JPH10509208A

JPH10509208A - Functionalized polymers for site-specific binding

Info

Publication number: JPH10509208A
Application number: JP8535165A
Authority: JP
Inventors: イー．オフォード，ロビン; エフ．ガートネール，ユベール
Original assignee: イー．オフォード，ロビン; エフ．ガートネール，ユベール
Priority date: 1994-11-09
Filing date: 1995-11-09
Publication date: 1998-09-08

Abstract

(57)【要約】有機ポリマー、たとえばアミノ−オキシオキシム−形成基により官能化されたポリ（エチレングリコール）、及びそれらの調製方法、並びに、緩和な条件下でアルデヒド（又はケトン）−官能化標的高分子又は表面への部位特異的化学選択性連結への使用法が提供される。オキシム結合を通して標的高分子上の単一の部位への構造体（及び従って、そのポリマーのすべて）の部位特異的化学選択性連結を可能にする、多−ポリマー含有アミノ−オキシ−官能化又はアルデヒド（又はケトン）−官能化ポリマー構造体がまた供給される。個々の構造体が、同じ種類においてトポロジーにおいては異なるが、しかし分子量（平均）においてはお互い異なっていない官能化されたポリマー構造体の種類がまた、供給される。それらの使用方法は、トポロジーにおいては異なるが、しかし分子量においてはお互い異なっていない標的分子、好ましくは生物学的に重要なタンパク質の種類を急速に創造するためにその標的高分子の組織的な改変を包含し、ここで前記種類から、所望する生物学的又は物理的性質、たとえば高められた薬物動力学挙動性を有する高分子が同定され得る。 (57) [Summary] Organic polymers, such as poly (ethylene glycol) functionalized with amino-oxy oxime-forming groups, and methods for their preparation, and the use of aldehyde (or ketone) -functionalized target polymers or surfaces under mild conditions Uses for site-specific chemoselective ligation are provided. Multi-polymer containing amino-oxy-functionalized or aldehyde that allows site-specific chemoselective linking of the structure (and thus all of the polymer) to a single site on the target polymer through an oxime bond A (or ketone) -functionalized polymer structure is also provided. Also provided are types of functionalized polymer structures in which the individual structures differ in topology in the same type, but do not differ from each other in molecular weight (average). Their use is systematic modification of the target macromolecules to rapidly create target molecules that differ in topology but not in molecular weight, preferably biologically important proteins. Wherein macromolecules with desired biological or physical properties, such as enhanced pharmacokinetic behavior, can be identified from the class.

Description

【発明の詳細な説明】部位特異的結合のための官能化されたポリマー序論技術分野本発明は、官能化されたポリマーの調製に関する。より詳しくは、本発明は、官能化されたポリマー、特にポリアルキレンオキシドポリマーの共有結合による、標的分子、たとえば生物高分子、特に生物学的に重要なポリペプチド、及び他の多分散高分子、たとえばプラスチック（たとえば、ポリエチレン又はナイロン）の部位特異的化学改変のための試薬及び方法に関する。背景ポリエチレングリコール改変ポリペプチドの調製物は、親ポリペプチドに比較して、免疫原性及び抗原性を減じ、そしてまた、血流においてより長い寿命を有する（Abuchowski and Davis（1981）“Enzymes as Drugs”，Holcenberg and R oberts，eds.，p367-383,John Wiley & Sons，N．Y.）。改変されたポリペプチドのそれらの有益な性質は、種々の治療用途、たとえば酵素治療においてそれらをひじょうに有用にする。タンパク質へのポリエチレングリコール（“PEG”）の結合をもたらすためには、ポリマーのヒドロキシル末端基が、最初に反応性官能基に転換されるべきである。この工程は時々、“活性化”として言及され、そしてその生成物は“活性化されたPEG”と呼ばれる。保護基により一端をキャップされ、そしてタンパク質分子上のアミンに対して反応性である求電子基を他端上に担持するメトキシポリエチレングリコール（“mPEG”）誘導体が、ほとんどの場合に使用されて来た。治療用酵素の調製のために使用される活性化されたPEG の最とも通常の形の１つは、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）スクシノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである(Abuchowski など．（1984）Cancer Biochem．Biophys．７：175-186)。しかしながら、１つの主な欠点は、ポリマーと琥珀酸残基との間のエステル結合が水性媒体において制限された安定性を有することである。ウレタン結合のPEG−タンパク質の調製のためへのPEG−フェニルカーボネート誘導体の使用は報告されている（Verones e、など、1985）。しかしながら、その疎水性フェノール残基（ｐ−ニトロフェノール又は２，４，５−トリクロロフェノール）は毒性であり、そしてタンパク質に対する親和性を有する。タンパク質へのリポーター基、リガンド、等の結合は通常、リシン残基の側鎖上の一次アミノ酸を通してランダム態様で進行する。リシン残基により結合されたいくつかのPEG−誘導体が合成されている。PEGのヒドロキシル末端基は典型的には、興味あるタンパク質にPEG を共有結合できる反応性官能基に転換される。それらの PEG−誘導体は、次のものを包含する：２−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−４，６−ジクロロトリアジン（Abuchowskiなど．(1977)J．Biol ．Chem．252：3578-3581）；２−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−Ｎ− スクシンイミジルスクシネート（Abuchowskiなど．（1984）Cancer Biochem．Bi ophys．７：175-186）；２−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−２，２，２−トリフルオロエタン（Delgado など．（1990）Biotech．Applied Biochem．１２：119-128）；２−アルコキシポリエチレンアルデヒド（Andresなど．（199 0）Biotech．Tec．４：49-54）；２−アルコキシポリエチレングリコキシメチルエポキシド（Andrews など．（1990）Biotech ．Tec．４：49-54）。EP539167（1993）は、タンパク質のアミノ基との反応のために末端イミデート基により改変されたPEGを報告している。タンパク質PEG 化の上記方法のすべてに関する主な欠点は、ポリマー接合がランダムに及び非部位特異的に、典型的にはアミノ基、たとえばリシン側鎖及びＮ −末端アミノ基で生じることであり、そのような結果、複数のポリマー基が生物学的活性、たとえば基質結合又はリポーター結合を潜在的に妨害し、そして接合体の調製物が、特に、その反応がランダムであり、そして種々の標的残基の選択的な活性又は接近性のために完全でない事実の観点から、典型的には不均一になる。さらに、標的分子の電荷の変更が典型的にはカップリング反応により、特に遊離アミノ基の改変に基づいてポリペプチドに引き起こされる。アミノ酸残基上の荷電されていない残基への電荷の導入又はアミノ酸残基上に存在する電荷の除去又はマスキングに基づいての電荷の変化は、タンパク質の三次構造の破壊及び活性部位の破壊を包含するいくつかの機構によりそのタンパク質の生物学的活性に悪影響を与える。電荷のそのような変化は典型的には、誘導体化が完結まで実施されるので、累積する。典型的には、上記方法を用いてポリペプチドの分子当たりのポリマーの数を低めることは、しばしば、活性部位の接近性を立体的に減じ、そして従って、改変されていないポリペプチドにより所有される生物学的活性を低める。ポリエチレングリコール改変 TNF−αは、広範な改変が生物活性の完全な損失をもたらした典型的な例である（Tsutsumiなど．（1994）Jpn．J．Ca nc．Res．85，9-12）。ポリマー接合分子の多くの可能性ある用途を考慮して及び特に、PEG−ポリペプチドに対する技術的な焦点から、標的高分子又は材料、たとえば表面の改変への使用のために官能化されたポリマーのレパートリを高める必要性が当業界において存在する。従って、官能化されたPE G の他に官能化されたポリマー、及びポリマー結合の現方法に固有であり、そしてその方法に観察される欠点の克服を可能にするための方法のための必要性が当業界において存在する。たとえば、残基上に存在する電荷を劇的に変えないで、又は標的分子の結合性質を妨害する傾向がある位置で基を導入しないで、標的分子の残基、たとえばポリペプチドのアミノ酸残基に結合することができ、そして種々の条件、特に生理学的に相当する条件下で安定する連鎖を通して結合される官能化されたポリマーを供給する必要性が当業界において存在する。従って、安定した連結連鎖を有する定義された構造の容易に合成された高分子の均質調製物を構成するための試薬及び方法の必要性が存在し、ここでそれらの試薬及び方法は、合成の迅速性及び温和さ；実質的に多量の収量；企画の多様性；及び生化学クラスの化合物の多様性を用いての構成への適用性を容易に提供する。本発明に提供される試薬及び方法は、適切なそれらの必要性及び他の必要性を提供する。発明の要約本発明は、標的高分子上のユニーク部位でのオキシム連鎖を通して、有機ポリマー、好ましくは水溶性有機ポリマー、より好ましくはPEG 又はデキストランのアミノ−オキシ又はアルデヒド（又はケトン）誘導体により、標的高分子、たとえばタンパク質、ペプチド、他の有機化合物、たとえばプラスチック、又は表面材含有高分子を穏やかな条件下で部位特異的且つ化学選択的に改変するための方法及び化合物を提供する。“官能化された”ポリマーとして言及される、PEG 及び他の水溶性ポリマーの新規アミノ−オキシ誘導体（オキシム−連鎖を形成することができる）が提供される。本発明の二又は多一ポリマー含有の官能化されたポリマーの使用を通して、１又は複数の水溶性ポリマーが、穏やかな条件下で個々の標的高分子上の予備選択された単一の部位に部位特異的且つ化学選択的に結合され得る。本発明のもう１つの観点は、官能化された水溶性ポリマー誘導体の部位特異的共有結合により改変されたタンパク質を調製するための方法を提供することである。本発明は、ポリマー反復単位の数が５〜2000の整数である官能化されたポリマーを提供する。本発明はまた、ポリマー反復単位の数が５〜2000の整数であるポリマー化合物と、オキシム形成基がポリマーに共有結合され、そしてそのオキシム−形成基が任意に、保護解除できる形で存在する、オキシム−形成基を含む化合物とを反応せしめる段階を包含する、オキシム−形成基を含む官能化されたポリマーを調製するための方法を提供する。本発明はさらに、部位特異的反応性及びオキシム−連鎖形成が生じるように、本発明の官能化されたポリマーに対して、反応性において相補的なオキシム−形成反応基を有する官能化された改変標的分子、好ましくはポリペプチドを提供する。本発明はさらに、改変された標的高分子、すなわちポリマー又は複数のポリマーが標的高分子上のユニーク部位に単一のオキシム連鎖を通して共有結合されている、少なくとも１つの有機ポリマーをそれに部位特異的に結合している、ポリペプチドを含んで成るポリマー接合体を提供する。本発明はまた、活性的に相補的な第１のオキシム−形成官能基を供給するために標的高分子を、本発明の官能化されたポリマー上に存在する第２のオキシム− 形成官能基により官能化し、そしてオキシム結合が前記第１官能基と第２官能基との間に形成されるように、前記官能化された標的高分子と前記官能化されたポリマーとを反応せしめる段階を包含する、穏やかな条件下で上記ポリマー接合体を調製するための方法を提供する。オキシム結合を通して標的高分子上の単一の部位への穏やかな条件下での構造体（及び従ってそのポリマーのすべて）の部位特異的化学選択性連結を可能にする、多ポリマー含有アミノ−オキシ−官能化された又はアルデヒド（又はケトン）−官能化されたポリマー構造体がまた供給される。個々の構造体が同じ系統においてトポロジー的には他と異なっているが、しかし分子量（平均）的には異なっていない官能化されたポリマー構造体の系統がまた供給される。それらの使用方法は、所望する生物学的又は物理学的性質、たとえば増強された薬物動力学的挙動性を有する高分子として同定され得る系統とは、トポロジー的には異なるが、しかし分子量的には異なっていない標的高分子、好ましくは生物学的に重要なタンパク質の系統を急速に創造するために標的高分子の組織的改変を包含する。従って、本発明は、標的高分子のストークス半径を組織的に改変する方法を提供し、ここで前記方法は、官能化された標的高分子と、本発明の一連の官能化されたポリマー、好ましくは多ポリマー含有の官能化されたポリマーとを、別の反応において接合せしめ、そして次に、ストーク半径に対する接合の効果を決定する段階を包含する。本発明のこの観点の好ましい態様においては、標的分子の薬物動力学的挙動性が組織的に改変される。本発明の方法を実施するための適切な試薬を有するキットが提供される。図面の簡単な説明図１は、異なった官能化されたPEG ポリマーと酸化されたIL−８との接合体の移動を示す、非還元条件下での SDS−PAGEゲルを示す。すべての場合、単一の誘導体がその接合体反応において得られた。レーン１，３，５，７：それぞれ AoA−PEG_5KD，AoA-PEG_10KD，AoA−PEG_20KD及び AoA−Ｎ−（PEG_5KD）₂ と酸化されたIL−８との20時間のインキュベーションの結果。AoA−Ｎ−（PEG_5K _D ）₂は、(PEG_5KD−CONH(CH₂)₂)₂Ｎ−(CH₂)₂−NH−AoA である。レーン２，４，６，８：精製された接合体PEG_5KD−IL−８，PEG_10KD−IL−８，PEG_20KD−IL−８及び（PEG_5KD）₂−IL-８。レーン９：酸化されたIL−８。レーン10、すなわちタンパク質分子量マーカー：上部から底部の方に、ホスホリラーゼＢ（97.4KD）、ウシ血清アルブミン（66.2KD）、オボアルブミン（45KD）、カルボニックアンヒドラーゼ（31KD）、大豆トリプシンインヒビター（21.5KD）、リゾチーム（14.4 KD）。“KD”はキロダルトンを示す。図２は、異なった官能化されたポリマーにより得られるIL−８の移動を示す S DS−PAGEゲルを示す。レーン１：IL−８。レーン２，３，４：PEG_5KD−IL−８， PEG_10KD−IL−８，PEG_20KD−IL−８。レーン５：IL−８−PEG_20KD−IL−８（ダイマー、“ダンベル”）。レーン６，７：（PEG_10KD）₂ Lys−IL−８，（Lys−P EG_5KD）−IL−８。レーン８：デキストラン_9KD−IL−８。レーン９：タンパク質分子量マーカーは図１におけるのと同じである。PEG_5XD−PEG_10KD−PEG_20KD−IL −８，IL−８−PEG_20KD−IL−８及び（PEG_10KD）−Lys−IL−８は単一のバンドとして移動し、そして(Lys−PEG_5KD）₅−IL−８及びデキストラン_9KD−IL−８はゲル上に形跡を与えた。図３は des−Met−Ｇ−CSF と官能化されたPEG_5KD及びPEG_20KDとの接合体の移動を示す SDS−PAGEゲルを示す。レーン１：des−Met −Ｇ−CSF。レーン２：Ao A−PEG_5KDと酸化された des−Met −Ｇ−CSF との24時間のインキュベーションの結果。レーン３：精製されたPEG₅ _KD −des−Met−Ｇ−CSF。レーン４：24時間のインキュベーションの後、酸化された des−Met−Ｇ−CSFへの AoA−PEG_20KD のカップリング。レーン５：精製されたPEG_20KD−des−Met−Ｇ−CSF。レーン６：タンパク質分子量マーカーは図１における通りである。図４。インターロイキン−１レセプターアンタゴニストタンパク質（“IL−１ ra”）への官能化されたAoA−PEG_5KD，AoA−PEG_10KD及び AoA−PEG_20KDの接合。レーン１：IL−１ra。レーン２：室温で48時間のインキュベーションの後、アミノ基転移されたIL−１raへの AoA−PEG_10KDのカップリング。レーン３，４，５：精製された接合体PEG_10KD−IL−１ra，PEG_5KD−IL−１ra及びPEG_20KD−IL−１ ra。レーン６：タンパク質マーカーは図１における通りである。図５Ａ，５Ｂ及び５Ｃは、低下する濃度のIL−１ra誘導体の存在下で皮膚線維芽細胞によりIL−１β誘発されたプロスタグランジンＥ２生成の阻害を示す用量 −応答曲線を示す。図５ＡはPEG_5KD−IL−１raについての曲線であり、図５Ｂは PEG_10KD−IL−１raについての曲線であり、そして図５ＣはPEG_20KD−IL−１raについての曲線である。個々の場合、接合体は、活性化されたタンパク質を供給するためにアミノ基転移を用いて例８に記載のようにして調製された。個々の点は、３つのプロスタグランジン測定の平均に起因し、これから、緩衝液が単に、IL −１ra（また、本明細書においては“Antril”（Synergen，Inc.からの）とも称する）及び誘導体の代わりに使用される場合に得られる３つのプロスタグランジン測定の平均が引き算された。平均値のばらつきは、このアッセイにおいては、異例ではない。明確にするために、３種のAntril誘導体についての用量−応答曲線が別々にプロットされ（点線及び誤差バー）、個々の時点で、 Antrilにより得られた同じ標準曲線がプロットされた（実線及び誤差バー）。図６Ａ及び６Ｂは、改変されていないIL−１raの薬物動力学に比較しての、ラットにおけるPEG_10KD−IL−１ra（図６Ａ）及びPEG_20KD−IL−１ra（図６Ｂ）の薬物動力学を示す。明確にするために、２種の誘導体に関する結果が別々にプロットされ（点線）、個々の時点で、改変されていないAntrilに関して得られた同じ組の結果がプロットされた（実線）。血液サンプルを、３，10及び30分で、並びに１，３，７，12及び24時間で採取した。個々の点は、一匹の動物による単一の決定を示す。改変されていないAntrilの場合、初期低下が30〜180 分の間で示された後、血液レベルでの遅い上昇が見られた。そのような予測できない挙動は、同じ実験条件下で使用される他の調査されたタンパク質に関して観察されなかった。注射液のいくらか又はほとんどが尾の静脈を外れ、そして皮下に蓄積された明白な証拠を示した動物（過剰の放射能が注射部位で残存し、続いて、通常の二相性の指数株低下よりもむしろ、初期の低下の後、血液レベルでの遅い上昇が続く）は、廃棄された。図７は、IL−８，PEG_20KD−IL−８，IL−８−PEG_20KD−IL−８及び（PEG_20KD ）₂ Lys−IL−８の薬物動力学を示す。血液サンプルを３，７，15及び30分で、並びに１，３及び７時間で採取した。個々の点は４匹の動物の平均値を表わす。ダンベル及び複数アーム構造体は、血流におけるIL−８の寿命を改良するために最とも効果的な接合体として見える。特定の態様の記載本発明は、ポリマー、好ましくは水溶性ポリマー、たとえばPEG 、すなわちポリエチレングリコールのアミノ−オキシ誘導体である新規の改変試薬を提供する。本発明の試薬は、興味ある標的高分子に種々のポリマーを共有結合するために使用され得る。特に、生物学的に重要な高分子、たとえばポリペプチドの場合、本発明の重要な利点は、標的高分子が、その高分子の生物学的活性を実質的に減じないで水溶性ポリマーの結合により改変され得、又は前記生物学的活性よりも低い程度へのその生物学的活性の低下が、本発明の部位特異的作用性化合物以外の活性化されたポリマーを用いての、高分子（典型的には、ポリペプチドのためのリシン残基）に位置する複数の残基への前記同じ水溶性ポリマーの結合により減じられることである。用語“生物学的活性”とは、酵素活性、レセプター（抗体を包含する）への結合能力、リガンドを結合する能力、免疫応答を誘発する能力及び同様のことを包含する。 “相補的反応性官能基”とは、対の相補的メンバーと化学特異的に反応する一対の官能基の１つとして定義される。たとえば、アミノ−オキシ−アセチル（“ AoA”）及びグリオキシリル（“GXL”）は、オキシム結合を形成するために反応する相補的反応性官能基である。用語“化学選択的に連結”とは、相補的に直交する化学的反応性基間に生じる特異的連結を示す。本発明において使用される相補的官能基とは、存在する他の基、又は適用される他の化学を妥協しないで使用され得る基である。従って、本出願の情況における例によれば、“アミノ−オキシ−アセチル基が最とも好ましい官能基である。もちろん、標的ポリペプチドの複数の残基が本発明のポリマー上の官能基と特異的且つ相補的に反応する官能基を含むようにそれらの個々の残基が最初に改変される場合、官能化されたポリマーは適切に改変された標的分子への非部位特異的結合のために使用され得ることが明らかである。官能化されたポリマーは、オキシム連鎖を通しての共有接合により部位特異的に標的高分子に結合される。“共有接合された”又は“接合された”とは、官能化されたポリマーを通して標的へのポリマーの結合を意味する。“官能”又は“ 官能化された”とは、本発明のためには、ポリマーが相補的な官能化された標的高分子に部位特異的に接合され得るようにそのポリマー上へのオキシム−形成反応基の結合を説明する。一般的に、PEG 又はPOG（すなわち、ポリオキシエチル化されたグリセロール）分子は、末端ヒドロキシル基に反応性基を結合することによって活性化され又は官能化され、そして次に、官能化されたポリマーは、標的分子中に部位特異的に導入されているアルデヒド基に共有結合される。接合がタンパク質上のいづれかの反応性アミノ酸間で生じ、前記反応性アミノ酸が典型的にはリシンであり、そしてリシンがその遊離ε−アミノ基を通してPEG 又はPO G 上の反応性基に連結されている、接合の典型的な従来の方法に比べて、本発明の官能化されたポリマー試薬は、標的分子上の単一の予備選択された部位への安定したオキシム連鎖を通して部位特異的に結合されている。 “標的高分子”とは、本明細書で用いられる場合、少なくとも500、より好ましくは少なくとも2000、さらにより好ましくは少なくとも5000、最とも好ましくは少なくとも10,000の分子量を有する有機分子（生物起源の分子及び無機成分を含む有機分子を包含する）を意味する。“官能化された標的高分子”とは、オキシム−形成官能基を含むように部位特異的に改変されている標的高分子である。標的高分子は、天然源、組換え源又は合成源に由来することができる。用語“官能化された水溶性ポリマー試薬”とは、本明細書で用いられる場合、オキシム連鎖を通して標的高分子への水溶性ポリマーの部位特異的接合を提供する官能基を含むように改変された水溶性ポリマーを意味する。本発明の方法によれば、標的高分子は、ポリマー上に、好ましくはその末端の１つで（又は二官能ポリマーの場合、その両末端で）導入されるアミノ−オキシ又はアルデヒド官能基とのオキシム−形成反応性において相補的である官能基を含むように部位特異的に改変される。アミノ酸残基で、好ましくはＣ−又はＮ−末端でポリペプチドに部位特異的に結合され得る水溶性ポリマー試薬を供給することによって、タンパク質じゅうに位置するアミノ酸残基での複数のカップリングを通して悪影響を及ぼされるタンパク質の生物学的活性を実質的に悪影響を及ぼさないで、タンパク質に水溶性ポリマーを接合することが可能になる。本発明の“均質”ポリマー接合体組成物とは、実質的にすべての接合体分子が実質的に同一の化学構造（個々は、結合されたポリマーの分子量における範囲が存在するが、結合されたポリマーの同一の数及び位置を有する）を有する化学組成物を言及する。分子量範囲の平均とは典型的には、官能化のために本明細書で使用されるポリマーの市販の調製物に見出されるようなものであり；好ましくはその範囲は、市販の調製物のさらなるサイズ分別の後に得られるものである。これは、個々の分子が結合されたポリマーの位置及び数において少なくとも異なる典型的なポリマー接合体組成物と鋭い対比をもたらす。本発明の組成物はまた、ポリマー接合体中の個々の分子の実質的にすべてがお互い実質的に同一であるような“自己一同一性”組成物としても言及され得る。ここで、“実質的にすべて ”とは、個々の結合されたポリマーは同じサイズのものではないが、それらのすべては結合されたポリマーの同じ位置及び数を有する合計の接合体分子の少なくとも80％を意味する。純度の程度の上昇、たとえば90％，95％，98 ％，99％，99.5％，99.8％、等からはるかな100％までの純度の上昇は、“実質的にすべて”のますますの好ましい意味である。本発明の観点から容易に理解されるであろうように、均質ポリマー接合体組成物は、ホモ−又はヘテロ−ポリマーから構成され得、ここでヘテロ−ポリマーとは、本明細書で定義される場合、結合されるポリマーの化学タイプ又はMW（平均）の相異を意味し、前記ポリマーの個々はその分子量平均で存在することができる。本出願の残りで論議されるように、ヘテロ二又はヘテロ多−ポリマー官能化 −ポリマーが標的分子に結合される場合、その単一の部位で結合されるポリマー分子のすべては同一ではないが、それにもかかわらず、その組成物は本明細書で定義されるように均質であり得る。本発明の１つの態様において、オキシム連鎖を通して、官能化された相補的標的高分子、たとえばポリペプチドにポリマーを結合するために有用な化合物の式は下記の通りである：Ｐ−Ｘ−Ｏ−NH₂ 〔ここで、Ｐは有機ポリマー、好ましくは水溶性ポリマーを表わし、Ｘはスペーサー基を表わし、−Ｏ−NH₂はアミノ−オキシを表わす〕。興味ある水溶性有機ポリマーは好ましくは、官能化のための便利な部位である、ポリマー主鎖に付加されるヒドロキシ基を有し、そして次の既知の水溶性ポリマーから選択され得る（但し、それらだけには限定されない）：（ａ）デキストラン及びデキストラン誘導体、たとえばデキストランスルフェート、Ｐ−アミノ架橋されたデキストリン及びカルボキシメチルデキストリン、（ｂ）セルロース及びセルロース誘導体、たとえばメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロース、（ｃ）スターチ及びデキストリン、並びにスターチの誘導体及び加水分解物、（ｄ）ポリアルキレングリコール及びそれらの誘導体、たとえばポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ここで前記ホモポリマー及びコポリマーは非置換性であり、又はアルキル基により一端で置換され得、（ｅ）ヘパリン及びヘパリンのフラグメント、（ｆ）ポリビニルアルコール及びポリビニルエチルエーテル、（ｇ）ポリビニルピロリドン、（ｈ）α，β−ポリ〔（２−ヒドロキシエチル）−DL−アスパラギン酸アミド〕、（ｉ）ポリオキシエチル化されたポリオール、及び（ｊ）ポリヌクレオチド、たとえばデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びそれらのリン酸−主鎖−改変誘導体、たとえばホスホロチオエート誘導体。好ましいポリヌクレオチドは、生物学的に重要なポリペプチドに対して相同の、好ましくはウィルス又は哺乳類起源のオリゴヌクレオチドであり、そしてアンチセンス配列を含むことができる。水溶性ポリマー試薬は、ポリプロピレングリコール（“PPG”）、ポリオキシエチル化されたポリオール（“POP”）、ヘパリン、ヘパリンフラグメント、デキストラン、多糖類、ポリアミノ酸、たとえばプロリン、ポリビニルアルコール（“PVA”）、及び他の水溶性有機ポリマーを包含するが、但しこれらだけには限定されない。本発明の水溶性ポリマー試薬は、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー（ここで前記ホモポリマー及びコポリマーは非置換性であり、又はアルキル基により一端で置換される）、ポリオキシエチル化されたポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチルエーテル、及びα，β−ポリ〔（２− ヒドロキシエチル）−DL−アスパラギン酸アミド〕；並びに他の水溶性有機ポリマーのアミノ−オキシ誘導体を包含する。アメリカ特許第 4,179,337号；第 4,6 09,546号；第 4,261,973号；第 4,055,635号；第 3,960,830号；第 4,415,665号；第 4,412,989号；第 4,002,531号；第 4,414,147号；第 3,788,948号；第 4,7 32,863号；第 4,745,180号；ヨーロッパ特許第 152,847号；ヨーロッパ特許第98 ,110号（1984年１月11日に公開された）；日本特許第 5,792,435号は、本発明に従って官能化され得る種々のポリマーを記載しており、そしてそれらは引用により本明細書に組込まれる。好ましくは、水溶性ポリマーＰは、デキストラン及びデキストラン誘導体、デキストリン及びデキストリン誘導体、ポリエチレングリコール及びその誘導体から選択される。最とも好ましくは、水溶性ポリマーＰは、ポリエチレングリコール及びその誘導体類から選択され、ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルが特に好ましい（タンパク質間の架橋を回避するために）。ポリオキシエチル化された水溶性ポリオールはまた、本発明において有用である。それらは、ポリオキシエチル化されたソルビトール、ポリオキシエチル化されたグルコース、ポリオキシエチル化されたグリセロール（“POG”）、等を包含する。POGが好ましい。ポリオキシエチル化されたグリセロールのグリセロール主鎖は、たとえば動物及びヒトにおいて、モノ−、ジ−、トリ−グリセリドとして天然に存在するのと同じ主鎖である。従って、この枝分れは、身体において外来性物質として必ずしも見出されない。POG は、PEG と同じ範囲での好ましい分子量を有する。POG についての構造は、Knauf など．(1988)J．Biol．Che m．263：15064-15070 に示されており、そして一般的には、本明細書に記載される式においてPEG 又はその誘導体を置換することができる。本発明の水溶性ポリマー試薬により改変されたポリペプチドが医薬として使用される場合、ポリマーＰは非毒性及び好ましくは非免疫原性であるべきである。ポリマーＰは種々の量の複数の反復単位を含むので、Ｐの分子量は相当に変化することが理解されるであろう。さらに、Ｐが一定の分子量を有すると言われる場合、その分子量は単に近似値であり、分子に存在するサブユニットの数に関してお互いに対して異なる分子Ｐの集団の平均分子量を表わしている。一般的に、Ｐは約 200〜200,000、好ましくは約 400〜50,000、より好ましくは 1,000〜60, 000、さらにより好ましくは 2,000〜40,000の範囲での分子量を有するであろう。Ｐについての適切な分子量は、官能化されたポリマーがポリペプチドに結合される場合、改変される特定のタンパク質及び改変の目的に従って変化するであろう。スペーサー基Ｘは任意に存在する。本発明は、オキシム−連鎖を形成できる相補的反応性基がアミノ−オキシ基である官能化されたポリマーを供給する。好ましいものは、アミノ−オキシ−アセチル（“AoA”）である。事実、興味あるポリマーにアミノ−オキシ基を連結する追加の構造体（Ｘ又はスペーサー基）が使用され得る。スペーサー基Ｘは、置換された、又は置換されていない、枝分れ又は直鎖状の脂肪族又は芳香族基、たとえばフェニル又はＣ₁−Ｃ₁₀アルキレン成分、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル基、又はそれらの組合せ、又はアミノ酸鎖（たとえば柔軟なヒンジ又はループ配列（たとえば、Argos，J．Mol．Biol．（1990）211：94 3-958を参照のこと）、又は核酸鎖又は糖鎖又は脂質鎖、又はそれらの組合せを含んで成る非反応性基を表わし、そしてヘテロ原子を含むことができる。Ｐ−Ｘ −ONH₂の好ましい態様において、Ｘは−CH₂−又は−CHOH−、又はより好ましくは−CO−CH₂−又は−NH−CO−CH₂−を含んで成る。たとえば、下記例１において、Ｘは、AoA-MPEG：CH₃−Ｏ−（CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂−NH−CO−CH₂− Ｏ−NH₂において−NH−CO−CH₂−である。アミノ−オキシ基が追加の連結構造体に存在する官能化されたポリマー基上に存在する場合、そのアミノ−オキシ官能基に隣接するスペーサー基は臨界ではなく；しかしながら、それらのスペーサー基の必要条件は、それらがアミノ−オキシ基とその相補的アルデヒド基との間でのオキシム連鎖の形成を妨害しないことである。それらは、アミノ−オキシ基に優先してアルデヒド基と反応すべきではなく、又はその反応に立体的な妨害も付与せず、又は反応性基を不活性化もすべきでない。接合されたポリマーが抗原又は免疫原目的のために使用される場合、それら自体、強い免疫原性でないスペーサー基が選択されることは当業者に明らかであろう。接合されたポリマーが結合目的のために使用される場合、好ましいスペーサー基は、結合、結合活性、生成物の安定性又は溶解性のような性質を増強し、又はそのような性質を少なくとも妨害しない。スペーサー基Ｘは、オキシム連鎖の加水分解安定性を増強するように選択され得る。オキシムの加水分解安定性は、それらの構造により影響され；データは、オキシム安定性が次のような順序で上昇することを示す：−CO−NH−CH₂−CH＝Ｎ−Ｏ−CH₂−≦−CO−NH−CH₂−Ｃ（Ｒ）＝Ｎ−Ｏ−CH₂−＜−NH−CO−CH＝Ｎ −Ｏ−CH₂−＜−C₆H₄−CH＝Ｎ−Ｏ−CH₂−。高められたオキシム安定性は、Ｘにおける芳香族基の存在により得られる。本発明のさらなる態様においては、官能化されたポリマーは二官能であり、すなわち２つのオキシム−形成基を有するであろう。それらの基は反応性においてお互いに対して相補的ではない。好ましくは、２つの基は、ポリマー上の遠位の非妨害（オキシム結合を形成する能力をお互い有する）部位で、より好ましくは個々の末端で存在する。たとえば、ジヒドロキシポリアルキレングリコールは、その個々の末端でアミノ− オキシオキシム形成基を有するポリマーを得るために本明細書に教授されるように官能化される。ビス−アミノオキシポリマーは、本発明の部位特異的に官能化された標的高分子と反応せしめられ、“ダンベル”構造が得られ、ここでオキシム連鎖を通してのポリマーが第１の官能化された標的高分子及び好ましくは、第１のものと同一の第２の官能化された標的高分子を、それらの部位特異的オキシム−形成基の個々を通して連結するように作用する。前記第１及び第２の高分子が異なる場合、ヘテロ−ダイマーが形成され得る。ヘテロ−ダイマーは、たとえば、第１及び第２の官能化された高分子の連続的反応により（たとえば、２種のポリマー反応性基の１つのみが第１の標的高分子に連結されているポリマー接合体を単離する中間段階により）、又は同じモル比で存在する第１及び第２の官能化された高分子の混合物とポリマーとの一回の反応により形成され得る。本発明のダンベル構造体及びその組成物は、部位特異的に連結される標的高分子、好ましくは生物学的に重要なポリペプチドを有し、従って、従来のポリマー接合法に比較して、定義された構造及び均質の組成の構造体を提供する。二官能ポリマーの好ましい態様は、２つのアミノ−オキシアセチル(AoA)基を含む。特に好ましいものは、AoA−PEG −AoA（ここでPEG 又はその誘導体はポリマー成分を含む）である。本発明のさらなる態様においては、アミノ−オキシ基の酸素原子が硫黄原子により置換され得、この場合、標的高分子上のアルデヒド又はケトン官能基による化学選択性連結がチオ−オキシム結合−Ｃ（Ｒ）＝Ｎ−Ｓ−を生成する。本発明のもう１つの態様においては、二及び多−ポリマー含有の官能化されたポリマーが提供される。それらの態様の官能化されたポリマーは、下記一般式：（Ｐ）_m Ｌ−Ｘ−Ｏ−NH₂又は（Ｐ）_m Ｌ−Ｘ−Ｃ（Ｒ）Ｏ〔式中、Ｐは本明細書で定義されたような有機ポリマーであり、ｍは２〜10、より好ましくは２〜５の整数であり、Ｘは本明細書で定義されたようなスペーサー基であり、−Ｏ− NH₂はアミノ−オキシであり、−Ｃ（Ｒ）Ｏは、Ｒが水素である場合、アルデヒドであり、そしてＬは、個々のＰ（ｍの数）が別々に及び共有的に結合されている多価結合基であり、そしてそのＬの原子価は少なくともｍ＋１である〕を有する。−Ｃ（Ｒ）Ｏがケトンである場合、Ｒは好ましくはＣ₁〜Ｃ₁₀、より好ましくはＣ₁〜Ｃ₄の直鎖又は枝分れアルキル基である。アルデヒド又はケトン官能化ポリマーにおいて、そのアルデヒド又はケトン官能基に隣接するＸスペーサーに存在する基は臨界ではなく；しかしながら、それらの基の必要条件は、アルデヒドとその相捕的なアミノ−オキシ基との間でのオキシム連鎖の形成を妨害しないことである。それらはアルデヒド基に優先してアミノ−オキシと反応すべきでなく、反応に対して立体的な妨害を付与せず、又は反応性基を不活性化すべきでない。結合基は存在する他の官能基と反応しないが、しかしそのようにするように企画される場合、所望しない手段（すなわち、生成物の均質性又は活性を減じる手段）でそのようにすべきでない。スペーサー基は好ましくは、置換された又は置換されていない脂肪族又は芳香族基、たとえばフェニル又はＣ₁−Ｃ₁₀アルキレン成分、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル基、又はそれらの組合せ、又はアミノ酸鎖（たとえば柔軟なヒンジ又はループ配列（たとえばArgos，J．Mol．Biol．(1990)211： 943-958を参照のこと）、又はヌクレオチド鎖又は糖鎖、又は脂質鎖又はそれらの組合せを含んで成る非反応性基を表わし、そしてヘテロ原子を含むことができる。好ましくは、オキシム−形成基が−Ｘ−Ｃ（Ｒ）Ｏを含んで成る場合、ＸはCH₂−，−CO−、又は−CHOH、より好ましくは−C₆H₄−を含んで成るスペーサー基である。アルデヒド、及び OHC−CO−又はグリオキシリル（“GXL”）を含んで成るスペーサーがまた好ましい。本発明のさらなる態様において、アミノ−オキシ基の酸素原子は硫黄原子により置換され得、この場合、アルデヒド又はケトン官能基との反応がチオ−オキシム結合−Ｃ（Ｒ）＝Ｎ−Ｓ−を生成する。本発明の二及び多−ポリマー官能化ポリマーの場合、標的高分子への官能化されたポリマーの部位特異的接合が、多価Ｌ構造体に結合される−Ｏ−NH₂又は−C HO 基を経て単一のオキシム連鎖を通して複数のポリマーの部位特異的結合をもたらす。アミノ−オキシ−官能化ポリマーは、標的高分子上にアルデヒド（又はケト）官能基を導入するために利用できる方法及び本明細書に教授される方法のために、アルデヒド態様よりも一部好ましい。従って、二又は多−ポリマー含有の官能化されたポリマーは、同じか又は異なった、好ましくは同じ複数のポリマーの、標的高分子上への単一の予備選択された部位への結合を可能にする。Ｌが三価の基である場合、ｎは２である（本明細書における例２又は１０を参照のこと）。好ましくは、Ｌの原子価はｍ＋１であり、ここでＬの１つの原子価がＸを通して任意にオキシム−形成基により占領され、そしてＬの残る原子価は１又は複数の、すなわちｍ個のポリマーにより占領される。Ｌの構造は臨界ではなく、Ｌが続くオキシム反応に対して立体的な妨害を与えない限りポリマーにＬを連結する連鎖は存在せず、又は反応性基を不活性化もしない。Ｌは存在する他の官能基と反応しない。官能化されたポリマーにおける結合基Ｌの個々のアーム又は原子価は好ましくは、置換された又は置換されていない脂肪族又は芳香族基、たとえばフェニル又はＣ₁−Ｃ₁₀アルキレン成分、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル基、又はそれらの組合せ、又はアミノ酸鎖（たとえば柔軟なヒンジ又はループ配列（たとえばArgos,J．Mol．Biol．（1990）211：943-958を参照のこと）、又はヌクレオチド鎖又は糖鎖、又は脂質鎖又はそれらの組合せを含んで成る非反応性基を含んで成り、そしてヘテロ原子を含むことができる。ポリマーとの接合の前、好ましくは、Ｌの１つのアーム又は原子価を除くすべては、ポリマー上の、好ましくはポリマーの末端に位置する基と特異的に反応することができる官能基を含む。残る原子価は、オキシム−形成官能価（前記官能価は所望には、保護解除できる状態で存在する）を提供する化合物との後での反応のために保護されており、又は他方では、前記化合物により占領されている。ポリマー接合体が抗原性又は免疫原性の目的のために使用される場合、それ自体、強い免疫原性でないリンカー基が選択されることは当業者に明らかである。ポリマー接合体が結合目的のために使用される場合、好ましいリンカー基は、結合、結合活性、生成物安定性又は溶解性のような性質を増強し、又はそれらの性質を少なくとも妨害しない。結合構造体は、本発明の相補的な官能化されたポリマーとのオキシム形成を通しての類似するアセンブリーが（Ｐ）_mＬ−構造体をアセンブルするために使用されるよう、オキシム形成基により占領される原子価をそれ自体含むことができる。従って、同時継続のアメリカ特許出願08/057,594号、08/114,877号及び 08/057,594号及び同時継続の国際出願PCT/IB94/00093（これらは引用により本明細書に組込まれる）に記載される基本的な構造体が、Ｌ構造体としての使用のために適切である。前記基本的構造体のオキシム−形成基は、他の相補的な反応性基により置換され得るが；しかしながら、最とも好ましくは、オキシム形成がアセンブリーのために使用される。非オキシム化学が（Ｐ）_m Ｌ−アセンブリのために使用される例に関しては、本明細書中の例４を参照のこと、ここでＬは、共有結合されたポリマーを含む個々のリシル残基を有するペンタリシルペプチド（ここで、ｍは５である）であり、そしてそのペプチドＮ−末端はオキシム−形成基を含む。好ましいＬ構造体は、トリ−アミン化合物に由来し、ここでいづれか２つのアミノ基がポリマーへの結合のためにそれぞれ利用でき、そして残るアミノ基はオキシム−形成基の導入のために利用できる。好ましいトリ−アミンは式Ｎ(Ｒ５−NH₂)₃の化合物であり、ここでいづれか２つのアミノ基（−NH₂）がポリマーへの結合のために利用でき、そして残るアミノ基はオキシム−形成基の導入のために利用でき、そしてR5は置換された又は置換されていない脂肪族又は芳香族基、たとえばフェニル又はＣ₁ −Ｃ₁₀アルキレン成分、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル基、又はそれらの組合せ、又はアミノ酸鎖（たとえば柔軟なヒンジ又はループ配列（たとえばArgos，J．Mol．Biol ．（1990）211：943-958を参照のこと）、又はヌクレオチド鎖又は糖鎖、又は脂質鎖又はそれらの組合せを含んで成る非反応性基を表わし、そしてヘテロ原子を含むことができる。Ｒ５は好ましくは、−CH₂−CH₂−である。３個の第一アミノ基は好ましくは、窒素原子から遠位に存在する。最とも好ましくは、トリ−アミン化合物は、トリス−（２−アミノエチル）アミンである。本明細書に教授されるように、高い柔軟性が、ポリマーの結合のための特異的に配置された相補的反応性基を有する、所望する配列、構造、原子価及び官能価のＬ−構造体を企画し、そして得るために利用できる。本発明者の実験室において開発され、そしてＬ−構造体の合成のために適切な追加の方法及び化合物は、 Rose（J．Ame r．Chem．Soc．“Facile synthesis of artificial proteins”（1994）116：30 -33；引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。本明細書に論ぜられるように、本発明の二及び多−ポリマー官能化ポリマーは、好ましくは、標的高分子の特に所望する性質を改変する、その高分子のストークス半径を組織的に改変することに特に使用される。医療的に重要なポリペプチドの場合、好ましくは、その薬物運動学的挙動性及び究極性には、その治療効能の組織的な改変を可能にするストークス半径が組織的に改変され得る。本発明の好ましい態様において、官能化されたポリマーは、ポリマー主鎖としてPEG 又はその誘導体を含む。１つの態様において、官能化されたポリマーは、 PEG 又はその誘導体を含み、そして下記構造：Ｒ１−Ｏ（Ｒ２−Ｏ）_n Ｒ２−Ｒ３を有する、−官能価又は二官能価ポリマーであり、ここで前記構造において、ｎは５〜2,000の整数であり、Ｒ２は直鎖、枝分れ、置換された又は置換されていない低級アルキル基であり、そして（ａ）Ｒ１及びＲ３の１つはアミノ−オキシオキシム−形成基及び任意のスペーサー基を含んで成り、そしてＲ１及びＲ３の他の１つは水素、−CH₃又は保護基であり、又は（ｂ）Ｒ１及びＲ３の両者はアミノ−オキシオキシム−形成基及び任意のスペーサー基を含んで成る。ポリマーにおける個々の反復単位のＲ２は独立して、お互い同じか又は異なっている。７により定義される反復単位の数は、２〜2,000、好ましくは10〜1,000、及びより好ましくは50〜800である。従って、ポリマーは、約 200〜100,000 、好ましくは約 400〜50,000及びより好ましくは約 2,000〜40,000の平均分子量を有する。典型的には、出発PEG の分子量（平均）は、市販源（但し、これらだけには限定されない）から入手できるものであり、そして5,000，10,00 0 及び20,000から成る群を包含する。Ｒ１又はＲ３は、標的の第２有機高分子上の相補的アルデヒド又はケトン官能基と共にオキシム連鎖を形成することができる官能アミノ−オキシ基を含む。そのオキシム−形成基は、−Ｏ−NH₂ を含んで成る。好ましくは、オキシム−形成基は、−Ｘ−Ｏ−NH₂（ここで、Ｘは本明細書に定義されるスペーサー基である）を含んで成る。好ましくは、オキシム−形成基が−Ｘ−Ｏ−NH₂を含んで成る場合、Ｘは−NH−CO−Ｒ４−を含んで成るスペーサー基であり、ここでＲ４は直鎖状、枝分れ又は環状低級アルキル（置換された又は置換されていない）、好ましくはCH₂であり、そしてＲ４は−Ｏ−NH₂に直接結合される。保護基は、本発明の官能化法のポリマー又は本発明の標的高分子に対して非反応性である。好ましくは、保護基は、１〜10個の炭素原子を有し、より好ましくは、それはアルキル基であり、最とも好ましくは、それはメチルである。官能化の前、好ましくはPEGの少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは末端ヒドロキシ基である。それは、標的高分子上に部位特異的に導入される相補的反応性基を共にオキシム連鎖を部位特異的に形成することができる官能基を導入するために、好ましくは活性化される（官能化される）ヒドロキシ基である。“低級アルキル”基とは、Ｃ１〜ＣI0、好ましくは、Ｃ２〜Ｃ４のアルキル基を意味する。本発明のもう１つの好ましい態様においては、PEG 又はその誘導体を含む、二及び多−ポリマー含有官能化ポリマーが供給される。それらの態様は、上記で論ぜられたような二及び多−ポリマー官能化ポリマーであるが、しかしここでは、複数のPEG ポリマーが連結構造体への個々の結合を通して単一のオキシム形成基に結合されている。本発明の二及び多−PEG 官能化ポリマーは、医療的に重要なポリペプチドの場合、好ましくは、薬物動力学的挙動性及び究極的には、その治療効能の組織的な改変を可能にするポリペプチドのストークス半径を組織的に改変することに特に使用される。より特定には、本発明は官能化されたPEG 及びデキストラン、すなわち一官能価 MPEG-NH-CO-CH2-O-NH₂、デキストラン-O-CH(CHOH-CH₂OH)-(CHOH)₂-CH₂-NH-(C H₂)₂-NH-CO-CH₂-ONH₂、デキストラン-O-CH(CHOH-CH₂OH)-(CHOH)₂-CH₂-NH-(CH₂)₂ -NH-CO-C₆H₄-CHO、二官能価 NH₂-O-CH₂-CO-NH-PEG-NH-CO-CH₂-O-NH₂、及び多−P EG 化された(PEG)₂Lys-NH-(CH₂)₂-NH-CO-CH₂-O-NH₂，HO-((PEG)Lys)₅-NH-CO-CH₂ -O-NH₂、及び(PEG-アミノエチル)₂-N-(CH₂)₂-NH-CO-CH₂-O-NH₂の調製及び使用に関する。本発明の好ましい態様においては、本明細書に教授されるように、ポリマー主鎖としてデキストラン又はその誘導体を含む官能化されたポリマーが供給される。もう１つの好ましい態様においては、官能化されたポリマーは、デキストラン又はその誘導体を含む一官能価又は二官能価ポリマーである。さらにもう１つの好ましい態様においては、本明細書に教授されるように、デキストラン又はその誘導体を含む二及び多−ポリマー官能化ポリマーが供給される。それらの態様は上記で論ぜられたような二及び多−ポリマー官能化ポリマーであるが、しかしここで、複数のデキストランポリマーが、連結構造体への個々の結合を通して単一のオキシム形成基に結合されている。本発明のもう１つの態様においては、本発明の官能化されたポリマーを生成するための方法が提供される。一般的な場合、少なくとも１つの、好ましくは末端の反応性基を有する上記のようなポリマーが、オキシム−形成基を含むようにその反応性基で改変される。多くの改変化学のいづれでも、ポリマー上に利用できる反応性基に依存して使用され得る。たとえば、PEG 又はその誘導体の好ましい場合、末端ヒドロキシル基が利用できる。１以上の反応性基が存在すべきであり、すなわち１つの反応性基を除く他のすべて（又は二官能価ポリマーが所望される場合、２つの反応性基を除く他のすベて）が、反応から保護されているポリマーの形が出発材料として使用され得る。オキシム−形成基への改変は、便利な場合、連続的段階で生じ得る。たとえば、ポリマー上の反応性基が、保護されたアミノ−オキシ −含有化合物、たとえば Boc−NH−Ｏ−CH２−COOSuにより容易にアシル化されるもう１つの反応性基に転換され得る。次に、アミノ−オキシ基は、使用の前又は貯蔵の前、保護され得る。アシル化剤に対するほとんどの反応性基は−NH₂である。好ましいPEG 中間体は、CH３−Ｏ−（CH２−CH２−Ｏ）_n−CH２−CH２−N H₂であり、又は二官能価ポリマーが所望される場合、H2N−（CH２−CH２−Ｏ）_n −CH２−CH２−NH₂である。MPEGは、カルボキシメチル化の段階によりCH３−Ｏ −（CH２−CH２−Ｏ）_n−CH２−COOHに容易に転換され得る（Royer and Anantha nmaiah（1979）J．Am．Chem．Soc．101：3394-3396）。上記中間体 PEG-NH₂化合物を用いて、オキシム−形成基が、BOC−NH−Ｏ−CH ２−COOSu によるアシル化により個々のアミノ官能基で導入される。例１に示されるように、PEG−NH₂は、すでに記載されている方法（Zalipskyなど.，(1983) ，Eur．Polym．J.，19,1177-1183）に従って、次の一連の反応 PEG−OH→ PEG− Ｃ１→ PEG→Ｎ₃→ PEG−NH₂を通して調製された。もう１つの態様において、二及び多−ポリマー官能化ポリマーは、所望する多価の、通常、保護された一価のＬ構造体をまず獲得し、そして次に、当業界において知られている連結化学を用いて適切に活性化されたポリマー中間体、又はオキシム化学を通しての本発明の官能化されたポリマーと前記保護されたＬ−構造体とを反応せしめることによって合成される。二又は多−ポリマー生成物の単離の後、生成物は、Ｌの保護された残る原子価の保護解除、続く反応、たとえば、アミノ基の場合、適切に保護された−アミノ−オキシ又は保護された−アルデヒド含有アシル化基によるアシル化により、本発明に従って官能化される。オキシム−形成官能基の保護解除の後、最終生成物、すなわち二又は多−ポリマー官能化ポリマーが得られる。他方では、Ｌはまず、適切に保護された−アミノ−オキシ又は保護された−アルデヒド含有基により誘導体化され、一置換された誘導体が単離され、次に、一置換されたＬ誘導体が、ポリマー中間体（たとえば、ＬがNH₂を含む場合、COOH 、又はＬがCOOHを含む場合、NH₂基を有する中間体）、又は本発明の官能化されたポリマー（Ｐ〜Ｌをアセンブルするためにオキシム化学が使用される場合）と、個々の残存する原子価で反応せしめられる。たとえば、Ｌ−構造体上の遊離アミノ基と反応することができるMPEG−COOH中間体ポリマーが供給される。カップリングは、HOBt及びDCC の存在下で、又はMPEG−COOHのスクシンイミジル誘導体が前もって調製されている場合、それらの試薬の不在下で起こるであろう。オキシム−形成官能基の保護解除の後、最終生成物、すなわち二及び多−ポリマー官能化ポリマーが得られる。Ｌ基がアミノ酸から形成される場合、Ｌ構造体のペプチド配列は通常の固相ペプチド合成（“SPPS”）により合成され、そしてペプチドが固相にまだ結合されている間、活性化された形での PEG−COOH、たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが新生ペプチド鎖に付加され得る。たとえば、Ｌ構造体は、６個の反応性基、たとえば５個のリシン残基及びＮ−末端アミン基を有するペプチドから成ることができる。PEG−COOSu ヒドロキシスクシンイミドエステルは、リシン残基の個々のε−アミノ基を反応することができる（Ｎ−末端α−アミノ基が保護されたまま存続する間）。次に、十分にアシル化されたペプチドのＮ−末端アミン基は保護解除され、そしてポリマー含有構造体が Boc−AoA −含有活性エステルと反応せしめられ、Boc の除去及び樹脂からの緩和切断の後、本発明のペンタ−ポリマー含有官能化ポリマーを生成するAoA 基が導入される。この方法が合成構造体（及びたぶん、一定の組換え生成物）に関して特に使用されることは注目すべきである。なぜならば、それらの構造体はその工程の間、保護を必要とする追加の残基、たとえばアミノ酸残基を排除するように企画され得るからである。他方、活性化された形での Boc−Ser(ベンジル)−OH又は Boc−Ser(ｔ−ブチル)−OH、たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルがリシン残基のε −アミノ酸に結合され得る。次に、Ｎ−末端α−アミノ基が保護解除され、アミノ−オキシ基、たとえばAoA が導入され、その結果、Boc 除去の後、ε−Ser− ペンタリシンを含む前駆体Ｌ構造体が得られる。緩和酸化剤、たとえばpH７での過ヨウ素酸による、タンパク質に接合される前駆体Ｌ構造体の処理は、ε−Ser −ペンタリシンをε−GXL −ペンタリシンに転換し、従って、ペンタ−GXL Ｌ構造体を生成し、これは次に、本発明のアミノ−オキシ官能化ポリマーと反応せしめられ得る。酸化反応は、１，２結合の囲いで比較的自由な回転を有するいづれかの１，２−ジオール又は１−アミノ−２−オール又は１−オール−２−アミノ化合物、たとえばエチレングリコールを用いて終結され得る。他方、酸化反応は過ヨウ素酸の急速な除去により、たとえば逆相高性能液体クロマトグラフィー（ RP−HPLC）により終結せしめられ得る。酸化反応は第一アミノ基を含むセリン残基に関して単に生じるので、ε−セリン残基のみがグリオキシリルに転換される。当業者は、そのような保護が所望される場合、酸化からＮ−末端セリンを化学的に保護するための方法を知っている。次に、Ｎ−末端アミン基が保護解除され、そしてポリマー含有構造体が Boc−Ao A −含有エステルと反応せしめられ、Boc 除去の後、本発明のペンターポリマー官能化ポリマーを生成するAoA 基が導入される。生成物に対して緩和な条件下で続いて除去され得る、ペプチド合成に使用されるBOC 又は典型的なアミノ保護基が適切である（たとえば、Green and Wats（1991）“Protectine groups in org anic synthesis”，２nd ed.，Wiley，New York，NY を参照のこと）。官能化された標的高分子は、同時継続アメリカ特許出願08/057,594号、08/114 ,877号、08/057,594号、07/869,061号及び08/241,697号、及び同時継続国際特許出願PCT/IB94/00093（これらは引用により本明細書に組込まれる）に見出される方法を包含する、当業界において知られている方法を用いて、オキシム形成基を部位−特異的に導入するために企画され、そして調製され得る。標的高分子は、組換え法により得られ、又は天然源から単離され得、そしてオキシム形成相補的反応性基、アルデヒド又はアミノ−オキシ基が、その高分子の所望する位置で部位特異的に形成される。本発明の好ましい態様においては、ポリペプチド化合物、又はアミノ酸を含む化合物又は材料と部位特異的に反応性である官能化されたポリマーが調製され、前記ポリマーにおいては、アミノ酸はポリマー上に導入されるオキシム−形成官能基と特異的に反応するオキシム−形成基を得るために改変されている。好ましくは、ポリペプチドのＮ−末端又はＣ−末端残基は、本明細書に示される方法を用いて改変される。同時継続アメリカ特許出願08/114,877号（1993年８月31日に出願された）；08/105,904号（1994年５月12日に出願された）及びPCT/IB94/0093 号（1994年５月５日に出願された）（これらは、引用により本明細書に組込まれる）は、本発明の官能化されたポリマー化合物及び本明細書に教授されるような標的分子へのそれらの接合法を用いる、化学的及び酵素的手段による標的化合物、特にポリペプチドの部位特異的改変のための追加の方法を提供する。ポリペプチドの場合、オキシム形成基は、好ましくは、選択的酵素触媒された逆タンパク質加水分解によりペプチドのＣ−末端で、又は緩和酸化によりＮ−末端セリン又はトレオニンで導入される（たとえば、Geoghegan など．（Bioconju gate Chem．(1992)３：138-146）；Gaertnerなど．（Bioconjugate Chem．(1992 )３：262-268）；EP243929；及びWO90/02135（これらは、引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと）。組換え又は天然ペプチドは、それぞれ官能化され得る、ダイマー又はテトラマーに存在する複数のＣ−又はＮ−末端を有することができる。本発明の水溶性ポリマー試薬は、ポリマー上の官能基とオキシムを形成できる相補的官能基を含むように部位特異的に改変された種々のポリペプチド又は類似する分子を改変するために使用され得る。興味あるポリペプチドは次のものを包含する：抗体、モノクローナル及びポリクローナル抗体；サイトカイン、たとえばＭ−CSF ，GM−CSF ，Ｇ−CSF 、幹細胞増殖因子；リンホカイン、IL−２，IL −３、成長因子、たとえばPDGF，EGF ；ペプチドホルモン、たとえばhGH、エリトロポエチン；血液凝固因子、たとえば第VIII因子；免疫原；酵素；酵素インヒビター；リガンド及び同様のもの。水溶性ポリマーアミノ−オキシ又はアルデヒドによる水溶性ポリマー誘導体化のための興味あるポリペプチドは次のものを包含する：ホルモン、リンホカイン、サイトキン、成長因子、酵素、ワクチン抗原、及び抗体。エリトロポエチン(EPO)、特にヒトエリトロポエチンの水溶性ポリマー誘導体化が特に興味あるものである。興味あるポリペプチドは、それらの天然源、遺伝的に構築された細胞から単離され、又は種々のインビトロ合成法により生成され得る。次の特許出願（引用により本明細書に組込まれる）は、種々の生物学的に重要なタンパク質のPEG 化改変を報告している：アメリカ特許出願第 4 ,179,337号；第 4,609,546号；第 4,261,973号；第 4,055,635号；第 3,960,830 号；第 4,415,665号；第 4,412,989号；第 4,002,531号；第 4,414,147号；第 3 ,788,948号；第 4,732,863号；第 4,745,180号；ヨーロッパ特許第 152,847号； 1984年１月11日に公開されたヨーロッパ特許第98,110号；日本特許第 5,792,435 それらの非改変された状態でのタンパク質は、本明細書に教授されるように、部位特異的官能化及び続く部位特異的ポリマー接合のための標的高分子である。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（本明細書において交換可能的に使用される）は、天然に存在する形及び組換え形、並びに類似する生物又は化学活性の獲得を可能にするために天然に存在するペプチド又はタンパク質と十分に同一であるペプチド又はタンパク質の他の天然に存在しない形を意味する。当業界において知られているように、ペプチドは、天然に存在しないか又は非タンパク質原性アミノ酸残基から形成され得る。さらに、当業界において良く知られていないように、アミノ酸残基は非アミド連鎖を通して連結され得る。ペプチド又はタンパク質はまた、そのペプチド又はタンパク質のインビボ分解を妨ぎ又は最少にするいづれかの末端で保護基を含むことができる。本発明の水溶性ポリマー試薬はほとんどのポリペプチドを改変するために使用され得るが、（１）薬物としての使用のためのポリペプチド及び（２）アッセイへの使用のためのポリペプチドを改変することが特に興味あることである。アッセイへの使用のためのポリペプチドは、特異的結合タンパク質、特異的結合タンパク質により認識されるポリペプチド、及び酵素を包含する。特異的結合タンパク質とは、抗体、ホルモンレセプター、レクチン及び同様のものを意味する。用語“抗体”とは、天然のイムノグロブリン配列を有するポリクローナル及びモノクローナル抗体、合成抗体誘導体、及び同様のものを意味し；抗体は種々のラベル、螢光、放射能、酵素、ビオチン／アビジン又は同様のもののいづれかに連結するために改変され得る。合成抗体誘導体は、変更された結合特異性のために突然変異され、そして選択された天然の免疫グロブリン配列、遺伝子的に改変された細菌により生成された、典型的には一本鎖の種々の免疫グロブリン遺伝子由来のポリペプチド、改変された不変領域を含むように改変された抗体及び同様のものを包含し；抗体形成の原理に基づくそのような抗体誘導体のレビューは、Winter and Milstein，Nature ，349：293-299（1991）に提供される。抗体は、抗原の投与に応答して動物に形成され、そして前記抗原と特異的に組合され得る、グロブリンタイプの糖タンパク質である。抗体フラグメントは、それらの抗原又はハプテンと選択的に結合する能力を保持することができる。抗原又はハプテンと結合する能力は、抗原−結合アッセイにより決定される（たとえば、Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow and Lane，eds.，Co ld Spring Harbor，New York（1988）（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと）。そのような抗体フラグメントは、Fab，Fab’及び(Fab’)₂を包含するが、しかしこれらだけには限定されない。活性抗体は、動物から、又はハイブリッド動物（ハイブリドーマ）細胞系から単離されるものである。官能化されたポリマー上に存在するアルデヒド官能基又はアミノ−オキシ官能基に隣接する追加の連結構造体（スペーサー基）に存在する基を記載する本明細書における教授は、官能化された標的分子上に存在するいづれかのスペーサー基に適合する。本発明の１つの態様において、Ｃ−末端は、ポリペプチド又はタンパク質（たとえば抗体）におけるＣ−末端で特異的に、適切な反応性基により二官能価試薬を指図することができる酵素により、好ましくは改変される。ポリペプチド鎖のカルボキシル末端は、少なくとも一次構造体によれば、ほとんどの場合、タンパク質の活性部位から遠く離れている。本発明のもう１つの態様において、適切な反応性基を有する特定の二官能価試薬がポリペプチド分子の非カルボキシ末端部位で好ましくは又は特異的に反応する事実が利用される。最とも好ましい態様においては、アミノ末端基は、ペプチド上のＮ−末端部位を活性化する反応の後の部位特異的標的である。好ましい反応においては、Ｎ−末端セリン（“Ser”）及びトレオニン（“Thr”）残基が、ひじょうに緩和な反応下で、過ヨウ素酸により酸化される（たとえば、20℃、26μＭのタンパク質、10mMのイミダゾール緩衝液pH6.95，２倍過剰の過ヨウ素酸、５分間）。Ｎ−末端のSer は、他のタンパク質基よりも約1000倍早く反応し(Field and Dixon，（1968）Biochem．J．108 ：883)、その結果、高い程度の特異性が得られる。より高い一般化のためには、Ｎ−末端のSer 又はThr は、組換えDNA 技法により、又は適切な場合、天然のSe r 又はThr Ｎ−末端を有する興味あるタンパク質源を選択することにより、又は Ser 又はThr を暴露するために非必須の末端アミノ酸のアミノペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、又はプロリン特異的エンドペプチダーゼによる酵素切断により導入され得る。第２の好ましい反応は、好ましくはグリオキシレートとの反応によりタンパク質のＮ−末端残基を活性カルボニル官能基に転換するためにアミノ基転移の使用である。この反応は比較的緩和な条件下で進行する（たとえば、Dixon and Fields，(1979)Methods in Enzymology，25：409-419を参照のこと）。広範囲の種類のＮ−末端残基がアミノ基転移され得る。前述の文献（Methods in Enz ymol.，25：409-419)に言及されるタンパク質のアラニン、アスパラギン、グルタミン酸及びフェニルアラニンの他に、メチオニンは、例８に記載されるように、Antrilの特定の場合、アミノ基転移された、それらの技法により生成されるポリペプチジルＮ−末端脂肪族アルデヒド又はケトンが、好ましくはアミノ−オキシ−アセチル基により官能化されたポリマーと反応せしめられ得る。保護されたアミノオキシアセチル基は、ダンベルの構成のためにメトキシポリエチレングリコール（例１）又はデキストラン（例５）によくあるようにユニークアミノ基により、又はH₂N−PEG−NH₂（例２）によくあるように２つのアミノ基によりすでに官能化されたポリマーに、又は単一の部位でタンパク質に接合される多枝分れ構造体を合するために（例３，４，10）、多官能化されたリンカーに直接的に結合された。記載された構造体は次のものである： (PEG-CONH-(CH₂)₂)₂-N-(CH₂)₂-NHCO-CH₂-O-NH₂ PEGLys(PEG)-NH-(CH₂)₂-NHCO-CH₂-O-NH₂ H₂N-O-CH₂-CO-(Lys(PEG))₅。小さな二価のアミノオキシタグはまた、タンパク質に単一の部位で部位特異的に結合され得るので（例14）、接合されるべきポリマーは、たとえばアミノ官能化されたPEG とカルボキシ（ベンズアルデヒド）OSu とを反応せしめることによって得られる、例12に記載されるような、相補的アルデヒド官能基、たとえば P EG−Ｏ−CH₂−CHO 又は PEG−NHCO−C₆H₄−CHO により官能化されるべきである。同じ手段で、ポリアミノオキシタグは、(H₂N−OCH₂CONH(CH₂)₂)₃N 及び PEG− CHOにより、例18に示されるように、単一部位で導入され、マルチアーム−接合体が得られる。好ましい態様ではないが、部位特異的標的は、ポリペプチドの側鎖基、すなわち単一のコピーで存在し、又は他方では、選択的に利用でき、そして改変に対して敏感な、必ずしも必要ではないが非末端の、好ましくはアミノ酸残基である。他方、ユニークな残基が、組換え法により導入され得る。側鎖基は、官能化されたポリマー上の相補的反応性基（たとえばAoA 又はアルデヒド）と続いて特異的に反応するであろう反応性基を適切な位置に配置するために、本明細書に教授される方法を用いて改変され得る。本発明のもう１つの態様においては、標的高分子、特にポリペプチドは、その末端以外の位置で部位特異的に改変される。翻訳の間、配列に導入されるアミノ酸の欠失、付加又は変更による一次構造自体への改変が、タンパク質の活性を破壊しないで行なわれ得る。“ムテイン”として知られているそのような改変されたタンパク質を製造するための方法は、1985年５月21日に公開されたアメリカ特許第 4,518,584号及び1985年６月21日に公開されたアメリカ特許第 4,752,585号に記載されており（これらは、引用により本明細書に組込まれる）、そして当業界において良く知られている（Current Protocols in Molecular Biology，ed. ，Ausubel(1994)，Greene Pub．Associates and Wiley-Interscience，J．Wiley ，New York，NY；これらは引用により本明細書に組込まれる）。たとえば、生物学的活性に必須ではなく、そして生物学的活性のタンパク質に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基が、本発明の官能化された標的高分子を製造するために、続く部位特異的改変を受けるもう１つのアミノ酸により置換され得る。ヒドラジド基により官能化されたポリマーはまた、ヒドラゾン連鎖を形成するために、特異的に導入されたアルデヒド又はケト基と反応することができる。この結合は、特に酸性条件下で、オキシム結合よりも低い安定性であることが知られているが、それは、タンパク質がインビボで後で開放されるべきであるいくつかの特別な場合において興味あるものである。標的高分子ポリペプチドは、好ましくはヒト起原の天然又は改変されたポリペプチドコードのDNA配列により形質転換された原核微生物又は真核細胞により生成され得る。アミノ酸配列の実質的な同一性が維持されている天然に存在するポリペプチドの変異体（すなわち、前記配列は、同一であるか、又は突然変異的に変更されたタンパク質と生来のタンパク質との間に実質的に逆の機能的な相違を引き起こさない１又は複数のアミノ酸の変更（欠失、付加、置換）により異なっている）は、本明細書において有用である。本発明のもう１つの態様においては、オキシム連鎖を通して標的高分子上の単一の部位で１又は複数の水溶性ポリマーに共有結合されるために、ポリマー試薬分子、すなわち本発明の水溶性官能化ポリマーアミノ−オキシ又はアルデヒド試薬により改変された標的高分子が供給される。それらは、本明細書において、“ ポリマー接合体”として言及される。上記で論ぜられたように、好ましくは、標的分子は、ポリペプチド、より好ましくは生物学的に重要なポリペプチドである。好ましい接合体態様においては、オキシム連鎖を通して、水溶性ポリマーPEG 又はその誘導体により誘導体化されたポリペプチドが供給される。本発明は、１又は複数のポリマーが単一の独特に位置するオキシム連鎖を通して共有結合されている、上記で論ぜられた官能化されたポリマー分子との反応により改変された上記官能化された標的高分子を包含する。１つの態様において、それらのポリマー接合体は、次の式：Ｂ−Ｃ（Ｒ）＝Ｎ−Ｏ−Ｘ− Ｐ又はＢ−Ｃ（Ｒ）＝Ｎ−Ｏ−Ｘ−Ｌ（Ｐ）_m又はＢ−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ）−Ｘ− Ｌ（Ｐ）_mにより表わされ、ここでＰは本明細書に記載されるような、好ましくは水溶性の有機ポリマーであり、Ｂは本明細書に記載されるような官能化された標的高分子、好ましくはポリペプチドであり、ｍは２〜10の整数であり、Ｘ及びＬ並びにＲは本明細書で定義された通りであり、そして−Ｃ（Ｒ）＝Ｎ−Ｏ−はオキシム結合である。Ｒは好ましくはＨである。Ｒは、アミノ基転移により活性カルボニルに転換されているポリペプチドのＮ−末端残基の側鎖であり得る。好ましくは、ｍは約２〜10であり、２〜５の範囲が特に好ましい。好ましくは、Ｂはポリペプチドであり、ここで好ましくはＰはＢ上の官能化されたＮ−又はＣ− 末端残基に部位特異的に共有結合されている。本発明のさらなる態様においては、前記式のオキシム結合の酸素原子は、Ｃ（Ｒ）＝Ｎ−Ｓ−チオ−オキシム結合を得るために硫黄原子により置換される。個々の官能化された標的高分子は、本発明のポリマー化合物の異なった態様との反応の手段により１又は複数の異なった水溶性ポリマーにより誘導体化され得る。個々の標的高分子は、ｍが１以上である場合、単一の部位で複数の水溶性ポリマーにより改変され得る。好ましくは、Ｐはポリアルキレングリコール又はデキストラン誘導体である。 PEG 又はデキストランポリマーにより改変されたタンパク質の生物学的活性は、下記例により示されるように、かなりの程度まで保持される。本明細書に記載されるいづれかの高分子、たとえばポリペプチド、水溶性ポリマー及びその誘導体の塩は、そのような分子が種々のpHの水溶液に存在する（又は水溶液から単離される）場合、天然において生じるであろう。上記生物学的活性を有するペプチド及び他の高分子のすべての塩は、本発明の範囲内であると思われる。例は、カルボン酸残基のアルカリ、アルカリ土類及び他の金属塩、アミノ残基の酸付加塩(たとえばHCl)、及び同じ分子内のアミノ残基とカルボン酸との間での反応により形成されるZwitteriuns を包含する。本発明から容易に理解されるであろうように、均質のポリマー接合体組成物は、ホモ−又はヘテロ−ポリマーから構成され得る。本出願の残りに論ぜられるように、ヘテロ二又はヘテロ多−ポリマー官能化ポリマーが標的高分子に結合される場合、単一部位で結合されるすべてのポリマー分子は化学タイプ又はMW（平均）に関して同一ではないが、それにもかかわらず、組成物は本明細書において定義されるように均質であり得る。たとえば、連結構造体（“Ｌ”）上へのポリマーの段階的なアセンブリー（同時継続アメリカ特許出願08/057,594号、08/114,8 77号及び08/057,594号、同時継続国際特許出願PCT/IB94/00093；引用により本明細書に組込まれる）は、ヘテロポリマーの均質組成物を製造するために個々の段階で異なったポリマーの導入を可能にする。上記で示されたように、化学選択性連結による多ポリマー構成体の同様のアセンブリーは、定義された高分子構造体を有する多ポリマー構成体の均質調製物を形成するために、連結構造体（Ｌ）上のGXL 基と官能化されたポリマー上のAoA 基との間の相補的な化学反応の結果である。多ポリマー官能化ポリマーの他の態様は、逆相補的構造体、すなわち上記のものからのアミノ−オキシ連鎖構造体及びアルデヒド官能化ポリマーを有する。本発明の追加のポリマー接合体態様は、同じか又は異なっている２種の標的高分子が、好ましくはポリマーの末端を通して介在ポリマーにオキシム連鎖によりそれぞれ結合される。好ましい態様は、介在ポリマーとしてPEG 又はその誘導体を包含する。オキシム連鎖を形成するために、官能化されたポリマー及び官能化された標的分子を反応せしめる段階を包含するポリマー接合体形成の方法が、本発明により提供される。オキシム化反応は、ポリマーがオキシム連鎖により標的高分子に付加されるよう、２種の試薬間で部位特異的に生じるであろう。たとえば、オキシム化反応は、オキシム接合体を形成するために、標的高分子上に導入された XXL −官能基とpH4.6 でポリマー上に導入されたその相補的AoA 基との間で生じ得る。オキシムは広範囲のpH値にわたって形成し、そして約５のpH以下のpH値で急速に形成する。オキシム形成の程度は、RP−HPLCによりモニターされ得、そしてその反応は分離用RP−HPLCにより終結され得る。得られる化合物の分子量は、ゲル電気泳動又はマトリックス−助力のレーザー脱着イオン化質量分析法により決定され得る。他方では、AoA−標的高分子が使用され得、そしてオキシム化反応が、AoA 基とアルデヒド基を有するポリマーとの間で生じ得る。他方では、オキシム化は 4.6以下のpHで実施される。より低いpHが、いくつかのペプチドの溶解性のために好都合である。2.1のpHが、いくつかのペプチドの溶解性を高めるために好ましい。さらに、オキシム化は、pH4.6 でよりもpH2.1 で一層早く生じる。当業者は、オキシム−接合体の形成のためにポリマー及び標的のpH vs.溶解性プロフィールを決定することができ、そしてオキシム化反応の期間の間、分子のpH 定性を考慮して、特定のオキシム化反応のための適切なpHを選択することができる。相補的化学基の化学選択性連結によるオキシム化は、AoA 及びGXL 対が使用される場合、定義された構造体のオキシム接合体の均質調製物の形成を急速且つ実質的に定性的にもたらす。オキシム−形成の相補的な化学的反応性基は、保護された又は保護されていない形のいづれかで結合され得る。標的高分子にオキシム−形成の相補的な化学的反応性基を結合する方法は、化学的に反応性の側鎖基を通しての結合を包含する。たとえば、オキシム−形成の相補的な化学的反応性基は、アルキル化又はジスルフィド形成によりＳ原子を通してシステイン−含有標的高分子に結合され得る。次に、アルデヒド官能基を有する官能化されたポリマーへのオキシム化に基づいて、標的高分子が、ポリマーにチオエーテル結合（又はジスルフィド結合）及びオキシム結合を通してそのCys 残基を経て結合される。好ましいアルキル化化合物は、結合されるAoA 基を有するアルキルハロゲン化物である。特に好ましいものは、BOC保護されたアミノ−オキシ基、好ましくはAoA 基を有するものである。好ましくは、Br−CH₂−CO−NHCH₂CH₂NH−CO−CH₂Ｏ−NH−Boc（ここでAoA 基は保護され、そしてオキシム段階の前、除去され得る）及びBr−CH₂−CO−NHC H₂CH₂NH−CO−CH₂−Ｏ−NH₂である。もう１つのアルキル化試薬は、Br−CH₂CH₂C H₂NH−COCH₂ONH−Boc である。ブロモアセチル基は、たとえばCys 残基のチオール基のアルキル化のためにより一層反応性である。ヨードアセチル基は、それが時々、過反応性であり、そして光分解により失なわれるので、あまり好ましいものではない。ブロモアセチル基の他に、他のアルキル化基は、マレオイル基を包含する。本明細書に教授されるように、この基を用いてのタンパク質改変のためのリンカーが、AoA−Lys（マレオイル−β−アラニル）−OH及びマレオイル−β −アラニル−NHCH₂ CH₂NH−COCH₂ONH₂として例示される。マレオイル基は高分子接合体を製造するために有用であるけれども、それは重大な安定性の問題（環の加水分解性開環）を有することが知られており、そしてその結果、均質のポリオキシムを製造するためにほとんど適切ではない。さらに、マレオイル基を包含するアルキル化は、ブロモアセチル基によるアルキル化により形成される結合よりもより硬性且つ巨大であるリンカーを付与し、そして従って、免疫システムに対してすぐ使える。インビボ用途のための好ましいリンカーは、免疫応答が指図されていないものである。ジスルフィド結合を通してシステインの側鎖へのオキシム−形成の相補的な化学的反応性基の結合のための化合物の例は、２ −ピリジル−Ｓ−Ｓ−基を含むものである。好ましい例は、２−ピリジル−Ｓ− Ｓ−CH₂CH₂NH−CO−CH₂−Ｏ−NH−Boc及び２−ピリジル−Ｓ−Ｓ−CH₂CH₂NH−CO −CH₂−Ｏ−NH₂である。得られるCys 含有誘導体は、ジスルフィド結合を通して結合されるアミノオキシアセチル（又は保護されたアミノオキシアセチル）基を有する。本明細書に開示される改変は、ジスルフィド及びオキシム結合を通して Cys 側鎖を経てポリアルデヒドベースプレートに官能化されたポリマーを連結するために有用である。この形の結合により、標的高分子、たとえばペプチドは、ジスルフィド還元、すなわち身体において存在することが知られている工程によりポリマーから解放され得る。本発明のオキシム−結合されたポリマー接合体、及びポリオキシムに基づく多 −ポリマー官能化ポリマーは、いくつかの新規特徴を有する。１つの新規特徴は、調製物が均質であることである。オキシム−結合された化合物は、水溶液又は半水溶液において安定しており、そして−３℃〜50℃の温度で、但し最とも好都合には、室温で調製され得る。本発明のオキシム−結合された化合物は、それらの個々の成分部分の特定の生物学的反応性、及び特定の化学的及び物理的反応性に関連して有用である。本発明の官能化されたポリマー（たとえば、一官能価ポリマー、二官能価ポリマー、二ポリマー官能化ポリマー、又は多ポリマー官能化ポリマー）が得られた後、それはオキシム化反応を通して、官能化された標的高分子により接合される。オキシム連鎖は、ポリマー及び標的高分子上に導入された相補的官能基から形成される。標的分子へのポリマーの結合は、標的高分子上のオキシム形成官能基の選択された配置により指図されるように部位特異的に生じる。本発明の１つの態様において、接合の方法は、次の態様で実施される。官能化されたポリマー溶液が、最終の酸性pHで官能化された標的高分子溶液と組合される。オキシム化反応が可能にされ、所望する接合体の形成が進められる。上記で論ぜられたように、オキシム化反応は、広範囲のpH、好ましくは約pH２、特に急速な形成が所望される場合、より好ましくは約pH５以下で生じ得る。より好ましくは、pHは４以下であり、最とも好ましくは約 3.6である。オキシム化反応は、標的分子の安定性又は溶解性を維持するために必要である場合、より低いpHに適合する。反応温度は好ましくは、室温であるが、しかし標的高分子の安定性及び溶解性のための特定の必要性を満たすよう調整され得る。反応時間は、10分〜72 時間、より好ましくは３〜48時間、及び最とも好ましくは６〜24時間である。官能化されたポリマーは、官能化された標的高分子よりもモル過剰で、好ましくは約３〜20倍のモル過剰、より好ましくは、約４〜15倍のモル過剰で、及び最とも好ましくは、約５〜10倍のモル過剰で存在する。官能化されたポリマーは好ましくは、酸性のpHでの水溶液、好ましくは緩衝液に希釈される。pH4.6 の 0.1Ｍ酢酸塩の溶液が好ましい。任意に、カオトロピック剤が、官能化されたポリマーへの標的高分子の官能基の接近性を助けるために存在する。好ましい剤は、オキシム化反応に対して不活性であり、ポリマー及び標的分子の両者に対して不活性であり、そして最終生成物から除去される場合、生物学的活性の戻りを妨害しないであろう（それがカオトロピック剤により影響されるなら）。好ましい剤は、グアニジン塩酸塩（“GuHCl”）であり、好ましくは、最終反応において約１〜８モル濃度で、より好ましくは約４〜６モル濃度で存在する。アミノオキシ誘導体が水に水溶性である場合、接合反応は有機溶媒の存在下で行なわれ得る。その溶媒及びその濃度は、標的高分子の興味ある生物学的活性を逆に妨げるべきでない。適切な溶媒は当業界において良く知られている。たとえば、ある低い溶解性のペプチドに関しては、50％までのアセトニトリルが、カップリングのために使用され得る。所望には、ポリマー接合体は、反応混合物から精製され得る。当業者に知られている多くの精製方法、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分離用等電点電気泳動、等が存在する。１つの特に好ましい方法は、サイズ分離方法と電荷分離方法とを組合すことであり、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー処理、続いてイオン交換クロマトグラフィー処理を行なうことである（アメリカ特許第 253,708号を参照のこと；これは引用により本明細書に組込まれる）。好ましくは、サイズ分離法は、それらの分子の流体力学半径に基づいて分子間を区別するサイズ排除クロマトグラフィーである。流体力学半径とは、水性環境下での粒子の効果的分子半径として定義される。好ましくは、電荷分離法は、固定した不活性の荷電された物質に対する溶液における荷電されたイオン又は分子の示差親和性に基づいて分子間を区別するイオン交換クロマトグラフィーである。サイズ排除クロマトグラフィー法及びイオン交換クロマトグラフィー法は、適切な緩衝液及び適切な条件下で、ポリマー接合体の混合された溶液といづれかのカラムとを接触せしめることを含んで成る。本発明のもう１つの態様において、接合の方法は“ワン−ポット(one-pot)” 合成を包含する。官能化されたポリマー溶液が、緩和な反応条件下で、本明細書に記載されるように官能化に対してひじょうに敏感である、セリン又はトレオニンのＮ−末端残基を有する標的高分子及び過ヨウ素酸溶液と共に同時に混合され得る。標的高分子のＮ−末端アミノ酸にオキシム連鎖を通して部位特異的に結合されるポリマーによる所望するポリマー接合体の形成は、追加の操作の必要性を伴わないで生じるであろう。ワン−ポット反応のpHは、約２〜９、好ましくは約３〜７、より好ましくは約 4.5〜７、最とも好ましくは約６〜７であり、そして好ましい態様は約6.5 のpHである。ポリマー及び過ヨウ素酸の両者は、標的分子に対してモル過剰で存在する。過ヨウ素酸は好ましくは、２〜５倍のモル過剰で、より好ましくは２〜３倍のモル過剰で存在する。約３時間以下の反応時間が達成される。所望には、ポリマー接合体は、本明細書に記載されるようにして単離される。反応温度は好ましくは、凍結を回避するための約０℃〜標的分子を改変する温度以下であり、一般的には、改変を回避するために約 100℃以下であり、そしてほとんどのタンパク質の場合、約50℃である。より好ましくは、反応は約 15〜25℃、さらにより好ましくは約20℃で行なわれる。標的分子に対する官能化されたポリマーのモル比は、約３〜50倍、より好ましくは４〜30倍、さらにより好ましくは約５〜25倍の範囲での値である。過ヨウ素酸に対する標的分子のモル比は、好ましくは約１〜約６倍、より好ましくは約２〜４倍の範囲で存在する。特定の態様において、IL−８：NaIO₄：AoA は、約１：４：10である。画分が所望する接合体を含んでいるかを決定するために、画分は種々の基準に対してスクリーンされ得る。好ましいスクリーン法は、SDS−PAGE、等電点電気泳動、生物活性及び薬物動力学を包含する。画分が所望する接合体を含むことが知られた後、それらの画分はさらに精製され得る。たとえば、ポリマー／タンパク質接合体混合物は、サイズ排除クロマトグラフィーカラムにより分別され、画分が集められ、次に画分が所望するポリマー／タンパク質接合体を含むことを決定するために SDS−PAGEゲル上で分析される。次に、興味ある画分がイオン交換クロマトグラフィーとの接触によりさらに精製され、画分が集められ、そして画分が所望するポリマー／タンパク質接合体を有することを決定するために等電点電気泳動により分析される。ポリマー接合体混合物がクロマトグラフィー処理にゆだねられる前、それは不純物を除去され得る。たとえば、塩及びケオトロピック剤は予備カラムにより除去され得、又は適切な緩衝液に対して透析され得る。ポリマー接合体が精製された後、それは当業界において知られている方法を用いて生物活性について試験され得る。本発明の好ましい態様によれば、タンパク質及び他の有機標的高分子は、水溶性有機ポリマー、たとえばポリエチレングリコール(PEG)への接合により化学的に改変され得る。そのようなタンパク質接合体の生成は、水溶性ポリマーの結合により付与される所望する性質のために、興味あるものである。それらの所望する性質は、水溶液における高められた溶解性、貯蔵の間の高められた安定性、減じられた免疫原性、酵素分解に対する高められた耐性、広範囲の種類の薬物投与システムとの適合性、及び高められたインビボ半減期を包含する。 PEG 又は他の水溶性ポリマーによるポリペプチドの誘導体化によりもたらされるそれらの性質は、そのポリペプチドが身体中に注入される治療剤として使用される予定である場合、又はそのポリペプチドが、アッセイ、通常イムノアッセイに、興味ある化合物の検出及び／又は定量化のために使用される予定である場合、特に興味あるものである。もちろん、本発明の官能化されたポリマーの利用は、低分子量のペプチド、及びポリマー上の官能基に対して相補的な官能基を含み、又は含むように改変される他の材料のポリマー接合体の調製に及ぶ。官能化されたポリマー、特にPEG 化されたタンパク質の非医学的使用は、アッセイ、たとえばイムノアッセイのためへのポリペプチドの調製を包含する。官能化されたポリマーは、固相、たとえば珪素チップの表面、組織培養プレート、細胞又は膜、又は合成又は天然樹脂に結合され得る。固相に導入される相補的官能基の使用により固相に官能化されたポリマーを化学選択的に連結することができる。本明細書で示されるように、官能化されたポリマーは、標的高分子又は固相上の官能基の出現（又は消出）をモニターするために有用である。ポリマー接合体が生成され、そして精製された後、それは、ヒト及び家畜使用、たとえば癌治療及び感染性疾病の処理のために治療的に効果的であると思われる標的高分子が使用される場合、医薬組成物中に導入され得る。治療剤は、動物に投与される場合、疾病を予防し、又は緩和し、又は動物における疾病状態を阻止し、又は緩和するいづれかの分子である。治療剤は、抗腫瘍性抗生物質、抗ウィルス性タンパク質、放射性同位体、医薬又は毒素を包含するが、但しこれらだけには限定されない。ポリマー接合体は、非毒性で不活性の医薬的に許容できる水性キャリヤー媒体に配合され得る。“医薬的に許容できるキャリヤー”とは、標準の医薬キャリヤーのいづれか、たとえばリン酸緩衝溶液；水又はエマルジョン、たとえば油／水エマルジョン；種々のタイプの湿潤剤を実質的に含むものを意味する。ポリマー接合体は、非毒性で不活性な医薬的に許容できるキャリヤー媒体において、好ましくは３〜８のpH、より好ましくは６〜８のpHで配合され得る。インビボ治療のために使用される場合、滅菌されたポリマー接合体組成物は、再構成に基づいて許容できるpHを有する水性緩衝液に溶解されたタンパク質を含んで成る。ポリマー接合体は、多くの賦形剤、たとえばアミノ酸、ポリオール、糖、緩衝液、保存剤、他のタンパク質、等と共に配合され得る。特定の例は次のものを包含する：オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物；ポリエチレングリコール− ステアレート化合物；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；スクロース；フルクトース；デキストロース；マルトース；グルコール；デキストラン；マンニトール；ソルビトール；イノシトール；ガラクチトール；キシリトール；ラクトース；トレハロース；ウシ又はヒト血清アルブミン；シトレート；アセテート；リンガー及びハンクス溶液；塩溶液；リン酸塩；システイン；アルギニン；カルニチン；アラニン；グリシン；リシン；バリン；ロイシン；ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール；等。好ましくは、この配合物は、４℃で少なくとも６ヵ月間、安定している。組成物として、それは当業界において知られている方法により対象に対して非経口投与される。有効量の化合物又は医薬組成物を対象に供給する投与手段は知られている。動物への投与方法は、当業者に良く知られており、そして経口、皮下及び非経口投与を包含するが、但しこれらだけには限定されない。投与は他の処理の間じゅう、連続して又は断続的にもたらされ得る。投与の最とも効果的な手段及び投与量を決定するための方法は、当業界者に良く知られており、そして処理のための化合物又は組成物、治療の目的及び処理される動物又は患者により変化するであろう。この組成物は、特定の標的高分子タンパク質の有効性を高め、又はその所望する性質を促進する他の化合物を含むことができる。その組成物は、選択される投与路のために安全であり、無菌性であり、且つ効果的であるべきである。ポリマー接合体の無菌性を維持するために及びその安定性を高めるために、組成物は凍結乾燥され、使用の前、再構成され得る。好ましくは、その配合物は、治療的有効量でのヒト又は動物への非経口投与のために適切である。それらの量は、興味ある疾病状態の動物モデルについての予備臨床学的試験の後に得られるインビボ効能データにより又はインビボ効能と相互関係するような一般的に許容できるインビトロアッセイにより決定され得る。興味ある標的高分子の便利且つ再生できる誘導体を供給するために、本発明の水溶性の官能化されたポリマー試薬をキットの形で供給することもまた興味あることである。興味あるキットは、本発明の水溶性の官能化されたポリマー試薬を含んで成る溶液、緩衝液、反応インジケーター化合物、説明書、たとえばBradfo rdアッセイのためのタンパク質濃度測定試薬、及び同様のものを含むことができる。試薬溶液は好ましくは、予備測定された量で供給されるであろう。キットは、好ましくは緩和条件下で、興味ある標的高分子上に相補的官能基を部位特異的に導入するための試薬を含むことができる。そのような試薬は、官能化反応のモニターを可能にする（ポリマー接合体の形成によるように）本発明の官能化されたポリマー、Ｎ−末端切断のためのペプチダーゼ、Ｃ−末端部位特異的接合のためのプロテアーゼ、保護されたアミノ−オキシ基を含むリンカー基、過ヨウ素酸、分子量マーカー（既知の分子量のポリマー接合体の形でのような）、及び場合によっては、標的高分子の官能化を実施するためのいづれかの緩衝液又は溶媒を含むことができる。キットは、一連の個々の溶液（又は粉末形）、既知の分子量の標的高分子に結合される、既知の組成、分子量及び形態のポリマー接合体含有ポリマー（一−ポリマー、二−ポリマー、又は多−ポリマーのいづれか）、及びたとえば接合反応の完結及び／又は収率を評価し、又は分子量標準を供給するために対照として使用され得る組成物を含むことができる。本発明のポリマー−接合体の態様は、診断目的のための改良されたキットに使用され、又はたとえば結合アッセイ、たとえばイムノアッセイにおけるアッセイのための改良された試薬として使用され得る。たとえば、抗原ペプチドを担持するポリマー接合体組成物は、固相イムノアッセイにおいて高められた検出感度を提供する。大きな二価又は多価のポリマー接合体は、表面、たとえばイムノアッセイに使用される複数ウェルのプレートに容易に付着することができる。ポリマー接合体、特に多−ポリマー含有ポリマー接合体は、たとえば枝分れ DNA（“bD NA”）基礎のアッセイにおけるように、分析物の検出のためのシグナル改変段階を用いるインビトロアッセイに使用される。増幅は、単一の分析物分子への複数のポリマー（単一のポリマーよりもむしろ）の結合により達成され、ここで個々のポリマーは続くアッセイ段階における検出可能なシグナルに寄与する。分析物へのポリマー接合体の標的化は、たとえば分析物結合基を含んで成る連結Ｌ基の使用により、又はその構造体上の少なくとも１つのポリマーが分析物結合を提供する、本発明のヘテロ−ポリマー構造体の使用により、容易に付与される。本発明の多−ポリマー含有ポリマー、特にラベルが当業界において知られているような放射能、螢光、酵素結合され、又は同様のものであり得る、ラベルされた第２オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより続いて検出される反復単位として特定のヌクレオチド配列をその中のポリマーが含んで成るものが好ましい。他方、官能化されたポリマーは、検出可能なマーカー酵素−結合体、又は他のレポーター基を含むようにそれ自体、誘導化され得る。高分子の精製、特にタンパク質の精製のための一般的な方法及び原理は、たとえば“Protein Purification：Principles and Practice”(1987)，Scopes,２nd ed.，Springer-Verlag，New York，NY（引用により本明細書に組込まれる）に見出され得る。有機標的高分子のストークス半径を組織的に改変する方法がまた、本明細書に提供されており、ここで前記方法は、（ａ）第１のオキシム−形成基を含んで成る部位特異的に官能化された標的高分子を獲得し、（ｂ）一連の官能化された有機ポリマーにおけるトポロジーがお互い異なっているが、しかし標的高分子上の前記第１のオキシム−形成基に対して相補的な第２のオキシム−形成基を包含する本発明の前記一連の官能化された有機ポリマーを獲得し、そして次に（ｃ）一連の接合されたポリマーを得るために、本明細書に教授されるような緩和な条件下で、化学選択性部位特異的オキシム化を通して個々の官能化されたポリマーにより、官能化された標的高分子を別々に接合せしめる段階を含んで成る。前記段階（ａ）及び（ｂ）は、いづれの順序でも実施される。所望には、好ましくはサイズ分離方法により前記一連の官能化された有機ポリマー中の個々の接合されたポリマーについてのストークス半径の変化を同定することができる。前記方法はさらに、ストークス半径と標的高分子の興味ある生物学的又は物理的性質の変化とを関連づけることを包含することができる。他方、前記方法は、興味ある生物学的又は物理的性質、たとえば興味ある標的高分子の薬物動力学的挙動性、治療効能、インビトロアッセイシステムへの使用、分子量標準としての挙動性の変化を同定することを包含する。好ましくは、第２のオキシム−形成基は、−Ｏ−NH₂である。高分子のインビボ血液クリアランス挙動性は、そのストークス半径に一部、依存するにちがいない。ゲル濾過カラムからの高分子の溶出体積は、ストークス半径に理論的には関連するが、しかしその分子量には関連しない。移動する分子の濾過のための種々のサイズの孔を、三次元網状構造のフィラメントが形成しているゲル電気泳動にゆだねられる場合、高分子の移動度は、高分子のストークス半径の変化に影響を及ぼすことができる。典型的には、分子量で異なるポリマーは、分子量の対数の線状関数として移動するであろう（そしてここで、個々のポリマーについての質量比の変化はほぼ同じである）。本発明の１つの態様においては、標的高分子のストークス半径の所望する変化の付与を可能にする、より好ましくは、ストークス半径の一連の変化の組織的な導入によりある種類の分子を創造する、類似する分子量を除く、種々のトポロジーの官能化されたポリマーが供給される。一−ポリマー、二−ポリマー又は多−ポリマー含有官能化ポリマー構造体がユニーク部位で部位特異的、化学選択的に結合され、ここで個々の結合された官能化ポリマー構造体が標的高分子に、他のものと同じ分子量及びポリマー組成を、但し異なったトポロジーで付与する、一連の接合された標的高分子が急速に調製され得る。しかしながら、本明細書において発見されたように、それらの得られる種々のポリマー形態のために、個々のポリマー接合体の移動度は驚くべき異なっている。本明細書に教授されるように、標的高分子のストークス半径を組織的に改変することによって、高められた又は所望する挙動性を有するそれらの接合された分子をより容易に創造し（そして“細かに調整し”）、そして同定することができる。タンパク質への水溶性ポリマー、特にポリエチレングリコールのカップリングの利点は、十分に記録されており、そして次のものを包含する：活性タンパク質が生理学的pHで不溶性であるか又は単に部分的に溶解性である場合、生理学的pH でのその活性タンパク質に比較しての接合されたタンパク質の高められた溶解性、活性タンパク質により生成される免疫応答の低下、高められた薬物動力学的プロフィール、高められた保存寿命、及び高められた生物学的半減期。標的高分子、特に本明細書で教授されるような医薬的に重要なタンパク質のストークス半径を組織的に改変することによって、高められた又は所望する挙動性又は治療効能を有するそれらの接合された分子のより容易な創造及び同定を可能にする、分子の薬物動力学的挙動性の組織学的に重要な変化をもたらすことができる。従って、分子量（平均）を一定に保持しながら、異なったポリマートポロジーを有する官能化されたポリマーが供給される。たとえば、異なったトポロジーを有するが類似する分子量のPEG のある種の官能化されたPEG ポリマーが、そのストークス半径、及び従って、生物学的に重要な標的分子の薬物動力学的挙動性が断定でき且つ再生できる手段で変更され得るように供給される。類似する分子量を有するが、しかしポリマー構造体に存在するポリマーの数においては異なるポリマー構造体を含んで成る、興味ある標的への結合のための一連の官能化されたポリマーを含むキットが提供される。たとえば、一連の官能化されたポリマーは、２つの20KDのMW（平均）のポリマー、４つの10KDのMW（平均）のポリマー及び５つの８KDのMW（平均）のポリマーの多−ポリマー含有構造体及び40KDのMW（平均）のポリマーの構造体を含んで成る。本発明の方法は、標的へのポリマーの結合が断定でき、そして選択できるので、好都合である。本発明のさらなる利点は、試薬化合物により改変された高分子、たとえばポリペプチドが、同じ標的が非−オキシム及び非−部位特異的化学を用いることにより水溶性ポリマーを連結することによって同じ程度に改変される場合よりも高い程度のそれらの生物学的活性を保持することである。従って、本発明は、改変に関連する生物学的活性の損失を最少にしながら、水溶性ポリマーの接合に関連する利点を有する改変された標的を提供する。結果的に、多−ポリマー官能化ポリマーの使用によりより高く誘導体化され、そして従って、高い程度の誘導体化に関連する利点を有する標的が生成され、これはさらに、より低い程度に水溶性ポリマーにより誘導体化されたポリペプチドと同じレベルの生物学的活性を有する。第一アミン以外の求核試薬、たとえばタンパク質上のヒドロキシル基、フェノール基、及びスルフヒドリル基と反応することができる活性カルバメート、たとえば活性エステルの使用、及びリシン残基の第一アミンと選択するイミデートの使用に関する、タンパク質に水溶性ポリマーを結合する他の方法よりも本発明のさらなる利点は、本発明の特定化学の高い選択的性質により交差反応性が回避されることである。さらなる利点は、部位特異性が、本明細書に供給され、そして教授されるような部位特異的官能化方法及びリンカーの使用により標的高分子上に正確に配置され得ることである。本明細書に示されるように、ポリマーと標的との間にオキシム連鎖を形成するために相互作用する相補的反応性基は、ひじょうに特異的である。本明細書に教授されるオキシム化反応は、反応生成物の完全な又は実質的に高い収率を提供した。そのような複雑な分子形成は、ひじょうに緩和な条件下で生じる。急速性は、不活性−分子凝集又は反応を最少にするためにしばしば有用である希釈条件下で特に驚くべきことである。オキシム化反応は、ポリマー接合体の自己アセンブリーが生じるように、単独で生じ得る。ポリマー接合体は実質的に量的な収量により容易に精製され、そして微量中間体及び最終生成物は典型的には実質的に異なるので（すなわち、少なくとも１つのポリマー単位の存在又は不在により）、それらの分離のためのそのような方法は容易に選択され、そして適用される。オキシム連鎖は、ヒドラゾン又は同様のものに比較して、広範囲の生理学的条件下で卓越した加水分解安定性を有する。オキシム連鎖は、通常、酵素加水分解を受けない。従って、ポリマー接合体は、複合体の統合性及び安定性が所望される場合の用途に特に適切である利点を有する。例に示されるように、オキシム化反応はひじょうに緩和であり、そして従って、生物学的活性又は機能を保持する生物学的高分子を調製するために好都合である。オキシム化学は、サブユニットの可逆的化学保護を有する必要性を不要にする。高い柔軟性が、オキシム連鎖を形成することができる反応性基を創造するために、ポリマー及び標的の両者の部位特異的改変のために提供される。この柔軟性及び可逆的保護の必要性の不在のために、ポリマー及び標的の企画は、人工的な及び天然の分子及びそれらの誘導体まで及ぶ。ポリマー接合体は、ペプチドの溶解性を改良し、そして多価及び／又は強制された形で動物中のレセプター又は抗体、又は免疫システムにペプチドを与えるよう企画され得る。合成又は組換えポリマー及び標的高分子から形成されるポリマー接合体は、ウィルスフリーのさらなる利点を有する。従って、好ましくは、本発明の官能化されたポリマー及び本明細書に提供される方法は、アルデヒドとアミノ−オキシ化合物との間の縮合反応によりポリマーのポリペプチド及びタンパク質誘導体への接合を可能にする。最とも好ましくは、相補的反応は、アルデヒド又はケトンとアミノ−オキシ−アセチルとの間に存在する。すべての場合、オキシム結合が形成される。本発明はさらに、ポリマー、たとえばPEG のインビトロ使用を提供する。官能化されたポリマーは、標的分子に“標識を付ける”ために使用され得、そして従って、多くの手段での分子の続く検出及び／又は定量化を可能にする。最とも単純には、結合されたポリマーは、混合物中の他の分子からポリマー標識された一標的分子を分離するであろう単純なサイズ分離の実施を可能にする。たとえば、ポリマー標識された標的の出現として検出される、官能化されたポリマー上の反応性官能基と反応する能力により測定されるように、所望する官能部位の生成のために標的分子の改変を容易に従えることができる。有機ポリマーの異なった物理化学性質がポリマーの単純な変更によりこの手段における利点を有することが現在容易に明らかになる。たとえば、わずかに疎水性のポリマーは、疎水性に基づいての分離を可能にし、又は次に、所望のポリマー接合体について又はそれに対して選択するポリマー結合カラムを用いることができる。さらに、ポリマーは、直接的に検出され得るように、選択することができ、又は改変され得る。これは、ポリマーが複数の検出可能な部位（又は反復単位）を含み、その結果、ポリマーに存在する個々の部位が結合し、又は検出システムにより認識され、従って検出シグナルの増幅をもたらす利点を付与する。枝分れ DNA（“bDNA”）含有試験は、個々のポリマー単位、この場合、特定のヌクレオチド配列又は反復単位が第２の測定可能な試薬を特異的に結合することによって検出される場合を例示する(Urdea（1994）Bio／Technology 12： 926-928)。たとえば、本明細書に提供される銅触媒されたアミノ基転移の割当においては、標的タンパク質のＮ−末端での反応性ケト基の出現は容易には査定され得ない。Ｎ−末端アミノ基の消出は、銅アダクトのみが同定され得るので、質量分析法、又は酢酸セルロース電気泳動のいづれかにより査定され得ない。しかしながら、反応性ケト基の出現は、検出される本発明の官能化されたPEG 誘導体と反応するその能力により、たとえば SDS−PAGEシステムにおける単純なサイズ分離により容易に査定された。例例１．メトキシポリエチレングリコールの官能化：MPEG−NH−CO−CH₂−Ｏ−NH₂ （”AoA−NH−PEG”）の合成 MPEG_5KD（５ｇ，１ｍモル；Mr（平均）５KD）を、トルエン（30ml）に溶解し、そして共沸蒸留により乾燥せしめた。乾燥ピリジンを添加し、そして塩化チオニル（４ｍモル）を、還流下で10分間にわたって滴下した。その混合物を４時間加熱し、室温に冷却し、ピリジン塩酸塩から濾過し、そしてトルエンを真空下で蒸発した。残留物をCH₂Cl₂に溶解し、K₂CO₃上で乾燥し、そして濾過した。濾液を酸化アルミン（40ｇ）により処理し、そして冷エーテルにより沈殿せしめ、ポリマーをトルエン／ヘキサンから再結晶化した；収量4.6ｇ（92％）。 DMF(20ml)中、MPEG_5KD−Cl（４ｇ，0.8mモル）の溶液に、アジ化ナトリウム（８ｍモル）を添加し、そしてその混合物を120℃で２時間撹拌した。その溶液を冷却し、濾過し、そしてDMF を真空下で蒸発した。残留物をトルエンに取り、濾過し、そしてヘキサンにより沈殿せしめた。生成物をトルエン／ヘキサンから２度再結晶化した；収量 3.6ｇ（90％）。 MPEG_5kD−Ｎ₃（3.5ｇ）を無水エタノール(100ml)に溶解し、10％ Pd／Ｃ（0. 3ｇ）を添加し、そしてその混合物を低圧水素化装置において一晩、水素化した。触媒を濾過し、そしてエタノールを真空下で蒸発した。ポリマーを、トルエン／ヘキサンから再結晶化した；収量３ｇ（86％）。 MPEG_5KD−NH₂（１ｇ，0.2ｍモル）及びBoc-NH-Ｏ−CH₂−COOSu（0.5ｍモル）を、DMSO（４ml）に溶解し、見掛けのpHをＮ−メチルモルホリンにより８〜９に調整し、そしてその混合物を一晩混合した。MPEG−NH₂アシル化を、定量的なニンヒドリン方法（Sarin など．1981，Anal．Biochem．117：147-157）により、反応混合物の10μｌアリコートに対して調節した。改変されたMPEGを、水５体積による希釈により回収し、続いて、水に対して透析し、そして凍結乾燥せしめた。Boc 基を、TFA 10mlに前記生成物を室温で１時間、溶解することによって除去した。TFA を真空下で除去し、残留物を水に取り、水に対して広範に透析し、そして最終的に、凍結乾燥せしめた；収量0.93ｇ（93％）。同じ方法を、対応するPEG−NH₂からのAoA−NH−PEG_10KD及び AoA-NH−PEG_20KD の合成のために用いた。例２．メトキシポリエチレングリコールの官能化：NH₂−Ｏ−CH₂CONH −PEG −N HCO−CH₂−Ｏ−NH₂（“AoA NH−PEG −NH−AoA”）の合成 Boc−NH−Ｏ−CH₂−COOSu（86mg，0.3ｍモル）を、無水DMSO１mlに溶解し、同じ溶媒４ml中、１ｇ（50μモル）のNH₂−PEG_20kD−NH₂の溶液に添加し、そして見掛のpHをＮ−メチルモルホリンにより８〜９に調整した。その混合物を室温で一晩撹拌し、そしてアシル化を、標準のニンヒドリン分析により調節した。次に、その溶液を５体積の希釈水により希釈し、水に対して広範な透析を行ない、そして最終的に凍結乾燥した。Boc 基を切断し、そしてその材料を例１に記載のようにしてさらに処理した；収量0.9ｇ（90％）。このポリマーとの接合は、ダイマー、たとえば“ダンベル”形成を導びく。例３．メトキシポリエチレングリコールの官能化：多価リンカー(PEG)₂Lys−NH −(CH₂)₂−NH−CO−CH₂−Ｏ−NH₂（“(PEG)₂Lys−AoA”）の合成Ｚ−Lys（Ｚ）−OSu 2.0ｇ（3.9ｍモル）に、エチレンジアミン４ml（60ｍモル）を添加し、そしてその混合物を室温で２時間撹拌した（ここで、Ｚはベンジルオキシ−カルボニルである）。カップリング反応は、０〜100％のＢの線状グラジエントを用いるＣ８カラム上での分析HPLCにより50分間にわたって調整されるように定量的であった（ｔ_R＝Ｚ−Lys（Ｚ）−OSuのために48.5分の代わりに4 1.5分）。カップリング生成物を、CHCl₃／MeOH（９／１，ｖ：ｖ）により平衡化されたシリカカラム上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、そして回転蒸発により乾燥せしめ、1.4ｇの生成物を得た。生成物は、ESIMS により測定される場合、予測される分子量を有した（計算されたＭ＋Ｈ，ｍ／ｚ457.2；実測されたｍ／ｚ458.0）。Ｚ−Lys（Ｚ）−NH-(CH₂)₂−NHCO-CH₂−Ｏ−NH-Boc を、無水DMSO ３mlに溶解された0.9ｇ（1.9ｍモル）のＺ−Lys（Ｚ） −NH−(CH₂)₂−NH₂に1.1ｇ(3.8ｍモル)のBoc−NH−Ｏ−CH₂−COOSu を添加することによって合成し、そして見掛のpHをＮ−メチルモルホリンにより８〜９に調節した。その溶液を室温で５時間撹拌し、0.1％ TFA 10体積により希釈し、そして生成物を、３ml／分の流速で30分間にわたって、40〜80％Ｂの線状グラジエントを用いての分離用HPLCカラム 250×25nm i．d．（Nucleosil 300Ａ，７μ ｍＣ８，Macherey Nagel，Oensingen，Switzerland）上で精製した。凍結乾燥の後、生成物（重量 1.1ｇ；収率90％）をESIMSにより特徴づけた（計算されたＭ＋Ｈ，ｍ／ｚ 630.2、実測されたｍ／ｚ 630.9）。ｚ基を触媒水素化により切断した。このためには、材料を、無水エタノール（ 50ml）に溶解し、100μｌのCH₃COOH により酸性化し、10％ Pd／Ｃ（0.1ｇ）を添加し、そしてその混合物を水素化装置により一晩、水素化した。触媒を濾過し、そして溶媒を回転蒸発により除去した。生成物を、０〜50％Ｂの線状グラジエントにより25分間にわたって、前記で使用されたのと同じカラム上で精製した。凍結乾燥の後、（重量、600mg；収率95％）生成物を、ESMSにより特徴づけた：計算されたＭ＋Ｈ，ｍ／ｚ 360.2；実測されたｍ／ｚ 361.8）。 Lys−NH−(CH₂)₂−NHCO−CH₂−Ｏ−NH−Bocを、PEG_5KD−COOH，PEG_10KD−COOH 及び PEG_20KD−COOHによりアシル化した。典型的な実験においては、14mgのLys−NH−(CH₂)₂−NHCO−CO₂−Ｏ−NH-Boc・２HCl(33μモル)を、無水DMSO ２mlに溶解し、PEG_5KD−COOH(0.4ｇ，80μモル）、ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（80μモル）及びDCC（21mg，100μモル）を添加し、見掛けのpHをＮ−メチルモルホリンにより８〜９に調節し、そしてその混合物を一晩撹拌した。標準のニンヒドリン試験は、アシル化が定量的であることを示した。次に、その溶液を５体積の水により希釈し、蒸留水に対して透析し、濾過し、そして水により平衡化されたDEAE Sephadex A25 カラム上に適用した。アシル化されたリンカーを、蒸留水により最初の画分に溶離し、そして凍結乾燥せしめた。次に、Boc 基を、TFA 10mlに前記生成物を室温で１時間、溶解することによって切断した。TFA を真空下で除去し、残留物を水に取り、水に対して広範に透析し、そして最終的に凍結乾燥せしめ（収量 300mg，90％）、次の誘導体を得た： PEG_5KD−Lys（PEG_5KD）−NH−(CH₂)₂−NHCO−CH₂−Ｏ−NH₂。比較できるリンカーを、PEG_10KD−COOH及び PEG_20KD−COOHによるリシン誘導体のアシル化により得た。例４．メトキシポリエチレングリコールの官能化：多価リンカー AoA−(Lys(PEG _5KD))₅−OHの合成Ｚ−(Lys(Boc))₅−OHを出発材料として使用した。ペプチドを、Boc−基を除去した後すぐに、10mMのHClに再溶解し、再凍結乾燥し、そして次に、HOBt及びDCC の存在下でDMSO中、２倍過剰のPEG_5KD−COOHにより完全にアシル化した。その反応混合物を蒸留水により希釈し、透析し、そして可溶性画分をさらに、DEAE− A25 及びCM−C25 Sephadexカラム上でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、そして凍結乾燥せしめた。Ｚ基を２時間のHBr 処理により切断し、そして次に生成物を Boc−AoA −OSu によりアシル化した。最後に、リンカーのAoA 官能基をTFA 処理により保護解除した。官能化の程度は、495nmでTNBSによる反応性アミノオキシ基の決定により評価され、そして80％であることが見出された。例５．デキストランの官能化。デキストラン−Ｏ−CH（CHOH−CH₂OH)−(CHOH)₂ −CH₂−NH−(CH₂)₂−NH−CO−CH₂−Ｏ−NH₂の合成ユニーク反応性基を、還元性アミノ化による還元糖の改変によりデキストラン（Mr（平均）9.3KD 及び39KD）に導入した。デキストラン_39KD（１ｇ，２５μモル）を、軽く加熱しながら（45℃）、無水 DMSO(4.5ml)に溶解し、そして25℃に戻した。エチレンジアミン(500μｌ，7.5ｍモル）及び粉砕された４−Ａ分子篩(200mg)を添加した。フラスコをＮ₂によりフラッシュし、そして次に密封し、そして37℃で24時間インキュベートした。NaBH₄ （80mg，2.1ｍモル）を添加し、フラスコをＮ₂によりフラッシュし、そしてその溶液を37℃で24時間さらにインキュベートした。その粘性溶液を５体積の水により希釈し、pHを氷酢酸の添加により5.0に調節し、蒸留水に対して広範に透析し、そして最後に、凍結乾燥し、生成物 800mgを得た（出発デキストランに基づいて80％の回収率）。官能化の収率は、420nmでの２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸誘導体の吸光度から評価された（Fields，R.，1972，Methods En zymol.，25B，464-468）。比較できる程度の末端基改変を、デキストラン_9KD及びデキストラン_39KDのために獲得し(１モルのポリマー当たり0.9〜1.0 モルのNH₂ )、そして一官能化された市販のMPEG_10KD−NH₂及びMPEG_20KD−NH₂のために得られた改変と一致した。 NH₂−誘導体化されたデキストラン_39KD（800mg，20μモル）DMSO（５ml）に溶解し、同じ溶媒（１ml）に溶解されたBoc−NH−Ｏ−CH₂−COOSu（19mg，60μモル）を添加し、見掛のpHをＮ−メチルモルホリンにより８〜９に調節し、そしてその溶液を室温で一晩撹拌した。その溶液を５体積の水により希釈し、蒸留水に対して広範に透析し、そして凍結乾燥せしめた。末端改変されたデキストランを、TNBS試験により調整されるようにして定量的にアシル化した。前記物質を、保護解除のために20mlのTFA に１時間、溶解し、TF A を真空下で除去し、水により希釈し、広範に透析し、そして凍結乾燥した。それらのすでに導入された末端アミノ基側の単一のアミノオキシ基により官能化されたポリマーは、好ましくは酸性条件下で、最とも好ましくは pH3.0〜5.0 で、過ヨウ素酸酸化又はアミノ基転移により（タンパク質の特定のＮ−末端配列により指図されるような）、タンパク質のＮ−末端で位置し又はそのＮ−末端で部位特異的に導入されたカルボニル官能基と反応することができ、安定したオキシム結合を形成することができる。タンパク質のＮ−末端でのカルボニル基の部位特異的配置は、下記例に示されている。IL−８，Ｇ−CSF 及びIL−１raが、アミノオキシ官能化された合成ポリマーの部位特異的接合のためのこの新規アプローチを示すために使用された。例６．タンパク質のNH₂−末端残基の部位特異的改変：IL−８の改変及び接合 IL−８の短い形のＮ−末端セリン残基（72個の残基；２〜５mg／ml）を、50モル過剰のメチオニンの存在下で、pH8.3 での１％ NH₄HCO₃緩衝液中、10倍過剰の過ヨウ素酸ナトリウムにより、室温で10分間、酸化した。IL−８はいづれのメチオニンも含まないけれども、それらの標準の条件を開発し、過ヨウ素酸処理の間、メチオニン酸化のすべての危険性を排除した（Gaertnerなど．1992，Peptides 1992，Schneider and Eberle，eds.，239-240 p，ESCOM，Leiden，The Netherl ands）。その反応を、過ヨウ素酸に対して2000倍過剰のエチレングリコールの添加、及び室温での15分間のさらなるインキュベーションにより停止し、そしてタンパク質を最後に、pH4.6の 0.1ＭのAcONa 緩衝液に対して透析した。透析管は、１％炭酸水素ナトリウム中で30分間、前もって煮沸された。酸化は、ESI−MS により確認された(計算されたｍ／ｚ 8351.3；実測されたｍ／ｚ 8351.3±1.4 )。酸化されたタンパク質を、３〜４mg／mlまで濃縮し、そしてタンパク質主鎖のＮ−末端への官能化されたポリマーの部位特異的結合のためにその形で使用した。ポリマーとの接合。ポリマーの10mM水溶液10倍モル過剰を、酸化されたタンパク質に添加し、そのpHを、氷酢酸により3.6に調節し、そして室温で20時間インキュベートした。図１に示されるように、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、単一ポリマー鎖の結合に対応する均質接合生成物が形成されたことを明確に示す。その接合体の分子量は、カップリング反応に使用されるポリマーのサイズに直接的に関連している。接合生成物を、０〜２ＭのNaClの線状グラジエントを用いて、pH4.7 の25mMの AcONa 緩衝液により平衡化されたPharmacia MonoS カラム上での20分間にわたるイオン交換クロマトグラフィーにより、続いて、30〜65％Ｂの線状グラジエントを用いての分析用Ｃ８カラム上での逆相HPLCにより35分間にわたって精製した（図２）。接合体のインビトロ活性。IL−８接合体の生物学的活性を、すでに記載されたように、Micro−Boydenチャンバーを用いてヒト好中球走化性アッセイにより決定した（Ribaudo and Kreutzer(1985),Practical Methods and Clinical Immuno logy(Yoshida T．ed.)p．116-125，Churchill Livingston，Edinburgh，U．K.）。 IL−８は２nMのEC₅₀（最大の化学誘引剤活性の５０％に対応する濃度）を示すが、すべての調査された PEG−誘導体（PEG_5KD−，PEG_10KD−，PEG_20KD−、及び (PEG_20KD)₂ Lys−IL−８及びIL−８−PEG_20KD−IL−８）は、３〜10nMの範囲のE C₅₀と同じ程度の大きさの活性を有することが示された。薬物動力学テータ。好中球走化性により決定されるように、十分な生物学的活性を保持することがすでに示されている、IL−８及びその誘導体を、ヨウ素化した(Grobなど．(1990)J．Biol．Chem．265：8311-8316)。手短に言及すれば、約 0.5ｍCiのNa ¹²⁵Ｉを、１mlのポリプロピレン管において、50μｇのIL−８を含むpH7.4 の 0.1Ｍリン酸ナトリウム溶液50μｌと共に混合した。ヨウ素化を、２mMのクロラミンＴ15μｌの添加により開始せしめた。 20℃で90秒間のインキュベーションに続いて、ヨウ素化反応を、２mM亜硫酸水素ナトリウム15μ１及び50（ｖ／ｖ）ヨウ化カリウム10μｌの添加により停止した。放射性タンパク質を、PBSにより平衡化され、そして0.1％ウシ血清アルブミンを含む同じ緩衝液により前もって洗浄されたGF５カラム（Pierce）上の遊離¹² ⁵ Ｉから分離した。得られる比放射能は、１mgタンパク質当たり５〜10ｍCiの範囲で存在した。 ¹²⁵Ｉ−ラベルされたIL−８又はその誘導体を、雌のWistarラットの尾の静脈に注射し（10μｇ／kg）、そして血液サンプルを例８に記載のようにして集めた。ラットに静脈内投与される、IL−８，PEG_20KD−IL−８，IL−８−PEG_20KD−IL −８及び（PEG_20KD）Lys−IL−８についての相対的血液レベルの曲線が図７に示されている。単一の20KDのPEG鎖の接合は、薬物動力学曲線下での領域に対してほとんど影響を及ぼさなかった。最とも重要なことには、ダンベル及び(PEG_20KD )₂Lys−誘導体は、相当にこの領域を高める。それらの曲線は、IL−８について約10分、PEG_20KD−IL−８について17分、IL ８−PEG_20KD−IL８について30分及び(PEG_20KD)₂ Lys−IL８について60分の見掛けの第１のＴ_1/2値を付与する。検出可能な差異は、すべてのタンパク質誘導体間で見掛けの第２のＴ_1/2値に観察されなかったが、しかし１％以下の初期に観察される放射能は2 4時間後、IL−８についての循環に残存すると共に、初期量の６％が(PEG_20KD)₂L ys−IL−８の場合、まだ存在した。例７．タンパク質のNH₂−末端残基の部位特異的改変及び接合：rh−Ｇ−CSFの改変及び接合Ｇ−CSF の改変への同じ方法論の適用は、過ヨウ素酸酸化の標的であるトレオニン（IL−８の場合、セリン）を示すために、Ｎ−末端メチオニンの除去を包含する。Ｎ−末端メチオニンの酵素分解。メチオニン残基を、腎臓ミクロソームアミノペプチダーゼによる酵素消化により特異的に除去した（EC３．４．11．２）。Ｇ −CSF を、50mMのトリス、0.3％ナトリウムラウリルサルコシネート、pH８の緩衝液において５mg／Ｌに濃縮し、そして次に、アミノペプチダーゼ（酵素／基質比、１／20）と共に37℃で20時間、10mMのMgCl₂，2.5mMのPMSF及びベンズアミジン並びに２mg／mlのアプロチニンの存在下でインキュベートした。すべてのそれらのインヒビターが添加され、市販のアミノペプチダーゼ調製物に存在するいづれかの汚染性タンパク質分解性酵素によるポリペプチド鎖のいづれかの分解が妨げられた。次に、アミノペプチダーゼを、10mMの濃度でEDTAを添加することによって不活性化し、そしてその溶液を20mMのトリス(pH8.0)に対して及び水に対して４℃で透析し、そして生成物を、最終的に、３ml／分の流速及び50〜80％溶媒Ｂの線状グラジエントを用いて、250×10nm i．d．Nucleosil Ｃ８カラム上での逆相HPLCにより15分間にわたって精製した。改変されたタンパク質を、ESI−M Sにより特徴づけた。ESI質量スペクトルは、２つの一連の多−電荷イオンを示し、その主な１つは des− Met¹−rhG−CSFに対応し(計算された.,ｍ／ｚ 18820.8 ；実測された、ｍ／ｚ 18821.7±2.2)、そしてマイナーな１つはMet^I−rh−Ｇ−CSF に対応する(計算された、ｍ／ｚ 18951.9；実測された、ｍ／ｚ 18956.1±5.5)。 des − Met^I−Ｇ−CSF の酸化。凍結乾燥された材料を、６Ｍの塩化グアニジンの存在下で、５mg／mlで、0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)に溶解し、そして酸化を、ペプチドに対して５倍過剰の過ヨウ素酸により行なった。暗室において室温で10分間のインキュベーションの後、反応されなかった過ヨウ素酸を、 1000倍過剰のエチレングリコールにより破壊した。酸化を ESI−MSにより確認した(計算された、ｍ／ｚ 18775.3；実測された、ｍ／ｚ 18777±2.7)。ポリマーの接合。５倍過剰の AoA−NH−PEG を反応混合物に添加し、６Ｍの塩化グアニジンを含む 0.1ＭのAcONa 緩衝液(pH4.6)５体積により希釈し、そしてC entricon マイクロ濃縮機上で１体積に濃縮した。希釈及び濃縮を２回くり返した。次に、そのpHを3.6 に調節し、そして第２の５倍過剰の AoA−NH−PEG を添加し、そしてその溶液を室温で24時間インキュベートした。その溶液を、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に対して透析し、塩化グアニジンを除去し、そして接合生成物をＣ８カラム上でのHPLCにより単離した。図３に示されるように、PEG_5KD及び PEG_20KD−Ｇ−CSF の両者を逆相HPLCにより単離したが、しかしPE G_5KD−Ｇ−CSF の場合、この段階の前、20mMのリン酸ナトリウム、1.2ＭのNa₂SO₄ ，pH6.3，50mM のリン酸ナトリウム、５％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール、pH7 .4 の線状グラジエントを15分間にわたって用い、続いて、25mMのリン酸ナトリウムを含む25％の第３緩衝液〜50％ MeOH，pH7.1の線状グラジエントを25分間にわたって用いて、0.6ml／分の流速で、ポリプロピルアスパルタミドカラム上での疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理した。例８．タンパク質のNH₂−末端残基の部位特異的改変及び接合：IL−１−raのアミノ基転換及び接合による改変アミノ基転移。IL−１raのＮ末端配列は Met-Arg-Pro-Ser-Gly-であるので、銅触媒されたアミノ基転移を、タンパク質のＮ−末端の活性化のために用い、続いて、異なった分子量の官能化されたPEG の接合を行なった。濃縮されたタンパク質溶液（40mg／ml）を、2.5Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)により10倍に希釈し；CuSO₄及びグリオキシル酸を添加し、それぞれ、２mM及び 0.1Ｍの最終濃度にした。室温での１時間のインキュベーションの後、反応を、固体EDTAの添加により停止した。次に、その混合物を 0.1ＭのNaOAc 緩衝液(pH4.6)に対して広範に透析し、そして可溶性画分を接合反応のために使用した。ポリマーの接合。反応性ケト基の出現を、AoA−NH−PEGと反応するその能力により特徴づけた。10倍過剰のポリマーをアミノ基転移されたタンパク質に添加し、そのpHを酢酸により3.6 に調節し、そしてその反応混合物を室温で48時間インキュベートした。このようにして構成されたPEG_5KD−IL−１ra，PEG_10KD−IL− １ra及び PEG_10KD−IL−１raを、図４におけるようにして確認した。タンパク質接合体を、ポリ−プロピルアスパルタミドカラム(200×４mm，５μ ｍ，1000A，PolyLC Inc.，Columbia，MA)を用いての疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いて、BioSep−SecS−2000 Phenomenex カラム(600×7.8mm)上でのゲル濾過、及び Mono Ｑカラム上でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。接合体のインビトロ活性。IL−１raは、用量−応答の態様において、皮膚又は滑液線維芽細胞によるプロスタグラジン₂(PG₂)生成の誘発に対するIL−１βの効果を阻害する（Arend など．(1990)J．Clin．Invest．85：1694-1699）。このバイオアッセイは、IL− １β誘発された生物学的応答の阻害を研究するために、IL−１βに対して1000倍過剰の濃度のIL−１raを用いることによって、改変されたIL−１raの生物学的活性の評価を可能にした。表１は、１つのそのような初期アッセイの結果を示す。表１に列挙されるPEG_20KD−des（MRP）IL−１ra形は、下記例９において論ぜられるように酵素分解及び過ヨウ素酸酸化により誘導されるものである。図５Ａ，５Ｂ及び５Ｃ（用量−応答曲線）に示されるように、IL−１β効果は、すべての接合体により用量−応答態様で阻害され、そしてIC₅₀値（IL−１β応答の50％を阻止するのに必要な濃度）を決定し：その値は、それぞれPEG_5KD−IL −１ra（図５Ａ），PEG_10KD −IL−１ra（図５Ｂ）及びPEG_20KD−IL−１ra（図５Ｃ）のために約13，10及び９であった。接合体は、アミノ基転移方法により調製された。純粋なIL−１raのためのIC₅₀値は、約６ng／mlであることが見出された。それらの結果から推定され得るIL−１ra：IL−１βの必要な比は、天然のタンパク質に関するよりもPEG 誘導体に関して高いけれども、多くの場合、10：50の範囲で存続し、その範囲は、異なった細胞系（Arend など.，1990，J．Clin．Invest．85：1694-1697）に関してのIL−１ra（また、Synergen，Inc.により医薬Antrilとも称する）についての文献に記載されている。薬物動力学データ。Antril及びその誘導体を、良く知られているクロラミン− Ｔ法(Hunter，W．M．and Greenwood，F．C．(1962)Nature，194：495-496)により標識した。タンパク質（約 0.5mg）を、0.1Ｍのトリス・HCl ，0.15ＭのNaCl ，pH7.0 の緩衝液に対して透析し、そして約300μｌに濃縮した。次に、この溶液に、500μCiのNaI 及び前記タンパク質のための緩衝液と同じ緩衝液において調製された１％（ｗ／ｖ）クロラミンＴ溶液30μｌを添加した。インキュベーションを、５％（ｗ／ｖ）メタ亜硫酸ナトリウム溶液30μｌ及び50％（ｗ／ｖ）KI 溶液25μｌの添加により90秒後に停止した。放射性ヨウ素化されたタンパク質を、PBS により平衡化され、そして 0.1％ウシ血清アルブミンを含む同じ緩衝液により前もって洗浄されたGF５カラム（Pierce）上で遊離¹²⁵Ｉから分離した。このようにして得られた比放射能は、mgタンパク質当たり100〜300 μCiの範囲であった。 150 ｇ〜200 ｇの体重を有する、Iffa-Credo(L'Arbresle，France)から得られた雌のWistarラットを用いた。約50μｇの¹²⁵Ｉ−ラベルされたタンパク質を尾の静脈にボーラスとして注射し、そして血液サンプルを選択された時間（できるだけ、３，10分、30分、１，３，７及び24時間）で尾から集めた。サンプルの重量を計り、それらの余分な体積を測定し、そしてそれらの放射能を測定した。ラットに静脈内注入された、IL−１ra，PEG_10KD−IL−１ra及び PEG_20KD−IL−１raについての相対的血液レベルの曲線を、図６Ａ及び６Ｂにおいて比較した。図から明らかなように、An trilの見掛けの第１のＴ_1/2（実線を参照のこと）はひじょうに短かく、そして見掛けの第２のＴ_1/2はより一層長く、従って、薬物動力学曲線下での領域に対しての強い影響は有さなかった。最とも重要なことには、それらの予備実験においてさえ、２種の誘導体の見掛けの第１のＴ_1/2値とAntrilのＴ_1/2との間にはっきりした差異が存在する。両誘導体についての見掛けの第１のＴ_1/2値は、改変されていないタンパク質についてのＴ_1/2値よりも有意に長かった。それらの曲線から、純粋なIL−１raについての見掛けの第１のＴ_1/2値は約３分であり、PEG_10KD −IL−１raについてのその値は14分であり、そして PEG_20KD−IL−１raについてのその同じ値は20分であった。すべての３種のタンパク質間の見掛けの第２のＴ_1/2には、検出できる差異は観察されず、そしてすべての動物において、初期に観察された放射能の２％以下の放射能が24時間後、循環中に残存した。ポリマーの質量を高めることによって、すなわちその長さを増すことにより、又は上記で論ぜられたように、１つの部位でポリマーの複数のコピーを付加することにより（多−リンカー型を通して）、その活性に有害な効果を引き起こさないで、接合体の循環半減期を高めることができることは、本明細書に示される結果から明確である。本発明の部位特異的改変法及び試薬のこの結果は、標的分子がポリマーにより、たとえばリシン残基でランダムにラベルされる方法を用いてしばしば見られる結果と鋭く対照をなしている。これまでの技法と異なって、本発明の試薬及び方法を用いれば、生物学的比活性の過度にきびしいさらなる低下を伴なわないで、Ｔ_1/2のさらなる上昇を予測することができる。たとえば、Antrilへの40KDのポリマーの付加（直接的に又は小さいが、しかし連結されているポリマーを用いて得られるようにして）は、生物学的比活性の突然の不良な損失を伴なわないで見掛けの第１のＴ_1/2のさらなる上昇をもたらすであろう。実際、本発明の方法を用いれば、付加されたPEG のMrの機能としての生物学的比活性の傾向が、他の方向に存在することが観察された（図５Ａ，５Ｂ及び５Ｃを比較すること）。さらに、本明細書に示されるように、多 −リンカーの使用は、多−リンカーの分子量よりも思いがけなく高い分子量の単一の線状ポリマーについて観察される効果と類似する効果を達成することができる。たとえば、２種のPEG 鎖が多−リンカ−上に置かれ、そしてIL−８のＮ−末端で部位特異的に配置される場合、その得られる誘導体PEG_2x5KD−IL−８は、20 KDのPEG 鎖の付加に対応する見掛けの分子半径を有する誘導体についてのゲル電気泳動挙動性とほとんど同等のその挙動性を有した（図１を参照のこと）。例９．タンパク質のNH₂−末端残基の部位特異的改変及び接合：IL−１raの酵素切断／過ヨウ素酸酸化及び接合による改変 Met-Arg-Pro の酵素切断及び過ヨウ素酸酸化。セリンを現わすために３個のＮ −末端残基の除去はまた、例６及び７にすでに記載される方法に従っての官能化されたポリマーの接合のためにも考慮され得る。プロリン特異的エンドペプチダーゼ(Seikagaku Corp.，Toko)を、Ｎ−末端トリペプチドの切断のために使用した。消化はPro²残基のカルボキシル側で効果的に生じることが示されたが、しかしひじょうに遅かった。従って、タンパク質を１／10の比での酵素／基質と共に 50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)において30 mg／mlの濃度で、37℃で20時間インキュベートした。次に、タンパク質をBioSep −SecS−2000 Phenomenex カラム上でのゲル濾過により単離し、そしてアリコートを ESI−MSによる特徴づけのためにHPLCにより精製した。異なった類似体に対応する３種の一連の連続したピークが同定され：１つの主要ピーク(16874.5±5. 4D)は予測される生成物 des(Met-Arg-Pro)IL−１ra（計算された値、16872.1D）に対応し；そして他の２種のマイナーなピークの１つのピーク（16785.1±1.5D ）は des(Met-Arg-Pro-Ser)IL−１ra類似体（計算された値、16785.0D）に対応し、そして他の１つのピーク（17125.9±2.ID）はdes-Met IL−１ra（計算された値、17126.4D）に対応する。活性タンパク質（17257.6D）の形跡は検出されなかった。それらの結果は、市販の酵素における汚染性のアミノペプチドの存在と一致する。それにもかかわらず、この方法は、過ヨウ素酸酸化及びポリマー接合を実施するために位置３に十分な量のセリンを現わす良好な手段として思える。タンパク質を、例６に記載される条件と同じ条件下で、１％ NH₄HCO₃緩衝液に溶解された切断されたIL−１raタンパク質に対して５倍過剰のNaIO₂を用いて酸化し、これにより、タンパク質材料の50％がＮ−末端セリンを有することを想定できる。ポリマーへの接合。0.1ＭのNaOAc 緩衝液(pH4.6)に対する広範な透析の後、改変されたタンパク質を、10倍過剰のPEG_20KD−NH−CO−CH₂−Ｏ−NH₂と共に混合し、そしてそのpHを酢酸により3.6にした。室温での40時間のインキュベーションの後、接合生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーにより単離した。そのカップリング反応は、アミノ基転移されたタンパク質との反応よりも明確であることが示された。接合体のインビトロ活性。代表的な接合体PEG_20KD−des（MRP） IL−１raのインビトロ活性は、上記表１に示されている。例10．メトキシポリエチレングリコールの官能化：多価リンカー（PEG−アミノエチル）₂−NH−CO−CH₂−Ｏ−NH₂の合成この多価リンカーは、例３に記載されるリンカーに比較でき、そしてDMSO中、１当量の Boc−NH−Ｏ−CH₂−CONSu によるトリス−（２−アミノエチル）アミンのアシル化により得られた。−置換された誘導体をHPLCにより単離し、ESIMS により特徴づけた（計算されたＭ＋Ｈ，ｍ／ｚ 319.4、実測されたｍ／ｚ 320.6 ）。この材料を10mMのHCl に溶解し、そして凍結乾燥せしめ、そしてさらに、等モル量のヒドロキシベンゾトリアゾール及びDCC の存在下で、DMF中、PEG_5KD−C OOH（残るアミノ基に対して１.２モル過剰）によりアシル化した。その溶液を室温で一晩撹拌し、そして十分にアシル化された誘導体を、蒸留水に対する広範な透析の後、DEAA−A25 及び CMC−25上でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、そして最後に、保護解除し、次の誘導体を得た：酸化されたIL−８への接合を、線状PEG ポリマーについて使用される条件と同じ条件下で実施し、そしてその得られる誘導体を、図１に示されるのと同じ方法に従って単離した。例11．“ワン−ポット”改変及び接合反応上記反応において示されるように、オキシム形成の間の副反応は問題ではなかった。たとえば、図３のレーン１及び２を比較すること。しかしながら、“ワン −ポット”反応が、取り扱い、汚染、装置、時間、等を最少にし、反応間での再生能力及び均一性を提供し、労力時間及び費用を低め、大規模及び商業的製造の開発を促進し、そして診断方法又はキットの場合、使用を単純にするために、所望される。IL−８を、過ヨウ素酸及びアミノオキシ化合物（Ｎα−アミノオキシアセチル、ＮεLC−ビオチニルリシン）の両者と共に同時に混合し、そして適切な反応時間の後、所望する生成物（そのＮ−末端でIL−８により特異的にビオチニル化された）を同定した。驚くべきことには、その反応は、pH8，6.5 及び4.6 で進行した。pH6.5 で、所望する分子のおおよその定量的生成（質量分析法により同定される場合）を伴って、生成物の製造が約３時間で達成された。その反応は他の２つのpHでは、幾分遅く、そしてほとんど定量的ではなかった。その結果は驚くべきことであった。なぜならば、たとえば過ヨウ素酸酸化が保護解除されたアミノ基を必要とし、そして従って、アルカリ性pHを好むが、ところが、オキシム形成は酸性pHでより早いからである。さらに、相当の過剰量で必ず存在するアミノオキシ化合物が、過ヨウ素酸を破壊することが予測された。室温（約20℃）で行なわれる典型的な実験においては、IL−８の溶液（40mMのリン酸（Na）（pH6.5）250μｌ中、2.5mg）20μｌを用いた。この溶液に、最初に、41.5mMのNaIO₄ ２μｌを添加し、続いてすぐに、混合しながら、ＮαAoA，Ｎε−LCビオチニルリシン（下記で調製された）の10mM水溶液17μｌを添加した。３時間後、その反応混合物２μｌを、10Ｍの水性エチレングリコール４μｌと共に急冷せしめた。さらに10分後、その急冷された溶液を、0.1％水性トリフルオロ酢酸500μｌに急速に希釈した。（これは、いづれかのさらなるオキシム化反応を最少にするために希釈により行なわれた。）完全なサンプルを逆相HPLCにより分析した。実質的なピークのみが、所望するビオチニル−IL−８誘導体の既知位置で溶離した。大規反応の生成物は、単離される場合、予想される質量又はエレクトロスプレー質量分光測定を付与した(計算されたｍ／ｚ8891.8；実測されたｍ／ｚ 8 892.8±1.2)。 AoA−LCビオチニルリシンを、Ｎα(BOC−AoA)リシン、及びLC（長鎖）ビオチン（Pierce Chemical Corp．から得られた）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルから製造した。Ｎα(BOC−AoA)リシンを、次の通りに２段階工程により製造した。最初に、Ｎ−ｄ−tert−ブチルオキシカルボニルアミノオキシアセチル、Ｎ−ε−トリフルオロアセチル−リシンを、DMSO ３mlに懸濁されたＮ−ε− トリフルオロアセチルリシン（NovaBiochem，4448 Laefelfingeu,Switzerland） 371mgに、前に記載されたようにして調製され（Pochon、など．（1989）Int．J ．Cancer 43：1188-1194）、そして記載されるようにして改変された(Vilaseca など．（1993）Bioconjugate Chem．４：515-520)、アミノオキシ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル 576mgのDMSO １mlにおける懸濁液を添加することによって得た。次に、Ｎ−エチルモルホリンを、前記懸濁液に撹拌しながら、湿った狭い範囲のpH紙に基づいて外部から示されるような見掛けのpHが約８になるまで、添加した。その懸濁液は、pH８への調整に基づいてほとんどすぐに透明になり、そしてその得られる溶液を室温で一晩放置した。小サンプルの続く薄層クロマトグラフィー（Vilasecaなど．(1993)Bioconjugate Chem．4：515-520 ）処理は、ほとんど又はまったく、ニンヒドリン−陽性材料が残存しないことを示した。反応混合物における残留ヒドロキシスクシンイミドエステルを、同体積の水による希釈及び37℃での１時間のインキュベーションにより破壊した。次に、その混合物を、水32mlにより希釈し、０℃に冷却し、そして酢酸により3.0 の見掛けpH（ガラス電極）にした。次に、その溶液を２つに分け、そして個々の半分を、0.1％水性TFA により平衡化されたChromabond 1000mg（Machery−Nagel，Du ren，52348，Germany）上に配置した。次に、個々のChromabondを前記同じ溶液2 0mlにより洗浄し、そして 0.1％ TFA：アセトニトリル（４：６，ｖ／ｖ）の混合物４mlにより溶離した。アセトニトリルを、濾過された空気の流れ下で溶離物から除去し、そして残る液体を、真空遠心分離により除去した。第２に、トリフルオロアセチル基を、個々の乾燥された溶離物に水３mlを添加し、次にピペリジン330μｌを添加することによりリシンのε−アミンから除去した。その混合物を、時おり撹拌しながら、氷浴に３時間維持した。反応を、氷酢酸500μｌを注意して添加することにより停止し、そして溶液をこの点で凍結保存した。前記方法を続けるために、個々の混合物を水により希釈し、10mlにし、そしてpHを、必要なら、酢酸により3.0 に調節した（ガラス電極）。混合物を、前のようにして２つのChromabonds に適用した。但し、（ａ）所望する画分の溶離を、0.1％ TF A：アセトニトリル（７：３，ｖ／ｖ）の混合物４mlにより行ない、そして（ｂ）個々のChromabondのために、調べられていない材料を続く20mlの洗浄画分と共にプールし、そして再平衡化の後、同じChromabond上に２度通した。個々のChro mabondのために、２つの溶離物をプールし、そして乾燥せしめ、それぞれ約40mg の所望する生成物Ｎ−α−tert−ブチルオキシカルボニルアミノオキシアセチル −リシンを得た。 AoA−LCビオチニルリシンを、まず、DMSO 478μｌにＮα(BOC−AoA)リシン15. 3mgを溶解し、そしてＮ−エチルモルホリン５μｌを添加することにより製造した。これに、DMSO 478μｌに溶解された、LC（長鎖）ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのビオチン化合物53.2mgを添加した。いづれかの成分が、混合の前、溶解しにくい場合、その後、すべてを溶液にする。室温での18時間後、いづれかの過剰活性のエステルを、956μｌのNaHCO₃（水において１％）を添加し、そして2.5時間、待つことにより破壊した。反応混合物を水10μｌにより希釈し、そして60μｌの酢酸の０℃での注意した添加により酸性にした（pH３）。その混合物を、0.1％ TFAにより平衡化されたChromabond分離用カートリッジ、0.1％ TFA 20ml により洗浄されたカートリッジ次に、CH₃CN/0.1％ TFA（１：４，ｖ／ｖ）４mlにより洗浄されたカートリッジ上に負荷した。所望する生成物を、CH₃CN/0.1％ TFA（２：３，ｖ／ｖ）４mlにより希釈し、そして乾燥せしめた。収量は23.8mgであった。乾燥された画分を、CH₃CN 200μｌ及び0.1％TFA 1800μｌに溶解した。その溶液を、必要なら、遠心分離により透明にし、そしてその１mlを、上記Ｃ８分析カラム上に一度に注入した。カラムを、上記20％の第２溶媒により平衡化し、そしてこれを、注入の後、最初の５分で40％にした。次に、その値を、次の100分間にわたって80％にした。所望する生成物は、グラジエントの２つの後者の部分上の主要ピークであった。そのピークを乾燥せしめた。質量分析法は、予想される質量を示した。BOC 基を、TFA 200μｌに前記生成物１mgを溶解することによって除去した。20℃での45分後、その溶液を乾燥せしめ、そしてさらなる精製を伴わないで使用した。例12．メトキシポリエチレングリコールの官能化：PEG−CHOの合成末端ヒドロキシル基を酸化するためには、いくつかの方法がすでに記載されて来たけれども(Wirthなど.，（1991）Bioorganic Chem．19，133-142；Harris M ．M．など．(1984)J．Polym．Sci．Polym．Chem．Ed．222，341)、アルデヒド官能基は、カルボキシ（ベンズアルデヒド）OSu によりPEG−NH₂をアシル化することにより導入された。PEG−NH₂（１ｇ，５０μモル）及びカルボキシ（ベンズアルデヒド）OSu（62mg，250μモル）をDMSO（４ml）に溶解し、その見掛けのpH を、Ｍ−メチルモルホリンにより８〜９に調節し、そしてその混合物を一晩撹拌した。アシル化を、標準のニンヒドリン分析により調節した。次に、その溶液を５体積の蒸留水により希釈し、水に対して広範に透析し、そして最終的に凍結乾燥せしめた。例13．タンパク質のシステイン残基の部位特異的改変及び接合：システイン17でのrh−Ｇ−CSFの改変及び接合Ｇ−CSF を部位特異的に改変するためのもう１つのアプローチは、Cys¹⁷位置で反応性AoA を配置するために、AoA 官能基を担持するリンカーによるCys¹⁷のアルキル化であった。Ｇ−CSF の場合、単一のCys 残基のみが存在した。このためには、次のリンカー化合物を用いた： Boc−NH−Ｏ−CH₂−COHN−(CH₂)₂−NH−CO−CH₂−Br_o Boc 基を除去し、そしてリンカーを、20mMの濃度で、0.1Ｍのリン酸緩衝液（Na ）、pH7.0，５mNのEDTA及び６ＭのGuHCl に溶解されたrh−Ｇ−CSF に急速に添加した。30分間のインキュベーションの後、その溶液を酸性にした。アルキル化されたＧ−CSF を、逆相HPLCにより精製し、そして質量分析法により特徴づけた (計算されたｍ／ｚ 18971.8；実測されたｍ／ｚ 18978.2±7.8)。次に、そのタンパク質を、６ＭのGnHCl を含む酢酸緩衝液(0.1ＭのNa)（pH4.6）に再溶解し、そして PEG−CHO（上記例12からの）と反応せしめた。ポリマー接合の程度は、前の例に記載されるＮ−末端での二段階カップリングで得られたものと比較できた。前記リンカーによるアルキル化が高いpH値（たとえば、pH8.0，pH9.0）で行なわれる場合、ヒスチジン及びメチオニン残基がまた改変されるであろう。例14．タンパク質の部位特異的改変及び接合：rh−Ｇ−CSFの改変及び接合本発明の官能化されたポリマーと反応性の基を含む小さな二価タグを、タンパク質を過剰に添加し、そして従って、タンパク質におけるその創造されたグリオキシリル官能基と急速に反応するであろう。第２段階においては、官能化されたポリマーが、前記タグを通してタンパク質への接合を達成するために添加される。この２段階アプローチは、たとえば立体的な問題及び副反応により引き起こされる問題の両者を回避し、又は最少にすることが所望される場合、有用である。例示される小さな二価のタグは、ビスアミノオキシタグである。H₂N-Ｏ−CH₂CO −Lys(CO-CH₂−Ｏ−NH₂)を、Lys−OMe への Boc−AoA −ONSuの結合、続く、NaO H処理及びTFA 保護解除により合成した（計算されたＭ＋Ｈ，293：１；実測されたＭ＋Ｈ 293.9）。タンパク質上にAoA 基を補充するためには、反応性カルボニル基を有する官能化されたポリマーを接合のために使用した。PEG−NH₂をカルボキシ−（ベンズアルデヒド）−ONSuと反応せしめ、AoA−ダグされたＧ−CSF との反応のための必要なアルデヒド官能基を有するポリマー；すなわち次の最終生成物を得た： PEG−NH−CO−C₆H₄−CH＝Ｎ−Ｏ−CH₂−CO−Lys CO−CH₂−Ｏ−Ｎ＝CH−CO−d es Met¹mG−CSF 。例15．多−アミノオキシリンカーの合成及びタンパク質への接合例10で使用されるトリス（２−アミノエチル）アミンを、DMSO中、Boc−NH− Ｏ−CH₂−COOSu ３当量によりアシル化した。十分に置換された誘導体をHPLCにより単離し、ESIMS により特徴づけた（計算されたＭ＆Ｍ，ｍ／ｚ 665.5、実測されたｍ／ｚ 665.3）。その材料を、１時間のTFA 処理により保護解除し、そしてTFA を回転蒸発により除去した。その材料を水に再溶解し、そして次に、15モル過剰（架橋を回避するために）で、0.1ＭのAcoNa（pH3.6）における酸化されたIL−８と反応せしめた。その接合生成物（２つの遊離AoA 基を担持する）を、HPLCにより単離し、そしてESIMS により特徴づけた（計算されたＭ＆Ｍ，ｍ／ｚ 8698.6、実測されたｍ／ｚ 8696.0±0.5)。この接合体を PEG−CHO と反応せしめ、２つのポリマーをアームに持つ誘導体、すなわちビーポリマー含有官能化ポリマーが生成され得る。他の多アーム構造体、すなわち多−ポリマー含有官能化ポリマー構造体は、特に、ポリマー接合体のアームがタンパク質の免疫原性を低める場合に構成され得る。実際、３〜10個のアーム、好ましくは４〜６のアームを担持するリンカーがより適切であろう。そのような構成は、最初の反応において、タンパク質に、下記構造： H₂N−Ｏ−CH₂−CO−Ｘ−(Lys(Ser))n 〔ここで、Ｘは未反応タンパク質からの接合生成物の分離を促進するペプチト又は非ペプチド構造体であり、そしてｎは上記で定義されたような結合されるポリマーの数である〕で表わされるペプチドリンカー、又はＮ−末端セリン残基を有するその対応する樹枝状形リンカーを結合することによって得られる。追加のスペーサー基は、リシン残基間に導入され得る。第２の反応においては、導入されたリンカーのセリン残基が酸化され、そして次に、前記例に記載されるように、タンパク質にｎ個の鎖を共有結合するために、PEG−AoA 官能化ポリマーと反応せしめられる。本明細書に記載されるすべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。本発明は十分に記載されて来たが、多くの変更及び修飾が、本発明の範囲内で行なわれ得ることは、当業者に明らかであろう。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Functionalized polymers for site-specific bindingIntroduction Technical field The present invention relates to the preparation of functionalized polymers. More specifically, the present invention By covalent attachment of functionalized polymers, especially polyalkylene oxide polymers , Target molecules, such as biological macromolecules, especially biologically important polypeptides, and other Polydisperse polymers such as plastics (eg polyethylene or nylon) )) A reagent and a method for site-specific chemical modification.background Preparation of polyethylene glycol-modified polypeptide compared to parent polypeptide Reduce immunogenicity and antigenicity and also have a longer lifespan in the bloodstream. (Abuchowski and Davis (1981) “Enzymes as Drugs”, Holcenberg and R oberts, eds., p367-383, John Wiley & Sons, N.W. Y.). Modified polypeptide Their beneficial properties are useful in a variety of therapeutic applications, such as enzyme therapy. Make it very useful. Polyethylene glycol ("PEG") for proteins In order to effect the attachment of the polymer, the hydroxyl end group of the polymer is first Should be converted to Noh. This process is sometimes referred to as "activation" and The product is then called "activated PEG". One end is protected by a protecting group. The other end with an electrophilic group that is reactive with an amine on the protein molecule. Methoxy polyethylene glycol ("mPEG") derivative supported on But has been used in most cases. Activities used for the preparation of therapeutic enzymes One of the most common forms of modified PEG is methoxy-poly (ethylene glycol). B) succinoyl-N-hydroxysuccinimide ester (Abuchowski Such. (1984) Cancer Biochem. Biophys. 7: 175-186). However, one The main drawback is that the ester bond between the polymer and the succinic acid residue It has limited stability. Preparation of urethane-conjugated PEG-protein The use of PEG-phenyl carbonate derivatives has been reported (Verones e, etc., 1985). However, the hydrophobic phenol residue (p-nitrophene) Ethanol or 2,4,5-trichlorophenol) is toxic and Has an affinity for quality. The binding of reporter groups, ligands, etc. to proteins is usually performed on the side chain of a lysine residue. Proceed in a random manner through the primary amino acids above. Linked by lysine residues Several PEG-derivatives have been synthesized. PEG hydroxyl end groups are typical Is converted to a reactive functional group that can covalently attach PEG to the protein of interest. These PEG-derivatives include: 2- (alkoxypolyethylene) (Glycoxy) -4,6-dichlorotriazine (Abuchowski et al. (1977) J. Biol . Chem. 252: 3578-3581); 2- (alkoxypolyethyleneglycoxy) -N- Succinimidyl succinate (Abuchowski et al. (1984) Cancer Biochem. Bi ophys. 7: 175-186); 2- (alkoxypolyethyleneglycoxy) -2,2, 2-trifluoroethane (Delgado et al. (1990) Biotech. Applied Biochem. 12: 119-128); 2-alkoxypolyethylene aldehydes (Andres et al. (199) 0) Biotech. Tec. 4: 49-54); 2-alkoxypolyethyleneglycoxymethyl Epoxides (Andrews et al. (1990) Biotech . Tec. 4: 49-54). EP539167 (1993) describes the reaction with amino groups of proteins. A PEG modified by a terminal imidate group has been reported. A major disadvantage of all of the above methods of protein PEGylation is that polymer conjugation is Randomly and non-site-specifically, typically amino groups such as lysine side chains and N -Occurs at the terminal amino group, such that more than one polymer group Biological activity, such as substrate binding or reporter binding, and conjugation The preparation of the body, in particular, the reaction is random and the choice of various target residues Typically non-uniform in view of the fact that they are not complete due to You. Furthermore, the alteration of the charge on the target molecule is typically due to a coupling reaction, especially Caused by polypeptides based on modification of free amino groups. On amino acid residues Introduction of charges to uncharged residues or removal of charges present on amino acid residues Changes in charge based on deletion or masking can disrupt the tertiary structure of the protein and Biological activity of the protein by several mechanisms, including active site disruption Adversely affect Such changes in charge typically occur until derivatization is complete. It accumulates because it is applied. Typically, the molecular method of a polypeptide is performed using the methods described above. Reducing the number of brittle polymers often reduces steric accessibility of the active site. The biological activity owned by the unmodified polypeptide. Decrease the sex. Polyethylene glycol modified TNF-α A typical example that resulted in complete loss (Tsutsumi et al. (1994) Jpn. J. Ca. nc. Res. 85, 9-12). In view of the many possible uses of polymer conjugated molecules, and in particular, PEG-polypeptides From technical focus on peptides to modification of target macromolecules or materials, such as surfaces Of polymers functionalized for use in There is a need in the art to increase repertoire. Therefore, functionalized PE G specific to the functionalized polymer in addition to the current method of polymer attachment, and The need for a method to enable overcoming the drawbacks observed in the method Exists in the industry. For example, without dramatically changing the charge present on the residue, Alternatively, do not introduce a group at a position that tends to interfere with the binding properties of the target molecule. A child residue, for example, an amino acid residue of a polypeptide, and Linked through a chain that is stable under various conditions, especially under physiologically relevant conditions There is a need in the art to provide a functionalized polymer. Therefore, Homogeneous preparation of easily synthesized macromolecules of defined structure with defined linking chains There is a need for reagents and methods for constructing Is the rapidity and mildness of synthesis; substantially high yields; variety of projects; and biochemistry It readily provides applicability to configurations with the diversity of classes of compounds. In the present invention The reagents and methods provided provide their needs as appropriate and others.Summary of the Invention The present invention provides an organic polymer through an oxime chain at a unique site on the target polymer. Polymers, preferably water-soluble organic polymers, more preferably PEG or dextran. By amino-oxy or aldehyde (or ketone) derivatives, target macromolecules, For example, proteins, peptides, other organic compounds such as plastics or surfaces For site-specific and chemoselective modification of wood-containing polymers under mild conditions Methods and compounds are provided. PEG and PEG, referred to as "functionalized" polymers And other novel amino-oxy derivatives of water-soluble polymers (forming oxime-chains) Can be provided). Of the present invention Through the use of functionalized polymers containing two or more monopolymers, one or more The water-soluble polymer is a preselected single on individual target macromolecules under mild conditions Site-specifically and chemoselectively. Another aspect of the present invention is a site-specific functionalized water-soluble polymer derivative. To provide a method for preparing a covalently modified protein. You. The invention relates to a functionalized polymer wherein the number of polymer repeat units is an integer from 5 to 2000. Offer a ma. The present invention also relates to a polymer compound wherein the number of polymer repeating units is an integer of 5 to 2000. The oxime-forming group is covalently attached to the polymer and the oxime-forming group is Optionally reacting with a compound containing an oxime-forming group, which is present in a deprotectable form. Preparing a functionalized polymer containing oxime-forming groups, comprising the steps of Provide a way to The present invention further provides for site-specific reactivity and oxime-chain formation to occur. Oxime-forms that are complementary in reactivity to the functionalized polymers of the present invention Providing a functionalized modified target molecule, preferably a polypeptide, having a reactive group You. The invention further relates to a modified target macromolecule, i.e., a polymer or a plurality of polymers. Is covalently linked to a unique site on the target polymer through a single oxime chain Wherein at least one organic polymer is site-specifically bound to the A polymer conjugate comprising a peptide is provided. The present invention also provides for providing an actively complementary first oxime-forming functional group. The target macromolecule is the second oxime present on the functionalized polymer of the present invention. Functionalized by a forming functional group, and an oxime bond is formed between the first functional group and the second functional group. As formed between Reacting the functionalized target polymer with the functionalized polymer A method for preparing the polymer conjugate under mild conditions, including the floor. Offer. Structure under mild conditions to a single site on the target polymer through an oxime bond Enables site-specific chemoselective ligation of the body (and thus all of its polymers) Multi-polymer containing amino-oxy-functionalized or aldehyde (or ketone) )-A functionalized polymer structure is also provided. Each structure is in the same system In terms of topology, but different in molecular weight (average) A family of unfunctionalized polymer structures is also provided. Their use The method may include the desired biological or physical property, such as enhanced pharmacokinetics. Although topologically different from those that can be identified as behavioral macromolecules, , But not molecularly distinct target macromolecules, preferably biologically important Includes systematic modification of the target macromolecule to rapidly create a family of proteins. Accordingly, the present invention provides a method for systematically modifying the Stokes radius of a target polymer. Wherein the method comprises the steps of: Polymer, preferably a multipolymer-containing functionalized polymer, in a separate reaction At the joint, and then determine the effect of the joint on the Stoke radius Steps. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the target molecule drug The kinetic behavior is systematically altered. Kits are provided having suitable reagents for performing the methods of the invention.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows different functionalized PEG polymers and oxidized IL-8. 2 shows an SDS-PAGE gel under non-reducing conditions, showing the transfer of the conjugate with the conjugate. All places In that case, a single derivative was obtained in the conjugate reaction. Lanes 1, 3, 5, 7: AoA-PEG respectively_5KD, AoA-PEG_10KD, AoA-PEG_20KDAnd AoA-N- (PEG_5KD)_Two Of incubation for 20 hours with oxidized IL-8. AoA-N- (PEG_5K _D )_TwoIs (PEG_5KD−CONH (CH_Two)_Two)_TwoN- (CH_Two)_Two—NH-AoA. Lanes 2, 4, 6, 8: purified conjugated PEG_5KD-IL-8, PEG_10KD-IL-8, PEG_20KD-IL-8 And (PEG_5KD)_Two-IL-8. Lane 9: oxidized IL-8. Lane 10, i.e. Protein molecular weight marker: from the top to the bottom, phosphorylase B (97.4KD), Bovine serum albumin (66.2KD), ovalbumin (45KD), carbonic anhydride Dorase (31KD), soybean trypsin inhibitor (21.5KD), lysozyme (14.4 KD). “KD” indicates kilodalton. FIG. 2 shows the migration of IL-8 obtained with different functionalized polymers. 3 shows a DS-PAGE gel. Lane 1: IL-8. Lanes 2, 3, 4: PEG_5KD−IL-8, PEG_10KD-IL-8, PEG_20KD-IL-8. Lane 5: IL-8-PEG_20KD-IL-8 (da Immer, "dumbbell"). Lanes 6, 7: (PEG_10KD)_Two Lys-IL-8, (Lys-P EG_5KD) -IL-8. Lane 8: Dextran_9KD-IL-8. Lane 9: protein The molecular weight markers are the same as in FIG. PEG_5XD−PEG_10KD−PEG_20KD−IL -8, IL-8-PEG_20KD-IL-8 and (PEG_10KD) -Lys-IL-8 is a single band As (Lys-PEG_5KD)_Five-IL-8 and dextran_9KD-IL-8 is Evidence was given on the gel. Figure 3 shows PEG functionalized with des-Met-G-CSF._5KDAnd PEG_20KDTransfer of conjugate with 2 shows an SDS-PAGE gel showing the behavior. Lane 1: des-Met-G-CSF. Lane 2: Ao A-PEG_5KDAnd oxidized des-Met -Results of a 24-hour incubation with G-CSF. Lane 3: purified PEG_Five _KD -Des-Met-G-CSF. Lane 4: oxidation after 24 hours incubation AoA-PEG to des-Met-G-CSF_20KD Coupling. Lane 5: purified PEG_20KD-Des-Met-G-CSF. Lane 6: protein molecular weight marker is shown in FIG. It is as in. FIG. Interleukin-1 receptor antagonist protein ("IL-1 ra ”) functionalized AoA-PEG_5KD, AoA-PEG_10KDAnd AoA-PEG_20KDJoining. Lane 1: IL-1ra. Lane 2: after incubation at room temperature for 48 hours, AoA-PEG to trans-transferred IL-1ra_10KDCoupling. Lanes 3, 4, 5 : Purified conjugate PEG_10KD-IL-1ra, PEG_5KD-IL-1ra and PEG_20KD-IL-1 ra. Lane 6: protein markers are as in FIG. FIGS. 5A, 5B and 5C show dermal fibers in the presence of decreasing concentrations of IL-1ra derivatives. Dose showing inhibition of IL-1β induced prostaglandin E2 production by blast cells -Shows a response curve. FIG. 5A shows PEG_5KDFIG. 5B is a curve for −IL-1ra. PEG_10KDFIG. 5C is a curve for IL-1ra, and FIG._20KD-IL-1ra It is a curve about. In each case, the conjugate supplies the activated protein Prepared as described in Example 8 using transamination. Each point is , Due to the average of the three prostaglandin measurements, from which buffer only -1ra (also referred to herein as "Antril" (from Synergen, Inc.) And prostaglandins obtained when used in place of derivatives The average of the measurements was subtracted. The variability of the mean value was Not unusual. For clarity, the three Antril derivatives Dose-response curves are plotted separately (dotted line and error bar) and at each time point: The same standard curve obtained by Antril was plotted (solid line and error bar). FIGS. 6A and 6B show the pharmacokinetics of unmodified IL-1ra. PEG in the unit_10KD-IL-1ra (FIG. 6A) and PEG_20KD-IL-1ra (FIG. 6B) Show pharmacokinetics. For clarity, the results for the two derivatives were separately (Dotted line) and, at each time point, the same as obtained for unmodified Antril. The result of the pair was plotted (solid line). Blood samples were taken at 3, 10 and 30 minutes And at 1, 3, 7, 12, and 24 hours. Each point is a single animal This shows the decision. Unaltered Antril shows initial drop between 30-180 minutes After that, there was a slow rise in blood levels. Such unpredictable behavior is Not observed for other investigated proteins used under the same experimental conditions Was. Some or most of the injection solution escapes the tail vein and accumulates subcutaneously Animals that showed clear evidence (excess radioactivity remained at the injection site, followed by normal Rather than a biphasic index decline, a slow rise in blood levels follows the initial decline. Followed) was discarded. FIG. 7 shows IL-8, PEG_20KD-IL-8, IL-8-PEG_20KD-IL-8 and (PEG_20KD )_Two 4 shows the pharmacokinetics of Lys-IL-8. Blood samples at 3, 7, 15, and 30 minutes And at 1, 3 and 7 hours. Each point represents the average of four animals. Dumbbells and multi-arm structures are needed to improve the life of IL-8 in the bloodstream. It looks as the most effective conjugate.Description of specific embodiments The present invention relates to a polymer, preferably a water-soluble polymer such as PEG , A novel modification test which is an amino-oxy derivative of polyethylene glycol Provide medicine. The reagents of the present invention covalently bind various polymers to the target macromolecule of interest. Can be used to match. Particularly, in the case of biologically important macromolecules such as polypeptides, An important advantage is that the target polymer is soluble in water without substantially reducing the biological activity of the polymer. To a lower degree than the biological activity. A decrease in its biological activity may activate other than the site-specific active compound of the present invention. Macromolecules (typically lysine residues for polypeptides) ) Is reduced by the attachment of the same water-soluble polymer to a plurality of residues located in And The term "biological activity" refers to enzymatic activity, binding to receptors (including antibodies). Include the ability to bind, bind ligand, elicit an immune response, and the like. Include. A “complementary reactive functional group” is one that reacts chemically with a complementary member of a pair. Defined as one of a pair of functional groups. For example, amino-oxy-acetyl (" AoA ”) and glyoxylyl (“ GXL ”) react to form an oxime bond Are complementary reactive functional groups. The term "chemoselectively linked" occurs between complementary, orthogonally chemically reactive groups. Shows specific ligation. Complementary functional groups as used in the present invention are other groups present or applied. Groups that can be used without compromising other chemistry. Therefore, in the context of this application According to one example, the "amino-oxy-acetyl group is the most preferred functional group. Of course, multiple residues of the target polypeptide may be functionally different from the functional groups on the polymer of the invention. Those containing functional groups that react differently and complementarily If individual residues of are functionalized first, the functionalized polymer is appropriately modified Obviously, it can be used for non-site specific binding to target molecules. Functionalized polymers are site-specific by covalent conjugation through an oxime chain Is bound to the target polymer. "Covalently conjugated" or "conjugated" Means the attachment of the polymer to the target through the polymerized polymer. “Sensuality” or “ "Functionalized" means, for the purposes of the present invention, that the polymer is a complementary functionalized target Oxime-forming reaction on the polymer so that it can be site-specifically conjugated to the polymer The bonding of the functional groups will be described. Generally, PEG or POG (ie, polyoxyethyl Glycerol) molecules can bind reactive groups to terminal hydroxyl groups Activated or functionalized, and then the functionalized polymer is labeled Aldehyde group introduced site-specifically into the target molecule. Bonding Occurs between any reactive amino acids on a protein, said reactive amino acids being typical Is lysine, and lysine is PEG or PO through its free ε-amino group. Compared to the typical conventional method of conjugation, which is linked to a reactive group on G, the present invention Of functionalized polymer reagents to a single preselected site on the target molecule Site-specifically through a defined oxime chain. A “target macromolecule” as used herein is at least 500, more preferably Or at least 2000, even more preferably at least 5000, most preferably Are organic molecules with a molecular weight of at least 10,000 (both biological and inorganic components Including organic molecules). “Functionalized target polymer” Target macromolecules that have been site-specifically modified to include shim-forming functional groups. Target macromolecules can be derived from natural, recombinant or synthetic sources. You. The term “functionalized water-soluble polymer reagent” as used herein, Providing site-specific conjugation of a water-soluble polymer to a target polymer through an oxime chain Refers to a water-soluble polymer that has been modified to include a functional group. According to the method of the present invention If so, the target macromolecule is placed on the polymer, preferably at one of its ends (or bifunctional In the case of polymers, amino-oxy or aldehyde functions introduced at both ends) Site-specific to include functional groups that are complementary in oxime-forming reactivity with the group Is modified. Polypeptide at an amino acid residue, preferably at the C- or N-terminus By providing a water-soluble polymer reagent that can be site-specifically attached to Adverse effects through multiple couplings at amino acid residues located throughout the protein Proteins without substantially adversely affecting the biological activity of the affected protein. It becomes possible to bond a water-soluble polymer to a substrate. A "homogeneous" polymer conjugate composition of the present invention is defined as substantially all conjugate molecules. Substantially identical chemical structures (each having a range in molecular weight of the attached polymer Present but having the same number and position of attached polymers) Mention the product. The average of the molecular weight range is typically referred to herein for functionalization. As found in commercial preparations of the polymers used; preferably That range is that obtained after further size fractionation of the commercial preparation. This It differs at least in the position and number of polymers to which the individual molecules are attached Provides a sharp contrast to typical polymer conjugate compositions. The compositions of the present invention also include Substantially all of the individual molecules in the polymer conjugate are substantially identical to each other. Such a "self-identity" composition may also be referred to. Here, "substantially all "Individual bonded polymers are not of the same size, , All of which have the same position and number of attached polymers Means at least 80% of the molecule. Increasing the degree of purity, eg 90%, 95%, 98 %, 99%, 99.5%, 99.8%, etc., the increase in purity from 100% to much more All in all "is an increasingly preferred meaning. As will be readily appreciated from the perspective of the present invention, a homogeneous polymer conjugate composition The product can be comprised of a homo- or hetero-polymer, where the hetero-polymer and Is, as defined herein, the chemical type or MW (average ), Wherein each of said polymers can be present in its molecular weight average You. As discussed in the remainder of the application, heterobi or heteropoly-polymer functionalization -When the polymer is attached to the target molecule, the polymer attached at that single site Not all of the molecules are identical, but nevertheless, the composition is described herein. It can be homogeneous as defined. In one embodiment of the present invention, a functionalized complementary marker through an oxime linkage Formulas of compounds useful for attaching the polymer to a macromolecule, such as a polypeptide Is as follows: PX-O-NH_Two [Where P represents an organic polymer, preferably a water-soluble polymer, and X represents a space. Represents a sir group, -O-NH_TwoRepresents amino-oxy]. Interesting water-soluble organic The polymer is preferably attached to the polymer backbone, a convenient site for functionalization And can be selected from the following known water-soluble polymers (But not limited to): (a) dextran and dextran Derivatives such as dextran sulfate, P-amino crosslinked dextrin And carboxymethyl dextrin, (b) cellulose and cellulose derivatives Such as methylcellulose and carbo Xymethylcellulose, (c) starch and dextrin, and invitation of starch Conductors and hydrolysates, (d) polyalkylene glycols and their derivatives, For example, polyethylene glycol, methoxy polyethylene glycol, polyethylene Glycol homopolymer, polypropylene glycol homopolymer, ethylene Copolymers of glycol and propylene glycol, wherein the homopolymer and And the copolymer may be unsubstituted or substituted at one end by an alkyl group, wherein (e ) Heparin and fragments of heparin, (f) polyvinyl alcohol and poly Vinyl ethyl ether, (g) polyvinylpyrrolidone, (h) α, β-poly [( 2-hydroxyethyl) -DL-aspartic acid amide], (i) polyoxyethyl And (j) a polynucleotide such as deoxyribonucleic acid. Nucleotides, ribonucleotides and their phosphate-backbone-modified derivatives, e.g. If phosphorothioate derivatives. Preferred polynucleotides are biologically important Oligonucleotides homologous to the polypeptide, preferably of viral or mammalian origin Is a reotide and can include an antisense sequence. Water-soluble polymer reagents include polypropylene glycol ("PPG"), polyoxy Ethylated polyol ("POP"), heparin, heparin fragments, Kisstran, polysaccharides, polyamino acids such as proline, polyvinyl alcohol (“PVA”), and other water-soluble organic polymers, but only these Not limited. The water-soluble polymer reagent of the present invention is a polyethylene glycol homopolymer. Rimer, polypropylene glycol homopolymer, ethylene glycol and propylene Copolymer with renglycol (where the homopolymer and copolymer are not Or substituted at one end by an alkyl group), polyoxyethylated Polyols and polyvinyl alcohol Alcohol, polysaccharides, polyvinyl ethyl ether, and α, β-poly [(2- Hydroxyethyl) -DL-aspartic acid amide]; and other water-soluble organic poly And amino-oxy derivatives of the mer. U.S. Pat. No. 4,179,337; 4,6 No. 09,546; No. 4,261,973; No. 4,055,635; No. 3,960,830; No. 4,415,665 No. 4,412,989; No. 4,002,531; No. 4,414,147; No. 3,788,948; No. 4,7 No. 32,863; 4,745,180; EP 152,847; EP 98 No. 5,792,435 (published Jan. 11, 1984); Japanese Patent No. Accordingly, various polymers that can be functionalized are described, and they are incorporated by reference. Incorporated herein. Preferably, the water-soluble polymer P is dextran and Dextran derivatives, dextrins and dextrin derivatives, polyethylene glycol Selected from cole and its derivatives. Most preferably, the water-soluble polymer P is , Polyethylene glycol and derivatives thereof, polyethylene glycol Is particularly preferred (to avoid cross-linking between proteins) To). Polyoxyethylated water-soluble polyols are also useful in the present invention It is. They are polyoxyethylated sorbitol, polyoxyethyl Glucose, polyoxyethylated glycerol ("POG"), etc. Is included. POG is preferred. Glycer of polyoxyethylated glycerol The roll backbone can be used, for example, in animals and humans in mono-, di-, tri-glycer It is the same backbone as naturally occurring as a metal. Therefore, this branching affects the body. And is not always found as a foreign substance. POG is preferred in the same range as PEG. It has a new molecular weight. The structure of POG is Knauf and others. (1988) J. Biol. Che m. 263: 15064-15070, and are generally described herein. PEG or its derivative in the formula Can be exchanged. Use of a polypeptide modified by the water-soluble polymer reagent of the present invention as a medicament If done, the polymer P should be non-toxic and preferably non-immunogenic. Since polymer P contains various amounts of multiple repeating units, the molecular weight of P varies considerably. It will be understood that Further, P is said to have a constant molecular weight In some cases, the molecular weight is only an approximation and is related to the number of subunits in the molecule. Represents the average molecular weight of a group of different molecules P with respect to each other. Typically, P is about 200-200,000, preferably about 400-50,000, more preferably 1,000-60, 000, and even more preferably will have a molecular weight in the range of 2,000 to 40,000 . The appropriate molecular weight for P is such that the functionalized polymer is attached to the polypeptide. Will vary according to the particular protein being modified and the purpose of the modification. U. The spacer group X is optionally present. The present invention relates to a phase capable of forming an oxime chain. Provide a functionalized polymer wherein the complementary reactive groups are amino-oxy groups. Like A new one is amino-oxy-acetyl ("AoA"). In fact, interested Additional structures (X or spacer groups) linking the amino-oxy group to the rimer are used. Can be used. The spacer group X may be substituted or unsubstituted, branched or Is a linear aliphatic or aromatic group such as phenyl or C₁-C_TenAlkylene Min, C₁-C_TenAlkyl groups, or combinations thereof, or amino acid chains (eg, flexible Soft hinge or loop sequences (eg, Argos, J. Mol. Biol. (1990) 211: 94 3-958), or a nucleic acid chain or a sugar chain or a lipid chain, or a combination thereof. Represents a non-reactive group comprising and may contain heteroatoms. PX −ONH_TwoIn a preferred embodiment of X is -CH_Two-Or -CHOH-, or More preferably -CO-CH_Two-Or -NH-CO-CH_Two-. For example, In Example 1, X is AoA-MPEG: CH_Three-O- (CH_TwoCH_TwoO)_nCH_TwoCH_Two-NH-CO-CH_Two− O-NH_TwoAt -NH-CO-CH_Two-. Linked structure with additional amino-oxy group The amino-oxy function, when present on a functionalized polymer group present in The spacer groups adjacent to the groups are not critical; however, those spacers The requirements of the groups are that they must be between the amino-oxy group and its complementary aldehyde group. Do not interfere with the formation of the oxime chain of They have the amino-oxy group It should not react preferentially with aldehyde groups or the reaction is sterically hindered. It should not be conferred, nor should the reactive groups be deactivated. The conjugated polymer is the antigen or When used for immunogenic purposes, spaces themselves are not strongly immunogenic. It will be apparent to one skilled in the art that a sir group is selected. Bonded polymer bonds When used for purposes, preferred spacer groups are binding, binding activity, formation Enhances properties such as stability or solubility of the product, or at least enhances such properties Do not interfere. The spacer group X is selected to enhance the hydrolytic stability of the oxime chain. obtain. The hydrolytic stability of oximes is affected by their structure; It shows that the oxime stability increases in the following order: -CO-NH-CH_Two−CH = N-O-CH_Two-≤-CO-NH-CH_Two-C (R) = NO-CH_Two-<-NH-CO-CH = N -O-CH_Two− <− C₆H_Four-CH = NO-CH_Two-. Enhanced oxime stability Obtained by the presence of an aromatic group in the In a further aspect of the invention, the functionalized polymer is difunctional and comprises That is, it will have two oxime-forming groups. Those groups are reactive Not complementary to each other. Preferably, the two groups are distal to the polymer Non-interfering (forms an oxime bond ), More preferably at individual termini. Was For example, a dihydroxypolyalkylene glycol has an amino-terminal at its individual terminus. As taught herein to obtain polymers having oxioxime-forming groups Functionalized. Bis-aminooxy polymers are site-specifically functionalized according to the present invention. Reacts with the target polymer, resulting in a “dumbbell” structure where the oxy The polymer through the rubber chain is a first functionalized target polymer and preferably a second functionalized target polymer. A second functionalized target polymer identical to that of It acts to link through each of the home-forming groups. The first and second polymers If is different, a hetero-dimer may be formed. Hetero-dimers are For example, a continuous reaction of a first and a second functionalized polymer (eg, two types of Polymer conjugation in which only one of the polymer reactive groups is linked to a first target polymer First and second functionalities present in the same molar ratio) Can be formed by a single reaction of the polymerized mixture with the polymer. The present invention Dumbbell structures and their compositions are site-specifically linked target macromolecules, preferably Or polypeptides that are biologically important, By comparison, it provides a structure with a defined structure and a homogeneous composition. Bifunctional polymer A preferred embodiment comprises two amino-oxyacetyl (AoA) groups. Especially preferred AoA-PEG-AoA (where PEG or a derivative thereof contains a polymer component) It is. In a further aspect of the invention, the oxygen atom of the amino-oxy group is replaced by a sulfur atom. Where the aldehyde or ketone functionality on the target polymer Chemoselective ligation creates a thio-oxime bond -C (R) = N-S-. In another embodiment of the present invention, there are di- and multi-polymer containing A functionalized polymer is provided. The functionalized polymers of those embodiments are The following general formula: (P)_m L-X-O-NH_TwoOr (P)_m L-X-C (R) O wherein P is the present invention An organic polymer as defined in the description, wherein m is 2 to 10, more preferably 2 to X is a spacer group as defined herein, and -O- NH_TwoIs amino-oxy and —C (R) O is aldehyde when R is hydrogen. And L represents the individual P (number of m) is separately and covalently linked And the valency of L is at least m + 1. You. When -C (R) O is a ketone, R is preferably C₁~ C_Ten, More preferred Kuha C₁~ C_FourIs a straight-chain or branched alkyl group. Aldehyde or ketone functionalization In the polymer, the X spacer adjacent to the aldehyde or ketone functional group The groups present are not critical; however, the requirements of those groups are that Does not interfere with the formation of an oxime linkage between the compound and its complementary amino-oxy group That is. They should react with amino-oxy in preference to aldehyde groups. And should not add steric hindrance to the reaction or inactivate the reactive groups. No. The linking group does not react with other functional groups present, but as it does When designed, unwanted measures (ie, reducing the homogeneity or activity of the product) Means) should not be so. The spacer group is preferably substituted or Unsubstituted aliphatic or aromatic groups such as phenyl or C₁-C_TenArchi Ren component, C₁-C_TenAlkyl groups, or combinations thereof, or amino acid chains (eg, For example, flexible hinge or loop sequences (eg, Argos, J. Mol. Biol. (1990) 211: 943-958), or nucleotide chains or sugar chains, or lipid chains or them Represents a non-reactive group comprising a combination of Can contain atoms. Preferably, the oxime-forming group is -XC (R) O. X comprises CH_Two-, -CO-, or -CHOH, more preferably -C₆H_Four- Comprising a spacer group. Aldehydes and OHC-CO- or glyoxyli Also preferred are spacers comprising thiol ("GXL"). In a further aspect of the invention, the oxygen atom of the amino-oxy group is a sulfur atom. In which case the reaction with the aldehyde or ketone functional group is Generate a system bond -C (R) = N-S-. In the case of the bi- and multi-polymer functionalized polymers of the present invention, the functionalization to the target polymer Site-specific conjugation of the resulting polymer is attached to the multivalent L-structure -O-NH_TwoOr -C Site-specific binding of multiple polymers through a single oxime chain via the HO group Sprinkle. The amino-oxy-functionalized polymer is an aldehyde (or Keto) Methods available for introducing functional groups and of the methods taught herein Therefore, it is partially preferable to the aldehyde embodiment. Thus, the bi- or multi-polymer containing functionalized polymer may be the same or different. A single pre-selection of the same polymers onto the target polymer Allows binding to the site. When L is a trivalent group, n is 2 (this specification (See Examples 2 or 10). Preferably, the valence of L is m + 1 Wherein one valence of L is optionally occupied through X by an oxime-forming group. And the remaining valence of L is occupied by one or more, ie, m, polymers. Is done. The structure of L is not critical and sterically hinders the oxime reaction followed by L There is no link connecting L to the polymer unless It does not change. L does not react with other functional groups present. Functionalized polymer Of the linking group L Individual arms or valencies are preferably substituted or unsubstituted aliphatic Or an aromatic group such as phenyl or C₁-C_TenAlkylene component, C₁-C_TenAl Kill groups, or combinations thereof, or amino acid chains (eg, flexible hinges or loops). Sequence (see, eg, Argos, J. Mol. Biol. (1990) 211: 943-958), Or a non-reactive material comprising a nucleotide chain or a sugar chain, or a lipid chain or a combination thereof. It comprises a reactive group and can contain a heteroatom. Bonding with polymer , Preferably all but one arm or valency of L is on the polymer Functionalities that can specifically react with groups located at the ends of the polymer, preferably Group. The remaining valencies are the oxime-forming functionality (the functionality may optionally be protected Protected for later reaction with a compound that is Or, on the other hand, is occupied by the compound. Polymer conjugate is resistant When used for immunogenic or immunogenic purposes, they are not themselves strongly immunogenic. It will be apparent to those skilled in the art that a suitable linker group is selected. Polymer conjugate is bonded When used for purposes, preferred linker groups are binding, binding activity, product Enhance or at least interfere with properties such as stability or solubility Absent. The binding structure is capable of forming an oxime with a complementary functionalized polymer of the invention. A similar assembly through (P)_mTo assemble the L-structure As used, may itself contain the valence occupied by the oxime-forming group it can. Accordingly, co-pending U.S. patent applications 08 / 057,594, 08 / 114,877 and 08 / 057,594 and co-pending international application PCT / IB94 / 00093, which are hereby incorporated by reference. The basic structure described in (incorporated in the textbook) is used for use as an L structure. Is appropriate for The oxime-forming group of the basic structure is capable of reacting with other complementary reactants. May be substituted by a group; however, However, most preferably, oxime formation is used for assembly. Non Oxime Chemistry (P)_m For examples used for L-assemblies, see See Example 4 in the specification, where L is an individual, including a covalently bonded polymer. A pentalysyl peptide having a lysyl residue (where m is 5), Thus, the peptide N-terminus contains an oxime-forming group. Preferred L structures are Derived from a lamine compound, where either two amino groups are attached to the polymer Respectively, and the remaining amino group is used for the introduction of the oxime-forming group. Available for Preferred tri-amines are of the formula N (R5-NH_Two)_ThreeIs a compound of One of the two amino groups (-NH_Two) Is available for attachment to the polymer, The remaining amino group is then available for introduction of the oxime-forming group, and R5 is replaced. Substituted or unsubstituted aliphatic or aromatic groups such as phenyl or C₁ -C_TenAlkylene component, C₁-C_TenAn alkyl group, or a combination thereof, Acid chains (eg, flexible hinge or loop sequences (eg, Argos, J. Mol. Biol) . (1990) 211: 943-958), or nucleotide or sugar chains, or fats. Represents a non-reactive group comprising a chain or a combination thereof; Can be included. R5 is preferably -CH_Two−CH_Two-. Three primary amino The group is preferably located distal from the nitrogen atom. Most preferably, tri-amid The compound is tris- (2-aminoethyl) amine. As taught herein, high flexibility is required for specific binding of polymers. The desired sequence, structure, valency and functionality with complementary reactive groups located at L-structures can be designed and used to obtain. In the laboratory of the inventor Additional methods and compounds that have been developed and are suitable for the synthesis of L-structures are: Rose (J. Ame r. Chem. Soc. "Facile synthesis of artificial proteins" (1994) 116: 30 -33; incorporated herein by reference). As discussed herein, the bi- and multi-polymer functionalized polymers of the present invention are Preferably, the stoichiometry of the target macromolecule that alters the particularly desired properties of that macromolecule It is particularly used for systematically modifying the hull radius. Medically important polypeptides In the case of the drug, preferably its pharmacokinetic behavior and ultimately its therapeutic efficacy The Stokes radius, which allows for the systematic modification of, can be systematically modified. In a preferred embodiment of the present invention, the functionalized polymer has a polymer backbone. PEG or its derivatives. In one embodiment, the functionalized polymer is Comprising PEG or a derivative thereof, and having the following structure: R1-O (R2-O)_n R2-R3 A -functional or difunctional polymer, wherein in the above structure, n Is an integer from 5 to 2,000, and R2 is linear, branched, substituted or unsubstituted. (A) one of R1 and R3 is an amino-oxy group; Comprising an oxime-forming group and an optional spacer group, and R1 and R3 The other is hydrogen, -CH_ThreeOr (b) both R1 and R3 are Comprising an amino-oxy oxime-forming group and an optional spacer group. Poly R2 of the individual repeat units in the mer are independently the same or different from each other . The number of repeating units defined by 7 is between 2 and 2,000, preferably between 10 and 1,000, and More preferably, it is 50 to 800. Thus, the polymer is preferably about 200-100,000, Having an average molecular weight of about 400-50,000 and more preferably about 2,000-40,000 You. Typically, the molecular weight (average) of the starting PEG is obtained from a commercial source (but But not limited to these) and 5,000, 10,000 Includes the group consisting of 0 and 20,000. R1 or R3 is on the target second organic polymer Can form an oxime linkage with the complementary aldehyde or ketone functionality of Functional amino-oxy groups. The oxime-forming group is -O-NH_Two Including Become. Preferably, the oxime-forming group is -X-O-NH_Two(Where X is the present specification Which is a spacer group as defined herein. Preferably, the oxime-form The group is -X-O-NH_TwoWhen X comprises -NH-CO-R4- A Pacer group wherein R4 is a linear, branched or cyclic lower alkyl (substituted or substituted) Substituted or unsubstituted), preferably CH_TwoAnd R4 is -O-NH_TwoTo Directly combined. The protecting group may be a polymer of the functionalization method of the invention or a target polymer of the invention. Non-reactive to offspring. Preferably, the protecting group has 1 to 10 carbon atoms More preferably, it is an alkyl group, most preferably it is methyl It is. Prior to functionalization, preferably having at least one hydroxy group of PEG; More preferably, it is a terminal hydroxy group. It is a site on the target polymer Together with specifically introduced complementary reactive groups form oxime linkages in a site-specific manner Activated (functionalized) to introduce functional groups capable of ) A hydroxy group. A "lower alkyl" group refers to a C1-C10, preferably a C1-C10, It means an alkyl group of 2 to C4. In another preferred embodiment of the present invention, a method comprising the use of PEG or a derivative thereof comprising And a multi-polymer containing functionalized polymer. Those aspects are discussed above. Di- and multi-polymer functionalized polymers as described above, but here, Multiple PEG polymers form a single oxime-forming group through individual bonds to the tether Is joined to. The bi- and multi-PEG functionalized polymers of the present invention are of medical interest. In the case of a polypeptide, preferably the pharmacokinetic behavior and ultimately its Systematically alter the Stokes radius of the polypeptide to allow for systematic modification of therapeutic efficacy Especially used for changing. More specifically, the present invention relates to functionalized PEG and dextran, Price MPEG-NH-CO-CH2-O-NH_Two, Dextran-O-CH (CHOH-CH_TwoOH)-(CHOH)_Two-CH_Two-NH- (C H_Two)_Two-NH-CO-CH_Two-ONH_Two, Dextran-O-CH (CHOH-CH_TwoOH)-(CHOH)_Two-CH_Two-NH- (CH_Two)_Two -NH-CO-C₆H_Four-CHO, bifunctional NH_Two-O-CH_Two-CO-NH-PEG-NH-CO-CH_Two-O-NH_Two, And multi-P EG (PEG)_TwoLys-NH- (CH_Two)_Two-NH-CO-CH_Two-O-NH_Two, HO-((PEG) Lys)_Five-NH-CO-CH_Two -O-NH_Two, And (PEG-aminoethyl)_Two-N- (CH_Two)_Two-NH-CO-CH_Two-O-NH_TwoFor the preparation and use of Related. In a preferred embodiment of the present invention, as taught herein, the polymer Provided is a functionalized polymer containing dextran or its derivative as a chain . In another preferred embodiment, the functionalized polymer is dextran Or a monofunctional or bifunctional polymer containing a derivative thereof. Yet another In a preferred embodiment, as taught herein, dextran or a derivative thereof. Di- and multi-polymer functionalized polymers including derivatives are provided. Those aspects are Bi- and multi-polymer functionalized polymers as discussed above, but Here, multiple dextran polymers are singularized through individual bonds to the tether. To the oxime-forming group of In another aspect of the present invention, a functionalized polymer of the present invention is produced. A method is provided for: In the general case, at least one, preferably terminal Such a polymer having the above reactive groups has a oxime-forming group. With a reactive group of Any of a number of modified chemistries are available on the polymer Reactive groups Can be used depending. For example, when PEG or its derivative is preferred, A droxyl group is available. One or more reactive groups should be present, ie 1 All but two reactive groups (or two if a bifunctional polymer is desired) Starting from the polymer form protected from the reaction except for the reactive group of Can be used as a material. Modifications to the oxime-forming groups may be conveniently performed in a continuous step. Can occur on floors. For example, if the reactive group on the polymer is a protected amino-oxy -Is easily acylated by containing compounds such as Boc-NH-O-CH2-COOSu To another reactive group. Next, the amino-oxy group is added before use or Can be protected before storage. Most reactive groups for the acylating agent are -NH_Twoso is there. A preferred PEG intermediate is CH3-O- (CH2-CH2-O)_n-CH2-CH2-N H_TwoOr if a bifunctional polymer is desired, H2N- (CH2-CH2-O)_n -CH2-CH2-NH_TwoIt is. MPEG can be converted to CH3-O by the carboxymethylation step. -(CH2-CH2-O)_n-CH2-COOH (Royer and Anantha nmaiah (1979) J. Am. Am. Chem. Soc. 101: 3394-3396). The above intermediate PEG-NH_TwoUsing the compound, the oxime-forming group is BOC-NH-O-CH Introduced at the individual amino function by acylation with 2-COOSu. Shown in Example 1 PEG-NH_TwoIs a method already described (Zalipsky et al., (1983) , Eur. Polym. J., 19, 1177-1183), the following series of reactions PEG-OH → PEG- C1 → PEG → N_Three→ PEG-NH_TwoPrepared. In another embodiment, the bi- and multi-polymer functionalized polymer is the desired multi-functionalized polymer. First, a monovalent, usually protected monovalent L-structure is obtained, and then A polymer intermediate suitably activated using known ligation chemistry, or The origin through Kissim chemistry Reacting a light-functionalized polymer with the protected L-structure Therefore, they are synthesized. After isolation of the di- or multi-polymer product, the product is protected by L Deprotection of the remaining valences, followed by subsequent reactions, e.g., in the case of amino groups, Protected -amino-oxy or protected -aldehyde-containing acylating groups By silation, it is functionalized according to the invention. Deprotection of oxime-forming functional groups After that, the final product, i.e. the bi- or multi-polymer functionalized polymer, is obtained. On the other hand, L is first suitably protected -amino-oxy or protected-A The mono-substituted derivative derivatized with a aldehyde-containing group is isolated and then The substituted L derivative is a polymer intermediate (eg, where L is NH_TwoCOOH Or when L comprises COOH, NH_TwoHaving a group), or a functionalized compound of the invention Polymer (if oxime chemistry is used to assemble PL) and Are reacted at the individual remaining valences. For example, free radicals on the L-structure An MPEG-COOH intermediate polymer capable of reacting with a mino group is provided. cup Rings can be used in the presence of HOBt and DCC or succinimidyl derivatives of MPEG-COOH Would have occurred in the absence of those reagents if had been previously prepared. Oki After deprotection of the shim-forming functional groups, the final product, i.e. di- and multi-polymer A functionalized polymer is obtained. When the L group is formed from amino acids, the peptide sequence of the L structure is converted to a normal solid phase Synthesized by peptide synthesis (“SPPS”), and the peptide still bound to the solid phase PEG-COOH in an activated form, such as N-hydroxysuccinyl A midester can be added to the nascent peptide chain. For example, an L structure has six Peptides with reactive groups such as 5 lysine residues and an N-terminal amine group Can consist of: PEG-COOSu hydroxysuccinimide ester is Can react with individual ε-amino groups of amino acid residues (where the N-terminal α-amino group is While remaining protected). Next, the N-terminus of the fully acylated peptide The amine group is deprotected, and the polymer-containing structure becomes Boc-AoA-containing active After removal of Boc and gentle cleavage from the resin, An AoA group is introduced that produces a functionalized polymer containing the interpolymer. This method Of particular use with respect to synthetic constructs (and possibly certain recombinant products) It should be noted. Because those structures need protection during the process Because it can be designed to eliminate additional residues, e.g., amino acid residues. You. On the other hand, Boc-Ser (benzyl) -OH or Boc-Ser (t-butyl) in the activated form Tyl) -OH such as N-hydroxysuccinimide ester -Can be linked to an amino acid. Next, the N-terminal α-amino group is deprotected and the amino group is removed. A no-oxy group, such as AoA, is introduced so that, after Boc removal, ε-Ser- A precursor L structure containing pentalysine is obtained. Moderating oxidants, such as at pH 7 The treatment of the precursor L structure conjugated to the protein by periodate is ε-Ser -Converting pentalysine to ε-GXL-pentalysine, and thus the penta-GXL L structure To form a structure, which is then reacted with the amino-oxy-functionalized polymer of the present invention. Can be The oxidation reaction has relatively free rotation around the 1,2 bond. 1,2-diol or 1-amino-2-ol or 1-ol-2-amino It can be terminated with a compound such as ethylene glycol. On the other hand, the oxidation reaction The rapid removal of periodate allows, for example, reverse-phase high performance liquid chromatography ( RP-HPLC). The oxidation reaction is a serine residue containing a primary amino group. Ε-serine as it simply occurs with respect to the group Only residues are converted to glyoxylyl. One skilled in the art will appreciate that such protection is desired. In some cases, methods are known for chemically protecting the N-terminal serine from oxidation. Next, the N-terminal amine group is deprotected and the polymer-containing structure is Boc-Ao After reacting with an A-containing ester and removing Boc, AoA groups are introduced that produce a functionalized polymer. Under mild conditions for products BOC or typical amino protecting groups used in peptide synthesis that can be subsequently removed Are appropriate (eg, Green and Wats (1991) “Protectine groups in org anic synthesis ", 2nd ed., Wiley, New York, NY). Functionalized target macromolecules are disclosed in co-pending U.S. patent applications 08 / 057,594, 08/114. No., 877, 08 / 057,594, 07 / 869,061 and 08 / 241,697, and concurrent international patents Found in application PCT / IB94 / 00093, which are incorporated herein by reference. Oxime-forming groups can be prepared using methods known in the art, including methods. Can be designed and prepared for site-specific introduction. The target polymer is It can be obtained by recombinant methods or isolated from natural sources and is complementary to oxime formation. A reactive group, aldehyde or amino-oxy group is added at the desired position on the polymer. It is formed site-specifically. In a preferred embodiment of the present invention, it comprises a polypeptide compound or an amino acid A functionalized polymer that is site-specifically reactive with the compound or material is prepared, In said polymers, the amino acid is the oxime-forming agent introduced on the polymer. It has been modified to obtain oxime-forming groups that react specifically with active groups. Preferred Alternatively, the N-terminal or C-terminal residues of the polypeptide may be modified according to the methods set forth herein. Modified by using Concurrent US Patent Application 08 / 114,877 (August 31, 1993 08 / 105,904 (filed May 12, 1994) And PCT / IB94 / 0093 (filed May 5, 1994), which are Are incorporated herein by reference) are the functionalized polymer compounds of the present invention and Chemical and chemical methods using their conjugation methods to target molecules as taught herein. Additional for site-specific modification of target compounds, especially polypeptides, by enzymatic means To provide a way. In the case of polypeptides, the oxime forming group is preferably a selective enzyme catalyzed At the C-terminus of the peptide by reverse proteolysis or at the N-terminus by mild oxidation Introduced with terminal serine or threonine (eg, Geoghegan et al. (Bioconju gate Chem. (1992) 3: 138-146); Gaertner et al. (Bioconjugate Chem. (1992 ) 3: 262-268); EP243929; and WO 90/02135, which are incorporated herein by reference. Incorporated)). Recombinant or natural peptides are each functionalized To have multiple C- or N-termini present in the dimer or tetramer Can be. The water-soluble polymer reagents of the present invention can form oximes with functional groups on the polymer Various polypeptides or similar modified site-specifically to include complementary functional groups Can be used to modify the molecule. Polypeptides of interest include: Contains: antibodies, monoclonal and polyclonal antibodies; cytokines, even M-CSF, GM-CSF, G-CSF, stem cell growth factor; lymphokines, IL-2, IL -3, growth factors such as PDGF, EGF; peptide hormones such as hGH, Tropoetin; blood clotting factors such as factor VIII; immunogens; enzymes; Bitter; ligands and the like. Water-soluble polymer amino-oxy or aldehyde Polypeptides of interest for derivatization of water-soluble polymers with Contains: hormones, lymphokines, cytokins, growth factors, enzymes, vaccine antigens , And antibodies. Erythropoietin (EPO), especially the water-soluble polymer of human erythropoietin -Derivatization is of particular interest. Polypeptides of interest are those naturally occurring Source, isolated from genetically engineered cells, or by various in vitro synthesis methods Can be generated. The following patent applications, which are incorporated herein by reference, include various Reports PEGylation Modification of a Physically Important Protein: US Patent Application No. 4 No. 4,609,546; No. 4,261,973; No. 4,055,635; No. 3,960,830 No. 4,415,665; No. 4,412,989; No. 4,002,531; No. 4,414,147; No. 3 No. 4,732,863; No. 4,745,180; European Patent No. 152,847; European Patent No. 98,110 published on Jan. 11, 1984; Japanese Patent No. 5,792,435 The proteins in their unmodified state are, as taught herein, Target macromolecules for site-specific functionalization and subsequent site-specific polymer conjugation. Peptide, polypeptide or protein (used interchangeably herein) Are naturally occurring and recombinant forms, and similar biological or chemical activities Sufficiently identical to a naturally occurring peptide or protein to allow the acquisition of Means another non-naturally occurring form of a peptide or protein that is In the industry As is known in the art, peptides are non-naturally occurring or non-protein It can be formed from native amino acid residues. In addition, it is not well known in the industry. As such, amino acid residues can be linked through non-amide linkages. Peptide or TA The protein also prevents or minimizes the in vivo degradation of the peptide or protein. A protecting group may be included at any of the termini. Water soluble polymer reagents of the invention are used to modify most polypeptides (1) Polypeptides for use as drugs Modifying the peptides and polypeptides for use in (2) assays is particularly advantageous. It is interesting. Polypeptides for use in assays may have specific binding tags. Contains proteins, polypeptides recognized by specific binding proteins, and enzymes Include. Specific binding proteins include antibodies, hormone receptors, lectins and It means the same thing. The term "antibody" has a native immunoglobulin sequence Polyclonal and monoclonal antibodies, synthetic antibody derivatives, and the like Means antibody; various labels, fluorescence, radioactivity, enzymes, biotin / avidin or Can be modified to link to any of these. Synthetic antibody derivatives modified Natural immunoglobulins that have been mutated and selected for improved binding specificity Various, typically single-stranded, sequences produced by genetically modified bacteria Polypeptides derived from immunoglobulin genes, modified to include altered constant regions Modified antibodies and the like; such antibodies based on the principle of antibody formation A review of derivatives can be found in Winter and Milstein,Nature ,349: 293-299 (1991) Provided. Antibodies are formed in animals in response to administration of the antigen, and are combined with the antigen. Globulin-type glycoproteins that can be specifically combined. Antibody fragment Can retain the ability to selectively bind to their antigen or hapten. Wear. The ability to bind an antigen or hapten is determined by an antigen-binding assay. (For example, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Co. ld Spring Harbor, New York (1988), which is incorporated herein by reference. See). Such antibody fragments include Fab, Fab 'and (Fab')_TwoContains But not limited to these. Active antibodies can be obtained from animals or from hybrids. Lid animal (hybridoma) cell line. Aldehyde or amino-oxy functions present on the functionalized polymer This specification describes groups present in additional linking structures (spacer groups) adjacent to the groups The professor in the book states that any spacer group present on the functionalized target molecule Complies with In one aspect of the invention, the C-terminus is a polypeptide or protein (such as Bifunctional reagents with appropriate reactive groups specifically at the C-terminus in Is preferably modified by an enzyme capable of directing Of the polypeptide chain The carboxyl terminus is, in at least according to the primary structure, almost always Far from the active site of the protein. In another embodiment of the present invention, Certain bifunctional reagents with reactive groups are used to bind non-carboxy termini of polypeptide molecules. The fact that reacts preferably or specifically at the position is used. Most preferred mode In this case, the amino terminal group is located after the reaction that activates the N-terminal site on the peptide. It is a site-specific target. In a preferred reaction, the N-terminal serine ("Ser") And threonine (“Thr”) residues are converted to periodic acid under a very mild reaction. More oxidized (eg, 20 ° C., 26 μM protein, 10 mM imidazole buffer) Buffer pH 6.95, 2 fold excess periodate, 5 minutes). The N-terminal Ser is Reacts about 1000 times faster than a carboxyl group (Field and Dixon, (1968) Biochem. J. 108). : 883), resulting in a high degree of specificity. For higher generalization, The N-terminal Ser or Thr can be obtained by recombinant DNA technology or, where appropriate, by native Se. by selecting a protein source of interest having an r or Thr N-terminus; or Terminal amino acids, aminopeptidases, di- and non-essential for exposing Ser or Thr Enzyme cleavage with peptidyl peptidase or proline-specific endopeptidase Can be introduced by interruption. The second preferred reaction is preferably with glyoxylate. By the reaction Transamination to convert the N-terminal residue of the protein to an active carbonyl function The use of transfer. This reaction proceeds under relatively mild conditions (eg, Dixon and Fields, (1979) Methods in Enzymology, 25: 409-419). Extensive N-terminal residues of the boxed type can be transaminated. The aforementioned literature (Methods in Enz ymol., 25: 409-419), the proteins alanine, asparagine, glue In addition to tamic acid and phenylalanine, methionine is prepared as described in Example 8. , In the particular case of Antril, transaminated The lipeptidyl N-terminal aliphatic aldehyde or ketone is preferably an amino-oxo It can be reacted with a polymer functionalized by a c-acetyl group. The protected aminooxyacetyl group is a methoxy poly As is common with ethylene glycol (Example 1) or dextran (Example 5) By amino group or H_TwoN-PEG-NH_TwoTwo aminos as in (Example 2) Attached to a polymer already functionalized by a group or to a protein at a single site Polyfunctionalized linkers to combine multi-branched structures (eg, 3, 4, 10) Directly. The structure described is: (PEG-CONH- (CH_Two)_Two)_Two-N- (CH_Two)_Two-NHCO-CH_Two-O-NH_Two PEGLys (PEG) -NH- (CH_Two)_Two-NHCO-CH_Two-O-NH_Two H_TwoN-O-CH_Two-CO- (Lys (PEG))_Five. Small divalent aminooxy tags can also be site-specific on proteins at a single site (Example 14), the polymer to be conjugated is, for example, an amino-functional By reacting the immobilized PEG with carboxy (benzaldehyde) OSu A complementary aldehyde function, such as described in Example 12, EG-O-CH_Two-CHO or PEG-NHCO-C₆H_Four− Should be functionalized by CHO . In the same way, the polyaminooxy tag can be_TwoN-OCH_TwoCONH (CH_Two)_Two)_ThreeN and PEG- By CHO, introduced at a single site as shown in Example 18, multi-arm-conjugation The body is obtained. Although not a preferred embodiment, the site-specific target is a side group of the polypeptide, i.e. Exist in a single copy or, on the other hand, are selectively available and Sensitive, but not necessarily non-terminal, preferably amino acid residues. On the other hand, unique residues can be introduced by recombinant methods. Side groups are functionalized Complementary reactive groups (eg, AoA or aldehyde) on the exposed polymer followed by specific In order to place reactive groups that will react with Can be modified using any of the methods described herein. In another aspect of the invention, the target macromolecule, especially the polypeptide, is It is site-specifically modified at a position other than the terminal. Amino introduced into the sequence during translation Modifications to the primary structure itself due to deletion, addition or alteration of acids can disrupt protein activity It can be done without breaking. Such a modification known as “mutein” A method for producing a modified protein is described in US Pat. U.S. Patent No. 4,518,584 and U.S. Patent No. 4,752,585 issued June 21, 1985 (These are incorporated herein by reference), and Well known in the world (Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel (1994), Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, J.S. Wiley , New York, NY; these are incorporated herein by reference). For example, organisms Is not essential for biological activity and is present at least in biologically active proteins. Even one amino acid residue is used to produce the functionalized target polymer of the present invention. Another subject to subsequent site-specific modifications It can be replaced by an amino acid. Polymers functionalized with hydrazide groups also form hydrazone linkages For this purpose, it can react with specifically introduced aldehyde or keto groups. This Is known to be less stable than oxime bonds, especially under acidic conditions. It is important to note that the number of proteins that should be released later in vivo It is interesting in that special case. The target macromolecular polypeptide is preferably a native or modified polypeptide of human origin. Produced by prokaryotic or eukaryotic cells transformed with the peptide-encoding DNA sequence. Can be achieved. A naturally occurring polypeptide in which substantial identity of the amino acid sequence is maintained A variant of the polypeptide (ie the sequences are identical or mutated Substantially opposite functional differences between the altered protein and the native protein Depends on non-causing one or more amino acid changes (deletion, addition, substitution) Is useful herein. In another embodiment of the present invention, a single molecule on a target macromolecule is linked through an oxime chain. Polymeric reagents to be covalently linked to one or more water-soluble polymers at one site Molecule, i.e., the amino-oxy or aldehyde test of the water-soluble functionalized polymer of the present invention. A drug-modified target macromolecule is provided. They are referred to herein as " Polymer conjugate ". As discussed above, preferably the marker is Target molecule is a polypeptide, more preferably a biologically important polypeptide . In a preferred conjugate embodiment, the water-soluble polymer PEG is passed through an oxime chain. Alternatively, a polypeptide derivatized with a derivative thereof is provided. The present invention relates to a method wherein one or more polymers comprises a single, uniquely located oxy The functionalized polymer component discussed above, covalently linked through a And functionalized target macromolecules modified by reaction with a ligand. One form In these embodiments, the polymer conjugates have the following formula: BC (R) = NO—X— P or BC (R) = N-OXL (P)_mOr B-ON = C (R) -X- L (P)_mWhere P is preferably as described herein. Is a water-soluble organic polymer and B is a functionalized as described herein A target macromolecule, preferably a polypeptide, m is an integer from 2 to 10, X and L and R are as defined herein, and -C (R) = NO- An oxime bond. R is preferably H. R is activated by transamination It may be the side chain of the N-terminal residue of the polypeptide that has been converted to a carbonyl. Good Preferably, m is about 2 to 10, with a range of 2 to 5 being particularly preferred. Preferably, B Is a polypeptide, wherein preferably P is a functionalized N- or C- It is covalently linked to the terminal residue in a site-specific manner. In a further aspect of the invention, The oxygen atom of the oxime bond in the above formula is represented by C (R) = NS-thio-oxime bond Is replaced by a sulfur atom to give The individual functionalized target macromolecules are different from the different embodiments of the polymer compounds of the present invention. Can be derivatized with one or more different water-soluble polymers by the means of You. When m is 1 or more, each target polymer has a plurality of water-soluble polymers at a single site. It can be modified by limers. Preferably, P is a polyalkylene glycol or It is a kisstran derivative. The biological activity of proteins modified by PEG or dextran polymers , As shown by the following example. Any of the macromolecules described herein, such as polypeptides, water-soluble poly The salts of the mer and its derivatives are such that such molecules are present in aqueous solutions at various pHs (or Will occur in nature if is isolated from aqueous solutions). The above biological activities All salts of peptides and other macromolecules with potential properties are considered to be within the scope of the present invention. Will be Examples are alkali, alkaline earth and other metal salts of carboxylic acid residues, amino acids Acid addition salts (e.g., HCl) of amino acid residues, and amino acid residues and carboxylic acids in the same molecule. And Zwitteriuns formed by the reaction between As will be readily appreciated from the present invention, a homogeneous polymer conjugate composition is , Homo- or hetero-polymers. Will be discussed in the rest of this application Thus, a heterobi or heteropoly-polymer functionalized polymer is attached to a target polymer. If all polymer molecules attached at a single site are of the chemical type or MW (average )), Nevertheless, the compositions are nevertheless defined herein. It can be homogeneous as defined. For example, a polymer on a linking structure ("L") Step-by-Step Assembly (Concurrent US Patent Applications 08 / 057,594, 08 / 114,8 Nos. 77 and 08 / 057,594, co-pending international patent application PCT / IB94 / 00093; hereby incorporated by reference. Are incorporated by reference into the individual steps to produce a homogeneous composition of the heteropolymer. Allows the introduction of different polymers on the floor. As shown above, similar assays of multipolymer constructs by chemoselective ligation Embry provides homogeneous preparations of multi-polymer constructs with defined polymer structures. The GXL group on the tether (L) and the AoA on the functionalized polymer to form The result of a complementary chemical reaction with the group. Other aspects of multi-polymer functionalized polymers Are the reverse complementary structures, i.e., amino-oxy chain structures and those from the above. And an aldehyde-functionalized polymer. An additional polymer conjugate aspect of the invention is that two target heights that are the same or different The molecule is linked to the intervening polymer by an oxime chain, preferably through the end of the polymer Each is combined. In a preferred embodiment, PEG or a derivative thereof is used as the intervening polymer. Is included. Functionalized polymers and functionalized targets to form oxime chains According to the present invention, a method for forming a polymer conjugate comprising reacting molecules is provided. Provided. In the oximation reaction, the polymer is attached to the target polymer by an oxime chain. As will be added, it will occur site-specifically between the two reagents. For example, oxy Reaction is performed by introducing XXL onto the target polymer to form an oxime conjugate. -Can occur between a functional group and its complementary AoA group introduced on the polymer at pH 4.6 . The oxime forms over a wide range of pH values and rapidly forms at pH values below about 5 pH. Formed. The extent of oxime formation can be monitored by RP-HPLC and Can be terminated by preparative RP-HPLC. The resulting compound has a molecular weight of gel Determined by electrophoresis or matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry Can be done. On the other hand, AoA-target macromolecules can be used and the oximation reaction , AoA groups and polymers having aldehyde groups. On the other hand, oxy The transformation is carried out at a pH below 4.6. Lower pH, but solubility of some peptides It is convenient for 2.1 pH to increase the solubility of some peptides Preferred. In addition, oximation occurs earlier at pH 2.1 than at pH 4.6. One skilled in the art will recognize the pH vs. solubility profile of the polymer and target for oxime-conjugate formation. The pH of the molecule can be determined, and the pH of the molecule during the oximation reaction. The appropriate pH can be selected for a particular oximation reaction in consideration of qualitative You. Chemistry of complementary chemical groups Oximation by selective ligation is a defined structure when AoA and GXL pairs are used. Rapidly and substantially qualitatively leads to the formation of a homogeneous preparation of oxime conjugate of the construct . The oxime-forming complementary chemically reactive group may be protected or unprotected. Can be combined in any of the different forms. Complementary chemistry of oxime formation to the target polymer The method of attaching a reactive group involves attachment through a chemically reactive side group. . For example, an oxime-forming complementary chemically reactive group may be alkylated or dis- Can be attached to cysteine-containing target macromolecules through S atoms by sulfide formation . Next, based on the oximation to a functionalized polymer with aldehyde functionality, And the target polymer has a thioether bond (or disulfide bond) And via its Cys residue through an oxime bond. Preferred alkylation The compound is an alkyl halide having an AoA group attached. Especially preferred Are those having a BOC protected amino-oxy group, preferably an AoA group. You. Preferably, Br-CH_Two-CO-NHCH_TwoCH_TwoNH-CO-CH_TwoO-NH-Boc (where AoA The group is protected and can be removed before the oxime step) and Br-CH_Two-CO-NHC H_TwoCH_TwoNH-CO-CH_Two-O-NH_TwoIt is. Another alkylating reagent is Br-CH_TwoCH_TwoC H_TwoNH-COCH_TwoONH-Boc. The bromoacetyl group is, for example, the thio group of the Cys residue. Are more reactive due to the alkylation of the alkyl group. The iodoacetyl group is Sometimes less preferred because it is overreactive and is lost by photolysis Not. In addition to the bromoacetyl group, other alkylating groups include the maleoyl group. Include. As taught herein, for protein modification using this group Are AoA-Lys (maleoyl-β-alanyl) -OH and maleoyl-β -Alanyl-NHCH_Two CH_TwoNH-COCH_TwoONH_TwoAs an example. Male oil Although the group is useful for making polymer conjugates, it has significant stability Is known to have problems (hydrolytic ring opening of the ring) and as a result It is hardly suitable for producing quality polyoximes. Furthermore, male oil Alkylation involving groups are formed by alkylation with a bromoacetyl group. To provide a linker that is more rigid and bulky than Ready for stem. Preferred linkers for in vivo applications are immunoreactive The answer is unspecified. Side chain of cysteine through disulfide bond Examples of compounds for attachment of the oxime-forming complementary chemically reactive group to -A pyridyl-SS- group. A preferred example is 2-pyridyl-S- S-CH_TwoCH_TwoNH-CO-CH_Two-O-NH-Boc and 2-pyridyl-SS-CH_TwoCH_TwoNH-CO −CH_Two-O-NH_TwoIt is. The resulting Cys-containing derivative is converted through a disulfide bond. The aminooxyacetyl (or protected aminooxyacetyl) group to be bound Have. The modifications disclosed herein may be modified through disulfide and oxime bonds. Linking functionalized polymer to polyaldehyde base plate via Cys side chain Useful for. Due to this form of binding, the target macromolecule, eg, a peptide, Disulfide reduction, a process known to be present in the body Can be released from the polymer. The oxime-linked polymer conjugates of the present invention and polyoxime-based Polymer-functionalized polymers have several novel features. One new feature is The preparation is homogeneous. The oxime-bound compound can be an aqueous solution or Stable in semi-aqueous solutions and at temperatures between -3 ° C and 50 ° C, but most conveniently If so, it can be prepared at room temperature. The oxime-linked compounds of the present invention The specific biological reactivity of the individual component parts of the Useful in relation to physical reactivity. The functionalized polymers of the present invention (eg, monofunctional polymers, difunctional polymers) Polymer, dipolymer functionalized polymer, or multipolymer functionalized polymer) Later, it is conjugated by the functionalized target polymer through an oximation reaction . The oxime chain is formed from complementary functional groups introduced on the polymer and the target polymer. Is done. Attachment of the polymer to the target molecule depends on the oxime-forming functional group on the target polymer. Occurs site-specifically as dictated by the selected arrangement of In one aspect of the invention, the method of bonding is performed in the following manner. Functionalization Polymer solution is combined with the target polymer solution functionalized at the final acidic pH. You. The oximation reaction is enabled and the formation of the desired conjugate proceeds. Above As discussed, the oximation reaction can be carried out over a wide range of pH, preferably about pH 2, especially rapid. If rapid formation is desired, it may more preferably occur at about pH 5 or less. More preferred Preferably, the pH is less than 4, most preferably about 3.6. The oximation reaction is Suitable for lower pH if necessary to maintain stability or solubility of the target molecule Combine. The reaction temperature is preferably room temperature, but the stability of the target polymer and It can be tailored to meet specific needs for solubility. Reaction time is 10 minutes to 72 Hours, more preferably 3 to 48 hours, and most preferably 6 to 24 hours. Government The functionalized polymer is in a molar excess over the functionalized target polymer, preferably About a 3-20 fold molar excess, more preferably about a 4-15 fold molar excess, and at least Preferably, it is present in about a 5- to 10-fold molar excess. The functionalized polymer is preferably an aqueous solution at an acidic pH, preferably a buffer. Diluted in A solution of 0.1 M acetate at pH 4.6 is preferred. Optionally, chaotrope Agents target functionalized polymers Present to aid accessibility of the functional groups of the polymer. Preferred agents are oximation agents Inert to both the polymer and the target molecule, And if removed from the end product, would not interfere with the return of biological activity (If it is affected by the chaotropic agent). The preferred agent is guanidinium Hydrochloride ("GuHCl"), preferably about 1-8 molar concentrated in the final reaction. Degrees, more preferably about 4-6 molar. Aminooxy derivatives in water If water-soluble, the conjugation reaction can be performed in the presence of an organic solvent. The solvent and The concentration should not adversely interfere with the biological activity of interest of the target macromolecule. Appropriate Suitable solvents are well known in the art. For example, one low solubility pepti For acetamide, up to 50% acetonitrile can be used for coupling You. If desired, the polymer conjugate can be purified from the reaction mixture. Known to those skilled in the art There are many purification methods available, such as size exclusion chromatography, hydrophobic interactions Chromatography, ion exchange chromatography, isoelectric focusing for separation , Etc. exist. One particularly preferred method is the size separation method, the charge separation method, For example, size exclusion chromatography followed by ion exchange. (US Pat. No. 253,708). , Which is incorporated herein by reference). Preferably size Separation methods use size exclusion to distinguish between molecules based on the hydrodynamic radius of those molecules Chromatography. The hydrodynamic radius is the effective fraction of particles in an aqueous environment. Child radius. Preferably, the charge separation method comprises a fixed inert charge. Based on the differential affinity of a charged ion or molecule in solution for a given substance Exchange chromatography to distinguish between molecules is there. Size exclusion chromatography and ion exchange chromatography Mixed solution of polymer conjugate, under appropriate buffer and appropriate conditions Contacting the column. In another embodiment of the present invention, the method of joining is a "one-pot" Includes synthesis. Under mild reaction conditions, the functionalized polymer solution Serine or threonine that is very sensitive to functionalization as described in Simultaneously with the target polymer having the N-terminal residue of obtain. Site-specific binding to the N-terminal amino acid of the target polymer through an oxime chain The formation of the desired polymer conjugate with the polymer being polymerized necessitates the need for additional operations. Will occur without. The pH of the one-pot reaction is about 2-9, preferably about 3-7, more preferably about 4.5-7, most preferably about 6-7, and A preferred embodiment has a pH of about 6.5. Both the polymer and periodic acid are the target molecules In molar excess relative to Periodic acid is preferably in a 2-5 fold molar excess. , More preferably in a 2-3 fold molar excess. Reaction time of about 3 hours or less Is done. If desired, the polymer conjugate can be isolated as described herein. Is done. Reaction temperature is preferably from about 0 ° C. to avoid freezing to modifying the target molecule Below 100 ° C, generally below about 100 ° C to avoid tampering, And for most proteins it is around 50 ° C. More preferably, the reaction is about It is carried out at 15-25 ° C, even more preferably at about 20 ° C. Functionalization for target molecules The molar ratio of the polymer obtained is about 3 to 50 times, more preferably 4 to 30 times, and even more. Preferably, the value is in the range of about 5 to 25 times. Moles of target molecule for periodate The ratio is preferably in the range of about 1 to about 6 times, more preferably about 2 to 4 times. In certain aspects And IL-8: NaIO_Four: AoA is about 1: 4: 10. To determine whether a fraction contains the desired conjugate, the fraction may be subject to various criteria. Can be screened against. Preferred screen methods are SDS-PAGE, isoelectric focusing Includes electrophoresis, biological activity and pharmacokinetics. After the fractions are known to contain the desired conjugate, they are further purified. Can be For example, a polymer / protein conjugate mixture is a size exclusion chromatograph. The fractions are separated by a column and the fractions are collected, and then the fractions It is analyzed on an SDS-PAGE gel to determine that it contains a protein conjugate. Next In addition, the fraction of interest is further purified by contact with ion-exchange chromatography. Fractions are collected, and the fractions have the desired polymer / protein conjugate Analyzed by isoelectric focusing to determine Polymer conjugate mixture Before the material is subjected to chromatographic processing, it can be removed for impurities. For example, salts and chaotropic agents can be removed by a preparatory column, or It can be dialyzed against a buffer. After the polymer conjugate has been purified, it can be purified using methods known in the art. And can be tested for biological activity. According to a preferred embodiment of the present invention, proteins and other organic target macromolecules are soluble in water. Chemically by conjugation to water-soluble organic polymers such as polyethylene glycol (PEG) Can be modified. The production of such protein conjugates is due to the binding of water-soluble polymers Of interest because of the desired properties provided by Those desired Properties include increased solubility in aqueous solutions, increased stability during storage, and reduced Treated immunogenicity, increased resistance to enzymatic degradation, a wide range of species Compatibility with other drug delivery systems, and enhanced in vivo half-life. Resulting from derivatization of the polypeptide with PEG or other water-soluble polymers Their properties are used as therapeutics where the polypeptide is injected into the body. Or the polypeptide will be used in assays, usually immunoassays. If it is to be used for the detection and / or quantification of the compound of interest, Of particular interest. Of course, the use of the functionalized polymers of the present invention is useful for low molecular weight peptides and And / or modified to include functional groups complementary to the functional groups on the polymer And the preparation of polymer conjugates of other materials. Non-medical uses of functionalized polymers, especially PEGylated proteins, are And the preparation of polypeptides for immunoassays, for example. The functionalized polymer is applied to a solid phase, for example, the surface of a silicon chip, a tissue culture plate. Cells, membranes or membranes, or synthetic or natural resins. Complementation introduced on solid phase Linking a polymer functionalized to a solid phase by use of a functional group Can be. As shown herein, the functionalized polymer can be attached to a target polymer or solid phase. Is useful for monitoring the appearance (or elimination) of a functional group of After the polymer conjugate has been produced and purified, it can be used in human and livestock applications. Appear to be therapeutically effective, for example for cancer treatment and treatment of infectious diseases If a target macromolecule is used, it can be introduced into a pharmaceutical composition. The therapeutic agent, when administered to an animal, prevents or ameliorates the disease, or treats the animal. Any molecule that prevents or alleviates the disease state It is. Therapeutic agents include antitumor antibiotics, antiviral proteins, radioisotopes , Medicines or toxins, but is not limited to these. The polymer conjugate is a non-toxic, inert, pharmaceutically acceptable aqueous carrier medium. Can be compounded. "Pharmaceutically acceptable carrier" means a standard pharmaceutical carrier Any of, for example, phosphate buffer solutions; water or emulsions, for example oil / water Emulsion; means substantially containing various types of wetting agents. polymer The conjugate is preferably a non-toxic, inert, pharmaceutically acceptable carrier medium. Or at a pH of 3 to 8, more preferably at a pH of 6 to 8. In vivo treatment When used for sterile polymer conjugate compositions, Comprising the protein dissolved in an aqueous buffer having an acceptable pH. Polymer -Conjugates contain many excipients, such as amino acids, polyols, sugars, buffers, Agents, other proteins, and the like. Specific examples include the following: Octylphenoxypolyethoxyethanol compound; polyethylene glycol- Stearate compound; polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester; sucrose Fructose; dextrose; maltose; glycol; dextran; Mannitol; sorbitol; inositol; galactitol; xylitol; Lactose; trehalose; bovine or human serum albumin; citrate; acete Ringer and Hanks solution; Salt solution; Phosphate; Cysteine; Arginine Carnitine; alanine; glycine; lysine; valine; leucine; Lolidone; polyethylene glycol; and the like. Preferably, the formulation is low at 4 ° C. It has been stable for at least six months. As a composition, it is formulated by methods known in the art. It is administered parenterally to elephants. Providing an effective amount of the compound or pharmaceutical composition to the subject Means of administration are known. Methods for administration to animals are well known to those of skill in the art, and Include, but are not limited to, oral, subcutaneous and parenteral administration . Administration can be effected throughout the other treatments, continuously or intermittently. Administration The most effective means and methods for determining dosage are well known to those skilled in the art. Compound or composition for treatment, the purpose of treatment and the animal or animal being treated. Will vary from patient to patient. This composition contains a specific target macromolecule protein It may include other compounds that enhance its effectiveness or promote its desired properties . The compositions are safe, sterile, and effective for the chosen route of administration. Should be fruitful. To maintain the sterility of the polymer conjugate and its stability To enhance potency, the composition can be lyophilized and reconstituted before use. Preferably, the formulation is for parenteral administration to a human or animal in a therapeutically effective amount. Suitable for. Their amounts are estimated for animal models of the disease state of interest. In vivo efficacy data obtained after preclinical studies or in vivo efficacy It can be determined by generally accepted in vitro assays as interrelated. To provide convenient and reproducible derivatives of the target macromolecules of interest, It is also interesting to supply water-soluble functionalized polymer reagents in kit form That is. An interesting kit is to use the water-soluble functionalized polymer reagents of the present invention. Solutions, buffers, reaction indicator compounds, instructions such as Bradfo Can contain protein concentration measurement reagents for rd assays, and the like You. The reagent solution will preferably be supplied in premeasured quantities. The kit may include complementary functional groups on the target polymer of interest, preferably under mild conditions. A reagent for site-specific introduction can be included. Such reagents are functional Of the invention (as by the formation of polymer conjugates) Functionalized polymers, peptidases for N-terminal truncation, C-terminal site-specific A protease for mechanical conjugation, a linker group containing a protected amino-oxy group, Periodic acid, a molecular weight marker (such as in the form of a polymer conjugate of known molecular weight) And, in some cases, any buffer for performing the functionalization of the target polymer Alternatively, it can include a solvent. The kit consists of a series of individual solutions (or powders), which are combined with a target polymer of known molecular weight. Polymer conjugate-containing polymers of known composition, molecular weight and morphology (one-port Limmer, bi- or multi-polymer) and, for example, conjugation reactions Used as a control to assess the completion and / or yield of the product or to provide a molecular weight standard It can include a composition that can be used. Embodiments of the polymer-conjugate of the present invention may be used in improved kits for diagnostic purposes. Used in, for example, binding assays, eg, in immunoassays Can be used as improved reagents for For example, carrying antigenic peptides Polymer conjugate compositions provide enhanced detection sensitivity in solid-phase immunoassays. provide. Large divalent or multivalent polymer conjugates can be used on surfaces, such as immunoassays. It can be easily attached to a multi-well plate used for staining. Polymer -Conjugates, especially multi-polymer containing polymer conjugates, are for example branched DNA ("bD NA ") Signal modification step for analyte detection, as in the base assay Used for in vitro assays using Amplification is performed on multiple analytes on a single analyte molecule. Of polymers (rather than a single polymer), where individual Polymers contribute a detectable signal in subsequent assay steps. Analyte Targeting of the polymer conjugate to the linking L group comprising, for example, an analyte binding group Use or at least one polymer on the structure provides for analyte binding The use of the hetero-polymer structure of the present invention facilitates this. Departure Light multi-polymer containing polymers, especially labels, are known in the art. Labeled secondary, which can be highly radioactive, fluorescent, enzyme-linked, or the like. Repeated units subsequently detected by hybridization to oligonucleotides Preferred are those in which the polymer comprises a particular nucleotide sequence as a position No. On the other hand, the functionalized polymer may be a detectable marker enzyme-conjugate, or other Can itself be derivatized to contain a reporter group of General methods and principles for the purification of macromolecules, especially proteins, are as follows: For example, “Protein Purification: Principles and Practice” (1987), Scopes, 2nd ed., Springer-Verlag, New York, NY (incorporated herein by reference). Can be found. A method for systematically modifying the Stokes radius of an organic target polymer is also described herein. Provided, wherein the method comprises: (a) including a first oxime-forming group. (B) obtaining a series of functionalized active macromolecules Topologies in organic polymers are different from each other, Includes a second oxime-forming group complementary to the first oxime-forming group Obtaining said series of functionalized organic polymers of the present invention, and then (c) Relaxed conditions as taught herein to obtain a series of joined polymers Below, to individual functionalized polymers through chemoselective site-specific oximation More specifically, separately bonding the functionalized target macromolecules. The step Floor (a) and (B) is performed in any order. If desired, preferably a size separation method Each individual conjugated polymer in the series of functionalized organic polymers. Changes in the Stokes radius can be identified. The method may further comprise: Linking the radius of a macromolecule with changes in the biological or physical properties of interest of the target polymer Can be included. On the other hand, the method may be of biological or physical interest Properties, such as the pharmacokinetic behavior of the target polymer of interest, therapeutic efficacy, For use in microassay systems and to identify changes in behavior as molecular weight standards. And Preferably, the second oxime-forming group is -O-NH_TwoIt is. The in vivo blood clearance behavior of macromolecules depends in part on their Stokes radius. Must exist. The elution volume of the polymer from the gel filtration column is It is theoretically related to diameter, but not its molecular weight. Various sizes of pores for the filtration of migrating molecules are created by a three-dimensional network of filaments. When subjected to gel electrophoresis, the mobility of macromolecules is high. It can affect the change in the child's Stokes radius. Typically, by molecular weight Different polymers will move as a linear function of the log of the molecular weight (and Here, the change in mass ratio for the individual polymers is approximately the same). In one aspect of the invention, the desired change in Stokes radius of the target polymer More preferably, the systematic change of the series of Stokes radii Various topologies, creating similar types of molecules upon introduction, excluding similar molecular weights A functionalized polymer is provided. Mono-, bi- or multi-polymer containing functionalized polymer structures may be used. Site-specific and chemoselective binding at the Here, each attached functionalized polymer structure is shared with the target polymer in the same way as the others. A series of joined, giving molecular weight and polymer composition, but with different topologies Target macromolecules can be rapidly prepared. However, as discovered herein As noted, due to their various polymer morphologies, individual polymer bonding Body mobility is surprisingly different. As taught herein, target macromolecules By systematically modifying the Stokes radius of the More easily create those conjugated molecules with mobility (and “fine-tune "), And can be identified. Coupling of water-soluble polymers, especially polyethylene glycol, to proteins The benefits of are well documented and include: Active protein Is insoluble or only partially soluble at physiological pH, Enhanced solubility of conjugated protein compared to its active protein Reduced immune response produced by active proteins, enhanced pharmacokinetic Lofil, increased shelf life, and increased biological half-life. Target macromolecules, especially proteins of pharmaceutically important proteins as taught herein Enhanced or desired behavior by systematically modifying the Stokes radius Or allow easier creation and identification of those conjugated molecules with therapeutic efficacy Can cause histologically significant changes in the pharmacokinetic behavior of molecules. Wear. Therefore, while maintaining the molecular weight (average) constant, different polymer A functionalized polymer having a zee is provided. For example, different topologies Certain functionalized PEG polymers having similar but similar molecular weights of PEG Radius of the Stokes radius and, therefore, the pharmacokinetic behavior of biologically important target molecules Can be determined and reproduced It is supplied so that it can be changed by such means. With similar molecular weights, but due to the number of polymers present in the polymer structure For binding to targets of interest, comprising different polymer structures. Kits comprising a series of functionalized polymers are provided. For example, a series of functionalization The polymers obtained were two 20 KD MW (average) polymers and four 10 KD MW (average) ) And five 8 KD MW (average) polymers of a multi-polymer containing structure And 40 MW (average) polymer structure. The method of the present invention provides a method for determining and selecting the binding of a polymer to a target. It is convenient. A further advantage of the present invention is that polymers modified with reagent compounds, such as poly Peptides can be identified by the same target using non-oxime and non-site-specific chemistry. Higher than when modified to the same extent by linking water-soluble polymers Is to retain their degree of biological activity. Therefore, the present invention Related to conjugation of water-soluble polymers while minimizing the associated loss of biological activity. To provide a modified target having the advantages of: Consequently, multi-polymer functionalized poly Higher derivatization through the use of A target with the associated advantages is generated, which further reduces water-soluble Has the same level of biological activity as the polypeptide derivatized by the limer . Nucleophiles other than primary amines, such as hydroxyl groups on proteins, pheno Active carbamates capable of reacting with thiol and sulfhydryl groups, For example, the use of active esters and the use of imidates to select primary amines for lysine residues The use of the present invention over other methods of attaching water-soluble polymers to proteins for use. A further advantage is that cross-reactivity is avoided due to the highly selective nature of the particular chemistry of the present invention. It is to be. A further advantage is that site specificity is provided herein and taught. Precise placement on target macromolecules by use of simple site-specific functionalization methods and linkers It can be done. Form an oxime linkage between the polymer and the target, as shown herein The complementary reactive groups with which they interact are very specific. Taught here The oximation reaction provided provides complete or substantially high yields of the reaction product. Was. Such complex molecular formation occurs under very mild conditions. Rapidity is , Inert-dilution conditions that are often useful to minimize molecular aggregation or reaction This is especially surprising. The oximation reaction is a self-assembly of the polymer conjugate. Lie can occur alone, as can Lie. Polymer conjugates give substantially quantitative yields It is more easily purified and trace intermediates and end products are typically substantially different. (Ie, due to the presence or absence of at least one polymer unit), Such methods for their separation are easily selected and applied. Oh The oxime linkage can be used under a wide range of physiological conditions compared to hydrazone or the like. Excellent hydrolytic stability. The oxime chain usually undergoes enzymatic hydrolysis. I can't. Therefore, polymer conjugates can be used where the integrity and stability of the composite is desired. It has the advantage of being particularly suitable for the intended use. As shown in the example, the oximation reaction Is an organism that is very palliative and thus retains biological activity or function It is convenient for preparing biological macromolecules. Oxime chemistry can be subunit Eliminates the need to have reverse chemoprotection. High flexibility forms oxime chains In order to create reactive groups that can be Provided for unusual modifications. Due to this flexibility and the absence of the need for reversible protection And polymer And the design of targets extends to artificial and natural molecules and their derivatives. Poly Mer conjugates improve the solubility of the peptide and provide a multivalent and / or constrained form Designed to give peptides to receptors or antibodies in animals or the immune system Can be done. Polymer conjugates formed from synthetic or recombinant polymers and target macromolecules The body has the additional advantage of being virus-free. Thus, preferably, the functionalized polymers of the present invention and those provided herein are provided. Is a method in which a polymer is produced by a condensation reaction between an aldehyde and an amino-oxy compound. To polypeptide and protein derivatives. Most preferably The complementary reaction exists between the aldehyde or ketone and the amino-oxy-acetyl. Exist. In all cases, an oxime bond is formed. The invention further provides for the in vitro use of a polymer, such as PEG. Sensuality The polymerized polymer can be used to “tag” a target molecule, and This allows for subsequent detection and / or quantification of the molecule in a number of ways. At most simple Purely, the bound polymer is polymer-labeled from other molecules in the mixture. Allows for performing a simple size separation that will separate the target molecules. For example, Antibodies on the functionalized polymer, detected as the appearance of a polymer-labeled target Formation of the desired functional site, as measured by its ability to react with a responsive functional group. Therefore, modification of the target molecule can be easily followed. Different organic polymers Physicochemical properties may have advantages in this means by simple modification of the polymer It will be readily apparent now. For example, a slightly hydrophobic polymer is Or a subsequent separation of the desired polymer conjugate A polymer binding column of choice can be used. In addition, the polymer , So that it can be detected directly Or can be modified. This is because the polymer has multiple detectable sites ( Or repeating units), so that the individual sites present in the polymer bind and Have the advantage of being recognized by the detection system and thus of amplifying the detection signal. Give. Branched DNA (“bDNA”) content tests are performed on individual polymer units, in this case, A particular nucleotide sequence or repeating unit specifically binds a second measurable reagent (Urdea (1994) Bio / Technology 12: 926-928). For example, in the assignment of the copper-catalyzed transamination provided herein. In this case, the appearance of a reactive keto group at the N-terminus of the target protein is easily assessed. I can't. The elimination of the N-terminal amino group is of poor quality since only the copper adduct can be identified. It cannot be assessed either by quantitative analysis or by cellulose acetate electrophoresis. Only However, the appearance of a reactive keto group is detected by the functionalized PEG derivative of the present invention. Due to its ability to react with, for example, simple size in SDS-PAGE system Easily assessed by separation.An example Example 1 Functionalization of methoxy polyethylene glycol: MPEG-NH-CO-CH 2 -O-NH 2 Synthesis of (“AoA-NH-PEG”) MPEG_5KD(5 g, 1 mmol; Mr (average) 5 KD) was dissolved in toluene (30 ml). And dried by azeotropic distillation. Add dry pyridine and add thiochloride Nyl (4 mmol) was added dropwise at reflux over 10 minutes. 4 hours for the mixture Heat, cool to room temperature, filter from pyridine hydrochloride and remove toluene under vacuum Evaporated. CH residue_TwoCl_TwoDissolved in K_TwoCO_ThreeDry over and filter. Filtrate Was treated with aluminum oxide (40 g) and precipitated with cold ether. The remer was recrystallized from toluene / hexane; yield 4.6 g (92%). MPEG in DMF (20ml)_5KD-Cl (4 g, 0.8 mmol) in a solution of sodium azide ( (8 mmol) was added and the mixture was stirred at 120 ° C. for 2 hours. The solution Cooled, filtered, and DMF was evaporated under vacuum. The residue is taken up in toluene and filtered. And precipitated with hexane. The product is converted from toluene / hexane to 2 Recrystallized; yield 3.6 g (90%). MPEG_5kD-N_Three(3.5 g) was dissolved in absolute ethanol (100 ml), and 10% Pd / C (0. 3 g) was added and the mixture was hydrogenated in a low pressure hydrogenator overnight . The catalyst was filtered and the ethanol was evaporated under vacuum. Polymer, toluene Recrystallized from / hexane; yield 3 g (86%). MPEG_5KD−NH_Two(1 g, 0.2 mmol) and Boc-NH-O-CH_Two-COOSu (0.5 mmol) Was dissolved in DMSO (4 ml) and the apparent pH was adjusted to 8-9 with N-methylmorpholine. Adjusted and the mixture was mixed overnight. MPEG-NH_TwoAcylation is quantitative According to the hydrin method (Sarin et al. 1981, Anal. Biochem. 117: 147-157) Adjusted to a 10 μl aliquot of the reaction mixture. 5 modified volumes of water And subsequently dialyzed against water and lyophilized . The Boc group is removed by dissolving the product in 10 ml of TFA for 1 hour at room temperature. did. The TFA is removed under vacuum, the residue is taken up in water, extensively dialyzed against water, and And finally lyophilized; yield 0.93 g (93%). The same method is used for the corresponding PEG-NH_TwoAoA-NH-PEG from_10KDAnd AoA-NH-PEG_20KD Was used for the synthesis ofExample 2. Functionalization of methoxy polyethylene _{_{glycol: NH 2 -O-CH 2 CONH}} -PEG -NSynthesis of _{_{HCO-CH 2 -O-NH 2}} ( "AoA NH-PEG -NH-AoA") Boc-NH-O-CH_Two-COOSu (86 mg, 0.3 mmol) was dissolved in 1 ml of anhydrous DMSO, 1 g (50 μmol) of NH in 4 ml of the same solvent_Two−PEG_20kD−NH_TwoTo the solution of The apparent pH was adjusted to 8-9 with N-methylmorpholine. At room temperature Stir overnight and adjust the acylation by standard ninhydrin analysis. next The solution was diluted with 5 volumes of dilution water, subjected to extensive dialysis against water, and And finally freeze-dried. Cleavage of the Boc group and the material is described in Example 1. Further processing; yield 0.9 g (90%). Bonding with this polymer leads to dimer, eg, "dumbbell" formation.Example 3 Functionalization of methoxypolyethylene glycol: multivalent linker (PEG) ₂ Lys-NH Synthesis of — (CH ₂ ) ₂ —NH—CO—CH ₂ —O—NH ₂ (“(PEG) ₂ Lys-AoA”) 2.0 g (3.9 mmol) of Z-Lys (Z) -OSu was added to 4 ml of ethylenediamine (60 mmol). ) And the mixture was stirred at room temperature for 2 hours (where Z is Loxy-carbonyl). The coupling reaction is a linear group of 0-100% B. Prepared over 50 min by analytical HPLC on C8 column using gradient As quantitative (t_R= 4 instead of 48.5 minutes for Z-Lys (Z) -OSu 1.5 minutes). The coupling product is converted to CHCl_ThreeEquilibrated with / MeOH (9/1, v: v) Purified by flash chromatography on a purified silica column, and Drying by rotary evaporation gave 1.4 g of product. Products are measured by ESIMS. Had the expected molecular weight when defined (calculated M + H, m / z 457.2; M / z 458.0 found). Z-Lys (Z) -NH- (CH_Two)_Two−NHCO-CH_Two-O-NH-Boc dissolved in 3 ml of anhydrous DMSO 0.9 g (1.9 mmol) of Z-Lys (Z) -NH- (CH_Two)_Two−NH_Two1.1 g (3.8 mmol) of Boc-NH-O-CH_Two−Add COOSu And adjust the apparent pH to 8-9 with N-methylmorpholine. Saved. The solution was stirred at room temperature for 5 hours, diluted with 10 volumes of 0.1% TFA, and And the product was treated with a linear gradient of 40-80% B over 30 minutes at a flow rate of 3 ml / min. HPLC column for separation using a gel 250 × 25 nm i. d. (Nucleosil 300A, 7μ mC8, Macherey Nagel, Oensingen, Switzerland). freeze drying After that, the product (weight 1.1 g; yield 90%) was characterized by ESIMS (calculated M + H, m / z 630.2, m / z 630.9 found). The z group was cleaved by catalytic hydrogenation. To do this, the material is converted to absolute ethanol ( 50 ml) and 100 μl CH_ThreeAcidified with COOH, 10% Pd / C (0.1g) Was added and the mixture was hydrogenated on a hydrogenator overnight. Filter the catalyst And the solvent was removed by rotary evaporation. The product is treated with a linear gradient of 0-50% B. And purified on the same column used above for 25 minutes. After lyophilisation, the product (weight, 600 mg; 95% yield) was characterized by ESMS: M + H calculated, m / z 360.2; m / z 361.8 found)). Lys-NH- (CH_Two)_Two-NHCO-CH_Two-O-NH-Boc is converted to PEG_5KD−COOH, PEG_10KD−COOH And PEG_20KDAcylated by -COOH. In a typical experiment, 14 mg of Lys-NH- (CH_Two)_Two-NHCO-CO_Two-O-NH-Boc. 2HCl (33 μmol) was dissolved in 2 ml of anhydrous DMSO and PEG was dissolved._5KD-COOH (0.4g, 80μmol ), Hydroxy-benzotriazole (80 μmol) and DCC (21 mg, 100 μmol) Was added, the apparent pH was adjusted to 8-9 with N-methylmorpholine, and Was stirred overnight. Standard ninhydrin test shows quantitative acylation It was shown that. Next, the solution was diluted with 5 volumes of water and distilled water Dialyzed, filtered and equilibrated with water on a DEAE Sephadex A25 column. Applied. The acylated linker was eluted with distilled water in the first fraction and And freeze-dried. The Boc group was then dissolved by dissolving the product in 10 ml of TFA for 1 hour at room temperature. Cut. The TFA is removed under vacuum, the residue is taken up in water and extensively dialyzed against water And finally lyophilized (300 mg, 90% yield) to give the following derivative: PEG_5KD-Lys (PEG_5KD) -NH- (CH_Two)_Two-NHCO-CH_Two-O-NH_Two. A comparable linker, PEG_10KD-COOH and PEG_20KD-Lysine induction by COOH Obtained by acylation of the body.Example 4. Functionalization of methoxypolyethylene glycol: Multivalent linker AoA- (Lys (PEG _5KD )) Synthesis of _5- OH Z- (Lys (Boc))_Five-OH was used as starting material. Peptide, Boc-group removed Immediately after reconstitution in 10 mM HCl, relyophilization and then HOBt and DCC 2-fold excess of PEG in DMSO in the presence of_5KDCompletely acylated by -COOH. That The reaction mixture was diluted with distilled water, dialyzed and the soluble fraction was further subjected to DEAE- Purify by ion exchange chromatography on A25 and CM-C25 Sephadex columns. And lyophilized. The Z group is cleaved by HBr treatment for 2 hours, and Next, the product was acylated with Boc-AoA-OSu. Finally, the Linker AoA officer The functional group was deprotected by TFA treatment. Degree of functionalization, reaction with TNBS at 495 nm Was determined by the determination of the sex aminooxy groups and was found to be 80%.Example 5 Dextran functionalization. Dextran _{-O-CH (CHOH-CH 2} OH) - (CHOH) 2 −CH_Two-NH- (CH_Two)_Two-NH-CO-CH_Two-O-NH_TwoSynthesis of Unique reactive groups are modified by dextran modification of reducing sugars by reductive amination. (Mr (average) 9.3KD and 39KD). Dextran_39KD(1 g, 25 μmol) while heating slightly (45 ° C.) Dissolved in DMSO (4.5 ml) and returned to 25 ° C. Ethylenediamine (500μl, 7.5m Mol) and ground 4-A molecular sieve (200 mg). N flask_TwoBy Rush and then sealed and incubated at 37 ° C. for 24 hours. NaBH_Four (80 mg, 2.1 mmol) and the flask was charged with N_TwoFlash, and Was further incubated at 37 ° C. for 24 hours. The viscous solution into 5 volumes of water More diluted, pH adjusted to 5.0 by addition of glacial acetic acid, extensive dialysis against distilled water And finally lyophilized to give 800 mg of product (based on starting dextran 80% recovery). The yield of functionalization is 2,4,6-trinitroben Estimated from the absorbance of zensulfonic acid derivative (Fields, R., 1972, Methods En zymol., 25B, 464-468). Comparable end group modifications were made with dextran_9KDPassing And dextran_39KD(0.9 to 1.0 mole of NH per mole of polymer)_Two ), And monofunctionalized commercial MPEG_10KD−NH_TwoAnd MPEG_20KD−NH_TwoGot for Were consistent with the modifications made. NH_Two-Derivatized dextran_39KD(800 mg, 20 μmol) dissolved in DMSO (5 ml) Boc-NH-O-CH dissolved in the same solvent (1 ml)_Two−COOSu (19mg, 60μ ), The apparent pH is adjusted to 8-9 with N-methylmorpholine, and The solution was stirred overnight at room temperature. Dilute the solution with 5 volumes of water and add to distilled water It was extensively dialyzed and lyophilized. Dextran with modified terminal , Was quantitatively acylated as adjusted by the TNBS test. Protect the substance Dissolve in 20 ml of TFA for 1 hour to release A was removed under vacuum, diluted with water, extensively dialyzed, and lyophilized. Functionalized by a single aminooxy group on their already introduced terminal amino group The polymerized polymer preferably has a pH of 3.0 to 5.0, preferably under acidic conditions. By periodate oxidation or transamination (specific N-terminal sequence of the protein) At the N-terminus of the protein or at its N-terminus) It can react with site-specifically introduced carbonyl functional groups, A shim bond can be formed. Part of the carbonyl group at the N-terminus of the protein Site specific configurations are shown in the examples below. IL-8, G-CSF and IL-1ra This novel approach for site-specific conjugation of minooxy-functionalized synthetic polymers Used to indicate theExample 6. NH Protein ₂ - Site-specific modification of terminal residues: modification and bonding of IL-8 The short N-terminal serine residue of IL-8 (72 residues; 2-5 mg / ml) was 1% NH at pH 8.3 in the presence of excess methionine_FourHCO_Three10-fold excess in buffer Oxidation with sodium periodate at room temperature for 10 minutes. What is IL-8? Although they do not contain onin, they developed their standard conditions and during periodate treatment Eliminates all risks of methionine oxidation (Gaertner et al. 1992, Peptides 1992, Schneider and Eberle, eds., 239-240p, ESCOM, Leiden, The Netherl ands). The reaction was performed by adding a 2000-fold excess of ethylene glycol to periodic acid. And stopped by further incubation at room temperature for 15 minutes, and The protein was finally dialyzed against 0.1 M AcONa buffer at pH 4.6. Dialysis tubing 1, pre-boiled in 1% sodium bicarbonate for 30 minutes. Oxidation is ESI-MS (Calculated m / z 8351.3; found m / z 8351.3 ± 1.4 ). The oxidized protein is concentrated to 3-4 mg / ml and the protein backbone Used in that form for the site-specific attachment of a functionalized polymer to the N-terminus of Was. Bonding with polymer. A 10-fold molar excess of a 10 mM aqueous solution of the polymer was Solution, adjust the pH to 3.6 with glacial acetic acid, and allow to incubate at room temperature for 20 hours. Cubbed. As shown in Figure 1, SDS polyacrylamide gel electrophoresis Clearly shows that a homogenous conjugation product was formed corresponding to the binding of a single polymer chain. Show. The molecular weight of the conjugate is determined by the size of the polymer used in the coupling reaction. Is directly related to The conjugation product was purified using a linear gradient of 0-2M NaCl at 25 mM pH 4.7. Over 20 minutes on a Pharmacia MonoS column equilibrated with AcONa buffer By ion exchange chromatography, followed by a linear gradient of 30-65% B Purified over 35 min by reverse phase HPLC on an analytical C8 column using (Fig. 2). In vitro activity of the conjugate. The biological activity of the IL-8 conjugate has been described previously. As determined by a human neutrophil chemotaxis assay using a Micro-Boyden chamber. (Ribaudo and Kreutzer (1985), Practical Methods and Clinical Immuno logy (Yoshida T. ed.) p. 116-125, Churchill Livingston, Edinburgh, U.S.A. K.) . IL-8 is 2 nM EC₅₀(Concentration corresponding to 50% of maximum chemoattractant activity) Are all investigated PEG-derivatives (PEG_5KD−, PEG_10KD−, PEG_20KD−, And (PEG_20KD)_Two Lys-IL-8 and IL-8-PEG_20KD-IL-8) has an E in the range of 3-10 nM. C₅₀It was shown to have the same degree of activity. Pharmacokinetic data. Sufficient, as determined by neutrophil chemotaxis IL-8 and its derivatives, which have been shown to retain Iodinated (Grob et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 8311-8316). In short, about 0.5mCi of Na¹²⁵I in a 1 ml polypropylene tube And mixed with 50 μl of 0.1 M sodium phosphate solution at pH 7.4 containing 50 μg of IL-8. I combined. Iodination was initiated by the addition of 15 μl of 2 mM chloramine T. Following incubation at 20 ° C. for 90 seconds, the iodination reaction was Stopped by adding 15 μl of sodium iodide and 10 μl of 50 (v / v) potassium iodide Was. Radioactive protein was equilibrated with PBS and 0.1% bovine serum albumin. On a GF5 column (Pierce) previously washed with the same buffer containing¹² ^Five Separated from I. The specific activity obtained is in the range of 5-10 mCi / mg protein. Existed in the box. ¹²⁵I-labeled IL-8 or a derivative thereof was injected into the tail vein of female Wistar rats. (10 μg / kg) and blood samples were collected as described in Example 8. . IL-8, PEG administered intravenously to rats_20KD-IL-8, IL-8-PEG_20KD−IL -8 and (PEG_20KD7.) Curves of relative blood levels for Lys-IL-8 are shown in FIG. Have been. Conjugation of a single 20 KD PEG chain will result in a region under the pharmacokinetic curve Has little effect. Most importantly, dumbbells and (PEG_20KD )_TwoLys-derivatives significantly enhance this region. The curves show that PEG was approximately 10 minutes for IL-8._20KD17 minutes for IL-8, IL 8-PEG_20KD30 minutes for IL8 and (PEG_20KD)_Two About 60 minutes of Lys-IL8 First T_1/2Assign a value. The detectable difference is the apparent secondary difference between all protein derivatives. T_1/2No activity was observed in the values, but initially observed activity of less than 1% was 2 After 4 hours, 6% of the initial amount remains in the circulation for IL-8 (PEG_20KD)_TwoL In the case of ys-IL-8, it was still present.Example 7 NH Protein ₂ - terminal residue site-specific modification and joining of: reforming of rh-G-CSF Strange and bonded The application of the same methodology to the modification of G-CSF involves the modification of threo, a target of periodate oxidation. Includes removal of the N-terminal methionine to indicate nin (serine in the case of IL-8) I do. Enzymatic degradation of N-terminal methionine. Methionine residue is converted to kidney microsomal amino It was specifically removed by enzymatic digestion with peptidase (EC 3.4.11.2). G -CSF was diluted with 50 mM Tris, 0.3% sodium lauryl sarcosinate, pH 8 buffer. Concentrate in the buffer to 5 mg / L and then add aminopeptidase (enzyme / substrate Ratio, 1/20), 10 mM MgCl for 20 hours at 37 ° C._Two, 2.5mM PMSF and benzamidi And 2 mg / ml of aprotinin. All that These inhibitors were added and any of the inhibitors present in commercially available aminopeptidase preparations were added. Prevent degradation of any of the polypeptide chains by any of the contaminating proteolytic enzymes It was Next, aminopeptidase was added by adding EDTA at a concentration of 10 mM. And inactivate the solution against 20 mM Tris (pH 8.0) and against water. And dialyzed at 4 ° C and finally the product was flowed at a flow rate of 3 ml / min and 50-80% solvent Using the linear gradient of B, 250 × 10 nm i. d. On a Nucleosil C8 column Was purified for 15 minutes by reverse phase HPLC. ESI-M Characterized by S. The ESI mass spectrum shows two series of multi-charged ions The main one is des-Met¹Corresponding to -rhG-CSF (calculated., M / z 18820.8 Measured, m / z 18821.7 ± 2.2) and minor 1 One is Met^I-Corresponding to -rh-G-CSF (calculated, m / z 18951.9; found , M / z 18956.1 ± 5.5). des − Oxidation of Met ^I −G-CSF. The lyophilized material is replaced with 6M guanidinium chloride. In a 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5) at 5 mg / ml in the presence of Oxidation was performed with a 5-fold excess of periodate relative to the peptide. In the darkroom After 10 minutes incubation at room temperature, the unreacted periodate It was destroyed by a 1000-fold excess of ethylene glycol. Confirm oxidation by ESI-MS (Calculated, m / z 18775.3; found, m / z 18777 ± 2.7). Polymer bonding. A 5-fold excess of AoA-NH-PEG was added to the reaction mixture and 6M salt was added. Diluted with 5 volumes of 0.1 M AcONa buffer (pH 4.6) containing guanidine bromide, Concentrated to one volume on an entricon microconcentrator. Repeat dilution and concentration twice Was. The pH was then adjusted to 3.6 and a second 5-fold excess of AoA-NH-PEG was added. And the solution was incubated at room temperature for 24 hours. 20 mM of the solution Dialysis was performed against sodium phosphate buffer (pH 7.0) to remove guanidine chloride. The conjugated product was isolated by HPLC on a C8 column. As shown in FIG. , PEG_5KDAnd PEG_20KD-G-CSF was isolated by reverse phase HPLC, but G_5KD-In the case of G-CSF, before this step, 20 mM sodium phosphate, 1.2 M Na_TwoSO_Four , PH 6.3, 50 mM sodium phosphate, 5% (v / v) isopropanol, pH 7 .4 linear gradient for 15 minutes, followed by 25 mM sodium phosphate 25% tertiary buffer with 50% MeOH, pH 7.1 for 25 min Used over a polypropyl aspartamide column at a flow rate of 0.6 ml / min. Was processed by hydrophobic interaction chromatography.Example 8 NH Protein ₂ - terminal residue site-specific modification and joint: A of IL-1-ra Modification by amino conversion and conjugation Transamination. Since the N-terminal sequence of IL-1ra is Met-Arg-Pro-Ser-Gly-, Copper-catalyzed transamination was used for N-terminal activation of the protein, Conjugation of functionalized PEGs of different molecular weights. Concentrated tampa Solution (40 mg / ml) was diluted 10-fold with 2.5 M sodium acetate buffer (pH 5.5). Mark: CuSO_FourAnd glyoxylic acid were added to a final concentration of 2 mM and 0.1 M, respectively. I did it. After incubation for 1 hour at room temperature, the reaction was terminated by the addition of solid EDTA. Stopped by The mixture is then spread against 0.1 M NaOAc buffer (pH 4.6). Dialyzed extensively and the soluble fraction was used for the conjugation reaction. Polymer bonding. The appearance of a reactive keto group is attributed to its ability to react with AoA-NH-PEG. More characterized. Add 10-fold excess of polymer to transaminated protein The pH was adjusted to 3.6 with acetic acid and the reaction mixture was allowed to incubate for 48 hours at room temperature. Cubbed. PEG constructed in this way_5KD-IL-1ra, PEG_10KD−IL− 1ra and PEG_10KD-IL-1ra was confirmed as in FIG. The protein conjugate was applied to a poly-propyl aspartamide column (200 × 4 mm, 5 μm). m, 1000A, hydrophobic interaction chromatography using PolyLC Inc., Columbia, MA). Luffy followed by BioSep-SecS-2000 Phenomenex column (600 x 7.8 mm). Purification by gel filtration and ion exchange chromatography on Mono Q column did. In vitro activity of the conjugate. IL-1ra is administered in a dose-response manner to the skin or Prostaglandin by synovial fibroblasts_Two(PG_Two) Effect of IL-1β on induction of production (Arend et al. (1990) J. Clin. Invest. 85: 1694-1699). This ba Ioassay is IL- To study inhibition of 1β-induced biological response, 1000-fold against IL-1β By using an excess concentration of IL-1ra, the biological activity of the modified IL-1ra Sex evaluation was made possible. Table 1 shows the results of one such initial assay. PEGs listed in Table 1_20KD-Des (MRP) IL-1ra form is discussed in Example 9 below. It is induced by enzymatic degradation and periodate oxidation as described above. As shown in FIGS. 5A, 5B and 5C (dose-response curves), the IL-1β effect was Are inhibited by all conjugates in a dose-response manner and IC₅₀Value (IL-1β response The concentration required to block 50% of the answer) is determined:_5KD−IL -1ra (FIG. 5A), PEG_10KD -IL-1ra (Fig. 5B) and PEG_20KDAbout 13,10 for IL-1ra (FIG. 5C) and Nine. Conjugates were prepared by the transamination method. Pure IL-1ra IC for₅₀The value was found to be about 6 ng / ml. Estimated from those results The required ratio of IL-1ra: IL-1β can be higher for PEG than for the native protein. High for derivatives, but often persists in the 10:50 range, To different cell lines (Arend et al., 1990, J. Clin. Invest. 85: 1694-1697). IL-1ra (also referred to by Synergen, Inc. as the drug Antril) It is described in all references. Pharmacokinetic data. Antril and its derivatives are combined with the well-known chloramine- According to the T method (Hunter, WM and Greenwood, FC (1962) Nature, 194: 495-496). Labeled. The protein (about 0.5 mg) was added to 0.1 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl , Dialysed against a buffer of pH 7.0 and concentrated to about 300 μl. Next, In a solution, 500 μCi of NaI and the same buffer as the buffer for the protein 30 μl of the prepared 1% (w / v) chloramine T solution was added. Incubation 30% of 5% (w / v) sodium metasulfite solution and 50% (w / v) KI Stopped after 90 seconds by addition of 25 μl of solution. Radioiodinated protein , Equilibrated in PBS and in the same buffer containing 0.1% bovine serum albumin Free on a previously washed GF5 column (Pierce)¹²⁵Separated from I. This Is obtained in the range of 100-300 μCi / mg protein. there were. Obtained from Iffa-Credo (L'Arbresle, France), weighing 150-200 g Female Wistar rats were used. About 50 μg¹²⁵Tail the I-labeled protein Inject a bolus into the vein of the vein and allow a blood sample to be Only 3,10 minutes, 30 minutes, 1, 3, 7 and 24 hours). Weigh the samples and those extra The volumes were measured and their radioactivity was measured. Rats were injected intravenously , IL-1ra, PEG_10KD-IL-1ra and PEG_20KD-Relative blood for IL-1ra The level curves were compared in FIGS. 6A and 6B. As is clear from the figure, An tril's apparent first T_1/2(See solid line) is very short, and Apparent second T_1/2Is even longer and therefore corresponds to the area under the pharmacokinetic curve. Had no strong influence. Most importantly, these preliminary experiments Even the apparent first T of the two derivatives_1/2Value and T of Antril_1/2Between There are sharp differences. Apparent first T for both derivatives_1/2Value is modified T for unresolved proteins_1/2It was significantly longer than the value. Those songs From the line, the apparent first T for pure IL-1ra_1/2The value is about 3 minutes, PEG_10KD Its value for IL-1ra is 14 minutes and PEG_20KD−IL-1ra That same value was 20 minutes. Apparent second T between all three proteins_1/2Has a detectable difference Not observed and less than 2% of the initially observed radioactivity in all animals Radioactivity remained in circulation after 24 hours. By increasing the mass of the polymer, that is, by increasing its length, Or add multiple copies of the polymer at one site, as discussed above Does not adversely affect its activity (through the multi-linker form). Thus, the ability to increase the circulating half-life of the conjugate can be demonstrated by the conclusions set forth herein. It is clear from the result. This result of the site-specific modification methods and reagents of the present invention Is randomly labeled with a polymer, for example, with a lysine residue In sharp contrast to the results often seen. this Unlike the techniques described above, the use of the reagents and methods of the present invention provides Without a further severe drop, T_1/2To anticipate a further rise in Can be. For example, adding a 40 KD polymer to Antril (directly or But as obtained with linked polymers) Apparent first T without sudden sudden loss of specific activity_1/2Further rise of Will bring. In fact, by using the method of the present invention, the function of the added PEG Mr It was observed that the tendency of biological specific activity as a function exists in the other direction (Fig. 5A, 5B and 5C). In addition, as shown herein, -The use of a linker can be used to increase the molecular weight of unexpectedly higher molecular weights than the molecular weight of a multi-linker. An effect similar to that observed for a single linear polymer can be achieved You. For example, two PEG chains are placed on a multi-linker and the N-terminal of IL-8 is When placed site-specifically at the ends, the resulting derivative PEG_2x5KD-IL-8 is 20 Gel charge for derivatives with an apparent molecular radius corresponding to the addition of the PEG chain of KD It had its behavior almost equivalent to the electrophoretic behavior (see FIG. 1).Example 9 NH Protein ₂ - Site-specific modification and joint terminal residues: enzyme IL-1ra Modification by cleavage / periodic acid oxidation and bonding Met-Arg-Pro Cleavage and Periodate Oxidation. Three N to show serine -Removal of the terminal residue is also functionalization according to the methods already described in Examples 6 and 7. It can also be considered for the bonding of a given polymer. Proline-specific endopeptida (Seikagaku Corp., Toko) was used for cleavage of the N-terminal tripeptide. Was. Digestion is Pro^TwoIt was shown to occur effectively on the carboxyl side of the residue, but only It was very slow. Therefore, the protein with enzyme / substrate in a 1/10 ratio 30 mM in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) Incubated at 37 ° C. for 20 hours at a concentration of mg / ml. Next, the protein is -Isolated by gel filtration on a SecS-2000 Phenomenex column and The samples were purified by HPLC for characterization by ESI-MS. For different analogs A corresponding series of three consecutive peaks was identified: one major peak (16874.5 ± 5. 4D) is the expected product des (Met-Arg-Pro) IL-1ra (calculated value, 16872.1D) And one of the other two minor peaks (16785.1 ± 1.5D ) Corresponds to the des (Met-Arg-Pro-Ser) IL-1ra analog (calculated value, 16785.0D) And one other peak (17125.9 ± 2.ID) was des-Met IL-1ra (calculated Value, 17126.4D). No evidence of active protein (17257.6D) detected won. These results indicate the presence of contaminating aminopeptides in commercially available enzymes. Matches. Nevertheless, this method involves periodate oxidation and polymer conjugation. Seems to be a good means of displaying a sufficient amount of serine at position 3 to perform The protein was converted to 1% NH 3 under the same conditions as described in Example 6._FourHCO_ThreeSoluble in buffer Five-fold excess of NaIO over the cleaved cleaved IL-1ra protein_TwoOxidation using And this assumes that 50% of the protein material has an N-terminal serine. Wear. Bonding to polymer. After extensive dialysis against 0.1 M NaOAc buffer (pH 4.6), Replace the altered protein with a 10-fold excess of PEG_20KD-NH-CO-CH_Two-O-NH_TwoMixed with And the pH was brought to 3.6 with acetic acid. 40 hours incubation at room temperature After conjugation, the conjugation product was isolated by hydrophobic interaction chromatography. That Coupling reactions are clearer than reactions with transaminated proteins It was shown that. In vitro activity of the conjugate. Representative conjugate PEG_20KD−des (MRP) The in vitro activity of IL-1ra is shown in Table 1 above.Example 10. Functionalization of methoxypolyethylene glycol: multivalent linker (PEG-amino Ethyl) of _{_{2 -NH-CO-CH 2 -O}} -NH 2 Synthesis This multivalent linker is comparable to the linker described in Example 3 and in DMSO 1 equivalent of Boc-NH-O-CH_Two-Tris- (2-aminoethyl) amido by CONSu Obtained by the acylation of -The substituted derivative is isolated by HPLC and ESIMS (Calculated M + H, m / z 319.4, measured m / z 320.6 ). This material was dissolved in 10 mM HCl and lyophilized, and PEG in DMF in the presence of molar amounts of hydroxybenzotriazole and DCC_5KD−C Acylation was carried out with OOH (1.2 molar excess over remaining amino groups). Chamber the solution Stir overnight at room temperature, and fully acylate the derivative with distilled water After dialysis, by ion exchange chromatography on DEAA-A25 and CMC-25 Purification and, finally, deprotection gave the following derivatives: Conjugation to oxidized IL-8 was performed under the same conditions used for the linear PEG polymer. Under the conditions and the resulting derivative was prepared in the same manner as shown in FIG. Therefore, it was isolated.Example 11. "One-pot" modification and conjugation reactions As shown in the above reaction, side reactions during oxime formation are not a problem Was. For example, comparing lanes 1 and 2 in FIG. However, "One -Pot “reaction” minimizes handling, contamination, equipment, time, etc., and To provide freshness and uniformity Reduces labor time and costs, accelerates the development of large-scale and commercial manufacturing, and diagnoses In the case of a method or kit, it is desired for simplicity of use. IL-8 Uric acid and aminooxy compounds (Nα-aminooxyacetyl, NεLC-bioti Nyllysine) simultaneously with both, and after a suitable reaction time the desired The product (specifically biotinylated at its N-terminus by IL-8) was identified. . Surprisingly, the reaction proceeded at pH 8, 6.5 and 4.6. At pH 6.5, With approximate quantitative production of the desired molecule (if identified by mass spectrometry) Thus, product production was achieved in about 3 hours. The reaction, at the other two pHs, Minutes late and hardly quantitative. The result was surprising . For example, periodate oxidation requires a deprotected amino group, Thus, while alkaline pH is preferred, oxime formation is more pronounced at acidic pH. Because it is early. In addition, aminooxy compounds, which are always present in substantial excess, It was predicted that periodate would be destroyed. In a typical experiment performed at room temperature (about 20 ° C.), a solution of IL-8 (40 mM 20 μl of phosphoric acid (Na) (2.5 mg in 250 μl of pH 6.5) was used. First into this solution In addition, 41.5 mM NaIO_Four 2 μl is added, followed immediately by mixing with NαAoA, 17 μl of a 10 mM aqueous solution of Nε-LC biotinyl lysine (prepared below) was added. . After 3 hours, 2 μl of the reaction mixture was combined with 4 μl of 10 M aqueous ethylene glycol. Both were quenched. After an additional 10 minutes, the quenched solution was washed with 0.1% aqueous trifle. Dilute rapidly to 500 μl of oloacetic acid. (This is any further oximation Performed by dilution to minimize the reaction. ) Complete sample for reverse phase HPLC More analyzed. Only substantial peaks are present for the desired biotinyl-IL-8 derivative. Elution at known position did. The product of the bulk reaction, when isolated, will have the expected mass or electrolysis Play mass spectrometry was provided (calculated m / z 8891.8; observed m / z 8 892.8 ± 1.2). AoA-LC biotinyl lysine was used for Nα (BOC-AoA) lysine and LC (long chain) biotin. N-hydroxysuccinimide (obtained from Pierce Chemical Corp.) Manufactured from Stell. Nα (BOC-AoA) lysine was produced in a two-step process as follows: Built. First, Nd-tert-butyloxycarbonylaminooxyacetyl , N-ε-trifluoroacetyl-lysine was added to N-ε-suspended in 3 ml of DMSO. Trifluoroacetyl lysine (NovaBiochem, 4448 Laefelfingeu, Switzerland) 371 mg, prepared as previously described (Pochon, et al. (1989) Int. J. . Cancer 43: 1188-1194) and modified as described (Vilaseca Such. (1993) Bioconjugate Chem. 4: 515-520), N-amino of aminooxyacetic acid Add a suspension of 576 mg of droxysuccinimide ester in 1 ml of DMSO Gained by that. Next, N-ethylmorpholine is added to the suspension while stirring. An apparent pH of about 8 as indicated from the outside based on wet, narrow range pH paper Until the addition. The suspension is almost immediately transparent on adjustment to pH 8. Cleared, and the resulting solution was left overnight at room temperature. Continued thin of small sample Layer chromatography (Vilaseca et al. (1993) Bioconjugate Chem. 4: 515-520) ) The treatment should be such that little or no ninhydrin-positive material remains. Indicated. The residual hydroxysuccinimide ester in the reaction mixture is Were disrupted by dilution with water and incubation at 37 ° C. for 1 hour. next The mixture was diluted with 32 ml of water, cooled to 0 ° C. and Apparent pH (glass electrode). The solution is then divided into two and individual halves Minute Was purified with 1000 mg of Chromabond (Machery-Nagel, Du.) Equilibrated with 0.1% aqueous TFA. ren, 52348, Germany). Then, add each Chromabond to the same solution 2 Wash with 0 ml and mix with 0.1% TFA: acetonitrile (4: 6, v / v) Eluted with 4 ml of the compound. The acetonitrile is eluted under a stream of filtered air. And the remaining liquid was removed by vacuum centrifugation. Second, Trif Fluoroacetyl groups were added to each dried eluate by adding 3 ml of water, followed by piperidine. Lysine was removed from the ε-amine by adding 330 μl of lysine. The mixture Was maintained in an ice bath for 3 hours with occasional stirring. Inject the reaction with 500 μl of glacial acetic acid. The solution was stopped by adding it at will and the solution was stored frozen at this point. Said person To continue the procedure, the individual mixtures were diluted with water to 10 ml and the pH was adjusted as required. Adjusted to 3.0 with acetic acid if necessary (glass electrode). Mix the mixture as before Applied to two Chromabonds. However, (a) elution of the desired fraction was performed with 0.1% TF A: with 4 ml of a mixture of acetonitrile (7: 3, v / v) and (b ) For each Chromabond, combine the untested material with the subsequent 20 ml wash fraction. And passed twice on the same Chromabond after re-equilibration. Individual Chro Pool two eluates for mabond and allow to dry, approximately 40 mg each Desired product N-α-tert-butyloxycarbonylaminooxyacetyl -Lysine was obtained. AoA-LC biotinyl lysine was first added to 478 μl of DMSO in Nα (BOC-AoA) lysine 15. Prepared by dissolving 3 mg and adding 5 μl of N-ethylmorpholine Was. To this, N-hydroxyl of LC (long chain) biotin dissolved in 478 μl of DMSO was added. 53.2 mg of a biotin compound of a succinimide ester was added. One of the ingredients If it is difficult to dissolve before mixing, then bring everything into solution. 18 hours at room temperature Afterwards, any overactive ester was added to 956 μl of NaHCO_Three(1% in water) Added and disrupted by waiting 2.5 hours. The reaction mixture was diluted with 10 μl of water. And acidified by careful addition of 60 μl of acetic acid at 0 ° C. (pH 3 ). The mixture is loaded onto a Chromabond separation cartridge equilibrated with 0.1% TFA. D, cartridge washed with 20 ml of 0.1% TFA_ThreeCN / 0.1% TFA (1 : 4, v / v) was loaded onto the cartridge washed with 4 ml. Desired generation Things, CH_ThreeDilute with 4 ml of CN / 0.1% TFA (2: 3, v / v) and dry I did. The yield was 23.8 mg. The dried fractions are_ThreeIt was dissolved in 200 μl of CN and 1800 μl of 0.1% TFA. That The solution was clarified, if necessary, by centrifugation, and 1 ml thereof was used for the C8 analysis Injected all at once on the column. The column was equilibrated with the above 20% second solvent, This was then brought to 40% in the first 5 minutes after injection. Next, the value is calculated for the next 100 minutes. 80% over time. The desired product is the two latter parts of the gradient Upper major peak. The peak was dried. Mass spectrometry is expected Mass. The BOC group was determined by dissolving 1 mg of the product in 200 μl of TFA. Was removed. After 45 minutes at 20 ° C., the solution was dried and further purification Used without.Example 12. Functionalization of methoxypolyethylene glycol: synthesis of PEG-CHO Several methods have already been described for oxidizing terminal hydroxyl groups. (Wirth et al., (1991) Bioorganic Chem. 19, 133-142; Harris M.) . M. Such. (1984) J.C. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 222, 341), aldehyde officer The functional group is PEG-NH by carboxy (benzaldehyde) OSu_TwoAcylating And was introduced by PEG-NH_Two(1 g, 50 μmol) and carboxy (benz Aldehyde) OSu (62 mg, 250 μmol) was dissolved in DMSO (4 ml) and its apparent pH Is adjusted to 8-9 with M-methylmorpholine and the mixture is stirred overnight did. Acylation was controlled by standard ninhydrin analysis. Next, the solution Dilute with 5 volumes of distilled water, dialyze extensively against water, and finally freeze-dry I let it dry.Example 13. Site-specific modification and conjugation of cysteine residues in proteins: with cysteine 17 Modification and conjugation of rh-G-CSF Another approach for site-specifically modifying G-CSF is Cys.¹⁷position Cys with linker carrying AoA functional group to place reactive AoA at¹⁷of Alkylation. In the case of G-CSF, only a single Cys residue was present. others For this, the following linker compounds were used: Boc-NH-O-CH_Two−COHN− (CH_Two)_Two-NH-CO-CH_Two−Br_o The Boc group was removed and the linker was added at a concentration of 20 mM in 0.1 M phosphate buffer (Na ), PH 7.0, rapidly added to rh-G-CSF dissolved in 5mN EDTA and 6M GuHCl. Added. After a 30 minute incubation, the solution was acidified. Alkylation G-CSF purified by reverse phase HPLC and characterized by mass spectrometry (Calculated m / z 18971.8; found m / z 18978.2 ± 7.8). Next, The protein was redissolved in acetate buffer (0.1 M Na) (pH 4.6) containing 6 M GnHCl, Then reacted with PEG-CHO (from Example 12 above). The degree of polymer bonding is Comparable to that obtained with the two-step coupling at the N-terminus described in the previous example. Was. Alkylation with the linker is performed at high pH values (eg, pH 8.0, pH 9.0). If done, histidine and methionine residues will also be modified.Example 14. Site-specific modification and conjugation of protein: modification and conjugation of rh-G-CSF Small divalent tags containing groups reactive with the functionalized polymers of the invention are Protein in excess, and thus its created glioma in the protein Will react rapidly with xylyl functionality. In the second stage, the functionalized A polymer is added to achieve conjugation to the protein through the tag . This two-step approach is caused, for example, by steric problems and side reactions. It is useful if it is desired to avoid or minimize both of the problems mentioned. An exemplary small divalent tag is a bisaminooxy tag. H_TwoN-O-CH_TwoCO −Lys (CO-CH_Two-O-NH_Two), Boc-AoA-ONSu binding to Lys-OMe, followed by NaO Synthesized by H treatment and deprotection of TFA (calculated M + H, 293: 1; measured M + H 293.9). To supplement AoA groups on proteins, reactive carbon A functionalized polymer with a hydroxyl group was used for conjugation. PEG-NH_TwoThe carbo Reacted with xy- (benzaldehyde) -ONSu and AoA-dugged G-CSF Polymers with the necessary aldehyde functionality for the reaction of Got the product: PEG-NH-CO-C₆H_Four-CH = NO-CH_Two-CO-Lys CO-CH_Two-ON = CH-CO-d es Met¹mG-CSF.Example 15. Synthesis of poly-aminooxy linkers and conjugation to proteins The tris (2-aminoethyl) amine used in Example 10 was converted to Boc-NH- O-CH_Two-COOSu acylated with 3 equivalents. HPLC of fully substituted derivatives And was characterized by ESIMS (calculated M & M, m / z 665.5, found M / z 665.3). The material is deprotected by a 1 hour TFA treatment, and TFA was removed by rotary evaporation. Redissolve the material in water and then In excess (to avoid cross-linking), oxidized in 0.1 M AcoNa (pH 3.6) Reacted with IL-8. The joined product (two play (Carrying an isolated AoA group) were isolated by HPLC and characterized by ESIMS ( M & M calculated, m / z 8698.6, found m / z 8696.0 0.5). This conjugate is reacted with PEG-CHO, and a derivative having two polymers as arms Ie, a bee polymer-containing functionalized polymer can be produced. Other multi-arm structures, i.e., multi-polymer containing functionalized polymer structures, are particularly useful. In some cases, the arms of the polymer conjugate may be configured to reduce the immunogenicity of the protein. You. Indeed, a linker carrying 3-10 arms, preferably 4-6 arms, is Would be more appropriate. Such a configuration, in the first reaction, Notation structure: H_TwoN-O-CH_Two-CO-X- (Lys (Ser)) n [Where X is a peptide or peptide that facilitates the separation of the conjugated product from unreacted protein. Is a non-peptidic structure and n is a linked poly as defined above. Or a N-terminal serine residue. Obtained by attaching the corresponding dendritic linker. Additional resources Pacer groups can be introduced between lysine residues. In the second reaction, the serine residue of the introduced linker is oxidized, and Next, as described in the previous example, to covalently link n chains to the protein, , PEG-AoA functionalized polymer. All publications and patent applications mentioned herein are hereby incorporated by reference. Be incorporated. Although the present invention has been sufficiently described, many changes and modifications may be made within the scope of the present invention. What can be done will be apparent to those skilled in the art.

Claims

[Claims] 1. A functionalized polymer comprising an organic polymer covalently linked to an amino-oxy oxime-forming group. 2. The functionalized polymer of claim 1 wherein said organic polymer is attached to two amino-oxy groups. 3. An organic polymer having a first end and a second end is covalently linked at its first polymer end to a first amino-oxy group and at its second polymer end to a second amino-oxy group. 3. The functionalized polymer of claim 2. 4. The functionalized polymer of claim 1, wherein said polymer is a water-soluble polymer. 5. The water-soluble polymer is dextran, dextran sulfate, P-amino cross-linked dextrin, carboxymethyl dextrin, cellulose, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, starch, dextrin, starch hydrolyzate, polyalkylene glycol, heparin, heparin fragment, polyvinyl The method according to claim 4, wherein the compound is selected from the group consisting of alcohol, polyvinyl ethyl ether, polyvinyl pyrrolidone, α, β-poly (2-hydroxyethyl) -DL-aspertamide, polyoxyethylated polyol and polynucleotide. Functionalized polymer. 6. The polyalkylene glycol is selected from the group consisting of linear, branched, disubstituted or unsubstituted polyalkylene glycols, polyethylene glycol homopolymers, polypropylene glycol homopolymers, and copolymers of ethylene glycol and propylene glycol. 6. The functionalized polymer of claim 5, wherein the homopolymer and copolymer are unsubstituted or substituted at one end by an alkyl group. 7. 7. The functionalized polymer according to claim 6, wherein said polymer is polyethylene glycol (PEG) or methoxy polyethylene glycol (mPEG). 8. The functional composition of claim 5, wherein the polyoxyethylated polyol is selected from the group consisting of polyoxyethylated sorbitol, polyoxyethylated glucose, and polyoxyethylated glycerol. Polymer. 9. The functionalized polymer of claim 1, wherein said polymer has an average molecular weight of about 200 to 200,000. Ten. 10. The functionalized polymer of claim 9, wherein said polymer has an average molecular weight of about 400-50,000. 11． 11. The functionalized polymer of claim 10, wherein said polymer has an average molecular weight of about 2,000 to 40,000. 12． 6. The functionalized polymer according to claim 5, wherein said dextran or its derivative has an average molecular weight of 10,000 to 500,000. 13. The polymer is represented by the following formula: R1-O (R2-O) _n R2-R3 wherein n is an integer from 5 to 2,000, and R2 is straight chain, branched chain, disubstituted or substituted. not a lower alkyl group, and one of (a) R1 and R3 are amino - oxy oxime - comprises forming group, and one of the other of R1 and R3 is hydrogen, -CH ₃ or a protecting group Or (b) both R1 and R3 comprise an amino-oxy oxime-forming group, and either or both of R1 and R3 optionally comprise a spacer group]. 6. The functionalized polymer according to claim 1. 14. 14. The functionalized polymer according to claim 13, wherein said protecting group is an alkyl group. 15． 15. The functionalized polymer according to claim 14, wherein said protecting group has 1 to 10 carbons. 16． 16. The functionalized polymer according to claim 15, wherein said protecting group is methyl. 17． 14. The functionalized polymer according to claim 13, wherein said n is an integer from 10 to 1,000. 18． The amino - oxy oxime - forming groups comprises at -X-O-NH _2, a spacer group consisting wherein said X is contains -NH-CHO-R4-, and wherein R4 is -O- coupled to NH _2, and substituted or unsubstituted straight-chain, branched or functionalized polymers in the range 13 claim of claim is a cyclic lower alkyl. 19. Polymers functionalization of paragraph 18, wherein claims a is - said R4 is -CH _2. 20. Formula (P) _m L-X-O-NH ₂ or (P) _m L-X-C (R) O wherein P is an organic polymer, m is an integer of 2 to 10, and X is a spacer group, R is a straight-chain or branched alkyl radical of C ₁ -C ₁₀ non-hydrogenated, or substituted or unsubstituted, and L is a multi individual P is covalently coupled And the valency of L is at least m + 1]. twenty one. Wherein X is, in the formula _{(P) m L-X-} O-NH 2, -CH 2 - or the comprising at claims CHOH- scope of paragraph 20, wherein the functionalized polymer. twenty two. Wherein X is, in the formula _{(P) m L-X-} O-NH 2, -CO-CH 2 - or -NH-CO -CH ₂ - functionalized range recited in Claim 21 wherein the the comprising at claims polymer. twenty three. Wherein X is, in the formula _{(P) m L-X-} C (R) O, -CH 2 -, CO-, or -CHOH- a contains the claims made in the paragraph 20, wherein the functionalized polymer. twenty four. 21. The method according to claim 20, wherein said L comprises a triamine of the formula N (R5-NH-) _3, wherein R5 comprises a substituted or unsubstituted aliphatic or aromatic group. 6. The functionalized polymer according to claim 1. twenty five. Wherein R5 is phenyl or C ₁ -C ₁₀ alkylene component, C ₁ -C ₁₀ alkyl group, or a combination thereof, amino acid peptide, oligonucleotide, oligosaccharide, selected from the group consisting of a lipid chain or a combination thereof, 25. The functionalized polymer of claim 24, which can include a heteroatom. 26. Wherein R5 is -CH ₂ -CH ₂ - functionalized of the claims paragraph 24, wherein the polymer. 27. A method for systematically modifying the Stokes radius of an organic target polymer, comprising: (a) obtaining a site-specifically functionalized target polymer comprising a first oxime-forming group; b) Complementary second oxime-forming reactive with said first oxime-forming group, wherein the topologies differ in the series of functionalized organic polymers but not in the molecular weight (average). Obtaining said series of functionalized organic polymers comprising groups and then (c) separately from the individual functionalized polymers through oximation to obtain a series of conjugated polymers; Bonding the functionalized target polymer, and wherein steps (a) and (b) are performed in any order. 28. 28. The method of claim 27, further comprising (d) identifying a change in a biological or physical property of the conjugated polymer of step (c). 29. The second oxime - range 27 11. The method according to claims forming groups comprises an -O-NH _2.