JPH11103858A - Dna transfer by electroporation - Google Patents
Dna transfer by electroporationInfo
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- JPH11103858A JPH11103858A JP9286066A JP28606697A JPH11103858A JP H11103858 A JPH11103858 A JP H11103858A JP 9286066 A JP9286066 A JP 9286066A JP 28606697 A JP28606697 A JP 28606697A JP H11103858 A JPH11103858 A JP H11103858A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、エレクトロポレー
ションによる植物組織へのＤＮＡ導入方法に関するもの
である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for introducing DNA into plant tissue by electroporation.
【０００２】[0002]
【従来の技術】植物細胞に、ＤＮＡを導入する方法に
は、間接法と直接法とがあり、さらに、この直接法のう
ち、電気パルスを利用するものとして、エレクトロポレ
ーション法が知られている。2. Description of the Related Art There are an indirect method and a direct method for introducing DNA into plant cells. Among these direct methods, an electroporation method is known as a method utilizing electric pulses. I have.
【０００３】さて、植物細胞は、動物細胞と異なり、細
胞膜の外側にセルロースからなる細胞壁を有する。した
がって、細胞壁に包まれた植物細胞内に、ＤＮＡを導入
しようとするなら、ＤＮＡを、細胞膜だけでなく、細胞
壁をも通過させなければならない。そして、従来、電気
パルスのみによって、ＤＮＡを、細胞膜と細胞壁とを一
度に通過させることはできないものと信じられていた。[0003] Unlike animal cells, plant cells have a cell wall made of cellulose outside the cell membrane. Therefore, if DNA is to be introduced into a plant cell wrapped in the cell wall, the DNA must pass not only through the cell membrane but also through the cell wall. It has been conventionally believed that DNA cannot pass through a cell membrane and a cell wall at the same time only by an electric pulse.
【０００４】このため、従来のエレクトロポレーション
法では、まず、ＤＮＡを導入したい植物細胞をプロトプ
ラストにした上で、電気パルスを印加していた。即ち、
従来のエレクトロポレーション法では、プロトプラスト
再分化系が必須のものとなっていた。これにより、形質
転換を植物で作製することが可能になる。[0004] Therefore, in the conventional electroporation method, first, a plant cell into which DNA is to be introduced is converted into a protoplast and then an electric pulse is applied. That is,
In the conventional electroporation method, a protoplast regeneration system has been essential. This allows the transformation to be made in plants.
【０００５】ここで、プロトプラストとは、細胞をばら
ばらにし、植物細胞から細胞壁を取り除き（ペクチナー
ゼ、セルラーゼを用いる）、外部に細胞膜を露呈させた
ものである。そして、このプロトプラストは、植物細胞
が生命活動を維持できる最小の単位である。[0005] Here, the protoplasts are obtained by disintegrating cells, removing cell walls from plant cells (using pectinase and cellulase), and exposing cell membranes to the outside. And this protoplast is the smallest unit that enables plant cells to maintain vital activity.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな技術では、プロトプラストにするための装置や手間
がかかるだけでなく、植物生体の本来の姿から、遠くか
け離れた形態（プロトプラスト）でないと、ＤＮＡを導
入できないことになる。However, such a technique requires not only a device and labor for producing protoplasts, but also a DNA (protoplast) that is far from the original form of the plant organism (protoplast). Cannot be introduced.
【０００７】そこで本発明者は、植物生体の本来の姿に
近い状態で、ＤＮＡ導入を行うことができないものか
と、鋭意研究の結果、本発明を完成するに至ったもので
ある。即ち、本発明は、プロトプラスト化せずに、植物
細胞にＤＮＡを導入できるエレクトロポレーションによ
るＤＮＡ導入方法を提供することを目的とする。The inventors of the present invention have made intensive studies as to whether DNA can be introduced in a state close to the original state of a plant organism, and as a result, have completed the present invention. That is, an object of the present invention is to provide a DNA introduction method by electroporation that can introduce DNA into plant cells without forming protoplasts.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明のエレクトロポレ
ーションによるＤＮＡ導入方法では、細胞壁を残したま
まの植物組織、器官又は植物体を、ＤＮＡ又はＤＮＡの
ベクターを含ませた緩衝液に浸漬し、緩衝液にＤＣパル
スを印加しＤＮＡ又はＤＮＡのベクターを植物組織、器
官又は植物体を構成する植物細胞内に導入する。この構
成により、プロトプラスト化せずに、植物細胞にＤＮＡ
を導入できる。In the method of introducing DNA by electroporation according to the present invention, a plant tissue, organ or plant with cell walls remaining is immersed in a buffer containing DNA or a DNA vector. A DC pulse is applied to the buffer to introduce DNA or a DNA vector into plant cells constituting a plant tissue, organ or plant. With this configuration, plant cells can be made into DNA without protoplast formation.
Can be introduced.
【０００９】[0009]
【発明の実施の形態】請求項１記載のエレクトロポレー
ションによるＤＮＡ導入方法では、細胞壁を残したまま
の植物組織、器官又は植物体を、ＤＮＡ又はＤＮＡのベ
クターを含ませた緩衝液に浸漬し、緩衝液にＤＣパルス
を印加しＤＮＡ又はＤＮＡのベクターを植物組織、器官
又は植物体を構成する植物細胞内に導入する。この構成
により、細胞壁を残し、より植物生体に近い状態で、植
物細胞にＤＮＡを導入できる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In the method for transfecting DNA by electroporation according to the first aspect, a plant tissue, organ or plant with cell walls left is immersed in a buffer containing DNA or a DNA vector. A DC pulse is applied to the buffer to introduce DNA or a DNA vector into plant cells constituting a plant tissue, organ or plant. With this configuration, the DNA can be introduced into the plant cells in a state closer to the plant body while leaving the cell wall.
【００１０】請求項２記載のエレクトロポレーションに
よるＤＮＡ導入方法では、ＤＣパルスは、パルス幅と電
圧が設定された矩形波である。この構成により、ＤＣパ
ルスのパルス幅と電圧を調整することにより、緩衝液の
成分や植物組織の性質に合わせたパルスを印加できる。In the method of introducing DNA by electroporation according to the second aspect, the DC pulse is a rectangular wave having a pulse width and a voltage set. With this configuration, by adjusting the pulse width and voltage of the DC pulse, it is possible to apply a pulse that matches the components of the buffer solution and the properties of the plant tissue.
【００１１】請求項３記載のエレクトロポレーションに
よるＤＮＡ導入方法では、ＤＣパルスを印加する前後に
おいて、緩衝液のインピーダンスを計測する。この構成
により、インピーダンスの変化を調べて、ＤＣパルスの
最適化を図ることができる。In the method for introducing DNA by electroporation according to the third aspect, the impedance of the buffer solution is measured before and after the DC pulse is applied. With this configuration, a change in impedance can be examined to optimize the DC pulse.
【００１２】次に図面を参照しながら、本発明の実施の
形態について説明する。図１は、本発明の一実施の形態
におけるＤＮＡ導入装置の概念図である。図１におい
て、１は、透明プラスチックからなるキュベットであ
り、角柱状をなす。２は、キュベット１の上端開口部を
封鎖するふたであり、キュベット１の対向面には、一対
の電極３、４（本形態では、アルミニウム板）が設けて
ある。５は、キュベット１に入れられる緩衝液であり、
通常、２０〜８００μｌ程度の体積で、例えば、マニト
ールやＮａＣｌ液を主材とする。そして、この緩衝液５
には、ＤＮＡ又はＤＮＡのベクターが所定量浸漬され
る。ここで、本形態では、ｐＢＩ２２１を添加してい
る。Next, an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a conceptual diagram of a DNA introduction device according to an embodiment of the present invention. In FIG. 1, reference numeral 1 denotes a cuvette made of transparent plastic, which has a prismatic shape. Reference numeral 2 denotes a lid for closing the opening at the upper end of the cuvette 1, and a pair of electrodes 3 and 4 (in this embodiment, an aluminum plate) are provided on the facing surface of the cuvette 1. 5 is a buffer solution to be put into the cuvette 1,
Usually, the volume is about 20 to 800 μl, and for example, mannitol or NaCl solution is used as a main material. And this buffer 5
Is immersed in a predetermined amount of DNA or a DNA vector. Here, in this embodiment, pBI221 is added.
【００１３】６は、細胞壁を残したままの（プロトプラ
ストではない）植物組織である。本形態では、後述する
ように、植物体の器官の切片を用いている。植物組織６
は、少なくともＤＣパルスを印加する前に、キュベット
１の緩衝液５に浸漬される。なお、同様に、植物組織、
器官又は植物体について、本発明を適用できる。７は、
矩形波印加手段である。矩形波印加手段７は、電極３、
４に接続され、緩衝液５にＤＣパルスを印加するもので
あって、１００μｓ〜１０００ｍｓｅｃのパルス幅、１
〜５００ｖの電圧、パルス回数を設定可能なものが望ま
しい。８は、インピーダンス測定手段であり、ＤＣパル
ス印加前後において、電極３、４間（緩衝液５）のイン
ピーダンスを測るものである。Numeral 6 is a plant tissue with cell walls remaining (not protoplasts). In this embodiment, as described later, a section of a plant organ is used. Plant tissue 6
Is immersed in the buffer solution 5 of the cuvette 1 at least before applying a DC pulse. In addition, similarly, plant tissue,
The present invention can be applied to an organ or a plant. 7 is
This is a rectangular wave applying means. The rectangular wave applying means 7 includes the electrode 3,
4, a DC pulse is applied to the buffer 5 and has a pulse width of 100 μs to 1000 msec.
It is desirable that the voltage and the number of pulses of up to 500 V can be set. Reference numeral 8 denotes impedance measuring means for measuring the impedance between the electrodes 3 and 4 (the buffer 5) before and after the application of the DC pulse.
【００１４】さて、後述するように、本発明者の実験に
より明らかになった点であるが、細胞壁を残したままの
状態でも、緩衝液５にＤＣパルスを印加すると、少なく
とも植物細胞の細胞膜に、微細な小孔があき、この小孔
を介して、細胞外から細胞内へ分子量の大きな物質（例
えば、ＤＮＡやＤＮＡのベクター）の導入が可能にな
る。As will be described later, as has been clarified by the experiments of the present inventor, when a DC pulse is applied to the buffer solution 5 even when the cell wall is left, at least the cell membrane of the plant cell is exposed. Fine pores are formed, and a substance having a large molecular weight (for example, DNA or a DNA vector) can be introduced from outside the cell into the cell through the small pore.
【００１５】ここで、この小孔があくということは、細
胞に損傷が起こることに他ならないが、細胞の損傷が過
大でなければ、ＤＣパルスの印加後、細胞の自己修復機
能によって小孔が塞がれて、細胞は生存し続ける。しか
し、ＤＣパルスを強くしてゆくと、ある条件以上では、
細胞の損傷が無視できない程度となり、ＤＣパルスの印
加後に小孔が残ったままの状態となる。その結果、細胞
内の物質が緩衝液５に滲出し、滲出量次第では、細胞が
死に至ることになる。ここで、細胞内の物質が緩衝液５
に滲出すると、緩衝液５の電気化学的特性が変化し、イ
ンピーダンスにも変化があらわれる。[0015] Here, the formation of the pores is nothing but damage to the cells. However, unless the cells are damaged excessively, the pores are self-repaired by the cells after the application of the DC pulse. Once blocked, the cells continue to survive. However, as the DC pulse is increased, above a certain condition,
Cell damage is not negligible, and the pore remains after application of the DC pulse. As a result, the substance in the cells exudes to the buffer solution 5, and depending on the amount of exudation, the cells die. Here, the substance in the cell is buffer 5
, The electrochemical characteristics of the buffer solution 5 change, and the impedance also changes.
【００１６】さて、細胞内にＤＮＡなどを導入しやすく
するには、ＤＣパルスを強くする方が良いが、せっかく
細胞にＤＮＡを導入しても、過大なＤＣパルスによって
細胞が死滅してしまうのでは、本末転倒になってしま
う。そこで、本形態では、ＤＣパルスの印加前後におい
て、インピーダンス測定手段８を用いて、インピーダン
スの変化を繰り返し計測することにより、細胞が死なな
い範囲において、できるだけ大きなＤＣパルスを印加で
きる最適な条件を探している。In order to easily introduce DNA or the like into cells, it is better to use a strong DC pulse. However, even if DNA is introduced into cells, cells may be killed by excessive DC pulses. Then, it will be overturned. Therefore, in the present embodiment, the impedance measurement means 8 is used to repeatedly measure the change in impedance before and after the application of the DC pulse, so as to find the optimum conditions for applying the largest possible DC pulse within a range where the cells do not die. ing.
【００１７】以上の前提をふまえた上で、本発明者は、
以下の実験を行った。因みに、ＤＮＡ自体が細胞に導入
されたかどうかを直接測ることは困難であるので、導入
したＤＮＡから細胞内で合成される酵素の活性、ＧＵＳ
酵素活性を示す蛍光強度（３試料の平均値）を計測し
た。また、この蛍光強度は、ＤＮＡが全く導入できてい
なければゼロとなり、導入されたＤＮＡの量が増える
と、より大きな値となる。Based on the above assumptions, the present inventor
The following experiment was performed. Incidentally, since it is difficult to directly determine whether or not the DNA itself has been introduced into the cell, the activity of the enzyme synthesized in the cell from the introduced DNA, GUS
The fluorescence intensity indicating the enzyme activity (average value of three samples) was measured. The fluorescence intensity becomes zero if no DNA has been introduced, and becomes larger as the amount of introduced DNA increases.
【００１８】（実験１）植物組織６として、ニンジン塊
根切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２
１であり、３００μｌのＨＣＫＭの緩衝液５に４０μｇ
浸漬した。また、パルス回数を５とした。そして、導入
を試みた後、３日間培養し蛍光強度を測定した。なお、
電極３、４には、極性を入れ替えた電圧を２回かけた。
ここで、ＨＣＫＭとは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＋ ５
ｍＭ ＣａＣｌ2 ＋８０ｍＭ ＫＣｌ ＋ ０．４２
５ｍＭ Ｍａｎｎｉｔｏｌ（ｐＨ７．２）である。(Experiment 1) A carrot tube root section was used as the plant tissue 6. The DNA to be introduced is pBI22
1, 40 μg in 300 μl of HCKM buffer 5
Dipped. The number of pulses was set to 5. After attempting the introduction, the cells were cultured for 3 days and the fluorescence intensity was measured. In addition,
The electrodes 3 and 4 were subjected to twice the voltage whose polarity was switched.
Here, HCKM means 10 mM HEPES + 5
mM CaCl2 +80 mM KCl + 0.42
5 mM Mannitol (pH 7.2).
【００１９】パルス幅（ｍｓｅｃ）と電圧（ｖ）をパラ
メータとした結果は、以下の通りである。 パルス幅 ８０ 電圧 ５０ 蛍光強度 １１ パルス幅 ８０ 電圧 ７０ 蛍光強度 ９５ パルス幅 ８０ 電圧 １１０ 蛍光強度 １４８ パルス幅 ８０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ３７ パルス幅 ４０ 電圧 ５０ 蛍光強度 ７ パルス幅 ４０ 電圧 ７０ 蛍光強度 ５２ パルス幅 ４０ 電圧 １１０ 蛍光強度 ８５ パルス幅 ４０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ８１The results using the pulse width (msec) and voltage (v) as parameters are as follows. Pulse width 80 Voltage 50 Fluorescence intensity 11 Pulse width 80 Voltage 70 Fluorescence intensity 95 Pulse width 80 Voltage 110 Fluorescence intensity 148 Pulse width 80 Voltage 150 Fluorescence intensity 37 Pulse width 40 Voltage 50 Fluorescence intensity 7 Pulse width 40 Voltage 70 Fluorescence intensity 52 Pulse width 40 voltage 110 fluorescence intensity 85 pulse width 40 voltage 150 fluorescence intensity 81
【００２０】（実験２）植物組織６として、キャベツ葉
切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２１
であり、３００μｌのＨＣＫＭの緩衝液５に４０μｇ浸
漬した。また、パルス回数を５とした。そして、導入を
試みた後、３日間培養し蛍光強度を測定した。なお、電
極３、４には、極性を入れ替えた電圧を２回かけた。(Experiment 2) A cabbage leaf section was used as the plant tissue 6. The DNA to be introduced was pBI221.
And 40 μg was immersed in 300 μl of buffer 5 of HCKM. The number of pulses was set to 5. After attempting the introduction, the cells were cultured for 3 days and the fluorescence intensity was measured. It should be noted that the electrodes 3 and 4 were applied twice with the voltages whose polarities were switched.
【００２１】パルス幅（ｍｓｅｃ）と電圧（ｖ）をパラ
メータとした結果は、以下の通りである。 パルス幅 ８０ 電圧 ５０ 蛍光強度 ９ パルス幅 ８０ 電圧 ７０ 蛍光強度 ２９ パルス幅 ８０ 電圧 １１０ 蛍光強度 ５３ パルス幅 ８０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ４６ パルス幅 ４０ 電圧 ５０ 蛍光強度 ７ パルス幅 ４０ 電圧 ７０ 蛍光強度 １２ パルス幅 ４０ 電圧 １１０ 蛍光強度 １６ パルス幅 ４０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ２１The results using the pulse width (msec) and voltage (v) as parameters are as follows. Pulse width 80 Voltage 50 Fluorescence intensity 9 Pulse width 80 Voltage 70 Fluorescence intensity 29 Pulse width 80 Voltage 110 Fluorescence intensity 53 Pulse width 80 Voltage 150 Fluorescence intensity 46 Pulse width 40 Voltage 50 Fluorescence intensity 7 Pulse width 40 Voltage 70 Fluorescence intensity 12 Pulse width 40 voltage 110 fluorescence intensity 16 pulse width 40 voltage 150 fluorescence intensity 21
【００２２】（実験３）植物組織６として、ニンジン塊
根切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２
１であり、緩衝液５に４０μｇ浸漬した。また、パルス
回数を５とした。そして、導入を試みた後、３日間培養
し蛍光強度を測定した。なお、電極３、４には、極性を
入れ替えた電圧１１０（ｖ）をパルス幅８０（ｍｓｅ
ｃ）で、２回かけ、日数毎の経時変化を調べた。(Experiment 3) A carrot tube root section was used as the plant tissue 6. The DNA to be introduced is pBI22
1, which was immersed in Buffer 5 at 40 μg. The number of pulses was set to 5. After attempting the introduction, the cells were cultured for 3 days and the fluorescence intensity was measured. The electrodes 3 and 4 are supplied with a voltage 110 (v) having the reversed polarity and a pulse width of 80 (msec).
In c), the change with time for each number of days was examined twice.
【００２３】結果は、以下の通りである。 日数 ０ 蛍光強度 ２．５ 日数 １ 蛍光強度 ７ 日数 ２ 蛍光強度 ３７ 日数 ３ 蛍光強度 ８４ 日数 ４ 蛍光強度 ９２ 日数 ５ 蛍光強度 ６１The results are as follows. Days 0 Fluorescence intensity 2.5 Days 1 Fluorescence intensity 7 Days 2 Fluorescence intensity 37 Days 3 Fluorescence intensity 84 Days 4 Fluorescence intensity 92 Days 5 Fluorescence intensity 61
【００２４】（実験４）植物組織６として、ジャガイモ
塊根切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２
２１である。また、パルス回数を５とした。そして、導
入を試みた後、３日間培養し蛍光強度を測定した。な
お、電極３、４には、極性を入れ替えた電圧１１０
（ｖ）をパルス幅８０（ｍｓｅｃ）で、２回かけ、ＤＮ
Ａの量（μｇ）を変化させて蛍光強度を測定した。(Experiment 4) A potato tuber root section was used as the plant tissue 6. The DNA to be introduced is pBI2
21. The number of pulses was set to 5. After attempting the introduction, the cells were cultured for 3 days and the fluorescence intensity was measured. The electrodes 3 and 4 have a voltage of 110
(V) is applied twice with a pulse width of 80 (msec) and DN
The fluorescence intensity was measured by changing the amount (μg) of A.
【００２５】結果は、以下の通りである。 ＤＮＡ量 １０ 蛍光強度 ６ ＤＮＡ量 ２０ 蛍光強度 １９ ＤＮＡ量 ４０ 蛍光強度 ４３ ＤＮＡ量 ８０ 蛍光強度 ９６The results are as follows. DNA amount 10 Fluorescence intensity 6 DNA amount 20 Fluorescence intensity 19 DNA amount 40 Fluorescence intensity 43 DNA amount 80 Fluorescence intensity 96
【００２６】（実験５）植物組織６として、ペチュニア
茎切片を用いた。導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２１であ
り、緩衝液５に４０μｇ浸漬した。また、電極３、４に
は、極性を入れ替えた電圧１１０（ｖ）をパルス幅８０
（ｍｓｅｃ）で、２回かけ、緩衝液５の種類に対する蛍
光強度の変化を調べた。(Experiment 5) As the plant tissue 6, a petunia stem section was used. The DNA to be introduced was pBI221, and was immersed in Buffer 5 at 40 μg. The electrodes 3 and 4 are supplied with a voltage 110 (v) whose polarity has been switched and a pulse width of 80.
(Msec), the change in the fluorescence intensity with respect to the type of buffer 5 was examined twice.
【００２７】結果は、以下の通りである。 緩衝液 蒸留水 蛍光強度 ２２ 緩衝液 ＴＥ 蛍光強度 ２５ 緩衝液 ＨＣＭＫ 蛍光強度 ７３ 緩衝液 ＨＣＭＫ＋ＰＥＧ 蛍光強度 ７７ 緩衝液 ＴＥＮＡ 蛍光強度 ４４The results are as follows. Buffer distilled water Fluorescence intensity 22 Buffer TE fluorescence intensity 25 Buffer HCCM fluorescence intensity 73 Buffer HCCM + PEG fluorescence intensity 77 Buffer TENA fluorescence intensity 44
【００２８】但し、 ＴＥ ： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＋ １ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８.０） ＰＥＧ ： Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏ
ｌ ８０００ ＴＥＮＡ ： １ｍＭ Ｔｒｉｓ ＋ ２５ｕＭ ＥＤ
ＴＡ＋ １５０ｍＭ ＮａＣｌHowever, TE: 10 mM Tris + 1 mM ED
TA (pH 8.0) PEG: Polyethylene glyco
l 8000 TENA: 1 mM Tris + 25 uM ED
TA + 150 mM NaCl
【００２９】以上の実験結果から、与えられた植物組織
６に対して、適切な電圧とパルス幅を組み合わせて選択
することにより、細胞壁を残したままの植物組織６中
に、ＤＮＡを導入でき、それが発現して酵素活性が生じ
ることがわかった。また、発現する酵素活性の強さは、
添加するＤＮＡの量と組織の培養時間に依存して増加
し、緩衝液５の種類に、かなり影響されることもわかっ
た。From the above experimental results, it is possible to introduce DNA into the plant tissue 6 with the cell wall remaining by selecting an appropriate voltage and pulse width in combination with the given plant tissue 6, It was found that it was expressed to produce enzyme activity. Also, the strength of the expressed enzyme activity is
It was also found that the amount increased depending on the amount of DNA to be added and the culture time of the tissue, and was significantly affected by the type of buffer 5.
【００３０】即ち、エレクトロポレーション法を改善し
た本発明の方法を用いて、条件を適切に選べば、細胞壁
を残したまま、即ち、植物生体に近い状態において、効
率的にＤＮＡ導入を行える。That is, by using the method of the present invention in which the electroporation method is improved, if the conditions are appropriately selected, DNA can be efficiently introduced while leaving the cell wall, that is, in a state close to a plant organism.
【００３１】[0031]
【発明の効果】本発明は、以上のように構成したので、
植物生体に近い形態で、ＤＮＡ導入を行うことができ
る。The present invention is configured as described above.
DNA can be introduced in a form similar to a plant organism.
【図１】本発明の一実施の形態におけるＤＮＡ導入装置
の概念図FIG. 1 is a conceptual diagram of a DNA introduction device according to an embodiment of the present invention.
１ キュベット ２ ふた ３、４ 電極 ５ 緩衝液 ６ 植物組織 ７ 矩形波印加手段 ８ インピーダンス測定手段 REFERENCE SIGNS LIST 1 cuvette 2 lid 3, 4 electrode 5 buffer solution 6 plant tissue 7 rectangular wave applying means 8 impedance measuring means
Claims (4)
植物体を、ＤＮＡ又はＤＮＡのベクターを含ませた緩衝
液に浸漬し、前記緩衝液にＤＣパルスを印加し前記ＤＮ
Ａ又はＤＮＡのベクターを前記植物組織、器官又は植物
体を構成する植物細胞内に導入することを特徴とするエ
レクトロポレーションによるＤＮＡ導入方法。1. A method of immersing a plant tissue, organ or plant body with a cell wall remaining in a buffer containing DNA or a DNA vector, applying a DC pulse to the buffer, and
A method for introducing DNA by electroporation, comprising introducing an A or DNA vector into a plant cell constituting the plant tissue, organ or plant.
された矩形波であることを特徴とする請求項１記載のエ
レクトロポレーションによるＤＮＡ導入方法。2. The method according to claim 1, wherein the DC pulse is a rectangular wave having a pulse width and a voltage set.
前記緩衝液のインピーダンスを計測することを特徴とす
る請求項１記載のエレクトロポレーションによるＤＮＡ
導入方法。3. Before and after applying the DC pulse,
2. The DNA according to claim 1, wherein the impedance of the buffer is measured.
Introduction method.
ベツ葉切片、ジャガイモ塊根切片又はペチュニア茎切片
のいずれかであることを特徴とする請求項１記載のエレ
クトロポレーションによるＤＮＡ導入方法。4. The method for introducing DNA by electroporation according to claim 1, wherein the plant tissue is any one of a carrot tuber section, a cabbage leaf section, a potato tuber section and a petunia stem section.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9286066A JPH11103858A (en) | 1997-10-01 | 1997-10-01 | Dna transfer by electroporation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9286066A JPH11103858A (en) | 1997-10-01 | 1997-10-01 | Dna transfer by electroporation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11103858A true JPH11103858A (en) | 1999-04-20 |
Family
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| JP9286066A Pending JPH11103858A (en) | 1997-10-01 | 1997-10-01 | Dna transfer by electroporation |
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|---|---|
| JP (1) | JPH11103858A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003070875A2 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Amaxa Gmbh | Container with at least one electrode |
| WO2005035755A1 (en) * | 2003-10-08 | 2005-04-21 | Kyoto University | Method of introducing nucleic acid |
| US8263756B2 (en) * | 2001-04-06 | 2012-09-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of gene transfer via vascular system or ureter |
| JP2013198637A (en) * | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Toshiyuki Moriizumi | Power source for electroporator |
| WO2020075399A1 (en) * | 2018-10-12 | 2020-04-16 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Method for introducing protein in nuclei of plant cells |
-
1997
- 1997-10-01 JP JP9286066A patent/JPH11103858A/en active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US8263756B2 (en) * | 2001-04-06 | 2012-09-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of gene transfer via vascular system or ureter |
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| WO2003070875A3 (en) * | 2002-02-20 | 2004-01-08 | Amaxa Gmbh | Container with at least one electrode |
| KR100852288B1 (en) | 2002-02-20 | 2008-08-14 | 아막사 아게 | Container with at least one electrode |
| US7678564B2 (en) | 2002-02-20 | 2010-03-16 | Lonza Cologne Ag | Container with at least one electrode |
| WO2005035755A1 (en) * | 2003-10-08 | 2005-04-21 | Kyoto University | Method of introducing nucleic acid |
| JP2013198637A (en) * | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Toshiyuki Moriizumi | Power source for electroporator |
| WO2020075399A1 (en) * | 2018-10-12 | 2020-04-16 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Method for introducing protein in nuclei of plant cells |
| JPWO2020075399A1 (en) * | 2018-10-12 | 2021-09-09 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Method of introducing protein into the nucleus of plant cells |
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