JPH10509179A

JPH10509179A - Stable N-terminally linked DTPA: protein compositions and methods

Info

Publication number: JPH10509179A
Application number: JP8517016A
Authority: JP
Inventors: リツツインガー，デイビツド・シー; ラルフ，ロイド・デイ
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1994-11-17
Filing date: 1995-11-17
Publication date: 1998-09-08
Also published as: AU4366796A; WO1996015816A2; EP0796113A2; MX9703549A; WO1996015816A3; AU709012B2

Abstract

(57)【要約】この本発明は、キレート化剤ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)が蛋白質のＮ−末端に部位特異的に結合され、それにより種々の金属放射性核種と錯体を形成することのできる均質で明瞭な生成物を与えるＤＴＰＡ：蛋白質組成物に関する。キレート化金属放射性核種を有する又は有さないいずれかのこの発明の組成物は、大量に生産することができ、且つインビボ生物活性を完全に保持する。この組成物は、白血病および関連疾患の診断、画像化、および／または治療に潜在的用途を有する。 (57) [Summary] The present invention provides a homogenous and clear product in which the chelating agent diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) is site-specifically bound to the N-terminus of the protein, thereby allowing it to complex with various metal radionuclides. DTPA given: related to the protein composition. The compositions of this invention, with or without chelated metal radionuclides, can be produced in large quantities and retain full in vivo biological activity. This composition has potential use in the diagnosis, imaging, and / or treatment of leukemia and related disorders.

Description

【発明の詳細な説明】安定なＮ−末端結合ＤＴＰＡ：蛋白質組成物および方法発明の分野本発明は、概括的には蛋白質修飾の分野に関し、更に詳しくは、キレート化剤ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）が、蛋白質のＮ−末端に部位特異的に結合し、それによって、種々の金属性放射性核種と錯体を形成することのできる均質で明瞭な生成物を与える、ＤＴＰＡ：蛋白質組成物に関する。別の態様において、本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）にＤＴＰＡを結合させる方法に関し、それにより、蛋白質の構造的および機能的完全性を維持しながら、このような蛋白質およびサイトカイン類を含む関連蛋白質に放射性標識する有用な手法を提供する。発明の背景蛋白質および他の生物学的化合物の放射性標識は、通常、沃素化により達成されている。蛋白質は、いくつかの方法［Reogoeczi,E.,Iodine-LabeledPlasmaPro teins,1,53,(CRCPress，Boca Raton，Fla 1982)］により沃素の放射性同位元素でうまく標識することができ、そのように標識された抗体が、外部的画像化により腫瘍の局在を決定する放射性免疫検出研究に用いられてきた［ Keenan等，J.Nucl．Med.，26，531(1985)］。しかしながら、これらの研究および沃素の放射性同位元素の使用に関連するその他の研究の過程で、放射性沃素を使用する画像化手法に対する特定の限界が明白になってきた（例えば、多数の沃素放射性同位元素の貧弱な画像特性、関連の標識手法、およびインビボにおける標識の高度の不安定性）。更に、最も一般的な沃素化法は、他の感受性基を修飾し、蛋白質構造の変化、ひいては可能性のある生物学的不活性化を引き起こすことがある反応混合物における酸化条件を含む。これらの蛋白質および他の化合物を沃素化しようとする場合に遭遇する困難性を回避するために、代替法が用いられた。このような方法の一つは、強力なキレート基が蛋白質に共有結合により結合し、これによってキレートを結合した蛋白質が、次いで、種々の金属性放射性核種[Meares & Goodwin，J．Prot．Chem.,3, 215-228,(1984)]、常磁性金属イオン[Lauffer&Brady,Magn.Reson.Imag.,3,11-16 ,(1985);Ogan等,Invest.Radjol.,22，665-671，(1987)］、又は蛍光性金属［Muk kala 等，Anal.Biochem.，176，319-325，(1989)］と錯体を形成することができる、という“二官能性分子キレート”法である。キレート化剤による蛋白質の共有結合修飾に最も一般的に用いられる試薬は、ＤＴＰＡの環状二無水物である。ＤＴＰＡの環状二無水物は、通常、エチレントリアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の類似体に比べて強力なキレートを形成し［Perrin 等，Organic Ligands，IUPAC Chemical Data Series No．22，(New York,Pergam on Press 1982)］、ＥＤＴＡの類似体を用いる場合の合成手法に比べてさほど複雑でない合成手法を含む。更に、ＤＴＰＡの環状二無水物は、室温で明らかに安定であり、それにより結合条件においてより高い制御を提供する。HnatowichおよびMcGann,Int.J.Rad.Appl.Instrum.,[B],14,563-568(1987)。ＤＴＰＡの蛋白質への結合は、該二無水物が主として遊離のアミン基（例えば、利用可能なリシン残基）と反応してアミド結合を形成するｐＨ≧７．０で慣例的に実施される［ Hnatowich等，Science，220，613-615(1983a)］。これらの共有結合修飾を実施する者にとっての主な気がかりは、キレート化剤が結合できる各蛋白質上に多数の結合可能な部位があることである。現在存在する方法では、リシン側基のように蛋白質の内部に位置しようとＮ−末端であろうといずれかの反応基において非選択的結合が起こるが、これは、不均質な集団が原因である。例えば、ＤＴＰＡ二無水物とインスリンとの反応は、架橋した蛋白質およびアシル化チロシン残基を含むいくつかの生成物の錯体混合物を生成するし［Mais ano等，Bioconj．Chem.，3，212-217 (1992)］、一方、アルブミンとＤＴＰＡ二無水物との反応は、複数のキレート基が結合した蛋白質分子を生成した［Lauffe r & Brady，Magn．Reson．Imag.，3,11-16，(1985)］。蛋白質に結合したＤＴＰＡ基の数は、しばしば平均数として与えられるが、これは試料調製物が不均質であり、それぞれキレート基が平均数より多いおよび少ない両方の蛋白質を有するからである［HnatowichおよびMcGann，Int．J．Rad． Appl．Instrum.，[B]，14，563-568(1987)］。蛋白質は、キレート基の共有結合により分解されることがあり、置換が増加するほど分解の程度も増加することが周知である［Sakahara等,J.Nucl.Med.，26，750，(1985)］。いくつかのキレート基を有するこれらの蛋白質分子は、それらの本来の生物学的性質を保持することはほとんどなさそうである［MearesおよびGoodwin,Jour.of Prot．Chem.，3， 215-228(1984)］。生産者の見地から言えば、これらの不均質な治療蛋白質の販売規制の認可獲得には、複雑さが加わっていたかもしれない。キレート標識蛋白質のインビボ性質は総説されている［Meares等，Adv．Chem. ，198，369-387(1982)］。最も一般的知見は、インビボの安定性は、蛋白質−キレート化剤結合体の化学的性質に決定的に依存すること、より軽く標識した蛋白質は、より長い生物学的半減期を有すること、および活性の保持は、活性部位内に含まれる残基の標識を最小にする手法（例えば、特異的標識）によってより可能になりそうであること、である。例えば、ウマ血清アルブミン（ＨＳＡ）を、¹¹¹ Ｉｎで標識したキレート化剤と結合し、インビボ注入した場合肝臓により急速に浄化された（沃素化ＨＳＡ上の¹²⁵Ｉ標識後の結果との比較による）［Leung およびMeares，Biochem．Biophys．Res．Commun.，75，149-155(1977)］。少なくとも、最も多数のキレート基を有し従って続いて放射能の高いパーセンテージを示す集団であるキレート剤結合ＨＳＡは、インビボで異種蛋白質として認識されていたかもしれない［MearesおよびGoodwin，Jour．of Prot．Chem.，3，215- 228(1984)］。蛋白質上の単一の（重要でない）部位に特異的に標識することによって、生成物の不規則で数多い分布を回避する有利性は明らかである。ＤＴＰＡ二無水物を用いたＤＴＰＡと蛋白質との共有結合については数人の研究者により述べられてきた。例えば、Khaw等，Science，209，295(1980)は、ミオシンに対して活性な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）断片にＤＴＰＡを結合させ、イヌの心筋梗塞における標識蛋白質の局在を調査した。同じ方法を用い、Schein berg等，Science，215，1511，(1982)は、マウスの赤白血病細胞に特異的な標識モノクローナル抗体を調製した。これらの方法及びその他の方法は、結合蛋白質を提供するが、これらは常に複雑な合成および低い結合効率によって特徴づけられる。Hnatowich等，Science，220，613-615，(1983a)。米国特許第４，４７９，９３０（Hnatowich）は、放射性同位体金属陽イオンでキレート化した、アミンに結合した二環式二無水物を含む組成物を開示している。この組成物は、インビボで安定であることが報告されている。この組成物を調製する方法も開示されている。結合反応混合物の初期および最終ｐＨは、全ての場合にｐＨ７．０であること、無水物対抗体のモル比が１：１に保たれている場合、結合効率（ポリペプチドまたは蛋白質に共有結合する無水物分子のパーセンテージとして定義される）が高いが、中性より上または下のｐＨ値では減少することが報告されている。種々の反応生成物の蛋白質またはポリペプチド上のＤＴＰＡ部分の分布に関する教示はない。結合が蛋白質のＮ−末端に部位特異的であり、それにより、より明瞭で均質な組成物が得られるという事実のために、先行文献のものより有利であるＤＴＰＡ：蛋白質結合体の調製に関しては、文献から引き出し得るものは何もない。キレート化金属性放射性核種を有するか又は有しないいずれかの組成物を、大量に生産することができ、そのインビボ生物活性を完全に保持する。本発明の合成法は、単一の反応部位を創出する単純な一工程反応であり、蛋白質を標識する有用な方法を提供する。本発明のＤＴＰＡ:蛋白質結合体は、白血病および関連疾患の診断、画像化、および／または治療における潜在的用途を有する。発明の概要本発明は、Ｎ−末端に化学的に修飾した蛋白質の実質的に均質な調製物及びその製造方法に関する。思いがけなくも、キレート化剤ＤＴＰＡの結合は、蛋白質のＮ−末端に部位特異的であり、それにより、他のキレート化剤:蛋白質組成物と比較してより均質で明瞭な生成物を提供する。やはり思いかけなくも、好ましいＤＴＰＡ：Ｇ−ＣＳＦ結合体は、蛋白質の構造的および機能的完全性を維持しながら、いくつかの金属性放射性核種をキレート化して放射性標識した生成物を得ることができ、この方法は、Ｇ−ＣＳＦ同様他の蛋白質（又はその類似体）に広く適用することができる。一つの態様において、本発明は、ＤＴＰＡ：Ｇ−ＣＳＦ（又はその類似体）の実質的に均質な調製物および関連方法に関する。後記の実施例の１つは、キレート化剤ＤＴＰＡがｒｈＧ−ＣＳＦのＮ−末端に部位特異的に結合すること、またこのような組成物は種々の金属性放射性核種と錯体を形成しうることを示している。該結合体は、Ｇ−ＣＳＦ分子のＮ−末端に特異的であることから、その結果得られた生成物は、先行文献のものに比べてより均質で明瞭に定義される生成物である。また、本発明は、標識蛋白質を製造する方法に関し、この方法は、（ａ）蛋白質のアミノ末端のα−アミノ基を選択的に活性化するのに十分酸性であるｐＨでキレート化剤とこの蛋白質を反応させ；(ｂ)非結合蛋白質から結合蛋白質を分離し；(ｃ)この結合体に金属陽イオンを付加し；および（ｄ）標識蛋白質を得ることを含む。この方法は、ｒｈＧ−ＣＳＦおよびＩＬ−２に関して下記で説明しており、これらは本発明の更なる態様を提供する。図面の簡単な説明図１は、ｒｈＧ−ＣＳＦの結合に対する初期ｐＨおよびＤＴＰＡ：蛋白質モル比の影響を示す。以下の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した：レーン１−ＭＷマーカー；レーン２−４、初期ｐＨ６．０でそれぞれ５：１、５０：１、および５００：１のＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ；レーン５−７、初期ｐＨ７．０でそれぞれ５：１、５０：１、および５００：１のＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ；レーン８−１０、初期ｐＨ８．０でそれぞれ５：１、５０：１、および５００：１のＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ；レーン１１、ｐＨ６．０でのｒｈＧ−ＣＳＦ；レーン１２、ｐＨ８．０でのｒｈＧ−ＣＳＦ。図２は、ｒｈＧ−ＣＳＦ出発物質（ライン１）、Ｇ５０スピンカラムを通す前のＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合反応混合物（ライン２）、およびＧ５０スピンカラムを通した後のＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合反応混合物（ライン３）、のサイズ排除ＨＰＬＣ溶出プロットを示す。溶出は、２８０ｎｍでの吸光度で監視した。図３は、ｒｈＧ−ＣＳＦ出発物質（破線）およびＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ反応混合物（実線）の分取用陽イオン交換ＦＰＬＣ溶出プロットを示す。溶出は、２８０ｎｍでの吸光度で監視した。図４は、¹¹¹Ｉｎとともに予めインキュベートしたＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体（ライン１および４）およびｒｈＧ−ＣＳＦ（ライン２および３）の分析用陽イオン交換ＨＰＬＣ分析を示す。溶出は、２２０ｎｍでの吸収（ライン３および４）と放射能（逆転したライン１および２）とで監視した。図５は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（ライン１）、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体（ライン２）、および過剰のＩｎＣｌ₃で処理したＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体（ライン３）の分析用陽イオン交換ＨＰＬＣ分析を示す。溶出は、２２０ｎｍでの吸光度で監視した。ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を緩衝液Ａに加えた。図６は、以下の試料のシリカゲルＴＬＣプレート分析を示す：レーン１、０．１ナノモルの¹¹¹Ｉｎ（微量の¹¹¹Ｉｎを有するインジウム）；レーン２、２０ナノモルのＤＴＰＡに加えた１０ナノモルの¹¹¹Ｉｎ；レーン３、２ナノモルのｒｈＧ−ＣＳＦと共にインキュベートし、続いて２０ナノモルのＤＴＰＡを加えた１０ナノモルの¹¹¹Ｉｎ；およびレーン４、２ナノモルのＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体と共にインキュベートし、続いて２０ナノモルのＤＴＰＡを加えた１０ナノモルの¹¹¹Ｉｎ。レーン２−４は、０．１ナノモルの¹¹¹Ｉｎを含有するアリコートを混合物から取り出しプレート上にロードした。図７は、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す。スペクトルは、多重にプロトン化した種（１、２、３および４個のプロトンが結合したもの）を示す。図８は、キレート化インジウムを有するＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体のイオン−スプレー質量スペクトルを示す。結合体は、分析前に、飽和ＩｎＣｌ₃と共に予めインキュベートした（Ｉｎ：結合体、１０：１、モル／モル）。図９は、ｒｈＧ−ＣＳＦのイオン−スプレー質量スペクトルを示す。図１０は、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体のペプチドマッピングを示す。蛋白質分解によりＤＴＰＡ−ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体（実線）およびｒｈＧ−ＣＳＦ（破線）から生じたペプチド断片を、還元し、アルキル化し、次いで逆相ＨＰＬＣにより分離した。溶出は、２１５ｎｍでの吸光度で監視した。矢印は、消化したｒｈＧ−ＣＳＦ試料由来のＮ−末端ペプチドの溶出を指示する。図１１は、以下の試料を含有する等電点電気泳動ゲル（ｐＨ３−１０）を示す：レーン１、ｒｈＧ−ＣＳＦ；レーン２、過剰のＩｎＣｌ₃と共に予めインキュベートしたＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体（Ｉｎ：結合体、１０：１、モル／モル）；レーン３、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体；およびレーン４、等電点マーカー。図１２は、キレート化インジウム非含有（−−−−）および含有（）ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体、ならびに未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦ（）およびＤＴＰＡ（ . .）の円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。試料（０．０７８ｍｇ／ｍｌ蛋白質、および４．０７μＭのＤＴＰＡ）を、２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．４中で１０℃で分析した。未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦ試料およびＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ試料（インジウム非含有）は、同一である。図１３は、ｒｈＧ−ＣＳＦのインビボ活性に対するＤＴＰＡ結合体の影響を示す。ハムスターの皮下注射後に活性（ＷＢＣ数）を測定した。ｒｈＧ−ＣＳＦ投与量は、１００μｇ／ｋｇであった。棒は、標準偏差（蛋白質試料はｎ＝８−１０、および基線はｎ＝５−６である）を表す。図１４は、¹¹¹Ｉｎと共に予めインキュベートしたＩＬ−２（ライン２および３）およびＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体（ライン１および４）の分析用陽イオン交換ＨＰＬＣ分析を示す。溶出は、２２０ｎｍでの吸光度（ライン３および４）と放射能（逆転したライン１および２）とで監視した。図１５は、ＩＬ−２（ライン１）、ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体（ライン２）、および過剰のＩｎＣｌ₃で処理したＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体（ライン３）の分析用陽イオン交換ＨＰＬＣ分析を示す。溶出は、２２０ｎｍでの吸光度で監視した。ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を緩衝液Ａに加えた。図１６は、以下の試料のシリカゲルＴＬＣプレート分析を示す：レーン１、０．１ナノモルの¹¹¹Ｉｎ（微量の¹¹¹Ｉｎを有するインジウム）；レーン２、２０ナノモルのＤＴＰＡに加えた１０ナノモルの¹¹¹Ｉｎ；レーン３、２ナノモルのＩＬ− ２と共にインキュベートし、続いて２０ナノモルのＤＴＰＡを加えた１０ナノモルの¹¹¹Ｉｎ；およびレーン４、２ナノモルのＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体と共にインキュベートし、続いて２０ナノモルのＤＴＰＡを加えた１０ナノモルの¹¹¹ Ｉｎ。レーン２〜４は、０．１ナノモルの¹¹¹Ｉｎを含有するアリコートを混合物から取り出しプレート上にロードした。図１７は、ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体のペプチドマッピングを示す。蛋白質分解によりＤＴＰＡ−ＩＬ−２結合体（実線）およびＩＬ−２（破線）から生じたペプチド断片を、還元し、アルキル化し、次いで逆相ＨＰＬＣにより分離した。溶出は、２１５ｎｍでの吸光度で監視した。矢印は、消化したＩＬ−２試料由来のＮ−末端ペプチドの溶出を指示する。詳細な説明本発明のＤＴＰＡ：蛋白質結合体を、以下において更に詳細に説明し、後記の実施例により具体的に説明する。実施例は、本発明の種々の態様を示し、種々のＤＴＰＡ：蛋白質結合体の生物学的活性試験の結果を包含している。驚くべきことには、本発明の方法を用いると、得られるＤＴＰＡ結合体が蛋白質のＮ−末端に部位特異的であるように単一の反応性部位を創出して、蛋白質の構造的および機能的完全性を維持しながら種々の金属性放射性核種と錯体を形成することのできる明瞭で均質な組成物を与える。本発明の実施使用で意図するものは、種々のサイトカイン類および関連蛋白質である。意図する蛋白質の具体例としては、前述のＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターフェロン類（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン類（１〜１４）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球成長および発育因子（ＭＧＤＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ならびに腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）のような種々の造血因子が挙げられる。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、造血前駆細胞の好中球への分化を誘導し成熟好中球の活性を刺激する糖蛋白質である。１７５個のアミノ酸を有し大腸菌内で発現された組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）は、１８，７９８Ｄａの分子量を有し、生物学的に活性である。現在、組換えＧ−ＣＳＦであるフィルグラスチム(Filgrastim)は、治療用途に入手可能である。種々の条件下のＧ−ＣＳＦの構造は、精力的に研究されており［Lu等，J．Bio l．Chem．Vol．267，8770-8777(1992)］、ｒｈＧ−ＣＳＦの三次構造は、最近、Ｘ線結晶学により決定された。Ｇ−ＣＳＦは、２つの長い交叉接続(crossover c onnection)を有する４つのα−ヘリックスバンドルの共通構造モチーフを共有する成長因子種の一構成員である［Hill等，P.N.A.S．USA，Vol．90，5167-5171(1 993)］。このファミリーには、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、インターロイキン −２、インターロイキン−４、およびインターフェロンβが含まれる。二次構造の程度は、蛋白質が酸性のｐＨでいっそう高い度合いのαらせん含量を得る溶媒ｐＨに敏感である［Lu等，Arch．Biochem．Biophys.，286，81-92(1989)］。通常、本発明の実施に有用なＧ−ＣＳＦは、哺乳類生物から単離された形態のもの、あるいは、化学合成法による生成物かまたは、ゲノムもしくはｃＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ合成により得られた外来性ＤＮＡ配列の原核もしくは真核生物宿主発現の生成物であり得る。適切な原核生物宿主としては、種々の細菌（例えば、大腸菌）が挙げられ；適切な真核生物宿主としては、酵母（例えば、 S.cerevisiae）および哺乳類細胞（例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、サル細胞）が挙げられる。用いた宿主に依存して、Ｇ−ＣＳＦ発現生成物は、哺乳類もしくは他の真核生物の炭水化物でグリコシル化されていてもよいし、又はグリコシル化されていなくてもよい。また、Ｇ−ＣＳＦ発現生成物は、最初のメチオニンアミノ酸残基を（−１位に）含んでいてもよい。組換えＧ−ＣＳＦ、特に大腸菌由来の組換えＧ−ＣＳＦが、商業的実用性が最も大きいことから中でもとりわけ好ましいが、本発明は、このような形態のＧ−ＣＳＦのいずれか及び全ての使用を意図している。特定のＧ−ＣＳＦ類似体が、生物学的に機能的であることが報告されており、これらは化学的に修飾することもできる。Ｇ−ＣＳＦ類似体は、米国特許第４，８１０，６４３号に報告されている。報告された各類似体の活性は何ら示されていないが、生物学的活性を有するものとして報告された他のＧ−ＣＳＦ類似体の例は、ＡＵ−Ａ−７６３８０／９１、ＥＰ０４５９６３０、ＥＰ０２７２７０３、ＥＰ０４７３２６８およびＥＰ０３３５４２３に記載されるものである。ＡＵ−Ａ−１０９４８／９２、ＰＣＴＵＳ９４／００９１３およびＥＰ０２４３１５３も参照のこと。一般に、本発明に有用なＧ−ＣＳＦ及びその類似体は、本明細書中に記載するような化学的修飾手法を実施し、得られた生成物を、例えば本明細書中に記載する生物学的活性分析により所望の生物学的特徴を調べることにより確認することができる。当然のことながら、非ヒト哺乳類を治療する場合、そのように望むのならば、組換えマウス、ウシ、イヌ等のような組換え非ヒトＧ−ＣＳＦを用いることができる。例えば、ＰＣＴＷＯ９１０５７９８およびＰＣＴＷＯ８９１０９３２参照のこと。約１５，０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質であるインターロイキン− ２は、生体の免疫応答を仲介するリンホカイン類と呼ばれる群の構成員である。この蛋白質は、活性化Ｔ−細胞により産生され、種々のインビボ活性を有することが知られている。例えば、ＩＬ−２は、胸腺細胞有糸分裂誘発を促進し、Ｔ− 細胞の反応性を誘発し、ガンマインターフェロンを制御し、ある種の免疫不全状態におけるリンパ球の免疫機能の回復を増大させることが報告されている。これは、腫瘍性および免疫不全疾患の研究および治療に応用可能性があり、癌の治療に対する処置に用いられてきた。本発明の実施に有用なＩＬ−２は、哺乳類生物から単離された形態のもの、あるいは、ＩＬ−２類似体であれば特に、化学合成手法により得られる生成物かまたは、ゲノムもしくはｃＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ合成により得られた外来性ＤＮＡ配列の原核もしくは真核生物宿主発現の生成物であり得る。適切な原核生物宿主としては、種々の細菌（例えば、大腸菌）が挙げられ；適切な真核生物宿主としては、酵母（例えば、S.cerevisiae）および哺乳類細胞（例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、サル細胞）が挙げられる。用いた宿主に依存して、ＩＬ−２発現生成物は、哺乳類もしくは他の真核生物の炭水化物でグリコシル化されいてもよいし、又はグリコシル化されていなくてもよい。また、ＩＬ−２発現生成物は、最初のメチオニンアミノ酸残基を（−１位に）含んでいてもよい。組換ＩＬ−２および類似体、特に大腸菌由来のものが、商業的実用性が最も大きいことから中でもとりわけ好ましいが、本発明は、このような形態のＩＬ−２及びその類似体のいずれか及び全ての使用を意図している。天然に存在するＩＬ−２の単離および精製による、又は遺伝子工学的手段によるＩＬ−２の調製法は公知である。例えば、米国特許第４，７７８，８７９号；第４，９０８，４３４号；および第４，９２５，９１９号（Mertelsman等）；米国特許第４，４９０，２８９号（Stein）；米国特許第４，７３８，９２７号（Taniguchi等）；米国特許第４，５６９，７９０号（Koths等）；米国特許第４，５１８，５８４号（Mark等）；米国特許第４，９０２，５０２号（Nitecki等）；ならびにヨーロッパ特許第０１３６４８９号（Souza等）参照のこと。ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）は、成人Ｔ−細胞白血病(Uchiyama等，1985)、ヘアリーセル白血病(Trentin等,1992)、慢性リンパ性白血病(Rosolen等，1989) 、ホジキン病(StrauchenおよびBreakstone,1987)、および非ホジキンリンパ腫（Grant等，1986）を含む種々の悪性血液病に構成的に過発現する。慢性関節リウマチ（LemmおよびWarnatz，1986）および同種移植片拒絶（Waldmann，1989）を含むいくつかの自己免疫疾患に関与するリンパ球もＩＬ−２Ｒを過発現する。従って、この受容体は、細胞毒性剤療法の標的として積極的に研究されてきた。シュードモナス(Pseudomonas)外毒素の細胞結合ドメイン（Lorberboum-Galski等，1988a）またはジフテリア毒素の受容体結合ドメイン（Williams等，1987）がＩＬ−２で置換された組換え融合毒素が合成されている。これらの融合蛋白質は、高親和性ＩＬ−２Ｒを発現する細胞に対し特に細胞毒性を示す（Lorberboum-Galsk i等，1988b;Williams等，1990）。最近記載されたシュードモナス外毒素／ＴＬ −４キメラ蛋白質も、自己免疫疾患、同種移植片拒絶および、細胞が高レベルのＩＬ−４受容体を発現する多数の悪性血液病の治療に有用であろう（Puri等，19 94）。白血病の研究および治療に有用性があると思われるジフテリア毒素関連ヒトＧ−ＣＳＦ融合蛋白質も、最近構築された(Chadwick等，1993)。また、ＤＴＰＡのＩＬ−２、ＩＬ−４およびｒｈＧ−ＣＳＦへの結合は、白血病および関連疾患の診断、画像化および／または治療に潜在的な用途を有する。細胞毒性剤療法のためのキレート可能な放射性金属としては、²¹²Ｂｉ、²¹¹Ａｔ、および⁹⁰Ｙが挙げられる。事実、結合した二官能性キレートを介して放射性同位体²¹²Ｂｉおよび⁹⁰Ｙを有する、ＩＬ−２Ｒａ鎖に対する抗体については、数人の研究者等（Junghans等，1993;Parenteau等，1992;Kozak等，1990）により異反応性(allor eactive)Ｔ−細胞系に対する細胞毒性および放射性治療の可能性が研究されている。本発明の結合に有用なＤＴＰＡは、工業的グレードのＤＴＰＡ二無水物である。大腸菌由来のｒｈＧ−ＣＳＦを含む好ましい実施態様において、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合は、初期ｐＨ６．０および５０：１のＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦモル比でおこる。大腸菌由来のＩＬ−２を含む好ましい実施態様において、ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合は、初期ｐＨ６．０および５０：１のＤＴＰＡ：ＩＬ−２モル比でおこる。本発明を、特定のＤＴＰＡ：蛋白質結合体および治療法に関して具体的に説明してきたが、種々の関連結合体および治療法が本発明の範囲から逸脱することなく存在しうることは当業者には明らかであろう。以下の実施例により本発明の種々の態様をさらに詳細に説明する。実施例１結合に用いるＤＴＰＡは、初めは二無水物の形態であり、従って、蛋白質：蛋白質架橋のような望ましくない副反応の可能性が存在する［Hnatowich等，J．Im muno．Methods，65，147-157，(1983b)］。従って、このような生成物の形成を最小にするために初期ｐＨおよびＤＴＰＡ二無水物：ｒｈＧ−ＣＳＦモル比のような反応条件を検討した。米国特許第４，８１０，６４３号(Souza)に述べられているようにヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列で大腸菌細胞をトランスフェクションする組換えＤＮＡ技術を用いｒｈＧ−ＣＳＦを産生した。ｒｈＧ−ＣＳＦを、１００ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０中の２．７５−４ｍｇ／ｍｌ溶液として調製した。ＤＴＰＡ二無水物およびトリブチルホスフィン(ＴＢＰ、工業的純度)は、Aldrich社(Milwaukee，WI)から得た。ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の調製種々の量のＤＴＰＡ二無水物を、乾燥した酸洗浄（Meares等，J．Prot．Chem. ，3，215-228，(1984)）試験管に入れた。２ミリリットルの無水クロロホルム(A ldrich Chemicals社，Milwaukee，WI)を次いで加え、試験管を穏やかな気流の窒素ガス下で激しく攪拌してクロロホルムを蒸発させ試験管の底にＤＴＰＡ二無水物の薄いフィルムを形成した。１００ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、またはｐＨ８．０中の２．７５−４．０ｍｇ／ｍｌ濃度のｒｈＧ− ＣＳＦを、ＤＴＰＡ二無水物で被覆した試験管に穏やかに攪拌しながら最終モル比５：１、５０：１、または５００：１（ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ）になるように加えた。各試料のアリコートをとっておき、未結合のＤＴＰＡを除去するために大部分の試料をPenefske，H．S .，Methods Enzymol.，56，527-530，(1979)に記載のようにＧ５０スピンカラムに通した。ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の分析１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析１７−２７％のISS MiniPlusゲル（Nattick社，MA）を用い試料を処理したＧ５０スピンカラム上でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。試料を非還元緩衝液で希釈し、５μｇの蛋白質を各ウェルの中にロードした。ゲルを不連続緩衝液系で泳動し、クマシーブル−Ｒ−２５０で染色した(Laemmli,U.K.,Nature,227,680-685,( 1970)。上記で調製した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図１に示す。初期ｐＨ７．０（レーン５−７）または８．０（レーン８−１０）で行った反応により、未処理のｒｈＧ−ＣＳＦ（レーン１１および１２）で観察した見掛けの分子量と比較してより高分子量の著量の物質を得た。しかしながら、初期ｐＨ６．０（レーン２−４）の反応では、単一の検出可能なより高分子量の物質（ｐＨ７．０および８．０の試料で検出した物質の一つに相当する）を得た。この物質の見掛け分子量は、ＤＴＰＡ架橋蛋白質二量体であるかもしれないことを示唆する。ｐＨ６．０の試料では、このより高分子量のバンドは、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦモル比が増加するにつれて強さが減少しており、５００：１の試料（レーン４）では実質的に存在しなかった。２．サイズ排除ＨＰＬＣ初期ｐＨ６．０およびＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ比５０：１の反応混合物を、サイズ排除ＨＰＬＣにより更に分析した。Ｇ５０スピンカラム前およびＧ５０スピンカラム後の試料を分析した。WISP 717および５℃に保冷された自動試料採取器を具備したWaters Liquid Chromatograph(Milliford，MA)およびRaytest Ramo na LS放射性同位体検出器を配した490 E多重波長UV/Vis検出器（Pittsburgh，PA ）によりＨＰＬＣを実施した。UV/Vis検出器と放射性同位体検出器との間のボイド容量は、５０μｌであった。サイズ排除ＨＰＬＣでは、２５℃で１．０ｍｌ／分で溶出するPhenomenexBio Sep S2000カラム(Torrance，CA)上で０．１Ｍの燐酸ナトリウム緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９のアイソクラチック移動相を用いて試料を分析した。溶出は、２８０ｎｍでの吸光度で監視し、Waters M illenniumソフトウェアによりＰＣコンピューターで記録した。図２に示すように、Ｇ５０スピンカラム前試料は、８．６５および９．５３分の溶出時間で２つの主要なピークを示した（図２、ライン２）。二番目の主要なピークは、遊離のＤＴＰＡと一緒に共溶出し、Ｇ５０スピンカラム後の試料においてはほどんど除去されていたが、このことは反応混合物からの未結合のＤＴＰＡの除去がうまくいったことを示している（図２、ライン３）。残りの主要なピークの溶出時間は、Ｇ５０スピンカラムにより変わらず、未反応のｒｈＧ−ＣＳＦのわずか前に溶出した（図２、ライン１）。このピークは、単量体のＤＴＰＡ結合ｒｈＧ−ＣＳＦを表す。従って、このサイズ排除カラム上のＤＴＰＡ結合ｒｈＧ−ＣＳＦの挙動は、未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦからのその分離を可能にする。上記の分析は、初期ｐＨおよびＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦモル比が望ましくない副反応の形成に影響することを示す。初期ｐＨ６．０の緩衝液中で反応を開始することにより、このような副反応（例えば、蛋白質の架橋）に起因する生成物の形成が大きく減少する。実施例２この実施例では、¹¹¹ＩｎをキレートするＤＴＰＡ：ｒｈＧ −ＣＳＦ結合体の能力を、分析用陽イオン交換ＨＰＬＣおよび薄層クロマトグラフィーを用いて測定した。次いで、結合体を更に分析して結合体（キレートしたインジウム含有および非含有）の質量、ＤＴＰＡ対ｒｈＧ−ＣＳＦの化学量論モル比、およびｒｈＧ−ＣＳＦ上の結合したＤＴＰＡ部分の位置を決定した。ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の調製この実施例において、初期ｐＨ６．０および５０：１のＤＴＰＡ二無水物：ｒｈＧ−ＣＳＦモル比を用いて調製したＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の分析を、実施例１で述べたように行った。しかしながら、試料を、Ｇ５０スピンカラムを通す代わりに、Pharmacia Hi-Load SP-Sepharose High Performance，16/10，強陽イオン交換カラム（Pharmacia社，Sweden）を用いて分取用陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。分離は、５０ｍｌの注入用ループを取り付けたPh armaciaFPLCシステムにより５℃で達成した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４）中で平衡にし、０−４０％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．４）勾配を用い１．０ｍｌ／分で１８０分にわたって溶出を行った。溶出は、２８０ｎｍでの吸光度で監視し記録した。初めに２０ｍｇのｒｈＧ−ＣＳＦを含む反応混合物（初期ｐＨ６．０、５０：１のＤＴＰＡ二無水物：ｒｈＧ−ＣＳＦモル比）を、Milli-Q 水で５０ｍｌに希釈し、直接 Hi-Load SP-Sepharoseカラムに載せた。約１３％の積分ピーク面積を表すピーク（図３、ピーク２）は、対照の未反応のｒｈＧ−ＣＳＦ（図３、破線）と一緒に共溶出した。これは、約１３％のｒｈＧ−ＣＳＦが未修飾のままであることを示す。１２０から１３０分の間に溶出したピークは、全溶出蛋白質の約８４％を含有する（図３、ピーク１）。より低い塩濃度で溶出するこの物質のシフトは、ＤＴＰＡとの結合による蛋白質の負の電荷の増加と一致する。この簡便で効率的なクロマトグラフィー工程により、精製したＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体から分離された未結合のＤＴＰＡおよび未結合のｒｈＧ−ＣＳＦの両方と共に均質で明瞭な生成物が得られた。ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の分析１．分析用陽イオン交換ＨＰＬＣ．分析用陽イオン交換ＨＰＬＣを、緩衝液Ａ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４）および緩衝液Ｂ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．４）の移動相を用いTosohaas SP-5PW 7.5 x 7.5 mmカラム（Montgomery， PA）上でWaters HPLC システムを用いて実施した。カラムを移動相Ａで平衡にし、分離は、２５℃で１％Ｂ／分直線勾配を用い１．０ｍｌ／分で３０分にわたって行った。分離は、２２０ｎｍでの吸光度を監視することにより、及び使用できる場合、放射性同位体検出器で検出した。インジウムを含有する試料は、ｐＨを５．４に調整する前に１ｍＭのＥＤＴＡを緩衝液Ａに加えた。ｒｈＧ−ＣＳＦおよびＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体を、¹¹¹Ｉｎと共に１５分間予めインキュベートした。過剰の冷インジウムを次いで加え（Ｉｎ：蛋白質、２：１、モル／モル）、試料を、上記のような分析用陽イオン交換ＨＰＬＣにより分析した。ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体（図４、ライン１および４、実線）については、¹¹¹Ｉｎ放射能の９９．５％が、陽イオン交換カラムから蛋白質と共に共溶出し、一方、検出可能な放射能は未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦと共に共溶出されておらず（図４、ライン２および３、破線）、これは、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体による¹¹¹Ｉｎのキレート化を示し、および未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦによる¹¹¹Ｉｎ結合が無いことを示す。ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の分析用陽イオン交換ＨＰＬＣ分析での金属キレート化の効果を、図５に示す。ｒｈＧ−ＣＳＦ（ライン１）、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体（ライン２）、および過剰のＩｎＣｌ₃と共に予めインキュベートした結合体（Ｉｎ：結合体、１０：１、モル／モル、ライン３）の溶出は、２２０ｎｍでの吸光度で監視した。ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体は、未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦに比べてより低い塩濃度で溶出した。次いで、キレート化結合体を、非キレート化結合体よりも僅かに高い塩濃度ではあるが未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦよりは低い塩濃度で溶出した。キレート化金属を有する及び有さないＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の特徴的保持時間は、結合調製物の金属混入を監視するのに用いることができる。更に、この分析は、結合体の金属標識を監視するのに用いることができる。２．薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）僅かに変えてはいるが前述(Meares等，J．Prot．Chem.，3，215-228，(1984)) のようにＴＬＣを行った。１０ｍＭのＨＣｌ中の微量の¹¹¹Ｉｎを有するＩｎＣｌ₃を含有するインジウムストック溶液を調製し、以下の試料を調製するのに用いた：（１）インジウムを１００ｍＭの燐酸ナトリウムに加えた、ｐＨ６．０；（２）１０ナノモルのインジウムを２０ｍＭの酢酸ナトリウム中の２０ナノモルのＤＴＰＡに加えた、ｐＨ５．４；（３）１０ナノモルのインジウムを２ナノモルのｒｈＧ−ＣＳＦと共に室温で１０分間インキュベートし、続いて２０ｍＭの酢酸ナトリウム中の２０ナノモルのＤＴＰＡを加えた、ｐＨ５．４、および（４）１０ナノモルのインジウムを２ナノモルのＤＴＰＡ結合ｒｈＧ−ＣＳＦと共に室温で１０分間インキュベートし、続いて２０ｍＭの酢酸ナトリウム中の２０ナノモルのＤＴＰＡを加えた、ｐＨ５．４。ガラスの支持体上の２５０μｍ厚さのシリカゲル（６０Ａ）（Whatman，Clifton，NJ）上に各試料（０．１ナノモルのインジウム含有）１μｌをスポットした。溶媒として蒸留Ｈ₂Ｏ：メタノール（１：１、ｖ／ｖ）中の１０％（ｗ／ｖ）酢酸アンモニウムを用いてＴＬＣプレートを展開した。展開したプレートを、次いで、MolecularDynamicsPhosphorImage r(Sunnyvale，CA)を用いて分析した。ＤＴＰＡ対ｒｈＧ−ＣＳＦの化学量論モル比を、上記のように決定した。ＤＴＰＡによる¹¹¹Ｉｎのキレート化の結果、溶媒先端近くから全放射能が移動した（図６、レーン１および２を比較）。¹¹¹Ｉｎ（１０ナノモル）をＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体（２ナノモル）と共にインキュベーションし、続いてＤＴＰＡを加えた結果、オリジンに放射能の一部が保持された（図６、レーン４）。個々のレーンの線グラフを描いた処、レーン４のピーク面積の積分により、オリジンに１８％の放射能が残っていることが示された。残存する未結合¹¹¹Ｉｎを、加えたＤＴＰＡで捕集し、溶媒の先端近くに移動させた。かくして、約１．８ナノモルの¹¹¹Ｉｎが２ナノモルのＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体（ＤＴＰＡ対ｒｈＧ−ＣＳＦのモル比０．９）により結合した。未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦは、オリジンに放射能を保持しておらず、これは、¹¹¹Ｉｎ結合が無いことを示している（図６、レーン３）。３．質量分析法マトリックス補助のレーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を、標準３３７ｎｍ窒素レーザーを取り付けたKompact MA LDI III質量分析計（Kratos Analytical，Ramsey，NJ）を用いて行った。２０ｋＶの加速電圧で直線モードでアナライザーを用いてスペクトルを記録した。１５ピコモルの蛋白質および１．０μｌのアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を含有する試料のアリコートを、プローブスライドの試料ウェル中で混合し、風乾した。装置のレーザーフルエンスは、３０にセットした（０−１００の相対尺度にわたって調整可能）。ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の質量は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより測定した（図７）。得られたスペクトルは、モノプロトン化種(species)に加えて多重に荷電したイオンを示した。ピークの連続を平均することにより得られた質量は、１９，１７１．7（±７．３）ダルトンであった。ｒｈＧ−ＣＳＦに結合した単一のＤＴＰＡのＭＷの計算値は、１９，１７０．８ダルトンであった。従って、ＴＬＣ分析と総合的に一致して、観察された質量は、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体について１：１のＤＴＰＡ対ｒｈＧ−ＣＳＦモル比を示した。４．イオン−スプレー質量分析法イオン−スプレー質量分析法を、フロー注入法によりイオン−スプレーインターフェイスを取り付けたPerkin-Elmer Sciex API III質量分析計（Norwalk，CT ）を用いて実施した。試料を、水／アセトニトリル／蟻酸（５０：５０：０．１、ｖ／ｖ）中に希釈し、２５μｌ／分で流れる同じ溶媒中にフロー注入した。オリフィスを７０Ｖにセットし、質量分析計をＱ１モードで操作した。キレートしたインジウムを有するＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の質量を、上記のように測定した。飽和インジウムと共に予めインキュベートした結合体（Ｉｎ：結合体、１０：１、モル／モル）の分析により、異なるｍ／ｚ値の一連のピークを得た。蛋白質の複数のプロトン化に由来するこの多重に荷電したイオンの連続を、デコンボリューションして図８に示すＭＷスペクトルを得た。キレートしたインジウムを有する結合体の測定質量は、１９，２８６（±１．７）ダルトンであり、１９，２８５．６ダルトンの算定質量と一致する。ｒｈＧ−ＣＳＦについては、測定質量が、算定質量１８，７９８．５ダルトンと一致する１８，７９８（±１．８）ダルトン（図９）であった。５．ペプチドマッピングペプチド分析のために、約０．５ｍｇのｒｈＧ−ＣＳＦまたはＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦを、スピードバキューム内で乾燥し、１００μｌの８Ｍの尿素中で再構成し、１０分間超音波処理した。超音波処理後、１０μｌの１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５および１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５中の１ｍｇ／ｍｌのストック溶液から２．５μｇのEndoLys-C(WakoChemicals，Richmond，VA)を加えた。全容量を蒸留水で２００μｌに調整し、蛋白質分解消化を、室温で７時間行った。EndoLys-Cを用いた加水分解後、Kirley,T.K.,Anal.Biochem.,180,231-2 36(1989)に述べられているように、ジスルフィド結合を、同時に、５μｌの８０ｍＭのＴＢＰで還元し、１０μｌの４０ｍＭのＡＢＤ−Ｆ（２ｍＭの最終濃度）でアルキル化した。還元およびアルキル化直後、生じたペプチド（２００μｌ）を、直接、溶媒Ａ（蒸留水中の０．１％ＴＦＡ）で平衡にした３００ÅポアサイズＣ₄逆相ＨＰＬＣカラム（Separations Group，Vydac，Hesperia，CA）上に注入した。ペプチド分析は、システムソフトウェアMaximaによりシステムインターフェースモジュールを介して全てが制御されている、２つの５１０ポンプ、WISP 712 オートインジェクターおよび481LC分光光度計から成るWatersＨＰＬＣシステムを用いて行った。生じたペプチドは、３−７６％の溶媒Ｂ（０．１％のＴＦＡ、９５％のアセトニトリル）の直線勾配を用い１１５分にわたって溶出した。溶出は、２１５ｎｍでの吸光度で監視した。ｒｈＧ−ＣＳＦ標準ペプチド地図に基づいて個々のペプチドを集め、Souza等，Science，232，61-65，(1986)に述べられているようにアミノ酸組成分析およびＮ−末端配列分析により同定した。未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦおよびＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦのペプチド断片を調製し、上記のように分析した。未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦ試料から６０分に溶出するピークが、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体試料には無かった（図１０）。このピークに溶出する物質を、アミノ酸組成分析およびＮ−末端配列分析によりｒｈＧ−ＣＳＦのＮ−末端の１７個の残基であると決定した。かくして、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体由来の対応するＮ−末端ペプチド断片が修飾され、６２分に溶出する新しい一部分離した二重ピークが得られた。質量分析法によりこれらの一部分離したピークのそれぞれから得られるペプチドの分析により、最初のピークが、結合したＤＴＰＡを有するＮ−末端ペプチドの予期される質量を有することを示し、一方、二番目のピークの物質の質量は、鉄の混入した結合ペプチドを示唆した。従って、ペプチドマッピングは、結合されたＤＴＰＡ基が、Ｎ−末端の１７アミノ酸に局在していることを示した。このＮ− 末端ペプチドは、Ｎ−末端、１個のトレオニン、３個のセリン残基およびリシン残基を含有する。EndoLys-Cによるペプチドの切断は、リシンが未修飾であることを示す。トレオニンまたはセリン残基のアシル化は、ｐＨ６．０ではほとんどありそうもない。Ｎ−末端配列分析に供した未消化のＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体は、＞９９％ブロックされたＮ−末端を示し、これは、蛋白質上の単一のＤＴＰＡ部分がＮ−末端に結合していることを示している。６．等電点電気泳動等電点電気泳動を、Novex ｐＨ３−１０ゲル（SanDiego,CA）を用いｐＩ３．５−８．５の実施範囲で行った。試料を、試料緩衝液で１：１に希釈し、５μｇの蛋白質を各レーンに載せた。ゲルを、１００Ｖで１時間、２００Ｖで２時間、次いで５００Ｖで０．５時間の定電圧にかけた。固定、染色および脱色手法の全てを、製造元の仕様書に従って行った。ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体は、等電点電気泳動後、ｐＩ４．９の単一の主要なバンドを顕わした（図１１、レーン３）。過剰のＩｎＣｌ₃と結合体（Ｉｎ：結合体、１０：１、モル／モル）との前もってのインキュベーションにより、バンドがｐＩ５．３に移動した（図１１、レーン２）。インジウムを有する及び有しない両方の結合体のｐＩ値は、ｒｈＧ−ＣＳＦのｐＩ６．０より低かった（図１１、レーン１）。Ｎ−末端の遊離のアミノ基の喪失を伴うＤＴＰＡの結合は、ｒｈＧ−ＣＳＦのｐＩを実質的に減少させた。更に、キレートしたインジウムは、結合体のｐＩを僅かに増加させた。キレート化金属を有する及び有しないＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の特徴的等電点も、結合調製物の金属混入および金属標識を監視するのに用いることができる。上記のデータは、（１）ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体が、¹¹¹Ｉｎをキレート化することができること；（２）ＤＴＰＡ対ｒｈＧ−ＣＳＦの化学量論モル比は、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体では約１．０であること；（３）ＤＴＰＡ結合体は、ｒｈＧ−ＣＳＦのＮ−末端に特異的であること；および（４）ＤＴＰＡのｒｈＧ−ＣＳＦへの結合は、ｒｈＧ−ＣＳＦのｐＩを減少させることを示している。実施例３この実施例では、円二色性分析を用いて、ｒｈＧ−ＣＳＦのＮ−末端へのキレート基の結合に起因するｒｈＧ−ＣＳＦの二次構造に及ぼす影響を調べた。円二色性（ＣＤ）スペクトルを、JascoJ-720分光偏光計(JapanSpectroscopic Co .，LTD.，Tokyo，Japan)を用いて得た。試料（０．０７８ｍｇ／ｍｌ蛋白質）を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４中で１０℃で分析した。ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体のＣＤスペクトルは、未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦのそれと重なり（図１２）、それぞれ２０８ｎｍおよび２２２ｎｍで最小の楕円率を示す。結合体の全キレート部位を飽和させる過剰のインジウム（Ｉｎ：結合体、１０：１、モル／モル）の添加は、スペクトルの全体の形状を変化させなかったが、アルファヘリシティの僅かな（約５％）減少をまねいた。従って、二次構造（ｐＨ５．４での）は、Ｎ−末端へのキレート基の結合により影響されないことをここに示す。実施例４この実施例では、ｒｈＧ−ＣＳＦの生物学的活性に対するＤＴＰＡの結合及び引き続くインジウムのキレート化の影響を測定した。ハムスターへの１００μｇ／ｋｇのｒｈＧ−ＣＳＦの皮下注射後、ハムスターの末梢ＷＢＣ数を、ｒｈＧ−ＣＳＦ、ＤＴＰＡ：ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体、およびキレート化インジウムを有する結合体を評価した（図１３）。動物を、指示された時間毎に屠殺し、集めた血液試料を、Sysmex F800マイクロセルカウンターを用いて分析した。結合体（図１３、（△））の注射は、未修飾のｒｈＧ−ＣＳＦ（図１３、（○ ））に類似した様式で末梢ＷＢＣ数水準を誘導した。過剰のインジウムと共に予めインキュベートした結合体(Ｉｎ：結合体、１０：１、モル／モル)(図１３、( ◇))の注射も、注射後２４から３６時間で最大ＷＢＣレベルに達する同様の応答を誘導した。従って、ＤＴＰＡとｒｈＧ−ＣＳＦの結合は、ｒｈＧ−ＣＳＦの観察されるインビボ活性を著しく変えず、更に、結合体の活性は、インジウムのキレート化後、変化しない。実施例５この実施例では、上記の結合体反応を、関連の成長因子インターロイキン−２（ＩＬ−２）に対して行った。¹¹¹Ｉｎをキレート化するＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体の能力を、上記のように陽イオン交換ＨＰＬＣを用いて評価した。更に、ＤＴＰＡ：ＩＬ−２の化学量論モル比およびＩＬ−２上のＤＴＰＡ部分の分布も測定した。ＩＬ−２は、ヨーロッパ特許第０１３６４８９号（Souza等）に記載のようにＩＬ−２をコードするＤＮＡ配列で大腸菌細胞をトランスフェクションする組換えＤＮＡ技術を用いて作成した。ＩＬ−２は、１００ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０中の１．８２ｍｇ／ｍｌ溶液として調製した。ＤＴＰＡ二無水物およびトリブチルホスフィン（ＴＢＰ、工業的純度）を、Aldrich(Milwaukee,WI) から入手した。結合体を、上記の実施例２で述べたように調製した。ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体の分析１．分析用陽イオン交換ＨＰＬＣ分析用陽イオン交換ＨＰＬＣを上記のように行った。ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体（図１４、ライン１および４、実線）では、¹¹¹Ｉｎ放射能の９９．５％が、陽イオン交換カラムから蛋白質と共に共溶出したが、一方、検出可能な放射能は、未修飾のＩＬ−２と共に共溶出しておらず（図１４、ライン２および３、破線）、これは、¹¹¹ＩｎのＤＴＰＡ：ＩＬ −２結合体によるキレート化および、未修飾のＩＬ−２による¹¹¹Ｉｎ結合の不在を示す。ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体の分析用陽イオン交換ＨＰＬＣ分析に対する金属キレート化の影響を、図１５に示す。ＩＬ−２（ライン１）、ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体（ライン２）、および過剰のＩｎＣｌ₃と共に予めインキュベートした結合体（Ｉｎ：結合体、１０：１、モル／モル、ライン３）の溶出は、２２０ｎｍでの吸光度で監視した。ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体は、未修飾のＩＬ−２に比べ低い塩濃度で溶出した。キレート化結合体を、次いで、未修飾のＩＬ−２のそれより低い塩濃度ではあるが、非キレート化結合体より僅かに高い塩濃度で溶出した。上記のｒｈＧ−ＣＳＦ分析を行った場合と同じように、ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体の特徴的保持時間は、結合体の金属混入および金属標識を監視する有用な方法を提供する。２．薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ） ¹¹¹Ｉｎをキレート化するＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体の能力を測定し、且つＤＴＰＡ対ＩＬ−２の化学量論モル比を測定するために上記のようにＴＬＣを行った。図１６に示すように、ＤＴＰＡによる¹¹¹Ｉｎのキレート化の結果、溶媒先端近くから全放射能が移動した（図１６、レーン１および２を比較せよ）。¹¹¹Ｉｎ（１０ナノモル）とＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体（２ナノモル）とのインキュベーション、続いてＤＴＰＡの添加によって、オリジンに放射能の一部が保持された（図１６、レーン４）。個々のレーンの線グラフを描いた処、レーン４のピーク面積の積分は、オリジンに１８％の放射能が残っていることを示した。残存する未結合¹¹¹Ｉｎを、加えたＤＴＰＡにより捕集し、溶媒の先端近くに移動させた。かくして、０．９：１のＤＴＰＡ対ＩＬ−２のモル比を示す２ナノモルのＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体に約１．８ナノモルの¹¹¹Ｉｎが結合した。未修飾のＩＬ−２は、オリジンに放射能を保持しておらず、これは、¹¹¹Ｉｎ結合が無いことを示している（図１６、レーン３）。３．ペプチドマッピングＩＬ−２上の結合ＤＴＰＡ部分の位置を測定するためにＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体のペプチド分析を行った。ペプチド断片は、上記のように調製した。図１７に示すように（矢印）、未修飾のＩＬ−２試料から約３６分に溶出するピークが、ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体試料には無い。このピークに溶出する物質を、アミノ酸組成分析およびＮ−末端配列分析によりＩＬ−２のＮ−末端ペプチドであると決定した。従って、ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体由来の対応するＮ−末端ペプチド断片を修飾し、４０分のところに新たな一部分離したピークを得た。ｒｈＧ−ＣＳＦを用いた場合と同じように、ペプチドマッピングは、結合したＤＴＰＡ基が、Ｎ−末端に局在していることを示した。これらのデータは、ＤＴＰＡ：ＩＬ−２結合体が¹¹¹Ｉｎをキレート化できること、ＤＴＰＡ対ＩＬ−２の化学量論モル比が約１．０であること、およびＤＴＰＡがＩＬ−２のＮ−末端に部位特異的に結合することを示す。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Stable N-terminally linked DTPA: protein compositions and methods Field of the invention The present invention relates generally to the field of protein modification, and more particularly to chelating agents Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) is site-specifically located at the N-terminus of the protein. Can bind and thereby form complexes with various metallic radionuclides DTPA: relates to a protein composition that gives a homogeneous and clear product. In another aspect Thus, the present invention relates to granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) or interleukin. A method of binding DTPA to IL-2 (IL-2), whereby the protein Such proteins and cytochromes are maintained while maintaining their structural and functional integrity. To provide a useful technique for radiolabeling related proteins, including proteins. Background of the Invention Radiolabeling of proteins and other biological compounds is usually achieved by iodination. Have been. Proteins can be synthesized by several methods [Reogoeczi, E., Iodine-LabeledPlasmaPro teins,1, 53, (CRCPress, Boca Raton, Fla 1982)] Antibody can be labeled with It has been used in radioimmunoassay studies to determine tumor localization by partial imaging [ Keenan et al., J. Nucl. Med.,26, 531 (1985)]. However, these studies and In the course of other research related to the use of radioactive isotopes of iodine, Certain limitations on the imaging techniques used have become apparent (eg, many Poor imaging properties of elemental radioisotopes, related labeling techniques, and in vivo High instability of the sign). In addition, the most common iodination methods modify other sensitive groups Cause protein structure changes and, consequently, possible biological inactivation. And oxidation conditions in certain reaction mixtures. Difficulties encountered when trying to iodine these proteins and other compounds To avoid this, an alternative method was used. One such method is a powerful sharp Protein is covalently bound to the protein, thereby binding the chelate to the protein. The quality is then followed by various metallic radionuclides [Meares & Goodwin, J .; Prot. Chem.,Three, 215-228, (1984)], paramagnetic metal ions [Lauffer & Brady, Magn. Reson. Imag.,Three, 11-16 , (1985); Ogan et al., Invest. Radjol.,twenty two, 665-671, (1987)] or a fluorescent metal [Muk kala et al., Anal. Biochem.,176, 319-325, (1989)]. This is the "bifunctional molecular chelate" method. The most commonly used reagents for covalent modification of proteins with chelating agents are: DTPA is a cyclic dianhydride. The cyclic dianhydride of DTPA is usually ethylene It forms stronger chelates than analogs of riamintetraacetic acid (EDTA) [Perrin Organic Ligands, IUPAC Chemical Data Series No. 22, (New York, Pergam on Press 1982)], which is much more complex than the synthesis method using an analog of EDTA. Includes uncomplicated synthesis techniques. In addition, the cyclic dianhydride of DTPA is clearly safe at room temperature. Constant, thereby providing greater control over the binding conditions. Hnatowich And McGann, Int. J. Rad. Appl. Instrum., [B],14, 563-568 (1987). DTPA protein The bond to the substance is that the dianhydride is primarily free amine groups (eg, available Reaction at pH ≥ 7.0, which reacts with the amide bond to form an amide bond [ Hnatowich et al., Science,220, 613-615 (1983a)]. A major concern for those performing these covalent modifications is the chelator Is that there are a large number of binding sites on each protein that can bind. Currently exists In some methods, the N-terminus may be located inside the protein, such as the lysine side group. And any Non-selective binding occurs at some reactive groups due to heterogeneous populations. You. For example, the reaction of DTPA dianhydride with insulin reacts with the crosslinked protein and Produces a complex mixture of several products containing acylated tyrosine residues [Mais ano et al., Bioconj. Chem.,Three, 212-217 (1992)], whereas albumin and DTPA Reaction with the anhydride produced a protein molecule with multiple chelating groups attached [Lauffe r & Brady, Magn. Reson. Imag.,Three, 11-16, (1985)]. The number of DTPA groups attached to a protein is often given as an average number, This is because the sample preparation is heterogeneous, with more and less than the average number of chelating groups, respectively. Because it has both proteins [Hnatowich and McGann, Int. J. Rad. Appl. Instrum., [B],14, 563-568 (1987)]. Proteins are covalently linked to chelating groups May be decomposed by the reaction, and the degree of decomposition may increase as the substitution increases. It is well known [Sakahara et al., J. Nucl. Med.,26750, (1985)]. Some pretty These protein molecules that carry the basic group retain their original biological properties. Is unlikely [Meares and Goodwin, Jour. Of Prot. Chem.,Three, 215-228 (1984)]. From a producer's point of view, Gaining regulatory approval for the sale of these heterogeneous therapeutic proteins added complexity Maybe. The in vivo properties of chelate-tagged proteins have been reviewed [Meares et al., Adv. Chem. ,198, 369-387 (1982)]. The most common finding is that in vivo stability is not Dependently on the chemistry of the activating agent conjugate, lightly labeled protein Quality has a longer biological half-life, and retention of activity is within the active site. Techniques that minimize labeling of residues contained in (eg, specific labeling) It is going to be able to do it. For example, horse serum albumin (HSA)¹¹¹ Conjugates to In-labeled chelators and is more aggressive to the liver when injected in vivo. Quickly purified (on iodinated HSA¹²⁵(Comparison with results after I-labeling) [Leung And Meares, Biochem. Biophys. Res. Commun.,75149-155 (1977)]. Few At the very least, it has the highest number of chelating groups and thus is subsequently highly radioactive , A chelator-bound HSA, is recognized as a heterologous protein in vivo. [Meares and Goodwin, Jour. of Prot. Chem.,Three, 215- 228 (1984)]. To specifically label a single (unimportant) site on a protein Yo Thus, the advantage of avoiding an irregular and numerous distribution of the product is clear. Several studies have described the covalent binding of DTPA to proteins using DTPA dianhydride. Has been stated by the investigator. For example, Khaw et al., Science,209, 295 (1980) Binding DTPA to an immunoglobulin G (IgG) fragment active against osin; The localization of labeled proteins in dog myocardial infarction was investigated. Using the same method, Schein berg et al., Science,215, 1511, (1982) is a label specific for mouse erythroleukemia cells. Monoclonal antibodies were prepared. These and other methods are based on binding proteins. But these are always characterized by complex synthesis and low coupling efficiency It is. Hnatowich et al., Science,220, 613-615, (1983a). U.S. Pat. No. 4,479,930 (Hnatowich) discloses a radioisotope metal cation A composition comprising an amine-linked bicyclic dianhydride chelated with You. This composition is reported to be stable in vivo. This composition A method of preparation is also disclosed. The initial and final pH of the coupling reaction mixture is PH 7.0 and the molar ratio of anhydride to antibody is kept at 1: 1 If the binding efficiency (polypeptide or protein) (Defined as the percentage of anhydride molecules covalently attached to white matter) It is reported to decrease at pH values above or below neutral. Various reaction students There is no teaching as to the distribution of the DTPA moiety on the resulting protein or polypeptide. The binding is site-specific at the N-terminus of the protein, thereby providing a clearer and more homogeneous DTPA is advantageous over that of the prior art due to the fact that the composition is obtained Nothing can be drawn from the literature regarding the preparation of protein conjugates. Sharp A large amount of either a composition with or without a metallated radionuclide And fully retains its in vivo biological activity. The synthesis method of the present invention , A simple one-step reaction that creates a single reactive site, useful for labeling proteins Provide a way. The DTPA: protein conjugate of the present invention is useful for leukemia and related diseases. It has potential uses in diagnosis, imaging, and / or therapy. Summary of the Invention The present invention provides a substantially homogeneous preparation of a protein chemically modified at the N-terminus and the preparation thereof. And a method for producing the same. Unexpectedly, the binding of the chelating agent DTPA is N-terminus is site-specific so that other chelating agents: protein compositions Compared to Provides a more homogeneous and clear product. Again, unexpectedly, a good DTPA : G-CSF conjugates maintain protein structural and functional integrity while maintaining Chelation of some metallic radionuclides to yield radiolabeled products This method can be widely applied to other proteins (or analogs thereof) as well as G-CSF. Can be In one embodiment, the present invention relates to DTPA: G-CSF (or analog thereof). It relates to substantially homogeneous preparations and related methods. One of the embodiments described below is That the toning agent DTPA binds site-specifically to the N-terminus of rhG-CSF; It has been shown that such compositions can form complexes with various metallic radionuclides. You. Since the conjugate is specific for the N-terminus of the G-CSF molecule, The product obtained is a more homogeneous and well-defined product than that of the prior literature It is. The present invention also relates to a method for producing a labeled protein, the method comprising the steps of: At a pH that is sufficiently acidic to selectively activate the α-amino group at the amino terminus of the protein Reacting the protein with a chelating agent; (b) separating bound protein from unbound protein (C) adding a metal cation to the conjugate; and (d) a labeled protein. Including obtaining. This method is described below for rhG-CSF and IL-2. Having described, these provide further aspects of the present invention. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows initial pH and DTPA: protein moles for rhG-CSF binding. Shows the effect of ratio. SDS-PAGE analysis of the following samples was performed: Lane 1-M W marker; lanes 2-4, 5: 1 and 50: 1 at initial pH 6.0, respectively. And 500: 1 DTPA: rhG-CSF; lanes 5-7 at initial pH 7.0. 5: 1, 50: 1, and 500: 1 DTPA: rhG-CSF, respectively; 8-10, 5: 1, 50: 1 and 500: 1 respectively at an initial pH of 8.0. DTPA: rhG-CSF; lane 11, rhG-CSF at pH 6.0; RhG-CSF at pH 12, pH 8.0. FIG. 2 shows the rhG-CSF starting material (line 1), before passing through a G50 spin column. DTPA: rhG-CSF binding reaction mixture (line 2), and G50 spin Of DTPA: rhG-CSF binding reaction mixture (line 3) after passing through the column 3 shows a size exclusion HPLC elution plot. Elution at 280 nm Was monitored by absorbance. FIG. 3 shows the rhG-CSF starting material (dashed line) and DTPA: rhG-CSF counterpart. 2 shows a preparative cation exchange FPLC elution plot of the reaction mixture (solid line). Elution is Monitored by absorbance at 280 nm. FIG.¹¹¹DTPA pre-incubated with In: rhG-CSF Analysis of conjugate (lines 1 and 4) and rhG-CSF (lines 2 and 3) 1 shows a cation exchange HPLC analysis for use. Elution was measured at 220 nm (line 3 and 2). And 4) and radioactivity (reversed lines 1 and 2). FIG. 5 shows rhG-CSF (line 1), DTPA: rhG-CSF conjugate (LA 2), and excess InCl_ThreeTreated with DTPA: rhG-CSF conjugate 3 shows an analytical cation exchange HPLC analysis of (line 3). Elution at 220 nm Was monitored by absorbance. EDTA (1 mM) was added to Buffer A. FIG. 6 shows a silica gel TLC plate analysis of the following samples: lanes 1, 0. 1 nanomolar¹¹¹In (trace amount¹¹¹Indium with In)); lanes 2, 20 Nomol DTPA 10 nanomoles¹¹¹In; lane 3, lane 2, 2 nmol with rhG-CSF 10 nmoles, followed by addition of 20 nmoles DTPA.¹¹¹I n; and lane 4, 2 nmol with DTPA: rhG-CSF conjugate Cuvated, followed by addition of 20 nmol DTPA to 10 nmol¹¹¹In . Lanes 2-4 are 0.1 nmoles¹¹¹Aliquot containing In And removed and loaded on a plate. FIG. 7 shows a MALDI-MS spectrum of the DTPA: rhG-CSF conjugate. You. The spectra show multiple protonated species (1, 2, 3, and 4 protons). Are bonded). FIG. 8 shows the DTPA: rhG-CSF conjugate with indium chelation. 4 shows an on-spray mass spectrum. The conjugate was saturated InCl prior to analysis._ThreeWhen Both were preincubated (In: conjugate, 10: 1, mol / mol). FIG. 9 shows an ion-spray mass spectrum of rhG-CSF. FIG. 10 shows the peptide mapping of the DTPA: rhG-CSF conjugate. Red rice DTPA-rhG-CSF formation by white matter decomposition The peptide fragments resulting from the coalescence (solid line) and rhG-CSF (dashed line) were reduced , Alkylated and then separated by reverse phase HPLC. Elution at 215 nm Monitored by absorbance. Arrows indicate N-terminal peptide from digested rhG-CSF sample. Direct elution of the solution. FIG. 11 shows an isoelectric focusing gel (pH 3-10) containing the following samples. : Lane 1, rhG-CSF; lane 2, excess InCl_ThreeTogether with the incubator Bated DTPA: rhG-CSF conjugate (In: conjugate, 10: 1, mol / Mol); lane 3, DTPA: rhG-CSF conjugate; and lane 4, isoelectric point marker. FIG. 12 shows that indium-free (----) and chelated indium (- ) DTPA: rhG-CSF conjugate, as well as unmodified rhG-CSF ( ) And DTPA ( . 2) shows the circular dichroism (CD) spectrum of FIG. Sample (0.07 8 mg / ml protein, and 4.07 μM DTPA) were added to 20 mM sodium acetate Analyzed at 10 ° C. in lithium pH 5.4. Unmodified rhG-CSF sample and D The TPA: rhG-CSF sample (without indium) is identical. FIG. 13 shows the effect of DTPA conjugate on the in vivo activity of rhG-CSF. You. The activity (WBC number) was measured after subcutaneous injection of hamsters. rhG-CSF throw The dose was 100 μg / kg. The bars represent the standard deviation (n = 8-1 for protein samples) 0, and the baseline is n = 5-6). FIG.¹¹¹IL-2 (line 2 and 3) and analytical cation exchange of DTPA: IL-2 conjugate (lines 1 and 4) 3 shows a HPLC analysis. Elution was determined by the absorbance at 220 nm (lines 3 and 4). Radioactivity (reversed lines 1 and 2) was monitored. FIG. 15 shows IL-2 (line 1), DTPA: IL-2 conjugate (line 2), And excess InCl_ThreeOf DTPA: IL-2 conjugate (line 3) treated with 1 shows a cation exchange HPLC analysis for precipitation. Elution was monitored by absorbance at 220 nm. Was. EDTA (1 mM) was added to Buffer A. FIG. 16 shows a silica gel TLC plate analysis of the following samples: lanes 1,0 . 1 nanomolar¹¹¹In (trace amount¹¹¹Indium with In); lanes 2, 20 10 nanomoles added to nanomoles DTPA¹¹¹In; lanes 3, 2 nanomolar IL- 2 followed by 10 nanomolar with 20 nanomolar DTPA. Le¹¹¹In; and Lane 4, with 2 nmoles of DTPA: IL-2 conjugate Incubate followed by 10 nanomolar with 20 nanomolar DTPA¹¹¹ In. Lanes 2-4 show 0.1 nanomolar¹¹¹Mix aliquots containing In Removed from object and loaded onto plate. FIG. 17 shows the peptide mapping of the DTPA: IL-2 conjugate. Protein content Solution generated from DTPA-IL-2 conjugate (solid line) and IL-2 (dashed line) The peptide fragments were reduced, alkylated and then separated by reverse phase HPLC. Elution was monitored by absorbance at 215 nm. Arrows from digested IL-2 sample Indicates the elution of the N-terminal peptide. Detailed description The DTPA: protein conjugate of the present invention is described in more detail below, and This will be specifically described with reference to examples. The examples illustrate various aspects of the invention and DTPA: Contains the results of the biological activity test of the protein conjugate. Amazing By using the method of the present invention, the resulting DTPA conjugate is converted to the N-terminal of the protein. Create a single reactive site to be site-specific Various metallic radionuclides while maintaining the structural and functional integrity of the protein To give a clear and homogeneous composition capable of forming a complex. It is contemplated that the practice use of the present invention is directed to various cytokines and related proteins. It is. Specific examples of intended proteins include the aforementioned G-CSF, GM-CSF, M-CSF, interferons (alpha, beta and gamma), interferons Leukins (1-14), erythropoietin (EPO), fibroblast growth factor , Stem cell factor (SCF), megakaryocyte growth and growth factor (MGDF), platelet-derived Various like growth factors (PDGF) and tumor growth factors (alpha, beta) Hematopoietic factors. Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) promotes the differentiation of hematopoietic progenitor cells into neutrophils It is a glycoprotein that induces and stimulates the activity of mature neutrophils. Has 175 amino acids Recombinant human G-CSF expressed in E. coli (rhG-CSF) was 18,79 It has a molecular weight of 8 Da and is biologically active. Currently a recombinant G-CSF Filgrastim is available for therapeutic use. The structure of G-CSF under various conditions has been studied energetically [Lu et al. Bio l. Chem. Vol.267, 8770-8777 (1992)], and the tertiary structure of rhG-CSF has recently been Determined by X-ray crystallography. G-CSF has two long crossover connections. share the common structural motif of the four α-helix bundles [Hill et al., P.N.A.S. USA, Vol.90, 5167-5171 (1 993)]. This family includes GM-CSF, growth hormone, interleukin -2, interleukin-4, and interferon beta. Secondary structure Depends on the solvent in which the protein obtains a higher degree of α-helical content at acidic pH. It is sensitive to pH [Lu et al., Arch. Biochem. Biophys.,286, 81-92 (1989)]. Generally, G-CSF useful in the practice of the present invention will be in a form isolated from a mammalian organism. Or products of chemical synthesis or genomic or cDNA Prokaryotic or true exogenous DNA sequences obtained by cloning or DNA synthesis It can be the product of a eukaryotic host expression. Suitable prokaryotic hosts include various bacteria (Eg, E. coli); suitable eukaryotic hosts include yeast (eg, S. cerevisiae) and mammalian cells (eg. For example, Chinese hamster ovary cells, monkey cells) can be mentioned. Inn used Depending largely on the G-CSF expression product, carbohydrates of mammals or other eukaryotes May be glycosylated or non-glycosylated . In addition, the G-CSF expression product has the first methionine amino acid residue (at position -1). ) May be included. Recombinant G-CSF, particularly recombinant G-CSF derived from Escherichia coli, However, the present invention is particularly preferred because of its greatest commercial utility. The use of any and all of the forms of G-CSF is contemplated. Certain G-CSF analogs have been reported to be biologically functional, These can also be chemically modified. G-CSF analogs are disclosed in U.S. Pat. 810,643. What is the activity of each analog reported? But not for other G-CSF analogs reported as having biological activity Examples are AU-A-76380 / 91, EP 0 459 630, EP 0 272 7 03, EP 0 473 268 and EP 0 335 423 You. AU-A-10948 / 92, PCT US94 / 00913 and EP0 See also 243 153. In general, G-CSF and its analogs useful in the present invention are described herein. Such chemical modification techniques are performed and the resulting product is described, for example, as described herein. Confirmation by examining desired biological characteristics by biological activity analysis Can be. Not surprisingly, when treating non-human mammals, Then, use a recombinant non-human G-CSF such as a recombinant mouse, cow, dog, etc. be able to. For example, PCT WO 9105798 and PCT WO 891 See 0932. Interleukin, a glycoprotein having a molecular weight of about 15,000 daltons 2 are members of a group called lymphokines that mediate the body's immune response. This protein is produced by activated T-cells and has various in vivo activities. And is known. For example, IL-2 promotes thymocyte mitogenesis and T- Induces cell reactivity, regulates gamma interferon, and causes certain immunodeficiencies It has been reported to increase the recovery of lymphocyte immune function in conditions. This It has potential application in the study and treatment of neoplastic and immunodeficiency disorders, and It has been used for treatment of medical treatment. IL-2 useful in the practice of the present invention is isolated from mammalian organisms. In particular, or in the case of IL-2 analogs, by chemical synthesis techniques. Genomic or cDNA cloning or DNA synthesis Product of prokaryotic or eukaryotic host expression of the exogenous DNA sequence obtained by Can get. Suitable prokaryotic hosts include various bacteria (eg, E. coli). Suitable eukaryotic hosts include yeast (eg, S. cerevisiae) and mammals Cells (eg, Chinese hamster ovary cells, monkey cells). Depending on the host used, the IL-2 expression product may be mammalian or other eukaryotic. Carbohydrates may be glycosylated or non-glycosylated Good. Also, the IL-2 expression product replaces the first methionine amino acid residue with the (-1 position). To). Recombinant IL-2 and analogs, especially those derived from E. coli, Although particularly preferred because of its greatest commercial utility, the present invention Any and all uses of such forms of IL-2 and its analogs are contemplated. . By isolation and purification of naturally occurring IL-2 or by genetic engineering means Methods for preparing IL-2 are known. For example, US Pat. No. 4,778,879; No. 4,908,434; And 4,925,919 (Mertelsman et al.); U.S. Pat. No. 4,490,28. No. 9 (Stein); U.S. Pat. No. 4,738,927 (Taniguchi et al.); U.S. Pat. No. 4,569,790 (Koths et al.); U.S. Pat. No. 4,518,584 (Mark et al.) US Patent No. 4,902,502 (Nitecki et al.); And European Patents. No. 0136489 (Souza et al.). IL-2 receptor (IL-2R) is used for adult T-cell leukemia (Uchiyama et al., 1985), Hairy cell leukemia (Trentin et al., 1992), chronic lymphocytic leukemia (Rosolen et al., 1989) , Hodgkin's disease (Strauchen and Breakstone, 1987), and non-Hodgkin's lymphoma (Grant et al., 1986). Chronic joint Equine (Lemm and Warnatz, 1986) and allograft rejection (Waldmann, 1989) Lymphocytes involved in several autoimmune diseases also overexpress IL-2R. Therefore, this receptor has been actively studied as a target for cytotoxic drug therapy. Cell binding domain of Pseudomonas exotoxin (Lorberboum-Galski et al.) 1988a) or the receptor binding domain of diphtheria toxin (Williams et al., 1987). Recombinant fusion toxins substituted with IL-2 have been synthesized. These fusion proteins , High Particularly cytotoxic to cells expressing affinity IL-2R (Lorberboum-Galsk i et al., 1988b; Williams et al., 1990). Recently described Pseudomonas exotoxin / TL -4 chimeric protein also has autoimmune disease, allograft rejection and high levels of cells. It may be useful in treating a number of hematologic malignancies that express the IL-4 receptor (Puri et al., 19 94). Diphtheria toxin-related chicks that may be useful for leukemia research and treatment A G-CSF fusion protein has also been recently constructed (Chadwick et al., 1993). Also, DTP A binds to IL-2, IL-4 and rhG-CSF, is associated with leukemia and related diseases. It has potential use in diagnosing, imaging and / or treating disease. Cytotoxic therapy Chelating radioactive metals for²¹²Bi,²¹¹At, and⁹⁰Y is No. In fact, radioisotopes via linked bifunctional chelates²¹²Bi And⁹⁰For antibodies against the IL-2R a chain having Y, several researchers (Junghans et al., 1993; Parenteau et al., 1992; Kozak et al., 1990). eactive) The cytotoxicity of T-cell lines and the potential of radiotherapy are being studied. You. DTPA useful in the conjugation of the present invention is technical grade DTPA dianhydride . In a preferred embodiment comprising rhG-CSF from E. coli, DTPA: r hG-CSF binding was achieved at initial pH 6.0 and 50: 1 DTPA: rhG-CS. Occurs at F molar ratio. In a preferred embodiment comprising IL-2 from E. coli, DTPA: IL-2 Binding occurs at an initial pH of 6.0 and a DTPA: IL-2 molar ratio of 50: 1. The invention is illustrated with respect to specific DTPA: protein conjugates and therapeutic methods However, various related conjugates and therapies do not depart from the scope of the present invention. It will be clear to those skilled in the art that there are many The following examples further illustrate various aspects of the present invention. Example 1 The DTPA used for conjugation is initially in the form of a dianhydride and, therefore, There are potential for unwanted side reactions such as white matter crosslinking [Hnatowich et al. Im muno. Methods,65, 147-157, (1983b)]. Therefore, the formation of such products To minimize the initial pH and the DTPA dianhydride: rhG-CSF molar ratio Such reaction conditions were examined. U.S. Pat. No. 4,810,6 No. 43 (Souza), DNA sequence encoding human G-CSF RhG-CS using recombinant DNA technology to transfect E. coli cells with F was produced. rhG-CSF was added to 100 mM sodium phosphate buffer pH6. Prepared as a 2.75-4 mg / ml solution in 0. DTPA dianhydride and g Libutyl phosphine (TBP, industrial purity) was obtained from Aldrich (Milwaukee, WI). Was. Preparation of DTPA: rhG-CSF conjugate Various amounts of DTPA dianhydride were combined with a dry acid wash (Meares et al., J. Prot. Chem. ,Three, 215-228, (1984)). 2 ml of anhydrous chloroform (A ldrich Chemicals, Milwaukee, WI) was then added and the tubes were gently ventilated. Vigorously agitate under hydrogen gas to evaporate chloroform and place DTPA dianhydride on the bottom of the test tube. A thin film of material was formed. 100 mM sodium phosphate buffer pH 6.0, rhG- at a concentration of 2.75-4.0 mg / ml in pH 7.0 or pH 8.0. The CSF was added to the DTPA dianhydride-coated test tube with gentle stirring under the final molar conditions. The ratio will be 5: 1, 50: 1 or 500: 1 (DTPA: rhG-CSF) Added. Aliquot each sample Set aside, most samples were removed from Penefske, H.E. to remove unbound DTPA. S ., Methods Enzymol.,56, 527-530, G1979 spin column as described in (1979). Passed. Analysis of DTPA: rhG-CSF conjugate 1. SDS-PAGE analysis G processed samples using 17-27% ISS MiniPlus gel (Nattick, MA) SDS-PAGE was performed on a 50 spin column. Dilute sample with non-reducing buffer And 5 μg of protein was loaded into each well. Run gel in discontinuous buffer system And stained with Coomassie-R-250 (Laemmli, U.K., Nature,227, 680-685, ( 1970). FIG. 1 shows the SDS-PAGE analysis of the sample prepared above. Reactions performed at an initial pH of 7.0 (lanes 5-7) or 8.0 (lanes 8-10) In response, the apparent observed in untreated rhG-CSF (lanes 11 and 12) A significant amount of higher molecular weight material was obtained compared to the molecular weight of. However, the initial pH In the 6.0 (lanes 2-4) reaction, a single detectable higher molecular weight material (p H7.0 and 8.0, corresponding to one of the substances detected in the samples). This thing The apparent molecular weight of the quality is DTPA Suggests that the bridge protein may be a dimer. For samples with pH 6.0, The higher molecular weight bands of DTPA: rhG-CSF increase with increasing molar ratio. And is substantially absent in the 500: 1 sample (lane 4). Was. 2. Size exclusion HPLC Reaction mixture with initial pH 6.0 and DTPA: rhG-CSF ratio 50: 1 Further analysis by size exclusion HPLC. Before G50 spin column and G50 spin column The sample after the pin column was analyzed. WISP 717 and automatic sampling at 5 ° C Liquid Chromatograph (Milliford, MA) equipped with a vessel and Raytest Ramo na 490 E multi-wavelength UV / Vis detector with LS radioisotope detector (Pittsburgh, PA ) Was performed. Void between UV / Vis detector and radioisotope detector The loading volume was 50 μl. For size exclusion HPLC, 1.0 ml / 0.1M phosphorus on a PhenomenexBio Sep S2000 column (Torrance, CA) Isocratic transfer of sodium acid buffer, 0.5 M NaCl, pH 6.9 The samples were analyzed using the phases. Elution was monitored by absorbance at 280 nm and Waters M Recorded on a PC computer with illennium software. As shown in FIG. 2, the sample before the G50 spin column was 8.65 and 9.53 min. The elution time showed two major peaks (FIG. 2, line 2). Second major The peak co-elutes with free DTPA and appears in the sample after the G50 spin column. Was almost removed, which indicates that unbound DTP from the reaction mixture A indicates successful removal of A (FIG. 2, line 3). Remaining key The elution time of the peak was unchanged by the G50 spin column, and the unreacted rhG-CS Eluted slightly before F (FIG. 2, line 1). This peak corresponds to the monomeric DTPA Represents bound rhG-CSF. Therefore, the DTPA binding r on this size exclusion column The behavior of hG-CSF allows its separation from unmodified rhG-CSF. The above analysis shows that the initial pH and DTPA: rhG-CSF molar ratio are undesirable. It affects the formation of side reactions. Initiate reaction in initial pH 6.0 buffer By doing so, the products resulting from such side reactions (eg, protein crosslinking) Formation is greatly reduced. Example 2 In this example,¹¹¹DTPA chelating In: rhG -The ability of the CSF conjugate was determined by analytical cation exchange HPLC and thin layer chromatography. It was measured using a fee. The conjugate was then further analyzed and the conjugate (chelated Mass with and without indium), stoichiometry of DTPA vs. rhG-CSF And the position of the bound DTPA moiety on rhG-CSF was determined. Preparation of DTPA: rhG-CSF conjugate In this example, an initial pH of 6.0 and 50: 1 DTPA dianhydride: r Analysis of DTPA: rhG-CSF conjugate prepared using hG-CSF molar ratio Performed as described in Example 1. However, the sample was transferred to a G50 spin column. Instead of Pharmacia Hi-Load SP-Sepharose High Performance, 16/10, Use a strong cation exchange column (Pharmacia, Sweden) for preparative cation exchange Chromatography was performed. Separation was performed using Ph with a 50 ml injection loop. Achieved at 5 ° C. with the armacia FPLC system. The column is buffer A (20 mM vinegar) Sodium acid, pH 5.4) and 0-40% buffer B (20 mM 1.0 ml / min using a gradient of sodium acetate, 0.5 M NaCl, pH 5.4) At 180 Elution was performed over minutes. Elution was monitored and recorded by absorbance at 280 nm. A reaction mixture initially containing 20 mg of rhG-CSF (initial pH 6.0, 50: 1 DTPA dianhydride: rhG-CSF molar ratio) was diluted to 50 ml with Milli-Q water. And directly loaded on a Hi-Load SP-Sepharose column. About 13% integrated peak area (FIG. 3, peak 2) is the control unreacted rhG-CSF (FIG. 3, broken Co-eluted with the curve (line). This means that about 13% of the rhG-CSF remains unmodified. Indicates that there is. The peak eluted between 120 and 130 minutes is the total eluted protein Contains about 84% (FIG. 3, peak 1). This substance elutes at lower salt concentrations The shift is consistent with an increase in the protein's negative charge upon binding to DTPA. By this simple and efficient chromatography step, purified DTPA: rh Unbound DTPA and unbound rhG-CS separated from G-CSF conjugate A homogeneous and clear product was obtained with both F. Analysis of DTPA: rhG-CSF conjugate 1. Analytical cation exchange HPLC. Analytical cation exchange HPLC was performed using Buffer A (20 mM sodium acetate, pH 5.4) and buffer B (20 mM sodium acetate, 0.5 M NaCl, p H5.4) using a mobile phase of Tosohaas SP-5PW 7.5 x 7.5 mm column (Montgomery, PA) on a Waters HPLC system. Equilibrate the column with mobile phase A Separation was performed at 25 ° C. using a linear gradient of 1% B / min at 1.0 ml / min for 30 min. I went. Separation can be used by monitoring the absorbance at 220 nm, and If detected, it was detected with a radioisotope detector. Samples containing indium have a pH 1 mM EDTA was added to buffer A before adjusting to 5.4. rhG-CSF and DTPA: rhG-CSF conjugate,¹¹¹1 with In Pre-incubated for 5 minutes. Excess cold indium is then added (In: protein Quality, 2: 1, mol / mol), samples were analyzed by analytical cation exchange HPLC as described above. Was analyzed by DTPA: rhG-CSF conjugate (FIG. 4, lines 1 and 4, Solid line)¹¹¹99.5% of the In radioactivity was recovered from the cation exchange column. Co-eluted with white matter, but detectable Radioactivity was not co-eluted with unmodified rhG-CSF (FIG. 4, line 2). And 3, dashed line), due to the DTPA: rhG-CSF conjugate¹¹¹In Show chelation and by unmodified rhG-CSF¹¹¹No In bond Is shown. DTPA: by cation exchange HPLC analysis for analysis of rhG-CSF conjugate FIG. 5 shows the effect of metal chelation. rhG-CSF (line 1), DTP A: rhG-CSF conjugate (line 2) and excess InCl_ThreeTogether with Of the conjugate (In: conjugate, 10: 1, mol / mol, line 3) Elution was monitored by absorbance at 220 nm. DTPA: rhG-CSF conjugate is Eluted at lower salt concentrations compared to unmodified rhG-CSF. Then, clean The non-modified chelated conjugate has a slightly higher salt concentration than the unchelated It eluted at a lower salt concentration than rhG-CSF. With and without chelating metals The characteristic retention time of no DTPA: rhG-CSF conjugate is due to the metal loading of the conjugate preparation. Can be used to monitor incoming traffic. In addition, this analysis provides for metal labeling of the conjugate Can be used to monitor. 2. Thin layer chromatography (TLC) With slight changes, see above (Meares et al., J. Prot. Chem.,Three, 215-228, (1984)) TLC was performed as described above. Trace amounts in 10 mM HCl¹¹¹InC with In l_ThreePrepare an indium stock solution containing Were: (1) Indium was added to 100 mM sodium phosphate, pH 6.0; (2) 10 nanomoles of indium was converted to 20 nanomoles in 20 mM sodium acetate (3) 10 nmol of indium was added to 2 nm of DTPA. For 10 minutes at room temperature, followed by 20 mM PH 5.4, and 20 nanomolar DTPA in sodium acetate was added, and (4 ) 10 nanomolar indium with 2 nanomolar DTPA-bound rhG-CSF Incubate for 10 minutes at room temperature, followed by 20 Na in 20 mM sodium acetate. Nomol DTPA was added, pH 5.4. 250 μm thick glass support Each sample (0.1 nanomolar) was loaded on silica gel (60A) (Whatman, Clifton, NJ). 1 μl of indium (containing indium) was spotted. Distilled H as solvent_TwoO: methanol ( TLC play using 10% (w / v) ammonium acetate in 1: 1, v / v) Expanded. The developed plate is then combined with the MolecularDynamicsPhosphorImage Analysis was performed using r (Sunnyvale, CA). The stoichiometric molar ratio of DTPA to rhG-CSF was determined as described above. DT By PA¹¹¹As a result of chelation of In, all radioactivity was transferred from near the solvent front. (FIG. 6, compare lanes 1 and 2).¹¹¹In (10 nmol) in DTPA: r Incubation with hG-CSF conjugate (2 nmol) followed by DTP As a result of adding A, a part of the radioactivity was retained in the origin (FIG. 6, lane 4). Individual When the line graph of each lane was drawn, the original area was calculated by integrating the peak area of lane 4. It was shown that 18% of the radioactivity remained in the reactor. Remaining unbound¹¹¹In, It was collected with added DTPA and moved near the top of the solvent. Thus, about 1.8 na Nomol's¹¹¹In 2 nmole DTPA: rhG-CSF conjugate (DTPA vs. RhG-CSF was combined by a molar ratio of 0.9). Unmodified rhG-CSF is The origin does not carry radioactivity,¹¹¹Show that there is no In bond (FIG. 6, lane 3). 3. Mass spectrometry Matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI-MS) using Kompact MA equipped with a standard 337 nm nitrogen laser. This was performed using an LDI III mass spectrometer (Kratos Analytical, Ramsey, NJ). 20k Spectra were recorded using an analyzer in linear mode at an accelerating voltage of V. Fifteen Picomolar protein and 1.0 μl of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid An aliquot of the sample containing is mixed in the sample well of the probe slide and Dried. The laser fluence of the device was set to 30 (0-100 relative scale) Adjustable over time). The mass of the DTPA: rhG-CSF conjugate was measured by MALDI-MS (FIG. 7). The resulting spectra are multiplexed in addition to the monoprotonated species. Charged ions are shown. The mass obtained by averaging the sequence of peaks is 19,171.7 (± 7.3) daltons. Simple binding to rhG-CSF The calculated MW of one DTPA was 19,170.8 daltons. Therefore, The observed mass was consistent with DTPA: rhG-CSF, consistent with TLC analysis. A 1: 1 molar ratio of DTPA to rhG-CSF was shown for the conjugate. 4. Ion-spray mass spectrometry Ion-spray mass spectrometry was performed by ion-spray Perkin-Elmer Sciex API III mass spectrometer (Norwalk, CT ). Samples were run in water / acetonitrile / formic acid (50: 50: 0.1 , V / v) and flow injected into the same solvent flowing at 25 μl / min. Oh The orifice was set at 70V and the mass spectrometer was operated in Q1 mode. The mass of the DTPA: rhG-CSF conjugate with chelated indium is Measured as described above. Conjugates pre-incubated with saturated indium ( In: conjugate, 10: 1, mol / mol), a series of different m / z values A peak was obtained. This multiply charged ion from multiple protonations of proteins Was deconvoluted to obtain the MW spectrum shown in FIG. Clean The measured mass of the conjugate with oxidized indium is 19,286 (± 1.7) dal Tonnes, consistent with a calculated mass of 19,285.6 daltons. rhG-CSF For, the measured mass is consistent with the calculated mass of 18,798.5 daltons18, 798 (± 1.8) Dalton (Fig. 9) Met. 5. Peptide mapping For peptide analysis, about 0.5 mg of rhG-CSF or DTPA: rh G-CSF was dried in a speed vacuum and re-dissolved in 100 μl 8 M urea. Configured and sonicated for 10 minutes. After sonication, 10 μl of 1 M Tris-H Cl, pH 8.5 and 1 mg / ml in 10 mM Tris HCl, pH 8.5 2.5 μg EndoLys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) from the stock solution of I got it. The total volume was adjusted to 200 μl with distilled water and proteolytic digestion was performed at room temperature for 7 hours. went. After hydrolysis using EndoLys-C, Kirley, T.K., Anal.Biochem.,180, 231-2 36 (1989), 5 μl of 80 Reduce with 10 mM TBP and 10 μl of 40 mM ABD-F (2 mM final concentration) And alkylated. Immediately after reduction and alkylation, the resulting peptide (200 μl) Was directly equilibrated with solvent A (0.1% TFA in distilled water) Z_FourNote on reverse phase HPLC columns (Separations Group, Vydac, Hesperia, CA) Entered. Peptide analysis was performed using the system software Maxima. Fe 510 pumps, WISP 712, all controlled via the module Waters HPLC system consisting of autoinjector and 481LC spectrophotometer This was performed using The resulting peptide was 3-76% solvent B (0.1% TFA, A linear gradient of (95% acetonitrile) was used to elute over 115 minutes. Elution Was monitored by absorbance at 215 nm. Based on rhG-CSF standard peptide map To collect individual peptides, souza et al., Science,232, 61-65, (1986) As identified by amino acid composition analysis and N-terminal sequence analysis. Unmodified rhG-CSF and DTPA: peptide fragments of rhG-CSF were prepared. And analyzed as described above. Elution in 60 minutes from unmodified rhG-CSF sample No peak was found in the DTPA: rhG-CSF conjugate sample (FIG. 10). This The substance eluted in the peak of No. 1 was analyzed by amino acid composition analysis and N-terminal sequence analysis. It was determined to be the N-terminal 17 residues of hG-CSF. Thus, DTPA : The corresponding N-terminal peptide fragment from the rhG-CSF conjugate was modified to A new partially separated double peak eluting in minutes was obtained. This by mass spectrometry Of peptides obtained from each of these partially separated peaks Analysis showed that the first peak was the N-terminal peptide with bound DTPA. Expected mass, while the mass of the material in the second peak is Suggested contaminating binding peptide. Therefore, the peptide mapping was The DTPA group was shown to be located at the N-terminal 17 amino acids. This N- The terminal peptide is N-terminal, one threonine, three serine residues and lysine Contains residues. Cleavage of the peptide by EndoLys-C confirms that lysine is unmodified. And Acylation of the threonine or serine residue is almost impossible at pH 6.0. Unlikely. Undigested DTPA subjected to N-terminal sequence analysis: rhG-CSF The conjugate shows> 99% blocked N-terminus, which indicates a single on the protein This indicates that the DTPA moiety is attached to the N-terminus. 6. Isoelectric focusing Isoelectric focusing was performed using Novex pH3-10 gel (SanDiego, CA) with a pI of 3. Performed within the working range of 5-8.5. Samples were diluted 1: 1 with sample buffer and 5 μg Was loaded in each lane. Gel was run at 100V for 1 hour, 200V for 2 hours, Then a constant voltage of 500 V was applied for 0.5 hour. Fixation, staining and decolorization techniques Were performed according to the manufacturer's specifications. The DTPA: rhG-CSF conjugate has a single pi of 4.9 after isoelectric focusing. (Fig. 11, lane 3). Excess InCl_ThreeAnd the union ( In: conjugate, 10: 1, mol / mol). The band shifted to a pI of 5.3 (FIG. 11, lane 2). Has indium The pi values of both conjugates with and without rhI were lower than the pi 6.0 of rhG-CSF. (FIG. 11, lane 1). DTPA with loss of free N-terminal amino group Binding substantially reduced the pi of rhG-CSF. In addition, Ndium slightly increased the pi of the conjugate. With and with chelating metals The characteristic isoelectric point of the DTPA: rhG-CSF conjugate was also It can be used to monitor incoming and metal signs. The above data shows that (1) DTPA: rhG-CSF conjugate¹¹¹Clean In (2) stoichiometric moles of DTPA to rhG-CSF The ratio is about 1.0 for DTPA: rhG-CSF conjugate; (3) DTP The A-conjugate is specific for the N-terminus of rhG-CSF; and (4) Binding of DTPA to rhG-CSF reduces rhG-CSF pI Is shown. Example 3 In this example, circular dichroism analysis was used to clean the rhG-CSF to the N-terminus. The effect on the secondary structure of rhG-CSF due to the binding of a phosphate group was investigated. Circular dichroism (CD) spectra were obtained using a Jasco J-720 spectropolarimeter (Japan Spectroscopic Co ., LTD., Tokyo, Japan). Sample (0.078mg / ml protein) , 20 mM sodium acetate, pH 5.4 at 10 ° C. DTPA: r The CD spectrum of the hG-CSF conjugate overlaps that of the unmodified rhG-CSF. FIG. 12 shows the lowest ellipticity at 208 nm and 222 nm, respectively. Conclusion Excess indium (In: conjugate, 10: 1) saturating all chelating sites of the coalescence , Mol / mol) did not change the overall shape of the spectrum, This caused a slight (about 5%) decrease in facility helicity. Therefore, the secondary structure (pH 5.4) is unaffected by the attachment of the chelating group to the N-terminus. Shown in Example 4 In this example, the binding of DTPA to the biological activity of rhG-CSF and The effect of subsequent indium chelation was measured. After subcutaneous injection of 100 μg / kg rhG-CSF into hamsters, Peripheral WBC counts of rhG-CSF, DTPA: rhG-CSF conjugate, and Conjugates with chelated indium were evaluated (FIG. 13). Animals, directed Blood samples collected at the same time were collected and collected using a Sysmex F800 microcell counter. And analyzed. Injection of the conjugate (FIG. 13, (△)) was performed with unmodified rhG-CSF (FIG. 13, (○) Peripheral WBC number levels were induced in a manner similar to)). With excess indium Conjugate (In: conjugate, 10: 1, mol / mol) (FIG. 13, ( Injections of ◇)) have similar responses reaching maximum WBC levels 24 to 36 hours after injection Was induced. Therefore, the binding between DTPA and rhG-CSF is not related to rhG-CSF. It does not significantly alter the observed in vivo activity, and furthermore, the activity of the conjugate does not No change after rate. Example 5 In this example, the conjugate reaction described above is performed using the related growth factor interleukin-2. (IL-2).¹¹¹DTPA to chelate In: IL-2 The ability of the coalescence was evaluated using cation exchange HPLC as described above. Furthermore, D The stoichiometric molar ratio of TPA: IL-2 and the distribution of the DTPA moiety on IL-2 were also measured. Specified. IL-2 is synthesized as described in EP 0136489 (Souza et al.). Recombinant transfection of E. coli cells with a DNA sequence encoding IL-2 It was made using DNA technology. IL-2 is 100 mM sodium phosphate buffer Prepared as a 1.82 mg / ml solution in liquid pH 6.0. DTPA dianhydride And tributylphosphine (TBP, industrial purity) were obtained from Aldrich (Milwaukee, WI). Obtained from. The conjugate was prepared as described in Example 2 above. DTPA: Analysis of IL-2 conjugate 1. Analytical cation exchange HPLC Analytical cation exchange HPLC was performed as described above. DTPA: IL-2 conjugate (FIG. 14, lines 1 and 4, solid line) Then¹¹¹99.5% of the In radioactivity is shared with the protein from the cation exchange column. While eluted, detectable radioactivity was co-eluted with unmodified IL-2. (FIG. 14, lines 2 and 3, dashed lines)¹¹¹In's DTPA: IL -2 conjugate and by unmodified IL-2¹¹¹In bonding Indicates the presence. DTPA: Metallic key for analytical cation exchange HPLC analysis of IL-2 conjugates FIG. 15 shows the effect of the rate conversion. IL-2 (line 1), DTPA: IL-2 Conjugate (line 2) and excess InCl_ThreeWith pre-incubation Elution of the conjugation (In: conjugate, 10: 1, mol / mol, line 3) was 220 nm Monitored by absorbance at The DTPA: IL-2 conjugate is compared to unmodified IL-2 Eluted at low salt concentration. The chelation conjugate was then converted to that of unmodified IL-2. Elution at lower salt concentrations but slightly higher than unchelated conjugates Was. As in the case of performing the above rhG-CSF analysis, DTPA: IL-2 The characteristic retention time of the conjugate is useful for monitoring metal contamination and metal labeling of the conjugate. Provide a way. 2. Thin layer chromatography (TLC) ¹¹¹Measuring the ability of the DTPA: IL-2 conjugate to chelate In TLC was performed as described above to determine the stoichiometric molar ratio of TPA to IL-2. Was. As shown in FIG.¹¹¹As a result of chelation of In, the solvent tip All radioactivity migrated from nearby (FIG. 16, compare lanes 1 and 2).¹¹¹I n (10 nmol) and DTPA: IL-2 conjugate (2 nmol) A portion of the radioactivity is retained on the origin by the addition of (FIG. 16, lane 4). When the line graph of each lane was drawn, the peak of lane 4 Integral of the surface area indicated that 18% of the radioactivity remained in the origin. Survive Unbound¹¹¹In was collected by the added DTPA and moved near the top of the solvent. Was. Thus, 2 nmoles of D exhibiting a molar ratio of DTPA to IL-2 of 0.9: 1. About 1.8 nmoles of TPA: IL-2 conjugate¹¹¹In has bound. Unmodified I L-2 does not carry radioactivity on the origin,¹¹¹No In bond (FIG. 16, lane 3). 3. Peptide mapping To determine the location of the bound DTPA moiety on IL-2, use DTPA: IL-2 The combined peptide analysis was performed. Peptide fragments were prepared as described above. As shown in FIG. 17 (arrow), elution occurs at about 36 minutes from the unmodified IL-2 sample There is no peak in the DTPA: IL-2 conjugate sample. Substance eluted in this peak Was analyzed by amino acid composition analysis and N-terminal sequence analysis for the N-terminal peptide of IL-2. Was decided. Therefore, the corresponding N-terminal from the DTPA: IL-2 conjugate The terminal peptide fragment was modified, and a new partially separated peak was obtained at 40 minutes. As with rhG-CSF, peptide mapping was performed with the bound D The TPA group was shown to be located at the N-terminus. These data indicate that the DTPA: IL-2 conjugate¹¹¹In can be chelated That the stoichiometric molar ratio of DTPA to IL-2 is about 1.0; Figure 6 shows that PA binds site-specifically to the N-terminus of IL-2.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 1/13 Ａ６１Ｋ 49/02 Ａ 14/535 37/02 ＡＤＶ 14/55 37/66 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラルフ，ロイド・デイアメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、サウザンド・オークス、リツカード・ドライブ・2450──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI C07K 1/13 A61K 49/02 A 14/535 37/02 ADV 14/55 37/66 37/24 (81) Designated country EP ( AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), AL, AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG , MK, MN MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TT, UA, UG, UZ, VN (72) Inventor Ralph, Lloyd Day United States of America, California・ 91362, Thousand Oaks, Ritz Card Drive ・ 2450

Claims

[Claims] 1. A composition comprising a chelating agent, a protein and a metal cation, wherein the composition comprises A binding agent binds to the metal cation and binds site-specifically to the N-terminus of the protein. The composition as described above. 2. The composition of claim 1, wherein the metal cation is radioactive. 3. The chelating agent is a bicyclic dianhydride of diethylenetriaminepentaacetic acid, 3. The composition according to claim 1 or 2. 4. Radioactive metal cations are gallium-67, indium-111 and 3. The composition of claim 2, wherein the composition is selected from the group consisting of netium-99m. 5. The protein is G-CSF, GM-CSF, M-CSF, interferons (Alpha, beta and gamma), interleukins (1-14), erythris Lopoietin (EPO), fibroblast growth factor, stem cell factor, nerve growth factor, N T3, megakaryocyte growth and growth factor (MGDF), platelet-derived growth factor (PDGF) And a tumor growth factor (alpha, beta). Or the composition according to 2. 6. The composition according to claim 5, wherein the protein is G-CSF. 7. 6. The composition according to claim 5, wherein the protein is IL-2. 8. Bicyclic dianhydride of diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) and rhG-C A composition comprising SF and indium-111, wherein the DTPA comprises the indium. -111 and site-specifically bound to the N-terminus of the rhG-CSF , The composition. 9. Bicyclic dianhydride of diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) and rhIL- A composition comprising 2 and indium-111, wherein said DTPA comprises said indium-111. 111, and site-specifically linked to the N-terminus of rhIL-2. The composition. 10. A method for producing a labeled protein, the method comprising: (A) sufficiently acidic to selectively activate the α-amino group at the amino terminus of the protein Reacting the protein with the chelating agent at a pH of: (B) separating the bound protein from the unbound protein; (C) adding a metal cation to the conjugate; and (D) obtaining the labeled protein; The method comprising: 11. The method according to claim 10, wherein the pH is 6.0. 12. A method for producing labeled G-CSF, comprising: (A) sufficient to selectively activate the amino-terminal α-amino group of G-CSF Reacting the G-CSF with a chelating agent at an acidic pH; (B) separating bound G-CSF from unbound G-CSF; (C) adding a metal cation to the conjugate; and (D) obtaining the labeled G-CSF, The method comprising: 13. 13. The method according to claim 12, wherein said pH is 6.0. 14． 14. The method according to claim 13, wherein said chelating agent is DTPA. 15. A method for producing labeled IL-2, comprising: (A) sufficient acid to selectively activate the amino-terminal α-amino group of IL-2 Reacting the IL-2 with a chelating agent at an acidic pH; (B) separating bound IL-2 from unbound IL-2; (C) adding a metal cation to the conjugate; and (D) obtaining the labeled IL-2, The method comprising: 16. The method according to claim 15, wherein the pH is 6.0. 17． 17. The method according to claim 16, wherein the chelating agent is DTPA. 18. (A) a metal cation is chelated and bound and via an amide bond Consisting of a chelator moiety attached only at the N-terminus to the recombinant human G-CSF moiety A substantially homogeneous preparation of recombinant human G-CSF, comprising: (b) a pharmaceutically acceptable A pharmaceutical composition comprising a diluent, an adjuvant or a carrier. 19. (A) a metal cation is chelated and bound and via an amide bond Consisting of a chelator moiety attached to the recombinant human IL-2 moiety only at the N-terminus A substantially homogeneous preparation of recombinant human IL-2; and (b) a pharmaceutically acceptable diluent. A pharmaceutical composition comprising a diluent, an adjuvant or a carrier. 20. 3. A composition according to claim 1 or 2 for use as a diagnostic imaging agent. Stuff.