JPH11167A - 輸送シグナルをコードする遺伝子を含む核酸構築体 - Google Patents

輸送シグナルをコードする遺伝子を含む核酸構築体

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JPH11167A
JPH11167A JP9115947A JP11594797A JPH11167A JP H11167 A JPH11167 A JP H11167A JP 9115947 A JP9115947 A JP 9115947A JP 11594797 A JP11594797 A JP 11594797A JP H11167 A JPH11167 A JP H11167A
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cell
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ハンス‐ハラルト、ゼドラツェック
Rolf Prof Dr Mueller
ロルフ、ミューラー
Reinhard Luehrmann
ラインハルト、リュールマン
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Hoechst AG
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 宿主細胞における外来遺伝子の発現を正確に
調節できる遺伝子治療用核酸構築物の提供。 【解決手段】 読取方向の下流においてトランス遺伝子
と連結された核保持シグナルを有する核酸構築体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本出願は遺伝子操作、特に疾患の予防または治療（以
下、「遺伝子治療」という）に使用できる核酸構築体に
関する。
【０００２】背景技術 遺伝子治療において、遺伝子はそれらを生物で発現させ
る目的で生物中に導入される。これら遺伝子の調節は遺
伝子治療の予防または治療効果上重要である。特許出願
ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２０００、ＰＣＴ／ＥＰ９５／０
３３７０、ＰＣＴ／ＥＰ９５／０３３７１、ＰＣＴ／Ｅ
Ｐ９５／０３３６８、ＰＣＴ／ＥＰ９５／０３３３９で
は遺伝子発現レギュレーターについて記載している。こ
れらのレギュレーターはアクチベーター配列からなり、
その機能は例えば基礎転写の細胞特異的またはウイルス
特異的活性化である。このアクチベーター配列のＤＮＡ
配列はその３′末端でプロモーターモジュールの５′末
端に連結されている。構造遺伝子は次にその５′末端で
プロモーターモジュールの３′末端に連結されている。
【０００３】プロモーターモジュールは、ＣＤＦとＣＨ
ＦまたはＥ２ＦとＣＨＦファミリーの転写因子を結合さ
せるための核酸配列を含んでいる。細胞周期のＧ０およ
びＧ１期において、この結合は上流アクチベーター配列
の阻害と、ひいては下流に位置する（即ち、転写方向
で）構造遺伝子の転写の阻害に至る。
【０００４】細胞分裂のＧ０およびＧ１期において、細
胞中に含まれるＤＮＡは二倍体状態にある。細胞はＧ０
期に休止していて、その細胞周期過程でＧ１期に阻害さ
れる。Ｇ１期に続いてＳ期があり、そこではＤＮＡ合成
が起きて、ゲノムが複製される。続いてＧ２期があり、
細胞が四倍体状態にある。Ｇ２期に続いて細胞分裂（有
糸分裂＝Ｍ期）が起こる。娘細胞はＧ０またはＧ１状態
に入る。
【０００５】このため、細胞特異的またはウイルス特異
的アクチベーター配列と、このアクチベーター配列をＧ
０およびＧ１期で阻害するプロモーターモジュールとを
組み合わせれば、細胞特異的またはウイルス特異的と細
胞周期特異的（即ち、ＳおよびＧ２期に限定させる）と
の双方で構造遺伝子の発現を調節することができる。
【０００６】アクチベーター配列とプロモーターモジュ
ールとの組合せはキメラプロモーターと称される。遺伝
子治療にキメラプロモーターを適用する多くの可能性が
存在するが、これらプロモーターの欠点によりその適用
は制限されている。
【０００７】これら制限の例は以下の通りである： ‐構造遺伝子の転写を極端に低く行わせる弱いアクチベ
ーター配列 ‐選択されたプロモーターモジュールによっては細胞周
期依存的に十分に阻害できないアクチベーター配列の使
用 ‐構造遺伝子の転写の２つの（例えば、細胞またはウイ
ルス特異的と細胞周期特異的）レギュレーターへの制
限、および ‐細胞核中で転写産物の不十分な存続性 ‐または、細胞中に導入された構造遺伝子の転写産物の
不十分な細胞内輸送。
【０００８】
【発明の概要】本発明は、宿主細胞中で外来遺伝子（ト
ランス遺伝子）の発現を正確に調節することができる、
利用可能な核酸構築体を作製することをその目的とす
る。したがって、本発明は、読取方向の下流でトランス
遺伝子と連結された核保持シグナルを有する核酸構築体
に関する。
【０００９】好ましくは、核酸構築体は読取方向で５′
末端から３′末端に少くとも下記の要素（element ）を
含んでいる： （ａ）非特異的、細胞特異的、ウイルス特異的、代謝的
および／または細胞周期特異的に活性化しうる第一プロ
モーター配列またはエンハンサー配列（Ｉ）であって、
トランス遺伝子の基礎転写を活性化させる配列、（ｂ）
構造遺伝子として活性化合物をコードするトランス遺伝
子、および（ｃ）そのｃＤＮＡが５′末端で構造遺伝子
（ｂ）の３′末端に直接または間接的に連結されている
核保持シグナル（nuclear retention signal）。
【００１０】好ましくは、核保持シグナルの転写産物は
核放出因子と結合する構造を有している。
【００１１】新規な核酸構築体は要素（ａ）〜（ｃ）に
加えて下記要素を有することができる： （ｄ）核放出因子（nuclear export factor ）の基礎転
写を活性化する追加プロモーター配列またはエンハンサ
ー配列（II）、および（ｅ）核保持シグナル（ｃ）の転
写産物に結合し、かつ細胞核からトランス遺伝子の転写
産物の輸送を媒介する核放出因子をコードする核酸。
【００１２】
【発明の具体的説明】第一（Ｉ）プロモーター配列また
はエンハンサー配列（ａ）と第二（II）プロモーター配
列またはエンハンサー配列（ｄ）は同一でもまたは異な
っていてもよく、要素（ａ）および（ｄ）のうち少くと
も１つは非特異的、細胞特異的、ウイルス特異的、代謝
的、特に低酸素症でまたは細胞周期特異的に活性化しう
る。
【００１３】本発明の範囲内において、プロモーター配
列またはエンハンサー配列（ａ）および（ｄ）のうち少
くとも１つは、プロモーターモジュールＣＤＥ‐ＣＨＲ
またはＥ２ＦＢＳ‐ＣＨＲが隣接した上流の細胞特異
的、ウイルス特異的または代謝的に活性化しうるアクチ
ベーター配列と相互作用して、下流遺伝子の発現に影響
を与えうる、特にそれを阻害しうる、キメラプロモータ
ーである。
【００１４】要素ａ）およびｄ）はアクチベーター応答
性プロモーター単位であってもよい。この種の構築体は
下記要素を更に有している： （ｆ）非特異的、ウイルス特異的、代謝的または細胞特
異的および／または細胞周期特異的に活性化しうる、少
くとも１つのプロモーター配列またはエンハンサー配列 （ｇ）プロモーター配列またはエンハンサー配列（ｆ）
の下流に位置して、その基礎転写でプロモーター配列ま
たはエンハンサー配列（ｆ）により活性化される、少く
とも１つのアクチベーターサブ単位、および（ｈ）１以
上のアクチベーターサブ単位（ｇ）の発現産物により活
性化されるアクチベーター応答性プロモーター。
【００１５】本発明の一態様において、核酸構築体は、
プロモーター配列またはエンハンサー配列（ａ）および
／または（ｄ）および／またはアクチベーター応答性プ
ロモーターがキメラプロモーターであって、アクチベー
ターサブ単位（ｇ）がアクチベーター応答性プロモータ
ー（ｈ）のキメラプロモーターを活性化させる少くとも
１つの転写因子の遺伝子である核酸構築体である。
【００１６】ＳＶ４０プロモーターと組み合わされたＬ
ｅｘＡオペレーターが、２つのアクチベーターサブ単位
（ｇ、ｇ′）により活性化されるアクチベーター応答性
プロモーター（ｈ）の例である。アクチベーターサブ単
位（ｇ）はアミノ酸１‐８１または１‐２０２をコード
するＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質に関するｃＤＮＡ
を含み、その３′末端はＧａｌ８０タンパク質（アミノ
酸１‐４３５）に関するｃＤＮＡの５′末端に連結され
ている。第二アクチベーターサブ単位（ｇ′）はアミノ
酸８５１‐８８１をコードするＧａｌ４タンパク質のＧ
ａｌ８０結合ドメインのｃＤＮＡを含み、その３′末端
はアミノ酸１２６‐１３２をコードするＳＶ４０ラージ
Ｔ抗原のｃＤＮＡの５′末端に連結されていて、更にそ
の３′末端はアミノ酸４０６‐４８８をコードするＨＳ
Ｖ‐１ ＶＰ１６トランス活性化ドメインに関するｃＤ
ＮＡの５′末端に連結されている。
【００１７】ＳＶ４０プロモーターと組み合わされたＧ
ａｌ４タンパク質に関する結合配列が、２つのアクチベ
ーターサブ単位（ｇ、ｇ′）により活性化されるアクチ
ベーター応答性プロモーターのもう１つの例である。
【００１８】アクチベーター単位（ｇ）はＧａｌ４タン
パク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１‐１４７）に
関するｃＤＮＡを含み、その３′末端はＧａｌ８０タン
パク質（アミノ酸１‐４３５）に関するｃＤＮＡの５′
末端に連結されている。
【００１９】第二アクチベーターサブ単位（ｇ′）はＧ
ａｌ４のＧａｌ８０結合ドメイン（アミノ酸８５１‐８
８１）に関するｃＤＮＡを含み、その３′末端はＳＶ４
０の核局在シグナル（ＳＶ４０ラージＴ、アミノ酸１２
６‐１３２）のｃＤＮＡの５′末端に連結されていて、
更にその３′末端はアミノ酸４０６‐４８８をコードす
るＨＳＶ‐１ ＶＰ１６トランス活性化ドメインに関す
るｃＤＮＡの５′末端に連結されている。
【００２０】Ｇａｌ４タンパク質およびＳＶ４０プロモ
ーターに関する結合配列から構成されるアクチベーター
応答性プロモーターを活性化させる２つのアクチベータ
ーサブ単位（ｇ、ｇ′）のもう１つの例は、 ‐５′末端がＨＳＶ‐１ ＶＰ１６トランス活性化ドメ
イン（アミノ酸４０６‐４８８）に関するｃＤＮＡの
３′末端に連結されていて、５′末端が更にＳＶ４０の
核局在シグナル（ＳＶ４０ラージＴ、アミノ酸１６‐１
３２）のｃＤＮＡの３′末端に連結されている、ＣＤ４
Ｔ細胞抗原の細胞質ドメイン（アミノ酸３９７‐４３
５）に関するｃＤＮＡからなるアクチベーター単位
（ｇ）、および ‐ＳＶ４０の核局在シグナル（ＳＶ４０ラージＴ、アミ
ノ酸１２６‐１３２）のｃＤＮＡ；３′末端がｐ５６
ｌｃｋタンパク質のＣＤ４結合配列（アミノ酸１‐７
１）に関するｃＤＮＡの５′末端に連結されているＧａ
ｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１‐１
４７）に関するｃＤＮＡからなるアクチベーター単位
（ｇ′）により表される。
【００２１】好ましくは、核保持シグナルをコードする
遺伝子はＨＩＶ‐１またはＨＩＶ‐２のｒｅｖ応答性要
素（ＲＲＥ）、レトロウイルスのＲＲＥ等価保持シグナ
ル、あるいはＨＢＶのＲＲＥ等価保持シグナルからなる
群より選択される。
【００２２】核放出因子（ｅ）は、好ましくは、ウイル
スＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２、maedi-visna ウイルス、ヤ
ギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ
免疫不全ウイルス、レトロウイルス、ＨＴＬＶのｒｅｖ
遺伝子、ｈｎＲＮＰ‐Ａ１タンパク質の遺伝子、または
転写因子ＴＦIII-Ａの遺伝子からなる群より選択される
遺伝子である。一般的に、核酸はＤＮＡである。新規の
核酸構築体は慣例的にベクター、特にプラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクターとして用いられる。
【００２３】一般的に、トランス遺伝子は、サイトカイ
ン、成長因子、抗体または抗体断片、抗体または抗体断
片のようなリガンドとサイトカインまたは成長因子との
融合タンパク質、サイトカインまたは成長因子のレセプ
ター、抗増殖または静細胞効果を有するタンパク質、血
管形成インヒビター、凝固因子、血栓誘導物質および凝
固インヒビター、繊維素溶解効果を有する物質、補体活
性化タンパク質、ウイルスコートタンパク質、細菌抗原
および寄生虫抗原、血液循環に効果を有するタンパク質
と、リボザイムからなる群より選択される薬理学的に活
性な活性化合物をコードする構造遺伝子である。
【００２４】好ましくは、トランス遺伝子は、細胞周期
コントロールタンパク質、特にサイクリンＡ、サイクリ
ンＢ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、Ｅ２Ｆ１‐５、
ｃｄｃ２、ｃｄｃ２５ＣまたはＤＰ１、あるいはウイル
スタンパク質、サイトカイン、成長因子またはそれらの
レセプターからなる群より選択されるタンパク質をコー
ドするｍＲＮＡを不活化するリボザイムをコードする構
造遺伝子である。
【００２５】特殊な態様において、トランス遺伝子は制
御された細胞死（アポトーシス）、特にスフィンゴミエ
リナーゼを誘発させるタンパク質についてコードする構
造遺伝子であってもよい。
【００２６】もう１つの態様において、トランス遺伝子
（ｂ）は薬物の前駆体を開裂させて薬物を形成させる酵
素についてコードする構造遺伝子であってもよい。別の
態様において、構造遺伝子はリガンド‐酵素融合タンパ
ク質をコードすることもでき、その酵素は薬物の前駆体
を開裂させて薬物を形成させ、リガンドは細胞表面、好
ましくは内皮細胞または腫瘍細胞と結合する。
【００２７】プロモーター配列、エンハンサー配列また
はアクチベーター配列は、内皮細胞、平滑筋細胞、横紋
筋細胞、マクロファージ、リンパ球、腫瘍細胞、肝臓細
胞、白血病細胞およびグリア細胞で活性化される遺伝子
調節ヌクレオチド配列、あるいはＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳ
Ｖ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたはＨＩＶウイルスの
プロモーター配列からなる群より選択することができ
る。
【００２８】本発明は新規な核酸構築体を保有した単離
細胞または細胞系にも関する。
【００２９】この種の細胞は疾患の治療用薬剤を製造す
るために使用でき、薬剤の製造は標的細胞中への核酸構
築体の導入からなる。この種の疾患はしばしば過度な細
胞増殖を伴う。
【００３０】薬剤を製造するために、核酸構築体はまず
第一に標的細胞中に導入されなければならない。
【００３１】新規な核酸構築体は、任意のプロモータ
ー、エンハンサーまたはアクチベーター配列を用いるこ
と、特に、細胞中に導入された構造遺伝子の転写産物の
細胞核中での存続性を増加させるか、または細胞中に導
入された構造遺伝子の転写産物の細胞内輸送を増加させ
ることを可能とする。
【００３２】細胞核中における転写産物の存続性増加の
ための新規な核酸構築体は、下記要素を含んでいる： （ａ）構造遺伝子の基礎転写を活性化させる、プロモー
ター配列またはエンハンサー配列Ｉ （ｂ）望ましい活性化合物をコードする、好ましくはｃ
ＤＮＡの形をとったトランス遺伝子（構造遺伝子）、お
よび（ｃ）そのｃＤＮＡが５′末端で構造遺伝子の３′
末端に好ましくは直接連結されている核保持シグナル
（ＮＲＳ）。個別要素の配置は、例えば図１で示されて
いる。
【００３３】転写産物の細胞内輸送増加のための新規な
核酸構築体は、構造遺伝子の基礎転写を活性化させるプ
ロモーター配列またはエンハンサー配列Ｉと、望ましい
活性化合物をコードするトランス遺伝子に加えて、その
ｃＤＮＡが５′末端で構造遺伝子の３′末端に連結され
ていて、メッセンジャーＲＮＡが核放出因子（ＮＥＦ）
と結合する構造をとった核保持シグナル（ＮＲＳ）も有
している。
【００３４】これに加えて、この種の核酸構築体は、核
放出因子（ＮＥＦ）のｃＤＮＡの基礎転写を活性化させ
る別のプロモーター配列またはエンハンサー配列（II）
を有している。ＮＥＦの発現産物は、核保持シグナル
（ＮＲＳ）と結合し、これにより細胞核から構造遺伝子
の転写産物の輸送を媒介する。個別要素の配置は、例え
ば図２で示されている。
【００３５】新規な核酸構築体において、要素ａ）また
はｄ）のプロモーター配列またはエンハンサー配列は同
一でもまたは異なっていてもよく、更に要素ｄ）および
ｅ）は要素ａ）、ｂ）およびｃ）の上流または下流に位
置することができる。
【００３６】例えばＣＭＶ（ＥＰ‐Ａ‐０１７３１７
７）またはＳＶ４０からの少くとも１種の強いプロモー
ター配列またはエンハンサー配列、あるいは当業者に知
られているいずれか他のプロモーター配列またはエンハ
ンサー配列が、好ましくはプロモーター配列またはエン
ハンサー配列として用いられる。
【００３７】好ましい態様において、新規な核酸構築体
における少くとも１つのプロモーター配列またはエンハ
ンサー配列は、細胞特異的、代謝的（例えば、低酸素症
による）、ウイルス特異的または細胞周期特異的に活性
化しうる。
【００３８】特に好ましいものは以下の通りである： ‐内皮細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、造血細胞、リン
パ球、マクロファージ、グリア細胞または腫瘍細胞で転
写を細胞特異的に活性化させるプロモーター配列または
エンハンサー配列、および／または ‐ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、
ＨＴＬＶまたはＨＩＶウイルスのプロモーター配列また
はエンハンサー配列、および／または ‐低酸素症誘導性エンハンサー（Semenza et al.,PNAS,
88,5680 (1991)）またはプロモーター（McBurney et a
l.,Nucleic Acids Res.19,5755 (1991)；ＷＯ９５／２
１９２７）のような代謝的に活性化しうるプロモーター
配列またはエンハンサー配列、および／または ‐ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、ｃｄｃ２
遺伝子（Lucibello etal.,EMBO J.14,132(1995)；Zwick
er et al.,EMBO J.14,4514 (1995)；Zwickeret al.,Nuc
l. Acids Res.23,2833(1995)）、Ｂ‐ｍｙｂ遺伝子（La
m et al., EMBO J.12,2705 (1993)）、ＤＨＦＲ遺伝子
（Means et al.,Mol.Cell Biol.12,1054(1992)）および
Ｅ２Ｆ‐１遺伝子（Johnson et al.,Genes Dev. 8,1514
(1994)；Hsiao et al.,Genes Dev.8,15256(1994)）の
プロモーターのような、細胞周期特異的に活性化しうる
プロモーター。
【００３９】もう１つの好ましい態様において、新規な
核酸構築体における少くとも１つのプロモーター配列ま
たはエンハンサー配列はキメラプロモーターである。本
発明の意味において、キメラプロモーターは上流の細胞
特異的、代謝的またはウイルス特異的に活性化しうるア
クチベーター配列と下流のプロモーターモジュールとの
組合せからなる。プロモーターモジュールはＣＤＦとＣ
ＨＦまたはＥ２ＦとＣＨＦファミリーの転写因子を結合
させるヌクレオチド配列により特徴付けられ、それによ
り細胞周期のＧ０およびＧ１期で上流アクチベーター配
列の活性化を阻害することができる（Lucibello et a
l.,EMBO J.14,132(1994)；ＰＣＴ／ＧＢ／０２００
０）。
【００４０】もう１つの好ましい態様において、新規な
核酸構築体における少くとも１つのプロモーター配列ま
たはエンハンサー配列（要素（ａ）または（ｄ））はア
クチベーター応答性プロモーター単位である。
【００４１】アクチベーター応答性プロモーター単位は
その部分に関して下記要素から構成されている： （ｆ）例えば細胞周期特異的、代謝的、細胞特異的また
はウイルス特異的に活性化しうるか、あるいは細胞周期
特異的および代謝的、細胞特異的またはウイルス特異的
に双方で活性化しうる（いわゆるキメラプロモータ
ー）、１以上の同一または異なるプロモーター配列また
はエンハンサー配列 （ｇ）各場合にプロモーター配列またはエンハンサー配
列の下流に位置して、それらの基礎転写でこれらの配列
により活性化される、１以上の同一または異なるアクチ
ベーターサブ単位、および （ｈ）１以上のアクチベーターサブ単位の発現産物によ
り活性化されるアクチベーター応答性プロモーター。
【００４２】好ましいアクチベーター応答性プロモータ
ー単位の個別要素の配置は図３で示されている。
【００４３】新規な核酸構築体中への好ましいアクチベ
ーター応答性プロモーター単位の挿入は、例えば図４で
示されている。
【００４４】それらの最も簡単な形のとき、アクチベー
ター応答性プロモーター単位は、例えば図５で示された
ようなキメラプロモーター構築体を表すことができる。
【００４５】もう１つの態様において、新規なアクチベ
ーター応答性プロモーター単位はＤＮＡ結合ドメイン、
タンパク質‐タンパク質相互作用ドメインおよびトラン
ス活性化ドメインから構成されるキメラ転写因子を結合
させるための配列を構成していてもよい。
【００４６】薬理学的に活性な活性化合物にとり好まし
い構造遺伝子はリボザイムに関する遺伝子であって、リ
ボザイムはサイトカイン、成長因子、サイトカインまた
は成長因子についてのレセプター、リガンド（例えば抗
体または抗体断片）とサイトカインまたは成長因子から
構成される融合タンパク質、抗増殖または静細胞効果を
有するタンパク質、血管形成インヒビター、血栓誘導タ
ンパク質、血液凝固インヒビター、補体活性化タンパク
質、ウイルスのコート物質および細菌のコート物質から
なる群より選択される混合アンチセンスＲＮＡ、タンパ
ク質および糖タンパク質を有している。
【００４７】細胞周期のコントロールに特に関与するタ
ンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡを特異的に開裂
させるリボザイムの遺伝子が特に好ましい。
【００４８】これらのタンパク質には、特にサイクリン
Ａ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、サイクリンＢ、ｃ
ｄｃ２、Ｅ２Ｆ１‐５、ＤＰ１およびｃｄｃ２５Ｃがあ
る（La Thangue,Current Opin.Cell Biol.6,443 (199
4)；Muller,Trends Genet.11,173(1995)；Zwicker et a
l.,EMBO J.14,4514 (1995)）。
【００４９】好ましい態様において、核保持シグナル
（ＮＲＳ）は、それに連結されたプレメッセンジャーＲ
ＮＡの核膜からの輸送を妨げながら、他方で輸出タンパ
ク質を結合させるための構造をもったヌクレオチド配列
である。この輸出タンパク質は、細胞核からＮＲＳを含
んだプレメッセンジャーまたはメッセンジャーＲＮＡの
細胞質中への輸送を媒介する。こうして、ＮＲＳを含ん
だプレメッセンジャーまたはメッセンジャーＲＮＡは、
輸出タンパク質に結合した結果として細胞核から分泌さ
れる（Fischer et al.,Cell,82,475(1995)）。
【００５０】ＮＲＳは、好ましくはレトロウイルスのｒ
ｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）配列である。ＨＩＶ‐１にお
いて、このＲＲＥはｅｎｖ遺伝子（Malim et al.,Natur
e,338,254 (1989)；Kjems et al.,PNAS,88,683(1991)）
の２４３ヌクレオチド（ヌクレオチド７３６２‐７５９
５；Muesing et al.,Nature,313,450 (1985)）を含んだ
配列である。しかしながら、本発明の意味内において、
核保持シグナル（ＮＲＳ）はＨＢＶウイルスのＲＲＥ等
価物のような、相同的なおよび／または機能的に類似し
た（相似した）ヌクレオチド配列であってもよい（Huan
g et al.,Mol.Cell Biol.13,7476(1993)）。
【００５１】新規な核酸構築体において、核放出因子
（ＮＥＦ）は、ＮＲＳのｍＲＮＡと結合して、細胞核か
らＮＲＳを含んだプレメッセンジャーＲＮＡまたはメッ
センジャーＲＮＡの細胞質中への（または細胞質から細
胞核中への）輸送を媒介するタンパク質をコードするヌ
クレオチド配列である。本発明の意味において、レトロ
ウイルス、特にＨＩＶ‐１またはＨＩＶ‐２ウイルスか
らのｒｅｖ遺伝子が用いられる（Daly et al.,Nature,3
42,816(1989)；Emerman et al.,Cell,57,1155 (1989)；
Felber et al.,PNAS,86,1495(1989)；Fischer et al.,E
MBO J.13,4105 (1994)）。
【００５２】レトロウイルスのｒｅｖ遺伝子のｒｅｖタ
ンパク質は、そのＮ末端ドメインによりプレｍＲＮＡの
ＲＲＥ（Iwai et al.,Nucl. Acids Res.20,6465 (199
2)）と結合する（Zapp et al.,Nature,342,714(1989)；
Malim et al.,Cell,65,241(1991)）。ＲＲＥとｒｅｖタ
ンパク質との結合は“非スプライス”プレメッセンジャ
ーＲＮＡとＲＲＥを含むいずれか他のＲＮＡとを細胞核
から細胞質中に輸送させることができ（Fischer et a
l.,EMBO J.13,4105 (1994)；Fischer et al.,Cell,82,4
75(1995)）、結果的に翻訳を著しく増加させる。
【００５３】本発明の意味において、visna-maedi ウイ
ルス（ＶＭＶ；Tiley et al.,J.Virol.65,3877(1991)）
のｒｅｖ遺伝子またはヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥ
Ｖ；Tiley et al.,J.Virol.65,3877(1991)）のｒｅｖ遺
伝子のような、ＨＩＶ‐１のｒｅｖタンパク質（Bogerd
et al.,Cell,82,485 (1995)）と相同的であるかまたは
機能的に類似しているタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列もＮＥＦとして使用できる。
【００５４】本発明の意味において、ｒｅｖタンパク質
と低または無相同性を有するだけでありながら、ＨＩＶ
‐１のｒｅｖタンパク質と機能的に類似しているタンパ
ク質をコードする遺伝子も使用できる。
【００５５】これらの遺伝子には、例えばＨＴＬＶ‐１
のｒｅｘ遺伝子（Cullen,Microbiol.Rev.56,375 (199
2)）と、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびネ
コ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のｒｅｖ遺伝子（Manusc
o et al.,J.Virol.68,1988(1994)）がある。
【００５６】代わりの態様において、ＮＥＦは、核から
のＲＮＡを、このＲＮＡがＮＲＳにより核に留められて
いなくても分泌させるタンパク質についてのヌクレオチ
ド配列であってもよい。これらのタンパク質には、例え
ば転写因子ＴＦIII Ａ（Gaddat et al.,Cell,60,619 (1
990)）または異種核リボヌクレオ‐タンパク質Ａ１（ｈ
ｎＲＮＰＡ１タンパク質；Pinol-Roma et al.,Nature,3
55,730(1992)）がある。
【００５７】加えて、核輸送タンパク質には、広義の意
味で、熱ショックタンパク質７０（ｈｓｃ７０；Mandel
l et al.,J.Cell Biol.111,1775 (1990)）およびタンパ
ク質キナーゼインヒビターＣＰＫＩ（Fantozzi et al.,
J.Biol.Chem.269,2676(1994)；Wen et al.,J.Biol.Che
m.269,32214(1994)）がある。
【００５８】ＮＥＦとその相同的および相似的タンパク
質により一般的に保有される特徴は、ＮＲＳのＲＮＡに
モノマータンパク質を結合させるためのよりアミノ末端
側に位置するドメイン（J.Virol.64,881(1990)；Kjems
et al.,EMBO J.11,1119 (1992)）と、ＮＥＦの輸送機能
に要求される主にロイシンに富むドメイン（ｈｎＲＮＰ
Ａ１はこの例外である）（Wen et al.,Cell.82,463(199
5)；Fischer et al.,Cell,82,475(1995)；Malim et a
l.,J.Virol.65,4248(1991)；Venkatesh et al.,Virol.1
78,327(1990)）である。
【００５９】核酸構築体は、好ましくはＤＮＡから構成
される。核酸構築体という用語は、標的細胞中で転写さ
れうる人工核酸構築体を意味すると理解されている。そ
れらは好ましくはベクター中に挿入され、プラスミドベ
クターまたはウイルスベクターが特に好ましい。
【００６０】新規な核酸構築体を用いると、トランス遺
伝子（要素ｂ）は細胞特異的、ウイルス特異的または特
定の代謝条件下で、しかも細胞周期特異的に双方で発現
させることができ、その構造遺伝子は薬理学的に活性な
活性化合物、または薬物の不活性前駆体を開裂させて活
性な薬物を形成させる酵素についてコードする遺伝であ
ることが好ましい。構造遺伝子は、この酵素がリガンド
との融合タンパク質として発現されて、このリガンドが
細胞の表面、例えば増殖している内皮細胞または腫瘍細
胞と結合するように選択することができる。
【００６１】本発明は新規な核酸構築体を保有した酵母
または哺乳動物の細胞にも関する。特に好ましい態様に
おいて、核酸構築体は細胞系中に導入されてから、トラ
ンスフェクション後に、トランス遺伝子を発現させるた
めに使用できる。その結果、これらの細胞は患者向けに
患者体内で薬剤を作らせて、ひいては疾患を治療するた
めに用いることができる。新規な核酸構築体の好ましい
使用は疾患を治療するためであり、薬剤の製造は標的細
胞中への核酸構築体の挿入とそのウイルス特異的または
標的細胞特異的で細胞周期特異的な発現とを含む。疾患
にはしばしば過度な細胞増殖を伴う疾患があり、薬剤の
製造は標的細胞中への核酸構築体の挿入と細胞増殖段階
におけるそのウイルス特異的または標的細胞特異的発現
を含む。
【００６２】新規な核酸構築体は自然にはこの形で生じ
ることがなく、即ち活性化合物、酵素またはリガンド‐
酵素融合タンパク質についてのトランス遺伝子または構
造遺伝子は核保持シグナル（ＮＲＳ）と自然には組み合
わされず、２つはプロモーターＩに自然には連結され
ず、そのためこの組合せはプロモーターIIと核放出因子
（ＮＥＦ）からなるヌクレオチド配列と自然には組み合
わされない。
【００６３】新規な核酸構築体のプロモーターＩおよび
IIと活性化合物（または酵素）の構造遺伝子は、意図し
た適用例に応じて選択される。一部の好ましい適用可能
性を以下に示す：
【００６４】１．１ 強い非特異的プロモーターまたは
エンハンサーと構造遺伝子を発現させるためのキメラプ
ロモーターとの組合せこのような組合せの例は図６で示
されている。
【００６５】１．２ 構造遺伝子を発現させるための２
つの異なるまたは同一キメラプロモーターの組合せこの
ような組合せの例は図７で示されている。
【００６６】１．３ 構造遺伝子を発現させるための２
つの異なるまたは同一プロモーターまたはエンハンサー
の組合せこのような組合せの例は図８で示されている。
【００６７】１．４ アクチベーター応答性プロモータ
ーこのような組合せの例は図９で示されている。
【００６８】１．５ 構造遺伝子の多重制御発現のため
の異なるプロモーターの多様な組合せこのような組合せ
の例は図１０で示されている。核酸構築体の意図した使
用に応じて、下記態様が選択できる：
【００６９】２．内皮の増殖を阻害することによる腫瘍
および慢性炎症の治療 ２．１．ａ）内皮細胞で活性化されるプロモーターまた
はアクチベーター配列の選択 本発明の意味において、プロモーターまたはエンハンサ
ーから構成される好ましいプロモーターまたはアクチベ
ーター配列には、特に内皮細胞（またはその他に増殖内
皮細胞のすぐ近くにある細胞）で検出できるタンパク質
をコードする遺伝子についての遺伝子調節配列または要
素がある。
【００７０】これらタンパク質の一部はBorrows et al.
（Pharmac.Ther.64,155(1994) およびPlate et al.,Bra
in Pathol.4,207 (1994)）により記載されている。これ
ら内皮細胞特異的タンパク質の例は、特に下記の通りで
ある。 ‐脳特異的内皮グルコース‐１‐トランスポーター プロモーター配列は Murakami et al.（J.Biol.Chem.26
7,9300(1992)）により記載されていた。 ‐エンドグリン プロモーター配列は Bellon et al.（Eur.J.Immunol.2
3,2340 (1993)）およびGe et al.（Gene,138,201(199
4)）により記載されていた。
【００７１】‐ＶＥＧＦ‐レセプター ２つのレセプターに分けられる（Plate et al.,Int.J.C
ancer,59,520(1994)）： ・ＶＥＧＦレセプター１（flt-１）（de Vries et al.,
Science,255,989 (1992)） ・ＶＥＧＦレセプター２（flt-１、ＫＤＲ）（Terman e
t al.,BBRC,187,1579(1992)） 双方のレセプターはほとんど例外なく内皮細胞でみられ
る（Senger et al.,Cancer Metast.Rev.12,303(1993)）
【００７２】‐他の内皮細胞特異的レセプターチロシン
キナーゼ ・til-１またはtil-２ （Partanen et al.,Mol.Cell.Biol.12,1698 (1992)；Sc
hnurch and Risau,Development,119,957(1993) ；Dumon
t et al.,Oncogene,7,1471 (1992)） ・Ｂ６１レセプター（Ｅｃｋレセプター） （Bartley et al.,Nature,368,558 (1994)；Pandey et
al.,Science,268,567 (1995)；van der Geer et al.,An
n.Rev.Cell.Biol.10,251(1994)）
【００７３】‐Ｂ６１ Ｂ６１分子はＢ６１レセプターのリガンドである。 （Holzman et al.,J.Am.Soc.Nephrol.4,466 (1993)；Ba
rtley et al.,Nature,368,558 (1994)）
【００７４】‐エンドセリン、特に ・エンドセリンＢ プロモーター配列はBenatti et al.,J.Clin.Invest.91,
1149(1993)により記載されている。 ・エンドセリン１ プロモーター配列はWilson et al.,Mol.Cell.Biol.10,4
654(1990) により記載されている。 ‐エンドセリンレセプター、特にエンドセリンＢレセプ
ター （Webb et al.,Mol.Pharmacol.47,730(1995)；Haendler
et al.,J.Cardiovasc.Pharm.20,1 (1992)）
【００７５】‐マンノース‐６‐リン酸レセプター プロモーター配列はLudwig et al（Gene,142,311(199
4)）、Oshima et al（J.Biol.Chem.263,2553(1988)）お
よびPohlmann et al（PNAS USA,84,5575(1987)）により
記載されている。 ‐フォンビルブラント因子 プロモーター配列はJahroudi and Lynch（Mol.Cell.Bio
l.14,999(1994)）、Ferreira et al（Biochem.J.293,64
1 (1993)）およびAird et al（PNAS USA,92,4567(1995)
）により記載されている。
【００７６】‐ＩＬ‐１αおよびＩＬ‐１β プロモーター配列はvon Hangen et al.,Mol.Carcinog.
2,68 (1986)；Turner et al.,J.Immunol.143,3556(198
9) ；Fenton et al.,J.Immunol.138,3972(1987)；Bensi
et al.,Cell Growth Diff.1,491 (1990)；Hiscott et
al.,Mol.Cell.Biol.13,6231(1993) ；Mori et al.,Bloo
d,84,1688(1994) により記載されている。
【００７７】‐ＩＬ‐１レセプター プロモーター配列はYe et al.,PNAS USA,90,2295(1993)
により記載されている。 ‐血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ‐１） ＶＣＡＭ‐１のプロモーター配列はNeish et al.,Mol.C
ell.Biol.15,2558(1995)；Ahmad et al.,J.Biol.Chem.2
70,8976 (1995)；Neish et al.,J.Exp.Med.176,1583 (1
992) ；Iademarco et al.,J.Biol.Chem.267,16323(199
2)；Cybulsky et al.,PNAS USA,88,7859(1991)により記
載されている。
【００７８】‐合成アクチベーター配列 天然内皮特異的プロモーターの代替物として、内皮細胞
で優先的または選択的に活性である転写因子のためのオ
リゴマー結合部位を含んだ合成アクチベーター配列も使
用できる。この例は、内皮‐１遺伝子における結合部位
が５′‐ＴＴＡＴＣＴ‐３′である転写因子ＧＡＴＡ‐
２である（Lee et al.,Biol.Chem.266,16188(1991)；Do
rfmann et al.,J.Biol.Chem.267,1279(1992)；Wilson e
t al.,Mol.Cell Biol.10,4854 (1990)）。
【００７９】２．１．ｂ）活性化内皮細胞付近の細胞で
活性化されるプロモーターまたはアクチベーター配列の
選択 増殖内皮において、近接細胞は開かれた密着結合を介し
て血液由来の高分子に接近しうる。機能的および解剖学
的相互関係のために、活性化内皮細胞に近接した細胞
は、本発明の意味において、標的細胞である。
【００８０】‐ＶＥＧＦ ＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子調節配列は以下である： ・ＶＥＧＦ遺伝子のプロモーター配列（５′フランキン
グ領域）（Michenko et al.,Cell.Mol.Biol.Res.40,35
(1994)；Tischer et al.,J.Biol.Chem. 266,11947(199
1)）または ・ＶＥＧＦ遺伝子のエンハンサー配列（３′フランキン
グ領域）（Michenko et al.,Cell.Mol.Biol.Res.40,35
(1994)）または ・ｃ‐Ｓｒｃ遺伝子 （Mukhopadhyay et al.,Nature,375,577(1995)；Bonham
et al.,Oncogene, 8,1973 (1993) ；Parker et al.,Mo
l.Cell.Biol.5,831 (1985)；Anderson et al.,Mol.Cel
l.Biol.5,112(1985)）または ・Ｖ‐Ｓｃｒ遺伝子 （Mukhodpadhyay et al.,Nature,375,577(1995) ；Ande
rson et al.,Mol. Cell.Biol.5,112(1985)；Gibbs et a
l.,J.Virol.53,19(1985)）
【００８１】‐ステロイドホルモンレセプターおよびそ
れらのプロモーター要素（Truss andBeato.Endocr.Rev.
14,459 (1993)）、特に ・マウス乳癌ウイルスプロモーター ＭＭＴＶの長末端反復領域のプロモーター領域のｃＤＮ
Ａ配列はChalepakis et al.,Cell,53,371(1988)とTruss
and Beato,Endocr.Rev.14,459 (1993)により記載され
ている。
【００８２】２．２．抗腫瘍（または抗炎症）物質の構
造遺伝子 ２．２．ａ）増殖のインヒビター 本発明の意味における抗腫瘍または抗炎症物質は、内皮
細胞の増殖を阻害するタンパク質のＤＮＡ配列であると
して理解されている。これらＤＮＡ配列の例は： ‐網膜芽腫タンパク質（ｐＲｂ／ｐ１１０）またはその
アナログｐ１０７および１２０ ‐ｐ５３タンパク質 ‐ｐ２１（ＷＡＦ‐１）タンパク質 ‐ｐ１６タンパク質 ‐他のＣｄＫインヒビター ‐ＧＡＤＤ４５タンパク質 ‐ｂａｋタンパク質 に関する場合である。
【００８３】これら細胞周期インヒビターの速やかな細
胞内不活化を妨げるためには、発現タンパク質の不活化
部位に関した変異を有する遺伝子が用いられることが好
ましいが、それによってこれらタンパク質の機能は損な
われていない。
【００８４】網膜芽腫タンパク質（ｐＲｂ）と関連ｐ１
０７およびｐ１３０タンパク質は、リン酸化により不活
化される。結果的に、コードされたタンパク質のリン酸
化部位がリン酸化しえないアミノ酸で置き換えられるよ
うに点変異されたｐＲｂ／ｐ１１０ ｃＤＮＡ配列、ｐ
１０７ ｃＤＮＡ配列またはｐ１３０ ｃＤＮＡ配列が
用いられることが好ましい。
【００８５】２．２．ｂ）凝固誘導因子および血管形成
インヒビター 抗腫瘍または抗炎症物質とは更に、凝固を誘導するおよ
び／または血管形成を阻害するタンパク質についてのＤ
ＮＡ配列であるとして理解されている。これらタンパク
質の例は以下の通りである：
【００８６】‐組織因子（ＴＦ）およびその凝固活性断
片（Morrissey et al.,Cell,50,129 (1987)；Scarpati
et al.,Biochem.26,5234 (1987)；Spicer et al.,PNAS
USA,84,5148(1987)；Rehemtulla et al.,Thromb.Heamos
t.65,521 (1991)） ‐プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（Ｐ
ＡＩ‐１） ‐ＰＡＩ‐２ ‐ＰＡＩ‐３ ‐アンギオスタチン ‐インターフェロン ・ＩＦＮα ・ＩＦＮβ ・ＩＦＮγ ‐血小板因子４ ‐ＩＬ‐１２ ‐ＴＩＭＰ‐１ ‐ＴＩＭＰ‐２ ‐ＴＩＭＰ‐３ ‐白血病阻害因子（ＬＩＦ）。
【００８７】２．２．ｃ）静細胞および細胞毒性タンパ
ク質 しかしながら、抗腫瘍または抗炎症物質とは、腫瘍で静
細胞効果を直接または間接的に示すタンパク質について
のＤＮＡ配列であるとしても理解されている。これらの
タンパク質には特に以下のものがある： ‐抗体または抗体断片 ‐パーフォリン ‐グランザイム ‐ＩＬ‐２ ‐ＩＬ‐４ ‐ＩＬ‐１２ ‐インターフェロン、例えば ・ＩＦＮα ・ＩＦＮβ ・ＩＦＮγ ‐ＴＮＦ ・ＴＮＦα ・ＴＮＦβ ‐オンコスタチンＭ ‐スフィンゴミエリナーゼ（Jarvis et al.,PNAS-USA,9
1,73(1994)） ‐マガイニンおよびマガイニン誘導体（Cruciani et a
l.,PNAS,88,3792(1991)；Jacob et al.,Ciba Found.Sym
p.186,197(1994)；Peck-Miller et al.,CancerChemoth.
Pharmac.32,109(1993)）。
【００８８】２．２．ｄ）炎症インデューサー 抗腫瘍物質とは更に、適宜に抗腫瘍効果に加えて、炎症
を促進することで腫瘍細胞の消失に寄与するタンパク質
のＤＮＡ配列であるとして理解されている。これらタン
パク質の例は以下の通りである： ‐ＲＡＮＴＥＳ（ＭＣＰ‐２） ‐単球走化性および活性化因子（ＭＣＡＦ） ‐ＩＬ‐８ ‐マクロファージ炎症タンパク質１（ＭＩＰ‐１α、‐
β） ‐好中球活性化タンパク質２（ＮＡＰ‐２） ‐ＩＬ‐３ ‐ＩＬ‐５ ‐ヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ） ‐ＩＬ‐７ ‐ＩＬ‐１１ ‐ＩＬ‐１３ ‐ＧＭ‐ＣＳＦ ‐Ｇ‐ＣＳＦ ‐Ｍ‐ＣＳＦ ‐機能的にヒト補体因子Ｃ３ｂに相当する、即ち補体因
子Ｂと結合して、因子Ｄによる開裂後にＣ３コンバータ
ーゼを作るコブラ毒因子（ＣＶＦ）またはＣＶＦの構成
配列。ＣＶＦのＤＮＡ配列とその構成配列はFritzinger
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,12775(1994) に発
表されている。 ‐ヒト補体因子Ｃ３またはその構成配列Ｃ３ｂ。Ｃ３の
ＤＮＡ配列およびその構成配列はDe Bruijn et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,82,708(1985)に発表されている。 ‐機能的および構造的にＣＶＦと似たヒト補体因子Ｃ３
の開裂産物。この種の開裂産物はO'Keefe et al.,J.Bio
l.Chem.263,12690(1988)に記載されている。 ‐Salmonella typhimuriumのポーリン（Galdiero et a
l.,lnfection andlmmunity,46,559 (1984)）、Staphylo
coccus aureus の凝集因子（Espersen Acta Path.Micro
b.et Imm.Scandin.Sect C,93,59 (1985)）、特にグラム
陰性細菌のモジュリン（Henderson et al.,lnflam.Res.
44,187(1995)）、レジオネラ属（Bellinger-Kawahara e
t al.,J.Exp.Med.172,1201(1990)）またはHaemophilus
influenzaeタイプＢ（Hetherington et al.,Infection
and Immunity,60,19(1992)）またはクレブシエラ属（Al
berti et al.,Infection and Immunity,61,852(1993)）
の主要外膜タンパク質、あるいはＧ連鎖球菌属のＭ分子
（Campo et al.,J.Infec.Dis.171,601(1995)）のよう
な、補体を活性化するかまたは炎症を誘導する細菌タン
パク質。
【００８９】一方に掲載されたサイトカインまたは成長
因子と、他方で細胞膜上のレセプターのリガンド（例え
ば、内皮細胞または腫瘍細胞に特異的な抗体、あるいは
ヒト免疫グロブリンのＦｃ部分）との間で形成された融
合タンパク質のＤＮＡ配列も、本発明の意味において活
性物質として用いることができる。この種のＤＮＡ配列
およびそれらの製法は、例えばＥＰ‐Ａ‐０ ４６４
６３３ Ａ１に記載されている。
【００９０】２．２．ｅ）静細胞剤の前駆体を活性化さ
せる酵素 しかしながら、抗腫瘍または抗炎症物質とは、抗腫瘍活
性化合物の前駆体を抗腫瘍活性化合物に変換することが
できる酵素についてのＤＮＡ配列であるとしても理解さ
れている。
【００９１】不活性な前駆体物質（プロドラッグ）を開
裂させることで活性な静細胞剤（薬物）を形成させるこ
の種の酵素と、各場合における関連プロドラッグおよび
薬物は、Deonarain et al.（Br.J.Cancer,70,786(199
4)）、Mullen（Pharmac.Ther.63,199 (1994)）および H
arris et al.（Gene Ther.1,170(1994）) で既に概説さ
れている。
【００９２】例えば、下記酵素のうち１つのＤＮＡ配列
が用いられる： ‐単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ （Garapin et al.,PNAS USA,76,3755 (1979)；Vile et
al.,Cancer Res.53,3860(1993)；Wagner et al.,PNAS U
SA,78,1441(1981)；Moelten et al., Cancer Res.46,52
76(1986)；J.Natl.Cancer lnst.82,297 (1990)） ‐水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ （Huber et al.,PNAS USA,88,8039 (1991)；Snoeck.ln
t.J.Antimicrob.Agents4,211 (1994)） ‐細菌ニトロレダクターゼ （Michael et al.,FEMS Microbiol.Letters,125,195,(1
994)；Bryant et al.,J.Biol.Chem.266,4126(1991)；Wa
tanabe et al.,Nucleic Acids Res.18,1059 (1990)） ‐細菌β‐グルクロニダーゼ （Jefferson et al.,PNAS USA,83,8447 (1986)） ‐Secale cerealeからの植物β‐グルクロニダーゼ （Schulz et al.,Phytochemistry,26,933 (1987)） ‐ヒトβ‐グルクロニダーゼ （Bosslet et al.,Br.J.Cancer,65,234 (1992)；Oshima
et al.,PNAS USA,84,685 (1987)） ‐ヒトカルボキシペプチダーゼ（ＣＢ）、例えば ・肥満細胞ＣＢ‐Ａ （Reynolds et al.,J.Clin.lnvest.89,273(1992)） ・膵臓ＣＢ‐Ｂ （Yamamoto et al.,J.Biol.Chem.267,2575(1992)；Cata
sus et al.,J.Biol.Chem.270,6651 (1995)） ・細菌カルボキシペプチダーゼ （Hamilton et al.,J.Bacteriol.174,1626(1992)；Oste
rman et al.,J.Protein Chem.11,561 (1992)） ‐細菌β‐ラクタマーゼ （Rodrigues et al.,Cancer Res.55,63 (1995)；Hussai
n et al., J.Bacteriol.164,223 (1985)；Coque et a
l.,EMBO J.12,631(1993)） ‐細菌シトシンデアミナーゼ （Mullen et al.,PNAS USA,89,33(1992)；Austin et a
l.,Mol.Pharmac.43,380(1993)；Danielson et al.,Mol.
Microbiol.6,1335 (1992)） ‐ヒトカタラーゼまたはペルオキシダーゼ （Ezurum et al.,Nucl.Acids Res.21,1607(1993)） ‐ホスファターゼ、特に ・ヒトアルカリホスファターゼ （Gum et al.,Cancer Res.50,1085 (1990)） ・ヒト酸性前立腺ホスファターゼ （Sharieff et al.,Am.J.Hum.Gen.49,412 (1991)；Song
et al.,Gene,129, 291(1993)；Tailor et al.,Nucl.Ac
ids Res.18,4928(1990)） ・５型酸性ホスファターゼ （Gene 130,201(1993)） ‐オキシダーゼ、特に ・ヒトリシルオキシダーゼ （Kimi et al.,J.Biol.Chem.270,7176(1995)） ・ヒト酸性Ｄ‐アミノオキシダーゼ （Fukui et al.,J.Biol.Chem.267,18631(1992)） ‐ペルオキシダーゼ、特に ・ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ （Chada et al.,Genomics,6,268 (1990)；Ishida et a
l.,Nucl.Acids Res. 15,10051(1987)） ・ヒト好酸球ペルオキシダーゼ（Ten et al.,J.Exp.Me
d.169,1757 (1989)；Sahamaki et al.,J.Biol.Chem.26
4,16828(1989) ） ・ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ（Kimura,PNAS USA,84,5
555 (1987)） ‐ガラクトシダーゼ。
【００９３】掲載された酵素の分泌を促進させるため
に、各場合にＤＮＡ配列に含まれている相同的シグナル
配列は、細胞外分泌を改善する異種シグナル配列で置き
換えることができる。
【００９４】このため、例えば、β‐グルクロニダーゼ
のシグナル配列（ＤＮＡ位置≦２７〜９３；Oshima et
al.,PNAS 84,685 (1987)）は免疫グロブリンのシグナル
配列（ＤＮＡ位置≦６３ ≧１０７；Riechmann et a
l.,Nature 332,323 (1988)）、ＣＥＡのシグナル配列
（ＤＮＡ位置≦３３ ≧１３４；Schrewe et al.,Mol.C
ell.Biol.10,2738(1990)；Berling et al.,Cancer Res.
50,6534 (1990)）またはヒト呼吸シンシチアルウイルス
糖タンパク質のシグナル配列（アミノ酸≦３８ ≧５０
または４８〜６５のｃＤＮＡ；Lichtenstein et al.,J.
Genera Virol.77,109 (1996)）と置き換えることができ
る。
【００９５】加えて、点変異の結果として低い程度でリ
ソソームに貯蔵されて大きな程度で分泌される酵素のＤ
ＮＡを選択することが好ましい。この種の点変異は、例
えばβ‐グルクロニダーゼに関して記載されている（Sh
iplex et al.,J.Biol.Chem.268,12193 (1993)）。
【００９６】トランスメンブレンドメインの配列は、酵
素形成細胞の細胞膜中に酵素をつなぎ止める目的で、シ
グナル配列の代わりにまたはそれに加えて挿入すること
ができる。
【００９７】このため、例えば、ヒトマクロファージコ
ロニー刺激因子のトランスメンブレン配列（ＤＮＡ位置
≦１４８５ ≧１５５４；Cosman et al.,Behring Ins
t.Mitt.83,15 (1988)）、ヒト呼吸シンシチアルウイル
ス（ＲＳＶ）糖タンパク質Ｇのシグナル領域およびトラ
ンスメンブレン領域のＤＮＡ配列（アミノ酸１〜６３ま
たはそれらの構成配列、アミノ酸３８〜６３；Vijaya e
t al.,Mol.Cell Biol.8,1709(1988)；Lichtenstein et
al.,J.General Virol.77,109(1996)）またはインフルエ
ンザウイルスノイラミニダーゼのシグナルおよびトラン
スメンブレン領域のＤＮＡ配列（アミノ酸７〜３５また
は構成配列アミノ酸７〜２７；Brown et al.,J.Virol.6
2,3824(1988)）は、プロモーターのＤＮＡ配列と酵素
（例えば、β‐グルクロニダーゼ）のＤＮＡ配列との間
に挿入することができる。
【００９８】ヌクレオチド配列ＧＣＣＡＣＣまたはＧＣ
ＣＧＣＣは、翻訳を増強させる目的で、プロモーターの
３′末端と、シグナルまたはトランスメンブレン配列の
開始シグナル（ＡＴＧ）の５′末端の前に直接挿入する
ことができる（Kozak,J.Cell.Biol.108,299 (1989)）。
【００９９】しかしながら、糖リン脂質アンカーのヌク
レオチド配列も、酵素形成細胞の細胞膜に酵素をつなぎ
止める目的で挿入することができる。
【０１００】糖リン脂質アンカーは酵素のヌクレオチド
配列の３′末端に挿入され、この挿入はシグナル配列の
挿入に追加してもよい。
【０１０１】糖リン脂質アンカーは、例えばＣＥＡ（Ｄ
ＮＡ位置≦８９３ ≧１０７９；Berling et al.,Cance
r Res.50,6534 (1990)）およびＮ‐ＣＡＭ（Cunningham
etal.,Science 236,799(1987) と、Ｔｈｙ‐１（Cliss
old,Biochem.J.281,129(1992)）またはＣＤ１６（Selva
ray et al.,Nature 333,565(1988)）のような他の膜タ
ンパク質に関して記載されている。
【０１０２】Ferguson et al.（Ann.Rev.Biochem.57,28
5(1988)）は糖リン脂質でつなぎ止められた膜タンパク
質の概説について発表している。
【０１０３】本発明に従い細胞膜に酵素をつなぎ止める
もう１つの選択肢は、リガンド‐酵素融合タンパク質の
ＤＮＡ配列を用いることである。この融合タンパク質の
リガンドの特異性は、内皮細胞または腫瘍細胞を増殖さ
せる細胞膜上に存在する膜構造に対してである。
【０１０４】内皮細胞を増殖させる表面と結合するリガ
ンドには、例えばburrows et al.（Pharmac.Ther.64,15
5 (1994)）、 Hughes et al.（Cancer Res.49,6214(198
9)）および Maruyama et al.（PNAS-USA 87,5744(199
0)）に記載されたような、例えば内皮細胞の膜構造に対
する抗体または抗体断片がある。これらの抗体には、特
にＶＥＧＦレセプターに対する抗体がある。
【０１０５】ネズミモノクローナル抗体はヒト化された
形で用いられることが好ましい。ヒト化は Winter et a
l.（Nature 349,293(1991)）およびHoogenbooms et al.
（Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36,19(1993)）に記載され
たようにして行われる。抗体断片は先端技術に従い、例
えば Winter et al.（Nature 349,293(1991)）、Hoogen
booms et al.（Ref.Tr.Transfus.Hemobiol.36,19(199
3)；Girol.Mol.Immunol.28,1379 (1991)）または Husto
n et al.（Intern.Rev.Immunol.10,195 (1993)）に記載
されたようにして作製する。
【０１０６】リガンドには更に、内皮細胞上にある膜構
造または膜レセプターと結合するすべての活性化合物を
含む。例えば、それらには末端にマンノースを含んだ物
質と、その他にＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ
βのような内皮細胞により発現されるレセプターと結合
するＩＬ‐２または成長因子、あるいはそれらの断片ま
たはその構成配列がある（Pusztain et al.,J.Pathol.1
69,191(1993)）。加えて、それらには活性化および／ま
たは増殖内皮細胞と結合する接着分子がある。ＳＬｅ
ｘ、ＬＦＡ‐１、ＭＡＣ‐１、ＬＥＣＡＭ‐１またはＶ
ＬＡ‐４のようなこの種の接着分子は既に記載されてい
る（Augustin-Voss et al.,J.Cell.Biol.119,483(199
2)；Pauli et al.,Cancer Metast.Rev.9,175(1990)；Ho
nn et al.,Cancer Metast.Rev.11,353(1992)の概説）。
【０１０７】しかしながら、リガンドには腫瘍細胞膜上
の腫瘍特異的または腫瘍関連抗原に対する抗体またはそ
れらの断片も含む。
【０１０８】この種の抗原および関連抗体の例は、Sedl
acek et al.,Contrib.Oncol.32(1988)およびContrib.On
col.43(1992)に記載されている。抗体‐酵素融合タンパ
ク質は、例えばBosslet et al.,Br.J.Cancer,65,234 (1
992)に記載されている。掲載されたリガンド‐酵素融合
タンパク質の分泌を促進するために、各場合に酵素のＤ
ＮＡ配列に含まれる相同的シグナル配列は、既に記載さ
れたように、細胞外分泌を改善する異種シグナル配列で
置き換えることができる。
【０１０９】２．２．ｆ）リボザイム しかしながら、抗腫瘍または抗炎症物質とは、細胞周期
コントロールタンパク質についての遺伝子の転写産物
（メッセンジャーＲＮＡ）を開裂して不活化させること
ができるリボザイムについてのＤＮＡ配列であるとして
も理解されている。
【０１１０】この種のリボザイムについて好ましい物質
は、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ１、サ
イクリンＥ、ｃｄｃ２、ｃｄｃ２５ＣおよびＤＰ１の遺
伝子のメッセンジャーＲＮＡである。
【０１１１】下記ヌクレオチド位置 （３０１） ＣＵＧ ＣＣ ＧＵＣ Ｃ ＡＵＧ （３
１２） でサイクリンＤ１ ｍＲＮＡを開裂させるリボザイムに
ついてのＤＮＡオリゴヌクレオチド配列（Xiong et a
l.,Cell 665,691 (1991)）は、例えば以下の通りであ
る。 ５′‐ＡＧＣＴＴＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣ
ＣＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＧＧＣＡＧ‐３′（配列
番号１） ５′‐ＡＡＴＴＣＴＧＣＣＧＴＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧＣ
ＧＧＣＣＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＧＧＡ‐３′（配列
番号２）
【０１１２】下記ヌクレオチド位置 （４０６） ＵＵＣ ＣＵ ＧＵＣ Ｇ ＣＵＧ （４
１７）(Xiong et al.,1991) でサイクリンＤ１ ｍＲＮＡを開裂させるもう１つのリ
ボザイムについてのＤＮＡオリゴヌクレオチド配列は、
例えば以下の通りである。 ５′‐ＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧ
ＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧ‐３′（配列番
号３） ５′‐ＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧ
ＣＧＧＣＣＴＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＧＡ‐３′（配列番
号４）
【０１１３】下記ヌクレオチド位置 （２０８） ＧＣＡ ＧＵＣ ＵＧＵ （２１６）
(Xiong et al.,1991) でサイクリンＥのｍＲＮＡを開裂させるリボザイムにつ
いてのＤＮＡオリゴヌクレオチド配列（Koff et al.,Ce
ll 66,1217(1991)）は、例えば以下の通りである。 ５′‐ＡＧＣＴＴＧＣＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧ
ＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＧ‐３′（配列番号
５） ５′‐ＡＡＴＴＣＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧＣＧ
ＧＣＣＴＣＡＴＣＡＧＴＧＴＧＣＡ‐３′（配列番号
６）
【０１１４】下記ヌクレオチド位置 （４８１） ＧＡＡ ＧＵＣ ＵＡＵ （４８９） (X
iong et al.,1991) でサイクリンＥのｍＲＮＡを開裂させるもう１つのリボ
ザイムについてのＤＮＡオリゴヌクレオチド配列は、例
えば以下の通りである。 ５′‐ＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＴＴＡＴＡＣＴＧＡＴＧＡ
ＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧ‐３′
（配列番号７） ５′‐ＡＡＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧＣ
ＧＧＣＣＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＣＡ‐３′
（配列番号８）
【０１１５】２．３．いくつかの抗腫瘍または抗炎症物
質の組合せ 本発明は更に、いくつかの同一抗腫瘍または抗炎症物質
（Ａ、Ａ）または異なる抗腫瘍物質（Ａ、Ｂ）のＤＮＡ
配列の組合せからなる核酸構築体に関する。２つのＤＮ
Ａ配列を発現させるために、内部リボソームエントリー
部位（ＩＲＥＳ）のｃＤＮＡは好ましくは調節要素とし
て挿入される。これは図１１に示されている。
【０１１６】この種のＩＲＥＳ配列は、例えば Mountfo
rd and Smith（ＴＩＧ １１，179(1995)；Kaufman et
al.,Nucl.Acids Res.19,4485 (1991)；Morgan et al.,N
ucl.Acids Res.20,1293(1992)；Dirks et al.,Gene 12
8,247 (1993)；Pelletier and Sonenberg,Nature 334,3
20(1988)；Sugitomo et al.,BioTechn.12,694(1994)に
記載されている。
【０１１７】このため、ポリオウイルスのＩＲＥＳ配列
のｃＤＮＡ（５′ＵＴＲの１４０〜６３０位；Pelletie
r and Sonenberg,Nature 334,320(1988)）は（３′末端
で）抗炎症物質ＡのＤＮＡと（５′末端で）抗炎症物質
ＢのＤＮＡを連結させるために用いることができる。
【０１１８】組合せに応じて、この種の活性化合物は本
発明の意味内で相加（Ａ＋Ａ、Ａ＋Ｂ１）または相乗効
果を示す。
【０１１９】３．血液細胞の欠陥形成を修復するための
活性化合物 ３．１．造血細胞用のプロモーターまたはアクチベータ
ー配列の選択 本発明の意味において、造血細胞で特に強くまたは選択
的に発現されるタンパク質をコードする遺伝子からの遺
伝子調節配列または要素である、プロモーターまたはエ
ンハンサーから構成されるプロモーターまたはアクチベ
ーター配列が用いられることが好ましい。このような遺
伝子調節配列にはサイトカインまたはそのレセプターの
遺伝子についてのプロモーター配列があり、未成熟造血
細胞（または間質のような隣接細胞）でのその発現は、
造血細胞で効果を発揮して活性物質として望まれるサイ
トカインに先行する。未成熟造血細胞で効果を発揮する
このようなサイトカインの例は以下である： ‐幹細胞因子 ‐ＩＬ‐１ ‐ＩＬ‐３ ‐ＩＬ‐６ ‐ＧＭ‐ＣＳＦ
【０１２０】３．２．造血細胞用の活性物質に関する構
造遺伝子の選択 本発明の意味において活性物質とは、発現されたタンパ
ク質が血液細胞の増殖および／または分化を起こすＤＮ
Ａ配列であるとして理解されている。 ４．自己免疫疾患、アレルギーおよび炎症の治療と臓器
拒絶防止のための活性化合物 ４．１．特に自己免疫疾患用のプロモーターまたはアク
チベーター配列の選択 免疫反応に際してマクロファージおよび／またはリンパ
球でかなりの程度に形成されるタンパク質に関する遺伝
子の遺伝子調節配列は、プロモーターまたはエンハンサ
ーから構成されるプロモーターまたはアクチベーター配
列として用いられる。この種のタンパク質の例は以下の
通りである： ‐ＩＬ‐１ ‐ＩＬ‐１β ‐ＩＬ‐１レセプター ‐ＩＬ‐２ ‐ＩＬ‐２レセプター ‐ＩＬ‐３ ‐ＩＬ‐３レセプター ‐ＩＦＮγ ‐ＩＬ‐４ ‐ＩＬ‐４レセプター ‐ＩＬ‐５ ‐ＩＬ‐６ ‐ＬＩＦ ‐ＩＬ‐７ ‐ＩＬ‐１０ ‐ＩＬ‐１１ ‐ＩＬ‐１２ ‐ＩＬ‐１３ ‐ＧＭ‐ＣＳＦ ‐ＧＭ‐ＣＳＦレセプター ‐インテグリンβ２タンパク質
【０１２１】４．２．特に自己免疫疾患用の活性物質の
遺伝子の選択 本発明の意味における活性物質とは、サイトカイン、ケ
モカイン、成長因子またはそれらインヒビターの１つに
関するＤＮＡ配列、これらＤＮＡ配列の１つの転写産物
または細胞周期コントロールタンパク質をコードする遺
伝子の転写産物にとり触媒的であるリボザイムに関する
ＤＮＡ配列、抗体または抗体断片、酵素あるいは抗体、
サイトカインまたは成長因子と酵素との融合タンパク質
に関するＤＮＡ配列である。活性物質の選択は、治療す
べき基礎疾患と、選択されるプロモーター配列に依存す
る。
【０１２２】５．関節炎を治療するための活性化合物 ５．１．関節炎用のプロモーターまたはアクチベーター
配列の選択 本発明の意味内で、プロモーター、プロモーターまたは
エンハンサーからのアクチベーター配列、あるいは転写
因子が内皮細胞、滑液細胞および炎症細胞で相互作用す
る遺伝子の遺伝子調節配列が好ましくは用いられる。本
発明の意味において好ましいプロモーター配列には、内
皮細胞、滑液細胞および炎症細胞で特に発現されるタン
パク質をコードする遺伝子からの遺伝子調節配列または
要素がある。
【０１２３】５．２．関節炎用の活性物質の構造遺伝子
の選択 本発明の意味における活性物質とは、発現されたタンパ
ク質が例えば関節で直接的または間接的に炎症を阻害す
る、および／または関節で細胞外マトリックス（軟骨お
よび結合組織）の再構成を促進するＤＮＡ配列であると
理解されている。
【０１２４】６．感染源に対する活性化合物の製造 活性化合物は２つの基本的に異なる形で、即ち： ‐ウイルス感染および寄生虫侵入治療向け、またはその
他に ‐ウイルス、細菌または寄生虫に起因する感染症の予防
向け に製造することができる。
【０１２５】ワクチンは感染症の予防に用いられる。し
かしながら、常法で有効なワクチンを製造する可能性は
限定されている（Brown,Int.J.Technol.Assessm.Health
Care 10,161(1994)；Ellis,Adv.Exp.Med.Biol.327,263
(1992)；Arnon et al.,FASEBJ.6,3265 (1992)）。
【０１２６】結果的に、ＤＮＡワクチンの技術が開発さ
れてきた。しかしながら、これらのＤＮＡワクチンは効
力、安全性および副作用の程度に関して問題がある（Fy
nanet al.,Int.J.Immunopharm.17,79(1995)；Donnelly
et al.,Immunol.2,20(1994)）。
【０１２７】本発明の意味における感染症の予防のため
の活性化合物は、それらの細胞特異性および細胞周期調
節性であることから、高度な安全性が注目される。
【０１２８】６．１．プロモーターまたはアクチベータ
ー配列の選択 ６．１．ａ）感染症の治療の場合 活性が特に細菌寄生虫感染により変えられる細胞遺伝子
のプロモーター配列、または感染した細胞を形質転換さ
せてそれらを増殖させるように促すウイルスのプロモー
ター配列は、アクチベーター配列として選択される。こ
れらのウイルスは、例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、Ｈ
ＰＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶおよびＨＴＬＶがある。
【０１２９】６．２．活性物質用の構造遺伝子の選択 ６．２．ａ）感染症の治療の場合 静細胞、細胞毒性または抗ウイルス効果を示すタンパク
質のＤＮＡが、活性物質として選択される。細胞毒性ま
たは静細胞タンパク質の例は、既に前記されている。酵
素が選択されるとき、この酵素により開裂できて抗ウイ
ルス、細胞毒性または抗寄生虫物質の前駆体である前駆
体が後で投与されねばならない。
【０１３０】抗ウイルス活性サイトカインおよび成長因
子も、本発明の意味において抗ウイルスタンパク質に関
する活性物質である。それらには、例えば下記活性物質
のＤＮＡ配列がある： ‐ＩＦＮα ‐ＩＦＮβ ‐ＩＦＮγ ‐ＴＮＦβ ‐ＴＮＦα ‐ＩＬ‐１ ‐ＴＧＦβ
【０１３１】しかしながら、一方で掲載されたサイトカ
イン、成長因子またはレセプターの細胞外部分と、他方
でリガンドとの融合タンパク質に関するＤＮＡ配列も、
本発明の意味内における活性物質として用いることがで
き、例えばヒト免疫グロブリンのＦｃ部分を含んだ融合
タンパク質はＥＰ‐Ａ‐０ ４６４ ６３３ Ａ１に記
載されている。
【０１３２】細胞周期コントロールタンパク質に関する
遺伝子のｍＲＮＡまたはウイルスのｍＲＮＡを切断する
リボザイムに関する酵素も活性物質とみなされる。ＨＩ
Ｖに触媒的なリボザイムは、例えばChristoffersen et
al.,J.Med.Chem.38,2033(1995)で概説されている。
【０１３３】本発明の意味において、活性物質には、特
定のウイルスを不活化する特異性を有した抗体について
のＤＮＡ配列、またはそのＶＨ含有およびＶＬ含有断
片、あるいはリンカーにより連結されて、例えば Maras
co et al.,（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,7889(1993)）
に記載された方法に従い作製されるそのＶＨおよびＶＬ
断片もある。ウイルスに対してこのような特異性を有す
る抗体の例は、セクション８．４．に掲載されている。
【０１３４】６．２．ｂ）感染症の予防の場合 感染源により形成されて、免疫反応の誘発により、即ち
抗体結合および／または細胞毒性Ｔリンパ球の作用によ
り病原体の中和および／または破壊に至らせるタンパク
質のＤＮＡが、活性物質として選択される。この種のい
わゆる中和抗原は、既にワクチン抗原として用いられて
いる（Ellis,Adv.Exp.Med.Biol.327,263(1992)の概説参
照）。中和抗原をコードするＤＮＡ配列の例は下記文献
から得ることができる： ‐インフルエンザＡ‐ウイルス抗原 （Ulmer et al.,Science 259,1745 (1993)；Robinson e
t al.,Vaccine 11,957(1993)；Fynan et al.,Int.J.Imm
unopharmac.17,79(1995)） ‐ＨＩＶ抗原 （Wang et al.,PNAS USA 90,4156(1993)） ‐狂犬病ウイルス抗原 （Donnelly et al.,Immunol.211,20(1994)） ‐ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）抗原 （Fleckenstein et al.,Nature 274,57 (1978)） ‐ＲＳＶ（呼吸シンシチアルウイルス）抗原 （Du et al.,Bio/Tech.12,813 (1994)；Hall,Science 2
65,1393 (1993)） ‐パラインフルエンザウイルス抗原 （Du et al.,Bio/Tech.12,813 (1994)） ‐ロタウイルス抗原 （Albert et al.,J.Clin.Microbiol.25,183(1987) ；An
derson et al., J.Infect.Dis.153,823(1986)；Battagl
ia et al.,J.Infect.Dis.155,140 (1987)；Chanock et
al.,J.Infect.Dis.148,49(1983)；Dyall-Smith et al.,
J.Virol.38,1099 (1981)；Glass et al.,Science 265,
1389 (1994)） ‐ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）抗原 （Straus et al.,Ann.Intern.Med.109,438(1988)；Gers
hon,Pediatr.Infect.Dis.2,171 (1991)；Kinchington e
t al.,J.Virol.64,4540(1990)） ‐ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）抗原 （Plotkin,Science 265,1383(1994)； ‐麻疹ウイルス抗原 （Katz and Kellin.Science 265,1391(1994)） ‐ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）抗原 （Tindl and Frazer,Curr.Topics Microbiol.Immunol.1
86,217(1994)） ‐ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）抗原 （Valenzuela et al.,Nature 280,815(1979)；Heerman
et al.,J.Virol.52,396(1984)） ‐ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）抗原 （Cerny et al.,Curr.Topics Microbiol.Immunol.189,1
69(1994)；Esteban etal.,Progr.Liver Dis.10,253(199
2)；Jung et al.,Eur.J.Clin.Invest.24,641(1994)） ‐ＨＤＶ（Ｄ型肝炎ウイルス）抗原 （Iwarson,Scand.J.Infect.Dis.24,129 (1992)；Consol
o et al.,Nephron.61,251(1992)） ‐ＨＥＶ（Ｅ型肝炎ウイルス）抗原 （Iwarson,Scand.J.Infect.Dis.24,129 (1992)；Consol
o et al.,Nephron.61,251(1992)） ‐ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）抗原 （d'Hondt,Vaccine 10,48 (1992)；Andre,J.Infect.Di
s.171,33 (1995)；Lemon et al.,Vaccine 10,40(199
2)；Melnick et al.,Vaccine 10,24(1992)；Flehmig,Ba
illieres Clin.Gastroenterol.4,707 (1990)） ‐Vibrio cholerae 抗原 （Levine and Kaper,Vaccine 11,207 (1993)） ‐Borrelia burgdorferi抗原 （Schaible et al.,Immunol.Letters 36,219(1993)；Wa
llich et al.,Lab.Med.17,669(1993)） ‐Helicobacter pylori 抗原 （Crabtree et al.,Lancet 338,332(1991)；Blaser,J.I
nfect.Dis.161,626(1990)；Cover and Blaser,J.Biol.C
hem.267,10570(1993)；Cover et al.Infect.Immunol.5
8,603 (1990)；Dunn et al.,J.Biol.Chem.265,9464(199
0)；Dunn etal.,Infect.Immunol.60,1946(1992)；Lage
et al.,Acta Gastroenterol.Belg.56(suppl.),61(199
3)；Mobley et al.,Scand.J.Gastroint.26(suppl.187),
39(1991)） ‐マラリア抗原 （Nussenzweig and Long,Science 265,1381 (1994)；Ma
urice,Science 267,320 (1995)；Enders et al.,Vaccin
es 10,920 (1992)；Knapp et al.,Infect.Imm.60,2397
(1992)）。
【０１３５】しかしながら、本発明の意味において、こ
の種の活性物質には抗イディオタイプ抗体またはその抗
原結合断片のＤＮＡも含み、その抗原結合構造、相補性
決定領域は感染源の中和抗原のタンパク質または炭水化
物構造のコピーを形成している。
【０１３６】この種の抗イディオタイプ抗体は、特に細
菌感染源の場合で炭水化物抗原に代えることができる。
この種の抗イディオタイプ抗体とそれらの開裂産物はHa
wkins et al.（J.Immunotherapy 14,273(1993)）および
Westerink and Apicella（Springer Seminarsin Immuno
pathol.15,227(1993)）で概説されている。
【０１３７】６．３．感染症の治療または予防用の同一
または異なる活性物質の組合せ 本発明は更に、同一活性物質（Ａ、Ａ）または異なる活
性物質（Ａ、Ｂ）のＤＮＡ配列の組合せからなる活性化
合物に関する。２配列の発現の場合には、内部リボソー
ムエントリー部位（ＩＲＥＳ）のｃＤＮＡが好ましくは
調節要素として挿入される。この種のＩＲＥＳ配列は、
例えばMontford and Smith（ＴＩＧ１１,179(1995)；Ka
ufman et al.,Nucl.Acids Res.19,4485 (1991)；Morgan
et al.,Nucl.AcidsRes.20,1293(1992)；Dirks et al.,
Gene 128,247 (1993)；Pelletier and Sonnenberg,Natu
re 334,320 (1988)；Sugitomo et al.,BioTechn.12,694
(1994) に記載されている。
【０１３８】このため、ポリオウイルスのＩＲＥＳ配列
のｃＤＮＡ（５′ＵＴＲの１４０〜６３０位（Pelletie
r and Sonenberg,Nature 334,320(1988)）は、（３′末
端で）抗ウイルス物質ＡのＤＮＡと（５′末端で）抗ウ
イルス物質ＢのＤＮＡとを連結させるために用いること
ができる。これは図１２に示されている。
【０１３９】組合せに応じて、この種の活性化合物は本
発明の意味内で相加（Ａ＋Ａ、Ａ＋Ｂ１）または相乗効
果を示す。
【０１４０】このように、２つの同一または２つの異な
る抗ウイルス活性物質は、例えばウイルス疾患の治療の
ために互いに組み合わせることができる。
【０１４１】感染症の予防には、感染源または異なる感
染源の異なる抗原をコードするいくつかの活性物質が互
いに組み合わせられる。更に、感染源の抗原をコードす
る活性物質は、サイトカインまたはサイトカインレセプ
ターをコードする活性物質と組み合わせることができ
る。
【０１４２】感染源抗原と同時に（活性化合物の注入後
に）形成されるサイトカインまたはサイトカインレセプ
ターは、生じる免疫反応の性質および強度に影響を与え
ることができる。
【０１４３】体液性免疫反応を増幅させるサイトカイン
およびサイトカインレセプターのＤＮＡ配列は６．２．
ｄ）で既に記載されており、細胞性免疫反応を増幅させ
るサイトカインおよびサイトカインレセプターの場合は
６．２．ａ）および６．２．ｃ）に記載されている。
【０１４４】全体として免疫反応を増幅させるサイトカ
インに関するＤＮＡ配列の例は： ‐ＩＬ‐１α （Fenton,Int.J.Immunopharm.14,401 (1992)；Furntani
et al.,Nucl.Acids Res.14,3167(1986)；Lafage et a
l.,Blood 73,104(1989)；March et al.Nature 315,641
(1985)） ‐ＩＬ‐１β （Bensi et al.,Gene 52,95 (1987)；Auron et al.,PNA
S 81,7907 (1984)；Clark et al.,Nucl.Acids Res.14,7
897 (1986)） ‐ＩＬ‐２ （Fletscher et al.,Lymphok.Res.6,45 (1987)；Matsui
et al.,Lymphokines12,1(1985)；Tanaguchi et al.,Na
ture 302,305 (1983)） ‐ＧＭ‐ＣＳＦ （Gough et al.,Nature 309,763 (1984)；Nicola et a
l.,J.Biol.Chem.254,5290(1979)；Wong et al.,Science
228,810 (1985)）
【０１４５】７．白血病および腫瘍を治療するための活
性化合物 ７．１．白血病用のプロモーターまたはアクチベーター
配列の選択 白血病細胞または腫瘍細胞で形成されるかまたは活性な
転写因子が相互作用する遺伝子調節ヌクレオチド配列
は、プロモーターまたはアクチベーター配列と考えられ
る。本発明の意味において、好ましいプロモーターまた
はアクチベーター配列には、特に白血病細胞または腫瘍
細胞で形成されるタンパク質をコードする遺伝子からの
遺伝子調節配列または要素がある。
【０１４６】７．２．白血病向け活性物質用の構造遺伝
子の選択 本発明の意味における活性物質は、発現されたタンパク
質が細胞、特に白血病細胞または腫瘍細胞の増殖を直接
または間接的に阻害するＤＮＡ配列であるとして理解さ
れている。これらの活性物質には、例えば阻害、静細
胞、アポトーシス誘導または細胞毒性タンパク質、ある
いは既に記載されたような酵素のＤＮＡ配列がある。活
性物質は更に、細胞周期コントロールタンパク質に関す
る遺伝子のｍＲＮＡの開裂を触媒するリボザイムについ
てのＤＮＡ配列であるとして理解されている。
【０１４７】８．血管閉塞で平滑筋細胞の増殖を阻害す
るための活性化合物 ８．１．平滑筋細胞用のプロモーターまたはアクチベー
ター配列の選択 本発明の意味内において、特に平滑筋細胞で形成される
タンパク質をコードする遺伝子からの遺伝子調節配列ま
たは要素は、プロモーターまたはエンハンサーから構成
されるプロモーターまたはアクチベーター配列として用
いられることが好ましい。
【０１４８】８．２．平滑筋細胞向け活性物質用の構造
遺伝子の選択 本発明の意味内において、活性物質は発現されたタンパ
ク質が平滑筋細胞の増殖を阻害するＤＮＡ配列であると
して理解されている。増殖のこれらインヒビターには、
２．２．ａ）および２．２．ｃ）で既に記載されたタン
パク質がある。しかしながら、活性物質は静細胞剤の不
活性前駆体を静細胞剤に変換する酵素に関するＤＮＡ配
列としても理解されている（２．２．ｅ）参照）。しか
しながら、活性物質は細胞周期コントロールタンパク質
に関する遺伝子のｍＲＮＡに特異的なリボザイムについ
てのＤＮＡ配列であるとしても理解されている（２．
２．ｆ）参照）。
【０１４９】９．凝固を阻害または促進するための活性
化合物 ９．１．凝固を阻害するためのプロモーターまたはアク
チベーター配列の選択 平滑筋細胞、活性化内皮細胞、活性化マクロファージま
たは活性化リンパ球で検出できるタンパク質をコードす
る遺伝子からの遺伝子調節配列または要素は、本発明の
意味におけるプロモーターまたはアクチベーター配列と
して用いられることが好ましい。
【０１５０】９．１．ａ）平滑筋細胞 平滑筋細胞における遺伝子についてのプロモーター配列
の例は、既に記載されている。
【０１５１】９．１．ｂ）活性化内皮細胞 特に活性化内皮細胞で形成されるタンパク質の例は、Bu
rrows et al.（Pharmac.Ther.64,155 (1994)により記載
されている。特に、内皮細胞でかなりの程度に生じるこ
れらタンパク質には、例えばそれら遺伝子のプロモータ
ー配列を有するとして既に前記されたタンパク質があ
る。
【０１５２】９．１．ｃ）活性化マクロファージおよび
／または活性化リンパ球 本発明の意味内において、アクチベーター配列は免疫反
応中にマクロファージおよび／またはリンパ球でかなり
の程度に形成されるタンパク質に関する遺伝子のプロモ
ーター配列であるとしても理解されている。この種のタ
ンパク質は既に掲載されている。
【０１５３】９．２．凝固を阻害または促進する活性物
質に関する構造遺伝子の選択 直接または間接的に血小板凝集または血液凝固因子を阻
害するか、あるいは繊維素溶解を促進するタンパク質を
コードするＤＮＡ配列は、本発明の意味内において凝固
を阻害する活性物質として用いられる。この種の活性物
質は凝固インヒビターと称される。例えばプラスミノー
ゲンアクチベーター（ＰＡ）、例えば組織ＰＡ（ＰＡ）
またはウロキナーゼ様ＰＡ（ｕＰＡ）、あるいはタンパ
ク質Ｃ、抗トロンビン III、Ｃ‐１Ｓインヒビター、μ
１抗トリプシン、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰ
Ｉ）またはヒルジンに関する遺伝子は、凝固インヒビタ
ーとして用いられる。本発明の意味内において、血液凝
固を直接または間接的に促進するタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列は、凝固を促進する活性物質として用いら
れる。これらのタンパク質には、例えば血液凝固因子VI
II、血液凝固因子IXまたは血液凝固因子XIIIがある。
【０１５４】１０．ＣＮＳ障害から保護するための活性
化合物 １０．１．ＣＮＳ障害から保護する活性化合物向けのプ
ロモーターまたはエンハンサーから構成されるプロモー
ターまたはアクチベーター配列 １０．１．ａ）内皮細胞で活性化されるプロモーターま
たはアクチベーター配列 これらには、特に内皮細胞特異性タンパク質の遺伝子に
関するプロモーター配列がある。
【０１５５】１０．１．ｂ）グリア細胞で活性化される
プロモーターまたはアクチベーター配列 好ましいアクチベーター配列は更に、グリア細胞で特定
の程度まで形成されるかまたは活性である転写因子と相
互作用するヌクレオチド配列（プロモーター配列または
エンハンサー配列）であるとして理解されている。
【０１５６】１０．２．神経特異性因子についての構造
遺伝子の選択 本発明の意味において、神経特異性因子はニューロン成
長因子をコードするＤＮＡ配列であるとして理解されて
いる。
【０１５７】
【実施例】実施例１ アクチベーター応答性プロモーター単位の作
製および試験（アクチベーター応答性プロモーターはＬ
ｅｘＡを結合させるための配列である） 新規なアクチベーター応答性プロモーター単位は、下流
方向に互いに続く、以下の異なるヌクレオチド配列から
構成される：アクチベーターサブ単位Ａ ‐ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（核酸−２９０〜
＋１２１；Zwicker et al.,EMBO J.14,4514 (1995)；Zw
icker et al.,Nucl.Acids Res.23,3822 (1995)） ‐ＬｅｘＡタンパク質（アミノ酸１〜８１；Kim et a
l.,Science 255,203(1992)）または全ＬｅｘＡタンパク
質（アミノ酸１〜２０２；Brent et al.,Cell 43,729
(1985)）のＤＮＡ結合ドメインについてのｃＤＮＡ ‐Ｇａｌ８０についてのｃＤＮＡ（アミノ酸１〜４３
５；Leuther et al.,Science 256,1333 (1992)）アクチベーターサブ単位Ｂ ‐フォンビルブラント因子遺伝子のプロモーター（アミ
ノ酸−４８７〜＋２４７；Jahroudi and Lynch,Mol.Cel
l.Biol.14,999(1994)） ‐Ｇａｌ４のＧａｌ８０結合ドメインについてのｃＤＮ
Ａ（アミノ酸８５１〜８８１；Leuther et al.,Science
256,1333 (1992)） ‐ＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージ
Ｔ；アミノ酸１２６〜１３２：ＰＫＫＫＲＫＶ；Dingwa
llet al.,TIBS 16,478(1991)） ‐ＨＳＶ‐１ ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（Ｔ
ＡＤ）（アミノ酸４０６〜４８８：Triezenberg et a
l.,Genes Developm.2.718(1988)；Triezenberg,Curr.O
p.Gen.Developm.5,190(1995)）アクチベーター応答性プロモーター ‐下記ヌクレオチド配列を有した、ＬｅｘＡ（ＬｅｘＡ
オペレーター）を結合させるための配列（これはＳＶ４
０基礎プロモーター（核酸４８〜５１９１；Tooze (e
d.),DNA Tumor Viruses（Cold Spring Harbor New Yor
k,New York;Cold Spring Harbor Laboratory ））とカ
ップリングされる） ５′‐ＴＡＣＴＧＴＡＴＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＴＡ‐
３′（配列番号９） （Brent et al.,Nature 612,312 (1984)）。
【０１５８】アクチベーター応答性プロモーター単位の
ヌクレオチド配列の順序は図１３に示されている。記載
されたアクチベーター配列は下記のように機能する： ‐ｃｄｃ２５Ｃプロモーターは、Ｌｅｘ ＤＮＡ結合タ
ンパク質およびＧａｌ８０についての組合せｃＤＮＡの
転写を細胞周期特異的に調節する。 ‐ｖＷＦプロモーターは、Ｇａｌ４のＧａｌ８０結合ド
メイン、ＳＶ４０ＮＳＬおよびＴＡＤに関するカップリ
ングｃＤＮＡの転写を内皮細胞に限定する。 ‐アクチベーターサブ単位ＡおよびＢの発現産物は、Ｇ
ａｌ８０に結合されているＧａｌ４のＧａｌ８０結合ド
メインにより二量体化される（二量体化は図１４で図示
されている。）。 ‐二量体タンパク質は、ＬｅｘＡオペレーターアクチベ
ーター応答性プロモーターについてのキメラ転写因子を
形成する。
【０１５９】プロモーターはその３′末端でＧＣＣＡＣ
Ｃ配列（Kocak,J.cell.Biol.108,229 (1989)）に連結さ
れており、この後者は免疫グロブリンシグナルペプチド
についてのｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列≦６３ ≧１０
７；Riechmann et al.,Nature 332,323(1988)）に連結
されている。次いでβ‐グルクロニダーゼのｃＤＮＡ
（ヌクレオチド配列≦９３ ≧１９８２；Oshima et a
l.,PNAS USA 84,685(1987)）は図１５で示されたように
この配列に連結されている。
【０１６０】こうして作製されたヌクレオチド構築体
は、インビボ投与で直接またはコロイド分散系で用いら
れるｐＵＣ１８／１９またはBluescript誘導プラスミド
ベクター中にクローニングされる。
【０１６１】構築体の個別要素は適切な制限部位を用い
て連結されるが、それはＰＣＲ増幅により異なる要素の
末端に導入される。連結は、制限部位に特異的であって
当業者に知られる酵素と、ＤＮＡリガーゼにより行われ
る。これらの酵素は市販されている。
【０１６２】培養で維持されているヒト臍帯内皮細胞お
よび繊維芽細胞（Ｗｉ‐３８）は当業者に知られる方法
（Lucibello et al.,EMBO J.14,132(1995)）を用いて記
載されたプラスミドでトランスフェクトされ、内皮細胞
により産生されたβ‐グルクロニダーゼの量は基質とし
て４‐メチルウンベリフェリル‐β‐グルクロニドを用
いて測定される。
【０１６３】細胞周期特異性を調べるために、内皮細胞
は４８時間にわたりメチオニンを止めることによりＧ０
／Ｇ１で同調化される（Nettelbeck et al.,発行準備
中）。細胞のＤＮＡ含量はHoechst ３３２５８で染色し
た後に蛍光活性化細胞選別器で調べる（Lucibello et a
l.,EMBO J.14,132(1995)）。
【０１６４】下記結果が得られる：β‐グルクロニダー
ゼの増加は、非トランスフェクト繊維芽細胞と比較し
て、トランスフェクト繊維芽細胞で検出できない。
【０１６５】トランスフェクト内皮細胞は、非トランス
フェクト内皮細胞の場合よりも実質的に多くのβ‐グル
クロニダーゼを発現する。
【０１６６】増殖中の内皮細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ）は、Ｇ
０／Ｇ１で同調化された内皮細胞（ＤＮＡ＝２Ｓ）の場
合よりも実質的に多くのβ‐グルクロニダーゼを分泌す
る。
【０１６７】結果的に、記載されたアクチベーター応答
性プロモーター単位は、β‐グルクロニダーゼ構造遺伝
子の細胞特異的な細胞周期依存性発現を行う。
【０１６８】例えば腫瘍の部位で局所適用後に、あるい
は頭蓋内またはクモ膜下投与、または全身、好ましくは
静脈内または動脈内投与後に、本発明による活性化合物
は、アクチベーター応答性プロモーター単位の細胞周期
特異性および内皮細胞特異性のために、主に、排除的で
なければ、内皮細胞を増殖させるだけでβ‐グルクロニ
ダーゼを分泌させうる効果を有している。このβ‐グル
クロニダーゼは、注入された容易に耐性化されるドキソ
ルビシン‐β‐グルクロニド（Jacquesy et al.,ＥＰＯ
０５１１ ９１７ Ａ１）を、静細胞効果を有するド
キソルビシンに開裂する。ドキソルビシンは内皮細胞増
殖を阻害し、これらの細胞と隣接腫瘍細胞でも静細胞効
果を有する。これは腫瘍増殖を阻害する。
【０１６９】活性化合物はその細胞特異性およびその細
胞周期特異性の双方のために高度な安全性の見込みをも
たせるため、それは高用量で、必要であれば数日または
数週間の間隔で数回にわたり腫瘍疾患の治療に用いるこ
ともできる。
【０１７０】実施例２ 核保持シグナル（ＮＲＳ）およ
び核放出因子（ＮＥＦ）を有するマルチプロモーターの
作製 新規なマルチプロモーターは、下流方向に互いに続く、
以下の異なるヌクレオチド配列から構成される：要素Ａ ‐ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（核酸−２９０〜
＋１２１；Zwicker et al.,EMBO J.14,4514 (1995)；Zw
icker et al.,Nucl.Acids Res.23,3822 (1995)） ‐ＧＣＣＡＣＣ配列（Kodak,J.Cell.Biol.108,229 (198
9)） ‐免疫グロブリンシグナルペプチドについてのｃＤＮＡ
（ヌクレオチド配列≦６３ ≧１０７；Riechmann et a
l.,Nature 332,323(1988)） ‐β‐グルクロニダーゼについてのｃＤＮＡ（ヌクレオ
チド配列≦９３ ≧１９８２；Oshima et al.,PNAS USA
84,685 (1987)） ‐核保持シグナル（ＮＲＳ）としてのＨＩＶ‐１ウイル
スＲＥＲのｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列７３５７〜７６
０２；Ratner et al.,Nature 313,277(1985)；Malim et
al.,Nature 338,254 (1989)）．要素Ｂ ‐フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）遺伝子のプロモー
ター（アミノ酸−４８７〜＋２４７；Jahroudi and Lyn
ch,Mol.Cell.Biol.14,999(1994)） ‐核放出因子（ＮＥＦ）としてのＨＩＶ‐１ウイルスＲ
ＥＶのｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列１〜１１７；Ratner
et al.,Nature 313,277(1985)）。
【０１７１】要素Ａおよび要素Ｂのヌクレオチド配列は
図１６に従い連結される。
【０１７２】こうして作製されたヌクレオチド構築体
は、インビボ投与で直接またはコロイド分散系で用いら
れるｐＵＣ１８／１９またはBluescript誘導プラスミド
ベクター中にクローニングされる。
【０１７３】構築体の個別要素は適切な制限部位を用い
て連結されるが、それはＰＣＲ増幅により異なる要素の
末端に導入される。連結は、制限部位に特異的であって
当業者に知られる酵素と、ＤＮＡリガーゼにより行われ
る。これらの酵素は市販されている。
【０１７４】培養で維持されているヒト臍帯内皮細胞お
よび繊維芽細胞（Ｗｉ‐３８）は当業者に知られる方法
（Lucibello et al.,EMBO J.14,132(1995)）を用いて記
載されたプラスミドでトランスフェクトされ、内皮細胞
により産生されたβ‐グルクロニダーゼの量は基質とし
て４‐メチルウンベリフェリル‐β‐グルクロニドを用
いて測定される。
【０１７５】細胞周期特異性を調べるために、内皮細胞
は４８時間にわたりメチオニンを止めることによりＧ０
／Ｇ１で同調化される（Nettelbeck et al.,発行準備
中）。細胞のＤＮＡ含量はHoechst ３３２５８で染色し
た後に蛍光活性化細胞選別器で調べる（Lucibello et a
l.,EMBO J.14,132(1995)）。
【０１７６】下記結果が得られる：β‐グルクロニダー
ゼの増加は、非トランスフェクト繊維芽細胞と比較し
て、トランスフェクト繊維芽細胞で検出できない。
【０１７７】トランスフェクト内皮細胞は、非トランス
フェクト内皮細胞の場合よりも実質的に多くのβ‐グル
クロニダーゼを発現する。
【０１７８】増殖中の内皮細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ）は、Ｇ
０／Ｇ１で同調化された内皮細胞（ＤＮＡ＝２Ｓ）の場
合よりも実質的に多くのβ‐グルクロニダーゼを分泌す
る。
【０１７９】結果的に、記載されたマルチプロモーター
単位は、β‐グルクロニダーゼ構造遺伝子の細胞特異的
な細胞周期依存性発現を行う。
【０１８０】実施例３ アクチベーター応答性プロモー
ター単位の作製（アクチベーター応答性プロモーターは
Ｇａｌ４を結合させるための配列である） 新規なアクチベーター応答性プロモーター単位は、下流
方向に互いに続く、以下の異なるヌクレオチド配列から
構成される：アクチベーターサブ単位Ａ ‐ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（核酸−２９０〜
＋１２１；Zwicker et al.,EMBO J.14,4514 (1995)；Zw
icker et al.,Nucl.Acids Res.23,3822 (1995)） ‐Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインについての
ｃＤＮＡ（アミノ酸１〜１４７；Chasman and Kornber
g,Mol.cell.Biol.10,2916(1990)）‐Ｇａｌ８０につい
てのｃＤＮＡ（アミノ酸１〜４３５；Leuther et al.,S
cience 256,1333 (1992)）アクチベーターサブ単位Ｂ ‐フォンビルブラント因子遺伝子のプロモーター（アミ
ノ酸−４８７〜＋２４７；Jahroudi and Lynch,Mol.Cel
l.Biol.14,999(1994)） ‐Ｇａｌ４のＧａｌ８０結合ドメインについてのｃＤＮ
Ａ（アミノ酸８５１〜８８１；Leuther et al.,Science
256,1333 (1992)） ‐ＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージ
Ｔ；アミノ酸１２６〜１３２：ＰＫＫＫＲＫＶ；Dingwa
ll et al.,TIBS 16,478(1991)） ‐ＨＳＶ‐１ ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（Ｔ
ＡＤ）（アミノ酸４０６〜４８８：Triezenberg et a
l.,Genes Developm.2.718 (1988)；Triezenberg,Curr.O
pin.Gen.Developm.5,190(1995)）アクチベーター応答性プロモーター ‐ヌクレオチド配列５′‐ＣＧＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＧ
ＡＣＣＧ‐３′を有した、Ｇａｌ４を結合させるための
配列（Chasman and Kornberg,Mol.cell.Biol.10,2916(1
990)）。（これはＳＶ４０基礎プロモーター（核酸４８
〜５１９１；Tooze (ed.),DNA Tumor Viruses(Cold Spr
ing Harbor New York,New York; Cold Spring Harbor L
aboratory ）とカップリングされる）
【０１８１】アクチベーター応答性プロモーター単位の
ヌクレオチド配列の順序は図１７に示されている。
【０１８２】記載されたアクチベーター配列は下記のよ
うに機能する： ‐ｃｄｃ２５Ｃプロモーターは、Ｇａｌ４結合タンパク
質およびＧａｌ８０についての組合せｃＤＮＡの転写を
細胞周期特異的に調節する。 ‐ｖＷＦ遺伝子のプロモーターは、Ｇａｌ４のＧａｌ８
０結合ドメイン、ＳＶ４０ ＮＳＬおよびＴＡＤに関す
るカップリングｃＤＮＡの転写を内皮細胞に限定する。 ‐アクチベーターサブ単位ＡおよびＢの発現産物は、Ｇ
ａｌ８０に結合されているＧａｌ４のＧａｌ８０結合ド
メインにより二量体化される（二量体化は図１８で図示
されている。）。 ‐二量体タンパク質は、アクチベーター応答性プロモー
ターについてのキメラ転写因子（Ｇａｌ４結合ドメイン
／ＳＶ４０プロモーターについてのＤＮＡ配列）を形成
している。
【０１８３】プロモーターはその３′末端でＧＣＣＡＣ
Ｃ配列（Kocak,J.cell.Biol.108,229 (1989)）に連結さ
れており、この後者は免疫グロブリンシグナルペプチド
についてのｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列≦６３ ≧１０
７；Riechmann et al., Nature 332,323(1988)）に連結
されている。β‐グルクロニダーゼのｃＤＮＡ（ヌクレ
オチド配列≦９３ ≧１９８２；Oshima et al.,PNAS U
SA 84,685 (1987)は図１９で示されたようにこの配列に
連結されている。
【０１８４】こうして作製されたヌクレオチド構築体
は、インビボ投与で直接またはコロイド分散系で用いら
れるｐＵＣ１８／１９またはBluescript誘導プラスミド
ベクター中にクローニングされる。
【０１８５】構築体の個別要素は適切な制限部位を用い
て連結されるが、それはＰＣＲ増幅により異なる要素の
末端に導入される。連結は、制限部位に特異的であって
当業者に知られる酵素と、ＤＮＡリガーゼにより行われ
る。これらの酵素は市販されている。
【０１８６】培養で維持されているヒト臍帯内皮細胞お
よび繊維芽細胞（Ｗｉ‐３８）は当業者に知られる方法
（Lucibello et al.,EMBO J.14,132(1995)）を用いて記
載されたプラスミドでトランスフェクトされ、内皮細胞
により産生されたβ‐グルクロニダーゼの量は基質とし
て４‐メチルウンベリフェリル‐β‐グルクロニドを用
いて測定される。
【０１８７】細胞周期特異性を調べるために、内皮細胞
は４８時間にわたりメチオニンを止めることによりＧ０
／Ｇ１で同調化される（Nettelbeck et al.,発行準備
中）。細胞のＤＮＡ含量はHoechst ３３２５８で染色し
た後に蛍光活性化細胞選別器で調べる（Lucibello et a
l.,EMBO J.14,132(1995)）。
【０１８８】下記結果が得られる：β‐グルクロニダー
ゼの増加は、非トランスフェクト繊維芽細胞と比較し
て、トランスフェクト繊維芽細胞で検出できない。
【０１８９】トランスフェクト内皮細胞は、非トランス
フェクト内皮細胞の場合よりも実質的に多くのβ‐グル
クロニダーゼを発現する。
【０１９０】増殖中の内皮細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ）は、Ｇ
０／Ｇ１で同調化された内皮細胞（ＤＮＡ＝２Ｓ）の場
合よりも実質的に多くのβ‐グルクロニダーゼを分泌す
る。結果的に、記載されたアクチベーター応答性プロモ
ーター単位は、β‐グルクロニダーゼ構造遺伝子の細胞
特異的な細胞周期依存性発現を行う。
【０１９１】実施例４ もう１つのアクチベーター応答
性プロモーター単位の作製および試験（アクチベーター
応答性プロモーターはＧａｌ４を結合させるための配列
である） この新規なアクチベーター応答性プロモーター単位は、
下流方向に互いに続く、以下の異なるヌクレオチド配列
から構成される：アクチベーターサブ単位Ａ ‐ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（核酸−２９０〜
＋１２１；Zwicker etal.,EMBO J.14,4514(1995)；Zwic
ker et al.,Nucl.Acids Res.23,3822 (1995)） ‐ＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージ
Ｔ；アミノ酸１２６〜１３２：ＰＫＫＫＲＫＶ；Dingwa
ll et al.,TIBS 16,478 (1991)） ‐ＨＳＶ‐１ ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（Ｔ
ＡＤ）（アミノ酸４０６〜４８８：Triezenberg et a
l.,Genes Developm.2.718 (1988)；Triezenberg,Curr.O
pin.Gen.Developm.5,190(1995)） ‐ＣＤ４糖タンパク質の細胞質部分についてのｃＤＮＡ
（アミノ酸３９７〜４３５；Simpson et al.,Oncogene
4,1141(1989)；Maddon et al.,Cell 42,93(1985)アクチベーターサブ単位Ｂ ‐ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（核酸−２９０〜
＋１２１；Zwicker etal.,EMBO J.14,4514(1995)；Zwic
ker et al.,Nucl.Acids Res.23,3822 (1995)） ‐ＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージ
Ｔ；アミノ酸１２６〜１３２：ＰＫＫＫＲＫＶ；Dingwa
ll et al.,TIBS 16,478 (1991)） ‐Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインについての
ｃＤＮＡ（アミノ酸１〜１４７；Chasman and Kornber
g,Mol.cell.Biol.10,2916(1990)） ‐ｐ５６ ｌａｃタンパク質のＣＤ４結合配列について
のｃＤＮＡ（アミノ酸１〜７１；Shaw et al.,Cell 59,
627 (1989)；Turner et al.,Cell 60,755 (1990)；Perl
mutter et al.,J.Cell.Biochem.38,117 (1988)）アクチベーター応答性プロモーター ‐ヌクレオチド配列５′‐ＣＧＧＡＣＡＡＴＧＴＴＧＡ
ＣＣＧ‐３′を有した、Ｇａｌ４結合タンパク質につい
ての結合配列（Chasman and Kornberg,Mol. cell.Biol.
10,2916 (1990)）１０ｘ‐ＳＶ４０基礎プロモーター
（核酸４８〜５１９１；Tooze (ed.),DNA Tumor Viruse
s（Cold Spring Harbor New York,New York,Cold Sprin
g Harbor Laboratory）エフェクター遺伝子 ‐ルシフェラーゼについてのｃＤＮＡ（リポーター遺伝
子）（Nordeen, BioTechniques 6,454 (1988) ）。
【０１９２】記載されたアクチベーター配列は下記のよ
うに機能する： ‐ｃｄｃ２５Ｃプロモーターは、ＶＰ１６の活性化ドメ
インおよびＣＤ４の細胞質部分（アクチベーターサブ単
位Ａ）についての組合せｃＤＮＡの転写を細胞周期特異
的に調節する。 ‐ｃｄｃ２５Ｃプロモーターは更に、Ｇａｌ４のＤＮＡ
結合タンパク質およびｐ５６ ｌｃｋタンパク質のＣＤ
４結合部分（アクチベーターサブ単位Ｂ）についての組
合せｃＤＮＡの転写を調節する。 ‐アクチベーターサブ単位ＡおよびＢの発現産物は、ｐ
５６ ｌｃｋドメインに結合されているＣＤ４ドメイン
により二量体化する。 ‐二量体タンパク質は、エフェクター遺伝子（＝リポー
ター遺伝子＝ルシフェラーゼ遺伝子）の転写に関するア
クチベーター応答性プロモーターについてのキメラ転写
因子（Ｇａｌ４結合ドメイン／ＳＶ４０プロモーターに
ついてのＤＮＡ配列）を形成している。
【０１９３】こうして作製されたヌクレオチド構築体
は、インビボ投与で直接またはコロイド分散系で用いら
れるｐＸＰ２プラスミドベクター（Nordeen,BioTechniq
ues 6,454 (1988)）中にクローニングされる。
【０１９４】構築体の個別要素は適切な制限部位を用い
て連結されるが、それはＰＣＲ増幅により異なる要素の
末端に導入される。連結は、制限部位に特異的であって
当業者に知られる酵素と、ＤＮＡリガーゼにより行われ
る。これらの酵素は市販されている。
【０１９５】培養で維持されている３Ｔ３繊維芽細胞は
当業者に知られる方法（Lucibelloet al.,EMBO J.14,13
2(1995)）を用いて記載されたプラスミドでトランスフ
ェクトされ、繊維芽細胞により産生されたルシフェラー
ゼの量は Herber et al.（Oncogene 9,1295 (1994)）お
よびLucibello et al.（EMBO J.14,132 (1995)）により
記載されたようにして測定される。
【０１９６】細胞周期特異性を調べるために、繊維芽細
胞は４８時間にわたり血清を止めることによりＧ０／Ｇ
１で同調化される。細胞のＤＮＡ含量はHoechst ３３２
５８で染色した後に蛍光活性化細胞選別器で調べる（Lu
cibello et al.,EMBO J.14,132(1995)）。
【０１９７】下記結果が得られる：ルシフェラーゼの著
しい増加が、非トランスフェクト繊維芽細胞と比較して
みて、トランスフェクト繊維芽細胞で検出できる。
【０１９８】増殖中の繊維芽細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ）は、
Ｇ０／Ｇ１で同調化された繊維芽細胞（ＤＮＡ＝２Ｓ）
の場合よりも実質的に多くのルシフェラーゼを形成す
る。
【０１９９】結果的に、記載されたアクチベーター応答
性プロモーター単位は、ルシフェラーゼリポーター遺伝
子の細胞周期依存性発現を行う。
【０２００】本発明による活性化合物は、例えば腫瘍の
部位で局所適用後に、あるいは頭蓋内またはクモ膜下投
与、または全身、好ましくは静脈内または動脈内投与後
に、アクチベーター応答性プロモーター単位の細胞周期
特異性および内皮細胞特異性によって、主に、排除的で
なければ、増殖内皮細胞にβ‐グルクロニダーゼを分泌
させうる。このβ‐グルクロニダーゼは、注入された容
易に耐性化されるドキソルビシン‐β‐グルクロニド
（Jacquesy et al.,ＥＰＯ ０５１１ ９１７Ａ１）
を、静細胞効果を有するドキソルビシンに開裂する。ド
キソルビシンは内皮細胞増殖を阻害し、これらの細胞と
隣接腫瘍細胞でも静細胞効果を有する。これは腫瘍増殖
を阻害する。
【０２０１】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．４１ 配列 AGCTTCCGCA TGCTGATGAG GCCGCAAGGC CGAAACGGCA G 41
【０２０２】配列番号：２ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．４１ 配列 AATTCTGCCG TTTCGGCCTT GCGGCCTCAT CAGCATGCGG A 41
【０２０３】配列番号：３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．４０ 配列 AGCTTCCAGC CTGATGAGGC CGCAAGGCCG AAACAGGAAG 40
【０２０４】配列番号：４ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．４０ 配列 AATTCTTCCT GTTTCGGCCT TGCGGCCTCA TCAGGCTGGA 40
【０２０５】配列番号：５ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．３８ 配列 AGCTTGCACA CTGATGAGGC CGCAAGGCCG AAACTGCG 38
【０２０６】配列番号：６ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon存在位置：１．．３８ 配列 AATTCGCAGT TTCGGCCTTG CGGCCTCATC AGTGTGCA 38
【０２０７】配列番号：７ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon存在位置：１．．４４ 配列 AGCTTGAAGT TTATACTGAT GAGGCCGCAA GGCCGAAACT TCAG 44
【０２０８】配列番号：８ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．４４ 配列 AATTCTGAAG TTTCGGCCTT GCGGCCTCAT CAGTATAAAC TTCA 44
【０２０９】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．２０ 配列 TACTGTATGT ACATACAGTA 20
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸構築体を示した図である。
【図２】本発明の核酸構築体を示した図である。
【図３】アクチベーター応答性プロモーター単位の個別
要素の配置を示した図である。
【図４】アクチベーター応答性プロモーター単位の挿入
配置を示した図である。
【図５】本発明のキメラプロモーター構築体を示した図
である。
【図６】本発明の核酸構築体を示した図である。
【図７】本発明の核酸構築体を示した図である。
【図８】本発明の核酸構築体を示した図である。
【図９】本発明の核酸構築体を示した図である。
【図１０】本発明の核酸構築体を示した図である。
【図１１】本発明の核酸構築体を示した図である。
【図１２】本発明の核酸構築体を示した図である。
【図１３】本発明の核酸構築体（実施例１）を示した図
である。
【図１４】本発明の核酸構築体（実施例１）を示した図
である。
【図１５】本発明の核酸構築体（実施例１）を示した図
である。
【図１６】本発明の核酸構築体（実施例２）を示した図
である。
【図１７】本発明の核酸構築体（実施例３）を示した図
である。
【図１８】本発明の核酸構築体（実施例３）を示した図
である。
【図１９】本発明の核酸構築体（実施例３）を示した図
である。

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】読取方向の下流においてトランス遺伝子と
    連結された核保持シグナルを有する核酸構築体。
  2. 【請求項２】読取方向において５′末端から３′末端に
    下記要素： （ａ）非特異的、細胞特異的、ウイルス特異的、代謝的
    および／または細胞周期特異的に活性化しうる第一プロ
    モーター配列またはエンハンサー配列であって、トラン
    ス遺伝子の基礎転写を活性化させる配列、（ｂ）構造遺
    伝子として活性化合物をコードするトランス遺伝子、お
    よび（ｃ）そのｃＤＮＡが５′末端で構造遺伝子の３′
    末端に直接または間接的に連結された核保持シグナルを
    有する、請求項１に記載の核酸構築体。
  3. 【請求項３】核保持シグナルの転写産物が核放出因子と
    結合するための構造を有する、請求項１または２に記載
    の核酸構築体。
  4. 【請求項４】要素（ａ）〜（ｃ）に加えて下記要素： （ｄ）核放出因子の基礎転写を活性化させる追加プロモ
    ーター配列またはエンハンサー配列、および（ｅ）核保
    持シグナル（ｃ）の転写産物に結合し、かつ細胞核から
    細胞質中へのトランス遺伝子の転写産物の輸送を媒介す
    る核放出因子をコードする核酸を有する、請求項１また
    は２に記載の核酸構築体。
  5. 【請求項５】第一プロモーター配列またはエンハンサー
    配列（ａ）並びに第二プロモーター配列またはエンハン
    サー配列（ｄ）が同一であるかまたは異なり、要素
    （ａ）および（ｄ）のうち少くとも１つが非特異的、細
    胞特異的、ウイルス特異的、代謝的、特に低酸素症でま
    たは細胞周期特異的に活性化しうる、請求項４に記載の
    核酸構築体。
  6. 【請求項６】プロモーター配列またはエンハンサー配列
    （ａ）および（ｄ）のうち少くとも１つが、プロモータ
    ーモジュールＣＤＥ‐ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ‐ＣＨＲ
    が細胞特異的、ウイルス特異的または代謝的に活性化し
    うる上流に隣接したアクチベーター配列と相互作用し、
    かつ下流遺伝子の発現に影響を与えうる、特にそれを阻
    害しうる、キメラプロモーターである、請求項４または
    ５に記載の核酸構築体。
  7. 【請求項７】要素（ａ）および（ｄ）のうち少くとも１
    つが、下記要素： （ｆ）非特異的、ウイルス特異的、代謝的、細胞特異的
    および／または細胞周期特異的に活性化しうる、少くと
    も１つのプロモーター配列またはエンハンサー配列、
    （ｇ）プロモーター配列またはエンハンサー配列（ｆ）
    の下流に位置し、かつその基礎転写でプロモーター配列
    またはエンハンサー配列（ｆ）により活性化される、少
    くとも１つのアクチベーターサブ単位、および（ｈ）１
    つのアクチベーターサブ単位（ｇ）またはいくつかの同
    一または異なるアクチベーターサブ単位（ｇ、ｇ′）の
    発現産物により活性化されるアクチベーター応答性プロ
    モーターを含んだアクチベーター応答性プロモーター単
    位を形成している、請求項３または４に記載の核酸構築
    体。
  8. 【請求項８】プロモーター配列またはエンハンサー配列
    （ａ）および／または（ｄ）および／またはアクチベー
    ター応答性プロモーターがキメラプロモーターであっ
    て、アクチベーターサブ単位（ｇ）がアクチベーター応
    答性プロモーター（ｈ）のキメラプロモーターを活性化
    する少くとも１つの転写因子の遺伝子である、請求項７
    に記載の核酸構築体。
  9. 【請求項９】（１）アクチベーター応答性プロモーター
    （ｈ）がＳＶ４０プロモーターと組み合わされたＬｅｘ
    Ａオペレーターであり、およびアクチベーターサブ単位
    （ｇ）がアミノ酸１‐８１または１‐２０２をコードす
    るＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質に関するｃＤＮＡを
    含み、その３′末端はＧａｌ８０タンパク質（アミノ酸
    １‐４３５）に関するｃＤＮＡの５′末端に連結されて
    おり、および更にアクチベーターサブ単位（ｇ′）がア
    ミノ酸８５１‐８８１をコードするＧａｌ４タンパク質
    のＧａｌ８０結合ドメインのｃＤＮＡを含み、その３′
    末端はアミノ酸１２６‐１３２をコードするＳＶ４０ラ
    ージＴ抗原のｃＤＮＡの５′末端に連結され、更にその
    ３′末端はアミノ酸４０６‐４８８をコードするＨＳＶ
    ‐１ ＶＰ１６トランス活性化ドメインに関するｃＤＮ
    Ａの５′末端に連結されている、あるいは（２）アクチ
    ベーター応答性プロモーター（ｈ）がＧａｌ４タンパク
    質を結合させるための１以上の配列を少くとも１つのＳ
    Ｖ４０プロモーターと組み合わせて含み、 アクチベーターサブ単位（ｇ、ｇ′）が： ・アクチベーターサブ単位ｇ（Ｇａｌ４タンパク質のＤ
    ＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１‐１４７）に関するｃＤ
    ＮＡおよびＧａｌ８０に関するｃＤＮＡ）と、 ・アクチベーターサブ単位ｇ′（Ｇａｌ４のＧａｌ８０
    結合ドメイン（アミノ酸８５１‐８８１）に関するｃＤ
    ＮＡ、ＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）（アミノ酸１
    ２６‐１３２）のｃＤＮＡおよびＨＳＶ‐１ ＶＰ１６
    酸トランス活性化ドメイン（アミノ酸４０６‐４８８）
    のｃＤＮＡ）とを含むか、あるいは ・アクチベーターサブ単位ｇ（ＳＶ４０核局在シグナル
    （アミノ酸１２６‐１３２）のｃＤＮＡ、ＨＳＶ‐１
    ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（アミノ酸４０６‐
    ４８８）のｃＤＮＡおよびＣＤ４糖タンパク質の細胞質
    部分（アミノ酸３９７〜４３５）のｃＤＮＡ）と、 ・アクチベーターサブ単位ｇ（ＳＶ４０核局在シグナル
    （アミノ酸１２６‐１３２）のｃＤＮＡ、Ｇａｌ４タン
    パク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７）の
    ｃＤＮＡおよびｐ５６ ｌｃｋタンパク質のＣＤ４結合
    配列（アミノ酸１〜７１）のｃＤＮＡ）とを含む、請求
    項７に記載の核酸構築体。
  10. 【請求項１０】核保持シグナル（ｃ）をコードする遺伝
    子がＨＩＶ‐１またはＨＩＶ‐２のｒｅｖ応答要素（Ｒ
    ＲＥ）、レトロウイルスのＲＲＥ等価保持シグナル、あ
    るいはＨＢＶのＲＲＥ等価保持シグナルからなる群より
    選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸
    構築体。
  11. 【請求項１１】核放出因子（ｅ）がウイルスＨＩＶ‐
    １、ＨＩＶ‐２、visna-maedi ウイルス、ヤギ関節炎脳
    炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウ
    イルス、レトロウイルス、ＨＴＬＶのｒｅｖ遺伝子、ｈ
    ｎＲＮＰ‐Ａ１タンパク質の遺伝子、または転写因子Ｔ
    ＦIII-Ａの遺伝子からなる群より選択される遺伝子であ
    る、請求項４に記載の核酸構築体。
  12. 【請求項１２】核酸がＤＮＡである、請求項１〜１１の
    いずれか一項に記載の核酸構築体。
  13. 【請求項１３】核酸構築体がベクターである、請求項１
    〜１２のいずれか一項に記載の核酸構築体。
  14. 【請求項１４】プラスミドベクターである、請求項１３
    に記載の核酸構築体。
  15. 【請求項１５】ウイルスベクターである、請求項１３に
    記載の核酸構築体。
  16. 【請求項１６】トランス遺伝子（ｂ）が、サイトカイ
    ン、成長因子、抗体または抗体断片、リガンドと酵素、
    サイトカインまたは成長因子とから構成される融合タン
    パク質、サイトカインまたは成長因子についてのレセプ
    ター、抗増殖、アポトーシスまたは細胞毒性効果を有す
    るタンパク質、血管形成インヒビターおよび／または血
    栓誘導タンパク質、血液凝固因子、凝固インヒビター、
    繊維素溶解誘導タンパク質、補体活性化タンパク質、例
    えばコブラ毒因子、ヒトＣ３ｂ、改変Ｃ３ｂ、細菌タン
    パク質、ウイルスコートタンパク質、細菌抗原および寄
    生虫抗原、血液循環に効果を有するペプチドまたはタン
    パク質、並びにリボザイムからなる群より選択される活
    性化合物をコードする構造遺伝子である、請求項１〜１
    ５のいずれか一項に記載の核酸構築体。
  17. 【請求項１７】トランス遺伝子（ｂ）が、細胞周期コン
    トロールタンパク質、特にサイクリンＡ、サイクリン
    Ｂ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、Ｅ２Ｆ１‐５、ｃ
    ｄｃ２、ｃｄｃ２５ＣまたはＤＰ１、ウイルスタンパク
    質、サイトカイン、成長因子またはそれらのレセプター
    からなる群より選択されるタンパク質をコードするｍＲ
    ＮＡを不活化するリボザイムをコードする構造遺伝子で
    ある、請求項１６に記載の核酸構築体。
  18. 【請求項１８】プロモーター配列、エンハンサー配列ま
    たはアクチベーター配列が、内皮細胞、平滑筋細胞、横
    紋筋細胞、マクロファージ、リンパ球、腫瘍細胞、肝臓
    細胞、白血病細胞およびグリア細胞で活性化される遺伝
    子調節ヌクレオチド配列、あるいはＨＢＶ、ＨＣＶ、Ｈ
    ＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたはＨＩＶウイルス
    のプロモーター配列からなる群より選択される、請求項
    １〜１７のいずれか一項に記載の核酸構築体。
  19. 【請求項１９】トランス遺伝子（ｂ）が薬物の前駆体を
    開裂させて薬物を形成させる酵素をコードする構造遺伝
    子である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸
    構築体。
  20. 【請求項２０】トランス遺伝子（ｂ）がリガンド‐酵素
    融合タンパク質をコードする構造遺伝子である、請求項
    １〜１９のいずれか一項に記載の核酸構築体。
  21. 【請求項２１】リガンドが、増殖内皮細胞と結合し、か
    つ抗体またはそれらの断片、末端マンノース含有タンパ
    ク質、サイトカイン、例えばＩＬ‐１またはＴＮＦ、成
    長因子、例えばＰＤＧＦ、Ｇ‐ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧ
    Ｆβ、あるいは接着分子、例えばＳＬｅｘ、ＬＦＡ‐
    １、ＭＡＣ‐１、ＬＥＣＡＭ‐１またはＶＬＡ‐１から
    なる群より選択されるものである、請求項２０に記載の
    核酸構築体。
  22. 【請求項２２】リガンドが腫瘍細胞と結合する、請求項
    ２０に記載の核酸構築体。
  23. 【請求項２３】請求項１〜２２のいずれか一項に記載さ
    れた核酸構築体を有する単離細胞。
  24. 【請求項２４】疾患を治療するための薬剤を製造するた
    めの、請求項１〜２２のいずれか一項に記載された核酸
    構築体または請求項２３に記載された細胞の使用。
  25. 【請求項２５】薬剤の製造が標的細胞中への核酸構築体
    の挿入を含む、疾患を治療するための、請求項１〜２２
    のいずれか一項に記載された核酸構築体または請求項２
    ３に記載された単離細胞の使用。
  26. 【請求項２６】疾患が過度な細胞増殖を伴う、請求項２
    ５に記載の使用。
  27. 【請求項２７】薬剤の製造が、請求項１〜２２のいずれ
    か一項に記載された核酸構築体を標的細胞中に核酸構築
    体を挿入しうる形へ変換することを含む、請求項２４〜
    ２６のいずれか一項に記載された使用。
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