JPH1066585A - ヒト軟骨糖蛋白質 - Google Patents

ヒト軟骨糖蛋白質

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JPH1066585A
JPH1066585A JP9152775A JP15277597A JPH1066585A JP H1066585 A JPH1066585 A JP H1066585A JP 9152775 A JP9152775 A JP 9152775A JP 15277597 A JP15277597 A JP 15277597A JP H1066585 A JPH1066585 A JP H1066585A
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protein
sequence
nucleic acid
encoding
cells
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ロバート・ビー・キルクパトリック
Martin Rosenberg
マーティン・ローゼンバーグ
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SmithKline Beecham Corp
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ＨＣ ｇｐ−３９Ｌについての核酸配列
が提供される。組織再造形蛋白質の変化した発現の検出
方法および組織再造形障害の診断方法もまた提供され
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト軟骨糖蛋白質
に関するものである。
【０００２】
【関連出願】本発明は、１９９６年５月３日に出願した
アメリカ合衆国仮出願番号第６０／０１６,５３２号の
利益を要求する。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】組織
の発生または破壊は、間質コラーゲン、基底膜コラーゲ
ン、フィブロネクチン、ラミニン、アグリカン（aggrec
an）および種々のプロテオグリカンを含む細胞外基質
（ＥＣＭ）成分の一定の再器質化（reorganization）お
よび再構築を必要とする。Heinegard and Oldberg, FAS
EB J. 1989, 3, 2042-2051；WoessnerFASEB J. 1991,
5, 214-2154。再造形プロセスの正常なタイプとして
は、胎芽発生、子宮の分娩後退縮、排卵、創傷治癒、な
らびに骨および成長板（growth plate）再造形が挙げら
れる。Woessner et al. Steroids 1989, 54, 491-499；
Weeks et al. Biochim Biophys Acta 1976, 445, 205-2
14；Lepage and Gache EMBO J. 1990, 9, 3003-3012；W
ride and Sanders Dev-Dyn. 1993, 198(3) 225-39。リ
ウマチおよび変形性関節症における関節破壊、歯周組織
および腫瘍細胞転移などの病状においても同様のプロセ
スが生じる。Thompson and Oegema J Bone Joint Surg.
1979, 61, 407-16；Reynolds et al. Adv-Dent-Res. 1
994, 8(2) 312-9。これらのプロセスの一例は、慢性関
節リウマチにおける滑膜組織の場合のように大食細胞の
炎症部位への移動である。Cutolo et al. Clin. and Ex
per. Rheum. 1993, 11, 331-339。ＥＣＭ成分は、正常
な状態および疾患状態の両方の状態において、種々の外
因性および内因性因子により調節される。例えば、腫瘍
形成において、細胞の分化状態は、ＥＣＭの分解速度を
増大させることができる。Benya Pathol. Immunopatho
l. Res. 1988, 7, 51-54。同様に、メタロプロテイナー
ゼまたはそれらの阻害薬の存在は、ＥＣＭの組成を改変
することができる。メタロプロテイナーゼとマトリック
スメタロプロテイナーゼの組織阻害薬（ＴＩＭＰ）の不
均衡は、変形性関節症の病因の一因となることが判明し
た。Dean et al. J. Clin. Invest. 1989, 84: 678-68
5。サイトカイン、成長因子および細胞外環境は、全
て、ＥＣＭの改変の一因となり得る。Tyler Biochem J.
1985, 227, 869-878；Dinarello Sem Immunol. 1992,
4, 133-145；McConnell et al. J. Cell Biol. 1987, 1
05-1087-98。
【０００４】軟骨および骨の成長は、関節軟骨細胞およ
び骨芽細胞などの細胞によって行われる。未熟組織にお
けるこれらの細胞の主な機能は、軟骨基質または骨基質
の沈着および再造形である。成人組織においては、これ
らの細胞は、その適切な機能を確実にするために、この
基質を維持する。両方の場合、これは、細胞外成分の分
泌ならびにＥＣＭのターンオーバーに関係する蛋白質の
分泌を包含する。これらの細胞によって分泌され、ＥＣ
Ｍのターンオーバーに関係する蛋白質の主要な種類は、
メタロプロテイナーゼである。Woessner FASEB J. 199
1, 5, 214-2154。新しいタイプの血清型糖蛋白質は、ヒ
ト軟骨、骨芽細胞、滑膜細胞、ヒツジおよびウシ卵管お
よび乳房細胞、ならびに大食細胞においても同定され
た。Nyrikos and Golds Biochem J. 1990, 268, 265-26
8；Hakala et al. J. Biol.Chem. 1993, 268(34) 25803
-25810；Johansen et al. J. Bone and Min. Res. 199
2, 7(5) 501-511；Rejman and Hurley Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 1988, 150, 329-334；DeSouza and Mu
rray Endocrinology 1995, 136(6) 2485-2496；Hollak
et al. J. Clin. Invest. 1994, 93, 1288-92；Arias e
t al. Biol. of Reproduction 1994, 51, 685-694。こ
れらの新規哺乳動物蛋白質は、全て、細菌および真菌類
キチナーゼとの有意なホモロジーの領域を有しており、
したがって、「キチナーゼ様」蛋白質と称する。キチナ
ーゼは、グリコシド結合を加水分解する酵素である。そ
れらは、哺乳動物からのリゾチームとの繊細な類似性を
生じ、Ｎ−アセチル−グルコサミン結合について特異性
を有するエンドグリコシダーゼとして機能する。しかし
ながら、これらのタイプのキチン様構造物、Ｎ−アセチ
ル−グルコサミンのホモポリマーは、通常、哺乳動物組
織においては見られない。
【０００５】ヒト軟骨糖蛋白質、ＨＣ ｇｐ−３９は、
関節軟骨細胞および滑膜線維芽細胞の両方によって分泌
される約３９kＤaの見かけの分子量を有する蛋白質であ
る。Nyrikos and Golds Biochem J. 1990, 268, 265-26
8；Hakala et al. J. Biol.Chem. 1993, 268(34), 2580
3-25810。この蛋白質は、慢性関節リウマチについて診
断された患者由来の血液および滑液において見られる、
関節損傷についてのマーカーとして開示されている。Jo
hansen et al. British J. of Rheumatology 1993, 32,
949-955。この蛋白質をコードしている遺伝子は、クロ
ーン化され、リウマチ性関節の軟骨および滑膜細胞にお
いて特異的に発現される。Hakala et al. J. Biol. Che
m. 1993, 268(34), 25803-25810。蛋白質ＹＫＬ−４０
は、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３刺激作用に応
じて発現した培養ヒト骨芽細胞（骨癌細胞系ＭＧ−６
３）の主要な分泌生成物の１つと同定された。Johansen
et al. J. Bone and Min. Res. 1992, 7(5), 501-51
1；Johansen et al. Br. J. Rheumatol. 1993, 32, 949
-55。ＹＫＬ−４０のＮ末端部分は、配列決定され、Ｈ
Ｃｇｐ−３９と同一であることが判明した。さらなる配
列決定により、ＹＫＬ−４０およびＨＣ ｇｐ−３９
は、同一であることが判明した。
【０００６】キトトリオシダーゼは、この「キチナーゼ
様」ファミリーの一員として同定された酵素である。Re
nkema et al. J. Biol Chem. 1995, 27C, 2198-2202；H
ollak et al. J. Clin. Invest. 1994, 93, 1288-92。
この蛋白質は、また、３９kＤaの見かけの分子量を有し
ており、ＨＣ ｇｐ−３９、ウシ乳房蛋白質およびいく
つかの細菌キチナーゼとのＮ−末端ホモロジーを有す
る。この酵素の活性は、最初、ゴシェ病（ＧＤ）に罹患
している患者の細胞から検出された。ゴシェ病は、リソ
ソームヒドロラーゼであるグルコセレブロシダーゼの活
性の遺伝的欠損である。この欠損により、大食細胞のリ
ソソームにおけるグルコシルセラミド（グルコセレブロ
シド）の蓄積が生じる。脂質担持大食細胞の蓄積によ
り、肝脾腫大症、骨病変、および神経系異常を生じる。
培養における単球の大食細胞への形態学的分化の後、該
細胞は、漸増する量のキトトリオシダーゼを生産し、分
泌し始める。この増加は、ＧＤ患者における方が他の病
状を有する患者におけるよりも平均して６００倍大き
い。しかしながら、キトトリオシダーゼ活性の上昇は、
酵素補給治療の開始により、有効に減少させることがで
きる。キトトリオシダーゼは、キチナーゼ様ファミリー
の他のメンバーとは異なって、キチン溶解（chitolyti
c）活性を有する。キトトリオシダーゼは、細菌酵素と
は同様に、ベータ１−４−結合Ｎ−アセチルグルコサミ
ン部分のポリマーであるキチンアズレを分解する能力を
有する。
【０００７】今、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌと称するキチナー
ゼ様ファミリーの新しいリンパ球関連蛋白質が同定され
た。ＨＣ−ｇｐ３９Ｌ蛋白質は、哺乳動物細胞における
組織再造形に関係すると思われ、したがって、組織再造
形障害のための治療薬および診断薬の開発において有用
な手段として役立つ。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、１つの態様に
よると、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌである新規成熟ポリペプチ
ド、ならびに生物学的に活性かつ診断的または治療的に
有用なそのフラグメント、類似体および誘導体を提供す
るものである。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のも
のである。
【０００９】本発明は、別の態様によると、mＲＮＡ、
ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む、ヒト ＨＣ ｇ
ｐ−３９Ｌをコードしている単離核酸分子、ならびにそ
の類似体および生物学的に活性かつ診断的または治療的
に有用なフラグメントを提供するものである。
【００１０】本発明は、さらなる態様によると、蛋白質
の発現を促進する条件下、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌのヒト核
酸配列を含有する組換え原核および／または真核宿主細
胞を培養し、次いで、これらの蛋白質を回収することか
らなる、組換え技術によるＨＣ ｇｐ−３９Ｌの製造方
法を提供するものである。
【００１１】本発明は、さらなる態様によると、例えば
組織再造形障害の治療におけるような治療目的のための
ＨＣ ｇｐ−３９Ｌポリペプチドの使用方法を提供する
ものである。
【００１２】本発明は、さらなる態様によると、自己免
疫または組織再造形障害の治療のような治療目的のため
に特異的抗体を用いてリンパ球の表面上に位置するＨＣ
ｇｐ−３９Ｌを目標にするための方法を提供するもの
である。
【００１３】本発明は、さらなる態様によると、例えば
組織再造形障害の診断におけるような診断目的のための
ＨＣ ｇｐ−３９Ｌポリペプチドの使用方法を提供する
ものである。
【００１４】本発明のこれらの態様および他の態様は、
本明細書における教示から当業者に明らかである。
【００１５】本発明は、１つの態様によると、キチナー
ゼ様蛋白質ＨＣ ｇｐ−３９Ｌ（ＨＣ ｇｐ−３９様）を
コードしている単離核酸配列（配列番号１）を提供する
ものである。この蛋白質の推定アミノ酸配列（配列番号
２）を「図１」に示す。さらに、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌ
は、リンパ球から単離され、保存されたキチナーゼ様ド
メインおよびシステインモチーフを含む、キチナーゼ様
蛋白質ＨＣ ｇｐ−３９と５１％のアミノ酸同一性（６
８％アミノ酸類似性）を有することが判明した。しかし
ながら、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌは、ｃＤＮＡがＨＣ ｇｐ−
３９およびＮ−末端伸長を生じるキトトリオシダーゼと
のホモロジーを越えて伸長するという点で他のキチナー
ゼ様蛋白質とは異なる。
【００１６】本発明の核酸配列は、ＲＮＡの形態であっ
てもまたはＤＮＡの形態であってもよく、ＤＮＡとして
は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが挙げら
れる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり、一本鎖
である場合、コード化鎖または非コード化（アンチセン
ス）鎖であってよい。ＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質をコー
ドしている暗号配列は、「図１」に示された暗号配列と
同一であるか、または、遺伝暗号の重剰性または縮重の
結果として、暗号配列が「図１」のＤＮＡと同一の蛋白
質をコードしている異なる暗号配列であってもよい。
【００１７】本発明は、「図１」に示されていると同一
の成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド
を含む。さらに、本発明は、「図１」のポリペプチドの
フラグメント、誘導体または類似体をコードしているか
かるポリヌクレオチドの変異体を含む。これに関する変
異体としては、ヌクレオチド置換、欠失または付加によ
り前記ポリヌクレオチドとは異なる変異体が挙げられ
る。該置換、欠失または付加は、１つ以上のヌクレオチ
ドを含む。該変異体は、コード化領域もしくは非コード
領域または両方の領域において改変されてよい。コード
化領域における改変は、保存的アミノ酸置換、欠失また
は付加を生じてよい。
【００１８】本発明の変異体は、自然に生じる配列を有
するか、または、本発明の変異体は、自然に生じない配
列を有していてもよい。前記のとおり、該ポリヌクレオ
チドは、「図１」に示された暗号配列の天然の対立変異
体である暗号配列を有する。当該技術分野で知られてい
るように、対立変異体は、１個以上のヌクレオチドの置
換、欠失または付加を有するポリヌクレオチド配列の互
生形態である。
【００１９】これに関しては本発明の特に好ましい具体
例としては、「図１」に示したＨＣｇｐ−３９Ｌのアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌ
クレオチド；その変異体、類似体、誘導体およびフラグ
メント、ならびに該変異体、類似体および誘導体のフラ
グメントが挙げられる。
【００２０】さらに、これに関しては特に好ましくは、
数個、多少、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または
０個のアミノ酸残基が組み合わせて置換され、欠失さ
れ、または付加されている「図１」のＨＣ ｇｐ−３９
Ｌポリペプチドのアミノ酸配列を有する、ＨＣｇｐ−３
９Ｌ変異体、類似体、誘導体およびフラグメントならび
に該フラグメントの変異体、類似体および誘導体をコー
ドしているポリヌクレオチドである。これらのうち特に
好ましくは、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌの性質および活性を変
更しないサイレント置換、付加および欠失である。ま
た、これに関しては特に好ましくは、保存的置換であ
り、最も好ましくは、置換を有しない「図１」のアミノ
酸配列を有するポリペプチドである。
【００２１】本発明のさらに好ましい具体例は、「図
１」に示したアミノ酸配列を有するＨＣ ｇｐ−３９Ｌ
ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドと８５
％を超えて同一であるポリヌクレオチドまたは前記した
ようなその変異体、近似の相同体、誘導体および類似体
である。別法としては、最も好ましくは、「図１」のＨ
Ｃ ｇｐ−３９Ｌポリペプチドをコードしているポリヌ
クレオチドと８５％を超えて同一である領域からなるポ
リヌクレオチドである。これに関しては、「図１」のＨ
Ｃ ｇｐ−３９Ｌポリペプチドをコードしているポリヌ
クレオチドと９０％を超えて同一であるポリヌクレオチ
ドが特に好ましく、これらの特に好ましいポリヌクレオ
チドのうち、９５％以上の同一性を有するポリヌクレオ
チドが特に好ましい。さらにまた、９５％以上の同一性
を有するポリヌクレオチドのうち９７％以上の同一性を
有するポリヌクレオチドが非常に好ましく、これらのう
ち９８％以上および９９％以上の同一性を有するポリヌ
クレオチドが特に非常に好ましく、９９％以上の同一性
を有するポリヌクレオチドがさらに好ましい。
【００２２】これに関しては特に好ましくは、「図１」
に示したＨＣ ｇｐ−３９Ｌのアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。
本明細書の他の箇所で記載したとおり、該ポリヌクレオ
チドは、連続領域において、または複数の２以上の不連
続エキソンにおいてポリペプチドＩをコードしており、
さらにコード化領域に関係しない付加領域からなる。
【００２３】これに関しては最も好ましくは、「図１」
に示すポリヌクレオチドのＨＣ ｇｐ−３９Ｌをコード
している部分と８５％を超えて同一である領域からなる
ポリヌクレオチドである。別法としては、最も好ましく
は、「図１」に示したＨＣｇｐ−３９Ｌをコードしてい
る部分と８５％を超えて同一である領域からなるポリヌ
クレオチドである。かかるポリヌクレオチドのうち、
「図１」に示したＨＣｇｐ−３９Ｌをコードしている部
分と９０％を超えて同一であるポリヌクレオチドが特に
好ましく、これらの特に好ましいポリヌクレオチドのう
ち９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが特に
好ましい。さらにまた、９５％以上の同一性を有するも
ののうち９７％以上の同一性を有するものが非常に好ま
しく、これらうち９８％以上および９９％以上の同一性
を有するものが特に非常に好ましく、９９％以上を有す
るものがさらに好ましい。
【００２４】本発明は、また、成熟ポリペプチドをコー
ドしている配列が同一のリーディングフレームにおいて
付加配列と縮合しているポリヌクレオチドをも含む。か
かる配列としては、未完成蛋白質の小胞体への輸送を容
易にするシグナル配列、細胞中のもしくは細胞の外側へ
の蛋白質の通行を容易するか、または細胞中もしくは細
胞外コンパートメント中での蛋白質の持続性を改良する
ポリペプチドの不活性前駆体に関連するプロ配列が挙げ
られる。かかる配列を付加して、生成および精製を容易
にするか、または、本明細書の他の箇所で検討したとお
り、さらなる機能性ドメインを付加する。
【００２５】さらなる好ましい具体例は、配列番号１に
おける５'配列の上流（５'）のＭetコドンからなるＨＣ
ｇｐ−３９Ｌポリヌクレオチド配列である。Ｍetコド
ンが「図１」のポリペプチド（配列番号２）をコードし
ているような連続的なオープンリーディングフレームの
一部であるのが最も好ましい。配列番号１のＨＣ ｇｐ
−３９Ｌの配列を用い、当業者は、慣用的な方法を用い
てプライマーに増幅を行わせしめることによりかかる上
流配列または他の上流配列を得ることができる。上流配
列を誘導するのに有用である好ましいプライマーは、配
列：
【化１】 5'-cagcacctgtggctggggagcccagatgaagtgtggctctatcttgtaTGTGAG CACACCCACATTTTCACTGCCATTATCTGGGACAGCagaaccaggtttggctcaacagat-3' から得られる。この配列のフラグメントは、有用であ
り、好ましくは、約１５〜５０ヌクレオチド長のフラグ
メント、最も好ましくは、約２０〜２５ヌクレオチド長
のフラグメントである。
【００２６】本発明は、さらに、「図１」の推定アミノ
酸配列（配列番号２）を有するＨＣｇｐ−３９Ｌポリペ
プチドならびにかかるポリペプチドのフラグメント、類
似体および誘導体に関する。
【００２７】「フラグメント」、「誘導体」および「類
似体」なる用語は、「図１」のポリペプチドに引用する
場合、かかるポリペプチドと同一の生物学的機能または
活性を実質的に保持するポリペプチドを意味する。かく
して、類似体は、プロ蛋白質部分の開裂によって活性化
されて活性成熟ポリペプチドを生成することができるプ
ロ蛋白質を含む。本発明のポリペプチドは、組換えポリ
ペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、
好ましくは組換えポリペプチドである。
【００２８】「図１」のポリペプチドのフラグメント、
誘導体または類似体は、（i）１個以上のアミノ酸残基
が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存ア
ミノ酸残基）で置換され、かかる置換アミノ酸残基が遺
伝暗号によってコードされているものであってもなくて
もよいもの、または（ii）１個以上のアミノ酸残基が置
換基を含むもの、または（iii）成熟ポリペプチドがポ
リペプチドの半減期を増加させるための化合物（例え
ば、ポリエチレングリコール）など別の化合物と縮合さ
れるもの、または（iv）付加アミノ酸が成熟ポリペプチ
ド（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列または成熟
ポリペプチドもしくはプロ蛋白質配列の精製のために用
いられる配列）と縮合されるものである。かかるフラグ
メント、誘導体および類似体は、本明細書の教示から当
業者の範囲内であると思われる。
【００２９】本発明のポリペプチドおよび核酸配列は、
単離された形態で準備されるのが好ましく、均質性に精
製されるのが好ましい。「単離された」なる用語は、物
質がその最初の環境（例えば、天然である場合は、自然
環境）から取り出されることを意味する。例えば、生動
物に存在する天然核酸配列またはポリペプチドは、単離
されないが、自然系における共生物質のいくつかまたは
全てから分離された同一の核酸配列またはポリペプチド
は、単離される。かかる核酸配列は、ベクターの一部で
あり、および／またはかかる核酸配列またはポリヌクレ
オチドは、組成物の一部であり、かかるベクターまたは
組成物がその自然環境の一部ではないという点でなおも
単離される。
【００３０】本発明は、また、本発明の核酸配列の１つ
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝学的に
処理される宿主細胞および組換え技術による本発明のポ
リペプチドの生成に関する。
【００３１】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターである本発明のベクターを用いて
遺伝学的に処理される（形質導入されるか、または形質
転換されるか、またはトランスフェクトされる）。該ベ
クターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファー
ジなどの形態であってもよい。処理された宿主細胞は、
所望により、プロモーターを活性化させるため、形質転
換体を選択するため、または、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌ遺伝
子を増幅させるために変更した慣用の栄養培地中で培養
することができる。温度、pＨなどの培養条件は、発現
のために選択された宿主細胞について以前に用いられた
ものであり、当業者に明らかである。
【００３２】本発明の核酸配列は、組換え技術によりポ
リペプチドを生成するために用いられる。該核酸配列
は、ポリペプチドを発現させるための種々の発現ベクタ
ーのいずれか１つに含まれる。かかるベクターとして
は、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、
ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；
バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよび
ファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクター、ワク
シニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂
犬病などのウイルスＤＮＡが挙げられる。しかしなが
ら、他のベクターは、宿主において複製可能かつ生存可
能である限り用いられる。
【００３３】種々の方法により、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌの
ＤＮＡ配列をベクター中に挿入することができる。一般
に、ＤＮＡ配列は、当該技術分野で知られている方法に
よって、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入さ
れる。かかる方法および他の方法は、当業者の範囲内で
あると思われる。
【００３４】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発
現調節配列（プロモーター）に操作的に連結されて、ｍ
ＲＮＡ合成を行わせしめる。かかるプロモーターの代表
例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、イー
・コリ（Ｅ.coli）lacまたはtrp、ファージラムダＰLプ
ロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそ
れらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが
知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベク
ターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転
写ターミネーターを含有する。ベクターは、発現を増幅
させるのに適切な配列をも含んでいる。
【００３５】さらに、発現ベクターは、好ましくは、１
個以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有しており、真
核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼもしくは
ネオマイシン耐性など、またはイー・コリ（Ｅ.coli）
におけるテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性な
どの形質転換宿主細胞の選択のための表現型特性を提供
する。
【００３６】前記のような適切なＤＮＡ配列を含有する
ベクター、ならびに適切なプロモーターまたは調節配列
を用いて、適切な宿主を形質転換させて、宿主に蛋白質
を発現させてもよい。
【００３７】適切な宿主の代表的な例としては、イー・
コリ（Ｅ.coli）、ストレプトマイセス（Ｓtreptomyce
s）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓalmonella typhi
murium）などの細菌細胞；酵母などの真菌類細胞；ドロ
ソフィラ（Ｄrosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓp
odoptera）Ｓｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまた
はボウズ（Ｂowes）黒色腫などの動物細胞；アデノウイ
ルス；植物細胞などが挙げられる。適切な宿主の選択
は、本明細書における教示から当業者の範囲内であると
思われる。
【００３８】さらに詳しくは、本発明は、前記配列の１
つ以上からなる組換え構築物を含む。該構築物は、前方
向または逆方向で、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌをコードしてい
る配列が挿入されるプラスミドまたはウイルスベクター
などのベクターからなる。この具体例の好ましい態様で
は、構築物は、例えば、配列に操作可能に連結したプロ
モーターを含む調節配列からなる。多数の好適なベクタ
ーおよびプロモーターが当業者に知られており、商業的
に入手可能である。以下のベクターが一例として挙げら
れる；細菌性：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９（キ
アゲン（Ｑiagen））、pＢＳ、pＤ１０、phagescript、
psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、p
ＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ（ストラータジ
ーン（Ｓtratagene））；ptrc９９a、pＫＫ２２３−
３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５（ファ
ルマシア（Ｐharmacia））；真核性：pＷＬＮＥＯ、ｐ
ＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ（ストラー
タジーン（Ｓtratagene））、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭ
ＳＧ、pＳＶＬ（ファルマシア（Ｐharmacia））。しか
しながら、他のプラスミドまたはベクターは、それらが
宿主中で複製可能かつ生存可能である限りは用いられ
る。
【００３９】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可
能なマーカーを有する他のベクターを用いて所望の遺伝
子から選択することができる。２つの適切なベクター
は、pＫＫ２３２−８およびpＣＭ７である。特に挙げら
れた細菌プロモーターとしては、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、
Ｔ７、gpt、ラムダＰR、ＰLおよびtrpが挙げられる。真
核プロモーターとしては、即時（immediate early）Ｃ
ＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４
０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロ
チオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプ
ロモーターの選択は、充分に当業者のレベルの範囲内で
ある。
【００４０】さらなる具体例では、本発明は、前記構築
物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物
細胞などの高等真核細胞、または、酵母細胞などの下等
真核細胞であってもよいか、または、宿主細胞は、細菌
細胞などの原核細胞であってよい。該構築物の宿主細胞
への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ま
たは、電気穿光法（Davis, L., Dibner, M., Battey,
I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)）に
より行うことができる。
【００４１】宿主細胞における構築物を慣用手段におい
て用いて、組換え配列によりコードされている遺伝子産
物を生産することができる。別法としては、ポリペプチ
ドは、慣用のペプチド合成器により合成的に生成するこ
とができる。
【００４２】成熟蛋白質は、適切なプロモーターの制御
下、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中で発現
させることができる。無細胞翻訳系を用い、本発明のＤ
ＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いてかかる蛋白質
を生成することもできる。原核宿主および真核宿主と一
緒に用いるための適切なクローニングベクターおよび発
現ベクターは、Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Ha
rbor, N.Y., (1989) に開示されている（出典明示によ
り本明細書の一部とする）。
【００４３】高等真核生物による蛋白をコードしている
ＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入
することによって増加させられる。エンハンサーは、プ
ロモーターに対して作用してその転写を増加させる通常
約１０〜３００bpのＤＮＡのシス作用性要素である。例
として、複製起点bp １００〜２７０のレートサイド（l
ate side）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイ
ルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点のレート
サイドのポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーが挙げられる。
【００４４】一般に、組換え発現ベクターとしては、複
製の起点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可
能なマーカー、例えば、イー・コリ（Ｅ.coli）のアン
ピシリン耐性遺伝子およびサッカロミセス・セレビシエ
（Ｓ.cerevisiae）ＴＲＰ１遺伝子、ならびに下流構造
配列の転写を行わせしめる高発現遺伝子から誘導された
プロモーターが挙げられるであろう。かかるプロモータ
ーは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐ
ＧＫ）、ａ因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショッ
ク蛋白質などの解糖酵素をコードしているオペロンから
誘導することができる。異種構造配列は、適切なフェー
ズ（phase）において翻訳開始配列および翻訳終結配
列、好ましくは、翻訳された蛋白質を細胞周辺腔または
細胞外培地中に分泌せしめる能力を有するリーダー配列
を用いて組み立てられる。所望により、異種配列は、例
えば発現組換え生産物の安定化または単純化精製などの
所望の特性を与えるＮ−末端同一化ペプチドを含む融合
蛋白質をコードすることができる。
【００４５】機能的プロモーターを有する操作可能なリ
ーディングフェーズ（operable reading phase）におけ
る適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと一
緒に所望の蛋白質をコードしている構造ＤＮＡ配列を挿
入することによって、細菌使用に有用な発現ベクターを
構築することができる。該ベクターは、該ベクターを確
実に維持し、所望により、宿主内で増幅させるように１
つ以上の表現型選択可能マーカーおよび複製起点からな
るであろう。形質転換のために好適な原核宿主として
は、イー・コリ（Ｅ.coli）、バシラス・サチリス（Ｂa
cillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウム
（Ｓalmonella typhimurium）ならびにシュードモナス
（Ｐseudomonas）属、ストレプトマイセス（Ｓtreptpmy
ces）属およびスタフィロコッカス（Ｓtaphylococcus）
属内の種々の種が挙げられるが、選択の問題として他の
種を用いてもよい。
【００４６】非限定的であるが代表的な例として、細菌
使用に有用な発現ベクターは、選択可能なマーカー、お
よびよく知られているクローニングベクターpＢＲ３２
２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝的要素からなる商業
的に入手可能なプラスミドから誘導される複製の細菌起
点からなることができる。かかる市販のベクターとして
は、例えば、pＫＫ２２３−３（スウェーデン国ウプサ
ラのファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia
Ｆine Ｃhemicals））およびＧＥＭ１（アメリカ合衆
国ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・バイオテク
（Ｐromega Ｂiotec））が挙げられる。これらのpＢＲ
３２２「バックボーン」セクションは、適切なプロモー
ターおよび発現させられるべき構造配列と合わせられ
る。
【００４７】適切な宿主菌株の形質転換および適切な細
胞密度への宿主菌株の増殖後、選択されたプロモーター
が適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘発）
により誘発され、さらなる期間、細胞を培養する。
【００４８】細胞は、典型的には、遠心分離により収穫
され、物理的または化学的手段により破壊され、得られ
た粗製抽出物をさらなる精製のために保持する。蛋白質
の発現において用いられる微生物細胞は、冷凍−解凍サ
イクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の
使用を含む慣用的な方法によって破壊することができ、
かかる方法は、当業者によく知られている。
【００４９】種々の哺乳動物細胞培養系を用いて、組換
え蛋白質を発現させることができる。哺乳動物発現系の
例としては、Gluzman Cell 1981, 23, 175 によって開
示されているサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および
適合ベクターを発現させる能力を有する他の細胞系、例
えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ
細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製の
起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならび
に必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、ス
プライス供与および受容部位、転写終結配列、および
５'フランキング未転写配列からなるであろう。ＳＶ４
０スプライスから誘導されたＤＮＡ配列およびポリアデ
ニル化部位を用いて、所望の未転写遺伝的要素を提供し
てもよい。
【００５０】次いで、硫酸アンモニウムまたはエタノー
ル沈殿法、酸性抽出法、陰イオンまたは陽イオン交換ク
ロマトグラフィー法、ホスホセルロースクロマトグラフ
ィー法、疎水性相互作用クロマトグラフィー法、アフィ
ニティークロマトグラフィー法、ヒドロキシアパタイト
クロマトグラフィー法およびレクチンクロマトグラフィ
ー法を含む方法によって、組換え細胞培養物からポリペ
プチドを回収し、精製することができる。所望により、
成熟蛋白質の配置を完全にする際に蛋白質の再生工程を
用いることができる。最後に、最終精製工程のために高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることが
できる。
【００５１】キチナーゼ様蛋白質、特に、ＨＣ ｇｐ−
３９Ｌは、組織再造形に関連していると思われている。
ＨＣ ｇｐ−３９、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌおよびヒトキトト
リオシダーゼは、全て、微生物キチナーゼと相同であ
る。特に、３つの蛋白質全ては、微生物キチナーゼの活
性部位と類似のシステインモチーフおよびホモロジーを
有している。したがって、これらの蛋白質は、組織再造
形疾患のための治療の開発において、および、これらの
疾患の診断において用いることができる。
【００５２】ＨＣ ｇｐ−３９とのホモロジーに基づい
て、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌは、大食細胞の生産物であると
思われる。プラスチックへの付着を介して大食細胞にな
るように活性化された主要なヒト単球は、培養培地中に
高レベルのＨＣ ｇｐ−３９を分泌する。さらに、ＨＣ
ｇｐ−３９発現の誘発は、ホルボールエステルを用いて
誘発させることによるマクロファージ系列に対する骨髄
性細胞系ＨＬ６０およびＵ９３７の分化と相互に関係し
ていた。動脈血管内膜切除術により得られたヒトアテロ
ーム性動脈硬化症プラークにおいてＨＣ ｇｐ−３９メ
ッセージを検出することができる。したがって、ＨＣ
ｇｐ−３９は、大食細胞が重要な役割を果たす慢性関節
リウマチおよびアテローム性動脈硬化症に関連するもの
を含む広範囲の再造形を受けている種々の組織において
機能する。さらに、rＨＣ ｇｐ−３９は、病んでいる動
脈において生じる再造形プロセスにおける関係を示す、
invitro平滑筋細胞移動を刺激することが示された。
【００５３】ＨＣ ｇｐ−３９Ｌの組織特異的発現パタ
ーンも決定された。ＨＣ ｇｐ−３９Ｌは、ＨＣ ｇｐ−
３９Ｌが見られる組織と一致するリンパ球細胞系におい
て特異的に発現される。さらに、ヒトマルチプル組織ノ
ーザンブロット法は、ＨＣｇｐ−３９Ｌメッセージが胸
腺および脾臓において最高レベルで見いだされることを
示し、これは、リンパ球特異的発現と一致する。部分Ｈ
Ｃ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質を含有する融合構築物で免疫化
したウサギから生産したポリクローナル抗血清マルチプ
ルを用いるウエスタンブロット法によりＨＣ ｇｐ−３
９Ｌ蛋白質を検出した。ＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質は、
細胞の膜フラクションと関連しており、培地中には分泌
されない。したがって、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌは、活性化
リンパ球のための細胞表面リンパ球マーカーとして機能
する。したがって、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌは、慢性関節リ
ウマチなどのＴ細胞またはＢ細胞活性化を含む炎症また
は組織再造形疾患について有用な標的である。
【００５４】ＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質は、抗体の生産
に用いることもできる。該蛋白質、そのフラグメントも
しくは他の誘導体、またはその類似体、またはそれらを
発現する細胞を免疫原として用いて、抗体を生産させる
ことができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナ
ル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、キメラ抗体、一本鎖抗体およびヒト抗
体、ならびにＦabフラグメント、またはＦab発現ライブ
ラリーの生産物をも含んでいる。当該技術分野で知られ
ている種々の方法は、かかる抗体およびフラグメントの
生産のために用いられる。
【００５５】これらの蛋白質に対して生じた抗体は、該
蛋白質を動物、好ましくは非ヒトに直接注射することに
よって得ることができる。次いで、このようにして得ら
れた抗体は、該蛋白質自体に結合するであろう。この方
法では、該蛋白質のフラグメントのみをコードしている
配列を用いて、完全天然蛋白質を結合している抗体を得
ることができる。次いで、かかる抗体を用いて、これら
の蛋白質を、これらの蛋白質を発現している組織から単
離することができる。
【００５６】モノクローナル抗体の調製のためには、連
続細胞系培養によって生産される抗体を提供する技術を
用いることができる。例えば、ハイブリドーマ技術（Ko
hlerand Milstein Nature 1975, 256, 495-497）、トリ
オーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor e
t al. Immunology Today 1983, 4, 72）、およびヒトモ
ノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリド
ーマ技術（Cole etal. in Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985, pp. 77-9
6）が挙げられる。
【００５７】一本鎖抗体の生産について開示された技術
（U.S.特許第4,946,778号）を適用して、免疫原性ＨＣ
ｇｐ−３９Ｌ蛋白質生産物に対する一本鎖抗体を生産す
ることができる。また、トランスジェニックマウスを用
いて、免疫原性ＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質生産物に対す
るヒト化抗体を発現させてもよい。
【００５８】本発明は、診断薬としてのＨＣ ｇｐ−３
９Ｌの使用にも関する。ＨＣ ｇｐ−３９Ｌの突然変異
体の検出により、慢性関節リウマチまたはアテローム性
動脈硬化症などの組織再造形疾患を診断することができ
るであろう。これらのＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質の１つ
以上において突然変異体を有する個体は、種々の技術に
よってＤＮＡレベルで検出される。診断のための核酸
は、血液、尿、組織生検および剖検物質からなど患者の
細胞から得られる。ゲノムＤＮＡを検出のために直接用
いてもよく、あるいは、分析前にＰＣＲ（Saiki et a
l., Nature 1986, 324, 163-166）を用いることによっ
て酵素的に増幅させてもよい。同目的のために、ＲＮＡ
またはcＤＮＡを用いてもよい。一例として、ＨＣｇｐ
−３９Ｌをコードしている核酸に相補的なＰＣＲプライ
マーを用いて、この蛋白質における突然変異を同定し分
析することができる。例えば、正常な遺伝子型と比較し
て増幅生産物のサイズの変化により欠失および挿入を検
出することができる。増幅ＤＮＡを放射性標識ＲＮＡま
たは放射性標識アンチセンスＤＮＡ配列にイブリダイズ
することによって、点突然変異を同定することができ
る。完全に適合した配列は、ＲＮase Ａ消化により、ま
たは、融解温度の差異により、ミスマッチ二本鎖と区別
することができる。
【００５９】参照遺伝子および突然変異を有する遺伝子
との間の配列差異は、直接ＤＮＡ配列決定法により判明
する。さらに、クローン化したＤＮＡセグメントをプロ
ーブとして用いて、特異的ＤＮＡセグメントを検出して
よい。この方法の感度は、ＰＣＲ法と組み合わせると非
常に増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ生産物または変
形ＰＣＲ法により得られた一本鎖鋳型分子と一緒に配列
決定プライマーを用いる。配列決定は、放射性標識ヌク
レオチドを用いる慣用的な手段によるか、または、フル
オレセント−タグを用いる自動配列決定法により行われ
る。
【００６０】ＤＮＡ配列差異に基づく遺伝試験は、変性
剤を用いるかまたは用いずに、ゲル中、ＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動移動における変化の検出によって行われ
る。小さな配列欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳
動法により可視化することができる。異なる配列のＤＮ
Ａフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメントの移動が
それらの特定の融解温度または部分融解温度に従って異
なる位置でゲル中で遅くなる変性ホルムアミド勾配ゲル
上で区別されてよい（例えば、Myers et al. Science 1
985, 230, 1242を参照）。特定の位置での配列変化は、
ＲＮaseおよびＳ１保護または化学的開裂法などのヌク
レアーゼ保護アッセイによっても判明する（例えば、Co
tton et al. PNAS USA 1985, 85, 4397-4401）。かくし
て、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーショ
ン、ＲＮase保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定ま
たは制限酵素の使用などの方法（例えば、制限断片長多
型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロット
法によって行われる。
【００６１】慣用のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決
定法に加えて、in situ分析により突然変異を検出する
こともできる。本発明は、種々の組織におけるＨＣ ｇ
ｐ−３９Ｌ蛋白質の変化したレベルを検出するための診
断アッセイにも関する。宿主から誘導された試料中のか
かる蛋白質のレベルを検出するために用いたアッセイ
は、当業者によく知られており、ラジオイムノアッセ
イ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析法およ
び好ましくはＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。ＥＬＩ
ＳＡアッセイは、まず、ＨＣｇｐ−３９Ｌ蛋白質に対し
て特異的な抗体、好ましくは、モノクローナル抗体を調
製することからなる。さらに、該モノクローナル抗体に
対してレポーター抗体を調製する。該レポーター抗体
に、放射活性、フルオレッセンスまたはこの例において
ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素などの検出可
能な試薬を結合させる。宿主から試料を取り出し、該試
料中の蛋白質を結合する固体支持体、例えば、ポリスチ
レン皿上でインキュベートする。次いで、非特異的蛋白
質様ＢＳＡと一緒にインキュベートすることによって、
皿上の遊離蛋白質結合部位を覆う。次に、該皿において
モノクローナル抗体をインキュベートし、その間にモノ
クローナル抗体がＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質に結合し、
ポリスチレン皿に結合する。全ての未結合モノクローナ
ル抗体をバッファーで洗い流す。ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼに結合したレポーター抗体を皿の中に置
き、該レポーター抗体を、ＨＣ ｇｐ−３９Ｌに結合し
たモノクローナル抗体に結合させる。次いで、未結合レ
ポーター抗体を洗い流す。次いで、該皿にペルオキシダ
ーゼ基質を添加し、所定の時間に発色した色の量は、標
準曲線と比較した場合、所定の量の患者試料中に存在す
るＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質の量の測定値である。
【００６２】ＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質に対して特異的
な抗体が固体支持体に結合される場合に競合アッセイを
用いることができ、標識蛋白質および宿主から誘導され
た試料を該固体支持体に通し、固体支持体に結合した検
出された標識の量を該試料中のＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白
質の量に相互に関係させることができる。以下の実施例
は、説明のために記載され、本発明を限定しようとする
ものではない。
【００６３】
【実施例】
実施例１：in vitroにおけるＨＣ ｇｐ−３９の発現 ｃＤＮＡを含有する発現ベクターをＣＨＯ細胞中にトラ
ンスフェクトし、次いで、安定な細胞系を選択すること
によって、in vitroで組換えＨＣ ｇｐ−３９を生成し
た。全長ＨＣ ｇｐ−３９遺伝子をＣＤＮに２片に分け
てクローン化し（６６０ｂｐのＳac II−Ｂst ＥIIフラ
グメント＋６７８ｂｐのＢst ＥII−Ｂclフラグメン
ト）、Ｓac II−Ｂcl Iで切断したＣＤＮベクターと一
緒に連結した。この構築物を標準的な方法によってＣＨ
Ｏ ＡＣＣ ３１７細胞にトランスフェクトした。詳細に
は、ＨＣ ｇｐ−３９プラスミド構築物２０mgを制限消
化によって直線化し、１ml中細胞１.２５×１０7個に電
気穿光処理した。細胞をウエル当たり細胞２.５×１０3
個の密度でシードし、ヌクレオシドの不在下、最小培地
中で選択した。分泌された蛋白質をならし培地から回収
し、Ｑセファロース流を用いて精製し、Ｓセファロース
捕獲し、スプローズ（Ｓpurose）１２上でサイズ分類し
た。得られた物質は、クーマシーブルー染色によって測
定すると、９５％を超える純度であった。ＨＣ ｇｐ−
３９Ｌもまた、この実施例１の記載に従って発現させる
ことができる。
【００６４】実施例２：平滑筋移動についてのアッセイ 片側にｒＨＣ ｇｐ−３９（２.３−７６６mg／ml）を結
合した半透過性フィルターによって分割したチャンバー
中で平滑筋移動を測定した。他方側では、ヒト胎児平滑
筋細胞を培養した。細胞がフィルター中に移動した程度
を比色定量分析的にモニターした（光学密度）。ｒＨＣ
ｇｐ−３９は、このアッセイにおいて、公知の平滑筋
移動刺激物質であるＰＤＧＦよりも強い移動応答を誘発
した。この実施例１におけるこのアッセイは、ＨＣ ｇ
ｐ−３９Ｌの分析のためにも容易に用いることができ
る。
【００６５】実施例３：ＨＣ ｇｐ−３９Ｌに対して生
じたポリクローナル抗体の生成 イー・コリ（Ｅ.coli）中で部分的なＨＣ ｇｐ−３９Ｌ
蛋白質を発現させ、これを用いて、ポリクローナル抗血
清を得た。Ｐet １６Ｂベクター系（ノバジェン（Ｎova
gen））中、Ｎ−末端Ｈisタグとの縮合として、フレー
ム中で、ＨＣｇｐ−３９Ｌの１４６１ｂｐ ＮdeI−Ｘho
I ｃＤＮＡフラグメントをクローン化した。これらの構
築物を標準的な方法によりイー・コリ（Ｅ.coli）中に
形質転換させた。該細胞を増殖させ、溶解させ、該蛋白
質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーによっ
て精製した。精製した融合蛋白質を用いて、ポリクロー
ナル抗血清の生成についてウサギを免疫化した。
【００６６】実施例４：ＨＣ ｇｐ−３９Ｌは、リンパ
球の膜フラクションに関連している。ポリクローナル抗
血清を用いて、ウエスタンブロット法でＨＣ ｇｐ−３
９Ｌ蛋白質を検出した。リンパ球の全細胞溶解物中で蛋
白質が検出される。また、膜フラクション中でも検出さ
れるが、細胞質フラクションに関連しないか、または、
培地中に分泌されない。ＨＣ ｇｐ−３９Ｌは、活性化
リンパ球（炎症または組織再造形疾患）のサブセットに
ついての細胞表面リンパ球マーカーとして機能し、当業
者に公知の二次的検出法であるＦＡＣＳ分析により検出
される。
【００６７】
【配列表】
（１）一般的情報： （i）出願人： キルクパトリック，ロバート ローゼンバーグ，マーティン （ii）発明の名称：ヒト軟骨糖蛋白質 （iii）配列の数：２ （iv）通信宛て名 （Ａ）名宛人：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）市：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州：ペンシルベニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号（ZIP)：１９４０６−０９３９ （v）コンピューター判読形態： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ Ｃompatible （Ｃ）オペレーティング・システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＦastＳＥＱ for Ｗindows Ｖers
ion 2.0 （vi）本出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）優先権データ： （Ａ）出願番号：６０／０１６,５３２ （Ｂ）出願日：１９９６年５月３日 （viii）代理人情報： （Ａ）氏名：ハン，ウィリアム・ティ （Ｂ）登録番号：５２１９ （Ｃ）リファレンス／ドケット番号：Ｐ５０３９０ （ix）遠距離通信情報： （Ａ）電話：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）テレファックス：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
【００６８】（２）配列番号１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４９６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （xi）配列：配列番号１： CAGCACCTGT GGCTGGGGAG CCCAGATGAA GTGTGGCTCT ATCTTGTATG TGAGCACACC 60 CACATTTTCA CTGCCATTAT CTGGGACAGC AGAACCAGGT TTGGCTCAAC AGATTTCTCT 120 TTCCACCCAT CTATTGCAGG TGTAGTGGTC TTGCTGCTTC TCCAGGGAGG ATCTGCCTAC 180 AAACTGGTTT GCTACTTTAC CAACTGGTCC CAGGACCGGC AGGAACCAGG AAAATTCACC 240 CCTGAGAATA TTGACCCCTT CCTATGCTCT CATCTCATCT ATTCATTCGC CAGCATCGAA 300 AACAACAAGG TTATCATCAA GGACAAGAGT GAAGTGATGC TCTACCAGAC CATCAACAGT 360 CTCAAAACCA AGAATCCCAA ACTGAAAATT CTCTTGTCCA TTGGAGGGTA CCTGTTTGGT 420 TCCAAAGGGT TCCACCCTAT GGTGGATTCT TCTACATCAC GCTTGGAATT CATTAACTCC 480 ATAATCCTGT TTCTGAGGAA CCATAACTTT GATGGACTGG ATGTAAGCTG GATCTACCCA 540 GATCAGAAAG AAAACACTCA TTTCACTGTG CTGATTCATG AGTTAGCAGA AGCCTTTCAG 600 AAGGACTTCA CAAAATCCAC CAAGGAAAGG CTTCTCTTGA CTGCGGGCGT ATCTGCAGGG 660 AGGCAAATGA TTGATAACAG CTATCAAGTT GAGAAACTGG CAAAAGATCT GGATTTCATC 720 AACCTCCTGT CCTTTGACTT CCATGGGTCT TGGGAAAAGC CCCTTATCAC TGGCCACAAC 780 AGCCCTCTGA GCAAGGGGTG GCAGGACAGA GGGCCAAGCT CCTACTACAA TGTGGAATAT 840 GCTGTGGGGT ACTGGATACA TAAGGGAATG CCATCAGAGA AGGTGGTCAT GGGCATCCCC 900 ACATATGGGC ACTCCTTCAC ACTGGCCTCT GCAGAAACCA CCGTGGGGGC CCCTGCCTCT 960 GGCCCTGGAG CTGCTGGACC CATCACAGAG TCTTCAGGCT TCCTGGCCTA TTATGAGATC 1020 TGCCAGTTCC TGAAAGGAGC CAAGATCACG CGGCTCCAGG ATCAGCAGGT TCCCTACGCA 1080 GTCAAGGGGA ACCAGTGGGT GGGCTATGAT GATGTGAAGA GTATGGAGAC CAAGGTTCAG 1140 TTCTTAAAGA ATTTAAACCT GGGAGGAGCC ATGATCTGGT CTATTGACAT GGATGACTTC 1200 ACTGGCAAAT CCTGCAACCA GGGCCCTTAC CCTCTTGTCC AAGCAGTCAA GAGAAGCCTT 1260 GGCTCCCTGT GAAGGATTAA CTTACAGAGA AGCAGGCAAG ATGACCTTGC TGCCTGGGGC 1320 CTGCTCTCTC CCAGGAATTC TCATGTGGGA TTCCCCTTGC CAGGATGGCC TTTGGATCTC 1380 TCTTCCAAGC CTTTCCTGAC TTCCTCTTAG ATCATAGATT GGACCTGGTT TTGTTTTCCT 1440 GCAGCTGTTG ACTTGTTGCC CTGAAGTACA ATAAAAAAAA TTCATTTTGC TCCAGT 1496
【００６９】（２）配列番号２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４２３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （xi）配列：配列番号２： Gln His Leu Trp Leu Gly Ser Pro Asp Glu Val Trp Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Glu His Thr His Ile Phe Thr Ala Ile Ile Trp Asp Ser Arg Thr 20 25 30 Arg Phe Gly Ser Thr Asp Phe Ser Phe His Pro Ser Ile Ala Gly Val 35 40 45 Val Val Leu Leu Leu Leu Gln Gly Gly Ser Ala Tyr Lys Leu Val Cys 50 55 60 Tyr Phe Thr Asn Trp Ser Gln Asp Arg Gln Glu Pro Gly Lys Phe Thr 65 70 75 80 Pro Glu Asn Ile Asp Pro Phe Leu Cys Ser His Leu Ile Tyr Ser Phe 85 90 95 Ala Ser Ile Glu Asn Asn Lys Val Ile Ile Lys Asp Lys Ser Glu Val 100 105 110 Met Leu Tyr Gln Thr Ile Asn Ser Leu Lys Thr Lys Asn Pro Lys Leu 115 120 125 Lys Ile Leu Leu Ser Ile Gly Gly Tyr Leu Phe Gly Ser Lys Gly Phe 130 135 140 His Pro Met Val Asp Ser Ser Thr Ser Arg Leu Glu Phe Ile Asn Ser 145 150 155 160 Ile Ile Leu Phe Leu Arg Asn His Asn Phe Asp Gly Leu Asp Val Ser 165 170 175 Trp Ile Tyr Pro Asp Gln Lys Glu Asn Thr His Phe Thr Val Leu Ile 180 185 190 His Glu Leu Ala Glu Ala Phe Gln Lys Asp Phe Thr Lys Ser Thr Lys 195 200 205 Glu Arg Leu Leu Leu Thr Ala Gly Val Ser Ala Gly Arg Gln Met Ile 210 215 220 Asp Asn Ser Tyr Gln Val Glu Lys Leu Ala Lys Asp Leu Asp Phe Ile 225 230 235 240 Asn Leu Leu Ser Phe Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Pro Leu Ile 245 250 255 Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Ser Lys Gly Trp Gln Asp Arg Gly Pro 260 265 270 Ser Ser Tyr Tyr Asn Val Glu Tyr Ala Val Gly Tyr Trp Ile His Lys 275 280 285 Gly Met Pro Ser Glu Lys Val Val Met Gly Ile Pro Thr Tyr Gly His 290 295 300 Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ala Glu Thr Thr Val Gly Ala Pro Ala Ser 305 310 315 320 Gly Pro Gly Ala Ala Gly Pro Ile Thr Glu Ser Ser Gly Phe Leu Ala 325 330 335 Tyr Tyr Glu Ile Cys Gln Phe Leu Lys Gly Ala Lys Ile Thr Arg Leu 340 345 350 Gln Asp Gln Gln Val Pro Tyr Ala Val Lys Gly Asn Gln Trp Val Gly 355 360 365 Tyr Asp Asp Val Lys Ser Met Glu Thr Lys Val Gln Phe Leu Lys Asn 370 375 380 Leu Asn Leu Gly Gly Ala Met Ile Trp Ser Ile Asp Met Asp Asp Phe 385 390 395 400 Thr Gly Lys Ser Cys Asn Gln Gly Pro Tyr Pro Leu Val Gln Ala Val 405 410 415 Lys Arg Ser Leu Gly Ser Leu 420
【図面の簡単な説明】
【図１】 ポリペプチドＨＣ ｇｐ−３９Ｌのポリヌク
レオチド暗号配列（配列番号１）および推定アミノ酸配
列（配列番号２）を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーティン・ローゼンバーグ アメリカ合衆国19406−0939ペンシルベニ ア州キング・オブ・プルシア、スウェード ランド・ロード709番

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＨＣ ｇｐ−３９Ｌをコードしている核
    酸配列。
  2. 【請求項２】 請求項１記載の配列からなる核酸配列に
    よってコードされている蛋白質。
  3. 【請求項３】 配列番号１の配列からなる核酸配列。
  4. 【請求項４】 宿主における突然変異ＨＣ ｇｐ−３９
    Ｌ蛋白質の発現に関連する組織再造形障害の診断方法で
    あって、 （ａ）正常なＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質をコードしてい
    る核酸と相補的なＰＣＲプライマーを合成し、 （ｂ）宿主の細胞から核酸を得、 （ｃ）得られた核酸を、上記の合成したＰＣＲプライマ
    ーを用いて増幅させて、増幅生成物を得、 （ｄ）増幅生成物を、正常なＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質
    をコードしている正常な遺伝子型と比較して、増幅生成
    物における突然変異を検出することからなる診断方法。
  5. 【請求項５】 ＨＣ ｇｐ−３９Ｌが配列番号１のポリ
    ペプチド配列からなる請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 宿主におけるＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質
    の改変発現の検出方法であって、 （ａ）ＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質に対して特異的な一次
    抗体を調製し、 （ｂ）一次抗体に対するレポーター抗体を調製し（ここ
    で、レポーター抗体は、付着した検出可能な試薬に結合
    している）、 （ｃ）宿主から試料を得、 （ｄ）該試料を試料中の蛋白質を結合する固体支持体上
    でインキュベートし、 （ｅ）固体支持体上の結合蛋白質と一緒に上記一次抗体
    をインキュベートして、該一次抗体を固体支持体に結合
    したＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質に付着させ、 （ｆ）検出可能な試薬に結合したレポーター抗体を、固
    体支持体上の付着した一次抗体と接触させ、 （ｇ）検出可能な試薬を検出し、 （ｈ）試料中のＨＣ ｇｐ−３９Ｌ蛋白質の量を測定す
    ることからなる検出方法。
  7. 【請求項７】 ＨＣ ｇｐ−３９Ｌが配列番号１のポリ
    ペプチドからなる請求項６記載の方法。
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