JPH10512453A

JPH10512453A - Human interleukin-1 receptor accessory protein

Info

Publication number: JPH10512453A
Application number: JP8522598A
Authority: JP
Inventors: アンソニーチゾニテ，リチャード; ウォンユー，グレイス
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1995-01-23
Filing date: 1996-01-17
Publication date: 1998-12-02
Also published as: AU4537096A; HUP9702458A2; NO973404L; AR003919A1; FI973089A0; IL116796A0; NO973404D0; WO1996023067A1; EA199700265A1; CA2210724A1; ZA96333B; BR9606837A; EP0808365A1; FI973089A; CZ208197A3; TR199700652T1; PL321538A1; MX9705501A; CO4480033A1; PE64396A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトIL−１レセプターアクセサリータンパク質をコードするポリヌクレオチド、単離されたIL−１レセプターアクセサリータンパク質、及びIL−１レセプターアクセサリータンパク質に対する抗体に向けられる。このタンパク質は特に、IL−１の作用により炎症を妨げるために有用である。 (57) [Summary] The present invention is directed to polynucleotides encoding human IL-1 receptor accessory proteins, isolated IL-1 receptor accessory proteins, and antibodies to IL-1 receptor accessory proteins. This protein is particularly useful for preventing inflammation by the action of IL-1.

Description

【発明の詳細な説明】ヒトインターロイキン−１レセプターアクセサリータンパク質本発明は一般的に、サイトカインレセプター、そしてより具体的には、インターロイキン１レセプターのアクセサリータンパク質に関する。インターロイキン１（IL−１）は、種々の細胞型に対して作用し、そして複数の生物学的性質を有するポリペプチドホルモンである（Dinarello，Blood 77：1 627，1991）。IL-１は、炎症及び免疫原応答の主要メディエイタである。従って、IL−１活性の調節は、それらの応答を制御し、そして調節する手段を提供する。２種のIL−１、すなわちインターロイキン１α（IL−１α）及びインターロイキン１β（IL−１β）が特徴づけられており、それらの両者は本明細書においては、IL−１として言及される。IL−１により生成される生物学的活性は、タイプＩ及びタイプII IL−１レセプターと称する特定の細胞膜レセプターに結合することによって仲介される。IL−１レセプター（IL−１Ｒ）は、約 300個のアミノ酸の細胞外ドメインを有するトランスメンブランタンパク質であり、そして免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの分子である（Simsなど.，Science 2 41：585，1988；Sims など.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：8946，1989；Mc Mahanなど.，EMBO J．10：2821，1991）。両IL−１種は、それらのレセプターの個々に結合し、そして結合についてお互い完全に競争する。タイプＩ IL−１Ｒは完全な機能的なIL−１レセプターをコードすることが予想されている。クローン化されたタイプＩ IL−１Ｒに関する実験は、このレセプタータンパク質がチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクトされ、そして発現される場合、IL−１と結合し、そしてIL−１シグナルを伝達するのに十分であったことを示した(Curtisなど. ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：3045，1989)。ハムスター細胞の内因性のアクセサリータンパク質の存在は、それらの研究においては決定されなかった。タイプII IL−１ＲがIL−１Ｒのアクセサリー鎖を表わすことが提案されている(S olari，Cytokine 2：21，1990)。しかしながら、より最近の研究は、タイプII IL−１Ｒがシグナル−伝達アクセサリータンパク質として機能しそうもなく、そして代わりに、それが過剰のIL−１を結合し、そしてその活性を調節するためのおとりの(decoy)レセプターとして作用することを示している（colotta など.， Science 261：472，1993）。 IL−１レセプターに結合するIL−１はIL−１の生物学的効果を介在するので、 IL−１の活性を調節するためのレセプター結合及び活性化の機構の理解は重要である。ラベルされたIL−１との親和性架橋及び結合の研究は、IL−１レセプターが異なった親和性をもってIL−１を結合することができる複数のタンパク質の複合体として存在することを示している（Lowenthal and Mac Donald，J．Exp．Me d．164：1060，1980；Bensimanなど.，J．Immunol．143：1168, 1989；McMahan など.，EMBO J．10：2821，1991）。IL−１Ｒに関連し、そしてシグナル伝達及び生物学的活性のために必要とされる、ネズミ細胞上の90kDa タンパク質を認識するネズミモノクローナル(mAb)4C5 が記載されている(Powersなど.，AAI会議、 Denver，CO，May 21-25，1993)。同等のタンパク質がヒト細胞上に存在するかどうか、又は存在するなら、どの生物学的機能がそのようなタンパク質に関連しているかは知られていない。本発明の前、ヒトIL−１Ｒアクセサリータンパク質を同定し、又はこのタンパク質をコードする遺伝子をクローン化し、そして発現する努力が、精製されたタンパク質の欠乏、このタンパク質を認識する抗体の欠乏、及び多量のこのタンパク質及びそのmRNAを発現する細胞を同定することの不可能性により実質的に妨げられて来た。さらに、ネズミアクセサリータンパク質は、その対応するヒトアクセサリータンパク質を同定するための努力に使用するためには十分な量で得られなかった。アクセサリータンパク質を発現することが知られているネズミ細胞系は、確かなアミノ酸配列情報を得るための十分なタンパク質を精製するためには少な過ぎる量（約1000個の分子／細胞）でのみ発現した。4C5 標的タンパク質（ネズミアクセサリータンパク質）のヒト相同体を認識することが知られているmAb は存在しなかった。さらに、IL−１への結合は、多くのアクセサリータンパク質がリガンドを結合せず、又は非常に低い親和性を伴って結合することが知られているので、ヒトアクセサリータンパク質を同定するための効果的なスクリーンであることが知られていなかった（Hibiなど.，Cell 63：1149，19 90；Takeshita など.，Science 257：379，1992）。本発明は、IL−１の効果を調節するために使用され得る、精製されたヒトIL− １レセプターアクセサリータンパク質を初めて利用可能にする。可溶性アクセサリータンパク質の添加は、細胞に対するIL−１の効果を阻害する。従って、本発明の観点は、IL−１による細胞の活性化を阻害するために十分な量の可溶性ヒト IL−１Ｒアクセサリータンパク質（IL−１Ｒ AcP）を添加することによる、IL− １に応答する細胞の過剰活性により引き起こされる病理学的状態の処理である。この方法はまた、改変され得、そしてその可溶性アクセサリータンパク質は医薬のためのスクリーニング剤として使用され得る。手短には、IL−１アンタゴニストとして作用する医薬は、IL−１Ｒ AcPとIL− １との相互作用を阻止することによりその作用を行うことができる。細胞膜におけるIL−１Ｒ AcPの存在は、IL−１レセプター複合体とIL−１との効果的な相互作用を可能にするために必要である（効果的な相互作用とは、生物学的応答を開始せしめるためにレセプター複合体に結合することを意味する）。IL−１レセプター複合体は、IL−１Ｒ AcPに関連するタイプＩ又はタイプII IL−１レセプターを包含する（追加のタンパク質もまた、前記複合体の一部であるかもしれない）。可溶性IL−１Ｒ AcPの添加は、細胞上のIL−１Ｒ AcPの代わりに前記可溶性タンパク質とIL−１又はIL−１レセプターとの相互作用を可能にすることによってこの相互作用を阻害し、従って、IL−１により引き起こされる生物学的応答を減じる。本発明のIL−１Ｒ AcPに対する抗体は同様に、IL−１に対する細胞の生物学的応答を阻害する。IL−１Ｒ AcPに結合することによって、抗体は、IL−１がIL−１レセプターと効果的に相互作用することを妨げる。IL−１Ｒ AcPをブロックすることによって、それらの抗体は、IL−１レセプター複合体へのIL−１の結合を阻害し、これはIL−１Ｒ AcPとの相互作用に依存する。IL−１Ｒ AcPはIL −１とIL−１レセプターとの相互作用を阻害し、従って、IL−１応答性細胞の活性化を妨げ、そして炎症応答を低める。精製されたIL−１Ｒ AcPはまた、可能性ある医薬をスクリーンするために使用することができる。その医薬がIL−１Ｒ A cPへのIL−１の結合を阻止する場合、それは効果的なIL−１アンタゴニストであろう。本発明は、IL−１レセプターアクセサリータンパク質又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供し、好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、（ａ）図15〔配列番号１〕に示されるような、活性IL−１Ｒ AcP遺伝子のコード領域に由来するヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド、好ましくはcDNAクローン；（ｂ）適度な緊縮条件下で（ａ）のcDNAクローンにハイブリダイズすることができ、そしてIL−１Ｒ AcP又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；及び（ｃ）遺伝子コードの結果として（ａ）及び（ｂ）に定義されるDNA 配列に縮重し、そしてIL−１Ｒ AcP分子又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドから成る群から選択される。特に好ましい化合物は、ヒトIL−１レセプターアクセサリータンパク質をコードするポリヌクレオチド、たとえばアミノ酸配列〔配列番号３〕又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド、特に配列〔配列番号１〕を有するポリヌクレオチドである。特に好ましい化合物は、たとえばアミノ酸配列〔配列番号９〕を有するヒト可溶性IL−１レセプターアクセサリータンパク質をコードする。ポリペプチド〔配列番号７〕はヒト可溶性IL− １レセプターアクセサリータンパク質をコードする。上記化合物のアンチセンスポリヌクレオチドもまた、本発明の一部である。本発明はまた、ベクター及び適切な宿主細胞、好ましくは、上記で定義された DNA 配列を含んで成る発現ベクター、その発現ベクターを用いて生成された組換えIL−１Ｒ AcP、及び前記発現ベクターを用いて組換えアクセサリータンパク質分子を生成するための方法を提供する。本発明は、上記で定義されたようなポリヌクレオチドによりコードされる、IL −１レセプターアクセサリータンパク質及びその活性フラグメントを利用可能にする。好ましい化合物は、ヒトIL−１レセプターアクセサリータンパク質、好ましくはアミノ酸配列〔配列番号３〕を有するタンパク質である。特に好ましくは、たとえばアミノ酸配列〔配列番号９〕を有する可溶性ヒトIL−１レセプターアクセサリータンパク質である。変性された１又は複数の側基を担持するIL−１Ｒ AcPタンパク質もまた、本発明の一部である。本発明はまた、IL−１Ｒ AcPに対する抗体も提供する。それらの抗体は、ヒト IL−１レセプターアクセサリータンパク質に特異的に結合し、そしてIL−１によるIL−１レセプター複合体の活性化を妨げる。好ましい抗体は、約Ｋ_D 0.1nM〜約Ｋ_D 10nMのIL−１レセプター補助複合体に対する結合親和性を有し、そしてたとえば、モノクローナル抗体又はその誘導体である。上記のような、アンチセンスポリヌクレオチド、IL−１レセプターアクセサリータンパク質又は抗体を含んで成る医薬組成物もまた、本発明の一部である。それらの医薬組成物は、１又は複数の他のサイトカインアンタゴニストを含むことができる。本発明はまた、IL−１レセプターアクセサリータンパク質の製造方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）上記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを適切な宿主において発現し、（ｂ）前記IL−１レセプターアクセサリータンパク質を単離し、そして（ｃ）所望により、１又は複数の側基が変性されている類似体にそれを転換する段階を含んで成る。さらに、本発明は、IL−１レセプターアクセサリータンパク質抗体の製造方法を包含し、ここで前記方法は、（ａ）IL−１レセプターアクセサリータンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系の調製、及び（ｂ）前記モノクローナル抗体の生成及び単離の段階を含んで成る。対応するポリクローナル抗体は、既知方法を用いて生成され得る。上記化合物は、たとえば炎症又は免疫応答の治療への使用のための及び／又はインターロイキン−１の炎症又は免疫学的活性を調節し、そして妨げるための治療的活性物質として有用である。特に、それらの化合物は、急性又は慢性疾患、好ましくはリウマチ様関節炎、炎症性腸疾患、敗血症性ショック、移植片拒絶、乾癬、ぜん息及びＩ型糖尿病の治療において、又は癌、好ましくは急性及び慢性骨髄性白血病の処理において有用である。本明細書において使用される場合、特にことわらない限り、IL−１はIL−１α 及びIL−１βの両者を包含し、そしてIL−１レセプターは、タイプＩ及びタイプ II IL−１レセプターを包含する。図面の簡単な説明図１．室温でのネズミEL−４細胞への〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 の平衡結合。EL−４細胞(1.5×10⁶個の細胞)が、100nMのラベルされていない4C5 の不在（○）又は存在（▽）下で、上昇する濃度の〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 と共に室温で２時間インキュベートされた。合計（○）の及び非特異的（▽）な細胞結合放射能が例１に記載のようにして決定された。〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 の特異的結合（●）が、合計の結合から非特異的結合を引き算することによって計算された。１Ａ．〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 と共にインキュベートされたEL−４細胞の結合。１Ｂ．単一部位モデル(single site model)によるリガンド（Munson and Rodbard，Anal，Biochem．107：220， 1980；McPherson，J． Pharmacol．Methods 14：213，1985）により測定されSca tchard(Scatchard，Ann．N．Y．Acad．Sci．51：660，1949）の方法に従っての結合データの分析。図２．ネズミ70Ｚ／３細胞への〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 の平衡結合。70Ｚ／３細胞(1. 5×10⁶個の細胞)が、100nMのラベルされていない4C5 の不在（○）又は存在（▽ ）下で、上昇する濃度の〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 と共に室温で２時間インキュベートされた。合計（○）の及び非特異的（▽）な細胞結合放射能が例１に記載のようにして決定された。〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 の特異的結合（●）が、合計の結合から非特異的結合を引き算することによって計算された。２Ａ．〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 と共にインキュベートされた70Ｚ／３細胞の結合。２Ｂ．単一部位モデル(sinle site model)によるリガンド（Munson and Rodbard，Anal，Biochem．107：220，1980；McPhers on，J．Pharmacol．Methods 14：213，1985）により測定されるScatchard(Scatc hard，Ann．N．Y．Acad．Sci．51：660，1949)の方法に従っての結合データの分析。図３．モノクローナル抗体4C5，4E2及び35F3による、70Ｚ／３細胞上のIL−１レセプターへのヒト〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１の結合の阻害。阻害アッセイは、例１に記載されるようにして行なわれた。そのデータは、抗体の不在下での特異的結合と比較される場合、示される濃度の抗体の不在下での〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１結合の％阻害率として表わされる。タンパク質は、ヒトIL−１α（Ｈ−α）及びヒトIL −１β（Ｈ−β）である。図４．モノクローナル抗体4C5，4E2及び35F5による、EL−４細胞上のIL−１レセプターへのヒト〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１結合の阻害。阻害アッセイは、例１に記載されるようにして行なわれた。そのデータは、抗体の不在下での特異的結合と比較される場合、示される濃度の抗体の不在下での〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１結合の％阻害率として表わされる。タンパク質は、ヒトIL−１α（Ｈ−α）及びヒトIL−１ β（Ｈ−β）である。図５．4C5 アフィニティークロマトグラフィーによる、EL−４細胞溶解抽出物からの90及び50kDa の２種のタンパク質の単離。タンパク質は、例１に記載されるように、ヒラマメ（lentil）レクチンアフィニティークロマトグラフィー、続く、抗−タイプＩ IL−１Ｒ抗体(7E6)、ネズミIL−１α（Ma）又は抗−アクセサリータンパク質抗体(4C5)のいづれかを含むマトリックス上でのアフィニティークロマトグラフィーによるEL−４細胞の界面活性剤抽出物から部分的に精製された。EL− ４細胞の界面活性剤抽出物中のタンパク質はまた、4C5 親和性マトリックス(4C5 )上で直接的に精製された。カラムから溶出されたタンパク質は、SDS−PAGEにより分離され、ニトロセルロースに移され、そして〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 によりプローブされた。限界端に示される分子サイズは、平行レーンにおいて実施される分子量標準(Amersham Prestained Standards)から評価された。図６．モノクローナル抗体4C5，4E2及び35F5によるIL−１誘発された脾臓Ｂ細胞増殖の阻害。阻害アッセイは、例１に記載されるようにして行なわれた。そのデータは、抗体の不在下での³Ｈ−チミジンの取り込みと比較される場合、示される濃度の抗体の存在下でのＢ細胞による³Ｈ−チミジンの取り込み(CPM)として表わされる。タンパク質は次の通りである：６Ａ．ヒトIL−１α（IL−１α）及び６Ｂ．ヒトIL−１β（IL−１β）。図７．モノクローナル抗体4C5 及び35F5並びにヒトIL−１raによる、IL−１誘発されたＤ10．Ｇ4.1 ヘルパーＴ−細胞の増殖の阻害。阻害アッセイは、例１に記載されるようにして行なわれた。そのデータは、抗体又はIL−１raの不在下での³Ｈ−チミジンの取り込みと比較される場合、示される濃度の抗体の存在下でＤ10細胞による³Ｈ−チミジンの取り込み(CPM)として表わされる。タンパク質は次の通りである：７Ａ．ヒトIL−１α，７Ｂ．ヒトIL−１β。図８．70Ｚ／３細胞によるIL−１誘発されたKappa Ｌ鎖の発現の阻害。モノクローナル抗体4C5，4E2、及び35F5の効果。Kappa Ｌ鎖の発現の誘発、及び抗体による阻害は、例１に記載される通りであった。そのデータは、抗体の不在下で細胞の％と比較される場合、示される濃度の抗体の存在下でKappa Ｌ鎖を発現する細胞の％として表わされる。タンパク質は、ヒトIL−１α（IL−１α）及びヒトIL−１β（IL−１β）である。図９．モノクローナル抗体4C5 及び35F5による、C57BL／６マウスにおけるIL −１誘発された血清IL−６の阻害。マウスは、ヒトIL−１α（α）又はヒトIL− １β（β）（0.03μｇ）の皮下注射の４時間及び10分前、モノクローナル抗体により予備処理された。IL−１投与の２時間後、血清IL−６濃度が例１に記載されるようにして決定された。Mab Ｘ−7B2 は、対照抗体である。図10．ネズミIL−１Ｒ AcPの核酸配列及び推定されるアミノ酸配列。10Ａ．ネズミIL−１Ｒ AcP cDNA クローンE2−Ｋのリーディンングフレームのヌクレオチド配列が示される。上部の鎖は、そのコード配列〔配列番号４〕である。10Ｂ．図10Ａに示されるコード配列から推定されるネズミIL−１Ｒ AcPのアミノ酸配列が示される〔配列番号６〕。シグナルペプチド切断部位は、Ala−１の後に存在することが示されており、それはSer1からVal550まで及ぶ 550個のアミノ酸の成熟タンパク質をもたらす。その切断部位は、精製された天然のmuIL−１Ｒ AcPの NH₂−末端配列分析により確認された（例10）。予測されるトランスメンブランドメインは、Leu340からLeu363まで及ぶ。図11．トランスフェクトされたCOS 細胞からの組換えMuIL−１Ｒ AcPのmAb 4C 5 及び2E6 による免疫沈殿。COS 細胞は、pEF−BOS／muIL−１Ｒ AcP又は pEF− BOS(擬似)（mock）のいづれかによるエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は、例８に記載されるようにして、〔³⁵Ｓ〕Met により代謝的にラベルされた。ラベルされたトランスフェクトタントは、RIPA緩衝液により溶解され、そして記載されるように（例８）mAb 4C5 又は2E6（表２を参照のこと）のいづれかにより免疫沈殿された。両mAb は、70〜90kDa の広いバンドとして移動した pEF−BOS／muIL−１Ｒ AcP によりトランスフェクトされたCOS 細胞からのラベルされたタンパク質を免疫沈殿せしめた。ラベルされたタンパク質は、擬似（mock）のトランスフェクトされたCOS 細胞からは、このサイズ範囲において検出されなかった。より高い分子量の種(＞200 kDa)は、擬似（mock）及びmuIL−１Ｒ AcPトランスフェクトされたC OS 細胞の両者に存在する。図12． COS−７細胞において発現されたネズミ組換えIL−１Ｒ AcPへの〔¹²⁵ Ｉ〕−ラベルされた4C5 及びIL−１の平衡結合。IL−１Ｒ AcP発現プラスミド〔 COS（AcP）〕又は対照プラスミド〔COS(PEF−BOS)〕によりトランスフェクトされた細胞（４〜８×10⁴）を、100nMのラベルされていない4C5 又は50nMのラベルされていないIL−１αの不在（合計）又は存在（非特異的）下で上昇する濃度の〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 又は〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１αと共に４℃で３時間インキュベートした。合計の（合計）及び非特異的な（非特異的）細胞結合放射能を例１に記載されるようにして決定した。〔¹²⁵Ｉ〕−4C5（特異的）及び〔¹²⁵Ｉ〕−IL-１α（特異的）の特異的結合は、合計の結合から非特異的結合を引き算することによって計算された。対照プラスミド〔COS(PEF−BOS)〕によりトランスフェクトされたCOS 細胞への〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１αの結合は、COS−７細胞が天然において、IL -１αのための約600の高い親和性結合部位を発現することを示した。右側のパネルは、単一部位モデルを有するリガンド（Munson and Rodbard，Anal，Biochem ．107：220，1980；McPherson，J．Pharmacol．Methods 14：213，1985）により決定されるようなScatchard の方法(Scatchard，Ann．N．Y．Acad．Sci．51：66 0，1949)に従っての結合データの分析を示す。12Ａ．〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 と共にインキュベートされたCOS（AcP）細胞の場合。12Ｂ．1 2ＡデータのScatchard プロット。12Ｃ．〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１αと共にインキュベートされたCOS（AcP）細胞の結合。12Ｄ．12ＣデータのScatchard プロット。12 Ｅ．〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１αと共にインキュベートされた〔COS(PEF−BOS)〕細胞の結合。12Ｆ．12ＥデータのScatchard プロット。図13． COS−７細胞において発現されたネズミ組換えタイプＩ IL−１Ｒへの〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされた35F5及びIL−１の平衡結合。タイプＩ IL−１Ｒ発現プラスミド〔COS(Mu−IR−1R)〕によりトランスフェクトされた細胞（４〜８×1 0⁴）を、100nMのラベルされていない35F5又は50nMのラベルされていないIL−１ αの不在（合計）又は存在（非特異的）下で上昇する濃度の〔¹²⁵Ｉ〕−35F5又は〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１α及び〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１βと共に４℃で３時間インキュベートした。合計の（合計）及び非特異的な（非特異的）細胞結合放射能を例１に記載されるようにして決定した。〔¹²⁵Ｉ〕−35F5（特異的）及び〔¹²⁵Ｉ〕−IL -１α又はIL-１β（特異的）の特異的結合は、合計の結合から非特異的結合を引き算することによって計算された。右側のパネルは、単一部位モデルを有するリガンド（Munson and Rodbard，Anal，Biochem．107：220，1980；McPherson，J ．Pharmacol.Methods 14:213，1985）により決定されるようなScatchard の方法 (Scatchard，Ann．N．Y．Acad．Sci．51：660，1949)に従って、結合データの分析を示す。13Ａ．〔¹²⁵Ｉ〕−35F5と共にインキュベートされた〔COS(Mu−IR−1 R)〕細胞の結合。13Ｂ．13ＡデータのScatchard プロット。13Ｃ．〔¹²⁵Ｉ〕−I L−１βと共にインキュベートされた〔COS(Mu−IL−1R)〕細胞の結合。13Ｄ．13 ＣデータのScatchard プロット。13Ｅ．〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１αと共にインキュベートされた〔COS(Mu −IL−1R)〕細胞の結合。13Ｆ．13ＥデータのScatchard プロット。図14．ヒトIL−１Ｒ AcPの十分な長さのcDNAクローンの構成。クローン＃３及び＃６におけるヒトIL−１Ｒ AcP cDNA 挿入体の構造の図的な表示が、その図面の上方部に示されている。クローン＃３は、５’非コード配列、ATG 開始コドン及びコード領域の有意な部分を含む。クローン＃６は、コード領域、TGA 停止コドン及び３’非コード配列のほとんどを含み、クローン＃３と重複する。クローン＃３からの 846bpの XbaＩ／BstＸＩフラグメント及びクローン＃６からの約2 700bpの BstＸＩ／XbaＩフラグメントを単離し、そして例12及び13に記載のようにして発現ベクター pEF−BOS 中に連結した。十分な長さのヒトIL−１Ｒ AcPをコードするその得られるcDNAの図的な表示が、底部上に示されている。図15．ヒトIL−１Ｒ AcPのヌクレオチド配列。十分な長さのヒトIL−１Ｒ AcP cDNA における読み取り枠のヌクレオチド配列（例13，図14）が示されている。上部の鎖は、コード配列〔配列番号１〕である。図16．ヒトIL−１Ｒ AcPのアミノ酸配列。図15におけるヌクレオチド配列の翻訳から推定されるヒトIL−１Ｒ AcPのアミノ酸配列が示されている〔配列番号３〕。シグナルペプチド切断部位は、Ala-１の後に存在することが予測され、Ser- 1〜Val-550に及ぶ 550個のアミノ酸の成熟タンパク質の生成がもたらされる。推定されるトランスメンブランドメインは、Leu-340 〜Leu-363 に及ぶ。図17． MRC−５細胞におけるIL−６生成の誘発；IL−１レセプターアンタゴニスト及び抗−タイプＩ IL−１レセプター抗体4C1 による阻害。ヒト胎児の肺繊維芽細胞 MRC−５細胞(５×10⁴細胞；ATCC ♯CCL−171)を含む24ウェルのクラスター皿（No.3524；Cost ar）を、37℃で24時間、保湿されたインキュベーターに配置した。24時間後、細胞を、上昇する濃度のIL−１レセプターアンタゴニスト(IL−１RA；10^-2〜10³pM )、又は抗−タイプＩ IL−１レセプター抗体4C1(10^-4〜10¹μｇ／ml)のいづれかにより37℃で１時間、前処理するか、又はいづれの処理もしなかった。１時間の最後で、５pM又は 100pMのヒトIL−１βを添加し、そして37℃で24時間、インキュベーションを続けた。インキュベーションの最後で、100μｌの細胞上清液を個々のウェルから除去し、そして Quantikine Human IL−６ Assay Kit（Ｒ & Systems）によりIL-６濃度についてアッセイした。データは、IL−１βのみの存在下で又はIL−１β及びインヒビターの存在下で、MRC−５細胞から分泌されたIL−６の濃度（pg／ml）として表わされる。MRC−５細胞からのIL−６分泌の刺激に対する腫瘍壊死因子−α(TNFα)の上昇する濃度の効果もまた、測定された。TNFαは、それらの細胞からのIL−６分泌の刺激においてIL−１βよりも低い効果を有し（−500倍）、そしてそれらの細胞によるIL−１のオートクライン分泌に一部、依存するように見えた。17Ａは、IL−１β，TNFα及びIL−１raによる阻害についてのデータを示す。17Ｂは、mAb 4C1 による阻害についてのデータを示す。図18．可溶性ヒトIL−１Ｒ AcPのヌクレオチド配列。その可溶性ヒトIL−１Ｒ AcP cDNA のヌクレオチド配列が示されている。上方の鎖は、コード配列である〔配列番号９〕。図19．可溶性ヒトIL−１Ｒ AcPのアミノ酸配列。図18におけるヌクレオチド配列の翻訳から推定される可溶性ヒトIL−１Ｒ AcPのアミノ酸配列が示されている〔配列番号９〕。本発明は、IL−１Ｒ AcP（IL−１Ｒ AcP），IL−１Ｒ AcPの活性フラグメント（すなわち、IL−１レセプターに結合し、又は他方では、そのレセプターを活性化するIL−１の能力を阻害することができる）、特にヒト又はネズミIL−１Ｒ AcPをコードする単離されたポリヌクレオチドに向けられる。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列〔配列番号１〕を有するDNA ポリヌクレオチド、及びアミノ酸配列〔配列番号３〕を有するヒトIL−１Ｒ AcPをコードするDNA ポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、下記のように、タンパク質IL−１Ｒ AcPを生成するための中間体として使用され得る。このタンパク質は、IL−１炎症活性に関連する状態の処理において有用である。ポリヌクレオチドは、既知のアンチセンス方法による処理に、それ自体使用され得る。本発明はまた、他のタンパク質を有さない単離されたIL−１レセプターアクセサリータンパク質（IL−１Ｒ AcP）、又はIL−１Ｒ AcPの単離された活性フラグメントにも向けられる。本発明のIL−１Ｒ AcPは、IL−１レセプターに結合するか又は他方では、そのレセプターを活性化するIL−１の能力を阻害するタンパク質又は活性フラグメントである。次の化合物を中間体として使用する、ヒトIL−１Ｒを得るための方法は、本発明の一部である：ネズミIL−１Ｒ AcPをコードするポリヌクレオチド、ネズミIL −１Ｒ AcP、ネズミIL−１Ｒ AcPに対する抗体、及びヒトIL−１Ｒ AcPをコードするポリヌクレオチド。ヒトIL−１Ｒ AcPをコードするポリヌクレオチドから、可溶性ヒトIL−１Ｒ AcP及びその抗体が得られる。本発明のための決定的な第１の中間体は、ネズミIL−１Ｒアクセサリータンパク質のためのmAbの単離である。それらのmAb は、ネズミ70Ｚ／２ pre−Ｂ細胞からの可溶化され、架橋された IL−１α／IL−１Ｒ複合体の部分的に精製された調製物による免疫化により得られる（例１に記載される）。架橋されたリガンド−レセプター複合体の使用がひじょうに適切であった。なぜなら、アクセサリータンパク質はそのような複合体での相互作用の結果としてのみ精製され得るからである。次に、それらのmAb の１つ(4C5)が、ネズミIL−１Ｒ AcPをコードするcDNAを単離するために使用された。このネズミcDNAは、ヒト相同体の部分的ゲノムクローンを得るために使用された。次に、その部分的ゲノムクローンに由来するプローブが、ヒトIL−１Ｒ AcPのための十分な長さのcDNAを単離するために使用された。本明細書において使用される場合、“ポリヌクレオチド”は、実質的に純粋な形で、すなわち汚染性内因性物質を有さない形で、そして標準の方法により、たとえばクローニングベクターを用いて配列及びその成分ヌクレオチド配列の同定、操作及び回収を可能にする量又は濃度で、少なくとも１度単離されたDNA 又は RNA に由来する、より大きなDNA 又はRNA 構造体の成分としての又は異なった分子の形での単離されたDNA 又はRNA ポリマーを意味する。そのような配列は、好ましくは、真核遺伝子に典型的には存在する、内部非翻訳配列又はイントロンにより中断されていないリーディングフレームの形で提供される。しかしながら、適切な配列を含むゲノムDNA もまた使用され得ることは明らかであろう。非翻訳 DNA の配列は、前記リーディングフレームから５’又は３’側に存在することができ、ここで前記配列は、コード領域の操作又は発現を妨害しない。それらのヌクレオチド、たとえばDNA は、１又は複数の上記で同定されたDNA 配列を含むもの及び緊縮ハイブリダイゼーション条件下で（T．Maniatis など. ，Molecular Cloning。A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory( 1982)，387〜389 ページを参照のこと）、DNA 配列にハイブリダイズするそれらの配列を包含する。１つのそのような緊縮ハイブリダイゼーション条件の例は、 65℃で４×SSC でのハイブリダイゼーション、続く、0.1×SSC において65℃で１時間の洗浄である。他方においては、典型的な緊縮ハイブリダイゼーション条件は、50％ホルムアミド、４×SSC における42℃である。適度なハイブリダイゼーション条件下でIL−１Ｒ AcPのための配列にハイブリダイズし、そしてIL−１Ｒ AcPの生物学的性質を有するIL−１Ｒ AcPペプチドのための発現をコードするポリヌクレオチドはまた、新規のIL−１Ｒ AcPポリヌクレオチドをコードする。そのような非緊縮条件の例は、50℃での４×SSC 、又は 42℃での30〜40％ホルムアミドによるハイブリダイゼーションである。さらなるハイブリダイゼーション条件は、例11に言及されている。たとえば、有意な相同性の領域、たとえばグリコシル化又はジスルフィド結合の部位を、IL−１Ｒ AcP 配列と共有し、そして１又は複数のIL−１Ｒ AcPの生物学的性質を有するタンパク質をコードするDNA 配列は、そのようなDNA 配列がIL−１Ｒ AcP配列に厳格にはハイブリダイズしなくても、IL−１Ｒ AcPポリヌクレオチドを明確にコードする。本発明のポリヌクレオチドは、真核細胞においてネズミcDNAを発現させ、そして例７に記載されるアッセイを用いて細胞表面タンパク質をスクリーンすることによって、例７〜13に記載されるようにして得られた。mAb 4C5 と免疫反応性のタンパク質の発現をもたらすネズミcDNAクローンが同定された。このcDNAクローンは、相同のヒトゲノムクローンを得るために使用された。手短に言及すれば、ヒトゲノムDNA は、例７においてマウス細胞から得られた中間体のネズミIL−１Ｒ AcPプローブによりスクリーンされた。記載されるようにクローンが単離され、そして配列決定された。次に、一部のヒトゲノムクローンが、ヒトcDNAライブラリーをスクリーンするための中間体として使用され、そしてクローンが、ヒトIL−１Ｒ AcPをコードする本発明の十分な長さのポリヌクレオチドを得るために、記載のようにして単離され、そして配列決定された。本発明の特定のポリヌクレオチドは、配列〔配列番号１〕を有する。本発明のもう１つのポリヌクレオチドは、アミノ酸配列〔配列番号３〕を有するヒトIL− １Ｒ AcPをコードする。IL−１Ｒ AcPのアミノ酸配列、又は特に〔配列番号３〕をコードすることができるいづれのポリヌクレオチドも、本発明の一部である。本発明のもう１つのポリヌクレオチドは、配列〔配列番号４〕を有する。 IL−１Ｒ AcPの活性フラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の一部である。そのようなポリヌクレオチドは、従来の方法により発現される場合、下記IL−１アッセイにおいてIL−１活性を阻止するタンパク質を生成する、上記で供給されたポリヌクレオチドのフラグメント（既知の方法、たとえば制限消化又は切断によりフラグメント化された）である。可溶性IL−１Ｒ AcPをコードするポリヌクレオチドは、本発明の好ましいフラグメントである。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列〔配列番号７〕を有する。 IL−１Ｒ AcPをコードするポリヌクレオチド及びその活性フラグメントは、IL −１Ｒ AcP及びその活性フラグメントを得るための中間体として有用である。さらに、それらのポリヌクレオチドは、IL−１Ｒ AcPの生成を阻止するアンチセンス治療として有用である。アンチセンス治療は、Akhtar and Ivinson，Nature G enetics ４：215，1993 に記載されるようにして使用される。RNA 又はDNA ポリヌクレオチドは両者とも、それらのために有用である。〔配列番号１〕又はこの配列のフラグメントに対して相捕的であるアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の一部である。そのようなポリヌクレオチドは、相補的配列を生成するために、既知の方法、たとえばDNA 又はRNA 合成法により得られる。従って、当業界において知られている適切な緊縮条件下でIL−１Ｒ AcPをコードするDNA 又はRNA にハイブリダイズすることができ、そしてそのようにハイブリダイズされる場合、IL−１Ｒ AcPの合成を妨げる、本発明のポリヌクレオチドからのいづれの配列も、本発明の一部である。本発明は、IL−１Ｒ AcP又は活性フラグメントをコードする本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを包含する。当業界において知られているいづれかのベクター、たとえばプラスミド、ファージミド(phagemids)、ウィルスベクター、コスミド及び他のベクターは、本発明において使用され得る。前記ポリヌクレオチドは、組換えDNA 技法の業界において良く知られている方法によりベクターに挿入される。発現ベクターは、ベクターの特別な例である。本明細書において使用される場合、“発現ベクター”とは、（１）遺伝子発現において調節役割を有する遺伝子要素、たとえばプロモーター又はエンハンサー、（２）mRNAに転写され、そしてタンパク質に翻訳される構造又はコード配列、及び（３）適切な転写及び翻訳開始及び終結配列のアセンブリーを含んで成る転写単位を含んで成るベクター、たとえばプラスミドを意味する。種々の真核発現システムへの使用に向けられた構造的な要素は、宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするシグナル配列を包含する。他方、組換えタンパク質がシグナル又は輸送配列を伴わないで発現される場合、それはＮ−末端メチオニン残基を含むことができる。この残基は場合によっては、最終生成物を供給するために、発現された組換えタンパク質から続いて切断され得る。 IL−１Ｒ AcP又は活性フラグメントを発現する、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の一部である。ポリヌクレオチドは、発現ベクターを形成するために転写調節配列を含むベクター中に挿入される。次に、それらの発現ベクターは、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション又は他の良く知られた方法により宿主細胞中に挿入される。そのような宿主細胞は、その中に挿入された発現ベクターからタンパク質を生成することができる。他の宿主細胞、たとえば酵母、チャイニーズハムスターの卵巣細胞、細菌細胞が、適切な発現ベクターと共に使用され得る。上記で示されたように、本発明はまた、他のタンパク質を有さない、単離されたIL−１レセプターアクセサリータンパク質（IL−１Ｒ AcP）、又はその活性フラグメントにも向けられる。本発明のIL−１Ｒ AcPは、IL−１レセプター、特にタイプＩ IL−１レセプターに結合し、又は他方ではそのレセプターを活性化するIL−１の能力を阻害する、タンパク質又は活性フラグメントである。ヒトIL− １レセプターの活性化の阻害は、ヒトIL−１Ｒ AcP又は活性フラグメントにより達成され、そして種々の効果、特に炎症を低める効果を有する。従って、IL−１Ｒ AcP又は活性フラグメントによれば、細胞のIL−１活性化を阻害し、そしてそれにより、炎症に関連する徴候を減じ又は緩和することが可能である。 IL−１Ｒ AcPの活性化フラグメントは、タンパク質フラグメントを得るための従来の方法により得られる。たとえば、本発明のDNAを制限消化又は切断により断片化し、そしてIL−１Ｒ AcPPのフラグメントを供給するために従来の方法により宿主細胞において発現され得る。本発明の活性フラグメントは、下記IL−１アッセイを用いて、活性についてスクリーンすることによって決定される。可溶性IL−１Ｒ AcPは、COOH−末端配列の欠失が培地中へのタンパク質の分泌をもたらす、本発明のIL−１Ｒ AcPフラグメントである。その可溶性IL−１Ｒ AcPは、IL−１Ｒ AcPPの細胞外領域のすべて又は一部に対応する。タンパク質のCOOH末端及び細胞外領域を解明するための方法は良く知られている。その得られるタンパク質は、好ましくは、IL−１又はタイプＩ及びタイプII IL−１Ｒと相互作用するその能力を保持する。特に好ましい配列は、IL−１Ｒ A cPのトランスメンブラン領域及び細胞内ドメインが培地中へのそのアクセサリータンパク質の分泌を促進するために欠失され又は置換されている配列を包含する。可溶性IL−１Ｒ AcPはまた、その可溶性IL−１Ｒ AcPが分泌され得る条件下で、トランスメンブラン領域の一部を包含することができる。可溶性IL−１Ｒ AcP は例14及び15に記載されるようにして得られる。本発明の特定の可溶性IL−１Ｒ AcPは、配列〔配列番号９〕を有する。 IL−１Ｒ AcPの好ましい例は、アミノ酸配列〔配列番号３〕を有する。cDNA配列から推定されるIL−１Ｒ AcPのアミノ酸配列〔配列番号１〕は図16に示される。上記のようなIL−１結合に影響を及ぼすいづれかのIL−１Ｒ AcP、たとえば配列番号３の配列を有する類似体は本発明に包含され、この類似体においては、１又は複数の側基が、ポリエチレングリコールのような化合物の結合により、又は融合タンパク質（他のタンパク質配列、たとえば免疫グロブリン配列との）、たとえば又はそうでなければ、その活性がいづれかの変性により維持され又は増強されているタンパク質への組み込みにより、既知の態様で変性されている。IL− １レセプターへのIL−１結合を阻害し、そして特に、既知の技法、たとえば特定部位の突然変異誘発により付加され、欠失され又は置換された１又は複数のアミノ酸を含む配列〔配列番号３〕を実質的に有するタンパク質もまた、包含される。アミノ酸の変化は、記載されるようなその活性又は増強された活性のすべて又は一部を有するIL−１Ｒ AcPとしてのタンパク質の同一性を維持するために制限され、そして保存性である。IL−１阻害活性を決定するための手段は、例５，６，16に記載されており、そしてこの阻害はIL−１レセプターへのIL−１結合の阻害、リンパ球増殖又はカッパＬ鎖発現の阻害、及びIL −１誘発されたIL−６発現の低下を包含する。他のタンパク質を有さない、単離されたIL−１Ｒ AcPは、IL−１Ｒ AcPをコードする本発明のポリヌクレオチドから得られる。たとえば、IL−１Ｒ AcPは、IL −１Ｒ AcPをコードする本発明に提供されるポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１又は７のDNA を宿主細胞において発現し、そしてその得られるタンパク質を単離する従来の方法により得られる。IL−１Ｒ AcPが得られた後すぐに、そのタンパク質は従来の方法により他のタンパク質を有さないように単離され得る。それらの方法は、本発明の抗体による精製又は抗体親和性カラム、イオン交換又はゲル濾過カラム上でのクロマトグラフィー処理、高性能液体クロマトグラフィーによる精製、及びIL−１親和性カラムによる精製を包含するが、但しこれらだけには限定されない。 IL−１Ｒ AcPは、既知の方法によりポリアルキレングリコールポリマーを結合することによって安定化され得る。ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール、及び枝分した又は枝分していない他のポリアルキレンポリマーを包含する。前記ポリマーはタンパク質に直接的に結合され得、又はタンパク質上のリシンのNH₂にポリマーのCOOHを連結する結合基により連結され得る。本発明のIL−１Ｒ AcPは、IL−１を結合し、又は掃去するために治療に直接的に使用され、それにより、IL−１の炎症又は免疫学的活性を調節し、そして妨げるための手段を提供する。病理学的応答を妨げ又は逆転するためへのその使用においては、可溶性IL−１Ｒ AcP又はその IL−１Ｒ AcPに対する抗体が他のサイトカインアンタゴニスト、たとえばIL−２レセプター、可溶性TNF レセプター、IL−１レセプターアンタゴニスト、可溶性 IL−１レセプター及び同様のものに対する抗体と共に組み合わされ得る。さらに、本発明の単離されたIL−１Ｒ AcPは、治療においてそれら自体有用である、IL −１Ｒ AcPに対する抗体を生じさせるために有用である。そのような抗体を生じさせることは、本発明が抗体生成のためにIL−１Ｒ AcPを十分な量で利用可能にするので、実行可能にされる。従って、本発明はまた、ヒトIL−１Ｒ AcPに対する抗体へも向けられる。ヒト IL−１Ｒ AcPに対するネズミ又はラットモノクローナル抗体は、例15におけるようにして得られる。それらの抗体は、本発明のDNA を用いての全長の又は可溶性の組換えヒトIL−１Ｒ AcPの発現の後に得られる、精製され又は一部精製された量のヒトIL−１Ｒ AcPによる免疫化により得られる。ヒトIL−１Ｒ AcPのDNA は、例２及び３に記載されるユニークmAb 4C5 により単離された本発明のネズミIL −１Ｒ AcPのDNA を用いて単離された。ヒトIL−１Ｒ AcPに対するネズミ又はラットmAb に関しては、当業界において良く知られているハイブリドーマ技法が、 mAb を生成するためのハイブリドーマを得るために使用され得る。キメラ性抗体及びヒト化抗体は、既知の方法(Brownなど.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88： 2663，1991；WO90/7861，EP620276)を用いて、又はヘテロダイマー（hetero dim eric）二特異的（bispecific）抗体(Kostelnyなど.，J．Immunol．148：1547，1 992)を生成することによって、それらのゲッ歯動物抗体から得られる。本発明のヒトIL−１Ｒ AcPに対する抗体は、ヒトIL−１Ｒ AcPに特異的に結合し、そしてIL−１によるIL−１レセプター複合体の活性化を妨げる。この活性は、本明細書に記載されるアッセイにより決定され得る。特に、生物学的アッセイは、IL−１−応答性細胞の増殖、又はプロスタグランジンＥ₂及びIL−６のIL−１−誘発された分泌を阻害する抗体の能力に基づくスクリーンを包含する。そのようなアッセイは、細胞生物学における従来の方法により実施され得る。それらのアッセイのための適切な細胞は、脾臓Ｂ細胞、細胞系、たとえばヒトＢ細胞系RPMI 1788(Vandenabeeleなど.，J．Immunol．Meth．1 35：25，1990)、及びヒト繊維芽細胞、たとえばヒト肺繊維芽細胞系 MRC−５（C hinなど.，J．Exp．Med．165：70，1987）を包含する。マウス細胞を用いてのそのようなアッセイのための方法は、例１，２，５及び６に見出される。たとえば、マウスにおけるIL−１誘発されたIL−６生成の阻害を測定するインビボアッセイが使用され得る。それらのアッセイは、例に提供される同じ技法を用いて所望する活性について効果的にスクリーンするためにヒト細胞を用いて実施され得る。好ましい抗体は、従来の方法(Scatchard，Ann．N．Y．Acad．Sci．51：660，1 949)により決定されるように、約Ｋ_D 0.1nM〜Ｋ_D10nMのIL−１レセプター補助複合体への結合親和性を有する。本発明の抗体は、IL−１の存在により引き起こされる症状を軽減するために既知の方法により投与され得る。特に、本発明の抗体は、炎症を軽減することにおいて有用である。IL−１Ｒ AcPに対するそれらの抗体は、たとえばヒトにおける炎症又は免疫応答を抑制するために投与され得る。炎症過程（たとえばリウマチ様関節炎、炎症性腸疾患及び敗血症性ショック）により又は免疫応答（たとえば、Ｉ型糖尿病、移植片拒絶、乾癬及びぜん息）により引き起こされる種々の疾病又は病状は、高められたレベルのIL−１に関連している（Dinarello and Wolft ，New Engl．J．Med．328：106，1993）。従って、IL−１Ｒ AcPとのIL−１の相互作用を阻害する抗体による処理が、急性又は慢性疾患、たとえばリウマチ様関節炎、炎症性腸疾患、及びＩ型糖尿病の臨床学的処理において炎症又は免疫応答を効果的に抑制するために使用され得る。さらに、抗体は、一定の癌、たとえば急性及び慢性骨髄性白血病の治療においても有用である（Rambaldiなど.，Blood 78：3248，1991；Estrov など.，Blood 78．1476，1991）。ネズミIL−１Ｒ AcPに対する抗体、特に4C5，2B5，3F1，4C4，24C5，4D4（表１を参照のこと）、並びに1D2，2D6，2E6，1F6，2D4，2F6，3F5及び4A1（表２を参照のこと）は、本発明に包含される。それらの抗体は、記載されるように、ヒトIL−１Ｒ AcPを得るために有用である。上記のように、抗体は適切な細胞により天然において生成され得、又は抗体タンパク質を変性する組換え発現ベクターにより、たとえば抗体をヒト化することによって（Browinら、Proc．Natl．Acad Sci．USA 88：2663，1991）、又はアクセサリータンパク質及びタイプＩ又はタイプII IL−１Ｒの両者を認識することができるヘテロダイマー二特異的抗体(Kostelnyなど.，J．Immunol．148：1547 ，1992；WO90/7861，EP620276)を生成することによって、生成され得る。 IL−１Ｒ AcP及びそのフラグメント、もしくはIL−１Ｒ AcPに対する抗体又はアンチセンスポリヌクレオチドの投与のための用量範囲は、過度の実験を伴わないで当業者により決定され得る。一般的に、適切な用量は、所望する効果、たとえばIL−１に対して応答性の細胞に対する内因性IL−１の活性を阻止する効果を生成するために十分である用量である。その用量は、反対の副作用、たとえば所望しない架橋反応、過敏性反応及び同様のものを引き起こすほどの量であるべきでない。一般的に、その用量は、患者の年齢、病状、性別及び疾病の程度、反対症状（counter-indication）、存在するなら免疫寛容、及び個々の医者により調節されるべき他のそのような変数により変動するであろう。IL−１Ｒ AcP及びそのフラグメント、又はこのタンパク質に対する抗体又はアンチセンスポリヌクレオチドは、注射により又は時間にわたっての徐々の灌流により非経口投与され得る。それらは、静脈内、腹腔内、筋肉内又は皮下投与され得る。本発明は、炎症を減じるために効果的な量での本発明のタンパク質及び／又は抗体、並びに医薬的に許容できるキャリヤー、たとえば下記調製物及びビークルを含んで成る医薬組成物を包含する。そのような組成物は、所望により、他の活性化合物を含むことができる。タンパク質に関しては、効果的な量の例は、約４〜約32mg／ｍ²の範囲で存在する。抗体に関しては、効果的な量の例は、約 0.1 〜約15mg／kg体重の範囲で存在する。非経口投与のための調製物は、無菌性、又は水性もしくは非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンを包含する。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、たとえばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、たとえばエチルオレエートである。水性キャリヤーは、水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液、たとえば塩溶液及び緩衝媒体を包含する。非経口ビークルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル溶液、又は固定油を包含する。静脈内ビークルは、流体及び栄養補充物、電解液補充物、たとえばリンゲルデキストロースに基づく補充物、及び同様のものを包含する。保存剤及び他の添加剤；たとえば抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガス及び同様のものもまた、存在することができる。一般的には、Remington's Pharmacentical Scinece，16th E d.，Mack Eds.，1980 を参照のこと。次の例は、本発明をさらに説明するために提供されており、本発明を限定するものではない。例１方法ハイブリドーマ抗体の調製、スクリーニング及び精製 Lewis ラット（Charles River Laboratories）を、ネズミ70Ｚ／３ pre−Ｂ細胞（ATCC♯TIB 158）からのIL−１Ｒに親和性架橋された、ヒトIL−１α(Gubler など.，J．Immunol．136：2492，1986)の界面活性剤溶解された調製物により腹腔内（ｉ．ｐ．）路により免疫化した。一次免疫化のため、１×10¹¹個の70Ｚ／３細胞(Chizzoniteなど.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：8029，1989)から調製され、そして精製され、そして１：２の比で完全フロイントアジュバントに乳化され、そして（下記のように）溶解されたIL−１α／IL−１Ｒ複合体(0.4ml) をラットにｉ．ｐ注射した（下記のように）。６週間後、2.25×１０¹¹個の細胞から調製され、そして精製され、そして１：２の比で完全フロイントアジュバントに乳化され、そして溶解されたIL−１α／IL−１Ｒ複合体(0.3ml)をラットの個々の後脚の肉趾及びｉ．ｐ．に注射した。血清を、最後の免疫化の後、２及び６週でラットから集め、そして70Ｚ／３細胞上のIL−１Ｒへの〔¹²⁵Ｉ〕−IL− １βの結合を阻止する活性について試験した。最後の免疫化の後、４ヵ月で、１匹のラットを、脾臓細胞単離のための調製において、次の量の溶解されたIL−１ β／IL−１Ｒ複合体により免疫化した：完全フロイントアジュバントに１：４の比で乳化され、そして個々の後脚の肉趾及び個々の後脚に皮下（Ｓ．Ｃ．）注射される0.1ml（８×10¹⁰個の細胞から調製され、そして精製された）、並びに静脈内（ｉ．ｖ．）及びｉ．ｐ．注射される0.9ml(7.4 ×10¹¹個の70Ｚ／３細胞から調製され、そして精製された)。２日後、リン酸緩衝溶液(PBS)，pH.４(0.5ml)と共に混合され、そして溶解されたIL−１α／IL− １Ｒ複合体(0.5ml；２×10¹⁰個の70Ｚ／３細胞から調製され、そして精製された )をラットの個々の後脚にｓ．ｃ．注射することにより免疫化した。この最後の免疫化の２日後、ラットから脾臓細胞を単離し、そして公開された方法(Fazekas など.，J．Immunol．Meth．35：1，1980)に従って、35％ポリエチレングリコール（PEG 4000，E．Merck）を用いて、１：１（脾臓細胞：SP２／Ｏ細胞）の比で、SP２／Ｏ細胞に融合せしめた。その融合された細胞を、15％ FBS、グルタミン（２mM）、β−メルカプトエタノール(0.1mM)、ゲンタマイシン（50μｇ／ml）、HEPES(10mM)、５％ ORIGIN ハイブリドーマクローニング因子（IGEN，Inc.）、５％ P388D1上清液（Nordonなど.，Ｊ．Immunol． 139：813，1987）及び100 単位／mlの組換えヒトIL−６(Genzyme)により補充されたIMDMを含む48個のウェルのプレートにおいて、３×10⁵個の細胞／ウェル／mlの密度でプレートした。ハイブリドーマ上清液を、次の４種のアッセイにおいて、IL−１Ｒ AcP及びタイプII IL−１Ｒに対して特異的な阻害性及び非阻害性抗体についてスクリーンした：１）阻害性抗体について：70Ｚ／３及びEL−４胸腺腫細胞への〔¹²⁵Ｉ〕 −IL−１β結合の阻害（下記に記載される）、２）非阻害性抗体について：タイプII IL−１Ｒに架橋される〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１βの溶解された複合体の免疫沈殿、３）IL−１Ｒ AcP又はタイプII IL−１Ｒに対して特異的な阻害抗体について：組換えタイプＩ及びタイプII IL−１Ｒを発現する細胞への〔¹²⁵Ｉ〕−IL −１β及び〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１α結合の阻害、及び４）IL−１に対して特異的ないづれかの抗体を排除するために：〔¹²⁵Ｉ〕−IL-１α及び〔¹²⁵Ｉ〕−IL-１βの免疫沈殿。タイプII IL −１Ｒ及びIL−１Ｒ AcPに対して特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を、限界希釈法によりクローン化した。抗体を、製造業者の方法(Pharmacia)に従って、Sepharose ４Ｂファーストフローに結合されるプロテインＧ上でのアフィニティークロマトグラフィーにより大規模ハイブリドーマ培養物又は腹水から精製した。培養された細胞及び生物学的アッセイマウスEL−４．IL−２胸腺腫細胞（TIB181）及びＤ10．Ｇ4.1(TIB224)細胞を、前記のようにして維持した（Kilianなど.，J．Immunol．136：1，1986）。マウス3T3L1（CL173）及び70Ｚ／３ pre−Ｂ（TIB158）細胞を、600cm²の皿において５％ウシ胎児血清を含むIMDMにおいて維持した。上記細胞は、American Tyse Culture Collectionから得られ、そしてATCC番号は括弧内に記載される。ラベルされていないIL−１及び〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１タンパク質の生物学的活性を、ネズミＤ10増殖アッセイ(Kayeなど.，J．Exp．Med．158：836，1983)により評価した。 ¹²⁵ＩによるIL−１及び精製されたモノクローナル抗体のラベリング組換えネズミIL−１α、ヒトIL−１α及びヒトIL−１βを前述のようにして精製した(Kilianなど.，J．Immunol．136：1，1986； Gubler など.，J．Immunol ．136：2492，1986)。但し、ネズミIL−１αは25mMのトリス−HCl，0.4MのNaCl 溶液において調製された。タンパク質の測定を、BCA タンパク質アッセイ(Pierc e Chemical Co.，Rockford，IL)により実施した。ヒトIL−１α、ヒトIL−１β 、ネズミIL−１α、ネズミIL−１β及び精製されたIgG を、Iodogen 法(Pierce Chemical Co.)の変法に従って¹²⁵Ｉによりラベルした。Iodogen をクロロホルムに溶解し、そして0.05mgを12×15mmの珪硼酸ガラス管において乾燥せしめた。放射性ラベリングのために、1.0mCi のNa〔¹²⁵Ｉ〕（Amersham，Chicago，IL）を、0.05mlのトリス−ヨウ素化緩衝液（25mMのトリス−HCl，pH7.5，0.4ＭのNaCl，１mMのEDTA）を含むIodogen 被覆された管に添加し、そして室温で４分間インキュベートした。活性化された ¹²⁵Ｉ溶液を、トリス−ヨウ素化緩衝液中、0.05〜0.1ml IL−１（５〜13μｇ）又はIgG（100μ ｇ）を含む管に移し、そしてその反応物を室温で５〜８分間インキュベートした。そのインキュベーションの最後で、0.05mlのIodogen 停止緩衝液（ダルベッコのPBS（pH7.4）中、10mg／mlのチロシン、10％グリセロール）を添加し、そして３分間、反応せしめた。次に、その混合物を1.0mlのトリス−ヨウ素化緩衝液により希釈し、そしてクロマトグラフィーのための Bio−Gel P10DG 脱塩カラム(B ioRad Laboratories)に適用した。カラムをトリス−ヨウ素化緩衝液により溶出し、そしてピーク量のラベルされたタンパク質を含む画分（１ml）を組合し、そしてトリス−ヨウ素化緩衝液中、１％ BSAにより１×10^H cpm／mlに希釈した。 TCA 沈殿可能放射能（10％のTCA 最終濃度）は典型的には、合計放射能の95％以上であった。放射性特異的活性は典型的には、精製された抗体１ｆモル当たり20 00〜3500cpm であり、そしてIL−1 １ｆモル当たり3500〜4500cpm であった。マウスIL−１レセプター結合アッセイ懸濁培養において増殖されたマウス細胞への放射性ラベルされたIL−１の結合を、前で記載された方法（Kilianなど.，J．Immunol．136：1，1986）により測定した。手短に言及すれば、細胞を結合緩衝液（RPMI−1640，５％ FBS，25mMの HEPES，pH7.4）により１度洗浄し、1.5×10⁷個の細胞／mlの細胞密度に結合緩衝液により再懸濁し、そして種々の濃度の〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１（５〜1000pM）と共に４℃で３〜４時間インキュベートした（1.5×10⁶個の細胞）。細胞結合された放射能を、 0.1mlの油混合物（Thomas Silicone Fluid 6428-R15：A．H．Thomas 、及びSili cone Oil AR200：Gallard-Schlessingez の１：２混合物）を通して４℃で90秒間、10,000×ｇでアッセイ混合物を遠心分離することにより遊離〔¹²⁵Ｉ〕−IL −１から分離した。細胞ペレットを含む先端部分を切り出し、そして細胞結合放射能をガンマカウンターにより決定した。非特異的結合を、アッセイへの50nMのラベルされていないIL−１の包含により決定した。インキュベーションを、二重反復又は三重反復で実施した。レセプター結合データを、Elsevier−BIOSOFT からMcPherson（MCPherson，J．Pharmacol．Methods 14：213，1985）によりIBM パーソナルコンピューターのために適合されたような非線状形帰プログラムEBDA ，LIGAND及びKinetic（Munson and Rodbard，Anal．Biochem 107：220，1980）を用いることによって分析した。付着細胞への放射性ヨウ素化されたIL−１タンパク質の結合を、結合緩衝液（ 24）において４℃で４時間、ロッカープラットホーム上での24又は12ウェルプレートにおいて細胞及びリガンドをインキュベートすることによって実施した。次に、単分子層を結合緩衝液により４℃で３度すすぎ、１％ SDS 0.5mlにより溶解し、そして開放された放射能をガンマカウンターにより計数した。非特異的結合を、50nMのラベルされていないIL−１の存在下で決定した。結合データの分析を、上記のようにして行なった。ネズミ細胞への〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされたモノクローナル抗体の平衡結合ネズミ細胞を、結合緩衝液（RPMI 1640，５％ FBS，25mMのHEPES，pH7.4）により１度洗浄し、そして 1.5×10⁷細胞／mlの細胞密度に結合緩衝液により再懸濁した。細胞(1.5×10⁶)を、種々の濃度(0.005〜２nM )の〔¹²⁵Ｉ〕−特異的IgG と共に室温で1.5〜２時間インキュベートした。細胞結合放射能を、４℃で90秒間、10,000×ｇで 0.1mlのシリコーン油を通してアッセイ混合物を遠心分離することにより遊離〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされた抗体から分離した。細胞ペレットを含む先端部分を切り出し、そして細胞結合放射能をガンマカウンターにより決定した。非特異的結合を、そのアッセイへの 100nMのラベルされていない抗体の包含により決定した。インキュベーションを二重反復又は三重反復で実施した。レセプター結合データを、細胞へのIL−１結合について上記のようにして分析した。タイプＩ又はタイプII IL−１レセプターを担持するネズミ細胞への〔¹²⁵Ｉ〕−IL-１結合の抗体介在阻害 IL−１レセプターを担持するネズミ細胞への〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１タンパク質の結合を阻害するハイブリドーマ上清溶液、精製されたIgG、又は抗血清の能力を次の通りに測定した：培養上清液、精製されたIgG 又は抗血清の一連の希釈溶液を、結合緩衝液（RPMI−1640，５％ FBS，25mMのHEPES，pH7.4）中、細胞(1.5× 10⁶個の細胞)と共に混合し、そして室温で１時間、オービタルシェーカー上でインキュベートした。〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１（１×10⁵cpm；25pM）を個々の管に添加し、そして４℃で３〜４時間インキュベートした。非特異的結合をアッセイへの 50nMのラベルされていないIL−１の包含により決定した。インキュベーションを、二重反復又は三重反復で実施した。細胞結合放射能を、上記のようにして0.1m lの油混合物を通してのアッセイ混合物の遠心分離により遊離〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１から分離した。細胞ペレットを含む先端部分を切り出し、そして細胞結合放射能をガンマカウンターにより決定した。溶解された〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１α／IL−１Ｒ複合体の親和性架橋及び精製細胞への放射性ヨウ素化されたIL−１レセプターの親和性架橋を、少々の改変を伴って、記載されるようにして(Riske など.，J．Biol．Chem．266：11245，1 991)行なった。手短に言及すれば、細胞（1.5×10⁷個の細胞／ml）を、結合緩衝液中、50nMのラベルされていないIL−１の存在又は不在下で、放射性ラベルされたIL−１（60〜300 ｆモル／ml）と共に４℃で４時間インキュベートした。次に、細胞を氷冷却されたPBS，pH8.3(25mMのリン酸ナトリウム、pH8.3，0.15MのNaC l，１mMのMgCl₂)により洗浄し、PBS（pH8.3）中に５×10⁶個の細胞／mlの濃度で再懸濁した。ジメチルスルホキシド中、ジスクシンイミジルスベレート(DSS)又はビス（スルホスクシンイミジル）スベレート(BS3)（Pierce Chemical Co.）を添加し、0.4mMの最終濃度にした。インキュベーションを、一定の撹拌下で４℃ で30〜60分間、続けた。細胞を氷冷却された25mMのトリス−HCl，pH7.5，0.15ＭのNaCl，５mMのEDTA溶液により洗浄し、そして溶解緩衝液(８mMのCHAPS 又は１％ Triton Ｘ−100のいづれか、0.25ＭのNaCl，５mMのEDTA，40μｇ／mlのフェニルメチルスルホニルフルオリド、及び0.05％のNaN₃を含む50mMのリン酸ナトリウム溶液、pH7.5)において４℃で１時間、0.5〜１×10⁸個の細胞／mlで溶解した。界面活性剤抽出物を、120,000×ｇで１時間４℃で遠心分離し、核及び他の残骸を除去した。抽出物を、８％プレ−キャストゲル(NOVEX)上での SDS−PAGE、続くオートラジオグラフィーにより直接的に分析した。他方では、抽出物を、Ga mma−Bind G Plus（Pharmacia）に結合される抗体により免疫沈殿せしめた。沈殿されたタンパク質を、Laemmli サンプル緩衝液(Laemmli，Nature 227：680，1 970)による処理により開放し、SDS−PAGEにより分離し、そしてオートラジオグラフィーにより分析した。免疫原として使用されたIL−１α／IL−１Ｒの溶解された、架橋複合体の調製を、少々の改変を伴って、上記のようにして行なった。手短に言及すれば、70Ｚ／３細胞(0.5〜1.0×10⁸個の細胞／ml)を、結合アッセイ緩衝液において４℃で４時間、IL−１α(0.5〜1.0nM)と共にインキュベートした。次に、細胞を氷冷却されたPBS, pH8.3により洗浄し、PBS（pH8.3）中に５×10⁷個の細胞／mlの濃度で再懸濁し、そしてジメチルスルホキシド中、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート(BS3)(Pierce Chemical Co.)を添加し、0.4mMの最終濃度にした。インキュベーションを、一定の撹拌下で４℃で30〜60分間、続けた。親和性架橋工程及び細胞の界面活性剤可能化の急冷は、上記の通りであった。免疫原として使用された、溶解されたIL−１α／IL−１Ｒ複合体の精製のためには、70Ｚ／３細胞の界面活性剤抽出物を、架橋されたビーズアガロース(Afti −Gel 10，BioRad Laboratories)上に固定されたヤギ抗−ヒトIL−１αの親和性カラム（10ml）に適用した。そのヤギ抗−ヒトIL−１α親和性カラムは、製造業者の説明書に従って、充填されたゲル１ml当たりIgG １mgの密度で調製された。界面活性剤抽出物の適用の後、カラムを、Chaps 又は Triton Ｘ−100 を有さない可溶化緩衝液10カラム体積により洗浄し、又は 280nMでの吸光度が基線で存在するようになるまで洗浄した。次にカラムを、３Ｍのカリウムチオシアネート、 25mMのリン酸ナトリウム、pH7.5，５mMのEDTA，40μｇ／mlのフェニルメチルスルホニルフルオリド、及び0.05％のNaN₃溶液により溶出した。親和性カラムから溶出されたタンパク質を、10〜100倍に濃縮し、そして免疫化のために使用した。ネズミ細胞からの溶解されたタンパク質のイムノブロット分析ネズミ70Ｚ／３及びEL−４細胞を、氷冷却されたPBS により３度洗浄し、そして８mMのCHAPS 又は１％の Triton Ｘ−100 のいづれか、及び１mg/mlのBSA を含む可溶化緩衝液において 0.5〜１×10⁸個の細胞／mlで４℃で１時間、溶解した。抽出物を 120,000×ｇで45分間、４℃で遠心分離し、核及び他の残骸を除去した。抽出物を、4C5（例２に記載されるようにして得られた抗−IL−１Ｒ AcP ），12A6（Chizzoniteなど.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：8029，1989 に記載されるようにして得られた抗−タイプＩ IL−１Ｒ）、又は架橋されたアガロース（Gamma Bind G Plus，Pharmacia）上に固定されたプロテイン−Ｇに結合された対照抗体のいづれかと共にインキュベートした。沈殿されたタンパク質を、0.1Ｍのグリシン(pH2.3)による処理により開放し、３Ｍのトリスにより中和し、１／５体積の５× Laemmliサンプル緩衝液と共に混合し、そして８％プレ−キャストアクリルアミドゲル(NOVEX)上でのSDS／PAGEにより分離した。その分離されたタンパク質を、10mMのトリス−HCl，pH8.3，76.8mMのグリシン、20％のメタノール及び0.01％のSDSにおいて、100ボルトで16時間、ニトロセルロース膜(0.2 μＭ)に移行した。そのニトロセルロース膜を、BLOTTO（PBS＋0.05％ Tween 20 中、50％（ｗ／ｖ）の脱脂ドライミルク）によりブロックし、そして二重ブロットを、ラベルされていない4C5 IgG(67nM)を伴って、及びそれを伴わないで、〔¹ ²⁵ Ｉ〕−4C5 IgG(８mMのCHAPS，PBS，0.25ＭのNaCl，10％のBSA 及び５mMのEDTA 中、１×10⁶cpm／ml)によりプローブした。 COS 細胞におけるネズミ組換えタイプＩ及びタイプII IL−１レセプター及び IL−１Ｒ AcPの発現、及び〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされた4C5，35F5 及びIL-１結合の決定 COS 細胞（４〜５×10⁷）を、製造業者の説明書に従って、Bio Rad Gene Pulser（250μＦ，250 ボルト）により組換えネズミIL−１Ｒタンパク質又はIL−１Ｒ AcPを発現するプラスミドDNA 25μｇによるエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。細胞を、600cm²の培養プレートにプレートし、No−Zyme(JRH Biologics)による処理及び削り落すことにより72時間後に収穫し、洗浄し、そして結合緩衝液に再懸濁した。トランスフェクトされた細胞（４〜８×10⁴）を、上昇する濃度の〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされた4C5，35F5 又はIL−１タンパク質と共に４℃で３時間インキュベートした。細胞結合放射能を、上記のようにして、遊離〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされた抗体から分離した。 IL−１に応答しての70Ｚ／３細胞によるカッパＬ鎖発現：モノクローナル抗体 35F5，4E2 及び4C5 による阻害 70Ｚ／３細胞（10％ FBS，β−メルカプトエタノール及びゲンタマイシンにより補充されたRPMI 1640において１×10⁵／ml）を、 100Ｕ／ml（0.19nM）のヒト組換えIL−１α又はIL−１βと共に及びそれを伴わないで、24時間又は48時間インキュベートした。細胞を、IL−１の添加の前、１時間、0.5mlの合計体積で30 μｇ／mlの前記抗体と共にプレインキュベートした。IL−１又は培地のみを含む追加の培地 0.5mlをウェルに添加し、15μｇ／ml(100nＭ)の最終濃度の抗体にした。細胞を、培養の後、１度洗浄し、そしてFITCにより接合された対照のラット抗体、又はFITCにより接合されたラット抗−マウスカッパＬ鎖抗体のいづれかにより染色した（Tago，Burlingame，CA）。次に、細胞を、FACScan 流動細胞計測計(Becton−Dickinson)上でカッパＬ鎖発現について分析した。 IL−１に応答してのネズミ脾臓Ｂ細胞の増殖：モノクローナル抗体35F5，4C5 及び4E2 による阻害脾臓Ｂ細胞を、C57BL／６マウスから単離された脾臓細胞を抗− Thy 1.2 抗体及びウサギ補体による処理、続いて、Sephadex G10(Pharmacia)カラムを通しての２回の連続的な通過により精製した。Ｂ細胞（５×10⁵個の細胞）を、10％ FBS，β−メルカプトエタノール及びゲンタマイシンにより補充された 200μｌのRPMI 1640 培地の最終体積中、ヤギ抗−マウスIgM(１μｇ／ml)（Z YMED）及びジブチリルcAMP（10^-3Ｍ）により処理した。脾臓Ｂ細胞を、IL−１（ 100Ｕ／ml）により及びそれを伴わないで処理し、そして抗体35F5,4C5 及び4E2 により及びそれを伴わないで処理した。細胞を種々の試薬の存在下で２日間インキュベートし、そして次に、0.5μCiのトリチウム化されたチミジンによりパルスし、さらに６時間インキュベートし、そして収穫した。 IL−１に応答してのネズミＤ10．Ｇ4.1 細胞の増殖：モノクローナル抗体4C5 及び35F5、並びにヒトIL−１raによる阻害Ｄ10．Ｇ4.1ヘルパーＴ細胞を、記載のようにして維持し(Kayeなど.，J．Exp ．Med．158：836，1983；Mclntyreなど.，J．Exp．Med．173：931，1991)、そして前で記載されたようにしてIL−１により刺激した(McIntyreなど.，J．Exp．Me d．173：931，1991)。細胞(200μｌにおいて１×10⁵個)を、５％ FBS，β−メルカプトエタノール（５×10^-5Ｍ）、ゲンタマイシン（８μｇ／ml）、２mMのＬ− グルタミン、2.5μｇ／mlのコンカナバリンＡ及び示された濃度の抗体又はヒトI L−１レセプターアンタゴニスト（IL−１ra）を含むRPMI 1640 において 0.2pM のIL−１と共にインキュベートした。その培養物を２日間インキュベートし、0. 5μCiのトリチウム化されたチミジンによりパルスし、そして16時間後に収穫した。 IL−１による血清IL−６のインビボ誘発：モノクローナル抗体35F5及び4C5 による阻害 IL−１による血清IL−６の誘発を、前記のようにして実施した( McIntyreなど.，J．Exp．Med．173：931，1991)。手短に言及すれば、C57BL／６マウスを、IL-１α又はIL−１β（0.3μｇ／マウス、ｓ．ｃ．）の投与の４時間及び10分前、抗体 250μｇにより予備処理した（ｉ．ｐ．）。血清をIL−１の投与の２時間後、マウスから集め、そして記載されるようにしてＢ９ハイブリドーマ細胞バイオアッセイの変法によりIL−６濃度について分析した(Aardenなど.， Eur．J．Immunol．17：1411，1987)。ラット抗−マウスIL−１アクセサリータンパク質モノクローナル抗体4C5 を、次のように調製し、特徴づけ、そして生成した：例２ IL−１Ｒ AcP及びタイプII IL−１Ｒに対するモノクローナル抗体の調製、特徴化及び同定タイプII IL−１レセプターに対する抗体の調製の間、IL−１レセプター複合体の予測できない新規成分に対する抗体を検出した。ネズミ70Ｚ／３細胞はタイプII IL−１Ｒをほとんど独占的に発現するので、それらの細胞から溶解された、精製され架橋されたIL−１α／IL−１Ｒ複合体によるラットの免疫化は、モノクローナル抗体−タイプII IL−１Ｒ抗体を開発するために遂行された初期手段であった。この溶解されたIL−１α／IL−１Ｒ複合体により免疫化されたラットは、70Ｚ／３への〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１βの結合を阻止した血清抗体を生成せしめ、これは、タイプII IL−１Ｒに対して特異的なブロッキング抗体の存在を示唆する。血清サンプルはまた、70Ｚ／３細胞から溶解された〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１β ／IL−１Ｒ複合体を免疫沈殿した抗体も含んでおり、これは非ブロッキング抗− タイプII IL−１Ｒ抗体の存在を示唆する。〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１βを、タイプII レセプターの代わりにIL−１αに対して特異的な抗体の同定を排除するためにIL −１Ｒ結合及び免疫沈殿アッセイのために使用した。免疫化されたラットから単離された脾臓細胞の融合に起因するハイブリドーマを、70Ｚ／３（タイプIIレセプターを産生する）及びEL−４（タイプＩレセプターを産生する）細胞の両者へのIL−１β結合を阻止する抗体についてスクリーンした。70Ｚ／３細胞に対してのみ結合を阻止する抗体を同定し、そしてそれらがタイプII IL−１Ｒに対する抗体であるので、さらなる分析からは排除し、そしてEL−４細胞に対してのみ結合を阻止する抗体を同定し、そしてそれらがタイプＩ IL−１Ｒに対する抗体であるので、さらなる分析からは排除した。両細胞タイプに対するIL−１結合を阻止する抗体は、IL−１Ｒ AcPに対して特異的である。初期融合から、70Ｚ／３細胞に対するIL−１β結合を阻止する７個の抗体を同定した（表１）。それらの抗体のうち６個の抗体(2B5，4C5，3F1，4C4，24C5、及び4D4)は、両70Ｚ／３及びEL-４細胞へのIL−１βの結合を阻止した。それらの抗体は、ネズミ組換えタイプＩ IL−１Ｒを発現するCHO 細胞へのIL−１βの結合を阻止せず、そして従って、IL−１Ｒ AcPに対して特異的であった。１つの抗体、すなわち4E2 は、70Ｚ／３細胞へのIL-１βの結合のみを阻止し、これはそれがタイプII IL−１Ｒに対して特異的であることを示唆する。初期融合はまた、IL−１Ｒ AcP又はタイプII IL−１Ｒのいづれかに対して特異的である非阻止性抗体についてもスクリーンされた。８種の抗体(1D2，2D6，2 E6，1F6，2D4，2F6，3F5及び4A1)は、70Ｚ／３細胞から溶解されたIL−１β／IL −１Ｒ複合体を免疫沈殿せしめた（表２）。それらの抗体はまた、２種の他のタイプII IL−１Ｒ産生のネズミ細胞系、AMJ2C11 及びP388D1から溶解されたIL− １β／IL−１Ｒ複合体を免疫沈殿せしめた。それらの抗体のうち７種の抗体は、EL−４細胞から溶解されたIL−１β／IL−１Ｒ複合体を免疫沈殿し、これはそれらがIL−１Ｒ AcPを認識することを示す。１つの抗体1F6 は、EL −４細胞から溶解されたIL−１β／IL−１Ｒ複合体に結合せず、これはそれが非阻止性のタイプII IL−１Ｒ抗体であることを示唆する。それらの抗体がタイプＩ IL−１Ｒに結合しないことを確かめるために、それらは、可溶性ネズミタイプＩ IL−１Ｒによる免疫沈殿アッセイにおいて試験された（表２）。それらの抗体のいづれも、可溶性組換えタイプＩ IL−１Ｒ（〔¹²⁵Ｉ〕−sMsR〔bv〕）に架橋された〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１βの複合体を免疫沈殿せしめなかった。それらはまた、バキュロウィルス／昆虫細胞発現システム又はCOS 細胞発現システムのいづれかにおいて生成された〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされた可溶性タイプＩレセプターを免疫沈殿しなかった。ラットは溶解されたIL−１β／IL−１Ｒ複合体により免疫化されたので、IL− １αを認識する、ラット血清における抗体がまた検出された。個々のモノクローナル抗体を、それらがIL−１に結合しなかったことを確かめるために〔¹²⁵Ｉ〕 −ラベルされたネズミ及びヒトIL−１タンパク質による免疫沈殿アッセイにおいて試験した。すべての15種の抗体（表１及び２）は、それらのアッセイにおいて陰性であった。例３抗−タイプＩ（35F5）、タイプII(4E2)及びアクセサリータンパク質(4C5)モノクローナル抗体との反応性によるネズミIL−１Ｒ及びIL−１Ｒ AcPの特徴化上記抗体の初期同定及び特徴化に続いて、4C5、すなわち推定上の阻止性IL− １Ｒ AcP（IL−１Ｒ AcP）抗体、及び4E2、すなわち阻止性タイプII IL−１Ｒ抗体を、IL−１Ｒ AcPのさらなる研究のためのプローブとして選択した。前で同定され、そして特徴づけられた抗−タイプＩ IL−１Ｒ抗体35F5もまたこの研究に包含された(Chizzoniteなど.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：8029，1989 ；McIntyreなど.，J．Exp．Med．173：931，1991)。それらの３種の抗体を用いて、種々のネズミ細胞上でのタイプＩ及びタイプII IL−１Ｒ及びIL−１Ｒ AcPの存在を同定した。〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされたmAb 4 C5 による平衡結合アッセイは、主にタイプＩ（EL−４細胞）又はタイプII（70 Ｚ／３細胞）レセプターを担持するネズミ細胞上でのIL−１Ｒ AcPの存在を示す（図１及び２）。タイプＩ（3T3L1細胞）又はタイプII（P388D1細胞）レセプターを主に担持する他の細胞はまた、IL−１Ｒ AcPをまた発現した（表３）。タイプＩ又はタイプII IL−１Ｒ AcPのいづれも発現しない細胞（Ｓ49.1）は、IL− １Ｒ AcPを発現せず、これはIL−１Ｒ及びIL−１Ｒ AcPの発現間の連鎖を示す。その初期特徴化の間、mAb 4C5 は、EL−４及び70Ｚ／３細胞の両者への〔¹²⁵Ｉ〕−ヒトIL−１βの結合を阻止した。さらなる研究は、mAb 4C5 がまた、放射性ラベルされたヒトIL−１α（図３）、ネズミIL−１α及びIL−１βの70Ｚ／３細胞への結合を阻害したことを確立した（表４）。しかしながら、4C5 は、EL−４細胞への放射性ラベルされたヒトIL−１α（図４）又はネズミIL−１α（表４）のいづれの結合も阻止しなかった。さらに、4C5 は、ネズミ組換えタイプＩ又はタイプIIレセプターを発現するCHO 又はCOS 細胞への〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされたIL−１タンパク質の結合を阻止しなかった。抗−タイプＩレセプター抗体、すなわち35F5及び抗−タイプIIレセプター抗体、すなわち4E2 は、レセプターが天然形又は組換え形のいづれであろうとも、それらのそれぞれのIL−１レセプターへのIL−１α及びIL−１βの両者の結合を阻害した（表４）。EL−４及び70Ｚ／３細胞へのIL−１結合の 4C5− 介在阻害についてのIC₅₀は、組換えタイプＩ又はタイプIIレセプターを発現する細胞への結合の阻害についてのIC₅₀よりも少なくとも1000倍低かった（表５）。それらのIC₅₀データは、次の２種の結論を示唆した：Ｄ mAb 4C5がタイプＩ又はタイプII IL−１Ｒといづれか有意な程度も交差反応せず、そして２）天然のIL −１ＲへのIL−１β（但し、IL−１αではない）の結合を阻止する4C5 の能力の差異は、抗体の親和性に関係しなかった。例４モノクローナル抗体4C5 により認識されるIL−１Ｒ AcPの大きさの決定 EL−４細胞上のmAb 4C5 により認識される細胞表面タンパク質のおおよその分子サイズを、アフィニティークロマトグラフィー及びイムノブロットにより決定し、約90kDa であることがわかった（図５）。EL−４細胞から調製された界面活性剤抽出物を、ヒラマメのレクチンアフィニティーマトリックス上で、続いて抗 −タイプＩレセプター抗体(7E6)、ネズミIL−１α（Ma）又は4C5 アフィニティーゲルのいづれか上でのアフィニティークロマトグラフィー上で精製した。個々のアフィニティーカラムから溶離されたタンパク質を、Laemmli サンプル緩衝液により処理し、８％ゲル上での SDS−PAGEにより分離し、そしてニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース上に固定されたタンパク質を、〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 によりプローブし、そして免疫反応性バンドをオートラジオグラフィーにより同定した。〜90kDa の主要タンパク質及び55kDa のマイナーなタンパク質は、放射性ラベルされた4C5 と免疫反応性であった。それらの２種のタンパク質はまた、EL−４抽出物が4C5 アフィニティーマトリックス上で直接的に精製される場合、イムノブロット上でも同定された。それらのデータは、天然のグリコシル化されたIL−１Ｒ AcPの見掛け分子量が〜90kDa であり、そしてタンパク質分解工程がそのサイズを〜55kDa に減じることができることを示した。例５モノクローナル抗体4C5 によるIL−１β生物学的活性の中和用量依存性態様でIL−１βの生物学的活性を中和するmAb 4C5 の能力を、３種の生物学的アッセイで示した：１）ネズミ脾臓Ｂ細胞のIL−１誘発された増殖、２）Ｄ10．Ｇ4.1 ヘルパーＴ細胞のIL− １誘発された増殖、及び３）70Ｚ／３細胞におけるIL−１誘発されたカッパＬ鎖の発現。mAb 4C5は、脾臓Ｂ細胞のIL−１β誘発された増殖の用量依存性を示したが、しかしIL−１αに関しては、そうではなかった（図６）。mAb 4C5 に比較して、抗−タイプＩレセプター抗体35F5は、Ｂ細胞のIL−１α及びIL−１β誘発された増殖を阻止した。抗−タイプII IL−１Ｒ抗体4E2 は、IL−１α又はIL− １βのいづれかにより誘発された増殖を阻害しなかった。類似する態様で、mAb 4C5 はＤ10．Ｇ4.1 Ｔ細胞のIL−１α誘発された増殖を阻害したが、しかしIL− １βに関してはそうではなかった（図７）。mAb 35F5及びヒトIL−１raの両者は、Ｄ10．Ｇ4.1 細胞のIL−１α及びIL−１β誘発された増殖を阻止した。mAb 4C 5 はまた、70Ｚ／３細胞上でのカッパＬ鎖のIL−１β誘発された発現を阻止したが、しかしIL−１αに関してはそうではなかった（図８）。抗体35F5は、このアッセイにおいてIL−１α及びIL−１β誘発された効果を阻止したが、ところがタイプII IL−１Ｒを認識するmAb 4E2 は不活性であった。それらのアッセイのために、前記抗体又はIL−１raによるIL−１活性の中和を、生物学的応答における用量依存性の低下として検出する。応答の阻止は、100％阻害性（すなわち添加されるIL−１に等しくない）であり又は抗体の能力に依存してより低いレベルになる。例６モノクローナル抗体によるインビボIL−１β生物学的活性の阻害マウスに投与されたIL−１は、それらの血清においてIL−６の濃度の急速且つ劇的な上昇を示す。血清IL−６の上昇の大きさは、IL−１用量に依存し、そしてタイプＩ IL−１ＲへのIL−１の結合を妨げる因子により阻止され得る。このIL −１生物学的モデルにおいて試験される場合、4C5 は、血清IL−６の比−１β誘発された上昇を約90％阻止したが、しかしIL−１αに関してはそうではなかった（図９）。抗 −タイプＩ IL−１Ｒ抗体35F5は、血清IL−６のIL−１α及びIL−１β誘発された上昇を阻止した。対照のmAb Ｘ−732は阻害効果を有さなかった。例７ Mab 4C5 を用いてのマウス（ネズミ）IL−１Ｒ AcPの発現クローニングRNA の抽出 3T3−LI細胞を収穫し、そして全RNA を記載のようにしてグアニジウムイソチオシアネート／フェノールを用いて抽出した（P．Chomczynski and N．Sacchi， Anal．Biochem．162：156，1987）。ポリＡ⁺RNA を、記載のようにして、オリゴ dTラテックスビーズへの１つのバッチ吸着により全RNA から単離した（K．Kurib ayashiなど.，NaCl．Acid．Res．Symposium Series 19：61，1988）。この精製からのポリＡ⁺RNA の収率は約６％であった。RNA 調製物の結合性を、2.2Ｍのホルムアルデヒドの存在下で変性条件下で 1.0％アガロースゲルにおいての分別により分析した（Molecular Cloning A Laboratory Manual、第２版、J．Sambrook ，E．F．Fritsch，T．Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 ）。3T3 −L1 cDNA ライブラリーの構成上記ポリＡ⁺RNA から、cDNAライブラリーを、哺乳類発現ベクター pEF−BOS において確立した（Mizushima and Nagata，NaCl．Acids Res．18：5322，1990 ）。10μｇのポリＡ⁺RNA を、RNアーゼＨ^-逆転写酵素を用いて逆転写した（GIBC O BRL Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）。得られるmRNA−cDNAハイブリッドを、確立された方法により、ブラント末端化された二本鎖cDNAに転換した（Gubler and Chua，Essential Molecular Biology，VolumeII ，T．A．Brown，editor，pp．39-56，IRL Press 1991）。 BstＸＩリンカー（A ruffo and Seed，Proc．Natl．Acad．Sci（USA）84：8573，1987）を、その得られるcDNAに連結し、そして1000個の塩基対（bp）以上の分子を、Sephacryl SF50 0 ラム上への通過により選択した。Sephacryl SF500 カラム(0.8×29cm)を、10m Mのトリス−HCl，pH7.8／１mMのEDTA／100mM の酢酸ナトリウムにより充填した。BstＸＩリンカー処理されたcDNAをカラムに適用し、そして画分 0.5mlを集めた。個々の画分の小アリコートを、1.0％アガロースゲルに分別した。ゲルを真空下で乾燥せしめ、そして放射性cDNAのサイズ分布を、ゲルをＸ−線への照射により可視化した。1000bp以上のcDNA分子を含む画分を選択し、そしてプールした。cDNAを、エタノール沈殿により濃縮し、そしてクローニングベクターに連結した。そのクローニングベクターは、BstＸＩ制限酵素により消化され、そして２つの連続的なアガロースゲル上で精製されたプラスミド pEF−BOS であった。37 5ngのプラスミドDNA を、連結緩衝液(50mMのトリス−HCl，pH7.8／10mMのMgCl₂ ／10mMのDTT／１mMのrATP／25mg／mlのウシ血清アルブミン)150μｌにおいて15 ℃で一晩、上記からのサイズ選択されたcDNA 18.75ngに連結した。次の日、その連結反応体を、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：１）により抽出した。核酸を、オイスターグリコーゲン５μｇの存在下でエタノール沈殿せしめた。沈殿物を水に溶解し、そして再びエタノール沈殿し、続いて70 ％エタノールにより洗浄した。最終ペレットを水14μｌに溶解し、そして１μｌのアリコートをＥ．コリ株DH−10Ｂ(GIBCO−BRL)中にエレクトロポレートした。この方法により、約４×10⁶個の組換え体のライブラリーが生成された。モノクローナル抗体4C5 によるパンニングによってのネズミIL１− レセプターアクセサリータンパク質（muIL−１Ｒ AcP）cDNAについてのスクリーニング前記パンニング法はこれまでに記載されている(Aruffo and Seed，Proc．Natl ．Acad．Sci．（USA）84：8573,1987)。約５×10⁴個のクローンをそれぞれ表わす 3T3−LIライブラリーからの10アリコートを、10μｇ／mlのアンピシリン（am p）を含むLB寒天プレート上にプレートし、そして37℃で一晩、増殖した。次の日、個々のプールからのコロニーをプレートから、LB＋amp の別の50mlアリコート中に削り取り、そして37℃でさらに２〜３時間、増殖した。プラスミドDNA を続いて、QIAGENプラスミドキット(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)を用いて抽出した。次に、10の別々のDNA プールを用いて、DEAEデキストラン技法（５μｇの DNA／２×10⁶個の細胞／９cmの直径の皿）によりCOS−７細胞をトランスフェクトした（Molecular Cloning，A Laboratory Manuaｌ、第２版、J．Sambrook，E ．F．Fritsch，T．Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）。トランスフェクションの72時間後、COS 細胞を、リン酸緩衝溶液(PBS)中、0.5mM のEDTA／0.02％のアジ化ナトリウムを用いてプレートから分離した。単一細胞の懸濁液を個々のプールから製造した。抗−muIL−１Ｒ AcP mAb 4C5を、氷上で１時間、細胞に結合した〔（３mlのPBS 中、10μｇ／mlの 4C5 mAb／0.5mM のED TA／0.02％のアジ化ナトリウム／5.0％のウシ胎児血清(FCS)〕。細胞−mAb 懸濁液３mlを、上記緩衝液中、２％ Ficoll ６mlを通して遠心分離し（約 300×ｇ，５分）、結合されていないmAb を除去した。細胞を、上記緩衝液に再懸濁した。個々のプールからの細胞を続いて、ポリクローナルサギ抗−ラットIgG(50mMのトリス−HCl（pH9.5）中、20μｇ／ml、室温、1.5 時間）により被覆された単一細菌のプレート（直径９cm）に添加し、そして PBS／１％ BSAにより一晩、室温で阻止した。COS 細胞を、前記細菌プレート上に、室温で２〜３時間、軽くロッキングしながら放置した。非付着細胞を、PBSによる洗浄により除去した。残る細胞を、0.8ml のHirt溶解溶液(0.6％ SDS／10mMのEDTA)0.8mlの添加により溶解した。その溶解物を1.5ml のEppendorf 管に移し、そして１ＭのNa Clを添加し、氷上で一晩インキュベートし、そして15,000×ｇで15分間、４℃で回転せしめた。上清液を１度、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：１）により抽出し、10μｇのオイスターグリコーゲンを添加し、そしてDNA を、7.5ＭのNH₄OAc 0.5体積及びエタノール 2.5体積の添加により２度、沈殿せしめた。ペレットを70％エタノールにより洗浄し、乾燥せしめ、そして H₂O １μｌに再懸濁した。次に、DNA の個々のパンニングされたプールを、Ｅ．コリ株DH−10Ｂ中にエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの後、個々のプールの５×10⁴個のコロニーを上記のようにして増殖し、そしてプラスミドDNA を上記のようにして単離した。このDNA は、ライブラリーの１回のパンニング富化を示す。合計３回のパンニングを、それぞれ10のライブラリープールを維持しながら完結した。第３回目のパンニングの後、それぞれ10のプールを用いて、DEAEデキストラン法によりCOS 細胞をトランスフェクトした（１μｇの DNA／２×10⁵個の細胞／６−ウェルのCostar皿のウェル）。トランスフェクションの72時間後、COS 細胞を、第２抗体被覆されたポリスチレンビーズ（Dynal Inc.，Great Neck，NY）によるロセット形成により、muIL−１Ｒ AcPを発現したプールについてスクリーンした。4C5 mAb を、PBS／２％ FCSにおいて、トランスフェクトされたCOS 細胞に室温で 1.5時間、軽くロッキングしながら結合せしめた（２μｇのAb／ウェル）。抗体を除去し、そして細胞を PBS／２％ FCSにより洗浄した。１mlのPBS／２％ FCS／１μｌの羊抗−ラットIgG 被覆されたポリスチレンビース(約４×10⁵のDynabeads Ｍ−450)を添加し、そして室温で 1.5時間、軽くロッキングしながらインキュベートした。ビーズを除去し、そして細胞をPBS により５〜10回洗浄した。次に、細胞を、95％エタノール／ 15％酢酸においてのインキュベーションにより固定し、そしてロゼット形成について顕微鏡を用いて試験した。10のプールのうち１つ（パンニングプール＃２）が、muIL−１Ｒ AcPの表面発現のために陽性であることが見出された。陽性クローンを同定するために、100μｌのLB＋amp を、２つの96−ウェルマイクロタイタープレートのウェルに配置した。次に、個々のウェルを、パンニングプール＃２からの４つの個々のコロニーにより接種した。細菌細胞を、37℃で５〜６時間、増殖せしめた。次に、プールを、個々のプレートの８の横列及び12 の縦列に、個々のウェルからの10μｌのアリコートを組合し、個々の横列及び縦列を別々に維持することによって製造した。それらのプールをそれぞれ用いて、 LB＋amp における別の５ml培養物を接種し、そして37℃で一晩、増殖せめした。次の日、プラスミドDNA を、QIAGENプラスミドキットを用いて単離した。個々の DNA 調製物は、パンニングプール＃２からの48（横列）又は32（縦列）の個々の単離物を表わした。個々のマイクロタイタープールを用いて、上記のようにして６−ウェルプレートにおけるCOS 細胞をトランスフェクトし、そしてトランスフェクションの72時間後、細胞を上記のようにしてDynabeadロセット形成についてスクリーンした。２つの陽性プールがマイクロタイタープレートの１つから見出され、すなわち横列Ｅから１つ及び縦列２から１つであった。10mlのアリコートを、縦列及び横列の交差部分（ウェルE2）でのウェルから取り、そしてLB寒天＋ amp 上にプレートした。一晩のインキュベーションの後、40の個々のコロニーを用いて、５mlのLB＋amp 培養物をそれぞれ接種した。プラスミドDNA を、QIAGEN プラスミドキットを用いてそれらの培養物から単離した。個々のプラスミド単離物を XbaＩ制限酵素により消化し、cDNA挿入体を開放し、そして 1.0％アガロースゲル上で分別した。この分析は、わずか３種のサイズのcDNA挿入体が陽性のマイクロタイタープールに表わされたことを示した。３種のプラスミドの個々の単一の代表物を用いて、上記のようにして６−ウェルプレートにおけるCOS 細胞をトランスフェクトし、そしてDynabeadsを用いてロゼット形成によりスクリーンした。この場合、4C5−反応性muIL−１Ｒ AcPをコードする単一のcDNAクローン（E2−Ｋ）が同定された。muIL −１Ｒ AcP cDNA の特徴化 cDNAクローンE2−Ｋ(pEF−BOS ／muIL−１Ｒ AcP)をまず、制限酵素地図により特徴づけた。XbaＩによるこのクローンの消化は、 3.2kbのcDNA挿入体を開放した。この 3.2kbの XbaＩフラグメントをゲル精製し、そして両鎖のDNA 配列を、ターミネーターとしての熱安定性DNA ポリメラーゼ及び色素−ラベルされたデオキシヌクレオチドと共にABI 自動DNA 配列決定機を用いることにより決定した。このDNA 配列は、クローンの５’−プライム半分における読み取り枠(ORF)を示した（下記参照のこと）。Intelligenetics コンピューターソフトウェアを用いての制限酵素地図は、ORF 内での 1.4kbの PstＩ制限フラグメントを示した。この 1.4kbのフラグメントをゲル単離し、そして追加のmuIL−１Ｒ AcP cDNA クローンを同定するためにプローブとして使用した。前で記載された3T3−LI cDNA ライブラリーからの約６×10⁵個の追加のクローンを上記のようにしてプレートした。コロニーリフト(colony lift)を行ない（Mo lecular Cloning，A Laboratory Manual、第２版、J．Sambrook，E．F．Fritsch ，T．Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）、そしてそのリフトを、Multiprime DNAラベリングシステム(Amersham Co.，Arlington Heights ，IL)を用いてのランダム−プライミングにより〔³²Ｐ〕−dCTPによりラベルされた 1.4kbの PstＩ制限フラグメントによりプローブした。この場合、２種の追加の相同cDNAクローンを単離した。１つは 1.0kbの挿入体を含み、そして他の１つは XbaＩ消化により決定されるような 4.3kbの挿入体を含んだ。その 4.3kbの挿入体のDNA 配列を、muIL−１Ｒ AcP ORFの配列を確かめるために上記のようにして決定した。muIL −１Ｒ AcP cDNA クローンの配列分析 muIL−１Ｒ AcP cDNA 挿入体におけるリーディングフレームのヌクレオチド配列は、図10Ａに示されている〔配列番号４〕。この読み取り枠(ORF)は、570個のアミノ酸のタンパク質をコードする1710bpから成る。図10Ｂ〔配列番号６〕に示されるアミノ酸配列は、 Ala−１の後の切断による20個のアミノ酸の NH₂−末端シグナルペプチド、Ser1−Glu 339 からの細胞外ドメイン、Leu 340−Leu 363 からの疎水性トランスメンブランドメイン及び Glu 364−COOH末端の細胞質末端を予測する。７つの可能性あるＮ末端グリコシル化部位はすべて、細胞外ドメイン内に含まれる。 Intelligenetics コンピュータープログラムを用いてのタンパク質配列に関するデータベース研究は、muIL−１Ｒ AcPがマウス、ヒト、鶏及びラットからのIL −１タイプＩ及びIL−１タイプIIレセプターの両者に対しての有意な相同性を有することを示す。それらのタンパク質の個々に対する相同性は約25％であり、そしてそのタンパク質配列じゅうに均等に分布される。muIL−１Ｒ AcPのアミノ酸配列のさらなる分析は、それが免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであることを示す。IL−１レセプターのすべての細胞外ドメインに保存され、そして３種の IgG−株ドメインの形成を相当する３対のシステイン残基は、好ましくは、muIL−１Ｒ AcPに保存される。例８ COS 細胞に発現されるネズミ組換えIL−１Ｒ AcPへのMab 4C5 の結合 muIL−１Ｒ AcPのためのcDNAがmAb 4C5 と反応性のタンパク質をコードすることを確かめるために、組換えmuIL−１Ｒ AcPをトランスフェクトされたCOS 細胞上で発現し、そして〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 の直接的な結合について試験した。COS 細胞を標準方法を用いて、pEF−BOS／muIL−１Ｒ AcPによりエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの後、細胞を２〜３×10⁵個の細胞／ウェルで６− ウェル組織培養プレート上に接種した。48〜72時間後、増殖培地を除去し、そして１×10⁶cpmの〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 を含む結合緩衝液（RPMI／５％ FCS）１mlを、単独で（合計の結合）、又は寒冷インヒビターとしての２μｇのラベルされていない4C5 の存在下で（非特異的結合）、ウェル当たりに添加した。合計及び非特異的結合の両者は二重反復して実施された。40℃での３時間のインキュベーションの後、結合緩衝液を除去し、そして細胞をPBS により３度洗浄した。次に、細胞を 0.5％ SDS 0.75ml の添加により溶解した。その溶解物を収穫し、そして結合された計数を決定した。特異的結合は、合計の計数から非特異的計数を引き算することによって計算された。特異的計数は約 30,000cpm／ウェルであり、そして８％の非特異的バックグラウンドは、pEF−BOS／muIL−１Ｒ AcPがCOS 細胞における4C5 免疫反応性タンパク質の発現を指図することを示唆する。 COS 細胞に発現される組換えmuIL−１Ｒ AcPのサイズを、〔³⁶Ｓ〕−メチオニンによるトランスフェクトされたCOS 細胞の代謝性ラベリング、及びmAb 4C5 又は2E6 によるラベルされたmuIL−１Ｒ AcPの免疫沈殿により決定した（表２）。 pEF−BOS／muIL−１Ｒ AcPによるエレクトロポレーションの36時間後、培地を除去し、そしてCOS 細胞をメチオニン−フリーの培地〔DMEM（メチオニン−GIBCO −BRL を有さない、高いグリコース）／10％ FBS／１mMのＬ−グルタミン／１mM のピルビン酸ナトリウム〕により１度、洗浄した。新鮮なメチオニン−フリーの培地を添加し、そして37℃での５〜８時間のインキュベーションの後、50〜100 μCiの³⁵Ｓ−メチオニンを培地１ml当たりに添加し、そして24時間インキュベーションを続けた。次に、培地を除去し、そして細胞を冷PBS により２度、洗浄した。細胞を、RIPA緩衝液(0.5％のNP−40，0.5％の Tween−20，0.5％のデオキシコレート、420mM のNaCl，10mMのKCl，20mM のトリス、pH7.5，１mMのEDTA)の添加により溶解し、そして氷上で15分間インキュベートした。その溶解物を管に移し、そして15,000×ｇで15分間、回転せしめた。溶解物を、500μｌの溶解物への40μｌの GammaBind G Sepharose（RIPA緩衝液において50％（ｖ／ｖ））（Ph armacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ）の添加により前もって洗浄し、そして４℃で一晩インキュベートした。次の日、その前もって洗浄された溶解物を30秒間、マイクロフュージにおいて回転せしめ、そして溶解物を洗浄した管に移した。さらに40μｌのGammaBind G Sepharose を、20μｇのmAb 4C5 又は2E6（表２）と共に添加し、そしてその免疫沈殿物を回転しながら、４℃で３時間インキュベートした。Sepharose−Ab複合体を回転沈殿せしめ、そしてRIPA緩衝液により１度、50mMのHEPES，pH7.9／200mM のNaCl／１mMのEDTA／0.5％のNP−40により１度、及び25mMのトリス、pH7.5／ 100mM のNaCl／0.5％のデオキシコレート／1.0％の Triton Ｘ−100／0.1％のSD S により１度それぞれ洗浄した。タンパク質を、20μｌの２× Laemmliサンプル緩衝液(Laemmli，Nature 227：680，1970)の添加によりビーズから開放した。タンパク質をトリス−グリシン PAGE における電気泳動により分離し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。図11に示されるように、トランスフェクトされたCOS 細胞からのmAb 4C5 又は2E6 により免疫沈殿された組換えmuIL−１Ｒ AcPは、70〜90kDa の広いバンドとして移動する。タンパク質は擬似トランスフェクトされたCOS 細胞からは沈殿されなかった。例９ COS 細胞における組換えIL−１Ｒ AcPの発現：〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされたIL−１タンパク質及びモノクローナル抗体との反応性〔¹²⁵Ｉ〕−ラベルされたIL−１，4C5 及び4E2 のための組換えIL−１Ｒ AcP の結合特性を決定した（図12）。データは、〔¹²⁵Ｉ〕−4C5 結合により決定される場合、組換えIL−１Ｒ AcP〔Cos（4C5）〕の高レベル発現を示したが、しかし対照のトランスフェクトされたCOS 細胞〔Cos(PEF−BOS)〕と比較される場合、〔¹²⁵Ｉ〕−ヒトIL−１α結合の上昇を示さなかった。比較のために、〔¹²⁵Ｉ〕−35F5結合により決定されるような、COS 細胞〔COS(Mu−IL−1R）〕におけるネズミ組換えタイプＩレセプターの高レベル発現が、放射性ラベルされたIL−１ β及びIL−１β結合の対応する上昇により達成された（図13）。例10 EL−４細胞からの天然のネズミIL−１レセプターアクセサリータンパク質（IL− １Ｒ AcP）の精製ネズミEL−４細胞(100ｇ)を、８mMのCHAPS，５mMのEDTA及びプロテアーゼインヒビターペプスタチン（10μｇ／ml）、ロイペプチン（10μｇ／ ml）、ベンザミジン（１mM）、アプロチニン（１μｇ／ml）及びPMSF(0.2mM)を含むPBS １ｌに溶解した。不溶性物質を除去するために 100,000×ｇでの遠心分離の後、上清液を、50mlの小麦胚芽アグルチニン(WGA)アガロースカラム(Vector Laboratories，Inc.)上に0.8ml／分で負荷した。カラムを平衡緩衝液(PBS,８mM のCHAPS，５mMのEDTA)、続いて0.5ＭのNaClを含む平衡緩衝液により洗浄し、そして結合されたタンパク質を、８mMのCHAPS 及び 0.3ＭのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含むPBS により溶出した。３回のWGA アガロースカラム実験からの糖−溶出された画分をプールし、そして８mMのCHAPS を含むPBS により平衡化された５mlのイムノアフィニティーカラム〔ジメチルピメリミデートを通してプロテインＧセファロースに架橋されたmA b 4C5 抗体（Stern，A．S．and Podlaski，F．J.，Techniques in Protein Chem istry IV，R．H．Angeletti，ed.，pp 353-360，Academic Press，NY，1993）〕上に１ml／分で負荷した。カラムを平衡緩衝液、続いてＩＭのNaClを含む平衡緩衝液により洗浄した。結合されたタンパク質を、８mMのCHAPS を含む、50mMのジメチルアミン緩衝液（pH11.5）により溶出した。IL−１Ｒ AcPを含む画分を、４ mMのCHAPS を含むPBS に対して透析し、そして濃縮した。すべてのカラム画分を、mAb 4C5 による SDS−PAGE／イムノブロット分析によりIL−１Ｒ AcPの存在についてモニターした。SDS−PAGEを８〜16％グラジエントゲル(Novex)上で実施し、そしてタンパク質を記載のようにしてニトロセルロースに移した(Towbinなど.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76：4350，1979)。15 0mM のNaCl₂及び0.01％のチメロザール(pH7.5)を含む50mMのトリス中、2.5 ％カゼインによるニトロセルロースのブロッキングの後、ブロットを mAb 4C5（５μｇ／ml）と共にインキュベートし、続いて、HRP−接合されたヤギ(Fab)₂抗 −ラット抗体(Tago Immunologicals)と共にインキュベートした。ブロットを、E CL Sptem（Amersham Life Science）により展開せしめた。最終タンパク質調製物のアミノ酸組成（Hollfelderなど.，J．Protein Chem． 12：435，1993）が表６に示されており；それは、cDNAクローン〔配列番号１〕（図16）からの推定されるタンパク質配列〔配列番号３〕から予測される組成に類似する。サンプルの残りを SDS−PAGEにゆだね、PVDF膜（Matsudaira，J．Bio l．Chem．262：10035，1987）に移し、そしてクーマシーブル−Ｒ−250により染色した。4C5 抗体と免疫反応性である、80kDa でのタンパク質−染色バンドを、 NH₂−末端配列分析により分析した（Hollfelderなど.，J．Protein Chem．12：4 35，1993）。２種の配列を得（サイクル当たり個々のアミノ酸１〜３ｐモル）、この１つは、ネズミIL−１Ｒ AcPの発現クローニングから得られた推定されるタンパク質配列の残基１〜12（SERXDDWXLDTM）に適合した（図10Ｂ）。 EL−４細胞から溶解されたIL−１Ｒ AcPは、4C5 抗体によるイムノブロット分析により決定される場合、Mr＝80kDa を有するけれども、cDNA配列からのタンパク質の推定される分子量は66kDa である。この見掛けの差異は、たぶん、アクセサリータンパク質のグリコシル化による。この論点と取り組むために、親和性精製されたIL−１Ｒ AcPを SDS−PAGEにゆだね、そして80kDa の 4C5−免疫反応性タンパク質に対応するクーマシーブル染色されたバンドを、ゲルから溶出し、そしてトリフルオロメタンスルホン酸により化学的に脱グリコシル化した(Edgeなど.，Anal．Biochem．118：131，1981)。その脱グリコシル化されたタンパク質は SDS−PAGEにおいてMr＝ 63〜64kDa に移動し、この値は、cDNA配列からの推定される分子量と良好に一致する。例11 ヒトIL−１レセプターアクセサリータンパク質のゲノムクローンの単離交差−ハイブリダイゼーションによるスクリーニングネズミIL−１Ｒ AcPからの配列との交差−ハイブリダイゼーションによりヒト cDNAライブラリーをスクリーニングすることによってIL−１Ｒ AcPのヒト相同体をコードするcDNAを同定し、そして単離するための試みを行なった。RAJ1細胞又はNC37細胞から単離されたmRNAから調製されたヒトcDNAライブラリーを、ネズミ IL−１Ｒ AcP cDNA によりプローブしたが、初期の試みは、たぶん、それらの細胞におけるヒト相同体のひじょうに低い発現のために不成功であった（例１２を参照のこと）。本発明者は、続いてヒトcDNAライブラリーをスクリーンするために使用される特定の配列を単離するためにヒトゲノムライブラリーをスクリーンすることを決定した。ネズミIL−１Ｒ AcP cDNA クローン〔3.2kb の XbaＩフラグメント〕及びネズミIL−１Ｒ AcP cDNA クローンの制限フラグメント〔1.4kb の PstＩフラグメント及び 843bpのBamHＩ／ SalＩフラグメント〕を続いて、ヒトゲノムDNA の低緊縮サザンブロット分析を行なった(Clontech，Palo Alto，CA)。この分析は、ネズミプローブがヒトゲノムに存在する相同配列を検出することができる最適なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するために行なわれた。ネズミIL−１Ｒ AcP cDNA プローブとのハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ（２×SSC，20％ホルムアミド、２× Denhardt's，100μｇ／mlの酵母R NA，0.1％ SDS）において37℃で一晩、行なった。プローブを、Prime−It II Random Primer Labeling キット（Stratagene，La Jolla，CA)を用いて〔³²Ｐ〕 −dCTPによりラベルした。ブロットを37℃で開始して種々の温度点で２×SSC 及び0.01％ SDSにより洗浄した。最適条件は、〔³²Ｐ〕−843bp のBamHＩ／SalＩフラグメントの使用、ハイブリダイゼーション緩衝液Ａにおいて37℃での一晩のハイブリダイゼーション、55℃で２×SSC，0.01％ SDSにおける洗浄であることが決定された。それらの条件は、最低のバックグラウンドを生成し、そして市販のヒトゲノムライブラリーをスクリーンするために使用された。 IL−１Ｒ AcPのヒトゲノムクローンを同定するために、Lambda FIX ＃944201 （Stratagene，La Jolla，CA）におけるヒト肺線維芽細胞ライブラリーをスクリーンした。4.8×10⁵個のプラークを標準のプラークハイブリダイゼーション技法（Molecular Cloning，A Laboratory Ma nual、第２版、J．Sambrook，E．F．Fritsch，T．Maniatis，Cold Spring Harbo r Laboratory Press，1989）により、上記条件を用いてスクリーンした。６つのハイブリダイゼーション陽性ファージクローンを、連続的プラークハイブリダイゼーションにより精製した。２つのファージクローンをさらに特徴づけた（＃１及び＃７）。ヒトゲノムクローンの特徴化ヒトIL−１Ｒ AcPゲノムクローンを、制限酵素地図によりまず、特徴づけた。バクテリオファージラムダDNA を、Lambda Sorbファージ吸着剤（Promega，Madi son，WI）を用いてクローン＃１及び＃７から単離した。ファージDNA をSacＩにより消化し、挿入体を開放し、そして次に、そのフラグメントを１％アガロースゲル上での電気泳動により分離した。両クローン＃１及び＃７のための挿入体は約17kbのサイズであった。クローン＃１及び＃７のさらなる地図形成を、 XbaＩ及びEcoRＩを用いて行なった。消化されたDNA を、１％アガロース上での電気泳動により分離し、ナイロン膜(ICN，Irvine，CA)に移し、そしてサザンブロット分析のために架橋した。前記膜を、前で記載されたネズミIL−１Ｒ AcPの 843bp （BamHＩ／ SalＩ）フラグメントによりハイブリダイズせしめた。プローブを、 Prime−It II Random Primer Labeling キット（Stratagene，La Jolla，CA）を用いて〔³²Ｐ〕−dCTPによりラベルした。ブロットを、前記の低緊縮ハイブリダイゼーション条件を用いて、ハイブリダイズし、そして洗浄した。 EcoRＩ消化物からの 4.5kbフラグメント及び XbaＩ消化物からの 2.6kbフラグメントを、ネズミIL−１Ｒ AcP配列へのハイブリダイゼーションのための陽性として同定した。前記4.5 フラグメント及び 2.6kbフラグメントを、0.8 ％ Seaplaqueアガロース(FMC，Rockland，ME)から単離し、そしてQiaex(Oiagen，Chatsworth，CA)により精製した。それらのフラグメントを、ベクターpBluescript IISK⁺(Stratagene，La Jolla，CA)中にサブクローン化し、特徴化を促進した。プラスミドDNA を、Qiagenプラスミドキット（Qiagen，Chatsworth，CA）を用いて調製した。サザンブロット分析を行ない、ヒトゲノムにおける相同配列を検出するためにより適切であるフラグメントを決定した。前記 4.5kb及び 2.6kbのフラグメントをプローブとして使用した。低緊縮ハイブリダイゼーション条件は次の通りであった：５×SSC ，50％ホルムアミド、５×Denhardt's，100μｇ／mlの酵母RNA， 0.1 ％ SDS，37℃、一晩のハイブリダイゼーション。プローブを、Prime−ItII Random Primer Labeling キット（Stratagene，La Jolla，CA）を用いて〔³² Ｐ〕−dCTPによりラベルした。膜を、37℃で開始して、種々の温度点で、高い緊縮条件(0.1×SSC，0.01 ％ SDS)を用いて洗浄した。最適条件を決定し、ヒトcDN Aライブラリーをスクリーンする場合、huIL−１Ｒ AcPに対して特異的であるプローブの選択を確保した。それらの最適条件は、例12に記載されている。ヒトゲノムクローンの配列分析 pBluescript IISK⁺／2.6kb ヒトゲノムIL−１Ｒ AcPプラスミドDNA を、熱安定性DNA ポリメラーゼ及びターミネーターとしての色素−ラベルされたジデオキシヌクレオチドと共に、ABI 自動DNA 配列決定機を用いて配列決定した。予備DN A 配列分析は、このDNA がネズミIL−１Ｒ AcPの細胞内ドメインをコードする配列に対して90％の相同性を有する 150−ヌクレオチド領域を含むことを示した。例12 ヒトIL−１Ｒ AcPのcDNAクローンの単離YT 細胞cDNAライブラリーの構成 mAb 2E6(例２、表２)を、ネズミIL−１Ｒ AcPとのその反応性により当初は特徴づけた。予備データは、mAb 2E6 がヒト細胞上のIL−１Ｒ AcPを検出することを示した。多くのヒト細胞系を〔¹²⁵Ｉ〕−2E6によりスクリーンし、そしてYT細胞系(Yodoi など.，J．Immunol．134：1623，1985)は他のヒト細胞系、たとえば RAJIに比較して、細胞当たり比較的多数の2E6 反応性部位を発現したことが決定された。従って、YT細胞系を、cDNAライブラリー構成のためのRNA 源として選択した。全RNA をYT細胞から抽出し、そしてcDNAを、本明細書に記載のようにしてこの RNA から製造した（例７：3T3−LI cDNA ライブラリー構成）。EcoRＩアダプター（Stratagene，La Jolla，CA）を、前記得られたcDNAに連結し、そして1000bp 以上の分子を、本明細書に記載のようにしてSephacryl SF500 カラム上への通過により選択した（例７：3T3−LI cDNA ライブラリー構成）。cDNAをエタノール沈殿により濃縮し、そしてクローニングベクターに連結した。クローニングベクターは、EcoRＩ制限酵素により消化され、そして脱リン酸化されたλZAP IIファージ（Stratagene）であった（供給者により提供されるような）。上記からのサイズ選択されたcDNA 100ngの10アリコートを、15℃で一晩、連結緩衝液（66mMのトリス−HCl，pH7.5／５mMのMgCl₂／１mMの DTE／１mMのrATP）５μｌ中、λZAP IIアーム（EcoRＩ消化され、そして脱リン酸化された）１μｇにそれぞれ連結した。次の日、前記連結物をプールし、そして Gigapack IIIパッケージング抽出物を用い及び製造業者の説明書（Stratagene）に従って12の４μｌアリコートにおけるλファージ中にパッケージングした。パッケージされたファージを、非組換えファージを区別するために５mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）（Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN）及び４mg／ml の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Gal）(Boerhinger−Mannheim)の存在下で、細菌株XL１−Blue−MRF(Strat agene)にプレートすることにより力価した。次の日のプラークの計数は、3.55× 10⁶個の組換え体のライブラリーが、0.１％以下の非組換えバックグラウンドを伴って得られたことを示した。IL −１Ｒ AcPのヒトゲノムクローンフラグメントとのハイブリダイゼーションによるヒトcDNAライブラリーのスクリーニング huIL−１Ｒ AcPのための特異的プローブであるとして前に記載された 2.6kbの XbaＩ制限フラグメントを、YT cDNA ライブラリーをスクリーンするために、低緊縮ハイブリダイゼーション（５×SSC，50％ホルムアミド、５×Denhardt's，1 00μｇ／mlの酵母RNA，0.1％ SDS，37℃、一晩）、高緊縮洗浄条件(0.1×SSC，0 .01％の SDS，40℃)下で使用した。4.8×10⁵個のプラークを、標準のプラークハイブリダイゼーション技法（Moleculr Cloning，A Laboratory Manual、第２版、J．Sambrook，E．I．Fritsch，T．Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）によりスクリーンした。３種のハイブリダイゼーション陽性ファージクローン（＃３，＃５及び＃６）を、連続プラークハイブリダイゼーションにより同定し、そして精製した。λZAP IIベクターからの挿入体DNA を含むpBlu escript SK（−）ファージミドの切断を、製造業者の手段に従って行なった。ヒトcDNAクローンの特徴化 pBluescript SK（−）におけるヒトIL−１Ｒ AcP cDNA 挿入体＃３，＃５及び＃６を、制限酵素地図形成によりさらに特徴づけた。始めに、ミニプレプラスミドDNA を、急速煮沸法（Holmes and Qui gley，Anal．Biochem．114：193，1981）により調製した。続いて、プラスミドD NA を、Qiagenプラスミドキットにより調製した。そのプラスミドDNA をEcoRＩにより消化し、挿入体を開放し、そしてその挿入体を１％アガロース上での電気泳動により分離した。クローン＃３は 2.3kbの挿入体を含み、クローン＃５は 1 .4kbの挿入体を含み、そしてクローン＃６は 2.7kbの挿入体を含んだ。さらなる制限地図形成は、すべての３種のクローンに存在する単一の PvuII部位を示す。ヒトIL−１Ｒ AcP cDNA クローンの配列分析クローン＃３，＃５及び＃６からのプラスミドDNA を、熱安定性DNA ポリメラーゼ及びターミネーターとしての色素−ラベルされたジデオキシヌクレオチドと共にABI 自動DNA 配列決定機を用いて配列決定した。予備配列の分析は、クローン＃３及び＃６のみが、ネズミIL−１Ｒ AcP cDNA に対して相同である挿入体を有することを示した。従って、クローン＃３及び＃６挿入体を完全に配列決定した。配列の分析は、クローン＃３及び＃６が重複クローンであることを示す。クローン＃３及び＃６の図的な表示は、図14に示される。クローン＃３は、ATG 開始コドン及びコード領域の５’側部分を含む。クローン＃６は、cDNAの３’側部分及びTGA 停止コドンを含む。それらの２つの重複クローンを、完全な長さのhu IL−１Ｒ AcP cDNA を構成するために使用した。例13 完全な長さのヒトIL−１Ｒ AcP cDNA の構成制限エンドヌクレアーゼマッピング及び予備配列分析は、クローン＃３及びクローン＃６に存在する単一の BstＸＩ部位が存在することを示した。重複クローン＃３及び＃６の図的な表示は、図14に示されている。クローン＃３及び＃６を、制限酵素 BstＸＩ及び X baＩにより消化した。約 846bp及び約2700bpのフラグメントを、0.7 ％ Seaplaq ueアガロース(FMC，Rockland，ME)によりそれぞれクローン＃３及びクローン＃６から調製し、そしてQiaex 法（Qiagen，Chatsworth，CA）により精製した。完全な長さのヒトIL−１Ｒ AcPを、哺乳類発現ベクターpEF−BOS（Mizushima and Nagato，Nuc．Acids Res．18：5322，1990）中へのサブクローニングにより調製した。pEF−BOS プラスミドDNAを XbaＩにより消化し、ウシ小腸ホスファターゼ(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)により処理し、0.7 ％ Seaplaqu eアガロースゲル上での電気泳動により分離し、そしてQiaex 法（Qiagen，Chats worth，CA）により精製した。上記 846bp及び約2700bpの BstＸＩ／XbaＩフラグメントを、XbaＩ−切断のpEF−BOS 発現ベクター中に連結し、そしてその連結生成物を用いて、MC1061補体細胞を形質転換した。その形質転換された細胞を、10 0μｇ／mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上にプレートし、そして37℃で一晩、増殖せしめた。次の日、12の個々のコロニーを取り、アンピシリン(100μ ｇ／ml)を含むLBを接種し、そして37℃で一晩インキュベートした。ミニプレプラスミドDNA を、急速煮沸法（Holmes and Quigley，Anal．Biochem．114：193 ，1981）により個々の接種されたコロニーから調製した。制限エンドヌクレアーゼ分析は、10のクローンが pEF−BOS におけるプロモーター領域に対して正しい配向で適切な挿入体を含むことを確かめた。プラスミドDNA を、Qiaex 法（Qiagen，Chatsworth，CA）により２種の陽性クローン＃１及び＃９から単離した。両プラスミドの両鎖のヌクレオチド配列を、例７に記載のようにして決定した。完全な長さのhuIL−１Ｒ AcP cDNA 内に含まれる1710bpの読み取り枠(ORF）の配列を図15〔配列番号１〕に示す。図６に示される推定されるアミノ酸配列〔配列番号３〕は、20個のアミノ酸シグナルペプチド(Met^-20−A la^-1)、推定上の細胞外ドメイン(Ser１−Glu 339)、疎水性トランスメンブランドメイン(Leu 340−Leu 363)及び細胞質末端(Glu 364−Val 550)から成る 570個の残基のタンパク質をコードする。７つの可能性あるＮ−連結のグリコシル化部位は、細胞外ドメイン内にすべて含まれる。すべての７つの部位は、ネズミとヒトIL−１Ｒ AcP間に保存される。例14 可溶性ヒトIL−１Ｒ AcPの発現 huIL−１Ｒ AcPを発現するために、タンパク質の可溶形を、バキュロウィルス発現システムにおける発現のために構築した。このシステムは、真核細胞において組換えタンパク質を過剰生成するために有用である(Luckow and Summers，Bio /Technology ６：47，1988)。ポリメラーゼ鎖反応(PCR)方法（Innis M．A.,など .，PCR方法：A guide to Methods and Applications，Academic Press，San Die go）を用いて、huIL−１Ｒ AcPの細胞外ドメインの可溶形をコードするアンプリコンを生成した。手短に言及れば、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、Ap plied Biosystems合成機上で合成した。前進プライマーは、BamHＩ部位、及びシグナルペプチドの始めの11個のアミノ酸のためのコドンを含んだ：（5'）GGCC G GA TCC ATG ACA CTT CTG TGG TGT GTA GTG AGT CTC TAC（3'）〔配列番号10〕。後進プライマー配列は、トランスメンブランドメインの直前の11個のアミノ酸、 Ala スペーサー、及びGlu-Glu-Phe 標識、続いて停止コドンTAG 及び KpnＩ部位をコードした：（5'）CGCGCG GGT ACCCTA GAA CTC TTC AGC TTC CAC TGT GTA TC T TGG AGC TGG CAC TTT CTGC（3'）〔配列番号11〕。COOH末端でのGlu-Glu-Phe トリペプチド標識が、組換えタンパク質の抗体検出のためのエピトープを供給するために構築された。このトリペプチド標識は、α−チューブリンに対する市販のモノクローナル抗体により認識される(Skinnerなど.，J．Biol．Chem．266 ：14163，1991)。前進及び後進プライマーは、鋳型としてクローン＃３（図14）を用いて、huIL −１Ｒ AcP の細胞外ドメインを増幅するために使用された。その得られる約 80 0bpのPCR アンプリコンを、BamHＩ及び KpnＩにより消化した。消化されたフラグメントを、0.7 ％ Seaplaqueアガロースを通しての電気泳動にゆだね、そして Qiaex 法（Qiagen，Chatsworth，CA）により精製した。次に、可溶性ヒトIL−１Ｒ AcP細胞外ドメインをpNR1、すなわちバキュロウィルストランスファーベクターpVL941(PharMingen，San Diego，CA)の誘導体中にサブクローン化した。pNR1 を、位置7196でのEcoRＩ部位の除去によりpVL941から調製した（EcoRＩによる切断、及びクレノウDNA ポリメラーゼによる付着端のフィルイン）。次に、DNA を、再連結、次にBamＩ及びAsp 718（KpnＩイソシゾマー）による切断、及びBamH Ｉ，EcoRＩ及びAsp 718 認識配列を含む次のオリゴヌクレオチドの挿入にゆだねた：（5'）GATCCAGAATTCATAATAG（3'）〔配列番号12〕（3'）GTCTTAAGTATTATCCATG（5'）〔配列番号13〕。 BamHＩ，EcoRＩ及びAsp 718 制限部位は、pNR1においてユニークである。 pNR1プラスミドDNA を、BamHＩ及びKpnＩにより消化し、そしてQiaex 法（Qia gen，Chatsworth，CA）により0.7 ％ Seaplaqueアガロースゲルから精製した。B amHＩ／ KpnＩの約 800bpのhuIL−１Ｒ AcP PCRアンプリコンフラグメントを、B amHＩ／ KpnＩ切断されたpNR1発現ベクター中に連結した。その連結生成物を用いて、MC1061コンピテント細胞を形質転換し、次に、それを、アンピシリン(100 μｇ／ml)を含むLB寒天上にプレートし、そして37℃で一晩、増殖した。次の日、36の独立したコロニーを取り、そしてアンピシリン（100μｇ／ml）を含むLB 中に接種した。ミニプレプDNA を急速煮沸法（Holmes and Quigley，Anal．Bioc hem．114：193，1981）により調製した。DNA を制限エンドヌクレアーゼ地図形成により分析した。30のプラスミドクローンは、正しい挿入体を含むことが示された。プラスミドDNA を、Qiagen法（Qiagen，Chatsworth，CA）により２種の陽性クローン（＃11，＃25）から調製した。それらのクローンを、配列分析により確証した。 pNR1／可溶性ヒトIL−１Ｒ AcP DNA（クローン＃25）を、Baculo Gold トランスフェクションキット(PharMingen，San Diego，CA)を用いて、線状化されたAcR P23．lacZバキュロウィルスDNA（PharMingen，San Diego，CA）によりSF９(Spod optera frugiperda)細胞中に同時トランスフェクトした。トランスフェクションに続いて、組換えバキュロウィルスを、BaculoGold Transfection キット（Phar Mingen）に記載の手段に従って、単離し、そしてフラーク精製した。プラークを、記載のようにしてMTT による染色により可視化した（Shanafelt，Biotechniqu esll：330，1991）。12の個々のウィルスプラークを単離し、そしてウィルス粒子を、ローター上での４℃で一晩のインキュベーションにより0.5mlのSF−９培地(IPL−41＋10％ FBS−JRH Biosciences，Lenexa，KS)中にアガロースから溶離した。個々の組換えウィルスを、PCR により挿入体の存在について、及びイムノブロット分析により組換えヒトIL−１Ｒ AcPの発現について分析した。PCR 増幅のために、ウィルスDNA を抽出し、Taq DNAポリメラーゼ及び適切なpNR1前進及び後進プライマー（BamHＩ／Asp 718 クローニング部位に対して）と共にインキュベートし、そして標準のPCR 法(Innisなど.，PCR Protocols，Academic Pre ss，San Diego，1990)を用いて増幅した。個々のアンプリコンを1.5％アガロース上での電気泳動により分析した。その結果は、試験された11のプラークのうち 10のプラークが正しい挿入体サイズに対応する約１kbの挿入体を含むことを確証した。イムノブロット分析のために、ヒトIL−１Ｒ AcP＋標識（組換えウィルスにより感染されたSf９細胞の上清液からの）を、ストレプトアビジン−アガロース（ Pierce，Rockford，IL）上に固定されたビオチニル化された抗−チューブリン抗体（YLI／2）(Harlan Bioproducts)との反応により単離した。タンパク質を、0. 2 Ｍのグリシン(pH2.7)により抗−チューブリン抗体マトリックスから溶離し、そして画分を３Ｍのトリス塩基により中和した。溶離されたタンパク質を、β− メルカプトエタノールを伴わないでLaemmli サンプル緩衝液により処理し、８％アクリルアミド(Novex)スラブゲル上で分離し、そして 0.2μのニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)に移した。その固定されたタンパク質を、YL 1／2 抗体（10μｇ／ml）及びペルオキシダーゼ接合のヤギ−抗−ラット抗体（１：10,000の希釈度）（Boehringer Mannheim Biochemicals）によりプローブした。免疫反応性バンドを、製造業者の方法に従ってECL(Amersham)により可視化した。この分析は、ヒトIL−１Ｒ AcP＋標識挿入体を含む組換えウィルスにより発現された、200kDa以上のタンパク質を同定した。プラーク＃２及び＃12からの組換えウィルス（ヒトIL−１Ｒ AcP＋標識を発現するものとしてイムノブロット分析により同定された）を増幅し、免疫化のためにヒトIL−１Ｒ AcP＋標識の大規模生成に使用されるウィルスストックを得た。 Sf９細胞を、１％ウシ胎児血清を有するEX−（ELL40）(JRH Biosciences，Lenex a，KS)において27℃で、対数増殖（１×10⁶個の細胞／ml）で増殖し、記載のようにして（O'Reillyなど.，Baculovirus Expression Vectors，a Laboratory Ma nual，Oxford Univ．Press，1994）、組換えバキュロウィルスにより感染せしめ、そして古い培地を感染後３〜５日で収穫した。細胞を遠心分離によりその古い培地から除去し、そして可溶性ヒトIL−１Ｒ AcP＋標識を、下記例15に記載のようにして、固定されたYL 1／2 抗体から成る親和性マトリックス上で精製した。その精製されたヒトIL−１Ｒ AcP＋標識を用いて、マウスを免疫化した。例15 ヒトIL−１Ｒ AcPーアクセサリータンパク質（huIL−１Ｒ AcP）に対して特異的なモノクローナル抗体の調製及びスクリーニング３種の方法が、そのhuIL−１Ｒ AcPに対して特異的な抗体を成長せしめるために使用される。ヒト組換えIL−１Ｒ AcPを発現するCOS 細胞によるマウス及びラットの免疫化 COS 細胞（４×10⁷個）を、製造業者の方法に従って、250μＦ及び 350ボルトでのBioRad Gene Pulserにおいて、十分な長さのhuIL−１Ｒ AcP発現プラスミド（20μｇ、例13に記載される）によるエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、250mm×250mm のNunc組織培養トレーにプレートし、そして72時間の増殖の後、収穫した。トランスフェクトされた細胞を、37℃で10分間のNO-Zyme(JRH Biosciences)による処理により組織培養トレーから開放した。細胞を収穫し、PBS（pH7.4）により洗浄し、そして免疫化のために使用した。マウス及びラットを、０，７，14及び28日で、huIL−１Ｒ A cPを発現するCOS 細胞（１×10⁷個の細胞／動物）による腹腔内（ｉ．ｐ．）路により免疫化した。40日目、動物から採血し、huIL−１Ｒ AcPに対する抗体応答の力価を決定した（特定アッセイのためには下記を参照のこと）。動物を、 40日後、２〜４週の間隔で追加免疫した（１×10⁷個の細胞、ｉ．ｐ．）。huIL −１Ｒ AcPに対して特異的な血清抗体力価を、個々の追加免疫の後、10〜12日で決定した。動物が十分な血清抗体力価（たとえば、血清の１／1000希釈溶液は、ヒトYT及びRAJI細胞から溶解されたIL−１Ｒ AcPに架橋される〔¹²⁵Ｉ〕−IL− １βの一定量の複合体の少なくとも50％を免疫沈殿せしめる）を生成せしめる場合、それらはそれらの脾臓細胞を単離する調製において追加免疫を与えられる。それらの最終追加免疫は、２回の連続した日に、ｉ．ｖ．及びｉ．ｐ．投与される１×10⁷個の細胞から構成される。最後の免疫化の３日後、脾臓細胞を動物から単離し、そしてハイブリドーマ細胞を前に記載のようにして生成した。huIL− １Ｒ AcPに対して特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、下記アッセイにより同定する。ハイブリドーマ細胞を、例１に記載のようにしてクローン化する。精製されたヒト組換え可溶性IL−１Ｒ AcPによるマウス及びラットの免疫化ａ．COS 細胞及びバキュロウィルス発現システムにおけるヒト組換え可溶性IL −１Ｒ AcPの調製上記のようにして、COS 細胞を、Ｃ−末端で挿入された標識（Glu，Glu，Phe ）(Skinner など.，J．Biol．Chem．266：14163，1991)を有するhuIL−１Ｒ AcP の細胞外ドメイン(可溶性IL−１Ｒ AcP、アミノ酸１−399 ＋Ala ＋Glu ＋Glu ＋Phe)を発現するプラスミドDNA によりトランスフェクトする。前記標識は、抗 −チューブリン抗体YL 1／2(Harlan Bioproducts)による認識のための配列をコードする。培地を、トランスフェクションの72時間後、細胞から収穫し、そして可溶性IL−１Ｒ AcP＋標識を下記のようにして検出し、そして精製した。標準の方法(Gruenwald and Heitz，Baculovirus Expression Vector System： Procedures and Methods Mannual、第２版、1993，PharMingen，San Diego，CA) を用いて、可溶性IL−１Ｒ AcPタンパク質を発現する純粋な組換えバキュロウィルスを生成する。手短に言及すれば、ヒトIL−１Ｒ AcP＋標識の可溶性細胞外ドメインをコードするプラスミドDNA を、例14に記載のようにして、トランスファーベクター中に挿入する。組換えトランスファーベクターを精製し、そしてSf９ (Spodoptera frugiperda)細胞中に、線状化されたACVW１．lacZ DNA（PharMinge n）により同時トランスフェクトする。組換えバキュロウィルスを単離し、そしてプラーク精製する。Sf−９細胞（２×10⁶個の細胞／ml）を、27℃でTMH−FH培地（PharMingen）において対数増殖相に培養し、組換えバキュロウィルスにより感染せしめ、そして古い培養培地を３〜５日後に収穫する。細胞を遠心分離によりその古い培養培地から除去し、そして可溶性IL−１Ｒ AcP＋標識タンパク質を、下記のようにして検出し、そして精製する。ｂ．固定されたYL 1／2 抗体から構成される親和性マトリックスの調製多くの方法を用いて、活性化されたアガロースゲル、たとえばAfti−Gel 10(B ioRad Laboratories)又は固定されたプロテインＧを含むアガロースゲルのいづれかへの共有架橋を包含する親和性マトリックスにYL 1／2 抗体を固定することができる（Stern and Podlaski，Techniques in Protein Chemistry IV，R．H． Angelletti，ed.，pp．353-360，Academic Press，NY，1993）。しかしながら、可溶性IL−１Ｒ AcPの精製のために、YL 1／2 抗体を NHS−LC−ビオチン(Pierc e Chemical Co.)により共有変性し、そしてストレプトアビジン−アガロースゲル(Pierce Chemical Co.)上に固定する。YL 1／2 抗体（3mg／ml）を、0.1Ｍの硼酸緩衝液(pH8.5)に対して透析し、続いて、室温で２時間、40：１のモル比（LC−ビオチン：YL 1／2 抗体）で、NHS−LC−ビオチンと反応せしめる。反応しなかったLC−ビオチンを、１Ｍのグリシン／0.1Ｍの硼酸緩衝液(pH8.4)により急冷する。その反応せず、そして急冷された NHS−LC −ビオチンを、Centricon−30マイクロコンセントレーター（Amicon）を用いて、1000×ｇで15〜30分間の遠心分離により除去する。遠心分離の後、そのビオチニル化されたYL 1／2 抗体を、0.1Ｍのリン酸ナトリウム(pH7.0)により希釈し、そしてその工程をさらに２回、くり返す。ビオチニル化されたYL 1／2 抗体(0.1 Ｍのリン酸ナトリウム(pH7.0)中、６mg)を、室温で２時間、ストレプトアビジン −アガロース（50％の懸濁液６ml）と反応せしめる。固定されたビオチニル化されたYL 1／2 抗体を有するストレプトアビジンアガロースをカラム中に配置し、そして10カラム体積のPBS（pH7.4）により洗浄する。ｃ．可溶性IL−１Ｒ AcPの精製可溶性IL−１Ｒ AcPを含む、COS 細胞又はSf９細胞のいづれかからの培地を、３ml／分の流速でYL 1／2 親和性カラムに通す。カラムを、連続的に、２カラム体積のPBS（pH7.4），５カラム体積の50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)、0.5ＭのNa Cl，0.5％のTween 20，0.05％のNaN₃及び２カラム体積のPBS（pH7.4）により洗浄する。可溶性IL−１Ｒ AcP＋標識を、0.1Ｍのグリシン−HCl（pH2.8）により溶出し、そして画分（１ml）を、３Ｍのトリス塩基により中和する（１ml画分当たり 0.015ml）。カラムから溶出されたタンパク質（精製された可溶性ＩＬ−１Ｒ AcP＋標識）を、12％アクリルアミドスラブゲル上での還元及び非還元 SDS− PAGEにより、続いてタンパク質バンドを可視化するために銀染色により特徴づける。COS 細胞及びバキュロウィルス発現システムからのならし培地、及び精製された調製物に存在する可溶性IL−１Ｒ AcP＋標識を、ウェスターンブロット方法により同定することができる。ならし培地中のタンパク質（0.04ml）及び精製された可溶性IL−１Ｒ AcP＋標識(0.1〜１μｇ）を、β−メルカプトエタノールを含まないLaemmli サンプル緩衝液により処理し、12％ゲル上での SDS−PAGEにより分離し、そしてニトロセルロース膜に移す(0.2μＭ)（例１に記載されるようにして）。ニトロセルロース上に固定されたタンパク質を、YL 1／2 抗体（５μｇ／ml）及びペルオキシダーゼ接合のヤギ抗−ネズミ又は−ラットIgG 抗体（１／1000希釈度）（Boehring er Mannheim Biochemicals）によりプローブする。免疫反応性バンドを、ECL 技法(Amersham Inc.)により、製造業者の方法に従って同定する。COS 細胞及びバキュロウィルス発現システムから精製される可溶性IL−１Ｒ AcPは、それぞれ約 65〜67kDa 及び45〜47kDa のタンパク質として移動する。ｄ．可溶性IL−１Ｒ AcP＋標識によるマウス及びラットの免疫化マウス及びラットを、０，14及び28日目、10〜100 μｇの可溶性IL−１Ｒ AcP ＋標識によりｉ．ｐ．及び脚の肉趾路を通して免疫化する。タンパク質を、一次免疫化のために完全フロイントアジュバントにおいて及び14日及び28日目の追加免疫化のために不完全フロイントアジュバントにおいて例１及び２に記載されるようにして調製する。血清を４日目、動物から採取し、そして抗体活性について試験する（下記アッセイを参照のこと）。動物は、４週間隔で追加免疫化を与えられ（不完全フロイントアジュバントにおいて調製されたタンパク質10〜25μｇのｉ．ｐ．投与）、そして血清抗体の力価が個々の免疫化の２週間後に測定される。動物が可能性ある血清抗体力価を生成する場合（たとえば、血清の１／10⁴希釈溶液は、EIA において5 0％の応答を与える）、それらは、２日間の連続した日に10〜100 μｇの可溶性I L−１Ｒ AcP＋標識の追加免疫化（ｉ．ｖ．及びｉ．ｐ．）を与えられる。３日後、脾臓細胞を動物から単離し、そして抗−マウスIL−１Ｒ AcP抗体の生成のために例１に記載のようにしてSP２／０細胞により融合せしめる。ハイブリドーマ上清液を、下記アッセイにより阻害及び非阻害抗体についてスクリーンする。抗 −huIL−１Ｒ AcP抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を、限界希釈法によりクローン化する。抗−huIL−１Ｒ AcP抗体を、例１に記載のようにして精製する。ｅ．ヒトIL−１Ｒ AcPに対して特異的な抗体を検出するためのアッセイ血清における抗−IL−１Ｒ AcP抗体の存在を始め、96ウェルプレート上に固定された可溶性IL−１Ｒ AcP＋標識による酵素イムノアッセイ(EIA)により決定する。手短に言及すれば、可溶性IL−１Ｒ AcP＋標識（１μｇ／ml）を、50mMの炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)、0.15ＭのNaCl（BC塩溶液）により希釈し、そして室温で16時間、Nunc Maxisorb プレートのウェルに受動的に吸着せしめ(100μｌ，100ng)。洗浄の後、プレートを37℃で１時間、PBS（pH7.4），１％ウシ血清アルブミン(BSA)と反応せしめる。血清サンプルの連続的な希釈溶液〔50mMのリン酸ナトリウム、pH7.5，0.5ＭのNaCl，0.1％の Tween-20，１％のBSA 及び0.05％のNaN₃（抗体結合緩衝液）において１／100〜１／10⁶〕を、室温で２時間、固定された可溶性IL−１Ｒ AcPと共にインキュベートする。PBS（pH7.4），0.05％の Tween−20によるプレートの洗浄の後、結合された抗体を、ペルオキシダーゼ− 接合のヤギ抗−マウス又は−ラットIgG 抗体(Boerhringer−Mannheim Inc.)により検出し、そしてTMB(テトラメチルベンジジン)基質により可視化する。個々のウェルの色の強度が、複数チャネル光度計により 450nmで測定され、そして血清における抗−IL−１Ｒ AcP抗体の濃度に比例する。血清抗体をまた、FACS（螢光活性化された細胞ソーティング）により、１）ヒト細胞系YT，NC−37及びRAJI上に発現される天然のhuIL−１Ｒ AcP、及び２）CO S 細胞上に発現される組換えhuIL−１Ｒ AcPに対する反応性について試験する。細胞（１×10⁶個）を、PBS(pH7.4)（100μｌ）中、血清希釈溶液と共に４℃で１時間インキュベートする。PBS（pH7.4）により細胞を洗浄し、結合されていない抗体を除去した後、細胞をフルオレセイン−接合のヤギ−抗−マウス又は−ラットIgG 抗体(Tago Laboratories)と共に４℃で30分間インキュベートする。細胞をPBS（pH7.4）により洗浄し、そして細胞表面に結合された抗体の量を、FACSor t(Becton−Dickinson Co.)により螢光強度の上昇により測定する。抗−ネズミIL−１Ｒ AcP抗体4C5 及び2E6（表２）は、ネズミ細胞上に発現されたIL−１Ｒ AcPに対してそれぞれ阻害及び非阻害活性を示した。ヒトIL−１Ｒ AcPにより免疫化された動物からの血清が阻害及び非阻害抗体の両者を含むかどうかを決定するために、次の２種のタイプのアッセイを行なう：１）ヒト細胞への〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１βの結合の阻害及び２）ヒト細胞からの細胞表面タンパク質に架橋される〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１βの溶解された複合体の免疫沈殿。阻害アッセイのためには、血清の一連の希釈溶液を、結合緩衝液においてYT，NC−37及び RAJI細胞（１〜２×10⁶個）と共に室温で１時間インキュベートする。〔¹²⁵Ｉ〕 −IL−１β(25〜250pM)を個々の管に添加し、４℃で３時間インキュベートし、そして細胞結合放射能を例１に記載されるようにして決定する。阻害抗体の力価を、細胞結合された放射能の50％低下をもたらす血清希釈溶液により決定する。免疫沈殿アッセイのためには、血清の希釈溶液を、huIL−１Ｒ AcP に架橋される〔¹²⁵Ｉ〕−IL−１βの溶解された複合体と共に及びアガロースビーズ上に固定されたタンパク質−Ｇ−Plusの存在下で４℃で16時間インキュベートする。個々の血清サンプルを、ヒト細胞系YT，NC−37及びRAJIから調製された、溶解された複合体との反応性について試験する。タンパク質−Ｇ−Plusアガロースビーズを遠心分離し、そして洗浄した後、免疫沈殿されたタンパク質を、ネズミIL−１Ｒ AcP抗体について例１に記載されるように SDS−PAGE及びオートラジオグラフィーにより分析する。カサガイ（キーホールリンペット）のヘモシアニン(KLH)に接合されるhuIL−１Ｒ AcPペプチドによるマウス及びラットの免疫化完全な長さのhuIL−１Ｒ AcPの配列１−10，54−64，68−77，265−273，285 −294，490−499 及び 505−515に対応するペプチドを、標準の固相技法(Margli n and Merrifield，Ann．Rev．Biochem．39：841，1970)により合成した。個々のペプチドの配列は、MBS 技法によりKLH に共有結合するためにＣ−末端に付加されるシステインを有した。手短に言及すれば、KLH(PBS(pH7.4)中、1.5mg)を、 0.32mgの３−マレミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ MBS：Boehringer Mannheim Biochemicals）と４℃で１時間、反応せしめる。その反応混合物を、予備充填されたBioGel PIOカラム（10ml）(BioRad Laboratori es)に適用し、そしてPBS（pH7.4）によりクロマトグラフィー処理する。KLH−MB S 接合体を含む画分をプールし（２ml）、そしてペプチド（２mg）と４℃で１時間、反応せしめる。KLH−ペプチド接合体を、Centricon 10マイクロコンセントレーター（Amicon）により濃縮し、そして免疫化のために使用する。マウス及びラットを、200〜500 μｇの KLH−ペプチド接合体により０，７，14及び28日でｉ．ｐ．及び脚の肉趾路から免疫化する。接合体を、一次免疫化のために完全フロイントアジュバント及び追加免疫化のために不完全フロイントアジュバントにおいて調製する。血清を40日目で、動物から採取し、そして可溶性IL−１Ｒ AcP EIAにおける抗体反応性について試験する。動物を４週間隔で、追加免疫化し（ｉ．ｐ．、不完全フロイントアジュバントにおいて調製された KLH−ペプチド接合体 100μｇ）、そして血清抗体の力価を、個々の免疫化の後、２週で決定する。動物が可能性ある血清抗体力価を生成する場合（１／10⁴希釈溶液がEIA において50％応答を付与する）、それらは２日間の連続した日に、遊離ペプチド（100μｇ，ｉ．ｖ．路）及び KLH−ペプチド接合体（500μｇ，ｉ．ｐ．路）による追加免疫を付与される。３日後、脾臓細胞を動物から単離し、そしてhuIL−１Ｒ AcP抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、上記のようにして生成し、そして同定する。例16 抗−ヒトIL−１Ｒ AcP抗体、及びIL−１Ｒ AcPの活性フラグメントによるIL−１ β生物学的活性の中和用量依存性態様でのIL−１生物学的活性を中和する抗−ヒトIL−１Ｒ AcP抗体の能力を、ヒト胚の肺線維芽細胞 MRC−５細胞(ATCC＃ CCL−171)によるIL−１ −誘発されたIL−６アッセイにおいて決定することができる。MRC−５細胞を96 −ウェルクラスター皿にプレートし、そして上昇する濃度の抗−ヒトIL−１Ｒ A cP又はIL−１Ｒ AcPの活性フラグメントのいづれかにより１時間、予備処理する。その予備処理に続いて、細胞を、５pMのヒトIL−１α又はIL−１βのいづれかにより24時間、刺激する。IL−１に応答して細胞により分泌されるIL−６の量を、市販のIL−６ EIA（Quantikine Assay for Humnon IL−６，R & D Systems， Minneapolis，MN）により測定する。抗体及びIL−１Ｒ AcPの活性フラグメントの阻害効果を、インヒビターの存在及び不在下でのIL−６分泌の低下を決定することによって計算する。たとえば、５pM及び 100pMのIL−１βは、それぞれ、MRC−５細胞からの約8100及び9800pg／mlのIL−６の分泌を刺激した（図17）。IL−１レセプターアンタゴニスト（IL−１RA）及び抗−ヒトタイプＩ IL−１Ｒ抗体4C1は、IL− １βに応答してこのIL−６分泌を阻止した（図17）。IL−１RA及び4C1に関しては、５pMのIL−１βを阻止するためのIC₅₀はそれぞれ 200pM及び 0.025μｇ／ml であった（図17）。IL−１RA及び4C1 による阻害は、IL−１βの濃度を 100pMに高めることによって無効にされ得る。１00pMのIL−１βに関して、IL−１RA及び 4C1 阻害のためのIC₅₀はそれぞれ、１nM以上及び10μｇ／mlであった。それらのデータは、MRC−５細胞からのIL−１誘発されたIL−６は、ネズミ細胞におけるI L−１−依存性応答がまた、タイプＩレセプター依存性である同じ手段で、IL− １及びタイプＩ IL−１Ｒ−依存性応答に対して特異的であることを示した（図６，７及び８）。ネズミ細胞によるそれらのIL−１生物学的アッセイは、抗−ネズミIL−１Ｒ AcP抗体の中和の同定を誘導した。同様に、MRC−５細胞によるIL −１生物学的アッセイは、抗−ヒトIL−１Ｒ AcP抗体、及びIL−１Ｒ AcPの活性フラグメントの中和を同定するために使用され得る。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Human interleukin-1 receptor accessory protein The present invention generally relates to cytokine receptors, and more specifically, to receptors. The present invention relates to an accessory protein of the leukin 1 receptor. Interleukin 1 (IL-1) acts on a variety of cell types and (Dinarello, Blood 77: 1) 627, 1991). IL-1 is a major mediator of inflammatory and immunogenic responses. Therefore , Modulation of IL-1 activity provides a means to control and regulate their responses . Two types of IL-1, namely interleukin 1α (IL-1α) and interleukin Kin 1β (IL-1β) has been characterized, both of which are referred to herein. Is referred to as IL-1. The biological activity produced by IL-1 is of type Binds to specific cell membrane receptors called I and type II IL-1 receptors Mediated by things. IL-1 receptor (IL-1R) contains about 300 amino acids. A transmembrane protein with an acid extracellular domain, and Is a member of the globulin superfamily (Sims et al., Science 2 41: 585, 1988; Sims et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8946, 1989; Mc Mahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991). Both IL-1 species are responsible for their receptors. Combine individually and compete perfectly with each other for the combination. Type I IL-1R is predicted to encode a fully functional IL-1 receptor. Is imagined. Experiments with the cloned type I IL-1R Putter protein is Chinese Hams Binds to IL-1 when transfected and expressed in And showed that it was sufficient to transmit the IL-1 signal (Curtis et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3045, 1989). Endogenous hamster cell The presence of accessory proteins was not determined in those studies. Ta It has been proposed that Ip II IL-1R represents the accessory chain of IL-1R (S olari, Cytokine 2:21, 1990). However, more recent studies have shown that Type II IL-1R is unlikely to function as a signal-transduction accessory protein, Instead, it binds excess IL-1 and regulates its activity. It has been shown to act as a decoy receptor (colotta, etc.) Science 261: 472, 1993). Since IL-1 binding to the IL-1 receptor mediates the biological effects of IL-1, Understanding the mechanism of receptor binding and activation to regulate IL-1 activity is important. is there. Studies of affinity cross-linking and binding to labeled IL-1 are described by the IL-1 receptor. Can bind to IL-1 with different affinities (Lowenthal and Mac Donald, J. Exp. Me d. 164: 1060, 1980; Bensiman et al. Immunol. 143: 1168, 1989; McMahan Etc., EMBO J. 10: 2821, 1991). Related to IL-1R and signaling and Recognizes 90 kDa protein on murine cells required for bioactivity Mouse monoclonal (mAb) 4C5 has been described (Powers et al., AAI Conference, Denver, CO, May 21-25, 1993). Whether equivalent proteins are present on human cells What biological function, if any, is associated with such a protein Is not known. Prior to the present invention, the human IL-1R accessory protein was identified and Efforts to clone and express the gene encoding this protein Lack of purified protein, lack of antibodies recognizing this protein, and high amounts The inability to identify cells that express this protein and its mRNA Has been virtually hindered. In addition, murine accessory proteins are Enough to be used in efforts to identify human accessory proteins Could not be obtained in any significant amount. It is known to express accessory proteins Murine cell lines purify enough protein to get reliable amino acid sequence information Expressed in too small an amount (about 1000 molecules / cell). 4C5 target Recognizes human homologue of protein (murine accessory protein) No mAb was present. In addition, binding to IL-1 can Lie protein does not bind ligand or binds with very low affinity It is known to be effective for identifying human accessory proteins (Hibi et al., Cell 63: 1149, 19 90; Takeshita et al., Science 257: 379, 1992). The present invention provides purified human IL-, which can be used to modulate the effects of IL-1. Make the first receptor accessory protein available. Soluble accessor The addition of Lea protein inhibits the effect of IL-1 on cells. Therefore, A clear aspect is that a sufficient amount of soluble human to inhibit cell activation by IL-1 By adding IL-1R accessory protein (IL-1R AcP), IL- 1. Treatment of pathological conditions caused by overactivity of cells in response to 1. The method can also be modified, and the soluble accessory protein is Can be used as screening agents for Briefly, drugs that act as IL-1 antagonists include IL-1R AcP and IL- 1 can be effected by preventing its interaction. On the cell membrane The presence of IL-1R AcP in IL-1 Required to enable an effect (effective interactions are those that open a biological response). Means binding to the receptor complex to initiate). IL-1 receptor Complex is a type I or type II IL-1 receptor associated with IL-1R AcP. (Additional proteins may also be part of the complex ). Addition of soluble IL-1R AcP will result in the addition of the soluble IL-1R AcP on cells instead of the soluble IL-1R AcP. By allowing the protein to interact with IL-1 or the IL-1 receptor Inhibits the leverage interaction and thus the biological response elicited by IL-1 Reduce. Antibodies to the IL-1R AcP of the present invention may also be used to generate cells against IL-1. Inhibits physical response. By binding to IL-1R AcP, the antibody becomes IL-1R. Prevents it from interacting effectively with the IL-1 receptor. Blot IL-1R AcP By checking the antibodies, the antibodies of IL-1 to the IL-1 receptor complex are Inhibits binding, which depends on its interaction with IL-1R AcP. IL-1R AcP is IL Inhibits the interaction between IL-1 and the IL-1 receptor and thus activates IL-1 responsive cells. Prevents sexual development and reduces inflammatory response. Purified IL-1R AcP also has potential Can be used to screen certain medications. The drug is IL-1R A If it blocks the binding of IL-1 to cP, it is an effective IL-1 antagonist Would. The present invention relates to an IL-1 receptor accessory protein or an active fragment thereof. A polynucleotide encoding the polynucleotide, preferably the polynucleotide (A) of the active IL-1R AcP gene as shown in FIG. Nucleus derived from the code area A polynucleotide substantially having an otide sequence, preferably a cDNA clone; (b ) Can hybridize to the cDNA clone of (a) under moderate stringency conditions; And a polynucleotide encoding IL-1R AcP or a fragment thereof; and (C) As a result of the genetic code, degenerate to the DNA sequences defined in (a) and (b) And a polynucleotide encoding an IL-1R AcP molecule or a fragment thereof. Selected from the group consisting of Particularly preferred compounds are human IL-1 receptor A polynucleotide encoding an accessory protein, for example, an amino acid sequence [ SEQ ID NO: 3] or a polynucleotide encoding an active fragment thereof, A polynucleotide having the sequence [SEQ ID NO: 1]. Particularly preferred compounds are For example, a human soluble IL-1 receptor accession having an amino acid sequence [SEQ ID NO: 9] Encodes a Sally protein. The polypeptide [SEQ ID NO: 7] is human soluble IL- Encodes one receptor accessory protein. Antisense of the above compounds Polynucleotides are also part of the present invention. The invention also relates to vectors and suitable host cells, preferably as defined above. An expression vector comprising a DNA sequence, a recombinant produced using the expression vector Recombinant accessory protein using IL-1R AcP and the expression vector A method for producing a molecule is provided. The invention relates to an IL, encoded by a polynucleotide as defined above. -1 receptor accessory protein and its active fragment available I do. Preferred compounds are human IL-1 receptor accessory proteins, preferably Or a protein having an amino acid sequence [SEQ ID NO: 3]. Particularly preferably For example, a soluble human IL-1 receptor having the amino acid sequence [SEQ ID NO: 9] It is an accessory protein. IL-1R carrying one or more modified side groups AcP proteins are also part of the present invention. The present invention also provides antibodies to IL-1R AcP. Those antibodies are human Specifically binds to IL-1 receptor accessory proteins and is The activation of the IL-1 receptor complex. A preferred antibody is about K_D 0.1nM ~ About K_D Has a binding affinity for the IL-1 receptor co-complex of 10 nM, and For example, a monoclonal antibody or a derivative thereof. Antisense polynucleotide, IL-1 receptor accessor as described above Pharmaceutical compositions comprising Lea proteins or antibodies are also part of the invention. Those pharmaceutical compositions contain one or more other cytokine antagonists be able to. The present invention also provides a method for producing an IL-1 receptor accessory protein. Wherein the method comprises the steps of: (a) preparing a polypeptide encoded by the polynucleotide; (B) expressing the IL-1 receptor accessory protein in a suitable host; Isolating the protein and (c) optionally modifying one or more side groups. Converting it to an analog. Further, the present invention provides an IL-1 receptor A method for producing a ter accessory protein antibody, wherein said method comprises the steps of (a) ) Monoclonal that specifically binds to IL-1 receptor accessory protein Preparation of a hybridoma cell line producing the antibody, and (b) the monoclonal antibody Comprising the steps of body production and isolation. The corresponding polyclonal antibody is known Method. The compounds may for example be for use in the treatment of an inflammatory or immune response and / or Cure to modulate and prevent inflammatory or immunological activity of interleukin-1 Useful as therapeutically active substances. Especially, These compounds are useful for acute or chronic diseases, preferably rheumatoid arthritis, inflammatory bowel Disease, septic shock, transplant rejection, psoriasis, asthma and type I diabetes Or in the treatment of cancer, preferably acute and chronic myeloid leukemia . As used herein, unless otherwise noted, IL-1 is IL-1α And IL-1β, and the IL-1 receptor is of type I and type II IL-1 receptor.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. At room temperature for murine EL-4 cells [¹²⁵I] -4C5 equilibrium binding. EL-4 fine Vesicle (1.5 × 10⁶Cells) are not present (○) or do not have 100 nM of unlabeled 4C5. In the presence (▽), the increasing concentration of [¹²⁵I] Incubate with -4C5 for 2 hours at room temperature Was Total (（) and non-specific (▽) cell-bound radioactivity was as described in Example 1. Was determined as such. [¹²⁵I] Is the specific binding (-4) of -4C5 the total binding? Calculated by subtracting non-specific binding from them. 1A. [¹²⁵I] -4C5 Binding of EL-4 cells incubated with. 1B. Single site model (single site model) (Munson and Rodbard, Anal, Biochem.107: 220, 1980; McPherson, J .; Pharmacol. Methods14: 213, 1985) tchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci.51: 660, 1949) Analysis of binding data. FIG. For murine 70Z / 3 cells [¹²⁵I] -4C5 equilibrium binding. 70Z / 3 cells (1. 5 × 10⁶Cells) were not present (○) or present (▽) in the presence of 100 nM of unlabeled 4C5. ) Below, increasing concentrations of [¹²⁵I] -4C5 for 2 hours at room temperature Was. Total (（) and non-specific (▽) cell-bound radioactivity was as described in Example 1. Then decide Was done. [¹²⁵I] -4C5 specific binding (●) is changed from total binding to non-specific binding Was calculated by subtracting 2A. [¹²⁵I] Incubation with -4C5 Binding of vacated 70Z / 3 cells. 2B. Single site model Ligands (Munson and Rodbard, Anal, Biochem.107: 220, 1980; McPhers on, J. Pharmacol. Methods14Scatchard (Scatc: 213, 1985) hard, Ann. N. Y. Acad. Sci.51: 660, 1949) Analysis. FIG. IL-1 on 70Z / 3 cells by monoclonal antibodies 4C5, 4E2 and 35F3 Human to receptor [¹²⁵I]-Inhibition of IL-1 binding. The inhibition assay is described in Example 1. Performed as described. The data show specific binding in the absence of antibodies. When compared to [in the absence of the indicated concentration of antibody¹²⁵I] -IL-1 binding Expressed as% inhibition. Proteins include human IL-1α (H-α) and human IL-1 -1β (H-β). FIG. IL-1 levels on EL-4 cells by monoclonal antibodies 4C5, 4E2 and 35F5 Human to the scepter [¹²⁵I]-Inhibition of IL-1 binding. The inhibition assay is described in Example 1. It was done as it was. The data show specific binding and ratio in the absence of antibody. When compared in the absence of the indicated concentration of antibody [¹²⁵I]% inhibition of -IL-1 binding Expressed as harm rate. The proteins are human IL-1α (H-α) and human IL-1 β (H−β). Figure 5.4 EL-4 cell lysed extract by 4C5 affinity chromatography Of two proteins of 90 and 50 kDa from E. coli. The protein is described in Example 1. Lentil lectin affinity chromatography, followed by Anti-type I IL-1R antibody (7E6), murine IL-1α (Ma) or anti-accessory Saritan Affinity chromatography on matrices containing either protein antibody (4C5) It was partially purified from a detergent extract of EL-4 cells by chromatography. EL− The protein in the four-cell detergent extract also contains a 4C5 affinity matrix (4C5 ). The protein eluted from the column was analyzed by SDS-PAGE. Separated, transferred to nitrocellulose, and [¹²⁵I] -4C5 Was The molecular size shown at the marginal edge is the size of the molecule performed in the parallel lane. Estimated from Amersham Prestained Standards. FIG. IL-1 induced spleen B cells by monoclonal antibodies 4C5, 4E2 and 35F5 Inhibition of vesicle growth. The inhibition assay was performed as described in Example 1. That Data are in the absence of antibody^ThreeShown when compared to H-thymidine incorporation B cells in the presence of varying concentrations of antibody^ThreeH-thymidine incorporation (CPM) Is represented. The proteins are as follows: 6A. Human IL-1α (IL-1α) and And 6B. Human IL-1β (IL-1β). FIG. IL-1 induction by monoclonal antibodies 4C5 and 35F5 and human IL-1ra D10 issued. G4.1 Inhibition of helper T-cell proliferation. The inhibition assay is described in Example 1. Performed as described. The data was obtained in the absence of antibody or IL-1ra. of^ThreeIn the presence of the indicated concentration of antibody when compared to H-thymidine incorporation By D10 cells^ThreeExpressed as H-thymidine incorporation (CPM). Protein As follows: 7A. Human IL-1α, 7B. Human IL-1β. Figure 8. Inhibition of IL-1-induced Kappa light chain expression by 70Z / 3 cells. Monoc Effect of nal antibodies 4C5, 4E2, and 35F5. Induction of Kappa L chain expression and antibody The inhibition by was as described in Example 1. The data was collected in the absence of the antibody. When compared to the percentage of cells, Expressed as% of cells expressing Kappa light chain in the presence of the indicated concentration of antibody . The proteins are human IL-1α (IL-1α) and human IL-1β (IL-1β). You. FIG. IL in C57BL / 6 mice by monoclonal antibodies 4C5 and 35F5 -1 Induced inhibition of serum IL-6. The mouse is human IL-1α (α) or human IL- 4 hours and 10 minutes before subcutaneous injection of 1β (β) (0.03μg), monoclonal antibody More pre-processed. Two hours after IL-1 administration, serum IL-6 levels are described in Example 1. It was decided as follows. Mab X-7B2 is a control antibody. FIG. Nucleic acid sequence of murine IL-1R AcP and deduced amino acid sequence. 10A. Ne Nucleotide of the reading frame of P. pertussis IL-1R AcP cDNA clone E2-K Is shown. The upper chain is its coding sequence [SEQ ID NO: 4]. 10B. Amino acid sequence of murine IL-1R AcP deduced from the coding sequence shown in FIG. 10A Is shown [SEQ ID NO: 6]. Signal peptide cleavage site is present after Ala-1 And a 550 amino acid composition ranging from Ser1 to Val550. Brings ripe protein. The cleavage site is located in purified native muIL-1R AcP. NH_Two-Confirmed by terminal sequence analysis (Example 10). Predicted transmembrane Domains range from Leu340 to Leu363. FIG. Recombinant MuIL-1R AcP mAb 4C from transfected COS cells Immunoprecipitation with 5 and 2E6. COS cells are expressed as pEF-BOS / muIL-1R AcP or pEF- Transfection by electroporation with either BOS (mock) (mock) Was detected. The transfected cells were prepared as described in Example 8. [³⁵S] Met metabolically labeled. Labeled transfected tan Is dissolved in RIPA buffer and described as in 8) Immunoprecipitated with either mAb 4C5 or 2E6 (see Table 2). Both mAbs had pEF-BOS / muIL-1R AcP migrated as a broad band at 70-90 kDa. Of labeled proteins from transfected COS cells I was confused. Labeled protein is mock transfected COS cells were not detected in this size range. Higher molecular weight Species (> 200 kDa) were obtained from mock and muIL-1R AcP transfected C Present in both OS cells. FIG. [Mouse recombinant IL-1R AcP expressed in COS-7 cells¹²⁵ I]-Equilibrium binding of labeled 4C5 and IL-1. IL-1R AcP expression plasmid [ COS (AcP)] or a control plasmid [COS (PEF-BOS)]. Cells (4-8 × 10^Four), 100nM unlabeled 4C5 or 50nM label Of increasing concentrations in the absence (total) or presence (non-specific) of untreated IL-1α [¹²⁵I] -4C5 or [¹²⁵I] -IL-1α and incubated at 4 ° C. for 3 hours Was. Total (total) and non-specific (non-specific) cell-bound radioactivity are described in Example 1. It was decided to be. [¹²⁵I] -4C5 (specific) and [¹²⁵I] -IL-1α ( Specific binding is calculated by subtracting non-specific binding from total binding. Was calculated. Transfected with a control plasmid [COS (PEF-BOS)] To COS cells¹²⁵I] -IL-1α binds COS-7 cells naturally to IL It was shown to express about 600 high affinity binding sites for -1α. Panel on the right Are ligands with a single site model (Munson and Rodbard, Anal, Biochem. .107: 220, 1980; McPherson, J .; Pharmacol. Methods14: 213, 1985) Scatchard's method as determined (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci.51： 66 0, 1949) shows the analysis of the binding data. 12A . [¹²⁵I] COS (AcP) cells incubated with -4C5. 12B. 1 Scatchard plot of 2A data. 12C. [¹²⁵I] -Incube with IL-1α Binding of activated COS (AcP) cells. 12D. Scatchard plot of 12C data. 12 E. FIG. [¹²⁵[COS (PEF-BOS)] cells incubated with [I] -IL-1α Join. 12F. Scatchard plot of 12E data. FIG. To murine recombinant type I IL-1R expressed in COS-7 cells [¹²⁵I]-Equilibrium binding of labeled 35F5 and IL-1. Type I IL-1R expression Cells transfected with the plasmid [COS (Mu-IR-1R)] (4-8 × 1 0^Four) With 100 nM unlabeled 35F5 or 50 nM unlabeled IL-1 of increasing concentrations in the absence (total) or presence (non-specific) of α¹²⁵I] -35F5 or Is [¹²⁵I] -IL-1α and [¹²⁵I] Incubation with -IL-1β at 4 ° C for 3 hours I did it. Total (total) and non-specific (non-specific) cell-bound radioactivity in Example 1 Determined as described. [¹²⁵I] -35F5 (specific) and [¹²⁵I] -IL Specific binding of IL-1α or IL-1β (specific) subtracts nonspecific binding from total binding. Calculated by calculation. The panel on the right shows a single-site model. Gand (Munson and Rodbard, Anal, Biochem.107: 220, 1980; McPherson, J . Pharmacol.Methods14: 213, 1985), the Scatchard method as determined by (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci.51: 660, 1949) Shows the analysis. 13A. [¹²⁵I] -35F5 [COS (Mu-IR-1 R)] Cell binding. 13B. Scatchard plot of 13A data. 13C. [¹²⁵I] -I Binding of [COS (Mu-IL-1R)] cells incubated with L-1β. 13D. 13 Scatchard plot of C data. 13E. [¹²⁵I] -Incube with IL-1α (COS (Mu -IL-1R)] Cell binding. 13F. Scatchard plot of 13E data. FIG. Construction of a full length cDNA clone of human IL-1R AcP. Clone # 3 and Schematic representation of the structure of the human IL-1R AcP cDNA insert in E. coli and # 6 At the top. Clone # 3 has a 5 'non-coding sequence, ATG start codon. And a significant portion of the coding region. Clone # 6 is the coding region, TGA stop Contains most of the don and 3 'non-coding sequences and overlaps with clone # 3. Claw 846 bp XbaI / BstXI fragment from clone # 3 and approximately 2 from clone # 6 The 700 bp BstXI / XbaI fragment was isolated and as described in Examples 12 and 13. And ligated into the expression vector pEF-BOS. Sufficient length human IL-1R AcP A schematic representation of the resulting cDNA encoding is shown on the bottom. FIG. Nucleotide sequence of human IL-1R AcP. Human IL-1R AcP of sufficient length The nucleotide sequence of the open reading frame in the cDNA (Example 13, FIG. 14) is shown. The upper chain is the coding sequence [SEQ ID NO: 1]. FIG. Amino acid sequence of human IL-1R AcP. Inversion of nucleotide sequence in FIG. The amino acid sequence of human IL-1R AcP deduced from the translation is shown [SEQ ID NO: 3]. ]. The signal peptide cleavage site is predicted to be after Ala-1, and Ser- This results in the production of a mature protein of 550 amino acids ranging from 1 to Val-550. Push The Transmen brands that are specified range from Leu-340 to Leu-363. FIG. Induction of IL-6 production in MRC-5 cells; IL-1 receptor antagonist Inhibition by strike and anti-type I IL-1 receptor antibody 4C1. Human fetal lung fiber Fibroblast MRC-5 cells (5 × 10^FourCells; 24-well cells containing ATCC (CCL-171) Star dish (No.3524; Cost) ar) was placed in a humidified incubator at 37 ° C for 24 hours. 24 hours later, fine Vesicles with increasing concentrations of IL-1 receptor antagonist (IL-1RA; 10^-2~Ten^ThreepM ) Or anti-type I IL-1 receptor antibody 4C1 (10^-Four~Ten¹μg / ml) Pretreatment was carried out at 37 ° C. for 1 hour or none. 1 hour At the end of the reaction, 5 pM or 100 pM of human IL-1β is added and the Continued cubification. At the end of the incubation, 100 μl of cell supernatant Was removed from each well and the Quantikine Human IL-6 Assay Kit (R & Systems) for IL-6 concentration. Data is for IL-1β only Secreted from MRC-5 cells in the presence or in the presence of IL-1β and inhibitors Expressed as the concentration of IL-6 (pg / ml). Of IL-6 secretion from MRC-5 cells The effect of increasing concentrations of tumor necrosis factor-α (TNFα) on stimulation was also measured. Was. TNFα is lower than IL-1β in stimulating IL-6 secretion from those cells. Effect (-500-fold), and autocrine of IL-1 by those cells It appeared to be dependent, in part, on secretion. 17A is associated with IL-1β, TNFα and IL-1ra. Shown are data on inhibition due to. 17B shows data for inhibition by mAb 4C1. Data. FIG. Nucleotide sequence of soluble human IL-1R AcP. The soluble human IL-1R The nucleotide sequence of the AcP cDNA is shown. The upper strand is the coding sequence [SEQ ID NO: 9]. FIG. Amino acid sequence of soluble human IL-1R AcP. Nucleotide sequence in FIG. 18 Amino acid sequence of soluble human IL-1R AcP deduced from sequence translation is shown [SEQ ID NO: 9]. The present invention relates to IL-1R AcP (IL-1R AcP), an active fragment of IL-1R AcP. (Ie, bind to the IL-1 receptor or, on the other hand, Can inhibit the ability of IL-1 to activate its receptor), especially The present invention is directed to an isolated polynucleotide encoding a human or murine IL-1R AcP. It is. An example of such a polynucleotide is a DNA polynucleotide having the sequence [SEQ ID NO: 1]. Human IL-1R AcP having a nucleotide and amino acid sequence [SEQ ID NO: 3] It is a DNA polynucleotide that encodes. The polynucleotide of the present invention includes the following As such, it can be used as an intermediate to produce the protein IL-1R AcP. This protein is useful in treating conditions associated with IL-1 inflammatory activity. The polynucleotide is used per se for processing by known antisense methods. obtain. The present invention also relates to an isolated IL-1 receptor accessory having no other proteins. Sally protein (IL-1R AcP) or isolated activity flag of IL-1R AcP Is also directed to The IL-1R AcP of the present invention binds to the IL-1 receptor Or, on the other hand, a protein that inhibits the ability of IL-1 to activate its receptor Quality or active fragment. A method for obtaining human IL-1R using the following compounds as intermediates is described in the present invention. Part of the description: Polynucleotide encoding murine IL-1R AcP, murine IL -1R AcP, antibodies to murine IL-1R AcP, and encoding human IL-1R AcP Polynucleotide. From the polynucleotide encoding human IL-1R AcP, Soluble human IL-1R AcP and its antibodies are obtained. Definitive first for the present invention Intermediate is the isolation of a mAb for the murine IL-1R accessory protein . These mAbs were solubilized and cross-linked from murine 70Z / 2 pre-B cells. Obtained by immunization with a partially purified preparation of the IL-1α / IL-1R complex. (Described in Example 1). The use of cross-linked ligand-receptor complexes has been Very appropriate Met. Because accessory proteins interact in such a complex Because it can only be purified as a result of Next, one of those mAbs (4C5) Was used to isolate the cDNA encoding the murine IL-1R AcP. This mouse The mi cDNA was used to obtain a partial genomic clone of the human homolog. next, Probes derived from the partial genomic clone are sufficient for human IL-1R AcP. Was used to isolate cDNAs of sufficient length. As used herein, "polynucleotide" means substantially pure In the form, i.e. without contaminating endogenous substances, and by standard methods. Identification of sequences and their component nucleotide sequences using, for example, cloning vectors DNA or DNA isolated at least once in an amount or concentration that allows manipulation and recovery As a component of a larger DNA or RNA construct or from a different source derived from RNA An isolated DNA or RNA polymer in the form of a child. Such an arrangement is Preferably, internal untranslated sequences or introns, typically present in eukaryotic genes. It is provided in the form of a more uninterrupted reading frame. However, It will be clear that genomic DNA containing the appropriate sequence can also be used. Untranslated The DNA sequence may be 5 'or 3' to the reading frame. Wherein the sequence does not interfere with the manipulation or expression of the coding region. The nucleotides, eg, DNA, may be one or more of the above identified DNA Those containing sequences and under stringent hybridization conditions (T. Maniatis et al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1982), pp. 387-389), those that hybridize to DNA sequences. The sequence of An example of one such stringent hybridization condition is: Hybridization in 4 × SSC at 65 ° C., followed by 65 ° C. in 0.1 × SSC One hour of washing. On the other hand, typical stringent hybridization conditions The case is 42 ° C. in 50% formamide, 4 × SSC. Hybridize to the sequence for IL-1R AcP under moderate hybridization conditions Of IL-1R AcP peptides that soy and have the biological properties of IL-1R AcP Polynucleotides encoding expression for the same are also novel IL-1R AcP polynucleotides. Encodes leotide. Examples of such non-stringent conditions are 4 × SSC at 50 ° C., or Hybridization with 30-40% formamide at 42 ° C. Further Hybridization conditions are mentioned in Example 11. For example, significant homology Sites, such as sites of glycosylation or disulfide bonding, are IL-1R AcP Proteins sharing the sequence and having one or more of the biological properties of IL-1R AcP The DNA sequence encoding the protein may be such that the DNA sequence is strictly a IL-1R AcP sequence. Specifically encodes an IL-1R AcP polynucleotide without hybridizing You. The polynucleotides of the present invention express murine cDNA in eukaryotic cells, and Screening cell surface proteins using the assay described in Example 7. And as described in Examples 7-13. Immunoreactive with mAb 4C5 A murine cDNA clone that results in expression of the protein has been identified. This cDNA clone Was used to obtain homologous human genomic clones. In short, Human genomic DNA was the intermediate murine IL-1 obtained from the mouse cells in Example 7. Screened with R AcP probe. Clones were isolated as described And sequenced. Next, some human genomic clones were Screen rally And the clone encodes human IL-1R AcP To obtain a full-length polynucleotide of the present invention, isolate as described And sequenced. A particular polynucleotide of the invention has the sequence [SEQ ID NO: 1]. Of the present invention Another polynucleotide is a human IL- having the amino acid sequence [SEQ ID NO: 3]. Encodes 1R AcP. Amino acid sequence of IL-1R AcP, or especially [SEQ ID NO: 3] Any polynucleotide capable of encoding is also part of the present invention. Another polynucleotide of the invention has the sequence [SEQ ID NO: 4]. A polynucleotide encoding an active fragment of IL-1R AcP is also provided by the present invention. Part of the Ming. Such polynucleotides are expressed by conventional methods Produces a protein that blocks IL-1 activity in the IL-1 assay described below. Fragments of the polynucleotides provided above (known methods, eg, Fragmented by restriction digestion or cleavage). Soluble IL-1R AcP The polynucleotide to be loaded is a preferred fragment of the present invention. Like that An example of a suitable polynucleotide has the sequence [SEQ ID NO: 7]. The polynucleotide encoding IL-1R AcP and the active fragment thereof are IL-R It is useful as an intermediate for obtaining -1R AcP and its active fragment. Sa In addition, those polynucleotides have antisense that block the production of IL-1R AcP. It is useful as a medical treatment. Antisense treatment is available from Akhtar and Ivinson, Nature G Enetics 4: 215, 1993. RNA or DNA poly Nucleotides are both useful for them. [SEQ ID NO: 1] or this Antisense polynucleotides that are complementary to a fragment of the sequence Part of the invention. Such a polynucus Reotide can be produced by known methods, such as DNA or RNA, to generate complementary sequences. Obtained by a synthetic method. Therefore, under appropriate stringent conditions known in the art Can hybridize to DNA or RNA encoding IL-1R AcP, The present invention, when so hybridized, interferes with the synthesis of IL-1R AcP. Any sequences from the disclosed polynucleotides are part of the present invention. The present invention provides a method as described herein which encodes an IL-1R AcP or active fragment. And a vector containing the polynucleotide to be prepared. Known in the industry Any vector, such as plasmids, phagemids, will Sub-vectors, cosmids and other vectors can be used in the present invention. Said Polynucleotides may be produced by methods well known in the recombinant DNA technology art. Inserted into the vector. Expression vectors are a particular example of a vector. As used herein, “expression vector” refers to (1) gene expression Elements having a regulatory role in, such as promoters or enhancers (2) a structure or coding sequence transcribed into mRNA and translated into a protein; And (3) a transcription comprising an assembly of appropriate transcription and translation initiation and termination sequences. A vector, eg, a plasmid, comprising a transcription unit is meant. Various eukaryotic expressions Structural elements intended for use in the system include translated proteins by the host cell. Includes a signal sequence that allows extracellular secretion of the protein. On the other hand, recombinant tamper When the protein is expressed without a signal or trafficking sequence, it is It may include an onine residue. This residue may provide the final product To do so, it can be subsequently cleaved from the expressed recombinant protein. Polynucleases of the invention expressing IL-1R AcP or active fragments Host cells containing an expression vector containing a nucleotide are also part of the present invention. Po A oligonucleotide is a vector that contains a transcription regulatory sequence to form an expression vector. Inserted inside. Next, those expression vectors are used for transfection, infection, Inserted into host cells by electroporation or other well-known methods. It is. Such a host cell contains the protein from the expression vector inserted therein. Can be generated. Other host cells, such as yeast, Chinese hamster Ovarian cells, bacterial cells can be used with a suitable expression vector. As indicated above, the present invention also relates to isolated proteins without other proteins. IL-1 receptor accessory protein (IL-1R AcP) or its active protein Also aimed at ragments. The IL-1R AcP of the present invention is an IL-1 receptor, Binds to the type I IL-1 receptor or activates the receptor on the other hand A protein or active fragment that inhibits the ability of IL-1. Human IL- Inhibition of 1 receptor activation is achieved by human IL-1R AcP or active fragments. It is achieved and has various effects, especially the effect of reducing inflammation. Therefore, IL-1 R AcP or active fragment inhibits IL-1 activation in cells and Thereby, it is possible to reduce or alleviate the symptoms associated with inflammation. Activating fragments of IL-1R AcP are used to obtain protein fragments. Obtained by conventional methods. For example, by subjecting the DNA of the present invention to restriction digestion or cleavage. Fragmentation and conventional methods to provide fragments of IL-1R AcPP It can be more expressed in host cells. The active fragment of the present invention comprises the following IL-1 Determined by screening for activity using the assay. Soluble IL-1R AcP is a protein whose deletion of the COOH-terminal sequence An IL-1R AcP fragment of the invention that results in secretion of protein. Its soluble Sex IL-1R AcP corresponds to all or part of the extracellular region of IL-1R AcPP. Methods for elucidating the COOH terminus and extracellular region of proteins are well known . The resulting protein is preferably IL-1 or Type I and Type II Retains its ability to interact with IL-1R. A particularly preferred sequence is IL-1R A The transmembrane region of cP and the intracellular domain make it an accessory in the medium Includes sequences that have been deleted or replaced to promote secretion of the protein . Soluble IL-1R AcP can also be produced under conditions where the soluble IL-1R AcP can be secreted. , A portion of the transmembrane region. Soluble IL-1R AcP Is obtained as described in Examples 14 and 15. Particular Soluble IL-1R of the Invention AcP has the sequence [SEQ ID NO: 9]. A preferred example of IL-1R AcP has the amino acid sequence [SEQ ID NO: 3]. cDNA distribution The amino acid sequence of IL-1R AcP deduced from the sequence [SEQ ID NO: 1] is shown in FIG. . Any of the IL-1R AcPs that affect IL-1 binding as described above, e.g. Analogs having the sequence of SEQ ID NO: 3 are encompassed by the present invention, wherein 1 Or the plurality of side groups are linked by a compound such as polyethylene glycol, or Fusion proteins (with other protein sequences, eg, immunoglobulin sequences), For example or otherwise, its activity is maintained or enhanced by any denaturation It has been denatured in a known manner by incorporation into a protein that has been modified. IL− Inhibit IL-1 binding to the 1 receptor and, in particular, use known techniques, e.g. One or more amino acids added, deleted or substituted by site mutagenesis Proteins having substantially the sequence of amino acids [SEQ ID NO: 3] are also included. . The change in the amino acid is determined by its activity or Isolation of a protein as an IL-1R AcP with all or some of its enhanced activity Limited to maintain oneness, and preserved. Determine IL-1 inhibitory activity The means for this is described in Examples 5, 6, 16 and this inhibition is Inhibition of IL-1 binding to putter, inhibition of lymphocyte proliferation or kappa light chain expression, and IL -1 induced reduction of IL-6 expression. Isolated IL-1R AcP without other proteins codes for IL-1R AcP. Obtained from the polynucleotide of the present invention. For example, IL-1R AcP is Polynucleotides Provided by the Invention Encoding -1R AcP, preferably Sequences Expressing the DNA of No. 1 or 7 in a host cell and obtaining the resulting protein Can be obtained by conventional methods for isolating Immediately after IL-1R AcP was obtained, the The protein can be isolated free of other proteins by conventional methods. These methods can be performed using the antibody purification or antibody affinity column of the present invention, ion exchange or Means chromatography on a gel filtration column, high-performance liquid chromatography And purification on an IL-1 affinity column. However, the present invention is not limited to this. IL-1R AcP binds polyalkylene glycol polymer by known methods Can be stabilized. Polyalkylene glycol is polyethylene Glycol and other branched or unbranched polyalkylene polymers. Include. The polymer can be directly attached to the protein, or Lysine NH_TwoTo the COOH of the polymer. The IL-1R AcP of the present invention can be used directly in therapy to bind or scavenge IL-1. To modulate and prevent the inflammatory or immunological activity of IL-1 Provide the means for Pathological response In its use for preventing or reversing soluble IL-1R AcP or its Antibodies to IL-1R AcP may be used as other cytokine antagonists, such as IL-2 Receptor, soluble TNF receptor, IL-1 receptor antagonist, soluble It can be combined with antibodies to the IL-1 receptor and the like. further The isolated IL-1R AcP of the present invention is useful in therapy as an IL. Useful for raising antibodies to -1R AcP. Give rise to such antibodies Is that the present invention makes available IL-1R AcP in sufficient quantities for antibody production. To be executable. Accordingly, the present invention is also directed to antibodies against human IL-1R AcP. Human A murine or rat monoclonal antibody against IL-1R AcP was obtained as in Example 15. It can be obtained. These antibodies are fully or soluble using the DNA of the present invention. Purified or partially purified obtained after expression of recombinant human IL-1R AcP Obtained by immunization with an amount of human IL-1R AcP. The DNA of human IL-1R AcP is Murine IL of the present invention isolated by the unique mAb 4C5 described in Examples 2 and 3. It was isolated using -1R AcP DNA. Rat or rat against human IL-1R AcP With respect to the mAbs, hybridoma techniques well known in the art It can be used to obtain hybridomas for producing mAbs. Chimeric antibodies And humanized antibodies can be prepared by known methods (Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2663, 1991; WO 90/7861, EP 620276) or heterodimer (hetero dim). eric) Bispecific antibodies (Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547, 1). 992) can be obtained from their rodent antibodies. The antibody against human IL-1R AcP of the present invention specifically binds to human IL-1R AcP. And activation of the IL-1 receptor complex by IL-1 Hinder sex. This activity can be determined by the assays described herein. . In particular, biological assays may be used to determine the proliferation of IL-1-responsive cells or prostaglandins. Gin E_TwoAnd the ability of antibodies to inhibit IL-1-induced secretion of IL-6. Including clean. Such assays are compatible with traditional methods in cell biology. Can be implemented more. Suitable cells for those assays include spleen B cells, cells Systems such as the human B cell line RPMI 1788 (Vandenabeele et al., J. Immunol. Meth. 1 35:25, 1990), and human fibroblasts, such as the human lung fibroblast cell line MRC-5 (C hin and others. Exp. Med. 165: 70, 1987). Using mouse cells Methods for such assays are found in Examples 1, 2, 5, and 6. For example Measures the inhibition of IL-1-induced IL-6 production in miceIn vivoAsse A can be used. Those assays are desired using the same techniques provided in the examples. Can be performed using human cells to screen effectively for . Preferred antibodies are prepared by conventional methods (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci.51: 660, 1 949), as determined by_D 0.1nM-K_D10 nM IL-1 receptor assist Has binding affinity for the complex. The antibodies of the present invention may be used to reduce the symptoms caused by the presence of IL-1. It can be administered by known methods. In particular, the antibodies of the present invention are useful in reducing inflammation. And useful. Those antibodies against IL-1R AcP are, for example, in humans. It can be administered to suppress an inflammatory or immune response. Inflammatory processes (eg rheumatism) Osteoarthritis, inflammatory bowel disease and septic shock) or by an immune response (eg, , Type I diabetes, transplant rejection, psoriasis and asthma) Or the condition is associated with elevated levels of IL-1 (Dinarello and Wolft , New Engl. J. Med. 328: 106, 1993) . Therefore, treatment with an antibody that inhibits the interaction of IL-1 with IL-1R AcP is abrupt. Sexual or chronic diseases such as rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, and type I diabetes Can be used to effectively suppress inflammation or immune response in clinical treatment . In addition, antibodies are useful in the treatment of certain cancers, such as acute and chronic myeloid leukemia. (Rambaldi et al., Blood 78: 3248, 1991; Estrov et al., Blood 78. 1476, 1991). Antibodies against murine IL-1R AcP, especially 4C5, 2B5, 3F1, 4C4, 24C5, 4D4 (Table 1), and 1D2, 2D6, 2E6, 1F6, 2D4, 2F6, 3F5 and 4A1 (see Table 2). ) Are encompassed by the present invention. These antibodies, as described, It is useful for obtaining IL-1R AcP. As noted above, antibodies can be produced naturally by appropriate cells, or For example, humanizing an antibody with a recombinant expression vector that denatures proteins (Browin et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88: 2663, 1991) or Recognize both sesaly proteins and type I or type II IL-1R Heterodimer bispecific antibodies (Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547) , 1992; WO90 / 7861, EP620276). An antibody against IL-1R AcP and a fragment thereof, or IL-1R AcP, or Dosage ranges for administration of antisense polynucleotides will not involve undue experimentation. And can be determined by those skilled in the art. In general, the appropriate dose will depend on the desired effect, For example, the effect of inhibiting the activity of endogenous IL-1 on cells responsive to IL-1 A dose that is sufficient to produce. The dose depends on the opposite side effect, for example Causing unwanted cross-linking reactions, hypersensitivity reactions and the like Should not be quantity. Generally, the dose will depend on the age, medical condition, gender and disease of the patient. Degree, counter-indication, immune tolerance if present, and individual Will vary with other such variables to be adjusted by the physician. IL-1 R AcP and its fragments, or antibodies or antisense to this protein The polynucleotide may be non-transfused by injection or by gradual perfusion over time. It can be administered orally. They can be administered intravenously, intraperitoneally, intramuscularly or subcutaneously. The present invention relates to a protein of the present invention and / or an effective amount for reducing inflammation. Antibodies, and pharmaceutically acceptable carriers, such as the following preparations and vehicles And a pharmaceutical composition comprising: Such compositions may optionally include other activities. May be included. For proteins, an example of an effective amount is about 4 ~ 32mg / m^TwoExists in the range. For antibodies, an example of an effective amount is about 0.1 It is present in the range from about 15 mg / kg body weight. Preparations for parenteral administration may be sterile or aqueous or non-aqueous solutions, suspensions And emulsions. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, poly Ethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic For example, ethyl oleate. Aqueous carrier is water, alcohol / water Solutions, emulsions or suspensions include, for example, salt solutions and buffered media. Non-tradition Mouth vehicle is sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose , And sodium chloride, lactated Ringer's solution, or fixed oils. Intravenous bi Vehicles are fluid and nutrient supplements, electrolyte supplements such as Ringer's Dextrose Includes supplements based on biomass, and the like. Preservatives and other additives; even if Antibacterial agents, antioxidants, chelating agents, inert gases and the like may also be present. can do. Generally, Remington's Pharmacentical Scinece, 16th E d., Mack Eds., 1980. The following examples are provided to further illustrate the invention and limit the invention. Not something.Example 1 Method Preparation, screening and purification of hybridoma antibodies Lewis rats (Charles River Laboratories) were cultured with murine 70Z / 3 pre-B cells. Human IL-1α (Gubler) that has been affinity cross-linked to IL-1R from vesicles (ATCC @ TIB 158). Etc., J. Immunol. 136: 2492, 1986). Immunization was by the intracavitary (ip) tract. 1 × 10 for primary immunization¹¹70Z / From three cells (Chizzonite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8029, 1989). Prepared and purified and milked in complete Freund's adjuvant in a 1: 2 ratio IL-1α / IL-1R complex (0.4 ml) To rats. p injections (as described below). After 6 weeks, 2.25 × 10¹¹Individual cells And purified and purified in complete Freund's adjuvant at a ratio of 1: 2 The IL-1α / IL-1R complex (0.3 ml) emulsified and dissolved in Individual hind leg pads and i. p. Was injected. Serum was added 2 and after the last immunization At 6 weeks, they were harvested from rats and [IL to R-IR on 70Z / 3 cells.¹²⁵I] -IL- The activity of blocking 1β binding was tested. 4 months after the last immunization, 1 One rat was used in preparation for spleen cell isolation in the following amounts of dissolved IL-1 Immunized with β / IL-1R complex: 1: 4 in complete Freund's adjuvant Subcutaneous (SC) injection into each hind leg and individual hind leg 0.1ml (8 × 10^TenPrepared from individual cells Purified), and intravenously (iv) and i.v. p. 0.9 ml to be injected (7.4 × 10¹¹Prepared and purified from 70Z / 3 cells). 2 days later, phosphoric acid release IL-1α / IL- mixed with a buffer solution (PBS), pH 4 (0.5 ml) and dissolved. 1R complex (0.5 ml; 2 × 10^TenPrepared from 70Z / 3 cells and purified ) On the individual hind legs of the rat. c. Immunized by injection. This last Two days after immunization, spleen cells were isolated from rats and published according to published methods (Fazekas Etc., J. Immunol. Meth. 35: 1, 1980), 35% polyethylene glycol (PEG 4000, E. Merck) at a ratio of 1: 1 (spleen cells: SP2 / O cells) , SP2 / O cells. The fused cells were treated with 15% FBS, glutamine (2 mM), β-mercaptoethanol (0.1 mM), gentamicin (50 μg / ml) , HEPES (10 mM), 5% ORIGIN hybridoma cloning factor (IGEN, Inc.) 5% P388D1 supernatant (Nordon et al., J. Immunol. 139: 813, 1987) and 100% 48 wells containing IMDM supplemented with units / ml of recombinant human IL-6 (Genzyme) 3 × 10^FivePlated at a density of cells / well / ml. Hybridoma supernatants were used in the following four assays for IL-1R AcP and Screen for specific inhibitory and non-inhibitory antibodies to ip II IL-1R 1) For inhibitory antibodies: [70 Z / 3 and EL-4 on thymoma cells¹²⁵I] -Inhibition of IL-1β binding (described below), 2) For non-inhibitory antibodies: Thailand II IL-1R [¹²⁵I] -Immunoprecipitation of the dissolved complex of IL-1β 3) About specific inhibitory antibodies against IL-1R AcP or type II IL-1R T: to cells expressing recombinant type I and type II IL-1R [¹²⁵I] -IL -1β and [¹²⁵I] -IL-1α binding inhibition and 4) IL-1 specific Eliminate any antibodies for:〔¹²⁵I] -IL-1α and [¹²⁵I] -Immunoprecipitation of IL-1β. Type II IL Cell line secreting antibodies specific to IL-1R and IL-1R AcP Was cloned by limiting dilution. Antibodies can be prepared by the manufacturer's method (Pharmacia). Therefore, the affluence on protein G bound to Sepharose 4B fast flow From large-scale hybridoma cultures or ascites by affinity chromatography Purified. Cultured cells and biological assays Mouse EL-4. IL-2 thymoma cells (TIB181) and D10. G4.1 (TIB224) cells (Kilian et al., J. Immunol. 136: 1, 1986). Ma Mouse 3T3L1 (CL173) and 70Z / 3 pre-B (TIB158) cells^TwoThe smell of the dish And maintained in IMDM containing 5% fetal calf serum. The cells are from American Tyse Obtained from the Culture Collection, and the ATCC number is listed in parentheses. Unlabeled IL-1 and [¹²⁵I] -Biological activity of IL-1 protein By the murine D10 proliferation assay (Kaye et al., J. Exp. Med. 158: 836, 1983). evaluated. ¹²⁵I labeling of IL-1 and purified monoclonal antibodies Recombinant murine IL-1α, human IL-1α and human IL-1β were purified as described above. (Kilian et al., J. Immunol. 136: 1, 1986; Gubler et al., J. Immunol. . 136: 2492, 1986). However, murine IL-1α is 25 mM Tris-HCl, 0.4 M NaCl Prepared in solution. Measure protein using the BCA protein assay (Pierc e Chemical Co., Rockford, IL). Human IL-1α, human IL-1β , Murine IL-1α, murine IL-1β and purified IgG were purified by the Iodogen method (Pierce Chemical Co.)¹²⁵Label by I did. Dissolve Iodogen in chloroform and add 0.05 mg to a 12 x 15 mm borosilicate glass. The tubes were dried. For radioactive labeling, 1.0 mCi of Na [¹²⁵I] (Amersham, Chicago, IL) with 0.05 ml of Tris-iodination buffer (25 mM -HCl, pH 7.5, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA) And incubated for 4 minutes at room temperature. Activated¹²⁵I solution 0.05-0.1 ml IL-1 (5-13 μg) or IgG (100 μl) in squirrel-iodination buffer g) and transferred the reaction to room temperature for 5-8 minutes . At the end of the incubation, add 0.05 ml Iodogen stop buffer (Dulbecco Of 10 mg / ml tyrosine, 10% glycerol in PBS (pH 7.4), and The reaction was allowed for 3 minutes. Next, the mixture is added to 1.0 ml of Tris-iodination buffer. Bio-Gel P10DG desalting column (B ioRad Laboratories). Elute the column with Tris-iodination buffer The fractions containing the peak amount of labeled protein (1 ml) were combined and combined. 1x10 with 1% BSA in Tris-iodination buffer^H Diluted to cpm / ml. TCA precipitable activity (10% TCA final concentration) is typically less than 95% of total activity. Was on. Radiospecific activity is typically less than 20 fmoles of purified antibody. 00-3500 cpm and 3500-4500 cpm per fmol IL-1. Mouse IL-1 receptor binding assay Binding of radiolabeled IL-1 to mouse cells grown in suspension culture Was measured by the method described previously (Kilian et al., J. Immunol. 136: 1, 1986). Specified. Briefly, cells were treated with binding buffer (RPMI-1640, 5% FBS, 25 mM). HEPES, pH 7.4) once, 1.5 × 10⁷Buffer binding to cell density of cells / ml Liquid Suspended, and various concentrations of [¹²⁵I] -IL-1 (5-1000 pM) at 4 ° C Incubated for ~ 4 hours (1.5 x 10⁶Cells). Cell-bound radioactivity 0.1 ml oil mixture (Thomas Silicone Fluid 6428-R15: AH Thomas, and Sili 90 seconds at 4 ° C through cone oil AR200: 1: 2 mixture of Gallard-Schlessingez) While the assay mixture is released by centrifugation at 10,000 xg.¹²⁵I] -IL -1. Cut out the tip containing the cell pellet and release the cells The shooting power was determined by a gamma counter. Non-specific binding to 50 nM Determined by inclusion of unlabeled IL-1. Incubate in duplicate Performed in replicates or triplicates. Receptor binding data was obtained from Elsevier-BIOSOFT By McPherson et al. (MCPherson, J. Pharmacol. Methods 14: 213, 1985). Non-linear return program EBDA as adapted for personal computer , LIGAND and Kinetic (Munson and Rodbard, Anal. Biochem 107: 220, 1980) Was analyzed by using. Binding of radioiodinated IL-1 protein to adherent cells is determined by binding buffer ( 24) at 4 ° C for 4 hours, 24 or 12 well plate on rocker platform This was performed by incubating the cells and ligand on a plate. Next Next, the monolayer is rinsed three times with binding buffer at 4 ° C. and dissolved with 0.5 ml of 1% SDS And released radioactivity was counted by a gamma counter. Non-specific binding Was determined in the presence of 50 nM unlabeled IL-1. Analysis of the combined data This was performed as described above. To murine cells¹²⁵I]-Equilibrium binding of labeled monoclonal antibodies Murine cells are incubated in binding buffer (RPMI 1640, 5% FBS, 25 mM HEPES, pH 7.4). Wash once more and 1.5 × 10⁷Cell density of cells / ml Each time it was resuspended with binding buffer. Cells (1.5 × 10⁶) At various concentrations (0.005-2 nM )of〔¹²⁵I] -incubated with specific IgG at room temperature for 1.5-2 hours. cell The bound radioactivity was increased at 10,000 xg for 90 seconds at 4 ° C through 0.1 ml of silicone oil. The Say mixture is released by centrifugation [¹²⁵I]-minutes from labeled antibody Released. Cut out the tip containing the cell pellet and gun for cell-bound radioactivity. Decided by the counter. Non-specific binding is determined by labeling the assay with 100 nM Determined by the inclusion of unlabeled antibody. Duplicate incubations or Performed in triplicate. Receptor binding data are shown above for IL-1 binding to cells. Analysis was performed as described. For murine cells carrying the type I or type II IL-1 receptor [¹²⁵I Antibody-mediated inhibition of IL-1 binding For murine cells carrying the IL-1 receptor [¹²⁵I] -IL-1 protein The ability of the hybridoma supernatant solution, purified IgG, or antiserum to inhibit binding Measured as follows: culture supernatant, purified IgG or serial dilutions of antiserum In a binding buffer (RPMI-1640, 5% FBS, 25 mM HEPES, pH 7.4) in cells (1.5 × Ten⁶Cells) and mix on an orbital shaker for 1 hour at room temperature. Incubated. [¹²⁵I] -IL-1 (1 × 10^Fivecpm; 25pM) to each tube And incubated at 4 ° C. for 3-4 hours. Non-specific binding to the assay Determined by inclusion of 50 nM unlabeled IL-1. Incubate Performed in duplicate or triplicate. Cell-bound radioactivity, 0.1 m l by centrifugation of the assay mixture through¹²⁵I] -IL-1 Separated from Cut out the tip containing the cell pellet and allow cell-bound radioactivity Was determined by a gamma counter. Dissolved¹²⁵I] Affinity crosslinking and purification of -IL-1α / IL-1R complex Some modifications to the affinity cross-linking of radioiodinated IL-1 receptor to cells As described (Riske et al., J. Biol. Chem. 266: 11245, 1). 991) I did it. In short, cells (1.5 x 10⁷Cells / ml) are combined with binding buffer Radioactively labeled in the presence or absence of 50 nM unlabeled IL-1 in solution. And incubated at 4 ° C for 4 hours with IL-1 (60-300 fmol / ml). next The cells were ice-cooled in PBS, pH 8.3 (25 mM sodium phosphate, pH 8.3, 0.15 M NaC l, 1 mM MgCl_Two) And washed in PBS (pH 8.3)⁶At a concentration of cells / ml Resuspended. In dimethyl sulfoxide, disuccinimidyl suberate (DSS) or Uses bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) (Pierce Chemical Co.) Was added to a final concentration of 0.4 mM. Incubate at 4 ° C under constant agitation For 30-60 minutes. Cells were cooled on ice with 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA solution and lysis buffer (8 mM CHAPS or 1 % Triton X-100, 0.25 M NaCl, 5 mM EDTA, 40 μg / ml Nylmethylsulfonyl fluoride and 0.05% NaN_Three50mM sodium phosphate containing Solution, pH 7.5) at 4 ° C. for 1 hour, 0.5 to 1 × 10⁸Lysed at cells / ml . The detergent extract was centrifuged at 120,000 × g for 1 hour at 4 ° C. to remove nuclei and other residues. The body was removed. Extracts were subjected to SDS-PAGE on 8% pre-cast gels (NOVEX), Subsequent analysis was performed directly by autoradiography. On the other hand, the extract is Immunoprecipitation was performed with an antibody bound to mma-Bind G Plus (Pharmacia). Sinking The extracted proteins were transferred to a Laemmli sample buffer (Laemmli, Nature 227: 680, 1). 970) and separated by SDS-PAGE. And analyzed by autoradiography. Preparation of dissolved, cross-linked conjugate of IL-1α / IL-1R used as immunogen Was performed as described above, with some modifications. In short, 70Z / 3 cells (0.5-1.0 × 10⁸Cells / ml) at 4 ° C. in binding assay buffer. Incubated with IL-1α (0.5-1.0 nM) for 4 hours. Next, cool the cells with ice Washed with PBS, pH 8.3, 5 × 10 5 in PBS (pH 8.3)⁷Concentration of cells / ml And resuspended in bis (sulfosuccinimidyl) in dimethyl sulfoxide Suberate (BS3) (Pierce Chemical Co.) was added to a final concentration of 0.4 mM. I Incubation was continued at 4 ° C. for 30-60 minutes under constant stirring. Affinity crosslinking The process and quenching of the detergent enablement of the cells was as described above. For purification of lysed IL-1α / IL-1R complex used as immunogen The detergent extract of 70Z / 3 cells was added to cross-linked bead agarose (Afti -Affinity of goat anti-human IL-1α immobilized on Gel 10, BioRad Laboratories) Apply to column (10 ml). The goat anti-human IL-1α affinity column was manufactured by It was prepared according to the manufacturer's instructions at a density of 1 mg IgG / ml packed gel. After application of the detergent extract, the column was washed with Chaps or Triton X-100. Wash with 10 column volumes of fresh solubilization buffer or absorbance at 280 nM is at baseline Washed until it did. The column was then charged with 3M potassium thiocyanate, 25 mM sodium phosphate, pH 7.5, 5 mM EDTA, 40 μg / ml phenylmethyls Rufonyl fluoride and 0.05% NaN_ThreeEluted with the solution. From the affinity column Eluted protein was concentrated 10-100 fold and used for immunization . Immunoblot analysis of lysed proteins from murine cells Murine 70Z / 3 and EL-4 cells were washed three times with ice-cold PBS, and Either 8 mM CHAPS or 1% Triton X-100 and 1 mg / ml BSA. 0.5 to 1 x 10 in the solubilization buffer containing⁸Lysed at 4 ° C. for 1 hour at 4 cells / ml Was. Extracts are centrifuged at 120,000 xg for 45 minutes at 4 ° C to remove nuclei and other debris did. The extract was purified from 4C5 (anti-IL-1R AcP obtained as described in Example 2). ), 12A6 (Chizzonite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86: 8029, 1989 Anti-type I IL-1R obtained as described) or cross-linked agar Binds to protein-G immobilized on loin (Gamma Bind G Plus, Pharmacia) Incubated with any of the control antibodies given. The precipitated protein , Released by treatment with 0.1 M glycine (pH 2.3), neutralized with 3 M Tris , Mix with 1/5 volume of 5 × Laemmli sample buffer and 8% rake Separation by SDS / PAGE on cast acrylamide gel (NOVEX). Its separated The isolated protein was converted to 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 76.8 mM glycine, 20% Nitrocellulose membranes (0.2 μM). The nitrocellulose membrane is applied to BLOTTO (PBS + 0.05% Tween 20). Medium, 50% (w / v) skim dry milk) and block With and without unlabeled 4C5 IgG (67 nM)¹ ^{twenty five} I] -4C5 IgG (8 mM CHAPS, PBS, 0.25 M NaCl, 10% BSA and 5 mM EDTA Medium 1 × 10⁶cpm / ml). Murine recombinant type I and type II IL-1 receptors in COS cells and Expression of IL-1R AcP, and [¹²⁵I] -labeled 4C5, 35F5 and IL-1 binding Decision COS cells (4-5 × 10⁷) According to the manufacturer's instructions Recombinant murine IL-1R protein by Rad Gene Pulser (250 μF, 250 volts) By 25 μg of plasmid DNA expressing IL-1R AcP Transfected. Cells, 600 cm^TwoPlate on the culture plate Harvest after 72 hours by treatment with No-Zyme (JRH Biologics) and shaving And washed and resuspended in binding buffer. Transfected cells (4 ~ 8 × 10^Four) At increasing concentrations [¹²⁵I] -labeled 4C5, 35F5 or IL-1 Incubated with protein for 3 hours at 4 ° C. Cell-bound radioactivity Then, free [¹²⁵I]-separated from labeled antibody. Kappa light chain expression by 70Z / 3 cells in response to IL-1: monoclonal antibody Inhibition by 35F5, 4E2 and 4C5 70Z / 3 cells (10% FBS, β-mercaptoethanol and gentamicin) 1 × 10 in refilled RPMI 1640^Five/ Ml) with 100 U / ml (0.19 nM) human 24 hours or 48 hours with and without recombinant IL-1α or IL-1β Incubated. Cells were incubated for 1 hour with a total volume of 0.5 ml for 30 minutes prior to the addition of IL-1. Preincubated with μg / ml of the antibody. Contains only IL-1 or medium An additional 0.5 ml of medium was added to the wells to give a final concentration of antibody of 15 μg / ml (100 nM). Was. Cells were washed once after culture and control rats conjugated with FITC Antibody or rat anti-mouse kappa light chain antibody conjugated by FITC More stained (Tago, Burlingame, CA). Next, the cells are subjected to FACScan flow cell measurement. Kappa light chain expression was analyzed on a total (Becton-Dickinson). Proliferation of murine spleen B cells in response to IL-1: monoclonal antibodies 35F5, 4C5 And 4E2 inhibition Spleen B cells were isolated from spleen cells isolated from C57BL / 6 mice. Treatment with Thy 1.2 antibody and rabbit complement followed by Sephadex G10 (Pharmacia) Purified by two successive passes through the ram. B cells (5 × 10^FiveIndividual cells ) Was supplemented with 10% FBS, β-mercaptoethanol and gentamicin. In a final volume of 200 μl of RPMI 1640 medium, goat anti-mouse IgM (1 μg / ml) (Z YMED) and dibutyryl cAMP (10^-3M). Spleen B cells were converted to IL-1 ( 100 U / ml) and without, and antibodies 35F5, 4C5 and 4E2 And without it. Cells were incubated for 2 days in the presence of various reagents. Cubate, and then pulsed with 0.5 μCi of tritiated thymidine. And incubated for an additional 6 hours and harvested. Murine D10 in response to IL-1. G4.1 Cell Proliferation: Monoclonal Antibody 4C5 And 35F5, and inhibition by human IL-1ra D10. G4.1 helper T cells were maintained as described (Kaye et al., J. Exp. . Med. 158: 836, 1983; Mclntyre et al., J. Am. Exp. Med. 173: 931, 1991) Stimulated with IL-1 as previously described (McIntyre et al., J. Exp. Me d. 173: 931, 1991). Cells (1 × 10 5 in 200 μl)^Five5% FBS, β-mel Captoethanol (5 × 10^-FiveM), gentamicin (8 μg / ml), 2 mM L- Glutamine, 2.5 μg / ml Concanavalin A and antibody or human I at the indicated concentrations 0.2 pM in RPMI 1640 containing L-1 receptor antagonist (IL-1ra) Of IL-1. The culture was incubated for 2 days and Pulse with 5 μCi of tritiated thymidine and harvest after 16 hours Was. In vivo induction of serum IL-6 by IL-1: monoclonal antibodies 35F5 and 4C5 Inhibition by Induction of serum IL-6 by IL-1 was performed as described above ( McIntyre and others. Exp. Med. 173: 931, 1991). In short, C57BL / 6 Mice were treated with IL-1α or IL-1β (0.3 μg / mouse, sc) for 4 hours. And 10 minutes before, it was pre-treated (ip) with 250 μg of antibody. Serum was injected with IL-1 Two hours after administration, they are collected from mice and B9 hybridas described. The IL-6 concentration was analyzed by a modification of the mammary cell bioassay (Aarden et al., Eur. J. Immunol. 17: 1411, 1987). Rat anti-mouse IL-1 accessory protein monoclonal antibody 4C5, Prepared, characterized and produced as follows:Example 2 Preparation and characterization of monoclonal antibodies against IL-1R AcP and type II IL-1R And identification During preparation of antibodies to the type II IL-1 receptor, IL-1 receptor complex Antibodies were detected against novel components of the body that could not be predicted. Rat 70Z / 3 cells are in Thailand Lysed from those cells because it almost exclusively expresses Immunization of rats with purified and cross-linked IL-1α / IL-1R complex Clonal Antibodies-Early Procedures Performed to Develop Type II IL-1R Antibodies Met. Rat immunized with this dissolved IL-1α / IL-1R complex Is to 70Z / 3¹²⁵I] -Generating a serum antibody that blocks the binding of IL-1β , Which suggests the presence of a blocking antibody specific for type II IL-1R I do. Serum samples were also lysed from 70Z / 3 cells [¹²⁵I] -IL-1β Also contains an antibody immunoprecipitated with the / IL-1R complex, which is a non-blocking anti- Indicates the presence of a type II IL-1R antibody. [¹²⁵I] -IL-1β is converted to type II IL to eliminate identification of antibodies specific for IL-1α instead of receptor For -1R binding and immunoprecipitation assays Used for Hybridomas resulting from fusion of spleen cells isolated from immunized rats Were compared to 70Z / 3 (producing type II receptor) and EL-4 (type I receptor) Screen for antibodies that block IL-1β binding to both of the cells did. Antibodies that block binding only to 70Z / 3 cells have been identified and Since it is an antibody to type II IL-1R, it is excluded from further analysis and Antibodies that block binding only to EL-4 cells, and As an antibody to IIL-1R, it was excluded from further analysis. Both cells Antibodies that block IL-1 binding to ip are specific for IL-1R AcP . Seven antibodies blocking IL-1β binding to 70Z / 3 cells from the initial fusion (Table 1). Six of these antibodies (2B5, 4C5, 3F1, 4C4, 24C5, And 4D4) blocked binding of IL-1β to both 70Z / 3 and EL-4 cells. Those Was used to express IL-1β to CHO cells expressing murine recombinant type I IL-1R. It did not block binding and was therefore specific for IL-1R AcP. One The antibody, 4E2, blocks only the binding of IL-1β to 70Z / 3 cells, It indicates that it is specific for type II IL-1R. The initial fusion is also specific for either IL-1R AcP or type II IL-1R. Screening was also done for non-blocking antibodies that are foreign. 8 kinds of antibodies (1D2, 2D6, 2 E6, 1F6, 2D4, 2F6, 3F5 and 4A1) are IL-1β / IL lysed from 70Z / 3 cells The -1R complex was immunoprecipitated (Table 2). These antibodies are also available from two other IL-lysed from the murine cell lines producing Ip II IL-1R, AMJ2C11 and P388D1 The 1β / IL-1R complex was immunoprecipitated. Of those antibodies Seven antibodies immunoprecipitate the IL-1β / IL-1R complex lysed from EL-4 cells This indicates that they recognize IL-1R AcP. One antibody 1F6 is EL -4 cells do not bind to the lysed IL-1β / IL-1R complex, which indicates that It suggests that it is a blocking type II IL-1R antibody. Those antibodies are the type To make sure that they do not bind to IL-1R, Tested in an immunoprecipitation assay with PIL-1R (Table 2). Them All of the antibodies were soluble recombinant type I IL-1R ([[¹²⁵I] -sMsR [bv]) Cross-linked [¹²⁵I] -IL-1β complex was not immunoprecipitated. Those Can also be used in baculovirus / insect cell expression systems or COS cell expression systems. Generated in either¹²⁵I] -Labeled soluble type I receptor Was not immunoprecipitated. Rats were immunized with the lysed IL-1β / IL-1R complex, so that IL- Antibodies in rat serum that recognize 1α were also detected. Individual monochrome Null antibodies were used to confirm that they did not bind to IL-1 [¹²⁵I] In immunoprecipitation assays with labeled murine and human IL-1 proteins Tested. All 15 antibodies (Tables 1 and 2) were used in those assays It was negative. Example 3 Anti-type I (35F5), type II (4E2) and accessory protein (4C5) Characterization of murine IL-1R and IL-1R AcP by reactivity with nal antibodies Following initial identification and characterization of the antibody, 4C5, a putative inhibitory IL- 1R AcP (IL-1R AcP) antibody, and 4E2, ie, blocking type II IL-1R Antibodies were selected as probes for further study of IL-1R AcP. Same in front A defined and characterized anti-type I IL-1R antibody 35F5 was also used in this study. (Chizzonite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8029, 1989). McIntyre et al., J .; Exp. Med. 173: 931, 1991). Using these three antibodies, type I and type II on various murine cells The presence of IL-1R and IL-1R AcP was identified. [¹²⁵I]-labeled mAb 4 Equilibrium binding assays with C5 are mainly based on type I (EL-4 cells) or type II (70 Z / 3 cells) shows the presence of IL-1R AcP on murine cells carrying the receptor (FIGS. 1 and 2). Type I (3T3L1 cell) or Type II (P388D1 cell) receptor Other cells that predominantly also carry IL-1R AcP also (Table 3). Thailand Cells that do not express either Ip-1 or type II IL-1R AcP (S49.1) It does not express 1R AcP, indicating a linkage between IL-1R and IL-1R AcP expression. During its initial characterization, mAb 4C5 was released to both EL-4 and 70Z / 3 cells [¹²⁵I -The binding of human IL-1β was blocked. Further studies indicate that mAb 4C5 also 70Z / 3 cells of labeled human IL-1α (FIG. 3), murine IL-1α and IL-1β It was established that binding to vesicles was inhibited (Table 4). However, 4C5 is EL-4 Radiolabeled human IL-1α to cells (FIG. 4) or murine IL-1α (Table 4) Do not block any combination of Was. In addition, 4C5 expresses murine recombinant type I or type II receptors. CHO or COS cells¹²⁵I]-inhibits binding of labeled IL-1 protein Did not stop. Anti-type I receptor antibodies, ie, 35F5 and anti-type II Scepter antibodies, i.e., 4E2, are antibodies whose receptor is either native or recombinant. Whether IL-1α or IL-1β to their respective IL-1 receptors. Inhibition of binding (Table 4). 4C5- of IL-1 binding to EL-4 and 70Z / 3 cells IC for mediated inhibition₅₀Expresses recombinant type I or type II receptors IC for inhibition of cell binding₅₀At least 1000 times lower (Table 5). Those IC₅₀The data suggested two conclusions: D mAb 4C5 was type I or Does not cross-react to any significant degree with type II IL-1R and 2) native IL Of the ability of 4C5 to block the binding of IL-1β (but not IL-1α) to The differences were not related to the affinity of the antibody. Example 4 Determination of the size of IL-1R AcP recognized by monoclonal antibody 4C5 Approximate fraction of cell surface proteins recognized by mAb 4C5 on EL-4 cells Child size determined by affinity chromatography and immunoblot However, it was found to be about 90 kDa (FIG. 5). Surfactant prepared from EL-4 cells The extract of the active agent is applied on the lentin affinity matrix of lentil, -Type I receptor antibody (7E6), murine IL-1α (Ma) or 4C5 affinity -Purified on affinity chromatography on any of the gels. individual The protein eluted from the affinity column is transferred to the Laemmli sample buffer. , Separated by SDS-PAGE on an 8% gel, and nitrocellulose. Transferred to membrane. The protein immobilized on nitrocellulose was¹²⁵I] -4C5 And immunoreactive bands by autoradiography Identified. The major protein of ~ 90 kDa and the minor protein of 55 kDa Immunoreactive with radiolabeled 4C5. These two proteins also , When the EL-4 extract is purified directly on a 4C5 affinity matrix , Also identified on immunoblots. These data are based on native glycosylated The apparent molecular weight of the IL-1R AcP is ~ 90 kDa and the proteolytic process Showed that its size could be reduced to ~ 55 kDa.Example 5 Neutralization of IL-1β biological activity by monoclonal antibody 4C5 The ability of mAb 4C5 to neutralize the biological activity of IL-1β in a dose-dependent manner 1) IL-1 induced proliferation of murine spleen B cells, 2) D10. G4.1 Helper T cell IL- 1) induced proliferation and 3) IL-1-induced kappa light chain in 70Z / 3 cells. Expression. mAb 4C5 shows dose-dependent IL-1β-induced proliferation of spleen B cells However, this was not the case for IL-1α (FIG. 6). Compare to mAb 4C5 Thus, anti-type I receptor antibody 35F5 induces IL-1α and IL-1β in B cells. Growth was arrested. The anti-type II IL-1R antibody 4E2 is IL-1α or IL-α. It did not inhibit proliferation induced by any of 1β. In a similar manner, the mAb 4C5 is D10. Inhibited IL-1α-induced proliferation of G4.1 T cells but not IL- This was not the case for 1β (FIG. 7). Both mAb 35F5 and human IL-1ra , D10. G4.1 cells inhibited IL-1α and IL-1β induced proliferation. mAb 4C 5 also blocked IL-1β-induced expression of kappa light chain on 70Z / 3 cells. But not for IL-1α (FIG. 8). Antibody 35F5 Blocking IL-1α and IL-1β-induced effects in MAb 4E2, which recognizes Ip II IL-1R, was inactive. Of those assays To neutralize IL-1 activity by the antibody or IL-1ra, Detect as a dose-dependent decrease. Blocking the response is 100% inhibitory (ie Unequal to IL-1) or to lower levels depending on the ability of the antibody Become.Example 6 Inhibition of in vivo IL-1β biological activity by monoclonal antibodies IL-1 administered to mice showed a rapid and rapid concentration of IL-6 in their sera. Show a dramatic rise. The magnitude of the rise in serum IL-6 depends on the IL-1 dose, and It may be blocked by factors that prevent IL-1 binding to Type I IL-1R. This IL -1 When tested in a biological model, 4C5 is the ratio of serum IL-6 -1β induction. Issued rise About 90%, but not IL-1α (FIG. 9). Anti -Type I IL-1R antibody 35F5 is induced by IL-1α and IL-1β of serum IL-6 Stopped the rise. The control mAb X-732 had no inhibitory effect.Example 7 Expression cloning of mouse (murine) IL-1R AcP using Mab 4C5RNA Extraction 3T3-LI cells are harvested, and total RNA is guanidium isothi Extraction using ocyanate / phenol (P. Chomczynski and N. Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156, 1987). Poly A⁺RNA is converted to oligos as described. Isolated from total RNA by one batch adsorption to dT latex beads (K. Kurib ayashi et al., NaCl. Acid. Res. Symposium Series 19:61, 1988). This purification Poly A from⁺The yield of RNA was about 6%. The binding of the RNA preparation Fractionation on a 1.0% agarose gel under denaturing conditions in the presence of formaldehyde (Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition, J. Sambrook , E .; F. Fritsch, T .; Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ).3T3 -Construction of L1 cDNA library The above poly A⁺From the RNA, the cDNA library is transferred to the mammalian expression vector pEF-BOS (Mizushima and Nagata, NaCl. Acids Res. 18: 5322, 1990 ). 10 μg of poly A⁺RNA is converted to RNase H^-Reverse transcription using reverse transcriptase (GIBC O BRL Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). The resulting mRNA-cDNA high The brid was converted to blunt-ended double-stranded cDNA by established methods. (Gubler and Chua, Essential Molecular Biology, Volume II , T .; A. Brown, editor, pp. 39-56, IRL Press 1991). BstXI linker (A ruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 84: 8573, 1987) Ligated to the cDNA, and a molecule of 1000 base pairs (bp) or more 0 Selected by passing over the ram. Sephacryl SF500 column (0.8 × 29cm), 10m M Tris-HCl, pH 7.8 / 1 mM EDTA / 100 mM sodium acetate . BstXI linker treated cDNA is applied to the column and 0.5 ml fractions are collected Was. Small aliquots of each fraction were fractionated on a 1.0% agarose gel. Gel true Dry under air and determine the size distribution of the radioactive cDNA by exposing the gel to X-rays. More visualized. Fractions containing cDNA molecules greater than 1000 bp were selected and pooled . The cDNA is concentrated by ethanol precipitation and ligated into a cloning vector. Was. The cloning vector was digested with BstXI restriction enzyme and Plasmid pEF-BOS purified on two successive agarose gels. 37 5 ng of plasmid DNA was ligated with ligation buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.8 / 10 mM MgCl 2)._Two / 10 mM DTT / 1 mM rATP / 25 mg / ml bovine serum albumin) in 150 μl Ligation at 18.degree. C. overnight to 18.75 ng of size-selected cDNA from above. The next day, that The ligation reaction was performed using phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1). ). Nucleic acids were treated with ethanol in the presence of 5 μg oyster glycogen. Precipitate. The precipitate is dissolved in water and ethanol precipitated again, followed by 70 Washed with% ethanol. Dissolve the final pellet in 14 μl water and add 1 μl Aliquots of E. E. coli strain DH-10B (GIBCO-BRL) was electroporated. By this method, about 4 × 10⁶A library of recombinants was generated.Murine IL1- by panning with monoclonal antibody 4C5 Screening for receptor accessory protein (muIL-1R AcP) cDNA Ning The panning method has been described previously (Aruffo and Seed, Proc. Natl. . Acad. Sci. (USA) 84: 8573,1987). About 5 × 10^FourClones Ten aliquots from the 3T3-LI library were aliquoted to 10 μg / ml ampicillin (am Plated on LB agar plates containing p) and grown overnight at 37 ° C. next On day, colonies from individual pools are removed from the plate by another 50 ml aliquot of LB + amp. And grown at 37 ° C. for another 2-3 hours. Plasmid DNA Subsequently, extraction was performed using a QIAGEN plasmid kit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA). did. Next, using 10 separate DNA pools, the DEAE dextran technique (5 μg DNA / 2 × 10⁶Cells / 9 cm diameter dish) transfect COS-7 cells (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, J. Sambrook, E . F. Fritsch, T .; Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 72 hours after transfection, COS cells were treated with 0.5 mM phosphate buffer solution (PBS). Of EDTA / 0.02% sodium azide. Single cell Suspensions were prepared from individual pools. Anti-muIL-1R AcP mAb 4C5 on ice Bound cells for 1 hour [(10 μg / ml 4C5 mAb / 0.5 mM ED in 3 ml PBS) TA / 0.02% sodium azide / 5.0% fetal calf serum (FCS)]. Cell-mAb suspension 3 ml of the solution is centrifuged through 6 ml of 2% Ficoll in the above buffer (about 300 × g, 5 min), unbound mAb was removed. Cells were resuspended in the above buffer. Cells from individual pools were subsequently purified by polyclonal heron anti-rat IgG (50 mM Squirrel-HCl (pH 9.5), 20 μg / ml, room temperature, 1.5 hours) Add to bacterial plates (9 cm diameter) and add PBS / 1% BSA Overnight at room temperature. Place COS cells on the bacterial plate at room temperature for 2-3 hours. Meanwhile, it was left while rocking lightly. Non-adherent cells are removed by washing with PBS. I left. The remaining cells were added with 0.8 ml of Hirt lysis solution (0.6% SDS / 10 mM EDTA). It dissolved by addition. The lysate was transferred to a 1.5 ml Eppendorf tube and 1 M Na Add Cl, incubate on ice overnight, and 15,000 xg for 15 minutes at 4 ° C. I turned it. Once the supernatant is phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1), add 10 μg of oyster glycogen and add To 7.5 M NH_FourTwice by adding 0.5 volume of OAc and 2.5 volume of ethanol , Precipitated. The pellet is washed with 70% ethanol, dried, and H_TwoO resuspended in 1 μl. Next, the individual panned pools of DNA were The cells were electroporated in E. coli strain DH-10B. After electroporation, 5 × 10 of each pool^FourColonies were grown as described above and DNA was isolated as described above. This DNA is used for one round of panniers in the library. Indicates enrichment. 3 pannings in total, 10 library pools each It was completed while maintaining. After the third panning, DEAE dextran was used with 10 pools each. Cells were transfected by the method (1 μg DNA / 2 × 10^FiveCells / 6-well Costar dish wells). 72 hours after transfection, COS cells To polystyrene beads coated with a second antibody (Dynal Inc., Great Neck, NY) Screen for pools that expressed muIL-1R AcP by rosset formation did. COS cells transfected with 4C5 mAb in PBS / 2% FCS For 1.5 hours at room temperature with gentle rocking (2 μg Ab / well) ). The antibodies are removed and the cells are washed with PBS / Washed with 2% FCS. 1 ml PBS / 2% FCS / 1 μl sheep anti-rat IgG coated Covered polystyrene beads (about 4 × 10^FiveDynabeads M-450), and Incubate for 1.5 hours at room temperature with gentle rocking. Remove the beads And the cells were washed 5-10 times with PBS. Next, the cells were transformed with 95% ethanol / Fix by incubation in 15% acetic acid and allow for rosette formation. And examined using a microscope. One of 10 pools (panning pool # 2) Was found to be positive due to the surface expression of muIL-1R AcP. To identify positive clones, 100 μl of LB + amp was added to two 96-well Placed in wells of the microtitre plate. Next, the individual wells are Inoculated with four individual colonies from Gpur # 2. Bacterial cells at 37 ° C Grow for 5-6 hours. The pools were then pooled with 8 rows of individual plates and 12 rows. Combine 10 μl aliquots from individual wells in each column and separate rows and columns Manufactured by keeping the rows separate. Using each of those pools, Another 5 ml culture in LB + amp was inoculated and grown at 37 ° C. overnight. The next day, plasmid DNA was isolated using the QIAGEN plasmid kit. Individual DNA preparations were prepared from 48 (rows) or 32 (columns) of individual panning pool # 2. An isolate was represented. Using individual microtiter pools as described above Transfect COS cells in a 6-well plate and transfer After 72 hours of injection, cells were harvested for Dynabead losset formation as described above. Screened. Two positive pools found in one of the microtiter plates One from row E and one from column 2. 10ml aliquot From the wells at the intersection of the columns and rows (well E2) and LB agar + Plated on amp. After overnight incubation, select 40 individual colonies Were used to inoculate 5 ml of each LB + amp culture. Plasmid DNA is transferred to QIAGEN It was isolated from those cultures using a plasmid kit. Individual plasmid isolation The digest is digested with XbaI restriction enzyme, the cDNA insert is released and 1.0% agarose Separated on sgel. This analysis shows that only three sizes of cDNA inserts were positive. It was shown to be in the microtiter pool. Individual units of the three plasmids Using one representative, the COS cells in a 6-well plate were Transfect and screen by rosette formation using Dynabeads did. In this case, a single cDNA clone encoding 4C5-reactive muIL-1R AcP (E2-K) was identified.muIL Characterization of -1R AcP cDNA The cDNA clone E2-K (pEF-BOS / muIL-1R AcP) was first obtained by restriction map. It was characterized. Digestion of this clone with XbaI releases a 3.2 kb cDNA insert. did. The 3.2 kb XbaI fragment was gel purified and the DNA sequences of both strands were , Thermostable DNA polymerase as terminator and dye-labeled data Determined by using an ABI automated DNA sequencer with oxynucleotides . This DNA sequence defines the open reading frame (ORF) in the 5'-prime half of the clone. (See below). Uses Intelligenetics computer software The restriction map showed a 1.4 kb PstI restriction fragment in the ORF. The 1.4 kb fragment was gel isolated and an additional muIL-1R AcP cDNA clone was added. Used as a probe to identify loans. 3T3-LI cDNA described previously About 6 × 10 from library^FivePlate additional clones as above did. Perform a colony lift (Mo lecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Sambrook, E .; F. Fritsch , T .; Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and its resources To the Multiprime DNA Labeling System (Amersham Co., Arlington Heights) , IL) by random-priming [³²P] -dCTP Probed with the 1.4 kb PstI restriction fragment. In this case, two additional Additional homologous cDNA clones were isolated. One contains a 1.0 kb insert and the other one One contained a 4.3 kb insert as determined by XbaI digestion. Its 4.3kb The DNA sequence of the insert was converted as described above to confirm the sequence of the muIL-1R AcP ORF. Decided.muIL Sequence analysis of -1R AcP cDNA clone Nucleotide sequence of reading frame in muIL-1R AcP cDNA insert The columns are shown in FIG. 10A [SEQ ID NO: 4]. This reading frame (ORF) has 570 Consists of 1710 bp encoding amino acid protein. As shown in FIG. 10B [SEQ ID NO: 6] The amino acid sequence to be determined is the NH of 20 amino acids by cleavage after Ala-1._Two-Terminal Signal peptide, extracellular domain from Ser1-Glu 339, Leu 340-Leu 363 Transmembrane domain and Glu364-COOH-terminal cytoplasmic terminus from Predict. All seven possible N-terminal glycosylation sites are in the extracellular domain. Included in the application. Intelligenetics for protein sequences using computer programs Database studies have shown that muIL-1R AcP can be used to detect IL from mice, humans, chickens and rats. With significant homology to both IL-1 type I and IL-1 type II receptors To do so. The homology to each of these proteins is about 25%, And are evenly distributed throughout the protein sequence. Amino acids of muIL-1R AcP Further analysis of the sequence indicates that it is the immunoglobulin superfamily. Is a member of Retained in all extracellular domains of the IL-1 receptor Pairs of cysteine residues that correspond to the formation of three IgG-strain domains Is preferably stored in muIL-1R AcP.Example 8 Binding of Mab 4C5 to murine recombinant IL-1R AcP expressed in COS cells The cDNA for muIL-1R AcP encodes a protein reactive with mAb 4C5. COS cells transfected with recombinant muIL-1R AcP Expressed above, and [¹²⁵I] -4C5 was tested for direct binding. COS fine Cells were electroporated with pEF-BOS / muIL-1R AcP using standard methods. Was. After electroporation, cells are 2-3 × 10 5^Five6 cells / well Inoculated on well tissue culture plates. After 48-72 hours, remove the growth medium and 1 × 10⁶cpm [¹²⁵I] -4 ml of a binding buffer (RPMI / 5% FCS) containing 4C5 2 μg of labeled alone (total binding) or as a cold inhibitor Added per well in the presence of no 4C5 (non-specific binding). Total and non-special Both heterozygous linkages were performed in duplicate. 3 hours incubation at 40 ℃ After binding, the binding buffer was removed and the cells were washed three times with PBS. Next, The cells were lysed by adding 0.75 ml of 0.5% SDS. Harvest the melt and The combined count was determined. Specific binding subtracts non-specific counts from total counts Calculated by The specific count is about 30,000 cpm / well and 8% of the non-specific background indicates that pEF-BOS / muIL-1R AcP It suggests directing the expression of 4C5 immunoreactive protein in E. coli. The size of recombinant muIL-1R AcP expressed in COS cells was determined by [³⁶S] -methioni Labeling of transfected COS cells with mAb 4C5 or Was determined by immunoprecipitation of labeled muIL-1R AcP with 2E6 (Table 2). The medium was removed 36 hours after electroporation with pEF-BOS / muIL-1R AcP. And remove COS cells from methionine-free medium [DMEM (methionine-GIBCO -High glucose without BRL) / 10% FBS / 1 mM L-glutamine / 1 mM Of sodium pyruvate]. Fresh methionine-free Medium is added and after incubation at 37 ° C for 5-8 hours, 50-100 μCi³⁵S-methionine was added per ml of medium and incubated for 24 hours. Continued. Next, the medium is removed and the cells are washed twice with cold PBS. Was. Cells were grown in RIPA buffer (0.5% NP-40, 0.5% Tween-20, 0.5% deoxygenated). Collate, 420 mM NaCl, 10 mM KCl, 20 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA) Lysed by addition and incubated on ice for 15 minutes. Transfer the lysate to a tube And spun at 15,000 xg for 15 minutes. Lysate to 500 μl lysate 40 μl of GammaBind G Sepharose (50% (v / v) in RIPA buffer) (Ph armacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) Incubate overnight at 4 ° C. The next day, wash the previously washed lysate for 30 seconds While rotating in a microfuge and transferring the lysate to a washed tube . Further, 40 μl of GammaBind G Sepharose was added to 20 μg of mAb 4C5 or 2E6 (Table 2). ) And incubate the immunoprecipitate at 4 ° C for 3 hours while rotating. I was vate. The Sepharose-Ab complex was spun down and added with RIPA buffer. Once with 50 mM HEPES, pH 7.9 / 200 mM NaCl / 1 mM EDTA / 0.5% NP-40 Once and 25 mM Tris, pH 7.5 / 100 mM NaCl / 0.5% deoxycholate / 1.0% Triton X-100 / 0.1% SD Each was washed once with S. Transfer protein to 20 μl of 2 × Laemmli sample The beads were released by the addition of buffer (Laemmli, Nature 227: 680, 1970). Ta Proteins were separated by electrophoresis on a Tris-glycine PAGE and Visualized by triradiography. As shown in FIG. Recombinant muIL-1 immunoprecipitated with mAb 4C5 or 2E6 from isolated COS cells R AcP migrates as a broad band at 70-90 kDa. Protein is pseudo-trans No precipitation was observed from the transfected COS cells.Example 9 Expression of recombinant IL-1R AcP in COS cells: [¹²⁵I] -labeled IL-1 Reactivity with proteins and monoclonal antibodies [¹²⁵I] -Recombinant IL-1R AcP for labeled IL-1, 4C5 and 4E2 Was determined (FIG. 12). Data is,〔¹²⁵I] -4C5 binding , It showed high level expression of recombinant IL-1R AcP [Cos (4C5)], but only When compared with control transfected COS cells [Cos (PEF-BOS)] , [¹²⁵I] -Human IL-1α binding did not increase. For comparison,¹²⁵I ] In COS cells [COS (Mu-IL-1R)] as determined by -35F5 binding High level expression of murine recombinant type I receptor is associated with radiolabeled IL-1 Achieved by corresponding increases in β and IL-1β binding (FIG. 13).Example 10 A native murine IL-1 receptor accessory protein (IL- Purification of 1R AcP) Murine EL-4 cells (100 g) were loaded with 8 mM CHAPS, 5 mM EDTA and Rotase inhibitor pepstatin (10 μg / ml), leupeptin (10 μg / ml) ml), benzamidine (1 mM), aprotinin (1 μg / ml) and PMSF (0.2 mM) And dissolved in 1 l of PBS. Centrifuge at 100,000 xg to remove insoluble material After separation, the supernatant was added to a 50 ml wheat germ agglutinin (WGA) agarose column (Vector Laboratories, Inc.) at 0.8 ml / min. Equilibrate the column with equilibration buffer (PBS, 8 mM CHAPS, 5 mM EDTA), followed by an equilibration buffer containing 0.5 M NaCl. The bound protein was converted to 8 mM CHAPS and 0.3 M N-acetyl-D-G Elution was carried out with PBS containing lucosamine. The sugar-eluted fractions from three WGA agarose column experiments were pooled and 5 ml of immunoaffinity column equilibrated with PBS containing 8 mM CHAPS [MA cross-linked to protein G sepharose through dimethylpimelimidate b 4C5 antibody (Stern, AS and Podlaski, FJ, Techniques in Protein Chem istry IV, R. H. Angeletti, ed., Pp 353-360, Academic Press, NY, 1993) Loaded at 1 ml / min on top. The column is equilibrated with equilibration buffer followed by IM NaCl. Washing was performed with the buffer. The bound protein was removed from a 50 mM dimer containing 8 mM CHAPS. Elution was performed with a methylamine buffer solution (pH 11.5). The fraction containing IL-1R AcP was It was dialyzed against PBS containing mM CHAPS and concentrated. All column fractions were analyzed by SDS-PAGE / immunoblot analysis with mAb 4C5. The presence of IL-1R AcP was monitored. 8-16% gradient SDS-PAGE Run on a Togel (Novex), and convert the protein to nitrocellulose as described. (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350, 1979). Fifteen 0 mM NaCl_TwoAnd 2.5% in 50 mM Tris containing 0.01% thimerosal (pH 7.5). After blocking the nitrocellulose with% casein, the blot was treated with mAb 4C5 ( 5 μg / ml) followed by HRP-conjugated goat (Fab)_TwoAnti -Incubated with rat antibody (Tago Immunologicals). Blot the E It was developed by CL Sptem (Amersham Life Science). Amino acid composition of the final protein preparation (Hollfelder et al., J. Protein Chem. 12: 435, 1993) is shown in Table 6; it is a cDNA clone [SEQ ID NO: 1]. To the composition predicted from the deduced protein sequence from FIG. 16 [SEQ ID NO: 3] Similar. The rest of the sample is subjected to SDS-PAGE, and a PVDF membrane (Matsudaira, J. Bio. l. Chem. 262: 10035, 1987) and dyed with Coomassie-R-250. Colored. A protein-stained band at 80 kDa, immunoreactive with the 4C5 antibody, NH_Two-Analyzed by terminal sequence analysis (Hollfelder et al., J. Protein Chem. 12: 4 35, 1993). Obtaining two sequences (1-3 pmol of individual amino acids per cycle); One of these is the putative tag obtained from the expression cloning of murine IL-1R AcP. It matched residues 1 to 12 (SERXDDWXLDTM) of the protein sequence (FIG. 10B). IL-1R AcP lysed from EL-4 cells was analyzed by immunoblotting with 4C5 antibody. Has a Mr = 80 kDa as determined by analysis, but The estimated molecular weight of the protein is 66 kDa. This apparent difference is probably By glycosylation of Sally protein. To address this issue, affinity The produced IL-1R AcP is subjected to SDS-PAGE, and 80 kDa 4C5-immunoreactivity The Coomassie-stained band corresponding to the protein was eluted from the gel and And chemically deglycosylated with trifluoromethanesulfonic acid (Edge Etc., Anal. Biochem. 118: 131, 1981). Its deglycosylated protein Is Mr = in SDS-PAGE. Moves to 63-64 kDa, which is in good agreement with the estimated molecular weight from the cDNA sequence I do. Example 11 Isolation of genomic clone of human IL-1 receptor accessory proteinScreening by cross-hybridization Cross-hybridization with sequences from murine IL-1R AcP Screening of cDNA libraries to screen human homologues of IL-1R AcP An attempt was made to identify and isolate a cDNA encoding E. coli. RAJ1 cells or Is a mouse cDNA library prepared from mRNA isolated from NC37 cells. IL-1R AcP Although probed with cDNA, early attempts were probably performed in those cells. Was unsuccessful due to the very low expression of the homologue (see Example 12). . We will then use it to screen human cDNA libraries Decides to screen human genomic library to isolate specific sequences Specified. Murine IL-1R AcP cDNA clone [3.2 kb XbaI fragment] Restriction fragment of the IL-1R AcP cDNA clone [1.4 kb PstI fragment And the 843 bp BamHI / SalI fragment] Reduced Southern blot analysis was performed (Clontech, Palo Alto, CA). This analysis The optimal probe for the mouse probe to detect homologous sequences present in the human genome. Performed to determine hybridization and wash conditions. Murine IL-1 Hybridization with R AcP cDNA probe Buffer A (2 × SSC, 20% formamide, 2 × Denhardt's, 100 μg / ml yeast R NA, 0.1% SDS) at 37 ° C. overnight. Connect the probe to Prime-It II Using Random Primer Labeling kit (Stratagene, La Jolla, CA)³²P] -Labeled by dCTP. Blots were started at 37 ° C and 2xSSC and at various temperature points. And 0.01% SDS. The optimal conditions are [³²P] -843 bp BamHI / SalI Use of fragment, overnight at 37 ° C. in hybridization buffer A Hybridization, washing at 55 ° C in 2xSSC, 0.01% SDS Was decided. Those conditions produce the lowest background and are commercially available Human genomic library. To identify a human genomic clone of IL-1R AcP, Lambda FIX # 944201 (Stratagene, La Jolla, CA) to screen human lung fibroblast library I got it. 4.8 × 10^FiveStandard plaques Plaque hybridization techniques (Molecular Cloning, A Laboratory Ma nual, 2nd edition, J.M. Sambrook, E .; F. Fritsch, T .; Maniatis, Cold Spring Harbo r Laboratory Press, 1989) using the above conditions. Six Hybridization-positive phage clones were serially plaque-hybridized. Purified by zation. Two phage clones were further characterized (# 1 And # 7).Characterization of human genomic clones The human IL-1R AcP genomic clone was first characterized by a restriction map. Bacteriophage lambda DNA was purified using a Lambda Sorb phage adsorbent (Promega, Madi). son, WI). Phage DNA to SacI Digest more, release the insert, and then divide the fragment into 1% agarose Separated by electrophoresis on a gel. The insert for both clones # 1 and # 7 is It was about 17 kb in size. Further mapping of clones # 1 and # 7 was performed with XbaI And EcoRI. Swim digested DNA on 1% agarose Separation by transfer, transfer to nylon membrane (ICN, Irvine, CA) and Southern blot Crosslinked for analysis. The membrane was ligated with 843 bp of the murine IL-1R AcP described previously. (BamHI / SalI) fragment. Probe, Prime-It II Random Primer Labeling Kit (Stratagene, La Jolla, CA) Using〔³²P] -dCTP. Blots are stained with the low stringency hybrid as described above. Hybridization and washing were performed using the ligation conditions. 4.5 kb fragment from EcoRI digest and 2.6 kb flag from XbaI digest Was positive for hybridization to the murine IL-1R AcP sequence. And identified. 4.5 Fragments and And 2.6 kb fragment from 0.8% Seaplaque agarose (FMC, Rockland, ME) And purified by Qiaex (Oiagen, Chatsworth, CA). Those Fragment the vector pBluescript IISK⁺(Stratagene, La Jolla, CA) It was cloned to facilitate characterization. Transfer the plasmid DNA to the Qiagen plasmid kit. (Qiagen, Chatsworth, CA). Perform Southern blot analysis to detect homologous sequences in the human genome The fragment that was more appropriate was determined. 4.5kb and 2.6kb fragments Was used as a probe. Low stringency hybridization conditions are as follows: 5 × SSC, 50% formamide, 5 × Denhardt's, 100 μg / ml yeast RNA, Hybridization with 0.1% SDS at 37 ° C overnight. Probes are Prime-ItII Using Random Primer Labeling Kit (Stratagene, La Jolla, CA)³² P] -dCTP. The membrane was started at 37 ° C. and at various Washing was performed under reduced conditions (0.1 × SSC, 0.01% SDS). Determine optimal conditions for human cDN When screening the A library, screens that are specific for huIL-1R AcP Robe selection was secured. These optimal conditions are described in Example 12.Sequence analysis of human genomic clones pBluescript IISK⁺/2.6 kb human genomic IL-1R AcP plasmid DNA Dye-labeled dideoxy as a qualitative DNA polymerase and terminator Sequencing was performed using an ABI automated DNA sequencer with the nucleotides. Reserve DN A Sequence analysis indicates that this DNA encodes the intracellular domain of murine IL-1R AcP. It was shown to contain a 150-nucleotide region with 90% homology to the column.Example 12 Isolation of cDNA clone of human IL-1R AcPYT Structure of cell cDNA library mAb 2E6 (Example 2, Table 2) was initially characterized by its reactivity with murine IL-1R AcP. I took it. Preliminary data indicates that mAb 2E6 detects IL-1R AcP on human cells showed that. Many human cell lines¹²⁵I] -2E6 and YT fine Cell line (Yodoi et al., J. Immunol. 134: 1623, 1985) is another human cell line, eg, Determined to express a relatively large number of 2E6 reactive sites per cell compared to RAJI Was done. Therefore, select the YT cell line as the source of RNA for cDNA library construction did. Total RNA was extracted from the YT cells, and the cDNA was purified from this cell as described herein. Prepared from RNA (Example 7: 3T3-LI cDNA library construction). EcoRI adapter -(Stratagene, La Jolla, CA) was ligated to the resulting cDNA and Pass these molecules onto a Sephacryl SF500 column as described herein (Example 7: Construction of 3T3-LI cDNA library). cDNA to ethanol Concentrated by precipitation and ligated into the cloning vector. Cloning vector The λZAP II file was digested with EcoRI restriction enzyme and dephosphorylated. (Stratagene) (as provided by the supplier). From above 10 aliquots of 100 ng of the selected cDNA are ligated overnight at 15 ° C. with ligation buffer (66 mM). Tris-HCl, pH7.5 / 5mM MgCl_Two/ 1 mM DTE / 1 mM rATP) in 5 μl, λZAP Ligation to 1 μg of each II arm (EcoRI digested and dephosphorylated) did. The next day, pool the consolidation and extract the Gigapack III packaging 12 4 μl aliquots using exudates and according to manufacturer's instructions (Stratagene) In λ phage. Packaged phage 5 mM isopropyl-β-D-thiogalactopypi to distinguish recombinant phage La Nosid (IPTG) (Boehringer Mannheim Co., Indianapolis, IN) and 4 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indoleyl-β-D-galactopyranoside In the presence of (X-Gal) (Boerhinger-Mannheim), the bacterial strain XL1-Blue-MRF (Strat agene). The next day's plaque count was 3.55 x Ten⁶Library of less than 0.1% non-recombinant background It was shown that it was obtained with it.IL For hybridization of -1R AcP with human genomic clone fragment Screening of human cDNA library 2.6 kb described previously as a specific probe for huIL-1R AcP The XbaI restriction fragment was used to screen the YT cDNA library. Stringent hybridization (5 × SSC, 50% formamide, 5 × Denhardt's, 1 × 00 μg / ml yeast RNA, 0.1% SDS, 37 ° C., overnight), high stringency washing conditions (0.1 × SSC, (0.10% SDS, 40 ° C). 4.8 × 10^FiveIndividual plaques Hybridization techniques (Moleculr Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition) J. Sambrook, E .; I. Fritsch, T .; Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Three types of hybridization positive Continuous clones (# 3, # 5 and # 6) And purified. pBlu containing insert DNA from λZAP II vector Cleavage of escript SK (-) phagemid was performed according to the manufacturer's means.Characterization of human cDNA clones Human IL-1R AcP cDNA inserts # 3, # 5 and pBluescript SK (-) # 6 was further characterized by restriction mapping. First, the mini pre-plasmy DNA is rapidly boiled (Holmes and Qui gley, Anal. Biochem. 114: 193, 1981). Subsequently, plasmid D NA was prepared with the Qiagen plasmid kit. The plasmid DNA is transferred to EcoRI Digestion, release the insert, and remove the insert on 1% agarose Separated by electrophoresis. Clone # 3 contains a 2.3 kb insert and clone # 5 contains 1 The .4 kb insert was included, and clone # 6 contained the 2.7 kb insert. Further Restriction mapping shows a single PvuII site present in all three clones.Sequence analysis of human IL-1R AcP cDNA clone Plasmid DNAs from clones # 3, # 5 and # 6 were converted to thermostable DNA polymerases. Dye-labeled dideoxynucleotides as an enzyme and terminator Both were sequenced using an ABI automated DNA sequencer. Preliminary sequence analysis Only # 3 and # 6 inserts that are homologous to the murine IL-1R AcP cDNA. Has been shown. Therefore, clones # 3 and # 6 inserts were completely sequenced. Was. Analysis of the sequence shows that clones # 3 and # 6 are duplicate clones. K A graphical representation of loans # 3 and # 6 is shown in FIG. Clone # 3 is open to ATG It includes the start codon and the 5 'side of the coding region. Clone # 6 is the 3 'side of the cDNA Includes minute and TGA stop codons. These two duplicate clones are replaced with full-length hu Used to construct IL-1R AcP cDNA.Example 13 Construction of full length human IL-1R AcP cDNA Restriction endonuclease mapping and preliminary sequence analysis were performed for clones # 3 and This indicated that there was a single BstXI site present in loan # 6. Duplicate claw A graphical representation of steps # 3 and # 6 is shown in FIG. Clones # 3 and # 6 , Restriction enzymes BstXI and X Digested with baI. Approximately 846 bp and approximately 2700 bp fragments were ligated with 0.7% Seaplaq clone # 3 and clone # by ue agarose (FMC, Rockland, ME) 6 and purified by the Qiaex method (Qiagen, Chatsworth, CA). The full-length human IL-1R AcP was converted to the mammalian expression vector pEF-BOS (Mizushima and Nagato, Nuc. Acids Res. 18: 5322, 1990). Prepared. The pEF-BOS plasmid DNA was digested with XbaI and the bovine intestinal phosphatase was digested. Treated with Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, 0.7% Seaplaqu e Separation by electrophoresis on agarose gel, and the Qiaex method (Qiagen, Chats worth, CA). BstXI / XbaI flag of 846 bp and about 2700 bp The ligation fragment is ligated into an XbaI-cut pEF-BOS expression vector and the ligation product The resulting product was used to transform MC1061 complement cells. Transfer the transformed cells to 10 Plate on LB agar plates containing 0 μg / ml ampicillin and at 37 ° C. Propagated overnight. The next day, pick 12 individual colonies and pick up ampicillin (100 μl). g / ml) and incubate at 37 ° C. overnight. Miniprep Rasmid DNA was prepared by the rapid boiling method (Holmes and Quigley, Anal. Biochem. 114: 193). , 1981) from individual inoculated colonies. Restricted endonucleus Analysis revealed that 10 clones were correct for the promoter region in pEF-BOS. The orientation was confirmed to include the appropriate insert. Plasmid DNA was ligated to two positive clones by the Qiaex method (Qiagen, Chatsworth, CA). Isolated from loans # 1 and # 9. Nucleotide sequences of both strands of both plasmids Determined as described in Example 7. Included in full length huIL-1R AcP cDNA The sequence of the 1710 bp open reading frame (ORF) is shown in FIG. 15 [SEQ ID NO: 1]. Shown in FIG. Is estimated The amino acid sequence [SEQ ID NO: 3] has a 20 amino acid signal peptide (Met^-20−A la^-1), Putative extracellular domain (Ser1-Glu 339), hydrophobic transmembrane 570 domains consisting of a domain (Leu 340-Leu 363) and a cytoplasmic end (Glu 364-Val 550) Encodes a protein of residues Seven possible N-linked glycosylation sites The positions are all contained within the extracellular domain. All seven sites are rats and chicks Stored between IL-1R AcP.Example 14 Expression of soluble human IL-1R AcP To express huIL-1R AcP, the soluble form of the protein was transformed with a baculovirus. Constructed for expression in an expression system. This system is used for eukaryotic cells. Is useful for over-producing recombinant proteins (Luckow and Summers, Bio / Technology 6:47, 1988). Polymerase chain reaction (PCR) method (Innis M.A., etc.) ., PCR method: A guide to Methods and Applications, Academic Press, San Die go) using an amplifiable gene encoding a soluble form of the extracellular domain of huIL-1R AcP. Con generated. Briefly, two oligonucleotide primers are called Ap Synthesized on a plied Biosystems synthesizer. The forward primer contains a BamHI site, Included codons for the first 11 amino acids of the gnal peptide: (5 ') GGCC G GA TCC ATG ACA CTT CTG TGG TGT GTA GTG AGT CTC TAC (3 ′) [SEQ ID NO: 10]. The reverse primer sequence consists of 11 amino acids immediately before the transmembrane main, Ala spacer and Glu-Glu-Phe label, followed by stop codon TAG and KpnI sites Coded: (5 ') CGCGCG GGT ACCCTA GAA CTC TTC AGC TTC CAC TGT GTA TC T TGG AGC TGG CAC TTT CTGC (3 ′) [SEQ ID NO: 11]. Glu-Glu-Phe at COOH end Tripeptide labels provide epitopes for antibody detection of recombinant proteins Built to be. This tripeptide label is commercially available for α-tubulin. Recognized by commercially available monoclonal antibodies (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266) : 14163, 1991). Forward and reverse primers were cloned using clone # 3 (FIG. 14) as template and huIL -1R AcP was used to amplify the extracellular domain. Its about 80 The 0 bp PCR amplicon was digested with BamHI and KpnI. Digested hula Subject to electrophoresis through 0.7% Seaplaque agarose, and Purified by the Qiaex method (Qiagen, Chatsworth, CA). Next, soluble human IL-1 The R AcP extracellular domain is defined as pNR1, a baculovirus transfer vector. -Subcloned into derivatives of pVL941 (PharMingen, San Diego, CA). pNR1 Was prepared from pVL941 by removal of the EcoRI site at position 7196 (cut by EcoRI). Cleavage and fill-in of the cohesive end with Klenow DNA polymerase). Next, the DNA Religation followed by cleavage with BamI and Asp 718 (KpnI isoschizomers), and BamH Depend on insertion of next oligonucleotide containing I, EcoRI and Asp 718 recognition sequences Was: (5 ') GATCCAGAATTCATAATAG (3') [SEQ ID NO: 12] (3 ') GTCTTAAGTATTATCCATG (5') [SEQ ID NO: 13]. BamHI, EcoRI and Asp 718 restriction sites are unique in pNR1. The pNR1 plasmid DNA was digested with BamHI and KpnI and Qiaex method (Qiaex Gen., Chatsworth, CA) from a 0.7% Seaplaque agarose gel. B The approximately 800 bp huIL-1R AcP PCR amplicon fragment of amHI / KpnI was It was ligated into the amHI / KpnI-cut pNR1 expression vector. Use the linked product And transformed MC1061 competent cells, which were then transformed into ampicillin (100 μg / ml) and grown overnight at 37 ° C. Next day Pick 36 independent colonies and LB containing ampicillin (100 μg / ml) Inoculated inside. Miniprep DNA was rapidly boiled (Holmes and Quigley, Anal. Bioc. hem. 114: 193, 1981). DNA restriction endonuclease map Analyzed by analysis. 30 plasmid clones are shown to contain the correct insert Was. Plasmid DNA was subjected to two positive reactions by the Qiagen method (Qiagen, Chatsworth, CA). Prepared from sex clones (# 11, # 25). These clones were analyzed by sequence analysis. Confirmed. pNR1 / soluble human IL-1R AcP DNA (clone # 25) was transferred to Baculo Gold AcR linearized using a Sfection Kit (PharMingen, San Diego, CA) P23. lacZ baculovirus DNA (PharMingen, San Diego, CA) with SF9 (Spod optera frugiperda) cells. Transfection Subsequently, the recombinant baculovirus was transferred to the BaculoGold Transfection Kit (Phar (Mingen) and isolated and flake purified. Plaque And visualized by staining with MTT as described (Shanafelt, Biotechniqu esll: 330, 1991). Twelve individual virus plaques were isolated and virus particles Incubate 0.5 ml of SF-9 medium by overnight incubation on a rotor at 4 ° C. Elution from agarose in the ground (IPL-41 + 10% FBS-JRH Biosciences, Lenexa, KS) did. Individual recombinant viruses were checked for the presence of the insert by PCR and The expression of recombinant human IL-1R AcP was analyzed by blot analysis. PCR amplification Extract the viral DNA for Taq DNA polymerase and appropriate pNR1 With reverse primer (for BamHI / Asp 718 cloning site) And standard PCR methods (Innis et al., PCR Protocols, Academic Pre ss, San Diego, 1990). 1.5% agarose for each amplicon Analyzed by electrophoresis on a plate. The result was that of the 11 plaques tested Confirm that 10 plaques contain an insert of approximately 1 kb corresponding to the correct insert size did. For immunoblot analysis, human IL-1R AcP + label (recombinant virus) From the supernatant of the infected Sf9 cells was converted to streptavidin-agarose ( Biotinylated anti-tubulin antibodies immobilized on Pierce, Rockford, IL) (YLI / 2) (Harlan Bioproducts). Protein, 0. Eluted from the anti-tubulin antibody matrix with 2M glycine, pH 2.7, The fraction was neutralized with 3M Tris base. The eluted protein is converted to β- Treated with Laemmli sample buffer without mercaptoethanol, 8% Separate on acrylamide (Novex) slab gel and add 0.2 μl nitrocellulose And transferred to a membrane (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Its immobilized protein Were tested with goat-anti-rat conjugated with YL1 / 2 antibody (10 μg / ml) and peroxidase Antibody (1: 10,000 dilution) (Boehringer Mannheim Biochemicals) Moved. Immunoreactive bands were generated by ECL (Amersham) according to the manufacturer's method. Visualized. This analysis was performed on recombinant virus containing the human IL-1R AcP + labeled insert. , A protein of 200 kDa or more was identified. Recombinant virus from plaques # 2 and # 12 (expressing human IL-1R AcP + marker Identified by immunoblot analysis to amplify and A virus stock was obtained which was used for large-scale production of the human IL-1R AcP + label. Sf9 cells were expressed in EX- (ELL40) with 1% fetal calf serum (JRH Biosciences, Lenex). a, KS) at 27 ° C. at logarithmic growth (1 × 10⁶Cells / ml) and grow as described. (O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors, a Laboratory Ma nual, Oxford Univ. Press, 1994), infected by recombinant baculovirus And old media was harvested 3-5 days after infection. Centrifuge the cells to their old The medium was removed and the soluble human IL-1R AcP + label was removed as described in Example 15 below. Thus, it was purified on an affinity matrix consisting of immobilized YL1 / 2 antibody. Mice were immunized with the purified human IL-1R AcP + label.Example 15 Specific for human IL-1R AcP-accessory protein (huIL-1R AcP) Preparation and screening of various monoclonal antibodies Three methods have been used to grow antibodies specific to the huIL-1R AcP. Used forImmunization of mice and rats with COS cells expressing human recombinant IL-1R AcP COS cells (4 × 10⁷250 μF and 350 volts according to the manufacturer's method HuIL-1R AcP expression plasmid of sufficient length in BioRad Gene Pulser at Transfer by electroporation (20 μg, described in Example 13) Project. Transfected cells are transferred to a 250 mm x 250 mm Nunc tissue culture Leh was plated and harvested after 72 hours of growth. Transfected Cultured cells were treated with NO-Zyme (JRH Biosciences) for 10 minutes at 37 ° C. Released from the tray. Harvest cells, wash with PBS (pH 7.4) and immunize Used for Mice and rats were huIL-1RA at 0, 7, 14, and 28 days. COS cells expressing cP (1 × 10⁷Intraperitoneal (ip) tract by individual cells / animal) Immunized with On day 40, animals are bled and antibodies to huIL-1R AcP The titer of the response was determined (see below for specific assays). Animals, Forty days later, boosters were given at 2-4 week intervals (1 × 10⁷Individual cells, i. p. ). huIL Serum antibody titers specific to -1R AcP were determined 10-12 days after each boost. Were determined. If the animal has sufficient serum antibody titers (eg, a 1/1000 dilution of serum Cross-linked to lysed IL-1R AcP from human YT and RAJI cells [¹²⁵I] -IL- Immunoprecipitation of at least 50% of a certain amount of complex of 1β) If they are, they are boosted in preparation to isolate their spleen cells. Those final boosts were given on two consecutive days, i. v. And i. p. Administered 1 × 10⁷It is composed of individual cells. Three days after the last immunization, spleen cells were removed from animals. And hybridoma cells were generated as previously described. huIL− Hybridoma cells secreting antibodies specific to 1R AcP were assayed as described below. Identify by Hybridoma cells are cloned as described in Example 1. You.Immunization of mice and rats with purified human recombinant soluble IL-1R AcP a.COS Human recombinant soluble IL in cell and baculovirus expression systems Preparation of -1R AcP As described above, the COS cells were labeled with the C-terminally inserted label (Glu, Glu, Phe). HuIL-1R AcP (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266: 14163, 1991). Extracellular domain (soluble IL-1R AcP, amino acids 1-399 + Ala + Glu + Glu + Phe). The label is anti- -Coding sequence for recognition by tubulin antibody YL1 / 2 (Harlan Bioproducts) To load. Media is harvested from cells 72 hours after transfection, and Soluble IL-1R AcP + label was detected as described below. And purified. Standard method (Gruenwald and Heitz, Baculovirus Expression Vector System: (Procedures and Methods Mannual, 2nd edition, 1993, PharMingen, San Diego, CA) Using pure recombinant baculovirus expressing soluble IL-1R AcP protein Generate Luss. Briefly, human IL-1R AcP + labeled soluble extracellular domain Plasmid DNA encoding the main was transferred as described in Example 14. -Insert into the vector. The recombinant transfer vector is purified and Sf9 (Spodoptera frugiperda) Linearized ACVW1. lacZ DNA (PharMinge Cotransfect with n). Isolate the recombinant baculovirus and And plaque purified. Sf-9 cells (2 × 10⁶Cells / ml) at 27 ° C in TMH-FH medium Culture in logarithmic growth phase (PharMingen) with recombinant baculovirus Infect and harvest old culture medium after 3-5 days. Centrifuge cells And remove the soluble IL-1R AcP + labeled protein from the old culture medium. Detect and purify as described below. b.Preparation of affinity matrix composed of immobilized YL1 / 2 antibody Activated agarose gels, such as Afti-Gel 10 (B ioRad Laboratories) or an agarose gel containing immobilized protein G Immobilizing YL1 / 2 antibodies on an affinity matrix that includes covalent cross-linking to them (Stern and Podlaski, Techniques in Protein Chemistry IV, RH Angelletti, ed., Pp. 353-360, Academic Press, NY, 1993). However, For purification of soluble IL-1R AcP, the YL1 / 2 antibody was purified using NHS-LC-biotin (Pierc e Chemical Co.) and strep Immobilize on toavidin-agarose gel (Pierce Chemical Co.). YL 1/2 anti The body (3 mg / ml) was dialyzed against 0.1 M borate buffer (pH 8.5) followed by room temperature NHS-LC-biotin at a molar ratio of 40: 1 (LC-biotin: YL 1/2 antibody) for 2 hours And react with it. The unreacted LC-biotin was replaced with 1 M glycine / 0.1 M Quench quickly with borate buffer (pH 8.4). The unreacted and quenched NHS-LC -Biotin is purified using a Centricon-30 microconcentrator (Amicon) , Centrifugation at 1000 xg for 15-30 minutes. After centrifugation, the bioci Diluting the nylated YL 1/2 antibody with 0.1 M sodium phosphate, pH 7.0, The process is repeated twice more. Biotinylated YL 1/2 antibody (0.1 M sodium phosphate (pH 7.0), 6 mg) at room temperature for 2 hours with streptavidin. React with agarose (6 ml of a 50% suspension). Immobilized biotinylated Placing streptavidin agarose with the YL 1/2 antibody isolated in the column, Then, the column is washed with 10 column volumes of PBS (pH 7.4). c.Purification of soluble IL-1R AcP Medium containing either soluble IL-1R AcP from either COS cells or Sf9 cells Pass through an YL 1/2 affinity column at a flow rate of 3 ml / min. Columns are continuously converted into two columns Volume of PBS (pH 7.4), 5 column volumes of 50 mM sodium phosphate (pH 7.5), 0.5 M Na Cl, 0.5% Tween 20, 0.05% NaN_ThreeAnd 2 column volumes of PBS (pH 7.4) Cleanse. Soluble IL-1R AcP + label was labeled with 0.1 M glycine-HCl (pH 2.8). Elute and fractions (1 ml) are neutralized with 3M Tris base (1 ml fraction equivalent) 0.015ml). Protein eluted from the column (purified soluble IL-1 R AcP + -labeled) on reduced and non-reduced SDS- on 12% acrylamide slab gel. PAGE, followed by tamper Characterized by silver staining to visualize cytoplasmic bands. COS cells and baculo Soluble present in conditioned media from viral expression systems, and purified preparations Sex IL-1R AcP + label can be identified by the Western blot method. You. Protein (0.04 ml) in conditioned medium and purified soluble IL-1R AcP + The label (0.1-1 μg) was used for the Laemmli sample without β-mercaptoethanol. Treated with buffer, separated by SDS-PAGE on a 12% gel, and Transfer to Lurose membrane (0.2 μM) (as described in Example 1). Nitrocellulose The protein immobilized on the gel was purified using the YL1 / 2 antibody (5 μg / ml) and peroxidase. -Conjugated goat anti-mouse or rat IgG antibody (1/1000 dilution) (Boehring probed by Ermannheim Biochemicals). Immunoreactive band Identification (Amersham Inc.) according to the manufacturer's method. COS cells and cells Soluble IL-1R AcP purified from the culovirus expression system is approximately Migrate as 65-67 kDa and 45-47 kDa proteins. d.Immunization of mice and rats with soluble IL-1R AcP + label Mice and rats were treated with 10-100 μg of soluble IL-1R AcP on days 0, 14 and 28. + Label to i. p. And immunization through the toes of the legs. Primary protein Added in complete Freund's adjuvant for immunization and on days 14 and 28 Described in Examples 1 and 2 in incomplete Freund's adjuvant for immunization Prepared as described above. Serum was collected from the animals on day 4 and for antibody activity Test (see assay below). Animals receive booster immunizations at 4 week intervals (10-25 μg of protein prepared in incomplete Freund's adjuvant) I. p. Administration), and serum antibody titers were measured 2 weeks after each immunization You. Animals may have serum When generating antibody titers (eg, 1/10 of serum^FourDiluted solution is 5% in EIA 0% response), they are 10-100 μg of soluble I on two consecutive days. Booster immunizations (iv and ip) of L-1R AcP + label are provided. 3 days Later, spleen cells were isolated from the animals and generated anti-mouse IL-1R AcP antibodies. For this, the cells are fused with SP2 / 0 cells as described in Example 1. Hybridoma The supernatant is screened for inhibitory and non-inhibitory antibodies by the following assay. Anti -Hybridoma cell lines secreting huIL-1R AcP antibodies are cloned by limiting dilution. Make a loan. The anti-huIL-1R AcP antibody is purified as described in Example 1. e.Assay for detecting antibodies specific for human IL-1R AcP Starting with the presence of anti-IL-1R AcP antibody in serum, immobilized on 96-well plate Determined by enzyme immunoassay (EIA) with the soluble IL-1R AcP + label You. Briefly, soluble IL-1R AcP + label (1 μg / ml) was added to 50 mM charcoal. Diluted with sodium acid buffer (pH 9.0), 0.15 M NaCl (BC salt solution), and Passively adsorb to wells of Nunc Maxisorb plate for 16 hours at room temperature (100 μl , 100ng). After washing, plates were incubated at 37 ° C for 1 hour in PBS (pH 7.4), 1% bovine serum. React with albumin (BSA). Serial dilutions of serum samples (50 mM phosphate Sodium acid, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.1% Tween-20, 1% BSA and 0.05% NaN_Three1/100 to 1/10 in (antibody binding buffer)⁶], Fixed at room temperature for 2 hours And incubated with soluble IL-1R AcP. PBS (pH 7.4), 0.05% After washing the plate with Tween-20, the bound antibody was removed from peroxidase- Conjugated goat anti-mouse or rat IgG antibody (Boerhringer-Mannheim Inc.) And TMB (tetramethyl (Benzidine) substrate. Individual well color intensity The concentration of anti-IL-1R AcP antibody in serum was measured at 450 nm with a photometer. It is proportional to the degree. Serum antibodies were also analyzed by FACS (fluorescence activated cell sorting). Native huIL-1R AcP expressed on cell lines YT, NC-37 and RAJI, and 2) CO Test for reactivity to recombinant huIL-1R AcP expressed on S cells. Cells (1 × 10⁶) At pH 4 ° C together with a serum dilution in PBS (pH 7.4) (100 μl). Incubate for hours. Wash cells with PBS (pH 7.4), unbound After removal of the antibody, the cells were washed with fluorescein-conjugated goat-anti-mouse or rat. Incubate with IgG antibody (Tago Laboratories) for 30 minutes at 4 ° C. cell Was washed with PBS (pH 7.4) and the amount of antibody bound to the cell surface was determined by FACSor It is measured by increasing the fluorescence intensity by t (Becton-Dickinson Co.). The anti-murine IL-1R AcP antibodies 4C5 and 2E6 (Table 2) were expressed on murine cells. Exhibited inhibitory and non-inhibitory activity against the IL-1R AcP, respectively. Human IL-1R Whether serum from animals immunized with AcP contains both inhibitory and non-inhibitory antibodies Two types of assays are performed to determine whether: 1) To human cells of〔¹²⁵I] Inhibition of binding of -IL-1β and 2) cell surface protein from human cells Cross-linked to quality¹²⁵I] -Immunoprecipitation of the dissolved complex of IL-1β. Inhibition For assay, serial dilutions of serum were prepared in binding buffer with YT, NC-37 and RAJI cells (1-2 × 10⁶) For 1 hour at room temperature. [¹²⁵I] -Add IL-1β (25-250 pM) to each tube and incubate at 4 ° C for 3 hours, The cell-bound radioactivity is then determined as described in Example 1. Inhibitory antibody titer With a serum diluent solution that results in a 50% reduction in cell-bound radioactivity. To decide. For the immunoprecipitation assay, a diluted solution of serum was prepared using huIL-1R AcP Cross-linked [¹²⁵I] -IL-1β with dissolved complex and agarose Incubate at 4 ° C for 16 hours in the presence of Protein-G-Plus immobilized on To Individual serum samples were prepared from human cell lines YT, NC-37 and RAJI Test for reactivity with dissolved complex. Protein-G-Plus agaro After centrifuging and washing the source beads, the immunoprecipitated protein is SDS-PAGE and automatization as described in Example 1 for the murine IL-1R AcP antibody. Analyze by geography.HuIL-1 conjugated to limpet (keyhole limpet) hemocyanin (KLH) Immunization of mice and rats with R AcP peptide Full length huIL-1R AcP sequence 1-10,54-64,68-77,265-273,285 -294, 490-499 and 505-515 were synthesized using standard solid phase techniques (Margli n and Merrifield, Ann. Rev. Biochem. 39: 841, 1970). individual Peptide sequence is added to the C-terminus for covalent attachment to KLH by MBS technique. Cysteine. In short, KLH (1.5 mg in PBS (pH 7.4)) 0.32 mg of 3-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimide ester ( MBS: Boehringer Mannheim Biochemicals) at 4 ° C. for 1 hour. So Of the reaction mixture from BioGel PIO column (10 ml) (BioRad Laboratori es) and chromatographed with PBS (pH 7.4). KLH-MB The fractions containing the S conjugate were pooled (2 ml) and combined with the peptide (2 mg) for 1 hour at 4 ° C. Let it react for a while. KLH-peptide conjugates are loaded with Centricon 10 microconcentrators Concentrator and used for immunization. Mouse and Rats were treated with 200-500 μg of KLH-peptide conjugate at 0, 7, 14, and 28 days. i. p. And leg meat Immunize from the toes. Conjugates are completely Freund's adjuvant for primary immunization And in incomplete Freund's adjuvant for booster immunization. blood Sera were harvested from the animals at day 40 and antibody reactions in soluble IL-1R AcPEIA. Test for compliance. Animals were boosted at 4 week intervals (ip, incomplete infection). 100 μg of KLH-peptide conjugate prepared in Reunion adjuvant), Serum antibody titers are then determined two weeks after each immunization. Animals are possible To generate serum antibody titers (1/10^FourDilute solution gives 50% response in EIA ), They were free peptide (100 μg, iv route) on two consecutive days. ) And KLH-peptide conjugate (500 μg, ip tract) It is. Three days later, spleen cells are isolated from the animal and secrete huIL-1R AcP antibody Hybridoma cells are generated and identified as described above.Example 16 Anti-human IL-1R AcP antibody, and IL-1 by active fragment of IL-1R AcP Neutralization of β biological activity Anti-human IL-1R AcP antibodies that neutralize IL-1 biological activity in a dose dependent manner Of IL-1 by human embryonic lung fibroblast MRC-5 cells (ATCC # CCL-171). -Can be determined in an induced IL-6 assay. 96 MRC-5 cells -Plate well cluster dishes and increase anti-human IL-1RA at increasing concentrations Pretreat for 1 hour with either cP or active fragment of IL-1R AcP . Following the pretreatment, cells were treated with 5 pM of either human IL-1α or IL-1β. Stimulate for 24 hours. The amount of IL-6 secreted by cells in response to IL-1 Commercially available IL-6 EIA (Quantikine Assay for Humnon IL-6, R & D Systems, Minneapolis, MN). Active fragments of antibodies and IL-1R AcP The inhibitory effect of By determining the decrease in IL-6 secretion in the presence and absence of the inhibitor Calculate. For example, 5 pM and 100 pM of IL-1β, respectively, from MRC-5 cells Stimulated secretion of about 8100 and 9800 pg / ml of IL-6 (FIG. 17). IL-1 receptor The antagonist (IL-1RA) and the anti-human type I IL-1R antibody 4C1 This IL-6 secretion was blocked in response to 1β (FIG. 17). About IL-1RA and 4C1 Is an IC for blocking 5 pM of IL-1β₅₀Are 200 pM and 0.025 μg / ml, respectively. (FIG. 17). Inhibition by IL-1RA and 4C1 reduced the concentration of IL-1β to 100 pM. Can be overridden by raising. For 100 pM IL-1β, IL-1RA and IC for 4C1 inhibition₅₀Was greater than 1 nM and 10 μg / ml, respectively. Them The data show that IL-1 induced IL-6 from MRC-5 cells was expressed in I cells in murine cells. By the same means that L-1-dependent responses are also type I receptor dependent, IL-dependent 1 and type I IL-1R-dependent responses. 6, 7 and 8). Their IL-1 biological assay on murine cells is The identification of neutralization of the murine IL-1R AcP antibody was induced. Similarly, IL by MRC-5 cells -1 biological assay comprises anti-human IL-1R AcP antibody, and the activity of IL-1R AcP It can be used to identify fragment neutralization.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＶＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 39/395 ＡＢＥ 15/00 ＣＣ０７Ｋ 14/715 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ 16/28 ＡＤＰＣ１２Ｎ 5/10 ＡＤＡ 15/02 ＡＣＤＣ１２Ｐ 21/08 ＡＤＶ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI A61K 38/00 ADV C12N 5/00 B 39/395 ABE 15/00 C C07K 14/715 A61K 37/02 ABA 16/28 ADP C12N 5/10 ADA 15/02 ACD C12P 21/08 ADV // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (C12N 5/10 C12R 1:91) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE) , DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE) , SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, B, BG, BR, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, IS, JP, KP, KR, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ , PL, RO, SG, SI, SK, TR, TT, UA, US, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. A polynucleotide encoding an IL-1 receptor accessory protein or an active fragment thereof. 2. (A) a polynucleotide substantially having the sequence [SEQ ID NO: 1]; or (b) a polynucleotide that hybridizes to the DNA of (a) under moderate stringency conditions; or (c) a codon due to degeneracy of the genetic code. The polynucleotide of claim 1, comprising a DNA sequence selected from polynucleotides that differ in sequence. 3. The polynucleotide according to claim 1 or 2, which encodes a human IL-1 receptor accessory protein. 4. The polynucleotide according to claim 3, which encodes a human IL-1 receptor protein having an amino acid sequence [SEQ ID NO: 3] or an active fragment thereof. 5. The polynucleotide according to claim 4, having the sequence [SEQ ID NO: 1]. 6. The polynucleotide according to claim 1 or 2, which encodes a soluble IL-1 receptor accessory protein. 7. The polynucleotide of claim 6, which encodes a human soluble IL-1 receptor accessory protein. 8. The polynucleotide according to claim 7, which encodes a human soluble IL-1 receptor protein having an amino acid sequence [SEQ ID NO: 9] or an active fragment thereof. 9. The polynucleotide according to claim 8, which has a sequence [SEQ ID NO: 7]. Ten. The polynucleotide according to claim 1 or 2, which is an antisense polynucleotide. 11． A vector comprising the polynucleotide according to any one of claims 1 to 10. 12． 12. The vector according to claim 11, which is an expression vector. 13. A host cell comprising the vector according to claim 11 or 12. 14. An IL-1 receptor accessory protein or an active fragment thereof. 15． The protein according to claim 14, which is encoded by the polynucleotide according to claim 2. 16． 16. The protein according to claim 14, which is a human IL-1 receptor accessory protein. 17． 17. The protein according to claim 16, which has an amino acid sequence [SEQ ID NO: 3]. 18． 16. The protein according to claim 14, which is a soluble human IL-1 receptor accessory protein. 19. 19. The protein according to claim 18, which has an amino acid sequence [SEQ ID NO: 9]. 20. 20. A protein according to any one of claims 14 to 19 carrying one or more modified side groups. twenty one. An antibody that specifically binds to a human IL-1 receptor accessory protein and prevents activation of the IL-1 receptor complex by IL-1. twenty two. 22. The antibody according to claim 21, which is a monoclonal antibody. twenty three. About K _D 0.1 nM to about K _D 10 nM of claims 21 or 22 claim of antibodies with binding affinity to IL-1 receptor auxiliary complex. twenty four. A pharmaceutical composition comprising a compound according to any one of claims 10 and 14 to 23 and a pharmaceutically acceptable carrier. 25. The pharmaceutical composition according to claim 24, wherein the pharmaceutical composition is present in combination with one or more other cytokine antagonists. 26. A method for preparing an IL-1 receptor accessory protein, comprising: (a) expressing a polypeptide encoded by the DNA according to any one of claims 1 to 10 in a suitable host; Isolating the one receptor accessory protein, and (c) optionally converting it to an analog having one or more side groups modified. 27. A method for preparing an IL-1 receptor accessory protein antibody, comprising: (a) preparing a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody that specifically binds to the IL-1 receptor accessory protein; and (b) the monoclonal antibody. A process comprising the steps of preparing and isolating the compound. 28. 28. A compound according to any one of claims 14 to 23 prepared by the method according to claims 26 or 27. 29. 24. A compound according to any one of claims 24 and 14 to 23 for use as a therapeutically active substance. 30. 24. A compound according to any one of claims 10 and 14 to 23 for use in treating an inflammatory or immune response and for modulating and preventing the inflammatory or immunological activity of interleukin-1. 31. Use in the treatment of acute or chronic diseases, preferably rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, septic shock, transplant rejection, psoriasis, asthma and type I diabetes, or cancer, preferably acute and chronic myeloid leukemia. 24. A compound according to any one of claims 10 and 14 to 23 for: 32. Use of a compound according to any one of claims 10 and 14 to 23 for the manufacture of a medicament for the control or prevention of disease. 33. Claims 10 and 14 to 23 for the manufacture of a medicament for the treatment of an inflammatory or immune response and / or for modulating and preventing the inflammatory or immunological activity of interleukin-1. Use of a compound according to any one of the preceding claims. 34. Use of a medicament for the treatment and prevention of rheumatoid arthritis, inflammatory, bowel disease, septic shock, transplant rejection, psoriasis, asthma and type I diabetes, or the treatment or prevention of cancer, preferably acute and chronic myeloid leukemia. Use of a compound according to any one of claims 10 and 14 to 23 for the preparation. 35. Novel compounds, compositions, methods and uses thereof substantially as described herein.