JPH10509584A - Reporter cell line - Google Patents

Reporter cell line

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JPH10509584A
JPH10509584A JP8512938A JP51293896A JPH10509584A JP H10509584 A JPH10509584 A JP H10509584A JP 8512938 A JP8512938 A JP 8512938A JP 51293896 A JP51293896 A JP 51293896A JP H10509584 A JPH10509584 A JP H10509584A
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JP
Japan
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gene
reporter
expression
mediated
cell
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Application number
JP8512938A
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Japanese (ja)
Inventor
ステファン ニルソン
Original Assignee
カロ バイオ エービー
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、アッセイ可能な第一遺伝子産物を発現するよう配置され、第一リポーター遺伝子の発現がＡＰ−１介在性である第一リポーター遺伝子、及びアッセイ可能な第二遺伝子産物を発現するよう配置され、第二リポーター遺伝子の発現がグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）により介在される第二リポーター遺伝子を含む細胞株を提供する。本発明はまた、本発明の第一面に従う細胞を提供し、該細胞中のＡＰ１活性を刺激し及び該細胞を化合物と接触させ、また第一及び第二の遺伝子産物の発現をモニターすることを含む、化合物のグルココルチコイド様活性を試験する方法を提供する。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is directed to a first reporter gene arranged to express an assayable first gene product, wherein the expression of the first reporter gene is AP-1 mediated, and a second assayable gene. A cell line comprising a second reporter gene arranged to express the product, wherein expression of the second reporter gene is mediated by the glucocorticoid receptor (GR). The invention also provides a cell according to the first aspect of the invention, stimulating AP1 activity in said cell and contacting said cell with a compound, and monitoring expression of the first and second gene products. A method for testing the glucocorticoid-like activity of a compound is provided.

Description

【発明の詳細な説明】 リポーター細胞株 本発明は、リポーター細胞株及び、制限されないが特に可能性のある抗炎症薬 としての化合物を試験するのに有用な細胞株に関する。 ステロイド／甲状腺ホルモン及びビタミン類の腫瘍形成及び他のタイプの疾患 における役割は、よく知られている。アゴニスト又はアンタゴニストとして作用 する合成ホルモン薬は、今日いくつかの異なる病気の治療に使用される。しかし ながら、多くの適応症に関し、利用可能なホルモン性の薬物はなく、すでに存在 している薬物は、レセプター特異性又は組織選択性が低いために強い副作用を有 する。 グルココルチコイドは、炎症及び免疫応答に十分な効果を有する。グルココル チコイドは成長、分化及びこれらのプロセスに関与する広範囲の細胞の機能に影 響する。それらが強い効果を示す主要なメカニズムは、メタロプロテアーゼ、及 びＴＮＦ−α、ＩＬ−１，２，３及び６のような炎症メディエーターのような特 定の遺伝子のセットの転写を調節することによる。拮抗関係にあるグルココルチ コイドは、ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎオンコプ ロテインにより形成されるヘテロダイマー複合体で、メタロプロテアーゼ及びリ ンホカインプロモーターの主要なエンハンサーであるＡＰ１転写因子の妨害によ りこれら遺伝子の転写を抑制する（エンジェル(Angel)ら、(1987)Cell 49：729- 739; ボウムパス(Boumpas)ら、(1991)Clin．Experim．Rheum．９：413-423; ヤ ンイェン(Yang Yen)ら、(1990)Cell 62：1205-1215 及びこれらの中で引用され た参考文献）。 実験的なデータは、ＡＰ１依存性転写のメカニズムはＧＲ：ＡＰ１複合体の形 成を介してホルモン活性化グルココルチコイド受容体（ＧＲ）により抑制され、 該ＧＲ：ＡＰ１複合体は、そのＤＮＡ応答エレメントを介して転写レギュレータ ーとして作用するＧＲ因子及びＡＰ１因子の両方の能力を破壊することを示唆す る（ジョナット(Jonat)ら、Cell 62：1189-1204; ヤンイェン（Yang-Ye ら、(1990)Cell 62：1217-1226 及びこれらの中で引用された参考文献）。 実験的なデータによると、抗炎症剤としての合成及び天然のグルココルチコイ ドの相対的な強さは、それらがＡＰ１依存性転写を抑制する強さに対応する（ジ ョナット(Jonat)ら、Cell 62：1189-1204; ヤンイェン（Yang e)ら、（1990）Ce11 62：1217-1226; ボウムパス（Boumpas)ら、（1991）Clin． Experim．Rheum．９：413-423; 未発表の結果）。 現在臨床的に使用されているグルココルチコイドは副作用を有する。長期ステ ロイド使用の最も重大な副作用の１つはステロイド誘発オステオペニアである( クリスチャンセン シー．(Christiansen C.)及びオーバーガード ケイ(Overga ard K.)編、Osteoporosis 1990 p.1529-1538; ルッカート ビー．ピー．(Lucke rt B.P.)及びライツ エル．ジー．(Raisz L.G.)，（1990）Annals of Internal Medicine 112：352-364)。 グルココルチコイドは、高レベルの副甲状腺ホルモンＰＴＨ及び速やかな骨損 失を導く骨におけるマトリクス合成の抑制の組合せを誘導する。激しいネガティ ブな副作用が存在するため、臨床的に使用されるグルココルチコイドは、減弱し た毒性を有する新規抗炎症薬の必要性を示す。 大きい製薬会社の多くは、臨床適用に価値のあることが証明されるまで市場価 値のない１００，０００を超える化合物のライブラリーを蓄積している。動物に おける可能性のある抗炎症薬の伝統的試験は、時間がかかり、 かつ高価であり、今日では望ましくないと考えられ、ある場合には不正確な結果 を与えるかもしれない。 本発明の一面によれば、アッセイ可能な第一遺伝子産物を発現するよう配置さ れ、第一リポーター遺伝子の発現が転写因子により介在される第一リポーター遺 伝子、及びアッセイ可能な第二遺伝子産物を発現するよう配置され、第二リポー ター遺伝子の発現がレセプターにより介在される第二リポーター遺伝子を含み、 それによりある化合物の該２つの遺伝子発現に関する効果が測定可能である細胞 株が提供される。 好ましくは、本発明は、アッセイ可能な第一遺伝子産物を発現するよう配置さ れ、第一リポーター遺伝子の発現がＡＰ−１介在性である第一リポーター遺伝子 、及びアッセイ可能な第二遺伝子産物を発現するよう配置され、第二リポーター 遺伝子の発現がグルココルチコイドレセプターにより介在される第二リポーター 遺伝子を含む細胞株が提供される。 従って、本発明は抗炎症活性に関し多数の化合物を迅速に試験するために使用 することが可能である、１つの細胞株に基づく便利なアッセイシステムを提供す る。さらに、該細胞株は単一の細胞で２つの活性を試験することができ、一方、 以前は２つの細胞株が必要であろう。 好ましくは該細胞株はヒト、より好ましくはＨｅＬａ細胞に由来する。 リポーター遺伝子の１つはヒト胎盤のアルカリ性ホスファターゼのようなアル カリ性ホスファターゼを発現するよう配置されてもよく、他方のリポーター遺伝 子はヒト成長ホルモンを発現するよう配置されてもよい。これら遺伝子産物は、 それらが容易にアッセイできるので好ましい。 本発明の他の面によれば、本発明の第一の面に従う細胞を提供し、該細胞のＡ Ｐ１活性を刺激し、及び該細胞を化合物と接触させ、第一及び第二遺伝子産物の 発現をモニターすることを含むグルココルチコイド様活性に関する化合物の試験 方法が提供される。第一遺伝子産物のＡＰ１−介在性発現及び第二遺伝子産物の 刺激された発現の抑制は、化合物のグルココルチコイド様挙動の指標である。 ＡＰ１活性は、ＴＰＡ又はＥＧＦにより刺激され得る。 本発明による試験化合物に対する細胞株の産生及び使用は、添付の図面Ｆｉｇ ．１Ａから４を参照し、実施例のみにより記載されるであろう。該図面において ： Ｆｉｇ．１Ａは、マウス乳癌ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ ＬＴＲ）プロモ ーターの上流にタンデムに挿入 された５つのＡＰ１応答性エレメントのヌクレオチド配列及びヒト胎盤アルカリ 性ホスファターゼ（ＡＬＰ）の分泌型をコードする遺伝子を示す。 Ｆｉｇ．１Ｂは、Ｆｉｇ．１Ａのヌクレオチド配列を含むＡＬＰリポーターベ クター５ＡＰＮＴ−ＡＬＰを示す。 Ｆｉｇ．２は、ヒト成長ホルモンポリペプチド（ｈＧＨ）をコードするグルコ コルチコイドレセプターで制御されたリポーターベクターＭＭＴＶ−ｈＧＨ２を 示す。 Ｆｉｇ．３は、各々ＡＰ１依存性ＡＬＰ発現及びＧＲ依存性ｈＧＨリポーター 遺伝子トランス活性化に関するデキサメタゾンの効果及び本発明に従う細胞にお けるｈＧＨ発現に関する表皮成長因子（ＥＧＦ）の効果を示す； 及び Ｆｉｇ．４は、ｈＧＨ発現のグルココルチコイドレセプター依存性トランス活 性化及びＧＲＡＰＦ細胞中のＡＰ−１依存性ＡＬＰリポーター遺伝子転写の抑制 に関する異なるコルチコステロイドの効果を示す。結合ＡＰ−１／ＧＲレセプター細胞株の産生 まず、慣用技術を用いて、ＨｅＬａ ｔｋ−細胞をリポーターベクター５ＡＰ ＮＴ−ＡＬＰで安定に形質転換 した。該ベクターは、タンデムに配置された５つのＡＰ１応答エレメントをマウ ス乳癌ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ ＬＴＲ）のコアプロモーター配列の５’ 末端に融合し、また、培地へのＡＬＰタンパクの分泌がＡＰ−１介在性転写の指 標となるように、分泌型ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）をコード する遺伝子を含有している（Ｆｉｇ．１Ａ及びＢに示すように）。Ｆｉｇ．１Ａ は、プラスミド５ＡＰＮＴ−ＡＬＰ中のマウス乳癌ウイルス長末端反復（ＭＭＴ Ｖ）プロモーターのＴＡＴＡ−ボックスの上流にタンデムに挿入された５つのＡ Ｐ１応答性エレメントのヌクレオチド配列（上線）及び分泌型アルカリ性ホスフ ァターゼ（ＡＬＰ）をコードする遺伝子の始めの部分を示す。ＡＬＰのＡＴＧ（ 開始コドン）には下線が付されている。結果として生じる細胞をＧＲＡＰ細胞と 称した。 発現し、培地中に分泌されたＡＬＰリポータータンパクのレベルは、化学発光 アッセイによって直接測定することができる。化学発光に基づくアッセイの使用 簡便性及びＡＬＰが培養培地中に分泌されるという事実によって、ＡＬＰに基づ くリポーターアッセイは、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ （ＣＡＴ）及びルシフェラーゼ〔アラム ジェイ(Alam J.)及びコック ジェイ．エル．(Cook.J.L.)，(1990)アナリティカル・バイオケミストリー(An alyt．Biochem.)188: 245-254〕といった細胞内リポーターに比較して、著しく 便利に用いられる。さらに、化学発光ＡＬＰアッセイの高い感度ゆえに、９６穴 マイクロタイタープレート中で細胞を増殖させて該プレート中で化合物を試験す ることが可能になる。 それから次に、Ｆｉｇ．２に示されるＧＲ調節リポーターベクターＭＭＴＶ− ｈＧＨ２を、哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションに用いられる慣用技 術を使用して、ＧＲＡＰ細胞に導入し、ＧＲＡＰＦ細胞と称される新規な細胞株 を作成した。該リポーターベクターＭＭＴＶ−ｈＧＨ２は、ヒト成長ホルモン（ ｈＧＨ）をコードするリポーター遺伝子に融合したＧＲ−調節プロモーター（Ｍ ＭＴＶ）を含んでいる。該ｈＧＨリポータータンパクもまた、ＡＬＰリポーター タンパクと同様に、細胞培養培地中に分泌される。グルココルチコイド−誘導ｈ ＧＨ発現のレベルは、デルフィア・アッセイ（Delfia assay）〔ワラック オー ワイ(Wallac OY)、フィンランド〕によって免疫学的に測定される。 従って、リポーター遺伝子である２つの外因性転写ユニットを含むＧＲＡＰＦ 細胞は、それぞれ、２つの異な るシグナル活性化転写因子ＡＰ１及びＧＲによって、転写的に誘導される。ＡＬ Ｐ転写ユニットは、ホルボールエステルＴＰＡ又は表皮成長因子ＥＧＦによって 誘導されるＡＰ１転写因子の上昇レベルの存在によって、ＡＬＰ発現が増加する ように、コントロールされ、また該ＡＰ１転写因子の上昇レベルの存在に応答す る。一方、ｈＧＨ転写ユニットは、リガンド活性化ＧＲに応答してｈＧＨ発現の 増加を引き起こす。 ＡＰ１及びリガンド活性化ＧＲの両者の上昇レベルの下では、２つの転写ユニ ットは、ＧＲ及びＡＰ１とそれらが対応する応答性エレメントとの相互作用を互 いに抑制するＡＰ１：ＧＲ複合体の形成に起因して、不活動の状態にある（上記 参考文献参照）。 しかしながら、ホルモン活性化ＧＲはＡＰ１−依存性転写を妨害するのに対し て、増加ＡＬＰ発現によって直接的に測定されるＴＰＡ若しくはＥＧＦ誘導ＡＰ １活性は、ＧＲＡＰＦ細胞中でのグルココルチコイド−依存性ｈＧＨ発現を妨害 しない。従って、ＧＲＡＰＦ細胞によれば、全く同一の実験で、抗炎症薬として の能力を直接反映する、アゴニスト／アンタゴニスト・プロフィール及びグルコ コルチコイドとして作用する化合物の効力、並びにＡＰ１−依存性転写の阻害剤 としての化合物の効 力を評価することが可能となる。 これらの細胞中でのＡＬＰリポータータンパクの発現は、ＴＰＡのようなホル ボールエステル又は成長因子ＥＧＦによって誘導されるＡＰ１転写因子によって コントロールされる。ＧＲＡＰ細胞をＴＰＡ又はＥＧＦに曝露させると異なるＡ ＬＰ発現が誘導され、該発現は１００ｎＭデキサメタゾンの存在下で６０％抑制 され得る。２ ＧＲＡＰＦ細胞中での、デキサメタゾンのＡＰ１−依存性ＡＬＰ発現及びＧ Ｒ−依存性ｈＧＨリポーター遺伝子トランス活性化(transactivation)に対する 効果 種々の化合物の抗炎症薬としての効用を調べるにあたりＧＲＡＰＦ細胞が有用 であることが、合成グルココルチコイド・デキサメタゾンを用いて示された。 細胞は、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルベート及び１％非必須アミノ酸を加えたＭ ＥＭ中で培養された。 化合物に曝露する前に、ＧＲＡＰＦ細胞を、１０％ＦＣＳ（デキストラン−被 覆チャコール処理(strip)）を加えたＨａｍ’ｓ Ｆ１２（フェノールレッド無 添加）が入った９６穴マイクロタイタープレート中に播いた。２日目に該細胞を 洗浄し、下記に述べるような添加物を含む５％の血清代用品を加えたＣｏｏｎｓ Ｆ１２（フ ェノールレッド無添加）１００μｌを再び与えた。 発現したＡＬＰの相対的なレベルは、次に述べるような化学発光アッセイによ って測定された：白色のマイクロタイター中で、タイザード(Tizard)等〔(1990) 、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ズ（Proc.Natl Acad Sci.）87: 4514-4518〕及びアルクスニス(Alksnis)等〔(19 91)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、266: 10078-10085〕の方法に従って、細胞培養培地の１０μｌアリコートを２００μ ｌのアッセイ緩衝液（１０ｍＭジェタノールアミン、ｐＨ１０；１ｍＭ ＭｇＣ ｌ2及び０．５ｍＭ ＡＭＰＰＤ）と混合し、３７℃で２０分間インキュベート し、次いでマイクロプレート型ルミノメーター〔ルミノスキャン ラボシステム ズ(Luminoskan Labsystems)，フィンランド〕に移した。ルミノスキャン・ルミ ノメーターの設定は、各ウエルのリーディングを１秒とする積分測定とした。ア ルカリ性ホスファターゼ活性をライト・ユニット（light units：ＬＵ）として 表す。 ｈＧＨ発現を上述するデルフィア・アッセイで免疫学的にモニターした。 細胞は、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで処理してfos遺伝 子及びjun遺伝子（及び、ゆえにＡＰ１活性）を誘導し、その誘導をＡＬＰ発現 の増加によって直接測定した（Ｆｉｇ．３、白丸）。デキサメタゾン(″dex″) の濃度の増加に伴って、ＡＰ１−依存性ＡＬＰ発現は、ＥＧＦの存在の有無に関 わらず、ＧＲ−調節ｈＧＨリポーター発現がホルモン依存的に誘導されている間 、抑制される。 ｈＧＨ発現のグルココルチコイドリポーター依存性トランス活性化、及びＧＲ ＡＰＦ細胞中でのＡＰ−１依存性ＡＬＰリポータータンパク発現の抑制に対する 、異なるコルチコステロイドの効果をＦｉｇ．４に示す。グルココルチコイドレ セプター介在性転写（ｈＧＨ）に対するグルココルチコイドの効力に抑制効果は 見られないが、ＡＰ１機能（ＡＬＰ）の実質的な抑制活性が認められる。 本発明のリポーター細胞株及び方法は、広範囲にわたる種々の化合物について 抗炎症活性を試験するために用いられ、またコンパクトで便利なアッセイ系に使 用され得る。The present invention relates to reporter cell lines and cell lines useful for testing compounds as, but not limited to, particularly potential anti-inflammatory agents. The role of steroids / thyroid hormones and vitamins in tumorigenesis and other types of diseases is well known. Synthetic hormonal drugs that act as agonists or antagonists are used today for the treatment of several different diseases. However, for many indications, no hormonal drugs are available and already existing drugs have strong side effects due to poor receptor specificity or tissue selectivity. Glucocorticoids have a significant effect on inflammatory and immune responses. Glucocorticoids affect growth, differentiation and the function of a wide range of cells involved in these processes. The major mechanism by which they exert a strong effect is by regulating the transcription of specific sets of genes such as metalloproteases and inflammatory mediators such as TNF-α, IL-1,2,3 and 6. Antagonistic glucocorticoids are heterodimeric complexes formed by c-fos and c-jun oncoproteins that repress transcription of these genes by interfering with the AP1 transcription factor, a key enhancer of metalloproteases and lymphokine promoters. (Angel et al., (1987) Cell 49: 729-739; Boumpas et al., (1991) Clin. Experim. Rheum. 9: 413-423; Yang Yen et al., (1990) Cell 62: 1205-1215 and references cited therein. Experimental data show that the mechanism of AP1-dependent transcription is repressed by the hormone-activated glucocorticoid receptor (GR) via the formation of the GR: AP1 complex, which GR: AP1 complex binds its DNA response element. Suggests that it disrupts the ability of both GR and AP1 factors to act as transcription regulators through (Jonat et al., Cell 62: 1189-1204; Yang-Ye (1990) Cell 62: 1217-1226 and references cited therein). According to experimental data, the relative strength of synthetic and natural glucocorticoids as anti-inflammatory agents corresponds to their ability to suppress AP1-dependent transcription (Jonat et al., Cell 62: 1189-1204; Yang e) et al., (1990) Ce11 62: 1217-1226; Boumpas et al., (1991) Clin. Experim. Rheum. 9: 413-423; unpublished results). Glucocorticoids currently used clinically have side effects. One of the most serious side effects of long-term steroid use is steroid-induced osteopenia (Christiansen C. and Overgaard K. eds., Osteoporosis 1990 p.1529-1538; Luckert Bee. (Lucke rt BP) and Raizz LG (Raisz LG), (1990) Annals of Internal Medicine 112: 352-364). Glucocorticoids induce a combination of high levels of parathyroid hormone PTH and suppression of matrix synthesis in bone leading to rapid bone loss. The presence of severe negative side effects indicates that glucocorticoids used clinically indicate the need for new anti-inflammatory drugs with reduced toxicity. Many large pharmaceutical companies have accumulated a library of over 100,000 compounds with no market value until proven valuable for clinical applications. Traditional testing of potential anti-inflammatory drugs in animals is time consuming and expensive, is considered undesirable today and may give inaccurate results in some cases. According to one aspect of the invention, the first reporter gene is arranged to express an assayable first gene product, the expression of the first reporter gene is mediated by a transcription factor, and the second assayable gene product is expressed. Cell lines, wherein the expression of the second reporter gene comprises a second reporter gene mediated by a receptor, whereby the effect of a compound on the expression of the two genes can be measured. Preferably, the invention is arranged to express an assayable first gene product, wherein the expression of the first reporter gene is AP-1 mediated and the expression of a first reporter gene and an assayable second gene product. Cell lines comprising a second reporter gene arranged such that the expression of the second reporter gene is mediated by the glucocorticoid receptor. Thus, the present invention provides a convenient assay system based on one cell line that can be used to rapidly test a large number of compounds for anti-inflammatory activity. In addition, the cell line can test two activities on a single cell, whereas previously two cell lines would be required. Preferably, the cell line is derived from a human, more preferably, a HeLa cell. One of the reporter genes may be arranged to express alkaline phosphatase, such as human placenta alkaline phosphatase, and the other reporter gene may be arranged to express human growth hormone. These gene products are preferred because they can be easily assayed. According to another aspect of the invention, there is provided a cell according to the first aspect of the invention, stimulating the AP1 activity of said cell, and contacting said cell with a compound, wherein the first and second gene products are Methods are provided for testing compounds for glucocorticoid-like activity, including monitoring expression. Suppression of AP1-mediated expression of the first gene product and stimulated expression of the second gene product is indicative of the glucocorticoid-like behavior of the compound. AP1 activity can be stimulated by TPA or EGF. The production and use of cell lines for test compounds according to the invention is described in the accompanying FIG. 1A to 4 and will be described by way of example only. In the figure: FIG. 1A shows the nucleotide sequence of five AP1 responsive elements inserted in tandem upstream of the mouse mammary tumor virus long terminal repeat (MMTV LTR) promoter and the gene encoding the secreted form of human placental alkaline phosphatase (ALP). FIG. 1B is shown in FIG. 1 shows the ALP reporter vector 5APNT-ALP comprising the nucleotide sequence of 1A FIG. 2 shows a reporter vector MMTV-hGH2 regulated by a glucocorticoid receptor encoding human growth hormone polypeptide (hGH). FIG. 3 show the effect of dexamethasone on AP1-dependent ALP expression and GR-dependent hGH reporter gene transactivation, respectively, and the effect of epidermal growth factor (EGF) on hGH expression in cells according to the present invention; and FIG. 4 shows the effect of different corticosteroids on glucocorticoid receptor-dependent transactivation of hGH expression and suppression of AP-1-dependent ALP reporter gene transcription in GRAPF cells. Production of binding AP-1 / GR receptor cell line First, using conventional techniques, and the HeLa tk- cells stably transformed with a reporter vector 5AP NT-ALP. The vector fuses five AP1 response elements arranged in tandem to the 5 'end of the core promoter sequence of the mouse mammary tumor virus long terminal repeat (MMTV LTR), and secretes ALP protein into the culture medium to AP-1. Contains a gene encoding secreted human placental alkaline phosphatase (ALP) as an indicator of mediated transcription (as shown in FIGS. 1A and B). FIG. 1A is the nucleotide sequence of the five AP1 responsive elements inserted in tandem upstream of the TATA-box of the mouse mammary tumor virus long terminal repeat (MMTV) promoter in plasmid 5APNT-ALP (overlined) and secreted alkaline phosphatase The beginning of the gene encoding (ALP) is shown. ATG (start codon) of ALP is underlined. The resulting cells were called GRAP cells. The level of ALP reporter protein expressed and secreted into the medium can be measured directly by a chemiluminescence assay. Due to the simplicity of using chemiluminescence-based assays and the fact that ALP is secreted into the culture medium, ALP-based reporter assays are based on chloramphenicol acetyltransferase (CAT) and luciferase [Alam J. And Cook Jay. El. (Cook. JL), (1990) Analytical Biochemistry (Analyt. Biochem.) 188: 245-254]. In addition, the high sensitivity of the chemiluminescent ALP assay allows cells to be grown and tested for compounds in 96 well microtiter plates. Then, FIG. The GR-regulated reporter vector MMTV-hGH2 shown in Figure 2 is introduced into GRAP cells using conventional techniques used for stable transfection of mammalian cells to create a new cell line called GRAPF cells did. The reporter vector MMTV-hGH2 contains a GR-regulated promoter (MMTV) fused to a reporter gene encoding human growth hormone (hGH). The hGH reporter protein, like the ALP reporter protein, is also secreted into the cell culture medium. The level of glucocorticoid-induced hGH expression is measured immunologically by the Delphia assay (Wallac OY, Finland). Thus, GRAPF cells containing two exogenous transcription units, reporter genes, are transcriptionally induced by two different signal-activating transcription factors, AP1 and GR, respectively. The ALP transcription unit is controlled to increase ALP expression by the presence of elevated levels of the AP1 transcription factor induced by phorbol ester TPA or epidermal growth factor EGF, and the presence of elevated levels of the AP1 transcription factor. Respond to On the other hand, the hGH transcription unit causes an increase in hGH expression in response to ligand-activated GR. Under elevated levels of both AP1 and ligand-activated GR, the two transcription units result from the formation of an AP1: GR complex that mutually represses the interaction of GR and AP1 with their corresponding responsive elements. Inactive (see references above). However, hormone-activated GR blocks AP1-dependent transcription, whereas TPA or EGF-induced AP1 activity, measured directly by increased ALP expression, indicates that glucocorticoid-dependent hGH in GRAPF cells. Does not interfere with expression. Thus, according to GRAPF cells, in exactly the same experiment, the potency of compounds acting as agonist / antagonist profiles and glucocorticoids, which directly reflects their ability as anti-inflammatory drugs, and as inhibitors of AP1-dependent transcription Can evaluate the efficacy of the compound. The expression of ALP reporter protein in these cells is controlled by AP1 transcription factor induced by phorbol esters such as TPA or growth factor EGF. Exposing GRAP cells to TPA or EGF induces different ALP expression, which can be suppressed by 60% in the presence of 100 nM dexamethasone. 2 in GRAPF cells, when examined utility as anti-inflammatory drugs effect various compounds on AP1- dependent ALP expression and G R- dependent hGH reporter gene transactivation of dexamethasone (transactivation) GRAPF cells useful Something has been shown using synthetic glucocorticoid dexamethasone. Cells were cultured in MEM supplemented with 10% FCS, 1 mM pyruvate and 1% non-essential amino acids. Prior to compound exposure, GRAPF cells were seeded in 96-well microtiter plates containing Ham's F12 (without phenol red) supplemented with 10% FCS (dextran-coated charcoal strip). On day 2, the cells were washed and re-fed with 100 μl of Coons F12 (without phenol red) supplemented with 5% serum replacement with additives as described below. The relative levels of ALP expressed were determined by a chemiluminescence assay as described below: in white microtiters, Tizard et al. ((1990) Proceedings of the National Academy).・ Proc. Natl Acad Sci. 87: 4514-4518] and Alksnis et al. ((1991), Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 266: 10078-10085], mix with 200 μl of assay buffer (10 mM Jetanolamine, pH 10; 1 mM MgCl 2 and 0.5 mM AMPPD) and incubate at 37 ° C. for 20 minutes. And then transferred to a microplate luminometer (Luminoskan Labsystems, Finland). The setting of the luminoscan luminometer was an integral measurement in which the reading of each well was 1 second. Alkaline phosphatase activity is expressed as light units (LU). hGH expression was monitored immunologically in the Delphi assay described above. Cells were treated with 100 ng / ml EGF to induce the fos gene and the jun gene (and thus AP1 activity), and the induction was measured directly by increasing ALP expression (FIG. 3, open circles). With increasing concentrations of dexamethasone ("dex"), AP1-dependent ALP expression was suppressed during the hormone-dependent induction of GR-regulated hGH reporter expression, with or without EGF. You. The effect of different corticosteroids on glucocorticoid reporter-dependent transactivation of hGH expression and suppression of AP-1-dependent ALP reporter protein expression in GR APF cells is shown in FIG. It is shown in FIG. Although there is no inhibitory effect on the effect of glucocorticoid on glucocorticoid receptor-mediated transcription (hGH), a substantial inhibitory activity on AP1 function (ALP) is observed. The reporter cell lines and methods of the present invention can be used to test anti-inflammatory activity on a wide variety of compounds and can be used in compact and convenient assay systems.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12R 1:91) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91)

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ アッセイ可能な第一遺伝子産物を発現するよう配置され、該第一リポーター 遺伝子の発現が転写因子により介在される第一リポーター遺伝子、及びアッセイ 可能な第二遺伝子産物を発現するよう配置され、該第二リポーター遺伝子の発現 がレセプターにより介在される第二リポーター遺伝子を含み、それによりある化 合物の該２つの遺伝子発現に関する効果が測定可能である細胞株。 ２ アッセイ可能な第一遺伝子産物を発現するよう配置され、該第一リポーター 遺伝子の発現がＡＰ−１介在性である第一リポーター遺伝子、及びアッセイ可能 な第二遺伝子産物を発現するよう配置され、第二リポーター遺伝子の発現がグル ココルチコイドレセプターにより介在される第二リポーター遺伝子を含む請求項 １記載の細胞株。 ３ ヒト細胞由来の請求項１又は２記載の細胞株。 ４ ＨｅＬａ細胞に由来する請求項３記載の細胞株。 ５ リポーター遺伝子の一方がアルカリ性ホスファター ゼを発現するよう配置される前記請求項のいずれかに記載の細胞株。 ６ アルカリ性ホスファターゼがヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼである請求 項５記載の細胞株。 ７ 他方のリポーター遺伝子がヒト成長ホルモンを発現するよう配置される請求 項５又は６記載の細胞株。 ８ アッセイ可能な第一遺伝子産物を発現するよう配置され、該第一リポーター 遺伝子の発現が転写因子により介在される第一リポーター遺伝子、及びアッセイ 可能な第二遺伝子産物を発現するよう配置され、該第二リポーター遺伝子の発現 がレセプターにより介在される第二リポーター遺伝子を含む細胞を提供し； 該細胞における転写因子活性を刺激し及び該細胞を化合物と接触させ、第一及 び第二遺伝子産物の発現をモニターすること を含む転写因子−介在性遺伝子発現についての化合物の効果の試験方法。 ９ 請求項１〜８のいずれかに従う細胞を提供し、該細 胞におけるＡＰ−１活性を刺激し及び該細胞を化合物と接触させ、第一及び第二 遺伝子産物の発現をモニターすることを含む該化合物が抗炎症活性について試験 される請求項８記載の化合物の試験方法。 10 第一遺伝子産物のＡＰ１−介在性発現及び第二遺伝子産物の刺激された発現 の抑制は、化合物の抗炎症挙動の指標である請求項８記載の方法。 11 抗炎症挙動がグルココルチコイド様活性である請求項10記載の方法。 12 ＧＲＡＰＦ細胞株。[Claims] 1 the first reporter arranged to express an assayable first gene product, First reporter gene whose gene expression is mediated by transcription factors, and assays The second reporter gene is arranged to express a possible second gene product, Contains a second reporter gene mediated by the receptor, thereby A cell line wherein the effect of the combination on the expression of the two genes is measurable. 2. The first reporter, which is arranged to express an assayable first gene product, First reporter gene whose gene expression is AP-1 mediated, and assayable And the expression of the second reporter gene is Claims comprising a second reporter gene mediated by the cococorticoid receptor 2. The cell line according to 1. 3. The cell line according to claim 1, which is derived from a human cell. The cell line according to claim 3, which is derived from 4HeLa cells. 5. One of the reporter genes is alkaline phosphater A cell line according to any of the preceding claims, arranged to express zeolites. 6. The alkaline phosphatase is human placental alkaline phosphatase. Item 6. The cell line according to Item 5. 7. The claim wherein the other reporter gene is arranged to express human growth hormone. Item 7. The cell line according to item 5 or 6. 8. The first reporter, wherein the first reporter is arranged to express an assayable first gene product. First reporter gene whose gene expression is mediated by transcription factors, and assays The second reporter gene is arranged to express a possible second gene product, Providing a cell comprising a second reporter gene mediated by the receptor;   Stimulating transcription factor activity in the cell and contacting the cell with a compound for the first time; Monitoring the expression of the second gene product A method for testing the effect of a compound on transcription factor-mediated gene expression, comprising: 9. A cell according to any one of claims 1 to 8, wherein Stimulating AP-1 activity in cells and contacting the cells with a compound, Testing the compound for anti-inflammatory activity, including monitoring the expression of the gene product The method for testing a compound according to claim 8, which is performed. 10 AP1-mediated expression of first gene product and stimulated expression of second gene product 9. The method according to claim 8, wherein inhibiting is an indicator of the anti-inflammatory behavior of the compound. 11. The method of claim 10, wherein the anti-inflammatory behavior is a glucocorticoid-like activity. 12 GRAPF cell line.
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