【発明の詳細な説明】
ヒト及び植物メチルトランスフェラーゼの製造及び用途
背景 発明の分野
本発明はメチルトランスフェラーゼの製造及び用途に関するものである。更に
詳細には、本発明は組換えヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルタンパク
質メチルトランスフェラーゼ、植物L-イソアスパルチルタンパク質メチルトラ
ンスフェラーゼをコードする単離ポリヌクレオチド及び精製植物L-イソアスパ
ルチルタンパク質メチルトランスフェラーゼの製造、精製及び用途に関するもの
である。発明の背景
タンパク質は、徐々に自発的な熱力学的変化を受けて機能が低下する(Hardin
g,J.J.(1985年)Adv.Protein Chem.37:247〜334)。このような損傷の通常
の形態は、アスパラギニル及びアスパルチル残基の非酵素的脱アミド化、異性化
及びラセミ化である(Clarke等(1992年)「タンパク質医薬品の安定性、パー
トA: タンパク質分解の化学的及び物理的経路」)1〜29頁、Plenum Press、
ニューヨーク)。大部分の細胞においては、L-イソアスパルチル及びD-アスパ
ルチル残基を含有するタンパク質は、該タンパク質のメチルエステル化を触媒す
るタンパク質-L-イソアスパルテート(D-アスパルテート)O-メチルトランス
フェラーゼ(E.C.2.1.1.77)によって認識される(McFadden等(1982年)Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 79:2460〜2464、Murray等(1984年)J.Bio
l.Chem.259:10722〜10732、及びAswad(1984年)J.Biol.Chem.259:1071
4〜10721)。酵素的メチル化反応はこれらの変化を受けたアスパルチル残基を正
常なL-アスパルチル残基に変換する過程の第一段階を相当する(McFadden等(
1987年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:2595〜2599、Johnson等(1987年)
J.Bio1.Chem.262:5622〜5629、Lowenson等(1991年)J.Biol.Chem.26 6
:19396〜19406、
Lowenson等(1992年)J.Biol.Chem.267:5985〜5995)。この反応は異性化や
ラセミ化を受けたアスパルチル残基を含有するタンパク質の蓄積を阻止し、そし
て老化過程の悪影響を制限する重要な成分であると思われる。細菌においては、
欠失突然変異が生存を100分の1まで減少させるので、この酵素は静止期や熱シ
ョック生存にきわめて重要であることが示されている(Li等(1992年)Proc.
Natl.Acad.Sci USA 89:9885〜9889)。
L-イソアスパルチル/D-アスパルチルメチルトランスフェラーゼは哺乳動物
組織で広範囲に研究されている。2つの同様な活性体がウシ脳(Aswad等(1983
年)J.Neurochem.40:1718〜1728)及びヒト赤血球(Gilbert等(1988年)Bi
ochemistry 27:5227〜5233、Ota等(1988年)Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.151:1136〜1143)から単離されている。これらのアイソザイムは約25,000
Daの単量体ポリペプチドでありそして同様な触媒特性を有しているが、等電点
が約1pH単位だけ異なっている(Ota等(1988年)Biochem.Biophys.Res
.Commun.151:1136〜1143)。アイソザイムIとIIの間の等電点を有する第3の
活性体が認められたが、対応するアイソザイムは単離又は特性決定されていない
(Ingrosso等(1991年)Adv.Exper.Med.Biol.307:263〜276)。ウシ脳(
Henzel等(1989年)J.Biol.Chem.264:15905〜15911)及びヒト赤血球(
Ingrosso等(1989年)J.Biol.Chem.264:20131〜21039)から得られるアイソ
ザイムIの完全なアミノ酸配列並びにヒト赤血球から得られるアイソザイムIIの
アミノ酸配列の大部分(Ingrosso等(1991年)Biochem.Biophys.Res.Commu
n.175:351〜358)は決定されている。ヒトアイソザイムIの配列はウシ酵素と96
%同一である。2つのヒトアイソザイムのアミノ酸配列はC末端の2つのアミノ
酸を除いて同一であり、そしてこれら2つのアミノ酸が等電点の差異を説明する
ものと思われる(Ingrosso等(1991年)Biochem.Biophys.Res.Commun.175
:351〜358)。
サザンブロット分析は、両アイソザイムが単一遺伝子の産生物であることを示
唆している(Ingrosso等(1991年)Biochem.Biophys.Res.Commun.175:351〜
358)。ラット脳及びマウス精巣の、アイソザイムIに類似する酵素をコードする
ヌクレオチド配列が最近決定されている(Sato等(1989年)Biochem.Biophys
.
Res.Commun.161:342〜347、Romanik等(1992年)Gene 118:217〜222)。
ヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルタンパク質カルボキシルメチルト
ランスフェラーゼ(EC 2.1.1.77)の2つのアイソザイムのmRNAに対応す
る2つのcDNAクローン(MacLaren等(1992年)Biochem.Biophys.Res
.Commun.185、277〜283)は配列が決定されている。これらのうちの1つ(p
RK1)のDNA配列は、ヒト赤血球アイソザイムIのC末端半分のアミノ酸配
列をコードしている。他のcDNAクローン(pDM2)はより酸性のアイソザ
イムIIの完全なコード領域を含んでいる。アミノ酸残基119及び205の潜在的多形
部位を除いて、推定アミノ酸配列はC末端だけで異なっており、アイソザイムI
の-RWK配列はアイソザイムIIでは-RDEL配列で置換されている。後者の配
列は哺乳動物小胞体保持シグナルと同一である。pRK1のコード領域の欠失部
分はpDM2のコード領域に匹敵するように思われる。別のスプライシングの存
在は、−R C末端を有する第3のアイソザイムの存在を示唆している。最後に
、この酵素のヒト遺伝子には3つのゲノム多形が存在するという証拠が提出され
ている。残基22はイソロイシン(I)か又はロイシン(L)のいずれかであるこ
とができ、残基119はイソロイシンか又はバリン(V)のいずれかであることが
できそして残基205はリジン(K)か又はアルギニン(R)のいずれかであるこ
とができる(Tsai及びClarke(1994年)Biochem.Biophys.Res.Commun.203:
491〜497)。かくして、上記した各アイソザイムは少なくとも8つの形態(I22
I119K205、I22I119R205、I22V119K205、I22V119R205、L22I119K2 05
、L22I119R205、L22V119K205、L22V119R205)で存在することができ
る。
しかし乍ら、上記研究においては、ヒトメチルトランスフェラーゼをコードす
るDNAは適当な組換え体発現系がないため効率的には発現されなかった。かく
して、大量の均質な酵素はこれまでのところ単離されていない。メチルトランス
フェラーゼはウシ脳から精製されており、そしてそこでは0.58kgの大脳皮質から
5段階で3.7mgが得られた(Aswad等(1983年)J.Neurochem.40:1718〜1726)。
ヒト酵素の精製は一層困難であった。即ち、0.22リットルの血液から5段階で僅
か約0.1mgのタンパク質しか得られなかった(Gilbert等(1988年)Biochemistr
y
27
:5227〜5233)。従って、大量のイソアスパルチルメチルトランスフェラーゼを
産業的規模で製造する効率的な精製系はこれまでなかった。
植物においては、タンパク質L-イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ
活性は単子葉及び双子葉植物の両方並びに緑藻類、クラミドモナスレインハード
チィ(Chlamydomonas reinhardtii)で同定されている(Mudgett等(1993年)
Biochemistry 32:11100〜11111)。大部分の植物器官には何らかの酵素活性が
存在するが、それらの値はかなり変動することがある。興味深いことに、L-イ
ソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ活性の最高値は種子中に見られる(Mu
dgett等(1993年)Biochemistry 32:11100〜11111)。更に、外来性ペプチド基
質不存在下で種子可溶性フラクション中でカルボキシルメチル化タンパク質がイ
ンビトロで形成されることは、メチル受容基質がインビボメチルトランスフェラ
ーゼ用に存在することを示唆している(Trivedi等(1982年)Eur.J.Bioch
em.128:349〜354及びMudgett等(1993年)Biochemistry 32:11100〜11111)
。
タンパク質中のイソアスパルテート値はこのタンパク質の損傷値の目安として
使用されている。イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ酵素を使用するタ
ンパク質のイソアスパルチル含有量の測定方法はアスワド(Aswad)に付与され
た米国特許第5,273,886号明細書に開示されており、そしてこの開示は引用によ
り本明細書に組み入れる。
図面の簡単な説明
図1は、本発明のヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルメチルトランス
フェラーゼ発現プラスミド、pDM2xの構築を示す。107bpのKpnl-Narlフラグ
メントをプラスミドpDM2から取り除き、そしてリボソーム結合部位及びイニ
シエーター部位を有する合成ポリリンカーで置き換える。
図2は、本発明で使用される新規なポリリンカーフラグメントを示す。このポ
リリンカーはマルチプルクローニング部位(KpnI、KhoI、KbaI、BamHI、N
heI、NcoI)及び強力な原核生物リボソーム結合部位を含有している(Shine等
(1974年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71:1342〜1346)。
図3は、本発明のヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルメチルトランス
フェラーゼ発現プラスミド、pDM2xのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示
す(配列番号8)。
図4は、大腸菌(E.coli)におけるヒトL-イソアスパルチル/D-アスパル
チルメチルトランスフェラーゼ産生値に与えるイソプロピルβ-D-チオガラクト
ピラノシド(IPTG)の効果を示す。
図5は、本発明のpDM2x発現系におけるヒトメチルトランスフェラーゼとし
て得られる総可溶性タンパク質の大腸菌増殖パーセント、及びヒトメチルトラン
スフェラーゼの収率をIPTG誘導後の時間の関数として示す。
図6は、本発明による硫酸プロタミン沈殿化段階の最適化を示す。
図7は、本発明による硫酸プロタミン清澄化上清液から得られるヒトL-イソ
アスパルチル/D-アスパルチルメチルトランスフェラーゼの硫酸アンモニウム
沈殿分画の最適化を示す。
図8は、本発明によるヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルメチルトラ
ンスフェラーゼの陰イオン交換カラム精製段階を示す。
図9は、本発明による精製ヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルメチル
トランスフェラーゼ濃縮のpH依存性を示す。
図10は、本発明の精製組換えヒトメチルトランスフェラーゼのエレクトロス
プレー(electrospray)マススペクトル分析を示す。(A)ジチオスレイトール
を使用して精製した物質のスペクトルの1部分。(B)緩衝液A中の0.1μMジ
チオスレイトールの代わりに15mMのβ-メルカプトエタノールを使用したときに
精製された物質のスペクトルの1部分。
図11は、本発明の精製ヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルメチルト
ランスフェラーゼの紫外線吸光度スペクトルを示す。
図12は、本発明による小麦胚芽L-イソアスパルチルメチルトランスフェラ
ーゼの精製を示す。(A)DEAE-52陰イオン交換セルロース処理。(B)逆
硫酸アンモニウム勾配可溶化処理。(C)セファクリルS-200ゲルろ過。
図13は、本発明による小麦胚芽から得られるL-イソアスパルチルメチルト
ランスフェラーゼ精製のポリペプチド分析を示す。
図14は、本発明で使用した小麦胚芽メチルトランスフェラーゼcDNA挿入
物のDNA配列決定戦略を示す。
図15は、小麦胚芽から得られるL-イソアスパルチルメチルトランスフェラ
ーゼの配列決定されたペプチドフラグメントとpMBM1から得られるその予想
アミノ酸配列の並列を示す。
発明の概要
本発明の1つの特別の目的は、酵素をコードするcDNAの発現によって単離
組換えヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルタンパク質メチルトランスフ
ェラーゼを提供することである。驚いたことに、この発現系によって純粋な組換
え酵素の非常に効率的な大規模製造が可能になる。組換え酵素の構造は、組換え
酵素ではアセチル化による翻訳後修飾で修飾されていないN末端アラニン残基だ
けがヒト赤血球から得られる精製酵素の構造と異なっている。かくして、この酵
素は抗原性の問題が潜在していないのでヒト研究で使用するのに適している。
本発明の他の目的には、小麦L-イソアスパルチルタンパク質メチルトランス
フェラーゼをコードするcDNAの同定、及び小麦から得られる精製植物L-イ
ソアスパルチルタンパク質メチルトランスフェラーゼの提供が含まれる。高レベ
ルのメチルトランスフェラーゼは小麦、特に種子中に見られる。
本発明の更に他の目的は、タンパク質劣化に起因する疾患を治療するために酵
素を含有する医薬製剤を提供すること及びタンパク質医薬品やペプチド医薬品の
品質を管理しそしてタンパク質の劣化に関連した疾病状態を診断する分析手段を
提供することである。本発明の他の目的は、本発明の以下の詳細な説明を参照す
ることによって当該技術分野の通常の技個を有する者に明白となろう。
即ち、本発明の1つの要旨は、配列番号1(アイソザイムI)及び配列番号2
(アイソザイムII)からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドの
発現によって得られる単離組換えヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルタ
ンパク質メチルトランスフェラーゼであり、そしてこれらは各々アイソザイムI
又はIIの8個のアミノ酸配列、即ち上記したI22I119K205、I22I119R205、
I22V119K205、I22V119R205、L22I119K205、L22I119R205、L22V11
9K205及びL22V119R205をコードする合計17個のヌクレオチド配列を含んでい
る。
本発明のもう1つの要旨は、配列番号3(アイソザイムI)及び配列番号4(
アイソザイムII)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離組換えヒ
トL-イソアスパルチル/D-アスパルチルタンパク質メチルトランスフェラーゼ
であり、そしてこれらは各々上記した8個のアミノ酸配列を含んでいる。
本発明のもう1つの要旨は、配列番号5に示される配列のコード配列を有する
単離ポリヌクレオチドであり、そしてこれは植物L-イソアスパルチルタンパク
質メチルトランスフェラーゼをコードしている。塩基番号117〜199のATGコド
ンで開始しそして807〜809位のTGAコドンの前のAGCコドンで終結するこの
配列の690塩基対はこのポリヌクレオチドのコード配列を示す。
本発明のもう1つの要旨は配列番号5に示される配列を有するポリヌクレオチ
ドの発現によって得られる単離組換え植物L-イソアスパルチルタンパク質メチ
ルトランスフェラーゼである。
本発明のもう1つの要旨は、配列番号6又は7に示されるアミノ酸配列を有す
る小麦胚芽から得られる精製植物L-イソアスパルチルタンパク質メチルトラン
スフェラーゼである。
本発明のもう1つの要旨は、ヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルタン
パク質メチルトランスフェラーゼを組換え法で製造する方法であって、
オリゴヌクレオチドを使用して、ヒトL-イソアスパルチルタンパク質メチル
トランスフェラーゼの全コード領域を含有するプラスミドpDM2(Genebank受
理番号S37495)のようなプラスミドを修飾して、マルチプルクローニング部位
、効率的なリボソーム結合部位並びに細菌及び/又は真核生物発現系で機能する
ように設計されている強力な翻訳イニシエーター領域を提供し、
構築されたベクターを、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPT
G)誘導性T7ポリメラーゼ遺伝子を有する宿主中にトランスフェクションし、
そして
IPTGでメチルトランスフェラーゼの過剰発現を誘導してメチルトランスフ
ェラーゼを製造する、
ことを含む方法である。
この発現方法はメチルトランスフェラーゼの任意の変種に有利に適用すること
ができる。酵素は好ましくは、LBブイヨン中で増殖したBL21(DE3)のよ
うな大腸菌中で過剰に発現したヒトcDNAから得られる。更に効率的で且つ経
済的な発現はより栄養に富む培地、例えば強力ブイヨン(Sambrook等(1989年)
「分子クローニング:実験室マニュアル」、Cold Spring Harbor Laboratory)
を使用して達成され、その結果、より高い最終細胞密度並びにより長期の指数的
増殖及びメチルトランスフェラーゼ産生期が得られる。本発明では、最終的に、
ヒトメチルトランスフェラーゼが総細菌可溶性タンパク質の約10〜30%までを構
成する調製物とすることができる。
本発明のもう1つの要旨は、メチルトランスフェラーゼ発現が生じた溶解細菌
抽出物中に存在する組換え法で製造されたヒトL-イソアスパルチル/D-アスパ
ルチルタンパク質メチルトランスフェラーゼを精製する方法であり、そしてこの
方法は、
上記抽出物に硫酸プロタミン又はポリエチレンイミンのようなヌクレオチド沈
殿剤を添加して、細胞破片(debris)除去後に抽出物中に存在するDNAを除去し
、
硫酸アンモニウムでメチルトランスフェラーゼを沈殿させ、
透析して硫酸アンモニウムを除去し、そして
新規条件下で陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して透析物からメチルト
ランスフェラーゼを精製する、
ことを含む。
この新規精製法に基づいて、4リットルの細菌培養物から約50mgの酵素を得る
ことができる。この酵素の精製が単一カラムで成功したことは、酵素をカラムと
弱く結合させそして塩勾配を適用しないで開始緩衝液で無勾配(isocratically)
溶出できる条件の発見によるものと考えられる。リン酸塩/EDTA緩衝液で十
分に平衡化されていないDEAE-セルロースカラムで最も良く分画されたこと
が見い出されている。
本発明のもう1つの要旨は、小麦から得られる植物L-イソアスパルチルタン
パク質メチルトランスフェラーゼの精製方法であり、そしてこの方法は、
生小麦(raw wheat)胚芽から粗製(crude)細胞質ゾルを取得し、
DEAE-セルロースクロマトグラフィーで上記粗製細胞質ゾルを分画し、
集めた活性フラクションにタンパク質担体の存在下硫酸アンモニウムを添加し
、
得られた物質を逆硫酸アンモニウム勾配可溶化(reverse ammonium sulfate gr
adient solubilization)で分画し、そして
集めた活性フラクションをゲルろ過クロマトグラフィーで精製してメチルトラ
ンスフェラーゼを28,000Daの単量体種として精製する、
ことを含む。
本発明のもう1つの要旨は、組織中のポリペプチドのL-イソアスパルチル/
D-アスパルチル残基の増加と関連した医学的状態の治療方法であり、そしてこ
の方法は、S-アデノシルメチオニンと共に又はこれを用いないで、組織中の上
記L-イソアスパルチル/D-アスパルチル残基をL-アスパルチル残基に変換す
るのに十分な量のメチルトランスフェラーゼを組織に投与することを含む。
この好ましい実施態様のもう1つの特徴によって、L-イソアスパルチル/D-
アスパルチル残基が蓄積されている疾病状態の診断方法が提供され、そしてこの
方法は、プローブとしてメチルトランスフェラーゼを使用して、疾病関連タンパ
ク質中に蓄積されたL-イソアスパルチル/D-アスパルチル残基の含有量を測定
することを含む。
本発明のもう1つの要旨は医薬品ポリペプチドの劣化を測定する方法であり、
そしてこの方法は、プローブとしてメチルトランスフェラーゼを使用して、ポリ
ペプチド中のL-イソアスパルチル及びD-アスパルチル残基の含有量を測定する
ことを含む。
本発明の更にもう1つの実施態様は、組織中のポリペプチドのL-イソアスパ
ルチル/D-アスパルチル残基の増加と関連した医学的状態の治療用医薬製剤で
あり、そしてこの医薬製剤は、好ましくは基質S-アデノシルメチオニンを有す
るヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチルタンパク質メチルトランスフェラ
ーゼ、及び製薬的に許容可能な担体を含む。
本発明によって大量の酵素を得ることができるので、この酵素の商業的有用性
が適切になる。メチルトランスフェラーゼはタンパク質及びペプチド医薬品の品
質管理においてL-イソアスパルチル及びD-アスパルチル残基の高感度分析プロ
ーブとして使用することができる。β-アミロイド産生物(Roher,A.E.等(1993
年)J.Biol.Chem.268:3072〜3083)のような生物学的流体中の変化したタン
パク質やペプチドをアッセイする医学的診断で使用することが可能である。内在
性ヒトメチルトランスフェラーゼは細胞質ゾルに限定される(Clarke,S.(198
5年)Annu.Rev.Biochem.54:479〜506)ので、細胞外環境の損傷タンパク質は
この酵素が触媒する修復を受けることはできない。かくして、メチルトランスフ
ェラーゼ及びその基質S-アデノシルメチオニンを使用する注射用製剤及び局所
治療用製剤は有用である。特に、劣化して皮膚組織の老化の一因になると思われ
るコラーゲンやエラスチンのような皮膚中の損傷タンパク質の修復においてこの
酵素が有用であることは有利である。
好ましい実施態様の詳細な説明
大腸菌におけるヒトのL-イソアスパルチル/D-アスパルチル・メチルトランスフ
ェラーゼの過剰発現
プラスミドpBluescript SK(-)(pDM2:ジーンバンク受入番号S37495)は、
ヒトのL-イソアスパルチル/D-アスパルチル・メチルトランスフェラーゼ(配
列番号9)の酸性のアイソザイムIIの完全なコード領域(配列番号8)を含む(Ma
cLeren,etal.(1992)Biochem,Biophys.Res Commun.185:277/283)。こ
のプラスミドはプローブとしてマウスのcDNAを使って、ヒトの脳の組織由来
のcDNAライブラリー(Stratagene,La Jolla,CA)から得られる。発現ベ
クターとして、pDM2(配列番号9)以外の配列を有する、アイソザイムI(配列番
号1)またはアイソザイムII(配列番号2)をコードするcDNAを含有するプラスミ
ドは、配列番号3に示される配列を有するアイソザイムIまたは配列番号4に示
される配列を有するアイソザイムIIを生成するために使用でき、その結果各アイ
ソザイムはすでに説明したように少なくとも8個の形態(I22I119K205,I22
I119R205,I22V119K205,I22V119R205,I22V119R205,L22I119K205
,L22I119R105,L22V119K205,L22V119R205)で生成され得る。あるいは
、-RC末端(226残基の長さ)を有するアイソザイムIIIを同じ方法で生成でき
る。このようなプラスミドとしては、pBKファージ
ベクター(Strategene)およびpTrc99A発現プラスミド(Pharmacia,Piscatwa
y,NJ)が挙げられる。大腸菌はヒトのメチルトランスフェラーゼの発現に好ま
しい。なぜならば、ヒトの赤血球から精製されたアイソザイムIIの特徴を明らか
にしたところ、翻訳後に修飾されないことが示されたからである(Ingrosso,e
t al.(1989)J.Biol.Chem.264:20131/20139)。従って、大腸菌発現系はヒト
の酵素にほとんど同じ組換え体メチルトランスフェラーゼを生成できる。pDM2
プラスミドはすでにT7プロモーター部位を挿入cDNAの転写にとって適切な
位置および配向に有するが、リボゾーム結合部位を含まない(MacLaren,et a
t.(1992)Biochem.Biophpus.Res.Commun.185:277-283)。従って、pDM2プ
ラスミドは該酵素のT7プロモーター部位と開始コドン(start codon)との間の領
域を強力なリボゾーム結合部位を含む合成のフラグメントと取り換えることによ
り修飾され過剰発現ベクターpDM2xを生成する(Hine,et al(1974)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 71:1342-1346.)(図1)。図1において、pDM2か
らのKpnI-NarIフラグメントはマルチプルクローニング部位、真核イニシエ
ータ部位、および強力なリボゾーム結合部位を含む合成リンカーと取り替えられ
る(図2)。図2に示されるフラグメントは適正な挿入用のKpnlおよびNarI制
限部位を含むオリゴヌクレオチドのプライマーを使ってポリメラーゼ連鎖反応(
PCR)により生成された。T7プロモーター部位を含むKpnl制限部位からの領
域5’は元はpBluescript SK(-)プラスミドの一部であった。Ncolスタート
の配列5’は元のメチルトランスフェラーゼcDNA挿入物に存在していない。p
DM2はそのEcoRI部位に挿入されたヒトのメチルトランスフェラーゼ・アイ
ソザイムIIcDNAを含むpBluescript SK(-)(Stratagene)プラスミドである
。与えられたフラグメントのサイズはそれぞれKpnlおよびNarlの4および2塩
基対オーバーハングを含まない。この置き換えフラグメントは様々な発現組織お
よび有機体の中にメチルトランスフェラーゼcDNA(図3)を挿入するための
マルチプルクローニング部位を持つように処理をされた。図3において、配列の
3’末端のEcoRI部位はpBluescript SK(-)クローニングプラスミドの一
部である7個の塩基を示す。Kpnl制限部位からの領域5’はT7プロモーター部
位を含んでおり、pBluescript SK(-)プラスミドの一部でもある。このフラグ
メントは配列番号8の配列を有する。T7プロモーター部位か
らヒトcDNA挿入物の末端上の3’EcoRIリンカーまでのpDM2x発現プラ
スミドのヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列が図3に示されている
。pDM2xの修飾された領域の構造および総合的なプラスミド構造はそれぞれD
NA配列分析および制限エンドヌクレアーゼ消化分析により確認された。メチル
トランスフェラーゼをコードするベクターに挿入できるリボゾーム結合部位およ
びイニシエータ部位を含む合成ポリリンカーはいずれも本発明の範囲内である。
T7RNAポリメラーゼ誘導発現プラスミドは次にヒトL-イソアスパラチル/D
-アスパルチルメチルトランスフェラーゼの発現のために大腸菌株BL21(D
E3)にトランスフェクションされる(Studier,et al.(1986)J.Mol.Biol.18
9:113-130)。この細菌の株はイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IP
TG)誘発性lacUV5プロモーターの制御下においてクロモゾームにファージT7
RNAポリメラーゼ遺伝子を含んでいる。IPTG誘発性T7ポリメラーゼ遺伝
子を含む他の細菌のホスト株も考えられる。例えば、T7ポリメラーゼが熱誘発
性プロモーターの後ろでプラスミドpGP1-2の上にコードされるデュアルプラス
ミド系を使用できる。このブラスミドによって様々な細菌株が形質転換される。
メチルトランスフェラーゼの精製
溶解された細菌の抽出物中のメチルトランスフェラーゼを増すためにここで使
用された最初のバッチ精製工程はFu,et al.(Fu,et al,(1991)J.Biol.
Chem.266:14562・14572.)により使用された方法の変形である。過剰発現の細菌
を超音波により溶解した後、遠心分離により細胞の破片を除去する。上澄み液に
残っている核酸は沈殿剤である硫酸プロタミンまたはポリエチレンイミンの添加
および遠心分離により除去される。硫酸プロタミンの必要量は最適化され、硫酸
プロタミンの4%溶液の0.1容量の添加により本質的に定量的収率でメチルトラ
ンスフェラーゼが精製されることが判明した。次に、このメチルトランスフェラ
ーゼは濃縮され、さらに硫酸アンモニウムで沈殿させて精製される。再び、予備
実験においてこの工程の条件が最適化され、50%〜55%の飽和で最高の精製
が達成されるが、収量と精製との間の最高の歩み寄りは60%飽和で起こり、こ
れらの条件は大規模精製でも使用される。ペレット化されたタンパク質は少量の
緩衝液A
に再び懸濁され、緩衝液Aに対して透析され、硫酸アンモニウムを除去する。
次に、DEAEセルロースアニオン交換クロマトグラフィを使うことにより透
析液からメチルトランスフェラーゼを精製するための迅速な1工程カラム方法が
実施される。非相互作用カチオン緩衝液においてカラムに酵素が結合する伝統的
な方法を適用したが不完全な精製であることが判明した。しかし、非平衡条件下
で相互作用アニオン性緩衝液を使用すると均質な酵素が溶離されることが判明し
た。もしクロマトグラフィが、充填前にカラムを十分に平衡化して実施されると
メチルトランスフェラーゼが僅かに遅れて同じような量の夾雑ポリペプチドと共
に空隙容量近くに溶離する(データは示されていない)。
植物中のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼの同定
ペプチド依存性のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼは緑藻のC
.reinhardtiiの植物細胞中に発見され、それは植物界の少なくとも1種に存在
することを実証している。植物界では、メチルトランスフェラーゼ活性は被子植
物の両方の部類、すなわち、単子葉植物および双子葉植物において検出されてい
る。様々な組織における活性レベルはかなり変動する。分析された植物界の種の
内、メチルトランスフェラーゼの最も高い比活性は小麦の胚(麦芽)に認められ
る。それに対して、レタスの葉またはトマトの果実にはL-イソアスパルチル・ペ
プチド・特定のメチルトランスフェラーゼ活性はほとんど検出できない。麦芽の
酵素の比活性(14.0ミクロモル/分/mg)は大腸菌(1〜2.5ミクロモル/分/mg;F
u,et al.1991)およびヒトの赤血球(1.9〜9.4ミクロモル/分/mg;Ota,et al
.,1988; Gilbert,et al,1988)において認められたレベルを超えている。従っ
て、小麦粉製造の安価で豊富な副生成物である麦芽は優れた酵素精製材料源であ
る。
小麦の種子および実生のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼ
ペプチド依存性のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼ活性は成熟
した小麦の種子において最も高く、その活性は吸水膨潤および発芽の後は有意に
減少する。ノーザン分析は、メチルトランスフェラーゼmRNAは単一の1200ヌクレ
オチド種として種子にだけ発現され、全体の実生、葉または根には発現されない
ことを示している。酵素のレベルは殻果の発達段階により変動し、メチルトラン
スフェラーゼmRNAの最高レベルは胚が最大に成長したIV段階の種子において検出
されるが、メチルトランスフェラーゼmRNAはII段階では全く検出できない。ノー
ザン分析は、10時間の水欠乏処理、50μM(+)-シス、トランスアブシジン酸(ABA)
に曝し、塩のストレス(0.25MのNaCl)に曝したところ、劇的にメチルトランスフ
ェラーゼmRNAが発現することを示している。それに対して、メチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子の発現は低温(4℃)または高温(37℃)のストレスに曝した苗では誘
導されない。これらの結果は、イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼmR
NA発現および酵素活性は種子の発達および発芽において誘発されるばかりでなく
、苗の水欠乏期間および塩のストレスにおいても増加することを示している。特
に、苗はABAおよびNaClの両方で処理されると、メチルトランスフェラーゼ遺伝
子発現が単独の場合よりだいたい2倍に増加する。ABA-NaCl組み合わせ処理の相
加効果は、メチルトランスフェラーゼ遺伝子はABA反応遺伝子に加えて塩反応遺
伝子であることを示している。メチルトランスフェラーゼの発現を引き起こすた
めに必要なホルモンおよび環境のストレスは好ましくはABA濃度10〜100μM、塩
濃度0.1〜1M、または脱水時間5〜24時間である(脱水は他の植物については7
日間まで延ばせる)。
小麦の胚芽由来のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼの精製
高度のメチルトランスフェラーゼ活性の故に小麦系が選ばれた。本発明の精製
戦略はTrivedi,et al.により報告されたタンパク質カルボキシル・メチルトラ
ンスフェラーゼの部分的精製に基づく(Trivedi,et al.(1982)Eur.J.Biochem
.128,349-354)。メチルトランスフェラーゼは生の麦芽の細胞質ゾル分画から精
製される。この材料はまずDEAEセルロースクロマトグラフィによりpH7〜10
、好ましくは9.3で分画される(図12A)。次に、活性分画はCelite545などの
タンパク質担体の存在下で硫酸アンモニウムを60〜100%、好ましくは80%まで
飽和させ、カラムに注入され、室温で逆硫酸アンモニウム傾斜可溶化により分画
される(図12B)。約20〜50%、好ましくは26〜31%飽和硫酸アンモニウムを含
有する活性画分はさらに好ましくはセファクリルS-200ゲル濾過クロマトグラフ
ィを使っ
て精製できるが、他のゲル濾過材料も考えられる。驚いたことに、L-イソアスパ
ルチル・メチルトランスフェラーゼはカラムの全容量にほぼ相当する分画におい
て高度に精製された状態で溶離する。この工程は、メチルトランスフェラーゼが
そのサイズに基づいて分画されない点でユニークである。むしろ、メチルトラン
スフェラーゼは分画中のかなり高濃度の硫酸アンモニウムにより得られる溶剤効
果のために疎水性相互作用によりセファクリルSephacryl S-200樹脂と相互作
用することが示唆される(Belew,et al.(1978)J.Chromatogr.147,205-212)。
硫酸アンモニウムが存在しない場合は、メチルトランスフェラーゼはセファクリ
ルSephacryl S-200カラムから単量体の分子量と一致する位置で無数の夾雑ポ
リペプチドと共に溶離する。従って、ゲル濾過カラムから高度の精製された酵素
製剤を連続的に単離することはこの異例の吸着現象による。
このポリペプチドは、Clarke(Clarke(1981)Biochim,Biophys.Acta 670,1
95-202)により説明されているように、Triton X-100の存在下でゲルのスライス
を再生することにより分析したところ、L-イソアスパルチル・メチルトランスフ
ェラーゼに対応する。この製剤の純度は、クーマシイ着色ゲルの濃度測定から推
定して80〜100%ほどである(図13)。
小麦由来のL-イソアスパルチル/D-アスパルチル・メチルトランスフェラーゼを
コードするDNA配列
プラスミドpMBM1における952-bp cDNA挿入物のDNA配列は図14に示される配列
決定戦略を使って決定される。メチルトランスフェラーゼcDNAのDNA配列および
その予測アミノ酸配列は配列番号5および6にそれぞれ示される。690-bpオープ
ンリーディングフレームから予測される230アミノ酸ポリペプチドの計算された
分子量は24,710である。それに対して、精製されたメチルトランスフェラーゼは
SDS-ポリアクリルアミドのゲルの電子泳動(SDS-PAGE)により決定されるように
、28,000Daのポリペプチドとして泳動した。
麦芽由来のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼの配列決定されたペ
プチドフラグメントとpMBM1由来の予測アミノ酸配列との比較
興味深いことに、小麦cDNAの予測されるアミノ酸配列と麦芽L-イソアスパルチ
ル・メチルトランスフェラーゼのペプチドフラグメントの配列との間の12部位に
矛盾が見られる(図15)。これらの位置の内の6カ所では、実験により決定され
たアミノ酸配列のデータが明確にcDNAによりコードされていないアミノ酸の存在
を示している。他の6カ所の位置では、コードされた残基に加えて他の残基がエ
ドマン分解により同定される。これらの結果はこの種の小麦の6倍体の性質と一
致する。その場合、その3個の二倍体ゲノム(AABBDD)は様々な配列を有する対立
遺伝子を含むことができ、様々な遺伝子生成物の産生をもたらす(Peumans,et a
l.,(1982)Planta 154,562-567およびWright,et al.(1989)J.Mol.Evol.28
,327-336)。アミノ酸の変化のほとんどはメチルトランスフェラーゼの間に共有
される3つの高度に保存された領域の外側に位置する。これらのアミノ酸の相違
はわずかに異なるメチル受容体の特異性を有する酵素をもたらし、それが細胞に
広い範囲の損傷タンパク質を認識させ潜在的に修復する能力を与えるだろうと推
測することは興味深いことである。ヒトのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の多
形性も同定された(Ingrosso,et al.(1989)J.Biol.Chem.264,20131/20139
およびMaclaren,et al.(1992)Biochem.Biophys.Res Commun,185,277-283)
。
単離された組換え麦芽L-イソアスパルチルタンパク質メチルトランスフェラーゼ
の製造
メチルトランスフェラーゼcDNA挿入物はヒトの酵素について説明されるように
周知の原核生物の発現ベクターに挿入され、コンピテント大腸菌を形質転換し、
その後でIPTGを用いてT7ポリメラーゼ遺伝子を誘発するために使用される。植物
酵素の発現はヒトの酵素と正確に同じ方法で行うことができる。細菌の発現系は
それらの系統発生の起源とは関わり無くcDNA配列を発現するように設計されてい
る。発現された組換えタンパク質はすでに述べたように精製される。
L-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼの応用
メチルトランスフェラーゼはペプチドとタンパク質の典型的でないL-イソアス
パルチルおよびD-アスパルチル残基のS-アデノシルメチオニン依存性メチル化に
触媒作用を及ぼす。この反応は老化しストレスを与えられたタンパク質の変性残
基の存在を検出する分析的道具として使用されるばかりでなく、これらの残基を
正常なL-アスパルチル残基へ変換することのできる非酵素経路を開始することが
できる。
本発明のメチルトランスフェラーゼ酵素は、前述の引例によりここに組み入れ
た米国特許第5,273,886号明細書に開示されているようにペプチドのL-イソアス
パルテートおよびD-アスパルチル残基の測定に関連して使用できる。要するに、
この方法は、タンパク質分解酵素を使ってポリペプチドをフラグメントに分解し
、次にフラグメントの中のイソアスパルチル残基をメチルトランスフェラーゼ酵
素を使って定量的にメチル化することからなる。フラグメントに導入されたメチ
ル基の合計量はポリペプチドのイソアスパルチル残基の量を示す。ポリペプチド
のイソアスパルチル残基の量は、例えば治療に使用したようなタンパク質の損傷
量の指標として使用できる。
興味深いことに、組換え酵素の構造はN-末端アラニン残基のヒトの赤血球由来
の精製酵素の構造とは異なり、エレクトロスプレー質量分析法により測定される
ように、組換え酵素は共有結合による翻訳後の修正を含まない。従って、この酵
素は抗原性の潜在的問題を引き起こすこともなくヒトの研究に使用するのに適し
ている。内生のヒトのメチルトランスフェラーゼは細胞質ゾルに限定されている
ので(Clarke、S.(1985)Annu Rev Biochem 54:479-506)、細胞外の環境で損傷し
たタンパク質はこの酵素により触媒作用を受けて修復され得ない。従って、メチ
ルトランスフェラーゼおよびその基質であるS-アデノシルメチオニンを使う注射
可能で局所的な治療製剤が有用である。組換えヒト酵素は抗原性の潜在的問題を
抱えていないので、直接脳や目や血液などの中に注入できる。さらに、精製され
た植物の酵素はペプチドおよびタンパク質の損傷を受けたイソアスパルチル残基
を認識するので局所的製剤としてスキンケア製品に使用できる。
組織中で前記L-イソアスパルチル/D-アスパルチル残基をL-アスパルチル残基
へ変換するだけの十分な量のメチルトランスフェラーゼを好ましくはその基質の
S-アデノシルメチオニンと共に投与することにより、組織中のポリペプチドのL-
イソアスパルチル/D-アスパルチル残基の増加に関連する医療状態のための治療
が行われる。このような医療状態としては、マトリックスのタンパク質の架橋結
合および例えば白内障、アルツハイマー病等の皮膚の組織の柔軟性の低下から起
こるものが挙げられる。この目的のために、ヒトまたは植物の酵素が使用でき、
酵素の投与量は製剤中の酵素の濃度が好ましくは0.4〜40μMの範囲となるように
決められる。この酵素はS-アデノシルメチオニンと医薬的に許容可能な担体を使
って軟膏の形態に簡単に調合できる。典型的な軟膏は酵素を0.001〜10重量%お
よびS-アデノシルメチオニンを0.00004〜0.4重量%含有することができる。
他の医療状態としては、脳の組織にプラークを形成することおよび脳の組織の
細胞機能の低下が挙げられ、これらの目的のために、ヒトの酵素が好ましくは細
胞外の空間の酵素の濃度が0.4〜40μMの範囲となるような量で使用される。脳に
投与するために、酵素は医薬的に許容可能な担体中に0.001〜10重量%の酵素お
よび0.00004〜0.4重量%のS-アデノシルメチオニンを典型的には含有する注射溶
液として提供される。予備的な証拠は、L-イソアスパルチルおよびD-アスパルチ
ル残基はアルツハイマー病のアミロイドタンパク質に蓄積できることを示唆して
いる。βアミロイドタンパク質の画分は脳脊髄液(CSF)中に認められるので、こ
の酵素を脳脊髄液中に注入することによりアルツハイマー病を治療することも可
能かもしれない。
別の医療状態は血管系の柔軟性の低下であり、このためにヒトの酵素は好まし
くは赤血球、内皮組織、心臓の動脈組織、免疫細胞、全ての細胞または肺の受容
体における酵素の濃度が0.4〜40μMの範囲であるような量で使用される。血管系
については、酵素は医薬的に許容可能な担体中に0.001〜10重量%の酵素および0
.00004〜0.4重量%のS-アデノシルメチオニンを典型的には含有する注射溶液と
して提供される。溶液はカテーテルまたは直接注入により投与できる。
他の医療状態は卵および/または精液に関する不妊および組織の繊維形成が挙
げられ、これらの目的のために、ヒトの酵素が好ましくは卵または精子の細胞の
酵素の濃度が0.4〜40μMの範囲であるような量で使用される。血管系については
、酵素は医薬的に許容可能な担体中に0.001〜10重量%の酵素および0.00004〜0.
4重量%のS-アデノシルメチオニンを典型的には含有する注射溶液として提供さ
れ
る。
L-イソアスパルチルおよびD-アスパルチル残基は正確にメチルトランスフェラ
ーゼにより認識されるので、製薬ポリペプチド中のこれらの損傷された残基の存
在を測定することは可能であり、その結果このようなタンパク質生成物の純度お
よび貯蔵寿命を確認できる。これらの分析は製薬をS-アデノシル(14C-メチル)
メチオニンと共に精製メチルトランスフェラーゼの存在下でインキュベートし、
製薬に転移した放射活性を測定することにより実施される。これは反応生成物を
アルカリ溶液と共にインキュベートし、結合したメチルエステルを放射性メタノ
ールとして遊離させ、次いでこれは(Lowenson,et al.(1991)J.Biol Chem.26
6:19396-19406)に説明されているようにシンチレーション流体中に集められる。
さらに、L-イソアスパルチルおよびD-アスパルチル残基が蓄積する病状の診断
は、プローブとしてメチルトランスフェラーゼを使って、病気に関連のあるタン
パク質に蓄積されたL-イソアスパルチルおよびD-アスパルチル残基の含有量を測
定することにより実施される。β-アミロイドタンパク質の画分は骨髄液(CSF)に
認められるので、骨髄液の試料中のL-イソアスパルチルおよびD-アスパルチル残
基の含有量を測定することによりアルツハイマー病の診断テストを開発すること
が可能である。数百万のアメリカ人を無能力にしているこの病気の正確な診断を
することがこれまでは不可能であった。診断テストはタンパク質の製薬品質制御
に関する前述の同じ分析法を使って達成される。実験1:ヒトのメチルトランスフェラーゼコード領域のヌクレオチド配列
cDNAライブラリー合成とクローンスクリーニング
2歳の女性のヒトの脳の側頭皮質から構築されたcDNAライブラリーはStra
tagene(#935205)から購入した。このcDNAは、オリゴ-dTで単離されたmR
NAから合成され、ラムダZAPバクテリオファージ・ベクターのEcoRI部位
に挿入された(Stratagene)。ライブラリーは大腸菌BB4において増殖され、そ
れぞれ5x105のプラークを含有する22のプレート(1.1x107プラーク合計)が15
80bpネズミメチルトランスフェラーゼcDNAのコード領域由来の放射性同位元
素を使って標識した768bp HaeIIIフラグメントを使ってスクリーニングされた
(Romanik,et al.(1992)Gene,118:217-222)。フラグメントはPRIME-I
Tランダムプライミングキットで109cpm/μgの比活性に(α32P)-dCTPを用
いてラベルされた(Stratagene)。標準的なプラークリフト及びサザーンブロッ
ト法(Sambrook,et al(1989)分子クローニング:A Laboratory Manual,2nd
Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory)で3個の陽性体を得た。これらのプ
ラークのクローンはその後のスクリーニングにより単離された。クローンはλZ
APプロトコルによる生体内切り出しによりXL1−ブルー細胞のプラスミドに
再挿入された。切り出しの成功はアンピシリン耐性により示された。問題の挿入
物を担持するプラスミドを含む細胞はLB/アンピシリン培地において生育し、
そのプラスミドはQiagenプラスミド単離カラムを使って単離精製された。
ヌクレオチド配列決定および分析
クローンのヌクレオチド配列はジデオキシ鎖-停止法(Sanger,et al.(1977)P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467)によりSequenase2.0キット(USB),M1
3およびT7ユニバーサルプライマー、および合成された22merプライマーを使って
両方のストランド上で決定された。配列データはマッキントッシュコンピュータ
を使ってDNAStarプログラムで分析された。
1.1x107プラークのうちの3つのクローンは陽性を与え、単離された。クロー
ン(pDM2(配列番号9)およびpRK1(配列番号10))の2つの配列は両方のストランド
から決定された。プラスミドpDM2はジーンバンクから受入番号S37495として入手
できる。配列番号3,4,9において、コードされたメチオニンは0の番号がつけら
れ、次の酸のアラニンは1と番号付けされる。これは最初のメチオニンの切除に
より最終タンパク質の番号付けに適合するために行われる。両方のクローンとも
番号はこれらの位置で始まる。クローンpRK1は358の位置で始まる。その分かれ
目の番号の左の番号はpDM2を表す。その番号の右の番号はpRK1に対するもので
ある。pDM2のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列は(a)で示され
、(b)へ続く。(b)はクローンpRK1に発見された47塩基挿入物を表す。実験2:大腸菌におけるヒトのメチルトランスフェラーゼ発現
発現ベクターpDM2xの構築
pDM2プラスミドはT7プロモーター部位と酵素の開始コドンとの間の領域を強力
なリボソゾーム結合部位を含む合成フラグメントで置き換えることにより修飾さ
れて過剰発現ペクターpDM2xを生成する(図1〜3)。
細菌の成長
大腸菌株DH5α(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)はプラスミド構築物の
クローニングと増殖のために使用された。大腸菌の形質転換はCjhung,et al
.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:2172-519)により説明された1工
程の方法により達成された。タンパク質の発現のために、大腸菌株BL21(DE3
)(Studier,et al.J.Mol.Biol.(1986)189:113-130)がpDM2x発現プラ
スミドで形質転換された。pDM2xプラスミドを含むBL21(DE3)細菌は100μg
/mlのアンピシリンを含有するルリア・ベルトラニ(LB)肉汁(Sambrook,et
al."Molecular cloning: a laboratory manual,"(1989)Cold Spring Harbo
r Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)培地において37℃で培養された。
タンパク質濃度測定
粗製抽出物のタンパク質濃度はウシ血清アルブミンを基準として使用してトリ
クロロ酢酸ロウリー法(Chang,Y.C.(1992)Anal Biochem.205:22-26)により
測定された。カラム画分のタンパク質濃度は280 nmで光学密度を測定し、タン
パク質の混合物の1.0mg/mlの濃度(Sambrook,et al.(1989)"Molecular cloning
: a laboratory manual"Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring H
arbor,N.Y.)または均質なメチルトランスフェラーゼ(Mach,et al,Anal.B
iochem.(1992)200:74-80)の1.12mg/mlの濃度に1の吸光度が等しいとして測定
された。
メチルトランスフェラーゼ分析
活性なメチルトランスフェラーゼの濃度は蒸気拡散分析(vapor diffusion as
say)を使ってメチル受容体卵白アルブミン上で塩基に対して不安定なメチルエ
ステル形成を測定することにより決定された(Gilbert,et al.Biochemistry
(1988)27:5227-5233)。50μLの反応混合物の最終濃度は10μMのS-アデノシル
ーL-(メチル-14C)メチオニン(53 mCi/ミリモル、100 cpm/pmol、ICN
Biomedicals,Irvine,CA),40 mg/mlの鶏の卵白(画分V、Sigma,St.
Luouls,MO),および0.2Mのクエン酸ナトリウム、pH6.0であった。インキュ
ベーションが37℃で30分間にわたり行われ、等しい容量の(50μL)の0.2 N
のNaOH,1.0%(w/v)SDSを加えることにより反応を終了させた。この混合物
はアコーディオンプリーツのように予め畳まれた厚い濾紙の1cm×9cmの一片の上
に班点状にシミをつけて、6mlのSafety-Solveカウンティングフローを含有す
る20mlのプラスチックシンチレーション小瓶の首部に入れられた(No.111177,
Research Products International)。この小瓶は蓋をして、23℃で2時間の
インキュベーションをした後で、濾紙挿入物は除去され、再び小瓶の蓋を閉めた
。ワイド14Cチャンネルで放射活性を測定した。SDS-PAGEにより測定され
たように、いったん均質になるまで精製されたので、メチルトランスフェラーゼ
の比活性が測定された(37℃で10,000 pmoles/分/mg)。この値は酵素活性測
定値からメチルトランスフェラーゼの質量を決定するために使用された。
メチルトランスフェラーゼ発現
発現プラスミドpDM2xを含む大腸菌株BL21(DE3)の1リットルの培養基10個を10
0μg/mlのアンピシリンを含有するルリア・ベルトラニ(LB)肉汁で37℃にて
、250rpmで振盪しながら培養し、600nmでの光学密度0.5とする。次に、酵素の発
現が50μMにIPTGを加えることにより誘導された。細胞の成長は600nmでの光学
密度が1.6で成長が飽和に達するまで4時間以上続けられた。細胞は4℃で15分間
、5,000gで遠心分離により収穫され、14gの湿った重量ペレットを得た。ここか
らカラム分画までの全ての操作は4℃で行われた。
発現のためのIPTGの最適濃度を決定するために、対数期発現培養基は広い濃度
範囲のIPTGで誘導され、メチルトランスフェラーゼ濃度について分析された。図
4はメチルトランスフェラーゼの発現を誘導するためにきわめて少ない量(0.03m
M)のIPTGしか必要としないことを示している。図4では、100μg/mlのアンピシ
リンを含有する37℃のルリア・ベルトラニ(LB)肉汁の1リットル溶液にpDM2
xメチルトランスフェラーゼ発現プラスミドを収容するBL21(DE3)大腸菌が接種さ
れ、600nmで0.2の光学密度まで培養された。培養基は4つの等しい容量(各250m
l)に分割され、最終濃度は0、0.03mM、0.5mM、048.00mMのイソプロピルβ-D-
チオガラクトピラノシドとした。37℃で激しく振盪し続け、試料は3時間にわた
り集められた。各試料は氷の上に置かれ、細胞は低速の遠心分離によりペレット
化された。ペレット化された細胞は緩衝液Aに再び懸濁され、超音波処理され、
そしてメチルトランスフェラーゼ活性について分析された。可溶性タンパク質の
濃度は改変ロウリー分析により決定された。10,000pモル/分/mgの比活性が使
用されメチルトランスフェラーゼ濃度を計算した。重要なことであるが、メチル
トランスフェラーゼは完全な活性の形態で総可溶性タンパク質の20%に達する
ことが発見され、SDS-PAGEにより測定されたように、メチルトランスフェラーゼ
ポリペプチドは通常封入体が見られる非可溶性画分に認められなかった。
次に、50μMのIPTGの濃度を使って、メチルトランスフェラーゼ生成のさらに
広い分析が実施された。図5のデータは、酵素の生成は対数期成長期間に急速に
発生し、その結果メチルトランスフェラーゼの蓄積量が増加する結果となること
を示している。図5では、pDM2xを含有するBL21(DE3)細胞が1リットルの
ルリア・ベルトラニ(LB)肉汁において250rpmで振盪しながら37℃で培養され
た。発現はIPTGを50μMに加えることにより時間0で開始した。可溶性タンパク
質およびメチルトランスフェラーゼは図4に示される時間に関して分析された。
細胞の成長の速度が低下し始めたときだけ、可溶性タンパク質画分中のメチルト
ランスフェラーゼの画分の濃度が低下した。実験3:ヒトメチルトランスフェラーゼ精製
メチルトランスフェラーゼ精製
緩衝液Aは全ての調製物に使用され、5mMの燐酸ナトリウムを含有し、pH8.0で
あり、5mMのEDTA、25μMのフッ化フェニルメタンスルフォニル(PMSF)、0.1mMの
ジチオスレイトール(DTT)、および10%V/Vのグリセロールを含有した。
細胞ペレット(14g)は200mlの緩衝液Aに4℃で懸濁された。細菌の細胞がマイ
クロチッププローブを備えたBranson W-350ソニファイヤを使って連続出力で電
力レベル5で2分間にわたり超音波処理により溶解された。超音波処理は氷水の
スラリー浴において冷却された500ml入りビーカーで、熱を放散させ、完全に混
合されるように行われた。これらの超音波処理の設定は、試料が様々な電力レベ
ルで、様々な時間で溶解され、メチルトランスフェラーゼ活性により酵素含有量
について分析された予備実験で最適化された。細胞の破壊は電力レベル3で始ま
り、酵素の活性はレベル7で減少し始めたが、多分加熱のせいであろう。溶解さ
れた細胞は13,000gで15分間遠心分離に掛けられ、上清を保存した。200mlの緩
衝液Aはペレット化された破片に加えられ、この材料は再び超音波処理され、ペ
レット化されその上清が保存された。この2つの抽出物の上清は混合され、最終
容量390mlを得た。
混合された上清画分へ硫酸プロタミン(4%w/v硫酸プロタミン溶液を0.1容量(3
9ml)(グレードX,シグマ))をゆっくりと加えて4℃で混合することにより核
酸を沈殿させた。30分間混合した後、溶液を15分間13,000gで遠心分離した。
メチルトランスフェラーゼを濃縮し、さらに固体の硫酸アンモニウムを60%(167
g)の飽和状態になるまで4℃でゆっくりと加え、30分間混合し、15分間13,0
00gで遠心分離することにより精製した(Scopes,R.K.(1993)"Proteinpur
ification: orinciples and proctice,"Springer-Verlag,New York)。次の
アニオン交換カラム精製用に硫酸アンモニウムを除去するために、そのタンパク
質ペレットを18mlの緩衝液Aに再び懸濁し、3500分子量カットの透析膜(Spectr
apor3,Spectrum)に入れ、12時間毎に緩衝液Aを1リットルずつ変えて3回透
析した。
最終精製工程は非平衡条件下で室温でDEAEセルロースクロマトグラフィを使っ
た。高さ14.7cm×I.D.2.5cmのDE-52(Whatman)カラムは、溶離液のpHを測定する
ことにより決定されるように、緩衝液Aで流速2ml/分で平衡状態に保たれた。試
料を充填する準備のために、カラムは最終濃度1MとなるまでNaClを加えた緩衝液
Aで流速2ml/分で1時間にわたり洗浄され、最後にNaClの加えられていない緩
衝液Aで6時間にわたり洗浄された。次に、透析された硫酸アンモニウム調製液
の3mlがカラムに充填され、緩衝液Aで2ml/分で2時間にわたり洗浄された。こ
の時点でカラムに結合された物質は1MのNaCl緩衝液Aで洗浄することにより溶離
された。2分(4ml)の画分が集められた。
Audree Fowler博士によるエドマンタンパク質配列決定がUCLA Prote
in Microsequencing FacilityでPorton2909Eシークエンサーを使って行われ
た。エレクトロンスプレー質量分析法が、UCLA Molecular and Medical
Sciences Mass Spectroscopy FacilityでKen Coklin博士およびKym
Faull博士によりPerkin-Elmer Sciex AP13装置を使って実施された。紫外
線および可視光線の分光法がHawlett Packard 8452Aダイオード分析分光計で
実施された。
溶離された細菌の抽出物においてメチルトランスフェラーゼ画分を増やすため
にここで使用される最初のバッチ式精製工程はFu,et al.の使用した方法を修
正したものである(Fu,et al.(1991)J.Biol Chem.266:14562/14572)。超音波
処理により過剰発現の細菌を溶解した後、細胞の破片は遠心分離により除去され
た。上清に残っている核酸は沈殿剤の硫酸プロタミンの添加により遠心分離によ
り除去された。硫酸プロタミンの必要量は最適化され、硫酸プロタミンの4%溶液
の0.1容量を加えることにより本質的に定量的な収量で2.4倍の精製物が得られた
(図6、表1)。図6において、4%w/v硫酸プロタミンの様々な容量を緩衝液
Aに加えたものがピペットで1.0mlの遠心分離で透明にされた超音波処理済みの
上清に加えられ撹拌された。核酸および他の破片は15分間13,000gで沈殿させ
た。上澄み液は図4に示されるように総タンパク質とメチルトランスフェラーゼ
を求めて分析された。次に、メチルトランスフェラーゼは硫酸アンモニウムで沈
殿させることによりさらに濃縮精製された。また、この工程の条件が予備実験で
最適化された。様々な割合の硫酸アンモニウム飽和により沈殿されたタンパク質
とメチルトランスフェラーゼの合計の量が図7に示されている。図7において、
固形の硫酸アンモニウムが1.0mlの試料に加えられ、表示された割合の飽和状態
にして、振動する台の上で30分間4℃で混合された。タンパク質は15分間13,
000gの遠心分離によりペレット化された。ペレット化されたタンパク質は最初の
容量の緩衝液Aに再び懸濁され図4に示されるようにタンパク質とメチルトラン
スフェラーゼの合計について分析された。最高の精製は50%から55%までの
飽和で得られたが、収量と精製との最高の妥協点は60%の飽和で得られ、これら
の条件は現在の大規模な精製で使用された(表1)。ペレット化されたタンパク
質は次に少量の緩衝液Aに再び懸濁され緩衝液Aに対して透析され硫酸アンモニ
ウムを除去した。
DEAEセルロースアニオン交換クロマトグラフィを使うことにより透析液か
らメチルトランスフェラーゼを精製するための迅速1工程カラム方法が開発され
た。酵素が非相互作用カチオン緩衝液においてカラムに結合された従来の方法を
適用すると精製は不完全であることは判明した。しかし、非平衡条件下で相互作
用するアニオン緩衝液を使用すると、均質な酵素の非勾配溶離が得られることが
判明した(図8)。図8において、タンパク質濃度は280nmで光学密度を測定す
ることにより決定された。電子泳動は12%Duracryl(Millipore)分離ゲルを使
うLaemmli緩衝方式(Laemmli,U.K.(1970)Nature 227:680-5)を使って実施
された。ポリペプチドは迅速銀着色により視覚化された(Blum,et al.(1987
)Electrophoresis 8:93:99)。分画は2つのミニゲルで分析された。すなわち、
ゲル1番では1μLのソニケートとロード、分画10-21を10μL;およびゲル2
番では15μLのLMWS/100、10μLの画分22-25,27、29、31、33、35、1μL
の画分76-80が分析された。これらの条件下では、メチルトランスフェラーゼは
画分18の中央に集められた狭いスパイクの酵素として溶離し、画分21-40から
はさらに幅の広いピークとして溶離する。これらの2つのピークにおけるメチル
トランスフェラーゼは同じように見える。両方のピークはSDSゲル分析におい
て主要な25kDaポリペプチドにより特徴付けられる(図9)。図9において、精
製された酵素の1ml画分は表示されたpH値で20mMのクエン酸ナトリウムに対し
て透析され、Centricon-10ミクロ濃縮装置(Amicon,Beverly,MA)を使って
限外濾過により濃縮された。最初のピークは他のポリペプチドによる低いレベル
の夾雑(画分18について5%未満)を示すが、第二の幅の広いピークは他のタ
ンパク質の夾雑を全く示していない。メチルトランスフェラーゼの比活性は両方
のピークでは同じであり、質量分析法によるそれらの重量も同じである(下記参
照)。これらのピークの部分的分離はタンパク質の充填量ばかりでなくクロマト
グラフィの非平衡的性質に因るようである。例えば、透析液の量を減らすとたっ
た1本の幅の広いピークの均質な酵素がさらに空隙容量から溶離する結果をもた
らし、透析液の量を増やすとさらに高濃度の酵素(夾雑ポリペプチドが少ない)
を示す狭いピ
ークが画分18の近くで得られる(結果は示されていない)。もしカラムが充填
前に完全に平衡状態にあるクロマトグラフィが実施されるなら、メチルトランス
フェラーゼは僅かに遅れて、少量の夾雑ポリペプチドと共に空隙容量の近くに溶
離する。
表1は均質なメチルトランスフェラーゼを大量に得る場合の精製工程をまとめ
ている。表1によると、硫酸アンモニウム沈殿工程の間に収量の損失が最も大き
い。この理由は分からない。総合的に、非活性10,000pモル/分/mgで、1.7リッ
トルの最初の肉汁培養基のそれぞれから17mgの酵素が得られたが、精製されたヒ
トの赤血球酵素について発見されたものに匹敵する(Gilbert,et al,(1988)
Biochemlstry 27:5227-5233,Ingrosso,et al.(1989) J.Biol.Chem
.264:20130-20139)。この調製液において、カラムクロマトグラフィ工程は合計
の調製液のたった6分の1だけ使用して実施された(表1)。DEAEセルロー
スクロマトグラフィのサイクルは繰り返し使用され、容易に追加の均質な酵素を
生成する。
精製された組換え酵素は室温で2カ月間まで安定であり、冷凍と解凍のサイク
ルを繰り返しても活性に何の影響もない。さらに、メチルトランスフェラーゼは
活性を失うことなく50℃で30分まで加熱できる。
酵素濃度
酵素の濃縮された形態を入手できることは、X線構造決定を含むいくつかの用
途にとって重要である。メチルトランスフェラーゼの好結果をもたらす濃度は全
くのところpH次第で決められることが判明した。典型的なタンパク質溶解特性
(Scopes,R.K.(1993)"Protein purification: Principies and prac
tice,"Springer-Verlag,New York.)に反して、この酵素の濃縮はその等電
点5.9pH単位の近くで極めて容易に起こった(図8)。
精製された組換えメチルトランスフェラーゼの特徴
精製されたメチルトランスフェラーゼのN-末端配列は自動化されたエドマン
分解分析により行われた。最初の20の残基の実験で決められた配列はヒトの酵
素に認められるようにイニシエーターのメチオニンの除去と共にcDNAから予
測された通りのものであった(Ingrosso,et al.(1989)J.Biol.Chem.2
64:20131-20139)(表2)。例えば、ヒトの酵素に存在するアセチル化アラニン残
基などのようなブロックされたアミノ末端については全く証拠は認められなかっ
た(Ingrosso,et al.(1989)J.Biol.Chem.264:20131-20139)。
精製された酵素の分子量はエレクトロンスプレー質量分析法により24,551±3D
aで測定された(図10(A))。図10(A)では、精製された物質のスペクトルの一部
が緩衝液Aの還元剤としてジチオスレイトールを使ってすでに説明されたことが
示されている。他の分子量では他のピークは認められなかった。この平均値はcD
NA配列によりコードされた修飾されなかった生成物の24,551Daの予測値に正確に
一致した。還元剤としてジチオスレイトールの代わりにβ-メルカプトエタノー
ルを使って行う精製での予備的な試みにより、それぞれ24,627および24,702Daの
高分子量で2個の付加的な小さい方の形により表示されるようなβ-メルカプト
エタノールの1または2付加物を有する酵素が得られた(図10(B))。図10(B)で
は、15mMのβ-メルカプトエタノールが緩衝液Aの0.1mMのジチオスレイトールの
代わりに使用される場合に精製された物質のスペクトルの一部を示す。質量24,6
27でのピークは1個のβメルカプトエタノール分子を有する付加物を表し、24,7
04での小さいピークは2個のβメルカプトエタノール分子を有する付加物を表す
。
トリプシンおよびシアノゲンの臭化物フラグメントのオンライン液体クロマト
グラフィエレクトロスプレー質量スペクトル分析によりタンパク質生成物の構造
が直接確認された。残基37-143に対応する非可溶性疎水性核を除外して、全ての
検出された種の質量は予測されたフラグメントに対応した。
均質なメチルトランスフェラーゼの直接分光光度濃度測定について、アミノ酸
組成から、1A280nmに対し1.12mg/ml(Mach,et al.(1992)Anal.Biochem.
200:74-80)という酵素の吸光係数が計算された。この値はウシ血清アルブミンを
基準として使用するトリクロロ酢酸-ロウリー法により確かめられた(Chang.(19
92)Anal.Biochem.205:22・26)。DEAEカラム(図8)からの画分29の均質な
メチルトランスフェラーゼの紫外線スペクトルは図11に示される。
実験4:植物中のメチルトランスフェラーゼの同定
生物学的材料
新鮮なニンジン、イエローコーン、ロマインレタス、グリーンピース、ホワイ
トポテト、ホウレンソウ、チェリートマト、アルファファは地方の販売店で購入
された。アルファファの種子および生の麦芽はRainbow Acres,Inc.(Los
Angeles,CA)から入手したが、大豆の種子はArrowhead Mills,Inc,(He
reford,TX)から入手した。ウィンターフィート(Triticium aestivum cultiva
r Augusta)の種子はウイスコンシン大学(Madison,WI)のRobert Forsberg
博士により提供された。Danver Half Longニンジンの種子、Golden Jubile
eコーンの種子、ロマインレタスの種子、シュガースナップピーの種子、ニュー
ジランドホウレンソウの
種子およびボニー・ベストトマトの種子はChas.H.Lily Co.(Portland,OR
)から入手した。Chlamydomonas reinhardtii(Wt株2137)の細胞質ゾル画分は
ロスアンジェルスにあるカリフォルニア大学のGregg Howe博士およびSabeeh
a Merchant博士により提供された(Howe & Merchant,1992).
植物細胞質ゾルの調製
粗製の細胞質ゾルは植物組織から乳鉢と乳棒を使ってホモジェネートすること
により抽出された。冷やされた乳鉢において、液体窒素が植物組織(典型的に、
20gの新鮮な組織または5gの種子)の上に注入され、組織を完全に冷凍した。ホ
モジェネートする際に組織から潜在的に放出された望ましくないポリフェノール
オキシダーゼを除去するために、3gの水和化したPVPP(ポリヴィニルーポリピッ
ロリドン)(Loomis,et al.(1966)Phytochemistry 5,423-438)が冷凍された組
織と十分に混合されてから、乳棒で粉砕された。抽出緩衝液(20mLの100mMのHEPE
S、pH:7.5,10mMの2-メルカプトエタノール、1μmのロイペプチン、1mMのPMSF
、10mMのナトリウムハイドロサルファイト、および10mMのメタ亜硫酸水素ナトリ
ウム,4℃)が乳鉢に加えられ、スラリーはさらにすりつぶされた。得られた粗製
のホモジェネートは4層のチーズクロスで漉して、次に2200gで30分間4℃で
遠心分離し、非可溶性PVPPとすり潰されなかった植物材料を除去した。得られた
上澄み液はさらに172200xgで50分間4℃で遠心分離し、次に2層のミラクロスM
iracloth(Calbiochem,San Diego,CA)で濾過し浮かんでいる脂質層を除去した
。この分画は粗製細胞質ゾルとして同定され、80℃で貯蔵され、メチルトランス
フェラーゼ源として利用された。
メチル化分析
メチルトランスフェラーゼ活性は蒸気相拡散分析を使って同定されたが、この
分析は、塩基に対して不安定なメチルエステルの加水分解から得られた(14C)メ
タノールの遊離を定量することにより、ペプチド基質へS-アデノシル-L-(メチ
ル-14C)メチオニンから転移された放射性同位元素を使って標識されたメチル基
の数を定量する。合計反応容量40μLにおいて、12μLの酵素調製液が10μMのS
-アデノシル-L-(メチル-14C)メチオニン(ICN Biomedicals,50mCi/mmol)、500
μMのペプチド基質および0.33MのHEPES、pH7.5と共にインキュベートされた。ペ
プチド基質、(VYP-(L-isoAsp)-HA(配列番号15),KASA-(L-isoAsp)-LAKY(配列番
号16),AA-(L-isoAsp)-F-NH2(配列番号17),VYG-(D-Asp)-PA(配列番号18),KASA
-(D-isoAsp)-LAKY(配列番号19))はUCLA Peptide Synthesis FacilityでJanis Yo
ung博士により合成され、先に説明したように特性評価された(Lowenson,et al
.(1991b)J.Biol.Chem.266,19396-19406(1992)J.Biol.Chem.267,5985-5995)
。さもなければ、麦芽のメチルトランスフェラーゼの精製中(下記参照)、試料
を最終濃度の0.2Mのクエン酸ナトリウム,pH6.0を含有する緩衝液中で分析した。
いずれの場合も、インキュベーションは60分間25℃で行われた。各反応は次に
40μLの0.2MのNaOHおよび1%(w/v)SDSで停止され、撹拌され、60μLの部分が1.5
×8cmのプリーツ状に畳まれた濾紙(Bio-Rad No.195-090)に班点状に塗布され、
5mLのBio-SafeII(RPI,Mount Prospect,IL)カウンティングフローを含有する20
mL入りのシンチレーション小瓶の首部に入れられた。小瓶の蓋をして、(14C)
メタノールを濾紙から蒸気相を経てフローへ拡散するにまかせたが、非揮発性の14
C放射能は濾紙上に残った。室温で2時間後に、濾紙は小瓶の首部から取り出
され、小瓶をカウントした。
タンパク質の決定
ロウリー法(Bailey(1967)Techniques in Protein Chemistry,Else
vler Publishing Co.,New York)の修正したものを使用して1mLの10%(w/v)
トリクロロ酢酸で沈殿させた後タンパク質の濃度を測定した。
植物中のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼの同定
被子植物と緑藻の両方の分類から選ばれた代表的なものにL-イソアスパルチル
・メチルトランスフェラーゼが存在するかについて調査した。粗製の細胞質ゾル
が様々なタイプの植物材料から単離され、L-イソアスパルチル含有ペプチド,V
YP-(isoAsp)-HA(配列番号15)を使ってメチルトランスフェラーゼ活性につ
いて分析されたが、これはヒトの赤血球のメチルトランスフェラーゼ(kM-0.29
μm;
lOWENSON & cLARKE,1991)にとって優れたペプチド基質であること
が明らかにされている。内生の細胞質ゾルのオリゴペプチドも潜在的なメチル受
容体である。従って、平行実験がペプチド基材の存在下および非存在下で行われ
た(表3)。ペプチド依存性のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼ
は緑藻C.reinhardtiiの植物細胞に認められ、植物界の少なくとも1種にその存
在が実証された。植物界において、メチルトランスフェラーゼ活性は被子植物の
2部類、単子葉と双子葉植物において検出された。様々な組織において活性のレ
ベルはかなり変動した。分析された種類の内、メチルトランスフェラーゼの最高
比活性は麦芽に見られた。対照的に、レタスの葉またはトマトの果実にはL-イソ
アスパルチルペプチド特異的メチルトランスフェラーゼ活性はほとんど検出でき
なかった。有意に、高レベルのメチルトランスフェラーゼ活性が分析された全て
の植物の種子に見られたが、例えば、トウモロコシ、アルファルファ、レタス、
マメ、ホウレンソウ、トマトばかりでなく、ニンジンやジャガイモの根にも見ら
れた。植物の種子の酵素の比活性(0.66-14.0 pモル/分/mg)は大腸菌(1-2.5 pモル
/分/mg;Fu,et al.,1991)およびヒトの赤血球(1.9-9.4pモル/分/mg;Ota,et
al,1988;Gilbert,et al.1988)に認められたレベルに匹敵する。
実験5:麦芽由来のメチルトランスフェラーゼの精製
酵素精製用の麦芽細胞質ゾルの調製
生の麦芽(150g)を750mlの緩衝液(20mMのホウ酸ナトリウム(pH9.3)、5mMのEDTA
、2.4mMの2-メルカプトエタノールおよび25mMのNaCl)に懸濁して、4℃で30分
間撹拌した。次に、スラリーを4層のチーズクロスで絞り、得られた粗製ホモジ
ェネート(585mL)を7000×gで60分間4℃で遠心分離し、膜と細胞残骸を除去し
た。上澄み液(520mL)を2層のミラクロスを通過させ、浮かんでいる脂質層を濾
過した。
麦芽由来のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼの精製
本発明の精製戦略はTrivedi他により報告されたタンパク質カルボキシル・メ
チルトランスフェラーゼの部分的精製に基づいている(Trivedi,et al.(1982)E
ur.J.Biochem.128,349-354)。図12を参照すると、粗製の麦芽細胞質ゾル
(515mL,30mgのタンパク質/mL)がDE-52(Whatman)カラム(直径9cm×樹脂の高さ
13cm,827mL)に充填されたが、これは予め4℃で緩衝液(20mLのホウ酸ナトリウム
(pH9.3),5mMのEDTA、2.4mMの2-メルカプトエタノール、および25mMのNaCl)で平
衡化された。2分画分が平均流速8-10mL/分で集められた。充填されたカラムは
1リットルの緩衝液で等しく洗浄され、次に上記緩衝液に25-200mMのNaClの6リ
ットルのグラディエントが導入された。タンパク質プロフィールおよびNaClグラ
ディエントは対応する分画においてそれぞれ280nmでの吸光度および伝導度を測
定することによりモニターされた。ペプチド基質としてVYP-(L-isoAsp)-HA(配列
番号15)を使用してL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼについて5
つ毎の分画を分析した。メチルトランスフェラーゼ活性の1つのピークはプール
され(分画80-110,600mL、括弧参照)そしてさらにKing(Biochemistry 11,367
-371)により説明されているように逆硫酸アンモニウムグラディエント可溶化に
より精製された。DE-52のプールされた物質のpHは20mLの1MのTris-HCl,pH7.97で
pH8.38に調整された。次に、15.62gのCelite545(Baker Analyzed Reagent,1
1gのCelite/1gのタンパク質)を室温で30分間にわたり撹拌しなから加えて80%
飽和(56.1gの硫酸アンモニウム/100mL開始容量)にした後で、さらに45
分間撹拌し続けた。このCelite混合物は沈殿された細胞質ゾルタンパク質を含有
しており、直径3cm×19cmカラムに注入され、室温で蠕動ポンプで充填された。
このカラムは0.05MのTris-HCl(pH7.98)を含有する150mL(約2カラム容量)の80
%飽和硫酸アンモニウム溶液で等しく洗浄され、硫酸アンモニウムの80%溶液から0
%へ減少する550mLの直線グラディエントで溶離された。グラディエントの流速
は約0.6mL/分であり、7.5分画分が集められた。対応する画分の硫酸アンモニウ
ムとタンパク質のパーセントはそれぞれ280nmでの導電率と吸光度により決定さ
れた。2つ毎の画分がペプチド基質としてVYP(L-isoAsp)-HA(配列番号15)を使っ
てL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼについて分析された。メチル
トランスフェラーゼの最高比活性を有する画分(65-74)はプールされ(95mL、括弧
参照)、次にSephacryl S-200(シグマ)ゲル濾過カラム(2cmの直径×77.5cm樹脂の
高さ、243mL)上で精製された。20mLのトリス-アセテート(pH7.0)、0.2mMのEDTA
、15mMの2-メルカプトエタノール、および10mMのNaClを含有する緩衝液が使用さ
れカラムを平衡化し4℃で行った。カラムの流速は0.12mL/分に維持され、30分画
分が集められた。2つ毎の画分がペプチド基質としてVYP-(L-isoAsp)-HAを使っ
てL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼについて分析された。280nm
での吸光度が測定されこれらの画分のタンパク質濃度が測定された。精製された
麦芽L-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼは1つまたは2つの画分に
おいて一定に溶離され、おおよそ134-139mLの画分容量に相当する(図12Cの矢印
参照)。
驚いたことに、L-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼは高度に精製
された状態でカラムの全容量にほぼ対応する分画において溶離した。Sephacryl
S-200ゲル濾過カラムから高度に精製された酵素調製液を得ることに成功したの
はこの異常な吸着現象によるものであった。
麦芽からL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼを総合的に精製する
ことは表4に纏められており、精製の各工程に対応する典型的なポリペプチド組
成物は図13に示されている。図13を参照すると、各精製工程からのメチルトラ
ンスフェラーゼを含有する活性分画はLaemmliにより説明された緩衝液系を使っ
てSDS-PAGEにより分析された(Laemmli(1970)Nature 227,600-685)。タンパ
ク質画分は試料緩衝液(180mLのTris-HCl(pH6.8)、6.0%(w/v)SDS、2.1Mの2-メル
カプトエタノール、35.5%(v/v)グリセロールおよび0.004%(w/v)ブロモフェノー
ル・ブルー)と2:1(v/v)の割合で混合し、3分間沸騰させた。これらの分画は12
.5%(w/v)アクリルアミド/0.43%(w/v)N,N-メチレンビスアクリルアミド分離ゲル
において電気泳動された。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。
分子質量基準(Bio-Rad)としては、ホスホリラーゼb(97kDa)、ウシ血清アルブミ
ン(66kDa)、卵白アルブミン(45kDa)、炭酸アンハイドラーゼ(31kDa)、大豆トリ
プシンインヒビター(21.5kDa)およびリソザイム(14kDa)が挙げられる。分析され
た試料は粗製麦芽ホモジェネート(レーンA)、濾過された粗製細胞質ゾル(レ
ーンB)、DEAE-セルロースカラムからの画分80-100(レーンC)、逆硫酸アン
モニウムグラディエント可溶化工程(レーンD)、およびSephacryl S-200カラ
ムからの画分39(レーンE)であった。メチルトランスフェラーゼポリペプチ
ド(MT)の位置は矢印で右に表示されている(図13)。
MONO Q アニオン交換クロマトグラフィ
いくつかのSephacryl S-200ゲル濾過カラムからのL-イソアスパルチルメ
チルトランスフェラーゼを含有する画分がプールされ、緩衝液Aで透析(Spect
ropor,カット3500Da)された。透析されたメチルトランスフェラーゼ(0.6mgの
タンパク質)が、緩衝液Aで予め平衡化されたMono Q HR5/5アニオン交換(
Pharmacia)カラム(直径5mm×50mm樹脂の高さ、1mL)で分画された。1分の
画分が流速0.5mL/分で集められた。充填されたカラムは等しく緩衝液Aで15
分間洗浄され、次に直線グラディエントの0-100%緩衝液B(20mMのトリ−アセ
テート(pH7.0)、0.2mMのEDTA、15Mmの2-メルカプトエタノール,10%グリ
セロール、および1Mの酢酸ナトリウム)が60分にわたり導入された。カラムの
溶出液が280nmでモニターされた。典型的には、メチルトランスフェラーゼ活性
は画分43-44において検出された。活性メチルトランスフェラーゼを含有する画
分はプールされ、酵素学的研究に使用された。
SDSポリアクリルアミドの平板ゲルの電子泳動により決定された主要ポリペ
プチドの計算された分子質量は28,000Daであった。このポリペプチドはClark(
Clarke(1981)Biochim.Biophys.Acta 670,195-202)により説明されたように
トリトンX-100の存在下で個々のゲルの薄切りを再生させることによりL-イソ
アスパルチル・メチルトランスフェラーゼに対応することが実証された。この調
製物の純度はクーマシー染色ゲルのデンシトメトリーにより86%であることが
評価された。残っている小さい方のポリペプチド夾雑物質はクロマトグラフィの
追加工程により除去できた。透析されたメチルトランスフェラーゼはMONO
Qアニオン交換カラムに充填され、0.1Mの酢酸ナトリウムの直線的グラディエ
ントで溶離された。活性メチルトランスフェラーゼは約0.5Mの酢酸ナトリウム
で溶離された。
実験6:精製された麦芽のメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列
逆相HPLC
配列分析に適する均質なメチルトランスフェラーゼはセファクリルS-200工程
により精製された酵素の逆相HPLC(高性能液体クロマトグラフィ)により得られ
た。分画は65%の溶媒Bで平衡化されたVydacC−4カラム(直径1cmx25c
m、300Åの細孔、5μmの球形シリカ支持体)上に充填され、65-80%の溶媒Bの
直線的グラディエントで45分にわたり3.0mL/分の流速で溶離されたが、溶媒Aは
0.1%トリフルオロ酢酸水溶液(w/v)であり、溶媒Bは99%メタノール/0.9%水に0.1
%トリフルオロ酢酸の溶液(w/v/v)である。カラムの放出流は1分の分画が集めら
れたので280nmでモニターされた。揮発性試薬が画分からSavanto Speedvac装置
で除去され、次にこれらの画分がSOS-PAGEに掛けられ、銀染色された(Jones(199
0)in Current Protocols in Molecular Biology Suppl.11,John Wiley and So
ns,New York)。麦芽メチルトランスフェラーゼは約40分で明白な分子質量28,
000Daを有する単一のポリペプチドのバンドとして溶離された。
トリプシンおよびStaphylococcus aureus V8プロテアーゼマッピングによるアミ
ノ酸配列決定
アミノ酸配列分析に適する均質なメチルトランスフェラーゼは前述のように逆
相HPLC分析により得られた。この物質はトリプシンとStaphylococcus aureus V8
プロテアーゼで消化され、得られたペプチドはVvdac C-18カラムを使って逆相HP
LCにより回収された。N-末端エドマン配列がこれらのペプチドについて実施され
た。得られた部分的ペプチド配列データはオリゴヌクレオチドのプローブを発生
させ、多形現象および/または多重遺伝子の存在を確認するために使用された(
下記の実験7参照)。実験7:麦のメチルトランスフェラーゼをコードするcDNA
合成オリゴヌクレオチド・プローブ
オリゴヌクレオチドのプローブは、ジーンアセンブラプラスDNA合成装置(
Pharmacia LKB Biotechnology)においてβ-シアノエチル N,N-ジイソプ
ロピルホスホラミダイト化学法を使って合成された。オリゴヌクレオチドはpBl
uescript SK±phagemidのT7プロモーター、T7(DMT-TAATACGACTCACTATAGGG)(
配列番号11)および3種類の縮重オリゴヌクレオチド、MB1[TCTGG(G/A)AT(G/A)TG
(C/T)TC(G/A)ATNCCCAT](配列番号12),EcoRIリンカー[CTCGAATTCTA(C/T)(C/T)T
NAA(G/A)CA(G/A)TA(C/T)GGNGT](配列番号13)を含むMB3、およびHindlIIリンカー
[TCAAAGCTTTT(G/A)TC(T/G/A)ATNAC(C/T)TGNAG](配列番号14)を含むMB4を表し、
麦のcDNAライブラリー(下記)のPCR増幅におけるプローブとしてまたプライマ
ーとして使用するために合成された。プライマーはBio-Spin6カラム(Bio-Rad)
を使用するサイズ排除クロマトグラフィにより精製された。
麦由来のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼのcDNAクローンの単離
縮重オリゴヌクレオチドは部分的なアミノ酸配列データに基づいて合成され(
上記参照)、次に48時間黄化させた麦の苗から単離されたポリ(A)+RNAで
構成された麦cDNAライブラリーのメチルトランスフェラーゼcDNAの領域を
増幅するために使用された(Hatfield,et al.(1990)J.Biol.Chem.265,15813-
15817)。850bp PCR生成物は、メチルトランスフェラーゼcDNA(ペプチド
YLKOYGVに対応する)の5'の領域の核酸配列を表す384倍の縮重オリゴヌク
レオチド、MB3およびpBluescriptベクターのT7プロモーターを暗号化するプ
ライマーを使って増幅された。850-bpのPCR生成物の同定はメチルトランスフ
ェラーゼcDNA(ペプチドGIEHIPEに対応する)の中間領域の核酸配列を
表す64倍の縮重オリゴヌクレオチド、MB1を使うサザーン雑種形成により確認
された。pBluescriptベクター配列なしでメチルトランスフェラーゼcDNAを
含むPCR生成物を得るために、850-bpPCR生成物がMB3プライマーおよび
メチルトランスフェラーゼcDNA(ペプチドLOVIDKに対応する)の3'の領
域の核酸配列を表す288倍縮重オリゴヌクレオチドMB4とのPCR反応におい
て鋳型として使用された。PCR増幅はPCRジデオキシ鎖終止配列決定により
決定されたように、メチルトランスフェラーゼcDNA配列だけを含む600-bpフ
ラグメントを生成した。この600-bp生成物で麦cDNAライブラリーをスクリー
ニングしたところ、1個の陽性プラークを単離したが、これは大腸菌XL-1 pU
C19のpBluescript phagemidに戻し、pMBM1プラスミドを生成し、次に大腸
菌DH5a細胞を形質転換するために使用された。
麦からのL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼを暗号化する遺伝子の
DNA配列
プラスミドpMBM1の952-bpcDNA挿入物のDNA配列は図14に示される配列戦略を
使って決定された。図14を参照すると、麦のメチルトランスフェラーゼcDNa挿
入物(952-bpEcoRIフラグメント)を含むpMBM1クローンの両方のストランドはジ
デオキシ鎖終止配列決定により配列された。オリゴヌクレオチドは600-bpの麦の
メチルトランスフェラーゼcDNAを含むPCR生成物の配列を使って合成され、次に
この形の配列戦略に示されるように952-bpフラグメントを配列するためにプライ
マーとして使用された。メチルトランスフェラーゼcDNAのDNA配列およびその予
測アミノ酸配列はそれぞれ配列番号5および6に示される。配列番号5と6を参照し
て、プラスミドpMBM1の944bp挿入物のコーディングストランドの配列はcDNAライ
ブラリーに加えられた末端EcoRIリンカー(GGAATTCC)なしで示されている。690bp
メチルトランスフェラーゼcDNAは位置118のATGのコドンで始まり、位置808のTGA
コドンで終わる。690bpオープンリーディングフレームについて予測された230ア
ミノ酸ポリペプチドの計算された分子量は24,710である。それに対して、精製さ
れたメチルトランスフェラーゼはSDS-PAGEにより測定されたように、28,000Daポ
リペプチドとして移動した(図13)。実験8:配列決定されたペプチドフラグメントと予測された配列の比較
麦芽由来のL-イソアスパルチル・メチルトランスフェラーゼの配列決定されたペ
プチドフラグメントとそのpMBM1から予測されたアミノ酸配列
興味深いことに、麦のcDNAの予測されたアミノ酸配列と麦芽のL-イソアスパル
チル・メチルトランスフェラーゼのペプチドフラグメントの配列との間に、12部
位での不一致が発見された(図5)。図15を参照すると、トリプシン(T)お
よびS.aureusV8プロテアーゼ(V)での消化の後で、ペプチドは逆相HPLCによ
り回収され、自動化エドマン分解により配列決定された。溶離の順序で番号をつ
けられたフラグメントのペプチド配列は予測されたcDNA配列に比較して線により
示されている。空間の存在は、アミノ酸残基の明白な同定がこのサイクルでは行
われなかったことを示している。特別なサイクルで同定された別の残基は括弧で
上に示される。括弧の上の残基はこの位置でアミノ酸置換を示すが、そこではcD
NAがコードする残基については全く証拠は見つけられなかった。全体として、精
製された麦芽のアミノ酸配列は下記を除いて配列番号7に示されると考えられる
。位置41では、AはT8とV17に認められた;NはT9に認められた。位置52で
は、IはT8、V14,V17に認められた。位置54では、LだけがV17に認められた。
位置156では、AがT6とV8に認められた;VはT7とV9に認められた。これら
の位置の内6箇所において、実験で決定されたアミノ酸配列データは明確にcDNA
によりコードされないアミノ酸の存在を示している。他の6箇所の位置では、コ
ードされた残基の他に残基がエドマン配列により同定された。これらの結果はこ
の種の麦の六倍体の性質と一致する。すなわち、3つの二倍体のゲノム(AABBDD)
が様々な配列を有する対立遺伝子を有することができ、様々な遺伝子生成物を産
生できる(Peumans,et al.(1982)Planta 154,562-567; Wright,et al.(1989
)J.Mol.Evol.28,327-336)。アミノ酸の変化のほとんどはメチルトランスフ
ェラーゼの間で共有された高度に保存された領域の外側に位置する。これらのア
ミノ酸の相違はわずかに異なるメチル受容体の特異性を有する酵素をもたらすこ
とができ、それが細胞の広い範囲の損傷されたタンパク質を認識しもしかしたら
修復するかもしれない能力を与えると推測することは興味深いことである。本発
明の精製方法により、これらの酵素の変形体は同様に精製できる。実験9:メチルトランスフェラーゼを使う皮膚治療
精製されたメチルトランスフェラーゼ(植物源から単離されたものまたは細菌
で精製された組換えヒト酵素としてのいずれか)およびS-アデノシル-L-メチオ
ニンが混合され、グリセリンと鉱油を含有する水性クリームにおいてそれぞれ最
終濃度を0.01%および0.00004%とする。皮膚用クリームまたはヘアークリームは
、水、グリセリン、セチアリルアルコール、椰子油グリセリド、Ceteareth-20、
鉱油、ペトロラタム、ソルビトール、アボカド油、DMSO(または他の担体分子)
、ステアリン酸、アラントイン、スクアレン、メチルパラベン、Sodium Carbome
r 941、組換え体ヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチル・メチルトランスフェ
ラーゼ(または植物メチルトランスフェラーゼ)、プロピルパラベン、S-アデノ
シル-L-メチオニン、Quaternium-15、香料、FD&CイエロウNo.5およびFD&Cレッド
No.4を使って調合される。皮膚用ミスト("Methylmist")は水、グリセリン、セ
チ
アリルアルコール、DMSO(または他の担体分子)、クエン酸、組換え体ヒトL-イ
ソアスパルチル/D-アスパルチルメチルトランスフェラーゼ(または植物メチル
トランスフェラーゼ)、S-アデノシル-L-メチオニン、Quaternium-15、および香
料を使って調合された。経皮的な皮膚用パッチは上記皮膚用ミストと同じ成分を
使って調合される。これらの調合物は直接皮膚に塗布できる。皮膚を石けんと水
で洗浄した後で、メチルトランスフェラーゼ皮膚用クリーム(a)、ミスト(b)
、パッチ(c)をそれぞれ下記の用法により使用する:(a)少量(0.5ml)の粘着性
調合物を中心点に軽く塗り付け、ラテックスの手袋を使ってまたは使わないでお
よびまたはたとえばタオルおよびティシュ等を使ってまたは使わないで、手で直
接小さな円を描くように擦ることにより約100cm2の面積に拡げる:(b)粘着性の少
ない調合物("MethylMist")を使い、スプレー瓶または噴霧器を使って皮膚用クリ
ームについて上記説明のように皮膚に残留物が擦り込めるように噴霧する;およ
び(c)"MethylMist"と同じ調合物を使うが、皮膚に接着するパッチに包み込み、
薬剤がパッチの微少な細孔を経て直接皮膚に分配される。実験10:メチルトランスフェラーゼを使う他の医療治療
目の治療用の注射または局所用製剤(pH-7.3)(例えば、白内障予防薬)。脳の
注射薬(例えば、プラーク形成を予防)または血液流用注射薬(例えば、柔軟性
を維持)は137mMのNaCl、2.7mMのKCl,4.3mMのNa2HPO4・7H2O,1.4mMのKH2PO4、
25mMの組換えヒトL-イソアスパルチル/D-アスパルチル・メチルトランスフェラ
ーゼ(飽和)またはS-アデノシル-L-メチオニン濃度に適合する1-3μM、30μM
のS-アデノシルーメチオニン、および0.22μMの濾過殺菌剤を含有する。時間放
出分配方式については、注射薬は担体のリポゾームまたは微少孔の構造体に包装
することができる。これらの薬剤は直接目、脳または血流に注入できる。実験11:メチルトランスフェラーゼを使う診断
0.2Mのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)に希釈された脊髄液(0.01mL)の試料
は、同じ緩衝液にS-アデノシル-[14C-メチル]-L-メチオニン(100cpm/pモル)と精
製されたメチルトランスフェラーゼ(植物源またはヒト組換え体由来)とを溶解
した混合物0.03mLに混合される。後者の混合物は400pmolの放射性同位元素で識
別されたS-アデノシルメチオニンと10μgの精製されたメチルトランスフェラー
ゼを含有する。この混合物は37℃で15分間インキュベートされ、次に,0.04mL
の0.1%ドデシル硫酸ナトリウム溶液,0.2M水酸化ナトリウムが加えられる。この
混合物を次に1枚の厚い濾紙に塗布し,7mLの液体シンチレーション・カクテルを
含有するプラスチックの小瓶に釣り下げる。室温で2時間経過した後、濾紙を取
り出し、小瓶をカウントする。放射活性脊髄液の損傷されたL-イソアスパルチル
およびD-アスパルチル残基と比例している。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Manufacture and use of human and plant methyltransferases
background Field of the invention
The present invention relates to the production and use of methyltransferase. Further
Specifically, the present invention relates to recombinant human L-isoaspartyl / D-aspartyl protein.
Methyltransferase, plant L-isoaspartyl protein methyltra
And a purified plant L-isoaspa
Related to the production, purification and use of rutile protein methyltransferase
It is.Background of the Invention
Proteins gradually lose function due to spontaneous thermodynamic changes (Hardin
g, JJ (1985) Adv. Protein Chem.37: 247-334). Normal of such damage
Forms of non-enzymatic deamidation, isomerization of asparaginyl and aspartyl residues
(Clarke et al. (1992) "Stability of Protein Drugs, Part
A: Chemical and physical pathways of proteolysis ") p. 1-29, Plenum Press,
New York). In most cells, L-isoaspartyl and D-aspa
Proteins containing rutile residues catalyze the methyl esterification of the protein
Protein-L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltrans
Recognized by Ferase (EC 2.1.1.77) (McFadden et al. (1982) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA79: 2460-2464, Murray et al. Bio
l. Chem.25910722-10732, and Aswad (1984) J. Biol. Chem.259: 1071
4-10721). Enzymatic methylation corrects these altered aspartyl residues.
This corresponds to the first step in the process of conversion to a normal L-aspartyl residue (McFadden et al. (
1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84: 2595-2599, Johnson et al. (1987)
J. Bio1. Chem.262: 5622-5629, Lowenson et al. Biol. Chem.26 6
: 19396-19406,
Lowenson et al. (1992) J. Biol. Chem.267: 5985-5995). This reaction isomerization and
Prevents the accumulation of proteins containing racemized aspartyl residues, and
It appears to be an important component that limits the negative effects of the aging process. In bacteria,
Because the deletion mutation reduces survival by a factor of 100, this enzyme is
Has been shown to be crucial for the survival of mice (Li et al. (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci USA89: 9885-9889).
L-isoaspartyl / D-aspartyl methyltransferase is a mammal
Extensively studied in organizations. Two similar activators were found in bovine brain (Aswad et al. (1983
Year) J. Neurochem.40: 1718-1728) and human erythrocytes (Gilbert et al. (1988) Bi).
ochemistry27: 5227-5233, Ota et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Co
mmun.151: 1136-1143). These isozymes have about 25,000
Da monomeric polypeptide and have similar catalytic properties, but with isoelectric point
Differ by about 1 pH unit (Ota et al. (1988) Biochem. Biophys. Res.
. Commun.151: 1136-1143). A third with an isoelectric point between isozymes I and II
Active, but the corresponding isozyme has not been isolated or characterized
(Ingrosso et al. (1991) Adv. Exper. Med. Biol.307: 263-276). Bovine brain (
(1989) J. Henzel et al. Biol. Chem.264: 15905-15911) and human erythrocytes (
Ingrosso et al. (1989) J. Biol. Chem.264: 20131-21039)
Complete amino acid sequence of Zyme I and isozyme II from human erythrocytes
Most of the amino acid sequence (Ingrosso et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commu
n.175: 351-358) have been determined. The sequence of human isozyme I consists of bovine enzyme and 96
% Are identical. The amino acid sequences of the two human isozymes are the two amino acids at the C-terminus.
Identical except for the acid, and these two amino acids explain the difference in isoelectric point
(Ingrosso et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun.175
: 351-358).
Southern blot analysis shows that both isozymes are products of a single gene
(Ingrosso et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun.175: 351〜
358). Encodes an enzyme similar to isozyme I in rat brain and mouse testis
The nucleotide sequence has recently been determined (Sato et al. (1989) Biochem. Biophys).
.
Res. Commun.161: 342-347, Romanik et al. (1992) Gene118: 217-222).
Human L-isoaspartyl / D-aspartyl protein carboxyl methyl ester
Corresponding to mRNA of two isozymes of transferase (EC 2.1.1.77)
Two cDNA clones (MacLaren et al. (1992) Biochem. Biophys. Res.
. Commun.185, 277-283) have been sequenced. One of these (p
The DNA sequence of RK1) is the amino acid sequence of the C-terminal half of human erythrocyte isozyme I.
Code the column. Other cDNA clones (pDM2) are more acidic
Contains the complete coding region for ImII. Potential polymorphisms at amino acid residues 119 and 205
With the exception of the site, the deduced amino acid sequence differs only at the C-terminus,
The -RWK sequence is replaced by the -RDEL sequence in Isozyme II. The latter arrangement
The columns are identical to mammalian ER retention signals. Deletion of coding region of pRK1
The minutes appear to be comparable to the coding region of pDM2. The existence of another splicing
The presence indicates the presence of a third isozyme having a -RC terminal. Finally
Evidence was presented that there are three genomic polymorphisms in the human gene for this enzyme.
ing. Residue 22 is either isoleucine (I) or leucine (L).
Residue 119 can be either isoleucine or valine (V)
And residue 205 is either lysine (K) or arginine (R).
(Tsai and Clarke (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun.203:
491-497). Thus, each isozyme described above has at least eight forms (Itwenty two
I119K205, Itwenty twoI119R205, Itwenty twoV119K205, Itwenty twoV119R205, Ltwenty twoI119KTwo 05
, Ltwenty twoI119R205, Ltwenty twoV119K205, Ltwenty twoV119R205) Can exist
You.
However, in the above study, the coding for human methyltransferase was
DNA was not efficiently expressed due to the lack of a suitable recombinant expression system. Scratch
Thus, large quantities of homogeneous enzymes have not been isolated so far. Methyl trans
Ferase is purified from bovine brain, where 0.58 kg of cerebral cortex
3.7 mg was obtained in 5 steps (Aswad et al. (1983) J. Neurochem.40: 1718-1726).
Purification of the human enzyme was more difficult. That is, from 0.22 liters of blood in 5 steps
Only about 0.1 mg of protein was obtained (Gilbert et al. (1988) Biochemistr).
y
27
: 5227-5233). Therefore, large amounts of isoaspartyl methyltransferase
No efficient purification system has ever been produced on an industrial scale.
In plants, protein L-isoaspartyl methyltransferase
Activity is in both monocotyledonous and dicotyledonous plants and green algae, Chlamydomonas reinhard
Identified in Chi (Chlamydomonas reinhardtii) (Mudgett et al. (1993)
Biochemistry32: 11100-11111). Most plant organs have some enzyme activity
Although present, their values can vary considerably. Interestingly, L-a
The highest values of soaspartyl methyltransferase activity are found in seeds (Mu
dgett et al. (1993) Biochemistry32: 11100-11111). In addition, foreign peptide groups
Carboxymethylated protein in the seed soluble fraction in the absence of
What is formed in vitro is that the methyl acceptor substrate
(Trivedi et al. (1982) Eur. J. Bioch).
em.128: 349-354 and Mudgett et al. (1993) Biochemistry32: 11100-11111)
.
Isoaspartate value in protein is a measure of the damage value of this protein
in use. Using isoaspartyl methyltransferase enzyme
The method for measuring the isoaspartyl content of protein is given to Aswad.
No. 5,273,886, the disclosure of which is incorporated by reference.
And incorporated herein.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. 1 shows the human L-isoaspartyl / D-aspartyl methyltrans of the present invention.
1 shows the construction of a ferase expression plasmid, pDM2x. 107 bp Kpnl-Narl flag
Is removed from plasmid pDM2 and the ribosome binding site and
Replace with a synthetic polylinker that has a citator site.
FIG. 2 shows the novel polylinker fragment used in the present invention. This port
The relinker is a multiple cloning site (KpnI, KhoI, KbaI, BamHI, N
heI, NcoI) and contains a strong prokaryotic ribosome binding site (Shine et al.)
(1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA71: 1342-1346).
FIG. 3 shows the human L-isoaspartyl / D-aspartyl methyl trans of the present invention.
The nucleotide and deduced amino acid sequences of the ferase expression plasmid, pDM2x are shown
(SEQ ID NO: 8).
FIG. 4 shows human L-isoaspartyl / D-aspartyl in E. coli.
Isopropyl β-D-thiogalactate on tyl methyltransferase production
9 shows the effect of pyranoside (IPTG).
FIG. 5 shows human methyltransferase in the pDM2x expression system of the present invention.
E. coli growth percentage of total soluble protein obtained
Spherase yield is shown as a function of time after IPTG induction.
FIG. 6 shows the optimization of the protamine sulfate precipitation step according to the invention.
FIG. 7 shows human L-isoprotein obtained from the clarified supernatant of protamine sulfate according to the present invention.
Ammonium sulfate of aspartyl / D-aspartyl methyltransferase
4 shows the optimization of the precipitation fraction.
FIG. 8 shows human L-isoaspartyl / D-aspartyl methyl tra according to the present invention.
Figure 4 shows the anion exchange column purification step of the transferase.
FIG. 9 shows purified human L-isoaspartyl / D-aspartylmethyl according to the present invention.
Figure 4 shows the pH dependence of transferase concentration.
FIG. 10 shows the electrophoresis of the purified recombinant human methyltransferase of the present invention.
Figure 2 shows an electrospray mass spectral analysis. (A) Dithiothreitol
Part of spectrum of material purified using (B) 0.1 μM buffer in buffer A
When using 15 mM β-mercaptoethanol instead of thiothreitol
Part of spectrum of purified material.
FIG. 11 shows the purified human L-isoaspartyl / D-aspartyl methylt of the present invention.
3 shows an ultraviolet absorbance spectrum of transferrinase.
FIG. 12 shows wheat germ L-isoaspartyl methyltransfer according to the present invention.
2 shows purification of the enzyme. (A) DEAE-52 anion exchange cellulose treatment. (B) Reverse
Ammonium sulfate gradient solubilization treatment. (C) Sephacryl S-200 gel filtration.
FIG. 13 shows L-isoaspartyl methyl sulfate obtained from wheat germ according to the present invention.
Figure 5 shows polypeptide analysis of transferase purification.
FIG. 14 shows the insertion of the wheat germ methyltransferase cDNA used in the present invention.
1 shows the DNA sequencing strategy of the product.
FIG. 15 shows L-isoaspartyl methyltransfer obtained from wheat germ.
Sequenced Peptide Fragment of Glycine and Its Predictions Obtained from pMBM1
The alignment of amino acid sequences is shown.
Summary of the Invention
One particular object of the present invention is to isolate by expression of a cDNA encoding the enzyme.
Recombinant human L-isoaspartyl / D-aspartyl protein methyltransfer
To provide a cellulase. Surprisingly, this expression system allows pure recombination
It enables very efficient large-scale production of enzymes. The structure of the recombinase is
N-terminal alanine residue not modified by post-translational modification by acetylation in enzymes
Injury differs from the structure of the purified enzyme obtained from human erythrocytes. Thus, this yeast
The element is suitable for use in human studies because there is no potential antigenic problem.
Another object of the present invention is to provide wheat L-isoaspartyl protein methyltrans.
Identification of cDNA encoding ferase and purified plant L-I obtained from wheat
The provision of soaspartyl protein methyltransferase. High level
Methyltransferase is found in wheat, especially in seeds.
Still another object of the present invention is to provide an enzyme for treating a disease caused by protein degradation.
To provide pharmaceutical preparations containing
Analytical tools to control quality and diagnose disease states associated with protein degradation
To provide. For other objects of the invention, reference is made to the following detailed description of the invention.
This will be apparent to those of ordinary skill in the art.
That is, one gist of the present invention is that SEQ ID NO: 1 (isozyme I) and SEQ ID NO: 2
(Isozyme II) of a polynucleotide having a sequence selected from the group consisting of
Isolated recombinant human L-isoaspartyl / D-aspartylta obtained by expression
Protein methyltransferases, each of which is isozyme I
Or the eight amino acid sequence of II,twenty twoI119K205, Itwenty twoI119R205,
Itwenty twoV119K205, Itwenty twoV119R205, Ltwenty twoI119K205, Ltwenty twoI119R205, Ltwenty twoV11
9K205And Ltwenty twoV119R205Contains a total of 17 nucleotide sequences encoding
You.
Another aspect of the present invention provides that SEQ ID NO: 3 (isozyme I) and SEQ ID NO: 4 (
Isolated recombinant human having an amino acid sequence selected from the group consisting of
L-isoaspartyl / D-aspartyl protein methyltransferase
And each contains the eight amino acid sequences described above.
Another aspect of the present invention has the coding sequence of the sequence shown in SEQ ID NO: 5.
An isolated polynucleotide, which is a plant L-isoaspartyl protein
Encodes a methyltransferase. ATG code of base numbers 117 to 199
This starts with an AGC codon and ends at the AGC codon before the TGA codon at positions 807-809.
690 base pairs in the sequence indicate the coding sequence for this polynucleotide.
Another aspect of the present invention relates to a polynucleotide having the sequence shown in SEQ ID NO: 5.
Recombinant plant L-isoaspartyl protein obtained by expression of
Transferase.
Another aspect of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 7.
Purified plant L-isoaspartyl protein methyltolan obtained from wheat germ
Spherase.
Another gist of the present invention is to provide human L-isoaspartyl / D-aspartyltan
A method for producing a protein methyltransferase by a recombinant method,
Using oligonucleotides, human L-isoaspartyl protein methyl
Plasmid pDM2 containing the entire coding region for transferase (Genebank
By modifying a plasmid such as S37495).
Works in efficient ribosome binding sites and bacterial and / or eukaryotic expression systems
Providing a powerful translation initiator area that is designed to
The constructed vector was converted to isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPT
G) transfecting into a host having an inducible T7 polymerase gene,
And
IPTG induces methyltransferase overexpression to induce methyltransferase
To produce cellulase,
It is a method including that.
This expression method should be advantageously applied to any variant of methyltransferase
Can be. The enzyme is preferably BL21 (DE3) grown in LB broth.
Obtained from overexpressed human cDNA in E. coli. More efficient and efficient
An efficient expression is achieved in a more nutrient medium, such as a strong broth (Sambrook et al. (1989)
"Molecular Cloning: Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory)
Which results in higher final cell densities as well as longer exponential
A growth and methyltransferase production phase is obtained. In the present invention, finally,
Human methyltransferase makes up about 10-30% of total bacterial soluble protein
Resulting preparation.
Another aspect of the present invention is a lytic bacterium in which methyltransferase expression has occurred.
Recombinantly produced human L-isoaspartyl / D-aspa present in the extract
A method for purifying rutile protein methyltransferase, and
The method is
Nucleotide precipitation, such as protamine sulfate or polyethyleneimine
To remove the DNA present in the extract after removal of cell debris.
,
Precipitate methyltransferase with ammonium sulfate,
Dialysed to remove ammonium sulfate, and
Use anion exchange chromatography to convert methyl dialysate under new conditions.
Purifying the transferase,
Including.
Obtain about 50 mg of enzyme from 4 liters of bacterial culture based on this new purification method
be able to. Successful purification of this enzyme on a single column means that the enzyme can be
Weakly bind and isocratically with starting buffer without applying a salt gradient
This is probably due to the finding of conditions that can elute. Complete with phosphate / EDTA buffer
Best fractionation on a non-equilibrated DEAE-cellulose column
Have been found.
Another aspect of the present invention is a plant L-isoaspartyltan obtained from wheat.
A method for purifying protein methyltransferase, and the method comprises:
Obtain crude (crude) cytosol from raw wheat (raw wheat) germ,
The crude cytosol is fractionated by DEAE-cellulose chromatography,
Add ammonium sulfate to the collected active fractions in the presence of a protein carrier.
,
The resulting material was reverse ammonium sulfate gradient solubilized (reverse ammonium sulfate gr).
adient solubilization), and
The collected active fractions were purified by gel filtration chromatography and
Purify the transferase as a 28,000 Da monomeric species,
Including.
Another aspect of the present invention relates to L-isoaspartyl / polypeptides in tissues.
A method of treating a medical condition associated with an increase in D-aspartyl residues, and
Can be used in tissues with or without S-adenosylmethionine.
Converting the L-isoaspartyl / D-aspartyl residue to an L-aspartyl residue
Administering to the tissue a sufficient amount of methyltransferase to obtain the tissue.
According to another feature of this preferred embodiment, L-isoaspartyl / D-
A method of diagnosing a disease state in which aspartyl residues are accumulated is provided, and
The method uses methyltransferase as a probe to detect disease-related proteins.
Measures the content of L-isoaspartyl / D-aspartyl residues accumulated in carbonaceous materials
Including doing.
Another aspect of the present invention is a method for measuring degradation of a pharmaceutical polypeptide,
This method uses methyltransferase as a probe and
Measure the content of L-isoaspartyl and D-aspartyl residues in the peptide
Including.
Yet another embodiment of the present invention provides a method for treating L-isoaspa of a polypeptide in a tissue.
Pharmaceutical formulations for the treatment of medical conditions associated with increased rutile / D-aspartyl residues
And the pharmaceutical formulation preferably has the substrate S-adenosylmethionine
Human L-isoaspartyl / D-aspartyl protein methyltransfer
And a pharmaceutically acceptable carrier.
The commercial utility of this enzyme, as large quantities of the enzyme can be obtained by the present invention.
Will be appropriate. Methyltransferase is a protein and peptide drug product
Highly sensitive analysis of L-isoaspartyl and D-aspartyl residues in quality control
Can be used as a probe. β-amyloid product (Roher, A.E. et al. (1993
Year) J. Biol. Chem.268: 3072-3083) Modified tan in biological fluids
It can be used in medical diagnostics to assay proteins and peptides. Intrinsic
Sexual human methyltransferase is restricted to the cytosol (Clarke, S. (198
5 years) Annu. Rev. Biochem.54: 479-506), so the damaged proteins in the extracellular environment
It cannot undergo repair catalyzed by this enzyme. Thus, methyltransfer
Formulation and topical use of chelase and its substrate S-adenosylmethionine
Therapeutic formulations are useful. In particular, it may deteriorate and contribute to skin tissue aging
In the repair of damaged proteins in the skin such as collagen and elastin.
Advantageously, enzymes are useful.
Detailed Description of the Preferred Embodiment
Human L-isoaspartyl / D-aspartyl methyltransfer in Escherichia coli
Overexpression of chelase
Plasmid pBluescript SK (-) (pDM2: Genebank accession number S37495)
Human L-isoaspartyl / D-aspartyl methyltransferase
The complete coding region for acidic isozyme II (SEQ ID NO: 8) in SEQ ID NO: 9) (Ma
cLeren, et al. (1992) Biochem, Biophys. Res Commun. 185: 277/283). This
Is derived from human brain tissue using mouse cDNA as a probe
From a cDNA library (Stratagene, La Jolla, CA). Expression
Isozyme I (SEQ ID NO: 9) having a sequence other than pDM2 (SEQ ID NO: 9)
No. 1) or a plasmid containing a cDNA encoding isozyme II (SEQ ID NO: 2).
Is isozyme I having the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
Can be used to generate isozyme II with the sequence
Sozyme has at least eight forms (Itwenty twoI119K205, Itwenty two
I119R205, Itwenty twoV119K205, Itwenty twoV119R205, Itwenty twoV119R205, Ltwenty twoI119K205
, Ltwenty twoI119R105, Ltwenty twoV119K205, Ltwenty twoV119R205). Or
, Isozyme III having a -RC end (226 residues long) can be generated in the same manner.
You. Such plasmids include pBK phage
Vector (Strategene) and pTrc99A expression plasmid (Pharmacia, Piscatwa)
y, NJ). E. coli is preferred for expression of human methyltransferase.
New Because the characteristics of isozyme II purified from human erythrocytes were revealed
Was found to be unmodified after translation (Ingrosso, e
t al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 20131/20139). Therefore, the E. coli expression system is human
Can produce almost the same recombinant methyltransferase as this enzyme. pDM2
The plasmid already has a T7 promoter site suitable for transcription of the inserted cDNA.
In position and orientation but without the ribosome binding site (MacLaren, et a
t. (1992) Biochem. Biophpus. Res. Commun. 185: 277-283). Therefore, the pDM2
Rasmid is the region between the T7 promoter site of the enzyme and the start codon.
By replacing the region with a synthetic fragment containing a strong ribosome binding site
To produce the overexpression vector pDM2x (Hine, et al (1974) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 71: 1342-1346.) (FIG. 1). In FIG. 1, pDM2
The KpnI-NarI fragment of these multiple cloning sites, eukaryotic initiator
And a synthetic linker containing a strong ribosome binding site
(FIG. 2). The fragment shown in FIG. 2 has Kpnl and NarI restriction for proper insertion.
Polymerase chain reaction using oligonucleotide primers containing
PCR). Region from Kpnl restriction site including T7 promoter site
Zone 5 'was originally part of the pBluescript SK (-) plasmid. Ncol start
Sequence 5 'is not present in the original methyltransferase cDNA insert. p
DM2 is a human methyltransferase eye inserted at its EcoRI site.
PBluescript SK (-) (Stratagene) plasmid containing Sozyme II cDNA
. The sizes of the given fragments were 4 and 2 salts of Kpnl and Narl, respectively.
Does not include base pair overhangs. This replacement fragment can be used in various expression
And insertion of a methyltransferase cDNA (FIG. 3) into an organism.
It was processed to have multiple cloning sites. In FIG.
The EcoRI site at the 3 'end is one of the pBluescript SK (-) cloning plasmids.
7 bases are shown. The region 5 'from the Kpnl restriction site is the T7 promoter
And is also part of the pBluescript SK (-) plasmid. This flag
The comment has the sequence of SEQ ID NO: 8. T7 promoter site
PDM2x expression plasmid from the 3 'EcoRI linker on the end of the human cDNA insert to the
The nucleotide sequence of the sumid and the translated amino acid sequence are shown in FIG.
. The structure of the modified region of pDM2x and the overall plasmid
Confirmed by NA sequence analysis and restriction endonuclease digestion analysis. Methyl
A ribosome binding site that can be inserted into a transferase-encoding vector and
Any synthetic polylinker that contains an initiator and an initiator site is within the scope of the present invention.
The T7 RNA polymerase-inducible expression plasmid is then human L-isoasparatyl / D
For expression of -aspartyl methyltransferase, E. coli strain BL21 (D
E3) (Studier, et al. (1986) J. Mol. Biol. 18)
9: 113-130). This bacterial strain is isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IP
TG) Phage T7 is added to the chromosome under the control of the inducible lacUV5 promoter.
Contains RNA polymerase gene. IPTG-induced T7 polymerase inheritance
Other bacterial host strains, including offspring, are also contemplated. For example, T7 polymerase is heat-induced
Plus encoded on plasmid pGP1-2 behind a sexual promoter
A mid system can be used. A variety of bacterial strains are transformed with the plasmid.
Purification of methyltransferase
Used here to increase methyltransferase in lysed bacterial extracts
The first batch purification process used was by Fu, et al. (Fu, et al, (1991) J. Biol.
Chem. 266: 14562, 14572.). Overexpressing bacteria
Is lysed by ultrasonication, and cell debris is removed by centrifugation. To the supernatant
The remaining nucleic acid is added with the precipitant protamine sulfate or polyethyleneimine
And removed by centrifugation. The required amount of protamine sulfate is optimized,
The addition of 0.1 volume of a 4% solution of protamine in essentially quantitative yield
It was found that the transferase was purified. Next, this methyl transfer
The enzyme is concentrated and further purified by precipitation with ammonium sulfate. Again, reserve
The conditions of this step were optimized in the experiment, with the highest purification at 50% -55% saturation
Is achieved, but the best compromise between yield and purification occurs at 60% saturation,
These conditions are also used in large-scale purification. Small amounts of pelleted protein
Buffer A
And dialyzed against buffer A to remove ammonium sulfate.
Next, the transparency is determined by using DEAE cellulose anion exchange chromatography.
A rapid one-step column method for purifying methyltransferase from effluents
Will be implemented. Traditional binding of enzyme to column in non-interacting cation buffer
The method was applied but found to be incomplete purification. However, under non-equilibrium conditions
It was found that the use of interacting anionic buffers eluted a homogeneous enzyme.
Was. If chromatography is performed with the column fully equilibrated before packing
Methyltransferase is slightly delayed with similar amounts of contaminating polypeptides.
At close to the void volume (data not shown).
Identification of L-isoaspartyl methyltransferase in plants
Peptide-dependent L-isoaspartyl methyltransferase is a green algal C
. found in plant cells of reinhardtii, which is present in at least one species of the plant kingdom
Have demonstrated. In the plant kingdom, methyltransferase activity is
Species in both monocots and dicots
You. Activity levels in various tissues vary considerably. Of the plant kingdom analyzed
Among them, the highest specific activity of methyltransferase was found in wheat embryos (malt).
You. In contrast, lettuce leaves or tomato fruits have L-isoaspartyl pea.
Almost no peptide / specific methyltransferase activity can be detected. Malt
The specific activity of the enzyme (14.0 micromol / min / mg) was determined for E. coli (1-2.5 micromol / min / mg; F
u, et al. 1991) and human erythrocytes (1.9-9.4 micromol / min / mg; Ota, et al.
, 1988; Gilbert, et al, 1988). Follow
Malt, an inexpensive and abundant by-product of flour production, is an excellent source of enzyme purification material.
You.
Wheat seed and seedling L-isoaspartyl methyltransferase
Peptide-dependent L-isoaspartyl methyltransferase activity matures
Wheat seeds, the activity of which is significantly higher after water swelling and germination
Decrease. Northern analysis showed that methyltransferase mRNA was
Only expressed in seeds as otide species, not in whole seedlings, leaves or roots
It is shown that. Enzyme levels fluctuate with the stage of husk development,
Highest levels of spherase mRNA are detected in stage IV seeds where embryos have grown to their maximum
However, no methyltransferase mRNA can be detected at stage II. No
Zan analysis was performed for 10 hours with water deprivation, 50 μM (+)-cis, transabscisic acid (ABA)
Exposure to salt stress (0.25 M NaCl) resulted in dramatic methyltransfection.
This shows that the expression of the mRNA for E. coli is expressed. In contrast, methyl transfer
Lase gene expression is induced in seedlings exposed to low (4 ° C) or high (37 ° C) stress.
Not guided. These results indicate that isoaspartyl methyltransferase mR
NA expression and enzyme activity are not only induced in seed development and germination
It also shows that seedling water deficit and salt stress are increased. Special
In addition, when seedlings are treated with both ABA and NaCl, methyltransferase
Offspring expression is increased approximately two-fold over alone. ABA-NaCl combination treatment phase
The additive effect is that the methyltransferase gene has a salt reaction residue in addition to the ABA response gene.
It is a gene. Causes the expression of methyltransferase
The necessary hormonal and environmental stresses are preferably ABA concentrations of 10-100 μM, salt
The concentration is 0.1-1 M or the dehydration time is 5-24 hours (dehydration is 7 for other plants).
Days).
Purification of L-isoaspartyl methyltransferase from wheat germ
Wheat was chosen because of its high methyltransferase activity. Purification of the present invention
The strategy is based on the protein carboxyl methyl tiger reported by Tribedi, et al.
Based on partial purification of the phosphatase (Trivedi, et al. (1982) Eur. J. Biochem.
.128,349-354). Methyltransferase is purified from the cytosolic fraction of raw malt.
Made. This material is first purified by DEAE cellulose chromatography at pH 7-10.
, Preferably at 9.3 (FIG. 12A). Second, the active fraction is
60-100%, preferably up to 80% ammonium sulfate in the presence of protein carrier
Saturate, inject into column and fractionate by reverse ammonium sulfate gradient solubilization at room temperature
(FIG. 12B). About 20-50%, preferably 26-31%, containing saturated ammonium sulfate
The active fraction having is more preferably Sephacryl S-200 gel filtration chromatograph.
Using
, But other gel filtration materials are also contemplated. Surprisingly, L-isoaspa
Rutile methyltransferase is present in fractions roughly equivalent to the total volume of the column.
And elute in a highly purified state. In this step, methyltransferase
It is unique in that it is not fractionated based on its size. Rather, methyl tran
Spherases have a solvent effect which can be obtained by a very high concentration of ammonium sulfate in the fraction.
Interaction with Sephacryl Sphacryl S-200 resin through hydrophobic interaction for fruit
(Belew, et al. (1978) J. Chromatogr. 147, 205-212).
In the absence of ammonium sulfate, methyltransferase is
From the Sephacryl S-200 column at a position that matches the molecular weight of the monomer.
Elution with the lipopeptide. Therefore, highly purified enzymes from gel filtration columns
Continuous isolation of the formulation is due to this unusual adsorption phenomenon.
This polypeptide was obtained from Clarke (Clarke (1981) Biochim, Biophys. Acta 670, 1).
Gel slices in the presence of Triton X-100 as described by
Was analyzed by regenerating L-isoaspartyl methyltransfection.
Corresponding to the enzyme. The purity of this drug product can be estimated by measuring the concentration of Coomassie colored gel.
It is about 80 to 100% (Fig. 13).
L-isoaspartyl / D-aspartyl methyltransferase derived from wheat
DNA sequence to encode
The DNA sequence of the 952-bp cDNA insert in plasmid pMBM1 is the sequence shown in FIG.
Determined using a decision strategy. DNA sequence of methyltransferase cDNA and
The predicted amino acid sequence is shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively. 690-bp open
Of the 230 amino acid polypeptide predicted from the reading frame
The molecular weight is 24,710. In contrast, purified methyltransferase
As determined by gel electrophoresis (SDS-PAGE) of SDS-polyacrylamide
, 28,000 Da polypeptide.
Sequence of L-isoaspartyl methyltransferase from malt
Comparison of peptide fragments with predicted amino acid sequences from pMBM1
Interestingly, the predicted amino acid sequence of wheat cDNA and malt L-isoaspartyl
12 sites between the sequence of the peptide fragment of methyltransferase
There are contradictions (Figure 15). In six of these locations, experimentally determined
Of amino acids whose amino acid sequence data is not clearly encoded by cDNA
Is shown. At the other six positions, other residues are added in addition to the encoded residue.
Identified by Doman decomposition. These results are consistent with the hexaploid nature of this type of wheat.
Match. In that case, the three diploid genomes (AABBDD) have different sequences with different sequences.
Gene and can result in the production of various gene products (Peumans, et a
l., (1982) Planta 154, 562-567 and Wright, et al. (1989) J.C. Mol. Evol. 28
327-336). Most amino acid changes are shared between methyltransferases
Located outside the three highly conserved regions. Differences between these amino acids
Results in an enzyme with a slightly different methyl receptor specificity, which
It would provide the ability to recognize and potentially repair a wide range of damaged proteins.
It is interesting to measure. Many human methyltransferase genes
Shapes were also identified (Ingrosso, et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 20131/20139)
And Maclaren, et al. (1992) Biochem. Biophys. Res Commun, 185, 277-283)
.
Isolated recombinant malt L-isoaspartyl protein methyltransferase
Manufacturing of
Methyltransferase cDNA inserts as described for the human enzyme
Inserted into a well-known prokaryotic expression vector and transformed into competent E. coli,
It is then used to induce the T7 polymerase gene using IPTG. plant
Enzyme expression can be performed in exactly the same way as human enzymes. Bacterial expression systems
Designed to express cDNA sequences regardless of their phylogenetic origin
You. The expressed recombinant protein is purified as described above.
Application of L-isoaspartyl methyltransferase
Methyltransferase is an atypical L-isoas of peptides and proteins
For S-adenosylmethionine-dependent methylation of partyl and D-aspartyl residues
Has a catalytic effect. This reaction is an aging and stress-induced denaturation of proteins.
In addition to being used as an analytical tool to detect the presence of groups, these residues
Initiating a non-enzymatic pathway that can convert to normal L-aspartyl residues
it can.
The methyltransferase enzyme of the present invention is incorporated herein by reference.
As disclosed in U.S. Pat.No. 5,273,886, L-isoas
Can be used in connection with measurement of partate and D-aspartyl residues. in short,
This method breaks down a polypeptide into fragments using proteolytic enzymes.
Then, the isoaspartyl residue in the fragment is replaced with a methyltransferase enzyme.
Consists of quantitative methylation using elemental. Methyl introduced into the fragment
The total amount of the hydroxyl groups indicates the amount of isoaspartyl residues in the polypeptide. Polypeptide
The amount of isoaspartyl residues in
Can be used as an indicator of quantity.
Interestingly, the structure of the recombinant enzyme is derived from human erythrocytes at the N-terminal alanine residue.
Is different from the purified enzyme structure and is measured by electrospray mass spectrometry
As such, the recombinase does not include covalent post-translational modifications. Therefore, this yeast
Is suitable for use in human studies without causing potential antigenic problems
ing. Endogenous human methyltransferase is restricted to the cytosol
(Clarke, S. (1985) Annu Rev Biochem 54: 479-506), causing damage in the extracellular environment.
This protein cannot be repaired catalyzed by this enzyme. Therefore,
Injection using luciferase and its substrate, S-adenosylmethionine
Possible topical therapeutic formulations are useful. Recombinant human enzymes pose potential antigenic problems
Since it does not have it, it can be injected directly into the brain, eyes, blood, etc. Further purified
Plant Enzymes Are Peptide and Protein Damaged Isoaspartyl Residues
Can be used in skin care products as a topical formulation.
In the tissue, the L-isoaspartyl / D-aspartyl residue is replaced with an L-aspartyl residue
Sufficient amount of methyltransferase to convert to
By administering together with S-adenosylmethionine, L-
Treatment for medical conditions associated with increased isoaspartyl / D-aspartyl residues
Is performed. Such medical conditions include cross-linking of matrix proteins.
And a decrease in the softness of the skin tissue, for example, cataracts, Alzheimer's disease, etc.
This is the case. For this purpose, human or plant enzymes can be used,
The dosage of the enzyme is adjusted so that the concentration of the enzyme in the preparation is preferably in the range of 0.4 to 40 μM.
I can decide. This enzyme uses S-adenosylmethionine and a pharmaceutically acceptable carrier.
Can be easily formulated into an ointment. Typical ointments contain 0.001-10% by weight of enzyme
And S-adenosylmethionine in an amount of 0.00004 to 0.4% by weight.
Other medical conditions include plaque formation in brain tissue and
For these purposes, human enzymes are preferably used.
It is used in an amount such that the concentration of the enzyme in the extracellular space is in the range of 0.4 to 40 μM. In the brain
For administration, the enzyme is present in a pharmaceutically acceptable carrier at 0.001 to 10% by weight of the enzyme.
Injection solution typically containing 0.00004-0.4% by weight of S-adenosylmethionine.
Provided as a liquid. Preliminary evidence suggests that L-isoaspartyl and D-aspartyl
Suggests that residues can accumulate in amyloid protein of Alzheimer's disease
I have. Since the fraction of β-amyloid protein is found in cerebrospinal fluid (CSF),
Treatment of Alzheimer's disease by injecting certain enzymes into the cerebrospinal fluid
It might work.
Another medical condition is reduced vascular flexibility, which makes human enzymes preferred.
Or red blood cells, endothelial tissue, heart arterial tissue, immune cells, all cells or lungs
It is used in such an amount that the concentration of the enzyme in the body ranges from 0.4 to 40 μM. Vascular system
For the enzyme, 0.001 to 10% by weight of the enzyme and 0%
An injection solution typically containing 0.0004-0.4% by weight of S-adenosylmethionine;
Provided. Solutions can be administered by catheter or direct infusion.
Other medical conditions include infertility for eggs and / or semen and tissue fibrosis.
For these purposes, the human enzyme is preferably used in egg or sperm cells.
It is used in an amount such that the concentration of the enzyme ranges from 0.4 to 40 μM. For the vascular system
, The enzyme is present in a pharmaceutically acceptable carrier at 0.001 to 10% by weight of the enzyme and
Supplied as an injection solution typically containing 4% by weight of S-adenosylmethionine
Re
You.
L-isoaspartyl and D-aspartyl residues are accurately methyltransferred
The presence of these damaged residues in pharmaceutical polypeptides
It is possible to determine the presence and thus the purity and purity of such protein products.
And shelf life can be confirmed. These analyzes indicate that pharmaceuticals are14C-methyl)
Incubate with methionine in the presence of purified methyltransferase,
It is performed by measuring the radioactivity transferred to the pharmaceutical. This removes the reaction product
Incubate with alkaline solution to remove bound methyl ester
And then released as (Lowenson, et al. (1991) J. Biol Chem. 26
6: 19396-19406) is collected in the scintillation fluid.
Diagnosis of pathological conditions in which L-isoaspartyl and D-aspartyl residues accumulate
Uses methyltransferase as a probe to detect disease-related proteins.
Measure the content of L-isoaspartyl and D-aspartyl residues accumulated in the protein
It is implemented by setting. β-amyloid protein fraction is converted to bone marrow fluid (CSF)
L-isoaspartyl and D-aspartyl residues in the sample of bone marrow fluid
To develop a diagnostic test for Alzheimer's disease by measuring the content of groups
Is possible. An accurate diagnosis of this disease that has rendered millions of Americans incapable
It was not possible before. Diagnostic tests control pharmaceutical quality of proteins
This is achieved using the same analytical method described above forExperiment 1: Nucleotide sequence of human methyltransferase coding region
cDNA library synthesis and clone screening
A cDNA library constructed from the temporal cortex of the human brain of a two-year-old woman is Stra
Purchased from tagene (# 935205). This cDNA was isolated from the mR isolated with oligo-dT.
EcoRI site of lambda ZAP bacteriophage vector synthesized from NA
(Stratagene). The library was grown in E. coli BB4 and
5x10 eachFive22 plates (1.1 x 107(Plaque total) is 15
Radioisotope from coding region of 80 bp murine methyltransferase cDNA
Screened using a 768 bp HaeIII fragment labeled with
(Romanik, et al. (1992) Gene, 118: 217-222). Fragment is PRIME-I
10 with T Random Priming Kit9cpm / μg specific activity (α32Use P) -dCTP
And labeled (Stratagene). Standard plaque lift and southern block
Method (Sambrook, et al (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory) yielded three positives. These programs
Lark clones were isolated by subsequent screening. The clone is λZ
In vivo excision by AP protocol to XL1-blue cell plasmid
Reinserted. Successful excision was indicated by ampicillin resistance. Insert problem
Cells containing the plasmid carrying the product are grown in LB / ampicillin medium,
The plasmid was isolated and purified using a Qiagen plasmid isolation column.
Nucleotide sequencing and analysis
The nucleotide sequence of the clone was determined by the dideoxy chain-termination method (Sanger, et al. (1977) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467), Sequenase 2.0 kit (USB), M1
With 3 and T7 universal primers, and synthesized 22mer primers
Determined on both strands. Sequence data from Macintosh computer
Was analyzed with the DNAStar program using.
1.1x107Three clones of the plaque gave positive and were isolated. Claw
The two sequences (pDM2 (SEQ ID NO: 9) and pRK1 (SEQ ID NO: 10))
Was determined from. Plasmid pDM2 is available from GeneBank under accession number S37495
it can. In SEQ ID NOs: 3, 4, and 9, the encoded methionine is numbered 0.
And the next acid, alanine, is numbered 1. This is the first methionine excision
This is done to better fit the final protein numbering. Both clones
The numbers start at these positions. Clone pRK1 starts at position 358. The division
The number to the left of the eye number represents pDM2. The number to the right of that number is for pRK1
is there. The nucleotide sequence and encoded amino acid sequence of pDM2 are shown in (a).
, (B). (B) represents the 47 base insert found in clone pRK1.Experiment 2: Human methyltransferase expression in E. coli
Construction of expression vector pDM2x
The pDM2 plasmid enhances the region between the T7 promoter site and the start codon of the enzyme
Modified by replacement with a synthetic fragment containing a unique ribosome binding site.
To produce the overexpressed vector pDM2x (FIGS. 1-3).
Bacterial growth
The E. coli strain DH5α (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) is a plasmid construct.
Used for cloning and propagation. Transformation of E. coli is performed by Cjhung, et al.
. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 2172-519).
Achieved by the method described above. For protein expression, E. coli strain BL21 (DE3
) (Studier, et al. J. Mol. Biol. (1986) 189: 113-130)
Transformed with Sumid. 100 μg of BL21 (DE3) bacteria containing the pDM2x plasmid
Luria Bertrani (LB) broth containing 1 / ml ampicillin (Sambrook, et.
al. "Molecular cloning: a laboratory manual," (1989) Cold Spring Harbo
r Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) medium at 37 ° C.
Protein concentration measurement
The protein concentration of the crude extract was determined using bovine serum albumin as a reference.
According to the chloroacetic acid lowry method (Chang, YC (1992) Anal Biochem. 205: 22-26).
Measured. The protein density of the column fraction was measured at 280 nm and the optical density was measured.
A concentration of 1.0 mg / ml of the mixture of proteins (Sambrook, et al. (1989) "Molecular cloning
: a laboratory manual "Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring H
arbor, NY) or homogeneous methyltransferase (Mach, et al, Anal.
iochem. (1992) 200: 74-80) was measured as the absorbance of 1 was equal to the concentration of 1.12 mg / ml.
Was done.
Methyltransferase analysis
The concentration of active methyltransferase is determined by vapor diffusion as
base) on methyl receptor ovalbumin
Determined by measuring steal formation (Gilbert, et al. Biochemistry).
(1988) 27: 5227-5233). The final concentration of the 50 μL reaction mixture is 10 μM S-adenosyl
-L- (methyl-14C) Methionine (53 mCi / mmol, 100 cpm / pmol, ICN
Biomedicals, Irvine, CA), 40 mg / ml chicken egg white (fraction V, Sigma, St.
Luouls, MO), and 0.2 M sodium citrate, pH 6.0. Incu
Is carried out at 37 ° C. for 30 minutes and an equal volume (50 μL) of 0.2 N
The reaction was terminated by adding 1.0% (w / v) SDS of NaOH. This mixture
Is on a piece of 1cm x 9cm thick filter paper prefolded like accordion pleats
Include 6 ml Safariy-Solve counting flow with spots on spots
20ml plastic scintillation vial placed in the neck (No. 111177,
Research Products International). The vial is capped and kept at 23 ° C for 2 hours.
After incubation, the filter paper insert was removed and the vial was closed again.
. wide14Radioactivity was measured in the C channel. Measured by SDS-PAGE
Once purified to homogeneity, methyltransferase
Was measured (10,000 pmoles / min / mg at 37 ° C). This value is a measure of the enzyme activity.
It was used to determine the mass of methyltransferase from the fixed value.
Methyltransferase expression
Ten 10-liter cultures of E. coli strain BL21 (DE3) containing the expression plasmid pDM2x
Luria Bertrani (LB) broth containing 0 μg / ml ampicillin at 37 ° C
Culture at 250 rpm with shaking to an optical density of 0.5 at 600 nm. Next, the enzyme
The current was induced by adding IPTG to 50 μM. Cell growth is optical at 600nm
At a density of 1.6, growth continued for more than 4 hours until saturation was reached. Cells are 15 minutes at 4 ° C
, Harvested by centrifugation at 5,000 g to give a 14 g wet weight pellet. Here or
All operations from column fractionation to column fractionation were performed at 4 ° C.
To determine the optimal concentration of IPTG for expression, log phase expression media should be
A range of IPTG was induced and analyzed for methyltransferase concentration. Figure
4 is a very small amount (0.03m) to induce methyltransferase expression.
M) indicates that only IPTG is required. In FIG. 4, 100 μg / ml
Add pDM2 to a 1 liter solution of Luria Beltrani (LB) broth at 37 ° C containing phosphorus.
x BL21 (DE3) E. coli harboring the methyltransferase expression plasmid
And cultured to an optical density of 0.2 at 600 nm. The culture medium has four equal volumes (250m each)
l), final concentrations of 0, 0.03 mM, 0.5 mM, 048.00 mM isopropyl β-D-
Thiogalactopyranoside was used. Continue shaking vigorously at 37 ° C., sample over 3 hours
Collected. Each sample is placed on ice and cells are pelleted by low speed centrifugation.
Was The pelleted cells are resuspended in buffer A, sonicated,
And analyzed for methyltransferase activity. Soluble protein
Concentrations were determined by modified Lowry analysis. 10,000 pmol / min / mg specific activity
The methyltransferase concentration was used to calculate. Importantly, methyl
Transferase reaches 20% of total soluble protein in full active form
It was found that methyltransferase was measured as determined by SDS-PAGE.
Polypeptide was not found in the insoluble fraction where inclusion bodies were normally found.
Next, a concentration of 50 μM IPTG was used to further increase methyltransferase production.
Extensive analysis has been performed. The data in FIG. 5 show that enzyme production rapidly increases during log phase growth.
Occur, resulting in increased methyltransferase accumulation
Is shown. In FIG. 5, 1 liter of BL21 (DE3) cells containing pDM2x
Cultured at 37 ° C with shaking at 250 rpm in Luria Bertrani (LB) broth
Was. Expression was started at time 0 by adding IPTG to 50 μM. Soluble protein
Quality and methyltransferase were analyzed for the times shown in FIG.
Only when the rate of cell growth begins to slow, does methylation in the soluble protein fraction occur.
The concentration of the transferase fraction decreased.Experiment 3: Purification of human methyltransferase
Methyltransferase purification
Buffer A is used for all preparations and contains 5 mM sodium phosphate, pH 8.0
Yes, 5 mM EDTA, 25 μM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), 0.1 mM
It contained dithiothreitol (DTT), and 10% V / V glycerol.
The cell pellet (14 g) was suspended in 200 ml of buffer A at 4 ° C. Bacterial cells are my
Continuous output power using a Branson W-350 sonifier with a black tip probe
Lysed by sonication at a power level of 5 for 2 minutes. Sonication is ice water
Dissipate heat and mix thoroughly in a 500 ml beaker cooled in a slurry bath.
Made to be combined. These sonication settings are based on the sample at various power levels.
At various times, and enzyme content by methyltransferase activity
Optimized in preliminary experiments analyzed for Cell destruction starts at power level 3.
As a result, the activity of the enzyme began to decrease at level 7, probably due to heating. Dissolved
The cells were centrifuged at 13,000 g for 15 minutes and the supernatant was saved. 200ml loose
Impulse A is added to the pelletized debris, and the material is again sonicated and
The supernatant was stored. The supernatants of the two extracts are mixed and the final
A volume of 390 ml was obtained.
Protamine sulfate (4% w / v protamine sulfate solution in 0.1 volume (3
9 ml) (grade X, sigma)) and slowly add and mix at 4 ° C.
The acid was precipitated. After mixing for 30 minutes, the solution was centrifuged at 13,000 g for 15 minutes.
The methyltransferase was concentrated, and the solid ammonium sulfate was further reduced to 60% (167%).
g) Slowly add at 4 ° C. until saturated, mix for 30 minutes, and add
Purified by centrifugation at 00 g (Scopes, RK (1993) "Proteinpur
ification: orinciples and proctice, "Springer-Verlag, New York).
To remove ammonium sulfate for anion exchange column purification, the protein
The pellet was resuspended in 18 ml of buffer A, and a 3500 molecular weight cut-off dialysis membrane (Spectr
apor3, Spectrum) and permeate three times by changing 1 liter of buffer A every 12 hours
Was analyzed.
Final purification step using DEAE cellulose chromatography at room temperature under non-equilibrium conditions
Was. Height 14.7cm × ID. 2.5 cm DE-52 (Whatman) column measures eluent pH
As described above, equilibrium was maintained at a flow rate of 2 ml / min with buffer A. Trial
To prepare the column for loading, the column is buffered with NaCl to a final concentration of 1M.
A for 1 hour at a flow rate of 2 ml / min, and finally without NaCl.
Washed with Impact A for 6 hours. Next, the dialysed ammonium sulfate preparation
Was packed into the column and washed with buffer A at 2 ml / min for 2 hours. This
The substance bound to the column at the time of is eluted by washing with 1 M NaCl buffer A
Was done. Two minute (4 ml) fractions were collected.
Edman Protein Sequencing by Dr. Audree Fowler Is UCLA Prote
in Microsequencing Facility using a Porton 2909E sequencer
Was. Electron Spray Mass Spectroscopy is used for UCLA Molecular and Medical
Dr. Ken Coklin and Kym at Sciences Mass Spectroscopy Facility
Performed by Dr. Faul using a Perkin-Elmer Sciex AP13 instrument. ultraviolet
X-ray and visible light spectroscopy are performed on a Hawlett Packard 8452A diode analysis spectrometer.
It was implemented.
To increase the methyltransferase fraction in eluted bacterial extracts
The first batch purification step used here is by Fu, et al. The method used
Corrected (Fu, et al. (1991) J. Biol Chem. 266: 14562/14572). Ultrasonic
After lysis of the overexpressing bacteria by treatment, cell debris is removed by centrifugation.
Was. The nucleic acid remaining in the supernatant is centrifuged by adding the precipitant protamine sulfate.
Has been removed. The required amount of protamine sulfate has been optimized and a 4% solution of protamine sulfate
2.4 volumes of purified product with essentially quantitative yield by adding 0.1 volume of
(FIG. 6, Table 1). In FIG. 6, various volumes of 4% w / v protamine sulfate were added to buffer
A was sonicated by pipette clarified by centrifugation at 1.0 ml in addition to A
The supernatant was added and stirred. Nucleic acids and other debris are precipitated at 13,000g for 15 minutes
Was. The supernatant contains total protein and methyltransferase as shown in FIG.
Was analyzed in search of. Next, methyltransferase is precipitated with ammonium sulfate.
The solution was further concentrated and purified. Also, the conditions of this process were
Optimized. Protein precipitated by varying proportions of ammonium sulfate saturation
The total amount of and methyltransferase is shown in FIG. In FIG.
Solid ammonium sulphate is added to a 1.0 ml sample and the indicated percentage of saturation
And mixed at 4 ° C. for 30 minutes on a shaking table. Protein for 13 minutes,
Pelleted by centrifugation at 000 g. The pelleted protein is the first
Resuspended in a volume of buffer A and the protein and methyltrans
Analyzed for total spherase. The highest purification is from 50% to 55%
Although obtained at saturation, the best compromise between yield and purification was obtained at 60% saturation.
Conditions were used in current large-scale purifications (Table 1). Pelletized protein
The material is then resuspended in a small amount of buffer A, dialyzed against buffer A and treated with ammonium sulfate.
Um was removed.
Dialysate by using DEAE cellulose anion exchange chromatography
Rapid one-step column method for purifying methyltransferase from
Was. Conventional methods where the enzyme is bound to the column in a non-interacting cation buffer
Upon application, purification was found to be incomplete. However, under non-equilibrium conditions,
The use of an anion buffer can provide homogeneous, non-gradient elution of the enzyme.
It turned out (FIG. 8). In FIG. 8, the optical density is measured at a protein concentration of 280 nm.
It was decided by Electrophoresis was performed using 12% Duracryl (Millipore) separation gel.
Implemented using the Laemmli buffer system (Laemmli, UK (1970) Nature 227: 680-5)
Was done. Polypeptides were visualized by rapid silver staining (Blum, et al. (1987).
) Electrophoresis 8:93:99). Fractions were analyzed on two minigels. That is,
For gel # 1, 1 μL of sonicate and load, 10 μL of fractions 10-21;
In the turn, 15 μL of LMWS / 100, 10 μL of fractions 22-25, 27, 29, 31, 33, 35, 1 μL
Fractions 76-80 were analyzed. Under these conditions, methyltransferase
Eluted as a narrow spike of enzyme collected in the center of fraction 18, from fractions 21-40
Elutes as a broader peak. Methyl in these two peaks
Transferases look similar. Both peaks are in SDS gel analysis
And a major 25 kDa polypeptide (FIG. 9). In FIG.
The 1 ml fraction of the enzyme produced was at the indicated pH value against 20 mM sodium citrate.
Dialysed using a Centricon-10 microconcentrator (Amicon, Beverly, MA)
Concentrated by ultrafiltration. First peak is low level due to other polypeptides
(Less than 5% for fraction 18), but the second broad peak is
No protein contamination is indicated. Specific activity of methyltransferase is both
Are the same in their peaks, and their weight by mass spectrometry is also the same (see below).
See). Partial separation of these peaks not only
It seems to be due to the non-equilibrium nature of the graph. For example, reducing the volume of dialysate
One broad peak of the homogeneous enzyme further eluted from the void volume.
When the amount of dialysate is increased, the concentration of the enzyme becomes higher (the amount of contaminating polypeptides is small)
Showing a narrow pi
Is obtained near fraction 18 (results not shown). If the column is packed
If fully equilibrated chromatography has been performed before, methyltrans
Ferase is slightly delayed and dissolves near the void volume with small amounts of contaminating polypeptides.
Let go.
Table 1 summarizes the purification steps when obtaining a large amount of homogeneous methyltransferase.
ing. According to Table 1, the loss of yield is greatest during the ammonium sulfate precipitation step.
No. I don't know why. Overall, 1.7 pmol / min / mg of inactive 10,000 pmol / min / mg
17 mg of enzyme was obtained from each of the first broth cultures of Torr, but purified human
Comparable to that found for erythrocyte enzymes in G. (Gilbert, et al, (1988)
Biochemlstry 27: 5227-5233, Ingrosso, et al. (1989) Biol. Chem
. 264: 20130-20139). In this preparation, the column chromatography step
(Table 1). DEAE Cellulo
The chromatographic cycle is used repeatedly, easily adding additional homogeneous enzyme.
Generate.
The purified recombinant enzyme is stable at room temperature for up to 2 months and can be cycled between freezing and thawing.
Repeat has no effect on activity. In addition, methyltransferase
Can be heated at 50 ° C for up to 30 minutes without loss of activity.
Enzyme concentration
The availability of a concentrated form of the enzyme is useful for several applications, including X-ray structure determination.
Important to the way. Successful concentrations of methyltransferase are all
In most cases, it was found that it was determined depending on the pH. Typical proteolytic properties
(Scopes, RK (1993) "Protein purification: Principies and prac
tice, "Springer-Verlag, New York."
It happened very easily near the point 5.9 pH units (FIG. 8).
Characteristics of purified recombinant methyltransferase
The N-terminal sequence of the purified methyltransferase is an automated Edman
It was performed by degradation analysis. The sequence determined in the experiment for the first 20 residues is the human enzyme
As can be seen from the above, with the removal of the initiator methionine,
(Ingrosso, et al. (1989) J. Biol. Chem. 2).
64: 20131-20139) (Table 2). For example, acetylated alanine residues present in human enzymes
No evidence for blocked amino termini such as groups
(Ingrosso, et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 20131-20139).
The molecular weight of the purified enzyme was 24,551 ± 3D by electron spray mass spectrometry.
Measured at a (FIG. 10 (A)). In FIG. 10 (A), a part of the spectrum of the purified substance is shown.
Has already been described using dithiothreitol as a reducing agent in buffer A
It is shown. No other peaks were observed at other molecular weights. This average is cD
Accurately predicts 24,551 Da for the unmodified product encoded by the NA sequence
Matched. Β-mercaptoethanol instead of dithiothreitol as a reducing agent
Preliminary attempts at purification using
Β-mercapto as indicated by two additional minor forms of high molecular weight
An enzyme having one or two adducts of ethanol was obtained (FIG. 10 (B)). In FIG. 10 (B)
Is a solution of 0.1 mM dithiothreitol in buffer A with 15 mM β-mercaptoethanol.
Figure 2 shows a portion of the spectrum of a purified material when used instead. Mass 24,6
The peak at 27 represents the adduct with one β-mercaptoethanol molecule, 24,7
The small peak at 04 represents an adduct with two β-mercaptoethanol molecules
.
On-line liquid chromatography of the bromide fragments of trypsin and cyanogen.
Of protein products by electrographic electrospray mass spectrometry
Was confirmed directly. All but the insoluble hydrophobic nucleus corresponding to residues 37-143
The mass of the detected species corresponded to the expected fragment.
For direct spectrophotometric densitometry of homogeneous methyltransferases, amino acids
From composition, 1A280nm1.12 mg / ml (Mach, et al. (1992) Anal. Biochem.
The extinction coefficient of the enzyme was calculated as 200: 74-80). This value is based on bovine serum albumin.
This was confirmed by the trichloroacetic acid-Lowry method used as a reference (Chang.
92) Anal. Biochem. 205: 22.26). Homogeneous fraction 29 from the DEAE column (FIG. 8)
The ultraviolet spectrum of methyltransferase is shown in FIG.
Experiment 4: Identification of methyltransferase in plants
Biological material
Fresh carrots, yellow corn, romaine lettuce, green peas, white
Topotes, spinach, cherry tomatoes and alfafa are purchased at local stores
Was done. Alphafa seeds and raw malt are available from Rainbow Acres, Inc. (Los
Soybean seeds were obtained from Arrowhead Mills, Inc, (He
reford, TX). Winter Feet (Triticium aestivum cultiva
r Augusta) seeds are from Robert Forsberg, University of Wisconsin (Madison, WI).
Provided by Dr. Danver Half Long Carrot Seed, Golden Jubile
e-corn seeds, romaine lettuce seeds, sugar snappy seeds, new
Girand spinach
Seeds and seeds of Bonnie Best Tomato were purchased from Chas. H. Lily Co. (Portland, OR).
). The cytosolic fraction of Chlamydomonas reinhardtii (Wt strain 2137)
Dr. Gregg Howe and Sabeeh of the University of California, Los Angeles
a Provided by Dr. Merchant (Howe & Merchant, 1992).
Preparation of plant cytosol
Crude cytosol should be homogenized from plant tissue using a mortar and pestle
Extracted by In a chilled mortar, liquid nitrogen is introduced into plant tissue (typically,
20 g of fresh tissue or 5 g of seed) and the tissue was completely frozen. E
Undesired polyphenols potentially released from tissues during mogenation
To remove oxidase, 3 g of hydrated PVPP (polyvinyl-polyp
Loridone) (Loomis, et al. (1966) Phytochemistry 5, 423-438)
After being thoroughly mixed with the weave, it was ground with a pestle. Extraction buffer (20 mL of 100 mM HEPE
S, pH: 7.5, 10 mM 2-mercaptoethanol, 1 μm leupeptin, 1 mM PMSF
, 10 mM sodium hydrosulfite, and 10 mM sodium metabisulfite
Was added to the mortar and the slurry was further ground. The crude obtained
The homogenate is strained with 4 layers of cheesecloth and then at 2200g for 30 minutes at 4 ° C.
Centrifugation removed insoluble PVPP and unmilled plant material. Got
The supernatant is further centrifuged at 172,200 xg for 50 minutes at 4 ° C, then two layers of Miracloth M
Filtration through iracloth (Calbiochem, San Diego, CA) to remove floating lipid layers
. This fraction was identified as crude cytosol, stored at 80 ° C, and
It was used as a source of ferase.
Methylation analysis
Methyltransferase activity was identified using vapor phase diffusion analysis,
The analysis was obtained from the hydrolysis of the methyl ester which is unstable towards the base (14C)
By quantifying the release of ethanol, S-adenosyl-L- (methyl
Le-14C) Methyl group labeled with a radioisotope transferred from methionine
Quantify the number of In a total reaction volume of 40 μL, 12 μL of enzyme preparation was added to 10 μM S
-Adenosyl-L- (methyl-14C) Methionine (ICN Biomedicals, 50mCi / mmol), 500
Incubated with μM peptide substrate and 0.33 M HEPES, pH 7.5. Pe
Peptide substrate, (VYP- (L-isoAsp) -HA (SEQ ID NO: 15), KASA- (L-isoAsp) -LAKY (SEQ ID NO:
No. 16), AA- (L-isoAsp) -F-NH2 (SEQ ID NO: 17), VYG- (D-Asp) -PA (SEQ ID NO: 18), KASA
-(D-isoAsp) -LAKY (SEQ ID NO: 19)) is a UCLA Peptide Synthesis Facility with Janis Yo
synthesized by Dr. ung and characterized as described previously (Lowenson, et al.
. (1991b) J. Biol. Chem. 266, 19396-19406 (1992) J. Biol. Chem. 267, 5895-5995)
. Otherwise, during purification of malt methyltransferase (see below), sample
Was analyzed in a buffer containing a final concentration of 0.2 M sodium citrate, pH 6.0.
In each case, the incubation was performed at 25 ° C. for 60 minutes. Each reaction is then
Stopped with 40 μL of 0.2 M NaOH and 1% (w / v) SDS, agitated and 60 μL aliquots were 1.5
It is applied on a filter paper (Bio-Rad No. 195-090) folded in a pleated form of × 8 cm in the form of spots,
20 containing 5 mL of Bio-Safe II (RPI, Mount Prospect, IL) counting flow
It was placed in the neck of a scintillation vial containing mL. Cover the small bottle,14C)
Methanol was allowed to diffuse from the filter paper through the vapor phase into the flow, but was14
C radioactivity remained on the filter paper. After 2 hours at room temperature, remove the filter paper from the neck of the vial
And counted the vials.
Determination of protein
Lawley method (Bailey (1967) Techniques in Protein Chemistry, Else
10% (w / v) of 1 mL using a modified version of vler Publishing Co., New York
After precipitation with trichloroacetic acid, the protein concentration was determined.
Identification of L-isoaspartyl methyltransferase in plants
L-isoaspartyl is a representative of both angiosperms and green algae
-It was investigated whether methyltransferase was present. Crude cytosol
Is isolated from various types of plant material and contains L-isoaspartyl-containing peptide, V
Methyltransferase activity was determined using YP- (isoAsp) -HA (SEQ ID NO: 15).
This was determined to be methyltransferase (kM-0.29) in human erythrocytes.
μm;
Excellent peptide substrate for OWENSON & cLARKE, 1991)
Has been revealed. Endogenous cytosolic oligopeptides also have potential methyl
It is a condition. Therefore, parallel experiments were performed in the presence and absence of the peptide substrate.
(Table 3). Peptide-dependent L-isoaspartyl methyltransferase
Is found in plant cells of the green alga C. reinhardtii and is present in at least one species of the plant kingdom.
Has been proven. In the plant kingdom, methyltransferase activity is
Detected in two classes, monocotyledonous and dicotyledonous plants. Active in various tissues
The bell fluctuated considerably. The best methyltransferase of the types analyzed
Specific activity was found in malt. In contrast, lettuce leaves or tomato fruits have L-iso
Almost no aspartyl peptide-specific methyltransferase activity can be detected
Did not. Significantly all were analyzed for high levels of methyltransferase activity
Seen in the seeds of plants, for example, corn, alfalfa, lettuce,
Not only on beans, spinach and tomatoes, but also on carrots and potato roots
Was. Specific activity of plant seed enzyme (0.66-14.0 pMole/ Min / mg) for E. coli (1-2.5 pmol)
/ Min / mg; Fu, et al., 1991) and human erythrocytes (1.9-9.4 pmol / min / mg; Ota, et
al, 1988; Gilbert, et al. 1988).
Experiment 5: Purification of malt-derived methyltransferase
Preparation of malt cytosol for enzyme purification
Raw malt (150 g) was added to 750 ml of buffer (20 mM sodium borate (pH 9.3), 5 mM EDTA
, 2.4 mM 2-mercaptoethanol and 25 mM NaCl) for 30 minutes at 4 ° C.
While stirring. Next, the slurry was squeezed with four layers of cheese cloth, and the resulting crude homogen
(585 mL) was centrifuged at 7000 xg for 60 minutes at 4 ° C to remove membranes and cell debris.
Was. The supernatant (520 mL) is passed through two layers of Miracloth, and the floating lipid layer is filtered.
I have.
Purification of malt-derived L-isoaspartyl methyltransferase
The purification strategy of the present invention is based on the protein carboxyl method reported by Trivedi et al.
Based on partial purification of chill transferase (Trivedi, et al. (1982) E
ur. J. Biochem. 128, 349-354). Referring to FIG. 12, crude malt cytosol
(515mL, 30mg protein / mL) is a DE-52 (Whatman) column (diameter 9cm x resin height)
13cm, 827mL), which was previously stored at 4 ° C in buffer (20mL sodium borate).
(pH 9.3), 5 mM EDTA, 2.4 mM 2-mercaptoethanol, and 25 mM NaCl).
Balanced. Two fractions were collected at an average flow rate of 8-10 mL / min. The packed column is
Wash equally with 1 liter of buffer, then add 6 liters of 25-200 mM NaCl to the above buffer.
A gradient of the turtle was introduced. Protein profile and NaCl graph
Dient measures absorbance and conductivity at 280 nm in the corresponding fractions, respectively.
Was monitored by VYP- (L-isoAsp) -HA (sequence
No. 15) for L-isoaspartyl methyltransferase
Each fraction was analyzed. One peak of methyltransferase activity is pooled
(Fractions 80-110, 600 mL, see parenthesis) and further King (Biochemistry 11, 367
-371) to reverse ammonium sulfate gradient solubilization as described by
More purified. The pH of the pooled material of DE-52 is 20 mL of 1 M Tris-HCl, pH 7.97.
The pH was adjusted to 8.38. Next, 15.62 g of Celite545 (Baker Analyzed Reagent, 1
1 g of Celite / 1 g of protein) with stirring at room temperature for 30 minutes to give 80%
After saturation (56.1 g ammonium sulfate / 100 mL starting volume), an additional 45
Stirring continued for minutes. This Celite mixture contains precipitated cytosolic proteins
And injected into a 3 cm x 19 cm column and filled with a peristaltic pump at room temperature.
This column is 150 mL (about 2 column volumes) of 80 M containing 0.05 M Tris-HCl (pH 7.98).
Equally washed with a saturated ammonium sulfate solution, and
Eluted with a 550 mL linear gradient decreasing to%. Gradient flow rate
Was about 0.6 mL / min, and 7.5 fractions were collected. Ammonium sulfate corresponding fraction
Percent protein and protein are determined by conductivity and absorbance at 280 nm, respectively.
Was. Every two fractions use VYP (L-isoAsp) -HA (SEQ ID NO: 15) as peptide substrate
L-isoaspartyl methyltransferase. Methyl
Fractions with the highest specific activity of transferase (65-74) were pooled (95 mL, parentheses).
) And then a Sephacryl S-200 (Sigma) gel filtration column (2 cm diameter x 77.5 cm resin).
(Height, 243 mL). 20 mL Tris-acetate (pH 7.0), 0.2 mM EDTA
Buffer containing 15 mM 2-mercaptoethanol, and 10 mM NaCl was used.
The column was equilibrated and performed at 4 ° C. The column flow rate was maintained at 0.12 mL / min, with 30 fractions.
Minutes collected. Every two fractions use VYP- (L-isoAsp) -HA as peptide substrate
L-isoaspartyl methyltransferase. 280nm
And the protein concentration of these fractions was determined. Refined
Malt L-isoaspartyl methyltransferase is present in one or two fractions
Eluted at a constant volume, corresponding to a fraction volume of approximately 134-139 mL (see arrow in FIG. 12C).
reference).
Surprisingly, L-isoaspartyl methyltransferase is highly purified
As eluted, the fraction eluted in a fraction approximately corresponding to the total volume of the column. Sephacryl
Highly purified enzyme preparation from S-200 gel filtration column
Was due to this abnormal adsorption phenomenon.
Comprehensive purification of L-isoaspartyl methyltransferase from malt
This is summarized in Table 4 and shows a typical set of polypeptides corresponding to each purification step.
The composition is shown in FIG. Referring to FIG. 13, the methyl tiger from each purification step was
Active fractions containing phosphases use the buffer system described by Laemmli
And analyzed by SDS-PAGE (Laemmli (1970) Nature 227, 600-685). Tampa
The quality fraction was sample buffer (180 mL Tris-HCl (pH 6.8), 6.0% (w / v) SDS, 2.1 M 2-mer
Captoethanol, 35.5% (v / v) glycerol and 0.004% (w / v) bromophenol
(Le blue) at a ratio of 2: 1 (v / v) and boiled for 3 minutes. These fractions are 12
.5% (w / v) acrylamide / 0.43% (w / v) N, N-methylenebisacrylamide separation gel
Was electrophoresed. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue.
As molecular mass standards (Bio-Rad), phosphorylase b (97 kDa), bovine serum albumin
(66 kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic anhydrase (31 kDa), soybean bird
Psin inhibitor (21.5 kDa) and lysozyme (14 kDa). Analyzed
The crude malt homogenate (lane A) and the filtered crude cytosol
B), fraction 80-100 from the DEAE-cellulose column (lane C), reverse sulfate
Monium gradient solubilization step (lane D) and Sephacryl S-200 color
Fraction 39 from the system (lane E). Methyltransferase polypeptide
The position of the command (MT) is indicated on the right by an arrow (FIG. 13).
MONO Q anion exchange chromatography
L-isoaspartylme from several Sephacryl S-200 gel filtration columns
Fractions containing tiltransferase were pooled and dialyzed against buffer A (Spect
ropor, cut 3500 Da). Dialysed methyltransferase (0.6 mg
Protein) was pre-equilibrated with buffer A to Mono Q HR5 / 5 anion exchange (
(Pharmacia) column (5 mm diameter × 50 mm resin height, 1 mL). One minute
Fractions were collected at a flow rate of 0.5 mL / min. The packed column is equally buffered 15
And then a linear gradient of 0-100% buffer B (20 mM tri-acetate).
Tate (pH 7.0), 0.2 mM EDTA, 15 mM 2-mercaptoethanol, 10%
Serol, and 1M sodium acetate) were introduced over 60 minutes. Column
The eluate was monitored at 280 nm. Typically, methyltransferase activity
Was detected in fractions 43-44. Fraction containing active methyltransferase
Minutes were pooled and used for enzymatic studies.
Major Polypeptides Determined by Electrophoresis of SDS Polyacrylamide Slab Gels
The calculated molecular mass of the peptide was 28,000 Da. This polypeptide is Clark (
As described by Clarke (1981) Biochim. Biophys. Acta 670, 195-202).
Regeneration of individual gel slices in the presence of Triton X-100 allows L-isomers
It was demonstrated to correspond to aspartyl methyltransferase. This key
Purity of the product should be 86% by densitometry of Coomassie stained gel
Was evaluated. The remaining smaller polypeptide contaminants are
It could be removed by an additional step. The dialyzed methyltransferase is MONO
A linear gradient of 0.1 M sodium acetate packed in a Q anion exchange column
Eluted. Active methyltransferase is about 0.5M sodium acetate
Eluted.
Experiment 6: Amino acid sequence of purified malt methyltransferase
Reverse phase HPLC
Homogeneous methyltransferase suitable for sequence analysis is Sephacryl S-200 process
Obtained by reversed-phase HPLC (high performance liquid chromatography) of the enzyme purified by
Was. Fractionation was performed on a Vydac C-4 column (1 cm x 25 cm diameter) equilibrated with 65% solvent B.
m, 300 ° pores, 5 μm spherical silica support) and 65-80% solvent B
Eluted with a linear gradient at a flow rate of 3.0 mL / min for 45 min, but with solvent A
0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution (w / v), solvent B was 0.1% in 99% methanol / 0.9% water.
% Trifluoroacetic acid solution (w / v / v). The column effluent contains a fraction of 1 minute.
Was monitored at 280 nm. Volatile reagents are fractionated from Savanto Speedvac
And then these fractions were subjected to SOS-PAGE and silver stained (Jones (199
0) in Current Protocols in Molecular Biology Suppl. 11, John Wiley and So
ns, New York). Malt methyltransferase has an apparent molecular mass of 28,
Eluted as a single polypeptide band with 000 Da.
Amines by trypsin and Staphylococcus aureus V8 protease mapping
No acid sequencing
Homogeneous methyltransferase suitable for amino acid sequence analysis is reversed as described above.
Obtained by phase HPLC analysis. The substance is trypsin and Staphylococcus aureus V8
Protease was digested with protease and the resulting peptide was subjected to reverse phase HP using a Vvdac C-18 column.
Collected by LC. N-terminal Edman sequences have been performed on these peptides.
Was. Obtained partial peptide sequence data generates oligonucleotide probes
And used to confirm the presence of polymorphisms and / or multigenes (
See Experiment 7 below).Experiment 7: cDNA encoding wheat methyltransferase
Synthetic oligonucleotide probes
Oligonucleotide probes were used with the Gene Assembler Plus DNA Synthesizer (
Β-cyanoethyl N, N-diisopropane in Pharmacia LKB Biotechnology)
It was synthesized using ropyl phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are pBI
uescript SK ± phagemid T7 promoter, T7 (DMT-TAATACGACTCACTATAGGG) (
SEQ ID NO: 11) and three types of degenerate oligonucleotides, MB1 [TCTGG (G / A) AT (G / A) TG
(C / T) TC (G / A) ATNCCCAT] (SEQ ID NO: 12), EcoRI linker [CTCGAATTCTA (C / T) (C / T) T
MB3 containing NAA (G / A) CA (G / A) TA (C / T) GGNGT] (SEQ ID NO: 13), and HindlII linker
Represents MB4 containing [TCAAAGCTTTT (G / A) TC (T / G / A) ATNAC (C / T) TGNAG] (SEQ ID NO: 14),
As a probe in PCR amplification of a wheat cDNA library (below)
Synthesized for use as Primers are Bio-Spin 6 columns (Bio-Rad)
Purified by size exclusion chromatography using
Isolation of cDNA clone of L-isoaspartyl methyltransferase from wheat
Degenerate oligonucleotides are synthesized based on partial amino acid sequence data (
(See above), then poly (A) isolated from barley seedlings that were yellowed for 48 hours+With RNA
Methyltransferase cDNA region of constructed wheat cDNA library
Used for amplification (Hatfield, et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 15813-
15817). The 850 bp PCR product is a methyltransferase cDNA (peptide
384-fold degenerate oligonucleotide representing the nucleic acid sequence of the 5 'region (corresponding to YLKOYGV)
A protocol that encodes the T7 promoter of the leotide, MB3 and pBluescript vectors.
Amplified using a primer. Identification of the 850-bp PCR product is methyltransfer
Nucleic acid sequence of the middle region of the cDNA of the enzyme (corresponding to peptide GIEHIPE)
Demonstrated by Southern hybridization using a 64-fold degenerate oligonucleotide, MB1, representing
Was done. Methyltransferase cDNA without pBluescript vector sequence
In order to obtain a PCR product containing the 850-bp PCR product, the MB3 primer and
3 ′ region of methyltransferase cDNA (corresponding to peptide LOVIDK)
Reaction with the 288-fold degenerate oligonucleotide MB4 representing the nucleic acid sequence of the region
Used as a template. PCR amplification by PCR dideoxy chain termination sequencing
As determined, a 600-bp fragment containing only the methyltransferase cDNA sequence
Created a fragment. Screen the wheat cDNA library with this 600-bp product.
As a result, one positive plaque was isolated, which was E. coli XL-1 pU.
Return to the C19 pBluescript phagemid to generate the pMBM1 plasmid and then
It was used to transform fungal DH5a cells.
Gene encoding L-isoaspartyl methyltransferase from wheat
DNA sequence
The DNA sequence of the 952-bpc DNA insert of plasmid pMBM1 follows the sequence strategy shown in FIG.
Decided to use. Referring to FIG. 14, barley methyltransferase cDNa insertion.
Both strands of the pMBM1 clone containing the input (952-bp EcoRI fragment)
Sequenced by deoxy chain termination sequencing. Oligonucleotides of 600-bp wheat
Synthesized using the sequence of the PCR product containing the methyltransferase cDNA,
Prime to sequence the 952-bp fragment as shown in this form of sequencing strategy.
Used as a marker. DNA sequence of methyltransferase cDNA and its prediction
The measured amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively. See SEQ ID NOs: 5 and 6
The sequence of the coding strand of the 944 bp insert of plasmid pMBM1 was
Shown without terminal EcoRI linker (GGAATTCC) added to the library. 690bp
The methyltransferase cDNA begins at the codon for ATG at position 118 and the TGA at position 808
End with a codon. 230 predicted 690 bp open reading frame
The calculated molecular weight of the amino acid polypeptide is 24,710. On the contrary, refined
The methyltransferase was 28,000 Da po as measured by SDS-PAGE.
It migrated as a repeptide (FIG. 13).Experiment 8: Comparison of the sequenced peptide fragment with the predicted sequence
Sequence of L-isoaspartyl methyltransferase from malt
Amino acid sequence predicted from peptide fragment and its pMBM1
Interestingly, the predicted amino acid sequence of wheat cDNA and malt L-isoaspar
12 parts between the sequence of the peptide fragment of chill methyltransferase
A discrepancy in the order was found (FIG. 5). Referring to FIG. 15, trypsin (T) and
After digestion with S. aureus V8 protease (V), the peptide was
Recovered and sequenced by automated Edman degradation. Number the elution order
The peptide sequence of the fragment was compared to the predicted cDNA sequence by a line.
It is shown. The existence of the space means that unambiguous identification of amino acid residues is
Indicates that it was not done. Other residues identified in a particular cycle are in brackets
Shown above. The residue above the parentheses indicates an amino acid substitution at this position, where cD
No evidence was found for the NA-encoded residues. As a whole,
The amino acid sequence of the produced malt is considered to be shown in SEQ ID NO: 7, except for the following:
. At position 41, A was found at T8 and V17; N was found at T9. At position 52
In I, I was observed in T8, V14 and V17. At position 54, only L was found at V17.
At position 156, A was found at T6 and V8; V was found at T7 and V9. these
The amino acid sequence data determined experimentally at six of the positions
Indicates the presence of amino acids not encoded by. In the other six positions,
Residues in addition to the loaded residues were identified by the Edman sequence. These results are
Match the hexaploid nature of the barley seeds. That is, three diploid genomes (AABBDD)
Can have alleles with different sequences and produce different gene products.
(Peumans, et al. (1982) Planta 154, 562-567; Wright, et al. (1989)
) J. Mol. Evol. 28, 327-336). Most amino acid changes are methyltransfer
Located outside of the highly conserved region shared between the enzymes. These
Differences in amino acids can result in enzymes with slightly different methyl receptor specificities.
And possibly recognizes a wide range of damaged proteins in the cell
It is interesting to speculate that it gives the ability to be repaired. Departure
Variants of these enzymes can be similarly purified by the above-described purification methods.Experiment 9: Skin treatment using methyltransferase
Purified methyltransferase (isolated from plant sources or bacteria
Either as a recombinant human enzyme purified by S) and S-adenosyl-L-methio
Nin and glycerin, respectively, in an aqueous cream containing mineral oil.
Final concentrations are 0.01% and 0.00004%. Skin cream or hair cream
, Water, glycerin, cetylaryl alcohol, coconut oil glycerides, Ceteareth-20,
Mineral oil, petrolatum, sorbitol, avocado oil, DMSO (or other carrier molecule)
, Stearic acid, Allantoin, Squalene, Methylparaben, Sodium Carbome
r 941, recombinant human L-isoaspartyl / D-aspartyl methyltransfer
Lase (or plant methyltransferase), propylparaben, S-adeno
Sil-L-methionine, Quaternium-15, fragrance, FD & C Yellow No.5 and FD & C Red
Formulated using No. 4. Skin mist ("Methylmist") is water, glycerin,
H
Allyl alcohol, DMSO (or other carrier molecule), citric acid, recombinant human L-A
Soaspartyl / D-aspartyl methyltransferase (or plant methyl
Transferase), S-adenosyl-L-methionine, Quaternium-15, and incense
Formulated using a fee. Transdermal skin patches use the same ingredients as the skin mist above
Formulated using These formulations can be applied directly to the skin. Soap and water on skin
After washing with methyl transferase skin cream (a), mist (b)
, Patch (c) is used according to the following procedure: (a) a small amount (0.5 ml) of tackiness
Lightly apply the formulation to the center point, with or without latex gloves
And / or by hand, with or without towels and tissues, for example.
Approximately 100cm by rubbing in a small circleTwo(B) Low adhesiveness
Using a clean formulation ("MethylMist") and using a spray bottle or atomizer
Spray the residue onto the skin as described above;
(C) Use the same formulation as "MethylMist", but wrap it in a patch that adheres to the skin,
The drug is distributed directly to the skin via the tiny pores of the patch.Experiment 10: Other medical treatments using methyltransferase
Injectable or topical formulation for eye treatment (pH-7.3) (eg, cataract prophylaxis). Brain
Injectable (eg, to prevent plaque formation) or blood flow (eg, flexible)
137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM NaTwoHPOFour・ 7HTwoO, 1.4 mM KHTwoPOFour,
25 mM recombinant human L-isoaspartyl / D-aspartyl methyltransferer
1-3 μM, 30 μM to match the concentration of S-adenosine (saturated) or S-adenosyl-L-methionine
S-adenosyl-methionine, and 0.22 μM of filtered fungicide. Time release
For dispensing, the injection is packaged in a carrier liposome or microporous structure.
can do. These drugs can be injected directly into the eye, brain or blood stream.Experiment 11: Diagnosis using methyltransferase
Spinal fluid (0.01 mL) sample diluted in 0.2 M sodium citrate buffer (pH 6.0)
Is S-adenosyl- [14[C-methyl] -L-methionine (100 cpm / pmol)
Dissolves prepared methyltransferase (from plant source or human recombinant)
0.03 mL of the resulting mixture. The latter mixture is known with 400 pmol of radioisotope.
Separated S-adenosylmethionine and 10 μg of purified methyltransferer
Contains ze. This mixture is incubated at 37 ° C. for 15 minutes, then 0.04 mL
0.1% sodium dodecyl sulfate solution, 0.2 M sodium hydroxide is added. this
The mixture is then applied to a piece of thick filter paper and 7 mL of liquid scintillation cocktail is added.
Hang into plastic vials containing. After 2 hours at room temperature, remove the filter paper.
Start and count the vials. Injured L-isoaspartyl in radioactive spinal fluid
And D-aspartyl residues.
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
A61K 31/70 ABN A61K 31/70 ABN
ACV ACV
38/45 ADA C12N 9/10
C12N 9/10 C12Q 1/48 Z
C12Q 1/48 A61K 37/52 ADA
//(C12N 15/09 ZNA
C12R 1:91)
(C12N 9/10
C12R 1:19)
(72)発明者 マドゲット,メアリー,ベス
アメリカ合衆国,94612−3550 カリフォ
ルニア,オークランド,レイクサイド ド
ライブ 300番地,21スト フロアー
(72)発明者 クラーク,スティーブン
アメリカ合衆国,94612−3550 カリフォ
ルニア,オークランド,レイクサイド ド
ライブ 300番地,21スト フロアー──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 31/70 ABN A61K 31/70 ABN ACV ACV 38/45 ADA C12N 9/10 C12N 9/10 C12Q 1/48 Z C12Q 1 / 48 A61K 37/52 ADA // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (C12N 9/10 C12R 1:19) (72) Inventor Madget, Mary, Beth United States, 94612-3550 California, Oakland, Lake 300 Side Drive, 21st Floor (72) Inventor Clark, Steven United States, 94612-3550 California, Auckland, 300 Lakeside Drive, 21st Floor