【発明の詳細な説明】
化学発光ジアルキル基置換1,2−ジオキセタン化合物、その製造方法およびそ
の使用方法
技術分野
本発明は、酵素および他の化学物質を含む薬剤によってトリガーされて光を発
生することができる化学発光1,2−ジオキセタン化合物に関する。特に、本発明
は、アリール基の置換基であるトリガー可能なＸ−オキシ基(ＯＸ)を有する安定
なアリール基置換1,2−ジオキセタンに関し、この安定な1,2−ジオキセタンはＸ
の除去により不安定なジオキセタン化合物を形成し、これは分解して光と２つの
カルボニル化合物を生成する。
背景技術a.1,2 −ジオキセタンの調製
コペッキーとマンホールドはジオキセタン（相当するアルケンから順に調製さ
れたβ−ブロモハイドロパーオキサイドの塩基−触媒環化による3,3,4−トリ−
メチル−1,2ジオキセタン(K．R．Kopecky and C．Mumford，Can．J．Chem.，47
，709(1969))の最初の合成方法を報告した。しかし、この方法は種々のアルキル
及びアリール置換1,2−ジオキセタンの生成に用いられているが、ビニルエーテ
ル、ビニルサルファイド、及びエナミンから誘導されたジオキセタンの調製には
使用されていない。
1,2−ジオキセタンへの代わりの合成経路、特にビニルエーテル、ビニルサル
ファイド及びエナミンからの誘導体はハートレット及びシャープ(P．D．Bartlet
t and A．P．Schaap，J．Am．Chem．Soc.，92，3223(1970))そしてマツァー及び
フート(S．Mazur and C．S．Foote，J．Am．Chem．Soc.，92，3225(1970))によ
ってそれぞれ報告されている。光増感剤存在下での酸素分子の適当なアルケン化
合物への光化学的な付加は、高い収率で1,2−ジオキセタンを生成する。この方
法は多数のジオキセタン化合物を生成するのに使用されている。(K．R．Kopecky
in
Chemical and Biological Generation of Excited States，W．Adam and G．Cil
ento，(Eds.)，Academic Press，New York，P.85，1982)。
この方法の２つの限界が報告されている。芳香族置換基を有するある種のアル
ケンは光酸素化で、エンドパーオキサイドとして知られている六員環過酸化物を
生成することがわかっている(A．P．Schaap，P．A．Burns and K．A．Zaklika，
J．Am．Chem．Soc.，99，1270(1977))。反応性に富んだアリル水素を有するアル
ケンはしばしば"エン"反応と呼ばれる他の反応を行い、ジオキセタンの代わりに
アリルハイドロパーオキサイドを生成する(A．Baumstark in Advances In Oxyge
netated Process,JAI Presses,Greenwich,CT,1988;Vol.1,pp 31-84)。b. 立体障害アルケンからの熱安定ジオキセタン
ワインバーグ(J．H．Wieringa，J．Starting，H．Wyberg andW．Adam，Tetrah
edron Lett.，169(1972))によって発見されたヒンダードアルケンアダマンチリ
デンアダマンタンから誘導されたジオキサンは、分解に対して37kcal／molの活
性化エネルギーを持ち、25℃において数年の半減期（t1/2）を持つ(N．J．Turro
，G．Schuster，H．C．Steinmetzer，G．R．Faler and A.P.Schaap，J．Am．Che
m．Soc.，97，7110(1975))ことが示された。他には、スピロ−縮合された多環基
、例えば、アダマンチル基が、アミノ置換アルケン(F．McCapra，I．Beheshti，
A．Burford，R．A．Hann and K．A．Zaklika，J．Chem．Soc.，Chem．Comm.，94
4(1977))、ビニルエーテル(W．Adam，L．A．Encarnacion and K．Zinner，Chem
．Ber.，116，839(1983))及びビニルサルファイド(G．G．Geller，C．S．Foote
and D.B.Pechman，Tetrahedron Lett.，673(1983);W．Adam，L．A．Arias and D
．Schuetzow,Tetrahedron Lett.，2835(1982))から誘導されたジオキセタンの安
定性を増加を助け、この基がない場合には不安定になることが示されている。c. ジオキセタンの化学的トリガー
文献の最初の例は、2,3−ジアリール−1,4ジオキセンから誘導された水酸基置
換ジオキセタンに関して記述されている(A．P．Schaap and S．Gagnon，J．Amer
．
Chem．Soc.，104，3504(1982))。しかしながら、水酸基置換ジオキセタンとジア
リール−1,4−ジオキセンから誘導されたジオキセタンの任意の他の例も25℃で
数時間の半減期しか持たず、相対的に不安定である。さらに、これら安定化され
ていないジオキセタンは少量のアミン(T．Wilson，Int．Rev．Sci.: Chem.，Ser
．Two，9，265(1976))及び金属イオン(T．Wilson，M．E．Landies，A．L．Baums
tark，and P．D．Bartlett，J．Amer．Chem．Soc.，95，4765(1973); P．D．Bar
tlett，A．L．Baumstark，and M．E．Landies，J．Amer．Chem．Soc.，96，5557
(1974))によって破壊されてしまうが、両成分は生化学分析の緩衝液に用いられ
ている。アダマンチル安定化ジオキセタンの化学的トリガーの例は最初に米国特
許出願(A．P．Schaap，patent application serial No．887，139，filed July
，17，1986)及び論文(A．P．Schaap，T．S．Chen，R．S．Handley，R．DeSilva
，and B．P．Giri，Tetrahedron Lett.，1155(1987))に発表された。これらのジ
オキセタンは数年の熱的半減期を示し、必要に応じて有効な化学発光を生じさせ
るためにトリガーさせることができる。弱い化学発光を生ずるトリアルキルシリ
ル及びアセチル−保護フェニル基で置換された中程度に安定なベンゾフラニルジ
オキセタンもまた報告されている(W．Adam，R．Fell，M．H．Schulz，Tetrahedr
on，49(11)，2227-38(1993); W．Adam，M．H．Schulz，Chem．Ber.，125，2455-
61(1992))。他の剛直多環基の安定化効果もまた報告されている(P．D．Bartlett
and M．Ho，J．Am．Chem．Soc.，96，627(1975); P．Lechtken，Chem．Ber.，1
09，2862(1976))。国際出願（ＷＯ94／10258）には、様々な剛直多環置換基を有
するジオキセタンの化学的トリガーが開示されている。d. アダマンチルジオキセタンの酵素トリガー
酵素によって化学発光分解がトリガーされ得るジオキセタンは米国特許出願(A
．P．Schaap，patent application serial No．887，139)及び一連の論文(A．P
．Schaap，R．S．Handley，and B．P．Giri，Tetrahedron Lett.，935(1987); A
．P．Schaap，M．D．Sandison，and R．S．Handley，Tetrahedron Lett.，1159(
1987)and A．P．Schaap，Photochem．Photobiol.，47s，50S(1988))で開示され
ている。保護されたアリールオキサイド置換体を持つ非常に安定なアダマンチル
置換されたジオキセタンは緩衝液中の酵素の作用により、発光を伴う分解がトリ
ガーされ、ジオキセタンの分解速度を飛躍的に増加させる強電子供与アリールオ
キサイド陰イオンを生ずる。結果として、その化学発光は、保護された形のジオ
キセタンの穏やかな熱分解から生ずる化学発光の数オーダー高い強度で放射され
る。シャープの米国特許第 5，068，339号明細書は、蛍光を発する基を共有結合
で有し、酵素でトリガー可能なジオキセタンを開示している。これらジオキセタ
ンの分解は蛍光体への分子内エネルギー転移を通して増強及びレッドシフトされ
た化学発光を生ずる。エドワードの米国特許第 4，952，707号明細書には、アダ
マンチル基及び2,5−又は2,7−二置換されたナフチル基を有し酵素でトリガー可
能なジオキセタンを開示している。ブロンシュタインの米国特許第5，112，960
、第5，220，005号、5，326，882号明細書及び国際出願（8800695）は、塩素原
子、臭化カルボキシ基、水酸基、メトキシ基及びメチレン基を含む様々な基で置
換されたアダマンチル基を有するトリガー可能なジオキセタンを開示している。
刊行物(M．Ryan，J．C．Huang，O．H．Griffith，J．F．Keana，J．J．Volwerk
，Anal．Biochem.，214(2)，548-56(1993))は、ホスホリパーゼによってトリガ
ー可能なホスホジエステル置換されたジオキセタンを開示している。ウルデアに
よる米国特許第5，132，204号明細書は、化学発光分解をトリガーするために結
合した２つの保護基を連続的に除去するために異なった２つの酵素を必要とする
ジキセタンを開示している。ヘイスの米国特許5，248，618号明細書は、中間体
を生成する第１保護基を脱離することを酵素的もしくは化学的にトリガーするジ
オキセタンを開示している。この中間体は化学発光分解をトリガーするために、
速やかに分子内反応を行い第２保護基を脱離する。e. 界面活性剤存在下のジオキセタンの化学発光の増強
アンモニウム界面活性剤及び蛍光物質を含む水溶性物質の存在下における、安
定な1,2−ジオキセタンの酵素でトリガーされた分解による化学発光の増強も報
告されている(A．P．Schaap，H．Akhavan，and L．J．Romano，Clin．Chem.，35
(9)，1863(1989))。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）及び５−（
Ｎ−テトラデカノイル）アミノ−フルオレセインからなる蛍光ミセルは、中間の
ヒド
ロキシ置換されたジオキセタンを捕捉し、疎水性環境内の励起状態のアニオン系
エステルからミセルへのフルオレセイン化合物への効率的なエネルギー移転によ
って化学発光量子収量を400倍も増加させる。
シャープの米国特許第4，959，182号及び5，004，565号明細書は、化学的にまた
酵素でトリガーされて生ずる安定なジオキセタンの化学発光の、第４級アンモニ
ウム界面活性剤ＣＴＡＢ及び蛍光物質によって形成されるミセルの存在下での増
強の他の例を記載している。ＣＴＡＢと前述した蛍光界面活性剤もしくは１−ヘ
キサデシル−６−ヒドロキシベンゾチアザマイドとで形成された蛍光ミセルは、
ヒドロキシ及びアセトキシ置換されたジオキセタンの塩基でトリガーされた分解
により発光を増強する。ＣＴＡＢ自体がホスフェート置換されたジオキセタンの
発光を増強することもまた報告されている。
ヴォイタ（Ｖoyta）の米国特許第5145772号明細書は、酵素で生じる1,2−ジオキ
セタンの化学発光の、第四級アンモニウム基のペンダントのみまたはフルオレセ
イン（fluorescein）が付加されたポリマーの存在下での増強を開示している。
化学発光を高めるものとして報告されている他の物質には、ウシのアルブミン等
の球状タンパク質や第四級アンモニウム界面活性剤などがある。他のカチオン系
ポリマー化合物は、化学発光エンハンサー（enhancer）として限界的効果を示す
。非イオン系ポリマー化合物は、通常、効果がなく、アニオン系ポリマーのみが
発光を有意に減少させる。国際出願ＷＯ94／21821は、高分子のアンモニウム塩
界面活性剤と増強添加剤の組み合わせによる増強を開示している。1993年９月22
日に発行されたアクハブン−タフティ（ＡＫhaven−Ｔafti）の欧州特許出願第9
2113448.2号明細書は、蛍光エネルギー受容体が共有結合で結合されたポリビニ
ルホスホニウム塩、及びポリビニルホスホニウム塩の存在下、1,2−ジオキサン
から酵素的に生じた化学発光の増強を開示している。1993年６月24日に出願され
たアクハブン−タフティの係属中の米国特許出願Ｎo.08／082091は、二陽イオン
ホスホニウム塩の存在下、1,2−ジオキセタンから酵素的に生じた化学発光の増
強を開示している。
当業者に知られているトリガー可能な安定化されたジオキセタンは、剛直なス
ピロ−縮合された多環式置換基又は置換されたスピロアダマンチル置換基を取り
込んでいる。ジオキセタンを調製する出発物質のケトンは比較的高価で入手が困
難か、あるいは高価な前駆体から調製しなければならない。剛直なスピロ−縮合
された多環の有機基の代わりに２つのアルキル基を有する安定なトリガー可能な
ジオキセタンの例は知られていない。このようなトリガー可能な安定化ジオキセ
タンは、安価で容易に入手可能な出発物質から調製でき、それゆえ、商業化を容
易にするコスト有利性を提供するだろう。
発明の開示
本発明の目的は、長期にわたり室温で安定な、ジアルキル及びアリールＯＸ−
置換されたトリガー可能な新規1,2−ジオキセタン化合物を提供することにある
。また、本発明の目的は化学発光を伴う分解をトリガーできる、かかる安定な1,
2−ジオキセタン化合物を提供することにある。さらに、本発明の目的は、安価
で容易に入手が可能な出発物質から調製できるかかる安定1,2−ジオキセタン化
合物を提供することにある。更にまた本発明の目的は、酵素及び他の化学物質を
含む試薬により、化学発光をトリガーできる安定なジオキセタンを含む方法及び
組成物を提供することにある。更にまた本発明の目的は、エンハンサー物質の使
用を通して化学発光を更に増大させるための方法及び組成物を提供することにあ
る。更にまた本発明は、酵素の検出、およびイムノアッセイにおける使用、並び
に当業者に一般に既知であるような、酵素に結合された核酸、抗体および抗原の
検出のための方法および組成物に関する。更にまた本発明の目的は、化学発光の
応用に対する方法及び組成物を提供することにある。
図面の簡単な説明
第１図は、メタノールとジメチルスルフオキサイドとの混合物中の水酸化カリ
ウム溶液の添加によってトリガーした際の、ジメチルスルフオキサイド（ＤＭＳ
Ｏ）中のジオキセタン２ｃ溶液から生じた化学発光のスペクトルである。スペク
トルは、スキャンしている間に生じた化学発光強度についての減衰に対して補正
してある。
第２図は、ＤＭＳＯ中１Ｍのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム フルオライド
５０μＬで、ジオキセタン２ｇの１０-6Ｍ溶液の１０μＬアリコートをトリガー
することによって発生した化学発光強度の、時間の関数としてのグラフである。
第３図は、ＡＰ１．１２×１０-17モルの添加によって３７℃でトリガーした
本発明のジオキセタン２ｆ又は２ｋ(LUMIGEN PPD,Lumigen,Inc.,Southfield,MI)
を含有する溶液１００μＬによって生じた化学発光の強度の経時特性の比較を示
すグラフである。試薬は、１）０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパ
ノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭ溶解する溶
液と、２）０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９．６
の緩衝液中に、ジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭ溶解する溶液とで構成されてい
る。本発明のジオキセタン２ｆを使用することが、ジオキセタン２ｋに比してよ
り高い最高強度を得る上で有利である。
第４図は、ＡＰ１．１２×１０-17モルの添加によって３７℃でトリガーした
ジオキセタン２ｆ又は２ｋを含有する溶液１００μＬによって生じた化学発光の
強度の経時特性の比較を示すグラフである。試薬は、１）１−（トリ−ｎ−オク
チルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベン
ゼンジクロリド（エンハンサーＡ）１．０ｍｇ／ｍＬを含有する、０．２Ｍの２
−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセ
タン２ｆを０．３３ｍＭ溶解する溶液と、２）同じエンハンサー１．０ｍｇ／ｍ
Ｌを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９
６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭ溶解する溶液とで構成されて
いる。本発明のジオキセタン２ｆを使用することが、ジオキセタン２ｋに比して
より全ての時点でより高い光強度を得る上で有利である。
第５図は、ＡＰ１．１２×１０-17モルの添加によって３７℃でトリガーした
ジオキセタン２ｆ又は２ｋを含有する別の一組の溶液１００μＬによって生じた
化学発光の強度の経時特性の比較を示すグラフである。試薬は、１）ポリビニル
ベンジルトリブチルホスホニウム クロリド（エンハンサーＢ）０．５ｍｇ／ｍ
Ｌを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９
．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭ溶解する溶液と、２）同じ
エ
ンハンサー０．５ｍｇ／ｍＬを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−
１−プロパノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭ
溶解する溶液とで構成されている。エンハンサーＢの調製は、１９９３年９月２
２日発行の欧州特許第５６１，０３３号公報に記載されている。本発明のジオキ
セタン２ｆを使用することが、ジオキセタン２ｋに比して全ての時点でより高い
光強度を得る上で有利である。
第６図は、ＡＰ１．１２×１０-17モルの添加によって３７℃でトリガーした
ジオキセタン２ｆ又は２ｋを含有する別の一組の溶液１００μＬによって生じた
化学発光の強度の経時特性の比較を示すグラフである。試薬は、１）ポリビニル
ベンジルトリブチルホスホニウム クロリドとポリビニルベンジルトリオクチル
ホスホニウム クロリドとのコポリマー（トリブチル基：トリオクチル基は３：
１の比で含有）（エンハンサーＣ）０．５ｍｇ／ｍＬを含有する、０．２Ｍの２
−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９．６の緩衝液中に、ジオキセ
タン２ｆを０．３３ｍＭ溶解する溶液と、２）同じエンハンサー０．５ｍｇ／ｍ
Ｌを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨ９
．６の緩衝液中に、ジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭ溶解する溶液とで構成され
ている。エンハンサーＣの調製は欧州特許第５６１，０３３号公報に記載されて
いる。本発明のジオキセタン２ｆを使用することが、ジオキセタン２ｋに比して
全ての時点でより高い光強度を得る上で有利である。
第７図は、ＡＰの量に対する、３７℃でトリガーしたジオキセタン２ｆを含有
する試薬１００μＬによって発せられた最大の化学発光強度の関係を示すグラフ
である。化学発光は、１．０ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＡを含有する０．２Ｍの
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールの緩衝液（ｐＨ９．６）中にジオキ
セタン２ｆを０．３３ｍＭ溶解する溶液１００μＬに対して、３．３６×１０-1 6
モル〜３．３６×１０-22モルの酵素を含有するＡＰ溶液３μＬを添加すること
によって３７℃で引き起こされた。用語のＳ−Ｂとは、ＡＰの存在下での相対光
度単位（ＲＬＵ）における化学発光シグナル（Ｓ）を、ＡＰ不存在下でのバック
グランドの化学発光（Ｂ）に対して補正したものである。グラフは、アルカリホ
スファターゼの直線的な検出について示している。計算した検出限界（バックグ
ラ
ンドの標準偏差の２倍）は、この条件ではアルカリホスファターゼ１．４×１０-22
モル、即ち１００分子以下であった。
第８図は、化学発光を用いて膜上でアルカリホスファターゼを検出した実験か
ら得た、Ｘ線フィルムのデジタルスキャン画像である。１．１×１０-15から１
．１×１０-18モルまでを含有する、アルカリホスファターゼの水溶液を同一の
ナイロン膜(Micron Separations Inc.,Westboro,MA)に適用した。膜を５分間風
乾し、０．８８ｍＭのＭｇＣｌと０．３３ｍＭのジオキセタン２ｆか又は０．３
３ｍＭのジオキセタン２ｋかのいずれかとを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−
２−メチル−１−プロパノールのｐＨ９．６の緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬのエンハ
ンサーＡを含有する試薬に、短時間浸漬した。膜を透明なプラスチックのシート
の間に置き、Ｘ線フィルム(Kodak X-OMAT AR,Rochester,NY)に暴露した。両試薬
の比較において、本発明のジオキセタン２ｆを用いた発光は、同等の画像と検出
感度であった。これらの結果は、ジオキセタン２ｆがウエスタンブロッテイング
、サザンブロッテイング、ＤＮＡフィンガープリンテイングや他のブロッテイン
グへの応用に期待されるべき性能を有することを示している。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、酵素及び他の化学物質を含む試薬によってトリガーされて化学発光
を生ずることができる安定な1,2−ジオキサンを有する組成物に関する。本発明
を実施するのに有用な安定なジオキセタンは化学式、
（式中Ｒ3とＲ4はスピロ−縮合されていない有機基で、Ｒ1はＲ2と結合できる有
機基であり、Ｒ2はＸ−オキシ基で置換されたアリール基を示し、Ｘ−オキシ基
は、酵素及び他の化学物質を含む試薬によってトリガーされ化学的に不安定な基
Ｘが除去されると、不安定な酸化物中間体ジオキセタン化合物を形成する。）で
表わすことができる。不安定な酸化物中間体ジオキセタンは分解して電気的エネ
ルギーを放出し、光及び化学式、
で表される２つのカルボニル基を含有する化合物を生成する。本発明を実施する
のに望ましい方法は化学式、
(式中、Ｒ1は１〜12の炭素原子を有するアルキル基、シクロアルキル基及びアリ
ール基から選択され、更にヘテロ原子を有してもよい基であり、Ｒ3及びＲ4は３
〜８の炭素原子を有する分枝状鎖のアルキル基及びシクロアルキル基から選択さ
れる基で、更にヘテロ原子を有していてもよく、熱安定性を付与する基であり、
Ｒ2は置換または無置換のアリール基、ビアリール基、ヘテロアリール基、縮合
環の多環アリール基およびヘテロアリール基から選択される基であり、ＯＸは、
酵素及び他の化学物質を含む試薬によって化学的に不安定な基Ｘの除去がトリガ
ーされると、不安定な酸化物中間体ジオキセタン化合物を生成するＸ−オキシ基
である)で表される安定ジオキセタンを用いる。
安定な1,2−ジオキセタン化合物は化学試薬によってトリガー可能であるが、
室温（20〜30℃）で比較的長い半減期を持つ。安定でトリガー可能な1,2−ジオ
キセタンの従来の例は全て、熱安定性を与えるためにアダマンチル基や置換され
たアダマンチル基のような剛直なスピロ−縮合された多環アルキル基を使用して
いた。今回、上記構造におけるＲ3及びＲ4に対応する、より広い範囲の置換基を
持つ1,2−ジオキセタンが、室温で実質的な熱安定性をも示すことが見出された
。わずか３つの炭素原子を含むアルキル基で置換された（上記構造における置換
基Ｒ3及びＲ4として）ジオキセタン化合物でさえ、室温で約１年の半減期をもち
、４℃で数年の半減期を持つ。ジオキセタン環の炭素原子に結合した炭素原子が
０又は１つの水素原子で置換されているＲ3及びＲ4(例えば、イソプロピル、sec
−ブチル、ｔ−ブチル、シクロアルキル)はジオキセタン化合物に十分な熱安定
性を与え実際の用途に対して有用なものにする。Ｒ3及びＲ4はＣＨ2基を介して
ジオキセタン環
に結合しているが、嵩高い基、例えば、ネオ−ペンチル基も本発明の範囲内にあ
ると考えられる。さらに、これらジオキセタンはＸ基の除去によりトリガーされ
、光の発生を伴って分解する。トリガーによる速度増加の度合いはＸ基の不安定
性、トリガー試薬の量、溶剤の選択、ｐＨ及び温度のような要因に依存する。適
当な条件を選択することにより、106の倍（factor）又はより大きい速度増加が
達成される。
本発明は、化学式、
（式中、Ｒ3及びＲ4は、スピロ−縮合されていない有機基であり、Ｒ1は有機基
で、Ｒ2と結合できる有機基であり、Ｒ2は適当なアルケンに酸素を付加すること
によりＸ−オキシ基で置換されたアリール基を示す）で表される安定な1,2−ジ
オキセタンの調製に対して容易に入手でき、あるいは安価な出発物質を使用する
方法に関する。本発明の予期できなかった発見は、ここで報告されているアルケ
ンが容易に酸素分子（１重項酸素1Ｏ2として）の光化学的付加を起こし、相当す
る1,2−ジオキセタンを生成することである。アリル水素原子を有するアルケン
が異なった反応経路により１重項酸素の付加を優先的に行いアリルハイドロパー
オキサイドを生成し、ジオキセタンの形成はほとんどの場合マイナー過程である
ことが文献でよく知られている。
所要のアルケン化合物は、ハロゲン化遷移金属塩、好ましくは塩化チタニウム
化合物及び第三アミン塩基とともにリチウムアルミニウム水素化物、他の金属水
素化物、極性非プロトン性有機溶媒、好ましくはテトラヒドロフラン中の亜鉛金
属又は亜鉛−銅カップル存在下、Ｘ−オキシ基で置換されたアリルカルボキシレ
ートエステルと化学式、
で表されるジアリルケトンとのカップリングを通じて合成される。反応は一般に
還流しているテトラヒドロフラン中で行われ、普通２から24時間で終了する。こ
の方法の有意な点は、ケトン出発物質を大量に入手可能なために、反応を大規模
に行うことができることである。商業的に使用されているトリガー可能なジオキ
セタンはアダマンタノンもしくは置換されたアダマンタノン化合物から調製され
る。アダマンタノンは比較的高価である。置換されたアダマンタノンですら高価
で入手が困難である。危険な酸化物を大量に伴う実験室的操作を含むアダマンタ
ノンの調製と比較して、アルキル及びシクロアルキルケトンは、容易に一般的な
方法でしかも大量に調製できる。他の利点は、ある種のケトン出発物質のコスト
削減である。例えばジイソプロピルケトンはモル当たりアダマンタノンより15か
ら20倍安価である。
トリガー試薬は、１当量（Ｆ-）を必要とする化学物質、または少量しか使用
されない酵素のような触媒であり得る。電子供与体、有機及び無機塩基、求核性
試薬及び還元試薬はＸを除去するのに使用することができる。トリガー試薬は、
ホスファターゼ酵素、エステラーゼ酵素、コリンエステラーゼ酵素、加水分解酵
素、例えばα−及びβ−ガラクトシターゼ、α−及びβ−グルコシターゼ、グル
クロニターゼ、トリプシン及びキモトリプシンから選択される酵素であるが、こ
れらに制限されない。
ＯＸ基には、水酸基、ＯＯＣＲ6基(ここでＲ6はヘテロ原子を含んでいてもよ
い２〜20の炭素原子を含むアルキル基又はアリール基)、トリアルキルシリルオ
キシ基、トリアリールシリルオキシ基、アリールジアルキルシリルオキシ基、Ｏ
ＰＯ3 -2塩、ＯＳＯ3 -塩、β−Ｄ−ガラクトシドオキシ基及びβ−Ｄ−グルクロ
ニディル
オキシ基が含まれるが、これらに制限されない。
本発明は、化学試薬及び化学式、
(式中、Ｒ3及びＲ4は３〜８の炭素原子を含む低級アルキル基及びシクロアルキ
ル基から選択され、熱安定性を付与する有機基であり、Ｒ1はＲ2と結合できる有
機基であり、Ｒ2は、酵素及び他の化学物質を含む試薬により化学的に不安定な
基Ｘの除去がトリガーされる際、不安定な酸化物中間体ジオキセタン化合物を形
成するＸ−オキシ基で置換されたアリール基を示す)で表される安定な1,2−ジオ
キセタンの提供を含む発光方法に関する。ここで、不安定な酸化物中間体ジオキ
セタンは分解し、電気的エネルギーを放出し、光及び化学式、
で表される化合物を含む２つのカルボニルを形成する。
本発明はまた、酵素を含む化学試薬から選択されるトリガー試薬の検出方法に関
する。この場合、ジオキセタンが試薬として使用される。
さらに、本発明はイムノアッセイにおける酵素の検出、例えば、酵素免疫検定
法、及び酵素が結合したＤＮＡ又はＲＮＡプローブの検出の方法及び組成物に関
する。発光の検出は、ルミノメーター、Ｘ線フィルム又はカメラと光学フィルム
を用いて容易に行える。
実施例
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、ＧＥ ＱＥ300もしくはバリアンジェミニ
300を用い、内部標準物質としてテトラメチルシランを用いたＣＤＣl3溶液、も
しくはＣＤ3ＯＤもしくはＤ2Ｏ溶液で得られた。マススペクトルはＡＥＩ ＭＳ
−90TMスペクトロメーターを用いて得られた。
実施例１
１−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−フェニル）−2,2−ジイソプロピ
ル−１−メトキシエテン（19）の合成
三口フラスコがアルゴンで置換され100mlの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）
が投入された。実施例
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを、内部標準としてテトラメチルシランを
用い、CDCl3中の溶液として、又はCD3OD若しくはD2O中の溶液として、ＧＥＱＥ
３００か、或はＶａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ３００ スペクトロメーターで得
た。マススペクトルはＡＥＩ ＭＳ−９０TMスペクトルメーターで得た。
実施例１．１−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−２，２− ジイソプロピル−１−メトキシエテン（１ａ）の合成
．
三頸フラスコをアルゴンでパージし、無水のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）
１００ｍＬを仕込んだ。フラスコを氷浴で冷却し、３塩化チタン（１８ｇ）を攪
拌しながら加えた。水素化リチウムアルミニウム（２．２ｇ）を少量ずつ加えた
ところ、短時間の発熱反応を生じた。水素化リチウムアルミニウムを全部添加し
た後冷却浴を取り外し、トリエチルアミン（１６ｇ）を添加した。黒色の混合物
を、アルゴン気流下で１時間還流した。２，４−ジメチル−３−プロパノン（３
．８６ｇ）と、メチル３−ｔ−ブチル−ジメチルシリルオキシベンゾエート（３
．００ｇ）との、乾燥ＴＨＦ１０ｍＬ中溶液を２時間に亘って滴下した。４
％の酢酸エチル／ヘキサンで溶離しながら、シリカプレート上ＴＬＣで反応の進
行をモニターした。粗製の反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンで希釈し、デカ
ントした。残渣を、総量約７００ｍＬのヘキサンを用いて数回洗浄した。ヘキサ
ン溶液の合量を濾過し、蒸発して、残ったオイルをシリカゲル上ヘキサンで溶離
しながら、カラムクロマトグラフィで情製し、２．１２ｇ（収率５４％）の１ａ
を得た。1H NMR(CDCl3)δ 7.3-6.7(m,4H),3.18(s,3H),2.45(sept,1H,J=7.2 Hz),
2.31(sept,1H,J=7.2 Hz),1.24(d,6H,J=7.2 Hz),0.99(s,3H),0.91(d,6H,J=7.2 Hz
),0.19(s,3H);13C NMR(CDCl3)δ128.76，122.84，121.46，119.28，56.06，30.3
2,26.54，25.56，21.91，20.86，-4.58;Mass spectrum(m z):348，333，306;exa
ct mass,calc'd.348.2484，found348.2479．実施例２．２，２−ジイソプロピル−１−（３−ヒドロキシフェニル）−１−メ トキシエテン（１ｂ）の合成
．
乾燥THF３０ｍｌ中アルケン１ａ、０．９７ｇ（２．７８ｍｍｏｌ）の溶液
に、テトラ−ｎ−ブチル−アンモニウム フルオライド０．８１ｇ（１，１ｅｑ
．）を加えた。１時間攪拌した後、ＴＬＣ（シリカで、２０％酢酸エチル／ヘキ
サン使用）は、出発物質が新しい化合物に完全に転化したことを示した。ＴＨＦ
を蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解した。酢酸エチル溶液を４回水で抽出し、乾
燥した。シリカゲル（２ｇ）を加え、溶剤を蒸発した。物質を、シリカゲル上１
０〜２０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するカラムクロマトグラフィで精製し、
１ｂ、０．５６８ｇ（収率８７％）を得た。1H NMR(CDCl3)δ 7.5-6.5(m,4H),4.
91(s,1H),3.20(s,3H),2.47(sept,1H),2.33(sept,1H),1.25(d,6H),0.92(d,6H);13
C NMR(CDCl3)δ 129.25，124.98，124.98，122.60，116.54，114.98，114.56，5
6.38，30.52，26.80，22.11，21.08;Mass spectrum(m z):234，219，191;exact
mass,calc'd.234.1620,found 234.1620．実施例３．１−（３−アセトキシフェニル）−２，２−ジイソプロピル−１−メ トキシエテン（１ｃ）の合成
．
アルケン１ｂ（２００ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン０．３１
ｍＬと、乾燥メチレンクロライド２０ｍＬに溶解した。フラスコをアルゴンでパ
ージし、氷浴で冷却した。乾燥メチレンクロライド５ｍＬ中のアセチルクロライ
ド（０．１１５ｇ，１．４７ｍｍｏｌ）を１時間に渡って滴下した。ＴＬＣ分析
（シリカで、２０％酢酸エチル／ヘキサン使用）は、０℃で攪拌２．５時間後に
反応が完結したことを示した。溶剤を蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解した。溶
液を４回水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発した。残渣をシリカゲル上１０
〜２０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するカラムクロマトグラフィで精製し、１
ｃ、２２０ｍｇ（収率９３％）を得た。1H NMR(CDCl3)δ 7.37-6.99(m,4H),3.19
(s,3H),2.47(sept,1H,J=6.9 Hz),2.33(sept,1H,J=6.9 Hz),2.29(s,3H),1.24(d,6
H,J=6.9 Hz),0.93(d,6H,J=6.9 Hz);13C NMR(CDCl3)δ 169.46，150.62，149.03
，139.02，133.64，128.95，127.24，122.89，120.72，56.50，30.49，26.98，2
2 06，21.25，21.05．
実施例４．１−（３−ベンゾイルオキシフェニル）−２，２−ジイソプロピル −１−メトキシエテン（１ｄ）の合成
．
アルケン１ｂ（４．５ｇ，１．９ｍｍｏｌ）を、無水トリエチルアミン５．
３ｍＬと、乾燥したＣＨ2Ｃｌ2５０ｍＬに溶解した。フラスコをアルゴンでパー
ジし、氷浴で冷却した。ベンゾイルクロリド（４．０５ｇ，２．９ｍｍｏｌ）を
滴下した。冷却浴を取り外し、室温で１時間攪拌を続けた。混合物を濾過し、溶
液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発した。残渣をヘキサンに懸濁し、固
形分を濾別して溶液を蒸発した。残渣をシリカゲル上でヘキサン中１％の酢酸エ
チルで溶離しながらカラムクロマトグラフィで精製し、ジオキセタン１ｄ、３．
７ｇを得た：1H NMR(CDCl3)δ 8.25-7.05(m,9H),3.25(s,1H),2.54(sept,1H,J=6.
9 Hz),2.40(sept,1H,J=6.9 Hz),2.29(s,3H),1.26(d,6H,J=6.9 Hz),0.95(d,6H,J=
6.9 Hz)．
実施例５．１−（３−ピバロイルオキシフェニル）−２，２−ジイソプロピル −１−メトキシエテン（１ｅ）の合成
．
アルケン１ｂ（２ｇ，８．６ｍｍｏｌ）を、無水トリエチルアミン２．４ｍ
Ｌと、乾燥したＣＨ2Ｃｌ2５０ｍＬに溶解した。フラスコをアルゴンでパージし
、氷浴で冷却した。ピバロイルクロリド（１．６ｇ，２ｅｑ．）を１時間に渡っ
て滴下した。冷却浴を取り外し、室温で３時間攪拌を続けた。溶液をＫ2ＣＯ3の
水溶液で、次いで水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し蒸発した。残渣をシリカゲル
上で、ヘキサン中５％トリエチルアミンで溶離しながら、カラムクロマトグラフ
ィで精製し、ジオキセタン１ｅ、１．９５ｇを得た。1H NMR(CDCl3)δ 7.34-6.9
8(m,4H),3.198(s,3H),2.47(sept,1H),2.33(sept,1H),1.36(s,9H),1.24(d,6H,J=6
.9Hz),0.92(d,6H,J=6.9 Hz)．
実施例６．２，２−ジイソプロピル−１−メトキシ−１−（３−ホスホリルオ キシフェニル）エテン ジナトリウム塩（１ｆ）の合成
．
（ａ）乾燥したＣＨ2Ｃl2 ９ｍＬと、無水ピリジン０．７ｍＬ（８．７ｍｍ
ｏｌ）との溶液をアルゴンでパージし、氷浴で冷却した。ホスホラスオキシクロ
ライド（０．４０ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を加え、５分後に、ピリジン０．４ｍＬ
中アルケン１ｂ（２０９ｍｇ，０．８７ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で１時
間攪拌した。ＴＬＣ分析（シリカで、３０％酢酸エチル／ヘキサン使用）は、反
応が完結したことを示した。溶剤を蒸発し、残渣を次工程に利用した。
（ｂ）工程（ａ）からの生成物をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、ピリジン０．７ｍＬ
を加えた。溶液を氷浴で冷却し、２−シアノエタノール６１８ｍｇ（８．７ｍｍ
ｏｌ）で処理した。氷浴を取り外し、２時間室温で攪拌を続けた。次に混合物を
濃縮し、残渣をシリカゲル上でヘキサン中５０％の酢酸エチルから１００％の酢
酸エチルまで、なだらかに変えながら溶離して、カラムクロマトグラフィで精製
しビス（シアノエチルホスフェート）を得た：1H NMR(CDCl3)δ0.934(d,6H,J=9
Hz),1.235(d,6H,J=9 Hz),2.38-2.45(m,2H),2.76-2.82(m,4H),3.18(s,1H),4.31-4
.47(m,4H),7.11-7.38(m,4H)．
（ｃ）ビス（シアノエチルホスフェート）アルケン（４２０ｍｇ）をアセト
ン４ｍＬに溶解した。水酸化ナトリウム（６５ｍｇ）を水１ｍＬに溶解し、アセ
トン溶液に加え、次いで夜通し攪拌した。沈殿を集め、乾燥して白色粉末とした
。1H NMR(D2O)δ 0.907(s,3H),0.929(s,3H)1.20(s,3H),1.22(s,3H),2.35 2.46(m
,2H),3.23(s,1H),6.96-7.37(m,4H);13C NMR(D2O)δ 155.15(d),149,56，137.84,
136.08，129.71，124.55，122.33(d)，120.48，57.16，31.27，27.21，22.49，2
1.10;31P NMR(D2O)(rel.To ext.H3PO4)δ 0.345
実施例７．１−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−２，２− ジシクロプロピル−１−メトキシエテン（１ｇ）の合成
．
三頸フラスコをアルゴンでパージし、無水ＴＨＦ５０ｍＬを仕込んだ。フラ
スコを氷浴で冷却し、３塩化チタン（１１．６ｇ）を攪拌しながら加えた。水素
化リチウムアルミニウム（１．４ｇ）を少量ずつ加えて、短時間の発熱反応を生
じさせた。水素化リチウムアルミニウムを添加する間、攪拌を助ける為、無水Ｔ
ＨＦ２０ｍＬ分を追加した。添加し終わった後冷却浴を取り外し、黒色の混合物
を還流するようにした。トリエチルアミン（１０．５ｍＬ）を加え、黒色の混合
物をアルゴン雰囲気下１時間還流した。ジシクロプロピルケトン（２．６１ｇ）
と、メチル ３−ｔ−ブチル−ジメチルシリルオキシベンゾエート（２．００ｇ
）との、乾燥ＴＨＦ２０ｍＬ中溶液を７５分間に渡って滴下した。反応は、５％
の酢酸エチル／ヘキサンで溶離しながら、シリカプレート上ＴＬＣでモニターし
て、更に１時間の還流後に、完結したと判断された。粗製の反応混合物を室温に
冷却し、ヘキサン４００ｍＬずつで４回抽出した。ヘキサン溶液の合量を濾過し
蒸発して、残った黄色オイル１．４２ｇを、生成物アルケン１ａを溶離するため
、先ずヘキサンで、次いで２０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離しながら、シリカ
ゲル上カラムクロマトグラフィで精製した。シリカ上で５％酢酸エチル／ヘキサ
ンで溶離しながら用意したＴＬＣで更に精製した。1HMR(CDCl3)δ 7.3-6.7(m,4H
),3.36(s,3H),1.80(m,1H),1.13(m,1H),0.988(s,9H),0.78-0.67(m,4H),0.43-0.37
(m,2H),0.19(s,6H),0.11-0.05(m,2H)．実施例８．１−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−２，２−ジ シクロヘキシル−１−メトキシエテン（１ｈ）の合成
．
乾燥したＴＨＦ中メチル３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシベンゾエート
４．３ｇと、ジシクロヘキシルケトン９．５ｇとの混合物を、乾燥したＴＨＦ１
５０ｍＬ中ＴｉＣｌ3 ２５ｇ、ＬｉＡｌＨ4 ３．０ｇ及びトリエチルアミン１６
．４ｇで作ったチタン試薬を用い、実施例５の操作に従って結合させ
た。ヘキサン抽出後得た粗製生成混合物（１０ｇ）を、先ずヘキサンで次いで１
％の酢酸エチル／ヘキサンで溶離しながらシリカゲル上でカラムクロマトグラフ
ィで精製した。アルケン１ｅの収量は３．５ｇ（収率５１％）であった。1H NMR
(CDCl3)δ 7.22-7.16(m,1H),6.85-6.72(m,3H),3.155(s,3H),2.05-0.86(m,22H),0
.995(s,9H),0.21(s,6H)．実施例９．２，２−ジシクロヘキシル−１−（３−ヒドロキシフェニル）−１− メトキシエテン（１ｉ）の合成
．
アルケン１ｆ０．７ｇの乾燥ＴＨＦ溶液に、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウ
ム フルオライド０．６２ｇ（１．２ｅｑ．）を滴下した。１時間攪拌の後、Ｔ
ＬＣ（シリカで２０％酢酸エチル／ヘキサン使用）により出発物質が完全に新化
合物に転化したことが示された。ＴＨＦを蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解した
。酢酸エチル溶液を水で抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。該物質をヘキサン中０
〜１０％の酢酸エチルで溶離しながらシリカゲル上でカラムクロマトグラフィで
精製し、１ｆ、０．４６ｇ（収率９２％）を得た。アルケンをベンゼン／ヘキサ
ン（１：６）中で４℃にて結晶化により、更に精製した。1H NMR(CDCl3)δ 7.20
-6.72(m,4H),4.72(s,1H),3.174(s,3H),2.06-1.04(m,22H);13C NMR(CDCl3)δ 155
.19，138,20，131.97，129.05，122.50，116.36，114.39，56.48，41.51，39.34
，31.40，30.92，27.50，26.37，26.25，25.99;Mass spectrum(m z):314,231,12
1;exact mass,calc'd.314.2246,found314.2246．
実施例１０．１，２−ジオキセタンの合成．
光酸素添加工程。方法Ａ。標準的には、アルケンのサンプル１００ｍｇを、
光酸素添加チューブ中でメタノールとメチレンクロリドとの１：１混合物２０ｍ
Ｌに、溶解した。ポリスチレンに結合したローズベンガル(Rose Bengal)約２０
０ｍｇを加え、酸素バブラーに接続した。ドライアイス／２−プロパノール又は
氷水を含有する、半銀メッキしたデュアーびんに浸漬しながら、該装置を通して
ゆっくりと酸素を通気した。連続的に酸素をバブルしながら、紫外線防止フィル
ターとして５ミル(mil)のカプトン(Kapton)(DuPont,Wilmington,DE)のフィルム
を通して、サンプルに４００Ｗのナトリウムランプ(GE Lucalox)を照射した。反
応の進行をＴＬＣ又は1H NMRでモニターした。ポリマーと結合した増感剤を濾
別し、溶剤を室温で蒸発することにより、ジオキセタン化合物を単離した。更な
る精製は、シリカゲル上カラムクロマトグラフィか又は必要ならば適当な溶剤か
らの結晶化によって行うことができた。
方法Ｂ。上記と異なり、多くの場合、光増感剤として、メチレンブルーを使
用した。約１００ｍｇを反応溶剤１０ｍＬ中に溶解し、上記の如く照射を行った
。この方法で調製したジオキセタンを、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィ
によって精製した。
実施例11.４−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−3,3−ジイ ソプロピル−４−メトキシ−1,2−ジオキセタン（2a）の合成
．
アルケンのサンプル102.8ｍｇを、−78℃で方法Ｂにより合計９時間光酸素
添加した。溶剤を蒸発し、プレートを溶離するのに４％酢酸エチル／ヘキサンを
用いて、分散ＴＬＣにより混合物を精製した。ジオキセタン2aの収量は55.9ｍｇ
（収率50％）であった。1H NMR(CDCl3)δ 7.6-6.7(m,4H),3.14(s,3H),2.61(sept
,1H),2.46(sept,1H),1.30(d,1H),1.18(d,1H),1.00(s,3H),0.92(d,1H),0.46(d,1H
),0.20(s,3H);13C NMR(CDCl3)δ 155.88，137.07，129.41，114.526，98.57，49
.46，33.51，29.24，25.79，19.43，18.51，17.29，16.69，-4.32．
実施例１２．３，３−ジイソプロピル−４−（３−ヒドロキシフェニル）−４ −メトキシ−1,2−ジオキセタン（2b）の合成
．
アルケン1b（83.2ｍｇ）を、−78℃で方法Ｂにより合計３時間光酸素添加し
た。溶剤を蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解し、プレートを溶離するのに20％酢
酸エチル／ヘキサンを用いて、分散ＴＬＣにより混合物を精製した。ジオキセタ
ン2bの収量は79ｍｇ（収率84％）であった。1H NMR(CDCl3)δ 7.4-6.8(m,4H),3.
2(s,3H),2.62(sept,1H),2.48(sept,1H),2.08(s,1H),1.30(d,3H),1.17(d,3H),0.9
0(d,3H),0.47(d,3H);13C NMR(CDCl3)δ 156.00，137.21，129.70，116.41，114.
61，98.97，49.58，33.55，29.35，19.46，18.56，17.31，16.65．
実施例１３．４−（３−アセトキシフェニル）−3,3−ジイソプロピル−４− メトキシ−1,2−ジオキセタン（2c）の合成
．
アルケンのサンプル6３ｍｇを、−78℃で方法Ｂにより合計6.5時間光酸素添
加した。溶剤を蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解し、プレートを溶離するのに20
％酢酸エチル／ヘキサンを用いて、分散ＴＬＣにより混合物を精製した。ジオキ
セタン2cの収量は56ｍｇ（収率80％）であった。1H NMR(CDCl3)δ 7.37-6.99(m,
4H),3.14(s,3H),2.59-2.42(m,2H),2.32(s,3H),1.30(d,3H,J=7.2 Hz),1.17(d,3H,
J=7.2 Hz),0.91(d,3H,J=7.2 Hz),0.46(d,3H,J=7.2 Hz);13C NMR(CDCl3)δ150.89
，137.34，129.39，122.73，114.07，98.34，49.60，33.54，29.31，21.22，19.
44，18.53，17.17，16.59．
実施例１４．４−（３−ベンゾイルオキシフェニル）−3,3−ジイソプロピル −４−メトキシ−1,2−ジオキセタン（2d）の合成
．
アルケンのサンプル3.7ｇを、アセトンとＣＨ2Ｃl2との１:１混合物500ｍＬ
と、メチレンブルー100ｍｇとを用いて、−78℃で方法Ｂにより合計19時間光酸
素添加した。反応の進行を1H NMRでモニターした。溶剤を蒸発し、残渣を酢酸エ
チルに溶解し、溶離剤としてヘキサンを用い、カラムクロマトグラフィにより混
合物を精製した。1H NMR(CDCl3)δ8.22-7.0(m,9H),3.184(s,3H),2.62-2.46(m,2H
),1.30(d,3H,J=7.2 Hz),1.20(d,3H,J=7.2 Hz),0.94(d,3H,J=7.2 Hz),0.52(d,3H,
J=7.2 Hz);13C NMR(CDCl3)δ151.09，137.32,133.72，130.18，129.33，128.61
，122.66，98.24，49.48，33.44，29.22，19.32，18.42，17.11，16.48．
実施例１５．４−（３−ピバロイルオキシフェニル）−3,3−ジイソプロピル −４−メトキシ−1,2−ジオキセタン（2e）の合成
．
アルケンのサンプル1.95ｇを、アセトンとＣＨ2Ｃｌ2との１:１混合物300ｍ
Ｌを用いて、４℃で方法Ｂにより合計2.5時間光酸素添加した。反応の進行を1H
NMRでモニターした。溶剤を蒸発し、残渣を酢酸エチルに溶解し、溶離剤として
ヘキサンを用い、カラムクロマトグラフィにより混合物を精製した。1H NMR(CDC
l3)δ 7.43-7.07(m,4H),3.14(s,3H),2.59-2.42(m,2H),1.37(s,9H),1.31(d,3H,J=
6.9 Hz),1.17(d,3H,J=6.9 Hz),0.92(d,3H,J=6.9 Hz),0.47(d,3H,J=6.9 Hz)．
実施例１６．４−（３−ホスホリルオキシフェニル）−３，３−ジイソプロピ ル−４−メトキシ−１，２−ジオキセタン，ジナトリウム塩（２ｆ）の合成
．
アルケンのサンプル６４ｍｇを、方法Ｂに従い、０℃でＤ2Ｏの３ｍＬ中に
て合計１．５時間光酸素添加した。結晶化を誘導するため、溶液を４℃にて貯蔵
した。白色結晶を濾過し、アセトンで洗浄し、乾燥した。1H NMR(D2O)δ 7.43-7
.14(m,4H),3.132(s,3H),2.63-2.53(m,2H),1.225(d,3H,J=7.5 Hz),1.123(d,3H,J=
7.5 Hz),0.892(d,3H,J=6.6 Hz),0.475(d,3H,J=6.6 Hz);31P NMR(D2O)(rel.To ex
t.H3PO4)δ 0.248．
Ｄ2Ｏ／ｐ−ジオキサン、メタノール、メタノール／ＣＨ2Ｃｌ2を含め、用い
られる全ての他の溶剤系は数時間の反応時間を要し、かなりの量の分解生成物を
生じることは、注目すべきことである。実施例１７．４−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−３，３− ジシクロプロピル−４−メトキシ−１，２−ジオキセタン（２ｇ）の合成
．
アルケンのサンプル２５ｍｇを、−７８℃で方法Ａにより、合計１時間光酸
素添加した。1H NMRは、溶液がジオキセタン対アルケン３：１の混合物と、エス
テル分解生成物少量を含有することを示した。照射をこの時点で止め、増感剤を
濾別した。溶剤を蒸発し、混合物をキシレン溶液として速度論的測定に用いた。1
H NMR(CDCl3)ジオキセタンによるピーク：δ 7.6-6.7(m,4H),3.14(s,3H),1.80(
m,1H),1.2-1.0(m,9H),0.991(s,9H),0.221(s,6H)．
実施例１８．４−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−3,3− ジ シクロヘキシル−４−メトキシ−1,2−ジオキセタン（2h）の合成
．
アルケン1fのサンプル2.0ｇを、−78℃で方法Ｂにより合計8.5時間光酸素添
加した。溶剤を蒸発し、残渣をヘキサンに溶解し濾過した。有機溶液を蒸発し、
固体残渣をカラムクロマトグラフィにより精製した。生成物の収量は2.0ｇ（収
率93％）であった。1H NMR(CDCl3)δ 7.26-6.85(m,4H),3.143(s,3H),2.3-0.5(m,
22H),0.995(s,9H),0.205(s,6H);13C NMR(CDCl3)δ155.57，136.82，129.10，122
-121(several unresolved)，114.56，104.39，97.31，49.49，45.18，41.79，28
.71，28.07，27.80，27.17，26.95，26.83，26.74，26.30，25.68，18.24，-4.3
8．
実施例19．3,3−ジシクロヘキシル−４−（３−ヒドロキシフェニル）−４− メトキシ−1,2−ジオキセタン（2i）の合成
．
アルケン1ｇのサンプル150ｍｇを、−78℃で方法Ｂにより合計1.5時間光酸
素添加した。溶剤を蒸発し、残渣をヘキサンに溶解し、濾過した。沈澱を20％酢
酸エチル／ヘキサン10ｍＬで洗浄し、有機溶液を蒸発した。プレートを溶離する
のに20％酢酸エチル／ヘキサンを用いて、分散ＴＬＣにより固体残渣を精製した
。生成物の収量は120ｍｇ（収率72％）であった。1H NMR(CDCl3)δ 7.34-6.93(m
,4H),5.30(s,1H),3.163(s,3H),2.23-0.56(m,22H);13C NMR(CDCl3)δ155.55，137
.
02，129.42，116.23，116.12，114.62，104.36，97.88，49.60，45.28，41.78，
28.70，28.09，27.75，27.14，26.90，26.86，26.72，26.37．
実施例２０．１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ− ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼン ジクロリドの合成
．
エンハンサーＡ．
（ａ）トルエン（５０ｍＬ）中、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（７ｇ，３４
．６ｍｍｏｌ）の混合物を、アルゴン気流下トルエン（２００ｍＬ）中、α，α
’−ジクロロ−ｐ−キシレン（１２．１ｇ，６９．２ｍｍｏｌ，２ｅｑ．）の混
合物に滴下した。反応混合物をアルゴン気流下室温で１２時間攪拌した後、４−
（クロロメチル）ベンジル−トリ−ｎ−ブチルホスホニウムクロリドが溶液から
晶出した。結晶を濾過し、トルエンとヘキサンで洗浄し風乾した。1H NMR(CDCl3
)δ 0.92(t,9H),1.44(m,12H),2.39(m,6H),4.35-4.40(d,2H),4.56(s,2H),7.36-7.
39(d,2H),7.47-7.51(dd,2H)．
（ｂ）室温でＤＭＦ中、４−（クロロメチル）ベンジル−トリ−ｎ−ブチル
−ホスホニウムクロリド（３ｇ，７．９ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴン気流下
でトリ−ｎ−オクチルホスフィン（４．３９ｇ，１２ｍｍｏｌ）を加えた。反応
混合物を数日間攪拌しておき、その後ＴＬＣ測定で、反応が完結していることが
判った。ＤＭＦを減圧下に除去し、残渣をヘキサンとトルエンとで数回洗浄し、
次いで乾燥して、１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ
−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼン ジクロリドを白色結晶として得た
。1H NMR(CDCl3)δ 0.84(t,9H),0.89(t,9H),1.22(br s,24H),1.41(m,24H),2.34(
m,12H),4.35-4.40(d,4H),7.58(s,4H);13C NMR(CDCl3)δ 13.34，13.94，18.33，
18.62，18.92，19.21，21.76，21.81，23.58，23.64，23.78，23.98，26.10，26
.65，28.86，30.68，30.88，31.53，129.22，131.22;31P NMR(D2O)δ 31.10，31
.94．
実施例２１．化学発光速度(Kinetics)の測定．
化学発光の強さと速度(rate)の測定は、ターナー デザインズ(Turner Desi
gns)(Sunyvale,CA)型ＴＤ−２０ｅルミノメーターか、又は光子計数の光電子増
倍管を用いた屋内固定式のルミノメーター(Black Box)を使用して行った。ルミ
ノメーターで分析したサンプルの温度調節は、装置に接続した循環浴によって行
った。ターナー ルミノメーターでの光強度の定量的測定は、濃度フィルターに
よって検出器の１０4の直線領域を超えて拡張された。データの収集はルミソフ
ト・データリダクションプログラム(LUMISOFT data reduction program)(Lumige
n,Inc.,Southfield,MI)を用いて、アップルマッキントッシュＳＥ／３０コンピ
ューターでコントロールした。
ジオキセタン２ｃ、ｈ及びｉの熱分解活性化エネルギーを、幾通りかの温度
でキシレンの希釈溶液の化学発光の減衰についての１次速度定数ｋを測定するこ
とにより決定した。
実施例２２．化学発光及び蛍光発光のスペクトル．
化学発光及び蛍光発光のスペクトルを、１ｃｍの石英製キュベットでフルオ
ロログ(Fluorolog)II蛍光計(Spex Ind.,Edison,NJ)を用いて測定した。全測定は
周囲温度で行った。スペクトルは、光強度が恒常的水準に達した時にスキャンす
るか、又はスキャンの間光強度の減衰に対して補正をした。第１図は、１：１の
メタノール／ＤＭＳＯ中のＫＯＨの溶液少量の添加によってトリガーされた、Ｄ
ＭＳＯ中のジオキセタン２ｃの分解からの典型的な化学発光スペクトルを示して
いる。発光は、メチル３−ヒドロキシベンゾエートの陰イオンの励起状態から
生じている。ＤＭＳＯ中の本発明の各ジオキセタンの、トリガーされた分解がこ
の励起状態を発生させる。
実施例２３．ジオキセタン２ｃ、ｇ、ｉの化学発光的分解の化学的トリガー．
ジオキセタン２ｃ、２ｅ、２ｇと、比較例として４−（３−ｔ−ブチルジメチ
ルシリルオキシフェニル）−４−メトキシ−スピロ［１，２−ジオキセタン−３
，２’−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］（２ｊ）、（調製は米国特
許第４，９６２，１９２号明細書に記載）とを、ＤＭＳＯ中１０-6Ｍの濃度にし
た。必要に応じて、ＤＭＳＯでの一連の希釈を行った。１０μＬのアリコートを
、ターナー デザインズのＴＤ−２０ｅルミノメーターの中の７×５０ｍｍのポ
リプロピレン・チューブで、適当な溶剤、代表的にはＤＭＳＯ中で、テトラ−ｎ
−ブチルアンモニウム・フルオライド（ＴＢＡＦ）のＤＭＳＯ溶液（１Ｍ〜１０-4
Ｍ）５０μＬの注入によってトリガーした。全ての実験は周囲温度で行った。
ピークの光強度と減衰率はフルオライド濃度が減少するに従って減少した。フル
オライドの最小濃度では、減衰速度は明確な一次ではなかった。ＤＭＳＯ又はＤ
ＭＦ中のジオキセタン２ａ−ｅ及び２ｇ−ｉから化学発光を生じることが見いだ
された他のトリガー試薬には、ヒドラジン、水酸化カリウムとテトラアルキルア
ンモニウム・ヒドロキサイド、アルカリ金属のアルコキサイトとテトラアルキル
アンモニウム・アルコキサイド、及びアジ化ナトリウムがある。少量の（＜５％
）プロトン共通溶媒、例えばメタノール、エタノール又は水をＤＭＳＯ中のトリ
ガー試薬を溶解するのに用いることができる。
化学発光の持続時間と強度は、溶剤の選択、トリガー試薬及びジオキセタン
とトリガー試薬との比によって変えることができる。本発明を実施するために適
する溶媒には、反応物が溶解する任意非プロトン溶媒があり、特に極性溶媒、例
えばＤＭＳＯ、ジメチルフォルムアミド、アセトニトリル、ｐ−ジオキサン等が
好ましい。反応は、反応物の１つだけが溶解し、他は媒体中に未溶解で供給され
るような、例えば炭化水素溶媒中で処理することもできる。この場合には、発光
は未溶解の反応物の表面から起こる。
実施例２４．ジオキセタン２ｃ、ｈ、ｉのトリガーされた分解の速度．
第２図は、ＤＭＳＯ中１ＭのＴＢＡＦ・５０μＬで、ジオキセタン２ｈの１
０-6Ｍ溶液の１０μＬアリコートをトリガーする際の、代表的な化学発光強度の
特性を示す。ジオキセタン溶液の、１０倍希釈系によるトリガーによって、１０-9
Ｍ溶液が、バックグランドの１．５倍のシグナルを示すことが判った。化学発
光の減衰曲線は全て、擬似１次の反応速度を示した。減衰に関する半減期は、ジ
オキセタンの濃度と本質的に無関係である。
ジオキセタン２ｃ、ｈ、ｉ及びｊの、フルオライドでトリガーした分解の速度
を、ＤＭＳＯ中で同一条件の下、即ちＤＭＳＯ中１ＭのＴＢＡＦ５０μＬととも
にジオキセタン１０-6Ｍ溶液の１０μＬアリコートで、比較をした。この条件で
は、４種のジオキセタンは全て本質的に同一の速度で反応することが判った。
実施例２５．相対的化学発光の量子収率の測定．
ジオキセタン２ｃ、ｇ、ｈ及びｉの、フルオライドでのトリガーによって発
生した全化学発光強度を、ＤＭＳＯ中で同一条件の下、即ちＤＭＳＯ中１ＭのＴ
ＢＡＦ５０μＬでのジオキセタン１０-6Ｍ溶液の１０μＬアリコートについての
条件の下で、比較をした。正確な値を再現するのは、困難であった。しかし、全
ての４種のジオキセタンはこれらの条件の下で、２つのファクターの範囲内で同
じ化学発光の出力を出すことが見いだされた。ジオキセタン２ｈに対して化学発
光効率２５％という報告(A.P.Schaap,T.-S.Chen,R.S.Handley,R.DeSilva and B.
P.Giri,Tetrahedron Lett.,1155(1987))に基づき、本発明のジオキセタンは、Ｄ
ＭＳＯ中でのトリガーに際して、高効率で化学発光を生じることが見いだされた
。
実施例２６．ジオキセタン２ｆ、又は２ｋを含有する溶液の化学発光強度−反 応速度特性の比較
．
本発明のホスフェート・ジオキセタン２ｆの予期せぬ利点を示す為に、市場
で購入し得るジオキセタン、４−メトキシ−４−（３−ホスホリルオキシフェニ
ル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１3, 7
］デカン］，ジナトリウム塩，(LUMIGENPPD,Lumigen,Inc.,Southfield,MI)、ジ
オキセタン２ｋに対して、アルカリ緩衝溶液中でアルカリホスファターゼ（ＡＰ
）によって誘発される、ジオキセタン２ｆからの化学発光の経時的過程につき比
較した。第３図は、１つは本発明のジオキセタン２ｄを０．３３ｍＭ含有し、他
は同じ緩衝液にジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭ含有する、２種の組成物からの
、３７℃における経時特性と相対的化学発光強度とを示す。ジオキセタン溶液１
００μＬに対して１．１２×１０-17モルのＡＰの添加によって、発光を起こさ
せた。本発明のジオキセタン２ｆを含有する試薬は、有意に高い最高強度に到達
した。実施例２７．ジオキセタン２ｆ、又は２ｋを含有する溶液の化学発光強度−反応 速度特性の比較
．
第４図は、一つは本発明のジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭと１−（トリ−ｎ
−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチ
ル）ベンゼンジクロリド（エンハンサーＡ）１．０ｍｇ／ｍＬとを含有し、他は
ジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭと同じエンハンサー１．０ｍｇ／ｍＬとを含有
する、２種の組成物からの、３７℃における経時特性と相対的化学発光強度とを
示す。ジオキセタン溶液１００μＬに対して１．１２×１０-17モルのＡＰの添
加によって、発光を起こさせた。本発明のジオキセタン２ｆを含有する試薬は、
全ての時点でより高い光強度を達成した。実施例２８．ジオキセタン２ｆ、又は２ｋを含有する溶液の化学発光強度−反応 速度特性の比較
．
第５図は、一つは本発明のジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭとポリビニルベン
ジルトリブチルホスホニウム クロリド（エンハンサーＢ）０．５ｍｇ／ｍＬと
を含有し、他はジオキセタン２ｋを０．３３ｍＭと同じエンハンサー１．０ｍｇ
／ｍＬとを含有する、２種の組成物からの、３７℃における経時特性と相対的化
学発光強度とを示す。ジオキセタン溶液１００μＬに対して１．１２×１０-17
モルのＡＰの添加によって、発光を起こさせた。本発明のジオキセタン２ｆを含
有する試薬は、全ての時点でより高い光強度を達成した。実施例２９．ジオキセタン２ｆ、又は２ｋを含有する溶液の化学発光強度−反応 速度特性の比較
．
第６図は、一つは本発明のジオキセタン２ｆを０．３３ｍＭと、ポリビニル
ベンジルトリブチルホスホニウム クロリドとポリビニルベンジルトリオクチル
ホスホニウム クロリドとのコポリマー（トリブチル基：トリオクチル基は３：
１の比で含有）（エンハンサーＣ）０．５ｍｇ／ｍＬとを含有し、他はジオキセ
タン２ｋを０．３３ｍＭと同じエンハンサー０．５ｍｇ／ｍＬとを含有する、２
種の組成物からの、３７℃における経時特性と相対的化学発光強度とを示す。ジ
オキセタン溶液の１００μＬに対して１．１２×１０-17モルのＡＰの添加によ
って、発光を起こさせた。本発明のジオキセタン２ｆを含有する試薬は、全ての
時点でより高い光強度を達成した。実施例３０．ジオキセタン２ｆでのアルカリホスファターゼ検出の直線性と感度
．
ジオキセタン２ｆを含有する、本発明の試薬組成物を用いたＡＰ検出の直線性
を測定した。９６ウエルのミクロプレートにおける４８ウエルの夫々に、０．８
８ｍＭのＭｇ+2と１．０ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＡとを含有する、０．２Ｍの
２−メチル−２−アミノ−１−プロパノールのｐＨ９．６の緩衝液中に０．３３
ｍＭの２ｆを溶解する溶液１００μＬを添加した。プレートを３７℃でインキュ
ベートし、化学発光を、３．３６×１０-16モル〜３．３６×１０-22モルの酵素
を含有するＡＰ溶液３μＬを添加することによって引き起こした。光強度を１０
分で測定した。第７図は、アルカリホスファターゼの直線的な検出を示すもので
ある。用語のＳ−Ｂは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の存在下でのＲＬＵに
おける化学発光シグナル（Ｓ）を、ＡＰ不存在下でのバックグランドの化学発光
（Ｂ）に対して補正したものである。計算した検出限界（バックグランドの標準
偏差の２倍）は、この条件ではＡＰ２．０×１０-22モル、即ち１２０分子であ
った。実施例３１．化学発光の量子収量の比較
０．８８ｍＭのＭｇ+2と表４に記載した如き、選ばれたエンハンサーとを含有
する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールのｐＨ９．６の緩
衝液中に、１ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＣを含有する溶液において、ジオキセタ
ン２ｆと２ｋとの相対的な化学発光の量子収量を測定した。各試薬の１００μＬ
アリコートを、アルカリホスファターゼ３．３６×１０-13モルの添加によって
完全に脱りん酸化した。相対光度単位（ＲＬＵ）で、発する光の合計量を発光が
終わるまで積算した。更に、０．８８ｍＭのＭｇ+2を含有する０．２Ｍ又は０．
７５Ｍいずれかの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールのｐＨ９．６緩衝
液を使用し、如何なるエンハンサーをも用いない処方５００μＬで、同じ比較を
行った。ジオキセタン２ｆは、緩衝液だけでも、またエンハンサーＡ及びＣの存
在下でもジオキセタン２ｋより多量の発光を生じた。
実施例３２．水溶液中のジオキセタン２ｆの安定性．
０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールのｐＨ９．６の緩衝液
中１ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＡと０．８８ｍＭ Ｍｇ+2とを含有するジオキセ
タン２ｆの０．３３ｍＭ溶液の、熱的及び加水分解的安定性を３７℃で測定した
。このジオキセタン溶液を５日間、室温及び３７℃に保持した。９６ウエルのミ
クロプレート中１２ウエル各々に、各溶液１００μＬを加えた。プレートを３７
℃でインキュベートし、１．１×１０-15モルのＡＰを含有する溶液１０μＬを
加えることによって、化学発光を開始させた。光強度を２．５時間積算した。ジ
オキセタンの安定性を、３７℃でインキュベートしたサンプルの平均の光の収量
を室温に保持した溶液と比較することによって、評価した。発光量の減少は、イ
ンキュベーションの間のジオキセタンの分解を示す。３７℃に保持した溶液は、
室温の溶液と同一であって、この条件ではジオキセタンは安定であることを示し
た。実施例３３．膜でのアルカリホスファターゼの化学発光検出
．
ブロッテイング膜表面での酵素の化学発光検出に、本発明の組成物が有用であ
ることを、次の実施例に示す。１．１ｆｍｏｌから１．１ａｍｏｌまでを含有す
る、アルカリホスファターゼの水溶液を同一のナイロン膜(Micron Separations
Inc.,Westboro,MA)に適用した。膜を５分間風乾し、０．８８ｍＭのＭｇＣｌと
０．３３ｍＭのジオキセタン２ｆか又は０．３３ｍＭのジオキセタン２ｋかのい
ずれかとを含有する、０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールの
ｐＨ９．６の緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬのエンハンサーＡを含有する試薬に、短時
間浸漬した。この膜を透明シートの間に置き、Ｘ線フィルム(Kodak X-OMAT AR,R
ochester,NY)に暴露した。第８図は、両ジオキセタンを用いた発光により、同等
の画像と検出感度が得られることを示している。これらの結果は、ジオキセタン
２ｆの性能がウエスタンブロッテイング、サザンブロッテイング、ＤＮＡフィン
ガープリント法や他のブロッテイング用途に期待されることを示している。
─────────────────────────────────────────────────────
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(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｆ 7/18 Ｃ０７Ｆ 7/18
9/655 9/655
Ｃ０９Ｋ 11/07 Ｃ０９Ｋ 11/07
Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ