JPH10509949A

JPH10509949A - ｅｒｂＢ２−４を過剰発現する細胞に向けられた細胞毒性活性を備えた融合タンパク質

Info

Publication number: JPH10509949A
Application number: JP8516384A
Authority: JP
Inventors: ジョンダリー，ロジャー; ジョンフィデス，ロドニー
Original assignee: シーアールシーフォーバイオファーマシューティカルリサーチピーティワイリミテッド
Priority date: 1994-11-22
Filing date: 1995-11-17
Publication date: 1998-09-29
Also published as: WO1996016176A1; EP0804596A4; CA2205807A1; EP0804596A1; AUPM959894A0

Abstract

(57)【要約】本願発明は、ｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４を過剰発現する細胞に対して細胞毒性活性を備えたリガンド毒素を提供する。リガンド毒素は、毒素に融合したｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４に結合するアミノ酸配列を具備もしくは含有するペプチドを含む。好ましい形態としては、ペプチドは、ヘレグリンβ２の表皮成長因子様ドメインに実質的に相同なアミノ酸配列を具備もしくは含有する。また、毒素がシュードモナス外毒素もしくはその誘導体であることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】ｅｒｂＢ２−４を過剰発現する細胞に向けられた細胞毒性活性を備えた融合タンパク質本願発明は、修飾されたシュードモナス(Pseudomonas)外毒素（ＰＥ４０）に融合したヘレグリン(heregulin)β２の表皮成長因子様ドメインを含むリガンド毒素に関する。本願発明はさらに、リガンド毒素を含む薬学的組成物、並びに、多くの場合、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４（ｅｒｂＢ２−４）を単独もしくは組み合わせて過剰発現するガン、特に乳ガン等を処置する方法にも関する。ｅｒｂＢ２に対する抗体、例えば４Ｄ５モノクローナル抗体（Hudziakら，Mol ．Cell．Biol．9，1165-1172，1989）が知られており、抗癌治療におけるこれらの抗体の使用が提案されている。４Ｄ５は、ｅｒｂＢ２を過剰発現する細胞に特異的に向けられ、これらの生育を阻害する。このアプローチの利点は、ｅｒｂＢ２過剰発現細胞に特異的に向けられ、毒性の副作用がないことである。欠点は、このアプローチがｅｒｂＢ２を過剰発現する細胞に限定されることと、その効果が細胞毒性と言うよりむしろ細胞不活性化(cytostatic)であると言うことである。ｅｒｂＢ２に向けられた免疫毒素の使用、例えばｅ２３−ＬｙｓＰＥ４０（Ba traら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89，5867-5871，1992）、ＴＡ−１−リシン（Rodriguezら，Am．J．Obstet．Gynecol．168，228-232，1993）も提案されている。これらはｅｒｂＢ２過剰発現細胞に対して特異的でありかつ細胞毒性である；しかしながら、例えば４Ｄ５のみを用いた場合よりも毒性の副作用があり得る。天然のｅｒｂＢ２リガンド（本明細書ではヘレグリン類、ＨＲＧ群と称する）を示すために提案されたポリペプチドフアミリーのクローニングおよび特徴決定が、最初にWenら（Cell 69，559-572，1992）およびHolmesら（Science 256 ，1205-1210，1992）によって報告された。このフアミリーのメンバーが、次いで、他の二つのグループによってクローン化された；Marchionniら（Nature 362 ，312- 318，1993）およびFallsら（Cell 72，801-815，1993）。しかしながら、最近の研究によりＨＲＧ群がｅｒｂＢ２に直接結合しないことが明らかになった。代わって、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４がこれらのリガンドに対するレセプターとして機能し、これらのレセプターとのヘテロダイマー化(h eterodimerisation)の結果として、ＨＲＧ結合に次いで、観察されたｅｒｂＢ２のチロシンリン酸基転移が起こる（Plowmanら，Nature 366，473-475，1993; Ca rrawayら．J．Biol．Chem．269，14303-14306，1994; Slikowskiら．J．Biol．C hem．269，14661-14665，1994）。二つのグループが、ＨＲＧ群が生育阻害、および、ｅｒｂＢ２を過剰発現するヒト乳ガン細胞の表現型分化を引き起こすことを報告した（Wenら，Cell 69，55 9-572，1992; Bacusら，Cell Growth Differ．3，401-411）。それゆえ、このことは、最小の副作用を備えた可能性のある治療方法を示す。しかしながら、Holm esらは、ＨＲＧ群の増殖効果を観察したのみであり、本願発明者らは、この知見を支持する未公開のデーターを所有している。ＨＲＧ−毒素は、ヒト乳ガン細胞を標的化する別のアプローチを示し、抗ｅｒｂＢ２免疫毒素と比較して、産生が容易であり（抗体に比べてＨＲＧ成分のサイズがより小さく、高収率の原核性の発現システムに適していることによる）、抗原性が低い。ｅｒｂＢ２レセプターは、ヒト乳ガン細胞の約２０％において過剰発現され（ Slamonら．Science 244，707-712，1989）、卵巣ガン、胃ガンおよび結腸ガンを含む他のガンにおいても過剰発現され（Beschukら．Cancer Res．50，4087-4091 ，1990; Kamedaら．Cancer Res．50，8002-8009，1990; D'Emillaら．Oncogene 4，1233-1239，1989）、治療に魅力的な標的とされている。ｅｒｂＢ２リガンドとしての、またｅｒｂＢ２を過剰発現するヒト乳ガン細胞の増殖を阻害し分化を促進するファクターとしての、ＨＲＧ群の予備的な特徴決定により、本願発明者等は、これらのリガンドの組換え産生を試み、治療能力を調査するに至った。ＨＲＧ群が、ｅｒｂＢ２を過剰発現する細胞系を含むヒト乳ガン細胞の増殖を刺激したという本願発明者等の知見により、本願発明者等は、治療手段としてのＨＲＧ−毒素に焦点を当てるに至った。ＨＲＧ群がｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４レセプターに対するリガンドであるとする最近の同定により、本願発明者等は、ＨＲＧ群がｅｒｂＢ２のみのリガンドである場合より、より広い範囲のヒト乳ガン細胞を標的化すると予想するに至った。これは、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４レセプターもヒト乳ガン細胞にしばしば過剰発現され（Krausら．Proc．Natl．Acad Sci（USA）86，9193-9197．1989; Plowmanら．Proc．Natl．Acad Sci（USA）90 ，1746-1750，1993）、これらの細胞がｅｒｂＢ２も過剰発現するとは限らないからである。この仮説は、現在確認されている。本願発明者等は、修飾されたシュードモナス(Pseudomonas)毒素（ＰＥ４０）に融合されたヘレグリンβ２の表皮成長因子様ドメイン（ＨＲＧβ２、アミノ酸１７７−２３７）からなるリガンド毒素を構築した。ＨＲＧβ２−ＰＥ４０リガンド毒素を設計し、ｐＦｌａｇ原核性発現システムを用いて発現させた。ＨＲＧ β２−ＰＥ４０は、２０ｐＭの低い濃度で、ＭＣＦ−７ヒト乳ガン細胞上のｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ３レセプターのチロシンリン酸基転移を誘導した。リガンド毒素は、低いあるいは検出不可のレベルのｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４レセプターを発現する、１８４Ｂ５固定化正常乳表皮細胞の生育を顕著に阻害することはなかった。しかしながら、正常乳表皮細胞と比べて、ｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４を過剰発現するヒト乳ガン細胞を用いた生育実験では、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０を添加することにより、ＨＲＧβ２またはＰＥ４０のみを添加した場合と比べて、顕著な細胞毒性効果が生じた。例えば、正常な乳表皮細胞と比べてｅｒｂＢ２−４を過剰発現するＺＲ−７５−１ヒト乳ガン細胞では、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０のＩＣ₅₀（対照培養に対して細胞数が５０％減少するのに必要なリガンド−毒素の濃度）は２−４ｐＭであったのに対して、ＰＥ４０のみのＩＣ₅₀は２５００ｐＭであった。これらの結果は、ｅｒｂＢ２−４を単独もしくは組み合わせて過剰発現するヒトの乳ガンまたは他のガンに対する新規の治療手段を示すことを示唆する。従って、本願発明の最初の態様はリガンド毒素にあり、このリガンド毒素は、毒素に融合したｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４に結合するアミノ酸配列を具備もしくは含有したペプチドを含む。本願発明の好ましい実施態様では、ヘレグリンβ２の表皮成長因子様ドメインのアミノ酸配列に実質的に相同なアミノ酸配列を具備もしくは含有する。毒素は、当該技術分野で知られた多数の毒素のいずれかとすることができるが、現在のところ、シュードモナス外毒素もしくはその誘導体が好ましい。特に、毒素がＰＥ４０であることが望ましい。本願発明のさらに好ましい実施態様では、リガンド毒素は実質的に図１に示されたアミノ酸配列を備える。さらに好ましい実施態様では、リガンド毒素は組換えにより産生される。本願発明の第二の態様はベクターであり、このベクターは、実質的に図１に示されたアミノ酸配列を備えたリガンド毒素をコードしたＤＮＡ配列を含む。本願発明の第三の態様は、ｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４を過剰発現するガンを処置するのに使用される組成物であり、この組成物は本願発明の第一の態様のリガンド毒素と使用可能なキャリアーを含有する。本願発明の第四の態様は、患者におけるｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４を過剰発現するガンを処置する方法であり、患者に本願発明の第三の態様の有効量の組成物を投与することを含む。本願発明の態様の好ましい実施態様では、患者が乳ガンに罹患している。本願発明の性質がより明確に理解されるように、好ましい形態を以下の実施例および図面を参照しながら記載する。図１．ｐＦＬＡＧ／ＨＲＧβ２−ＰＥ４０発現ベクターにコードされた成熟ＨＲＧβ２−ＰＥ４０リガンド毒素の完全なアミノ酸配列．ｏｍｐＡペプチドを切断した後、成熟リガンド毒素タンパク質が、形質転換した細菌の細胞周辺腔に発現された。この組換えタンパク質の精製を、抗ＦＬＡＧ −アフィニティークロマトグラフィーで行った。８アミノ酸ＦＬＡＧペプチドには、二重下線が付されている。ＨＲＧβ２タンパク質配列は太字で示されている。HindIIIクローニング部位を含むＰＥ４０リーダー配列には下線が付されており、３６１アミノ酸ＰＥ４０タンパク質配列が正常型で示されている。翻訳終結コドンがアスタリスクで示されている。図２．ＨＲＧが誘導したｅｒｂＢ２−４のチロシンリン酸基転移．ＭＣＦ−７ヒト乳ガン細胞の単層培養を、１８時間、ＲＰＭＩ１６４０／０．５％ＦＣＳ中で血清飢餓状態にして、示された投与量で各々の組換えＨＲＧイソ型タンパク質（α、β１、β２もしくはβ３）を添加した。３７℃でさらに２０分後、細胞を溶解し、細胞抽出物の分割量に抗ホスホチロシン抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。ｅｒｂＢ２−４に対応する主要な１８０−１８５ｋＤａのバンドの強度をデンシトメトリーで評価し、図式的に示した（α-□； β１-●；β２-△；β３-▼）。図３．ＨＲＧβ２およびＨＲＧβ２−ＰＥ４０が誘導したｅｒｂＢ２−４のチロシンリン酸基転移の比較．ＭＣＦ−７ヒト乳ガン細胞の単層培養を、１８時間、ＲＰＭＩ１６４０／０．５％ＦＣＳ中で血清飢餓状態にして、示された投与量でＨＲＧβ２およびＨＲＧ β２−ＰＥ４０を添加した。３７℃でさらに２０分後、細胞を溶解し、細胞抽出物の分割量に抗ホスホチロシン抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。ｅｒｂＢ２−４に対応する主要な１８０−１８５ｋＤａのバンドの強度をデンシトメトリーで評価し、図式的に示した（ＨＲＧ-□；ＨＲＧβ２−ＰＥ４０-●）。図４．１８４Ｂ５固定化ヒト乳表皮細胞およびヒト乳ガン細胞の増殖速度に与えるＨＲＧβ２もしくはＨＲＧβ２／ＰＥ４０の影響．細胞を９６ウェルの培養プレートの各ウェルに分けた。ＨＲＧβ２、ＨＲＧβ ２／ＰＥ４０もしくはＰＥ４０（０．５ｐＭ−５ｎＭ）を０日目に添加し、間接ＭＴＴアッセイを用いて３、５および７日目に細胞数を評価した。グラフは、最大の応答を示す投与量に対する代表的な結果を示す（ＨＲＧβ２１ｎＭ；ＨＲＧβ２／ＰＥ４０５ｎＭ；ＰＥ４０５ｎＭ；対照ビヒクルのみ）。各実験は３、４回行われ、本質的に同じ結果となった。（Ａ− １８４Ｂ５；Ｂ−Ｔ− ４７Ｄ；Ｃ−ＭＣＦ−７；Ｄ−ＺＲ−７５−１；対照−□；ＨＲＧβ２−●；ＨＲＧβ２／ＰＥ４０−△；ＰＥ４０−◆；）図５．１８４Ｂ５固定化ヒト乳表皮細胞およびＺＲ−７５−１ヒト乳ガン細胞におけるＨＲＧβ２−ＰＥ４０が誘導した細胞毒性の用量応答．細胞を９６ウェル培養プレートの各々のウェルに分配した。ＨＲＧβ２、ＰＥ４０もしくはＨＲＧβ２／ＰＥ４０（０．５ｐＭ−５ｎＭ）を０日目に添加し、間接ＭＴＴアッセイを用いて７日目に細胞数を調べた。細胞数は対照値のパーセントとして示されている。（Ａ− １８４Ｂ５；Ｂ−ＺＲ−７５−１；ＨＲＧβ ２−□；ＨＲＧβ２／ＰＥ４０−●；ＰＥ４０−△）。ＨＲＧイソ型タンパク質のＥＧＦ様ドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントの単離グアニジニウム・イソチオシアナート−セシウムクロリド法(The guanidinium isothiocyanate-caesium chloride procedure)を用いて、高レベルのＨＲＧ群を発現するヒト乳ガン細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の全ＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを、Dynabeads（Dynal）でオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーによって調製した。第一鎖ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマーとＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を用いて合成した。二本鎖ｃＤＮＡをＲＮアーゼＨとＤＮＡポリメラーゼＩを用いて調製し、ＰＣＲによるＨＲＧ誘導ｃＤＮＡ群の合成鋳型として用いた。ｃＤＮＡ合成試薬は、Clontechから入手した：ＰＣＲ試薬はPerkin-Elm er Cetusから入手した。ＤＮＡフラグメントの増幅は、５つのヌクレオチドリーダー配列とサブクローニングを容易にするためのHindIII部位（下線部）を含有する各イソ型タンパク質に共通の正方向プライマー並びに、リーダー配列、HindIII部位（下線部）およびインフレーム終結コドン（an in-frame termination codon）（二重下線部）を含有する、α、β１およびβ２に共通の逆方向プライマーもしくはβ３の逆方向プライマーを利用した。ＨＲＧ−ＰＥ４０リガンド毒素の産生に適したｃＤＮＡ群をクローン化するために、停止コドンが削除された以下の逆方向プライマーを用いた。これらのｃＤＮＡフラグメントは、生物学的活性に重要であることが以前に示されたＨＲＧ群のＥＧＦ様ドメインをコードする（Holmesら，Science 256，1205- 1210，1992）。ＨＲＧおよびＨＲＧ−毒素発現ベクターの構築各ＨＲＧイソ型タンパク質をコードするＰＣＲ産物を、HindIIIで切断し、ｐＦＬＡＧ−１発現ベクターの対応部位にリゲートした。E.coliＤＨ５αに形質転換した後、特定のＨＲＧイソ型タンパク質をコードするプラスミドを有する形質転換体を、小規模プラスミド調製物の配列決定により同定した（Sequenase Vers ion 2.0，USB）。リガンド毒素発現ベクターの構築のために、シュードモナス外毒素ＰＥ４０をコードする１１８４ｂｐのHindIII/EcoRIｃＤＮＡフラグメントをｐＦＬＡＧ− １の対応部位にリゲートした。この最初の構築物は、E.coliＤＨ５で発現させた場合に、リガンド毒素実験の対照として用いられる組換えＰＥ４０毒素を産生した。ＨＲＧαもしくはＨＲＧβ２をコードするHindIIIｃＤＮＡフラグメントを、このＰＥ４０構築物に挿入した（それぞれＨＲＧα−およびＨＲＧβ２−ＰＥ４０を作製）。 E.coliにおけるＨＲＧイソ型タンパク質およびＨＲＧ−ＰＥ４０の発現組換え細菌を、振動させながら３７℃で生育させ、培養のＯＤ₆₀₀が０．８となるまで生育させた。ＩＰＴＧを５００μＭまで添加し、さらに２時間培養をインキュベートした。各E.coli細胞フラクションにおける発現レベルを決める最初の実験では、ＩＰＴＧ誘導培養（１００ｍｌ）を３つに分け、細胞を遠心して回収した。全細胞フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中の一つの細胞ペレットの再懸濁によって単離した。５ｍｌの抽出バッファーＡ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、５ｍＭＥＤＴＡ、０．２５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、５０μｇ／ｍｌＮａＮ₃）さらに０．５ｍｌの抽出バッファーＢ（１．５ＭＮａＣｌ、０．１ＭＣａＣｌ₂、０．１ＭＭｇＣｌ₂、０．０２μｇ／ｍｌＤＮアーゼI、０．２ｍＭＮａＶＯ₃、０．２ｍＭＰＭＳＦ、０．２ｍＭロイペプチン、０．２ｍＭアプロチニン(aprotinin)）を添加することによって、全細胞ペレットを可溶性もしくは不溶性フラクションに分画するために、第二のペレットを使用した。得られた懸濁液を１８０００ｘｇで１時間遠心して、可溶性（上清）と不溶性（ペレット）細胞フラクションを得た。不溶性細胞フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに再懸濁したが、可溶性フラクションの一定分量は等ボリュームの２ｘサンプルバッファーと混合した。最後に、第三の細胞ペレットを、４０ｍｌのＯＳバッファー（０．５Ｍスクロース、０．０３ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁して浸透圧ショック用に調製し、１０℃、１０分間、３５００ｘｇで速心した。細胞を２５ｍｌの氷冷水に急速に懸濁し、ペリプラズム（細胞周辺腔の）タンパク質を放出させた。４℃、１０分間、３５００ｘｇでの遠心後、懸濁液を回収し、５０μｌの一定分量を等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびニトロセルロース膜にタンパク質を転写した後に、ＦＬＡＧエピトープ付加タンパク質を、抗ＦＬＡＧＭ２モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と、それに次ぐ増強化学発光(Enhanced Chemiluminescence)（ＥＣＬ）（Amersh am）によって検出した。Ｍ２抗体は、ｏｍｐＡ切断および非切断形態の両方からなるＦＬＡＧタンパク質を検出する。組換えタンパク質は、全てのフラクションにおいて、種々のＨＲＧイソ型タンパク質とＨＲＧ誘導リガンド毒素の両方について検出された。ＨＲＧ群の場合には、予想される移動度のタンパク質（約７ｋＤａ）が産生された。ＨＲＧ−ＰＥ４０リガンド毒素は、単独で発現された場合には約４７ｋＤａの見かけの分子量で移動する、ＰＥ４０の異常な移動により、５２ｋＤａの相対移動度で移動した。ペリプラズムフラクションに見出されたタンパク質は抽出が最も単純で、最も正確にホールドされ、生物学的に活性であるため、親和的精製をペリプラズム抽出物に対して行った。組み換えＨＲＧおよびＨＲＧ−ＰＥ４０リガンド毒素の精製各々のＨＲＧイソ型タンパク質、ＨＲＧ−ＰＥ４０もしくはＰＥ４０毒素のみについて、細胞周辺腔に発現されたタンパク質を、ｏｍｐＡ切断ＦＬＡＧ融合タンパク質のみを結合する抗ＦＬＡＧＭ１モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって単離精製した。この抗体は、カルシウムの存在下でのみＦＬＡＧペプチドに結合するので、カラムに添加する前に、ペリプラズム細胞フラクションを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に２ｍＭＣａＣｌ₂とした。結合タンパク質を、２ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で溶出し、ウェスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色によってサイズと純度を分析した。それそれのタンパク質について、容易に溶けるタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により実質的にシングルバンドまで精製された。一般的に、精製されたタンパク質の収率は培養の０．２−２．０ｍｇ／ｌの範囲である。しかしながら、ＨＲＧイソ型タンパク質では、可溶性タンパク質の最も高い収率は、一貫してβ２イソ型タンパク質で得られ、収率は培養の３．０ｍｇ／ｌまでであった。ｅｒｂＢレセプターチロシンリン酸基転移のＨＲＧおよびＨＲＧ−ＰＥ４０刺激ＭＣＦ−７ヒト乳ガン細胞系を以前に記載されたようにして維持し（Buckleyら，Oncogene 8，2127-2133，1993）、６ウェル組織培養プレートで集密に近くなるまで生育させた。細胞を、０．５％ＦＣＳを含有する培地中で１８時間飢餓状態にした。組換えＨＲＧもしくはＨＲＧ−ＰＥ４０を、１００μｌのＴＢＳ／０．０５％ＢＳＡに添加した（２０ｐＭ〜１０ｎＭの終濃度）。対照にはビヒクルのみを与えた。３７℃で２０分間インキュベートした後、培地をアスビレーションによって除去し、細胞を２００μｌの溶解バッファー（１％ＴｒｉｔｏｎＸ −１００、１５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２ｍＭＮａ₃ＶＯ₄、１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン）に溶解した。氷上で５分間インキュベートした後、細胞の砕片を遠心によって除去した（１００００ｘｇ、５分、４ ℃）。ＨＲＧまたはＨＲＧ−ＰＥ４０投与後にｅｒｂＢ２−４のチロシンリン酸基転移レベルを調べるために、得られた細胞溶解物のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに転写し、ホスホチロシンに対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットした（ＰＹ２０、Transduction Laboratories）。結合した抗体の検出はＥＣＬによるものであった（Amersham）。ｅｒｂＢ２− ４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、小さい移動度で移動するので（１８０−１８５ｋＤａ）、これらのレセプターの組み合わせられたチロシンリン酸基転移レベルが、ゲルのこの領域の分析からわかる。ＨＲＧイソ型タンパク質がｅｒｂＢ２−４レセプターを活性化する能力は、ＨＲＧの用量が２０ｐＭ以上の場合に、ＭＣＦ−７細胞において１８０−１８５ｋＤａにチロシンリン酸基転移したバンドが誘導されることから明白なことである（図２）。ＨＲＧ群α、β２およびβ ３は、試験された最も高い濃度において（１０ｎＭ）、ｅｒｂＢ２−４チロシンリン酸基転移に約１０倍の増大を引き起こした。ＨＲＧβ２−ＰＥ４０がｅｒｂＢ２−４のチロシンリン酸基転移を刺激する能力についても、ＭＣＦ−７細胞を用いて試験した（図３）。リガンド毒素も、これらの細胞において１８０−１８５ｋＤａのタンパク質のチロシンリン酸化を誘導したが、重要なことに、ＨＲＧβ２と同じ様なチロシンリン酸基転移の用量応答が観察された。これらの結果は、ＨＲＧタンパク質のカルボキシ末端にＰＥ４０が存在するにも関わらず、ＨＲＧドメインが、ｅｒｂＢ２−４の活性化ということに関して、単独で発現された組換えＨＲＧと同じ様な活性を残していることを示唆している。どのｅｒｂＢレセプターが活性化されたかを調べるために、免疫沈降法を行った。容易に検出できるレベルのｅｒｂＢ２−４を発現することから、ＺＲ−７５ −１ヒト乳ガン細胞を用いた。Ｔ１５０組織培養フラスコ中で、細胞を集密に近くなるまで生育させた。血清飢餓状態の後に、ＨＲＧβ２（１０ｎＭ）を１５分間添加した。上述したように、１ｍｌの溶解バッファーに細胞を溶解させた。抗体（１−２μｇ）を、４℃で少なくとも２時間、溶解物（ＰＹ２０免疫沈降物中のｅｒｂＢ４の検出に２５０μｌを用いたことを除いては、全ての反応で１００ μｌの溶解物を用いた）とインキュベートした。４℃で少なくとも１時間、ヤギ抗マウスＩｇＧセファロースもしくはプロテインＡ−セファロースビーズ（４０ μｌ）とインキュベーションすることによって、免疫複合体を回収した。セファロースビーズを遠心して回収し、冷却した溶解バッファーで３回洗浄し、ＳＤＳ −ＰＡＧＥサンプルバッファーに再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ニトロセルロースに転写した後、サンプルを所望の抗体でウエスタンブロットした。抗ホスホチロシンモノクローナル抗体を用いてＺＲ−７５−１細胞からのｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ３免疫沈降物をウェスタンブロッティングすることにより、ＨＲＧβ２（１０ｎＭ）投与におけるこれらのレセプターのチロシンリン酸基転移の顕著な増大が示された。これらの研究で用いられた抗ｅｒｂＢ４抗体はウェスタンブロッティングに単に適しているだけなので、対照およびＨＲＧ刺激細胞からの抗ホスホチロシン免疫沈降物が抗ｅｒｂＢ４抗体を用いてブロットされる相互的な実験を行った。ＨＲＧ添加により、明らかに、抗ホスホチロシン免疫沈降物中にｅｒｂＢ４の取り込みが増大した。それゆえ、これらの結果は、ｅｒｂＢ２−４が、ＨＲＧ処置でＺＲ−７５−１ヒト乳ガン細胞においてリン酸基転移したチロシンになることを証明している。同じ実験をＭＣＦ−７乳ガン細胞の細胞溶解物を用いて行った。ｅｒｂＢ４の発現レベルが不十分であるために、ＨＲＧβ２による活性化の検出が妨げられたことを除いて、同様の結果が得られた。これらの結果の最も明確な説明は、ヒト乳ガン細胞上のｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４レセプターに組換えＨＲＧβ２が結合して、チロシンリン酸基転移を誘導するということである。ｅｒｂＢ２の観察されたチロシンリン酸基転移は、おそらくこれらのレセプターとのヘテロダイマー化による。これらの知見は、以前の報告と一致する。固定化ヒト乳表皮細胞およびヒト乳ガン細胞の増殖におけるＨＲＧβ２およびＨＲＧβ２−ＰＥ４０の効果１８４Ｂ５固定化ヒト乳表皮細胞（StampferとYaswen.ヒト表皮細胞の形質転換：Molecular and Oncogenetic Mechanisms，pp 117-140，Milo．CastoとShule r Eds．CRC Press，1992）といくつかのヒト乳ガン細胞系をこれらの研究に使用した。ノーザンおよびウェスタンブロット解析（Janesら，Oncogene 9，3601-36 08，1994: Fiddes，JanesとdeFasio,未公開の結果）から得られたこれらの細胞系のｅｒｂＢレセプター状態は、表１に示されている。これらの実験の目的は、ｅｒｂＢレセプターの種々の組み合わせを過剰発現する乳ガン細胞を標的化することにおけるＨＲＧβ２−ＰＥ４０の選択性を調べることであった。１８４Ｂ５固定化ヒト乳表皮細胞（ＭＥＧＭ中）もしくはヒト乳ガン細胞（５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０中）を、組換えＨＲＧβ２、ＨＲＧβ２− ＰＥ４０もしくはＰＥ４０を添加する３日前（−３日目）に、５０μｌの生育培地中に１０３細胞／ウェルの初濃度となるように９６ウェルプレートの各ウェル中に分配した。０日目に、終濃度が０．５ｐＭ〜５ｎＭとなるように、組換えタンパク質を５０μｌの生育培地に添加した。対照には、５０μｌの生育培地中の等量のビヒクル（０．５μｌの０．１％ＢＳＡ）もしくは生育培地のみが添加された。これらと同じ処理をしたプレートを調製し、試薬添加から３、５および７日目に、一つのプレートを細胞の生育について分析した。細胞数（それぞれの処理につき６ウェル）を非放射活性細胞増殖アッセイ（Promega）を用いて間接的に測定した。５７０ｎｍの吸収を、Dynatech MR7000 スペクトロフォトメーターを用いて各ウェルにつき記録した。Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ−７およびＺＲ−７５−１ヒト乳ガン細胞は、未処理の対照と比べて速い増殖速度でＨＲＧβ２投与に応答した（図４および５）。ＺＲ− ７５−１細胞の場合、対照細胞と比べて細胞数の顕著な増大が、５０ｐＭ以上の濃度で観察された（図５）。逆に、１８４Ｂ５細胞はＨＲＧβ２に対して増殖応答を示さなかった（図４および５）。試験した全ての濃度において（０．５ｐＭ〜５ｎＭ）、また、３つの最初のプレーティング密度において（２００−１０００細胞／ウェルの範囲）、ＨＲＧβ２処理した細胞と対照細胞との間の細胞数には、７日間のインキュベーション期間を通して顕著な差異は観察されなかった。同様の研究を、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０とＰＥ４０のみを用いて平行して行った。正常乳表皮細胞と比べてｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４を過剰発現するヒト乳ガン細胞系に対するＨＲＧβ２−ＰＥ４０の細胞毒性が、対照培養と比べて細胞数が顕著に減少することから証明された（図４および５、表１）。ＰＥ４０のみによる細胞増殖の阻害は、非常に高い濃度で起こった（表１）。このことは、リガンド毒素のＨＲＧβ２成分が毒素を乳ガン細胞にし向けたことを示唆している。正常乳表皮細胞と比べて顕著にｅｒｂＢ３を過剰発現する二つの細胞系、Ｔ−４７ＤおよびＭＣＦ−７は、それぞれ５０−１００および３００−４００ｐＭのＩＣ₅₀値を示した。しかして、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０は、ｅｒｂＢ３を過剰発現する細胞を標的とすることができる。しかしながら、ＺＲ−７５−１細胞は、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０に最も感受性が強く、２−４ｐＭのＩＣ₅₀値を示した（図４および５および表１）。これらの細胞はｅｒｂＢ２−４を過剰発現するが、ｅｒｂＢ４は、ＨＲＧ群に対してｅｒｂＢ３よりも高い親和性レセプターを構成することから（Ttzaharら，Ｊ．Biol．Chem．269．25226-25233．1994）、Ｔ −４７ＤまたはＭＣＦ−７細胞よりも細胞の感受性が増大するのは、主にｅｒｂＢ４の非常に高い発現レベルによるものと説明されるであろう。重要なことに、１８４Ｂ５細胞がＨＲＧβ２−ＰＥ４０に曝された場合には、どんな用量であっても細胞毒性効果が観察されないことである（図４および５および表１）。これらの結果の最も明確な解釈は、ｅｒｂＢレセプターに対するＨＲＧ群の結合活性の観点において、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０が、ｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４を過剰発言するヒト乳ガン細胞を選択的に標的化すること、並びに、ｅｒｂＢ２過剰発現もこれらの細胞系に観察されうることである。ヒト前立腺ガン細胞の増殖に対するＨＲＧβ２−ＰＥ４０の効果ｅｒｂＢ３の発現の増大は、前立腺ガンの発達における早期の症状である（My ersら．J．Nat．Cancer Inst．86．1140-1145）。本願発明者等は、ＨＲＧβ２ −ＰＥ４０に対するヒト前立腺ガン細胞系の感受性を調べることに興味を抱いた。この種の３つの細胞系、Ｌｎ−ＣａＰ、ＰＣ−３およびＤＵ１４５に、乳ガン細胞系について上述したように、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０を、濃度を増大させながら添加した。リガンド毒素の顕著な細胞毒性が、Ｌｎ−ＣａＰ細胞系に対して、２００ｐＭのＩＣ₅₀値で観察された。この細胞系のｅｒｂＢレセプター状態は確認されていないが、このＩＣ５０値は、Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ−７等のｅｒｂＢ３過剰発現乳ガン細胞に見られたものに匹敵する。それゆえ、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０は、前立腺ガン細胞系のサブセットを標的化することができ、乳ガン細胞の場合と同様に、これらの細胞の感受性は、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４の発現レベルによって広く調べられるであろう。ｅｒｂＢ３の過剰発現は、胃ガン（Sanida sら．Int．J．Cancer 54，953-940，1993）および膵臓がん（Lemoineら，J．Pat hology 168，269-273，1992）にも見られることから、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０はこれらのタイプのガン細胞にも使用できるであろう。ＨＲＧβ２−ＰＥ４０は、ｅｒｂＢ３もしくはｅｒｂＢ４を単独もしくは組み合わせて過剰発現するガン細胞を標的化するために使用できる。それゆえ、乳ガン細胞は多くの場合にこれらのレセプターを過剰発現することから、ヒト乳ガン細胞の新規の治療を示す。また、前立腺ガン、胃ガンおよび膵臓ガン等の、ｅｒｂＢレセプターを過剰発現する他のガンのタイプにも有効であろう。これらの予想は、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０の効能に関する研究室ベースのデータによって支持される。しかして、不死化された正常乳表皮細胞（１８４Ｂ５）もしくはｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４を過剰発現するヒト乳ガン細胞（例えば、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７ＤおよびＺＲ−７５−１細胞）の増殖が測定された実験では、ＨＲＧβ２−ＰＥ４０が、ヒト乳ガン細胞に顕著な細胞毒性効果を引き起こしたが、１８４Ｂ５対照には引き起こさなかった。当業者であれば、広く記載された本発明の精神もしくは範囲から逸脱することなく、特定の実施態様に示された本願発明に多数の変更および／または調節を施すことができると認識するであろう。それゆえ、本願の実施態様は、どの態様においても、例証的であって限定的なものではないと解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳＣ１２Ｐ 21/02 ＡＥＤ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フィデス，ロドニージョンオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2031 ランドウィックペロウスロード 173

Claims

【特許請求の範囲】１．毒素に融合した、ｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４に結合するヘレグリンβ２の表皮成長因子様ドメインに実質的に相同なアミノ酸配列を、具備もしくは含有するペプチドを含むリガンド毒素。２．毒素がシュードモナス外毒素もしくはその誘導体である、請求項１記載のリガンド毒素。３．毒素がＰＥ４０である、請求項１または２に記載のリガンド毒素。４．実質的に図１に示されたアミノ酸配列を備えた、請求項１ないし３のいずれか一項に記載のリガンド毒素。５．組換えによって産生された、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のリガンド毒素。６．実質的に図１に示されたアミノ酸配列を備えたリガンド毒素をコードするＤＮＡ配列を含むベクター。７．請求項１ないし５のいずれか一項に記載のリガンド毒素と使用可能なキャリアーとを含有する、ｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４を過剰発現するガンの治療に使用するための組成物。８．有効量の請求項７記載の組成物を患者に投与することを含む、患者におけるｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４を過剰発現するガンの治療方法。９．患者が乳ガンに罹患している、請求項８記載の方法。