【発明の詳細な説明】
３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−１，１−ジオキシドを用いた35Ｓ−標識
オリゴヌクレオチドの合成
発明の背景
技術分野
本発明は、35Ｓ標識３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジ
オキシド（１）の合成、および部位特異的な35Ｓ標識オリゴヌクレオチドを作製
する際のその合成方法に関する。
従来の技術
ZamecnikおよびStephenson、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75，280-284（1978
）が、合成オリゴヌクレオチドによるウイルス複製阻害を最初に示してから、治
療剤としてのオリゴヌクレオチドに大きな関心がよせられた。最近、治療剤とし
て、また遺伝子発現調節剤としてのオリゴヌクレオチドの開発が急増した。最も
大きな開発は、標的ｍＲＮＡでワトソン‐クリック二重鎖を形成する、いわゆる
アンチセンスオリゴヌクレオチドの用途におけるものである。Agrawal、Trends
in Biotechnology 10, 152-158（1992）では、抗ウイルス剤としてのアンチセン
スオリゴヌクレオチドの開発を広く検討する。Uhlmannおよびpeymann、Chem．Re
v．90，543（1990）も参照さ
れたい。
このような目的のオリゴヌクレオチドの合成に関し種々の方法が開発された。
概して、Methods in Molecular Biology，20巻、protocols for Oligonucleotid
es and Analogs (S.Agrawal編、Humana Press，1993）、Oligonucleotides and
Analogues: A Practical Approach（F．Eckstein編、1991）、UhlmannおよびPey
manの上記文献を参照されたい。初期の合成アプローチには、リン酸ジエステル
およびリン酸トリエステル化合物が含まれた。オリゴヌクレオチド合成のための
リン酸ジエステル化合物が、Khoranaら、J．Molec．Biol．72，209（1972）に、
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成のためのリン酸トリエステル
化合物がReese、Tetrahedron 34，3143-3179（1978）に開示されている。これら
の初期のアプローチは、合成により効果的なホスホロアミダイトおよびＨ−ホス
ホネートアプローチに大部分取って代わられた。BeaucageおよびCaruthers、Tet
rahedron Lett．22，1859-1862（1981（BeaucageおよびIyer、Tetrahedron 48，
2223（1992）にてレビュー）は、ポリヌクレオチド合成中にデオキシヌクレオシ
ドホスホロアミダイトを使用することを開示する。AgrawalおよびZamecnikの米
国特許第5,149,798 号（1992）には、Ｈ−ホスホネートアプローチによるオリゴ
ヌクレオチドの最適化された合成が開示されている。
これらの現代的アプローチは、両方とも、種々の修飾
ヌクレオチド間連結を示すオリゴヌクレオチドを合成するのに使用されている。
AgrawalおよびGoodchild、Tetrahedron Lett．28，3539-3542（1987）は、ホス
ホロアミダイト化合物を用いたオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成を
報告する。Connollｙら、Biochemistry 23，3443（1984）には、ホスホロアミダ
イト化合物を用いたオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成が開示されて
いる。Jagerら、Biochemistry 27，7237（1988）には、ホスホロアミダイト化合
物を用いたオリゴヌクレオチドホスホロアミダイトの合成が開示されている。Ag
rawalら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85，7079-7083（1988）には、Ｈ−ホス
ホネート化合物を用いたオリゴヌクレオチドホスホロアミダイトおよびホスホロ
チオエートの合成が開示されている。
ホスホロアミダイト化合物（BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Lett．2
2，1859-1862（1981）、およびBeaucageおよびIyer、Tetrahedron 48，2223-231
1（1992））を用いた接合の際の硫化剤（Iyerら、J．Am．Chem．Soc．112，1253
-1254（1990））としての３Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジ
オキシド（１）の使用は、今日では、種々のオリゴヌクレオシドホスホロチオエ
ートの慣例の合成および大量生産として十分に確立されている。メチルホスホノ
チオエートおよび他の類似体の合成に、この試薬を使用することが報告されてい
る。Padmapriyaら、Antisense Res．& Dev．4，185-1
99（1994）およびAndradら、Bioorg．& Med．Chem．Lett．pp.2017-2022（1994
）。生物学上の研究において、35Ｓ標識オリゴヌクレオシドホスホロチオエート
は、代用化合物、すなわちＨ−ホスホネート化合物を使用して製造される。Gare
ggら、Chem．Scr．25，280-282（1985）。しかしながら、Ｈ−ホスホネート化合
物を用いてホスホロチオエートの部位特異的標識を行うのは困難であり、（ａ）
混合リボヌクレオチド−デオキシリボヌクレオチド集団（「ハイブリッドオリゴ
」）、（ｂ）不均一な骨格、例えばデオキシリボヌクレオチド−メチルホスホネ
ート（「キメラオリゴ」）および（ｃ）混合ホスホロジエステル−ホスホロチオ
エート（ＰＯ−ＰＳ）骨格等との35Ｓ標識オリゴヌクレオシドホスホロチオエー
ト構築物の作製を行うには不都合である。立体化学的に「一様な」生成物を確実
にするためには、合成および生物学的評価の両方に同一の化合物を用いることが
望ましい。硫黄元素を使用することの欠点も認識されている。Iyerら、J．Am．C
hem．Soc．112，1253-1254（1990）およびIyerら、J．Org．Chem．55，4693-469
8（1990）。
薬理学上の化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエー
トのin vivo薬物動態学の研究（Agrawalら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88
，7595-7599（1991））では、検出可能にするために化合物を標識することが必
要である。35Ｓ標識は、確立された広く知れ渡った技術である。35Ｓ標識オリゴ
ヌクレオシド
ホスホロチオエート構築物を合成する上での前述の難点から、改善された方法が
望まれている。
発明の概要
本発明は、35Ｓ標識オリゴヌクレオシドホスホロチオエートを合成するための
新規化合物および改善方法を提供する。本発明は、いくつかの態様からなる。第
１の態様では、本発明は、35Ｓで標識されたオリゴヌクレオチドホスホロチオエ
ートを合成するために有用な新規化合物を提供する。この化合物の35Ｓ−３Ｈ−
１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイド（１）は、構造式
（式中、アステリスクは35Ｓ標識を示す。）で表される。
本発明の第２の態様では、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン
−１，１ジオキサイド（１）を合成する新規方法を提供する。この方法の重要性
は、種々の35Ｓ標識オリゴヌクレオチドホスホロチオエートが製造でき、それに
よりこれらの化合物の薬物動態学の研究が促進できることにある。
35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイド（１
）を合成する方法を図２に示すが、この方法は、まず35Ｓ−チオ安息香酸（４）
をチオ
サリチル酸（ｏ−メルカプト安息香酸）（５）と接触させて、縮合物である35Ｓ
−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン（２）を得ることからなる。次い
で、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン（２）を酸化させて所望
の生成物、すなわち、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，
１ジオキサイド（１）を得る。
本発明の第３の態様では、35Ｓ標識オリゴヌクレオチドを合成する新規方法を
提供する。この方法は、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１
，１ジオキサイド（１）を、酸化的硫化されやすいオリゴヌクレオチドと接触さ
せることからなる。ホスホロアミダイト法（phosphoramidate method）を介して
合成されたオリゴヌクレオチドを35Ｓ標識化する方法を図３に示す。しかしなが
ら、アルキルおよび／またはアリールホスファイトを酸化的硫化により対応する35
Ｓ標識アルキルおよび／またはアリールホスホノチオエートを得るというよう
な他の方法は検討中である。
当業者であれば、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１
ジオキサイド（１）が、その未標識の類似体である３Ｈ−１，２−ベンゾジチオ
ール−３−オン−１，１ジオキサイドが使用できるいかなる目的および方法にも
、使用できることが理解されよう。
前述の記載は、本発明のいくつかの態様を単に要約するものであって、本発明
をいかなる様にも限定すること
を意図するものでなく、また解釈されるべきものでもない。
本明細書で引用される全ての特許および他の文献はここで全体にて参照により
組み込まれる。
図面の簡単な説明
図１は、35Ｓの硫黄元素およびチオ安息香酸からの35Ｓチオ安息香酸（４）の
合成を示す。
図２は、中間体35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン（２）を介
した、35Ｓ−チオ安息香酸（４）およびチオサリチル酸（５）からの35Ｓ−３Ｈ
−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイド（１）の合成を示
す。
図３は、ホスホロアミダイト法（phosphoramidate method）により合成された35
Ｓ標識オリゴヌクレオチドを示す。
図４は、λ＝２６０ｎｍでのＵＶ検出（パネルＡ）およびフローシンチレーシ
ョン分析（パネルＢ）による35Ｓ−Ｒｐ−ｄ［ＴｐｓＴ］および35Ｓ−Ｓｐ−ｄ
［ＴｐｓＴ］のＲＰ−ＨＰＬＣのプロフィールである。
図５は、本発明の方法により合成された35Ｓ標識オリゴヌクレオチドを表す。
図６は、ＰＡＧＥにかけた配列番号５−７（精製物）および配列番号８（粗製
物）のオリゴヌクレオチドのオートラジオグラムを表す。
図７は、λ＝２６０ｎｍでのＵＶ吸収（パネルＡ）およびフローシンチレーシ
ョン分析（パネルＢ）により検出された35Ｓで標識された配列番号５のイオン交
換ＨＰＬＣのプロフィールを表す。
好ましい実施例の説明
治療剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドへの関心が相変わらず増加し
ているため、これらの化合物の薬物動態学上の特性が試験できる方法を提供する
必要がある。バイオ分布とともに半減期および分解産物を測定する必要がある。
これらの作業を成し遂げる１つの方法は、オリゴヌクレオチドを、生物学的化合
物を追跡したり検出したりするのに使用される一般的なアイソトープ標識である35
Ｓで標識することである。
本発明は、35Ｓ標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成するのに有用な新
規化合物、その化合物を合成するための新規方法、およびオリゴヌクレオチドを35
Ｓ標識するための新規方法を提供する。
本発明の第１の態様は、以下の構造式
（式中、アステリスクは35Ｓ放射性核種の位置を示す。）を示す新規化合物35Ｓ
−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイド（１）から
なる。
非放射性標識類似体である３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，
１ジオキサイドは公知であるが（例えば、Beaucage，ReganおよびIyerの米国特
許第5,003,097号（Beaucageら、'097）およびIyerら、J．Am．Chem．Soc.および
J．Org．Chem.,上述文献）、35Ｓ標識化合物は、まだ合成されていない。
当業者であれば、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１
ジオキサイド（１）が、その非放射性標識の対応物と同じ目的および方法で使用
できることが理解されよう。本発明の第２の態様は、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベン
ゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイドを合成する新規方法からなる。こ
の方法は、例えば、Beaucageら、'097の方法の応用例である。この方法の重要な
利点は、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイ
ド（１）の生成を可能にすることである。先行技術の方法と対比的に、本発明の
方法は、35Ｓ標識が容易に組み込まれる反応物を使用する。
先行技術では、硫酸中で２−チオール安息香酸およびチオール酢酸を混合する
ことにより、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイド
の前駆体である、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オンが生成されること
が教示される。例えば、Beaucageら、'097。この方法を使用して、最終生成物で35
Ｓを適切な位置に有するためには、35Ｓをチオール酢酸中に組み込
むことが必要である。我々は、報告された手段で、チオール酢酸および35Ｓ元素
の間の高温（１２５℃）交換反応により、35Ｓチオール酢酸の製造を試みた。Ka
wamuraら、Chem．Lett．1231-1234（1975）。しかし、高い比活性を有する35Ｓ
（３２ｍＣｉ／μモル）を使用しても、チオール酢酸の揮発性（沸点８１℃）お
よび蒸気圧が高いことが問題となって、高い比活性有する35Ｓ標識チオール酢酸
は単離できなかった。
チオール酢酸を35Ｓ標識しようとした際に遭遇した困難を解消するために、沸
点がより高く、蒸気圧がより低いチオール酸を探求したところ、市販のチオ安息
香酸（４）が理想的候補であるように思えた。35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチ
オール−３−オン−１，１ジオキサイド（１）の製造に35Ｓ−チオ安息香酸（４
）を使用する前に、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキ
サイド（１）の前駆体である35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン
（２）を製造することにより、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オ
ン−１，１ジオキサイド（１）の製造におけるチオ安息香酸（４）の使用の有用
性を確認した（図２）。いかなる理論にも縛られることは望まないし、実際、こ
の合成方法は、いかなる理論にも依存するものではないが、35Ｓ−３Ｈ−１，２
−ベンゾジチオール−３−オン（２）は、中間体（３）：
を経て形成されることが推測される（McKibbenおよびMaClelland，J．Chem．Soc
．170-173（1923））。収率は、チオール酢酸を使用する（約８０％）より幾分
低く（約６０％）、反応の完了にはより長い時間（４時間）が必要とされた。こ
のように合成された結晶化した35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オ
ン（２）のサンプルは、チオール酢酸を使用する報告された方法（Iyerら、J．A
m．Chem．Soc．112，1253-1254（1990）およびIyerら、J．Org．Chem．55，4693
-4698（1990））により得られるものと全ての点で同一であった（融点、1Ｈ−Ｎ
ＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲ）。35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン
（２）の製造に35Ｓ−チオ安息香酸（４）を使用することの実行可能性を示し、35
Ｓ−チオ安息香酸（４）は高い放射化学的収率（７８％）で都合よく製造され
た。こうして得られた35Ｓ−チオ安息香酸（４）は、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベン
ゾジチオ−ル−３−オン（２）に変換され、トリフルオロ酢酸中の過酸化水素を
使用して、注意深く制御して酸化された（図２）。Iyerら、J．Am．Chem．Soc．
112，1253-1254（1990）およびIyerら、J．Org．Chem．55，4693-4698（1990）
。過剰なＨ2Ｏ2の使用を避けることが重要であ
る。所望の生成物35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジ
オキサイド（１）は、３０％化学収率（使用された５の量に対し）で白色結晶固
体として得られ、９０μＣｉ／μモルの比活性を示した。反応混合物は、35Ｓ−
３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイド（１）の分解
を避けるために、完了後ただちに使用されるべきである。
このように、本発明のこの態様による合成方法は、第１に35Ｓチオ安息香酸（
４）をチオサリチル酸（５）と接触させて、縮合物35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾ
ジチオール−３−オン（２）を得ることよりなる。この反応は酸で触媒される。
任意の適切な強酸が使用されうるが、好ましい実施例では、硫酸が使用される。
その後、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン（２）を酸化して、
所望の生成物である35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１
ジオキサイド（１）を得る。任意の適切に強い酸化剤、例えば過酸化水素および
トリフルオロ酢酸、トリフルオロペルオキシ酢酸または、オキソン（oxone）、
過ヨウ素酸ナトリウム、ＮａＯＣｌ、ＲｕＣｌ3のような他の酸化剤、およびス
ルフィドをスルホンに酸化する際に使用される試薬が使用できる。例えば、M．H
udlicky，Oxidation in Organic Chemistry，ACS Monograph 186，1990を参照さ
れたい。好ましい実施例では、過酸化水素およびトリフルオロ酢酸を用いて酸化
を完了する。この概略を図２に表す。
本発明の第３の態様は、オリゴヌクレオチドを35Ｓ標識する新規方法からなる
。この方法は、任意の所望のヌクレオシド間連結に35Ｓを選択的に配置するのに
使用できる。１つから全部のヌクレオシド間連結のどこにでも35Ｓで標識できる
。この方法は、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオ
キサイド（１）を酸化的硫化されやすいオリゴヌクレオチドと接触させることか
らなる。好ましい実施例では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト法に
より合成され、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオ
キサイド（１）は、当業界で知られる標準条件下で１つまたはそれ以上のβ−シ
アノエチルホスホロトリエステルのヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオ
チドと接触される。別の好ましい実施例では、１つまたはそれ以上のアルキルお
よび／またはアリールホスファイトのヌクレオチド間連結を有するオリゴヌクレ
オチドは、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサ
イド（１）と接触させて、対応する35Ｓ標識アルキルおよび／またはアリールホ
スホノチオエートを得る。この反応は、非放射性標識酸化的硫化剤を用いるもの
であり、Padmapriyaら、上述の文献により教示される。
当業者であれば、35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１
ジオキサイド（１）が、未標識類似体である３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−
３−オ
ン−１，１ジオキサイドにより硫化され得る任意の化合物を35Ｓ標識するのに使
用できることが理解されよう。例えば、本発明の方法は、酸化的チオール化によ
り35Ｓ標識を組み込むことができる炭水化物、タンパク質、および任意の巨大分
子を35Ｓ標識することができる。したがって、ホスホペプチドのように、ＲＮＡ
は部位特異的に35Ｓで標識することができる。ホスホロチオエートおよびリン脂
質、グリセロリン脂質、およびホスホ炭水化物の硫黄類似体（例えば、ホスホロ
ミオイノシトール、または他の巨大分子とのこれらの結合体）も、35Ｓで標識さ
れうる。35Ｓは、チオホスフェートおよびチオトリホスフェート（例えば、ＡＴ
Ｐ）に挿入され、化学的または酵素的リン酸化反応を用いて、任意の分子に組み
込まれうる。
以下の実施例は、例示目的にのみ提供されるものであって、いかなる様にも本
発明を限定することを意図するものでなく、また解釈されるべきでもない。
実施例
実施例１
35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイド（１
）の合成 35 Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン（２）の合成
35Ｓ（100μｌのトルエン中の５ｍＣｉ）（Amersham，
英国）と６．５μｌ（５５μモル）の未標識チオ安息香酸（Aldrich，ウイスコ
ンシン、ミルウォーキー）の溶液とを、１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管に配
置し、内容物を９７℃で５時間加熱した。溶液をアルゴン下で濃縮乾固し、５ｍ
ｇのチオサリチル酸（Aldrich，ウイスコンシン、ミルウォーキー）を添加した
。反応混合物を０℃に冷却し、硫酸（９８％、５０ｍｌ、J．T．Baker，ニュー
ジャージー、フィリップスバーグ）を添加した。混合物を５０℃で３時間保持し
た。得られた茶色の反応混合物を−７８℃に冷却し、６００μｌの水を添加した
。塩化メチレン（４×３ｍｌ）（VWR，フィラデルフィア、ウエストチェスター
）で、その溶液を抽出し、有機層をＮａ2ＣＯ3（５％、２×２ｍｌ）（EM Scien
ce，ニュージャージー、ギブスタウン）で洗浄した。有機層をアルゴン流下で濃
縮乾固して、黄色固体を得た。その後、その物質を３ｍｌの温ヘキサン（J.T．B
aker，ニュージャージー、フィリップスバーグ）に溶解し、遠心分離した後、上
清溶液をアルゴン下で濃縮乾固し、淡黄色固体を得た（４ｍｇ、４４％収率）。
この物質は、さらに精製することなく次の段階に使用することができ、使用する
まで−２０℃で貯蔵した。 35 Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン（2）からの35Ｓ−３Ｈ−１ ，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイド（１）の合成
共に０℃に冷却された４ｍｇの35Ｓ−３Ｈ−１，２−
ベンゾジチオール−３−オン（２）（上述のとおり製造された）を含む１．５ｍ
ｌのエッペンドルフ試験管に、２５ｍｌのトリフルオロ酢酸（Aldrich，ウイス
コンシン、ミルウォーキー）および１２ｍｌの３０％過酸化水素を添加した。反
応混合物を４２℃に温めた。約２時間（シリカゲル、クロロホルムを用いたＴＬ
Ｃによりモニター、Iyerら、J．Org．Chem．）後、反応混合物を０℃に冷却し、
３００ｍｌの水を加えた。35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−
１，１ジオキサイド（１）の白色沈殿がただちに形成された。スラリーを遠心分
離し、沈殿物を水（２×３００μｌ）で洗浄し、真空中で乾燥させ、２ｍｇの35
Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキサイド（１）を
得た（総活量３５０μＣｉ、比活性９０μＣｉ／μモル）。
無水アセトニトリル中の35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−
１，１ジオキサイド（１）の溶液（２０ｍｇ、２００ｍｌアセトニトリル中９０
μＣｉ／μモル）を以下に記載の酸化的硫化反応に使用した。溶液は、使用まで
は−２０℃で貯蔵した。
実施例２
35Ｓ−標識オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドの作製の際の35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３
−オン−１，１ジオキサイド（１）の使用を示すために、ホスホロアミダイト化
合物
を用いて自動化ＤＮＡ合成機で０．１μモル規模で35Ｓ−ｄ［ＴｐｓＴ］（ここ
で、「ｐｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を意味する）を作製し
た。BeaucageおよびCaruthers，Tetrahedron Lett．22，1859-1862（1981）およ
びBeaucageおよびIyer，Tetrahedron48，2223-2311（1992）。35Ｓ標識を組み込
むために、ヌクレオチド間のホスファイト連結の形成後、合成サイクルを中断し
た。ＣＰＧをカラムから取り出し、溶液（１５ｍｌ、９０μＣｉ／μモル、３０
分）で処理した後、「冷」（すなわち、非35Ｓ標識）３Ｈ−１，２−ベンゾジチ
オール−３−オン−１，１ジオキサイドの溶液（アセトニトリル中２％、１００
ｍｌ、１０分）で処理した。「非放射性」の35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオ
ール−３−オン−１，１ジオキサイド（１）を使用し、厳格な条件下で作製され
た（ＴｐｓＴ）のサンプルは、ＴｐｓＴの変換が＞９９％であることを示した。
酸化的硫化は、合成中行われた「トリチルアッセイ」（trityl assays）によ
り定めたとおり定量的であった。Agrawal，Protocols in Molecular Biology）
上述文献。水酸化アンモニウム水溶液でＣＰＧからの開裂およびリン酸脱保護（
３０％、２時間、３５℃）後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ、２
０％）により２量体を調べた。オートラジオグラフ画像をそのＵＶ造影バンドに
重ねることができた。放射性化学的検知器と接続したＵＶ検知器を使用する逆相
ＨＰＬＣにかけると、Ｒ
ｐ−35Ｓ−ｄ［ＴｐｓＴ］（保持時間＝２２．７分）およびＳｐ−35Ｓ−ｄ［Ｔ
ｐｓＴ］（保持時間＝２４．０分）の保持時間に対応するＵＶ吸収ピークにその
活量プロフィールを重ねられた（図４、パネルＡ）。（「Ｒｐ」および「Ｓｐ」
は、リンのキラル中心での２つの立体配置を表す）。フローシンチレーション解
析による検出は図４、パネルＢに表される。８ＮＶ Ｃ18 ４μ Ｒａｄｉａｌ
Ｐａｋ（Waters，マサチューセッツ、ミルフォード）カートリッジカラム、緩
衝液Ａ（０．１Ｍ ＣＨ3ＣＯ2ＮＨ4）と緩衝液Ｂ（８０：２０、ＣＨ3ＣＮ：０
．１Ｍ ＣＨ3ＣＯ2ＮＨ4）とからなる勾配（６０分かけて１００％Ａ〜６０％
Ｂ）を設けた溶液、１．５ｍｌ／分の流量比を用い、Ｒａｄｉｏｍａｔｉｃ（Me
riden Ct．，マサチューセッツ）５００ＴＲｖ３．００放射化学検知機と接続し
たフォトダイオードアレイＵＶ検知機を具備したＷａｔｅｒｓカラム（マサチュ
ーセッツ、ミルフォード）でＨＰＬＣ解析を行った。
その後、所定の35Ｓ標識組み込み部位を有する多数のオリゴヌクレオチド（配
列番号１−４）を１μモル規模で作製した。図５に示されるとおり、全てのヌク
レオチド間連結は、特に示す以外ホスホロチオエートである。矢印は、35Ｓ標識
部位を示す。35Ｓ標識の部位特異的組み込みについては、所望の時点で合成サイ
クルを中断し、前記のとおり35Ｓ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン
−１，１ジオキサイド（１）（５０μｌ、９０
μＣｉ／μモル、３０分）で処理した。酸化的硫化は、合成中行われた「トリチ
ルアッセイ」により定めたとおり定量的であった。
水酸化アンモニウム（３０％、１０時間、５５℃）で脱保護した後、分離用Ｐ
ＡＧＥにより、粗製オリゴヌクレオチド（配列番号１−４）を精製し、Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−２５クロマトグラフィにより脱塩し、凍結乾燥し、解析用ＰＡＧ
Ｅにかけた（図６）。このように得られたオリゴヌクレオチド（配列番号１−４
）は、約２３〜２５μＣｉ／μモルの比活性を示した。
我々は、35Ｓ標識された配列番号５をイオン交換ＨＰＬＣにかけ、λ＝２６０
ｎｍでＵＶ検出（図７、パネルＡ）およびフローシンチレーション解析（図７、
パネルＢ）により溶出物を検出した。緩衝液Ａ（２５ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ
８．５、１０％ＣＨ3ＣＮ）から緩衝液Ｂ（２５ｍＭトリスＨＣｌ、２Ｍ Ｌｉ
Ｃｌ、ｐＨ８．５、１０％ＣＨ3ＣＮ）への勾配（５０分かけて８０％Ａ〜１０
０％Ｂ）のある溶液、０．５ｍｌ／分の流量比のＧＥＮ−ＰＡＫ ＦＡＸカラム
（４．６×１００ｍｍ）を使用し、６５℃で、イオン交換ＨＰＬＣを行った。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Using 3H-1,2-benzodithiol-3-1,1-dioxide35S-label
Oligonucleotide synthesis
Background of the Invention
Technical field
The present invention35S-labeled 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-di
Synthesis of oxide (1) and site-specific35Preparation of S-labeled oligonucleotide
To the synthesis method at the time.
Conventional technology
Zamecnik and Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 280-284 (1978
) First demonstrated inhibition of virus replication by synthetic oligonucleotides,
There has been great interest in oligonucleotides as therapeutic agents. Recently, as a therapeutic agent
Also, the development of oligonucleotides as gene expression regulators has increased rapidly. most
A major development is the formation of Watson-Crick duplexes on target mRNAs, the so-called
In applications of antisense oligonucleotides. Agrawal, Trends
In Biotechnology 10, 152-158 (1992), antisense agents as antiviral agents
Examine the development of oligonucleotides widely. Uhlmann and peymann, Chem. Re
v. 90, 543 (1990)
I want to be.
Various methods have been developed for the synthesis of such oligonucleotides.
In general, Methods in Molecular Biology, Volume 20, protocols for Oligonucleotid
es and Analogs (ed. by S. Agrawal, Humana Press, 1993), Oligonucleotides and
Analogues: A Practical Approach (F. Eckstein, 1991), Uhlmann and Pey
See man, supra. Early synthetic approaches include phosphodiester
And a phosphoric acid triester compound. For oligonucleotide synthesis
Phosphodiester compounds have been described by Khorana et al. Molec. Biol. 72, 209 (1972),
Phosphate triesters for oligonucleotide and polynucleotide synthesis
The compound is disclosed in Reese, Tetrahedron 34, 3143-3179 (1978). these
Early approaches to synthesizing more efficient phosphoramidites and H-phos
It has largely been replaced by the honate approach. Beaucage and Caruthers, Tet
rahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981 (Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48,
2223 (reviewed in 1992) shows that deoxynucleotides
The use of dophosphoramidites is disclosed. Agrawal and Zamcnik rice
No. 5,149,798 (1992) describes an oligo by the H-phosphonate approach.
An optimized synthesis of nucleotides is disclosed.
Both of these modern approaches have various modifications
It has been used to synthesize oligonucleotides that exhibit internucleotide linkages.
Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28, 3539-3542 (1987)
Synthesis of oligonucleotide methylphosphonates using holoamidite compounds
Report. Connolly et al., Biochemistry 23, 3443 (1984) include phosphoramidas.
Synthesis of oligonucleotide phosphorothioates using site compounds
I have. Jager et al., Biochemistry 27, 7237 (1988) include phosphoramidite compounds.
The synthesis of oligonucleotide phosphoramidites using a product is disclosed. Ag
rawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 (1988) includes H-phos.
Oligonucleotide phosphoramidites and phosphorosides using phonate compounds
The synthesis of thioates is disclosed.
Phosphoramidite compounds (Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 2
2, 1859-1862 (1981), and Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48, 2223-231
1 (1992)) (Iyer et al., J. Am. Chem. Soc. 112, 1253).
-1254 (1990)) 3H-1,2 benzodithiol-3-one-1,1di.
The use of oxides (1) is nowadays widely used for various oligonucleoside phosphorothioe
It is well established as a customary synthesis and mass production of the plate. Methylphosphono
The use of this reagent in the synthesis of thioates and other analogs has been reported.
You. Padmapriya et al., Antisense Res. & Dev. 4,185-1
99 (1994) and Andrad et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett. pp.2017-2022 (1994
). In biological research,35S-labeled oligonucleoside phosphorothioate
Are prepared using a surrogate compound, i.e., an H-phosphonate compound. Gare
gg et al., Chem. Scr. 25, 280-282 (1985). However, H-phosphonate compounds
It is difficult to perform site-specific labeling of phosphorothioate using
Mixed ribonucleotide-deoxyribonucleotide population ("hybrid oligo
"), (B) a heterogeneous backbone such as deoxyribonucleotide-methylphosphone
("Chimeric oligos") and (c) mixed phosphorodiester-phosphorothio
Eat (PO-PS) skeleton35S-labeled oligonucleoside phosphorothioe
This is inconvenient for producing a construct. Ensure stereochemically "uniform" products
Use the same compound for both synthetic and biological evaluations.
desirable. The disadvantages of using elemental sulfur have also been recognized. Iyer et al. Am. C
hem. Soc. 112, 1253-1254 (1990) and Iyer et al. Org. Chem. 55,4693-469
8 (1990).
Pharmacological compounds such as antisense oligonucleotide phosphorothioes
In vivo pharmacokinetic studies (Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88
, 7595-7599 (1991)), it is necessary to label a compound to make it detectable.
It is important.35S-labeling is an established and well-known technique.35S-labeled oligo
Nucleoside
The aforementioned difficulties in synthesizing phosphorothioate constructs have led to improved methods.
Is desired.
Summary of the Invention
The present invention35For the synthesis of S-labeled oligonucleoside phosphorothioates
New compounds and improved methods are provided. The invention consists of several aspects. No.
In one aspect, the invention provides:35Oligonucleotide phosphorothioe labeled with S
A novel compound useful for synthesizing a salt is provided. This compound35S-3H-
1,2-benzodithiol-3-one-1,1 dioxide (1) has a structural formula
(Where the asterisk is35Shows the S label. ).
In a second aspect of the present invention,35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one
A novel method for synthesizing -1,1 dioxide (1) is provided. Importance of this method
Is a variety of35S-labeled oligonucleotide phosphorothioate can be produced,
This is to facilitate the study of the pharmacokinetics of these compounds.
35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1 dioxide (1
2) is shown in FIG.35S-thiobenzoic acid (4)
The thio
Salicylic acid (o-mercaptobenzoic acid) (5) to form a condensate35S
-3H-1,2-benzodithiol-3-one (2). Next
so,35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one (2) is oxidized to the desired
The product of35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,
1 dioxide (1) is obtained.
In a third aspect of the present invention,35New method for synthesizing S-labeled oligonucleotide
provide. This method35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1
, 1 Dioxide (1) is contacted with an oligonucleotide susceptible to oxidative sulfidation
Consisting of Via the phosphoramidate method
Synthesized oligonucleotide35The method for S labeling is shown in FIG. However
Et al., The corresponding alkyl and / or aryl phosphites are oxidatively sulfurized.35
To obtain S-labeled alkyl and / or aryl phosphonothioates
Other alternatives are under consideration.
If you are skilled in the art,35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1
Dioxide (1) has its unlabeled analog, 3H-1,2-benzodithio.
For any purpose and method in which ure-3-one-1,1 dioxide can be used
It will be appreciated that it can be used.
The foregoing description merely summarizes some aspects of the present invention, and
To limit in any way
It is not intended and should not be construed.
All patents and other references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
Be incorporated.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG.35S from elemental sulfur and thiobenzoic acid35S-thiobenzoic acid (4)
Shows synthesis.
Figure 2 shows the intermediate35Via S-3H-1,2-benzodithiol-3-one (2)
did,35From S-thiobenzoic acid (4) and thiosalicylic acid (5)35S-3H
1 shows the synthesis of 1,2-benzodithiol-3-one-1,1 dioxide (1).
You.
FIG. 3 was synthesized by the phosphoramidate method.35
2 shows an S-labeled oligonucleotide.
FIG. 4 shows UV detection at λ = 260 nm (panel A) and flow scintillation.
Analysis (Panel B)35S-Rp-d [TpsT] and35S-Sp-d
It is a RP-HPLC profile of [TpsT].
FIG. 5 shows a sample synthesized by the method of the present invention.35Represents an S-labeled oligonucleotide.
FIG. 6 shows PAGEs of SEQ ID NOS: 5-7 (purified) and SEQ ID NO: 8 (crude)
3) shows an autoradiogram of the oligonucleotide of the product (1).
FIG. 7 shows UV absorption at λ = 260 nm (panel A) and flow scintillation.
Detection (panel B)35Ion exchange of SEQ ID NO: 5 labeled with S
1 represents the profile of an exchange HPLC.
Description of the preferred embodiment
Interest in antisense oligonucleotides as therapeutics continues to increase
Provide a way to test the pharmacokinetic properties of these compounds
There is a need. The half-life and degradation products need to be measured along with the biodistribution.
One way to accomplish these tasks is to combine oligonucleotides with biological compounds.
A common isotope label used to track and detect objects35
It is to label with S.
The present invention35New useful for synthesizing S-labeled antisense oligonucleotides
Reference compounds, novel methods for synthesizing the compounds, and oligonucleotides35
A new method for S labeling is provided.
A first aspect of the present invention provides the following structural formula
(Where the asterisk is35Indicates the location of the S radionuclide. )35S
From -3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1 dioxide (1)
Become.
The non-radiolabeled analog 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,
1 Dioxides are known (see, for example, Beaucage, Regan and Iyer in US Pat.
No. 5,003,097 (Beaucage et al., '097) and Iyer et al. Am. Chem. Soc. And
J. Org. Chem., Supra),35S-labeled compounds have not yet been synthesized.
If you are skilled in the art,35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1
Dioxide (1) used for the same purpose and method as its non-radiolabeled counterpart
It will be understood that it can be done. A second aspect of the present invention provides:35S-3H-1,2-ben
It comprises a novel method for synthesizing zodithiol-3-one-1,1 dioxide. This
Is an application example of the method of Beaucage et al., '097. Important of this method
The advantages are35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1dioxai
To generate the code (1). In contrast to prior art methods, the present invention
The method is35Use reactants that incorporate the S-label easily.
In the prior art, 2-thiolbenzoic acid and thiolacetic acid are mixed in sulfuric acid
3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1 dioxide
3H-1,2-benzodithiol-3-one, which is a precursor of
Is taught. For example, Beaucage et al., '097. Using this method, the final product35
To have S in the proper position,35Incorporates S into thiolacetic acid
Is necessary. We have reported that thiolacetic acid and35S element
During the high temperature (125 ° C) exchange reaction during35An attempt was made to produce S-thiolacetic acid. Ka
Wamura et al., Chem. Lett. 1231-1234 (1975). But with high specific activity35S
(32 mCi / μmol), the volatility of thiolacetic acid (boiling point 81 ° C.)
Has a high specific activity due to high vapor pressure and high pressure35S-labeled thiol acetic acid
Could not be isolated.
Thiol acetic acid35To eliminate the difficulties encountered when trying to use S
In search of thiolic acids with higher points and lower vapor pressure, commercial thiobenzo
Perfume acid (4) appeared to be an ideal candidate.35S-3H-1,2-benzodithi
For the production of all-3-one-1,1 dioxide (1)35S-thiobenzoic acid (4
)) Before use of 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1 diox
Precursor of side (1)35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one
By manufacturing (2),35S-3H-1,2-benzodithiol-3-o
Use of thiobenzoic acid (4) in the production of 1,1 dioxide (1)
Properties were confirmed (FIG. 2). We do not wish to be bound by any theory, and in fact
The synthesis method of does not depend on any theory,35S-3H-1,2
-Benzodithiol-3-one (2) is an intermediate (3):
(McKibben and MaClelland, J. Chem. Soc.
. 170-173 (1923)). The yield is somewhat higher than using thiolacetic acid (about 80%).
Low (approximately 60%) and a longer time (4 hours) was required to complete the reaction. This
Crystallized like synthesized35S-3H-1,2-benzodithiol-3-o
(2) samples were prepared according to the reported method using thiolacetic acid (Iyer et al., JA
m. Chem. Soc. 112, 1253-1254 (1990) and Iyer et al. Org. Chem. 55,4693
-4698 (1990)) in all respects (melting point,1H-N
MR and13C-NMR).35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one
For manufacturing (2)35Shows the feasibility of using S-thiobenzoic acid (4),35
S-thiobenzoic acid (4) is conveniently prepared in high radiochemical yield (78%).
Was. Thus obtained35S-thiobenzoic acid (4)35S-3H-1,2-ben
It is converted to zodithiol-3-one (2), and hydrogen peroxide in trifluoroacetic acid is converted to
Used and carefully controlled oxidation (FIG. 2). Iyer et al. Am. Chem. Soc.
112, 1253-1254 (1990) and Iyer et al. Org. Chem. 55, 4693-4698 (1990)
. Excess HTwoOTwoIt is important to avoid using
You. Desired product35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1di
Oxide (1) is a white crystalline solid in 30% chemical yield (based on the amount of 5 used).
It had a specific activity of 90 μCi / μmol. The reaction mixture is35S-
Decomposition of 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1 dioxide (1)
Should be used immediately after completion to avoid
Thus, the synthesis method according to this aspect of the invention firstly35S-thiobenzoic acid (
4) is contacted with thiosalicylic acid (5) to form a condensate35S-3H-1,2-benzo
To obtain dithiol-3-one (2). This reaction is catalyzed by an acid.
Although any suitable strong acid may be used, in a preferred embodiment, sulfuric acid is used.
afterwards,35Oxidizing S-3H-1,2-benzodithiol-3-one (2),
Is the desired product35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1
Dioxide (1) is obtained. Any suitably strong oxidizing agent, such as hydrogen peroxide and
Trifluoroacetic acid, trifluoroperoxyacetic acid or oxone,
Sodium periodate, NaOCl, RuClThreeOther oxidants, such as
The reagents used in oxidizing sulfides to sulfones can be used. For example, M. H
udlicky, Oxidation in Organic Chemistry, ACS Monograph 186, 1990.
I want to be. In a preferred embodiment, the oxidation is performed using hydrogen peroxide and trifluoroacetic acid.
Complete. This is schematically illustrated in FIG.
A third aspect of the present invention provides an oligonucleotide35Consists of a new method for S-labeling
. This method works for any desired internucleoside linkage.35To place S selectively
Can be used. Anywhere from one to all internucleoside linkages35Can be labeled with S
. This method35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1 geo
Contacting the oxide (1) with an oxidatively susceptible oligonucleotide
Become. In a preferred embodiment, the oligonucleotide is used in a phosphoramidite method.
Synthesized from35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1 geo
The oxide (1) has one or more β-cysteines under standard conditions known in the art.
Oligonucleotides with internucleoside linkages of anoethyl phosphorotriesters
Contact with tide. In another preferred embodiment, one or more alkyl and
And / or oligonucleotide having an aryl phosphite internucleotide linkage
Otide is35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1 dioxa
Contact with the id (1)35S-labeled alkyl and / or aryl
Obtain suphonothioate. This reaction uses a non-radiolabeled oxidative sulfurizing agent
And is taught by Padmapriya et al., Supra.
If you are skilled in the art,35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1
Dioxide (1) is an unlabeled analog, 3H-1,2-benzodithiol-
3-o
Any compound that can be sulfurized by 1,1 dioxide35Used to label S
It will be appreciated that it can be used. For example, the method of the present invention is based on oxidative thiolation.
R35Carbohydrates, proteins, and any macromolecules that can incorporate S-labels
Child35Can be S-labeled. Thus, like phosphopeptides, RNA
Is site-specific35It can be labeled with S. Phosphorothioate and phosphorous fat
Quality, glycerophospholipids, and sulfur analogs of phosphocarbohydrates (eg, phosphoro
Myo-inositol, or their conjugates with other macromolecules)35Labeled with S
Can be.35S represents thiophosphate and thiotriphosphate (eg, AT
P) and assembled into any molecule using chemical or enzymatic phosphorylation.
Can be included.
The following examples are provided for illustrative purposes only, and
It is not intended and should not be construed as limiting the invention.
Example
Example 1
35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1 dioxide (1
) Synthesis 35 Synthesis of S-3H-1,2-benzodithiol-3-one (2)
35S (5 mCi in 100 μl of toluene) (Amersham,
UK) and 6.5 μl (55 μmol) of unlabeled thiobenzoic acid (Aldrich, Wisco)
Solution in a 1.5 ml Eppendorf test tube.
And the contents were heated at 97 ° C. for 5 hours. The solution was concentrated to dryness under argon and 5m
g of thiosalicylic acid (Aldrich, Wisconsin, Milwaukee) was added.
. The reaction mixture was cooled to 0 ° C. and sulfuric acid (98%, 50 ml, JT Baker, New York).
Jersey, Philipsburg). Hold the mixture at 50 ° C. for 3 hours
Was. The resulting brown reaction mixture was cooled to −78 ° C. and 600 μl of water was added.
. Methylene chloride (4 x 3 ml) (VWR, Philadelphia, Westchester
), The solution was extracted, and the organic layer was extracted with Na.TwoCOThree(5%, 2 × 2 ml) (EM Scien
ce, New Jersey, Gibbstown). Concentrate the organic layer under a stream of argon
After drying to dryness, a yellow solid was obtained. The material was then added to 3 ml of warm hexane (J.T.B.
aker, Phillipsburg, NJ, and centrifuged.
The clear solution was concentrated to dryness under argon to give a pale yellow solid (4 mg, 44% yield).
This material can be used in the next step without further purification
-20 ° C until storage. 35 35 S-3H-1 from S-3H-1,2-benzodithiol-3-one (2) Of 2,2-benzodithiol-3-one-1,1 dioxide (1)
4 mg of both cooled to 0 ° C35S-3H-1,2-
1.5 m with benzodithiol-3-one (2) (prepared as described above)
1 eppendorf tube with 25 ml of trifluoroacetic acid (Aldrich, Wis.)
(Consin, Milwaukee) and 12 ml of 30% hydrogen peroxide. Anti
The reaction mixture was warmed to 42 ° C. About 2 hours (TL using silica gel and chloroform)
Monitored by C, Iyer et al. Org. Chem. After), the reaction mixture is cooled to 0 ° C.
300 ml of water were added.35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-
A white precipitate of 1,1 dioxide (1) formed immediately. Centrifuge the slurry
Release, wash the precipitate with water (2 × 300 μl), dry in vacuo and dry 2 mg35
S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1 dioxide (1)
(Total activity 350 μCi, specific activity 90 μCi / μmol).
In anhydrous acetonitrile35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one-
Solution of 1,1 dioxide (1) (20 mg, 90 ml in 200 ml acetonitrile)
μCi / μmol) were used for the oxidative sulfidation reaction described below. Solution until use
Was stored at -20 ° C.
Example 2
35Synthesis of S-labeled oligonucleotide
When preparing oligonucleotides35S-3H-1,2-benzodithiol-3
Phosphoramidite to demonstrate the use of -one-1,1 dioxide (1)
Compound
On an automated DNA synthesizer on a 0.1 μmole scale35Sd [TpsT] (here
Where "ps" means phosphorothioate internucleoside linkage).
Was. Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981) and
And Beaucage and Iyer, Tetrahedron48, 2223-2311 (1992).35Incorporate S sign
The synthesis cycle after the formation of a phosphite linkage between nucleotides.
Was. The CPG was removed from the column and the solution (15 ml, 90 μCi / μmol, 30
Minutes) and then "cold" (ie, non-35S label) 3H-1,2-benzodithi
A solution of all-3-one-1,1 dioxide (2% in acetonitrile, 100%
ml, 10 minutes). "Non-radioactive"35S-3H-1,2-benzodithio
Prepared under stringent conditions using ureol-3-one-1,1 dioxide (1).
A sample of (TpsT) showed that the conversion of TpsT was> 99%.
Oxidative sulphide is determined by "trityl assays" performed during the synthesis.
Quantitative as specified. Agrawal, Protocols in Molecular Biology)
The above references. Cleavage from CPG and phosphate deprotection with aqueous ammonium hydroxide (
After 30% for 2 hours at 35 ° C.), polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE, 2
0%). Autoradiographic image into its UV contrast band
I was able to overlap. Reverse phase using a UV detector coupled with a radiochemical detector
HPLC shows that R
p-35S-d [TpsT] (retention time = 22.7 minutes) and Sp-35Sd [T
psT] (retention time = 24.0 minutes).
Activity profiles were overlaid (FIG. 4, panel A). ("Rp" and "Sp"
Represents two configurations at the chiral center of phosphorus). Flow scintillation solution
The detection by analysis is shown in FIG. 8NV C18 4μ Radial
Pak (Waters, Mass., Milford) cartridge column, loose
Impact liquid A (0.1 M CHThreeCOTwoNHFour) And buffer B (80:20, CHThreeCN: 0
. 1M CHThreeCOTwoNHFour) (100% A to 60% over 60 minutes)
Using a solution provided with B), a flow rate ratio of 1.5 ml / min.
riden Ct. , Massachusetts) Connected to 500TRv3.00 radiochemical detector
Waters column equipped with a photodiode array UV detector (Masachu
HPLC).
After that,35A number of oligonucleotides (S
Column numbers 1-4) were prepared on a 1 μmole scale. As shown in FIG.
Inter-reotide linkages are phosphorothioates unless otherwise indicated. The arrow is35S sign
Indicates the site.35For site-specific incorporation of S-labels, synthetic
Suspend the cruiser, as described above35S-3H-1,2-benzodithiol-3-one
-1,1 dioxide (1) (50 μl, 90
μCi / μmol, 30 minutes). Oxidative sulphidation was carried out during the synthesis
The assay was quantitative as determined by the “Assay”.
After deprotection with ammonium hydroxide (30%, 10 hours, 55 ° C.), P
The crude oligonucleotide (SEQ ID NOs: 1-4) was purified by AGE and
desalted by adex G-25 chromatography, freeze-dried and analyzed PAG
E (FIG. 6). The thus obtained oligonucleotide (SEQ ID NOs: 1-4)
) Showed a specific activity of about 23-25 μCi / μmol.
we,35The S-labeled SEQ ID NO: 5 was subjected to ion exchange HPLC, and λ = 260
UV detection in nm (Figure 7, panel A) and flow scintillation analysis (Figure 7,
The eluate was detected by panel B). Buffer A (25 mM Tris HCl, pH
8.5, 10% CHThreeCN) to buffer B (25 mM Tris HCl, 2 M Li
Cl, pH 8.5, 10% CHThreeCN) (80% A-10 over 50 minutes)
0% B) solution, GEN-PAK FAX column with a flow rate of 0.5 ml / min
(4.6 × 100 mm) and ion exchange HPLC was performed at 65 ° C.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 ０８／４９３，３３９
(32)優先日 1995年６月21日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ
Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ
，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，
ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ
Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ
，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，
ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 アグラワル、 スディール
アメリカ合衆国 01545 マサチューセッ
ツ州 シュルーズベリー ランプライター
ロード 61
(72)発明者 タン、 ウェイティアン
アメリカ合衆国 01701 マサチューセッ
ツ州 フラミンガム アパートメント ナ
ンバー306エイ ウースター ロード
1612
【要約の続き】
学力学的研究においてアンチセンスオリゴヌクレオチド
のバイオ分布および分解を追跡するのに有用である。────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(31) Priority claim number 08 / 493,339
(32) Priority date June 21, 1995
(33) Priority country United States (US)
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M
C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG
, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN,
TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, U
G), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, C
A, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI
, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP,
KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, M
G, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO
, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM,
TT, UA, UG, US, UZ, VN
(72) Inventor Agrawal, Sudir
United States 01545 Massachusetts
County Shrewsbury Lamplighter
Road 61
(72) Inventor Tan, Waitian
United States 01701 Massachusetts
Framingham Apartments Na
Nmber 306 A Worcester Road
1612
[Continuation of summary]
Antisense oligonucleotides in academic studies
Useful for tracking the biodistribution and degradation of the