JPH10511842A

JPH10511842A - Conjugates of metal complexes and oligonucleotides that specifically bind to specific target structures, agents containing those conjugates, their use in NMR diagnosis, and methods for their production

Info

Publication number: JPH10511842A
Application number: JP8504000A
Authority: JP
Inventors: プラツェック，ヨハネス; ニートバラ，ウルリッヒ; ラデューヘル，ベルント; ミューラー，アンドレアス; スペック，ウルリッヒ; ベルントルフ，ディートマー; ゴールド，ラリー; ピーケン，ボルフガンク
Original assignee: シェーリングアクチェンゲゼルシャフト; ネクスターファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-07-12
Publication date: 1998-11-17
Also published as: IL114235A0; EP0770146A1; AU3109095A; WO1996002669A1

Abstract

(57)【要約】本発明は連結成分によってオリゴヌクレオチドに連結されている錯生成剤または錯体を含有する化学的に変更されたオリゴヌクレオチド結合体に関する。この場合、オリゴヌクレオチドは天然に存在するヌクレアーゼによる分解を妨げるかまたは少なくとも有意に阻害するように変更される。該オリゴヌクレオチドは、標的構造に特異的に且つ高い結合親和力で結合することができ、従って結合した錯生成剤または錯体により特定の治療または診断効果をもたらすことができる。 (57) [Summary] The present invention relates to chemically modified oligonucleotide conjugates containing a complexing agent or complex linked to the oligonucleotide by a linking component. In this case, the oligonucleotide is modified to prevent or at least significantly inhibit degradation by the naturally occurring nuclease. The oligonucleotide can bind specifically and with high binding affinity to the target structure, and thus can provide a particular therapeutic or diagnostic effect with the bound complexing agent or complex.

Description

【発明の詳細な説明】特定の標的構造に特異的に結合する金属錯体とオリゴヌクレオチドの結合体、それらの結合体を含有する剤、ＮＭＲ診断におけるそれらの利用並びにそれらの製造方法本発明は、請求の範囲に特徴付けられる物質、即ち、錯生成剤または錯体の性質を示すオリゴヌクレオチド結合体に関する。それらの結合体はＮＭＲ診断の分野で使われる。画像診断はここ十年間で大きな進歩を遂げ、途切れることなく更に発展し続けている。現在は大きな干渉を伴わずに生体内の血管系、大部分の器官および多数の組織を視覚化することができる。多くは病気が診断される。何故なら、それらは体内の解剖学的構造物の形状、大きさおよび位置の明確な変化を引き起こすからである。体の内部からのそのような解剖学的データは、Ｘ線技術、超音波診断法および磁気共鳴断層撮影法により得ることができる。撮像写真の組織と体液のコントラストを強調する薬剤を使うことにより、上述の各技法の能率を改善することができる。問題の薬剤は腔または管のコントラストを変える目的で体腔に導入されるかまたは血管に注入される。その上、それらは生物中の血流を通して広がり、器官または組織の可視度を変えることができる。稀なケースではあるが、そのような物質は体内の或る構造に結合しそして／または能動輸送されそして／または体外に分泌される。こうして、個々の場合に機能を可視化することができ、病気の診断に用いることもできる。一般的な問題点は、問題の器官の形状、構造および循環に明確な変化が得られない時の病的変化の診断および局在化である。そのような診断および追跡調査は、例えば転移の調査、組織の酸素供給不足の評価を含む腫瘍疾患の場合、および或る種の感染の場合、並びに代謝疾患の場合に非常に重要である。現在利用可能な画像診断法は、他の方法では検出できない病的変化の部位に蓄積する薬剤の入手可能性に本質的にかかっている。現時点で商業的に見つけられる造影剤は、圧倒的にいわゆる非特異的製剤である。それらは例えば注射により導入される空間に受動的に拡散する。過去に、検出することができるかまたは生存生物中でのそれらの分布に関して特異性を有すると期待される多くの物質や物質群が同定されている。この例は、抗体の他に、レクチン、あらゆる型のレセプター結合物質、細胞、膜および膜成分、核酸、天然代謝産物およびそれらの誘導体、並びに無数の薬用物質である。ペプチドが研究されており、また特別に関心をもって研究されている。 EP-A-0 285 057は、使用されるヌクレオチドの生体内不安定性のために生体内診断剤としての使用に適当でなく、また適合性と薬物動態学の他の必要条件もほとんど満たさない、ヌクレオチド−錯生成剤結合体を記載している。多数の米国特許、例えば米国特許第4,707,440 号は、検出可能な化学基を含有する変型ポリマーを扱っている。このポリマーはポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドであることができるが、それらは天然に存在するヌクレアーゼによる分解に対して安定化されていないし、また特殊の方法により高い結合親和力で標的構造に特異的に結合するように選択されてもいない。これらの検出可能な分子の特定態様は米国特許第4,843,122号と同第4,943,523号に記載されている。この形で変更された各ヌクレオチドは米国特許第4,952,685 号に開示されている。画像診断法におけるそれらの剤の使用は米国特許第4,849,208号に開示されている。本発明の目的は、例えば、試験管内および生体内における器官、組織およびそれらの病的変化の視覚化が可能になる、標的構造の検出用の特異的結合診断剤の提供である。この目的は、直接結合または連結成分により結合されたオリゴヌクレオチド基と錯生成剤を表し、そのオリゴヌクレオチド基が天然に存在するヌクレアーゼによる分解を妨げるかまたは少なくとも有意に阻害するように変更されている、オリゴヌクレオチド結合体により達成される。本発明の目的は次のものである：１．オリゴヌクレオチド基Ｎとｎ個の置換基（Ｂ−Ｋ）とから成るオリゴヌクレオチド結合体であって、ここでＢは直接結合を表すかまたはオリゴヌクレオチド基への連結成分を表し、そしてＫは原子番号21〜29，42，44または58〜70の元素の錯体または錯生成剤を意味し、オリゴヌクレオチド基Ｎが天然に存在するヌクレアーゼによる分解を妨げるかまたは少なくとも有意に阻害する変更を示すことを特徴とするオリゴヌクレオチド結合体。２．好ましい形態では、本発明のオリゴヌクレオチド結合体は一般式Ｎ−（Ｂ−Ｋ）_n （Ｉ）を有し、上式中Ｎは高い結合親和力で他の標的構造に特異的に結合し且つ天然に存在するヌクレアーゼによる分解を有意に減少させる変更を示すオリゴヌクレオチドであり、ＢはＮとＫとの間に連結を生む化学結合または連結成分であり、Ｋは項目１で言及した原子番号を有する少なくとも１つの元素を表す錯生成リガンドであり、そしてｎは１〜30の数である。３．Ｎが５〜200ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドであり、 a) 糖単位の２′位が互いに独立的に次の基： −ＯＲ基（ここでＲは１〜20個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により２個までのヒドロキシル基を含むことがあり、そして場合により１〜５個の酸素原子により中断されることがあるアルキル基を意味する）、水素原子、ヒドロキシル基、フッ素原子、アミン基、アミノ基により占有されており、そして３′位と５′位に存在するヒドロキシル基が場合によりＲ基でエーテル化されていることがあり、そして／または b) ヌクレオチド間結合として使われるホスホジエステルが、互いに独立的に、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはアルキルホスホネート、特に好ましくはメチルホスホネートにより置換されており、そして／または c) ３′位および５′位の末端基がb)に記載したようなヌクレオチド間結合により結合されており、そして／または d) 前記化合物が場合により３′−３′または５′−５′位を結合するb)に記載されたようなヌクレオチド間結合を含むことがあり、そして／または e) 前記化合物が場合により、それぞれ３′位のＣ₂〜Ｃ₁₀ヒドロキシアルキル基により２つのチミジンをエステル様に連結するか、または２′位もしくは３ ′位もしくは５′位のヒドロキシル基を使って類似的に置換されたチミジン基をエステル様に連結する、b)に記載したようなホスホジエステル結合を含むことがあり、そして／または f) 場合により変更されることがあるヌクレオチド間結合が好ましくはポリヌクレオチドの末端上、特に好ましくはチミジン上に含まれる、項目１または２に記載の化合物。４．オリゴヌクレオチドＮが10〜100ヌクレオチドを含んで成る、項目３に記載の化合物。５．Ｎが別の標的構造に高い結合親和力で特異的に結合するオリゴヌクレオチドであり、そしてランダムな配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を前記標的構造と一緒にし、或るオリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチド混合物に比較して増加された前記標的構造に対する親和力を示し、後者を前記オリゴヌクレオチド混合物の残りから分離し、次いで増加された標的構造に対する親和力を有するオリゴヌクレオチドを増幅させ、標的構造上に結合するオリゴヌクレオチドの割合が増加されたオリゴヌクレオチドの混合物を得ることから得ることができるオリゴヌクレオチドである、項目１〜４のいずれか１つに記載の化合物。６．Ｎが別の標的構造に高い結合親和力で特異的に結合するオリゴヌクレオチドであり、そして a) まず、このＤＮＡ鎖が３′末端ではＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターに相補的であり且つ同時にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーに相補的である限定された配列を示し、このＤＮＡ鎖が５′末端ではポリメラーゼ連鎖反応のプライマー配列に相補的である限定されたＤＮＡ配列を示し、そして前記２つの限定配列の間の配列がランダム配列を含むように、化学合成によってＤＮＡ鎖を製造し、 b) このＤＮＡ鎖をＲＮＡポリメラーゼの助けをかりてＲＮＡ鎖に転写し、そしてリボース単位の２′位が変更されているヌクレオチドを該ポリメラーゼに供給し、 c) こうして製造されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを該オリゴヌクレオチドが特異的に結合することができる標的構造と一緒にし、 d) 標的構造上に結合したそれらのオリゴヌクレオチドをまず標的構造と一緒に未結合のオリゴヌクレオチドから分離し、次いで結合したオリゴヌクレオチドを標的構造から分離し、 e) それらの標的構造特異的ＲＮＡオリゴヌクレオチドを逆転写酵素の助けをかりて相補的ＤＮＡ鎖に転写し、 f) それらのＤＮＡ鎖を限定プライマー配列を使ってポリメラーゼ連鎖反応により増幅せしめ、 g) こうして増幅させたＤＮＡオリゴヌクレオチドを、次いでＲＮＡポリメラーゼの助けをかりてそして変型ヌクレオチドを使って再びＲＮＡオリゴヌクレオチドに転写し、そして h) 所望により上述の選択段階c)〜g)を、標的構造に対する高い結合親和力により特徴づけられるオリゴヌクレオチドが十分に選択されるまで繰り返し、次いで所望によりこうして得られたオリゴヌクレオチドの配列を決定することができるということにより得ることができるオリゴヌクレオチドである、項目１〜５のいずれか１つに記載の化合物。７．前記標的構造が巨大分子、高等生物、例えば動物またはヒトの組織構造物、動物またはヒトの器官または器官の部分、腫瘍細胞または腫瘍である、項目６に記載の化合物。８．連結成分Ｂが a) ４′位がCH₂-OH基により還元されたオリゴヌクレオチド基Ｎの４′末端に結合され、そして／または b) ３′位が水素原子により還元されたオリゴヌクレオチド基Ｎの３′末端に結合され、そして／または c) 各場合に２つのヌクレオチド間の、OH基により還元された１または複数のホスホジエステル結合に結合され、そして／または d) それぞれ５，８位が水素原子によりそして／または２，４および６位がアミノ基により還元されている１〜30個の核酸塩基（nucleobase）に結合されている、項目１〜７のいずれか１つに記載の化合物。９．Ｂが一般式Ｘ−Ｙ−Ｚ¹を有し、Ｘ側で錯生成剤または錯体と連結されそしてＺ側でオリゴヌクレオチドと連結され、ここでＸは直接結合、−ＮＨ基または−Ｓ基を表し、Ｙは直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキレン鎖であり、前記アルキレン鎖は場合により１〜２個のシクロヘキシレン、１〜５個のイミノ、１〜３個のフェニレン、１〜３個のフェニレンイミノ、１〜３個のフェニレンオキシ、１〜３個のヒドロキシフェニレン、１〜５個のアミド、１〜２個のヒドラジド、１〜５個のカルボニル、１〜５個のエチレンオキシ、１個のウレイド、１個のチオウレイド、１〜２個のカルボキシアルキルイミノ、１〜２個のエステル基、１〜３個のAr基（ここでArは場合により窒素、酸素および硫黄から選択された１〜２個のヘテロ原子および／または１〜２個のカルボニル基を含むことがある飽和または不飽和の５員環または６員環を表す）、１〜10個の酸素、１〜５個の窒素および／または１〜５個の硫黄原子を含むことがあり、そして／または場合により１〜５個のヒドロキシ、１〜２個のメルカプト、１〜５個のオキソ、１〜５個のチオキソ、１〜３個のカルボキシ、１〜５個のカルボキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル、１〜５個のエステル、１〜３個のアミノ、１〜３個のヒドロキシ−Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル、１〜３個のＣ₁〜Ｃ₇ アルコキシ基により置換されることがあり、そしてＺ¹は−CONH−CH₂−４′，−NH−CO−４′，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ¹−NH−CH₂−４ ′，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ¹−Ｏ−CH₂−４′，−Ｏ−Ｐ（Ｓ）Ｒ¹−Ｏ−３′または −Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ¹−Ｏ−３′を表し、ここで４′または３′は末端糖単位への結合を示し、そしてＲ¹はＯ^-，Ｓ^-，Ｃ₁〜Ｃ₄アルキルまたはＮＲ²Ｒ³（Ｒ²およびＲ³は水素またはＣ₁〜Ｃ₄アルキル基を意味する）基を表す、項目８a)または８b)に記載の化合物。環状構造Arとしては、３〜６個、特に５または６個のＣ原子を有し、場合によりヘテロ原子、例えばＮ，ＳまたはＯを含むことがある飽和または不飽和環状アルキレンが適当である。例えば、シクロペンチレン、ピロリレン、フラニレン、チオフェニレン、イミダゾリレン、オキサゾリリデン、チアゾリレン、ピラゾリレン、ピロリジレン、ピリジレン、ピリミジレン、マレインイミジレンおよびフタルイミジレン基が考えられる。 10．Ｂが一般式Ｘ−Ｙ−Ｚ²を有し、ここで２つの隣接糖単位を連結するブリッジの中のＺ²は、基−ＮＲ²− 、−Ｏ−または−Ｓ−を表し、そしてＸ，ＹおよびＲ²は項目９に与えられた意味を有する、項目８c)に記載の化合物。連結成分Ｚ¹−Ｙ−ＸまたはＺ²−Ｙ−Ｘの基Ｙとしては、基を例として挙げることができる。 11．Ｂが一般式Ｘ−Ｙ−Ｚ³を有し、ここでＺ³は−ＮＨ基または塩基への直接結合を表しそしてＸとＹは項目９で与えられた意味を有する、項目８d)に記載の化合物。連結成分Ｚ³−Ｙ−Ｘの基Ｙとしては、基を例として挙げることができる。結合部位としては、プリン塩基の場合は特に８位が適当であり、そしてピリミジン塩基の場合は５位が適当である。この場合純粋に形式的に、それぞれの塩基の水素原子が基Ｂ−Ｋにより置換される。しかし、結合は２位、４位または６位に含まれることがあるアミノ基により、即ち例えばグアニンの２−アミノ基により、アデニンの６−アミノ基によりまたはシトシンの４−アミノ基により起こることもできる。この場合、それぞれのアミノ基の水素原子が基Ｂ−Ｋによりそれぞれ置換される。 12．金属錯体がイメージング元素としてガドリニウム、マンガンまたは鉄を含有する、上記項目のいずれか１つに記載の化合物。 13．標的構造の検出方法であって、上記項目のいずれか１つに記載の１または複数の化合物を生体内または試験管内で研究する予定の試料と一緒にし、そしてシグナルに基づいて、オリゴヌクレオチドＮが特異的に且つ高親和力で結合する標的構造が試料中に存在するかどうかを検出することを含んで成る方法。 14．病気の非侵害的診断方法であって、項目１〜12のいずれか１つに記載の１または複数の化合物を生体内で研究する予定の試料と一緒にし、そしてシグナルに基づいて、オリゴヌクレオチドＮが特異的に且つ高親和力で結合する標的構造が研究しようとする生物中に存在するかどうかを検出することを含んで成る方法。オリゴヌクレオチド基と連結されるイメージング置換基Ｂ−Ｋの数は、一方ではオリゴヌクレオチドの数値により制限されるが、決して30を越えることはない。本発明によれば、１〜20個の置換基Ｂ−Ｋが好ましい。オリゴヌクレオチド基Ｎの数値は理論上は制限されない。本発明には、５〜20 0ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが実用的であり、10〜100ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが特に好ましい。本発明に従って用いることができるオリゴヌクレオチドは、生体内に存在するヌクレアーゼによる分解に対して安定化されている。未変型オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはエンドヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼにより生体内で開裂される。ＲＮＡ鎖におけるのこの分解反応は２′−ヒドロキシ基の活性化で始まる。他の異化酵素は、例えば、ＲＮＳのホスホジエステル結合を開裂させるリボザイムである〔Science 261 ，709（1993）を参照のこと〕。ＲＮＳ誘導体の生体内安定性は、別の置換基による２′−ヒドロキシル基の部分置換または完全置換により増大させることができる。そのような置換基は、例えば、アルコキシ基、特にメトキシ基〔例えばChem．Pharm．Bul l．13，1273（1985），Biochemistry 10，2581（1971）を参照のこと〕、水素原子、フッ素原子〔例えばCan.J．Chem．46，1131（1968）を参照のこと〕、またはアミノ基〔例えばJ．Org．Chem．42，714(1977)を参照のこと〕である。それらの基の幾つかと他の置換基は、1994年６月22日出願の米国特許出願第08/264,0 29号に開示された方法を使って２′位に導入することもできる。ヌクレオチド間結合を安定化するための他の可能性は、ホスホロチオエート〔Trends Biochem． Sci．14，97(1989)〕またはホスホロジチオエート〔J．Chem．Soc.，Chem．Comm un．591(1983)および Nucleic Acids Res．12，9095（1984）〕を形成しながらのホスホジエステル結合中の１個もしくは２個の酸素原子の置換、およびホスホジエステルの代わりのアルキルホスホネートの使用〔Ann．Rep．N.Y．Acad．Sci．507 ，220（1988）〕である。この安定化は、リボース単位の２′位のヒドロキシル基を互いに独立的に変更することにおいて達成することができる。そのような変更は、ＯＲ基、ハロゲン原子、特にフッ素原子、水素原子またはアミン基、特にアミノ基、によるこのヒドロキシル基の置換により達成することができる。アルコキシ基の基Ｒは、この場合、１〜20 個のＣ原子を有する直鎖もしくは枝分かれアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、tert−ブチル、ペンチルもしくはヘキシル、または４〜20個のＣ原子を有する環状飽和もしくは不飽和アルキル基、例えばシクロペンチルもしくはシクロヘキシルを表す。ポリヌクレオチドの別の安定化は、ヌクレオチド間結合として使われるホスホジエステルが互いに独立的にホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはアルキルホスホネート、特に好ましくは低級アルキルホスホネート、例えばメチルホスホネートにより部分的にもしくは完全に置換されることでも起こる。それらのヌクレオチド間結合は、３′位と５′位の末端基に結合させることもでき、または３′−３′位もしくは５′−５′位を連結することもできる。ホスホジエステル結合は、塩基の窒素原子または炭素原子上に存在するヒドロキシアルキル基による別の結合を可能にし、例えば、３位に存在するヒドロキシアルキル鎖により２つのチミジンを結合させることができまたは８位に存在する基により２つのプリン塩基を結合させることができる。この結合は２′位または３′位または５′位のヒドロキシル基にも起こり得る。変型ヌクレオチド間結合は所望により好ましくはポリヌクレオチドの末端に存在することができ、それらは特に好ましくはチミジン上に存在する。本発明によれば、使用するオリゴヌクレオチド基Ｎは特定のオリゴヌクレオチド配列に限定されない。しかし、高い結合親和力で特異的に他の標的構造に結合するオリゴヌクレオチドが好ましい。本発明の結合体の出発物質として必要とされる適当なオリゴヌクレオチドを同定する方法は米国特許第5,270,163 号に記載されている。SELEX と呼ばれるこの方法は、任意の所望の標的分子に対して核酸リガンドを作製するのに用いることができる。 SELEX 法は、事実上どんな所望の結合親和力および選択性の基準を達成するためにも同一の一般的選別スキームを使う、候補となるオリゴヌクレオチドの混合物からの選択、並びに結合、分別および増幅の段階的反復を包含する。SELEX 法は、好ましくはランダム配列のセグメントを含んで成る核酸の混合物から出発して、前記混合物を結合に好都合な条件下で標的と接触させ、標的分子に特異的に結合したそれらの核酸から未結合の核酸を分離し、核酸−標的複合体を解離させ、核酸−標的複合体から解離された核酸を増幅せしめてリガンドが富化された核酸混合物を与え、次いで所望するサイクルだけ結合、分別、解離および増幅の段階を繰り返し、標的分子に対して高度に特異的で高親和性の核酸リガンドを得るという段階を含んで成る。基本的なSELEX 法は、多数の特定の目標を達成するために変更されている。例えば、1992年10月14日出願の米国特許出願第07/960,093号は、特定の構造的特徴を有する核酸分子（例えばイネ科DNA）を選択するためのゲル電気泳動と併用したSELEX の使用を記載している。1993年９月17日出願の米国特許出願第08/123,9 35号は、標的分子に結合および／または光架橋することができるおよび／または標的分子を光失活させることができる光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するためのSELEX をベースにした方法を記載している。1993年10月７日出願の米国特許出願第08/134,028号は、Counter-SELEX と名付けられた、密接に関連した分子間を識別することができる高特異的核酸リガンドを同定する方法を記載している。1993年10月25日出願の米国特許出願第08/143,564号は、標的分子に対して高および低親和性を有するオリゴヌクレオチド間を非常に効率的に分別することができるSELEX をベースにした方法を記載している。1992年10月21日出願の米国特許出願第07/964,624号は、SELEX を実施した後の改善された核酸リガンドを得る方法を記載している。1995年３月８日出願の米国特許出願第08/400,440号は、リガンドをそれの標的に共有結合的に結合させる方法を記載している。 SELEX 法は、リガンドに改善された特徴（例えば生体内安定性または改善された配送性質）を付与する変型ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような変更の例としては、リボースおよび／またはリン酸基における化学的置換および／または塩基置換が挙げられる。SELEX で同定された変型ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは1993年９月８日に出願の米国特許出願第08/117,991号に記載されており、その出願明細書はピリミジンの５′位と２ ′位が化学的に変更されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載している。前掲の米国特許出願第08/134,028 号は、２′−アミノ（２′−N H₂）、２′−フルオロ（２′−Ｆ）および／または２′−Ｏ−メチル（２′−Ｏ Me）により変更された１もしくは複数のヌクレオチドを含有する高特異的核酸リガンドを記載している。1994年６月22日に出願の米国特許出願第 08/264,029 号は、様々な２′−変更ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載している。 SELEX 法は、選択されたオリゴヌクレオチドを、1994年８月２日に出願の米国特許出願第08/284,063号および1994年４月28日に出願の米国特許出願第08/234,9 97号にそれぞれ記載されたような別の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合わせることを包含する。それらの応用は、多数の形状および別の性質の組合せ、並びに別の分子の望ましい性質とオリゴヌクレオチドの効率的増幅および複製性質の組合せを可能にする。最も基本的な形態では、SELEX 法は次の連続した段階により定義することができる： 1) 様々な配列を有する核酸の候補混合物を調製する。この候補混合物は一般的に、固定した配列の領域（即ち、候補混合物の各メンバーは同じ位置に同じ配列を含む）とランダムな配列の領域を含む。固定配列領域は、(a)後述の増幅段階で役立つように、(b)標的に結合することが知られている配列を模倣するように、または(c)候補混合物中の与えられた核酸の構造的整列の濃度を増大させるように選択される。ランダム配列は完全にランダムである（即ち、いずれかの位置で或る１つの塩基を見つける確率が１／４である）かまたは部分的にのみランダムである（例えばいずれかの位置で或る１つの塩基を見つける確率が０〜100 ％のいずれかのレベルにあるように選択することができる）ことができる。 2) 標的と候補混合物のメンバーとの結合に好都合である条件下で候補混合物を特定の標的と接触せしめる。これらの条件下では、標的と候補混合物の核酸との間の相互作用は、標的に対して最も強い親和力を有するそれらの核酸と標的との間で核酸−標的ペアを形成すると見なすことができる。 3) 標的に対して最高の親和力を有する核酸を低い親和力を有する核酸から分別する。最高の親和力の核酸に相当する配列はごく少数（ことによるとただ１分子の核酸）しか候補混合物中に存在しないので、分別中に候補混合物中に有意な量の核酸（約５〜50％）が保持されるように分別基準を設定することが一般に望ましい。 4) 分別中に選択された、標的に対して比較的高い親和力を有するそれらの核酸を次いで増幅せしめ、標的に対して比較的高い親和力を有する核酸が富化されている新しい候補混合物を得る。 5) 上記の分別と増幅の段階を繰り返すことにより、新たに作られた候補混合物はユニーク配列をだんだん少なく含むようになり、標的に対する核酸の平均親和力が一般に増加するだろう。極端な方法をとれば、SELEX 法は標的分子に対して最大の親和力を有するもとの候補混合物からの核酸を代表する１つのまたは少数のユニーク核酸を含有する候補混合物を与えるだろう。 SELEX 特許および出願明細書はこの方法について記載しそしてより詳細に詳述している。この方法で使うことができる標的；候補混合物の中の核酸の分離方法；および富化された候補混合物を得るための分離された核酸の増幅方法が含まれる。SELEX 特許および出願明細書は、多数の標的種（タンパク質が核酸結合タンパク質であるものとそうでないものの両方のタンパク質標的を含む）に対して得られたリガンドも記載している。従って、SELEX 法は標的分子の高親和性リガンドを提供するのに使うことができる。標的分子は好ましくはタンパク質であるが、特に炭水化物、ペプチドグリカンおよび様々な小分子も含むことができる。従来のタンパク様抗体と同様に、生物学的構造の必須部分である分子との特異的相互作用を通して、標的の生物学的構造、例えば細胞表面またはウイルスに対する核酸抗体（オリゴヌクレオチドリガンド）を使うことができる。オリゴヌクレオチドリガンドは、従来の抗体が持つような自己寛容によって制限されないという点で有利である。また、SELEX は完全に試験管内法であるため、核酸抗体は合成または生産に動物や細胞培養物を必要としない。周知の通り、核酸は相補的核酸配列に結合することができる。核酸のこの性質は、核酸分子の検出、定量および単離に広く利用されている。従って、本発明の方法は核酸間のそれらの周知の結合能力を包含するつもりはない。詳しくは、核酸抗体の使用に関する本発明の方法は、核酸分子間の周知の結合親和力を包含しない。多くのタンパク質は、核酸オペレーター配列に結合する調節タンパク質のように、核酸配列への結合を通して機能することが知られている。それらの生来の部位に結合する或る種の核酸結合タンパク質の既知能力は、例えば、そのようなタンパク質の検出、定量、単離および精製に使われている。オリゴヌクレオチドリガンドの使用に関する本発明の方法は、核酸結合タンパク質とそれらが結合することが知られている核酸配列との間の既知の結合親和力を包含するものではない。しかしながら、SELEX 法を使って、同じ核酸結合タンパク質に結合する新規の非天然配列を開発することができる。特に、本発明のオリゴヌクレオチドリガンドは、主としてワトソン／クリック塩基対合または三重ヘリックス結合に頼るメカニズムを通して前記オリゴヌクレオチドリガンドに結合するポリヌクレオチド以外の、三次元化学構造を含むそのような標的分子に結合し、ここで前記オリゴヌクレオチドリガンドは標的分子により結合される既知の物理的機能を有する核酸ではない。 SELEX はタンパク質に結合するであろう核酸配列の非常に迅速な決定を可能にするので、未知のオペレーターおよび結合部位配列の構造を容易に決定することができ、次いでそれらの配列を本明細書に記載されるような用途に使うことができる。よってSELEX 法は、核酸を結合することが知られていないタンパク質の検出、定量、単離および精製への核酸分子の一般的な利用方法である。それに加えて、SELEX により単離することができる或る種の核酸抗体を使って特定の標的分子または標的構造の機能に影響を及ぼす（例えば該機能を阻害、増強または活性化する）こともできる。つまり、核酸抗体を使ってタンパク質の機能を阻害、増強または活性化することができる。本発明の結合体に使われるオリゴヌクレオチドは、後述する方法に従った好ましい態様において得られる。適当なオリゴヌクレオチドは、ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を標的構造と一緒にし、オリゴヌクレオチドの混合物に比較して増加された標的構造に対する親和力を示す或るオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド混合物の残りから分離し、次いで増加された標的構造に対する親和力を有するオリゴヌクレオチドを増幅せしめ、標的構造に結合するオリゴヌクレオチドの割合が増加されたオリゴヌクレオチドの混合物を得るということから得ることができる。この方法では、好ましい態様では、まず初めに化学合成によってＤＮＡ鎖が製造される。このＤＮＡ鎖は３′末端上に、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターとして使われ且つ同時にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプライマー配列に相補的でもある既知の配列を有する。特に好ましい態様では、これはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターである。次いで、このプロモーターを基に、ランダム配列が該プロモーターに沿って合成される。ランダム配列は、適当な４塩基を合成装置中に同じ割合で供給することから得ることができる。こうして、完全にランダムなＤＮＡ配列が生じる。好ましい態様では、ランダム配列の長さは約15〜100 ヌクレオチドである。ランダム配列を有するこのＤＮＡ鎖を基に別のＤＮＡ配列が合成される。この場合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使うことができる。このＤＮＡ鎖の合成の後、ＲＮＡポリメラーゼの助けをかりて該ＤＮＡ鎖を相補的ＲＮＡ鎖に転写する。好ましい態様では、この場合Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが使われる。転写の際に、変更されたヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼに供給される。特に好ましい態様では、リボースが２′位で変更されている。この場合、それはアルコキシ基（好ましくはメトキシ基）、アミノ基またはフッ素原子による水素原子またはヒドロキシル基の置換であることができる。こうして製造されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは次いで選択段階に差し出される。選択段階では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが標的構造と一緒にされる。標的構造は、該オリゴヌクレオチドが特異的に且つ高親和力で結合することができる構造として定義される。そのような構造は、例えば、巨大分子、高等生物（例えば動物またはヒト）の組織構造、器官または器官の部分、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍である。この目的上、標的構造は完全に純粋な形態でなければならず、それは天然に存在する器官または細胞表面上に存在することもできる。SELEX 反応へのポリアミノ（ｔＲＮＡ、ヘパリン）、血漿または全血の添加により選択段階に緊縮性が適用されることがある。その中に単離タンパク質が含まれるならば、該タンパク質を固相、例えばフィルターに結合させることができる。選択の際には、ＲＮＡ混合物に対して過剰量の標的構造が使われる。インキュベーション中に特定のオリゴヌクレオチド分子が標的構造上に結合し、一方で未結合のオリゴヌクレオチドは例えば洗浄により混合物から分離される。次いで、適当な緩衝液または溶媒で洗浄することにより、標的分子から該オリゴヌクレオチド分子が分離されまたは取り外される。次いで、得られたＲＮＡオリゴヌクレオチドは逆転写酵素の助けをかりて完全なＤＮＡ鎖に転写される。得ようとするＤＮＡ鎖は両端にプライマー配列（またはプロモーター配列）を有するので、得られたＤＮＡ鎖の増幅はポリメラーゼ連鎖反応を使って簡単に実施することができる。こうして増幅されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、次いでＲＮＡポリメラーゼの助けを借りて再びＲＮＡオリゴヌクレオチドに転写され、そうして得られたＲＮＡオリゴヌクレオチドは更なる選択段階（上述）に使うことができる。二回目の選択段階で得られた結合したＲＮＡオリゴヌクレオチドを標的分子から分離した後、該ＲＮＡオリゴヌクレオチドを逆転写酵素の助けをかりて再びＤＮＡに転写し、こうして得られた相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応を使って増幅せしめ、次いでＲＮＡポリメラーゼの助けをかりて再びＲＮＡオリゴヌクレオチドに転写し、それを更なる選択段階に利用することができる。所望の高特異性と高結合親和力は、選択段階を数回繰り返せば得られることがわかった。１回または２回の選択段階の後のような早期に所望のオリゴヌクレオチド配列が得られることはめったにないだろう。標的配列とオリゴヌクレオチドとの間に所望の特異性と結合親和力が得られたらすぐに、オリゴヌクレオチドを配列決定することができ、結果として特異的に結合するオリゴヌクレオチドの配列を決定することができる。この方法において特に有利であるのは、この方法が適当なタンパク質に使えるだけでなく、生体内でも使えることである。しかし上述の選択工程は精製した標的構造に対して実施することもできる。特に生体内診断には、生存環境においてオリゴヌクレオチドの特異性が提供されることが不可欠である。従って、選択工程は細胞または細胞培養物、組織または組織切片、灌流させた組織および生存生物においてさえも実施することができる。この場合、変型オリゴヌクレオチドが大抵の偏在するＲＮＡによる分解に耐えられることが有利である。結果として、対応する天然のオリゴヌクレオチドは該ＲＮＡにより分解されるだろうから、選択工程において所望のオリゴヌクレオチド配列が生存生物中に蓄積する。オリゴヌクレオチド基Ｎは１もしくは複数の連結成分Ｂ、または置換基Ｂ−Ｋを表すことができ、それらは互いに独立的に選択することができる。特許請求されるのは、１〜30個の同一のまたは２〜30個の異なる連結成分Ｂを含有するオリゴヌクレオチド結合体である。連結成分Ｂは、オリゴヌクレオチド基Ｎを錯生成剤または錯体Ｋと連結する。有利には、Ｏ，ＳおよびＮ供与原子を有する多座配位の、開鎖状のまたは環状の錯生成リガンドを使うことができる。錯生成剤−基Ｋの例として、水素、ヒドロキシ基および／または酢酸基により還元されたポリアミノポリカルボン酸、即ちエチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸、１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン四酢酸、１，４，７−トリアザシクロノナン三酢酸、１，４，８，11−テトラアザテトラデカン四酢酸、１，５，９−トリアザシクロドデカン三酢酸、１，４，７，10−テトラアザジクロドデカン三酢酸、および３，６，９，15−テトラアザビシクロ〔９，３，１〕ペンタ−１（15），11， 13−トリエン三酢酸を挙げることができる。適当な錯生成剤は、例えばEP 0 485 045，EP 0 071 564およびEP0 588 229 中並びにDE 43 10 999およびDE 43 11 023中に記載されている。本発明の錯生成剤Ｋの様々な可能性を説明するために、幾つかの有利な構造が集められている図１および図２を参照することができる。これらの図面は抜粋としての意味であり、示された錯生成剤に本発明を限定するものではない。錯生成剤ＫはＮＭＲ診断に有用なあらゆる常磁性金属イオンを含有することができる。本発明に適当な同位体は、原子番号21〜29，42，44または58〜70の元素から選択される。それらは特に原子番号21〜29，42，44および58〜70の元素の二価値および三価イオンである。適当なイオンは、例えば、クロム（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、プラセオジム（III）、ネオジム（III）、サマリウム（III）およびイットリウム（III）イオンである。非常に大きい磁気モーメントのため、ガドリニウム（III）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、マンガン（II）、エルビウム（III）および鉄（I II）イオンが特に好ましい。上述の元素を錯生成するのに必要でないカルボン酸基は、所望により無機または有機塩基の塩として、例えばアルカリまたはアルカリ土類金属の水酸化物および炭酸塩、特に水酸化ナトリウムおよびカリウム、またはアンモニアおよびアルキルアミン、またはアミノ酸の塩としてまたはエステルもしくはアミドとして存在することができる。本発明は更に、本発明の結合体の製造方法に関する。オリゴヌクレオチドの５′末端上に前記置換基が結合されている結合体は、オリゴヌクレオチドとホスホロアミダイド誘導体との反応により得ることができる〔Tetrahedron 49，1925-1963(1993)〕。このためには、オリゴヌクレオチドの５′−ヒドロキシ基を一般式ＰＲ’（ＮＲ₂''）ＯＲ'''のホスホロアミダイトと反応させる。この場合、Ｒ’は場合によりＮ，NO₂，SiまたはSO₂を含有することがあり１〜20個のＣ原子を有するアルキル、アルコキシまたはアリールアルコキシ基、例えば場合により置換されることがあるメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ベンジルオキシまたはフェニルエトキシを表す。置換基としては、特にシアノおよびニトロ基が使われる。有利には、例えばメトキシ、β−シアノエトキシまたはニトロフェニルエトキシ基を使うことができる。特に好ましいのはβ−シアノエトキシ基である。Ｒ''はＣ₁〜Ｃ₄アルキル基であり、エチルおよびプロピル基が時に適当である。好ましいのはイソプロピル基である。Ｒ'''は場合によりＳ，Ｏ，Ｎ，CN，NO₂またはハロゲンを含むことがある、１〜20個のＣ原子を有するアルキルまたはアリールアルキル基である。好ましくは、保護されたアミノおよびチオアルキル基並びに保護されたアミノおよびチオオキサアルキル基が使われる。特に好ましいのは、６−アミノヘキシル、６−チオヘキシル、３，６，９−トリオキサ−11−アミノウンデシルおよび３，６−ジオキサ−８−アミノオクタニル基である。保護基としては、常用のＮまたはＳ保護基を一般に使うことができる。例えば、トリフルオロアセチル、フタルイミドおよびモノメトキシトリチル基が適当である。本発明の特に好ましい態様では、ホスホロアミダイト誘導体としてβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−６−（トリフルオロアセトアミド）− １−ヘキシルホスホロアミダイトが使われる。本発明の別の好ましい態様では、ホスホロアミダイト誘導体としてβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−（３，６，９−トリオキサ−11−フタルイミド−１−ウンデシル）ホスホロアミダイトが使われる。本発明の更なる態様では、上述したものと同様にして連結成分Ｂがリン含有基によりオリゴヌクレオチドＮの３′末端に結合される。オリゴヌクレオチドとホスホロアミダイトの間の上述の反応は固相反応として行うことができ、またオリゴヌクレオチドが自動合成装置のカラム上に存在することもできる。所望の配列のオリゴヌクレオチドが得られそして例えばトリクロロ酢酸を使って該オリゴヌクレオチドの５′−ヒドロキシ基の暴露が行われた後、それをホスホロアミダイトと反応せしめ、反応生成物を酸化しそして遊離させる。次いで、そうして得られたオリゴヌクレオチド誘導体を、末端アミノまたはチオール基上で所望により別のリンカー基により錯生成剤または錯体Ｋと結合させる。第一段階でリン含有基によりオリゴヌクレオチドと結合された基は、次いで所望により存在する追加のリンカー基と一緒になって、連結成分Ｂを形成する。オリゴヌクレオチドと錯生成剤の間の結合は、オリゴヌクレオチドの遊離の５ ′−ヒドロキシル基が末端に結合可能なリン基を有する錯生成剤または錯体と反応するように行うこともできる。そのようなものは式（上式中Ｒ^aは場合によりβ位にシアノ基を有することがあるＣ₁〜Ｃ₆アルキル基を表し、Ｒ^bは第二級アミノ基を表し、そしてＫおよびＢは言及された意味を有する）または式（上式中Ｒ^cはトリアルキルアンモニウムカチオンを表し、そしてＫおよびＢは言及された意味を有する）または式（上式中Ｒ^dは場合により１もしくは複数のハロゲン原子によりおよび／または１もしくは複数のニトロ基により置換されることがあるアリール基、または場合により β位がシアノ基で置換されることがあるＣ₁〜Ｃ₆アルキル基を表し、そしてＫ，ＢおよびＲ^Cは言及された意味を有する）により表すことができ、そして式a)の基を使う時、ホスフェートへの酸化段階はカップリング段階の終了後に行われる。基−ＯＲ^aまたは−ＯＲ^cはどちらの場合でも所望により加水分解により開裂させることができる。リンカーによるオリゴヌクレオチド誘導体と錯生成剤または錯体Ｋとの連結は、自動合成装置のカラム上での固相反応として起こることもできる。次いで溶解により固体基剤から本発明の化合物を単離することができる。オリゴヌクレオチドとリンカーの結合は末端ヌクレオチドの糖の５′−ＯＨ基により起こるだけでなく、５′−ＯＨ基から誘導することができる別の官能基、例えばアミノまたはカルボキシ基によって起こることもできる。そのようなアミノまたはカルボキシ基を有するヌクレオチドは既知であり、容易に製造することができる。５′−デオキシ−５−アミノウリジンの合成は、J．Med．Chem．22,1273（1979 ）中並びにChem．Lett．6 ，601（1976）中に記載されている。４′−カルボキシ −５′−デオキシウリジンはJ．Med．Chem.21，1141（1978）または Nucleic Ac ids Symp．Ser．9 ，95（1981）に記載されたようにして入手可能である。次いで当業者に既知の方法でカルボン酸またはアミノ基を有するリンカーにより錯生成剤との結合が行われる。次いで該リンカーは−NH−CH₂−４′または−C O−４′基と一緒になって連結成分Ｂを形成する。本発明の結合体のヌクレオチド基、連結成分および錯生成剤または錯体への区分は純粋に形式的に行われ、従って実際の合成構造とは無関係であると言ってもよい。よって、例えば上述の場合、基−NH−CH₂−４′または−CO−４′は連結成分Ｂに必要と見なされるが、CH₂−OH基により４′位が還元されたオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド基Ｎと指定される。連結成分がＯＨ基により還元されたホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合上で作られる結合体の製造方法は、まず２つの糖単位がジヌクレオチドに結合されるということにある〔例えば、Chem．Lett．1305（1993）を参照のこと〕。この場合、最初に式（上式中、Ｕは対応するアルキレン基を表し、そしてＶは保護されたアミノまたは硫黄基を表す）のトリエステルが得られる。例えばアミノ保護基の開裂後、当業者に周知の方法で、所望により錯生成剤をリンカーにより、例えばアミド結合の形で、該アミノ基と結合させることができる。次いで該リンカーは基Ｏ−Ｕ−Ｖ′（Ｖ′は基−NHを表す）と一緒になって連結成分Ｂを形成する。別の方法は、中間段階（例えば１，５−ジアミノペンタンとの反応）を通過したホスホトリエステルをアミノリシス〔Biochemistry27，7237（1988）またはJ ．Am．Chem．Soc．110 ，4470(1988)を参照のこと〕にかけることを含んで成る。こうして得られた式の化合物は、上述したようにして所望によりリンカーにより錯生成剤と連結せしめることができる。カップリング目的には、ジヌクレオシドリン酸モノチオトリエステルも適当である〔J．Am．Chem．Soc．111 ，9117(1983)およびNucl．Acids Res．20，5205（ 1992）を参照のこと〕。核酸塩基（nucleobase）は錯生成剤をヌクレオチドと結合させるのに特に大きな多様性を提供する。プリン中の２位のアミノ基およびピリミジン中の４位のアミノ基による結合は直接行うことができる。しかしながら、まずプリンまたはピリジミンを修飾しそしてそれらの修飾塩基を錯生成剤と連結せしめる（場合により追加のリンカーを使って）ことがしばしば一層有利である。。適当な誘導化された塩基は、例えば Biochemie［Biochemistry］71，319(1989),Nucl．Acids Re s．14，4937（1988）またはNucleosides & Nucleo-tides 10，633(1991)中に記載されている。核酸塩基による別の連結方法は、官能基を有する核酸塩基のパラジウム触媒臭素またはヨウ素カップリングを含んで成る〔Biogenic and Medical Chemistry Letter V，361(1994)〕。それらの官能基により、既知の方法に従って、錯生成剤を別のリンカーにより核酸塩基と連結せしめることができる。ピリミジンの５位またはプリンの８位の官能基としては、アクリル酸エステルまたはアリルアミンを例として挙げることができる〔Nucl．Acids Res．1 4 ，6115(1986)および Nucl．Acids Res．16，4077（1988）を参照のこと〕。５位が修飾されたピリミジンの別の調製方法、特にカルボニル、アルケニルまたはアリール基のような官能基を５位に導入するための方法は、1993年６月14日出願の米国特許出願第08/076,735に記載されている。前駆体として使われるハロゲン誘導体は、例えばBiophys.J．44，201（1983），J．Am．Chem．Soc．86，1242（ 1964）またはChem．Commun．17（1967）中に記載されたようにして得ることができる。本発明に従った無金属オリゴヌクレオチド結合体からの金属錯体の製造は、DE 34 01 052に開示されたようにして、所望の金属同位体の金属酸化物または金属塩（例えば硝酸塩、酢酸塩、炭酸塩、塩化物または硫酸塩）を水および／または低級アルコール（例えばメタノール、エタノールまたはイソプロパノール）中に溶解または懸濁し、そして当量の錯生成剤を含有するオリゴヌクレオチド結合体の溶液または懸濁液と反応させ、次いで所望であれば、存在する酸性水素原子を無機および／または有機塩基のカチオンにより置換し、またはアミノ酸もしくは遊離のカルボン酸基をアミノ酸アミドに変換することにより行われる。まだ存在する可能性のある遊離の酸基の中和は、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウムもしくはカルシウムの例えば水酸化物、炭酸塩もしくは炭酸水素塩、および／または有機塩基、例えば特に、第一、第二および第三級アミン、例えばエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、Ｎ−メチル−およびＮ，Ｎ−ジメチル−グルカミン、並びに塩基性アミノ酸、例えばリジン、アルギニンおよびオルニチン、または中性もしくは酸性アミノ酸のアミドの助けをかりて行われる。本発明に係る薬剤の製造も同様に当業者に既知の方法で、本発明のオリゴヌクレオチド結合体を（所望によりガレン製剤に常用される添加剤を添加することにより）水性溶媒中に懸濁または溶解させ、次いで前記懸濁液または溶液を所望により滅菌または濾過滅菌することにより行われる。適当な添加剤は、例えば、生理学的に無害の緩衝剤（例えばトロメタミン）、錯生成剤の添加剤（例えばジエチレントリアミン五酢酸）、または必要ならば電解質、例えば塩化ナトリウム、または必要ならば酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、または特に経口投与形態用には、マンニトールもしくは他の浸透活性物質である。水または生理的塩類溶液中の本発明の薬剤の懸濁液または溶液が経口投与または他の目的に所望される場合、それらはガレン製剤に常用される１または複数の添加剤（例えばメチルセルロース、ラクトース、マンニトール）および／または本発明の薬剤は好ましくは0.1 μモル／ｌ〜３ミリモル／ｌの本発明のオリゴヌクレオチド結合体を含有し、そして通常0.1 μモル／kg〜１ミリモル／kg（含まれる常磁性金属に関して）の量で投与される。それらは経口および非経口投与に向けられる。本発明は更に標的構造の検出方法に関する。この場合、上述した１または複数の化合物を、生体内でまたは試験管内で、調べようとする試料と一緒にする。この場合、オリゴヌクレオチド基Ｎは検出しようとする標的構造に特異的に且つ高い結合親和力で結合する。標的構造が試料中に存在するならば、シグナルに基づいてそれを検出することができる。この方法は非侵害的病気診断に特に適当である。この場合、１または複数の上記化合物を生体内に投与し、そして調べようとする生物中にオリゴヌクレオチド基Ｎが特異的に且つ高親和力で結合する標的構造が存在するかどうかをシグナルに基づいて検出することができる。本発明の別の態様は、凍結乾燥物質としての１または複数の上記化合物と調剤に必要な生理的に許容される液体とを含有する、標的構造の生体内検出のための診断キットを含んで成る。本発明に係る結合体および剤は、ＮＭＲ診断用の薬剤に課せられるだろう多数の必要条件を満たす。それらは特に問題の標的構造に対する高い特異性と親和力により区別される。既知のオリゴヌクレオチド結合体に比較して、本発明の結合体は特に高い生体内安定性を示す。これは、オリゴヌクレオチドの２′−ヒドロキシ基の置換と末端のヒドロキシル基上への修飾チミジン配列の取り込みにより達成された。驚くべきことに、この変更によってもまた錯生成剤とのカップリングによっても該オリゴヌクレオイドの特異性は有意に損なわれない。他の利点は、制御可能な薬物動態学並びに必要な適合性である。図面の簡単な説明本発明の様々な他の目的、特徴および付随の利点は、本発明を添付図面と共に考察すると良く理解できるようになるから、更に十分に認識されるだろう。図１は、本発明で有利に使用することができる環状錯生成剤Ｋの抜粋を示す。 “ｂ”は連結成分Ｂ上の結合部位を示す。図２は、本発明で有利に使用することができる開鎖状錯生成剤Ｋの抜粋を示す。下記の実施例は本発明をより具体的に説明するためである。実施例中に記載されるポリヌクレオチドは変更化合物を含有する。それらは次の意味を有する：Ａ，Ｕ，Ｃ，Ｇ：ヌクレオチドが２′−OCH₃を含有する^* ：ヌクレオチド間結合がメチルホスホネートである^** ：ヌクレオチド間結合がモノチオホスホネートである^*** ：ヌクレオチド間結合がジチオホスホネートである元素分析はP₂O₅上で0.1 ミリバールで乾燥した材料を使って実施される。追加の詳細なしに、当業者は上記記載を使って本発明をその最大範囲まで利用することができると思われる。従って、下記の好ましい特定態様は単に例示的なものとして見なすべきであり、どんな形にせよ開示の残りを制限するものとして見なしてはならない。上記および下記実施例において、全ての温度は摂氏度で未補正のまま与えられ；そして特記しない限り、全ての部および百分率は重量部および重量百分率である。上記および下記に引用される全ての特許出願、特許および刊行物（1994年７月 14日出願のDE 44 24 923.3を含む）の全内容が参考として本明細書中に組み込まれる。実施例実施例１ a) 32マーオリゴヌクレオチド（神経成長因子ＮＧＦのための変型リガンド、配列番号２１）（米国特許第5,270,163 号中に記載）の５′−（６−アミノ−１−ヘキシルリン酸エステル） SELEX 法に従って同定された、T3'-3'T-5'の変更を有する30マーオリゴヌクレオチド5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3'（５′位により支持体に結合されたオリゴヌクレオチド）をPharmacia 社の自動合成装置中で常法により製造し（ Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach，F．Eckstein 編，Ox ford University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991 参照）、該オリゴヌクレオチドは固体支持体のカラム上に存在する。ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５′−ヒドロキシ基を開放状態にする。カラム上への負荷は約10mgの32マーオリゴヌクレオチドである。リンカーを結合させるために、該カラムをテトラゾールの存在下で50μモルのβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−６−（トリフルオロアセトアミド）−１−ヘキシルホスホロアミダイト〔Nucl．Acids Res．16，2659-2669(1988)に従って製造〕の溶液と反応させる。生成したホスフィットから完全に保護されたホスホトリエステルへの酸化をテトラヒドロフラン中のヨウ素を使って行う。次いで、カラムをメタノールと水で順次洗浄する。固体支持体から変型オリゴヌクレオチドを取り外すために、カラムの内容物をマルチバイアル中に移し、５mlの30％アンモニア溶液と混合し、容器を密封し、55℃で一晩振盪する。次いでそれを０℃に冷却し、遠心分離し、該支持体を５mlの水で洗浄し、そして合わせた水相を凍結乾燥にかける。精製のため、固形物を２mlの水に取り、２mlの0.5 Ｍ酢酸アンモニウム溶液および10mlのエタノールと混合し、それを−20℃にて一晩置いておき、遠心分離し、残渣を１mlのエタノール（−20℃）で洗浄し、そして最後に室温で真空乾燥する。無色粉末として８mgの表題化合物が得られる。 b) 10−〔５−（２−カルボキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−４ −アザペンチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10 −テトラアザシクロドデカン 50 g（144.3 ミリモル）の１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン（Ｄ03Ａ）を250mlの水に溶かし、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を使ってpHをpH 13に調整する。次いで、100 mlのジオキサン中の38.12 g（187.6ミリモル）のＮ−（２，３−エポキシプロピル）フタルイミドの溶液を１時間以内で滴下添加し、50℃で24時間攪拌し、そして５Ｎ水酸化ナトリウム溶液の添加によりpHをpH 13 に維持する。次いで10％塩酸を使って該溶液をpH 2に調整し、真空中で蒸発乾固させる。残渣＝ポリ（４−ビニル）ピリジン；水を使って溶出させる〕。主画分を真空中での蒸発により濃縮し、残渣をRP-18 上でのクロマトグラ／水の勾配）による最終精製にかける。蒸発による主画の濃縮後、63.57 g（理論値の71％）の非晶質固体が得られる。水分：8.5 ％元素分析（無水物質に関して）：計算値：Ｃ 52.90 Ｈ 6.57 Ｎ 12.34 実測値：Ｃ 52.65 Ｈ 6.68 Ｎ 12.15 c) 10−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン 50 g（88.1ミリモル）の実施例１b)の表題化合物を300 mlの濃塩酸中で24時間還流させる。それを蒸発乾固せしめ、残渣を少量の水リ（４−ビニル）ピリジン；水を使って溶出させる〕。主画分を蒸発乾固させる。収量：39.0 g（理論値の95％）のガラス質固体水分：10.3％元素分析（無水物質に関して）：計算値：Ｃ 48.68 Ｈ 7.93 Ｎ 16.70 実測値：Ｃ 48.47 Ｈ 8.06 Ｎ 16.55 d) 10−〔７−（４−ニトロフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン 9.84 g（41.8ミリモル）の３−（４−ニトロフェニル）グルタル酸無水物〔J ．Org．Chem．26，3856（1961）〕を、200mlのジメチルホルムアミド／20mlのトリエチルアミン中の14.62 g（34.86 ミリモル）の実施例１c)の表題化合物に添加し、そして室温で一晩攪拌する。それを真空中で蒸発乾固させる。残渣をイソプロパノール／酢酸 95:5 から再結晶する。収量：21.68 g（理論値の95％）の帯黄色固体水分：0.9 ％元素分析（無水物質に関して）：計算値：Ｃ 51.37 Ｈ 6.47 Ｎ 12.84 実測値：Ｃ 51.18 Ｈ 6.58 Ｎ 12.67 e) 10−〔７−（４−アミノフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン 21.0 g（32.07 ミリモル）の実施例１d)の表題化合物を250 mlのメタノールに溶かし、そこに５ｇのパラジウム触媒（10％Pd／Ｃ）を添加する。それを室温で一晩水素化する。触媒を濾過により除去し、濾液を真空中で蒸発乾固させる。収量：19.63 g（理論値の98％）のクリーム色固体水分：0.8 ％元素分析（無水物質に関して）：計算値：Ｃ 53.84 Ｈ 6.35 Ｎ 12.60 実測値：Ｃ 53.73 Ｈ 6.45 Ｎ 12.51 f) 10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン 12.4 g（19.27 ミリモル）の実施例１e)の表題化合物を200 mlの水に溶かし、そこに50mlのクロロホルム中の6.64 g（57.8ミリモル）のチオホスゲンを添加する。混合物を50℃で１時間攪拌する。それを室温に冷やし、有機相を分離し、水相を100 mlのクロロホルムで２回振盪洗浄する。水相を蒸発乾固せしめ、残渣を室温で100 mlのイソプロパノール中で吸収沈澱させる。固体を濾過し、エーテルで洗浄する。真空中で一晩乾燥した後（40℃）、12.74 g（理論値の97％）のクリーム色固体が得られる。水分：3.1 ％元素分析（無水物質に関して）：計算値：Ｃ 52.24 Ｈ 6.35 Ｎ 12.60 Ｓ 4.81 実測値：Ｃ 52.37 Ｈ 6.44 Ｎ 12.48 Ｓ 4.83 g) 32マーオリゴヌクレオチド 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^3'-^3'T-5'の５′−（６−アミノ−１−ヘキシルリン酸エステル）と10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２ −ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕− １，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンの結合体実施例１a)で得られたオリゴヌクレオチド8 mgを2.5mlのNaHCO₃/Na₂CO₃混合物緩衝液（pH 8.0）に溶かし、そして１mgの10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン(実施例１ｆ)の表題化合物）と混合する。該混合物を室温で５時間攪拌し、0.01Ｍ塩酸の添加によりpHを7.2 に調整し、そして該溶液を排除限界3,000 の膜（Amicon YM3）を通した限外濾過にかけ、次いで凍結乾燥する。７mgの所望の結合体が得られる。 h) 32マーオリゴヌクレオチド 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^3'-^3'T-5'の５′−（６−アミノ−１−ヘキシルリン酸エステル）と10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２ −ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕− １，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンの結合体のガドリニウム錯体 15μｌの酢酸¹¹¹インジウム（III）溶液（350μCi）〔２Ｍ酢酸ナトリウム溶液中の塩化¹¹¹インジウム（III）から調製しそして0.1Ｍ塩酸を使ってpHをpH 4. 0に調整したもの〕を、ＭＥＳ緩衝液（pH 6.2）〔ＭＥＳ＝２−（Ｎ−モルホリノ）エチルスルホン酸〕中の１mgの実施例１g)の表題化合物の溶液135μｌに添加する。0.01Ｍ塩酸を添加することによりpHをpH 4.2にする。それをpH 4.2において37℃で１時間攪拌する。次いで２Ｍ酢酸ナトリウム溶液を使ってpH６に調整し、そして錯体過剰の¹¹¹インジウムに10μｌの0.1ＭNa₂EDTA 溶液（Na₂EDTA ＝エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）を加える。こうして得られた結合体（１ｈ）の最終精製をHPLC（排除クロマトグラフィー：TSK-400／ＭＥＳ緩衝液）により行う。標識結合体を含む画分を生理的塩類溶液で希釈し、0.01Ｍ水酸化ナトリウム溶液で pH 7.2に調整し、そして濾過する。こうして得られた溶液は適当な放射線診断用製剤に相当する。実施例２ a) 32マーオリゴヌクレオチド 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^3'-^3'T-5'の５′−（６−アミノ−１−ヘキシルリン酸エステル）とＮ−〔２−アミノ−３−（４−イソチオシアネートフェニル）プロピル〕−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ' ，Ｎ'，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸の結合体実施例１a)で得られたオリゴヌクレオチド８mgを2.5mlのNaHCO₃／Na₂CO₃混合物緩衝液（pH 8.0）に溶かし、そして１mgのＮ−〔２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアネートフェニル）プロピル〕−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸〔Bioconjugate Chem．１，59(19 90)に従って製造〕を添加する。それを室温で５時間攪拌し、次いで0.1 Ｍ塩酸を使ってpH 7.2に調整し、そしてその溶液を排除限界3,000 の膜（AmiconYM3）を通した限外濾過にかける。凍結乾燥した後、６mgのチオ尿素結合体２a)が得られる。 b) 32マーオリゴヌクレオチド 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^3'-^3'T-5'の５′−（６−アミノ−１−ヘキシルリン酸エステル）とＮ−〔２−アミノ−３−（４−イソチオシアネートフェニル）プロピル〕−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸の結合体のガドリニウム錯体所望のガドリニウム錯体は、実施例１h)に示した教示に従って、実施例２a)の表題化合物と酢酸ガドリニウムとの反応により得られる。実施例３ 32マーオリゴヌクレオチド 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^3'-^3'T-5'の５′−（６−アミノ−１−ヘキシルリン酸エステル）とＮ−〔２−アミノ−３−（４−イソチオシアネートフェニル）プロピル〕−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′ ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸の結合体のマンガン錯体所望のマンガン錯体は、実施例１h)に示した教示に従って、実施例２a)の表題化合物と酢酸マンガン（II）との反応により得られる。実施例４ a) 32マーオリゴヌクレオチド 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^3'-^3'T-5'の５′−（６−アミノ−１−ヘキシルリン酸エステル）と２−（４−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸の結合体実施例１a)で得られたオリゴヌクレオチド８mgを2.5mlのNaHCO₃/Na₂CO₃混合物緩衝液（pH 8.0）に溶かし、そして１mgの２−（ｐ−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸〔Bioconjugate Chem. 2，187(1991)に従って製造〕を添加する。それを室温で５時間攪拌し、次いで0.01 Ｍ塩酸を使ってpH 7.2に調整し、そして該溶液を排除限界3,000 の膜（Amicon Y M3）を通した限外濾過にかける。凍結乾燥した後、６mgのチオ尿素結合体が得られる。 b) 32マーオリゴヌクレオチド 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^3'-^3'T-5'の５′−（６−アミノ−１−ヘキシルリン酸エステル）と２−（４−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸の結合体のユウロピウム錯体所望のユウロピウム錯体は、実施例１h)に示した教示に従って、実施例４a)の表題化合物と酢酸ユウロピウムとの反応により得られる。実施例５ a) 35マーオリゴヌクレオチド 5'-T^*T^*T^*T^*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3'（セリンプロテアーゼのためのリガンド）の５′−（６−メルカプト−１−ヘキシルリン酸エステル） SELEX 法に従って同定された、前に置かれた配列5'-T^*T^*T^*T^*Tの変更を有する 30マーオリゴヌクレオチド5'-AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3'（米国特許第 5,270,163 号の配列番号13）を、Pharmacia 社の自動合成装置中で常法により製造し（Oligonucleo-tides and Analogues，A Practical Approach，F．Eckstein 編，Oxford University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991参照）、該オリゴヌクレオチドは固体支持体のカラム上に存在する。ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５′−ヒドロキシ基を開放状態にする。カラム上への負荷は約10mgの35マーオリゴヌクレオチドである。リンカーを結合させるために、該カラムをテトラゾールの存在下でアセトニトリル中の50μモルのβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｓ−トリチル−６−メルカプトホスホロアミダイトの溶液と反応させる。生成したホスフィットから完全に保護されたホスホトリエステルへの酸化をテトラヒドロフラン中のヨウ素を使って行う。次いで、カラムをメタノールと水で順次洗浄する。固体支持体から変型オリゴヌクレオチドを取り外すために、カラムの内容物をマルチバイアル中に移し、５mlの30 ％アンモニア溶液と混合し、容器を密封し、55℃で一晩振盪する。次いでそれを０℃に冷却し、遠心分離し、支持体を５mlの水で洗浄し、そして合わせた水相を凍結乾燥にかける。精製のため、固形物を２mlの水に取り、２mlの0.5 Ｍ酢酸アンモニウム溶液および10mlのエタノールと混合し、それを−20℃で一晩置いておき、遠心分離し、残渣を１mlのエタノール（−20℃）で洗浄し、そして最後に室温で真空乾燥する。９mgのＳ−トリチル化表題化合物が得られる。トリチル保護基を開裂させるために、生成物を0.5ml の水に溶かし、0.1 mlの１Ｍ硝酸銀溶液と混合し、そして室温で１時間攪拌する。次いでそれを0.1 mlの１Ｍジチオトレイトール溶液と混合する。15分後、混合物を遠心分離し、上澄液を酢酸エチルで数回抽出する。水相を凍結乾燥した後、８mgの所望の表題化合物が得られる。 b) 35マーオリゴヌクレオチド 5'-T^*T^*T^*T^*T^*AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAAUGAGAUU-^3'の５′−（６−メルカプト −１−ヘキシルリン酸エステル）と１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン −２−〔（５−アザ−８−マレイミド−６−オキソ）オクタン〕−１，４，７， 10−四酢酸の結合体１mgの１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン−２−〔（５−アザ−８− マレイミド−６−オキソ）オクタン〕−１，４，７，10−四酢酸〔J．Chem．Soc .，Chem．Commun．796（1989）に従って製造〕を、Ｎ₂下で、２mlのリン酸緩衝液（pH 8）中の５mgの実施例５a)に従って製造したチオール含有オリゴヌクレオチドの溶液に添加する。該混合物を35℃ で３時間攪拌し、10−のイソプロピルアルコールと混合し、そして生成物を遠心分離により単離する。次いで25mM酢酸トリエチルアンモニウム（pH 7）／アセトニトリル勾配を使った１×25cmのカラム上での逆相クロマトグラフィーにより精製を行う。合わせた画分を真空中での蒸発により穏やかに濃縮し、少量の水に溶かし、そしてSephadex G-10カラムを使って脱塩する。凍結乾燥により、白色粉末として４mgの表題化合物が得られる。 c) 35マーオリゴヌクレオチド 5'-T^*T^*T^*T^*T^*AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAAUGAGAUU-^3'の５′−（６−メルカプト −１−ヘキシルリン酸エステル）と１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン −２−〔（５−アザ−８−マレイミド−６−オキソ）オクタン〕−１，４，７， 10−四酢酸の結合体のガドリニウム錯体所望のガドリニウム錯体は、実施例１h)に示した教示に従って、実施例５b)の表題化合物と酢酸ガドリニウムとの反応により得られる。実施例６ a) 35マーオリゴヌクレオチド 5'-T^*T^*T^*T^*T^*AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAAUGAGAUU-^3'の５′−（６−メルカプト −１−ヘキシルリン酸エステル）と１，４，７−トリアザシクロノナン−２−〔（５−アザ−８−マレイミド−６−オキソ）オクタン〕−１，４，７−三酢酸の結合体１mgの１，４，７−トリアザシクロノナン−２−〔（５−アザ−８−マレイミド−６−オキソ）オクタン〕−１，４，７−三酢酸〔J．Chem．Soc.，Chem．Com mun．794（1989）に従って製造〕を、Ｎ₂下で、２mlのリン酸緩衝液（pH 8）中の５mgの実施例５a)に従って製造したチオール含有オリゴヌクレオチドの溶液に添加する。該混合物を35℃で６時間攪拌し、10mlのイソプロパノールと混合し、そして生成物を遠心分離により単離する。次いで25mM酢酸トリエチルアンモニウム（pH 7）／アセトニトリル勾配を使った１×25cmのカラム上での逆相クロマトグラフィーにより精製を行う。合わせた画分を真空中での蒸発により穏やかに濃縮し、少量の水に溶かし、そしてSeph adex G-10カラムを使って脱塩する。凍結乾燥により、白色粉末として３mgの表題化合物が得られる。 b) 35マーオリゴヌクレオチド T^*T^*T^*T^*T^*AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAAUGAGAUU-^3'の５′−（６−メルカプト−１ −ヘキシルリン酸エステル）と１，４，７−トリアザシクロノナン−２−〔（５ −アザ−８−マレイミド−６−オキソ）オクタン〕−１，４，７−三酢酸の結合体の鉄（III）錯体所望の鉄錯体は、実施例１h)に示した教示に従って、実施例６a)の表題化合物と塩化鉄（III）との反応により得られる。実施例７ a) ５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−５−（プロパ−２−エン− １−オン）−２′−デオキシウリジンのホスフィット化 50mgの４−ジメチルアミノピリジン、３mlのジイソプロピルエチルアミンおよび962μｌ（4.31ミリモル）の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを、50mlのテトラヒドロフラン中の2.1 g（3.59ミリモル）の５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−５−（プロパ−２−エン− １−オン）−２′−デオキシウリジン〔Nucleosides & Nucleotides 13，939-94 4(1994)に従って製造〕の攪拌溶液に順次添加する。約30分後、白色沈澱が生じる。それを濾過し、濾液を真空中での蒸発により濃縮し、残渣をジクロロメタンと５％炭酸水素ナトリウム溶液の間に分配させる。ジクロロメタン相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして真空中での蒸発により濃縮する。残渣をシリカゲル上での高速クロマトグラフィーにより精製し、それをジクロロメタン／ヘキサン／ジイソプロピルエチルアミン（80:18:2）を使って溶出させる。白色フォームとして1.8 g の目的化合物が得られる。元素分析：計算値：Ｃ 64.28 Ｈ 6.29 Ｎ 7.14 Ｐ 3.95 実測値：Ｃ 64.02 Ｈ 6.60 Ｎ 7.21 Ｐ 4.09 b) 33マーオリゴヌクレオチド 5'-^*UCUCAUGGAGCGCAAGACGAAVAGCVACAVAT^3'-^3'T-5'と10−（４−アザ−２−ヒドロキシ−５−イミノ−８−メルカプトオクタン）−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンの結合体 ^*Ｕ：５−（プロパ−２−エン−1−オン）−２′−デオキシウリジン SELEX 法に従って同定された30マーオリゴヌクレオチドを、 Pharmacia 社の自動合成装置中で常法により製造し（Oligonucleo-tides and An alogues，A Practical Approach，F．Eckstein編，Oxford University Press，O xford，New York，Tokyo，1991参照）、該オリゴヌクレオチドは固体支持体のカラム上に存在する。ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５ ′−ヒドロキシ基を開放状態にする。カラム上への負荷は約10mgの30マーオリゴヌクレオチドである。５′−ヒドロキシ基をテトラゾールの存在下で実施例13a) に従って得られたホスホロアミダイトと反応させる。次いで、得られたホスフィットをヨウ素溶液での処理によりホスホトリエステルに変換し、そしてジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により末端のＤＭＴ基を開裂させる。末端の２′−デオキシウリジン上に存在するα，β−不飽和カルボニル構造へのチオール基の付加のために、それをテトラヒドロフラン中の10−（４−アザ−２−ヒドロキシ−５−イミノ−８−メルカプトオクタン）−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン^*と反応させ、そしてメタノールと水で順次洗浄する。固体支持体から変型オリゴヌクレオチドを取り外すために、カラムの内容物をマルチバイアル中に移し、５mlの30％アンモニア溶液と混合し、容器を密封し、55 ℃で一晩振盪する。次いでそれを０℃に冷却し、遠心分離し、支持体を５mlの水で洗浄し、そして合わせた水相を凍結乾燥にかける。精製のため、固形物を２mlの水に取り、２mlの0.5 Ｍ酢酸アンモニウム溶液および10mlのエタノールと混合し、それを−20℃で一晩置いた後、遠心分離し、残渣を１mlのエタノール（−20℃）で洗浄し、そして最後に室温で真空乾燥する。無色粉末として６mgの表題化合物が得られる。 ^*10−（４−アザ−２−ヒドロキシ−５−イミノ−８−メルカプトオクタン） −１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンは次のようにして得られる： 15.7mlの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液と480 mg（3.49ミリモル）の２−イミノテトラヒドロチオフェン塩酸塩を、50mlの水と50mlのメタノールの混合物中の1.46 ｇ（3.49ミリモル）の10−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカン〔実施例１c)参照〕の溶液に添加し、この混合物を室温で３時間攪拌し、真空中での蒸発により元の体積の約１／４に濃縮し、そして11のpHに達するまでアニオン交換体（IRA 410）と攪拌混合する。溶液を濾過し、3.5 のpHになるまで小部分に分けて十分なカチオン交換体IRC 50と攪拌混合する。濾過した後、溶液を凍結乾燥する。4.9 ％の水分を有する白色粉末として1.39 gの目的物質が得られる。元素分析（無水物質に関して）：計算値：Ｃ 48.45 Ｈ 7.74 Ｎ 16.14 Ｓ 6.16 実測値：Ｃ 48.30 Ｈ 7.98 Ｎ 16.05 Ｓ 6.44 c) 5'-^*UCUCAUGGAGCGCAAGACGAAVAGCVACAVAT^3'-^3'T-5'と10−（４−アザ−２− ヒドロキシ−５−イミノ−８−メルカプトオクタン）−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンの結合体のガドリニウム錯体 ^*Ｕ：５−（プロパ−２−エン−１−オン）−２′−デオキシウリジン所望のガドリニウム錯体は、実施例１h)に示した教示に従って、実施例７b)の表題化合物と酢酸ガドリニウムとの反応により得られる。実施例８ a) 30マーオリゴヌクレオチド 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3'（神経成長因子ＮＧＦのためのリガンド、配列番号21）（米国特許第5,270,163 号中に記載）の５′−（11−アミノ−３，６，９−トリオキソウンデシル−１−リン酸エステル） SELEX 法に従って同定された30マーオリゴヌクレオチド5'-CUCAUGGAGCGCAAGAC GAAUAGCUACAUA-3'を、Pharmacia 社の自動合成装置中で常法により製造し（Olig onucleotides and Analogues，A Practical Approach，F．Eckstein 編，Oxford University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991参照）、該オリゴヌクレオチドは固体支持体のカラム上に存在する。ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５′−ヒドロキシ基を開放状態にする。カラム上への負荷は約10mgの30マーオリゴヌクレオチドである。連結成分を結合させるために、該カラムをテトラゾールの存在下で50μモルの β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−（３，６，９−トリオキサ −11−フタルイミド−１−ウンデシル）ホスホロアミダイト〔Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 86，6230-6234(1989)に従って製造〕の溶液と反応させる。生成したホスフィットから完全に保護されたホスホトリエステルへの酸化をテトラヒドロフラン中のヨウ素を使って行う。次いで、カラムをメタノールと水で順次洗浄する。固体支持体から変型オリゴヌクレオチドを取り外すために、カラムの内容物をマルチバイアル中に移し、５mlの30％アンモニア溶液と混合し、容器を密封し、55℃で一晩振盪する。次いでそれを０℃に冷却し、遠心分離し、支持体を５ml の水で洗浄し、そして合わせた水相を凍結乾燥にかける。精製のため、固形物を２mlの水に取り、２mlの0.5 Ｍ酢酸アンモニウム溶液および10mlのエタノールと混合し、それを−20℃にて一晩置いておき、遠心分離し、残渣を１−のエタノール（−200℃）で洗浄し、そして最後に室温で真空乾燥する。白色粉末として８mgの表題化合物８a)が得られる。 b) 10−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−1，４，７，10−テトラアザシクロドデカンのガドリニウム錯体実施例１c)に従って得られた38 g（90.6ミリモル）の化合物を300 mlの水に溶かし、そこに16.42 g（45.3ミリモル）の酸化ガドリニウムを加える。混合物を9 0℃で３時間加熱する。冷却した溶液を５mlの酸性イオン交換体（IR-120／Ｈ⁺型）および５mlの塩基性交換体（IRA-4 10／OH^-型）と共に各々室温で１時間ずつ攪拌する。それを濾過してイオン交換体から分離する。濾液の凍結乾燥により57.23 g（理論値の98％）の非晶質固体が得られる。水分：11.3％元素分析（無水物質に関して）：計算値：Ｃ 35.59％Ｈ 5.27％Ｎ 12.21％ Gd 27.41％実測値：Ｃ 35.32％Ｈ 5.38％Ｎ 12.31％ Gd 27.20％ c) 10−〔７−（４−ニトロフェニル）−２−（ベンジルカルボキシ）−２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンのガドリニウム錯体 9.84 g（41.8ミリモル）の３−（４−ニトロフェニル）グルタル酸無水物〔J ．Org．Chem．26，3856（1961）〕を、200 mlのジメチルホルムアミド／20mlのトリエチルアミン中の実施例８b)に従って得られた化合物 20 g（34.86 ミリモル）に添加し、そして室温で一晩攪拌する。それを真空中で蒸発乾固させる。残渣をイソプロパノール／酢酸 95:5 から再結晶する。収量：27.46 g（理論値の94％）の帯黄色固体水分：3.4 ％元素分析（無水物質に関して）：計算値：Ｃ 41.58％Ｈ 4.86％Ｎ 10.39％ Gd 19.44％実測値：Ｃ 41.38％Ｈ 4.97％Ｎ 10.17％ Gd 19.28％ d) 10−〔７−（４−アミノフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキサ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンのガドリニウム錯体実施例８c)に従って得られた化合物25 g（30.9ミリモル）を250mlのメタノールに溶かし、そこに５ｇのパラジウム触媒（10％Pd／Ｃ）を添加する。該混合物を室温で一晩水素化する。触媒を濾過し、濾液を真空中で蒸発乾固させる。収量：24.07 g（理論値の97％）のクリーム色固体水分：3.0 ％元素分析（無水物質に関して）：計算値：Ｃ 43.18％Ｈ 5.31％Ｎ 10.79％ Gd 20.19％実測値：Ｃ 43.27％Ｈ 5.48％Ｎ 10.61％ Gd 20.02％ e) 10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキサ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンのガドリニウム錯体実施例８d)に従って得られた化合物15 g（19.26 ミリモル）を100 mlの水に溶かし、そこに50mlのクロロホルム中の6.64 g（57.8ミリモル）のチオホスゲンを添加する。該混合物を50℃で１時間攪拌する。それを室温に冷却し、有機相を分離し、そして水相を100mlのクロロホルムで２回振盪洗浄する。水相を蒸発乾固せしめ、室温において残渣を100 mlのイソプロパノール中に吸収沈澱させる。固体を濾過し、エーテルで洗浄する。真空中で一晩乾燥した後（40℃）、15.9 g（理論値の98％）のクリーム色固体が得られる。水分：3.5 ％元素分析（無水物質に関して）：計算値：Ｃ 42.43％Ｈ 4.79％Ｎ 10.24％ Gd 19.15％Ｓ 3.91％実測値：Ｃ 42.23％Ｈ 4.90％Ｎ 10.05％ Gd 19.01％Ｓ 3.96％ f) 35マーオリゴヌクレオチドの５′−（11−アミノ−３，６，９−トリオキソウンデシル−１−リン酸エステル）と10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２−ヒドロキシ−５− オキサ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンのガドリニウム錯体との結合体実施例８a)で得られたオリゴヌクレオチド８mgを2.5mlのNaHCO₃/Na₂CO₃混合物緩衝液（pH 8.0）に溶かし、そして１mgの10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキサ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンのガドリニウム錯体８e)を添加する。それを室温で20時間攪拌し、次いで0.01Ｍ塩酸を添加することによりpHを7.2 に調整し、そして該溶液を排除限界3,000 の膜（Amicon YM3）を通した限外濾過にかける。凍結乾燥した後、７mgの所望の結合体８f)が得られる。実施例９ a) 35マーオリゴヌクレオチド（Ｕ’＝５−〔Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−（Ｅ）−アクリルアミド〕− ２′−デオキシウリジン） SELEX 法に従って同定された30マーオリゴヌクレオチド5'-CUCAUGGAGCGCAAGAC GAAUAGCUACAUA-3'を、Pharmacia 社の自動合成装置中で常法により製造し（Olig onucleotides and Analogues，A Practical Approach，F．Eckstein編，Oxford University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991 参照）、該オリゴヌクレオチドは固体支持体のカラム上に存在する。ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５′−ヒドロキシ基を開放状態にする。カラム上への負荷は約10mgの30マーオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの合成の標準法（F．Eckstein 参照）に従って、支持体上に存在する前記30マーオリゴヌクレオチドに５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５ −〔Ｎ−（６−トリフルオロアセチルアミノヘキシル）−３（Ｅ）−アクリルアミド−２′−ホスホロアミダイト（F．Eckstein、264 頁参照）を連続５回結合させる。次いで、生成したホスフィットから完全に保護されたホスホトリエステルへの酸化をテトラヒドロフラン中のヨウ素を使って行う。次いでカラムをメタノールと水で順次洗浄し、ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５′−ヒドロキシル基を開放状態にする。modifU−デオキシウリジン−３′ −β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−を取り外すために、カラムの内容物をマルチバイアル中に移し、５mlの30％アンモニア溶液と混合し、容器を密封し、55℃で一晩振盪する。次いでそれを０℃に冷却し、遠心分離し、支持体を５mlの水で洗浄し、そして合わせた水相を凍結乾燥にかける。精製のため、固形物を２mlの水に取り、２mlの0.5 Ｍ酢酸アンモニウム溶液および10mlのエタノールと混合し、それを−20℃で一晩置いておき、遠心分離し、残渣を１mlのエタノール（−20℃）で洗浄し、そして最後に室温で真空乾燥する。白色粉末として８mgの変型オリゴヌクレオチド９a)が得られる。 b) 35マーオリゴヌクレオチドと５当量の10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２−ヒドロキシ− ５−オキサ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７， 10−テトラアザシクロドデカンのガドリニウム錯体との結合体（^*Ｕ’＝５−〔Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−（Ｅ）−アクリルアミド〕 −２′−デオキシウリジン）上記実施例９a)で得られたオリゴヌクレオチド８mgを2.5 mlのNaHCO₃/Na₂CO₃ 混合物緩衝液（pH 8.0）に溶かし、そして３mgの10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキサ−７−（カルボキシメチル）− ４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７， 10−テトラアザシクロドデカンのガドリニウム錯体８e)と混合する。それを室温で20時間攪拌し、次いで0.01Ｍ塩酸を添加することによりpHを7.2に調整し、そして該溶液を排除限界3,000 の膜（Amicon YM3）を通した限外濾過にかける。凍結乾燥した後、７mgの所望の結合体９b)が得られる。実施例10 a) 30マーオリゴヌクレオチドの５′−（８−アミノ−３，６−ジオキサオクチル−１−リン酸エステル）手順は実施例８a)に記載したのと同様であるが、ただしβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−（３，６，９−トリオキサ−11−フタルイミド− １−ウンデシル）ホスホロアミダイトの代わりにβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−（３，６−ジオキサ−８−トリフルオロアセチルアミド− １−オクチル）ホスホロアミダイトを使用することにより、変型オリゴヌクレオチド10a)が得られる。 b) 35マーオリゴヌクレオチドの５′−（８−アミノ−３，６−ジオキサオクチル−１−リン酸エステル）とジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸のガドリニウム錯体の結合体５mgの化合物10a)を0.5 mlの水性炭酸水素ナトリウム溶液に溶かし、そして氷浴中で10mgのジエチレントリアミン五酢酸二水和物と共に２時間攪拌する。0.01 Ｍ塩酸溶液を添加することによりpHを７に調整する。該溶液を排除限界3,000 の膜（Amicon YM3）を通した限外濾過にかけ、次いで凍結乾燥する。20％ポリアクリルアミドゲル上でのゲル電気泳動により更なる精製を行う。錯体生成のため、精製溶液を１mgの酢酸ガドリニウムと混合し、室温で10分間攪拌し、更なる限外濾過を行う。凍結乾燥により生成物を単離する。３mgの化合物10b)が得られる。実施例11 a) 31マーオリゴヌクレオチド（Ｕ''＝５−〔Ｎ−（３，６−ジオキサ−８−アミノ−1−オクチル）−３−（Ｅ）−アクリルアミド〕−２′−デオキシウリジン） SELEX 法に従って同定された30マーオリゴヌクレオチド5'-CUCAUGGAGCGCAAGAC GAAUAGCUACAUA-3'を、Pharmacia 社の自動合成装置中で常法により製造し（Olig onucleotides and Analogues，A Practical Approach，F．Eckstein編，Oxford University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991 参照）、該オリゴヌクレオチドは固体支持体のカラム上に存在する。ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５′−ヒドロキシ基を開放状態にする。カラム上への負荷は約10mgの30マーオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの合成の標準法（F．Eckstein 参照）に従って、支持体上に存在する前記30マーオリゴヌクレオチドに５′−Ｏ −ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（３，６−ジオキサ−８−トリフルオロアセチルアミド−１−オクチル）−３−（Ｅ）−アクリルアミド〕−２′−デオキシウリジン−３′−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト〔Nucl．Acids Res．16，6115-6128(1986)と同様にして製造〕を結合させる。生成したホスフィットから完全に保護されたホスホトリエステルへの酸化をテトラヒドロフラン中のヨウ素を使って行う。次いで、カラムをメタノールと水で順次洗浄し、ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応により、５′−ヒドロキシル基を開放状態にする。固体支持体から変型オリゴヌクレオチドを取り外すために、カラムの内容物をマルチバイアル中に移し、５mlの30％アンモニア溶液と混合し、容器を密封し、 55℃で一晩振盪する。次いでそれを０℃に冷却し、遠心分離し、支持体を５mlの水で洗浄し、そして合わせた水相を凍結乾燥にかける。精製のため、固形物を２mlの水に取り、２mlの0.5 Ｍ酢酸アンモニウム溶液および10mlのエタノールと混合し、それを−20℃で一晩置いておき、遠心分離し、残渣を１mlのエタノール（−20℃）で洗浄し、そして最後に室温で真空乾燥する。白色粉末として12mgの変型オリゴヌクレオチド11a)が得られる。 b) 31マーオリゴヌクレオチドと10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキサ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンのガドリニウム錯体の結合体（Ｕ''＝５−〔Ｎ−（３，６−ジオキサ−８−アミノ−１−オクチル）−３−（Ｅ）−アクリルアミド〕−２′−デオキシウリジン）上記で得られたオリゴヌクレオチド11a）10mgを2.5 mlのNaHCO₃/Na₂CO₃混合物緩衝液（pH 8.0）に溶かし、そして１mgの10−〔７−（４−イソチオシアネートフェニル）−２−ヒドロキシ−５−オキサ−７−（カルボキシメチル）−４−アザヘプチル〕−１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，10−テトラアザシクロドデカンのガドリニウム錯体８e)と混合する。それを室温で20時間攪拌し、0.01Ｍ塩酸を添加することによりpHを7.2 に調整し、そして該溶液を排除限界3,000 の膜（Amicon YM3）を通した限外濾過にかけ、次いで凍結乾燥する。８mgの所望の結合体11b)が得られる。上述の実施例は、本発明の一般的または具体的に記載した反応体および／または作業条件を前記実施例で使用したもので置き換えることにより同様に首尾よく反復することができる。上記記載から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に理解することができ、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な用法および条件に合わせて本発明の様々な変更および改良を行うことができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Conjugates of oligonucleotides and metal complexes that specifically bind to specific target structures, Agents containing these conjugates, their use in NMR diagnostics and their preparation Construction method The invention relates to a substance characterized in the claims, i.e. the complexing agent or the properties of the complex. Oligonucleotide conjugates showing quality. These conjugates were analyzed by NMR diagnostics. Used in the field. Diagnostic imaging has made great strides over the last decade and continues to evolve without interruption ing. Currently the vasculature, most organs and many in vivo without significant interference Organization can be visualized. Many are diagnosed with the disease. Because those Causes a distinct change in the shape, size and location of anatomical structures in the body It is. Such anatomical data from inside the body can be obtained using X-ray technology, ultrasound And magnetic resonance tomography. Of tissue and body fluid Improve the efficiency of each of the above techniques by using contrast enhancing agents be able to. The drug in question is introduced into the body cavity to alter the contrast of the cavity or duct. Or injected into blood vessels. Moreover, they spread through the bloodstream in the organism. It can alter the visibility of organs or tissues. In rare cases, Such substances bind to and / or are actively transported to certain structures in the body and / Or is secreted outside the body. This makes it possible to visualize the function in individual cases It can also be used to diagnose diseases. A common problem is that there is a clear change in the shape, structure and circulation of the organ in question. Diagnosis and localization of pathological changes in absence. Such diagnosis and follow-up For example, investigating metastasis, tissue oxygen In the case of tumor diseases, including paw evaluation, and in the case of certain infections, and metabolic diseases Very important in case. Currently available imaging modalities are stored at sites of pathological change that cannot be detected by other methods. It depends essentially on the availability of the drug to be loaded. At present, contrast agents that are commercially available are by far the so-called non-specific preparations. You. They diffuse passively into the space introduced, for example, by injection. In the past, regarding their distribution in living organisms that can be detected or Many substances and substance groups expected to have specificity have been identified. This example In addition to antibodies, lectins, all types of receptor binding substances, cells, membranes and membranes Min, nucleic acids, natural metabolites and their derivatives, and countless medicinal substances. Peptides are being studied and are of particular interest. EP-A-0 285 057 is used in vivo due to the instability of the nucleotides used. It is not suitable for use as a diagnostic and has other requirements for compatibility and pharmacokinetics. Almost unsatisfactory nucleotide-complexing agent conjugates are described. Numerous U.S. Patents, including U.S. Pat.No. 4,707,440, contain detectable chemical groups. Dealing with modified polymers. This polymer is used for polynucleotides and oligonucleotides. Leotides, but they can be analyzed by naturally occurring nucleases. Not stabilized to solution and targeted with high binding affinity by special methods Neither was it selected to bind specifically to the structure. Of these detectable molecules Particular embodiments are described in U.S. Patent Nos. 4,843,122 and 4,943,523. This form Each nucleotide modified in is described in U.S. Pat. No. 4,952,685. image The use of these agents in diagnostic methods is disclosed in U.S. Pat. No. 4,849,208. An object of the present invention is to provide, for example, organs, tissues, and the like in vitro and in vivo. A specific binding diagnostic agent for the detection of target structures that allows visualization of these pathological changes Offer. The purpose of this is to use oligonucleotide groups linked by direct bonds or linking components. And the complexing agent, whose oligonucleotide groups are linked to naturally occurring nucleases. Has been modified to prevent or at least significantly inhibit Achieved by lignonucleotide conjugates. The objects of the present invention are: 1. Oligonucleotide consisting of oligonucleotide group N and n substituents (BK) A thiotide conjugate, wherein B represents a direct bond or an oligonucleotide And K represents an element having an atomic number of 21 to 29, 42, 44 or 58 to 70. Means a complex or complexing agent of element, wherein the oligonucleotide group N is a naturally occurring nucleic acid. Exhibit changes that prevent, or at least significantly inhibit, degradation by creatase An oligonucleotide conjugate comprising: 2. In a preferred form, the oligonucleotide conjugate of the invention has the general formula N- (BK)_n (I) Having the above N specifically binds to other target structures with high binding affinity and is a naturally occurring nucleic acid. Oligonucleotides that show a change that significantly reduces degradation by rease, B is a chemical bond or linking component that creates a link between N and K; K is a complexation complex representing at least one element having the atomic number mentioned in item 1. Gand, and n is a number from 1 to 30. 3. N is an oligonucleotide having 5 to 200 nucleotides, a) The 2 ′ position of the sugar unit is independently of the following groups: -OR groups wherein R is an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, May contain up to 2 hydroxyl groups, and optionally 1-5 Means an alkyl group which may be interrupted by an oxygen atom), Hydrogen atom, Hydroxyl group, Fluorine atom, Amine group, Amino group And the hydroxyl groups present at the 3 'and 5' positions are May have been etherified with an R group, and / or b) the phosphodiesters used as internucleotide linkages are independent of each other , Phosphorothioates, phosphorodithioates or alkyl phosphonates, especially Is preferably substituted by methylphosphonate, and / or c) the 3 ′ and 5 ′ end groups are capable of internucleotide linkage as described in b); More coupled and / or d) The compound described in b) wherein said compound optionally binds at the 3'-3 'or 5'-5'-position. And / or may contain internucleotide linkages as described and / or e) said compound is optionally a 3 'C_Two~ C_TenHydroxyalkyl The two thymidines are linked in an ester-like manner by the Use a hydroxyl group at the 5 'or 5' Linking similarly substituted thymidine groups in an ester-like manner, as described in b) And / or may contain a phosphodiester bond, and / or f) Any internucleotide linkages that may be altered are preferably polynuclear. Included on the end of the nucleotide, particularly preferably on thymidine, 3. The compound according to item 1 or 2. 4. Item 3. The oligonucleotide N comprises 10 to 100 nucleotides. Listed compound. 5. Oligonucleotide wherein N specifically binds to another target structure with high binding affinity A mixture of oligonucleotides containing random sequences In combination with the structure, one oligonucleotide is Showing an increased affinity for the target structure as compared to the oligonucleotide, Separates from the rest of the otide mixture and then has increased affinity for the target structure Oligonucleotides that amplify and bind to target structures Can be obtained from obtaining a mixture of oligonucleotides with increased proportions of 5. The compound according to any one of items 1 to 4, which is an oligonucleotide. 6. Oligonucleotide wherein N specifically binds to another target structure with high binding affinity And a) First, at the 3 'end, this DNA strand has a promoter for RNA polymerase. And at the same time as primers for the polymerase chain reaction (PCR) It shows a limited sequence that is complementary and the DNA strand has a polymerase at the 5 'end. Indicating a restricted DNA sequence that is complementary to the primer sequence of the chain reaction; and By chemical synthesis such that the sequence between the two restricted sequences comprises a random sequence Producing DNA strands, b) Transcribe this DNA strand into RNA strand with the help of RNA polymerase, Then, a nucleotide in which the 2'-position of the ribose unit is changed is supplied to the polymerase. Pay c) the RNA oligonucleotide thus produced is Together with a target structure that can specifically bind, d) The oligonucleotides bound on the target structure are first combined with the target structure. To the unbound oligonucleotide and then to the bound oligonucleotide Is separated from the target structure, e) use their target structure-specific RNA oligonucleotides with the aid of reverse transcriptase Transcribes to complementary DNA strands, f) The DNA strands are subjected to polymerase chain reaction using a limited primer sequence. Amplify more, g) The DNA oligonucleotide thus amplified is then transferred to an RNA polymerase. RNA oligonucleotides again with the aid of a modified nucleotide and with variant nucleotides Transferred to the tide, and h) If desired, the above selection steps c) to g) can be performed with a high binding affinity for the target structure. Repeat until more well characterized oligonucleotides are selected, then If desired, the sequence of the oligonucleotide thus obtained can be determined. To Items 1 to 5 which are oligonucleotides obtainable by A compound according to any one of the preceding claims. 7. The target structure is a macromolecule, a higher organism such as an animal or human tissue structure. 6. an animal or human organ or part of an organ, a tumor cell or tumor, The compound according to the above. 8. Connected component B a) 4'-position is CH_TwoOligonucleotide group N reduced by -OH group And / or to the 4 'end of b) at the 3 'end of the oligonucleotide group N whose 3' position has been reduced by a hydrogen atom; Combined and / or c) one or more reduced by an OH group between two nucleotides in each case Attached to a phosphodiester bond and / or d) in each case at positions 5 and 8 are hydrogen atoms and / or at positions 2, 4 and 6 Linked to 1 to 30 nucleobases reduced by a mino group The compound according to any one of items 1 to 7, wherein 9. B is a general formula XYZ¹And linked to a complexing agent or complex on the X side. And linked to the oligonucleotide on the Z side, where X represents a direct bond, a —NH group or a —S group, Y is a linear or branched, saturated or unsaturated C₁~ C₂₀An alkylene chain Wherein said alkylene chain optionally has 1 to 2 cyclohexylenes, 1 to 5 No, 1-3 phenylene, 1-3 phenylene imino, 1-3 phenylene Hydroxy, 1-3 hydroxyphenylenes, 1-5 amides, 1-2 arsenic Drazide, 1-5 carbonyls, 1-5 ethyleneoxy, 1 ureide 1 thioureido, 1 to 2 carboxyalkyl iminos, 1 to 2 S Ter group, 1-3 Ar groups (where Ar is optionally selected from nitrogen, oxygen and sulfur) Containing 1 to 2 heteroatoms and / or 1 to 2 carbonyl groups Represents a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring), 1 to 10 oxygens, May contain 5 nitrogen and / or 1-5 sulfur atoms, and / or Is optionally 1-5 hydroxy, 1-2 mercapto, 1-5 oxo , 1-5 thioxo, 1-3 carboxy, 1-5 carboxy-C₁~ C_FourAlkyl, 1 to 5 esters, 1 to 3 amino, 1 to 3 hydroxy-C₁~ C_FourAlkyl, 1-3 C₁~ C₇ May be substituted by an alkoxy group, and Z¹Is -CONH-CH_Two-4 ', -NH-CO-4', -OP (O) R¹-NH-CH_Two-4 ', -OP (O) R¹-O-CH_Two-4 ',-OP (S) R¹-O-3 'or -OP (O) R¹-O-3 ', where 4' or 3 'represents a terminal sugar unit Indicates a bond, and R¹Is O^-, S^-, C₁~ C_FourAlkyl or NR^TwoR^Three(R^TwoAnd And R^ThreeIs hydrogen or C₁~ C_FourAn alkyl group). A compound according to item 8a) or 8b). The cyclic structure Ar has 3 to 6, especially 5 or 6, C atoms, and Saturated or unsaturated cyclic compounds which may contain heteroatoms such as N, S or O. Lukylen is suitable. For example, cyclopentylene, pyrrolylene, furanylene, Thiophenylene, imidazolylene, oxazolylidene, thiazolylene, pyrazoly Len, pyrrolidylene, pyridylene, pyrimidylene, maleinimidylene and Talimidylene groups are conceivable. Ten. B is a general formula XYZ^TwoWhere Bridge connecting two adjacent sugar units Z in^TwoIs a group -NR^Two-, -O- or -S-, and X, Y and R^TwoHas the meaning given in item 9, A compound according to item 8c). Connected component Z¹-YX or Z^TwoAs the group Y of -YX, a group Can be mentioned as an example. 11． B is a general formula XYZ^ThreeWhere Z^ThreeIs direct to the -NH group or base Item 8d), representing a bond and X and Y having the meaning given in item 9 Compound. Connected component Z^ThreeAs the group Y of -YX, a group Can be mentioned as an example. As a binding site, especially in the case of purine base, position 8 is appropriate, In the case of a gin base, position 5 is appropriate. In this case purely Formally, the hydrogen atom of each base is replaced by the group BK. However, The amino group which may be contained at the 2-, 4- or 6-position, ie By the 2-amino group of anine, by the 6-amino group of adenine or by the cytosine It can also be caused by a 4-amino group. In this case, the hydrogen of each amino group The atoms are respectively replaced by groups BK. 12． Metal complexes contain gadolinium, manganese or iron as imaging elements A compound according to any one of the preceding items. 13. A method for detecting a target structure, the method according to any one of the above items, Combining the compounds with the sample to be studied in vivo or in vitro, and Based on signal, oligonucleotide N binds specifically and with high affinity A method comprising detecting whether a target structure is present in a sample. 14. A method for non-invasive diagnosis of a disease, comprising the method of any one of items 1 to 12, Or combine several compounds with the sample to be studied in vivo and signal Based on which the oligonucleotide N binds specifically and with high affinity Detecting whether or not is present in the organism to be studied . The number of imaging substituents BK linked to the oligonucleotide groups Is limited by the number of oligonucleotides but never exceeds 30 . According to the invention, 1-20 substituents BK are preferred. The value of the oligonucleotide group N is not theoretically limited. In the present invention, 5-20 Oligonucleotides with 0 nucleotides are practical, with 10-100 nucleotides Oligonucleotides having a peptide are particularly preferred. Oligonucleotides that can be used according to the present invention It is stabilized against degradation by nucleases present in it. Intact oligonucleotides or polynucleotides are not It is cleaved in vivo by exonuclease. This degradation reaction on the RNA strand Begins with activation of the 2'-hydroxy group. Other catabolic enzymes include, for example, the RNS A ribozyme that cleaves a spodiester bond [Science261 ,709 (1993) checking〕. The in vivo stability of the RNS derivative depends on the 2'-hydr It can be increased by partial or complete substitution of the loxyl group. Like that Examples of suitable substituents include, for example, an alkoxy group, particularly a methoxy group [for example, Chem. Pharm. Bul l.13, 1273 (1985), BiochemistryTen, 2581 (1971)], hydrogen source Atom, fluorine atom [for example, Can. Chem.46, 1131 (1968)], and Is an amino group [for example, J. Org. Chem.42, 714 (1977)]. It Some of these groups and other substituents are described in U.S. patent application Ser. No. 08 / 264,025, filed Jun. 22, 1994. It can also be introduced at the 2'-position using the method disclosed in No. 29. Between nucleotides Other possibilities for stabilizing binding are phosphorothioates [Trends Biochem. Sci.1497 (1989)] or phosphorodithioate [J. Chem. Soc., Chem. Comm un. 591 (1983) and Nucleic Acids Res.12, 9095 (1984)] Substitution of one or two oxygen atoms in the phosphodiester bond of Use of alkyl phosphonates instead of diesters [Ann. Rep. N.Y. Acad. Sci.507 ,220 (1988)]. This stabilization changes the 2'-hydroxyl group of the ribose unit independently of each other. Can be achieved. Such alterations include OR groups, halogens This atom by atoms, especially fluorine, hydrogen or amine groups, especially amino groups. This can be achieved by substitution of the droxyl group. The group R of the alkoxy group is If 1-20 Linear or branched alkyl groups having C atoms, such as methyl, ethyl, Propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, pentyl or hexyl, Or a cyclic saturated or unsaturated alkyl group having 4 to 20 C atoms, for example, Represents clopentyl or cyclohexyl. Another stabilization of polynucleotides is the use of phosphonucleotides used as internucleotide linkages. The diesters are independently phosphorothioate, phosphorodithioate or Alkyl phosphonates, particularly preferably lower alkyl phosphonates, such as methyl It also occurs when partially or completely replaced by lephosphonate. It These internucleotide linkages can also be attached to the 3 ′ and 5 ′ end groups, Alternatively, the 3'-3 'position or the 5'-5' position can be linked. Phosphodie The stele bond is a hydroxyalkyl present on the nitrogen or carbon atom of the base. Group to allow another attachment, for example, to a hydroxyalkyl chain at the 3-position Two more thymidines can be bound or two by the group located at position 8. Purine bases can be bound. This bond is at the 2 'or 3' position or It can also occur at the 5 'hydroxyl group. Modified internucleotide linkages may be optional It can preferably be at the end of the polynucleotide, and they are particularly preferred. Or on thymidine. According to the present invention, the oligonucleotide group N used is a specific oligonucleotide. It is not limited to the array. However, specifically binds to other target structures with high binding affinity Oligonucleotides are preferred. Suitable oligonucleotides required as starting materials for the conjugates of the invention are The method of determination is described in U.S. Pat. No. 5,270,163. This is called SELEX The method may be used to generate a nucleic acid ligand for any desired target molecule. Can be. The SELEX method achieves virtually any desired binding affinity and selectivity criterion. Mix of candidate oligonucleotides using the same general selection scheme And step-by-step repetition of binding, sorting and amplification. SELEX method Starts from a mixture of nucleic acids, preferably comprising segments of random sequence. Contacting the mixture with a target under conditions favorable for binding to specifically bind to the target molecule. Separating unbound nucleic acids from those bound nucleic acids and dissociating the nucleic acid-target complex Amplifying a nucleic acid dissociated from a nucleic acid-target complex to provide a ligand-enriched nucleus Give the acid mixture, then bind, fractionate, dissociate and amplify for the desired number of cycles Repeat steps to obtain highly specific and high-affinity nucleic acid ligands for target molecules Comprising the steps of: The basic SELEX method has been modified to achieve a number of specific goals. An example For example, U.S. Patent Application No. 07 / 960,093, filed October 14, 1992, describes certain structural features. In combination with gel electrophoresis to select nucleic acid molecules with It describes the use of SELEX. U.S. Patent Application Serial No. 08 / 123,9, filed September 17, 1993 No. 35 is capable of binding and / or photocrosslinking to a target molecule and / or Select nucleic acid ligands containing photoreactive groups that can photoinactivate target molecules It describes a SELEX-based method for doing so. Rice filed on October 7, 1993 No. 08 / 134,028 is a closely related, named Counter-SELEX A method for identifying highly specific nucleic acid ligands capable of distinguishing between molecules is described. I have. U.S. Patent Application No. 08 / 143,564, filed October 25, 1993, Very efficient fractionation between oligonucleotides with high and low affinity It describes a method based on SELEX that can be used. U.S. filed October 21, 1992 Patent Application No. 07 / 964,624 implements SELEX Methods for obtaining improved nucleic acid ligands after application are described. March 8, 1995 U.S. patent application Ser.No. 08 / 400,440 discloses that a ligand is covalently linked to its target. The method of matching is described. The SELEX method provides improved characteristics for ligands (eg, in vivo stability or improved High-affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides conferring Inclusive. Examples of such changes include ribose and / or phosphate groups. And / or base substitution. Identified by SELEX Nucleic acid ligands containing modified nucleotides are disclosed in U.S. Patents filed September 8, 1993. No. 08 / 117,991, the specification of which is incorporated herein by reference. Oligonucleotides containing nucleotide derivatives chemically modified at the 'position It has been described. The aforementioned U.S. patent application Ser. No. 08 / 134,028 discloses a 2'-amino (2'-N H_Two), 2'-fluoro (2'-F) and / or 2'-O-methyl (2'-O Highly specific nucleic acid containing one or more nucleotides modified by Me) Gand is listed. U.S. Patent Application Serial No. 08 / 264,029 filed June 22, 1994 Describe oligonucleotides containing various 2'-modified pyrimidines . The SELEX method uses selected oligonucleotides as filed in the United States on August 2, 1994. Patent Application No. 08 / 284,063 and U.S. Patent Application No. 08 / 234,9, filed April 28, 1994. No. 97, another selected oligonucleotide and a non- In combination with a lignonucleotide functional unit. Their applications are many Combinations of number shapes and other properties, as well as desirable properties of other molecules and oligonucleotides Allows for a combination of efficient amplification and replication properties of leotide. In its most basic form, the SELEX method can be defined by the following successive steps: Wear: 1) Prepare a candidate mixture of nucleic acids having various sequences. This candidate mixture is generally In general, regions of fixed sequence (ie, each member of the candidate mixture is the same at the same position) Columns) and regions of random sequence. The fixed sequence region consists of (a) an amplification stage described later. (B) mimic sequences known to bind to the target, as useful in the floor Or (c) increasing the concentration of structural alignment of a given nucleic acid in the candidate mixture To be selected. A random sequence is completely random (ie, The probability of finding a single base at a position is 1/4) or only partially run Dam (for example, the probability of finding a certain base at any position is 0-100 % Can be selected to be at any level). 2) The candidate mixture under conditions that favor binding of the target to a member of the candidate mixture Is brought into contact with a particular target. Under these conditions, the target and candidate mixture nucleic acids Interaction between those nucleic acids that have the strongest affinity for the target and the target Can form a nucleic acid-target pair between the two. 3) The nucleic acid having the highest affinity for the target is separated from the nucleic acid having the lower affinity. Separate. Very few sequences corresponding to the highest affinity nucleic acid (possibly only 1 minute Child nucleic acid) is present in the candidate mixture during the fractionation. It is generally desirable to set sorting criteria so that the amount of nucleic acid (about 5-50%) is retained. Good. 4) Those nuclei selected during fractionation that have relatively high affinity for the target The acid is then amplified, enriching for nucleic acids with relatively high affinity for the target. To get a new candidate mixture. 5) By repeating the above steps of separation and amplification, the newly created candidate mixture Objects are increasingly low in unique sequences and are the average parent of nucleic acids to the target. Harmony will generally increase. Extreme Method, the SELEX method mixes the original candidate with the highest affinity for the target molecule. Mixture containing one or a small number of unique nucleic acids representing nucleic acids from a product Will give. SELEX patents and applications describe this method and elaborate in more detail doing. Targets that can be used in this method; methods for separating nucleic acids in a candidate mixture And a method for amplifying the isolated nucleic acid to obtain an enriched candidate mixture. You. SELEX patents and applications describe a number of target species (proteins that bind nucleic acid binding proteins). Protein targets, both proteinaceous and non-proteinaceous) Listed ligands are also described. Therefore, the SELEX method can be used to target ligands with high affinity ligands. Can be used to provide code. The target molecule is preferably a protein, but especially carbohydrates, peptidoglycan And various small molecules. Like traditional protein-like antibodies, Through specific interactions with molecules that are an integral part of the biological structure For example, nucleic acid antibodies against cell surfaces or viruses (oligonucleotide ) Can be used. Oligonucleotide ligands are possessed by conventional antibodies This is advantageous in that it is not limited by such self-tolerance. SELEX is complete Because all methods are in vitro, nucleic acid antibodies require animal or cell culture for synthesis or production. No need. As is well known, nucleic acids can bind to complementary nucleic acid sequences. Nucleic acid This property is widely used for the detection, quantification and isolation of nucleic acid molecules. Therefore The methods of the present invention are not intended to encompass their well-known binding ability between nucleic acids. Details Alternatively, the method of the invention for the use of nucleic acid antibodies comprises the well-known binding affinity between nucleic acid molecules. Does not encompass power. Many proteins have regulatory tags that bind to nucleic acid operator sequences. Like proteins, they are known to function through binding to nucleic acid sequences. So Binds to their native sites The known ability of certain nucleic acid binding proteins may be, for example, the detection of such proteins. Used for extraction, quantification, isolation and purification. Use of oligonucleotide ligands The method of the present invention relates to nucleic acid binding proteins and It does not imply a known binding affinity between the nucleic acid sequence of interest. However Use the SELEX method to identify novel non-natural sequences that bind to the same nucleic acid binding protein. Can be developed. In particular, the oligonucleotide ligands of the present invention mainly Through mechanisms that rely on Watson / Crick base pairing or triple helix binding Other than a polynucleotide binding to the oligonucleotide ligand, Binds to such a target molecule comprising the original chemical structure, wherein the oligonucleotide A ligand is not a nucleic acid having a known physical function that is bound by a target molecule. SELEX enables very rapid determination of nucleic acid sequences that will bind to proteins Make it easy to determine the structure of unknown operator and binding site sequences These sequences can then be used for applications as described herein. Wear. Therefore, the SELEX method is used to detect proteins that are not known to bind nucleic acids. It is a common use of nucleic acid molecules for extraction, quantification, isolation and purification. In addition Specific target components using certain nucleic acid antibodies that can be isolated by SELEX. Affect the function of the offspring or target structure (eg, inhibit, enhance or ). In other words, using nucleic acid antibodies to inhibit or enhance protein functions Can be strong or activated. Oligonucleotides used in the conjugate of the present invention are preferably prepared according to the method described below. Obtained in a new embodiment. Suitable oligonucleotides are a mixture of oligonucleotides containing random sequences. Combine objects with target structure and mix oligonucleotides Certain oligonucleotides exhibit increased affinity for the target structure as compared to the product Is separated from the rest of the oligonucleotide mixture and then to the increased target structure Amplify oligonucleotides that have an affinity for To obtain a mixture of oligonucleotides with an increased proportion of lignonucleotides Can be obtained from that. In this method, in a preferred embodiment, a DNA chain is first produced by chemical synthesis. Built. This DNA strand has a promoter on the 3 'end for RNA polymerase. Used as a primer and at the same time a primer for the polymerase chain reaction (PCR) Has a known sequence that is also complementary to the sequence. In a particularly preferred embodiment, this is T 7 RNA polymerase promoter. Then, based on this promoter Next, a random sequence is synthesized along the promoter. Random sequence is appropriate The four bases can be obtained by feeding them into the synthesizer at the same ratio. Like this A completely random DNA sequence results. In a preferred embodiment, the random sequence It is about 15-100 nucleotides in length. Based on this DNA strand having a random sequence Then another DNA sequence is synthesized. In this case, the polymerase chain reaction (PCR) is used. I can. After the synthesis of this DNA strand, the DNA strand is synchronized with the help of RNA polymerase. Transcribes to complementary RNA strand. In a preferred embodiment, the T7 RNA polymerase in this case Ze is used. During transcription, the altered nucleotides are provided to RNA polymerase. Be paid. In a particularly preferred embodiment, the ribose is altered at the 2 'position. This place If it is an alkoxy group (preferably a methoxy group), an amino group or a fluorine atom For a hydrogen atom or a hydroxyl group. Manufactured in this way RNA oligonucleotides are then subjected to a selection step. Be offered. In the selection step, the RNA oligonucleotide is combined with the target structure. Target structure The structure is such that the oligonucleotide can bind specifically and with high affinity. Is defined as Such structures include, for example, macromolecules, higher organisms (eg, animals or humans). Tissue structures, organs or parts of organs, cells, especially tumor cells or tumors. For this purpose, the target structure must be in a completely pure form, which is It can also be on the surface of an existing organ or cell. Polyamide for SELEX reaction (TRNA, heparin), plasma or whole blood to add stringency to the selection step May be used. If the isolated protein is contained therein, the protein is immobilized on a solid phase, e.g. Can be coupled to Luther. When selecting, use excess amounts relative to the RNA mixture. Target structures are used. Specific oligonucleotide molecules during incubation Binds on the target structure, while unbound oligonucleotides are Separated from the mixture. Then, by washing with an appropriate buffer or solvent, The oligonucleotide molecule is separated or removed from the target molecule. The resulting RNA oligonucleotide is then completely transformed with the aid of reverse transcriptase. Is transcribed into a DNA strand. The DNA strand to be obtained has primer sequences (or promoter sequences) at both ends. The amplification of the resulting DNA strand is easily carried out using the polymerase chain reaction. Can be applied. The DNA oligonucleotide amplified in this way is then RNA polymerase Is again transcribed to an RNA oligonucleotide with the help of NA oligonucleotides are an additional step Can be used for floors (described above). Is the bound RNA oligonucleotide obtained in the second selection step a target molecule? After separation from the RNA oligonucleotide again with the help of reverse transcriptase NA and transcribe the resulting complementary DNA oligonucleotide into Polymerase Amplify using the X-chain reaction and then again with the help of RNA polymerase Can be transcribed into RNA oligonucleotides and used for further selection steps. Wear. The desired high specificity and high binding affinity can be obtained by repeating the selection step several times. all right. As early as after one or two selection steps, the desired oligonucleotide It is unlikely that a tide sequence will be obtained. Target sequence and oligonucleotide As soon as the desired specificity and binding affinity are obtained between Sequences of oligonucleotides that can be sequenced and consequently bind specifically The columns can be determined. Particularly advantageous in this method is that it can be used for suitable proteins Not only can it be used in vivo. However, the selection step described above is It can also be implemented for a static structure. Especially for in vivo diagnosis, It is essential that the specificity of the oligonucleotide be provided. Therefore, Processes include cells or cell cultures, tissues or tissue sections, perfused tissues and viable cells It can be implemented even on objects. In this case, the modified oligonucleotide is resistant to degradation by most ubiquitous RNAs. Advantageously. As a result, the corresponding natural oligonucleotide is In the selection step, the desired oligonucleotides will be degraded by RNA. Sequence accumulates in living organisms. The oligonucleotide group N may comprise one or more linking components B, or a substituent BK Which can be selected independently of each other. Claimed An orifice containing 1 to 30 identical or 2 to 30 different linking components B Gonucleotide conjugate. Linking component B links the oligonucleotide group N with a complexing agent or complex K. Advantageously, polydentate, open-chain or cyclic having O, S and N donor atoms Can be used. Complexing agents-examples of groups K include hydrogen, hydroxy and / or acetate groups Reduced polyaminopolycarboxylic acid, ie Ethylenediaminetetraacetic acid, Diethylenetriaminepentaacetic acid, Trans-1,2-cyclohexanediaminetetraacetic acid, 1,4,7,10-tetraazacyclododecanetetraacetic acid, 1,4,7-triazacyclononane triacetic acid, 1,4,8,11-tetraazatetradecanetetraacetic acid, 1,5,9-triazacyclododecane triacetic acid, 1,4,7,10-tetraazadiclododecanetriacetic acid, and 3,6,9,15-tetraazabicyclo [9,3,1] penta-1 (15), 11, 13-triene triacetic acid Can be mentioned. Suitable complexing agents are described, for example, in EP 0 485 045, EP 0 071 564 and EP 0 588 229. And in DE 43 10 999 and DE 43 11 023. To illustrate the various possibilities of the complexing agents K according to the invention, some advantageous structures are Please refer to FIGS. 1 and 2 which are collected. You. These drawings are meant as excerpts and limit the invention to the indicated complexing agents It does not do. Complexing agent K can contain any paramagnetic metal ion useful for NMR diagnosis it can. Isotopes suitable for the present invention are selected from the elements of atomic numbers 21-29, 42, 44 or 58-70. Selected. They are especially divalent and trivalent of the elements 21-29, 42, 44 and 58-70 It is an ion. Suitable ions are, for example, chromium (III), iron (II), cobalt (II), nickel (II), copper (II), praseodymium (III), neodymium (III), Samarium (III) and yttrium (III) ions. Very large magnetic Gadolinium (III), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III), manganese (II), erbium (III) and iron (I II) Ions are particularly preferred. Carboxylic acid groups that are not necessary to complex the above elements can be inorganic or Is a salt of an organic base, for example, an alkali or alkaline earth metal hydroxide and And carbonates, especially sodium and potassium hydroxide, or ammonia and aluminum Exists as a killamine or amino acid salt or as an ester or amide. Can be present. The invention further relates to a method for producing the conjugate of the invention. The conjugate in which the above substituent is bonded on the 5 ′ end of the oligonucleotide is It can be obtained by reacting a lignonucleotide with a phosphoramidide derivative [Tetrahedron49, 1925-1963 (1993)]. To do this, the oligonucleotide A 5′-hydroxy group is represented by the general formula PR ′ (NR_Two'') OR '' 'phosphoramidite Let react. In this case, R 'may be N, NO_Two, Si or SO_TwoContaining Alkyl, alkoxy or arylalkoxy having 1 to 20 C atoms Cy groups, such as optionally substituted methyl, ethyl, propyl, butyi , Pentyl, hexyl, methoxy, ethoxy, propyloxy, butyloxy , Benzyloxy or phenylethoxy. As the substituent, particularly cyano And nitro groups are used. Advantageously, for example, methoxy, β-cyanoethoxy or Or a nitrophenylethoxy group can be used. Particularly preferred is β-shear A noethoxy group. R '' is C₁~ C_FourAn alkyl group, ethyl and propyl groups are sometimes suitable . Preferred is an isopropyl group. R ″ ″ may be S, O, N, CN, NO_TwoOr may contain halogen, 1 An alkyl or arylalkyl group having up to 20 C atoms. Preferably Protected amino and thioalkyl groups and protected amino and thio Oxaalkyl groups are used. Particularly preferred are 6-aminohexyl, 6-thio Hexyl, 3,6,9-trioxa-11-aminoundecyl and 3,6-di Oxa-8-aminooctanyl group. Protecting groups include common N or S protection The group can be used generally. For example, trifluoroacetyl, phthalimide and And monomethoxytrityl groups are suitable. In a particularly preferred embodiment of the present invention, the phosphoramidite derivative is β-cyano Ethyl-N, N-diisopropylamino-6- (trifluoroacetamide)- 1-hexyl phosphoramidite is used. In another preferred embodiment of the present invention, the phosphoramidite derivative is β-cyano Ethyl-N, N-diisopropylamino- (3,6,9-trioxa-11-lid Luimido-1-undecyl) phosphorore Midite is used. In a further aspect of the present invention, the linking component B is a phosphorus-containing group in the same manner as described above. To the 3 'end of the oligonucleotide N. The above reaction between the oligonucleotide and the phosphoramidite is a solid phase reaction. And the oligonucleotide is present on the column of the automated synthesizer You can also. An oligonucleotide of the desired sequence is obtained and After exposure of the 5'-hydroxy group of the oligonucleotide using acetic acid Reacting it with a phosphoramidite, oxidizing and liberating the reaction product You. The oligonucleotide derivative so obtained is then converted to a terminal amino or Linked to the complexing agent or complex K on the thiol group, if desired by another linker group Let The group linked to the oligonucleotide by the phosphorus-containing group in the first step is: Together with additional linker groups optionally present at . The bond between the oligonucleotide and the complexing agent is the amount of free 5 The complexing agent or complex in which the '-hydroxyl group has a phosphorus group capable of binding to the terminal is opposite to that of the complexing agent or complex. It can also be done in response. Such is the formula (In the above formula R^aMay optionally have a cyano group at the β-position.₁~ C₆Table showing alkyl groups And R^bRepresents a secondary amino group, and K and B have the meanings mentioned) or a formula (In the above formula R^cRepresents a trialkylammonium cation, and K and B are referred to Meaning) or an expression (In the above formula R^dIs optionally with one or more halogen atoms and / or Or an aryl group which may be substituted by more than one nitro group, or C may be substituted at the β-position with a cyano group₁~ C₆Represents an alkyl group, and K, B and R^CHas the stated meaning), And when using a group of formula a), the oxidation step to phosphate is the end of the coupling step Will be done later. Group-OR^aOr -OR^cIs optionally hydrolyzed in both cases Can be cleaved. The link between the oligonucleotide derivative and the complexing agent or complex K by a linker is It can also occur as a solid phase reaction on a column of an automated synthesizer. Then dissolution Can isolate the compound of the present invention from the solid base. The bond between the oligonucleotide and the linker is the 5'-OH group of the sugar at the terminal nucleotide. Another functional group which can be derived from the 5'-OH group, For example, it can be caused by an amino or carboxy group. Such a net Or a carboxy group The known nucleotides are known and can be easily produced. The synthesis of 5'-deoxy-5-aminouridine is described in Med. Chem.twenty two,1273 (1979 ) And Chem. Lett.6 ,601 (1976). 4'-carboxy -5'-Deoxyuridine is described in J. Am. Med. Chem.twenty one, 1141 (1978) or Nucleic Ac ids Symp. Ser.9 ,95 (1981). Then, by a linker having a carboxylic acid or amino group by a method known to those skilled in the art. Bonding with the complexing agent takes place. Then the linker is -NH-CH_Two-4 'or -C Together with the O-4 'group forms the linking component B. The conjugate of the present invention may be divided into nucleotide groups, linking components and complexing agents or complexes. Minutes are purely formal and therefore independent of the actual composite structure. Good. Thus, for example, in the case described above, the group -NH-CH_Two-4 'or -CO-4' is linked Deemed necessary for component B, but CH_TwoOligonucleic acid reduced at 4'-position by -OH group Reotide is designated as oligonucleotide group N. Phosphodiester or phosphorothioate in which the linking component has been reduced by an OH group First, two sugar units are converted to dinucleotides. Are combined [see, for example, Chem. Lett. See 1305 (1993) ]. In this case, first the expression Where U represents the corresponding alkylene group and V is a protected amino or Represents a sulfur group) Is obtained. For example, after cleavage of the amino protecting group, methods well known to those skilled in the art If desired, a complexing agent may be added by a linker, for example, The amino group can be bound in the form of a amide bond. The linker is then a group Together with OUV '(V' represents the group -NH), it forms the linking component B. Another method involves passing through an intermediate stage (eg, reaction with 1,5-diaminopentane). Aminolysis [Biochemistry27, 7237 (1988) or J . Am. Chem. Soc.110 ,4470 (1988)]. The equation thus obtained Is optionally linked to a complexing agent by a linker as described above. Can be For coupling purposes, dinucleoside phosphate monothiotriesters are also suitable. There is [J. Am. Chem. Soc.111 ,9117 (1983) and Nucl. Acids Res.20, 5205 ( 1992). Nucleobases are particularly large for binding complexing agents to nucleotides. Provide diverse diversity. Amino group at position 2 in purines and position 4 in pyrimidines Coupling via a mino group can be performed directly. However, first the pudding or Modifying the lysine and linking those modified bases with the complexing agent (optionally (Using an additional linker) is often even more advantageous. . Suitable derivation The bases obtained are, for example, Biochemie [Biochemistry]71, 319 (1989), Nucl. Acids Re s.14, 4937 (1988) or Nucleosides & Nucleo-tidesTen, 633 (1991) It is listed. Another method of ligation with nucleobases involves the palladium-catalyzed odor of functionalized nucleobases. Comprising an iodine or iodine coupling [Biogenic and Medical Chemistry Letter V, 361 (1994)]. Known for their functional groups According to the method of the above, the complexing agent can be linked to the nucleobase by another linker. it can. As the functional group at the 5-position of pyrimidine or the 8-position of purine, acrylic acid Sterol or allylamine can be mentioned by way of example [Nucl. Acids Res.1 Four , 6115 (1986) and Nucl. Acids Res.16, 4077 (1988)]. 5 Alternative methods of preparing pyrimidines modified at the position, especially carbonyl, alkenyl or A method for introducing a functional group such as an aryl group at the 5-position was filed on June 14, 1993. No. 08 / 076,735 to U.S. Pat. Halogen used as precursor Derivatives are described, for example, in Biophys.44, 201 (1983); Am. Chem. Soc.86, 1242 ( 1964) or Chem. Commun. 17 (1967). Wear. The preparation of metal complexes from metal-free oligonucleotide conjugates according to the present invention comprises The metal oxide or metal of the desired metal isotope as disclosed in 34 01 052 Salt (eg nitrate, acetate, carbonate, chloride or sulfate) with water and / or In lower alcohols (eg methanol, ethanol or isopropanol) Oligonucleotide conjugate dissolved or suspended and containing an equivalent amount of complexing agent And then, if desired, remove any existing acidic hydrogen atoms. Substituted by cations of inorganic and / or organic bases, or amino acids or It is performed by converting a free carboxylic acid group into an amino acid amide. Neutralization of free acid groups, which may still be present, is achieved with inorganic bases such as sodium Potassium, lithium, magnesium or calcium, such as hydroxide, charcoal Acid salts or bicarbonates and / or organic bases, such as, in particular, first, second and And tertiary amines, such as Ethanolamine, morpholine, glucamine, N-methyl- and N, N-dimethyl Tyl-glucamine and basic amino acids such as lysine, arginine and It is performed with the help of lunitine or amides of neutral or acidic amino acids. The production of the drug according to the invention is likewise carried out by methods known to those skilled in the art. Add the reotide conjugate (optionally by adding additives commonly used in More) suspended or dissolved in an aqueous solvent and the suspension or solution This is performed by sterilization or filtration sterilization. Suitable additives include, for example, raw Physically harmless buffers (eg tromethamine), additives for complexing agents (eg die Tylenetriaminepentaacetic acid), or, if necessary, an electrolyte such as sodium chloride, Or, if necessary, an antioxidant such as ascorbic acid, or especially an oral dosage form For use, mannitol or other osmotically active substances. A suspension or solution of the agent of the present invention in water or physiological saline may be administered orally or If desired for other purposes, they may be one or more of those commonly used in galenic formulations. Additives (eg methylcellulose, lactose, mannitol) and / or The agent of the present invention preferably comprises 0.1 μmol / l to 3 mmol / l of the oligo of the invention. Containing nucleotide conjugates and usually from 0.1 μmol / kg to 1 mmol / kg (including (With respect to the included paramagnetic metal). They are oral and parenteral Turned to The invention further relates to a method for detecting a target structure. In this case, one or more of the above Are combined with the sample to be investigated in vivo or in a test tube. This The oligonucleotide group N is specific and high for the target structure to be detected. Bind with high binding affinity. If the target structure is present in the sample, detect it based on the signal Can be. This method is particularly suitable for non-invasive disease diagnosis. In this case, 1 or A plurality of the above compounds are administered in vivo, and the oligonucleotide is introduced into the organism to be examined. Whether a target structure to which the reotide group N binds specifically and with high affinity exists. Detection can be based on the signal. Another aspect of the present invention relates to a formulation of one or more of the above compounds as a lyophilized substance For the in vivo detection of a target structure containing a physiologically acceptable liquid required for Comprising a diagnostic kit. The conjugates and agents according to the present invention will have numerous implications for NMR diagnostic agents. Meet the requirements of They are particularly high specificity and affinity for the target structure in question Are distinguished by The binding of the present invention, compared to known oligonucleotide conjugates The body exhibits a particularly high biostability. This is the 2'-hydrogen of the oligonucleotide. By substitution of xy group and incorporation of modified thymidine sequence on terminal hydroxyl group Achieved. Surprisingly, this change also allows coupling with the complexing agent. The specificity of the oligonucleoid is not significantly impaired by the method. Other advantages Controllable pharmacokinetics as well as the required compatibility. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES Various other objects, features and attendant advantages of the present invention are made in conjunction with the accompanying drawings. It will be more fully appreciated when considered when it comes to understanding. FIG. 1 shows an excerpt of a cyclic complexing agent K that can be advantageously used in the present invention. “B” indicates a binding site on the linking component B. FIG. 2 shows an open chain complexing agent K that can be used advantageously in the present invention. Here is an excerpt. The following examples serve to illustrate the invention more specifically. The polynucleotides described in the examples contain altering compounds. They have the following meaning: A, U, C, G: nucleotides are 2'-OCH_ThreeContains^* : Internucleotide bond is methylphosphonate^** : The internucleotide bond is a monothiophosphonate To^*** : The internucleotide bond is a dithiophosphonate Elemental analysis is P_TwoO_FiveThe above is carried out using the dried material at 0.1 mbar. Without additional details, one skilled in the art can, using the preceding description, utilize the present invention to its fullest extent. Seems to be able to. Accordingly, the following preferred embodiments are merely exemplary. And should be considered as limiting the rest of the disclosure in any way. Don't consider it. In the above and below examples, all temperatures are given uncorrected in degrees Celsius. And all parts and percentages are by weight unless otherwise indicated. You. All patent applications, patents and publications cited above and below (July 1994 (Including DE 44 24 923.3, filed on the 14th) incorporated herein by reference. It is. ExampleExample 1 a) 32-mer oligonucleotide (Modified ligand for nerve growth factor NGF, SEQ ID NO: 21) (US 5 '-(6-amino-1-hexylphosphate) described in Patent No. 5,270,163 Tell) 30-mer oligonucleotide with T3'-3'T-5 'changes identified according to the SELEX method Otide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3 '(bound to the support by the 5' position Oligonucleotides) were prepared by a conventional method in a Pharmacia automated synthesizer ( Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein, Ox ford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991). The nucleotide is present on a column of a solid support. Trichloro in dichloromethane The 5'-hydroxy group is left open by reaction with the acetic acid solution. On the column The loading is about 10 mg of a 32-mer oligonucleotide. To attach the linker The column in the presence of tetrazole in the presence of 50 μmol of β-cyanoethyl-N, N-diamine. Isopropylamino-6- (trifluoroacetamido) -1-hexylphospho Loamidite [Nucl. Acids Res.16, 2659-2669 (1988)]. Let react. From formed phosphites to fully protected phosphotriesters Is carried out using iodine in tetrahydrofuran. Next, the column is And water sequentially. Removal of the modified oligonucleotide from the solid support To transfer the contents of the column into a multi-vial, add 5 ml of 30% ammonia solution. Mix, seal container and shake at 55 ° C. overnight. Then cool it to 0 ° C and centrifuge Separate, wash the support with 5 ml of water, and subject the combined aqueous phases to lyophilization . For purification, the solid is taken up in 2 ml of water and 2 ml of 0.5 M ammonium acetate solution. And 10 ml of ethanol, leave it at -20 ° C overnight, centrifuge And the residue with 1 ml of ethanol (-20 ° C) Wash and finally vacuum dry at room temperature. 8 mg of the title compound are obtained as a colorless powder. b) 10- [5- (2-carboxyphenyl) -2-hydroxy-5-oxo-4 -Azapentyl] -1,4,7-tris (carboxymethyl) -1,4,7,10 -Tetraazacyclododecane 50 g (144.3 mmol) of 1,4,7-tris (carboxymethyl) -1,4 , 7,10-Tetraazacyclododecane (D03A) is dissolved in 250 ml of water, Adjust the pH to pH 13 using sodium oxide solution. Then 100 ml of dioxa 38.12 g (187.6 mmol) of N- (2,3-epoxypropyl) phthalate in The solution of the amide is added dropwise within 1 hour, stirred at 50 ° C. for 24 hours and The pH is maintained at pH 13 by adding sodium solution. Then use 10% hydrochloric acid The solution is adjusted to pH 2 and evaporated to dryness in vacuo. Residue = Poly (4-vinyl) pyridine; eluted with water]. Main fraction in vacuum After concentration by evaporation, the residue is chromatographed on RP-18. / Water gradient). After concentration of the main painting by evaporation, 63.57 g (physical (71% of theory) of an amorphous solid is obtained. Moisture: 8.5% Elemental analysis (for anhydrous substances): Calculated value: C 52.90 H 6.57 N 12.34 Obtained value: C 52.65 H 6.68 N 12.15 c) 10- (3-amino-2-hydroxypropyl) -1,4,7-tris (calc Boxymethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane 50 g (88.1 mmol) of the title compound of Example 1b) were added to 300 ml of concentrated salt Reflux in acid for 24 hours. Evaporate it to dryness and remove the residue with a little water. L (4-vinyl) pyridine; eluted with water]. Evaporate the main fraction to dryness . Yield: 39.0 g (95% of theory) of a vitreous solid Moisture: 10.3% Elemental analysis (for anhydrous substances): Calculated value: C 48.68 H 7.93 N 16.70 Obtained value: C 48.47 H 8.06 N 16.55 d) 10- [7- (4-nitrophenyl) -2-hydroxy-5-oxo-7- ( Carboxymethyl) -4-azaheptyl] -1,4,7-tris (carboxymethyl Tyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane 9.84 g (41.8 mmol) of 3- (4-nitrophenyl) glutaric anhydride [J . Org. Chem.26, 3856 (1961)] with 200 ml of dimethylformamide / 20 ml of toluene. Add to 14.62 g (34.86 mmol) of the title compound of Example 1c) in liethylamine. And stir at room temperature overnight. It is evaporated to dryness in vacuo. Isolate the residue Recrystallize from propanol / acetic acid 95: 5. Yield: 21.68 g (95% of theory) of a yellowish solid Moisture: 0.9% Elemental analysis (for anhydrous substances): Calculated value: C 51.37 H 6.47 N 12.84 Obtained value: C 51.18 H 6.58 N 12.67 e) 10- [7- (4-aminophenyl) -2-hydroxy-5-oxo-7- ( Carboxymethyl) -4-azaheptyl] -1,4,7-tris (carboxymethyl Chill) -1,4,7,10-tetraazashi Clododecane 21.0 g (32.07 mmol) of the title compound of example 1d) are dissolved in 250 ml of methanol. Dissolve and add 5 g of palladium catalyst (10% Pd / C) to it. At room temperature Hydrogenate overnight. The catalyst is removed by filtration and the filtrate is evaporated to dryness in vacuo. Yield: 19.63 g (98% of theory) of a cream solid Moisture: 0.8% Elemental analysis (for anhydrous substances): Calculated value: C 53.84 H 6.35 N 12.60 Obtained value: C 53.73 H 6.45 N 12.51 f) 10- [7- (4-isothiocyanatophenyl) -2-hydroxy-5-o Oxo-7- (carboxymethyl) -4-azaheptyl] -1,4,7-tris ( Carboxymethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane 12.4 g (19.27 mmol) of the title compound of example 1e) are dissolved in 200 ml of water, To this is added 6.64 g (57.8 mmol) of thiophosgene in 50 ml of chloroform. You. The mixture is stirred at 50 ° C. for 1 hour. Cool it to room temperature, separate the organic phase and add water The phases are washed by shaking twice with 100 ml of chloroform. Evaporate the aqueous phase to dryness and remove the residue. Absorb in 100 ml of isopropanol at room temperature. Filter the solid and add ether Wash with. After drying in vacuum overnight (40 ° C.), 12.74 g (97% of theory) of A lean solid is obtained. Moisture: 3.1% Elemental analysis (for anhydrous substances): Calculated value: C 52.24 H 6.35 N 12.60 S 4.81 Obtained value: C 52.37 H 6.44 N 12.48 S 4.83 g) 32-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^{3 '}-^{3 '}The 5 '-(6-amino-1-he of T-5' Xyl phosphate) and 10- [7- (4-isothiocyanatephenyl) -2 -Hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl) -4-azaheptyl]- 1,4,7-tris (carboxymethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclo Dodecane Conjugate 8 mg of the oligonucleotide obtained in Example 1a) was added to 2.5 ml of NaHCO3_Three/ Na_TwoCO_Threeblend Dissolve in buffer (pH 8.0) and add 1 mg of 10- [7- (4-isothiocyanate). Phenyl) -2-hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl) -4-a Zaheptyl] -1,4,7-tris (carboxymethyl) -1,4,7,10-te Mix with Traazacyclododecane (the title compound of Example 1f). Place the mixture in the chamber Stir for 5 hours at room temperature, adjust the pH to 7.2 by adding 0.01 M hydrochloric acid, and add the solution. Ultrafiltration through a 3,000 exclusion limit membrane (Amicon YM3) followed by lyophilization You. 7 mg of the desired conjugate are obtained. h) 32-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^{3 '}-^{3 '}The 5 '-(6-amino-1-he of T-5' Xyl phosphate) and 10- [7- (4-isothiocyanatephenyl) -2 -Hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl) -4-azaheptyl]- 1,4,7-tris (carboxymethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclo Gadolinium complexes of dodecane conjugates 15 μl acetic acid¹¹¹Indium (III) solution (350μCi) [2M sodium acetate solution Chloride in liquid¹¹¹Prepared from indium (III) and adjusted pH to pH 4. using 0.1 M hydrochloric acid. Adjusted to 0] in MES buffer (pH 6.2) [MES = 2- (N-morpholine) No) Ethyl sulfonic acid] to a solution of 1 mg of the title compound of Example 1 g). Add. 0.01M The pH is brought to pH 4.2 by adding hydrochloric acid. 1 hour at 37 ° C at pH 4.2 While stirring. The pH is then adjusted to pH 6 using 2M sodium acetate solution and the complex Excess¹¹¹Add 10 μl of 0.1 M Na to indium_TwoEDTA solution (Na_TwoEDTA = ethylene diamine Tetrasodium disodium salt). Final purification of the conjugate (1h) thus obtained Preparation is performed by HPLC (exclusion chromatography: TSK-400 / MES buffer). Mark The fraction containing the conjugate is diluted with a physiological salt solution and then diluted with a 0.01 M sodium hydroxide solution. Adjust to pH 7.2 and filter. The solution thus obtained is suitable for radiological diagnosis Equivalent to a formulation.Example 2 a) 32-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^{3 '}-^{3 '}The 5 '-(6-amino-1-he of T-5' Xyl phosphate) and N- [2-amino-3- (4-isothiocyanate) Enyl) propyl] -trans-cyclohexane-1,2-diamine-N, N ' , N ', N ", N" -pentaacetic acid conjugate 8 mg of the oligonucleotide obtained in Example 1a) was added to 2.5 ml of NaHCO3_Three/ Na_TwoCO_Threemixture Buffer solution (pH 8.0) and 1 mg of N- [2-amino-3- (p-iso- Thiocyanatephenyl) propyl] -trans-cyclohexane-1,2-di Amine-N, N ', N', N ", N" -pentaacetic acid [Bioconjugate Chem.1,59 (19 90). It is stirred at room temperature for 5 hours, then 0.1 M hydrochloric acid The pH is adjusted to pH 7.2 using a membrane, and the solution is exclusion limit 3,000 membrane (AmiconYM3) Ultrafiltration through After lyophilisation, 6 mg of thiourea conjugate 2a) were obtained. It is. b) 32-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^{3 '}-^{3 '}5 '-(6-A of T-5' Mino-1-hexyl phosphate) and N- [2-amino-3- (4-isothio) Cyanatephenyl) propyl] -trans-cyclohexane-1,2-diamido Gadolinium complex of a complex of -N, N ', N', N ", N" -pentaacetic acid The desired gadolinium complex is prepared according to the teaching given in Example 1h) according to Example 2a). Obtained by reaction of the title compound with gadolinium acetate.Example 3 32-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^{3 '}-^{3 '}The 5 '-(6-amino-1-he of T-5' Xyl phosphate) and N- [2-amino-3- (4-isothiocyanate) Enyl) propyl] -trans-cyclohexane-1,2-diamine-N, N ' Manganese complex of conjugate of N, N ', N ", N" -pentaacetic acid The desired manganese complex is prepared according to the teaching given in Example 1h) according to the title of Example 2a). Obtained by reaction of the compound with manganese (II) acetate.Example 4 a) 32-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^{3 '}-^{3 '}The 5 '-(6-amino-1-he of T-5' Xyl phosphate) and 2- (4-isothiocyanatebenzyl) diethylene Conjugate of triamine-N, N, N ', N ", N" -pentaacetic acid 8 mg of the oligonucleotide obtained in Example 1a) was added to 2.5 ml of NaHCO3_Three/ Na_TwoCO_Threeblend Dissolve in buffer (pH 8.0) and add 1 mg of 2- (p-isothiocyanate benzyl). B) diethylenetriamine-N, N, N ', N ", N" -pentaacetic acid [Bioconjugate Chem.Two, 187 (1991)]. Stir it at room temperature for 5 hours, Then 0.01 The pH was adjusted to 7.2 using M hydrochloric acid and the solution was excised to 3,000 membranes (Amicon Y Ultrafiltration through M3). After lyophilization, 6 mg of thiourea conjugate was obtained. It is. b) 32-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-T^{3 '}-^{3 '}The 5 '-(6-amino-1-he of T-5' Xyl phosphate) and 2- (4-isothiocyanatebenzyl) diethylene Europium complex of conjugate of triamine-N, N, N ', N ", N" -pentaacetic acid The desired europium complex is prepared according to the teaching given in Example 1h) according to Example 4a). Obtained by reaction of the title compound with europium acetate.Example 5 a) 35-mer oligonucleotide 5'-T^*T^*T^*T^*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3 '(for serine protease 5 '-(6-mercapto-1-hexyl phosphate)) Preceding sequence 5'-T, identified according to SELEX method^*T^*T^*T^*With T change 30mer oligonucleotide 5'-AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3 '(US Patent No. No. 5,270,163 (SEQ ID NO: 13) was prepared by a conventional method in an automated synthesizer of Pharmacia. (Oligonucleo-tides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein Ed., Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991). The oligonucleotide is present on a column of a solid support. Tric in dichloromethane The 5'-hydroxy group is left open by reaction with the loroacetic acid solution. On the column Load is about 10 mg of 35-mer oligonucleotide. To attach the linker For this purpose, the column was treated with 50 μmol β-cysteine in acetonitrile in the presence Anoe Tyl-N, N-diisopropylamino-S-trityl-6-mercaptophosphoro React with a solution of amidite. Host completely protected from generated phosphites Oxidation to the spotriester is carried out using iodine in tetrahydrofuran. Next Then, the column is washed sequentially with methanol and water. Modified oligonucleotide from solid support To remove the oxide, transfer the contents of the column into a multivial and add 5 ml of 30 % Ammonia solution, seal the vessel and shake at 55 ° C. overnight. Then it Cool to 0 ° C., centrifuge, wash the support with 5 ml of water, and combine the combined aqueous phases Lyophilize. For purification, the solid is taken up in 2 ml of water and 2 ml of 0.5 M ammonium acetate solution. And 10 ml of ethanol, leave it at −20 ° C. overnight, centrifuge, The residue is washed with 1 ml of ethanol (−20 ° C.) and finally vacuum dried at room temperature . 9 mg of S-tritylated title compound are obtained. To cleave the trityl protecting group For the purpose, the product is dissolved in 0.5 ml of water, mixed with 0.1 ml of 1 M silver nitrate solution, and Stir at room temperature for 1 hour. Then mix it with 0.1 ml of 1 M dithiothreitol solution. Combine. After 15 minutes, the mixture is centrifuged and the supernatant is extracted several times with ethyl acetate. water After lyophilization of the phases, 8 mg of the desired title compound are obtained. b) 35-mer oligonucleotide 5'-T^*T^*T^*T^*T^*AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAAUGAGAUU-^{3 '}5 '-(6-mercapto -1-hexyl phosphate) and 1,4,7,10-tetraazacyclododecane -2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo) octane] -1,4,7, Conjugate of 10-tetraacetic acid 1 mg of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-2-[(5-aza-8- Maleimide-6-oxo) octane] -1,4,7,10-tetraacetic acid [J. Chem. Soc ., Chem. Commun. According to 796 (1989) Manufacturing)_TwoBelow, according to 5 mg of Example 5a) in 2 ml of phosphate buffer (pH 8) To the solution of the thiol-containing oligonucleotide prepared above. 35 ° C the mixture For 3 hours, mix with 10-isopropyl alcohol and centrifuge the product Isolate by separation. Then 25 mM triethylammonium acetate (pH 7) Purify by reverse phase chromatography on a 1 x 25 cm column using a nitrile gradient. Production. The combined fractions are gently concentrated by evaporation in a vacuum and dissolved in a small amount of water. And desalting using a Sephadex G-10 column. Lyophilization gives 4 mg of the title compound as a white powder. c) 35-mer oligonucleotide 5'-T^*T^*T^*T^*T^*AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAAUGAGAUU-^{3 '}5 '-(6-mercapto -1-hexyl phosphate) and 1,4,7,10-tetraazacyclododecane -2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo) octane] -1,4,7, Gadolinium complexes of conjugates of 10-tetraacetic acid The desired gadolinium complex is prepared according to the teaching given in Example 1h) according to Example 5b). Obtained by reaction of the title compound with gadolinium acetate.Example 6 a) 35-mer oligonucleotide 5'-T^*T^*T^*T^*T^*AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAAUGAGAUU-^{3 '}5 '-(6-mercapto -1-hexyl phosphate) and 1,4,7-triazacyclononane-2- [ (5-Aza-8-maleimido-6-oxo) octane] -1,4,7-triacetic acid Union 1 mg of 1,4,7-triazacyclononane-2-[(5-aza-8-maleimi De-6-oxo) octane] -1,4,7-triacetic acid [J. Chem. Soc., Chem. Com mun. 794 (1989)], N_TwoPrepared according to Example 5a) under 5 mg in 2 ml of phosphate buffer (pH 8) Add to the solution of thiol containing oligonucleotide. The mixture is stirred at 35 ° C. for 6 hours. Stir, mix with 10 ml of isopropanol and isolate the product by centrifugation You. Then use a 25 mM triethylammonium acetate (pH 7) / acetonitrile gradient. Purification is performed by reverse phase chromatography on a single 1 × 25 cm column. Matching The fractions were gently concentrated by evaporation in vacuo, dissolved in a little water and separated by Seph. Desalting using adex G-10 column. Lyophilized, 3 mg table as white powder The title compound is obtained. b) 35-mer oligonucleotide T^*T^*T^*T^*T^*AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAAUGAGAUU-^{3 '}5 '-(6-mercapto-1 -Hexyl phosphate) and 1,4,7-triazacyclononane-2-[(5 -Aza-8-maleimido-6-oxo) octane] -1,4,7-triacetic acid Iron (III) complex The desired iron complex is prepared according to the teaching given in Example 1h) according to the title compound of Example 6a). And iron (III) chloride.Example 7 a) 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -5- (prop-2-ene- Phosphite formation of 1-one) -2'-deoxyuridine 50 mg of 4-dimethylaminopyridine, 3 ml of diisopropylethylamine and And 962 μl (4.31 mmol) of 2-cyanoethyl-N, N-diisopropyl chloride Lophophosphoramidite was treated with 2.1 g (3.59 mmol) in 50 ml of tetrahydrofuran. 5) -O- (4,4'-dimethoxytrityl) -5- (prop-2-ene- 1-one) -2'-deoxyuridine [Nucleosides & Nucleotides13, 939-94 4 (produced according to 1994)]. After about 30 minutes, white A precipitate forms. It is filtered, the filtrate is concentrated by evaporation in a vacuum and the residue is Partition between dichloromethane and 5% sodium bicarbonate solution. Dichloromethane phase Is dried over magnesium sulfate and concentrated by evaporation in a vacuum. The residue Purify by high performance chromatography on silica gel, Elute with / hexane / diisopropylethylamine (80: 18: 2). White 1.8 g of the desired compound are obtained as a colored foam. Elemental analysis: Calculated value: C 64.28 H 6.29 N 7.14 P 3.95 Obtained value: C 64.02 H 6.60 N 7.21 P 4.09 b) 33-mer oligonucleotide Five'-^*UCUCAUGGAGCGCAAGACGAAVAGCVACAVAT^{3 '}-^{3 '}T-5 'and 10- (4-aza-2-hide Roxy-5-imino-8-mercaptooctane) -1,4,7-tris (carbo Conjugate of (xmethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane ^*U: 5- (prop-2-en-1-one) -2'-deoxyuridine 30-mer oligonucleotide identified according to the SELEX method, Manufactured by a conventional method in an automated synthesizer of Pharmacia (Oligonucleo-tides and An alogues, A Practical Approach, F. Eckstein, Oxford University Press, O xford, New York, Tokyo, 1991), and the oligonucleotide is a solid support. Present on the ram. Reaction with trichloroacetic acid solution in dichloromethane gives 5 The '-hydroxy group is left open. The load on the column is approximately 10 mg of 30-mer oligo. Nucleotides. Example 13a) with 5'-hydroxy group in the presence of tetrazole With the phosphoramidite obtained according to the above. Then, the obtained phosphite Is treated with an iodine solution to Convert to triester and react with trichloroacetic acid solution in dichloromethane Cleaves the terminal DMT group. Present on terminal 2'-deoxyuridine To add a thiol group to the α, β-unsaturated carbonyl structure, 10- (4-aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercap in hydrofuran Tooctane) -1,4,7-tris (carboxymethyl) -1,4,7,10-te Traazacyclododecane^*And washed sequentially with methanol and water. To remove the variant oligonucleotide from the solid support, crush the contents of the column. Transfer into a multivial, mix with 5 ml of 30% ammonia solution, seal container, Shake at C overnight. It is then cooled to 0 ° C., centrifuged and the support is washed with 5 ml of water. And the combined aqueous phases are lyophilized. For purification, the solid is taken up in 2 ml of water and 2 ml of 0.5 M ammonium acetate solution. And 10 ml of ethanol, leave it at -20 ° C overnight, then centrifuge and The residue is washed with 1 ml of ethanol (−20 ° C.) and finally dried under vacuum at room temperature. 6 mg of the title compound are obtained as a colorless powder. ^*10- (4-aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercaptooctane) -1,4,7-Tris (carboxymethyl) -1,4,7,10-tetraazic Rhodedecane is obtained as follows: 15.7 ml of 1N sodium hydroxide solution and 480 mg (3.49 mmol) of 2-iminoate Trahydrothiophene hydrochloride was added to 1.46 in a mixture of 50 ml of water and 50 ml of methanol. g (3.49 mmol) of 10- (3-amino-2-hydroxypropyl) -1,4,4 7-tris (carboxymethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane To the solution of [see Example 1c)] and the mixture is stirred at room temperature for 3 hours. Concentrate to about 1/4 of the original volume by evaporation in and reach a pH of 11 With an anion exchanger (IRA 410) until ready to mix. The solution is filtered and brought to a pH of 3.5 Stir and mix with sufficient cation exchanger IRC 50 in small portions until complete. Filtered Thereafter, the solution is lyophilized. 1.39 g of the desired product as a white powder with 4.9% moisture Quality is obtained. Elemental analysis (for anhydrous substances): Calculated value: C 48.45 H 7.74 N 16.14 S 6.16 Obtained value: C 48.30 H 7.98 N 16.05 S 6.44 c) 5'-^*UCUCAUGGAGCGCAAGACGAAVAGCVACAVAT^{3 '}-^{3 '}T-5 'and 10- (4-aza-2- Hydroxy-5-imino-8-mercaptooctane) -1,4,7-tris (ca Gado of a conjugate of (ruboxymethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane Linium complex ^*U: 5- (prop-2-en-1-one) -2'-deoxyuridine The desired gadolinium complex is prepared according to the teaching given in Example 1h) according to Example 7b). Obtained by reaction of the title compound with gadolinium acetate.Example 8 a) 30-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3 '(ligand for nerve growth factor NGF No. 21) (described in U.S. Pat. No. 5,270,163) of 5 '-(11-amino-3). , 6,9-Trioxoundecyl-1-phosphate) 30-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGAC identified according to SELEX method GAAUAGCUACAUA-3 'was produced by a conventional method in an automated synthesizer of Pharmacia (Olig onucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Edited by Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991). The tide is present on a column of solid support. Trichloroacetic acid solution in dichloromethane The 5'-hydroxy group is opened by reaction with the liquid. The load on the column is About 10 mg of 30-mer oligonucleotide. To bind the linking component, the column was run at 50 μmol in the presence of tetrazole. β-cyanoethyl-N, N-diisopropylamino- (3,6,9-trioxa -11-phthalimido-1-undecyl) phosphoramidite [Proc. Natl. Acad . Sci. USA86, 6230-6234 (1989)]. Generated Oxidation of phosphite to fully protected phosphotriester by tetrahydro Perform with iodine in furan. Next, the column is washed sequentially with methanol and water. You. To remove the modified oligonucleotide from the solid support, use the contents of the column. Into a multi-vial, mix with 5 ml of 30% ammonia solution, seal the container Shake at 55 ° C. overnight. It is then cooled to 0 ° C., centrifuged and the support is Of water and freeze-dry the combined aqueous phases. For purification, the solid is taken up in 2 ml of water and 2 ml of 0.5 M ammonium acetate solution. And 10 ml of ethanol, leave it at -20 ° C overnight, centrifuge The residue is washed with 1-ethanol (-200 ° C.) and finally vacuum dried at room temperature I do. 8 mg of the title compound 8a) are obtained as a white powder. b) 10- (3-amino-2-hydroxypropyl) -1,4,7-tris (cal Gadolinium complex of 1,4-, 7,10-tetraazacyclododecane body 38 g (90.6 mmol) of the compound obtained according to Example 1c) are dissolved in 300 ml of water. However, 16.42 g (45.3 mmol) of gadolinium oxide are added thereto. Mix 9 Heat at 0 ° C. for 3 hours. Chilled solution With 5 ml of acidic ion exchanger (IR-120 / H⁺Type) and 5 ml of the basic exchanger (IRA-4) 10 / OH^-With the mold) for 1 hour at room temperature. Filter it and ion exchange Separate from body. 57.23 g (98% of theory) of an amorphous solid by freeze-drying of the filtrate Is obtained. Moisture: 11.3% Elemental analysis (for anhydrous substances): Calculated value: C 35.59% H 5.27% N 12.21% Gd 27.41% Measured value: C 35.32% H 5.38% N 12.31% Gd 27.20% c) 10- [7- (4-nitrophenyl) -2- (benzylcarboxy) -2-h Droxy-5-oxo-7- (carboxymethyl) -4-azaheptyl] -1, 4,7-tris (carboxymethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclodode Gadolinium complex of can 9.84 g (41.8 mmol) of 3- (4-nitrophenyl) glutaric anhydride [J . Org. Chem.26, 3856 (1961)] with 200 ml of dimethylformamide / 20 ml 20 g (34.86 mmol) of the compound obtained according to Example 8b) in triethylamine And stirred at room temperature overnight. It is evaporated to dryness in vacuo. Remaining The residue is recrystallized from isopropanol / acetic acid 95: 5. Yield: 27.46 g (94% of theory) of a yellowish solid Moisture: 3.4% Elemental analysis (for anhydrous substances): Calculated value: C 41.58% H 4.86% N 10.39% Gd 19.44% Obtained value: C 41.38% H 4.97% N 10.17% Gd 19.28% d) 10- [7- (4-aminophenyl) -2-hydroxy-5-oxa-7- ( Carboxymethyl) -4-azaheptyl] -1,4,7-tris (carboxymethyl Gadolinium complex of (tyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane 25 g (30.9 mmol) of the compound obtained according to Example 8c) are mixed with 250 ml of methanol And 5 g of palladium catalyst (10% Pd / C) is added thereto. The mixture Is hydrogenated at room temperature overnight. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated to dryness in vacuo. Yield: 24.07 g (97% of theory) of a cream colored solid Moisture: 3.0% Elemental analysis (for anhydrous substances): Calculated value: C 43.18% H 5.31% N 10.79% Gd 20.19% Obtained value: C 43.27% H 5.48% N 10.61% Gd 20.02% e) 10- [7- (4-isothiocyanatophenyl) -2-hydroxy-5-o Oxa-7- (carboxymethyl) -4-azaheptyl] -1,4,7-tris ( Gadolinium of (carboxymethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane Complex 15 g (19.26 mmol) of the compound obtained according to Example 8d) are dissolved in 100 ml of water. But then add 6.64 g (57.8 mmol) of thiophosgene in 50 ml of chloroform Added. The mixture is stirred at 50 ° C. for 1 hour. Cool it to room temperature and separate the organic phase Separate and wash the aqueous phase twice with 100 ml of chloroform. Evaporate the water phase to dryness The residue is taken up in 100 ml of isopropanol at room temperature. Solid The body is filtered and washed with ether. After drying in vacuum overnight (40 ° C), 15.9 g ( 98% of theory) of a cream solid is obtained. Moisture: 3.5% Elemental analysis (for anhydrous substances): Calculated value: C 42.43% H 4.79% N 10.24% Gd 19.15% S 3.91% Measured value: C 42.23% H 4.90% N 10.05% Gd 19.01% S 3.96% f) 35-mer oligonucleotide Of 5 '-(11-amino-3,6,9-trioxoundecyl-1-phosphate ester ) And 10- [7- (4-isothiocyanatophenyl) -2-hydroxy-5- Oxa-7- (carboxymethyl) -4-azaheptyl] -1,4,7-tris Gadolini of (carboxymethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane Complex with uranium complex 8 mg of the oligonucleotide obtained in Example 8a) was added to 2.5 ml of NaHCO_Three/ Na_TwoCO_Threeblend Dissolve in buffer (pH 8.0) and add 1 mg of 10- [7- (4-isothiocyanate). Phenyl) -2-hydroxy-5-oxa-7- (carboxymethyl) -4-a Zaheptyl] -1,4,7-tris (carboxymethyl) -1,4,7,10-te The gadolinium complex of triazacyclododecane 8e) is added. 20 o'clock at room temperature And then adjust the pH to 7.2 by adding 0.01 M hydrochloric acid, and The solution is subjected to ultrafiltration through a 3,000 exclusion limit membrane (Amicon YM3). freeze drying After working up, 7 mg of the desired conjugate 8f) are obtained.Example 9 a) 35-mer oligonucleotide (U '= 5- [N- (6-aminohexyl) -3- (E) -acrylamide]- 2'-deoxyuridine) 30-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGAC identified according to SELEX method GAAUAGCUACAUA-3 'was produced by a conventional method in an automated synthesizer of Pharmacia (Olig onucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Edited by Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991). The tide is present on a column of solid support. Trichloro in dichloromethane The 5'-hydroxy group is left open by reaction with the acetic acid solution. On the column The load is about 10 mg of the 30-mer oligonucleotide. On a support, according to standard methods for oligonucleotide synthesis (see F. Eckstein). 5'-O-dimethoxytrityl-5 in the 30-mer oligonucleotide present in -[N- (6-trifluoroacetylaminohexyl) -3 (E) -acrylia 5 consecutive linkages of mid-2'-phosphoramidite (see F. Eckstein, p. 264) Let it. The phosphotriester, which is completely protected from the generated phosphites, is then Oxidation to iodine is carried out using iodine in tetrahydrofuran. Then meta column Wash with methanol and water, and react with trichloroacetic acid solution in dichloromethane. Leaving the 5'-hydroxyl group open. modifU-deoxyuridine-3 ' To remove -β-cyanoethyl-N, N-diisopropyl- Transfer the contents to a multi-vial, mix with 5 ml of 30% ammonia solution, and seal the container. Seal and shake overnight at 55 ° C. It is then cooled to 0 ° C., centrifuged and the support is Wash with 5 ml of water and lyophilize the combined aqueous phases. For purification, the solid is taken up in 2 ml of water and 2 ml of 0.5 M ammonium acetate solution. And 10 ml of ethanol, leave it at −20 ° C. overnight, centrifuge, The residue is washed with 1 ml of ethanol (−20 ° C.) and finally vacuum dried at room temperature . 8 mg of the modified oligonucleotide 9a) are obtained as a white powder. b) 35-mer oligonucleotide And 5 equivalents of 10- [7- (4-isothiocyanatophenyl) -2-hydroxy- 5-oxa-7- (carboxymethyl) -4-azaheptyl] -1,4,7-to Squirrel (carboxymethyl) -1,4,7, Conjugates of 10-tetraazacyclododecane with gadolinium complexes (^*U '= 5- [N- (6-aminohexyl) -3- (E) -acrylamide] -2'-deoxyuridine) 8 mg of the oligonucleotide obtained in Example 9a) above was mixed with 2.5 ml of NaHCO3_Three/ Na_TwoCO_Three Dissolve in the mixture buffer (pH 8.0) and add 3 mg of 10- [7- (4-isothiocyanate). Phenyl) -2-hydroxy-5-oxa-7- (carboxymethyl)- 4-azaheptyl] -1,4,7-tris (carboxymethyl) -1,4,7, It is mixed with a gadolinium complex of 10-tetraazacyclododecane 8e). It at room temperature For 20 hours, then adjust the pH to 7.2 by adding 0.01 M hydrochloric acid, The solution is then subjected to ultrafiltration through a 3,000 exclusion limit membrane (Amicon YM3). Frozen After sintering, 7 mg of the desired conjugate 9b) are obtained.Example 10 a) 30-mer oligonucleotide 5 '-(8-amino-3,6-dioxaoctyl-1-phosphate) The procedure is as described in Example 8a), except that β-cyanoethyl-N , N-Diisopropylamino- (3,6,9-trioxa-11-phthalimide- 1-undecyl) phosphoramidite instead of β-cyanoethyl-N, N-diamine Isopropylamino- (3,6-dioxa-8-trifluoroacetylamide- By using 1-octyl) phosphoramidites, modified oligonucleotides Pide 10a) is obtained. b) 35-mer oligonucleotide 5 '-(8-amino-3,6-dioxaoctyl-1-phosphate) and di Gadolinium complex of ethylenetriamine-N, N, N ', N ", N" -pentaacetic acid Union 5 mg of compound 10a) are dissolved in 0.5 ml of aqueous sodium hydrogen carbonate solution and Stir for 2 hours in a bath with 10 mg of diethylenetriaminepentaacetic acid dihydrate. 0.01 The pH is adjusted to 7 by adding M hydrochloric acid solution. The solution has an exclusion limit of 3,000 Ultrafiltration through a membrane (Amicon YM3) and then freeze drying. 20% Polyac Further purification is performed by gel electrophoresis on a rilamide gel. For complex formation, The purified solution is mixed with 1 mg of gadolinium acetate and stirred at room temperature for 10 minutes, further limiting Perform filtration. The product is isolated by lyophilization. 3 mg of compound 10b) are obtained.Example 11 a) 31-mer oligonucleotide (U ″ = 5- [N- (3,6-dioxa-8-amino-1-octyl) -3- ( E) -Acrylamide] -2'-deoxyuridine) 30-mer oligonucleotide 5'-CUCAUGGAGCGCAAGAC identified according to SELEX method GAAUAGCUACAUA-3 'was produced by a conventional method in an automated synthesizer of Pharmacia (Olig onucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Edited by Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991). The tide is present on a column of solid support. Trichloroacetic acid solution in dichloromethane The 5'-hydroxy group is opened by reaction with the liquid. The load on the column is About 10 mg of 30-mer oligonucleotide. On a support, according to standard methods for oligonucleotide synthesis (see F. Eckstein). The 5'-O -Dimethoxytrityl-5- [N- (3,6-dioxa-8-trifluoroacetate) Tylamido-1-octyl) -3- (E) -acrylamido] -2'-deoxy Uridine-3'-β-cyanoethyl-N, N-diisopropyl phosphoramidite G [Nucl. Acids Res.16, 6115-6128 (1986)]. Test oxidation of generated phosphites to fully protected phosphotriesters Perform with iodine in lahydrofuran. Then, the column is sequentially treated with methanol and water. Next, wash with 5'-hydrido by reaction with a solution of trichloroacetic acid in dichloromethane. The loxyl group is left open. Remove the contents of the column to remove the variant oligonucleotide from the solid support. Transfer into a multivial, mix with 5 ml of 30% ammonia solution, seal container, Shake at 55 ° C overnight. It is then cooled to 0 ° C., centrifuged and the support is Wash with water and lyophilize the combined aqueous phases. For purification, the solid is taken up in 2 ml of water and 2 ml of 0.5 M ammonium acetate solution. And 10 ml of ethanol, leave it at −20 ° C. overnight, centrifuge, The residue is washed with 1 ml of ethanol (−20 ° C.) and finally vacuum dried at room temperature . 12 mg of the modified oligonucleotide 11a) are obtained as a white powder. b) 31-mer oligonucleotide And 10- [7- (4-isothiocyanatophenyl) -2-hydroxy-5-oxo Sar-7- (carboxymethyl) -4-azaheptyl] -1,4,7-tris (ca Gadolinium of 1,4-, 7,10-tetraazacyclododecane Complex conjugate (U ″ = 5- [N- (3,6-dioxa-8-amino-1-octyl) -3- ( E) -Acrylamide] -2'-deoxyuridine) 10 mg of the oligonucleotide 11a) obtained above was added to 2.5 ml of NaHCO_Three/ Na_TwoCO_Threeblend Dissolve in buffer (pH 8.0) and add 1 mg of 10- [7- (4-isothiocyanate). Phenyl) -2-hydroxy-5-oxa-7- (carboxymethyl) -4-a Zaheptyl] -1,4,7-tris (carboxymethyl) -1,4,7,10-te It is mixed with the gadolinium complex of trazacyclododecane 8e). 20 o'clock at room temperature While adjusting the pH to 7.2 by adding 0.01 M hydrochloric acid, and adding the solution. Ultrafiltration through a 3,000 exclusion limit membrane (Amicon YM3) followed by lyophilization You. 8 mg of the desired conjugate 11b) are obtained. The above examples illustrate the reactants and / or general or specifically described reactants of the present invention. Is similarly successful by replacing the working conditions with those used in the previous example. Can be repeated. From the above description, those skilled in the art can easily understand the essential features of the present invention. And various uses and conditions without departing from the spirit and scope of the invention. Various modifications and improvements of the present invention can be made together.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ニートバラ，ウルリッヒドイツ連邦共和国，デー−14195 ベルリン，ゴスレルシュトラーセ 28 アー (72)発明者ラデューヘル，ベルントドイツ連邦共和国，デー−13465 ベルリン，ゴランツシュトラーセ 132 (72)発明者ミューラー，アンドレアスドイツ連邦共和国，デー−15366 ノイエンハーゲン，フォンテーンシュトラーセ 21 (72)発明者スペック，ウルリッヒドイツ連邦共和国，デー−13465 ベルリン，フュルステンダム 20 (72)発明者ベルントルフ，ディートマードイツ連邦共和国，デー−13403 ベルリン，コーゲルシュトラーセ 10 (72)発明者ゴールド，ラリーアメリカ合衆国，コロラド 80302，ブールダー，フィフス 1033 (72)発明者ピーケン，ボルフガンクアメリカ合衆国，コロラド 80503，ロングモント，マウントミークスロード 7308────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), AT, AU, BB, BG, B R, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES , FI, GB, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, LU, LV, MG, MN, MW, NO, NZ, PL, P T, RO, RU, SD, SE, SK, UA, US, UZ , VN (72) Inventor Nietborough, Ulrich Federal Republic of Germany, Day 14195 Berlin , Goslerstrasse 28 (72) Inventor Ladue Hel, Bernd Germany, Day 13465 Berli N. Gorantzstrasse 132 (72) Inventor Mueller, Andreas Germany, Day 15366 Neue Nhagen, Fontainestrasse twenty one (72) Inventor Spec, Ulrich Germany, Day 13465 Berli Fürstendamm 20 (72) Inventor Berndorf, Dietmer Germany, Day 13403 Berli Kogelstrasse 10 (72) Inventor Gold, Rally United States, Colorado 80302, Boo Ruder, Fifth 1033 (72) Inventors Peaken, Wolfgang United States, Colorado 80503, Ron Gmont, Mount Meaks Road 7308

Claims

[Claims] 1. An oligonucleotide conjugate consisting of an oligonucleotide group N and n substituents (BK), wherein B represents a direct bond or a linking moiety to the oligonucleotide group, and K represents an atom Nos. 21 to 29, 42, 44 or 58 to 70, meaning that the oligonucleotide group N prevents or at least significantly inhibits the degradation by naturally occurring nucleases. Oligonucleotide conjugates characterized. 2. Wherein the compound has the general formula N- (BK) _n (I) wherein N is a specific binding to another target structure with high binding affinity and the alteration significantly reduces degradation by naturally occurring nucleases. B is a chemical bond or a linking component that creates a link between N and K, and K is a complexing ligand representing at least one element having the atomic number mentioned in claim 1. And n is a number from 1 to 30). 3. N is an oligonucleotide having from 5 to 200 nucleotides, a) the 2'-position of the sugar unit is independently of each other the following groups: -OR groups, where R is an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms Which means an alkyl group which may optionally contain up to 2 hydroxyl groups and which may be interrupted by 1 to 5 oxygen atoms), a hydrogen atom, a hydroxyl group, a fluorine atom, Amine groups, occupied by amino groups, and the hydroxyl groups at the 3 'and 5' positions may optionally be etherified with R groups, and / or b) used as internucleotide linkages. The phosphodiesters independently of one another are phosphorothioates, phosphorodithioates or alkyl phosphonates, particularly preferably methyl phosphonates. And / or c) the 3 ′ and 5 ′ end groups are linked by internucleotide linkages as described in b), and / or d) the compound is optionally 3 ′ may contain bonds have been such nucleotides described in b) which bind the 3 'or 5'-5' and / or e) by the compound may, C ₂ -C respective 3 'position _An ester-like linking of two thymidines by a ₁₀ hydroxyalkyl group, or an ester-like linking of a 2'- or 3'- or 5'-hydroxyl group to a similarly substituted thymidine group, b) And / or f) internucleotide linkages, which may be optionally altered, are preferably on the termini of the polynucleotide, particularly preferred. It is included on the thymidine compound according to claim 1 or 2. 4. 4. The compound of claim 3, wherein said oligonucleotide N comprises 10-100 nucleotides. 5. N is an oligonucleotide that specifically binds to another target structure with high binding affinity, and a mixture of oligonucleotides containing random sequences is combined with the target structure and increased compared to the mixture of oligonucleotides Certain oligonucleotides exhibiting an affinity for the target structure are separated from the rest of the oligonucleotide mixture, and then the oligonucleotides having increased affinity for the target structure are amplified, such that the proportion of oligonucleotides bound on the target structure is reduced. 5. The compound according to any one of claims 1 to 4, which is an oligonucleotide obtainable by obtaining a mixture of increased oligonucleotides. 6. N is an oligonucleotide that specifically binds to another target structure with high binding affinity, and a) first, this DNA strand is complementary at the 3 'end to a promoter for RNA polymerase and at the same time the polymerase chain reaction (PCR) shows a defined sequence that is complementary to a primer, the DNA strand at the 5 'end shows a defined DNA sequence that is complementary to a primer sequence for a polymerase chain reaction, and the two defined sequences B) producing a DNA strand by chemical synthesis such that the sequence between comprises a random sequence, b) transcribe this DNA strand into an RNA strand with the aid of an RNA polymerase and alter the 2 'position of the ribose unit C) supplying the RNA oligonucleotide thus produced with the oligonucleotide With the target structure to which it can specifically bind, d) separating those oligonucleotides bound on the target structure first from the unbound oligonucleotide with the target structure, and then separating the bound oligonucleotide. E) transcribes their target structure-specific RNA oligonucleotides into complementary DNA strands with the aid of reverse transcriptase; f) polymerase chain reaction using limited primer sequences G) the DNA oligonucleotides thus amplified are then transcribed again into RNA oligonucleotides with the aid of RNA polymerase and using modified nucleotides, h) if desired, the selection steps c) to g) described above. Are sufficiently characterized by a high binding affinity for the target structure Repeat until-option, and then is an oligonucleotide that can be obtained by being able to determine the sequence of this obtained was oligonucleotides desired compound according to any one of claims 1 to 5. 7. 7. The compound according to claim 6, wherein the target structure is a macromolecule, a higher organism such as an animal or human tissue structure, an animal or human organ or part of an organ, a tumor cell or tumor. 8. The connecting component B a) 4 is attached to the terminal 'position 4 of CH ₂ -OH group by reduction oligonucleotide group N', and / or b) 3 'position oligonucleotide radical which is reduced by hydrogen atoms Attached to the 3 'end of N and / or c) linked to one or more phosphodiester linkages reduced by an OH group, in each case between two nucleotides, and / or d) each at position 5,8 Is linked to 1 to 30 nucleobases, which are reduced by a hydrogen atom and / or by an amino group at positions 2, 4 and 6. 9. B has the general formula XYZ- ¹ , linked on the X side to a complexing agent or complex and linked on the Z side to an oligonucleotide, where X is a direct bond, an -NH group or an -S group. Wherein Y is a linear or branched, saturated or unsaturated C ₁ -C ₂₀ alkylene chain, wherein said alkylene chain is optionally 1-2 cyclohexylene, 1-5 imino, 1-3 Phenylene, 1-3 phenylene imino, 1-3 phenyleneoxy, 1-3 hydroxyphenylene, 1-5 amide, 1-2 hydrazide, 1-5 carbonyl, 1 ~ 5 ethyleneoxy, 1 ureido, 1 thioureide, 1-2 carboxyalkylimino, 1-2 ester groups, 1-3 Ar groups (where Ar is optionally nitrogen, 1 selected from oxygen and sulfur Represents a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which may contain one or more heteroatoms and / or one to two carbonyl groups), one to ten oxygens, one to five nitrogens and / or Or 1-5 sulfur atoms and / or optionally 1-5 hydroxy, 1-2 mercapto, 1-5 oxo, 1-5 thioxo, 1-3 number of carboxy, 1-5 carboxy -C ₁ ~ C ₄ alkyl, 1-5 ester, 1-3 amino, 1-3 hydroxy -C ₁ -C ₄ alkyl, 1-3 it may be substituted by C ₁ -C ₇ alkoxy group, and Z ¹ is _{-CONH-CH 2 -4 ', -} NH-CO-4', - O-P (O) R 1 -NH-CH _{2 -4 ', -O-P (} O) R 1 -O-CH 2 -4', - O-P (S) R 1 -O-3 ' or -O-P (O) R 'Represents, wherein 4' ¹ -O-3 or 3 'indicates the bond to the terminal saccharide unit and R ¹ is ^{^{_{O -, S -, C 1}}} ~C 4 alkyl or NR ^² R ³ (R ² And R ³ represents hydrogen or a C ₁ -C ₄ alkyl group) group. Ten. B having the general formula XYZ- ² linked to a complexing agent or complex on the X side and linked to an oligonucleotide on the Z side, wherein a bridge connecting two adjacent sugar units Z ² represents a group —NR ² —, —O— or —S—, X represents a direct bond, an —NH group or a —S group, and Y represents a linear or branched, saturated or unsaturated group. A saturated C ₁ -C ₂₀ alkylene chain, wherein said alkylene chain is optionally 1-2 cyclohexylenes, 1-5 iminos, 1-3 phenylenes, 1-3 phenyleneiminos, 3 phenyleneoxy, 1-3 hydroxyphenylene, 1-5 amide, 1-2 hydrazide, 1-5 carbonyl, 1-5 ethyleneoxy, 1 ureide, 1 Thioureido, 1-2 carboxyalkylimino, 1-2 ester groups, 1-3 Ar groups, wherein Ar is 1-2 heteroatoms optionally selected from nitrogen, oxygen and sulfur And / or contains 1 to 2 carbonyl groups Represents a 5- or 6-membered ring), 1-10 oxygen, 1-5 nitrogen and / or 1-5 sulfur atoms, and / or optionally 1- 5 hydroxy, 1-2 mercapto, 1-5 oxo, 1-5 thioxo, 1-3 carboxy, 1-5 carboxy -C ₁ -C ₄ alkyl, 1-5 number of ester, 1-3 amino, 1-3 hydroxy -C ₁ -C ₄ alkyl, it may be substituted by one to three C ₁ -C ₇ alkoxy group, and R ² is hydrogen Or a C ₁ -C ₄ alkyl group. 11． B has the general formula X—Y—Z ³ , wherein Z ³ represents a —NH group or a direct bond to a nucleobase, X represents a direct bond, a —NH group or a —S group, and Y is straight or branched chain, a C ₁ -C ₂₀ alkylene chain, saturated or unsaturated, wherein the alkylene chain 1-2 cyclohexylene optionally, 1-5 imino, 1-3 phenylene, 1-3 phenylene imino, 1-3 phenyleneoxy, 1-3 hydroxyphenylene, 1-5 amide, 1-2 hydrazide, 1-5 carbonyl, 1-5 Ethyleneoxy, 1 ureido, 1 thioureido, 1-2 carboxyalkylimino, 1-2 ester groups, 1-3 Ar groups, where Ar is optionally from nitrogen, oxygen and sulfur Selected 1-2 heteroatoms and / or Or a 5- or 6-membered ring which may contain 1-2 carbonyl groups), 1-10 oxygen, 1-5 nitrogen and / or 1-5 sulfur atoms And / or optionally 1-5 hydroxy, 1-2 mercapto, 1-5 oxo, 1-5 thioxo, 1-3 carboxy, 1-5 carboxy- C ₁ -C ₄ alkyl, 1-5 ester, 1-3 amino, 1-3 hydroxy -C ₁ -C ₄ alkyl, substituted by one to three C ₁ -C ₇ alkoxy group 9. The compound of claim 8, section d). 12． Compound according to any of the preceding claims, wherein the metal complex contains gadolinium, manganese or iron as the imaging element. 13. A method for the detection of a target structure, comprising combining one or more compounds according to any one of the preceding claims with a sample to be studied in vivo or in a test tube, and based on the signal, the oligonucleotide N Detecting whether a target structure that specifically binds with high affinity is present in the sample. 14. A non-invasive method of diagnosing a disease, comprising combining one or more compounds according to any one of claims 1 to 12 with a sample to be studied in vivo and, based on the signal, the oligonucleotide. A method comprising detecting whether a target structure to which N binds specifically and with high affinity is present in the organism to be studied. 15． N is a non-natural oligonucleotide having a specific binding affinity for a target molecule, such a target molecule other than a polynucleotide that binds to the oligonucleotide ligand through a mechanism that relies primarily on Watson / Crick base pairing or triple helix binding. The compound according to any one of claims 1 to 4, wherein the compound is a three-dimensional chemical structure, wherein the oligonucleotide ligand is not a nucleic acid having a known physical function bound by a target molecule.