JPH10507758A

JPH10507758A - Gene therapy with simultaneous administration of adenovirus and immunosuppressive drugs

Info

Publication number: JPH10507758A
Application number: JP8514013A
Authority: JP
Inventors: トラップネル，ブルース，シー．; イエイ，スーンピン; マクレランド，アラン; カレコ，マイケル; スミス，セオドア
Original assignee: ジェネティックセラピー，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-10-19
Filing date: 1995-10-19
Publication date: 1998-07-28
Also published as: EP0804076A4; CA2200869A1; EP0804076A1; WO1996012406A1

Abstract

(57)【要約】遺伝子治療処置を宿主に実施する一つの方法であって、（ａ）宿主に同時に（ｉ）治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を含むアデノウイルスベクターおよび（ii）免疫抑制剤を投与し、（ｂ）前記アデノウイルスベクターおよび前記免疫抑制剤の投与を中断し、また（ｃ）アデノウイルスベクターおよび免疫抑制剤の投与を少なくとも１回反復する段階よりなることを特徴とする方法。アデノウイルスベクターおよび免疫抑制剤の投与を反復して行う治療のコースは治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列の発現を持続あるいは増加させる。 (57) [Summary] One method of performing gene therapy treatment on a host, comprising: (a) simultaneously administering (i) an adenoviral vector comprising at least one DNA sequence encoding a therapeutic agent to the host; and (ii) an immunosuppressant. And (b) interrupting the administration of the adenovirus vector and the immunosuppressant, and (c) repeating the administration of the adenovirus vector and the immunosuppressant at least once. The course of treatment with repeated administration of the adenovirus vector and the immunosuppressive agent will sustain or increase the expression of at least one DNA sequence encoding the therapeutic.

Description

【発明の詳細な説明】アデノウイルスおよび免疫抑制剤同時反復投与を伴う遺伝子治療この出願は１９９５年６月７日受理された出願番号０８／４７８，４８２号を部分継承するものであり、後者は１９９４年１０月１９日受理された出願番号０８／３２５，６７９号を部分継承するものであり、これらの開示は引用例として組み込まれている。この発明は遺伝子送達手段としてのアデノウイルスの使用を含む遺伝子治療に関する。より詳細には、この発明はアデノウイルスおよび免疫抑制剤の同時反復投与を伴う遺伝子治療に関し、それにより遺伝子治療処置の効率はアデノウイルスに対する免疫応答の抑制を通じて高められる。発明の背景アデノウイルスゲノムは約３６キロ塩基対の線形二本鎖ＤＮＡ分子である。ウイルスゲノムの各端は逆方向末端反復（つまりＩＴＲ）として知られる短い配列を持ち、これはウイルス複製に必要である。アデノウイルスのよく特徴付けられた分子遺伝的特徴が、それに遺伝子転移のための有利なベクターを与える。ウイルスゲノムの部分は外部起源のＤＮＡで置換することができる。加えて組換えアデノウイルスは構造的に安定である。アデノウイルスは細胞内への生体内での遺伝子転移に非常に効率的であり、かくして望ましい遺伝子を真核細胞内に導入するための送達手段として使用されこれによりアデノウイルスはこのような遺伝子を真核細胞に細胞レセプターと結合することにより送達する。しかしアデノウイルス遺伝子転移にはいくつかの制約があり、それはアデノウイルスベクター粒子、つまりベクター粒子の分解産物あるいは形質導入細胞のどちらかに向けられる宿主応答に部分的に帰因するものである。これらの宿主応答は非特異的応答および特異的免疫応答を含む。非特異的応答は炎症性および非炎症性変化を含む。後者の一例は宿主の細胞遺伝子発現の変化である。特異的免疫応答は各種の細胞応答および体液抗体応答を含む。細胞応答はＴヘルパーリンパ球、Ｔサプレッサーリンパ球、細胞毒Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびナチュラルキラー細胞により送達されるものを含む。遺伝子転移で送達されたアデノウイルスベクターの高い効率にも拘らず、遺伝子転移で送達されるアデノウイルスベクターの一過性性質は、アデノウイルスベクターの反復投与が必要であることを示唆している。しかしコットンラットの最近の研究は、アデノウイルスベクターに向けられた宿主免疫応答が反復投与後遺伝子転移および発現の効率減少と相関することを示した。イエイ、他、遺伝子治療、１巻：１９２−２００ページ（１９９４年）。スミス、他、自然遺伝学、５巻、３９７−４０２ページ（１９９３年）は、ヒト因子IX遺伝子を含むアデノウイルスベクターのマウスへの投与を開示する。このような投与は血友病Ｂ患者に治療効果のあるヒト因子IXの肝臓形質導入および血漿水準に効率を改善した。しかしヒト因子IX水準は注入９週後にはゆっくり基線まで下がり、第２ベクター注入によっても回復しなかった。スミス、他はまた、アデノウイルスに対する中和抗体がアデノウイルスの反復投与の成功を遮断することも発見した。コザルスキー、他、生物化学ジャーナル、２６９巻、１８号、１３６９５−１３７０２ページ（１９９４年５月６日号）は、ラビットに対するＬＤＬレセプターをコード化するＤＮＡを含むアデノウイルスベクターの注入を開示する。ＬＤＬレセプター遺伝子の安定した発現がラビット内で７日から１０日見出され、検出できない水準に３週間で減少した。アデノウイルスに対する中和抗体の成長が完全に効力のなくなる第２回目の用量で生じた。カッス−アイスラー、他、遺伝子治療、１巻、３９５−４０２ページ（１９９４年）は、Ｔ細胞応答がそれだけに帰因するものではないがアデノウイルスからの成人の発現の限定された継続に寄与することを示唆する。この著者は更にシクロスポリンＡがベクターに対する体液応答を遮断するのに効果的ではないことも示している。ファング、他、細胞生化学ジャーナル、補巻２１Ａ、Ｃ６−１０９、３６３ページ（１９９５年）は免疫抑制剤であるシクロスポリンＡで処置された犬におけるアデノウイルスベクターの再注入の試みを開示する。この再注入の試みは不成功であった。ヤング、他、全米科学アカデミー紀要、９１巻、４４０７− ４４１１ページ（１９９４年５月）はＥ１ａおよびＥ１ｂ領域の欠失した組換えアデノウイルスを説明する。このようなウイルスは更に移植遺伝子を含む。このアデノウイルスは、望ましい移植遺伝子を発現する組換えウイルスゲノムを内蔵する動物宿主細胞に投与される。しかしウイルス遺伝子の発現は低い水準に止まる。ウイルス特異的細胞免疫応答は遺伝子修飾細胞の破壊に導くように刺激され、これにより移植遺伝子の発現の継続を限定する。前記の研究は有効なベクターの再投与を妨げ発現の有効性を限定するアデノウイルスベクターに対する宿主免疫応答を阻止し遮断する方法の必要性を明確に立証する。しかしそれはこれをどのようにして達成するかについては記述していない。従ってこの発明の目的は、アデノウイルスベクターに対する免疫応答の抑制を通じて、アデノウイルスベクターの反復投与による遺伝子転移の持続有効性、および転移遺伝子の持続発現を提供することにある。図面の簡単な説明この発明はここで図面と関連して説明され、ここで、図１はプラスミドｐＨＲの構築の図形である。図２はアデノウイルスＩＴＲ、包膜シグナル、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アデノウイルス三部分リーダー配列、および結合配列を含む発現ベクター構築の図形である。図３はプラスミドｐＡｖＳ６構築の図形である。図４はプラスミドｐＡｖＳ６の地図である。図５はプラスミドｐＢＱ４．７の地図である。図６はプラスミドｐＡｖＳ６−ＣＦＴＲの地図である。図７はアデノウイルスベクターＡｖ１Ｌｕｃ１およびＡｖ１Ｃｆ２の図形である。図８はプラスミドｐＧＥＭ−１ｕｃの地図である。図９はプラスミドｐＡｖＳ６−ｌｕｃの地図である。図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃはベクター投与３日後のＡｖ１Ｃｆ２投与に応答する肺の組織的外観を描く。図１１Ａおよび１１ＢはＡｖ１Ｃｆ２投与３日および４２日後の肺洗浄細胞でのデキサメタゾン投与の効果を示すグラフである。図１２はデキサメタゾンで処置され、あるいは処置されなかったＡｖ１Ｃｆ２感染ラットからの肺洗浄サンプルの抗アデノウイルス抗体力価のグラフである。図１３はＡｖ１Ｃｆ２で感染４２日後のラットにおけるＣＴＬ応答のグラフである。図１４はデキサメタゾンで処置され、あるいは処置されなかったもので、次いでＡｖ１Ｌｕｃ１で感染されたＡｖ１Ｃｆ２感染ラットにおけるルシフェラーゼ酵素活性のグラフである。図１５はプラスミドｐＡｖ１Ｈ９ＦＲの地図である。図１６はアデノウイルスベクターＡｖ１Ｈ９Ｆ２の図形である。図１７はＡｖ１Ｈ９Ｆ２を与えられ、免疫抑制剤デオキシスペルグアリン、シクロホスファミド、あるいはデキサメタゾンの一つで処置あるいは処置されずまた５週早くＡｖ１ＬａｃＺ４を投与されあるいは投与されなかったマウスにおける血漿ヒト因子IXのグラフである。図１８は１−１０³から１×１０⁸ｐｆｕのＡｖ１ＬａｃＺ４を受け入れ、次いで５週後Ａｖ１Ｈ９ＦＲの投与を受けたマウスにおける血漿因子IX水準（ｎｇ／ｍｌ）のグラフである。図１９はＡｖ１ＬａｃＺ４を与えられ、免疫抑制剤を与えられなかったかあるいはデオキシスペルグアリン、シクロホスファミドあるいはデキサメタゾンで処置されたマウスにおける中和抗体力価のグラフである。図２０はＡｖ１ＬａｃＺ４を与えられ、かつ免疫抑制剤を与えられなかったかあるいはシクロホスファミドを与えられ、次いでシクロホスファミド処置あるいは処置なしでＡｖ１Ｈ９Ｆ２を投与され、更に次いでＡｖ１ＡＬＡＰＨ８１を投与されたマウスにおける血漿因子ＶＩＩＩ水準のグラフである。また、図２１はＡｖ１ＬａｃＺ４およびデオキシスペルグアリン０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、あるいは３３ｍｇ／ｋｇを受け、次いでＡｖ１Ｈ９Ｆ２を投与されたマウスにおける血漿因子IX水準（ｎｇ／ｍｌ）のグラフである。発明の詳細な説明この発明の一つの見地に従って、遺伝子治療処置を宿主で実施する一つの方法が提供される。この方法は宿主に（ｉ）少なくとも１個のＤＮＡ配列を含むアデノウイルスベクター、および（ii）免疫抑制剤を投与することよりなる。アデノウイルスベクターおよび免疫抑制剤の投与のコースは次いで停止される。免疫抑制剤とアデノウイルスベクターの投与は次いで少なくとも１回反復される。アデノウイルスベクターは宿主に治療効果を生じるのに有効な量で投与される。免疫抑制剤は体液およびもしくはベクターに対する細胞免疫応答およびもしくはベクターを含む細胞を阻止あるいは抑制するのに有効な量で投与される。ここで使用される「ＤＮＡ配列」という用語は一般にポリデオキシリボヌクレオチド分子を引用し、より詳細には隣接するペントースの３′および５′炭素の間のホスホジエステル結合により１個から他へと結合する線状シリーズのデオキシボヌクレオチドを引用する。出願人が発見したのは、免疫抑制剤がアデノウイルスベクターと併用して投与され、また次いでベクターの投与が反復される時には、アデノウイルスベクターおよびもしくはベクターで形質導入された細胞に対する（体液抗体応答などのような）免疫応答の抑制を通じてアデノウイルス媒介遺伝子転移の生体内反復の効率向上が達成され、これにより転移遺伝子の発現増加を達成できるということであった。使用されるアデノウイルスベクターは、一つの実施例において基本的に完全アデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターである。シェンク、他、微生物免疫学の今日の主題、１１１巻（３号）：１−３９ページ（１９８４年）。代替的には、アデノウイルスベクターは少なくともアデノウイルスゲノムの一部が欠失している修飾アデノウイルスベクターである。も一つの実施例において、アデノウイルスベクターはアデノウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイルス３′ＩＴＲ、アデノウイルス包膜シグナル、治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列、治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を制御するプロモーターよりなる。このベクターは大多数のアデノウイルスＥ１およびＥ３ＤＮＡ配列を欠失しているが、すべてのＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列、およびアデノウイルス主要後期プロモーターにより加速されるアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を欠失していない。一つの実施例において、ベクターは更にＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列よりなるグループから選択される少なくとも１個のＤＮＡ配列の少なくとも一部を欠失している。も一つの実施例において、ベクターはアデノウイルスＥ１およびＥ３ＤＮＡ配列の少なくとも大多数を欠失し、またＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列の他の部分を欠失している。更にも一つの実施例において、７２キロダルトン結合タンパク質をコード化するＥ２ａ領域における遺伝子は、３２℃で活性である温度感受性タンパク質を生産するために突然変異され、この温度でウイルス粒子が生産される。この温度感受性突然変異体は以下の文献に記述されている：エンシンジャー、他、ウイルス学ジャーナル、１０巻、３２８−３３９ページ（１９７２年）；ヴァン・デア・フリート、他、ウイルス学ジャーナル、１５巻、３４８−３５４ページ（１９７５年）；エングルハート、他、全米科学アカデミー紀要、９１巻、６１９６−６２００ページ（１９９４年６月）；ヤング、他、自然遺伝学、７巻、３６２−３６９ページ（１９９４年７月）。望ましい実施例において、このようなベクターは標準方法に従って５′末端から始まる「臨界左端要素（critical left end elements）」を含むシャトルプラスミドをまず構築することにより構築され、この臨界左端要素はアデノウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイルス包膜シグナル、およびＥ１ａエンハンサー配列を含み、またこのシャトルプラスミドはプロモーター（アデノウイルスプロモーターあるいは外部プロモーターであってもよい）；多重クローニング部位（前記記載のもの）；ポリＡシグナル；アデノウイルスゲノムの分接に対応するＤＮＡ分接をも含む。ベクターはまた三部分リーダー配列も含む。アデノウイルスゲノムに対応するＤＮＡ分接は修飾あるいは突然変異アデノウイルスとの相同的組換えの基質として役立ち、このような配列は、例えばゲノムの３３２９塩基から６２４６塩基までのアデノウイルス５ゲノムの分接を包含する。このプラスミドはまた選択的マーカーおよび複製起点を含む。複製起点は細胞複製起点であってもよい。このようなシャトルプラスミドの代表的な例は、図４で示されるｐＡｖＳ６を含む。凝固因子をコード化する望ましいＤＮＡ配列は、次いで多重クローニング部位に挿入され、プラスミドベクターを生産する。この構築物は次いでアデノウイルスベクターを生産するために使用される。相同的組換えが少なくとも大多数のＥ１およびＥ３アデノウイルスＤＮＡ配列が欠失している修飾あるいは突然変異アデノウイルスを用いて実施される。このような相同的組換えはリン酸カルシウム沈殿によりプラスミドベクターおよび修飾アデノウイルスを２９３細胞のようなヘルパー細胞系に同時形質移入することを通して実施される。このような相同的組換えに際して、ＮｏｔＩ部位および相同的組換え断片の間のシャトルプラスミドから誘導されるＤＮＡ配列、および相同的組換え断片および３′ＩＴＲの間のアデノウイルスを欠失したＥ１およびＥ３から誘導されるＤＮＡを含むアデノウイルスベクターが形成される。一つの実施例において、相同的組換え断片はアデノウイルス５（ＡＴＣＣＶＲ−５）ゲノムのヌクレオチド３３２９から６２４６でオーバーラップする。このような相同的組換えを通じて、アデノウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイルス包膜シグナル、Ｅ１ａエンハンサー配列、プロモーター、治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列、Ｅ１およびＥ３アデノウイルスＤＮＡ配列の少なくとも大多数を欠失しているアデノウイルスＤＮＡ、およびアデノウイルス３ ′ＩＴＲを含む一つのベクターが形成される。このベクターは次いでＥ１ａおよびＥ１ｂＤＮＡ配列を含みウイルス複製に必要である２９３ヘルパー細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）などのようなヘルパー細胞系に形質移入され感染性アデノウイルス粒子を生成する。形質移入は電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、顕微注射、あるいはプロテオリポソームを通じて生じる。前記記載のベクターは治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列のクローニングベクターへの挿入を容易にするために多重クローニング部位を含む。一般に多重クローニング部位は、「希有」制限酵素部位；すなわち約１０，０００塩基対毎に１個から約１００，０００塩基対毎に１個の頻度での真核細胞に見出される部位を含む。この発明に従っての適切なベクターはかくして標準方法により多重クローニング部位における適切なクローニング部位でクローニングベクターを切断し、次いで治療薬をコード化するＤＮＡ配列をクローニングベクターに結合することにより形成される。前記記載のアデノウイルスベクターは少なくとも１個の治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を含む。「治療」という用語は一般的な意味で使用され、治療薬、予防薬および置換薬を含む。アデノウイルスベクターに挿入される治療薬をコード化するＤＮＡ配列は、必ずしもそれに限定されないが、以下のものを含む：ＴＮＦ−αなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子；インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγなどののインターフェロンをコード化する遺伝子；ＩＬ−１、ＩＬ −１β、およびインターロイキン２から１４までのようなインターロイキンをコード化する遺伝子；ＧＭ−ＣＳＦをコード化する遺伝子；アデノシンデアミナーゼ、すなわちＡＤＡをコード化する遺伝子；Ｍｎ−ＳＯＤ、カタラーゼ、ＣｕＺｎＳＯＤ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼおよびグルタチオンレダクターゼなどの抗酸化剤をコード化する遺伝子；リンパ球の成長因子であるリンホカインなどの細胞成長因子をコード化する遺伝子；上皮成長因子（ＥＧＦ）およびクラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）などの成長因子をコード化する遺伝子；溶触ＣＤ４をコード化する遺伝子；因子 VIII；因子IX；フォン・ビレブランド因子；Ｔ細胞レセプター；コレステロール輸送および代謝に伴うＬＤＬレセプター、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ、ＡｐｏＡＩおよびその他の遺伝子；α１アンチトリプシン（α１ＡＴ）遺伝子、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）遺伝子、ＣＦＴＲ遺伝子、肺界面活性タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、インシュリン遺伝子、ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子など、単純性ヘルペスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ遺伝子および水痘−帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などのネガチブ選択マーカーあるいは「自殺」遺伝子；抗体の抗原結合領域のＦｃレセプターおよびＢ型肝炎および非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの複製を妨げるアンチセンス配列のようなウイルス複製を妨げるアンチセンス配列；組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）；尿プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ）；ヒルジン；酸化窒素シンターゼ、血管活性化ペプチド；および血管形成ペプチド。治療薬をコード化するＤＮＡ配列は適切なプロモーターの制御下にある。使用される適切なプロモーターは、必ずしもそれに限定されないが以下のものを含む：アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；あるいはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの非相同プロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴＶプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘導プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；およびＡｐｏＡＩプロモーター。選択肢として、治療薬をコード化するＤＮＡ配列はその天然プロモーターの制御下にある。しかしこの発明の範囲は特異的外部遺伝子あるいはプロモーターに限定されるものでないことは理解されねばならない。使用される免疫抑制剤は（ｉ）アデノウイルスベクターに対する体液（抗体）応答、（ii）例えばアデノウイルスベクターを含む細胞に対するＴ細胞応答などの細胞免疫応答、あるいは（iii）ベクターに対しまたベクターを含む細胞に対する非特異的な炎症応答、を妨げるものを含む。ベクターおよびもしくはベクターを含む細胞に対する体液およびもしくはＴ細胞およびもしくは非特異的炎症応答を妨げることにより、免疫抑制剤の投与は宿主に治療効果を生み出すためにベクターの効果的な再投与を可能にする。望ましくは、アデノウイルスベクターの反復投与が望まれる場合には、免疫抑制剤はアデノウイルスベクターに対する体液抗体応答を妨げる免疫抑制剤である。望ましくは、持続性の長いあるいは高水準の発現が望まれる場合には、免疫抑制剤は細胞あるいは非特異的消炎応答を妨げあるいは抑制するものである。生体内アデノウイルスベクター投与に対する宿主免疫応答は、（ｉ）ベクターの用量、（ii）投与のルート、（iii）複製の水準（複製が生じる場合）、（iv ）組換えベクターに含まれる移植遺伝子の性質、（ｖ）宿主の遺伝子学的および生理学的特性、および（vi ）これまでに投与したアデノウイルスベクターに対する前もって存在する免疫応答の存在と水準、と関連して変化する。一般に、宿主の応答は投与されるベクターの用量に依存する。重要なことは、特異的宿主応答の大きさは、ベクター投与のルートに依存する。例えば、静脈内投与は呼吸器系ルートを経て与えられるベクターの同一の量のものよりもより高い宿主抗体応答を産み出す。アデノウイルスベクターに対する異なった宿主応答は、全部ではないにしても大抵のこれらの異なった因子機構が関連し大いに相互依存的ではあるけれども、異なった消炎および免疫エフェクター機構により生じる。かくして例えば、体液抗体形成はある種のＴヘルパーリンパ球支援に非常によく依存している。またある種の細胞伝達細胞毒性は抗体形成、例えばオプソニン化マクロファージ細胞殺害に依存する。移植遺伝子発現の持続に影響を与える２種の主要な宿主応答は、消炎応答および細胞免疫応答である。消炎はベクターの投与に続いて生じる最初の宿主応答である。サイトカインの放出は続く消炎細胞の流入を非常によく伴う。このようなサイトカインはＩＬ− １、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦを含むことが多い。生体内アデノウイルスベクター投与に続いて見られる消炎量は与えられるベクター用量の増加で増加する。容量の増加は少ない量の用量によるものよりも移植遺伝子の発現のより急速な減少へと向かわせる。形質導入細胞に向けられるＣＴＬ応答は移植遺伝子発現の持続を減少させるのに重要であると見做されている。ＣＴＬはＣＴＬを誘発する細胞による低い水準のアデノウイルス遺伝子発現に向けられるものと考えられている。宿主に対し反復してアデノウイルスベクターを投与する能力に影響する主要な宿主応答は体液抗体応答である。それは口腔、静脈内、腹腔内、および肺内を含む各種ルートにより投与されるアデノウイルスを展開する。一般に、達成される抗体応答の水準は投与されるベクターの用量によく依存する。抗体応答はまたベクター投与のルートにも依存する。静脈内ベクター投与はベクターの一定用量に対する肺投与よりもより高い抗体水準を産み出す。対照的に、野生型アデノウイルスは生体内ウイルス複製により与えられたウイルスの量に係りなく高い抗体水準を誘出する。アデノウイルスベクター投与を成功裡に繰返す能力は存在する抗アデノウイルスベクター抗体を循環させる水準と逆相関である。アデノウイルスベクターに対する宿主免疫応答の薬理的調節は、消炎剤、細胞免疫修飾因子、および体液抗体免疫修飾因子の使用を伴う。消炎剤はステロイド、シクロホスフェミド、およびアゾチオフリンを含む。ステロイドは潜在的な消炎特性を持つ。デキサメタゾンなどのステロイドが非経口で投与されると肺ルートを経たベクターの生体内投与に続き移植遺伝子の発現の持続時間を長くする。ステロイドはまたリンパ球の機能を遮断する。かくしてデキサメタゾンは肺ベクター投与後に観察されるＣＴＬ応答を減少させる。デキサメタゾンはまた少なくとも部分的にはアデノウイルスベクター投与に対する宿主抗体応答を遮断する。免疫システムの細胞成分に向けられる抗体は細胞免疫応答を減少させる。例えば抗Ｔ細胞レセプター抗体（例えば抗ＣＤ４および抗ＣＤ３抗体など）の投与は移植遺伝子の発現を引き延ばす。ＣＴＬＡ４免疫グロブリンはも一つの例である。抗ＣＤ４抗体はＴヘルパーリンパ球に対して向けられ、その機能を減少させる。主として細胞免疫応答に向けられる他の作用薬はシクロスポリンＡなどのシクロスポリン、ＦＫ５０６などのラパマイシン結合タンパク質配位子、デキサメタゾンなどのステロイドを含む。体液抗体応答に影響を与える作用薬は一般にＢリンパ球（Ｂ細胞）を生産する抗体に、あるいはＢ細胞抗体生産を高水準に誘発させることの原因となるＴ細胞に向けられる。アデノウイルスベクターに対する体液抗体応答を妨げる免疫抑制剤の例は、必ずしもそれに限定されないが、デオキシスペルグアリン、すなわち以下の構造を持つＤＳＧを含む：ここで使用される「デオキシスペルグアリン」および「ＤＳＧ」という用語はデオキシスペルグアリンすなわちＤＳＧおよびその誘導体もしくは類似体、つまりデオキシスペルグアリン塩を意味し、必ずしもそれに限定されないがそのトリヒドロクロリド、および免疫抑制活性を持つ、他のいずれかの類似体を含む。このような化合物は米国特許番号４，５２５，２９９、４，８４７，２９９、５，１６２，５８１および５，１９６，４５３に詳細に記述されている。一つの実施例において、体液抗体応答を妨げる免疫抑制剤はステロイドである。使用されるステロイドは必ずしもそれに限定されないが、デキサメタゾン、および例えばコルチコステロイドなどのいずれかの副腎皮質ホルモン、ヒドロコルチゾン、プレドニソロン、およびメチルプレドニソロンを含む。も一つの実施例において、体液抗体反応を妨げる抑制剤は例えばシクロスポリンＡなどのシクロスポリンである。使用される体液抗体反応を妨げる他の抑制剤は、必ずしもそれに限定されないが、以下のもを含む：アザチオプリン、シクロホスファミド、ブレキナール、レフルノミド、ミコフェノレート・モフェティル（mycophenolate mofetil）、抗ＤＣ４０抗体配位子抗体、シクロホスファミン、ラパマイシン、抗ＣＤ４抗体、ＣＴＬＡ−４免疫グロブリン、インターロイキン１２、インターフェロンγ；ビアラー、他、全米科学アカデミー紀要、８７巻、９２３１−９２３５ページ（１９９０年）、デュモント、他、免疫学ジャーナル、１４４巻、１４１８−１４２４ページ（１９９０年）、およびビアラー、他、サイエンス、２５０巻、５５６−５５９ページ（１９９０年）に記載されているように、例えばＦＫ５０６などのラパマイシン結合タンパク質（ＦＥＢＰ）配位子、抗リンパ球機能抗原１（ＬＦＡ−１）抗体、および抗Ｔ細胞レセプター抗体。外部抗原に対する体液免疫応答を妨げ、抑制し、あるいは除去する化合物（例えばデオキシスペルグアリン、シクロホスファミド、ブレキナール、レフルノミド、ミコフェノレート・モフェティル、抗ＣＤ４０抗体、あるいは抗ＣＤ４０配位子抗体など）がアデノウイルス投与の少し前、およびもしくは投与の間、およびもしくは投与の少し後に投与される場合には、このような化合物が宿主内で抗アデノウイルス中和抗体の生産を妨げるということも出願人は発見した。この発明の範囲内で、免疫抑制剤が前記記載の１個以上の免疫応答を妨げることは理解されねばならない。しかしまた、この発明の範囲はいずれかの特異的な免疫抑制剤に限定されるものではないことも理解されねばならない。この発明の範囲内で、免疫抑制剤の組合せが使用されることも考慮されねばならない。アデノウイルスベクターおよび免疫抑制剤は一般に宿主に治療効果をもたらすのに有効な量で同時投与され、一方ベクターあるいはベクターで形質導入された細胞に対し免疫応答を妨げる。ここで使用される「同時」という用語は、アデノウイルスベクターの投与と免疫抑制剤の投与がほぼ同じ時間、つまりそれぞれの短い時間枠内で開始され、またアデノウイルスの投与と免疫抑制剤の投与が治療の一体の分割できないコースの部分であることを意味している。かくして例えば、アデノウイルスベクターが投与されるほぼ同じ時間に免疫抑制剤が投与される。すなわち免疫抑制剤の投与がアデノウイルスベクターの投与の少し（例えば約２４時間）前、あるいは投与の間、もしくは投与の少し（例えば２４時間）後に開始される。一般に免疫抑制剤はその薬剤に設定された標準用量スケジュールに従い、一般には１４日を越えない、また望ましくは１１日を越えない、より望ましくは８日を越えない期間投与される。かくして免疫抑制剤の長期の投与はアデノウイルスの反復投与を可能にするには必要ではない。免疫抑制剤の投与コースの終結に当り、アデノウイルスベクターおよび免疫抑制剤の投与コースはある一定期間中止される。アデノウイルスベクターおよび免疫抑制剤投与コースの間の期間、およびアデノウイルスベクターおよび免疫抑制剤の投与コース回数は、患者の年令、体重、および性、治療される疾病あるいは疾患、および治療される疾病あるいは疾患の発病度を含む各種の因子に依存する。前記免疫抑制剤投与コースがアデノウイルスベクターの各投与で反復されることは理解されねばならない。一つの実施例において、アデノウイルスベクターは各投与に際してキログラム当り１プラーク形成単位から約１０¹⁴プラーク形成単位まで、望ましくは約１０⁶ プラーク形成単位から約１０¹³プラーク形成単位まで、より望ましくは約１０⁸ プラーク形成単位から約１０¹⁰プラーク形成単位までの量で投与される。宿主はヒトあるいは非ヒト動物宿主である。アデノウイルスベクターは全身あるいは局所投与される。全身投与の例は、必ずしもそれに限定されないが、静脈内投与（例えば門静脈注射あるいは末梢静脈注射）、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、あるいはカプセル口腔投与を含む。免疫抑制剤は望ましい免疫抑制効果を宿主に生み出すのに有効な量で投与される。免疫抑制剤は各投与時にデキサメタゾンが使用される場合には約１ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇまでの量で、あるいは他のステロイドでは同量で投与される。デオキシスペルグアリンが使用される場合には、デオキシスペルグアリンは約１ｍｇ／ｋｇから約３３ｍｇ／ｋｇ、望ましくは約３ｍｇ／ｋｇから約７ｍｇ／ｋｇまでの量で投与される。シクロホスファミドが使用される場合には、シクロホスファミドは約５ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、望ましくは約５０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの量で投与される。アデノウイルスベクター粒子および免疫抑制剤それぞれは患者への投与に適した薬理的許容可能担体と併用して投与される。担体は例えば食塩水などの液状担体である。アデノウイルスベクター粒子は例えばマイクロキャリアビーズなどの固形担体、あるいは例えばポリオールなどの持続性薬剤送達材料と併用して投与される。アデノウイルス粒子により形質導入される細胞は必ずしもそれに限定されないが以下のものを含む：肺、気道、あるいは歯槽上皮細胞；白血球、顆粒細胞、単核細胞、マクロファージ、リンパ球（Ｔリンパ球およびＢリンパ球を含む）、全能幹細胞、および腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ細胞）などの一次有核血球などの一次細胞；骨髄細胞；内皮細胞；活性内皮細胞；上皮細胞；ケラチノサイト；幹細胞；肝細胞前駆体細胞を含む肝細胞；繊維芽細胞；間葉細胞；中皮細胞；実質細胞；血管平滑筋細胞；脳細胞および他の神経細胞；腸管細胞；腸幹細胞；および筋芽細胞。一つの実施例において、アデノウイルス粒子は血球に指向し、これによりそのアデノウイルスベクター粒子は血球を遺伝子で感染させ、これが直接間接的に血球の治療効果を高める。血球により運ばれる遺伝子は、血友病の治療に有効な凝固因子をコード化する遺伝子のような通常はそれがもっていない治療効果を血球に発揮させるいずれの遺伝子であってもよい。遺伝子は、治療効果を持つ１個もしくはそれ以上の産物をコード化できる。適切な遺伝子の例は、ＣＦＴＲ遺伝子をコード化するもの；ＴＮＦなどのサイトカイン、インターロイキン（インターロイキン１−１４）、インターフェロン（α、β、γ−インターフェロン）、Ｔ細胞レセプタータンパク質および免疫グロブリンなどの抗体の抗原結合領域のためのＦｃレセプターを含む。適切な遺伝子の他の例は、エイズの治療に使用される融解ＣＤ４をコード化する遺伝子およびα抗トリプシン欠損症により生じる気腫の治療に有用なα−抗トリプシンをコード化する遺伝子を含む。形質導入された細胞は、必ずしもそれに限定されないが、膵嚢胞性繊維症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、鎌状細胞貧血、地中海貧血、血友病、糖尿病、α −抗トリプシン欠損症、アルツハイマー病などの脳疾患、成長疾患および心臓病など他の疾病、例えばコレステロールが代謝され免疫システムを欠くような変化により生じたものを含む。も一つの実施例において、アデノウイルスベクター粒子は肝細胞に形質導入し、このアデノウイルスベクター粒子は後天性あるいは遺伝性肝細胞（肝臓）欠損の予防および治療に有用なポリペプチドあるいはタンパク質をコード化する遺伝子を含む。例えばそれらは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターの遺伝性欠損を中和し、およびもしくは先天性アンモニア過剰血症に生じる後天性オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を中和するのに使用することができる。も一つの実施例において、アデノウイルス粒子は肝細胞に形質導入し、これによりアデノウイルス粒子はウイルス感染から生成する疾病などの後天性感染疾病を治療するのに使用される治療薬をコード化する遺伝子を含む。例えば感染性アデノウイルス粒子はウイルス性肝炎、とりわけＢ型肝炎あるいは非Ａ非Ｂ型肝炎を治療するのに使用することができる。例えばアンチセンス遺伝子をコード化する遺伝子を含む感染性アデノウイルス粒子はウイルス複製を阻害するために肝細胞を感染するのに使用される。この場合、逆あるいは反対方向で構造的肝炎遺伝子を含むベクターを含む感染性アデノウイルス粒子は肝細胞に導入され、肝炎ウイルスあるいはそのＲＮＡ転写物を不活性化できるアンチセンス遺伝子を感染肝細胞内で生産する。選択肢として、肝細胞は例えば肝炎ウイルスに耐性を与える αインターフェロンなどのタンパク質をコード化する遺伝子を含む感染性アデノウイルス粒子で感染される。このベクター粒子はまたホジキンリンパ腫の治療に使用することができる。感染性アデノウイルスベクター粒子はホジキンリンパ腫の新生細胞を標的とする。更にアデノウイルスベクター粒子は単純性ヘルペスチミジンキナーゼなどの負の選択マーカーあるいは「自殺遺伝子」を含む。アデノウイルスは生体内で患者に投与され、これによりウイルスはホジキンリンパ腫の新生細胞に感染する。アデノウイルスが患者に投与された後、患者はガンシクロビルあるいはアシクロビルなどの相互作用薬を与えられ、これによりアデノウイルスで感染した新生ホジキンリンパ腫細胞は殺される。更にベクターはＣＦＴＲ遺伝子を含むように構築することができる。このベクターは次いで膵嚢胞性繊維症の患者の肺欠損症の治療に有効な量で上皮に投与される。も一つの実施例において、機能タンパク質を含むベクターがそのようなタンパク質の欠損症を治療するために気道上皮に送達される。このような機能タンパク質は抗酸化剤、α−１抗トリプシン、ＣＦＴＲ、肺界面タンパク質、サイトカイン、およびＥＧＦならびにＫＧＦなどの成長因子を含み、また重症複合型免疫不全治療のためのアデノシンデアミナーゼ、クリスマス病治療のためのフォン・ビレブランド因子、およびゴーシェ病治療のためのβ−グルクロニダーゼを含む。更に抗癌剤あるいは消炎剤をコード化する遺伝子を含むベクターは肺癌あるいは炎症性肺疾患治療のために患者の肺に投与される。実施例この発明はこれから以下の実施例と関連して説明される。しかしこの発明の範囲はそれにより限定されるものではない。実施例１Ａｖ１Ｃｆ２およびＡｖ１ＬｕＣ１の構築Ａ．ｐＡｖＳ６の構築アデノウイルス構築シャトルプラスミドｐＡｖＳ６がクローニング技術に基づくポリメラーゼ連鎖反応を含む標準クローニング技術を用いていくつかの段階を経て構築された。まず２９１３塩基対Ｂｇ１ＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ断片がＡｄ− ｄ１３２７から除去され、平滑断片としてピーブルースクリプト（pBluscript）ＩＩＫｓ（カリホルニア、ラホーラ、ストラータジェン）のＸｈｏＩ部位に挿入された。Ａｄ−ｄ１３２７は、塩基対２８５９１から３０４７４（あるいはアデノウイルス５ゲノムの地図単位７８．５から８４．７）を含みＥ３領域に位置を求めるＸｂａＩ断片が除去されていることを除いてアデノウイルス５と同一である。Ａｄ−ｄ１３２７でのＥ３欠失はＡｄ−ｄ１３２４でのＥ３欠失と類似しており、後者はジンマッパーヤ他、細胞、３１：５４３（１９８３年）に記載されている。完全アデノウイルス５ゲノムはジェンバンク、アクセス番号Ｍ７３２６０で登録されており、このウイルスはアメリカ合衆国、メリーランド、ロックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションからアクセス番号ＶＲ−５で利用できる。Ａｄ−ｄ１３２７はアデノウイルス５（Ａｄ５）から決まった方法で構築された。この方法は以下のように簡単に略述され、またこれまでにもジョーンズおよびシェンク、細胞、１３：１８１−１８８（１９７８年）に記述されている。Ａｄ５ＤＮＡはビリオンのタンパク質分解消化により分離され、ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼで部分的に切断される。ＸｂａＩ断片は次いで断片の混合物として連結反応により再集合される。これは配列２８５９１塩基対から３０４７４塩基対を除く点を除いてＡｄ５に類似する配列を用いてある連結ゲノムを生じる。このＤＮＡは次いで適当な細胞（例えばＫＢ細胞、ヒーラ細胞、２９３細胞）に形質移入され、プラーク形成を可能にするため軟寒天で覆われる。個々のプラークは次いで分離され、増幅され、１８７８塩基対Ｅ３領域ＸｂａＩ断片の欠除をスクリーンされる。この断片の配向は、ＢｇｌＩＩ部位がピーブルースクリプトＩＩＫＳのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ部位にもっとも近くなり、またＨｉｎｄＩＩＩ部位がピーブルースクリプトＩＩＫＳのＴ３ＲＮＡポリメラーゼ部位にもっとも近くなるような形であった。第２に、ＩＴＲ、包膜シグナル、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アデノウイルス三部分リーダー（ＴＰＬ）配列及び連結配列がＰＣＲ増幅を用いて結集された（図２）。ＩＴＲおよび包膜シグナル（Ａｄ−ｄ１３２７の配列１−３９２［ジェンバンク、アクセス番号Ｍ７３２６０のＡｄ５からの配列と同一のもの］ここで引用例として組み込まれている）はＮｏｔＩあるいはＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーを用いてＡｄ−ｄ１３２７と一緒に増幅された（増幅１）。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーターはＡｓｃＩ部位およびＳｆｉＩ部位を含むプライマーを用いてプラスミドｐＲＣ／ＲＳＶ（配列２０９から６０５；カリホルニア、サンジエゴ、インバイトロゲン）から増幅された（増幅２）。増幅１および２からのＤＮＡ製品は、ＮｏｔＩプライマーおよびＳｆｉＩプライマーのみを用いて「オーバーラップ」ＰＣＲ法を使用して結合された（増幅３）（ホートン他、バイオテクニクス、８：５２８−５３５（１９９０年））。反応１および２からの各当初ＤＮＡ増幅製品のＡｓｃＩ含有末端の間の相補性は増幅の間にこれら２個の片の結合を可能にした。次いでＴＰＬは、それぞれＳｆｉＩおよびＸｂａＩ部位を含むプライマーを用いてＡｄ− ｄ１３２７で１６時間感染させた２９３細胞（ＡＴＣＣアクセス番号ＣＲＬ１５７３）から分離されｍＲＮＡから作られるｃＤＮＡから増幅された（増幅４）（Ａｄ−ｄ１３２７の配列６０４９から９７３０［ジェンバンク、アクセス番号Ｍ７３２６０のＡｄ５類似配列と同一のもの］）。増幅反応３および４からのＤＮＡ断片は次いでＮｏｔＩおよびＸｂａＩプライマーと共にＰＣＲを用いて結合され（増幅５）、かくして完全遺伝子ブロックを生成した。第３として、ＩＴＲ−包膜シグナル−ＴＰＬ断片が次いで精製され、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで切断され、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ切断ＰＨＲプラスミドに挿入された。このプラスミドはｐＡｖＳ６Ａと名付けられその配向は断片のＮｏｔＩ部位がＴ７ＲＮＡポリメラーゼ部位の次に位置するものであった（図３）。第４に、ＳＶ４０初期ポリＡシグナルがＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＳＶ４０ＤＮＡから除去され、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理されプラスミドｐＡｖＳ６ａのＳａｌＩ部位に挿入され、ｐＡｖＳ６が生成された（図３および４）。Ｂ．Ａｖ１Ｃｆ２およびＡｖ１Ｌｕｃｌの構築Ａｖ１Ｃｆ２（図７）（イエイ他、遺伝子治療、１：１９２−２００（１９９４年））、Ｅ１欠失（１．１８地図単位から９．２地図単位）、Ｅ３欠失（７８．５地図単位から８４．７地図単位）アデノウイルスベクターが、正常ヒトＣＦＴＲｃＤＮＡコード化配列断片をｐＡｖＳ６のＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、ＣＦＴＲコーディング配列の５′末端がアデノウイルス５三部分リーダーにもっとも近くなるようにすることによりまず構築された。ＣＦＴＲｃＤＮＡはＰｓｔＩ断片（ヌクレオチド７５から４７２５：ナンバリングについてはジェンバンク、アクセス番号Ｍ２８６８８を参照）としてプラスミドｐＢＱ４．７（図５）（カナダ、トロント、病気の子供病院、Ｌ．Ｃ．ツーイにより提供されたもの）から除去され、平滑断片として挿入された。生成するプラスミド、ｐＡｖＳ６−ＣＦＴＲ（図６）はＫｐｎＩで線形化され、トラップネル、先端薬物送達レビュー、１２：１８５−１９９（１９９３年）で記述されているように２９３細胞内のＡｄ−ｄ１３２７の巨大（３５キロベース）ＣｌａＩ断片で組み換えられ、ＡｖｌＣｆ２を形成した（図７）。二重プラーク精製後、クローン分離株の同定は前に記載されているようにサザン分析、ＣＦＴＲの免疫沈殿により確認された（トルストシェフ、他、第９回名古屋癌処置国際シンポジウム紀要、日本、名古屋１９９３年９月１７−１８日（刊行））。Ａｖ１Ｌｕｃｌ（図７）（イエイ他、遺伝子治療、１巻、１９２−２００ページ（１９９４年））は、それがホタルルシフェラーゼ遺伝子（ジェンバンク、アクセス番号Ｍ１５０７７）を発現することを除けばＡｃｌＣｆ２のゲノム体制および配列と同一のアデノウイルスレポーターベクターである。ホタルルシフェラーゼ遺伝子はｐＧＥＭ−ｌｕｃ（図８、プロメガ）から得られた。ｐＧＥＭ−ｌｕｃはホタルルシフェラーゼ遺伝子を接合（スプライシング）するためにＳｔｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化された。ホタルルシフェラーゼ遺伝子はｐＡｖＳ６のＥｃｏＲＶ部位に挿入され、ホタルルシフェラーゼコード化配列の５′末端はアデノウイルス５三部分リーダーにもっとも近くなった。生成するプラスミド、ｐＡｖＳ６−Ｌｃｕｌ（図９）はＫｐｎＩで線形化され、前記記載の通りＡｄ−ｄ１３２７の巨大（３５キロベース）ＣｌａＩ断片で組換えられた。クローン分離株は次いで前記記載の通り同定された。二つのウイルスベクターは増殖され、ＣｓＣｌ配向での二重巻付けにより精製され、ローゼンフェルド他、細胞、６８：１４３−１５５（１９９２年）で記述されている通りに２９３細胞内で滴定された。実施例２同時断続的ステロイド投与でのアデノウイルス媒介遺伝子転移コットンラット（体重約１５０ｇ）が各グループ９ラットの４グループに分けられた。１日当り２ｍｇ／ｋｇの量の腹腔内注射によるデキサメタゾンの同時投与のある場合とない場合で、ＡｖｌＣｆ２がコットンラットの肺に低用量（１０⁸ｐｆｕ）あるいは高用量（１０¹⁰ｐｆｕ）で鼻腔内吸入で投与され、ベクター投与の開始１日前から１０日後まで与えられた。対照グループのラットは前記記載のデキサメタゾンの同時投与のある場合およびない場合でＡｖｌＣｆ２の代りにＰＢＳを与えられた。ベクター投与の３日後および４２日後に、各グループからの３匹のラットがＡｖｌＣｆ２ベクターの宿主応答を評価された。宿主応答の評価は肺組織病理学外観、全肺洗浄細胞充実性、肺洗浄抗アデノウイルス生産、および細胞毒Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を含んでいた。肺組織病理学の評価はイエイ他、ヒト遺伝子治療、５巻、７３１−７４４ページ（１９９４年）記載の通りに行われた。肺は除去され、４℃で一晩パラホルムアルデヒド０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ．）、グルタルアルデヒド０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ．）に固定され、パラフィンに包埋され、６μｍ部分がヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。アデノウイルス感染３日後、免疫抑制治療薬を毎日投与あるいは投与されなかったＡｖｌＣｆ２注射に対する応答によるコットンラットの肺の組織学的外観が図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃで示される。図１０ＡはアデノウイルスではなくＰＢＳを受けた対照ラットの肺の一部である。図１０Ｂは免疫抑制治療薬なしでＡｖｌＣｆ２を受けたラットの肺の一部である。図１０Ｃはデキサメタゾンを毎日投与されてＡｖｌＣｆ２を受けたラットの肺の一部である。すべての部分は１００倍拡大されている。図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃで見られるように、対照ラットおよびアデノウイルスに感染されたが免疫抑制治療薬を受けなかったラットと比較して、アデノウイルスおよび免疫抑制治療薬を受けたラットでは肺実質炎症は少なかった。肺洗浄液はＰＢＳ４．０ｍｌを用いて肺洗浄により収集され、全細胞数は血球計の計数で決定され、あるいは細胞は光学顕微による好中球の割合を細胞遠心分離調製で評価された。図１１ＡはＰＢＳを受けた対照ラットと比較した感染３日後のＡｖｌＣｆ２で感染したラットからの肺洗浄細胞計数のグラフである。対照ラットはデキサメタゾンを受けたあるいはデキサメタゾンを受けなかったかのいずれかであった。図１１ＢはＰＢＳを受けた対照ラットと比較した感染４２日後のＡｖｌＣｆ２で感染したラットからの肺洗浄細胞計数のグラフである。ラットはデキサメタゾンを受けたあるいは免疫抑制治療薬を受けなかったかのいずれかであった。図１１Ａで見られるように、炎症の頂上であるベクター投与３日後で、デキサメタゾンは全肺洗浄細胞充実性で表される）非特異的宿主細胞炎症応答を著しく減少させた。肺洗浄抗アデノウイルス生産はエリザ検定で測定され以下の通り行われた。１×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌでＡｖｌＬａｃＺ４、１０μｌ（イエイ、他、ヒト遺伝子治療、５巻、７３１−７４４ページ、（１９９４年））が０．５ｍｌエッペンドルフ管の二重蒸留水９０μｌに加えられた。管はアデノウイルスを殺すために３０分紫外線を照射され、タンパク質濃度がバイオラッドキット（Bio-Rad Kit）を用いて測定された。０．１Ｍの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）８ｍｌが、ウエル当り５０μｌ当りアデノウイルス抗原１０μｇ／４ｍすなわち１２５ｎｇのタンパク質産出を提供するために加えられた。抗原５０μｌが次いで９６ウエルマイクロタイタ平板（インミュロン２）の各ウエルに加えられた。また平板は３７℃で１時間、あるいは室温で２時間、もしくは４℃で一晩保温された。平板は次いで２回ＰＢＳあるいは二重蒸留水で洗浄された。遮断緩衝液（ＰＢＳに１％のＢＳＡ）３００μｌが各ウエルに加えられ、平板は１時間室温で保温された。平板は次いで二重蒸留水で洗浄された。遮断薬が次いでバックグラウンドウエルに加えられた。抗体サンプル（すなわち前記記載の通り調製された肺洗浄サンプル）５０μｌが次いで１／４から始まり１／８１９２で終る連続２倍の希釈で被覆ウエルに加えられた。未感染コットンラットから得た血清の負の対照サンプル５０μｌが同じ連続希釈のも一つの被覆ウエルに加えられた。この平板は２時間室温で保温され、０．０５％トウィーン２０／ＰＢＳ３００μｌが加えられた。平板は５分室温で保温され、空にされ、０．０５％トウィーン２０／ＰＢＳ３００μｌが再び加えられた。平板は再び室温で５分保温され、また空にされた。平板は次いで二重蒸留水あるいはＰＢＳで洗浄された。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（１０μｇ／１０μｌ）が、１ｍｇ／ｍｌの作業液（１：１，０００希釈）を作るためにＢＳＡ１０ｍｌおよびＰＢＳに加えられた。この溶液１００μｌが次いで各ウエルに加えられ、平板は室温で２時間保温された。平板は次いで５回０．０１％トウィーン２０／ＰＢＳ３００μｌで洗浄された。平板は次いで空にされ乾燥された。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質１００μｌが各ウエルに室温で加えられ、色が直ちに展開した。青色がエリザ読み取り機でＯＤ₆₅₀での読み取りでモニターされた。ＴＭＢ停止溶液１００μｌを各ウエルに加えることによりＯＤ₆₅ ₀ が０．５から０．６になった時に反応が停止された。ＯＤ₄₅₀が次いで反応停止５分後および１時間後に読み取られた。抗体力価はバックグラウンドＯＤより０．１大きいＯＤ値を与える希釈の逆数である。選択肢として、抗体力価は非特異的バックグラウンドを上回る３標準偏差として決定される。ベクター投与３日および４２日後の各グループのラットに対して抗体力価で表現される平均結果は図１２で示される。図１２で示されるように、デキサメタゾンを与えられたラットはデキサメタゾンを与えられなかったラットと比較してベクター投与４２日後に抗体力価の減少を示した。ＣＴＬ検定がベクター投与４２日後に実施された。感作細胞が１００感染多重度でコットンラット肺繊維芽細胞をＡｄ−ｄ１３２７で感染させることにより用意された。細胞は３日保温され、ＦＡＣＳによりヘキソン発現を検査された。細胞は次いでＰＢＳ／ＥＤＴＡで洗浄され、トリプシンと接触され、洗浄され、回転され、ＲＰＭＩ培地１ｍｌで再懸濁された。細胞は次いでＤＮＡを不活性化するために５，０００ラドで¹³Ｃｓで照射された。脾臓が次いで未感染（対照）ラットおよび感染４２日後のアデノウイルス感染ラットから分離された。脾臓は無菌ＨＢＳＳおよび氷で保存された。ＨＢＳＳ１０ｍｌが次いで５０ｍｌ管で２５／２７ゲージ針で各脾臓に注射された。脾臓はつぶされ、細胞濾過器を使って５０ｍｌ管に濾過された。この量は次いでＲＰＭＩプラス１０％ＦＣＳで４０ｍｌにされた。管は１，５００ｒｐｍで１０分回転された。赤血球が次いでＡＣＫ溶離緩衝液２．１ｍｌを加えて溶離され、液は１分以内で渦動された。この量はＲＰＭＩ−１０で５０ｍｌにされた。管は次いで１，５００ｒｐｍで１０分回転された。細胞ペレットは次いで再懸濁され、細胞は１：１０溶液で計数された。脾臓細胞は次いで感作細胞と共に脾臓細胞と感作細胞の比率がＲＰＭＩ内で４：１になるように平板に移された。脾臓細胞と感作細胞は３７℃でインターロイキン−２、２０−５０単位／ｍｌの存在下で保温された。インターロイキン−２は毎日５−６日にわたり加えられた。標的細胞が３×１０⁶コットンラット肺繊維芽細胞をＡｄ−ｄ１３２７で１００感染多重度で１時間感染させて用意された。培養培地が細胞に加えられ、５０ μＣｉより大きな量で⁵¹Ｃｒが１８時間加えられた。標的細胞はコットンラット繊維芽細胞をＥＤＴＡ／ＰＢＳで洗浄して収穫され、次いでトリプシン消化された。細胞は次いで洗浄され、回転され、培養培地５ｍｌで再懸濁され、その計数された。細胞は１０⁵細胞／ｍｌに再懸濁され、１０⁴細胞／０．１ｍｌウエルがＣＴＬ検定のため使用された。エフェクター細胞（すなわち時々Ｅｓ細胞として引用される脾臓細胞と感作細胞を組合せたもの）は１．５００ｒｐｍで１０分４℃で回転された。細胞はＨＢＳＳ−１０、２ｍｌで再懸濁され、フィコール・ハイパック（Ficoll Hypaque）にのせられ、１，５００ｒｐｍで１０分回転された。最上部部分（４ｍｌ）が収穫され、培養培地５ｍｌが加えられた。この材料は回転され、細胞ペレットは蓄えられ、培養培地１ｍｌで再懸濁された。エフェクター細胞はエフェクター細胞５０μｌをトリパンブルー５０μｌで混合して計数された。エフェクター細胞は次いでエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率が３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、および１００になるように、１０⁴標的細胞を含むウエルに加えられた。細胞は次いで５００ｒｐｍで５分回転された。細胞は次いで３７℃で４時間保温された。細胞は次いで回転され、上澄み１００μ ｌがウォーラックガンマカウンターを用いて⁵¹Ｃｒ放出を測定された。（デキサメタゾン処理を受けたものおよびそうでないものの）感染ラットから、および２匹の未感染対照ラットから採取された脾臓におけるＣＴＬ応答の平均結果が図１３で示される。図１３で示されるように、低いＣＴＬ応答がデキサメタゾンで処理された感染ラットから得られた脾臓から得られた。ベクター投与の４２日後、各グループの残る３匹のラットはＡｖ１Ｌｕｃｌの鼻腔内肺投与を２×１０⁹ｐｆｕの用量で受けた。もともとＰＢＳを受けた残る対照ラットもまたＡｖ１Ｌｕｃｌを２×１０⁹ｐｆｕの用量で受けた。肺洗浄抗アデノウイルス抗体生産は前記記載の方法に従ってＡｖ１Ｌｕｃｌ投与の３日後に評価され、その結果は図１２で示される。図１２で示されるように、もともとＡｖｌＣｆ２の１０¹⁰ｐｆｕを受け、またデキサメタゾンで処置されたラットはデキサメタゾンを受けなかったラットと比べて抗体力価の減少を示した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の転移および発現の効率は、イエイ他、遺伝子治療、１巻、１９２−２００ページ（１９９４年）に記載された通り、投与３日後に直接肺内ルシフェラーゼ酵素活性を通常の光測定による光単位（１ｕ）で定量化することにより評価された。結果は図１４で示される。図１４で示されるように、各ドットは１匹のラットのルシフェラーゼ酵素活性を表し、クロスバーは各グループの平均値を表す。反復アデノウイルス媒介遺伝子転移の効率は、最初のアデノウイルス投与の時点でデキサメタゾンを受けなかったラットに比べてＡｖｌＣｆ２およびデキサメタゾンを受けたラットの方がはるかに高かった（それぞれ１１，７８６±３５２３ｌｕ対６２２±１９２ｌｕ）。Ａｖ１Ｌｕｃｌからの遺伝子転移の効率もまたもともとデキサメタゾンと一緒にＰＢＳを受けた対照グループよりも高かった。実施例３アデノウイルスベクターの有効な反復投与を可能にするＤＳＧあるいは高用量シクロホスファミドを用いる体液免疫応答の抑制この実施例は実験時に生後５乃至６週のＣ５７ＢＬ／６オスマウス（インディアナ、インディアナポリス、ハーラン・スプレイグ・ドーリー）に対しアデノウイルスベクターＡｖｌＬａｃＺ４およびＡｖ１Ｈ９Ｆ２の静脈内投与について述べる。ＡｖｌＬａｃＺ４は核標的βガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を含むアデノウイルスベクターであり、１９９５年４月１３日公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／０９６５４に記述されている。Ａｖ１Ｈ９Ｆ２はアデノウイルスシャトルプラスミドベクターｐＡｖｌＨ９ＦＲ（回１５）の誘導体から構築され、これはヒト因子IX ＤＮＡを含み、１９９４年１２月２２日公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４７１に記述されている。Ａｖ１Ｈ９Ｆ２を構築するために、シャトルプラスミドｐＡｖｌＨ９ＦＲが制限酵素Ｓｆｉ１で消化され、ＤＮＡ末端はＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にされ、またＤＮＡ分子は連結反応により再循環された。コンピテントＤＨ５細胞は形質転換されアンピシリン耐性クローンは増幅され、ミニプレップＤＮＡの制限酵素消化によりスクリーンされた。正のクローンが同定され、生成するシャトルプラスミドはｐＡｖＳ１７Ｈ９Ｆとして引用された。続いて２９３細胞がｐＡｖＳ１７Ｈ９ＦおよびＣ１ａＩ消化Ａｄ−ｄ１３２７の巨大ＤＮＡ断片と一緒に同時形質移入された。組換えアデノウイルスベクタープラークが採取され、拡張され、エリザにより因子IXの発現をスクリーンされた。正のクローンは同定され増幅され、かくしてベクターＡｖ１Ｈ９Ｆ２を生成した。このベクターの左端の図形は図１６で示される。Ａｖ１Ｈ９Ｆ２は三部分リーダー、つまりＴＰＬの最初の所で１塩基対を欠失し、これが有効にＡＴＧをＣＴＧに変化させる。ベクターの構造は制限酵素診断法、およびＲＳＶプロモーターと因子IX ｃＤＮＡの３′未翻訳領域の間の領域のＤＮＡ配列分析により実証された。１５匹のマウスが３３ｍｇ／ｋｇのデオキシスペルグアリンＤＳＧ（日本、東京、日本化薬工業）を用いて、１日１回ベクター投与の１日前から全体で８日腹腔内投与で免疫抑制された。減圧凍結乾燥ＤＳＧ１００ｍｇを含む小びんが２５ｍｇ／ｍｌ溶液を産出するため注射グレード水３．８ｍｌで溶かされ、これはアリコートされ、−２０℃で乾燥された。毎日、免疫抑制直前に、アリコートは室温で解凍され、０．７ｍｌが２．５ｍｇ／ｍｌ溶液を産出するためにハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）６．３ｍｌと混合された。マウスは１度ＤＳＧの最初の用量投与直前に重量測定された。６匹のマウスは免疫抑制養生の第２日に尾部血管注射でＡｖ１１ａｃＺ４、１×１０⁸ｐｆｕを受け５週後にＡｖｌＨ９Ｆ２、１×１０⁸ｐｆｕを受けた。別の６匹のマウスは免疫抑制の５週後にＡｖｌＨ９Ｆ２のみを受けた。３匹のマウスは免疫抑制されたが、アデノウイルスベクターは受けなかった。６匹のマウスが低用量（１００ｍｇ／ｋｇ）のシクロホスファミド（シグマ）で免疫抑制され、１５匹のマウスが高用量（３００ｍｇ／ｋｇ）で処置された。動物はアデノウイルスベクター投与の１日前にシクロホスファミドの腹腔内単一投与を受けた。低用量のシクロホスファミドで処置された６匹すべてのマウスは更にシクロホスファミド（投与）１日後Ａｖ１１ａｃＺ４、１×１０⁸ｐｆｕをまた５週後ＡｖｌＨ９Ｆ２、１×１０⁸ｐｆｕを受けた。高用量のシクロホスファミドで免疫抑制された６匹のマウスは翌日Ａｖ１１ａｃＺ４、１×１０⁸ｐｆｕを、また５週後にＡｖｌＨ９Ｆ２、１×１０⁸ｐｆｕを受けた。別の６匹はＡｖ１１ａｃＺ４は受けずＡｖｌＨ９Ｆ２を受けた。最後に３匹のマウスは免疫抑制されたが、アデノウイルスベクターは受けなかった。１２匹のマウスは１日１回ベクター投与の１日前から８日間腹腔内経由でデキサメタゾン（ニューヨーク、シャーリー、アメリカン・リエイジェント・ラボラトリーズ、インコーポレイテッド）５ｍｇ／ｋｇで免疫抑制された。この内６匹のマウスはデキサメタゾン処置の２日目にＡｖ１１ａｃＺ４、１×１０⁸ｐｆｕを、また５週後にＡｖｌＨ９Ｆ２、１×１０⁸ｐｆｕを受ける。５匹の免疫抑制されたマウスはＡｖｌＨ９Ｆ２のみを受け、１匹はベクターを受けなかった。Ａｖ１１ａｃＺ４投与の５週後、但しＡｖｌＨ９Ｆ２の投与の前に、血漿がいくつかのマウスから調製され、抗アデノウイルス中和抗体を分析された。中和抗体は免疫抑制なしでＡｖ１１ａｃＺ４を受けるマウスの血漿内で検出されたが、ベクターおよびＤＳＧあるいは高用量のシクロホスファミドのいずれかを受けたマウスは中和抗体を検出しなかった。対照的に、低用量のシクロホスファミドあるいはデキサメタゾンで免疫抑制されたマウスは中和抗体を展開した。２０匹のマウスにおける中和抗体力価は以下の表Ｉで与えられる。表Ｉで示されるように、ＤＳＧはデオキシスペルグアリン、Ｃｙはシクロホスファミド、およびＤｅｘはデキサメタゾンである。ＡｖｌＨ９Ｆ２投与１週後、血漿が調製されヒト因子IXの水準を決定するためにエリザで分析された。この結果は図１７で示される。免疫抑制なしでＡｖ１１ａｃＺ４を受け、次いで５週後ＡｖｌＨ９Ｆ２を受けたマウスはヒト因子IXを発現しなかった。免疫抑制剤もＡｖ１１ａｃＺ４も受けなかったがＡｖｌＨ９Ｆ２で処置されたマウスは平均で９．２μｇ／ｍｌを発現した。Ａｖ１１ａｃＺ４送達時にＤＳＧで免疫抑制され、次いでＡｖｌＨ９Ｆ２を受けたマウスは平均で６．６μｇ／ｍｌを発現した。ＤＳＧで免疫抑制されしかしＡｖ１１ａｃＺ４は受けず、次いでＡｖｌＨ９Ｆ２で処置されたマウスは５．２μｇ／ｍｌの平均水準を有していた。最後にＤＳＧで処置されしかしいずれのベクターも受けなかったマウスは、ヒト因子IXを発現しなかった。Ａｖ１１ａｃＺ４投与の時点で低用量のシクロホスファミドで免疫抑制されたマウスは、ＡｖｌＨ９Ｆ２送達後ヒト因子IXを発現しなかった。高用量のシクロホスファミドで処置されたがＡｖ１１ａｃＺ４を投与されなかったマウスは、ＡｖｌＨ９Ｆ２送達１週後平均８μｇ／ｍｌを発現した。Ａｖ１１ａｃＺ４処置時点で高用量のシクロホスファミドで免疫抑制されたマウスは、ＡｖｌＨ９Ｆ２処置後平均１５．４μｇ／ｍｌのヒト因子IXを発現した。シクロホスファミドで処置されたがいずれのアデノウイルスベクターでも処置されなかったマウスはヒト因子IXを発現しなかった。デキサメタゾンで免疫抑制されたがＡｖ１１ａｃＺ４では処置されなかったマウスは、ＡｖｌＨ９Ｆ２投与１週後平均５．５μｇ／ｍｌのヒト因子IXを発現した。しかし免疫抑制時点でＡｖ１１ａｃＺ４を受けたマウスはＡｖｌＨ９Ｆ２送達後に因子IXを発現しなかった。免疫抑制されたがいずれのベクターをも処置されなかったマウスはヒト因子IXを発現しなかった。実施例４反復投与を可能に死するアデノウイルスベクターに対する体液免疫応答の抑制この実施例は実施例３に含まれるデータを推敲し敷衍したものである。この実施例では下記の材料および方法が採用される。アデノウイルスベクターＡｖ１ＬａｃＺ４およびＡｖｌＨ９Ｆ２は実施例３で記述された。ＡｖｌＨ９ＦＲは２９３細胞をｐＡｖｌＨ９ＦＲ（図１５）およびＣｌａＩ消化Ａｄ−ｄ１３２７から得る巨大ＤＮＡ断片と共に同時形質移入された。組換えアデノウイルスベクタープラークが採取され、拡張され、エリザにより因子IXの発現をスクリーンされた。正のクローンが同定され、増幅され、かくしてベクターＡｖｌＨ９ＦＲを生成した。ＡｖｌＨ９Ｆ２と同様に、このベクターは中心切形第１イントロンおよびヒト因子IX遺伝子からの完全５′および３′未翻訳領域を含んでいる。中心切形第１イントロンおよび３′未翻訳領域はジャラット、他、ＥＭＢＯＪ．、９巻、３２９５−３３０１ページ（１９９０年）に記載されたものと基本的には同じ配列である。ＡｖｌＡＬＡＰＨ８１はアデノウイルスベクターであり、それはマウスアルブミンプロモーターから発現されたＢ領域欠失ヒト因子VIII ｃＤＮＡを含み、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４７１に記述されている。すべてのベクター株はＥ１ａ配列の定量ＰＣＲ分析で決定された通り１０⁶野生型アデノウイルス内で１個以下を含んでいた。免疫抑制剤デオキシスペルグアリン（日本、東京、日本化薬工業株式会社製造）は、ニュージャージー、プリンストン、ブリストル−マイヤーズ−スクイブからの贈り物である。１００ｍｇガラスビンのデオキシスペルグアリンは水で溶かされて最終濃度２５ｍｇ／ｍｌとなり、アリコートされ、−７０℃で凍結された。凍結株は室温で解凍され、注射の前にハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で希釈された。デオキシスペルグアリンは器官移植で現在臨床試験されている免疫抑制剤である。これは抗原特異的Ｂ細胞に対して有力で長期の効果を持ち、タンパク質抗原と同時投与されると特異的抗体の生産を効果的に妨げることが示された（アレーガー、他、移植、５７巻、１７８６−１７９４ページ（１９９４年）；テッパー、ニューヨーク科学アカデミー年報、１２３−１３２ページ（１９９３年）；タフバソン、他、移植紀要、２６巻、３０２９−３０３９ページ（１９９４年））。ＤＳＧの作用モードは分子レベルでは完全には理解されていない。それはＢ細胞およびＴ細胞の分化に干渉し、かつ抗原処理に干渉することをデータは示唆している。ＤＳＧがｋ軽鎖発現を阻害し、従ってプレＢ細胞表面でＩｇＭ発現を遮断したことを最近の研究が示した（テッパー、１９９３年）。更にデータはＤＳＧがＮＦｋＢの核転移を阻害したことを示し、それはＤＳＧがＢ細胞およびＴ細胞の分化を阻害する機構であり得ることを示した。最後にＤＳＧがＨｓｃ７０、熱ショックタンパク質と結合することが示された（テッパー、１９９３年）。熱ショックタンパク質はタンパク質折りたたみ、分子付添い、ＭＨＣ分子のペプチド負荷、および抗原プレゼンテーションを伴う。従ってＤＳＧのＨｓｃ７０への結合は抗原プレゼンテーションに対する影響を説明するものとなる。シクロホスファミド（Ｃｙ）はシグマから入手され、ＨＢＳＳに溶解された。デキサメタゾン（Ｄｅｘ）溶液はニューヨーク、シャーリー、アメリカン・リエージェント・ラボラトリーズ・インコーポレイテッドから得られ、注射の前にＨＢＳＳで希釈された。３種すべての免疫抑制剤は、以下に示される用量に従って腹腔内に送達された。動物の処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスはハーラン・スプレイグ・ドーリー（インディアナ、インディアナポリス）から得られた。アデノウイルスベクターはベクター株の適当量をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）０．５ｍｌで希釈した後尾部血管注射を経て投与された。テキストに示された時点で、血液が眼窩後部叢から得られた。血漿サンプル調製のために、クエン酸ナトリウムが直ちに０．３８％（ｗ／ｖ）の最終濃度に加えられた。血清サンプルを調製するために、血液は凝固させられた。サンプルは５分エッペンドルフ・マイクロフュージで遠心分離され、その後血漿あるいは血清は収集され、アリコートされ、凍結された。ヒト因子VIIIエリザヒト因子VIIIの血漿水準はコネリー、他、ヒト遺伝子治療、第６巻、１８５− １９３ページ（１９９５年）に記述された通り、エリザにより決定された。Ｂ領域欠失ヒト因子VIIIを含むマウス血漿サンプルを用いる感受性の限界は３乃至６ｎｇ／ｍｌであった。マウス血漿サンプルは検定前に１：５で希釈されたので、実際の検出限界は１５乃至３０ｎｇ／ｍｌであった。ヒト因子IXエリザヒト因子IXの血漿水準はエリザにより決定された。アサーラクロムIX：Ａｇエリザキットはアメリカン・バイオプロダクツ・カンパニー（ニュージャージ、パーシッパニイ）から購入され、メーカーの指示に従って行われた。感受性の限界は１．６ｎｇ／ｍｌであった。抗アデノウイルス抗体検定マウス血漿あるいは血清サンプルは５５℃、３０分で熱不活性化され、次いで改良最少必須培地（メリーランド、ロックビル、バイオフルイズ）プラス２％のＦＢＳ（ＩＭＥＭ／２％ＦＢＳ）で１：２で始まる二部分の段階で熱不活性化された。５５μｌの各サンプルが１０μｌのＡｖｌｌａｃＺ４（４×１０⁵ｐｆｕを含むもの）で混合され、１時間３７ ℃で保温され、ほぼ密集の２９３細胞の９６ウエル平板（４×１０⁴細胞／ウエル）に加えられた。組織培養恒温器で６０分後、ウイルスは各ウエルから吸引されＩＭＥＭ／１０％ＦＢＳ、１５０μｌで置換された。翌日細胞は固定され、これまでに記述されているようにβガラクトシダーゼ発現のために染色された（スミス、他、自然遺伝学、５巻、３９７−４０２ページ（１９９３年））。不活性抗体の不存在下ではすべての細胞は青に染色した。各サンプルの不活性化抗体の力価は細胞の２５％以下が青に染色される最高希釈の逆数として報告された。結果アデノウイルスベクターに対する体液免疫応答の用量依存性アデノウイルスベクターの反復投与を検討したこれまでの研究はベクターの相対的に高用量を採用しており、これは免疫応答の強度を最大にするものと期待された（スミス、他、１９９３年；コザルスキー、他、生物科学ジャーナル、２６９巻、１３６９５−１３７０２ページ（１９９４年）；ケイ、他、全米科学アカデミー紀要、９１巻、２３５３−２３５７ページ（１９９４年）；イエイ、他、遺伝子治療、１９２−２００ページ（１９９４年）；ヤング、他、ウイルス学ジャーナル、６９巻、２００４−２０１５ページ（１９９５年）；デイ、他、全米科学アカデミー紀要、９２巻、１４０１−１４０５ページ（１９９５年）；バー、他、遺伝子治療、２巻、１５１−１５５ページ（１９９５年））。中和抗体の生産および反復投与の遮断が接種されるベクターの用量に依存するかどうかを決定するために、各種の用量のアデノウイルスベクターＡｖｌｌａｃＺ４が尾部血管を経てＣ５７ＢＬ／６マウスに投与された。ベクター接種材料は単一ｌｏｇ増分で１×１０³ｐｆｕから１×１０⁸ｐｆｕまで変動した。ベクター送達３４日後、抗アデノウイルス中和抗体の血清水準がベクターを１×１０⁵ｐｆｕあるいはそれ以上を受けたマウスで測定された（図１８）。マイナス記号はコホート内のマウスのいずれにも抗体を検出できなかったことを示す。１×１０⁸ｐｆｕのベクターを受けたマウスに対応するプラス記号は５匹のマウスの内３匹が８の抗体力価を持ち、一方２匹は抗体力価を検出できなかったことを示す。かくして１×１０⁸ｐｆｕを受けた５匹のマウスの内の３匹は４×１０⁵ｐｆｕのＡｖｌＬａｃＺ４を中和するのに十分な抗アデノウイルス抗体の水準を有し、一方２匹のマウスは検出できない水準にあった。ベクターの低用量を受けたマウスはいずれもこの相対的に過酷な中和検定を用いても抗体を検出できなかった。ＡｖｌｌａｃＺ４投与３５日後に、各マウスはヒト因子IXをコード化するアデノウイルベクターであるＡｖｌＨ９ＦＲを２×１０⁸ｐｆｕ受けた。１週間後ヒト因子IXの血漿水準はエリザで測定された（図１８）。平均で約２μｇ／ｍｌの因子IXがＡｖｌｌａｃＺ４を受けなかったか、あるいは第１ベクター１×１０⁵ ｐｆｕまでを受けたマウスで検出された。因子IXは更に１×１０⁶ｐｆｕおよび１×１０⁷ｐｆｕを受けたマウスで水準は減少したけれども直ちに検出された。ＡｖｌｌａｃＺ４、１×１０⁸ｐｆｕを受けたマウスはＡｖｌＨ９ＦＲ投与後殆ど僅かしかあるいは全然ヒト因子IXを産出しなかった。かくして有効な遺伝子転移および発現は最初のベクター用量があるしきい値水準以下であるという条件下で第２ベクター投与で達成することができる。これらのデータはＣ５７ＢＬ／６マウス内の静脈内送達のために、この値が１０⁷および１０⁸ｐｆｕであることを示している。一過性免疫抑制はベクター再投与の効率を増加させる一過性免疫抑制がアデノウイルスベクターの再投与を可能にするかどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスがＡｖｌｌａｃＺ４の１×１０⁸ｐｆｕを投与する時にデオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）、シクロホスファミド（Ｃｙ）、あるいはデキサメタゾン（Ｄｅｘ）のいずれかを用いて免疫抑制された。前に示されたように、この用量は有効な第２送達を完全に妨げた。マウスは毎日ＤＳＧを３３ｍｇ／ｋｇ注射され、それはベクター送達１日前から開始され更に７日続けられた。デキサメタゾンは同じ時間コースで５ｍｇ／ｋｇの用量で送達された。シクロホスファミドはベクター送達の１日前１回１００ｍｇ／ｋｇあるいは３００ｍｇ／ｋｇのいずれかを投与された。対照マウスは免疫抑制なしでＡｖｌｌａｃＺ４を受け、あるいは最初のベクター送達なしで免疫抑制された。ベクター投与の５週後、抗アデノウイルス中和抗体の血漿水準が測定された（図１９）。ＤＳＧあるいはシクロホスファミド３００ｍｇ／ｋｇで免疫抑制されたマウスは中和抗体を検出しなかったが、ＡｖｌｌａｃＺ４を受けた他のすべてのマウスは中和抗体を生成した。第１ベクター注射３５日後、マウスはＡｖｌＨ９Ｆ２、１×１０⁸ｐｆｕを受けた。ＡｖｌＨ９Ｆ２注射１週後、血漿サンプルが調製され、ヒト因子IXの水準がエリザで測定された（図１７）。ＤＳＧあるいはシクロホスファミド３００ｍｇ／ｋｇで免疫抑制されたマウスは第１ベクターで処置されなかったマウスの水準とほぼ同じ水準でヒト因子IXを発現した。ＡｖｌｌａｃＺ４投与の時点で免疫抑制されなかったマウスの血漿ではヒト因子IXは検出されなかった。これらの研究で使用された条件下で、デキサメタゾンあるいはシクロホスファミド１００ｍｇ／ｋｇでの免疫抑制は反復注射の際に因子IXの発現を可能とするには有効ではなかった。かくして第２ベクター注射での遺伝子導入発現を達成する能力はＤＳＧあるいは高用量シクロホスファミド処置による中和抗体の抑制と相関していた。第２ベクターＡｖｌＨ９Ｆ２投与時に、シクロホスファミドあるいはデキサメタゾンで免疫抑制された各コホートのマウスの半分は第１ベクター送達と同じ処方を用いて再び免疫抑制された。５週後、抗アデノウイルス中和抗体の血漿水準が測定された。シクロホスファミド３００ｍｇ／ｋｇで免疫抑制されたマウスは中和抗体を検出しなかったが、一方シクロホスファミド１００ｍｇ／ｋｇあるいはデキサメタゾン５ｍｇ／ｋｇで免疫抑制されたマウスは測定可能な応答を示した（データは示されていない）。ＡｖｌＨ９Ｆ２注射３５日後、因子VIIIベクター、ＡｖｌＡＬＡＰＨ８１の１×１０⁹ｐｆｕがシクロホスファミド３００ｍｇ／ｋｇで免疫抑制されたマウスに投与された。更に因子VIIIベクターが免疫抑制されずにＡｖｌｌａｃＺ４およびＡｖｌＨ９Ｆ２を受けた対照マウスおよびまた投薬されていないマウスにも投与された。１週後、ヒト因子VIIIの血漿水準がエリザで測定された（図２０）。ＡｖｌＡＬＡＰＨ８１ベクターのみを受けた対照マウス、および２個の事前ベクター注射時点にシクロホスファミド３００ｍｇ／ｋｇで免疫抑制されたマウスはヒト因子VI IIを発現した。ＡｖｌｌａｃＺ４およびＡｖｌＨ９Ｆ２を免疫抑制なしで受けたマウス、およびＡｖｌｌａｃＺ４伝達時点で免疫抑制のみを受けたマウスはヒト因子VIIIを発現しなかった。ＤＳＧは臨床関連用量時に有効な反復投与を許容するＤＳＧあるいはシクロホスファミドのいずれかの高用量がアデノウイルスベクターの再投与を許容したが、臨床関連用量のシクロホスファミドおよびデキサメタゾンは有効でなかったことを先の実験は示した。次の目標は低用量のＤＳＧが有効であるかどうかを決定することであった。最初の実験で使用されたＤＳＧの用量（３３ｍｇ／ｋｇ）はマウスにおいて最大許容用量に近く、器官移植でヒト臨床実験で使用される５−７ｍｇ／ｋｇに比べて著しく高い（鈴木、他、ニューヨーク科学アカデミー年報、６９６巻、２６３−２６９ページ（１９９３年）；ジンドール、他、シナイ山医学ジャーナル、６１巻、５１−５６ページ（１９９４年））。低用量がベクター再投与を許容するのにまた有効であるかどうかを決定するために、マウスはＡｖｌｌａｃＺ４の１×１０⁸ｐｆｕの投与時点でＤＳＧ５、１０、２０、および３３ｍｇ／ｋｇで免疫抑制された。免疫抑制はベクター送達の１日前に開始し全体で８日継続された。ベクター送達の日に、アデノウイルスの注射後にＤＳＧは与えられたが、それは抗原の後に投与された時にＤＳＧがもっとも有効であったためであった（高原、他、移植、５３巻、９１４−９１８ページ（１９９２年））。３５日後各マウスはＡｖｌＨ９Ｆ２、１×１０⁸ｐｆｕを受けた。ＡｖｌＨ９Ｆ２投与１週後、ヒト因子IX血漿水準はエリザで測定された（図２１）。ＡｖｌｌａｃＺ４で事前免疫されなかった対照マウスは平均９μｇ／ｍｌのヒト因子IX を発現した。ＡｖｌｌａｃＺ４は受けたが免疫抑制されなかった他の対照マウスはＡｖｌＨ９Ｆ２投与後ヒト因子IXを発現しなかった。３３ｍｇ／ｋｇのＤＳＧで免疫抑制された１匹のマウスは１２μｇ／ｍｌのヒト因子IXを発現した。２０ｍｇ／ｋｇのＤＳＧで免疫抑制された６匹のマウスの内の５匹は平均３．０μｇ／ｍｌのヒト因子IXを発現し、１匹のマウスは何も発現しなかった。１０ｍｇ／ｋｇの用量で免疫抑制されたマウスは３０ｎｇ／ｍｌから８μｇ／ｍｌまでにわたる広範囲のヒト因子IXを発現した。５ｍｇ／ｋｇで免疫抑制された３匹のマウスはヒト因子IXを発現せず、一方他の３匹のマウスは２乃至７μｇ／ｍｌにわたる水準を発現した。ＡｖｌｌａｃＺ４投与の時点で免疫抑制されなかったマウスはヒト因子IXを発現しなかった。討議データが示す所によると、多重静脈内投与および生成する遺伝子導入発現はベクター送達の時点で短いコースの免疫抑制で処理された免疫能動物で達成することができる。この観察は重要である。というのはアデノウイルスベクターに対し向けられる体液免疫応答は再投与を妨げるということを最近のいくつかの研究が示しているからである（スミス、他、１９９３年；ケイ、他、１９９４年；イエイ、他、１９９４年；ヤング、他、１９９５年）。ベクターを再投与できないことはアデノウイルスベクターの臨床利用に重要な障害を提供した。というのは有効な再投与は慢性疾病の遺伝子治療にこれらベクターの臨床適用が間違いなく必要とされるからである。免疫抑制の不在の下で発現および反復用量投与を得ることの失敗はアデノウイルス中和抗体と相関する。そのような抗体が十分に再投与を遮断する証拠はヤング他、１９９５年に提供され、彼はベクターで事前処理されたマウスから投薬されていないマウスへの血清の受身送達が肝臓におけるベクター媒介遺伝子発現を妨げることができることを示した。反復投与を妨げる免疫システムの役割もまたベクターの反復投与が免疫不全マウスに有効であるという観察から示された（ヤング、他、１９９５年；デイ、他、１９９５年；バー、他、遺伝子治療、２巻、１５１−１５５ページ（１９９５年））。この結果は、ＡｖｌＡＬＡＰＨ８１、５×１０⁸ｐｆｕ送達５週後の重症複合型免疫不全症マウス（scid mice）へのＡｖｌＨ９Ｆ２の有効な投与を例示することにより確認された（データは示されていない）。アデノウイルス投与に対する体液応答を記述するこれまでの報告書は相対的に高ベクター用量を使用していたので、我々は当初のベクター用量と有効な反復遺伝子転移を達成する能力との間に関係を評価した。その結果は免疫応答の大きさがベクターの当初の量に依存しており、この用量がしきい値以下であるとすると、第２投与が可能であることを示していた。この水準が僅か１乃至２桁臨床関連ベクター用量以下に過ぎなかったという結論は更にベクター送達の時点での免疫抑制が再投与を許容するということを示唆していた。抗アデノウイルス中和抗体力価が尾部血管経由でベクター単一投与の後にマウスの中で少なくとも１０ケ月保持されることを出願人は観察した。力価の長期の保持は、形質導入細胞において、進行中のアデノウイルスバックボーン遺伝子発現が低水準にあるということに帰因している。バックボーン遺伝子発現を減少しあるいは除去するように設計されたベクターはより弱い遺伝子応答を引き出し、従って再投与を成功させるための免疫抑制の必要を少なくさせる。ＤＳＧの一つの重要な性質は、それが免疫システムの一般的な抑制を生み出さず、それが薬剤処置の時点で提示される特異的抗原に対する応答の選択的欠除に帰着するということである。ベクター送達に続く７日間にわたるＤＳＧの免疫抑制はベクターに対する体液応答を効果的に阻害し、効果的な第２投与を可能にしたことを我々は発見した。ＤＳＧを用いる最初の実験は３３ｍｇ／ｋｇという高用量を採用したが、これはマウスにおける最大許容用量に近くまたヒト実験で使用される用量の数倍高い量である。同じ８日コースにわたり投与され、内７日がベクター処置後になる時、低用量のＤＳＧはまたベクターの反復投与を可能とするのに有効であった。因子IX発現の水準でより大きな個々の変化が減量された用量で見られ、もっとも試験された最低の用量（５ｍｇ／ｋｇ）でも著しい因子IX発現が６匹の動物の内３匹で見られた。ベクター注射の１日前３００ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたシクロホスファミドもまた体液応答を遮断するのに有効であり因子IXアデノウイルスベクターを用いた完全に有効な第２回注射を可能にした。更にベクターをコード化する因子VI IIを用いた第３回注射もまた、前の２個のベクター投与でそれぞれシクロホスファミドの単一用量の前に置かれた場合に完全に有効であった。シクロホスファミドはホジキン病および他の白血病の治療で抗癌剤として臨床的に使用される。それはまた因子VIIIタンパク質置換治療で阻害体を進化させる血友病患者治療に免疫抑制剤として使用される（エイルドート、血液学アメリカンジャーナル、４７巻、２０８−２１７ページ（１９９４年）；ニルソン、他、ニューイングランド医学ジャーナル、３１８巻、９４７−９５０ページ（１９８８年））。マウスで再投与を成功裡に得るために使用される用量がヒトで一般に使用されるものよりもかなり高いが、一方より低い臨床的に受け入れられる用量がヒトに有効であるかどうかは確証すべきものとして残っている。器官移植セッティングの経験から示唆される一つの可能性は、免疫抑制剤の組合せが毒性がより少なくて免疫システムのより有力な抑制を産みだすであろうということである。例えばシクロホスファミドはデキサメタゾンと併用されると低用量で有効である。必要とされる免疫抑制の度合が治療を実施するのに必要となるベクターの用量に依存することも可能である。この研究で使用されたＡｖｌＨ９Ｆ２の用量、１×１０⁸ｐｆｕは５−１０μｇ／ｍｌのヒト因子IXの血漿水準を生み出し、これは血友病患者を治療する水準を２０− ５０倍上回っていた。高水準で導入遺伝子産物を発現し比較的低い用量で投与することのできるＡｖｌＨ９Ｆ２などのベクターは免疫刺激の範囲および必要とされる免疫抑制の度合を必ず減少させるものとなる。要約すると、全身投与アデノウイルスベクターの有効な反復性送達は短期間の免疫抑制で達成できることを出願人は示してきた。重要なことは、これはヒトでの使用が認められるかあるいは臨床試験をされているかの薬剤を用いて達成できるということである。この明細書において引用されたすべての特許、公開情報（公開特許出願を含む）、およびデータベースアクセス番号、ならびに受託アクセス番号の開示は、あたかも各個別特許、公開情報、およびデータベースアクセス番号、ならびに受託アクセス番号が特異的かつ個別に引用例として組込まれるように指示されたかのように引用例としてここに特異的に組込まれる。しかしこの発明の範囲は前記の特異的な実施例に限定されるものではない。この発明は特に記載されたもの以外にも実施することができ、しかも以下にある特許請求の範囲内にある。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Gene therapy with simultaneous administration of adenovirus and immunosuppressive drugs This application is based on application Ser. No. 08 / 478,482, filed Jun. 7, 1995. Partially inherited, the latter being the application number 0 filed on October 19, 1994. No. 8 / 325,679, which are incorporated herein by reference. It has been incorporated. This invention relates to gene therapy involving the use of adenovirus as a means of gene delivery. Related. More particularly, this invention relates to the simultaneous repetition of adenovirus and immunosuppressants. For gene therapy with administration, the efficiency of gene therapy treatment is Increased through the suppression of the immune response to cancer. Background of the Invention The adenovirus genome is a linear double-stranded DNA molecule of about 36 kilobase pairs. C Each end of the ils genome is a short sequence known as the inverted terminal repeat (or ITR) Which is required for virus replication. Well characterized of adenovirus The molecular genetic characteristics give it an advantageous vector for gene transfer. Wooly Parts of the lus genome can be replaced with DNA of external origin. In addition, recombinant Denoviruses are structurally stable. Adenoviruses enter cellsIn vivoVery suitable for gene transfer Delivery means for introducing efficient and thus desirable genes into eukaryotic cells Adenovirus can transfer such genes to eukaryotic cells Delivered by binding to the receptor. But for adenovirus gene transfer Has some limitations, which are adenoviral vector particles, Partial in host response directed to either particle breakdown products or transduced cells Is attributed to These host responses are nonspecific and specific immune responses including. Non-specific responses include inflammatory and non-inflammatory changes. One example of the latter is the host Changes in cellular gene expression. Specific immune responses include various cellular responses and humoral antibodies Including the response. Cell response is T helper lymphocyte, T suppressor lymphocyte, cytotoxin T lymphocytes (CTL), including those delivered by natural killer cells No. Despite the high efficiency of adenovirus vectors delivered by gene transfer, The transient nature of adenoviral vectors delivered in transposition is Suggests that multiple doses of the receptor are required. But cotton rat Recent studies have shown that host immune responses directed against adenovirus vectors have been It was shown to correlate with reduced efficiency of gene transfer and expression. Yeah, others,Gene therapy Treatment 1: 192-200 (1994). Smith, others,Natural geneticsVol. 5, pages 397-402 (1993) Disclosed is the administration of an adenovirus vector containing the factor IX gene to mice. This Hepatic transduction of human factor IX with therapeutic effect on hemophilia B patients and plasma Improved efficiency to a level. However, human factor IX levels slowly reached baseline 9 weeks after injection. And did not recover with the second vector injection. Smith, others also Neutralizing antibodies against denovirus may block the success of repeated doses of adenovirus Also discovered. Kozalski, etc.Journal of Biochemistry269, No. 18, 13695-1 Page 3702 (issued May 6, 1994) describes the LDL receptor for rabbits. Discloses the injection of an adenovirus vector containing DNA encoding the gene. LD Stable expression of the L receptor gene was found in the rabbit for 7 to 10 days, and It has fallen to an inaccessible level in three weeks. Growth of neutralizing antibodies against adenovirus It occurred at a second dose that was completely ineffective. Cass-Eisler, etc.Gene therapy1, 395-402 (199 4 years) from adenovirus, although T cell responses are not solely attributable Suggest that it contributes to the limited continuation of adult expression of. The author also added Losporin A may not be effective in blocking humoral responses to vectors Is shown. Fang, others,Journal of Cell Biochemistry21A, C6-109, 363 pairs (1995) reported in dogs treated with the immunosuppressant cyclosporin A. An attempt to reinject the adenoviral vector is disclosed. This reinjection attempt was unsuccessful It was a success. Young, others,Bulletin of the National Academy of Sciences, 91 volumes, 4407- Page 4411 (May 1994) describes a recombination lacking the E1a and E1b regions. Explain adenovirus. Such viruses further include a transgene. this Adenovirus harbors a recombinant viral genome that expresses the desired transgene Administered to an animal host cell. However, viral gene expression remains low. You. Virus-specific cellular immune response is stimulated to lead to the destruction of genetically modified cells This limits the continuation of transgene expression. The above studies have shown that adenoviruses prevent re-administration of effective vectors and limit the effectiveness of expression. The need for a method to block and block the host immune response to ills vectors is clearly identified Testify. But it does not describe how to achieve this. No. Accordingly, an object of the present invention is to suppress the immune response to an adenovirus vector. As a result, sustained efficacy of gene transfer by repeated administration of adenovirus vector, And to provide sustained expression of the transgene. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES The present invention is now described with reference to the drawings, wherein: FIG. 1 is a diagram of the construction of the plasmid pHR. Figure 2 shows adenovirus ITR, envelope signal, Rous sarcoma virus promoter Expression vector comprising a promoter, an adenovirus tripartite leader sequence, and a binding sequence. It is a figure of construction. FIG. 3 is a diagram of the construction of plasmid pAvS6. FIG. 4 is a map of the plasmid pAvS6. FIG. 5 is a map of plasmid pBQ4.7. FIG. 6 is a map of the plasmid pAvS6-CFTR. FIG. 7 is a diagram of the adenovirus vectors Av1Luc1 and Av1Cf2. You. FIG. 8 is a map of plasmid pGEM-1uc. FIG. 9 is a map of the plasmid pAvS6-luc. FIGS. 10A, 10B and 10C show responses to Av1Cf2 administration 3 days after vector administration. Draw the systematic appearance of the answering lung. FIGS. 11A and 11B show lung lavage cells 3 days and 42 days after administration of Av1Cf2. 3 is a graph showing the effect of administration of dexamethasone. FIG. 12 shows Av1Cf2 treated with or without dexamethasone. Figure 4 is a graph of anti-adenovirus antibody titers of lung lavage samples from infected rats. FIG. 13 is a graph of CTL response in rats 42 days after infection with Av1Cf2. is there. FIG. 14 shows treatment with or without dexamethasone. In Av1Cf2-infected rats infected with Av1Luc1 It is a graph of an enzyme activity. FIG. 15 is a map of the plasmid pAv1H9FR. FIG. 16 is a diagram of the adenovirus vector Av1H9F2. FIG. 17 shows that given the Av1H9F2, the immunosuppressive agents deoxyspergualin, Untreated or untreated with clofosfamide or one of dexamethasone 5 weeks early Plasma humans in mice with or without Av1LacZ4 It is a graph of factor IX. FIG. 18 shows 1-10.^ThreeFrom 1 × 10⁸Accept pfu's Av1LacZ4, then 5 weeks later, plasma factor IX levels in mice receiving Av1H9FR (ng / ng (ml) is a graph. FIG. 19 shows that given Av1LacZ4 and no immunosuppressant Treatment with deoxyspergualin, cyclophosphamide or dexamethasone. Figure 4 is a graph of neutralizing antibody titers in placed mice. FIG. 20 shows whether Av1LacZ4 was given and no immunosuppressant was given. Alternatively, they are given cyclophosphamide and then treated with cyclophosphamide or Received Av1H9F2 without treatment, followed by Av1ALAPH81 Figure 4 is a graph of plasma factor VIII levels in fed mice. Also, FIG. 21 shows Av1LacZ4 and deoxyspergualin 0 mg / kg, 5 m g / kg, 10 mg / kg, 20 mg / kg, or 33 mg / kg, Then plasma factor IX levels (ng / ml) in mice receiving Av1H9F2 ) Is a graph. Detailed description of the invention According to one aspect of the invention, a method of performing a gene therapy treatment in a host Is provided. The method comprises the steps of: (i) selecting an adidas containing at least one DNA sequence; And (ii) administering an immunosuppressive agent. Adeno Virus The course of administration of the vector and the immunosuppressant is then stopped. Immunosuppressants and drugs The administration of the denovirus vector is then repeated at least once. Adenovirus The vector is administered to the host in an amount effective to produce a therapeutic effect. Immunosuppressants Cell immune response to body fluids and / or vectors and / or vectors Is administered in an amount effective to inhibit or inhibit the cells. The term "DNA sequence" as used herein generally refers to polydeoxyribonucleic acid. With reference to the otide molecule, more particularly the 3 'and 5' carbons of adjacent pentoses Linear series of deoxy linked from one to another by phosphodiester bonds between them Cibonucleotides will be cited. Applicants have discovered that immunosuppressants are administered in combination with adenovirus vectors When the administration of the vector is repeated, then the adenovirus vector And / or to cells transduced with the vector (such as a humoral antibody response). E) Effect of in vivo repetition of adenovirus-mediated gene transfer through suppression of immune response Increased gene transfer rate, which leads to increased transgene expression. there were. The adenovirus vector used is essentially complete in one embodiment. An adenovirus vector containing the denovirus genome. Schenk, others,Weakness Today's subject of object immunology 111 (3): 1-39 (1984). Teens Alternatively, adenovirus vectors contain at least a portion of the adenovirus genome. Modified adenovirus vector that is deleted You. In another embodiment, the adenovirus vector comprises an adenovirus 5'IT R, adenovirus 3'ITR, adenovirus envelope signal, code for therapeutic agent At least one DNA sequence that encodes, at least one D that encodes a therapeutic agent Consists of a promoter that controls the NA sequence. This vector contains the majority of adenowis Rus E1 and E3 DNA sequences are deleted, but all E2 and E4DN A sequence and adenovirus accelerated by adenovirus major late promoter The DNA sequence encoding the irs protein has not been deleted. In one embodiment, the vector further comprises a vector comprising E2 and E4 DNA sequences. Deleting at least a portion of at least one DNA sequence selected from the loop I have. In another embodiment, the vector comprises an adenovirus E1 and E3 DNA plasmid. At least the majority of the sequence and other portions of the E2 and E4 DNA sequences. Have lost. In yet another embodiment, the coding for a 72 kilodalton binding protein is The gene in the E2a region produces a temperature-sensitive protein that is active at 32 ° C. It is mutated to produce virus particles at this temperature. This feeling of temperature Passive mutants are described in the following references: Ensinger, et al.Virus Journal 10, 328-339 (1972); Van der Fleet, others,Virology Journal, Vol. 15, pp. 348-354 (197 5 years); Englehart, etc.Bulletin of the National Academy of Sciences, 91 Vol. 6196-6200 (June 1994); Young et al.Natural genetics, 7, 362-369 (July 1994). In a preferred embodiment, such vectors have a 5'-end according to standard methods. Shuttle plug including "critical left end elements" starting with This critical leftmost element is constructed by first constructing a sumid Includes 5'ITR, adenovirus envelope signal, and E1a enhancer sequence This shuttle plasmid also contains a promoter (adenovirus promoter). Alternatively, it may be an external promoter); a multiple cloning site (described above). DNA A corresponding to the adenovirus genome Including. The vector also contains a tripartite leader sequence. Adenovirus genome Corresponding DNA incisions are required for homologous recombination with modified or mutated adenovirus. Serving as a substrate, such a sequence may be, for example, from 3329 bases to 624 bases of the genome. Includes the incision of 5 adenovirus genomes up to 6 bases. This plasmid also Includes selectable marker and origin of replication. The origin of replication may be a cell origin of replication . A representative example of such a shuttle plasmid is pAvS6 shown in FIG. Including. The desired DNA sequence encoding the coagulation factor is then subjected to multiple cloning. Into the site to produce a plasmid vector. This construct is then used to produce an adenovirus vector. phase Homologous recombination is at least the majority of E1 and Modified or mutated adenovirus lacking the E3 adenovirus DNA sequence This is performed using Luz. Such homologous recombination is due to calcium phosphate precipitation. Plasmid vector and modified adenovirus into a helper such as 293 cells. It is performed through co-transfection of a cell line. For such homologous recombination In this case, it was induced from the shuttle plasmid between the NotI site and the homologous recombination fragment. Derived DNA sequence and adenovirus between homologous recombination fragment and 3'ITR Adenovirus vector containing DNA derived from E1 and E3 lacking irs Is formed. In one embodiment, the homologous recombination fragment is adenovirus 5 (ATCC V R-5) Overlaps from nucleotides 3329 to 6246 of the genome. Through such homologous recombination, the adenovirus 5'ITR, adenovirus Encoding the envelope signal, E1a enhancer sequence, promoter, and therapeutic agent At least one DNA sequence, the E1 and E3 adenovirus DNA sequences Adenovirus DNA lacking at least the majority, and adenovirus 3 One vector containing the 'ITR is formed. This vector is then used for E1a and 293 helper cell line (A Transfected into a helper cell line such as TCC No. CRL1573) Generate adenovirus particles. Transfection is electroporation, calcium phosphate precipitation It occurs through microinjection or proteoliposomes. The above-described vector encodes at least one DNA sequence encoding a therapeutic agent. Includes multiple cloning sites to facilitate insertion into cloning vectors. Generally, multiple cloning sites are "rare" restriction enzyme sites; It is found in eukaryotic cells at a frequency of 1 every 0 base pairs to about 1 every 100,000 base pairs. Including the site to be issued. A suitable vector according to the invention is thus compatible with standard methods. Cloning vectors at appropriate cloning sites in more multiple cloning sites The DNA sequence encoding the therapeutic agent into a cloning vector. Formed by bonding to An adenoviral vector as described above encodes at least one therapeutic agent It contains at least one DNA sequence. The term "treatment" is used in a general sense And includes therapeutic, prophylactic and replacement agents. The DNA sequence encoding the therapeutic inserted into the adenovirus vector must be Examples include, but are not limited to: tumor necrosis factors such as TNF-α Child (TNF) gene; interferon α, interferon β, and interferon Genes encoding interferons such as ferron gamma; IL-1, IL -1β and interleukins such as interleukins 2 to 14 Gene encoding GM-CSF; adenosine deaminer , A gene encoding ADA; Mn-SOD, catalase, CuZ nSOD, extracellular superoxide dismutase and glutathione reductor Encodes antioxidants such as ze Gene; encodes a cell growth factor such as lymphokine, a lymphocyte growth factor Genes; epidermal growth factor (EGF) and cratinocyte growth factor (KGF) Gene encoding a growth factor such as; gene encoding fusion CD4; factor VIII; factor IX; von Willebrand factor; T cell receptor; cholesterol LDL receptors involved in transport and metabolism, ApoE, ApoC, ApoAI and And other genes; α1 antitrypsin (α1AT) gene, ornithine tiger Carbamylase (OTC) gene, CFTR gene, lung surfactant protein Gene, β-glucuronidase gene, insulin gene, virus thymidine Herpes simplex thymidine kinase, cytomegalovirus Such as the thymidine kinase gene and the varicella-zoster virus thymidine kinase gene Any negative selectable marker or "suicide" gene; Fc of the antigen-binding region of the antibody Receptor and anti-blocking hepatitis B and non-A non-hepatitis B virus replication Antisense sequences that prevent viral replication, such as sense sequences; tissue plasmino Urinary plasminogen activator (urokinase); Hirudin; nitric oxide synthase, vascular activating peptide; and angiogenic peptide . The DNA sequence encoding the therapeutic agent is under the control of a suitable promoter. use Suitable promoters include, but are not necessarily limited to: : Adenovirus promoters such as adenovirus major late promoter; Or heterologous, such as the cytomegalovirus (CMV) promoter Promoter; Rous sarcoma virus (RSV) promoter; MMTV promoter Promoter, inducible promoter such as metallothionein promoter; heat shock promoter Motor; albumin promoter; and ApoAI promoter. Choices and Thus, the DNA sequence encoding the therapeutic agent is under the control of its native promoter . However, the scope of this invention is limited to specific external genes or promoters It must be understood that it is not. The immunosuppressant used is (i) a body fluid (antibody) against the adenovirus vector Response, (ii) eg T cell response to cells containing adenovirus vector, etc. The cellular immune response of, or (iii) against, or against cells containing the vector. Non-specific inflammatory response, Vectors and / or vectors Fluid and / or T cells and / or non-specific inflammatory responses to cells containing By interfering with the response, administration of immunosuppressive drugs may be necessary to produce a therapeutic effect in the host. Allow for effective re-administration of the patient. Preferably, the adenovirus vector If multiple doses are desired, the immunosuppressant may be It is an immunosuppressant that interferes with the humoral antibody response. Desirably long lasting or high water If sub-expression is desired, immunosuppressants may interfere with cellular or non-specific anti-inflammatory responses. Or suppress. The host immune response to adenoviral vector administration in vivo is determined by (i) the vector Dose, (ii) route of administration, (iii) level of replication (if replication occurs), (iv ) Included in the recombinant vector (V) the genetic and physiological characteristics of the host, and (vi) ) Pre-existing immune response to previously administered adenovirus vectors It varies in relation to the existence and level of the answer. Generally, the response of the host will depend on the dose of the vector to be administered. the important thing is, The magnitude of a specific host response will depend on the route of vector administration. For example, intravenously Dosing is higher than for the same amount of vector given via the respiratory route Produces a host antibody response. Different, if not all, host responses to adenovirus vectors Although most of these different factor mechanisms are related and highly interdependent, Produced by different anti-inflammatory and immune effector mechanisms. Thus, for example, body fluids Antibody formation is very dependent on some T helper lymphocyte support. Again Some cell-mediated cytotoxicity can be attributed to antibody formation, such as opsonized macrophage cell killing Depends on harm. The two major host responses that affect the persistence of transgene expression are the anti-inflammatory response and And cellular immune response. Inflammation is the first host response following administration of the vector. Cytokine Release is very often accompanied by an influx of anti-inflammatory cells. Such cytokines are IL- 1, often IL-6, IL-8, and TNF. In vivoThe amount of anti-inflammatory activity following adenoviral vector administration is Increases with increasing dose. Increased volume is more transplantable than with smaller doses More rapid expression of genes Let the decline go. CTL response directed at transduced cells reduces persistence of transgene expression Is considered to be important. CTL is low level by CTL-inducing cells Is thought to be directed to adenovirus gene expression. Key factors affecting the ability to repeatedly administer an adenovirus vector to a host The host response is a humoral antibody response. It includes oral, intravenous, intraperitoneal, and pulmonary Adenovirus administered by various routes. Generally achieved The level of antibody response is well dependent on the vector dose administered. Antibody responses are also Also depends on the route of administration. Intravenous vector administration requires a fixed dose of vector It produces higher antibody levels than pulmonary administration. In contrast, wild-type adenowis Ruth isIn vivoHigh antibody water regardless of the amount of virus given by virus replication Invite the associate. The ability to successfully repeat adenoviral vector administration is It is inversely correlated with the level of circulating adenovirus vector antibody. Pharmacological regulation of the host immune response to an adenovirus vector includes anti-inflammatory drugs, cells It involves the use of immunomodulators and humoral antibody immunomodulators. Anti-inflammatory agents include steroids, cyclophosphamide, and azothiophrine. Steroids have potential anti-inflammatory properties. Non-steroids such as dexamethasone When administered orally, the transgene is released following the in vivo administration of the vector via the pulmonary route. Increase the current duration. Steroids also block lymphocyte function. Thus, dexamethasone is a pulmonary vector Reduces the CTL response observed after administration of the CTL. Dexamethasone is also low It also partially blocks the host antibody response to adenovirus vector administration. Antibodies directed against cellular components of the immune system diminish the cellular immune response. example For example, administration of anti-T cell receptor antibodies (eg, anti-CD4 and anti-CD3 antibodies) Prolong the expression of the transgene. CTLA4 immunoglobulin is another example . Anti-CD4 antibody is directed against T helper lymphocytes and reduces their function . Other agonists that are primarily directed at cellular immune responses include cyclosporin A and other Rapamycin binding protein ligands such as rosporin, FK506, dexamethas Including steroids such as zon. Agents that affect humoral antibody responses generally produce B lymphocytes (B cells) T cells that cause high levels of antibody or B cell antibody production Turned to Examples of immunosuppressants that block the humoral antibody response to adenovirus vectors are essential. Although not necessarily limited thereto, deoxyspergualin, ie, having the following structure: Including DSG with: The terms "deoxyspergualin" and "DSG" as used herein Deoxyspergualin, ie, DSG and its derivatives or analogs, Deoxy Spergualin salt, including but not necessarily limited to trihydrochloro Lido, and any other analog with immunosuppressive activity. This kind of The compound is disclosed in U.S. Patent Nos. 4,525,299, 4,847,299, 5,162,5. 81 and 5,196,453. In one embodiment, the immunosuppressant that blocks the humoral antibody response is a steroid . Steroids used are not necessarily limited to dexamethasone, And any corticosteroids such as corticosteroids, hydrocor Includes thizone, prednisolone, and methylprednisolone. In another embodiment, the inhibitor that prevents a humoral antibody reaction is, for example, cyclosporine. And cyclosporins such as A. Other inhibitors that block the humoral antibody reaction used Includes but is not limited to: azathioprine, cyclo Phosphamide, brequinal, leflunomide, mycophenolate mofetil (Mycophenolate mofetil), anti-DC40 antibody ligand antibody, cyclophosphamine , Rapamycin, anti-CD4 antibody, CTLA-4 immunoglobulin, interleukin 12, Interferon gamma; Biarrer, et al., Bulletin of the National Academy of Sciences, 87 , 9231-9235 (1990), Dumont et al., Immunology Journal. 144, pp. 1418-1424 (1990), and Biarrah, et al. Science, 250, 556-559 (1990). For example, rapamycin binding such as FK506 Synthetic protein (FEBP) ligand, anti-lymphocyte functional antigen 1 (LFA-1) antibody, And anti-T cell receptor antibodies. Compounds that block, suppress, or eliminate humoral immune responses to external antigens (eg, For example, deoxyspergualin, cyclophosphamide, brequinal, leflunomy , Mycophenolate mofetil, anti-CD40 antibody or anti-CD40 distribution A short time before and / or during adenovirus administration. Or when administered shortly after administration, such compounds may be anti-inflammatory in the host. Applicants have also discovered that they interfere with the production of adenovirus neutralizing antibodies. Within the scope of this invention, immunosuppressive drugs may interfere with one or more of the immune responses described above. Must be understood. However, also, the scope of the invention is not limited to any specific It should also be understood that the invention is not limited to immunosuppressants. It must also be considered that within the scope of the present invention, combinations of immunosuppressants are used. No. Adenovirus vectors and immunosuppressants generally produce therapeutic effects in the host Co-administered in an amount effective for Blocks the immune response against cells. As used herein, the term "simultaneously" The administration of the viral vector and the administration of the immunosuppressant are performed at about the same time, Started within a short time frame and treated with adenovirus and immunosuppressants Means a part of the course that cannot be divided. Thus for example The immunosuppressant is administered at about the same time the adenoviral vector is administered You. That is, administration of the immunosuppressant is slightly less than administration of the adenovirus vector (eg, About 24 hours) before, during or shortly after administration (eg 24 hours) Started. In general, the immunosuppressant is a standard dose schedule set for that drug Generally not more than 14 days, and preferably not more than 11 days. Preferably, it is administered for a period not exceeding 8 days. Thus, long-term administration of immunosuppressive drugs is It is not necessary to allow for repeated administration of the denovirus. At the end of the course of immunosuppressant administration, adenoviral vectors and immunosuppressive The course of drug administration is stopped for a certain period. Adenovirus vector and immune Duration during the course of the epidemic administration, and adenovirus vector and immunosuppression The number of courses of administration of the drug depends on the age, weight and sex of the patient, the disease to be treated or Depends on the disease and various factors including the disease being treated or the severity of the disease . The course of administration of the immunosuppressant is repeated with each administration of the adenovirus vector. Must be understood. In one embodiment, the adenovirus vector is administered in kilograms at each administration. From 1 plaque forming unit to about 10¹⁴Up to plaque forming units, preferably about 10⁶ About 10 from plaque forming units¹³Up to plaque forming units, more preferably about 10⁸ About 10 from plaque forming units^TenIt is administered in amounts up to plaque forming units. Host is It is a human or non-human animal host. Adenovirus vectors are administered systemically or locally. Examples of systemic administration are Intravenous administration, including but not limited to (Eg portal or peripheral vein injection), intramuscular, intraperitoneal, intranasal Administration, or capsule oral administration. The immunosuppressant is administered in an amount effective to produce the desired immunosuppressive effect in the host. You. The immunosuppressant is about 1 mg / k if dexamethasone is used at each dose. g to about 15 mg / kg or the same for other steroids. It is. If deoxyspergualin is used, deoxyspergualin Is about 1 mg / kg to about 33 mg / kg, preferably about 3 mg / kg to about 7 m Administered in amounts up to g / kg. If cyclophosphamide is used, Clofosfamide is present in an amount of about 5 mg / kg to about 300 mg / kg, preferably about 50 mg / kg. It is administered in an amount from mg / kg to about 100 mg / kg. Adenovirus vector particles and immunosuppressants are each suitable for administration to patients Administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. The carrier is a liquid carrier such as saline. Body. Adenovirus vector particles, such as microcarrier beads Administered in combination with a solid carrier or sustained drug delivery material such as a polyol Is done. Cells transduced by adenovirus particles are not necessarily limited Includes: lung, airway or alveolar epithelial cells; leukocytes, granulocytes, cells Nuclear cells, macrophages, lymphocytes (including T and B lymphocytes), all Primary nucleated blood cells such as active stem cells and tumor infiltrating lymphocytes (TIL cells) Primary cells; bone marrow cells; endothelial cells; activated endothelial cells; epithelial cells; keratinocytes; Cells; liver containing hepatocyte precursor cells Cells; fibroblasts; mesenchymal cells; mesothelial cells; parenchymal cells; vascular smooth muscle cells; And other nerve cells; intestinal cells; intestinal stem cells; and myoblasts. In one embodiment, the adenovirus particles are directed to blood cells, thereby Adenovirus vector particles infect blood cells with genes, which indirectly Increase the therapeutic effect of the sphere. Genes carried by blood cells are effective in treating hemophilia. A blood cell that usually has a therapeutic effect that it does not have, such as a gene that encodes a solid factor Any of the genes may be used. Genes have one therapeutic effect Or more. An example of a suitable gene is the CFTR gene Encoding cytokines; cytokines such as TNF, interleukins (interleukins) Leukin 1-14), interferon (α, β, γ-interferon), T Antigen binding regions of antibodies such as cell receptor proteins and immunoglobulins The Fc receptor. Other examples of suitable genes are used to treat AIDS Caused by a gene encoding molten CD4 and α-antitrypsin deficiency Includes genes encoding α-antitrypsin useful for treating tumors. Transduced cells include, but are not necessarily limited to, cystic fibrosis Denosine deaminase deficiency, sickle cell anemia, Mediterranean anemia, hemophilia, diabetes, α -Brain diseases such as antitrypsin deficiency, Alzheimer's disease, growth diseases and heart diseases Other diseases, such as changes in which cholesterol is metabolized and lacks the immune system Including those generated by In another embodiment, the adenoviral vector particles transduce hepatocytes. This adenovirus vector particle has acquired or inherited hepatocyte (liver) deficiency Encoding a polypeptide or protein useful for the prevention and treatment of cancer Including children. For example, they are the low-density lipoprotein (LDL) receptor hereditary Acquired orni that neutralizes the deficiency and / or results in congenital hyperammonemia Can be used to neutralize tin transcarbamylase (OTC) deficiency Wear. In another embodiment, the adenovirus particles transduce hepatocytes, which Adenovirus particles are more acquired diseases, such as those caused by viral infection It contains genes encoding therapeutic agents used to treat E. coli. For example, infectious Denovirus particles are viral hepatitis, especially hepatitis B or non-A non-B hepatitis Can be used to treat For example, encoding an antisense gene Infectious adenovirus particles containing the gene Used to infect vesicles. In this case, reverse or opposite structural hepatitis inheritance Infectious adenovirus particles containing the vector containing the offspring are introduced into hepatocytes and hepatitis c. Liver infected with an antisense gene that can inactivate ls or its RNA transcript Produced in cells. As an option, hepatocytes confer resistance to hepatitis virus, for example Infectious adeno containing a gene encoding a protein such as alpha interferon Infected with virus particles. The vector particles can also be used to treat Hodgkin's lymphoma. Feeling Stainable adenovirus vector particles are Hodgkin Targets neoplastic cells of lymphoma. In addition, adenovirus vector particles are Contains negative selectable markers such as rupesthymidine kinase or "suicide genes" . AdenovirusIn vivoThe virus is administered to the patient at Infects neoplastic cells of empathoma. After the adenovirus is administered to the patient, the patient Given an interacting drug such as acyclovir or acyclovir. Neoplastic Hodgkin lymphoma cells infected with the denovirus are killed. Further, the vector can be constructed to include the CFTR gene. This baek Is then administered to the epithelium in an amount effective to treat lung deficiency in patients with cystic fibrosis. It is. In another embodiment, a vector containing a functional protein is used for such a vector. Delivered to the airway epithelium to treat protein deficiencies. Such a function tongue Protein is antioxidant, α-1 antitrypsin, CFTR, lung interface protein, site Contains Cain and growth factors such as EGF and KGF Adenosine deaminase for the treatment of epidemics, von for the treatment of Christmas disease Includes Bilebrand factor and β-glucuronidase for the treatment of Gaucher disease No. In addition, vectors containing genes encoding anti-cancer or anti-inflammatory agents are lung cancer Or for the treatment of inflammatory lung diseases. Example The invention will now be described with reference to the following examples. However, the scope of this invention The enclosure is not limited thereby. Example 1 Construction of Av1Cf2 and Av1LuC1 A. Construction of pAvS6 Adenovirus Construction Shuttle Plasmid pAvS6 Based on Cloning Technology Several steps using standard cloning techniques, including the polymerase chain reaction. Built through. First, a 2913 base pair Bg1II and HindIII fragment was Ad- Removed from d1327 and converted as blunt fragments into pBluscript II Ks (California, La Jolla, Stratagen) at XhoI site Was entered. Ad-d1327 binds to base pairs 28591 to 30474 (or adenovirus). Find the position in the E3 region including the map units 78.5 to 84.7) of the Lus 5 genome Identical to adenovirus 5 except that the Xba I fragment has been removed. The E3 deletion at Ad-d1327 is similar to the E3 deletion at Ad-d1324. The latter is described in Jinmaphapya et al., Cell, 31: 543 (1983). You. Complete adenovirus 5 genome is available at Genbank, accession number M73260 Registered, the virus is found in the United States, Maryland, Rockville, Access number VR-5 from the American Type Culture Collection Can be used. Ad-d1327 is constructed in a routine manner from adenovirus 5 (Ad5). Was. This method is briefly outlined below and has been described by Jones and And Schenk, Cell, 13: 181-188 (1978). A d5 DNA is obtained by proteolytic digestion of virions It is separated and partially cut with Xba I restriction endonuclease. Xba The I fragments are then reassembled by ligation as a mixture of fragments. This is array 2 A sequence similar to Ad5 except for excluding 30474 base pairs from 8591 base pairs The resulting connected genome is used. This DNA can then be used in appropriate cells (eg, KB cells). , HeLa cells, 293 cells) to allow plaque formation Covered with soft agar. Individual plaques were then separated and amplified to 1878 bases. The deletion of the Xba I fragment relative to the E3 region is screened. The orientation of this fragment was such that the BglII site was T7 of PBluescript II KS. The site closest to the RNA polymerase site and the HindIII site Closest to the T3 RNA polymerase site of Bluescript II KS It was like a shape. Second, ITR, envelope signal, Rous sarcoma virus promoter, adenovirus Ils tripartite leader (TPL) sequence and ligation sequence assembled using PCR amplification (Figure 2). ITR and envelope signal (Sequence 1-392 of Ad-d1327) [The same sequence as the sequence from Ad5 of Genbank, access number M73260] (Incorporated herein by reference) incorporates a NotI or AscI restriction site. Amplified together with Ad-d1327 using primers containing (amplification 1). Lau The ssarcoma virus LTR promoter contains a AscI site and an SfiI site. The plasmid pRC / RSV (sequences 209 to 605; Near, San Diego, Invitrogen) (Amplification 2). The DNA products from amplifications 1 and 2 were Uses "overlap" PCR method using only primers and SfiI primers (Amplification 3) (Houghton et al., Biotechnics, 8: 528-53) 5 (1990)). AscI of each initial DNA amplification product from reactions 1 and 2 Complementation between the termini allowed the joining of these two pieces during amplification. Then T PL was purified with Ad- using primers containing SfiI and XbaI sites, respectively. 293 cells infected with d1327 for 16 hours (ATCC access number CRL15 73) and amplified from cDNA made from mRNA (amplification 4) ( Sequences 6049 to 9730 of Ad-d1327 [Genbank, access number M 73260 and an Ad5 analogous sequence]). DN from amplification reactions 3 and 4 The A fragment was then ligated using PCR with NotI and XbaI primers. (Amplification 5), thus generating a complete gene block. Third, the ITR-envelope signal-TPL fragment was then purified and NotI And XbaI, and inserted into NotI and XbaI-cut PHR plasmid. Was. This plasmid was named pAvS6A and its orientation was the NotI part of the fragment. The position was located next to the T7 RNA polymerase site (FIG. 3). Fourth, the SV40 early polyA signal was converted to SVpaI-BamHI fragment 40 DNA, treated with T4 DNA polymerase and treated with plasmid p. SalI site of AvS6a Into pAvS6 (FIGS. 3 and 4). B. Construction of Av1Cf2 and Av1Luc1 Av1Cf2 (FIG. 7) (Yay et al., Gene Therapy, 1: 192-200 (199) 4 years)), E1 deletion (1.18 to 9.2 map units), E3 deletion (78 . 5 to 84.7 map units). Inserting the TR cDNA coding sequence fragment into the EcoRI site of pAvS6 Thus, the 5 ′ end of the CFTR coding sequence is adenovirus 5 tripartite leader. Was built first by being closest to CFTR cDNA Is the PstI fragment (nucleotides 75 to 4725; for numbering, Plasmid pBQ4.7 (see access number M28688). (Figure 5) (Courtesy of Ill Children's Hospital, Toronto, Canada, L.C. ) And inserted as blunt fragments. The resulting plasmid, pAv S6-CFTR (FIG. 6) was linearized with KpnI, trapnel, advanced drug delivery Review, 293 as described in 12: 185-199 (1993). Recombinant with a large (35 kilobase) ClaI fragment of Ad-d1327 in cells As a result, AvlCf2 was formed (FIG. 7). After double plaque purification, identification of clonal isolates was performed as described previously. Analysis and immunoprecipitation of CFTR (Tolst chef, et al., 9th name Bulletin of the Furuya Cancer Treatment International Symposium, Nagoya, Japan, September 17-18, 1993 ( Published)). Av1Lucl (FIG. 7) (Yay et al., Gene Therapy, Vol. 1, pp. 192-200) Di (1994)) that it is the firefly luciferase gene (Genbank, A Accession number M15077) except for the expression of AclCf2 And an adenovirus reporter vector identical to the sequence. The firefly luciferase gene was obtained from pGEM-luc (FIG. 8, Promega). Was. pGEM-luc conjugates the firefly luciferase gene (splicing ) Was digested with StuI and HindIII. The firefly luciferase gene was inserted into the EcoRV site of pAvS6, The 5 'end of the luciferase coding sequence is an adenovirus 5 tripartite leader. Closest. The resulting plasmid, pAvS6-Lcul (FIG. 9), pnI, linearized with Ad-d1327 as described above (35 kilobases) ) Recombined with ClaI fragment. Clonal isolates were then identified as described above. Was. Two viral vectors are propagated and purified by double wrapping in CsCl orientation And described in Rosenfeld et al., Cell, 68: 143-155 (1992). Was titrated in 293 cells as described. Example 2 Adenovirus-mediated gene transfer with simultaneous intermittent steroid administration Cotton rats (weight about 150g) are 9 rats in each group Were divided into four groups. Dex by intraperitoneal injection in an amount of 2 mg / kg per day AvlCf2 with and without co-administration of Sametasone Low dose (10⁸pfu) or high dose (10^Tenpfu) by intranasal inhalation And given from 1 day before the start of vector administration to 10 days after. Control glue Rats with and without co-administration of dexamethasone as described above. PBS was given instead of AvlCf2. Three and 42 days after vector administration, three rats from each group had A The host response of the vICf2 vector was evaluated. Evaluation of host response is outside lung histopathology View, whole lung lavage cellularity, lung lavage anti-adenovirus production, and cytotoxic T lymphocytes The sphere (CTL) response was included. Evaluation of lung histopathology by Y. et al., Human Gene Therapy, Vol. 5, pp. 731-744. Performed as described in J. (1994). Lungs are removed and paraform at 4 ° C overnight Aldehyde 0.25% (wt / vol.), Glutaraldehyde 0.25% (w t / vol. ), Embedded in paraffin, 6 μm portion of hematoxylin And eosin. 3 days after adenovirus infection, daily administration of immunosuppressive drug or not Histological Appearance of Cotton Rat Lungs in Response to Injected AvlCf2 Injection Shown in FIGS. 10A, 10B, and 10C. FIG. 10A shows no adenovirus. Part of the lungs of control rats receiving PBS. FIG. 10B shows no immunosuppressive drug. Part of the lung of a rat that received AvlCf2 You. FIG. 10C shows the results of rats receiving AvICF2 receiving daily dexamethasone. Part of the lungs. All parts are magnified 100 times. 10A, 10B, And 10C, infected with control rats and adenovirus Compared with rats that did not receive immunosuppressive treatments Pulmonary parenchymal inflammation was lower in rats receiving the suppressive treatment. Lung lavage fluid was collected by lung lavage using 4.0 ml of PBS and total cell count was The cells are determined by light microscopy or neutrophils determined by centrifugation. It was evaluated in a separate preparation. FIG. 11A shows AvICf2 at 3 days post infection compared to control rats receiving PBS. FIG. 4 is a graph of lung lavage cell counts from infected rats. Control rats are dexamethas Either they received zon or no dexamethasone. Figure 11B was sensitized to AvlCf2 42 days post infection compared to control rats receiving PBS. Figure 4 is a graph of lung lavage cell counts from stained rats. Rats take dexamethasone Either received or did not receive immunosuppressive treatment. As seen in FIG. 11A, 3 days after vector administration, which is the peak of inflammation, Dexa Methasone significantly enhances nonspecific host cell inflammatory response (represented by whole lung lavage cellularity) Reduced. Lung lavage anti-adenovirus production was measured by the ELISA assay and performed as follows. 1 × 10¹¹AvlLacZ4 in pfu / ml, 10 μl (Yay, et al.,Human remains Gene therapy 5, Vol. 731-744, (1994)) was added to 90 μl of double distilled water in a 0.5 ml Eppendorf tube. Was. The tubes are irradiated with UV light for 30 minutes to kill the adenovirus, The degree was measured using a Bio-Rad Kit. 0.1M carbonic acid 8 ml of sodium (pH 9.6) was added to 50 μl per well of adenovirus Added to provide 10 μg / 4m or 125 ng of protein production Was. 50 μl of antigen was then added to each of the 96-well microtiter plates (Inmulon 2). Added to the well. If the plate is at 37 ° C for 1 hour or at room temperature for 2 hours, Or 4 ° C. overnight. Plates are then washed twice with PBS or double distilled water Was done. 300 μl of blocking buffer (1% BSA in PBS) was added to each well and plated Was kept at room temperature for 1 hour. The plates were then washed with double distilled water. Blockers were then added to the background wells. Antibody sample 50 μl of lung lavage sample prepared as described above) In two-fold serial dilutions ending in 1/8192. Uninfected cot 50 μl of a negative control sample of serum from rat Added to the cover well. The plate is kept at room temperature for 2 hours, 300 μl of 20 / PBS was added. Plates are kept warm at room temperature for 5 minutes and emptied 300% of 0.05% Tween 20 / PBS was added again. The plate again Incubated at room temperature for 5 minutes and evacuated. The plate is then double steamed Washed with distilled water or PBS. Peroxidase-labeled goat anti-hamster IgG (10 μg / 10 μl) 10 ml of BSA to make a working solution of 1 mg / ml (1: 1,000 dilution) and Added to PBS. 100 μl of this solution is then added to each well and the plate is Incubated at room temperature for 2 hours. The plate is then washed 5 times with 0.01% Tween 20 / PBS Washed with 300 μl. The slabs were then emptied and dried. 100 μl of tetramethylbenzidine (TMB) substrate was added to each well at room temperature. The color developed immediately. Blue is OD with Eliza reader₆₅₀Read by I was negated. Add OD by adding 100 μl of TMB stop solution to each well.₆₅ ₀ Was stopped from 0.5 to 0.6. OD₄₅₀Then stops the reaction Read after 5 minutes and 1 hour. Antibody titer is 0 from background OD . One is the reciprocal of the dilution giving the OD value. Optionally, antibody titer is nonspecific It is determined as 3 standard deviations above the target background. 3 days after vector administration The mean results, expressed as antibody titers, for each group of rats at 42 days and Indicated at 12. Rats fed dexamethasone as shown in FIG. Is 42 days after vector administration compared to rats that did not receive dexamethasone A decrease in antibody titer was indicated. CTL assays were performed 42 days after vector administration. Sensitized cells were obtained from Ad-d132 cotton rat lung fibroblasts at 100 multiplicity of infection. 7 and prepared by infection. cell Were incubated for 3 days and examined for hexon expression by FACS. The cells are then PB Washed with S / EDTA, contacted with trypsin, washed, spun, RPM Resuspended in 1 ml of I medium. The cells are then used to inactivate the DNA At 00 rad¹³Irradiated with Cs. Spleens are then uninfected (control) rats and adenovirus infection 42 days after infection Isolated from rats. Spleens were stored on sterile HBSS and ice. HBSS1 0 ml was then injected into each spleen with a 25/27 gauge needle in a 50 ml tube. Spleen Crushed and filtered into 50 ml tubes using a cell strainer. This amount is then RPM Make up to 40 ml with I plus 10% FCS. Tube rotates at 1,500 rpm for 10 minutes Was done. The red blood cells are then eluted by adding 2.1 ml of ACK elution buffer, and Swirled within minutes. This volume was brought to 50 ml with RPMI-10. The tube then Rotated at 1,500 rpm for 10 minutes. The cell pellet is then resuspended and the cells Was counted in a 1:10 solution. The spleen cells are then sensitized with the spleen cells along with the sensitized cells Cells were plated so that the ratio of cells was 4: 1 in RPMI. Sensitization with spleen cells Cells are incubated at 37 ° C in the presence of interleukin-2, 20-50 units / ml. Was. Interleukin-2 was added daily for 5-6 days. 3 × 10 target cells⁶Cotton rat lung fibroblasts were cultured with Ad-d1327 for 10 days. Infection was prepared for 1 hour at a multiplicity of infection of 0. Culture medium is added to the cells and 50 With an amount larger than μCi⁵¹Cr was added for 18 hours. Target cells were harvested by washing cotton rat fibroblasts with EDTA / PBS. And then trypsin digested. The cells are then washed, spun and the culture medium 5 Resuspended in ml and counted. 10 cells^FiveResuspended in cells / ml, 0^FourCells / 0.1 ml well were used for CTL assay. Effector cells (ie, spleen cells and sensitized cells sometimes referred to as Es cells) Cells) was spun at 1.500 rpm for 10 minutes at 4 ° C. Cells are HB SS-10, resuspended in 2 ml, Ficoll Hypaque And spun at 1,500 rpm for 10 minutes. Top part (4ml) is collected Harvested and added 5 ml of culture medium. This material is spun and the cell pellet is stored. And resuspended in 1 ml of culture medium. Effector cells are effector cells 50 μl were mixed with 50 μl of trypan blue and counted. The effector cells then have an effector: target (E: T) ratio of 3.125. , 6.25, 12.5, 25, 50, and 100^FourTarget Added to wells containing vesicles. The cells were then spun at 500 rpm for 5 minutes. Fine The vesicles were then incubated at 37 ° C. for 4 hours. The cells are then spun and the supernatant l using a Wallac gamma counter⁵¹Cr release was measured. (Dexa From infected rats (with and without methasone treatment) and 2 The average results of CTL response in spleens collected from two uninfected control rats are shown in FIG. 3. As shown in FIG. 13, the low CTL response was dexamethasone Obtained from spleens obtained from infected rats treated with. Forty-two days after vector administration, the remaining three rats in each group received Av1Luc1 2 × 10 intranasal pulmonary administration⁹Received at doses of pfu. Remains originally received PBS Control rats also received 2 × 10 cells of Av1Luc1.⁹Received at doses of pfu. Lung lavage anti Adenovirus antibody production was performed 3 days after administration of Av1Luc1 according to the method described above. And the results are shown in FIG. As shown in FIG. AvlCf2 10^TenRats receiving pfu and treated with dexamethasone It showed reduced antibody titers compared to rats that did not receive dexamethasone. The efficiency of firefly luciferase gene transfer and expression was determined by Y. et al. 3 days after administration, as described in Vol. 1, Vol. 192-200 (1994) Of luciferase enzyme activity in lung directly by light unit (1u) by ordinary light measurement Was evaluated. The results are shown in FIG. As shown in FIG. In addition, each dot represents the luciferase enzyme activity of one rat, and the crossbar represents each Indicates the average value of the group. The efficiency of repeated adenovirus-mediated gene transfer is the first Av compared to rats that did not receive dexamethasone at the time of adenovirus administration. Rats receiving ICf2 and dexamethasone were much higher (each 11,786 ± 3523 lu vs. 622 ± 192 lu). Av1Lucl The efficiency of their gene transfer was also similar to that of PBS originally received with dexamethasone. It was higher than the Teru group. Example 3 DSG or high dose to allow effective repeated administration of adenovirus vector Suppression of humoral immune response using cyclophosphamide This example demonstrates that C57BL / 6 male mice 5-6 weeks old (Indy Ana, Indianapolis, Harlan Sprague Dawley) Description of intravenous administration of ills vectors AvlLacZ4 and Av1H9F2 Bell. AvlLacZ4 contains the nuclear target β-galactosidase gene (lacZ) Adenovirus vector, PCT Application No. published on April 13, 1995 No. WO95 / 09654. Av1H9F2 is an adenovirus Constructed from a derivative of the vector plasmid vector pAvlH9FR (times 15), It contains human factor IX DNA and is published in PCT published December 22, 1994. Application No. WO 94/29471. In order to construct Av1H9F2, the shuttle plasmid pAvlH9FR is restricted. After digestion with the restriction enzyme Sfi1, the DNA ends were flattened using T4 DNA polymerase. And the DNA molecule was recycled by ligation. Competent DH5 Cells are transformed and ampicillin resistant clones are amplified and miniprep DNA Was screened by restriction enzyme digestion. Positive clones have been identified and The shuttle plasmid was referred to as pAvS17H9F. Subsequently, 293 cells were digested with pAvS17H9F and C1aI. Co-transfected with a large DNA fragment of Ad-d1327. Recombinant adeno Viral vector plaques are collected, expanded, and factor IX is expressed by ELISA. Screened. Positive clones were identified and amplified and thus the vector Av1 H9F2 was produced. The graphic at the left end of this vector is shown in FIG. Av1H 9F2 lacks a tripartite leader, one base pair at the beginning of the TPL, which Effectively change ATG to CTG. The structure of the vector is determined by restriction enzyme diagnostics, and DNA sequence in the region between the RSV promoter and the 3 'untranslated region of Factor IX cDNA Demonstrated by column analysis. Fifteen mice were treated with 33 mg / kg of deoxyspergualin DSG (East Japan, Japan). Kyoto, Nippon Kayaku Kogyo) once a day from the day before vector administration to a total of 8 days It was immunosuppressed by intracavitary administration. 25 vials containing 100 mg of vacuum-freeze-dried DSG Dissolved in 3.8 ml of injection grade water to yield a mg / ml solution, which Recoated and dried at -20 ° C. Every day, immediately before immunosuppression, an aliquot is placed in the room Thawed at room temperature and 0.7 ml yielded a Hanks flat to yield a 2.5 mg / ml solution. It was mixed with 6.3 ml of balanced salt solution (HBSS). Mouse is once the first DSG Weighed immediately prior to dose administration. Six mice had tail blood on the second day of immunosuppression. Av11acZ4 by tube injection, 1 × 10⁸5 weeks after receiving pfu, AvlH9F2, 1 × 10⁸Received pfu. Another six mice had AvlH9 5 weeks after immunosuppression. Only F2 was received. Although three mice were immunosuppressed, the adenovirus vector Was not received. Six mice with low dose (100 mg / kg) cyclophosphamide (Sigma) And 15 mice were treated with a high dose (300 mg / kg). Animals were given a single intraperitoneal injection of cyclophosphamide one day prior to adenovirus vector administration. Received dosing. All six mice treated with low dose cyclophosphamide One day after cyclophosphamide (administration), Av11acZ4, 1 × 10⁸pfu After 5 weeks, AvlH9F2, 1 × 10⁸Received pfu. High dose cyclophosph Six mice immunosuppressed with amide were Av11acZ4, 1 × 10⁸pf u and 5 weeks later, AvIH9F2, 1 × 10⁸Received pfu. Another six are A It did not receive v11acZ4 but did receive AvlH9F2. Finally, the three mice were immunosuppressed. Control but did not receive the adenovirus vector. Twelve mice were intraperitoneally administered once daily for eight days from one day before vector administration. Sametazon (New York, Shirley, American Reagent Labora (Tries, Inc.) was immunosuppressed at 5 mg / kg. 6 of them Mice were Av11acZ4, 1 × 10 on day 2 of dexamethasone treatment.⁸pfu 5 weeks later, AvIH9F2, 1 × 10⁸Receive pfu. Immunosuppression of 5 animals The mice received only AvlH9F2 and one did not receive the vector. Five weeks after administration of Av11acZ4, but prior to administration of AvlH9F2, Prepared from some mice, anti-adenovirus The ils neutralizing antibody was analyzed. Neutralizing antibodies receive Av11acZ4 without immunosuppression Vector and DSG or high-dose Mice receiving either of the clophosphamides did not detect neutralizing antibodies. Contrast Immunosuppressed mice with low doses of cyclophosphamide or dexamethasone Us developed neutralizing antibodies. Neutralizing antibody titers in 20 mice are given in Table I below. Shown in Table I DSG is deoxyspergualin, Cy is cyclophosphamide, and And Dex are dexamethasone. One week after administration of AvlH9F2, plasma was prepared to determine the level of human factor IX. Was analyzed by Eliza. The result is shown in FIG. Av11 without immunosuppression Mice receiving acZ4 and then 5 weeks later AvlH9F2 developed human factor IX. Did not show. Neither immunosuppressive nor Av11acZ4 received, but AvlH9F2 Mice treated on average expressed 9.2 μg / ml. Av11acZ4 send On average, mice immunosuppressed with DSG and then receiving AvlH9F2 . 6 μg / ml was expressed. Immunosuppressed by DSG but not Av11acZ4 Mice, then treated with AvlH9F2 had an average level of 5.2 μg / ml. Had. Finally treated with DSG but did not receive any vectors Mice did not express human factor IX. Immunosuppressed by low dose cyclophosphamide at the time of administration of Av11acZ4 Mice did not express human factor IX after AvlH9F2 delivery. High dose cyclo Mice treated with phosphamide but not receiving Av11acZ4 had A One week after delivery of vIH9F2, an average of 8 μg / ml was expressed. At the time of Av11acZ4 treatment Mice immunosuppressed with high doses of cyclophosphamide in terms of AvIH9F2 treatment. After placement, an average of 15.4 μg / ml of human factor IX was expressed. Treatment with cyclophosphamide Mice that were placed but not treated with any of the adenovirus vectors were human Factor IX was not expressed. Mice that were immunosuppressed with dexamethasone but not treated with Av11acZ4 Us means mean 1 week after administration of AvlH9F2 5.5 μg / ml of human factor IX was expressed. However, at the time of immunosuppression, Av11ac Mice that received Z4 did not express factor IX after AvlH9F2 delivery. Immunosuppression Controlled but not treated with either vector expresses human factor IX. Did not. Example 4 Suppression of humoral immune response to adenovirus vectors that die after repeated dosing This embodiment is obtained by elaborating and expanding the data included in the third embodiment. This fruit In the embodiments, the following materials and methods are employed. Adenovirus vector Av1LacZ4 and Av1H9F2 were described in Example 3. AvlH9 FRs 293 cells with pAvlH9FR (FIG. 15) and ClaI digested Ad-d1. 327 were co-transfected with the large DNA fragment obtained. Recombinant adenovirus Plasmid plaques are harvested, expanded, and screened for expression of factor IX by ELISA. Was launched. Positive clones were identified and amplified and thus the vector AvlH9 FR was generated. Like AvlH9F2, this vector contains the central truncated first int. Contains complete 5 'and 3' untranslated regions from the Ron and human factor IX genes . The central truncated first intron and the 3 'untranslated region are Jarat, et al.EMBO J. 9 and 3295-3301 (1990) It is the same arrangement. AvlALAPH81 is an adenovirus vector, which is a mouse albu Containing the B region deleted human factor VIII cDNA expressed from the It is described in open PCT application number WO94 / 29471. All vector strains had 10 as determined by quantitative PCR analysis of the E1a sequence.⁶field It contained less than one in live adenovirus. Immunosuppressants Deoxyspergualin (manufactured by Nippon Kayaku Co., Ltd. in Tokyo, Japan) -Gifts from Jersey, Princeton, Bristol-Myers-Squib It is. 100mg glass bottle deoxyspergualin is dissolved in water and final The concentration was 25 mg / ml, aliquoted and frozen at -70 ° C. Frozen strain Thawed at room temperature and diluted in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) prior to injection. Deoxyspergualin is an immunosuppressant currently in clinical trials for organ transplantation. You. It has a potent and long-lasting effect on antigen-specific B cells, Co-administration has been shown to effectively prevent the production of specific antibodies (arrays). Gar, others,Transplant57, pp. 1786-1794 (1994); Tepper ,New York Academy of Science Annual123-132 (1993); Hubason, others,Bulletin of transplant26, pp. 3029-3039 (1994)) . The mode of action of DSG is not completely understood at the molecular level. It's B fine Interfere with the differentiation of vesicles and T cells, and The data suggest that they interfere with antigen processing. DSG inhibits k light chain expression Thus, recent studies have shown that IgM expression was blocked on the surface of pre-B cells (Te Upper, 1993). Further data show that DSG inhibited NFkB nuclear translocation Indicating that DSG may be a mechanism that inhibits the differentiation of B cells and T cells. Was shown. Finally, DSG binds to Hsc70, a heat shock protein (Tepper, 1993). Heat shock protein is protein folded Folding, molecular attendance, peptide loading of MHC molecules, and antigen presentation Accompanied by Thus, binding of DSG to Hsc70 has an effect on antigen presentation. To explain the effects of Cyclophosphamide (Cy) was obtained from Sigma and dissolved in HBSS. Dexamethasone (Dex) solution is available from New York, Shirley, American Rie Obtained from Agent Laboratories, Inc. before injection Diluted in BSS. All three immunosuppressants are administered according to the doses indicated below It was delivered intraperitoneally. Animal treatment C57BL / 6 mice are Harlan Sprague Dawley (Indiana, Indianapolis). Adenovirus vector is suitable for vector strain After tail dilution of the volume with 0.5 ml of Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Administration. At the time indicated in the text, blood was obtained from the retro-orbital plexus. Sodium citrate for plasma sample preparation Immediately added to a final concentration of 0.38% (w / v). Prepare serum sample Blood was allowed to clot. The sample is a 5-minute Eppendorf microfuge. After which the plasma or serum is collected, aliquoted and frozen. Was tied. Human factor VIII ELISA Plasma levels of human factor VIII were measured by Connery, et al.Human gene therapy, Vol. 6, 185- Determined by Eliza, as described on page 193 (1995). B territory The limit of sensitivity using mouse plasma samples containing range-deleted human factor VIII is 3-6. ng / ml. Since the mouse plasma sample was diluted 1: 5 before the assay, The actual detection limit was 15-30 ng / ml. Human factor IX ELISA Plasma levels of human factor IX were determined by ELISA. Asarachrome IX: Ag Riza Kit is a member of the American Bio Products Company (New Jersey, PA) -Sippany) and performed according to the manufacturer's instructions. Limit of sensitivity Was 1.6 ng / ml. Anti-adenovirus antibody assay Mouse plasma or serum samples are heat inactivated at 55 ° C for 30 minutes, then Improved minimal essential medium (Maryland, Rockville, Biofluids) plus 2% Heat inactivated in two steps starting at 1: 2 with FBS (IMEM / 2% FBS) Was. 55 μl of each sample was 10 μl of Avllac Z4 (4 × 10^Fivepfu And 1 hour 37 C., 96 well plates of nearly confluent 293 cells (4 × 10^FourCell / Waye Le). After 60 minutes in a tissue culture incubator, the virus was aspirated from each well. And replaced with 150 μl of IMEM / 10% FBS. The next day the cells are fixed and Stained for β-galactosidase expression as previously described ( Miss, other,Natural genetics5, 397-402 (1993)). Inactive All cells stained blue in the absence of antibody. Inactivated antibody in each sample Titers were reported as the reciprocal of the highest dilution at which less than 25% of the cells stained blue. result Dose dependence of humoral immune response to adenovirus vectors Previous studies examining repeated administration of adenovirus vectors have shown that High doses, which are expected to maximize the strength of the immune response. (Smith, et al., 1993; Kozalsky, et al., 1993)Biological Science Journal, 26 9, 13695-13702 (1994); Kei, et al.National Academy of Sciences Bulletin of Demi 91, 2353-2357 (1994);Gene therapy 192-200 (1994); Young, et al.Virology Journal 69, 2004-2015 (1995); Day et al.,Nationwide Bulletin of the Academy of Sciences , Vol. 92, pp. 1401-1405 (1995); bar ,other,Gene therapy2, Vol. 151-155 (1995)). Vectors inoculated for neutralizing antibody production and repeated dose blocking To determine whether the dose is dependent on the dose of adenovirus vector, TervllacZ4 was administered to C57BL / 6 mice via tail vein. Be Inoculum was 1x10 in single log increments^Three1 × 10 from pfu⁸change to pfu Moved. 34 days after vector delivery, serum levels of anti-adenovirus neutralizing antibody ー 1 × 10^FiveMeasured in mice receiving pfu or higher (Figure 18) . Minus sign means that no antibody was detected in any of the mice in the cohort Is shown. 1 × 10⁸The plus sign corresponding to the mouse receiving the pfu vector is 5 Three of the mice have an antibody titer of 8, while two cannot detect the antibody titer Indicates that Thus 1 × 10⁸Three of the five mice that received pfu 4 × 10^FiveSufficient anti-adenovirus anti-neutralizing to neutralize pfu AvLacZ4 It had body levels, while two mice were at undetectable levels. Vector low All mice receiving the dose will detect antibodies using this relatively harsh neutralization assay. I couldn't get out. 35 days after the administration of AvllacZ4, each mouse is treated with an adeno-encoding human factor IX. AvlH9FR, a Knowle vector, was⁸I received pfu. One week later Factor IX plasma levels were measured by ELISA (FIG. 18). About 2 μg / ml on average Factor IX did not receive AvllacZ4, or 1 × 10 1st vector^Five Detected in mice receiving up to pfu. Factor IX is also 1 × 10⁶pfu and 1 × 10⁷Levels decreased in mice receiving pfu but were detected immediately Was. Avllac Z4, 1 × 10⁸Mice receiving pfu receive AvlH9FR After that little or no human factor IX was produced. Thus effective heredity The condition that offspring transfer and expression are below a certain threshold level at the initial vector dose This can be achieved with a second vector administration under certain circumstances. These data are C57BL For intravenous delivery in / 6 mice, this value was 10⁷And 10⁸pfu Are shown. Transient immunosuppression increases the efficiency of vector re-administration Determine if transient immunosuppression allows re-administration of adenovirus vectors To determine, C57BL / 6 mice were 1 × 10⁸pfu When administered, deoxyspergualin (DSG), cyclophosphamide (Cy) Or dexamethasone (Dex). before As shown, this dose completely prevented effective second delivery. Mouse DS daily G was injected at 33 mg / kg, starting one day before vector delivery and another 7 days Continued. Dexamethasone is delivered at a dose of 5 mg / kg over the same time course Was. Cyclophosphamide is 100 mg / kg once a day before vector delivery or Either 300 mg / kg was administered. Control mice are Avl without immunosuppression. It received lacZ4 or was immunosuppressed without initial vector delivery. Five weeks after vector administration, plasma levels of anti-adenovirus neutralizing antibodies were measured ( (FIG. 19). Immunosuppressed by DSG or cyclophosphamide 300mg / kg Mice did not detect neutralizing antibodies, but all others who received Avllac Z4 mouse of Produced neutralizing antibodies. 35 days after the first vector injection, the mice are AvlH9F2, 1 × 10⁸Received pfu. One week after AvIH9F2 injection, a plasma sample was prepared. And the level of human factor IX was measured in ELISA (FIG. 17). DSG or cyclo Mice immunosuppressed with 300 mg / kg of phosphamide were treated with the first vector. Expressed human factor IX at about the same level as that of mice that did not. Avlac Human factor IX was detected in the plasma of mice that were not immunosuppressed at the time of Z4 administration Did not. Under the conditions used in these studies, dexamethasone or cyclodexamethasone was used. Immunosuppression with phosphamide 100 mg / kg allows expression of factor IX upon repeated injection It was not effective to work. Thus, gene transfer expression by injection of the second vector Ability to achieve neutralizing antibodies by DSG or high-dose cyclophosphamide treatment Was correlated with suppression. When the second vector AvlH9F2 is administered, cyclophosphamide or dexamethasone Half of the mice in each cohort immunosuppressed with tazone were treated in the same manner as the first vector delivery. Was again immunosuppressed. Five weeks later, plasma levels of anti-adenovirus neutralizing antibodies Was measured. Mice immunosuppressed with 300 mg / kg of cyclophosphamide Neutralizing antibodies were not detected, while cyclophosphamide was 100 mg / kg or Shows that mice immunosuppressed with dexamethasone 5 mg / kg show a measurable response (Data not shown). 35 days after AvIH9F2 injection, Factor VIII vector ー, 1 × 10 of AvALALAPH81⁹pfu is 300mg of cyclophosphamide / Kg administered to mice immunosuppressed Was. In addition, the factor VIII vector is not immunosuppressed and the AvIlacZ4 and AvIH Control mice that received 9F2 and also non-medicated mice were administered. One week later, plasma levels of human factor VIII were measured in ELISA (FIG. 20). AvlAL Control mice receiving APH81 vector only, and two pre-vector injections Mice immunosuppressed with cyclophosphamide 300 mg / kg in humans II was expressed. AvllacZ4 and AvlH9F2 received without immunosuppression Mice and mice that received only immunosuppression at the time of AvlacZ4 transmission were human Factor VIII was not expressed. DSG allows for effective multiple doses at clinically relevant doses High doses of either DSG or cyclophosphamide are Was allowed, but clinically relevant doses of cyclophosphamide and dexamethasone were given. Earlier experiments showed that Tason was not effective. The next goal is low-dose DSG Was to determine if it was effective. Of the DSG used in the first experiment The dose (33 mg / kg) is close to the maximum tolerated dose in mice and Significantly higher than 5-7 mg / kg used in clinical experiments (Suzuki et al.,new York Academy of Sciences Annual Report 696, pp. 263-269 (1993); Jindall, etc.Mount Sinai Medical Journal61, pp. 51-56 (199 4 years)). Determine if lower doses are also effective to tolerate vector readministration For determination, mice were 1 × 10⁸DS at the time of pfu administration Immunosuppression at G5, 10, 20, and 33 mg / kg Was controlled. Immunosuppression began one day before vector delivery and continued for a total of eight days. Be DSG was given after injection of the adenovirus on the day of DSG was most effective when administered after Hara (Kogen, et al. ,Transplant53, pp. 914-918 (1992)). After 35 days, each mouse was AvlH9F2, 1 × 10⁸Received pfu. AvlH9 One week after F2 administration, human factor IX plasma levels were measured by ELISA (FIG. 21). Avl Control mice not pre-immunized with lacZ4 had an average of 9 μg / ml human factor IX Was expressed. Other control mice that received Avllac Z4 but were not immunosuppressed Did not express human factor IX after administration of AvlH9F2. 33mg / kg DSG One mouse immunosuppressed expressed human factor IX at 12 μg / ml. 20 Five of the six mice immunosuppressed with mg / kg DSG had an average of 3.0 μg. / Ml human factor IX and one mouse did not express anything. 10mg / Mice immunosuppressed at the kg dose range from 30 ng / ml to 8 μg / ml. It expressed a wide range of human factor IX. 3 mice immunosuppressed at 5 mg / kg Did not express human factor IX, while the other three mice ranged from 2 to 7 μg / ml. Level. Mice that were not immunosuppressed at the time of AvllacZ4 administration Did not express human factor IX. Debate The data show that multiple intravenous injections and the resulting transgenic expression are Short course of immunosuppression at the time of delivery This can be achieved with a treated immune active. This observation is important. That Is that humoral immune responses directed against adenovirus vectors prevent readministration Several recent studies have shown that (Smith et al., 199). Kay, et al., 1994; Yey, et al., 1994; Young, et al., 1995 Year). The inability to re-administer the vector is critical to the clinical use of adenovirus vectors Provided the necessary obstacles. Because effective re-administration can be used for gene therapy of chronic diseases. Clinical application of the vector is definitely needed. Failure to obtain expression and multiple dose administration in the absence of immunosuppression is Correlates with Rus neutralizing antibodies. There is no evidence that such antibodies can block readministration sufficiently , Et al., 1995, where he was dosed from a vector pre-treated mouse. Passive delivery of serum to untreated mice increases vector-mediated gene expression in the liver Showed that it can be hindered. The role of the immune system in preventing repeated dosing is also Observations indicate that repeated administration of the vector is effective in immunodeficient mice (Ya Ning, et al., 1995; Day, et al., 1995; Bar, et al.,Gene therapy, Two volumes, 151-155 (1995)). The result is AvAlALPH81, 5 × 10⁸A to severe combined immunodeficiency mice (scid mice) 5 weeks after delivery of pfu Confirmed by illustrating effective administration of vIH9F2 (data shown Not in). Previous reports describing humoral responses to adenovirus administration have been relatively Since we were using high vector doses, we Assess the relationship between initial vector dose and ability to achieve effective repetitive gene transfer did. The result is that the magnitude of the immune response depends on the initial amount of vector, A dose below the threshold indicated that a second dose was possible. Conclusion that this level was only less than one or two orders of magnitude of clinically relevant vector dose Further suggests that immunosuppression at the time of vector delivery would allow readmission. I was Anti-adenovirus neutralizing antibody titers were observed after mouse single administration via the tail vein. Applicants have observed that they will be retained for at least 10 months in the media. Long term of titer Retention is based on ongoing adenovirus backbone gene expression in transduced cells. This is attributable to the low level of the present. Reduce backbone gene expression Alternatively, vectors designed to eliminate will elicit a weaker gene response, Thus, the need for immunosuppression for successful re-administration is reduced. One important property of DSG is that it produces a general suppression of the immune system. And this leads to a selective lack of response to specific antigens presented at the time of drug treatment. That is to return. Immunosuppression of DSG over 7 days following vector delivery Control effectively inhibits the humoral response to the vector and allows for an effective second dose We discovered that. Initial experiments using DSG were as high as 33 mg / kg. A dose was employed, which was close to the maximum allowed dose in mice and was used in human experiments. It is several times higher than the dose used. Administered over the same 8 day course, of which 7 days When following vector treatment, low doses of DSG also It was effective to allow multiple doses. Individuals greater at the level of factor IX expression Changes were seen at reduced doses, with the lowest dose tested (5 mg / kg ) Also showed significant Factor IX expression in three of the six animals. Cyclophosphamine administered at a dose of 300 mg / kg one day before vector injection Is also effective at blocking humoral responses and uses factor IX adenovirus vectors. Allowed a completely effective second injection. Factor VI further encoding the vector The third injection with II was also performed with the cyclophosphine in each of the previous two vector doses. It was completely effective when placed before a single dose of amide. Cyclophosphamido De is used clinically as an anticancer agent in the treatment of Hodgkin's disease and other leukemias. So It also exempts hemophilia patients from evolving inhibitors with factor VIII protein replacement therapy. Used as an epidemic (yield,American Journal of Hematology, 47 Vol. 208-217 (1994); Nilsson et al.New England Medical journal 318, pages 947-950 (1988)). With mouse The dose used to achieve successful re-administration is higher than that commonly used in humans Is much higher, while lower clinically acceptable doses are effective in humans It remains to be confirmed. Experience of organ transplant setting One potential suggestion is that the combination of immunosuppressive drugs may result in less toxic It will produce more powerful restraints on the system. For example, cyclophos Famide is effective at low doses when combined with dexamethasone. Required exemption Treat the degree of epidemic control It is also possible to depend on the dose of vector required to carry out the. This laboratory Dose of AvIH9F2 used in the study, 1 × 10⁸pfu is 5-10 μg / ml Produce human plasma levels of human factor IX, which raise the level to treat hemophiliacs by 20- 50 times higher. Express transgene products at high levels and administer relatively low doses Vectors, such as AvlH9F2, which can be used for The degree of immunosuppression is necessarily reduced. In summary, effective repetitive delivery of systemically administered adenovirus vectors is Applicants have shown that this can be achieved with immunosuppression. Importantly, this is human Can be achieved with drugs that have been approved or are in clinical trials. That is. All patents, published information (including published patent applications) cited in this specification ), And the database access number and accession number As if each individual patent, public information and database access number, and commissioned Whether the access number was specifically and individually indicated to be incorporated as a reference And is specifically incorporated herein by reference. However, the scope of the present invention is not limited to the specific embodiments described above. This The invention of the present invention can be carried out in addition to those particularly described, and It is within the scope of the claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 45/00 ＡＢＣＡ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者マクレランド，アランアメリカ合衆国，20882 メリーランド, ゲイザーズバーグ，ウッドフィールドロード 23709 (72)発明者カレコ，マイケルアメリカ合衆国，20854 メリーランド, ロックビル，ハースストーンコート８ (72)発明者スミス，セオドアアメリカ合衆国，20854 メリーランド, ジャーマンタウン，クラブヒルドライブ 20165──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI A61K 45/00 ABC A61K 37/02 C12N 15/09 C12N 15/00 A // (C12N 15/09 C12R 1:92) (81 ) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), CA, JP, US (72) Inventor McClelland , Alan United States, 20882 Maryland, Gaithersburg, Woodfield Road 23709 (72) Inventor Kaleko, Michael United States of America, 20854 Maryland, Rockville, Hearthstone Court 8 (72) Inventor Smith, Theodore United States of America, 20854 Maryland, Germantown, Club Hill Dry 20165

Claims

[Claims] 1. One method of performing gene therapy treatment on a host comprising: (a) administering to the host (i) an adenoviral vector comprising at least one DNA sequence encoding a therapeutic agent; and (ii) an immunosuppressive agent; (B) interrupting the administration of the adenovirus vector and the immunosuppressant; and (c) providing the adenovirus vector and the immunosuppressant comprising at least one DNA sequence encoding the therapeutic of step (a). The course of administration is repeated at least once, wherein the adenoviral vector is administered in an amount effective to produce a therapeutic effect in the host, and the immunosuppressive agent interferes with the host's immune response to the adenoviral vector or Administering in an amount effective to inhibit. 2. The method of claim 1, wherein said immunosuppressant is a steroid. 3. 3. The method of claim 2, wherein the steroid is dexamethasone. 4. 2. The method of claim 1, wherein said immunosuppressant is cyclosporin A. 5. 2. The method of claim 1, wherein said adenovirus vector is administered each time in an amount from about 1 pfu to about 10 ¹⁴ pfu. 6. 4. The method of claim 3, wherein said dexamethasone is administered each time in an amount from about 1 mg / kg to about 15 mg / kg. 7. 7. The method of claim 6, wherein said dexamethasone is administered each time in an amount of about 2 mg / kg. 8. 6. The method of claim 5, wherein said adenovirus vector is administered each time in an amount from about 10 ⁶ pfu to about 10 ¹³ pfu. 9. 9. The method of claim 8, wherein said adenoviral vector is administered each time in an amount from about 10 ⁸ pfu to about 10 ¹⁰ pfu. 10. 2. The method of claim 1, wherein said immunosuppressant is deoxyspergualin. 11. 11. The method of claim 10, wherein said deoxyspergualin is administered each time in an amount from about 1 mg / kg to about 33 mg / kg. 12. 2. The method of claim 1, wherein said immunosuppressant is cyclophosphamide. 13. 13. The method of claim 12, wherein said cyclophosphamide is administered each time in an amount from about 5 mg / kg to about 300 mg / kg. 14． 2. The method of claim 1, wherein said deoxyspergualin is administered each time in an amount from about 3 mg / kg to about 7 mg / kg. 15. 14. The method of claim 13, wherein the cyclophosphamide is administered each time in an amount from about 50 mg / kg to about 100 mg / kg. 16. 2. The method of claim 1, wherein the immunosuppressant is administered for a period not exceeding 14 days. 17． 17. The method of claim 16, wherein said immunosuppressant is administered for a period not exceeding 11 days. 18. 18. The method of claim 17, wherein said immunosuppressant is administered for a period not exceeding 8 days. 19. 2. The method of claim 1, wherein said administration of said immunosuppressive agent is initiated about 24 hours prior to administration of said adenoviral vector. 20. 2. The method of claim 1, wherein said administration of said immunosuppressive agent is initiated concurrently with administration of said adenovirus vector. 21. 2. The method of claim 1, wherein said administration of said immunosuppressive agent is initiated about 24 hours after administration of said adenovirus vector.