JPH10505423A

JPH10505423A - Cell separation

Info

Publication number: JPH10505423A
Application number: JP8509302A
Authority: JP
Inventors: ユゲルスタッド，ジョン; ステンスタッド，パー; キラース，ラーズ; バージ，アーヴィッド; プレストヴィック，ヴェンケ，スレタージェル
Original assignee: ジンベントエイエス
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 1998-05-26
Also published as: GB9417864D0; AU3395595A; CA2199020A1; WO1996007909A1; EP0782704A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、固相選択的細胞-捕獲マトリックスに細胞が非-特異的に結合するのをブロックするために乳タンパク質を使用する方法を提供する。一般的にいって、固相選択的捕獲マトリックスは、標的-特異的結合パートナー、例えば抗体により標的細胞を選択的に分離するのに適した固体支持体である。 (57) [Summary] The present invention provides methods of using milk proteins to block non-specific binding of cells to a solid phase selective cell-capture matrix. Generally speaking, a solid phase selective capture matrix is a solid support suitable for selectively separating target cells by a target-specific binding partner, eg, an antibody.

Description

【発明の詳細な説明】細胞分離本発明は、選択的細胞単離手法における細胞の非-特異的結合をブロッキングする方法に関する。細胞および他の生存可能な実体（entities）、例えばウイルスの分離および選択的単離は、医学および生化学および同様の関連分野において、調製の観点から、また研究用の手段としての両方で特別な重要性および実に増大する重要性を有する領域を表す。すなわち、例えば細胞分離は、骨髄からの悪性細胞の除去（パージ）において、あるいは特定細胞型の精製集団を得るために、例えば元に戻すため、または例えば培養または遺伝物質の挿入による後続の研究または操作のために必要な工程である。細胞分離はまた、例えば臨床サンプルから細菌または原生動物またはウイルスのような病原性細胞を単離することにより疾患および感染を診断する際に、また、例えば食品および廃水中の細菌汚染または他の病原性物質汚染をモニターする際に、しばしば用いられる。従って細胞分離は多くの重要な領域、例えば重大な疾患の処置および研究、診断、血液および組織の型決定、食品および環境の安全性などに関連している。細胞を分離するための多くの方法が知られている。最近、これらの方法は、アフィニティー結合システムを用いて、すなわち分離すべき細胞と、ある形態の支持体とに別個に結合する１対の結合パートナー（これは接触させると結合し、これにより細胞をその周囲から選択的に除去することを可能にする）を用いて、所望の細胞を選択的に捕獲することに基づいている。これは一般的に、特異的結合パートナーとして細胞表面上の抗原を認識する抗体を用いて達成され、より最近では支持体として磁性ビーズを用いて達成され、これは磁性凝集による結合細胞の分離（いわゆる "免疫磁性分離" ）を容易にする。細胞およびウイルスの選択的分離のために選択的アフィニティー-捕獲マトリックス、および特に磁性ビーズを用いることは、文献に広く記載されている（概説については、例えば Ugels tad et al.，Progress of Polymer Sience，17(1)，87- 161，1992; および Olsvik et al.，Clinical Microbiology Reviews，43-54，J anuary 1994 参照）。この形態の分離に伴う問題は所望しない細胞が支持体に非-特異的に結合することであり、標的特異的結合パートナーにより支持体に結合する所望の標的細胞のみならず、支持体の表面に非-特異的に結合する他の所望しない細胞をも分離することになる。非-特異的結合の程度は、用いられる細胞、支持体およびアフィニティー結合システムの性質により変化するが、一般的にいって、これは固相アフィニティー捕獲に基づく全てのシステム、および特に免疫磁性分離に伴う問題である。これは、例えば骨髄清浄化（パージ）または型決定において、例えば所望の細胞のみを単離することが重要な場合に、もしかして重大な結果を招くことがあり、また、例えば診断システムの結果に混乱を来すことがある。細胞の非-特異的結合が起こりうる部位をブロックするために支持体をウシ血清アルブミン(BSA)で前処理することにより、支持体に細胞が非-特異的に結合するのを減少させる試みがなされている。同様の効果は、不活性免疫グロブリン、すなわち非-標的特異的免疫グロブリンを用いて達成できる。しかしながら、このような方法を用いて達成できる非-特異的結合の減少は完全ではなく、多くの場合この問題を緩和するためには充分でない。従って、選択的細胞捕獲マトリックスに細胞がこのように非-特異的に結合するのをブロックするための改良方法に対する要求がある。本発明は、このような方法を提供しようとしている。すなわち本発明者らは、ブロッキング剤として乳タンパク質、例えばカゼインを使用することにより、このような非-特異的細胞結合を劇的に減少させることができ、多くの場合に完全に防止できることを見出した。カゼインは以前、タンパク質の物理的吸着を防止するために、固体表面、例えばポリスチレンの処理に使用されてきた。このような有用性は、最も顕著には、プレートをカゼイン溶液にさらしてブロックする ELISA などの免疫アッセイ手法（例えばVogt et al.， J．Immunol．Methods．101, 43-50，1987参照）において応用されているが、他の用途、例えばウエスタンブロッティングおよびサザンブロッティングにおける用途もまた記載されている（例えば Johnson et al.，Gene Anal．Techn．1, 3-8，1984参照）。しかしながら、細胞が固体支持体に非-特異的に付着するのを防止するためにカゼインが効果的であろうことは、これまで提案されなかった。従って本発明は、その最も一般的な意味において、固相選択的細胞-捕獲マトリックスに細胞が非-特異的に結合するのを防止するために乳タンパク質を使用する方法を提供する。もう一つの観点からみて、本発明はまた、固相選択的細胞-捕獲マトリックスに乳タンパク質を添加することを含む、固相選択的細胞-捕獲マトリックスに細胞が非-特異的に結合するのを防止する方法を提供する。一般的にいって、固相選択的捕獲マトリックスは、標的-特異的結合パートナーにより標的細胞を選択的に分離するのに適した固体支持体であり、例えば固体支持体は標的-特異的結合パートナーを担持していてもよい。前記のように、このようなブロッキングは、所望しない細胞の非-特異的結合が問題となることのある混合物から細胞を選択的に単離する際に特に重要である。従ってもう一つの観点によれば、本発明は、乳タンパク質を添加して非-標的細胞の非-特異的結合をブロックすることを特徴とする、標的-特異的結合パートナーにより標的細胞を固体支持体に選択的に結合させ、この支持体に結合した細胞をサンプルから分離することを含む、サンプルから標的細胞を選択的に単離する方法を提供する。本明細書において "細胞" という用語は、原核細胞、真核細胞および他の生存可能な実体、例えばウイルスおよびマイコプラズマ属菌、およびサブ細胞成分、例えば細胞内器官の全てを包含するために用いられる。従って、代表的な"細胞" には、哺乳類動物および非哺乳類動物の細胞、植物細胞、プロトプラスト、細菌、原生動物およびウイルスの全ての型が包含される。ここで用いられる "ブロッキング" という用語は、前記の非-特異的結合の減少および防止の両方を包含する。前記のように、本発明により得られる非-特異的結合の減少は、予想されたよりもはるかに高く、BSA および他のタンパク質を用いて得られるよりも著しく良好である。実際に、BSA で既に前処理された固体支持体を乳タンパク質で処理すると、BSA 単独で処理された支持体と比較して、非-特異的結合の顕著な減少を生じる。乳タンパク質は、免疫アッセイにおける非-特異的吸着のブロッキングのための、公知の文献に記載された任意の乳タンパク質であってよく、例えばカゼイン、乳漿タンパク質濃厚物、無脂肪乾燥ミルクおよびスキムミルクを包含する。これら乳タンパク質のいずれも、単独でまたは組み合わせて使用できる。カゼインを選択すると便利である。乳タンパク質の誘導体、例えば部分加水分解物または架橋タンパク質も包含される。固体支持体は、公知の支持体、あるいは固定化、分離などのために現在広く用いられているか、または提案されているマトリックスのいずれてあってもよい。これらは粒子、シート、ゲル、フィルター、膜、あるいはマイクロタイターストリップ、チューブまたはプレートなどの形態をとることができ、高分子材料で好都合に作製できる。粒子状材料、例えばビーズ、特に重合体ビーズは、結合能が大きいために一般的に好ましく、その広範囲のものがこの技術分野で公知である。操作および分離を補助するために、磁性ビーズが好ましい。ここで用いられる "磁性" という用語は、支持体が磁場に置かれたときに、それに与えられた磁気モーメントを有することができ、従ってその磁場の作用下に排除（移動）できることを意味する。換言すれば、磁性粒子からなる支持体は、磁性凝集により容易に除去できる。このような磁性粒子は、残留磁気、従って塊状化を防ぐために超常磁性であることが好ましく、また一様な動力学および分離を提供するように単分散状であることが有利である。超常磁性単分散状粒子の製造は Sintef が EP- A-106873 に記載している。Dynal AS（Oslo,Norway）から DYNABEADS として販売されている単分散状重合体超常磁性ビーズは、本発明に従って使用または変性しうる商業的に入手可能な磁性粒子の例である。このような支持体への細胞の非-特異的結合は、細胞の物理的吸着によって起こり、細胞分離手法に使用可能な全ての種類の固体表面、特に親水性表面および疎水性表面の両方を含む重合体支持体において観察されており、このような全ての支持体は本発明の範囲内に包含される。しかしながら、この問題は疎水性支持体で悪化することがあるという幾つかの報告がある。多くの理由から、疎水性表面は、特異的結合パートナー、例えば抗体をカップリングさせるために好ましい（あるいは少なくとも、カップリング反応時に表面が疎水性であることが好ましい）。この理由は、化学的カップリングにより支持体に抗体を結合させる反応が場合によっては遅いということである。抗体が支持体表面に自動的かつ高度に結合すると、反応部位における抗体濃度が非常に大幅に増大することになり、これにより化学的カップリング速度がより速くなる。従って、比較的に疎水性の表面を使用すると、細胞が支持体表面に非-特異的に付着するのを効果的にブロックする必要性が強くなる。前記のように、細胞の非-特異的結合を阻止する際の乳タンパク質の利点は、明確かつ疑いの余地なく、むしろ親水性表面を含む全ての種類の支持体表面で認めることができるが、これは疎水性表面で特に顕著であり、この場合カゼインは、BSA を最適量で用いると、BSA よりも著しく良好である。標的-特異的結合パートナーは、標的粒子を認識でき、かつこれに結合できる任意の分類のものであってよく、好都合には、分離技術および固定化技術に従来用いられているような任意の結合パートナーを含むことができる。この意味で、結合パートナーは、標的細胞および支持体の両方に選択的に結合可能な単一の実体を含むことができ、あるいは一端において標的細胞に選択的に結合可能な成分を含み、他端において支持体に結合する成分を含む実体のシリーズを含むことができる。最も簡単な場合、このようなシリーズは、標的細胞を認識する第１結合パートナーと、この第１結合パートナーおよび支持体に結合する第２結合パートナーとを含むことができる。典型的には、結合パートナーは、細胞、ウイルス粒子などの表面上の抗原を認識する抗体または抗体フラグメントを含む。抗体はモノクローナル、ポリクローナルまたはキメラであってよく、結合活性を保持しているフラグメントの形態、例えば F(ab)₂、Fab またはFv フラグメント（Fv フラグメントは抗原結合部位を含む抗体の "可変" 領域と定義される）の形態で使用できる。その代わりの結合パートナーとしては、タンパク質、例えばアビジン、レクチン、または細胞表面上のリセプターに結合するリガンドが挙げられる。分離することが望まれる粒子、および粒子をそれから分離することが望まれる環境に応じて、結合パートナーは、粒子に対して特異的な表面エピトープ、例えば特定の細胞型によってのみ発現される表面抗原を選択的に認識するように選ぶことができ、あるいは結合パートナーは、もっと一般的な反応性を有するもの、例えばある範囲の細胞を認識できるものであってもよい。その選択性および容易な入手可能性のため、抗体およびそれらのフラグメント、特に IgG 抗体および IgM 抗体は一般的に好ましい結合パートナーである。モノクローナル抗体は所望の標的特異性を容易に提供できる。従って、このような抗体またはそれらのフラグメントは、標的細胞に結合させるために支持体に直接にカップリングさせることができ、あるいはこれらを結合パートナーシリーズの一部として、上記のように間接的にカップリングさせることができる。好都合には、このような間接的カップリングは第２抗体を介していてもよく、この第２抗体は、それ自体が支持体に結合されており、かつ、ある部位、例えば Fc 部分で標的-特異的な第１抗体に結合し、これは第１抗体を標的と自由に結合できるようにしておく。その代わりに、このような第２抗体を免疫グロブリン-結合タンパク質、例えばプロテインＡで置き換えることができる。支持体は、機能性基、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基またはアミノ基を担持していてよく、これらの基は抗体の共有結合、または抗体の結合に好適なリガンドの共有結合を許容するように、よく知られた方法で活性化できる。好適なリガンドの例は、アビジンまたはストレプトアビジンであり、これは、ビオチン処理した標的-特異的結合パートナーで引き続き結合させるために、支持体に直接にカップリングさせることができる。支持体はまた、エポキシ基またはアルデヒド基のような基を担持していてもよく、この場合は抗体またはリガンドと支持体との共有結合カップリングを確立するために活性化する必要がない。多くの細胞特異的抗体が知られており、商業的に入手できる。このような多くの抗体およびそれらの源は Linccott の Directory（40 Glen Drive，Mill Vall ey，California，USA から入手可能）にリストされている。このような抗体の代表的なものとしては、下記のものを挙げることができる。ヒト多性能前駆体に対する抗体 B1-3C5、Sera Lab Ltd，Sussex，UK．から入手可能; ヒト樹状細胞に対する抗体 BU10、Binding Site Ltd，Birmingham，UK から入手可能; ヒト HLA DR および DR 組織適合性抗原に対する抗体 B721 および L243、Becton Dickinson Immunocytometry Systems，CA，USA から入手可能; ミトコンドリアに対する抗体 MAB1273、Paesel GmbH，Frankfurt，Germany から入手可能; カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する抗体 CA14-50、Chemunex S.A .，Maisons Alfort，France から入手可能; Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体 HBC170-4、Biosoft，Paris，France から入手可能; 黄色ブドウ球菌（Stap hylococcus aureus ）に対する抗体 4D2、Biodesign Inc．Main，USA から入手可能。さらなる例として、大多数の抗体は肝生成系の細胞上で発現された特定のマーカーに対して利用可能である（例えば Dako，Copenhagen から入手可能なCD 抗原に対する抗体の範囲参照）。加えて、初期肝生成細胞の選択に有用な抗-CD34 抗体 12.8 および B1-3C5 は Biosys S.A，France から入手できる。文献はまた、細菌、原生動物およびウイルスを含む多数の抗体に関する記載が含まれている。すなわち、例えば大腸菌（E.Coli）の K88（F4）ふさ状抗原に対する抗体は Lund et al が J．Clin．Micobiol．26: 2572-2575 に記載しており ; Skjerve および Olsvik はサルモネラ属菌（Salmonella）の免疫磁性分離において市販のポリクローナルヤギ IgG を用い(J．Fod Microbiol．14：11-18，198 9); サルモネラ属菌に対する血清-グループ特異的モノクローナル抗体は Widjoj oatmodo et al．が記載しており(Eur．J．Clin，Microbiol．Infect．Dis．10: 935-938，1991); Skjerve et al．はリステリア・モノサイトゲネス（Listeria Monocytogenes ）に対するモノクローナル抗体を記載しており(Appl．Environ．M icrobiol．56: 3478-3481); Morgan et al はシュードモナス・プチダ（Pseudom onas putida ）に対するモノクローナル抗体を記載しており(Appl．Environ．Mic robiol．67: 503-509，1991); HIV-感染 CD4 細胞を検出するために有用な CD4 抗原に対する抗体はBrinkmann et al が記載している(J．virol．65: 2019-2023 ，1991)。あるいは所望の特異性を有するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は標準的技術を用いて得ることができる。結合パートナーを選ぶことにより、所望の粒子または所望しない粒子を結合させることができ、すなわちポジティブ選択またはネガティブ選択を達成することができ、例えば所望の細胞集団を単離するか、あるいは所望しない粒子をシステムからパージすることができる。本発明の方法は、例えば血液、血漿または他の体液または臨床サンプルから、あるいは細胞培養物または他の生物学的媒質または人工的媒質などから、様々な所望の細胞集団をポジティブ選択する際に特に有用であることが見出された。結合パートナー、例えば抗体およびそれらのフラグメントを支持体に結合させてアフィニティー捕獲マトリックスを提供するための多くの方法が知られており、文献に広く記載されている。ある範囲の機能性基を支持体に備えることができ、これらの基を活性化して、活性化された基を抗体中のアミノ基またはSH 基と反応させることにより、支持体と抗体との間に共有結合を与えることができる。このように結合された抗体は、前記のように標的-特異的抗体であってよく、あるいは標的-特異的な第１抗体と結合する第２抗体であってもよい。最も普通の方法の例は次のとおりである：１．-CH₂-OH 基を含む支持体に、塩化スルホニルで活性化して抗体をカップリングさせて、支持体上にスルホニルエステルを与え、次いでこれを抗体上のアミノ基または -SH 基と反応させて、それぞれ -CH₂-N H- 結合および -CH₂-S- 結合を有する共有結合カップリングした抗体を与える。２．COOH 基を含む支持体に、このカルボキシル基をカルボジイミドおよび N-ヒドロキシスルホサクシンイミドで活性化して抗体をカップリングさせ、これにより支持体と抗体との間にアミド結合を形成する。３．グルタルアルデヒドで活性化されたアミノ基を含む支持体に抗体をカップリングさせ、これにより反応させて、抗体のアミノ基との共有結合を形成する。４．エポキシ基を含む支持体への抗体のカップリングは、エポキシ基が抗体上のアミノ基および -SH 基と直接に反応するので、さらに活性化しないで行われる。前記の磁性ビーズまたは他の支持体には、結合パートナーを結合させるためのある範囲の機能性基（例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基またはアミノ基）を備えることができ、あるいは例えば表面コーティングにより変性して所望の機能性基を導入することができる。US-A-4654267、 4336173 および 4459378 には、このような多くの表面コーティングの概論が記載されている。支持体への標的細胞の結合は、多数の工程により行うことができる。例えば、特異的結合パートナーを含めた全ての試薬を、段階的に支持体に結合させ、次いでこれを標的細胞含有サンプルと接触させることができる。あるいは、標的細胞集団を、別の段階で、適切な不溶性支持体にさらす前に、特異的結合パートナー、例えばモノクローナル抗体と接触させることができる。従って、連結の異なる部分は、複雑な間接的連結の場合は特に、結合させるために接触させる前に、標的細胞および支持体の各々において形成することができる。一つの好ましい方法は、標的細胞と接触させる前に、抗体または他の標的-特異的結合パートナーを支持体に結合させることである。あるいは、抗体（標的- 特異的結合パートナーとして）を、最初の工程で標的細胞に結合させることができる。別の工程で、第１抗体の Fc 領域に結合しうる第２抗体を支持体に結合させ、次いで細胞と支持体とを接触させる。標的細胞を固体支持体に選択的に結合させるための特に有利なカップリングシステムは、我々の同時係属国際特許出願 No．WO94/20858 に記載されている。これは、標的-特異的結合パートナーと固体支持体との間のヒドロキシボリル／シス-ジオール連結に基づいている。前記のように、この連結は実体のシリーズを含む結合パートナーシステムの形態であってもよく、細胞を認識する第１標的- 特異的結合パートナー、またはこの第１パートナーを結合する第２結合パートナーの何れか一方を、このようにして支持体に結合させる。すなわち第１抗体または第２抗体がヒドロキシボリル／シス-ジオール連結の対象であってよい。ヒドロキシボリルに基づくシステムは、カップリンクおよび後続の IgM 抗体の遊離化において特に効果的であることが見出された。ヒドロキシボリル／シス -ジオール連結により支持体にカップリングされた IgM 結合パートナーの使用法は、本発明の好ましい観点である。我々は驚くべきことに、結合パートナーをヒドロキシボリルに基づく結合によりカップリングさせる場合、支持体上で結合パートナーの好ましいオリエンテーションが得られ、その選択的結合が損なわれないことを見出した。これは引き続いて、支持体への標的細胞の結合を、極めて効果的かつ信頼性の高いものにする。以下にさらに詳細に論じるように、ヒドロキシボリルに基づくシステムの追加の利点は、特定の状況において、ヒドロキシボリル／シス-ジオール残基の結合を温和な条件下で逆転でき、これにより標的細胞を簡単かつ破壊しない手段で遊離化できることである。しかしながら、上記の観点からドロキシボリル／シス- ジオール連結方法が有利であるが、特に非-特異的な細胞結合の問題が生じるようであり、この問題はこの方法において特に目立つようである。特に、Ｂ細胞および単球の目立った非-特異的結合が観察された。従って、このような細胞が存在する場合に、この技術の使用を厳しく制限し、かつ複雑にする恐れがある。本発明によれば、乳タンパク質を使用すると、ヒドロキシボリルに基づく結合が備えられた固体支持体による非-特異的細胞結合をブロックするのに特に効果的であることが見出された。これは本発明の特に好ましい態様である。細胞分離手法において、標的細胞および用途に依存して、分離後に細胞を支持体から脱着することが望まれる場合も望まれない場合もあろう。すなわち幾つかの場には、例えば臨床用途または機能性研究のために純粋な細胞分画を単離する必要がある一方で、他の場合（例えばパージまたは他のネガティブ選択手法）には、そうする必要がない。広範囲の脱着方法がこの技術分野で知られており、異なる支持体には異なる方法が適切であろう。特異的結合パートナーが抗体である場合、Dynal AS，Oslo，Norway の DETACHaBEAD システムを使用できる（例えば Rasmussen et al．の J．Immunol．Methods，146，195-202，1992 参照）。他の脱着方法としては、例えば過剰の遊離抗原を用いた競合置換反応、またはチオール試薬、例えばジチオスレイトールを用いたジスルフィド結合の切断が挙げられる。ヒドロキシボリルに基づく連結は、WO64/20858に記載されているような競合性シス-ジオール試薬を添加することにより簡単かつ効果的に破壊できる。乳タンパク質を添加する時期、およびこれにさらす時間の長さ、またはこれと共にインキュベートする時間の長さは、支持体および結合の性質に依存し、そしてまた分離後に標的細胞を遊離化することが望ましいか否かにも依存する。全ての場合、乳タンパク質の添加は、結合パートナーが支持体に充分に連結するのを可能にするように行う必要がある。非-特異的な細胞結合の防止に加えて、乳タンパク質はまた、結合パートナーが表面に結合するのを減少させる効果も有する。従って、一般的にいって、乳タンパク質は結合パートナーが支持体に連結または結合された後に添加される。結合パートナーが多成分システムである場合、この添加は一般的に、前記のシステム中の支持体-結合成分、例えば第２抗体が結合された後に行われる。ある種の乳タンパク質は、所望により結合パートナーの結合工程中に添加できるが、一般的にいって、主要な部分は、結合パートナー（結合パートナー成分）が結合された後に添加される。結合パートナーの結合工程中に追加のタンパク質を含ませると、結合パートナーが正しいオリエンテーションで結合するのを促進するのに有利なことがあり、乳タンパク質はこのような追加のタンパク質を提供するのに使用できる。上記で説明したように、タンパク質性結合パートナー、例えば抗体は、支持体へのその連結を強化する疎水性表面との疎水性相互作用を生じさせる傾向を有する。これは、後続の脱着を望まない場合、あるいは例えば型決定反応において、結合パートナーが支持体から漏洩するのを防ぐことが特に望ましい場合に有利である。すなわち、このような場合、より強い疎水性結合が形成されるのを保証するために、カップリング反応の後、支持体が乳タンパク質に長時間さらされるのを防ぐことが望ましいことがある。このような状況において、支持体を乳タンパク質と共にインキュベートするブロック工程は、何時でも、結合パートナーと支持体との間で充分強い結合を確立するのに充分なだけ、時間的な上限なしに、好都合に行うことができる。しかしながら、支持体から結合パートナーを後で脱着する必要があるならば、結合パートナーが支持体に充分強く連結したらすぐに、しかし支持体と結合パートナーとの間で強すぎる疎水性相互作用（これは結果として得られる脱着度を低下させる傾向がある）が確立する前に行うことが好ましいことがある。この時間は、支持体の種類および結合パートナーの種類により大いに変化する。原則として、ブロッキング剤は、結合パートナーが支持体に強固に結合された後は何時でも添加することができ、その時間は 15分〜24時間またはそれ以上で変化しうる。一例として、乳タンパク質ブロッキング剤は１〜４時間後に添加できる。ブロッキング剤を添加した後、結合パートナーが結合している支持体は、結合パートナーの脱着が望まれない場合は特に、使用前に任意の長さの時間貯蔵することができる。細胞の選択的捕獲の場合のように、ある工程において支持体から結合パートナーを遊離化することが望まれるであろうシステムについては、場合により支持体をできるだけ早く使用することが好ましいことがある。なぜならば、結合パートナーの構造が変化する可能性があり、これは非-特異的結合を生じさせることがあるためである。しかしながら、乳タンパク質が支持体の表面に存在すると、支持体への結合パートナーの疎水性結合が減少するので、４℃で数週間貯蔵した後でも、結合パートナー、例えば抗体を支持体から充分に遊離化することができる。一般的にいって、支持体はブロッキング剤の存在下に貯蔵され、使用直前に洗浄される。支持体から漏洩してしまうことのある結合パートナーを除去するために洗浄することが望ましい。ブロッキング工程中の温度および他の条件は特に臨界的ではなく、従来の実験室の手順および条件を使用できる。ブロッキング工程中の温度は４℃が好都合であることが見出された。用いられる乳タンパク質の濃度もまた、状況および選択に応じて変化することができる。例えば 0.01〜0.1 % w/v、より好ましくは 0.05〜0.1 % w/v の濃度が好適である。前記のように、本発明の方法は、全血液、バッフィコート、および例えば密度勾配遠心分離により得られた細胞懸濁物を含む生物学的媒質または人工的媒質から、全ての原核細胞、真核細胞または他の生存可能な実体を単離するのに利用できる。本発明の方法を実施するために必要な種々の試薬および材料は、好都合にはキットの形態で提供することができる。従って、本発明のもう一つの観点は、 (i) 上記で定義した固体支持体; (ii) 前記支持体および標的細胞に結合しうる上記で定義した標的-特異的結合パートナー; および (iii) 乳タンパク質を含む、本発明の方法に使用するためのキットを提供する。本発明の細胞分離方法は、多くの用途、例えば、骨髄パージ、同種移植片中の正常Ｔ細胞の枯渇、例えば元に戻すための幹細胞の単離、機能性研究のための純粋細胞サブ集団の単離、組織型決定、および診断、例えば細菌性病原体の検出に使用できる。非-特異的細胞結合は、例えば下記の状況において説明されるような細胞分離手法において問題となりうる。１．直接のポジティブ細胞分離工程において、標的細胞に非-標的細胞が夾雑（汚染）する場合。このような非-標的細胞の夾雑は、例えば幹細胞のポジティブ分離の場合のように、標的細胞が低濃度で存在する場合に特に重大な問題である。通常、幹細胞の濃度は、ビーズに非-特異的に結合した他の細胞の量が比較的に少なくても、この量が、単離された幹細胞に基づいて高い％を占めるほどに低い。２．細胞のネガティブ除去により標的細胞を単離する際に、標的細胞が損失する場合。この選択的細胞分離方法は、除去しようとする非-標的細胞上の抗原に対する結合パートナーを担持した支持体により、細胞懸濁物から全ての非-標的細胞を除去することに関する。標的細胞の非-特異的結合は標的細胞の損失を表し、これは場合により著しい。特別な例としては、骨髄分離に関連して骨髄から癌細胞をパージする際に、骨髄中の幹細胞分画の部分を除去することが挙げられる。この場合、免疫磁性パージにより癌細胞が洗浄除去された骨髄は患者に再注射される。移植の成功は、再注入される骨髄中に活性な幹細胞が充分な数で存在することに依存する。従って、癌細胞を枯渇させる工程中に、磁性粒子への幹細胞の非-特異的結合が高いことは、望ましくない。３．標的細菌の免疫磁性単離において、単離された細菌またはウイルスに細胞および非-標的細菌が夾雑する場合。単離された細菌中に夾雑物が存在すると、単離された標的細菌の次の決定を複雑にすることがある。下記の非限定的な実施例を参照して、以下に本発明をより詳細に説明する。実施例粒子が細胞に非-特異的に結合するのを減少させるための異なる物質および方法の効果は、異なった手段で実証することができる。異なる方法で得られた様々な粒子表面への細胞の非-特異的結合の結果を、下記に示す。実施例１磁性粒子への細胞結合の直接測定による細胞の非-特異的結合磁性粒子への細胞の非-特異的結合に対するブロッキング剤の効果を、簡単ではあるが一定した手段で実証するために使用できる直接的方法は、所定の条件下で磁石により移動させたときに、多数の所定の磁性ビーズと共に輸送されるほどに強くビーズに結合した細胞を測定することに基づいている。この操作は、下記のように行った。バッフィコートの勾配遠心分離により得られ、20ｘ10⁶細胞／１ml を含む単核細胞の懸濁液を、３粒子／細胞に相当する量の磁性粒子と共にインキュベートした。穏やかに回転しながら４℃で 30分間インキュベートした後、粒子および細胞を含む試験管を、PBS 緩衝液 pH 7.4 で 10 倍に希釈し、細胞が結合した粒子を磁石で懸濁液から分離した。アクリジンオレンジおよびエチジウムブロマイドで着色した後、ビーズに結合した細胞数を、Burker 血球計を用い蛍光顕微鏡で評価した。粒子に結合した細胞の数は、懸濁液中の全細胞の％として表した。期待したとおり、ビーズに結合した細胞の絶対数は細胞懸濁液ごとに変化したが、異なる粒子表面上に細胞が非-特異的に結合した相対値はかなり一定しており、全ての場合に、細胞の非-特異的結合の防止において最も効果的なブロッキング剤として、カゼインが明らかに好ましいことを示した。カゼインは、予め BSA で被覆した粒子の改良にも応用された。この場合、予め BSA で処理した粒子の後処理剤としてカゼインを用いた。この処理の効力は、上記のように評価した。実施例１に記載した方法により細胞の非-特異的結合について調査したビーズの種類は、下記のとおりであった。ａ．M-450 粒子（DYNAL AS）幾つかの論文（例えば J．Ugelstand et al.，Progress of Polymer Sience， 87-161，1992）に記載されているこれらの粒子は、エポキシ樹脂で被覆されており、かつ中程度の親水性表面を有する磁性粒子である。これらの粒子は、そのままで、BSA およびカゼインでの処理後の両方において、細胞の物理的吸着を直接測定するために使用した。短時間の実験（タンパク質を１時間結合させた後、細胞の非-特異的結合の測定値を得た）において、細胞付加の測定は、タンパク質が物理的に吸着された粒子上で行われると考えることができる。細胞付着を測定する前に、粒子をタンパク質で１日間またはそれ以上処理した場合の結果は、共有結合したタンパク質で被覆された粒子に細胞が吸着した場合と考えることができる。ｂ．表面に BSA が共有結合している粒子これらの粒子は、M-450 粒子を、0.1 % の BSA を含む BSA 溶液と共に室温で 20 時間インキュベートすることにより調製した。これらの粒子への細胞の非- 特異的吸着は、直接に、あるいは 0.1 % カゼイン溶液を用いて pH 7.4 で粒子を４℃で１時間処理した後に、測定した。項目 a）に挙げた手順とは異なり、この場合の粒子は、カゼインを添加する前に化学的に結合した BSA で常に被覆されていたので、測定値は、BSA で被覆された粒子への細胞の非-特異的結合の減少に対するカゼインの効果を示す。ｃ．表面にフェニル基が結合している粒子比較的高い疎水性表面を有する種類の支持体を代表として意図したこれらの粒子は、次のように調製した。遊離のエポキシ基を担持した Dynabeads M450、4.5μmの磁化可能なビーズ（D ynal AS，Oslo，Norway）(10 g)を、ビス-(3-アミノプロピル)アミン(100 g)と 70℃で５時間反応させ、ビーズ上に表面 -NH₂基を与えた。次いでビーズをジグライム（ジエチレングリコールジメチルエーテル）500 mlで７回洗浄した。次いでビーズ（10 g）をグリシジルメタクリレート(200 g)と 70℃で 20 時間反応させ、表面ビニル基を与えた。ビーズをアセトン 500ml で７回洗浄した後、ビーズ 10ｇを、アクリル酸 50ｇ、およびイソプロパノール 300ｇ中に分散させた A IBN（アゾビスイソブチロニトリル）２ｇと 70℃で 20 時間反応させると、共重合して表面 -COOH 基が形成された。この -COOH ビーズ（0.5 g）をジグライム 7.5 ml 中に分散させ、ジグライム 7.5 ml 中の 2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)（0.5 g）の溶液を加えた。20℃で 10 分間攪拌した後、アニリン 1ml を加え、この懸濁液を 30℃で 16 時間攪拌した。次いでビーズをジグライム 50 ml で５回、メタノール 50 ml で１回、蒸留水 50 ml で少なくとも３回洗浄した。これらの粒子への非-特異的細胞付着は、前記のように測定した。細胞の非-特異的付着は、タンパク質溶液でビーズを前処理した場合について、種々のタンパク質濃度および種々のインキュベーション時間で測定した。ｄ．表面上にボロン酸基を有する粒子これらの粒子は、国際特許出願 No．PCT/GB94/00473 に記載された手順に従って調製した。前記の COOH ビーズ（5 g）を、100 ml の 0.1 M 燐酸塩緩衝液 pH 7.3 で１回洗浄した。次いでビーズを同じ緩衝液 50 ml 中に再分散させ、0.1 M 燐酸塩緩衝液(50 ml)中の 3-アミノフェニルボロン酸(3 g)の溶液を加えた。0 .1 M 燐酸塩緩衝液 pH 7.3（100 ml）中の L-エチル-3-(3-アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)（3 g）および N-ヒドロキシスルホサクシンイミドのナトリウム塩(0.5 g)の溶液を、10℃で攪拌下に滴下した(20 ml/min)。さらに５分間攪拌した後、温度を 20℃に高め、粒子懸濁液を 20℃で 20 時間攪拌した。次いでビーズを洗浄した。150 ml の 0.1 M 燐酸塩緩衝液 pH 7.3 で２回、150 ml の 1 M NaCl で２回、150 ml の0.1 M 炭酸塩緩衝液 pH 10.5 で２回、各洗浄は攪拌下に１時間。最後にビーズを蒸留水 200 ml で３回洗浄した。異なるタンパク質で処理した後、粒子への細胞の非-特異的付着の測定は、前記の a、b、c および d の粒子について記載したのと同様に行った。ｅ．グルタルアルデヒドを用いて表面に BSA またはカゼインがカップリングされている粒子次のようにして、グルタルアルデヒドを用いて磁性ビーズ表面に BSA またはカゼインを結合させた。M450 ビーズ（100 ml）を、0.1 % の BSA または0.1 % のカゼインの何れか一方を含む 2 ml の PBS 緩衝液 pH 7.4 中に分散させ、20 ℃で 20 時間インキュベートした。次いで粒子を磁石で単離して洗浄した後、0. 1 M 燐酸塩緩衝液 pH 7.7 中のグルタルアルデヒド溶液（0.5 M）2 ml を加えた。この反応を 20℃で 20 時間行った。単離して洗浄した後、0.1 % の BSA または 0.1 % のカゼインの何れか一方を含む 2 ml の PBS 緩衝液 pH 7.4 を加えた。20℃で 20 時間インキュベートした後、ビーズを再び単離して洗浄した。次いで、アルデヒド基をヒドロキシ基に変換するために、ビーズを、0.1 M NaBH₄を含む PBS 緩衝液 pH 7.4（2 ml）中で 20℃にて４時間インキュベートした。次いでビーズを蒸留水 2 mlで６回洗浄した。これらの粒子はまた、疎水性表面を有する磁性粒子に予め結合された BSA またはカゼインを架橋させることにより直接に調製することができた。ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅに記載した粒子への細胞の非-特異的結合の測定結果を表Ｉに示す。表Ｉは、細胞の非-特異的結合の減少におけるカゼインの利点が、BSA と比較して、表面にボロン酸がカップリングされた粒子の場合に最も卓越していることを示している。また、表Ｉ中の a）粒子と b）粒子との比較は、より親水性の表面の場合よりも疎水性表面の場合に、カゼインの利点がさらに卓越していることを示している。ブロッキング剤としてカゼインを使用することにより、疎水性の c）粒子（フェニル基を有する粒子）の非-特異的結合を減少でき、これらが、BSA で処理された、よりいっそう親水性の M450 粒子で得られるよりも、細胞付着を受けにくくすることは、注目すべきである。実施例２粒子から脱着した細胞分画における無関係な細胞での標的細胞の汚染から評価した、細胞をポジティブ選択する場合の非-特異的結合ポジティブ細胞分離後に遊離化された標的細胞中の非-特異的細胞を測定するために用いた粒子は、表面にボロン酸が共有結合している粒子であった。ポジティブ細胞分離に用いるこれらのボロン酸粒子は、細胞の非-特異的付着の直接測定に用いたボロン酸粒子について実施例１に記載したのと同様にして調製した。これらの粒子を用いた細胞のポジティブ分離は、今までのところ、T4 細胞、T8 細胞、Ｂ細胞および単球について行った。単離した細胞から粒子を除去した後に得られた細胞分画中での細胞の非-特異的結合の防止、およびこれによる標的細胞の汚染の防止に対するカゼインの効果を、BSA の効果と比較して、T4 細胞の場合について詳細に説明する。前記の他の細胞のポジティブ単離により、同様の結果が得られた。"Bor- 粒子" への抗-CD4 抗体のカップリング前記のように調製した "Bor-粒子" を抗-IgG1、抗-CD4 モノクローナル抗体、 ST4（Biosys，Compiegne，France）と共にインキュベートした。粒子（10mg/ml ）のインキュベーションは、抗体（100 μg/ml）と共に PBS 緩衝液 pH 7.4 中で４℃にて１時間行った。次いで粒子を磁石で単離した後、PBS 緩衝液で１回洗浄した。次いで 0.1 % のカゼインまたは 0.1 % の BSA の何れか一方を含む PBS 緩衝液 pH 7.4 中で粒子を４℃で１時間インキュベートした後、使用直前に、同じ PBS 緩衝液で４℃にて２回洗浄した。細胞懸濁液の調製血小板-枯渇バッフィートから Lymphoprep（Nycomed Pharma AS，Oslo，Norwa y）により末梢血単核細胞（PBMC）を単離し、0.6 % のクエン酸ナトリウムを含む PBS 緩衝液 pH 7.4 で４回洗浄した。次いでこの PBMC 懸濁液を CD14 に対するモノクローナル抗体で被覆されたDy nabeads M450（５〜10 粒子／標的細胞）（Dynal AS，Oslo，Norway）と共にインキュベートした。粒子濃度は少なくとも 20 x 10⁶ビーズ/ml であった。インキュベーションは、2 % のウシ胎児血清を含む PBS 緩衝液 pH 7.4 中で４℃にて 30 分間行った。次いで磁性粒子を、これにより単球を磁石で除去し、単球を枯渇した PBMC を集めた。T4 細胞の単離抗-CD4 抗体で被覆されたボロン酸粒子を、単球を枯渇した PBMC と共にインキュベートした。粒子の数を 10〜20 粒子／標的細胞に調節し、さらに粒子濃度を 25 x 10⁶ビーズ/ml に保持した。インキュベーションは 0.1 % のカゼインまたは 0.1 % の BSA の何れか一方を含む PBS 緩衝液 pH 7.4 中で４℃にて 30 分間行った。インキュベーションの後、懸濁液をインキュベーション緩衝液で 1 0 倍に希釈した。次いで粒子に結合した標的細胞および過剰の粒子を、外部磁石を用いて磁性凝集により単離した。単離された細胞を、0.1 % のカゼインまたは 0.1 % の BSA の何れか一方を含む PBS 緩衝液 pH 7.4 中に再懸濁させ、磁性粒子に結合した細胞を再び磁石を用いて単離した。単離と再懸濁のこの工程を４回繰り返した。ビーズの脱着細胞からビーズを脱着させるために、単離された細胞を、50 % のウシ胎児血清、0.3 % のクエン酸ナトリウムおよび 0.2 M のソルビトールを含むPBS 緩衝液 pH 7.4 中に 20℃で再懸濁させた。次いで細胞が入った試験管を Rock and R oller（Labinco，Breda，The Netherlands）の上に２時間置いた。次いで粒子を磁石で除去した。この工程により 80〜90 % の細胞がビーズから脱着された。収率を向上させるために、ビーズを脱着緩衝液中に再懸濁させ、懸濁液をピペットで 10 回処理した。再び磁石を用いてビーズを除去し、細胞を集め、最初の段階からの細胞懸濁液に加えた。細胞の計数異なる細胞分画中の細胞の数を、Coulter Multisiser II（Coulter Electroni cs Ltd.，Luton，England）を用いて決定した。流動血球計算発蛍色素が接合された CD3、CD4、CD8、CD19 および CD56 に対する抗体(Bect on Dickinson，Mountain View，Clifornia，USA)を下記の三つの細胞分画：単球を枯渇した PBMC、T4 細胞の単離後に残った細胞分画、および磁性ビーズを除去した単離細胞からの分画と共にインキュベートした。FACScan流動血球計数装置（Becton Dickinson）を用いて細胞を分析した。ブロッキング剤の有効性は、細胞を単離し磁性粒子を除去した後に遊離化された細胞中の非-標的細胞汚染を測定することにより決定した。結果：細胞懸濁液から単離された標的細胞の数は、ブロッキング剤としてのBSA およびカゼインで実際上同じであった。ブロッキング剤としての BSA では、ビーズから遊離化した細胞分画は 85 % の標的細胞（T4 細胞）を含んでいた。汚染は主にＢ細胞であり、単離された細胞の 13 % に達した。ブロッキング剤としてのカゼインでは、遊離化した細胞分画は 98 % の T4 細胞を含んでいた。実施例３ブロッキング剤として BSA またはカゼインを用いた細胞懸濁液からの標的細胞の除去細胞を単離する全ての場合に、標的細胞に加えて少量の非-標的細胞が細胞懸濁液から除去される。標的細胞を単離する間に両方の磁性粒子が過剰に除去されるだけでなく、粒子と標的細胞との凝集物として除去される場合は、同じ表面処理を行ったが粒子上に無関係な抗体を有する場合よりも認めうるほど多量の非- 標的細胞が同時に除去される。すなわち、標的細胞がビーズと一緒に単離されるということは、非-標的細胞が非-特異的に結合する傾向が、ビーズ単独の場合よりも高いことを明確に意味する。標的細胞の除去は、異なる粒子を用い、モノクローナル抗体に対して異なるカップリング方法を用い、かつブロッキング剤として BSA またはカゼインを用いて行った。M-450 ビーズの場合、ビーズを先ずモノクローナル抗体 ST4 と共に 20℃で 20 時間インキュベートした。次いで粒子を 0.1 % の BSA または 0.1 % のカゼインと共にさらに 20 時間インキュベートした。BSA で被覆された粒子およびカゼインで被覆された粒子の両者を、実施例２に記載したのと同じ型の細胞懸濁液からT4 細胞を除去するために使用した。BSA を有するビーズおよびカゼインを有する粒子の両者は、細胞懸濁液から 9 5 % 以上の標的細胞を除去することができた。細胞の非-特異的結合は、T4 細胞を除去する前および T4 細胞を除去した後の細胞懸濁液中の非-標的細胞を、前記の流動血球計数法を用いて決定して評価した。この場合もまた、細胞の非-特異的結合において BSA 被覆ビーズとカゼイン被覆ビーズとの間で明らかな相違があり、後者は、非-標的細胞の非-特異的結合を減少させるのに明らかに好ましい。後続の抗体結合のために塩化スルホニルで活性化したビーズについても同様の手法を用いた。この場合にもまた、BSA をカゼインで置き換えると、著しく減少した非-特異的な細胞の除去が観察された。 BSA またはカゼインで被覆した粒子をグルタルアルデヒトで架橋した場合、過剰のアルデヒド基を用いて IgG モノクローナル抗体をビーズにカップリングさせたのち、シッフ塩基および残留アルデヒド基を減少させるために、システムを水素化硼素ナトリウムで処理した。BSA 被覆およびカゼイン被覆の両方の粒子は、標的細胞の除去に有効であった。ここでもまた、カゼイン被覆粒子は標的細胞と一緒に非-標的細胞を除去する傾向が低かった。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Cell separation The present invention blocks non-specific binding of cells in selective cell isolation techniques On how to do it. Isolation and selection of cells and other viable entities, such as viruses Alternative isolation is well-known in medicine and biochemistry and related fields from a preparation standpoint. And of particular and increasing importance both as research tools. Represents the region to be used. That is, for example, cell separation is the removal of malignant cells from bone marrow. ) Or to obtain a purified population of a particular cell type, eg, revert Or subsequent research or manipulation, for example by culture or insertion of genetic material. This is a necessary step for Cell separation can also include, for example, bacterial or Disease and infection by isolating pathogenic cells such as live animals or viruses In diagnosing bacteria, and also, for example, bacterial contamination or other pathogenic agents in food and wastewater Often used in monitoring quality contamination. Therefore cell separation is of many importance Treatment and research, diagnosis, blood and tissue typing of critical diseases, It is related to food and environmental safety. Many methods for separating cells are known. Recently, these methods have Using an affinity binding system, i.e., the cells to be separated and some form of support A pair of binding partners that bind separately to the carrier (which Which allows cells to be selectively removed from their surroundings). It is based on the selective capture of desired cells. This is generally the case for specific binding Achieved using antibodies that recognize antigens on the cell surface as partners, more recently Is achieved using magnetic beads as a support, which binds cells by magnetic aggregation. Separation (so-called "immunomagnetic separation"). Cell and virus selection Affinity-capture matrix for selective separation, and especially magnetic beads The use of lysates is widely described in the literature (for a review, see for example Ugels tad et al., Progress of Polymer Sience, 17 (1), 87- 161, 1992; and Olsvik et al., Clinical Microbiology Reviews, 43-54, J. anuary 1994). The problem with this form of separation is that unwanted cells bind non-specifically to the support The desired target cells that bind to the support by the target-specific binding partner As well as other unwanted cells that bind non-specifically to the surface of the support Will do. The degree of non-specific binding depends on the cells used, the support and the It depends on the nature of the affinity binding system, but in general this is a solid phase All systems based on affinity capture, and especially with immunomagnetic separation It is a title. This may be, for example, in bone marrow purging or typing, If it is important to isolate only the desired cells, it may have serious consequences. And may, for example, confuse the results of the diagnostic system. Supports bovine blood to block sites where non-specific binding of cells may occur. Pretreatment with clear albumin (BSA) allows non-specific binding of cells to the support Attempts have been made to reduce this. Similar effects include inactive immunoglobulins, That is, it can be achieved using a non-target specific immunoglobulin. However, this The reduction in non-specific binding that can be achieved using methods such as In some cases this is not enough to alleviate this problem. Therefore, selective cell capture matrices Improved method for blocking such non-specific binding of cells to cells There is a request for The present invention seeks to provide such a method. That is, the present inventors, milk proteins such as casein as a blocking agent Can dramatically reduce such non-specific cell binding And found that in many cases it can be completely prevented. Casein used to be tan For the treatment of solid surfaces, e.g. polystyrene, to prevent physical adsorption of protein Have been used. Such utility is most notable when the plates are treated with casein solution. Immunoassay techniques such as ELISA that block upon exposure to (eg, Vogt et al., J. Immunol. Methods.101, 43-50, 1987). Applications such as Western blotting and Southern blotting The use in siting is also described (eg, Johnson et al., Gene Anal. Techn.1, 3-8, 1984). However, cells are non-specific for solid supports It has previously been suggested that casein would be effective in preventing It was not planned. Thus, the present invention provides, in its most general sense, solid phase selective cell-capture matrices. Uses milk protein to prevent cells from non-specifically binding to Rix Provide a way to In another aspect, the present invention also provides a solid phase selective cell-capture matrix. A solid phase selective cell-capture matrix, including the addition of milk protein to A method is provided for preventing cells from binding non-specifically. Generally speaking, a solid phase selective capture matrix is a target-specific binding partner. A solid support suitable for selectively separating target cells by The support may carry a target-specific binding partner. As mentioned above, such blocking can result in non-specific binding of unwanted cells. Is especially important for selectively isolating cells from mixtures that can be problematic . Thus, according to another aspect, the present invention provides a method for adding non-targeted milk proteins. Target-specific binding part, characterized by blocking non-specific binding of cells The target cells are selectively bound to the solid support by the enhancer, and the cells bound to the support are Selectively isolating target cells from a sample, including separating cells from the sample Provide a way to As used herein, the term "cell" refers to prokaryotic, eukaryotic and other living cells. Possible entities, such as viruses and mycoplasma, and subcellular components, For example, it is used to include all of the intracellular organs. Therefore, a typical "cell" Include mammalian and non-mammalian cells, plant cells, protoplasts, and cells. All forms of fungi, protozoa and viruses are included. As used herein, the term "blocking" refers to the reduction of non-specific binding described above. Includes both low and prevention. As described above, the non-specific The reduction in dynamic binding is much higher than expected, with BSA and other proteins Significantly better than that obtained with the In fact, the BSA already Treated solid support with milk protein compared to support treated with BSA alone As a result, a significant reduction in non-specific binding occurs. Milk protein is used to block non-specific adsorption in immunoassays May be any milk protein described in the known literature, such as casein , Whey protein concentrate, nonfat dry milk and skim milk. This Any of these milk proteins can be used alone or in combination. casein It is convenient to select. Derivatives of milk proteins, such as partial hydrolysates or Crosslinked proteins are also included. Solid supports are known supports or widely used for immobilization, separation, etc. Or any of the proposed matrices. These can be particles, sheets, gels, filters, membranes, or microtiters. It can take the form of a lip, tube or plate, etc. It can be made conveniently. Particulate materials, such as beads, especially polymer beads, have a binding capacity. Generally preferred for large, a wide variety of which are known in the art . Magnetic beads are preferred to aid manipulation and separation. Used here The term "magnetism" means that when a support is placed in a magnetic field, Can have a moment and thus be eliminated (moved) under the action of its magnetic field Means that. In other words, the support composed of magnetic particles is easily formed by magnetic aggregation. Can be removed. Such magnetic particles are ultra-fine to prevent remanence and thus agglomeration. It is preferably paramagnetic and simply singly to provide uniform kinetics and separation. Advantageously, it is dispersed. Sintef produces EP-paramagnetic monodisperse particles. A-106873. Sold as DYNABEADS from Dynal AS (Oslo, Norway) Monodisperse polymer superparamagnetic beads sold are used or modified according to the present invention. Examples of commercially available magnetic particles that can be used. Such non-specific binding of cells to the support occurs by physical adsorption of the cells. All types of solid surfaces that can be used for cell separation techniques, especially hydrophilic surfaces and This has been observed in polymer supports containing both hydrophobic surfaces, All such supports are included within the scope of the present invention. However, the problem is hydrophobic There have been some reports that sexual supports can be exacerbated. For many reasons, sparse Aqueous surfaces are suitable for coupling specific binding partners, such as antibodies. (Or at least the surface should be hydrophobic during the coupling reaction) preferable). The reason for this is that the antibody is bound to the support by chemical coupling The reaction is sometimes slow. Antibodies automatically and high on the support surface Each binding can result in a very large increase in antibody concentration at the reaction site. , Which results in faster chemical coupling rates. Therefore, relatively hydrophobic The use of a unique surface effectively blocks cells from non-specifically adhering to the support surface. The need to lock becomes stronger. As mentioned above, the benefits of milk proteins in preventing non-specific binding of cells include: Clear and unquestionable, but rather on all types of support surfaces, including hydrophilic surfaces This is especially true on hydrophobic surfaces where casein When BSA is used in an optimal amount, it is significantly better than BSA. Target-specific binding partners can recognize and bind to target particles It can be of any classification, and is conveniently used for separation and immobilization techniques. Any binding partner as used can be included. In this sense, A binding partner is a single entity that can selectively bind to both target cells and supports. A component that can include the body or that can selectively bind to a target cell at one end And a series of entities comprising a component that binds to the support at the other end. it can. In the simplest case, such a series is the first binding that recognizes the target cell A partner and a second binding part binding to the first binding partner and the support Can be included. Typically, the binding partner is a cell, viral particle Includes antibodies or antibody fragments that recognize antigens on surfaces such as offspring. Antibodies are It can be noclonal, polyclonal or chimeric, retaining binding activity Fragment form, for example F (ab)_Two, Fab or Fv fragment (Fv fragment) Fragment is defined as the "variable" region of an antibody that contains the antigen-binding site). Can be used. Alternative binding partners include proteins such as avidin , Lectins, or receptors on the cell surface Ligands that match. Particles that are desired to be separated, and particles that are desired to be separated therefrom Depending on the environment, the binding partner may be a surface epitope specific for the particle, e.g. To selectively recognize surface antigens expressed only by specific cell types Or binding partners are those with more general reactivity, For example, it may be able to recognize a certain range of cells. Due to their selectivity and ready availability, antibodies and their fragments In particular, IgG and IgM antibodies are generally preferred binding partners. Mo Noclonal antibodies can readily provide the desired target specificity. So, like this Antibodies or their fragments are directly attached to a support for binding to target cells. Or these can be coupled to a series of binding partners. In part, it can be coupled indirectly as described above. Conveniently States that such indirect coupling may be via a second antibody, The body is itself bound to the support, and at some site, for example, the Fc portion. Binds to the target-specific primary antibody, which allows the primary antibody to freely bind to the target Keep it. Instead, such a second antibody is replaced by an immunoglobulin-binding protein. It can be replaced with protein, for example, protein A. The support is a functional group, For example, they may carry hydroxyl, carboxyl or amino groups. These groups allow covalent attachment of the antibody, or of a ligand suitable for binding the antibody. As will be appreciated, it can be activated in a well-known manner. Examples of suitable ligands include Gin or streptavidin, which is biotin-treated target-specific Coupling directly to the support for continued binding at the binding partner Can be The support may also carry groups such as epoxy or aldehyde groups. In this case, a covalent cup between the antibody or ligand and the support There is no need to activate to establish a ring. Many cell-specific antibodies are known and are commercially available. Many like this Antibodies and their source are in Linccott's Directory (40 Glen Drive, Mill Vall ey, California, USA). Such anti Representative examples of the body include the following. Human multi-performance precursor Antibodies against the body B1-3C5, Sera Lab Ltd, Sussex, UK. Available from; human dendritic Antibody to cells BU10, available from Binding Site Ltd, Birmingham, UK; G Antibodies to HLA DR and DR histocompatibility antigens B721 and L243, Becton Available from Dickinson Immunocytometry Systems, CA, USA; Mitochondria Antibody to MAB1273, available from Paesel GmbH, Frankfurt, Germany; Jida Albicans (Candida albicans) Antibody against CA14-50, Chemunex S.A , Available from Maisons Alfort, France; against hepatitis B virus core antigen Antibody HBC170-4, available from Biosoft, Paris, France; Staphylococcus aureus (Stap hylococcus aureus 4D2, Biodesign Inc. Available from Main, USA Noh. As a further example, the majority of antibodies are specific markers expressed on cells of the hepatogenic lineage. Available for cars (eg Dako, a CD anti-available from Copenhagen) See range of antibodies to the original). In addition, anti-CD34 useful for selection of early hepatogenic cells Antibodies 12.8 and B1-3C5 are available from Biosys S.A, France. The literature also describes a number of antibodies, including bacteria, protozoa and viruses. include. That is, for example, E. coli (E.Coli) For K88 (F4) tufted antigen Lund et al. Clin. Micobiol.26: 2572-2575 Skjerve and Olsvik are Salmonella spp.Salmonella) For immunomagnetic separation Using commercially available polyclonal goat IgG (J. Fod Microbiol.14: 11-18, 198 9); Serum-group specific monoclonal antibodies against Salmonella sp. oatmodo et al. (Eur. J. Clin, Microbiol. Infect. Dis. 10: 935-938, 1991); Skjerve et al. Is Listeria monocytogenes (Listeria Monocytogenes ) Are described (Appl. Environ. M). icrobiol.56: 3478-3481); Morgan et al reported that Pseudomonas putida (Pseudom onas putida ) Are described (Appl. Environ. Mic. robiol.67: 503-509, 1991); CD4 useful for detecting HIV-infected CD4 cells Antibodies to the antigen are described by Brinkmann et al (J. virol.65: 2019-2023 , 1991). Alternatively, polyclonal and monoclonal antibodies having the desired specificity Can be obtained using standard techniques. By selecting a binding partner, the desired or unwanted particles are bound To achieve positive or negative selection For example, to isolate the desired cell population or to remove unwanted particles from the system. Can be purged from the system. The method of the invention may be used, for example, for blood, plasma, From body fluids or clinical samples, or from cell cultures or other biological media or Is particularly useful for positive selection of various desired cell populations from artificial media, etc. Was found to be useful. Binding partners, such as antibodies and fragments thereof, are bound to a support Many methods are known for providing an affinity capture matrix. And are widely described in the literature. The support can be provided with a range of functional groups By activating these groups, the activated groups are replaced with amino groups or SH groups in the antibody. The reaction can provide a covalent bond between the support and the antibody. The antibody so bound may be a target-specific antibody as described above, Alternatively, it may be a second antibody that binds to the target-specific first antibody. The most ordinary An example of the method is as follows: -CH_TwoSulfonyl chloride on a support containing -OH groups Activated to couple the antibody to give the sulfonyl ester on the support. And then react it with an amino or -SH group on the antibody to give -CH_Two-N H-bond and -CH_TwoA covalently coupled antibody having a -S- bond is provided. 2. This carboxyl group is attached to a carbodiimide and N- Activation with droxysulfosuccinimide couples the antibody, which An amide bond is formed between the support and the antibody. 3. Active in glutaraldehyde The antibody is coupled to a support containing a functionalized amino group, and To form a covalent bond with the amino group of the antibody. 4. To a support containing epoxy groups The coupling of the antibody is such that the epoxy group is directly linked to the amino and -SH groups on the antibody. The reaction is performed without further activation. For binding a binding partner to the above magnetic beads or other support A range of functional groups (eg, hydroxyl, carboxyl, aldehyde , An epoxy group or an amino group) or, for example, a surface coating. Thus, a desired functional group can be introduced by modification with a coating. US-A-4654267, 4336173 and 4459378 provide an overview of many of these surface coatings. It is listed. Binding of the target cells to the support can be performed in a number of steps. For example, All reagents, including the specific binding partner, are stepwise bound to the support, Can be brought into contact with the sample containing the target cells. Alternatively, target cells Before exposing the population to the appropriate insoluble support in another step, the specific binding partner , For example, with a monoclonal antibody. Therefore, the connection is different The parts are marked before contacting to join, especially in the case of complex indirect connections. Target cell and the support. One preferred method is to use antibodies or other target-specific features prior to contacting the target cells. Binding the heterologous binding partner to the support. Alternatively, the antibody (target- (As a specific binding partner) can be bound to target cells in the first step. Wear. In another step, a second antibody capable of binding to the Fc region of the first antibody is bound to a support. And then contact the cells with the support. A particularly advantageous coupling system for selectively binding target cells to a solid support Stem is described in our co-pending International Patent Application No. WO94 / 20858. This This is due to the hydroxyboryl / cysteine between the target-specific binding partner and the solid support. Based on a su-diol linkage. As mentioned above, this connection creates a series of entities. A first target that recognizes a cell. A specific binding partner, or a second binding partner that binds this first partner One of them is bound to the support in this way. That is, the first antibody or The second antibody may be subject to a hydroxyboryl / cis-diol linkage. The hydroxyboryl-based system uses a cup link and subsequent IgM antibody Has been found to be particularly effective in the liberation of Hydroxyboryl / cis IgM binding partner coupled to support via -diol linkage Is a preferred aspect of the present invention. We have surprisingly found that the binding partner is based on hydroxyboryl-based binding. When coupling, the preferred orientation of the binding partner on the support And found that the selective binding was not impaired. This continues Makes the binding of target cells to the support extremely effective and reliable . Addition of hydroxyboryl-based systems, as discussed in more detail below The advantage of this is that, in certain situations, the binding of hydroxyboryl / cis-diol residues Can be reversed under mild conditions, allowing easy and non-destroying It can be separated. However, from the above viewpoint, droxyboryl / cis- The diol ligation method is advantageous, but it can cause non-specific cell binding problems. This problem seems to be particularly noticeable in this method. In particular, B cells and Outstanding non-specific binding of and monocytes was observed. Therefore, such cells do not exist. In some cases, the use of this technique can be severely limited and complicated. Book According to the invention, the use of milk proteins provides a bond based on hydroxyboryl. Especially effective at blocking non-specific cell binding by the resulting solid support. It was found to be. This is a particularly preferred embodiment of the present invention. Support cells after separation, depending on the target cell and application in cell separation techniques It may or may not be desirable to desorb from the body. Ie some For isolation of pure cell fractions, e.g. for clinical use or functional studies While in other cases (eg purging or other negative selection techniques) Need not do so. A wide variety of desorption methods are known in the art, Different methods may be appropriate for different supports. The specific binding partner is an antibody In this case, the DETACHaBEAD system from Dynal AS, Oslo, Norway can be used (for example, Rasmussen et al. J. Immunol. Methods, 146, 195-202, 1992). other Methods for desorption include, for example, competitive displacement reaction using excess free antigen, or thiol Cleavage of disulfide bonds using a reagent such as dithiothreitol. It is. Hydroxyboryl-based linkages are competitive as described in WO 64/20858. Easy by adding compatible cis-diol reagent And can be effectively destroyed. When to add milk protein and how long it is exposed to, or The length of time to incubate together depends on the nature of the support and the binding, and It also depends on whether it is desirable to release the target cells after separation. all In this case, the addition of milk protein will ensure that the binding partner is fully linked to the support. It must be done to make it possible. In addition to preventing non-specific cell binding, Proteins also have the effect of reducing binding of binding partners to the surface . Thus, in general, milk proteins have a binding partner linked to the support or Is added after binding. If the binding partner is a multi-component system, The addition of the antibody generally will bind the support-binding component in the system, such as a second antibody. It is performed after being combined. Certain milk proteins can be added during the binding partner binding step if desired. However, generally speaking, the main part is the binding partner (binding partner component) Is added after binding. Additional protein during the binding partner binding step To facilitate binding partners to bind in the correct orientation Milk protein provides such additional protein Can be used to As explained above, a proteinaceous binding partner, such as an antibody, Has a tendency to create hydrophobic interactions with hydrophobic surfaces that enhance its linkage to You. This may be the case if subsequent desorption is not desired, or for example in a typing reaction. This is advantageous when it is particularly desirable to prevent the binding partner from leaking out of the support. is there. That is, in such a case, it is ensured that a stronger hydrophobic bond is formed. After the coupling reaction, the support is exposed to milk protein for a long time. It may be desirable to prevent In such situations, the support should be The block step of incubating with the substrate is always supported with the binding partner. Without a time limit, sufficient to establish a sufficiently strong bond with the carrier It can be done conveniently. However, the binding partner is later desorbed from the support If necessary, as soon as the binding partner is sufficiently tightly coupled to the support, But too strong hydrophobic between support and binding partner Sexual interaction, which tends to reduce the resulting degree of desorption, is established It may be preferable to do this before doing so. This time depends on the type of support and the binding It varies greatly depending on the type of partner. In principle, the blocking agent is bound It can be added at any time after the partner is firmly bound to the support, Time can vary from 15 minutes to 24 hours or more. As an example, milk protein The blocking agent can be added after 1-4 hours. After adding the blocking agent, the support to which the binding partner is bound Store for any length of time before use, especially if removal of the partner is not desired be able to. At some point, as in the case of selective capture of cells, For systems where it would be desirable to liberate the binding partner, It may be preferable to use the support as soon as possible. because Can alter the structure of the binding partner, which results in non-specific binding This is because there are times when it is done. However, milk proteins are not present on the surface of the support. At 4 ° C. for several weeks due to reduced hydrophobic binding of the binding partner to the support Sufficient release of the binding partner, eg, antibody, from the support, even after storage between be able to. Generally, the support is stored in the presence of a blocking agent and washed immediately before use. Is purified. To remove binding partners that may leak from the support It is desirable to wash it. The temperature and other conditions during the blocking step are not particularly critical, and Room procedures and conditions can be used. The temperature during the blocking step is preferably 4 ° C. It was found to be. The concentration of milk protein used may also vary depending on the situation and choice Can be. For example, a concentration of 0.01-0.1% w / v, more preferably 0.05-0.1% w / v Is preferred. As mentioned above, the method of the present invention comprises whole blood, buffy coat, and Biological or artificial media containing cell suspensions obtained by gradient centrifugation? Can be used to isolate all prokaryotic, eukaryotic, or other viable entities. Wear. The various reagents and materials required to perform the methods of the present invention are conveniently It can be provided in the form of a kit. Therefore, another aspect of the present invention is: (i) a solid support as defined above; (ii) target-specific binding as defined above capable of binding to said support and target cells. Partners; and (iii) milk protein A kit for use in the method of the present invention is provided. The cell separation method of the present invention can be used in many applications, such as bone marrow purging, in allografts. Depletion of normal T cells, for example, isolation of stem cells for reversion, pure purification for functional studies For isolation, tissue typing, and diagnosis of smart cell subpopulations, for example, detection of bacterial pathogens Can be used. Non-specific cell binding can be achieved, for example, by cell separation as described in the context below. This can be a problem in the approach. 1. In the direct positive cell separation step, non-target cells are contaminated with target cells ( Pollution). Such non-target cell contamination, for example, stem cell positive This is a particularly serious problem when the target cells are present at low concentrations, such as in the case of separation. . Typically, the concentration of stem cells is relatively low in the amount of other cells non-specifically bound to the beads. At least this amount is low enough to account for a high percentage based on the isolated stem cells. No. 2. Target cell loss when isolating target cells by negative removal of cells Case. This selective cell separation method is directed against antigens on non-target cells to be removed. All non-target cells are removed from the cell suspension by the support carrying the binding partner It relates to removing vesicles. Non-specific binding of target cells indicates loss of target cells , Which is sometimes significant. A special example is cancer from bone marrow in connection with bone marrow isolation. Purging cells involves removing a portion of the stem cell fraction in the bone marrow . In this case, the bone marrow from which the cancer cells have been washed away by the immunomagnetic purge Is re-injected into the patient. Successful transplantation is due to active stem cells filling the reinjected bone marrow. It depends on being in a fraction. Therefore, during the process of depleting cancer cells, High non-specific binding of stem cells to the particles is undesirable. 3. In immunomagnetic isolation of a target bacterium, the isolated bacterium or virus And when non-target bacteria are contaminated. If contaminants are present in the isolated bacteria, Subsequent determination of isolated target bacteria can be complicated. The invention will now be described in more detail with reference to the following non-limiting examples.Example Different substances and methods to reduce non-specific binding of particles to cells The effect of the law can be demonstrated by different means. The results of non-specific binding of cells to various particle surfaces obtained by different methods are shown below. It shows in the note.Example 1 Non-specific binding of cells by direct measurement of cell binding to magnetic particles The effect of blocking agents on non-specific binding of cells to magnetic particles However, direct methods that can be used to demonstrate by certain means When it is moved by a magnet, it is transported with many predetermined magnetic beads. It is based on measuring cells that bind strongly to the beads. This operation was performed as follows. Obtained by gradient centrifugation of buffy coat, 20 × 10⁶Mononuclear cells containing 1 ml of cells Incubate the cell suspension with 3 particles / cell equivalent of magnetic particles. I was vate. After incubating at 4 ° C for 30 minutes with gentle rotation, The tubes containing cells and cells are diluted 10-fold with PBS buffer pH 7.4 to bind cells. The separated particles were separated from the suspension with a magnet. Acridine orange and ethidium bu After staining with romide, the number of cells bound to the beads was determined by fluorescence using a Burker hemocytometer. It was evaluated under a microscope. The number of cells bound to the particles is expressed as a percentage of the total cells in the suspension. did. As expected, the absolute number of cells bound to the beads varies from cell suspension to cell suspension However, the relative value of non-specific binding of cells on different particle surfaces was fairly constant. In all cases, the most effective block in preventing non-specific binding of cells Casein has been shown to be clearly preferred as a locking agent. Casein has also been applied to improve particles previously coated with BSA. In this case, Casein was used as a post-treatment agent for the particles treated with BSA. The effect of this process is Was evaluated as described above. Beads investigated for non-specific binding of cells by the method described in Example 1 Were as follows. a. M-450 particles (DYNAL AS) Several papers (eg J. Ugelstand et al., Progress of Polymer Sience, 87-161, 1992) are coated with epoxy resin. And magnetic particles having a moderately hydrophilic surface. These particles are Direct physical sorption of cells, both after treatment with BSA and casein Used to measure. Short experiments (after binding proteins for 1 hour, In the measurement of non-specific binding of the cells) Is performed on physically adsorbed particles. Measure cell attachment If the particles were treated with protein for one or more days before It can be considered that cells are adsorbed on particles coated with bound proteins. Wear. b. Particles with BSA covalently bonded to the surface These particles were prepared by combining M-450 particles with a BSA solution containing 0.1% BSA at room temperature. Prepared by incubating for 20 hours. Non-cells into these particles Specific adsorption can be carried out directly or with 0.1% casein solution at pH 7.4. Was measured at 4 ° C. for 1 hour, and then measured. Unlike the procedure described in item a), In all cases, the particles are always coated with chemically bound BSA before adding casein. Measurements were taken to reduce non-specific binding of cells to BSA-coated particles. 7 shows the effect of casein on small amounts. c. Particles with phenyl groups attached to the surface These particles intended to represent a type of support having a relatively high hydrophobic surface The offspring were prepared as follows. Dynabeads M450 carrying free epoxy groups, 4.5 μm magnetizable beads (D ynal AS, Oslo, Norway) (10 g) with bis- (3-aminopropyl) amine (100 g) Reaction at 70 ° C for 5 hours, surface -NH on beads_TwoGave the group. Then jig the beads Washed seven times with 500 ml of lime (diethylene glycol dimethyl ether). Next Reaction of beads (10 g) with glycidyl methacrylate (200 g) at 70 ° C for 20 hours To give surface vinyl groups. After washing the beads 7 times with 500 ml of acetone, A in which 10 g of the powder was dispersed in 50 g of acrylic acid and 300 g of isopropanol. When reacted with 2 g of IBN (azobisisobutyronitrile) at 70 ° C for 20 hours, Together, surface -COOH groups were formed. Diglyme with these -COOH beads (0.5 g) Disperse in 7.5 ml and add 2-ethoxy-1-ethoxycarb in 7.5 ml of diglyme. A solution of nyl-1,2-dihydroquinoline (EEDQ) (0.5 g) was added. Stir at 20 ° C for 10 minutes After stirring, 1 ml of aniline was added and the suspension was stirred at 30 ° C. for 16 hours. Next 5 times with 50 ml of diglyme, 1 time with 50 ml of methanol, 50 ml of distilled water At least three times. Non-specific cell attachment to these particles was measured as described above. Cell non-specific Differential attachment can be attributed to various tampering when beads are pretreated with a protein solution. The concentrations were determined at different concentrations and at different incubation times. d. Particles with boronic acid groups on the surface These particles are described in International Patent Application No. Follow the procedure described in PCT / GB94 / 00473 Prepared. Transfer the COOH beads (5 g) from above to 100 ml of 0.1 M phosphate buffer pH Washed once with 7.3. The beads were then redispersed in 50 ml of the same buffer and A solution of 3-aminophenylboronic acid (3 g) in M phosphate buffer (50 ml) was added. 0 L-Ethyl-3- (3-aminopropyl) carb in .1 M phosphate buffer pH 7.3 (100 ml) Bodiimide hydrochloride (EDC) (3 g) and N-hydroxysulfosuccinimide A solution of thorium salt (0.5 g) was added dropwise at 20 ° C. with stirring (20 ml / min). Another 5 minutes After stirring, the temperature was increased to 20 ° C and the particle suspension was stirred at 20 ° C for 20 hours. Next The beads were washed. 150 ml 0.1 M phosphate buffer pH 7.3 twice with 150 ml Wash twice with 1 M NaCl and twice with 150 ml 0.1 M carbonate buffer, pH 10.5 Is 1 hour under stirring. Finally, the beads were washed three times with 200 ml of distilled water. Different tongue After treatment with the protein, measurement of non-specific attachment of cells to the particles is determined by a, b, c as described above. And d were performed as described for the particles. e. BSA or casein coupled to the surface using glutaraldehyde Particles Use glutaraldehyde to add BSA or Casein was bound. Add 100 ml of M450 beads to 0.1% BSA or 0.1% Disperse in 2 ml of PBS buffer pH 7.4 containing either Incubated for 20 hours at ° C. The particles were then isolated with a magnet and washed, before 2 ml of glutaraldehyde solution (0.5 M) in 1 M phosphate buffer pH 7.7 was added. . The reaction was performed at 20 ° C. for 20 hours. After isolation and washing, 0.1% BSA Is 2 ml of PBS containing either 0.1% casein Buffer pH 7.4 was added. After incubating at 20 ° C for 20 hours, the beads are Isolated and washed. Then, to convert the aldehyde group to a hydroxy group, To 0.1 M NaBH_FourIn PBS buffer pH 7.4 (2 ml) containing Incubated. The beads were then washed six times with 2 ml of distilled water. These particles Also provides BSA or casein pre-bound to magnetic particles with a hydrophobic surface. It could be prepared directly by crosslinking. Measurement results of non-specific binding of cells to particles described in a, b, c, d and e Are shown in Table I. Table I shows that the benefits of casein in reducing non-specific binding of cells The most prominent in the case of boronic acid coupled particles on the surface Is shown. Also, the comparison between a) and b) particles in Table I is more pronounced than for the more hydrophilic surface. Even for hydrophobic surfaces, the benefits of casein show even greater prominence . By using casein as a blocking agent, hydrophobic c) particles ( Non-specific binding of particles with phenyl groups), which are treated with BSA. Less susceptible to cell attachment than can be obtained with a more and more hydrophilic M450 particle It is noteworthy that this is done.Example 2 Assessed from target cell contamination with unrelated cells in the cell fraction detached from the particles Non-specific binding for positive cell selection Measure non-specific cells in target cells released after positive cell separation The particles used for this were particles having a boronic acid covalently bonded to the surface. Posité These boronic acid particles used for live cell separation provide a direct measure of non-specific cell attachment. The boronic acid particles used for the determination were prepared in the same manner as described in Example 1. Positive separation of cells using these particles has so far been performed for T4 cells, T8 cells Performed on cells, B cells and monocytes. After removing particles from isolated cells Prevention of non-specific binding of cells in the resulting cell fraction, and thereby the targeting The effect of casein on the prevention of vesicle contamination was compared to the effect of BSA on T4 cells. The case will be described in detail. Similar isolation by positive isolation of said other cells The result was obtained."Bor- Of Anti-CD4 Antibody to "Particles" The “Bor-particles” prepared as described above were treated with anti-IgG1, anti-CD4 monoclonal antibodies, Incubated with ST4 (Biosys, Compiegne, France). Particles (10mg / ml Incubation is performed in PBS buffer with antibody (100 μg / ml). Performed at pH 7.4 for 1 hour at pH 7.4. The particles are then isolated with a magnet and then buffered in PBS. Washed once with liquid. Then either 0.1% casein or 0.1% BSA After incubating the particles for 1 hour at 4 ° C in PBS buffer pH 7.4 containing Immediately before use, the plate was washed twice with the same PBS buffer at 4 ° C.Preparation of cell suspension Platelet-depleted buffet from Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwa y) to isolate peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and contain 0.6% sodium citrate. Washed four times with PBS buffer pH 7.4. This PBMC suspension was then coated with Dy coated with a monoclonal antibody against CD14. nabeads M450 (5-10 particles / target cell) (Dynal AS, Oslo, Norway) Incubated. Particle concentration at least 20 x 10⁶Beads / ml. Inn The incubation was performed at 4 ° C in PBS buffer pH 7.4 containing 2% fetal calf serum. For 30 minutes. The magnetic particles are then removed, thereby removing the monocytes with a magnet, Collected depleted PBMC.T4 Cell isolation Boronate particles coated with anti-CD4 antibody were injected together with monocyte-depleted PBMCs. Cubbed. Adjust the number of particles to 10-20 particles / target cell, and further increase the particle concentration The 25 x 10⁶It was kept at beads / ml. Incubate with 0.1% casein Or 0.1% BSA in PBS buffer pH 7.4 at 4 ° C. Minutes. After incubation, suspend the suspension with incubation buffer 1 It was diluted 0-fold. The target cells and excess particles bound to the particles are then transferred to an external magnet And isolated by magnetic aggregation. Isolate cells with 0.1% casein or Resuspend in PBS buffer pH 7.4 containing either 0.1% BSA Cells bound to the particles were again isolated using a magnet. This step of isolation and resuspension Repeated times.Desorption of beads To detach the beads from the cells, the isolated cells are transferred to 50% fetal bovine blood. PBS buffer containing 0.3% sodium citrate and 0.2 M sorbitol Resuspended in liquid pH 7.4 at 20 ° C. Then place the test tube containing the cells in Rock and R Placed on oller (Labinco, Breda, The Netherlands) for 2 hours. Then the particles Removed with a magnet. This step detached 80-90% of the cells from the beads. Income Resuspend beads in desorption buffer and pipette suspension to improve efficiency Was processed 10 times. Remove the beads again using a magnet, collect the cells, and Was added to the cell suspension.Cell counting The number of cells in different cell fractions was determined using Coulter Multisiser II (Coulter Electroni cs Ltd., Luton, England).Flow cytometry Antibodies to CD3, CD4, CD8, CD19 and CD56 conjugated with fluorochromes (Bect on Dickinson, Mountain View, California, USA) with the following three cell fractions: monocytes Depleted PBMCs, cell fractions remaining after isolation of T4 cells, and magnetic beads And incubated with fractions from the isolated cells. FACScan flow cytometer Cells were analyzed using (Becton Dickinson). The effectiveness of the blocking agent is released after isolating cells and removing magnetic particles. Determined by measuring the non-target cell contamination in the cells that had died.result : The number of target cells isolated from the cell suspension was determined by BSA as a blocking agent. And casein were practically the same. BSA as a blocking agent The cell fraction released from the strain contained 85% of target cells (T4 cells). Dirty The staining was mainly B cells, reaching 13% of the isolated cells. For casein as a blocking agent, the released cell fraction was 98% T4 Vesicles.Example 3 Target cells from cell suspension using BSA or casein as blocking agent Removal In all cases of cell isolation, a small amount of non-target cells in addition to target cells Removed from the suspension. Excessive removal of both magnetic particles during target cell isolation The same surface treatment if removed as aggregates of particles and target cells. But with appreciably higher amounts of non- The target cells are removed at the same time. That is, the target cells are isolated along with the beads This means that non-target cells tend to bind non-specifically, compared to beads alone. Is clearly higher. Removal of target cells is performed using different particles Use a different coupling method for the local antibody and use it as a blocking agent. Using BSA or casein. For M-450 beads, first remove the beads The plate was incubated with the noclonal antibody ST4 at 20 ° C for 20 hours. Then particles For an additional 20 hours with 0.1% BSA or 0.1% casein. I did it. Perform both BSA-coated and casein-coated particles. Used to remove T4 cells from the same type of cell suspension as described in Example 2. . Both beads with BSA and particles with casein can 5% or more target cells were removed. Non-specific binding of cells to T4 cells Non-target cells in the cell suspension before removal of T4 cells and after removal of T4 cells It was determined and evaluated using the flow cytometry described above. In this case, too, Distinct binding between BSA-coated and casein-coated beads in differential binding The latter is clearly preferred to reduce non-specific binding of non-target cells. No. The same applies to beads activated with sulfonyl chloride for subsequent antibody binding. The method was used. Again, replacing BSA with casein significantly reduced Non-specific cell removal was observed. If particles coated with BSA or casein are crosslinked with glutaraldehyde, excessive The IgG monoclonal antibody is coupled to the beads using excess aldehyde groups. System to reduce Schiff bases and residual aldehyde groups. Treated with sodium borohydride. Both BSA-coated and casein-coated particles And was effective in removing target cells. Again, casein-coated particles are The tendency to remove non-target cells along with was less.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バージ，アーヴィッドノールウェー，エヌ−7034 トロンドハイム，アーリングスクジャルクソンズゲイト 14 (72)発明者プレストヴィック，ヴェンケ，スレタージェルノールウェー，エヌ−7035 トロンドハイム，ジョンスヴァンスファイエン 87シー────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, C H, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB , GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, M K, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO , RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, VN (72) Inventor Barge, Arvid Norway, N. 7034 Toronto High M, Earling Skjalxons Light 14 (72) Inventor Prestvic, Wenke, Slettage Well Norway, N. 7035 Trondhay Mu, John Svans Fayen 87 Sea

Claims

[Claims] 1. Blocks non-specific binding of cells to a solid phase selective cell-capture matrix How to use milk protein for 2. Including adding milk protein to a solid phase selective cell-capture matrix; Solid Phase Selective Cell-Preventing Cells from Non-specifically Binding to a Capture Matrix Law. 3. A solid phase selective cell-capture matrix is labeled by a target-specific binding partner. Claim 1 or Claim 2 which is a solid support suitable for selectively separating target cells. 3. The method according to 2. 4. Add milk protein to block non-specific binding of non-target cells Characterized, target-specific binding partners selectively target cells to solid support And separating the support-bound cells from the sample. A method for selectively isolating a target cell from a target cell. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the milk protein is casein. 6. A method according to any of the preceding claims, wherein the solid or solid support is granular. 7. 7. The solid or solid support according to claim 1, wherein the solid or magnetic support is magnetic. Method. 8. Target-specific binding partners selectively bind to both target cells and supports Or a single entity that can selectively bind to target cells at one end A series of entities that contain active components and components that bind to the support at the other end. The method according to any one of claims 3 to 7. 9. The target-specific binding partner is one or more antibodies or their antibodies. 9. The method according to any of claims 3 to 8, comprising a fragment. 10. The method according to claim 9, wherein the antibody is IgM or a fragment thereof. 11. Target-specific binding partner binds hydroxyboryl / cis-diol linkage The coupling according to any one of claims 3 to 10, wherein the coupling includes a coupling to the support. The method described. 12. The target-specific binding partner carries a cis-diol group, and Via the hydroxyboryl / cis-diol linkage, the hydroxyboryl on the support 12. The method according to any of claims 3 to 11, wherein the method is directly attached to a lyl group. 13. A target-specific binding partner binds to said first target-specific binding partner; Indirectly bound to the support by a binding second binding partner, wherein said second binding partner is The toner has a cis-diol group, and the hydroxyboryl / silicone Attached to the hydroxyboryl group on the support via a di-diol linkage. 12. The method according to any one of 1 to 11. 14． The target-specific binding partner or its support binding component is bound to the support. The milk protein is added to a solid phase or solid support after being added. The method according to any of the above. 15. 15. The milk protein is used at a concentration of 0.01-0.1% w / v. The method according to any one of the above. 16. Further comprising detaching the separated cells from the support. The method according to any one of claims 4 to 15. 17． The target-specific binding partner is a hydroxyboryl / cis-diol linkage Is coupled to the support, and the desorption is performed by using a competitive cis-diol. Adding a reagent to cleave the hydroxyboryl / cis-diol linkage 17. The method of claim 16, wherein the method is achieved by: 18. (i) a solid support as defined in any of the preceding claims; (ii) any of the preceding claims capable of binding to the support and target cells. Target-specific binding partner; and (iii) milk protein A kit for use in the method according to any one of claims 2 to 17, comprising: