに、本例で得られたトランスジェニックブタの場合に
は、赤血球全体のポピュレーションの中にhDAFを発現す
る赤血球とhDAFを発現しない赤血球が混在する(モザイ
クと称する)。なお、マイクロインジェクション法によ
り作成されたトランスジェニック動物の第一世代目(Fou
nder)個体がモザイクを呈すること、及び交配や育種等
の慣用の手段によりモザイクが解消されることは既に知
られている。とに示す結果から、pMCPプロモーター
とhDAFcDNAを含む導入用遺伝子を導入して得たトランス
ジェニックブタは、hDAFcDNAに由来するhDAF蛋白質を血
管内皮細胞を含む広範囲の臓器組織に発現していること
が分かった。For transgenic mammals (pigs)
Of transgene expression (hDAF protein by FACS analysis)
Confirmation of expression and intensity of expression) of the pig tissue confirmed to be transgenic by the PCR method and the immunohistochemical method described in FACS (Fluores) using an anti-hDAF monoclonal antibody.
ence-activated cell sorter, FACScan manufactured by Becton Dickinson) analysis to confirm the expression of hDAF protein. That is, blood was collected from the pig to obtain a red blood cell fraction. The erythrocytes were reacted with a biotinylated anti-hDAF monoclonal antibody. After that, Phycoprobe PE Streptavidin
(Manufactured by Biomeda) and the expression intensity was examined by FACScan. FIG. 6A shows the result. In addition, the results of the same FACS analysis performed on non-transgenic pigs among litters are shown in FIG. 6 (B). In addition,
The horizontal axis in FIG. 6 represents the fluorescence intensity per cell, that is, the expression intensity of hDAF, and the vertical axis represents the number of cells per each intensity.
As shown in FIG. 6, it was confirmed that erythrocytes collected from pigs that were confirmed to be transgenic by PCR and immunohistological techniques expressed hDAF, and that the expression level was high. On the other hand, non-transgenic pigs did not express hDAF. As shown in FIG. 6, in the case of the transgenic pig obtained in this example, red blood cells expressing hDAF and red blood cells not expressing hDAF are mixed in the population of whole red blood cells (referred to as mosaic). The first generation of transgenic animals (Fou
nder) It is already known that individuals exhibit mosaics and that mosaics are eliminated by conventional means such as crossing and breeding. The results show that transgenic pigs obtained by introducing a transgene containing the pMCP promoter and hDAF cDNA express hDAF protein derived from hDAF cDNA in a wide range of organ tissues including vascular endothelial cells. Was.
【００２５】トランスジェニック哺乳動物における導入
遺伝子の発現の確認（hDAF蛋白質の機能の確認） トランスジェニック哺乳動物の細胞上に発現されたhDAF
蛋白質がhDAF蛋白質本来の機能、すなわち補体カスケー
ド反応の抑制作用を有すること確認した。この確認はト
ランスジェニック哺乳動物の赤血球にヒト血清を反応さ
せ、溶血の有無を測定することにより行った。なお、ト
ランスジェニック哺乳動物の細胞として赤血球を用いた
のは、（1）補体カスケード反応による膜侵襲複合体形
成の有無を溶血の有無により簡便に検定可能であるこ
と、（2）赤血球の膜は他の細胞（例えば、白血球、血
管内皮細胞など）の膜より脆弱であるので、補体カスケ
ード反応の強弱をより鋭敏に検定可能であることに依
る。トランスジェニックマウス及び非トランスジェニッ
クマウスの尾部、並びにトランスジェニックブタ及び非
トランスジェニックブタの耳静脈より血液を採取し、赤
血球画分を得た。それぞれの赤血球をPBSにて希釈後、9
6穴マイクロプレートの各ウエルに30μlずつ分注し（1x
107個／ウェル）、その後、補体含有量調整ヒト血清
（無処理の正常ヒト血清[HNS]と予め非働化処理[56℃30
分間の加熱]しておいたヒト血清[HIS]を種々の割合で混
合し、ヒト補体の含有量を調整しておいた血清）70μl
を上記のウェルに滴下し、赤血球と反応させた（37℃、
1.5時間）。その後、各ウェル上清液の405nmにおける吸
光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad社製)を用い
て測定し、補体反応により生じる溶血の割合を算出し
た。その結果を図７に示す。但し、図７(a)はトランス
ジェニックマウスの結果、図７(b)はトランスジェニッ
クブタの結果である。また、図７の横軸は補体含有量調
整ヒト血清中のHNSの割合、即ちヒト補体の濃度を示
し、縦軸は各赤血球の溶血率を示す。なお、図中、●印
はトランスジェニック動物より、▲黒四角▼印は通常の
動物より採取した赤血球である。なお、このような溶血
反応は、（1）ヒト血清中には自然抗体と補体が含まれ
ているので、動物の赤血球と共存すると補体の古典経路
反応が速やかに活性化されること、（2）補体制御因子
の種特異性は高く、動物（本発明のトランスジェニック
動物は除く）の赤血球はヒトの補体反応を制御できない
こと、によって生じる。図７が示すように、非トランス
ジェニック動物の赤血球はヒト補体含有量の如何を問わ
ず溶血した。一方、トランスジェニック哺乳動物の赤血
球の溶血は抑制された。これらのことから、hDAF蛋白質
を発現しているトランスジェニック哺乳動物の赤血球は
ヒト補体に対する抵抗性を有していることが確認され
た。なお、本実施例のトランスジェニックブタ赤血球の
ポピュレーションはモザイク状であったが、ヒト補体に
対する抵抗性を有していた。 Transduction in transgenic mammals
Confirmation of gene expression (confirmation of hDAF protein function) hDAF expressed on cells of transgenic mammal
It was confirmed that the protein had an intrinsic function of the hDAF protein, that is, an inhibitory effect on the complement cascade reaction. This confirmation was carried out by reacting red blood cells of a transgenic mammal with human serum and measuring the presence or absence of hemolysis. Erythrocytes were used as the cells of the transgenic mammal because (1) the presence or absence of membrane attack complex formation by the complement cascade reaction can be easily assayed by the presence or absence of hemolysis; (2) the erythrocyte membrane Is more fragile than the membrane of other cells (eg, leukocytes, vascular endothelial cells, etc.), and thus depends on being able to more sensitively assay the strength of the complement cascade reaction. Blood was collected from the tails of the transgenic and non-transgenic mice and from the ear vein of the transgenic and non-transgenic pigs to obtain a red blood cell fraction. After dilution of each red blood cell with PBS, 9
Dispense 30 μl into each well of a 6-well microplate (1x
10 7 cells / well), followed by complement content-adjusted human serum (untreated normal human serum [HNS] and pre-inactivated treatment [56 ° C. 30
70 μl of serum prepared by mixing human serum [HIS] in various ratios and adjusting the content of human complement
Was dropped into the above-mentioned well, and reacted with red blood cells (37 ° C.,
1.5 hours). Thereafter, the absorbance at 405 nm of the supernatant of each well was measured using a microplate reader (manufactured by Bio-Rad), and the percentage of hemolysis caused by the complement reaction was calculated. FIG. 7 shows the result. However, FIG. 7 (a) shows the result of the transgenic mouse, and FIG. 7 (b) shows the result of the transgenic pig. The horizontal axis in FIG. 7 shows the ratio of HNS in the complement-content-adjusted human serum, that is, the concentration of human complement, and the vertical axis shows the hemolysis rate of each red blood cell. In the figures, the open circles indicate red blood cells collected from transgenic animals, and the black squares indicate red blood cells collected from normal animals. In addition, such a hemolysis reaction is (1) since human serum contains natural antibodies and complement, the classical pathway reaction of complement is rapidly activated when coexisting with animal erythrocytes; (2) Species-specificity of complement control factors is high, and erythrocytes in animals (excluding the transgenic animals of the present invention) are caused by the inability to control human complement response. As FIG. 7 shows, erythrocytes from non-transgenic animals lysed regardless of human complement content. On the other hand, hemolysis of erythrocytes of the transgenic mammal was suppressed. From these, it was confirmed that the erythrocytes of the transgenic mammal expressing the hDAF protein had resistance to human complement. The transgenic pig erythrocyte population of this example was mosaic, but had resistance to human complement.
【００２６】[0026]
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：５，４１８ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 直接の起源：λFIXIIブタゲノムファージライブラリー 配列 GAATTCTGCG TACACGGGGC CCCGGTGGCT TTACATCATC GCTACAGCGA 50 CATGGGATCC GAGCCGTGTC TACAACCTAC ACAACAACGC CAGATCCTTA 100 ACCCAATGCA TGAGGACAGG GCTCAAACCT GCGGCCTCAT AGATGCTAGT 150 CAGATTCGTT TCTGCTGAGC CACAATGGGA ACTCCTAATT CTAGATCGAT 200 CTAGAATTAG GAGTTCCCAT TGTGGCTCAG CAGAAACGAA TCTGACTAGC 250 ATCTATGAGG CCGCAGTTTG AGCCCTGTCC TCATGCATTG GGTTAAGGAT 300 CTGGCGTTGT TGTGTAGGTT GTAGACACGG CTCGGATCCC ATGTCGCTGT 350 AGCGATGATG TAAAGCCACC GGGGCCCCGT GCTACGCAGA ATTCNTGCAG 400 CCCGGGGGAT CCACTAGTTC TAGCNAGAGA GTTGAAAATT TAAAGAACAT 450 TTCTCCCCTA ATCTCCCAAA ATATGGGCAA AGGACAGGTA CCCGTGGCAC 500 TGGAAAAATA CAGGCAAGCA ACCCATGAGT ACATGAAAAG ATGCTCCAGG 550 GTTCGGCCTA ATGGAAGCCT GAACAATGCC TATCACATCG TGGGTTTCTG 600 AAGAAGTAAC TTAAAGAAAC TAGAAATTAA ATGGCTTTCT TAGAATGAAA 650 ATTCTCTATC ACAAGGAAAA ATGTTGTATG TTGTTTTTCC CATAATGGAG 700 GTCAGTGGGC GCTATGATTA ACAAATATCT GATGCCTGTG ACTTTTTAAT 750 TGCAAGAAAT CTGTGNAGTT TTTTTATTAT CTATGGGAAA TATTGCATAT 800 ATTAATGATA TCACCTAACT TGTATTATTG AGCAATTCTG TCCACATCTG 850 GCCTTTCATC TTTCATCTAA AAAGCAGGGG CTGGACCAAC TGACCTTCAG 900 TGCCATTCTT ACTGCTAACA TTCTAATTTT GTTTTTATTG CCTTTTTGTA 950 CAAAAGTGTG AGAGAAGTCA TTTTAAGTCT GTGACATTAA ATGTAATTTT 1000 CTGTCTCCAG CATTATAATA AGAATCAAAG ATTTAATCTA ATACACCGAT 1050 GGAATATTGT TTATAACGTA TTTACTGTTT CAAGCCTTCA AAACCAAGAG 1100 AAAACAAAAT GAGTACCTGT TCCTTCTGAG AAATGCCCTT CTTCCTGTTC 1150 AGAATCCCTG TGTATAACAG GAATGCTCTC GAGTTAACAG CCAAGTAAGA 1200 GGCCCATCGG CTGGCAGGTG CCCACCTAGC TAGGTGCAAG CAGAGGTGGC 1250 AGTGCTCCCA GGACCAACAG CAGAAACATG GCTTAACTAT CCTGTGTTTA 1300 GCAGTTCTCT TACGGGTTTT CACAACACCT AAAAAGCGCC CTGATGGGGT 1350 AAAGCCTCTG CCTTCATGCT GCTGCCCCGT CTCTGAAAAG CAGGACGTAA 1400 ATATACAATT TAGGAGGTAA GAGGGACATC TGCCATTGTT TTCTTTAACA 1450 CAGTCAGCCT CTGTTTAATG AATCCCAGCC ACCTCCCTCC ACCTACCATC 1500 ATTCCTAAGG TTTGCAGAGG AGCTGCCATA GAGCTCAAAA CACGGWNTAC 1550 AGACAAGCAT NTTCTCCATC CCTCCTCATC TTCTCACAGG CCGCTTGACA 1600 ACATCTCTAG GAGGGGGTGG AGGCGCCACC AGTGTTTGAG CCCCTCGTTC 1650 ACGCAAAGCC TTGACTCTGG AGTTCTAGTC CTCGCGGGAC CTTAGGAAGT 1700 TCACGGTCAA TACTCCGCCC TTGGGCTCAG ACACTAAGAG GATCTCCGGG 1750 TAAAGAGATA GACAGTAGCT CCATGCCTGA TTTAGGAAAA CTGTCCGTAC 1800 AGACAGTTGT AATTCATTCC TTTCAGAGAC AAATCCTGCT CTCTTCCTAG 1850 TTCCTGAAGT CATTAAAATC AAAAGCTCTC AGAAACGTCC CAGCATTTGC 1900 TAAGTCCACG CTGGGGGAGG ATGGGCAGAG CCGTGTTCAG CGCGTTTGAC 1950 AGCAACACCC ACTTATTTCA TTYAGTATCC ATAGGCATAT ATCATGCACC 2000 TGGTATAGGC CTCTCTCTCA GCACTGGAGA TACAGCAAGA AAACGCTATT 2050 CCTGCCCCAT GGAGCTTGTW MARAAAAATA GANNNAAAAA CCCTTTANAA 2100 ANGGAAGCTR CCNGMTGGGN CMAAGTNAAA ATTAAGTAAA AAGAAAWCCG 2150 TGARRAAACC CTTCAGTNAT ATTAAGAAAG AAANTAGCTT GATGAAACCC 2200 CAGGTGTANA AATTNNCACT AAAACAATGS TCCCAATTAA AACCCCCMAA 2250 TTCATGGAAT TTACTCNAGT ANCCTGNAAC TAGGRAAACC AAATTCTAGC 2300 CNATAGTTTC TCCCTTCTAA ATNTTCTCAT GAGAAAACAA YTTATTTCCA 2350 AAGANATTTT CCATGATGGG GAAAGTTTTT TTCAACTTTG CTCAGGTATA 2400 AACTGAANAT ACAGCATTAA AGTAAAGATA GTTGCAGAGA CCACCAAATA 2450 GATACCCGTT TTCANAAAAA GTGCCAACAT GGAGCCAGAG AACATTTCCG 2500 TTACATCACG CTTTTACGGC TTTGAAAATT AACAGAGATG ATAATCCCCC 2550 MCCTTGGGTT TCCNACTCCN TCCCTCCTNA ATTTTACCTC CTTTAATTGT 2600 CATCATGTCT GGAGATTATA ATCCAAGATA CTAAGATGTT TATNTCATAC 2650 ATCGCCTCCA CACAGTGTGT CTNANAAGCT CTTGCAAGAA TCCAAACATT 2700 GTGCTGGTCT GGGTAGAAAA GGAAATTCCA TGGTTTGTTG AACCCAGGAA 2750 CTCTTCAGTA CATCTCCGAG GTAAAACTGT TTAAATACAA TTAAAGTTCT 2800 ACAGTTAAAG GGTACCCTCC TCCACTGTTG GTGGGAATGT AAACTGGTAC 2850 AATCACTATG AAAAACAGGA TGGAGGTACT TCAGAAAATG AAGTATAGAA 2900 CTACCACAGG ATCCAGCACT CTCACTCCTG GGCACCTATC AGGACAAAAA 2950 ATTCGCTGCA AAAGATGCAT GCACCCATAG CTATGTTCAC TGCAGCAGCA 3000 TTCACAATAG CCAAGACATG GAAACGACCT AAATGTCCAT CAACAGCTGA 3050 ATGCATTAAG AAGACGTGGT ATATACACAC AATGGAATAC TACTCAAGTC 3100 ATGAAAAAGA ACAAAAGAAT GCCATTTGCA GCAACATGGC ATGGCTGGAA 3150 CTAGAGACTC ATGCTAAATG AAGTCAGTGA GAAAGAGAAA GACAAATACC 3200 ACATGATATC ACTTATATCT GGAATCTAAT ATACGACACA CATGAAACTT 3250 TCCACAGAAA AGAAAACCTN CATGGACTTT GGAGAACAGA CTTGTGGTTT 3300 CSCCAAGGGG GGARGGGGGG AAGACCGTGG GAGGACTGGG GAGCTTTGGG 3350 GTTAATAGAT GCAAAACTAT TGCCTTTNGA ATGGATAAGC CAATGGGATC 3400 CTGCTGTACC AGAACCRGGG AACTATANCT AGTCACTTGC KNTAGAACAT 3450 GATGGAGGAT NATNTGAGAN AAAGAATATN TGTGTGTGTK AGAGAGAGAG 3500 AGACTGGCTC CACTTTGCTG TATAGTAGAA AACTGACAGA ACACCGTAAA 3550 CCATTAAATA AAAATCCAGT AAAAATTTAA AAATAAAAAC ACACATTGGT 3600 TCCAATGTGT TTAAAAGCAA TAAAGTTCTA TAATTGCAGC AGATGCATCT 3650 GAGGTTTACA CGGAGAGCTT CCATTCCTTA CCATCCTCTC ATTCCTTAAC 3700 TCTAATGTGA TACAGGTTCT ATTCTCACCA TTCTATGAAC AAAAGAGCAG 3750 CTGATTTACA GGTTGGATTT TTCAAAAAAA AAAATTTCTT TACCAGGATC 3800 CCAAATGTAA CAAAGGGTCA ATATAGAAAA CTTAAAAAGC ACAGCCAAAG 3850 AGAAATATAC ATAAGCCTTT CAACTATTAA TTTTGATTAA TATCCAACGA 3900 ATCTCTTTTT AAGTGTATCA ATATATTATT CATTTTAATA AAAGAAATTG 3950 CAAGAGGCAC TTGCTTTTTC TGCTTACAAA TACGGTTTCT CAAATCGATT 4000 TTTTTTATAT ACTGTTTGCA TAGAATTTCA ATCCATAAAG CTACCTATTG 4050 AAAATTCCTT ATATTTCTGC TAAACACTTA AGGGCTTATA TTTTCTCCAA 4100 ATTTATACAT CCTTGCTCAC AGTTCTGACG ATGTCTTTGG GATAAACTCT 4150 AAATGGAACT AGAGGTTTAA AAGTTATGTC CATTTAAAAC TTTTAACACA 4200 AAAAAAGGTA AGTTAAAAAG TAAAAGTTTG GGGAGGCTGC TGGTCGCCCC 4250 CCCAACATTG GCTGACATTT TTATTCTTTG ACAACAAATA GGAAGAAAAT 4300 GTCAATGTCT TTTTTTACTG CTTAATACTG GTCATGTTAC TTTTCTTTCC 4350 TTTTGCTAAT CATACAGGCT TACTCACAAC TCTACAAAAA AATCTTACTC 4400 ATTCCTAATG TTCCTTCATT GAGAGATTGG TTTGCCGGAA ACGTTCTCAC 4450 TCTCACCAAG TCCCAACAGT CCCAACTCTA ACGACGGTCG CTGCTTCCAG 4500 AAATACGGCA CTTAAGGCAC CCTCGTCCTT ACCTTTTTCA TGCATGTGTA 4550 TTTCATTTTC AATAAAACAT TGAGTTGTTC CAAGGCCAGA CCATAGAGTT 4600 GAGCCCCAAC ATGCTAGTGG CCCAGTGTGA TGTAATAATT TACCTTCCCA 4650 GGGGTCCTCT CCGGGGGGGT ACAGGCGAGA CTAAGTGACT TTAAGCTGTT 4700 GGGAGAACAA TGGCCAAACC TTTCGTGATT TTGAAATCTA TCAGGCCACG 4750 AGACACTTCG GTAGCGGACG CTCAACCCTG GGAATCCCAA CTATTGTCCC 4800 AAATTTTGCC TGACTCGTGC CAAAGATTGA GCCAGGGCCC GGGTGTCCAG 4850 GCAGTCTGCA GTGCCCCAGT CCCCACCAGA GCCCTGAAGG GTGTCGGGCC 4900 CCACGAAACC GCTGCCCGGG CTCTAGGGTT TCTGTTTTCA GGTCGCTGCG 4950 CTTTATTCTC TAATTCAGCG TTCCCGAAAG AGACCATGAG GACCCGCCCA 5000 GTGTCCTTTA CACCTTCCCG TGTCGGGTGG CGACAGCTGT TTACGAAGAA 5050 GAGTGCACCA CCCTTTCCCG CAAGCCGCAG CGGTTAGTTC CGCAGAAGGA 5100 GGAGCCAGGG CGTCGGGCCG CAGCTGGGAG AGAGGCCCGG CAGCGGGCGC 5150 CGCGGAGCAG CAAGGGCGTC CCTCTCTCGG CCGGAGCCCC GCCCCGCCCC 5200 GCCCCCACGG CCCCGCCTTG CGGCCCGCCC ATTGGCTCCG CCGGGCCCTG 5250 GAGTCACTCC CTAGAGCCAC TTCCGCCCAG GGCGGGGCCC AGGCCACGCC 5300 CACTGGCCTG ACCGCGCGGG AGGCTCCCGG AGACCGTGGA TTCTTACTCC 5350 TGCTGTCGGA ACTCGAAGAG GTCTCCGCTA GGCTGGTGTC GGGTTACCTG 5400 CTCATCTTCC CGAAAATG 5418[Sequence list] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 5,418 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Direct origin: λFIXII swine genomic phage library Sequence GAATTCTGCG TACACGGGGC CCCGGTGGCT TTACATCATC GCTACAGCGA 50 CATGGGATCC GAGCCGTGTC TACAACCTAC ACAACAACGC CAGATCCTTA 100 ACCCAATGCA TGAGGACAGG GCTCAAACCT GCGGCCTCAT AGATGCTAGT 150 CAGATTCGTT TCTGCTGAGC CACAATGGGA ACTCCTAATT CTAGATCGAT 200 CTAGAATTAG GAGTTCCCAT TGTGGCTCAG CAGAAACGAA TCTGACTAGC 250 ATCTATGAGG CCGCAGTTTG AGCCCTGTCC TCATGCATTG GGTTAAGGAT 300 CTGGCGTTGT TGTGTAGGTT GTAGACACGG CTCGGATCCC ATGTCGCTGT 350 AGCGATGATG TAAAGCCACC GGGGCCCCGT GCTACGCAGA ATTCNTGCAG 400 CCCGGGGGAT CCACTAGTTC TAGCNAGAGA GTTGAAAATT TAAAGAACAT 450 TTCTCCCCTA ATCTCCCAAA ATATGGGCAA AGGACAGGTA CCCGTGGCAC 500 TGGAAAAATA CAGGCAAGCA ACCCATGAGT ACATGAAAAG ATGCTCCAGG 550 GTTCGGCCTA ATGGAAGCCC GATCAATGAGGATCGA TGATCTAGTCGATCAG ATGATCGA TGATCGATCAG AGAATGAAA 650 ATTCTCTATC ACAAGGAAAA ATGTTGTATG TTGTTTTTCC CATAATGGAG 700 GTCAGTGGGC GCTATGATTA ACAAATATCT GATGCCTGTG ACTTTTTAAT 750 TGCAAGAAAT CTGTGNAGTT TTTTTATTAT CTATGGGAAA TATTGCATAT 800 ATTAATGATA TCACCTAACT TGTATTATTG AGCAATTCTG TCCACATCTG 850 GCCTTTCATC TTTCATCTAA AAAGCAGGGG CTGGACCAAC TGACCTTCAG 900 TGCCATTCTT ACTGCTAACA TTCTAATTTT GTTTTTATTG CCTTTTTGTA 950 CAAAAGTGTG AGAGAAGTCA TTTTAAGTCT GTGACATTAA ATGTAATTTT 1000 CTGTCTCCAG CATTATAATA AGAATCAAAG ATTTAATCTA ATACACCGAT 1050 GGAATATTGT TTATAACGTA TTTACTGTTT CAAGCCTTCA AAACCAAGAG 1100 AAAACAAAAT GAGTACCTGT TCCTTCTGAG AAATGCCCTT CTTCCTGTTC 1150 AGAATCCCTG TGTATAACAG GAATGCTCTC GAGTTAACAG CCAAGTAAGA 1200 GGCCCATCGG CTGGCAGGTG CCCACCTAGC TAGGTGCAAG CAGAGGTGGC 1250 AGTGCTCCCA GGACCAACAG CAGAAACATG GCTTAACTAT CCTGTGTTTA 1300 GCAGTTCTCT TACGGGTTTT CACAACACCT AAAAAGCGCC CTGATGGGGT 1350 AAAGCCTCTG CCTTCATGCT GCTGCCCCGT CTCTGAAAAG CAGGACGTAA 1400 ATATACAATT TAGGAGGTAA GAGGGACATC TGCCATTGTT TTCTTTAACA 1450 CAGTCAGCCT CTGTTTAATG AATCCCAGCC ACCTCCCTCC ACCTACCATC 1500 ATTCCTAAGG TTTGCAGAGG AGCTGCCATA GAGCTCAAAA CACGGWNTAC 1550 AGACAAGCAT NTTCTCCATC CCTCCTCATC TTCTCACAGG CCGCTTGACA 1600 ACATCTCTAG GAGGGGGTGG AGGCGCCACC AGTGTTTGAG CCCCTCGTTC 1650 ACGCAAAGCC TTGACTCTGG AGTTCTAGTC CTCGCGGGAC CTTAGGAAGT 1700 TCACGGTCAA TACTCCGCCC TTGGGCTCAG ACACTAAGAG GATCTCCGGG 1750 TAAAGAGATA GACAGTAGCT CCATGCCTGA TTTAGGAAAA CTGTCCGTAC 1800 AGACAGTTGT AATTCATTCC TTTCAGAGAC AAATCCTGCT CTCTTCCTAG 1850 TTCCTGAAGT CATTAAAATC AAAAGCTCTC AGAAACGTCC CAGCATTTGC 1900 TAAGTCCACG CTGGGGGAGG ATGGGCAGAG CCGTGTTCAG CGCGTTTGAC 1950 AGCAACACCC ACTTATTTCA TTYAGTATCC ATAGGCATAT ATCATGCACC 2000 TGGTATAGGC CTCTCTCTCA GCACTGGAGA TACAGCAAGA AAACGCTATT 2050 CCTGCCCCAT GGAGCTTGTW MARAAAAATA GANNNAAAAA CCCTTTANAA 2100 ANGGAAGCTR CCNGMTGGGN CMAAGTNAAA ATTAAGTAAA AAGAAAWCCG 2150 TGARRAAACC CTTCAGTNAT ATTAAGAAAG AAANTAGCTT GATGAAACCC 2200 CAGGTGTANA AATTNNCACT AAAACAATGS TCCCAATTAA AACCCCCMAA 2250 TTCATGGAAT TTACTCNAGT ANCCTGNAAC TAGGRAAACC AAATTCTAGC 2300 CNATAGTTTC T CCCTTCTAA ATNTTCTCAT GAGAAAACAA YTTATTTCCA 2350 AAGANATTTT CCATGATGGG GAAAGTTTTT TTCAACTTTG CTCAGGTATA 2400 AACTGAANAT ACAGCATTAA AGTAAAGATA GTTGCAGAGA CCACCAAATA 2450 GATACCCGTT TTCANAAAAA GTGCCAACAT GGAGCCAGAG AACATTTCCG 2500 TTACATCACG CTTTTACGGC TTTGAAAATT AACAGAGATG ATAATCCCCC 2550 MCCTTGGGTT TCCNACTCCN TCCCTCCTNA ATTTTACCTC CTTTAATTGT 2600 CATCATGTCT GGAGATTATA ATCCAAGATA CTAAGATGTT TATNTCATAC 2650 ATCGCCTCCA CACAGTGTGT CTNANAAGCT CTTGCAAGAA TCCAAACATT 2700 GTGCTGGTCT GGGTAGAAAA GGAAATTCCA TGGTTTGTTG AACCCAGGAA 2750 CTCTTCAGTA CATCTCCGAG GTAAAACTGT TTAAATACAA TTAAAGTTCT 2800 ACAGTTAAAG GGTACCCTCC TCCACTGTTG GTGGGAATGT AAACTGGTAC 2850 AATCACTATG AAAAACAGGA TGGAGGTACT TCAGAAAATG AAGTATAGAA 2900 CTACCACAGG ATCCAGCACT CTCACTCCTG GGCACCTATC AGGACAAAAA 2950 ATTCGCTGCA AAAGATGCAT GCACCCATAG CTATGTTCAC TGCAGCAGCA 3000 TTCACAATAG CCAAGACATG GAAACGACCT AAATGTCCAT CAACAGCTGA 3050 ATGCATTAAG AAGACGTGGT ATATACACAC AATGGAATAC TACTCAAGTC 3100 ATGAAAAAGA ACAAAAGAAT GCCATTTGCA GCAACATGGC ATGGCTGG AA 3150 CTAGAGACTC ATGCTAAATG AAGTCAGTGA GAAAGAGAAA GACAAATACC 3200 ACATGATATC ACTTATATCT GGAATCTAAT ATACGACACA CATGAAACTT 3250 TCCACAGAAA AGAAAACCTN CATGGACTTT GGAGAACAGA CTTGTGGTTT 3300 CSCCAAGGGG GGARGGGGGG AAGACCGTGG GAGGACTGGG GAGCTTTGGG 3350 GTTAATAGAT GCAAAACTAT TGCCTTTNGA ATGGATAAGC CAATGGGATC 3400 CTGCTGTACC AGAACCRGGG AACTATANCT AGTCACTTGC KNTAGAACAT 3450 GATGGAGGAT NATNTGAGAN AAAGAATATN TGTGTGTGTK AGAGAGAGAG 3500 AGACTGGCTC CACTTTGCTG TATAGTAGAA AACTGACAGA ACACCGTAAA 3550 CCATTAAATA AAAATCCAGT AAAAATTTAA AAATAAAAAC ACACATTGGT 3600 TCCAATGTGT TTAAAAGCAA TAAAGTTCTA TAATTGCAGC AGATGCATCT 3650 GAGGTTTACA CGGAGAGCTT CCATTCCTTA CCATCCTCTC ATTCCTTAAC 3700 TCTAATGTGA TACAGGTTCT ATTCTCACCA TTCTATGAAC AAAAGAGCAG 3750 CTGATTTACA GGTTGGATTT TTCAAAAAAA AAAATTTCTT TACCAGGATC 3800 CCAAATGTAA CAAAGGGTCA ATATAGAAAA CTTAAAAAGC ACAGCCAAAG 3850 AGAAATATAC ATAAGCCTTT CAACTATTAA TTTTGATTAA TATCCAACGA 3900 ATCTCTTTTT AAGTGTATCA ATATATTATT CATTTTAATA AAAGAAATTG 3950 CAAGAGGCAC TTGCTTTTTC TGCTTACAAA TACGGTTTCT CAAATCGATT 4000 TTTTTTATAT ACTGTTTGCA TAGAATTTCA ATCCATAAAG CTACCTATTG 4050 AAAATTCCTT ATATTTCTGC TAAACACTTA AGGGCTTATA TTTTCTCCAA 4100 ATTTATACAT CCTTGCTCAC AGTTCTGACG ATGTCTTTGG GATAAACTCT 4150 AAATGGAACT AGAGGTTTAA AAGTTATGTC CATTTAAAAC TTTTAACACA 4200 AAAAAAGGTA AGTTAAAAAG TAAAAGTTTG GGGAGGCTGC TGGTCGCCCC 4250 CCCAACATTG GCTGACATTT TTATTCTTTG ACAACAAATA GGAAGAAAAT 4300 GTCAATGTCT TTTTTTACTG CTTAATACTG GTCATGTTAC TTTTCTTTCC 4350 TTTTGCTAAT CATACAGGCT TACTCACAAC TCTACAAAAA AATCTTACTC 4400 ATTCCTAATG TTCCTTCATT GAGAGATTGG TTTGCCGGAA ACGTTCTCAC 4450 TCTCACCAAG TCCCAACAGT CCCAACTCTA ACGACGGTCG CTGCTTCCAG 4500 AAATACGGCA CTTAAGGCAC CCTCGTCCTT ACCTTTTTCA TGCATGTGTA 4550 TTTCATTTTC AATAAAACAT TGAGTTGTTC CAAGGCCAGA CCATAGAGTT 4600 GAGCCCCAAC ATGCTAGTGG CCCAGTGTGA TGTAATAATT TACCTTCCCA 4650 GGGGTCCTCT CCGGGGGGGT ACAGGCGAGA CTAAGTGACT TTAAGCTGTT 4700 GGGAGAACAA TGGCCAAACC TTTCGTGATT TTGAAATCTA TCAGGCCACG 4750 AGACACTTCG GTAGCGGACG CTCAACCCTG GGAATCCCAA CTATTGTCCC 4800 AAATTTTGCC T GACTCGTGC CAAAGATTGA GCCAGGGCCC GGGTGTCCAG 4850 GCAGTCTGCA GTGCCCCAGT CCCCACCAGA GCCCTGAAGG GTGTCGGGCC 4900 CCACGAAACC GCTGCCCGGG CTCTAGGGTT TCTGTTTTCA GGTCGCTGCG 4950 CTTTATTCTC TAATTCAGCG TTCCCGAAAG AGACCATGAG GACCCGCCCA 5000 GTGTCCTTTA CACCTTCCCG TGTCGGGTGG CGACAGCTGT TTACGAAGAA 5050 GAGTGCACCA CCCTTTCCCG CAAGCCGCAG CGGTTAGTTC CGCAGAAGGA 5100 GGAGCCAGGG CGTCGGGCCG CAGCTGGGAG AGAGGCCCGG CAGCGGGCGC 5150 CGCGGAGCAG CAAGGGCGTC CCTCTCTCGG CCGGAGCCCC GCCCCGCCCC 5200 GCCCCCACGG CCCCGCCTTG CGGCCCGCCC ATTGGCTCCG CCGGGCCCTG 5250 GAGTCACTCC CTAGAGCCAC TTCCGCCCAG GGCGGGGCCC AGGCCACGCC 5300 CACTGGCCTG ACCGCGCGGG AGGCTCCCGGAGACCGTGGA TTCTTACTCC 5350 TGCTGTCGGA ACTCGAAGAG GTCTCCGCTATA GGCTGGTGCATGCTGATCCATGACTCT
【図１】pMCPプロモーター（5.4kb）とhDAFcDNAを含む
導入用遺伝子の構造を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the structure of a gene for introduction containing a pMCP promoter (5.4 kb) and hDAF cDNA.
【図２】pMCPプロモーター（0.9kb）とhDAFcDNAを含む
導入用遺伝子の構造を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the structure of a transgene containing a pMCP promoter (0.9 kb) and hDAF cDNA.
【図３】比較として用いたhDAFプロモーターとhDAFcDNA
を含む導入用遺伝子の構造を示す図である。FIG. 3 hDAF promoter and hDAF cDNA used for comparison
It is a figure which shows the structure of the gene for introduction containing.
【図４】トランスジェニック哺乳動物及び非トランスジ
ェニックである哺乳動物について、hDAFcDNA特異的プラ
イマーを用いてPCR反応を行った結果を示す図である。
なお、図中の(1)と(3)はそれぞれhDAFcDNAを有すること
が確認されたブタとマウスの結果であり、(2)と(4)はそ
れぞれ同腹産仔のうちhDAFcDNAを有さないことが確認さ
れたブタとマウスの結果である。FIG. 4 is a diagram showing the results of PCR reactions performed on transgenic mammals and non-transgenic mammals using hDAF cDNA-specific primers.
Note that (1) and (3) in the figure are the results of pigs and mice confirmed to have hDAF cDNA, respectively, and (2) and (4) that hDAF cDNA is not among litters Are the results of confirmed pigs and mice.
【図５】TgF１マウス、比較のトランスジェニックマウ
ス及び通常のマウス（非トランスジェニックマウス）の
各種臓器中のhDAF由来のmRNAの発現を示す図である。な
お、（Ａ）はTgF１マウスの各種臓器に発現されたmRNA
を示す図であり；（Ｂ）は比較のトランスジェニックマ
ウス（hDAFプロモーターとhDAFcDNAを含む導入用遺伝子
（３）（図３参照）を導入して得たトランスジェニック
マウス）の各種臓器に発現されたmRNAを示す図であり；
（Ｃ）は非トランスジェニックマウスの各種臓器に発現
されたmRNAを示す図であり、最右端はヒトリンパ球細胞
（ｋ５６２）におけるhDAF由来mRNAの発現を示す。ま
た、図中の記号のB、H、K、Li、Lu、S及びTは、それぞ
れ脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓及び精巣を意味す
る。FIG. 5 shows the expression of hDAF-derived mRNA in various organs of TgF1 mice, comparative transgenic mice, and normal mice (non-transgenic mice). (A) shows mRNA expressed in various organs of TgF1 mouse
(B) shows expression in various organs of a comparative transgenic mouse (transgenic mouse obtained by introducing a transgene (3) containing an hDAF promoter and hDAF cDNA (see FIG. 3)). Fig. 4 shows mRNA;
(C) is a diagram showing mRNA expressed in various organs of a non-transgenic mouse, and the rightmost end shows expression of hDAF-derived mRNA in human lymphocyte cells (k562). Symbols B, H, K, Li, Lu, S and T in the figure mean brain, heart, kidney, liver, lung, spleen and testis, respectively.
【図６】トランスジェニックブタ及び同腹産仔の内、非
トランスジェニックであったブタより採取した赤血球に
ついて抗hDAFモノクローナル抗体を用いてFACS解析を行
った示す図である。なお、（Ａ）はトランスジェニック
ブタより採取した赤血球のhDAFの発現頻度を示す図であ
り；（Ｂ）は比較のために、同腹産仔の内、非トランス
ジェニックであったブタより採取した赤血球にはhDAFが
発現されていないこと示す図である。FIG. 6 is a diagram showing FACS analysis of erythrocytes collected from non-transgenic pigs among transgenic pigs and litters, using an anti-hDAF monoclonal antibody. (A) shows the expression frequency of hDAF in erythrocytes collected from transgenic pigs; (B) shows erythrocytes collected from non-transgenic pigs among litters for comparison FIG. 2 shows that hDAF is not expressed in.
【図７】トランスジェニック動物（●印）及び通常の動
物（▲黒四角▼印）より採取した赤血球とヒト血清を反
応させた際の溶血の程度を示す図である。なお、(a)は
マウス赤血球、(b)はブタ赤血球について調べた結果を
示す図である。図の横軸は補体含有量調整ヒト血清中の
HNSの割合を示し、縦軸は溶血率を示す。FIG. 7 is a diagram showing the degree of hemolysis when red blood cells collected from a transgenic animal (marked by ●) and a normal animal (marked by black square ▼) are reacted with human serum. (A) shows the results of examination on mouse erythrocytes, and (b) shows the results of examination on porcine erythrocytes. The horizontal axis in the figure is the complement content adjusted human serum
The ratio of HNS is shown, and the vertical axis shows the hemolysis rate.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 豊村 浩司 茨城県つくば市緑ケ原３丁目３番 日本ハ ム株式会社中央研究所内 (72)発明者 重久 保 茨城県つくば市緑ケ原３丁目３番 日本ハ ム株式会社中央研究所内 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Koji Toyomura 3-3 Midorigahara, Tsukuba-shi, Ibaraki Japan Central Research Laboratory (72) Inventor Shigeru Shigehisa 3-3-1 Midorigahara, Tsukuba-shi, Ibaraki Nihon-ham Central Research Laboratory Co., Ltd.
Claims (7)
遺伝子を有し、当該ヒトの補体制御因子を臓器・組織に
発現しているヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。1. A non-human transgenic mammal having a human complement regulatory factor (DAF / CD55) gene and expressing said human complement regulatory factor in an organ or tissue.
血管内皮細胞に発現している請求項１記載のトランスジ
ェニック哺乳動物。2. The transgenic mammal according to claim 1, wherein the human complement regulatory factor (DAF / CD55) is expressed in vascular endothelial cells.
全臓器・組織の血管内皮細胞に発現している請求項１又
は２記載のトランスジェニック哺乳動物。3. The transgenic mammal according to claim 1, wherein the human complement regulatory factor (DAF / CD55) is expressed on vascular endothelial cells of all organs and tissues.
遺伝子の上流側にブタ補体制御因子（pMCP）プロモータ
ーを有する請求項１〜３の何れかに記載のトランスジェ
ニック哺乳動物。4. The transgenic mammal according to claim 1, which has a porcine complement control factor (pMCP) promoter upstream of a human complement control factor (DAF / CD55) gene.
ターが、配列番号１に示される塩基配列又はその一部で
ある請求項４記載のトランスジェニック哺乳動物。5. The transgenic mammal according to claim 4, wherein the porcine complement regulatory factor (pMCP) promoter is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof.
畜又は実験動物である請求項１〜５の何れかに記載のト
ランスジェニック哺乳動物。6. The transgenic mammal according to claim 1, wherein the transgenic mammal is a domestic animal or an experimental animal.
ランスジェニックブタ又はトランスジェニックマウスで
ある請求項６記載のトランスジェニック哺乳動物。7. The transgenic mammal according to claim 6, wherein the transgenic mammal is a transgenic pig or a transgenic mouse.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10216410A JPH11239430A (en) | 1997-07-14 | 1998-07-14 | Transgenic mammal |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20523597 | 1997-07-14 | ||
| JP9-205235 | 1997-07-14 | ||
| JP10216410A JPH11239430A (en) | 1997-07-14 | 1998-07-14 | Transgenic mammal |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPH11239430A true JPH11239430A (en) | 1999-09-07 |
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ID=26514939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10216410A Pending JPH11239430A (en) | 1997-07-14 | 1998-07-14 | Transgenic mammal |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11239430A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1998
- 1998-07-14 JP JP10216410A patent/JPH11239430A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002015681A1 (en) | 2000-08-25 | 2002-02-28 | Nippon Meat Packers, Inc. | Transgenic mammals |
| US7485769B2 (en) | 2000-08-25 | 2009-02-03 | Nippon Meat Packers, Inc. | Transgenic mammals |
| JP2006129736A (en) * | 2004-11-02 | 2006-05-25 | Nippon Dobutsu Kogaku Kenkyusho:Kk | Pig cell for xenotransplantation, method for selecting the same, and pig for the xenotransplantation |
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