JPH10506289A

JPH10506289A - Two therapeutic genes: adenoviruses containing suicide and immunostimulatory genes

Info

Publication number: JPH10506289A
Application number: JP8511469A
Authority: JP
Inventors: ドネフル，パトリス; ペリコデ，ミツシエル; トツク，ブリユノ
Original assignee: ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー
Priority date: 1994-10-04
Filing date: 1995-10-02
Publication date: 1998-06-23
Also published as: NO971521L; AU714867B2; FR2725213B1; MX9702078A; EP0784691A1; AU3611495A; FI971377A0; CA2200629A1; FR2725213A1; FI971377A; NO971521D0; WO1996010642A1; NO319893B1

Abstract

(57)【要約】新規なアデノウイルス由来のウイルスベクター、その製法、および遺伝子治療におけるその使用。特に、２の治療的遺伝子、すなわち、自殺遺伝子および免疫刺激もしくは腫瘍−サプレッサー遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスを開示する。 (57) [Summary] Novel adenovirus-derived viral vectors, their preparation and their use in gene therapy. In particular, a defective recombinant adenovirus comprising two therapeutic genes, a suicide gene and an immunostimulatory or tumor-suppressor gene, is disclosed.

Description

【発明の詳細な説明】２の治療的遺伝子：自殺性および免疫刺激性遺伝子を含むアデノウイルス本発明は、新しいウイルスベクター、その製法および遺伝子治療におけるその使用に関する。また、本発明は、該ウイルスベクターを含有する医薬組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、遺伝子治療のためのベクターとしての組換えアデノウイルスに関する。遺伝子治療は、遺伝子情報を患部の器官または細胞に導入することによって欠陥または異常性（突然変異、異常発現等）を矯正することからなる。この遺伝情報は、器官から抽出された細胞にイン・ビトロで導入して、該修飾された細胞は次いで身体に再度導入されるか、あるいはイン・ビボで適当な組織に直接導入される。この第２の場合、ＤＮＡおよびＤＥＡＥ−デクストラン（Ｐａｇａｎｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７（８９１）の複合体、ＤＮＡおよび核タンパク質の複合体（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３(１９８９)３７５）、ＤＮＡおよび脂質の複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒら、ＰＮＡＳ８４（１９８７）７４１３）、およびリポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）に関する種々のトランスフェクション技術には、異なる技術が存在する。より最近では、これらの物理的トランスフェクション技術の替わりに期待されるものとして、遺伝子の移入用ベクターとしてのウイルスの使用が出現した。これに関し、異なるウイルスが、ある細胞集団を感染するその能力につきテストされてきた。特に、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳ等）、ＨＳＶウイルス、アデノ−関連ウイルスおよびアデノウイルスである。これらのウイルスのうち、アデノウイルスは遺伝子治療での使用に有利なある種の特性を示す。特に、それらは、かなり広い宿主スペクトルを有し、静止期細胞を感染でき、感染細胞のゲノムに組み込まれた状態とはならず、これまでヒトにおける主要疾患に関連してこなかった。アデノウイルスは、サイズが約３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡを持つウイルスである。そのゲノムは、特に、その端部の逆方向反復配列（ＩＴＲ）、カプセル化配列、初期遺伝子および後記遺伝子（図１参照）を含む。主要初期遺伝子はＥ１（Ｅ１ａおよびＥ１ｂ）、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子である。主要後記遺伝子はＬ１〜Ｌ５遺伝子である。アデノウイルスの前記特性が与えられれば、それらは、イン・ビボで遺伝子の導入で既に使用されてきた。この目的では、異なるアデノウイルス−由来ベクターが調製され、異なる遺伝子に組み込まれた（β−ｇａｌ、ＯＴＣ、α−１ＡＴ、サイトカイン等）。これらの各構築体において、アデノウイルスは、感染細胞で複製できないようにするために修飾されてきた。かくして、先行技術で記載されている構築体は領域Ｅ１（Ｅ１ａおよび／またはＥ１ｂ）および所望により、異種ＤＮＡ配列が挿入されるレベルでのＥ３を欠失したアデノウイルスである（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ１０１(１９９１)１９５；Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、Ｇｅｎｅ５０（１９８６）１６１）。本発明は、遺伝子治療適用に特に効果的な新しいアデノウイルス−由来ベクターに関する。さらに詳しくは、本発明は、部分的には、注目するいくつかの遺伝子をアデノウイルスに導入して、感染細胞でこれらの異なる遺伝子の実質的発現を得ることができるという証明の結果である。また、本発明は、その最適発現を可能とする条件下で、いくつかの治療遺伝子を組み込むことができるアデノウイルスベクターの構築の結果である。さらに、本発明は、相補的治療遺伝子の、同一標的細胞における共発現に関連した、本発明のベクターの相乗的効果の証明に由来する。かくして、本発明は、遺伝子または細胞の治療でその使用が完全に有利である治療特性を呈するウイルスベクターを提供する。特に、本発明のベクターは、細胞過剰増殖（癌、再狭窄）のエピソードでの疾患の治療で使用するのに完全に有利である特性を示す。本発明の最初の主題は、２の治療的遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスに関し、ここに、該治療的遺伝子の一方は自殺遺伝子であって、他方は免疫刺激もしくは腫瘍−サプレッサー遺伝子である。出願人は、事実、同一標的細胞におけるかかる遺伝子の同時共発現は、これらの遺伝子単独または別途導入によって得られる効果よりもかなり大きい特に有利な治療的抗腫瘍効果を生じることを示した。本発明の枠内で使用される治療的遺伝子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）または、例えば、１以上のイントロンが挿入され得るｃＤＮＡからなるハイブリッド構築体であり得る。また、それらは、合成または半合成配列であり得る。特に有利には、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡを使用する。本発明によりアデノウイルスベクターに組み込まれた２の治療的遺伝子は異なる方法で配置できる。まず、それらは、単一の転写体（entity）を構成する。この配置では、２の遺伝子は連続的であり、単一のプロモーターの制御下に置かれ、単一のプレメッセンジャーＲＮＡを生起する。この配置は、唯一の転写プロモーターを使用するのが可能なので有利である。２の治療的遺伝子は別々の転写プロモーターの制御下に置くこともできる。この配置は高発現レベルを得ることができ、遺伝子発現の良好な制御を提供する。この場合、２の治療的遺伝子は、アデノウイルスゲノムの同一部位または異なる部位に、同一の向きに挿入することができるか、あるいは逆向きに挿入することができる。自殺遺伝子としては、その発現産物が細胞に治療剤に対する感受性を与える遺伝子が好ましく使用される。より好ましくは、自殺遺伝子はチミジンキナーゼであり、その発現産物は哺乳動物細胞に、ガンシクロビール（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）およびアシクロビール（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）のごときある種の治療剤に関する感受性を付与する。単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼはアシクロビール（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）およびガンシクロビール（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）のごときヌクレオシド類似体をリン酸化できる。これらの修飾された分子は、伸長されつつあるＤＮＡ鎖に取り込むことができ、その結果、ＤＮＡ合成が停止され、細胞の死減を引き起こす（Ｆ．Ｌ．Ｍｏｏｌｔｅｎ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４６（１９８６）５２７６）。かくして、この戦略は、自殺遺伝子を発現する細胞を特異的に排除するのを可能とする。さらに、ＤＮＡ合成は毒性の標的であり、分裂している細胞のみが影響される。より好ましくは、ヒト単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ｈＴＫ、ＨＳＶ−１）を本発明の枠内で使用する。この遺伝子の配列は文献に記載されている（特に、ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ．Ｒｅｓ８（１９８０）５９３１参照）。また、より大きい基質特異性および良好なキナーゼ活性を有するこの配列の誘導体を使用することもできる。かかる誘導体は、特に、前記したごとき結合部位のレベルでの突然変異誘発によって得ることができる（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１９９０）２９７９；Ｍｕｎｉｒら、ＪＢＣ２６７（１９９２）６５８４）。また、その発現産物が、哺乳動物細胞にニトロ芳香族産物に対する感受性を付与するニトロレダクターゼまたは５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）に対する感受性を哺乳動物細胞に付与するシトシンデアミナーゼを使用することもできる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１９９１）４１２６）。前記したごとく、自殺遺伝子を免疫刺激または腫瘍サプレッサー遺伝子と組み合わせるのが最も有利である。これに関し、免疫刺激遺伝子は、その発現産物が身体の防御を刺激できるいずれの遺伝子であってもよい。好ましくは、特にリンホカイン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１２）のごときサイトカイン、インターフェロン（アルファ、ベータ等）、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ− ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ等）等をコードする遺伝子である。なおさらに好ましくは、インターロイキン−２またはＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子である。インターロイキン−２は、抗原、特に腫瘍抗原の存在に応答して、リンパ球によって実質的に合成される。次いで、それは、細胞毒性Ｔおよびキラー（ＮＫ）細胞の局所的活性化によって、これらの抗原に対する免疫応答の発生に作用する。かくして、このリンホカインは抗腫瘍免疫性で主要な役割を演じる。本発明のベクターによって、今や、インターロイキン−２の、およびチミジンキナーゼ遺伝子のごとき自殺遺伝子の、同一腫瘍細胞における、同時発現から得られる相乗的抗腫瘍効果を得ることができる。ＧＭ−ＣＳＦは顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子である。従って、それは、これらの免疫細胞の増殖を刺激し、従って、免疫防御を補強できる。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子およびｃＤＮＡは文献に記載されている。自殺遺伝子と一緒の、本発明のベクターにおけるその共発現は高い相乗的抗腫瘍効果を生じる。本発明の枠内で使用できる腫瘍−サプレッサー遺伝子の中には、特にｐ５３、Ｒｂ、ｒａｐ１Ａ、ＤＤＣ、ＷＡＦおよびＭＴＳ遺伝子を挙げることができる。より好ましくは、ｐ５３またはＲｂ遺伝子を用いる。ｐ５３遺伝子は５３ｋＤａの核タンパク質をコードする。欠失および／または突然変異によって突然変異するこの遺伝子の形態はほとんどのヒト癌の発生に関与する（Ｂａｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４（１９８９）２１７）。また、その突然変異形態はｒａｓオンコジーンと共働してネズミ繊維芽細胞を形質転換することもできる。天然ｐ５３をコードする野生型遺伝子は、他方、種々の組合せのオンコジーンで形質転換された齧歯類繊維芽細胞における形質転換のフォーカスの形成を阻害する。最近のデータは、ｐ５３遺伝子はそれ自体他の腫瘍−サプレッサー遺伝子を刺激できるのではないかと強調している。さらに、血管小筋肉細胞の増殖に対するｐ５３の効果が最近示されている（Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１５１（１９９４））。Ｒｂ遺伝子は、その機能が、休止相へのその侵入を引き起こす細胞の分裂を抑制すべき約９２７アミノ酸（Ｆｒｉｅｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ３２３（１９８６）６４３）の核リンタンパク質の合成を決定する。Ｒｂ遺伝子の不活性形態は、異なる腫瘍で、特に網膜芽細胞腫および骨肉腫のごとき間葉癌で考えられてきた。この遺伝子の、それが不活化された腫瘍細胞への再導入は、正常状態への復帰および腫瘍形成の喪失を生じる（Ｈｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２（１９８８）１５６３）。最近、正常Ｒｂタンパク質（その突然変異形態ではなく）はプロトーオンコジーンｃ−ｆｏｓ（細胞増殖に必須の遺伝子）の発現を抑制することが示された。ＷＡＦおよびＭＴＳ遺伝子およびその抗腫瘍特性は文献に記載されている（Ｃｅｌｌ７５（１９９３）８１７；Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４（１９９４）４３６）。特に好ましい具体例において、本発明は、チミジンキナーゼをコードする遺伝子および腫瘍−サプレッサー遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスに関する。より好ましくは、本発明は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝子および野生型ｐ５３遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＴＫ−ｐ５３）に関する。特に有利には、２の遺伝子は、別々のプロモーター、好ましくはＨＳＶウイルスＬＴＲプロモーターの制御下に置く。なおさらに好ましくは、２の遺伝子はアデノウイルスゲノムのＥ１領域のレベルにおいて挿入する。もう１つの特に好ましい具体例において、本発明は、チミジンキナーゼをコードする遺伝子およびリンホカインをコードする遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスに関する。より好ましくは、本発明は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝子およびインターロイキン−２をコードする遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＴＫ−ＩＬ２）またはヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝子およびＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＴＫ−ＧＭ−ＣＳＦ）に関する。特に有利には、２の遺伝子は別々のプロモーター、好ましくはＨＳＶウイルスＬＴＲプロモーターの制御下に置く。なおさらに好ましくは、２の遺伝子はアデノウイルスゲノムのＥ１領域のレベルにおいて挿入される。本発明の枠内で使用される転写プロモーターに関しては、それらは、感染細胞で機能できる場合に考えられる治療的遺伝子の発現を天然で担うプロモーターであり得る。それらは、（他のタンパク質または合成タンパク質でさえ発現を担う）異なる起源の配列であり得る。特に、それらは、哺乳動物、真核生物またはウイルス遺伝子の配列であり得る。例えば、それらは、感染させるのが望まれる細胞のゲノムに由来するプロモーター配列であり得る。同様に、それらは、使用するアデノウイルスを含めた、ウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列であり得る。これに関し、例えば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶおよびＲＳＶ遺伝子等のプロモーターを挙げることができる。加えて、これらの発現配列は、組織−特異的発現を可能とする配列の活性化および調節配列の付加によって修飾することができる。さらに、挿入された遺伝子が発現配列を含有しない場合は、それはかかる配列の下流の欠陥ウイルスのゲノムに挿入できる。本発明のベクターを産生する好ましいプロモーターは、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ＬＴＲ−ＲＳＶ）よりなる。他の特に好ましいプロモーターは、増殖または癌細胞に特異的なプロモーターである。これらのプロモーターは、事実、規定細胞集団に対して治療効果を標的化できる。本発明の好ましい具体例において、発現シグナルは、腫瘍の原因となるまたはそれに関するウイルスの存在によって誘導されるか、またはその存在下で活性である。なおさらに好ましくは、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）によって、またはパピローマウイルスによって誘導可能な発現ウイルスは本発明の枠内で使用される。エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）は、２つのタイプのヒト癌：バーキットリンパ腫および鼻咽頭の癌に関連する。ＥＢＶによって誘導可能なプロモーターの制御下にある毒性遺伝子よりなる組換えアデノウイルスの使用は、鼻咽頭の腫瘍細胞においてこの毒性遺伝子を特異的発現させる。鼻咽頭の癌のバイオプシーにおいて、単一の核抗原は規則的に存在するＥＢＮＡ１であり、これは、ＥＢＶによって感染される細胞におけるウイルスゲノムを潜伏期に維持することに関連し、これはＢＣＲ２ウイルスプロモーターをトラント活性化する。従って、本発明の特別の主題は、ＥＢＮＡ１応答的配列（ＥＢＮＡ１−ＲＥ）の、鼻咽頭の癌細胞における遺伝子の特異的発現のための使用にある。特に、本発明は、もう１つのウイルスプロモーター（末端タンパク質１（ＴＰ１）のための遺伝子のプロモーター）の上流で使用されるＥＢＮＡ１応答的配列からなるキメラプロモーターを発現シグナルとして含んでなるアデノウイルスに関する。本出願で記載される例は、明らかに、このキメラプロモーターはＥＢＮＡ１によって誘導可能であることを示す。パピローマウイルス（特にＨＰＶ１６および１８ウイルス）は、婦人の子宮癌の９０％を担い、前癌表皮細胞病巣で同定されている（Ｒｉｏｕら、Ｌａｎｃｅｔ３３５（１９９０）１１７）。Ｅ６遺伝子の産物は、ＨＰＶ−陽性細胞において、野生型ｐ５３、抗−オンコジーンの量を実質的に減少させることによって、腫瘍の形成に導く（Ｗｒｅｄｅら、Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．４（１９９１）１７１）。ＨＰＶ（例えば、Ｅ６タンパク質）によって誘導可能なプロモーターの制御下にある毒性遺伝子からなる組換えアデノウイルスの使用は、対応する腫瘍細胞にいてこの毒性遺伝子を特異的に発現させる。発現シグナルは、さらに、正常細胞で不活性であり得、腫瘍細胞で活性であり得る。特に、本発明の枠内で、α−フェトプロテインのプロモーター（ＡｌｐｅｒｔＥ．，ｄａｎｓＨｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｋｕｄａ＆Ｐｅｔｅｒｓ（編），ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７６，３５３）またはＩＧＦ−ＩＩのＰ３プロモーター（Ｓｕｓｓｅｎｂａｃｈら、ＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ２（１９９１）１）を使用することができ、これらは成体で、特に悪性肝癌でのみ活性である。また、ホルモン−依存的またはホルモン−関連腫瘍の場合には、ホルモンによって誘導できるプロモーターを使用することもできる（例えば、乳癌または前立腺腫瘍）。前記したごとく、本発明のベクターの生産では異なる配置が考えられる。まず、本発明のベクターは単一の転写体(transcriptional entity)の形態である２の遺伝子を含有することができる。この配置では、２の遺伝子は隣接し、単一のプロモーターの制御下に置かれ、単一のプレメッセンジャーＲＮＡを生起する。その配置は、単一の転写プロモーターを使用して２の遺伝子の発現を調節できるので有利である。さらに、この単一転写体は、２つの可能な向きでアデノウイルスベクターに組み込むことができる。また、２の遺伝子を別々の転写プロモーターの制御下に置くこともできる。この配置は、高発現レベルを得ることができ、遺伝子発現の良好な制御を提供する。この場合、２の治療的遺伝子は同一の向きで、あるいは逆の向きで、アデノウイルスゲノムの同一部位または異なる部位に挿入できる。好ましくは、該遺伝子は、少なくとも部分的には、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３またはＥ４領域のレベルで挿入される。それらを２つの異なる部位に挿入する場合は、Ｅ１およびＥ３またはＥ１およびＥ４領域の使用は本発明の枠内のものである。特に有利な具体例は、２の治療的遺伝子がＥ１領域のレベルで挿入されるものである。その例は、事実、この挿入は、２つの間の干渉なくして、２の遺伝子の高い発現を可能とすることを示す。従って、本発明は、ゲノムのＥ１領域のレベルにおいて挿入された注目する２の治療的遺伝子に関する。さらに、また、免疫刺激遺伝は、標的細胞の分泌経路において合成される産物に向けられるシグナル配列を含む。このシグナル配列は免疫刺激産物の天然シグナル配列であってもよいが、いずれの他の機能的シグナル配列または人工的シグナル配列のいずれであってもよい。前記したごとく、本発明のアデノウイルスは欠陥(defective)があり、すなわち、それらは標的細胞では自律的に複製できない。一般に、本発明による欠陥アデノウイルスのゲノムは、少なくとも、感染細胞における該ウイルスの複製のために必要な配列を欠く。これらの領域は（完全にまたは部分的に）除去されていてもよく、あるいは非機能的にされていてもよく、あるいは他の配列によって、または治療的遺伝子によって置き換えられていてもよい。本発明のアデノウイルスの欠陥特性は重要な要素である。というのは、それは投与後に本発明のベクターの非散在を確実とするからである。好ましい具体例において、本発明のアデノウイルスは、ＩＴＲ配列およびカプセル化(encapsidation)を可能とする配列を含み、Ｅ１遺伝子の全部または一部の欠失を有する。逆方向反復配列（ＩＴＲ）はアデノウイルスの複製起点を構成する。それらはウイルスゲノムの３’および５’末端の間に位置し（図１参照）、それから、当業者に公知の通常の分子生物学技術によって容易に単離される。ヒトアデノウイルス（特に、Ａｄ２およびＡｄ５セロタイプ）のＩＴＲ配列のヌクレオチド配列は文献に記載されており、イヌアデノウイルス（特に、ＣＡＶ１およびＣＡＶ２）も同様である。例えばＡｄ５アデノウイルスに関しては、左側ＩＴＲ配列はゲノムの１〜１０３ヌクレオチドに対応する。カプセル化配列（Ｐｓｉ配列とも言われる）は、ウイルスＤＮＡのカプセル化に必要である。従って、この領域は、本発明の欠陥組換えアデノウイルスの調製を行うのに存在させなければならない。カプセル化配列はアデノウイルスゲノムに、左側（５’）ＩＴＲおよびＥ１遺伝子の間に存在する（図１参照）。それは、通常の分子生物学技術によって単離できるか、あるいは人工的に合成できる。ヒトアデノウイルス（特に、Ａｄ２およびＡｄ５セロタイプ）のカプセル化配列のヌクレオチド配列は文献に記載されており、イヌアデノウイルス（特に、ＣＡＶ１およびＣＡＶ２）も同様である。例えば、Ａｄ５アデノウイルスに関しては、カプセル化配列はゲノムのヌクレオチド１９４〜３５８を含む領域に対応する。より好ましくは、本発明のアデノウイルスはＩＴＲ配列およびカプセル化を可能とする配列を含み、Ｅ１およびＥ４遺伝子の全部または一部の欠失を有する。より好ましい具体例において、本発明のアデノウイルスのゲノムは、Ｅ１、Ｅ３およびＥ４遺伝子の全部または一部、なおさらに好ましくは、Ｅ１、Ｅ３、Ｌ５およびＥ４遺伝子の全部または一部を欠失している。本発明のアデノウイルスは、広範な起源のアデノウイルスから調製できる。事実、異なるアデノウイルスセロタイプがあり、その構造および特性はいくぶん変化するが、匹敵する遺伝的組織を呈する。かくして、本出願に記載する教示は、いずれのタイプのアデノウイルスについても当業者が容易に追試できるであろう。より詳しくは、本発明のアデノウイルスはヒト、動物または混合（ヒトおよび動物）起源であってもよい。ヒト起源のアデノウイルスに関しては、グループＣに分類されるものの使用が好ましい。より好ましくは、異なるヒトアデノウイルスセロタイプのうち、タイプ２および５のアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）の使用が本発明の枠内で好ましい。前記したごとく、また、本発明のアデノウイルスは動物起源でものであってよく、あるいは動物起源のアデノウイルスに由来する配列を含むものであってもよい。出願人は、事実、動物起源のアデノウイルスは高効率でヒト細胞に感染でき、また、それらはテストされたヒト細胞で増殖できないことを示した（仏国特許出願９３０５９５４参照）。また、出願人は、動物起源のアデノウイルスはヒト起源のアデノウイルスによって全くトランス−補足（trans-complemented）されず、これは、感染粒子の形成に導くことができるヒトアデノウイルスの存在下で、組換えおよびイン・ビボでの増殖のいずれの危険も除外する。動物起源のアデノウイルスまたはアデノウイルスの領域の使用は、従って、特に有利である。というのは、遺伝子治療においてベクターとしてウイルスを使用するのに固有の危険はより小さくなるからである。本発明の枠内で使用できる動物起源のアデノウイルスはイヌ、ウシ、ネズミ（例えば、Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、鳥類または類人猿（例えば：ＳＡＶ）起源であってよい。より特別には、鳥類アデノウイルスのうちには、例えば株Ｐｈｅｌｐｓ（ＡＴＣＣＶＲ−４３２）、Ｆｏｎｔｅｓ（ＡＴＣＣＶＲ−２８０）、Ｐ７−Ａ（ＡＴＣＣＶＲ−８２７）、ＩＢＨ−２Ａ（ＡＴＣＣＶＲ−８２８）、Ｊ２−Ａ（ＡＴＣＣＶＲ −８２９）、Ｔ８−Ａ（ＡＴＣＣＶＲ−８３０）、Ｋ−１１（ＡＴＣＣＶＲ −９２１）または参照株ＡＴＣＣＶＲ−８３１〜８３５のようなＡＴＣＣで入手可能なセロタイプ１ないし１０が挙げられる。ウシアデノウイルスのうちでは、公知の異なるセロタイプ、特に、参照ＡＴＣＣＶＲ−３１３、３１４、６３９−６４２、７６８および７６９の下でＡＴＣＣで入手できるもの（タイプ１〜８）を使用できる。また、ネズミアデノウイルスＦＬ（ＡＴＣＣＶＲ−５５０）およびＥ２０３０８（ＡＴＣＣＶＲ−５２８）、ヒツジアデノウイルスタイプ５（ＡＴＣＣＶＲ−１３４３）またはタイプ６（ＡＴＣＣＲ−１３４０）；ブタアデノウイルス（５３５９）、または特に番号ＶＲ−５９１−５９４、９４１−９４３、１９５−２０３等の下でＡＴＣＣで参照されるアデノウイルスのようなシミアンアデノウイルスが挙げられる。好ましくは、動物起源の異なるアデノウイルスのうちには、イヌ起源のアデノウイルスまたはアデノウイルスの領域、特にすべてのＣＡＶ２アデノウイルス株［例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣＶＲ−８００）］が本発明の枠内で使用される。イヌアデノウイルスは多数の構造的研究の主題であった。かくして、ＣＡＶ１およびＣＡＶ２アデノウイルスの完全な制限地図は先行技術で記載されており（Ｓｐｉｂｅｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９８９）１６５）、Ｅ１ａおよびＥ３遺伝子ならびにＩＴＲ配列はクローン化され、配列決定されている（特に、Ｓｐｉｂｅｙら、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．１４（１９８９）２４１；Ｌｉｎｎｅ，ＶｉｒｕｓＲｅｓ．２３（１９９２）１１９，ＷＯ９１／１１５３５参照）。本発明の欠陥組換えアデノウイルスは種々の方法で調製できる。第１の方法は、イン・ビトロで調製された欠陥組換えウイルスのＤＮＡ（連結によるまたはプラスミド形態による）をコンピテント細胞系（すなわち、欠陥ウイルスの相補性(Complementation)に必要な全ての機能をトランス(intrans)にて担う）へトランスフェクトすることよりなる。これらの機能は好ましくは細胞のゲノムに組み込まれ、これは組換えの危険み込まれ、これは組換えの危険性を回避することを可能とし、増大した安定性を細胞系に与える。第２のアプローチは、イン・ビトロで調製した欠陥組換えウイルスからのＤＮＡ（連結またはプラスミド形態による）、およびヘルパーウイルスからのＤＮＡを適当な細胞系に共トランスフェクトすることからなる。本発明によると、組換えアデノウイルスのすべての欠陥機能を補足できるコンピテント細胞系を有する必要はない。これらの機能の一部は、事実、ヘルパーウイルスによって補足される。このヘルパーウイルスは、それ自体、欠陥があり、細胞系がその補足のために必要な機能をトランスにて担持する。特に第２のアプローチの意味で使用できる細胞系には、特にヒト胚系２９３、ＫＢ細胞、細胞Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＧＨＫ等（実施例参照）が挙げることができる。次に、増殖したベクターを回収し、精製し、通常の分子生物学的技術に従って増幅する。変形した具体例では、連結またはプラスミド形成のいずれかによって、適当な欠失および２の治療的遺伝子を担持する欠陥組換えウイルスＤＮＡをイン・ビトロで調製することができる。前記したごとく、本発明のベクターは、有利には、あるウイルス遺伝子、特にＥ１、Ｅ３、Ｅ４および／またはＬ５遺伝子の全部または一部の欠失を有する。この欠失は、考えられる遺伝子に影響するいずれのタイプの抑制にも対応できる。それは、特に、該遺伝子の暗号配列の全てまたは一部、および／または該遺伝子の転写プロモーター領域の全部または一部の抑制であり得る。抑制は、一般に、実施例に示すごとく、分子生物学技術に従い、例えば、適当な制限酵素による消化、次いで、連結によって欠陥組換えウイルスＤＮＡに対して生じる。次いで、選択された領域のレベルにて、かつ選択した向きにて、治療的遺伝子を、酵素切断、次いで連結によってこのＤＮＡに挿入できる。かくして得られたＤＮＡ（従って、適当な欠失および２の治療的遺伝子を担持する）は、該欠失および治療的遺伝子を担持する欠陥組換えアデノウイルスが直接生じるのを可能とする。この第１の変形は、特に、治療的遺伝子が別々のプロモーターの制御下にある単一転写単位（unit）の形態で配置され、ゲノムの同一部位に挿入された組換えアデノウイルスの生産に適用される。また、２段階で組換えウイルスを調製することも可能であり、２の治療的遺伝子の連続的導入を可能とする。かくして、適当な欠失（または該欠失の一部）および治療的遺伝子の１つを担持する第１の組換えウィルスからのＤＮＡは、連結またはプラスミド形態で構築される。次いで、このＤＮＡを使用して、該欠失および治療的遺伝子を担持する第１の組換えウイルスを得る。次いで、この第１のウイルスからのＤＮＡを単離し、第２のプラスミドまたは第２の治療的遺伝子、適当な欠失（第１のウイルス上に存在しない一部）、および相同組換えを可能とする領域を担持する第２の欠陥組換えウイルスからのＤＮＡで共トランスフェクトする。かくして、この第２の段階で、２の治療的遺伝子を担持する欠陥組換えウイルスが生じる。この変形調製は、特に、アデノウイルスゲノムの２の異なる領域に挿入された２の治療的遺伝子を担持する組換えウイルスの調製に適する。また、本発明は、前記した欠陥組換えアデノウイルスを１つ以上を含むいかなる医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻孔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内または経皮経路等を介する投与用に処方できる。好ましくは、該医薬組成物は、注射用処方のための医薬上許容される賦形剤を含有する。それらは、特に、等張滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム等、かかる塩の混合物）、または乾燥した、特に、場合に応じての滅菌水または生理食塩水の添加に際して、注射溶液の調製を可能とする、凍結乾燥した組成物であってよい。注射に使用するウイルス用量は、異なるパラメーターに応じて、特に使用する投与方法、関連する疾患、発現させるべき遺伝子、または治療の望まれる持続に従って適合させることができる。一般に、本発明の組換えアデノウイルスは１０４および１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌの間、好ましくは１０⁶および１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの間の用量の形態で投与される。ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）なる語は、ウイルス溶液の感染性に対応し、適当な細胞培養を感染させ、一般に５日後に感染した細胞プラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を測定する技術は文献によく記載されている。本発明のアデノウイルスは、多数の疾患の治療または予防で使用できる。それらは、関連部位のレベルにおいて直接的注射によって、過剰増殖疾患（癌、再狭窄）の治療で特に有利である。これに関して、本発明は、増殖性細胞またはその一部を前記したアデノウイルスベクターで感染させることよりなる増殖性細胞を破壊する方法にも関する。自殺遺伝子が治療剤に対する感受性を付与する遺伝子である場合、本発明の破壊方法は、細胞を該治療剤で治療することよりなる。この方法の実施では、本発明は、自殺遺伝子が治療剤に対する感受性を付与する遺伝子である前記定義の組換えアデノウイルスからなる産物に関し、該治療剤は、過剰増殖疾患の治療のための、同時にまたは別々の使用あるいは経時的に別々の使用用の組合せ産物としてのものである。さらに詳しくは、自殺遺伝子はチミジンキナーゼ遺伝子であって、治療剤はガンシクロビールまたはアシクロビールである。以下の実施例の助けを借りて本発明をさらに詳細に記載し、これは説明のためであって、限定的なものと考えるべきでない。図面の説明図１：Ａｄ５アデノウイルスの遺伝的構成。Ａｄ５の完全な配列はデータベースで入手でき、当業者がいずれの制限部位も選択または創製することができ、かくして、ゲノムのいずれか領域も単離できる。図２：ＣＡＶ２アデノウイルス、Ｍａｎｈａｔｔａｎ株（Ｓｐｉｂｅｙら、前記引用）の制限地図。図３：ベクターｐＯＮＴｔｋの表示。図４：ベクターｐＲＳＶｔｋの表示。一般的分子生物学技術プラスミドＤＮＡの分取抽出、塩化セシウムグラジエント中でのプラスミドＤＮＡの遠心、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気泳動によるＤＮＡ断片の精製、タンパク質のフェノールまたはフェノール−クロロホルム抽出、生理食塩水媒体中のＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノール沈殿、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ等における形質転換のごとき分子生物学で通常使用される技術は当業者によく知られており、文献で豊富に記載されている［ＭａｎｉａｔｉｓＴ．ら、“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ，，１９８２；ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ｍ．ら（編）、“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、ＪｐｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７］。ｐＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミドおよびＭ１３シリーズのファージは商業的源からのものである（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。連結には、供給業者の推奨に従い、ＤＮＡ断片をそのサイズに従ってアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合液で抽出し、エタノールで沈殿させ、次いで、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートする。突出５’末端の充填は、供給業者の仕様に従い、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）のクレノウ断片で行うことができる。突出３’末端の破壊は、製造業者の推奨に従って使用するＴ４ファージＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で行う。突出５’末端の破壊は、ヌクレアーゼＳ１を用いた調節処理によって行うことができる。イン・ビトロ合成オルゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍによって供給されているキットを用い、Ｔａｙｌｏｒら［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］によって開発された方法に従って行うことができる。製造業者の仕様に従い、「ＤＮＡサーマルサイクラー」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を用い、いわゆるＰＣＲ［ポリメラーゼ−触媒の鎖反応，ＳａｉｋｉＲ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０(１９８５)１３５０−１３５４；ＭｕｌｌｉｓＫ．Ｂ．およびＦａｌｏｏｎａＦ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５(１９８７)３３０−３５０］技術によってＤＮＡ断片の酵素的増幅を行うことができる。ヌクレオチド配列の確認は、Ａｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキットを用い、Ｓａｎｇｅｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４ (１９７７)５４６３−６４６７］によって開発された方法によって行うことができる。使用する細胞系以下の実施例では、以下の細胞系を使用した、または使用することができる。 −ヒト胚腎臓系２９３（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）。この系は特に、そのゲノムに組み込まれた、ヒトアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分を含有する（１２％）。 −ＫＢヒト細胞系：ヒト表皮癌に由来するもので、この系ならびにその培養を可能とする条件はＡＴＣＣ（参照ＣＣＬ１７）で入手できる。 −Ｈｅｌａヒト細胞系：ヒト上皮癌に由来するもので、この株ならびにその培養を可能とする条件はＡＴＣＣ（参照ＣＣＬ２）で入手できる。 −ＭＤＣＫイヌ細胞系：ＭＤＣＫ細胞の培養条件は特にＭａｃａｔｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ４４（１９８８）９によって記載されている。 −ｇｍＤＢＰ６細胞系（Ｂｒｏｕｇｈら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９０（１９９２）６２４）。この系はＭＭＴＶＬＴＲの制御下にあるアデノウイルスＥ２遺伝子を担持するＨｅｌａ細胞よりなる。実施例実施例１癌−特異的プロモーターの制御下にあるＴＫ遺伝子およびＣＭＶプロモーターの制御下にあるｐ５３遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスの構築これらのアデノウイルスは、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分、２の治療的遺伝子およびＡｄ５アデノウイルスの領域（ＩＸタンパク質に対応）を担持するプラスミドと、異なる欠失を担持する欠陥アデノウイルスからのＤＮＡとの間の相同組換えによって構築した。１．ベクターｐＯＮＴ−ｔｋの構築１．１プラスミドｐ７ｔｋ１の構築本実施例は、多重クローニング部位に挿入された、１１３１塩基対（ＡＴＧ１１４−１１６および停止コドンＴＧＡ１２４２−１２４４）のｔｋ遺伝子のオープンリーディングフレームを含有するプラスミドｐ７ｔｋ１の構築を記載する。単純疱疹ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有するＢｇＩＩＩ−ＮｃｏＩ断片をプラスミドｐＨＳＶ−１９６（ＧｏｂｃｐＢＲＬによって市販）から単離し、クレノウ断片の作用によって修復し、次いで、プラスミドｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａによって市販）のＳｍａＩ部位に挿入した。ＳｍａＩおよびＢｇＩＩＩ部位はこの工程の間に破壊され、ＮｃｏＩ部位は保存される。得られたプラスミドはｐ７ｔｋ１と命名した。１．２．プラスミドｐＯＮＴ１の構築本実施例は、ＥＢＮＡ１抗原のトランス活性化およびＥＢＶウイルスのＴＰ１プロモーターのトランス活性化に必要な配列からなるキメラプロモーターを含有するプラスミドの構築を記載する。ＥＢＶウイルスのＥｃｏＲＩ（７３１５）−ＳｍａＩ（８１９１）断片を株Ｂ９５−８から単離した。ＥＢＶウイルスの完全配列はＢａｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ３１０（１９８４）２０７）によって記載されている。この断片は核抗原１（ＥＢＮＡ１）（Ｄ．Ｒｅｉｓｍａｎ＆Ｂ．Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６ｐｐ．３８３８−３８４６）によるトランス−活性化に必要な配列を含有する。次いで、この断片を、ＴＰ１プロモーターを含有する、ＥＢＶＢ９５−８（ＰｓｔＩ部位はＴ４ポリメラーゼで消化した）のＮｒｕＩ（１６６２４１）−ＰｓｔＩ（１６６５５９）断片に融合させた。次いで、かく得られたキメラプロモーターをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫの多重クローニング部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＯＮＴ１と命名した。１．３．プラスミドｐＯＢＴｔｋの構築プラスミドｐＯＢＴｔｋは、プラスミドｐＯＮＴ１にクローン化したキメラプロモーターＥＢＮＡ１−ＲＥ／ＴＰ１の制御下にあるプラスミドｐ７ｔｋ１にクローン化した単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子からなる。このプラスミドを構築するために、ＥＢＮＡ−１およびＥＢＮＡ−２によってトランス活性化されるキメラプロモーターを含有するｐＯＮＴ１のＢａｍＨＩ− ＸｈｏＩ断片、およびｔｋオープンリーディングフレームを含有するｐ７ｔｋ１のＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片をプラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβｇａｌのＢａｍＨＩ（４７８）およびＣｌａＩ（４５５０）部位にクローン化した。プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβＧａｌは、５’→３’の向きに、 −ＩＴＲ配列、複製起点、カプセル化およびエンハンサーシグナルＥ１Ａを含むＡｄ５アデノウイルスの左側末端に対応するＰｖｕＩＩ断片； −ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）の制御下にあるβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、 −プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβＧａｌおよびアデノウイルスｄ１３２４の間の相同組換えを可能とするＡｄ５アデノウイルスゲノムの第２断片；を含有する。プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβＧａｌはＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）によって記載されている。すべてのクローニング部位は保存されている。得られたプラスミドをｐＯＮＴｔｋと命名した（図３）。２．プラスミドｐＯＮＴｔｋＣＭｖｐ５３の構築本実施例は、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分（左側ＩＴＲ、カプセル化領域およびＥ１領域の開始からなる）、ＯＮＴプロモーターの制御下にあるｔｋ遺伝子、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるｐ５３遺伝子および組換えアデノウイルスの創製のための相同組換えを可能とするＡｄ５ゲノムの第２断片（ｐＩＸタンパク質）を担持するベクターの構築を記載する（実施例１．３参照）。このプラスミドは、ｔｋ遺伝子の下流に、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるｐ５３遺伝子を担う断片、続いてＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位を同一向きに挿入することによって構築した。さらに詳しくは、挿入された断片は以下のものを含む。 −サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターに対応するウイルス起源のプロモーター領域。この領域は、ベクターにおいて、ＣＭＶ／ｐＯＮＴｔｋ結合における唯一の制限部位ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩおよびＣＭＶ／ｐ５３結合におけるＢａｍＨＩ部位によって囲まれている。プロモーター領域を隣接して挟む唯一の部位の存在は、いずれかの他のプロモーターによるＣＭＶ領域の置き換えを可能とする。かくして、ｐ５３遺伝子が誘導可能なプロモーター（重金属（カドミウムおよび亜鉛））によって誘導可能なメタロチオニンプロモーター）の制御下に置かれた第２シリーズのベクターが得られる。 −野生型形態であるマウスｐ５３タンパク質をコードするＣＤＮＡに対応する１１７３ｂｐ配列（Ｚａｋｕｔ−Ｈｏｕｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ３６（１９８３）５９４）。この構築体において、サプレッサー遺伝子はｃＤＮＡの形態であり、これはイントロンを欠く。これは、特にベクターのサイズを減少させるのを可能とする。さらに、得られた発現レベルがイントロンの存在下または不存在下で匹敵することをチェックした。 −ＳＶ４０ウイルス後期遺伝子のポリアデニル化シグナル、これは非常に効率的なポリアデニル化シグナルに対応する。２つの唯一の制限部位ＳａｌＩおよびＨＩｎｄＩＩＩはポリアデニル化シグナルの下流に位置する。得られたベクターをｐＯＮＴｔｋｃＭＶｐ５３と命名した。該断片の挿入は逆向きに同様になすことができ、ｔｋ遺伝子およびｐ５３遺伝子が逆向きであるプラスミドに導くことは理解されるであろう（ｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３ｉｎｖ）。３．組換えアデノウイルスの構築３．１Ｅ１領域のレベルにおいて、同一向きに挿入された２の治療的遺伝子を担持する、Ｅ１領域が欠失した組換えアデノウイルスの構築ベクターｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３を線状化し、Ｅ１領域を欠くアデノウイルスベクターで、アデノウイルスＥ１（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）領域によってコードされる機能をトランス的に供するヘルパー細胞（系２９３）に共トランスフェクトした。より正確には、アデノウイルスＡｄ−ＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３は、以下の手順に従い、アデノウイルスＡｄ−ＲＳＶβｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、前記引用参照）およびベクターｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３の間のイン・ビボ相同組換えによって得られる。ＸｍｎＩで線状化されたプラスミドｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３、およびＣｌａＩ酵素で線状化されたアデノウイルスＡｄ −ＲＳＶβｇａｌを、リン酸カルシウムの存在下で系１９３に共トランスフェクトして、相同組換えを行った。次いで、かく創製された組換えアデノウイルスをプラーク精製によって選択した。単離の後、組換えアデノウイルスＤＮＡを２９３細胞系で増幅し、これは約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する未精製組換え欠陥アデノウイルスを含有する培養上清に導く。一般に、ウイルス粒子は公知の技術に従い（特に、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）、塩化セシウムグラジエント上での遠心によって精製される。アデノウイルスＡｄ−ＯＮＴ−ｔｋＣＭＶｐ５３，ΔＥ１は−８０℃で貯蔵できる（２０％グリセロール）。３．２Ｅ１領域のレベルにて、同一向きに挿入された２の治療的遺伝子を担持する、Ｅ１およびＥ３領域を欠失した組換えアデノウイルスの構築ベクターｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３を線状化し、Ｅ１およびＥ３遺伝子を欠くアデノウイルスベクターで、アデノウイルスＥ１（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）領域によってコードされる機能をトランスにて供するヘルパー細胞（系２９３）に共トランスフェクトした。より正確には、アデノウイルスＡｄ−ＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３，ΔＥ１，ΔＥ３は、以下の手順に従い、突然変異体アデノウイルスＡｄ−ｄ１１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ３１（１９８２）５４３）およびベクターｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３の間のイン・ビボ相同組換えによって得られる。ＸｍｎＩで線状化されたプラスミドｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３、および酵素ＣｌａＩで線状化されたアデノウイルスＡｄ−ｄ１１３２４を、リン酸カルシウムの存在下で系２９３に共トランスフェクトして、相同組換えを行った。次いで、かく創製された組換えアデノウイルスをプラーク精製によって選択した。単離の後、組換えアデノウイルスＤＮＡを２９３細胞系で増幅し、これは約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する末精製組換え欠陥アデノウイルスを含有する培養上清に導く。一般に、ウイルス粒子は公知の技術に従い（特に、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）、塩化セシウムグラジエント上での遠心によって精製される。アデノウイルスＡｄ−ＯＮＴ−ｔｋＣＭＶｐ５３，ΔＥ１，ΔＥ３は２０％グリセロール中、−８０℃で貯蔵できる。３．３ｔｋおよびｐ５３遺伝子が逆向きで位置するアデノウイルスの構築前記実施例３．１．および３．２．に記載した手法に従って、ｔｋおよびｐ５３遺伝子が逆向きに位置するアデノウイルスを、プラスミドｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３ｉｎｖで出発して構築することができる。実施例２ＲＳＶウイルスＬＴＲプロモーターの制御下にあるＴＫ遺伝子およびＣＭＶプロモーターの制御下にあるｐ５３遺伝子からなる欠陥組換えアデノウイルスの構築これらのアデノウイルスは、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分、２の治療的遺伝子およびＡｄ５アデノウイルスの領域（ＩＸタンパク質に対応）を担持するプラスミドと異なる欠失を担持する欠陥アデノウイルスからのＤＮＡとの間の相同組換えによって構築した。１．ベクターｐＲＳＶｔｋの構築このプラスミドは、ＥＢＮＡ１−トランス活性化可能なプロモーターをＲＳＶＬＴＲプロモーターによって置き換えることによって、プラスミドｐＯＮＴｔｋ（実施例１．１）から構築した。そのために、ＲＳＶプラスミドを、プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ．βｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）からのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片の形態で単離し、次いで、プラスミドｐＯＮＴｔｋのＢａｍＨＩ（４７８）およびＳａｌＩ（１７００）部位にクローン化した。得られたプラスミドをｐＲＳＶｔｋと命名した（図４）。２．プラスミドｐＲＳＶｔｋＣＭＶｐ５３の構築本実施例は、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分（左側ＩＴＲ、カプセル化領域およびＥ１領域の開始からなる）、ＲＳＶプロモーターの制御下にあるｔｋ遺伝子、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるｐ５３および組換えアデノウイルスの創製のための相同組換えを可能とするＡｄ５ゲノムの第２断片（ｐＩＸタンパク質）を担持するベクターの構築を記載する（実施例２．３参照）。このプラスミドは、ｔｋ遺伝子の下流に、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるｐ５３遺伝子を担持する断片、続いてＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位を挿入することによってプラスミドｐＲＳＶｔｋから構築した。より詳しくは、挿入された断片は以下のものよりなる。 −サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターに対応するウイルス起源のプロモーター領域。この領域は、ベクターにおいて、ＣＭＶ／ｐＯＮＴｔｋ結合における唯一の制限部位ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩおよびＣＭＶ／ｐ５３結合におけるＢａｍＨＩ部位によって囲まれている。プロモーター領域を隣接して挟む唯一の部位の存在は、いずれかの他のプロモーターによるＣＭＶ領域の置き換えを可能とする。かくして、ｐ５３遺伝子が誘導可能なプロモーター（重金属（カドミウムおよび亜鉛））によって誘導可能なメタロチオニンプロモーター）の制御下に置かれた第２シリーズのベクターが得られる。 −野生型形態であるマウスｐ５３タンパク質をコードするＣＤＮＡに対応する１１７３ｂｐ配列（Ｚａｋｕｔ−Ｈｏｕｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ３６（１９８３）５９４）。この構築体において、サプレッサー遺伝子はｃＤＮＡの形態であり、これはイントロンを欠く。これは、特にベクターのサイズを減少させるのを可能とする。さらに、得られた発現レベルがイントロンの存在下または不存在下で匹敵することをチェックした。 −ＳＶ４０ウイルス後期遺伝子のポリアデニル化シグナル、これは非常に効率的なポリアデニル化シグナルに対応する。２つの唯一の制限部位ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩはポリアデニル化シグナルの下流に位置する。得られたベクターをｐＲＳＶｔｋＣＭＶｐ５３と命名した。３．組換えアデノウイルスの構築３．１Ｅ１領域のレベルにおいて、同一向に挿入された２の治療的遺伝子を担持する、Ｅ１領域を欠失した組換えアデノウイルスの構築このアデノウイルスは、実施例１（３．１）に記載した手法に従って構築する。かく得られたアデノウイルスＡｄ−ＲＳＶ−ｔｋＣＭＶｐ５３，ΔＥ１は２０％グリセロール中で−８０℃で保存できる。３．２Ｅ１領域のレベルにおいて、同一向に挿入された２の治療的遺伝子を担持する、Ｅ１およびＥ３領域が欠失した組換えアデノウイルスの構築このアデノウイルスは実施例１（３．２）に記載した手法に従って構築する。かく得られたアデノウイルスＡｄ−ＲＳＶ− ｔｋＣＭＶｐ５３，ΔＥ１，ΔＥ３は２０％グリセロール中、−８０℃で貯蔵できる。実施例３ＲＳＶウイルスＬＴＲプロモーターの制御下のあるＴＫ遺伝子および同プロモーターの制御下にあるインターロイキン−２遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスの構築これらのアデノウイルスは、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分、２の治療的遺伝子およびＡｄ５アデノウイルスの領域（ＩＸタンパク質に対応する）を担持するプラスミドと、異なる欠失を担持する欠失アデノウイルスからのＤＮＡとの間の相同組換えによって構築した。１．プラスミドｐＲＳＶｔｋＲＳＶＩＬ−２の構築本実施例は、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分（左側ＩＴＲ、カプセル化領域およびＥ１領域の開始からなる）、ＲＳＶプロモーターに制御下にあるｔｋ遺伝子、ＲＳＶプロモーターの制御下にあるインターロイキン−２遺伝子および組換えアデノウイルスの創製のための相同組換えを可能するＡｄ５ゲノムの第２断片（ｐＩＸタンパク質）を担持かるベクターの構築を記載する（実施例３．２参照）。このプラスミドは、ｔｋ遺伝子の下流に、ＲＳＶプロモーターの制御下にあるインターロイキン−２伝子を担持する断片、続いてＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位を挿入することによってプラスミドｐＲＳＶｔｋ（実施例２参照）から構築した。より詳しくは、挿入された断片は以下のものよりなる。 −プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ．βｇａｌからのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片の形態で単離されたＲＳＶウイルスＬＴＲプロモーター（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）。 −ヒトインターロイキン−２をコードするｃＤＮＡに対応する配列（ＥＰ９１５３９）。この構築体において、治療的遺伝子はｃＤＮＡの形態である。 −ＳＶ４０ウイルス後期遺伝子のポリアデニル化シグナル、これは非常に効率的なポリアデニル化シグナルに対応する。２つの唯一のＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位はポリアデニル化シグナルの下流に位置する。得られたベクターをｐＲＳＶｔｋＲＳＶＩＬ−２と命名した。２．組換えアデノウイルスの構築２つのタイプの組換えアデノウイルスを実施例１または２ら記載した手法に従って構築する。これらのアデノウイルスは、Ｅ１領域のレベルにおいて、同一向きで挿入された２の治療的遺伝子を担持し、Ｅ１領域に、またはＥ１およびＥ３領域に欠失を有する。かく得られたアデノウイルスＡｄ−ＲＳＶ−ｔｋＲＳＶＩＬ−２，ΔＥ１およびＡｄ−ＲＳＶ−ｔｋＲＳＶＩＬ−２，ΔＥ１，ΔＥ３は２０％グリセロール中、−８０℃で貯蔵できる。実施例４ＴＫ遺伝子および顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスの構築前記実施例に記載した手法に従って、（例えば、ＯＮＴおよびＲＳＶプロモーターの制御下にある）ｔｋ遺伝子およびそれ自体のプロモーターのまたはＲＳＶプロモーターの制御下にあるＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を担持する欠陥アデノウイルスを特に構築することができる。このために、２の遺伝子を担持する中間体ベクターを、プロモーターの制御下にあるＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を担持する断片を、同一向または反対向に挿入することによってベクターｐＯＮＴｔｋまたはｐＲＳＶｔｋから構築することができる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子およびそれを含有する構築体は特に国際出願ＷＯ８６／０３２２５に記載されている。実施例５２つの注目する遺伝子（１つはＥ１領域のレベルで挿入されたもの、他方はＥ３領域のレベルで挿入されたもの）を含む欠陥組換えアデノウイルスの構築これらのアデノウイルスは、Ｅ１領域のレベルにおいて挿入された第１の遺伝子を担持する第１の欠陥ウイルスのＤＮＡと、Ｅ３領域のレベルにおいて挿入された第２の欠陥アデノウイルスのＤＮＡとの間の相同組換えによって構築される。１．Ｅ３領域のレベルで挿入された遺伝子を担持する欠陥ウイルスの構築このウイルスはアデノウイルスＡｄｄ１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ３１（１９８２）５４３）から構築される。このウイルスはＥ１およびＥ３領域のレベルで欠失を担持する（ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片が欠失）。Ａｄｄ１３２４ウイルスＤＮＡを単離し精製する。次いで、このＤＮＡを酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断する。次いで、ＸｂａＩ −ＥｃｏＲＩ断片は、ＲＳＶプロモーターの制御下にあるチミジンキナーゼをコードする配列を担持するプラスミドｐＲＳＶｔｋに由来し、次いで、前記したごとく開いたＡｄｄ１３２４ＤＮＡ中の該部位のレベルで挿入する。かく得られたＤＮＡは、従って、Ｅ１領域のレベルでの欠失およびＥ３領域のレベルで挿入されたＴＫ遺伝子を含む。２．２の遺伝子を担持するアデノウイルスの構築前記から調製した組換えウイルスからのＤＮＡおよびＢａｍＨＩによって線状化された、Ｅ１領域のレベルで挿入された免疫刺激または腫瘍−サプレッサー遺伝子を担持する組換えアデノウイルスからのＤＮＡをリン酸カルシウムの存在下で系２９３に共トランスフェクトして、相同組換えを可能とする。次いで、かく創製された組換えアデノウイルスをプラーク精製によって選択する。単離後、組換えアデノウイルスＤＮＡを２９３細胞系で増幅し、これは約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する未精製組換え欠陥アデノウイルスを含有する培養上清に導く。ウイルス粒子は、一般に、公知の技術（Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）に従って塩化セシウムグラジエント上の遠心によって精製される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Two therapeutic genes: suicide and immunostimulation Adenovirus containing gene The present invention relates to new viral vectors, their production and their use in gene therapy. About use. The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing the virus vector. I do. More specifically, the present invention relates to recombinants as vectors for gene therapy. Adenovirus. Gene therapy is missing by introducing genetic information into affected organs or cells. Rectification of defects or abnormalities (mutations, abnormal expression, etc.). This genetic information The report states that cells extracted from an organ are introduced in vitro and the modified cells It can then be reintroduced into the body or directly into the appropriate tissue in vivo. It is. In this second case, DNA and DEAE-dextran (Pagano et al.) J. Virol. 1 (1967 (891) complex, DNA and nuclear protein) Quality complex (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), DN A and a complex of lipids (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413 ) And the use of liposomes (Fral ey et al. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) Different techniques exist for each transfection technique. More recently, this The promising alternative to these physical transfection techniques is genetic The use of viruses as vectors for transfer of offspring has emerged. In this regard, different Ils has been tested for its ability to infect certain cell populations. In particular, Torovirus (RSV, HMS, MMS, etc.), HSV virus, adeno-associated virus Irs and adenovirus. Of these viruses, adenoviruses have advantages for use in gene therapy Shows the properties of the species. In particular, they have a rather broad host spectrum, Cells can be infected and not become integrated into the genome of infected cells. Has not been associated with major diseases in Adenovirus is approximately 36k in size This virus has the linear double-stranded DNA of b. The genome, in particular, Inverted repeat sequence (ITR), encapsulation sequence, early genes and genes described below (Fig. 1). The major early genes are E1 (E1a and E1b), E2, E3 and And the E4 gene. The major genes are L1 to L5 genes is there. Given the above properties of adenovirus, they will be able to Has already been used in the introduction. For this purpose, different adenovirus-derived vectors Were prepared and integrated into different genes (β-gal, OTC, α-1AT , Cytokines, etc.). In each of these constructs, the adenovirus is Has been modified to prevent duplication. Thus, described in the prior art The constructed construct comprises region E1 (E1a and / or E1b) and optionally An adenovirus that lacks E3 at the level at which the heterologous DNA sequence is inserted ( Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Cho. udhury et al., Gene 50 (1986) 161). The present invention relates to a novel adenovirus-derived vector that is particularly effective for gene therapy applications About. More specifically, the present invention provides, in part, The offspring into the adenovirus and the substantial expression of these different genes in infected cells Is the result of the proof that In addition, the present invention provides Incorporate several therapeutic genes under conditions that allow This is the result of the construction of an adenovirus vector. Further, the present invention The vector of the present invention relates to co-expression of a complementary therapeutic gene in the same target cell. Derived from the proof of the synergistic effect of Thus, the present invention provides Provide viral vectors that exhibit therapeutic properties whose use in therapy is entirely advantageous You. In particular, the vectors of the present invention may be used in episodes of cell hyperproliferation (cancer, restenosis). It shows properties that are completely advantageous for use in the treatment of diseases. A first subject of the present invention is to provide a defective recombinant adenovirus containing two therapeutic genes. Wherein one of the therapeutic genes is a suicide gene and the other is also an immune stimulator. Or a tumor-suppressor gene. Applicants may, in fact, Co-expression of such genes can be obtained by introducing these genes alone or separately. To produce a particularly beneficial therapeutic anti-tumor effect that is significantly greater than Was. Therapeutic genes used within the framework of the present invention are cDNA, genomic DNA (gDNA Or, for example, a hive consisting of a cDNA into which one or more introns can be inserted. It can be a lid construct. Also, they can be synthetic or semi-synthetic sequences. Especially advantageous For this, cDNA or gDNA is used. The two therapeutic genes integrated into the adenovirus vector according to the invention are different. Can be arranged in any way. First, they constitute a single transcript. In this arrangement, two remains The gene is continuous, under the control of a single promoter, and a single pre- Ger RNA. This arrangement uses only one transcription promoter This is advantageous because The two therapeutic genes can also be under the control of separate transcription promoters. This The arrangement of can obtain high expression levels and provides good control of gene expression. In this case, the two therapeutic genes may be at the same site or different in the adenovirus genome Can be inserted in the same direction at the site or inserted in the opposite direction Can be. Suicide genes are genes whose expression products render cells sensitive to therapeutic agents. Genes are preferably used. More preferably, the suicide gene is thymidine kinase And its expression product is transmitted to mammalian cells by ganciclovir. certain cures such as ir) and acyclovir Provides sensitivity for the therapeutic agent. Herpes simplex virus thymidine kinase is acyclo Beer (acyclovir) and ganciclovir (ganciclovi) Nucleoside analogs such as r) can be phosphorylated. These modified molecules are Can be incorporated into the elongating DNA strand, thereby stopping DNA synthesis. And causes cell death (F. L. Moolten, Cancer R es. 46 (1986) 5276). Thus, this strategy expresses suicide genes Cells to be specifically excluded. In addition, DNA synthesis is a toxic target And only dividing cells are affected. More preferably, the human herpes simplex virus thymidine kinase gene (hTK, HTK SV-1) is used within the framework of the present invention. The sequence of this gene has been described in the literature. (In particular, McKnight et al., Nucleic Acid. Res 8 (19 80) 5931). Greater substrate specificity and good kinase activity Can also be used. Such derivatives are, in particular, It can be obtained by mutagenesis at the level of the binding site as noted (B alasubramaniam et al. Gen. Virol. 71 (1990) 2979; Munir et al., JBC 267 (1992) 6584). The expression product also sensitizes mammalian cells to nitroaromatic products. To nitroreductase or 5-fluorocytosine (5-FC) A cytosine deaminase that confers competence to mammalian cells can also be used ( J. Biol. Chem. 266 (1991) 4126). As described above, suicide genes are combined with immunostimulatory or tumor suppressor genes. It is most advantageous to combine them. In this regard, the immunostimulatory gene has an expression product It can be any gene that can stimulate body defense. Preferably, especially phosphorus Cytokines such as hokines (IL-1 to IL-12), interferons ( Alpha, beta, etc.), tumor necrosis factor, colony stimulating factor (G-CSF, GM- CSF, M-CSF, SCF, etc.). Still more preferred Or a gene encoding interleukin-2 or GM-CSF. Interleukin-2 is activated by lymphocytes in response to the presence of antigens, especially tumor antigens. Are substantially synthesized. Then, it becomes cytotoxic T and killer (NK) cells. By local activation of the vesicle, Affects the development of an immune response to these antigens. Thus, this lymphokine Plays a major role in antitumor immunity. With the vector of the present invention, Turilekin-2 and suicide genes such as the thymidine kinase gene. Synergistic anti-tumor effect obtained from co-expression in one tumor cell can be obtained You. GM-CSF is a granulocyte and macrophage colony stimulating factor. Therefore It can stimulate the proliferation of these immune cells and thus reinforce the immune defense. The GM-CSF gene and cDNA have been described in the literature. With suicide gene Its co-expression in the vector of the invention results in a high synergistic antitumor effect. Among the tumor-suppressor genes that can be used within the framework of the present invention are, in particular, p53, Rb, rap 1A, DDC, WAF and MTS genes can be mentioned. . More preferably, the p53 or Rb gene is used. The p53 gene encodes a 53 kDa nucleoprotein. Deletion and / or The form of this gene that is mutated by mutation is involved in the development of most human cancers. (Baker et al., Science 244 (1989) 217). The mutant form is ras Murine fibroblasts can also be transformed in cooperation with oncogenes. Natural p The wild-type gene encoding 53, on the other hand, was transformed with various combinations of oncogenes. Inhibits the formation of transformed foci in transformed rodent fibroblasts. Most Recent data indicate that the p53 gene can itself stimulate other tumor-suppressor genes. He emphasizes that he can come. In addition, p5 on the proliferation of vascular small muscle cells 3 have recently been shown (Epstein et al., Science 151 (19 94)). The Rb gene inhibits cell division whose function causes its entry into the quiescent phase. About 927 amino acids to be controlled (Friend et al., Nature 323 (1986)) 643) The nuclear phosphoprotein synthesis is determined. The inactive form of the Rb gene Tumors, especially mesenchymal carcinomas such as retinoblastoma and osteosarcoma. Reintroduction of this gene into tumor cells in which it has been inactivated will return to normal and return to normal. And loss of tumorigenesis (Huang et al., Science 242 (1988) ) 1563). Recently, the normal Rb protein (but not its mutant form) has been Too It is shown to suppress the expression of ncogene c-fos (gene essential for cell proliferation) Was. The WAF and MTS genes and their antitumor properties have been described in the literature (C ell75 (1993) 817; Science 264 (1994) 436). In a particularly preferred embodiment, the present invention relates to a gene encoding thymidine kinase. Defective recombinant adenovirus containing offspring and tumor-suppressor genes. More preferably, the present invention provides a method for encoding a herpesvirus thymidine kinase. Adenovirus (Ad-TK-p53) containing gene and wild-type p53 gene Related. Particularly advantageously, the two genes are separated promoters, preferably HSV Placed under the control of the viral LTR promoter. Still more preferably, two genetics Offspring are inserted at the level of the E1 region of the adenovirus genome. In another particularly preferred embodiment, the present invention provides a method for encoding thymidine kinase. Defective recombinant adenovirus containing a gene to encode and a gene encoding lymphokine About Ils. More preferably, the present invention provides a herpesvirus thymidine kinase. Gene encoding interleukin-2 and gene encoding interleukin-2 (Ad-TK-IL2) or herpesvirus thymidine containing Addition containing a gene encoding a kinase and a gene encoding GM-CSF Virus (Ad-TK-GM-CSF). Particularly advantageously, the two genes Is under the control of a separate promoter, preferably the HSV virus LTR promoter Put on. Still more preferably, the two genes are in the E1 region of the adenovirus genome At the level of With regard to the transcription promoters used within the framework of the present invention, they refer to infected cells. Is a promoter that naturally carries the expression of a therapeutic gene that can be considered when it can function in E. coli. possible. They are responsible for expression (even other proteins or even synthetic proteins ) Sequences of different origin. In particular, they may be mammals, eukaryotes or cormorants. It may be the sequence of the ils gene. For example, they are cells that are desired to be transmitted. It may be a promoter sequence derived from the vesicle genome. Similarly, they use Promoter sequences derived from the genome of the virus, including adenovirus Can get. In this regard, for example, E1A, MLP, CMV and RSV genes, etc. Promoters can be mentioned. In addition, these expression sequences are tissue-specific. Of sequences that enable It can be modified by the addition of sexing and regulatory sequences. In addition, inserted If the gene does not contain an expressed sequence, it may be a defective virus downstream of such a sequence. Can be inserted into the genome. Preferred promoters for producing the vectors of the invention are Consists of the Rous sarcoma virus LTR (LTR-RSV). Other particularly preferred professionals The motor is a promoter specific for growth or cancer cells. These promos Can, in fact, target therapeutic effects against a defined population of cells. In a preferred embodiment of the invention, the expression signal is tumor-causing or Induced by or active in the presence of the virus associated therewith is there. Still more preferably, the Epstein-Barr virus (EBV). Or an expression virus inducible by papillomavirus is within the framework of the present invention. Used in. Epstein-Barr virus (EBV) is two types of human cancer: Burki Lymphoma and nasopharyngeal cancer. Promoteable by EBV The use of recombinant adenoviruses consisting of virulence genes under the control of This toxic gene is specifically expressed in tumor cells. Nasopharyngeal cancer In biopsy, the single nuclear antigen is EBNA1, which is regularly present, It maintains the viral genome in latency in cells infected by EBV. In turn, this activates the BCR2 viral promoter. Accordingly, a particular subject of the invention is the EBNA1 responsive sequence (EBNA1-RE). For the specific expression of genes in nasopharyngeal cancer cells. In particular, Ming explains another viral promoter (for terminal protein 1 (TP1)). Texture comprising an EBNA1 responsive element used upstream of the gene promoter) Adenovirus comprising a promoter as an expression signal. Book The example described in the application clearly shows that this chimeric promoter is driven by EBNA1. Indicates that guidance is possible. Papillomaviruses (especially HPV16 and 18 viruses) are uterine cancers in women. , Which have been identified in precancerous epidermal cell foci (Riou et al., Lance) t335 (1990) 117). The product of the E6 gene is found in HPV-positive cells. Thus, by substantially reducing the amount of wild-type p53, an anti-oncogene, Leads to tumor formation (Wrede et al., Mol. Carcinog. 4 (1991) 171). HPV (eg, Toxic gene under the control of a promoter inducible by E6 protein) The use of a recombinant adenovirus consisting of this toxic gene in the corresponding tumor cells Is specifically expressed. The expression signal may also be inactive in normal cells and active in tumor cells obtain. In particular, within the framework of the present invention, the promoter of α-fetoprotein (Alpe rt E.R. , Dans Hepatocellular carcinoma. Okuda & Peters (eds.), New York, 1976, 353) Alternatively, the P3 promoter of IGF-II (Sussenbach et al., Growth h Regulation 2 (1991) 1) can be used. Is active in adults, especially in malignant liver cancer. Also hormone-dependent or hormone-dependent In the case of mon-associated tumors, use a promoter that can be induced by hormones. (Eg, breast cancer or prostate tumor). As mentioned above, different arrangements are conceivable for the production of the vectors according to the invention. First The vector of the present invention may be in the form of a single transcript It can contain genes. In this arrangement, the two genes are adjacent and a single Lomo Placed under the control of a chromosome, producing a single premessenger RNA. Its placement Is advantageous because a single transcription promoter can be used to regulate the expression of two genes It is. In addition, this single transcript is used in two possible orientations of the adenovirus vector. Can be incorporated into Alternatively, the two genes can be placed under the control of separate transcription promoters. This Arrangement can provide high expression levels and provide good control of gene expression . In this case, the two therapeutic genes are in the same orientation or in opposite orientations, It can be inserted at the same site or at a different site in the ils genome. Preferably, the gene is, at least in part, the E. coli of the adenovirus genome. It is inserted at the level of the 1, E3 or E4 region. Insert them into two different parts The use of the E1 and E3 or E1 and E4 regions is within the scope of the present invention. belongs to. A particularly advantageous embodiment is where two therapeutic genes are inserted at the level of the E1 region. Is to be entered. The example shows that, in fact, this insertion, without interference between the two, 2 shows that high expression of two genes can be achieved. Thus, the present invention relates to the genomic E For the two therapeutic genes of interest inserted at the level of one region. In addition, immunostimulatory inheritance is a product synthesized in the secretory pathway of target cells. Includes a signal sequence directed to This signal sequence is the natural signal of the immunostimulatory product. Null sequence, but any other functional signal sequence or artificial signal Any of null sequences may be used. As mentioned above, the adenovirus of the present invention is defective, i.e. They cannot replicate autonomously in target cells. In general, the defect The genome of the denovirus is at least as important as its replication in infected cells. The sequence needed for These areas have been (completely or partially) removed. Or may be rendered non-functional, or by other arrangements, Or it may be replaced by a therapeutic gene. Adenovirus of the present invention The defect characteristics of the source are important factors. Because it is the vector of the invention after administration This is to ensure non-dispersion of the key. In a preferred embodiment, the adenovirus of the invention comprises an ITR sequence and a cap Contains all or part of the E1 gene, including sequences that allow for cell encapsidation With a deletion of The inverted repeat (ITR) constitutes the origin of replication of adenovirus. To achieve. They are located between the 3 'and 5' ends of the viral genome (see Figure 1). ), Which are then easily isolated by conventional molecular biology techniques known to those skilled in the art. . Of the ITR sequences of human adenoviruses (especially Ad2 and Ad5 serotypes) Nucleotide sequences have been described in the literature and canine adenovirus (especially CAV) 1 and CAV2). For example, for the Ad5 adenovirus, left The flanking ITR sequence corresponds to 1-103 nucleotides of the genome. Encapsulation sequences (also called Psi sequences) are used to encapsulate viral DNA. Is necessary for Therefore, this region is used to prepare the defective recombinant adenovirus of the invention. Must be present to do. Encapsulation sequence is adenovirus genome Is located between the left (5 ') ITR and the E1 gene (see FIG. 1). that is Can be isolated by conventional molecular biology techniques or can be artificially synthesized. Encapsulation sequences of human adenovirus, especially Ad2 and Ad5 serotypes Has been described in the literature and canine adenovirus (especially CA V1 and CAV2) are the same. For example, for the Ad5 adenovirus , The encapsulation sequence is the nucleotide of the genome This corresponds to an area including 194 to 358. More preferably, the adenovirus of the invention is capable of ITR sequences and encapsulation. And deletion of all or part of the E1 and E4 genes. In a more preferred embodiment, the genome of the adenovirus of the invention comprises E1, E All or part of the E3 and E4 genes, even more preferably E1, E3, L All or part of the 5 and E4 genes have been deleted. The adenoviruses of the present invention can be prepared from adenoviruses of a wide variety of sources. Thing In fact, there are different adenovirus serotypes, the structure and properties of which are somewhat variable But exhibit comparable genetic organization. Thus, the teachings described in this application are: Those of skill in the art will be able to easily replicate any type of adenovirus . More particularly, the adenovirus of the invention may be human, animal or mixed (human and (Animal) origin. For adenoviruses of human origin, the use of those classified in group C is not recommended. preferable. More preferably, of different human adenovirus serotypes, Adenowi of steps 2 and 5 The use of loose (Ad2 or Ad5) is preferred within the framework of the present invention. As mentioned above, the adenovirus of the present invention may be of animal origin. Or may contain sequences derived from an adenovirus of animal origin. No. Applicants have shown that adenoviruses of animal origin can infect human cells with high efficiency. And have shown that they cannot grow on the human cells tested (French patent Application 93 05954). Applicants also report that adenoviruses of animal origin are Completely trans-complemented by an adenovirus of However, this is due to the presence of human adenovirus, which can lead to the formation of infectious particles. Excludes the risks of both recombination and in vivo growth. Animal origin The use of denovirus or adenovirus regions is therefore particularly advantageous. This is because of the inherent use of viruses as vectors in gene therapy. The danger is less. Adenoviruses of animal origin that can be used within the framework of the present invention include dogs, cows, rats ( For example, Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), It may be of sheep, pig, bird or ape (eg: SAV) origin. More special Apart from the bird Among the adenoviruses, for example, the strain Philps (ATCC VR-432) ), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-8) 27), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR -829), T8-A (ATCC VR-830), K-11 (ATCC VR -921) or ATCC such as the reference strain ATCC VR-831-835. Available serotypes 1 to 10 are listed. Among bovine adenoviruses Known serotypes, especially ATCC VR-313, 314, 63 9-642, 768 and 769, available at the ATCC (Types 1- 8) can be used. In addition, murine adenovirus FL (ATCC VR-550) ) And E20308 (ATCC VR-528), ovine adenovirus type Group 5 (ATCC VR-1343) or Type 6 (ATCC R-1340) Porcine adenovirus (5359), or especially the numbers VR-591-594, 9; 41-943, 195-203 and the like. Such simian adenovirus. Preferably, among adenoviruses of different animal origin, Adenovirus or regions of adenovirus of canine origin, especially all CAV2 Adenovirus strains [eg Manhattan or A26 / 61 strains (ATC CVR-800)] is used within the framework of the present invention. Many canine adenoviruses Was the subject of a structural study. Thus, CAV1 and CAV2 adenovirus A complete restriction map of the system has been described in the prior art (Spbee et al., J. Mol. Gen . Virol. 70 (1989) 165), the E1a and E3 genes and I TR sequences have been cloned and sequenced (see, inter alia, Speyy et al., Vi. rus Res. 14 (1989) 241; Linne, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11535). The defective recombinant adenovirus of the present invention can be prepared by various methods. The first method uses the defective recombinant virus DNA prepared in vitro (ligation). Or in a plasmid form) into a competent cell line (ie, defective All necessary functions for complementation of ills by intrans Transfection). These functions are preferably Integrated into the genome, which is a risk of recombination This makes it possible to avoid the risk of recombination and to increase the stability Give to cell line. The second approach involves DN from in vitro prepared defective recombinant virus. A (by ligation or plasmid form), and DNA from helper virus In a suitable cell line. According to the invention, the recombination Have a competent cell line that can complement all defective functions of adenovirus No need. Some of these features are in fact supplemented by helper viruses You. This helper virus is defective in its own right, and The functions required for are carried by a transformer. Especially in the sense of the second approach Cell lines include human embryonic line 293, KB cells, cells Hela, MDCK, GH, among others. K and the like (see Examples). Next, the propagated vector is recovered, purified, and used in accordance with ordinary molecular biology techniques. Amplify. In a modified embodiment, either by ligation or plasmid formation, the appropriate Defective recombinant viral DNA carrying the deletion and two therapeutic genes It can be prepared in b. As described above, the vector of the present invention advantageously comprises A certain will Genes, especially all or part of the E1, E3, E4 and / or L5 genes. Has a deletion. This deletion can be any type of repression that affects the gene Can also respond. It is, in particular, all or part of the coding sequence of the gene, and And / or repression of all or part of the transcription promoter region of the gene. Inhibition is generally in accordance with molecular biology techniques, as shown in the Examples, for example, by appropriate Digestion with restriction enzymes, then ligation to defective recombinant viral DNA Occurs. Then, at the level of the selected area and in the selected orientation, A gene can be inserted into this DNA by enzymatic cleavage and then ligation. The DNA thus obtained (and thus carries the appropriate deletion and two therapeutic genes) The defective recombinant adenovirus carrying the deletion and therapeutic gene In contact with each other. This first variant is particularly true when the therapeutic genes are Located in the form of a single transcription unit under the control of a motor, Applies to the production of recombinant adenovirus inserted at the site. It is also possible to prepare a recombinant virus in two steps, It allows the continuous introduction of two therapeutic genes. Thus, the appropriate deletion (or Part of the deletion) and from the first recombinant virus carrying one of the therapeutic genes DNA is assembled in ligation or plasmid form. Then use this DNA Thus, a first recombinant virus carrying the deletion and the therapeutic gene is obtained. Next The DNA from the first virus is isolated and the second plasmid or the second Therapeutic genes, appropriate deletions (parts not present on the first virus), and homology Sharing with DNA from a second defective recombinant virus carrying a region allowing recombination Transfect. Thus, in this second stage, carrying two therapeutic genes A defective recombinant virus results. This variant preparation, in particular, Of a recombinant virus carrying two therapeutic genes inserted into two different regions of the Suitable for preparation. The present invention also relates to a method comprising one or more of the defective recombinant adenoviruses described above. Pharmaceutical compositions. The pharmaceutical composition of the present invention can be topically, orally, parenterally, intranasally. It can be formulated for administration via intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular or transdermal routes and the like. Preferably, the pharmaceutical composition is a pharmaceutically acceptable formulation for an injectable formulation. Containing excipients. They are especially suitable for isotonic sterile saline (monophosphate). Thorium or disodium, sodium, potassium, calcium or magnesium A mixture of such salts, such as gnesium) or dried, especially as occasionally destroyed. Lyophilization, which allows the preparation of injection solutions upon addition of bacterial water or saline Composition. The viral dose used for injection depends on the different parameters, especially The method of administration, the disease involved, the gene to be expressed, or the desired duration of treatment Therefore it can be adapted. Generally, the recombinant adenovirus of the present invention comprises 10 4 and 10¹⁴pfu / ml, preferably 10⁶And 10^Tenpfu / ml It is administered in the form of a dose between The term pfu ("plaque forming unit") Infect appropriate cell cultures, corresponding to the infectivity of the irs solution, generally 5 days later It is determined by measuring the number of cell plaques isolated. Virus solution pf Techniques for measuring u titers are well described in the literature. The adenovirus of the present invention can be used in the treatment or prevention of a number of diseases. It Have shown that by direct injection at the level of the relevant site, hyperproliferative diseases (cancer, Particularly advantageous in the treatment of stenosis) You. In this regard, the present invention relates to an adenovirus comprising a proliferative cell or a portion thereof as described above. The invention also relates to a method for destroying proliferative cells, comprising infecting with a lus vector. If the suicide gene is a gene that confers sensitivity to a therapeutic agent, The method comprises treating the cells with the therapeutic agent. In the practice of this method, the invention Is a recombinant as defined above, wherein the suicide gene confers sensitivity to the therapeutic agent. A product comprising an adenovirus, said therapeutic agent for the treatment of a hyperproliferative disease. As a combined product for simultaneous or separate use or separate use over time belongs to. More specifically, the suicide gene is a thymidine kinase gene, The therapeutic agent is ganciclovir or acyclovir. The invention is described in further detail with the help of the following examples, which And should not be considered limiting. Description of the drawings FIG. 1: Genetic organization of Ad5 adenovirus. The complete sequence of Ad5 is And any restriction site can be selected or created by those skilled in the art, Thus, any region of the genome can be isolated. Figure 2: CAV2 adenovirus, Manhattan strain (Spbee et al., Supra). Quotation) restriction map. Figure 3: Display of the vector pONTtk. FIG. 4: Display of the vector pRSVtk. General molecular biology techniques Preparative extraction of plasmid DNA, plasmid D in cesium chloride gradient D by NA centrifugation, agarose or acrylamide gel electrophoresis, electrophoresis Purification of NA fragments, phenol or phenol-chloroform extraction of proteins Ethanol or isopropanol precipitation of DNA in saline medium, Esc Normally used in molecular biology, such as for transformation in Herichia coli The techniques used are well known to those skilled in the art and are well described in the literature [Man iatis T .; Et al., "Molecular Cloning, a Labo. rattro Manual ", Cold Spring Harbor La boratery, Cold Spring Harbor, N, Y, 19 Ausubel F. 82; M. (Eds.), “Current Protocol ls in Molecular Biology ", Jphn Wiley & Sons, New York, 1987]. pBR322 and pUC type plasmids and M13 series fur Di is from a commercial source (Bethesda Research Lab) oratories). For ligation, the DNA fragments are agarose according to their size according to the recommendations of the supplier. Or acrylamide gel electrophoresis to separate Extracted with ethanol / chloroform mixture, precipitated with ethanol, and then Incubate in the presence of di-DNA ligase (Biolabs). Filling of the protruding 5 'end was performed according to the supplier's specifications. coli DNA Polymer This can be done with the Klenow fragment of Lase I (Biolabs). Protruding 3 'end Of the T4 phage DNA polymerase (used according to the manufacturer's recommendations) (Biolabs). Disruption of the protruding 5 'end results in nuclease S1 This can be done by the adjustment process used. In vitro synthetic orthonucleotide-specific mutagenesis was performed by Amersh. Using the kit supplied by Am, Taylor et al. [Nucleic Acids Res.13(1985) 8749-8864]. In a way Therefore it can be done. According to the manufacturer's specifications, "DNA Thermal Cycler" (Perkin El mer [Cetus], so-called PCR [Polymerase-catalyzed chain reaction, Saiki R. K. Et al., Science230(1985) 1350-1354 Mullis K .; B. And Falloona F .; A. , Meth. Enz ym.155(1987) 330-350] Enzymatic amplification of DNA fragments by the technique. It can be performed. Nucleotide sequence confirmation kits sold by Amersham And Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,7 4 (1977) 5463-6467]. it can. Cell line used In the examples below, the following cell lines were used or can be used. -Human embryonic kidney system 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1 977) 59). This system is particularly suitable for human adenovirus integrated into its genome. Contains the left part of the Ad5 genome (12%). -KB human cell line: derived from human epidermoid carcinoma, The enabling conditions are available at the ATCC (reference CCL17). -Hela human cell line: derived from human epithelial cancer, this strain and its culture Conditions that enable feeding are available from the ATCC (reference CCL2). MDCK dog cell line: The culture conditions for MDCK cells are described in particular in Macatney et al. Science 44 (1988) 9. -GmDBP6 cell line (Brough et al., Virology 190 (1992 ) 624). This system uses the adenovirus E2 gene under the control of the MMTV LTR. Consists of Hela cells carrying offspring. Example Example 1 TK gene and CMV promoter under the control of a cancer-specific promoter Construction of defective recombinant adenovirus containing p53 gene under control These adenoviruses are located on the left side of the Ad5 adenovirus. Min, two therapeutic genes and a region of the Ad5 adenovirus (versus the IX protein). A) and a plasmid from a defective adenovirus carrying a different deletion. It was constructed by homologous recombination with DNA. 1. Construction of vector pONT-tk 1.1 Construction of plasmid p7tk1 In this example, 1131 base pairs (ATG1 14-116 and the stop codon TGA1242-1244) The construction of plasmid p7tk1 containing the punreading frame is described. Bgl containing the herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (tk) gene The II-NcoI fragment was cloned into plasmid pHSV-196 (by GobcpBRL). Commercially available), repaired by the action of the Klenow fragment, and then Inserted into the Smal site of GEM7zf (+) (commercially available from Promega) . The SmaI and BgIII sites were destroyed during this step and the NcoI site was retained. Be preserved. The resulting plasmid was named p7tk1. 1.2. Construction of plasmid pONT1 This example demonstrates transactivation of the EBNA1 antigen and TPV of the EBV virus. Contains a chimeric promoter consisting of sequences necessary for promoter transactivation The construction of the plasmid is described. The EcoRI (7315) -SmaI (8191) fragment of the EBV virus was Isolated from 95-8. The complete sequence of the EBV virus is described in Baer et al. 310 (1984) 207). This fragment is nuclear antigen 1 ( EBNA1) (D. Reisman & B. Sugden, 1986, Mol. eculular and Cellular Biology, vol. 6 pp . 3838-3846). Next This fragment was then cloned into EBV B95-8 (Pst) containing the TP1 promoter. I site was digested with T4 polymerase) NruI (166 241) -Pst It was fused to the I (166 559) fragment. Next, the chimeric promoter thus obtained was obtained. The multiple cloning site of plasmid pBluescript II SK. Was inserted. The resulting plasmid was named pONT1. 1.3. Construction of plasmid pOBTtk Plasmid pOBTtk is the chimeric plasmid cloned into plasmid pONT1. Plasmid p7tk1 under the control of the EBNA1-RE / TP1 promoter. Consists of a loaned herpes simplex virus thymidine kinase (tk) gene. To construct this plasmid, EBNA-1 and EBNA-2 BamHI- of pONT1 containing a transactivated chimeric promoter P7tk1 containing the XhoI fragment and the tk open reading frame The XhoI-ClaI fragment of plasmid pAd. BamHI of RSVβgal ( 478) and ClaI (4550) sites. Plasmid pAd . RSVβGal is in the direction of 5 ′ → 3 ′, -Contains ITR sequence, origin of replication, encapsulation and enhancer signal E1A A PvuII fragment corresponding to the left end of the Ad5 adenovirus; Β-galactosi under the control of the RSV promoter (Rous sarcoma virus) A gene encoding a dase, -Plasmid pAd. RSVβGal and adenovirus Second cut of Ad5 adenovirus genome allowing homologous recombination during d1324 Piece; It contains. Plasmid pAd. RSVβGal is Stratford-Per ricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626). Has been described. All cloning sites are preserved. PONT tk (FIG. 3). 2. Construction of plasmid pONtkCMvp53 In this example, the left part of the Ad5 adenovirus (left ITR, encapsulation region) And the start of the E1 region), the tk gene under the control of the ONT promoter. Offspring, p53 gene under control of CMV promoter and recombinant adenovirus A second fragment of the Ad5 genome (pIX protein) that allows homologous recombination for the creation of The construction of a vector carrying the protein is described (see Example 1.3). This plasmid is under the control of the CMV promoter, downstream of the tk gene. The fragment carrying the p53 gene, followed by the SV40 virus polyadenylation site Constructed by inserting in the orientation. More specifically, the inserted fragment is Things Including. -Viral origin corresponding to the cytomegalovirus (CMV) early promoter Promoter region. This region is defined as the CMV / pONTtk link in the vector. Unique restriction sites EcoRI-SphI and CMV / p53 binding BamHI site. The only one that sandwiches the promoter region The presence of one site will result in the replacement of the CMV region by any other promoter. Make it possible. Thus, the p53 gene-inducible promoter (heavy metal (cad Regulation of metallothionein promoters inducible by medium and zinc)) A second series of vectors is obtained below. -Corresponds to the cDNA encoding the mouse p53 protein in wild-type form 1173 bp sequence (Zakut-Houri et al., Nature 36 (1983)) 594). In this construct, the suppressor gene is in the form of a cDNA, It lacks introns. This can in particular reduce the size of the vector And In addition, expression levels obtained were comparable in the presence or absence of introns. Checked to be enemy. A polyadenylation signal of the SV40 virus late gene, This corresponds to a very efficient polyadenylation signal. Two only restrictions The positions SalI and HindIII are located downstream of the polyadenylation signal. The resulting vector was named pONTtkcMVp53. The insertion of the fragment can be similarly done in the opposite direction, the tk gene and the p53 gene. It will be appreciated that the offspring will lead to the plasmid being inverted (pONTtkC MVp53inv). 3. Construction of recombinant adenovirus 3. 1 Two therapeutic genes inserted in the same orientation at the level of the E1 region Construction of a recombinant adenovirus carrying the E1 region and carrying the offspring Adenovirus linearizing the vector pONTtkCMVp53 and lacking the E1 region Vector, encoded by the adenovirus E1 (E1A and E1B) regions Co-transfection to helper cells (line 293) that provide the transgenic function I did it. More precisely, the adenovirus Ad-ONTtkCMVp53 is prepared according to the following procedure: According to the adenovirus Ad-RSVβgal (Stratford-Perr icaudet et al., supra) and the vector pONTtkCMVp53. Between Obtained by homologous recombination in vivo. Plasmid pO linearized with XmnI Adenovirus Ad linearized with NTtkCMVp53 and ClaI enzyme -RSVβgal is co-transfected into system 193 in the presence of calcium phosphate And homologous recombination was performed. Then, the recombinant adenovirus thus created was Selected by plaque purification. After isolation, the recombinant adenovirus DNA was Amplify in a three cell line, which is approximately 10^TenUnpurified recombination deletion with a titer of pfu / ml Lead to culture supernatant containing degenerate adenovirus. In general, virus particles can be prepared according to known techniques (in particular, Graham et al., Viro logy52 (1973) 456), centrifugation on a cesium chloride gradient Purified. Adenovirus Ad-ONT-tkCMVp53, ΔE1 Can be stored at -80 ° C (20% glycerol). 3.2 At the level of the E1 region, carry two therapeutic genes inserted in the same orientation. Construction of a recombinant adenovirus lacking the E1 and E3 regions Vector pONTtkCMVp53 is linearized and lacks E1 and E3 genes Adenovirus vector, adenovirus Provides in trans the function encoded by the E1 (E1A and E1B) regions Helper cells (line 293). More precisely, the adenovirus Ad-ONTtkCMVp53, ΔE1, ΔE 3 was obtained using the mutant adenovirus Ad-d11324 (Th immappaya et al., Cell 31 (1982) 543) and the vector pO. Obtained by in vivo homologous recombination between NTtkCMVp53. XmnI Plasmid pONtkcmVp53, which has been linearized with The immobilized adenovirus Ad-d11324 was isolated in the presence of calcium phosphate. Line 293 was co-transfected to perform homologous recombination. Then it was created The resulting recombinant adenovirus was selected by plaque purification. After isolation, recombination Adenovirus DNA was amplified in a 293 cell line, which was approximately 10^Tenpfu / ml It leads to a culture supernatant containing a purified recombinant defective adenovirus having a titer. In general, virus particles can be prepared according to known techniques (in particular, Graham et al., Viro logy52 (1973) 456), centrifugation on a cesium chloride gradient Purified. Ade Virus-Ad-ONT-tkCMVp53, ΔE1, ΔE3 are 20% glycero Storage at -80 ° C. 3.3 Construction of adenovirus with tk and p53 genes located in reverse orientation Example 3.1. And 3.2. Tk and p5 according to the procedure described in The adenovirus in which the three genes are located in the opposite orientation was cloned into plasmid pONTtkCMV It can be constructed starting from p53inv.Example 2 TK gene and CMV promoter under control of RSV virus LTR promoter Construction of defective recombinant adenovirus consisting of p53 gene under motor control These adenoviruses are the left part of the Ad5 adenovirus, two therapeutic residues. Gene carrying the gene and the region of the Ad5 adenovirus (corresponding to the IX protein) Homology between Rasmid and DNA from defective adenovirus carrying different deletions Constructed by recombination. 1. Construction of vector pRSVtk This plasmid contains the EBNA1-transactivatable pro By replacing the motor with the RSV LTR promoter, Constructed from the sumid pONTtk (Example 1.1). For that, RSV Plus Amide was transferred to plasmid pAd. RSV. βgal (Stratford-Perr icaudet et al. Clin. Invest. 90 (1992) 626) Isolated in the form of a BamHI-SalI fragment, and then the plasmid pONTt k was cloned into the BamHI (478) and SalI (1700) sites. The resulting plasmid was named pRSVtk (FIG. 4). 2. Construction of plasmid pRSVtkCMVp53 In this example, the left part of the Ad5 adenovirus (left ITR, encapsulation region) And the start of the E1 region), the tk gene under the control of the RSV promoter. Offspring, p53 under the control of the CMV promoter and the creation of recombinant adenovirus A second fragment of the Ad5 genome (pIX protein ) Is described (see Example 2.3). This plasmid is under the control of the CMV promoter, downstream of the tk gene. fragment carrying the p53 gene, followed by SV By inserting the polyadenylation site of the 40 virus, plasmid pRSV Constructed from tk. More specifically, the inserted fragment consists of: -Viral origin corresponding to the cytomegalovirus (CMV) early promoter Promoter region. This region is defined as the CMV / pONTtk link in the vector. Unique restriction sites EcoRI-SphI and CMV / p53 binding BamHI site. The only one that sandwiches the promoter region The presence of one site will result in the replacement of the CMV region by any other promoter. Make it possible. Thus, the p53 gene-inducible promoter (heavy metal (cad Regulation of metallothionein promoters inducible by medium and zinc)) A second series of vectors is obtained below. -Corresponds to the cDNA encoding the mouse p53 protein in wild-type form 1173 bp sequence (Zakut-Houri et al., Nature 36 (1983)) 594). In this construct, the suppressor gene is in the form of a cDNA, It lacks introns. This can in particular reduce the size of the vector And Furthermore, the obtained expression level is Checked comparable in presence or absence. SV40 virus late gene polyadenylation signal, which is very efficient Corresponding to a typical polyadenylation signal. Two unique restriction sites SalI and HindIII is located downstream of the polyadenylation signal. The resulting vector was named pRSVtkCMVp53. 3. Construction of recombinant adenovirus 3.1 Two therapeutic genes inserted in the same orientation at the level of the E1 region Construction of a carrying, recombinant adenovirus lacking the E1 region This adenovirus is constructed according to the method described in Example 1 (3.1). . The adenovirus Ad-RSV-tkCMVp53, ΔE1 thus obtained was 20 % Glycerol at -80 ° C. 3.2 Two therapeutic genes inserted in the same orientation at the level of the El region Construction of a carrying recombinant E1 and E3 region deleted adenovirus This adenovirus is constructed according to the procedure described in Example 1 (3.2). Adenovirus Ad-RSV- thus obtained tkCMVp53, ΔE1, ΔE3 are stored in 20% glycerol at −80 ° C. Wear.Example 3 TK gene under control of RSV virus LTR promoter and promoter Recombinant adenovirus containing interleukin-2 gene under the control of Building These adenoviruses are the left part of the Ad5 adenovirus, two therapeutic residues. Carries the gene and the region of the Ad5 adenovirus (corresponding to the IX protein) Between the plasmid and the DNA from the deleted adenovirus carrying the different deletions Was constructed by homologous recombination. 1. Construction of plasmid pRSVtkRSVIL-2 In this example, the left part of the Ad5 adenovirus (left ITR, encapsulation region) And the start of the E1 region), the tk gene under the control of the RSV promoter. Child, Interleukin-2 gene under the control of RSV promoter and recombination Second fragment of the Ad5 genome allowing homologous recombination for the creation of adenovirus The construction of a vector carrying (pIX protein) is described (see Example 3.2). ). This plasmid is under the control of the RSV promoter, downstream of the tk gene. A fragment carrying the interleukin-2 gene, followed by the SV40 virus polyadduct. Plasmid pRSVtk (see Example 2) can be It was built from. More specifically, the inserted fragment consists of: -Plasmid pAd. RSV. Form of BamHI-SalI fragment from βgal RSV virus LTR promoter (Stratford-Pe) rricaudet et al. Clin, Invest. 90 (1992) 626 ). A sequence corresponding to the cDNA encoding human interleukin-2 (EP91 539). In this construct, the therapeutic gene is in the form of a cDNA. SV40 virus late gene polyadenylation signal, which is very efficient Corresponding to a typical polyadenylation signal. Two unique SalI and Hind The III restriction site is located downstream of the polyadenylation signal. The resulting vector was named pRSVtkRSVIL-2. 2. Construction of recombinant adenovirus Example 1 or 2 et al. Construct according to the described method. These adenoviruses are at the level of the E1 region. Carries two therapeutic genes inserted in the same orientation, Has deletions in the E1 and E3 regions. The adenoviruses Ad-RSV-tkRSVIL-2, ΔE1 and And Ad-RSV-tkRSVIL-2, ΔE1, ΔE3 are in 20% glycerol , Can be stored at -80 ° C.Example 4 TK gene and granulocyte and macrophage colony stimulating factor (GM-CSF Construction of a defective recombinant adenovirus containing the gene encoding According to the method described in the above embodiment (for example, ONT and RSV promotion) Of the tk gene and its own promoter or RSV Defective adenovirus carrying the GM-CSF gene under the control of a promoter Can be specifically constructed. For this purpose, an intermediate vector carrying the two genes is transferred under the control of a promoter. The GM-CSF gene-carrying fragment in the same or opposite orientation And the vector pONT It can be constructed from tk or pRSVtk. Code GM-CSF Genes and constructs containing them are described in particular in International Application WO 86/03225. It is listed.Example 5 Two genes of interest (one inserted at the level of the E1 region and the other E3 Construction of defective recombinant adenoviruses (including those inserted at the level of the region) These adenoviruses contain the first gene inserted at the level of the E1 region. DNA at the level of the E3 region with the DNA of the first defective virus carrying the offspring Constructed by homologous recombination with the DNA of the second defective adenovirus . 1. Construction of a defective virus carrying a gene inserted at the level of the E3 region This virus is an adenovirus Add1324 (Thymmappaya et al., Cell 31 (1982) 543). The virus is E1 and And a deletion at the level of the E3 region (XbaI-EcoRI fragment deleted). A The dd1324 viral DNA is isolated and purified. Then, this DNA was converted to enzyme Xb. Cleave with aI and EcoRI. Then, XbaI -The EcoRI fragment encodes a thymidine kinase under the control of the RSV promoter. Derived from the plasmid pRSVtk carrying the coding sequence, and then Insert at the level of that site in the open Add1324 DNA. The DNA thus obtained therefore has a deletion at the level of the E1 region and a deletion of the E3 region. Contains the TK gene inserted at the level. 2.2 Construction of adenovirus carrying the gene of 2.2 Linearized with BamHI and DNA from recombinant virus prepared above Immunostimulatory or tumor-suppressor residues inserted at the level of the El region DNA from recombinant adenovirus carrying the gene in the presence of calcium phosphate To co-transfect line 293 to allow homologous recombination. Then, The created recombinant adenovirus is selected by plaque purification. After isolation, set The recombinant adenovirus DNA was amplified in a 293 cell line, which^Tenpfu / m 1 to a culture supernatant containing unpurified recombinant defective adenovirus with a titer of 1. Viral particles are generally prepared by known techniques (Graham et al., Virology 5). 2 (1973) 456) by centrifugation on a cesium chloride gradient. And purified.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者トツク，ブリユノフランス国、エフ−92400・クルブボワ、ブルバール・サン−ドニ、58────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, C Z, EE, FI, GE, HU, IS, JP, KG, KP , KR, KZ, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, S G, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US , UZ, VN (72) Inventor Toku, Briyuno France, F-92400 Courbevoie, Boulevard Saint-Denis, 58

Claims

[Claims] 1.2, the first being a suicide gene and the second being a suicide gene. Is an immunostimulatory gene or a tumor-suppressor gene Defective recombinant adenovirus. 2.2 that the two genes constitute a single transcript under the control of a single promoter The adenovirus according to claim 1, characterized in that: 3.2 The gene of claim 2, wherein the genes are under the control of separate transcription promoters. The adenovirus according to claim 1. 4. The adenoprotein according to claim 3, wherein the 4.2 genes are inserted in the same orientation. No virus. 4. The Adehyde according to claim 3, wherein the 5.2 gene has been inserted in the opposite direction. No virus. 6.2 Therapeutic gene is located at the same site in the genome, preferably E1, E3 or E 6. The method according to claim 1, wherein the information is inserted at four levels. Or the adenovirus according to claim 1. 7. The gene of claim 6, wherein the 7.2 gene has been inserted at the level of the E1 region. Adenovirus listed. 8.2 Therapeutic gene inserted at a different site in the genome The adenovirus according to any one of claims 1, 3, 4, and 5. 9. One of the genes is at the level of the E1 region and the other is at the level of the E3 or E4 region. 9. The adenovirus according to claim 8, wherein the adenovirus is inserted at a bell. 10. ITR sequences, including sequences enabling encapsulation, and E1 and E4 genes 10. The method according to claim 1, which carries deletion of all or part of the offspring. 2. The defective recombinant adenovirus according to claim 1. 11. ITR sequences, including sequences that enable encapsulation, E1, E3 and E4 11. The method according to claim 10, which carries deletion of all or part of the gene. Denovirus. 12. Its genome lacks all or part of the E1, E3, L5 and E4 genes. The adenovirus according to any one of claims 1 to 11, wherein the adenovirus has been lost. 13. 2. The adé according to claim 1, characterized in that it is of human, animal or mixed origin. No virus. 14． Adenoviruses of human origin are classified in group C From, preferably a type 2 or 5 adenovirus (Ad2 or Ad5) The adenovirus according to claim 13, which is selected from the group consisting of: 15. Adenoviruses of animal origin are dogs, cows, rats, sheep, pigs, birds 14. The adenovirus according to claim 13, wherein the adenovirus is selected from the group consisting of: Ruth. 16. The suicide gene is a thymidine kinase gene, preferably herpesvirus H The adenovirus according to claim 1, which is the SV-I thymidine kinase gene. Virus. 17． Gene encoding thymidine kinase and tumor-suppressor gene The adenovirus according to claim 1, comprising: 18. Gene encoding thymidine kinase and lymphokine 2. The adenovirus according to claim 1, comprising a gene. 19. Gene encoding herpesvirus thymidine kinase and wild-type p A defective recombinant adenovirus (Ad-TK-p) comprising 53 genes; 53). 20. Genetics encoding herpesvirus thymidine kinase. Deficiency characterized by containing a gene encoding an offspring and interleukin-2 Recombinant adenovirus (Ad-TK-IL2). 21. Gene encoding herpesvirus thymidine kinase and GM-C A defective recombinant adenovirus (A) comprising a gene encoding SF d-TK-GM-CSF). 22. The transcription promoter (s) is a mammalian, eukaryotic or viral promoter 4. The adenovirus according to claim 2, wherein the adenovirus is selected from the group consisting of: 23. Immunostimulatory genes indicate therapeutic products synthesized in the secretory pathway of target cells 23. The method according to claim 1, which comprises a signal sequence. Denovirus. 24. 24. At least one defective recombinant adeno according to any one of claims 1 to 23. A pharmaceutical composition comprising a virus. 25. 25. The medicament according to claim 24, comprising a pharmaceutically acceptable excipient for an injection formulation. Composition. 26. -The suicide gene is a gene that confers sensitivity to a therapeutic agent. One or more recombinant adenovirus according to any of claims 23 to 23, and -Used simultaneously or separately for the treatment of hyperproliferative diseases or over time The therapeutic agent as a combination product used Products containing. 27. The suicide gene is the thymidine kinase gene and the therapeutic agent is ganciclovir. 27. The method according to claim 26, wherein the alcohol or acyclovir or an analogue is used. Products. 28. Contains two genes of therapeutic value inserted at the level of the E1 region of the genome Defective recombinant adenovirus.