JPH10502454A - Screening for NUC inhibitors - Google Patents

Screening for NUC inhibitors

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JPH10502454A
JPH10502454A JP8503950A JP50395095A JPH10502454A JP H10502454 A JPH10502454 A JP H10502454A JP 8503950 A JP8503950 A JP 8503950A JP 50395095 A JP50395095 A JP 50395095A JP H10502454 A JPH10502454 A JP H10502454A
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nuc
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ムケルジー，ランジャン
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Ligand Pharmaceuticals Inc
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＮＵＣタンパク質活性レベルによって影響される疾患および病理学的状態の治療に有用な薬剤をスクリーニングする方法を提供する。これらの薬剤は、ＮＵＣタンパク質によるＰＰＡＲαタンパク質およびＴＲタンパク質転写活性化活性の抑制を低下させまたは軽減する。選択された新規なまたは独特の薬剤を用いて、高脂血症、高コレステロール血症および高リポタンパク血症を治療することができる。 (57) SUMMARY The present invention provides methods of screening for agents useful for treating diseases and pathological conditions affected by NUC protein activity levels. These agents reduce or reduce the suppression of PPARα and TR protein transcriptional activation activity by NUC proteins. The selected new or unique agents can be used to treat hyperlipidemia, hypercholesterolemia and hyperlipoproteinemia.

Description

【発明の詳細な説明】 ＮＵＣ阻害剤のスクリーニング 関連出願のクロスリファレンス 本出願は、マケルジー（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ）による１９９３年１０月２５日 出願の「ヒトペルオキシソーム増殖因子活性受容体」と題する米国特許出願第０ ８／１４３，２１５号明細書に関し、それはマケルジーによる１９９３年１０月 ２２日出願の「ヒトペルオキシソーム増殖因子活性受容体」と題する出願第０８ ／１４１，５００号明細書の一部継続であり；その開示は本明細書中に援用され る。 発明の分野 本発明は、ペルオキシソーム増殖因子活性受容体（ＰＰＡＲ）および甲状腺ホ ルモン受容体（ＴＲ）に関連した分子に対して活性な薬剤のスクリーニングに関 する。本発明は、更に、ｈＮＵＣ１Ｂと称される新規なヒトペルオキシソーム増 殖因子活性受容体のクローニングおよび配列順序決定に関する。 発明の背景 ペルオキシソームは、動物および植物において見出された細胞下小器官である 。ペルオキシソームは、コレステロールおよび脂質代謝並びに呼吸のための酵素 を含む。 ペルオキシソーム増殖因子と称される種々の化学薬剤は、ペルオキシソームの 増殖を引き起こす。ペルオキシソーム増殖因子としては、不飽和脂肪酸、血中脂 肪低下薬（レディ（Ｒｅｄｄｙ），Ｊ．Ｋ．およびアザルノフ（Ａｚａｒｎｏｆ ｆ），Ｄ．Ｌ．（１９８０） Ｎａｔｕｒｅ ２８３，３９７〜３９８）、除草 剤、ロイコトリエンアンタゴニストおよび可塑剤（総説については、グリーン（ Ｇｒｅｅｎ），Ｓ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３：３９３〜４ ００，１９９２年を参照されたい）がある。クロフィブレートなどの血中脂肪低 下薬は、血漿中のトリグリセリドおよびコレステロール濃度を低下させ、しかも 高濃度のコレステロールを有する個体での虚血性心臓疾患の予防に有益である ことが分かっている（ハヴル（Ｈａｖｅｌ），Ｒ．Ｊ．およびケイン（Ｋａｎｅ ），Ｊ．Ｐ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃ．１３：２８７〜３０８，１９ ７３年）。しかしながら、このような薬物の治療的使用は、クロフィブレートが ラットにおいて発癌物質であるので疑問である。 ペルオキシソーム増殖には二つの仮説がある。「脂質過負荷仮説」は、脂肪酸 の細胞内濃度の増加が、ペルオキシソーム増殖のための主要な刺激であることを 示唆している（ネッスル（Ｎｅｓｔｌｅ），Ｐ．Ｊ．（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅ ｖ．Ｎｕｔｒ．１０ ，１４９〜１６７、並びにフィリプソン（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｏｎ），Ｂ．Ｅ．、ロスロック（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ），Ｄ．Ｗ．、コナー（Ｃｏ ｎｎｏｒ），Ｗ．Ｅ．、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ），Ｗ．Ｓ．およびイリングワー ス（Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ），Ｄ．Ｒ．（１９８５）Ｎ．Ｅｎｇｌｄ．Ｊ．Ｍ ｅｄ．３１２ ，１２１０〜１２１６）。もう一つの仮説は、受容体に媒介された 機序を仮定している。ペルオキシソーム増殖因子活性受容体（ＰＰＡＲ）は、様 々な種から単離され且つクローン化されている（イスマン（Ｉｓｓｅｍａｎ）， Ｉ．およびグリーン，Ｓ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４７，６４５〜６５０ ；ドレイア（Ｄｒｅｙｅｒ），Ｃ．、クレイ（Ｋｒｅｙ），Ｇ．、ハンスヨルグ （Ｈａｎｓｊｏｒｇ），Ｋ．、ギベル（Ｇｉｖｅｌ），Ｆ．、ヘルフテンバイン （Ｈｅｌｆｔｅｎｂｅｉｎ），Ｇ．およびワーリ（Ｗａｈｌｉ），Ｗ．（１９９ ２）Ｃｅｌｌ ６８，８７９〜８８７；ゴットリヒャー（Ｇｏｔｔｌｉｃｈｅｒ ），Ｍ．、ウィドマー（Ｗｉｄｍｅｒ），Ｅ．、リー（Ｌｉ），Ｑ．およびグス タフソン（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ），Ｊ．Ａ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９ ，４６５３〜４６５７；シャー（Ｓｈｅｒ） ，Ｔ．、イー（Ｙｉ），Ｈ．Ｆ．、マクブライド（ＭｃＢｒｉｄｅ），Ｗ．Ｏ． およびゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｓ），Ｆ．Ｊ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ ３２，５５９８〜５６０４；並びにシュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ） ，Ａ．、Ｎ．エンドー（Ｅｎｄｏ）、Ｓ．Ｊ．ラトレッジ（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ） 、Ｒ．フォーゲル（Ｖｏｇｅｌ）、Ｄ．シャイナー（Ｓｈｉｎａｒ）およびＧ． Ａ．ロダン（Ｒｏｄａｎ）（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１ ６３４−１６４１４−８）。ＰＰＡＲのリガンドはまだ同定されていない。 イスマンおよびグリーン、Ｎａｔｕｒｅ ３４７：６４５〜６５０，１９９０ ．年は、マウス肝臓の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーからマウスペルオ キシソーム増殖因子活性受容体（ｍＰＰＡＲ）遺伝子をクローン化した。ゴット リ ＵＳＡ．８９：４６５３〜４６５７，１９９２年は、ラット肝ｃＤＮＡライブラ リーからラットペルオキシソーム増殖因子活性受容体（ｒＰＰＡＲ）遺伝子をク ローン化した。マウスおよびラットからのＰＰＡＲは、アミノ酸配列が９７％相 同であり且つ特に十分に保存された推定上のリガンド結合ドメインを共有する。 アフリカツメガエル核ホルモン受容体スーパーファミリーの３種類のメンバー（ すなわち、ＸＰＰＡＲα、ＸＰＰＡＲβおよびＸＰＰＡＲγ）もまた、ｍＰＰＡ Ｒと構造的におよび機能的に関連があることが分かっている（ドレイアら、Ｃｅ ｌｌ ６８：８７９〜８８７，１９９２年） シュミットら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ６：１６ ３４−１６４１，１９９２年は、ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡライブラリーからステ ロイドホルモン受容体遺伝子ｈＮＵＣ１をクローン化した。ｈＮＵＣ１のアミノ 酸配列とｍＰＰＡＲのそれとの間の相同は６２％でる。 シャーら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：５５９８〜５６０４，１９９３ 年は、ヒト肝ｃＤＮＡライブラリーからヒトＰＰＡＲ遺伝子をクローン化した。 このクローンは、ｍＰＰＡＲクローンと８５％のヌクレオチド配列相同および９ １％のアミノ酸配列相同を有する。 ペルオキシソーム増殖因子活性受容体（ＰＰＡＲ）は、ステロイド受容体群の メンバーである。ＰＰＡＲは、それらの一次配列相同に基いていくつかの部分群 に分けられる。ファング（Ｆａｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍ． １９６：６７１〜６７７，１９９３年は、ＸＰＰＡＲα、ＸＰＰＡ Ｒβ、ＸＰＰＡＲγ、ｍＰＰＡＲおよびｈＮＵＣ１を論及した。 発明の概要 本発明は、ヒトペルオキシソーム増殖因子活性受容体サブタイプｈＮＵＣ１Ｂ のクローニング、配列順序決定および発現に関する。ｈＮＵＣ１Ｂは、１個のア ミノ酸（すなわち、２９２位のアラニン）によってアミノ酸配列がｈＮＵＣ１と 異なる。 本出願人は、ｈＮＵＣ１Ｂタンパク質が、ｈＰＰＡＲα（米国特許出願第０８ ／１４３，２１５号明細書においてｈＰＰＡＲ１と称されたｈＰＰＡＲαは、Ｐ ＰＡＲのサブタイプである）およびＴＲタンパク質活性を抑制すること、そして このような抑制の軽減が治療的に有用であることを確認した。 したがって、本発明は、ＰＰＡＲαタンパク質およびＴＲタンパク質活性に対 するＮＵＣタンパク質の抑制作用を緩和する治療薬を同定する方法、並びにＮＵ Ｃタンパク質活性レベルによって影響される疾患および病理学的状態、例えば、 限定されないが高脂血症、高コレステロール血症および高リポタンパク血症を治 療するためのこれらの薬剤の使用方法を特徴とする。これらの方法は、ＮＵＣタ ンパク質によるＰＰＡＲαまたはＴＲ活性の抑制を軽減する治療薬について多数 の天然、半合成または合成化合物をスクリーニングすることを可能にする。 「ＰＰＡＲαタンパク質」とは、ｈＰＰＡＲαを含むがこれに限定されないｈ ＰＰＡＲαタンパク質と実質的に相同である（すなわち、アミノ酸配列が９０％ 以上相同である）ＰＰＡＲサブタイプタンパク質を意味する。 「ＮＵＣタンパク質」とは、ｈＮＵＣ１Ｂタンパク質、ｈＮＵＣ１タンパク質 並びにｈＮＵＣ１ＢまたはｈＮＵＣ１タンパク質と相同な配列を有するタンパク 質を含むがこれらに限定されない、ＰＰＡＲαタンパク質および／またはＴＲタ ンパク質の転写活性化活性を抑制するＰＰＡＲサブタイプタンパク質またはＰＰ ＡＲ関連タンパク質を意味する。 本発明は、更に、ＮＵＣタンパク質活性によって影響される過程を調節するた めのおよびＮＵＣタンパク質活性レベルによって引き起こされた、誘発されたま たは悪化した病理学的状態を示す患者を治療するのに有用な化合物、組成物およ び方法に関する。更に詳しくは、本発明は、ＮＵＣタンパク質によるＰＰＡＲα タンパク質およびＴＲタンパク質活性の抑制を軽減する化合物および薬剤組成物 に関する。 したがって、一つの態様において、本発明は、ＮＵＣタンパク質活性レベルに よって影響される病理学的状態の治療用の治療薬を同定する方法であって、ＮＵ Ｃタンパク質活性の阻害剤をスクリーニングする工程を含む上記方法を特徴とす る。 一つの方法は、ＮＵＣタンパク質およびＰＰＡＲαタンパク質を含む系に対し て加えられた場合に、ＮＵＣタンパク質によるＰＰＡＲαタンパク質活性の抑制 を軽減する治療薬を同定することを含む。 好ましい実施態様において、この系は、ＰＰＡＲαタンパク質活性化に対して 応答性のリポーター遺伝子を更に含み、ＮＵＣタンパク質によるＰＰＡＲαの抑 制の低下すなわち軽減は、該リポーター遺伝子の発現レベルによって測定される 。 「リポーター遺伝子」とは、当業者に知られている技法によって容易に検出さ れ且つ検定される生成物をコードしている遺伝子を意味する。本発明におけるリ ポーター遺伝子は、アシル補酵素Ａオキシダーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラター ゼ／３−ヒドロシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ二機能性酵素または３−ケト アシルチオラーゼなどの遺伝子の天然のプロモーターを含むがこれらに限定され ない、ＰＰＡＲαタンパク質またはＴＲタンパク質に対して応答性であるプロモ ーターによって作動される。 更に好ましい実施態様において、スクリーニング検定は細胞中で行われる。 また更に好ましい実施態様において、ＮＵＣ遺伝子、ＰＰＡＲα遺伝子および リポーター遺伝子はベクター中にコードされ、そしてトランスフェクションによ って細胞中に導入される。リポーター遺伝子はペルオキシソーム増殖因子反応性 要素（ＰＰＲＥ）を有し、そしてＰＰＡＲαタンパク質によって活性化されうる 。 もう一つの更に好ましい実施態様において、スクリーニング検定は、ｉｎ ｖ ｉｔｒｏ転写によって細胞抽出物中で行われる。 第三の更に好ましい実施態様において、ＰＰＡＲ活性化因子をスクリーニング 検定に加える。 「ＰＰＡＲ活性化因子」とは、ＰＰＡＲαタンパク質の転写活性化活性を活性 化することができる化学薬剤、例えば、限定されないが、ＣＦＡ（クロフィブリ ン酸（ｃｌｏｆｉｂｒｉｃ ａｃｉｄ））、ＥＴＹＡ（５，８，１１，１４−エ イコサテトライン酸（ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｙｎｏｉｃ ａｃｉｄ））または ＷＹ−１４，６４３（［４−クロロ−６−（２，３−キシリジノ）−２−ピリミ ジニルチオ］酢酸）を意味する。 もう一つの方法は、ＮＵＣタンパク質およびＴＲタンパク質を含む系に対して 加えられた場合に、ＮＵＣタンパク質によるＴＲタンパク質活性の抑制を軽減す る治療薬を同定することを含む。 好ましい実施態様において、この系は、ＴＲタンパク質活性に対して反応性の リポーター遺伝子を更に含み、ＮＵＣによるＴＲの抑制または抑制の軽減は、該 リポーター遺伝子の発現レベルによって測定される。 更に好ましい実施態様において、スクリーニング検定は細胞中で行われる。 また更に好ましい実施態様において、ＮＵＣ遺伝子、ＴＲ遺伝子およびリポー ター遺伝子はベクター中にコードされ、そしてトランスフェクションによって細 胞中に導入される。リポーター遺伝子は甲状腺ホルモン反応性要素（ＴＲＥ）を 有し、そしてＴＲタンパク質によって活性化されうる。ＴＲＥとしては、限定さ れないが、ＴＲＥｐ（パリンドロームＴＲＥ）およびＤＲ４（４ヌクレオチドス ペースの５′−ＡＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡ−３′を有する直列反復）が ある。 もう一つの更に好ましい実施態様において、スクリーニング検定は、ｉｎ ｖ ｉｔｒｏ転写によって細胞抽出物中で行われる。 第三の更に好ましい実施態様において、ＴＲ活性化因子をスクリーニング検定 に加えてＴＲを活性化する。 「ＴＲ活性化因子」とは、ＴＲタンパク質の転写活性化活性を活性化すること ができる化学薬剤、例えば、限定されないが、ＬＴ３（３，３'，５−トリヨー ド−Ｌ−チロニン）、ＬＴ４（Ｌ−チロキシン）またはトリアク（Ｔｒｉａｃ） （３，３'，５−トリヨードチロ酢酸）を意味する。 第三の方法は、ＮＵＣタンパク質およびＰＰＲＥ含有核酸（例えば、オリゴヌ クレオチド）を含む系に対して加えられた場合に、該核酸に対するＮＵＣタンパ ク質の結合を減少させる薬剤を同定することを含む。結合レベルは、ゲル遅延検 定または当業者に知られている他の検定において検出することができる。 第四の方法は、ＮＵＣタンパク質およびＰＰＡＲαタンパク質を含む系に対し て加えられた場合に、ＮＵＣ−ＰＰＡＲα複合体の生成を減少させる薬剤を同定 することを含む。 好ましい実施態様において、ＮＵＣタンパク質は標識され、そしてＮＵＣ−Ｐ ＰＡＲα複合体の生成は、ＰＰＡＲα特異的抗体によって沈降した標識ＮＵＣタ ンパク質の量によって測定される。 第五の方法は、ＮＵＣタンパク質およびＴＲタンパク質を含む系に対して加え られた場合に、ＮＵＣ−ＴＲ複合体の生成を減少させる薬剤を同定することを含 む。 好ましい実施態様において、ＮＵＣタンパク質は標識され、そしてＮＵＣ−Ｔ Ｒ複合体の生成は、ＴＲ特異的抗体によって沈降した標識ＮＵＣタンパク質の量 によって測定される。 もう一つの態様において、本発明は、ＮＵＣタンパク質活性レベルによって影 響される病理学的状態の治療方法であって、該ＮＵＣタンパク質活性を抑制する または低下させる薬剤を提供することによる上記方法を特徴とする。本方法によ って治療される病理学的状態としては、限定されないが、高脂血症、高コレステ ロール血症および高リポタンパク血症がある。 本発明は、更に、上記方法によって発見された新規なまたは独特の治療薬、す なわち、それ自体が知られていない薬剤、またはＮＵＣタンパク質活性レベルに よって影響される病理学的症状の治療に関して用いるのに既知ではない薬剤に関 する。 本出願人は、有用な治療薬として容易に配合することができる低分子量（１０ ，０００ダルトン未満、好ましくは、５，０００ダルトン未満、そして最も好ま しくは、１，０００ダルトン未満）の薬剤の同定に特に関心がある。 次に、このような薬剤をスクリーニングして、それらが、健康な組織に対して はほとんどまたは全く作用せず、ＮＵＣタンパク質によって誘発されたまたは悪 化した病理学的状態を有する組織に対して特異的であることを確認して、該薬剤 を治療法または予防法で用いることができるようにすることができる。このよう な薬剤が健康な組織に対してある種の作用を有するとしても、それらは、特に、 生命を脅かす疾患の治療的処置においてなお有用でありうる。 次に、上記検定によって発見された治療薬は、当業者に知られている方法によ って組織特異性および毒性についてスクリーニングすることができる。それらは 、 薬学的に許容しうる製剤中に入れることができるし、且つＮＵＣタンパク質活性 によって誘発されたまたは悪化した疾患および病理学的状態の治療に用いること ができる。 いったん同定されたら、ＮＵＣ阻害剤を用いてＰＰＡＲαおよびＴＲタンパク 質活性のＮＵＣ阻害の機序を研究することができる。当業者に知られている技法 、例えば、Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッチュ（Ｆｒ ｉｔｓｃｈ）およびＴ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第２版，コー ルド・スプリング・ハーバー・ラボラリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・ ハーバー，ニューヨーク，１９８９年に記載されたものを応用すると、ＮＵＣ阻 害剤はまた、該阻害剤がＮＵＣタンパク質に対して結合する時のＮＵＣタンパク 質の構造的変化、および他のタンパク質と相互作用し且つＤＮＡに対して結合す るＮＵＣタンパク質の能力に、該結合がどのように影響するかを研究するのに用 いることができる。 本発明の他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明および請求の範囲か ら明らかであろう。 図面の簡単な説明 図１（Ａ〜Ｃ）は、基準化されたルシフェラーゼ活性を示すグラフである。Ｈ ｅｐＧ２細胞は、（Ａ）ベクターｐＣＭＶｈＰＰＡＲαまたはｐＢＫＣＭＶ（発 明の詳細な説明の「ベクター構築」を参照されたい）によってトランスフェクト され且つＣＦＡによって処理された。細胞は、ｐＣＭＶｈＮＵＣ１Ｂ（発明の詳 細な説明の「ベクター構築」を参照されたい）またはベクターによってトランス フェクトされ且つＣＦＡ（Ｂ）またはＥＴＹＡ（Ｃ）によって処理され、そして ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ検定を材料および方法で記載のよう に行った。 図２は、ｈＮＵＣ１Ｂの増加用量に対するリポーター遺伝子の基準化反応を示 すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞は、ｐＣＭＶｈＰＰＡＲα ０．１μｇおよび 増加量のｐＣＭＶｈＮＵＣ１Ｂ（μｇで示された）によってトランスフェクトさ れた。ＣＦＡを加えて最終濃度１ｍＭにした。対照細胞には等量のエタノール（ ビヒクル）を与えた。 図３（Ａ〜Ｅ）は、ｈＮＵＣ１Ｂに対する種々の受容体の基準化反応を示すグ ラフである。ＨｅｐＧ２細胞は、（Ａ）ＥＲ発現ベクターＨＥＯ（１μｇ）およ びｐＬＰｗｔＣＡＴ（発明の詳細な説明の「ベクター構築」を参照されたい）（ １．５μg）リポーター、（Ｂ）ｐＲＳｈＲＡＲα（発明の詳細な説明の「ベク ター構築」を参照されたい）およびＭＴＶ−ＴＲＥｐ２−ＬＵＣ、（Ｃ）ｐＲＳ ｈＲＡＲαおよびＣＲＢＰＩＩ−ｔｋ−ＬＵＣ、（Ｄ）ｐＲＳｈＴＲβ（発明の 詳細な説明の「ベクター構築」を参照されたい）およびＭＴＶ−ＴＲＥｐ２−Ｌ ＵＣによってトランスフェクトされた。発現プラスミド０．１μｇおよびルシフ ェラーゼリポーター０．５μｇを用いた（Ｂ〜Ｄ）。ｐＣＭＶｈＮＵＣ１Ｂは、 指示されたところでは、１μｇ（Ａ）および０．１μｇ（Ｂ〜Ｄ）で同時トラン スフェクトされた。トランスフェクトされた受容体のそれぞれのリガンドは、β −エストラジオール（１００ｎＭ）、ＡＴＲＡ（全トランス−レチン酸）（１μ Ｍ）、９−シス−ＲＡ（１μＭ）およびＬ−Ｔ３（１００ｎＭ）であって、最終 濃度を括弧内に示した。指示されたところではＣＦＡを加えて、最終濃度を１ｍ Ｍにした。図３Ｅにおいて、トランスフェクションは、リポーター遺伝子がＤＲ ４要素（４ヌクレオチドによって隔てられた直列反復）の２コピーを有する以外 は図３Ｄの場合と同様に行われた。用いられたＤＲ４要素の配列は、５′−ＡＧ ＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡ−３′である。反復配列は、それより上の列によ って示される。 図４は、ｈＮＵＣ１Ｂに対するｈＰＰＡＲαの増加率によるｈＮＵＣ１Ｂに対 するｈＰＰＡＲαの基準化応答を示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞は、ｐＣＭ ＶｈＮＵＣ１Ｂ ０．０５μｇおよび異なる量のｐＣＭＶｈＰＰＡＲαプラスミ ド（μｇで示された）によってトランスフェクトされた。ＣＦＡを加えて最終濃 度１ｍＭにした。 図５は、ゲル遅延検定のラジオグラフである。 ＤＮＡ結合検定は、材料および方法で記載のように、ｐＣＭＶｈＮＵＣ１Ｂま たはｐＲＳｈＲＸＲαによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの抽出物 を用いて行われた。模擬トランスフェクト細胞からの抽出物を対照として用いた 。 発明の詳細な説明 ＮＵＣタンパク質およびペルオキシソーム増殖 有意の心臓防御作用を有するジェムフィブロジル（ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ） のような血中脂肪低下薬の作用は、ＰＰＡＲによって媒介される。ヒトＰＰＡＲ サブタイプに対する種々のフィブレートの作用を研究するために、本出願人は、 ２種類のヒトＰＰＡＲサブタイプ、すなわち、ＰＰＡＲαおよびｈＮＵＣ１Ｂを 単離した。本出願人は、ｈＮＵＣ１Ｂが、クロフィブリン酸などのＰＰＡＲ活性 化因子によって活性化されないことを確認した。更に、本出願人は、ｈＮＵＣ１ Ｂが、ＰＰＡＲαおよび甲状腺ホルモン受容体によって影響される転写活性化の 特異的抑制因子であることを確認した。ＰＰＡＲαおよびＴＲ受容体に対するＮ ＵＣタンパク質の抑制作用は、ＰＰＡＲαおよびＴＲ活性化因子（例えば、フィ ブレート、シントロイド）の臨床的効力を制限することがある。この抑制を軽減 する薬剤は、ＰＰＡＲαおよびＴＲの活性を増加させ且つ既存の薬物の効力を増 加させるかまたはこれらの薬物を不必要にするであろう。 ＮＵＣタンパク質のサブタイプであるｈＮＵＣ１は、ＰＰＡＲおよびＴＲが活 性であるところのヒト心臓、脳および肝組織中に存在することが分かっている。 したがって、本発明のスクリーニング方法およびそれによって同定される薬剤は 、広範囲に治療的に有意でありうる。 本出願人は、ＰＰＡＲ応答要素であるＰＰＲＥに対するｈＮＵＣ１ＢおよびＲ ＸＲαの協同的結合を実証した。いずれの特定の理論にも拘束されることはない が、本出願人は、ｈＮＵＣ１ＢによるＰＰＡＲαの抑制が、おそらくは、ＤＮＡ 結合に対する競合、またはＰＰＡＲαおよびＴＲ活性に必要な因子の滴定のレベ ルで起こるということを提案する。ｈＮＵＣ１Ｂは、ＰＰＲＥに対して結合する ことによってＰＰＡＲαタンパク質の活性化に拮抗しうると考えられる。ＣＯＵ Ｐ−ＴＦ（ニワトリ卵アルブミン上流プロモーター転写因子）は、同様の機序に よってＰＰＡＲ活性化を阻害することが分かっている（ミヤタ（Ｍｉｙａｔａ） ，Ｋ．Ｓ．、ザン（Ｚｈａｎｇ），Ｂ．、マルクス（Ｍａｒｃｕｓ），Ｓ．Ｌ． 、カポン（Ｃａｐｏｎｅ），Ｊ．Ｐ．およびラクビンスキ（Ｒａｃｈｕｂｉｎｓ ｋ ｉ），Ｒ．Ａ．（１９９３）Ｊｏｕｒｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１９１ ６９〜１９１７２）。ｈＮＵＣ１Ｂの転写活性化機能が不存在の場合、この機序 は、ｈＮＵＣ１ＢによるＰＰＡＲα活性の抑制を説明しうるであろう。 ここで、ＮＵＣ阻害剤のスクリーニングに関する以下の実施例を論及すること により、本発明を更に詳細に記載する。しかしながら、本発明は、以下に記載の 同時トランスフェクション検定、ゲル遅延検定および免疫沈降検定に限定されな い。細胞活性に対するタンパク質の抑制作用を軽減する薬剤の検定のための当業 者に知られている他の方法もまた用いることができる。実施例 候補薬剤は、（Ａ）ＰＰＡＲαまたはＴＲ応答性遺伝子の脱抑制についての間 接的評価か、（Ｂ）ＰＰＡＲαまたはＴＲ応答性要素に対するＮＵＣタンパク質 結合についての直接的評価かまたは（Ｃ）ＮＵＣタンパク質とＰＰＡＲαタンパ ク質またはＴＲタンパク質との間の複合体形成についての直接的評価によってス クリーニングすることができる。 本明細書中に記載の実施例で用いられた実験手順および試薬を以下に記載する 。試薬 ＥＴＹＡ、β−エストラジオール、ＡＴＲＡ、ＬＴ３（３，３′，５−トリヨ ード−Ｌ−チロシン）およびＣＦＡはシグマ（Ｓｉｇｍａ）から、そしてＷＹ− １４，６４３はケムシン・サイエンス・ラボラリーズ（Ｃｈｅｍｓｙｎ Ｓｃｉ ｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），レネキサ，カンザス州，米国から購入 した。これらの化合物の原液は、エタノール、メタノールまたはジメチルスルホ キシド中で製造された。 以下の実施例の緩衝液、培地および溶液の製法は、Ｊ．サムブルック、Ｅ．Ｆ ．フリッチュおよびＴ．マニアティス、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第２版，コールド・スプリング・ハ ーバー・ラボラリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク ，１９８９年で与えられている。ベクター構築 哺乳動物細胞での発現用に、ｈＰＰＡＲα ｃＤＮＡをｐＢＫＣＭＶ（ストラ タジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＮｏｔＩ部位中にクローン化してｐＣＭ ＶｈＰＰＡＲαを生成した。 ｈＮＵＣ１Ｂ ｃＤＮＡをｐＢＫＣＭＶのＳａｌＩ−ＳａｃＩＩ部位中に直接 的にクローン化し、ｐＣＭＶｈＮＵＣ１Ｂを生成した。 リポータープラスミドｐＰＰＲＥＡ３−ｔｋ−ｌｕｃは、アシル−ＣｏＡオキ シダーゼ遺伝子調節配列（オスミ（Ｏｓｕｍｉ），Ｔ．、ウェン（Ｗｅｎ），Ｊ ．およびハシモト（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ），Ｔ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７５ ，８６６〜８７１）の「Ａ」部 位を含む合成オリゴヌクレオチド（５′−ＣＣＣＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣＴＴＴＧ ＴＣＣＴＧＧＴＣＣ−３′）の３コピーを、前に記載されたｐＢＬｔｋ−ルシフ ェラーゼベクター（ジグレ（Ｇｉｇｕｅｒｅ），Ｖ．、ホレンバーグ（Ｈｏｌｌ ｅｎｂｅｒｇ），Ｓ．Ｍ．、ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ），Ｍ．Ｇ ．、エバンス（Ｅｖａｎｓ），Ｒ．Ｍ．（１９８６）Ｃｅｌｌ ４６，６４５〜 ６５２）中のｔｋプロモーターのＸｈｏＩ部位５′中に挿入することによって生 成された。 ｐＲＳｈＲＡＲα、ｐＲＳｈＲＸＲα、ＭＴＶ−ＴＲＥｐ２−ＬＵＣおよびＣ ＲＢＰＩＩ−ｔｋ−ＬＵＣは、ジグレ，Ｖ．、オン（Ｏｎｇ），Ｅ．Ｓ．、セギ （Ｓｅｇｕｉ），Ｐ．およびエバンス，Ｒ．Ｍ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３ ３０ （２），６２４〜６２９；マングルスドルフ（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ）， Ｄ．Ｊ．、オン，Ｅ．Ｓ．、ダイク（Ｄｙｃｋ），Ｊ．Ａ．およびエバンス，Ｒ ．Ｍ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４５，２２４〜２２９；ウメソノ（Ｕｍｅ ｓｏｎｏ），Ｋ．、ギグレ，Ｖ．、グラス（Ｇｌａｓｓ），Ｃ．Ｋ．およびロー ゼンブェルド，Ｍ．Ｇ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６，２６２〜２６５； およびマングルスドルフ，Ｄ．Ｊ．、ウメソノ，Ｋ．、クライバー（Ｋｌｅｉｗ ｅｒ），Ｓ．Ａ．、ボルグメイヤー（Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒ），Ｕ．、オン，Ｅ． Ｓ．およびエバンス，Ｒ．Ｍ．（１９９１）Ｃｅｌｌ ６６，５５５〜５６１で 記載された。 ｐＲＳｈＴＲβは、トムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ），Ｃ．Ｃ．およびエバンス， Ｒ．Ｍ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６， ３４９４〜３４９８で記載された。 ヒトＴＲα１ ｃＤＮＡ（ナカイ（Ｎａｋａｉ）Ａ．、サクライ（Ｓａｋｕｒ ａｉ），Ａ．、ベル（Ｂｅｌｌ），Ｇ．Ｉ．およびデ・グロート（ＤｅＧｒｏｏ ｔ），Ｌ．Ｊ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃ．２，１０８７〜１０９２ ）を、ＥｃｏＲＩによる消化によってｐＭＥ２１から放出し、そしてマングビー ン（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼによる消化によってブラント末端付きに した。ｐＲＳプラスミド（ジグレ，Ｖ．、ホレンバーグ，Ｓ．Ｍ．、ローゼンフ ェルド，Ｍ．Ｇ．、エバンス（Ｅｖａｎｓ），Ｒ．Ｍ．（１９８６）Ｃｅｌｌ ４６ ，６４５〜６５２）をＢａｍＨＩによって消化し、脱リン酸化し、そしてク レノウ酵素によって修復した。次に、ＴＲα１ ｃＤＮＡをベクターに対してブ ラント末端連結によって結合した。 ＴＲ発現プラスミドＨＥＯは、（クマー（Ｋｕｍａｒ），Ｖ．およびチェンボ ン（Ｃｈａｍｂｏｎ），Ｐ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５５，１４５〜１５６）で 記載されている。 エストロゲン誘導脳クレアチンキナーゼプロモーターは、ｐＵＣＰＬＣＡＴ中 にクローン化されてｐＬＰｗｔＣＡＴを生成した。同時トランスフェクション検定 ＨｅｐＧ２細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌ ｏｎｅ））、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシン（バイオホイッタカ ー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））５５μｇ／ｍｌを補足したダルベッコ修飾イ ーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。細胞は、１２ウェル細胞培養皿（コス ター（Ｃｏｓｔａｒ））中においてＨｅｐＧ２について細胞２ｘ１０5個／ウェ ルで平板培養された。培地は、２０時間後に新鮮な培地によって交換された。４ 時間後、リン酸カルシウム共沈降技法によってＤＮＡを加えた（バーガー（Ｂｅ ｒｇｅｒ），Ｔ．Ｓ．、パランドシュ（Ｐａｒａｎｄｏｓｈ），Ｚ．、ペリー（ Ｐｅｒｒｙ），Ｂ．およびスタイン（Ｓｔｅｉｎ），Ｒ．Ｂ．（１９９２）Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ．Ｂｉｏｃｈeｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４１ ，７３３〜７３ ８）。典型的に、発現プラスミド０．１μｇ、β−ｇａｌ発現プラスミドｐＣＨ １１０（内部対照）０．５μｇおよびリポータープラスミド０．５ｍｇを各ウェ ルに対して加えた。 指示されたところでは、ｈＮＵＣ１Ｂプラスミド（抑制因子）０〜０．５μｇ を加えた。抑制因子プラスミド用量は、適当な量のエンプティ（ｅｍｐｔｙ）発 現ベクターｐＢＫＣＭＶを加えることによって一定に保たれた。ＤＮＡの全量は 、ｐＧＥＭ ＤＮＡ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を加えることによって２０ μｇで維持された。 １４時間後、細胞を１Ｘ ＰＢＳによって洗浄し、且つ新鮮培地（１０％木炭 でストリッピングされたウシ胎児血清（ハイクローン）および上記添加物を含む ＤＭＥＭ）を加えた。リガンドまたはＰＰＡＲ活性化因子を、指示された最終濃 度まで加えた。対照細胞はビヒクルによって処理された。 更に２４時間後、細胞を採取し、そしてルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシ ダーゼ活性を、それぞれダイナテク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ＭＬ１０００ルミノメ ーターおよびベックマン・バイオメク（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ）１００ ０ワークステーションで定量した。基準化反応は、抽出物のルシフェラーゼ活性 を同β−ガラクトシダーゼ活性で除したものである。それぞれのデータポイント は、３回のトランスフェクションの平均値である。誤差棒線は、平均値からの標 準偏差を示す。ＣＡＴ検定は、オースベル（Ａｕｓｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．、ブレン ト（Ｂｒｅｎｔ），Ｒ．、キングストン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ），Ｒ．Ｅ．、ムー ア（Ｍｏｏｒｅ），Ｄ．Ｄ．、セイドマン（Ｓｅｉｄｍａｎ），Ｊ．Ｇ．、スミ ス（Ｓｍｉｔｈ），Ｊ．Ａ．およびストルール（Ｓｔｒｕｈｌ），Ｋ．（１９８ ７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｇｙ ，ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎ ｃｅ）の場合と同様に行われた。ゲル遅延検定 ＣＯＳ細胞を、ｐＣＭＶｈＮＵＣ１ＢまたはｐＲＳｈＲＸＲα（プタシュン（ Ｐｔａｓｈｎｅ），Ｍ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３５，６８３〜６８９） ５μｇ／１００ｍｍ皿によって４８時間トランスフェクトした。全細胞抽出物を 、０．４Ｍ ＫＣｌ含有緩衝液中での４回の凍結融解サイクルに続いて遠心分離 によって製造した。ゲル遅延は、１０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（７．８）、５ ０ ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｄＩｄＣ ０．５ｍ ｇ／ｍｌおよび２０％グリセロールを含む緩衝液中において細胞抽出物５μｇを ４℃で５分間インキュベートすることによって行われた。次に、32Ｐ−末端標識 プローブ約１００，０００ｃｐｍを加え且つ２５℃で更に５分間インキュベート した。 タンパク質−ＤＮＡ複合体を、０．５Ｘ ＴＢＥ中５％ポリアクリルアミドゲ ル上の電気泳動によって分離した。プローブとして用いられたアシル−補酵素Ａ オキシダーゼ（ＡＯＸ）遺伝子からのＰＰＲＥ配列は、 ５′−ＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＴＣ− ３′（上方鎖）および ５′−ＣＴＡＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＴＡＴＣＧ− ３′（下方鎖） である。実施例１． ｈＰＰＡＲαのクローニング ラットＰＰＡＲαのヒト同族体を、ヒト肝５′−伸長１ｇｔ１０ ｃＤＮＡラ イブラリー（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））から単離した。ライブラリーは 、中程度のストリンジェンシーで（３７℃で４０％ホルムアルデヒド、５Ｘ Ｓ ＳＣ）、Ａ／ＢおよびＤＮＡ結合ドメインに対して特異的なｒＰＰＡＲニックト ランスレーションＤＮＡフラグメント（ＥｃｏＲＩ〜ＢｇｌＩＩ部位、ヌクレオ チド４５０〜９０９）（ゴットリヒャー，Ｍ．、ウィドマー，Ｅ．、リー，Ｑ． およびグスタフソン，Ｊ．Ａ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ．８９ ，４６５３〜４６５７）を用いてスクリーニングされた。正 のクローンを単離し、そして配列順序決定するためにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｋ Ｓベクター（ストラタジーン）中にサブクローン化した。配列は、２６８位のア ラニンおよび２９６位のグリシンの２個のアミノ酸が異なる以外は、シャーら（ シャー，Ｔ．、イー，Ｈ．Ｆ．、マクブライド，Ｗ．Ｏ．およびゴンザレス，Ｆ ．Ｊ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，５５９８〜５６０４）に よって公表されたのと同一である。 ＣＦＡによるｈＰＰＡＲαの活性化プロフィールを図１Ａで示す。この受容体 はまた、ＨｅｐＧ２およびＣＶ−１細胞中においてＰＰＡＲの他の既知の活性化 因子、例えば、ＷＹ−１４，６４３およびＥＴＹＡによって活性化される。実施例２． ｈＮＵＣ１Ｂのクローニング ｈＮＵＣ１Ｂを、上記実施例１で記載の手順を用いて、ラットＰＰＡＲ ＤＮ Ａ結合ドメインに対して特異的なプローブ（ＰｖｕＩＩ〜ＢｇｌＩＩ部位、ヌク レオチド６１８〜９０９、参考文献（ゴットリヒャー，Ｍ．、ウィドマー，Ｅ． 、リー，Ｑ．およびグスタフソン，Ｊ．Ａ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９ ，４６５３〜４６５７））を用いるスクリーニ ングによってヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーから単離した。組換え体クローンを 単離し、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ中にサブクローン化し、そして配列順序決定した。こ の受容体の配列は、２９２位のアラニン以外はｈＮＵＣ１配列のそれと同一であ る（シュミット，Ａ．、Ｎ．エンドー、Ｓ．Ｊ．ラトレッジ、Ｒ．フォーゲル、 Ｄ．シャイナーおよびＧ．Ａ．ロダン（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌ．６ ，１６３４〜１６４１）。 ｈＮＵＣ１Ｂは、ＰＰＡＲ群のメンバーである。ｈＮＵＣ１Ｂは、ｈＰＰＡＲ αに対して６１％相同であり、「Ｄ」ボックス中の２個のシステイン残基は３個 のアミノ酸（Ｅ、ＲおよびＳ）アミノ酸配列の１１２〜１１４位）によって隔て られている。これがＰＰＡＲの特徴である（ドレイア，Ｃ．、クレイ，Ｇ．、ハ ンスヨルグ，Ｋ．、ギベル，Ｆ．、ヘルフテンバイン，Ｇ．およびワーリ，Ｗ． （１９９２）Ｃｅｌｌ ６８，８７９〜８８７）。他の核受容体はいずれも、同 じ部分に５個のアミノ酸を有する。 ｈＮＵＣ１Ｂタンパク質は、ｈＰＰＡＲαとは異なり、ＣＦＡ、ＥＴＹＡまた はＷＹ−１４，６４３によってＨｅｐＧ２およびＣＶ−１細胞中で転写活性化さ れない（図１Ｂ、Ｃ）。トランスフェクトされた受容体の不存在下で見られた僅 かな活性化は、用いられた細胞系の内因性ＰＰＡＲのためであると考えられる。 これはまた、シュミット，Ａ．、Ｎ．エンドー、Ｓ．Ｊ．ラトレッジ、Ｒ．フォ ーゲル、Ｄ．シャイナーおよびＧ．Ａ．ロダン（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃ ｒｉｎｏｌ．６ ，１６３４〜１６４１によってｈＮＵＣ１および若干の脂肪酸と 一緒に観察された。このデータは、ｈＮＵＣ１Ｂ中のＰＰＡＲ活性化因子誘導ト ランス活性化機能の不存在を示唆している。 しかしながら、トランスフェクトされたｈＮＵＣ１Ｂは、内因性ＰＰＡＲから の応答を減少させた。これは、ｈＮＵＣ１ＢがｈＰＰＡＲ機能の抑制因子として 作用しうることを示唆した。図４は、ｈＮＵＣ１Ｂに対するｈＰＰＡＲαの増加 率がｈＮＵＣ１Ｂによる抑制を圧倒したことを示している。実施例３． 同時トランスフェクション検定によるｈＮＵＣ１Ｂ阻害剤のスクリ ーニング 増加量のｈＮＵＣ１Ｂプラスミドは、一定量のｈＰＰＡＲα発現プラスミドに よって細胞中に同時トランスフェクトされた。図２は、ＣＦＡの存在下でのｈＮ ＵＣ１ＢによるｈＰＰＡＲα活性の強い用量依存性抑制を示す。抑制は、同時ト ランスフェクトされたｈＮＵＣ１Ｂプラスミド０．１μｇによって８５％であっ た。ｈＮＵＣ１による抑制はまた、ＥＴＹＡおよびＷＹ−１４，６４３の存在下 においてラットＰＰＡＲ（ゴットリヒャー，Ｍ．、ウィドマー，Ｅ．、リー，Ｑ ．およびグスタフソン，Ｊ．Ａ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９ ，４６５３〜４６５７）およびｈＰＰＡＲαにおいて観察 された。 ｈＮＵＣ１ＢがｈＰＰＡＲαの特異的抑制因子であるかどうかを確認するため に、本出願人は、ステロイド受容体群の他のメンバーに対するｈＮＵＣ１Ｂの作 用を試験した（図３Ａ〜Ｃ）。 ｈＮＵＣ１Ｂは、ＥＲおよびＲＡＲαの活性化に対してそれらのそれぞれのリ ガンドによって最小の作用を有する。ｈＮＵＣ１Ｂは、ＣＦＡの不存在下におい てＲＸＲαを抑制しないが、その存在下では僅か２５％の抑制が検出された。 しかしながら、ｈＴＲβ１およびパリンドロームＴＲＥについては、ＣＦＡの 不存在下においてｈＮＵＣ１による６５％の抑制が見られた（図３Ｄ）。ＣＦＡ の存在下において抑制は７５％まで増加した。ｈＴＲαについても、もっと少な い程度にではあるが抑制が観察された。 したがって、ｈＮＵＣ１Ｂは一般的な転写抑制因子ではないが、ｈＰＰＡＲα およびｈＴＲの優性の負の抑制因子である。抑制はクロフィブリン酸の不存在下 でも起こったが、その存在下で促進された。 ｈＮＵＣ１Ｂによる抑制ＰＰＡＲαおよびＴＲ活性を軽減する薬剤についてス クリーニングするために、ＰＰＡＲαおよびｈＮＵＣ１ＢまたはＴＲおよびｈＮ ＵＣ１Ｂ発現プラスミドを、ＣＶ−１（サル腎細胞系）またはＨｅｐＧ２（ヒト 肝細胞系）細胞中に、ＰＰＡＲ活性化因子（例えば、クロフィブリン酸、ＷＹ− １４，６４３）またはＴＲ活性化因子（例えば、ＬＴ３）の存在下においてＰＰ ＡＲまたはＴＲ結合要素（例えば、ＰＰＲＥまたはＴＲＥ）を含むリポーターと 一緒に同時トランスフェクトする。 クロフィブリン酸またはＬＴ３は、通常、それらのそれぞれの受容体を活性化 し、したがって、強いシグナルを与えるであろう。ｈＮＵＣ１Ｂの存在下におい て、ｈＮＵＣ１Ｂによるこれらの受容体の抑制のために、そのシグナルは極めて 弱いであろう。本出願人は、トランスフェクトされた細胞に対して化合物を種々 の濃度で加え、そしてｈＮＵＣ１Ｂによる抑制を軽減するものを選択する。 上記スクリーニング計画はまた、適当なベクターおよびリポーターを用いる酵 母基剤検定で行われるであろう。実施例４． ゲル遅延検定によるｈＮＵＣ１Ｂ阻害剤のスクリーニング ゲル遅延検定は、ｈＮＵＣ１Ｂが、ＰＰＡＲ要素であるＰＰＲＥに対して結合 することを示した。ｈＮＵＣ１ＢまたはｈＲＸＲα単独では、僅かに遅延した複 合体が見られた（図５、列１および２）。ＲＸＲαの添加は、ｈＮＵＣ１Ｂの結 合を促進し（列３）、ＰＰＲＥに対するｈＮＵＣ１ＢおよびｈＲＸＲαの協同的 結合を実証した。同様の結果が、ｍＰＰＡＲαおよびｒＰＰＡＲについて見られ た（クリーワー（Ｋｌｉｅｗｅｒ），Ｓ．Ａ．、ウメソノ，Ｋ．、ヌーナン（Ｎ ｏｏｎａｎ），Ｄ．Ｊ．、ハイマン（Ｈｅｙｍａｎ），Ｒ．Ａ．およびエバンス ，Ｒ．Ｍ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３５８，７７１〜７７４；お よびイスマン，Ｉ．、プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ），Ｒ．Ａ．、タグウッド（Ｔｕ ｇｗｏｏｄ），Ｊ．Ｄ．およびグリーン，Ｓ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ７５，２５１〜２５６；ジーリング（Ｇｅａｒｉｎｇ），Ｋ．Ｌ．、ゴットリ ヒャー，Ｍ．、テボウル（Ｔｅｂｏｕｌ），Ｍ．、ウィドマーク（Ｗｉｄｍａｒ ｋ），Ｅ．およびグスタフソン（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ．９０ ，１４４０〜１４４４）。 ｈＮＵＣ１Ｂは、ＰＰＡＲαまたはＴＲの活性化を、これらの受容体によって 通常結合されたＤＮＡ配列に対して結合することによって簡単に抑制しうるので 、本出願人は、結合反応中に加えることによってｈＮＵＣ１Ｂ−ＰＰＲＥ複合体 の生成を妨げる化合物についてスクリーニングする。同様の反応検定が、ＴＲα およびＴＲβについて行われるであろう。実施例５． 免疫沈降検定によるｈＮＵＣ１Ｂ阻害剤のスクリーニング ｈＮＵＣ１Ｂは、ＰＰＡＲαまたはＴＲと一緒に簡単に二量体化されて不活性 ヘテロ二量体を生成する。ｈＮＵＣ１Ｂによる抑制ＰＰＡＲαおよびＴＲ活性を 軽減する薬剤についてスクリーニングするために、本出願人は、標識されたｈＮ ＵＣ１Ｂと未標識ＴＲまたはＰＰＡＲαとを混合する。次に、ＴＲまたはＰＰＡ Ｒα特異的抗体を用いて、ｈＮＵＣ１Ｂ−ＴＲまたはｈＮＵＣ１Ｂ−ＰＰＡＲα 複合体をそれぞれ免疫沈降させる。試験化合物をこの配合物に加え、そしてこれ らのヘテロ二量体の生成を破壊するものだけを選択する。次に、これらの化合物 を、それらがｈＮＵＣ１ＢによるＰＰＡＲおよびＴＲの抑制を軽減するかどうか 調べるために、上記の方法によって更に試験する。実施例６． 推定上のＮＵＣ阻害剤の毒性試験 本方法は、上記の方法のいずれにおいても活性な薬剤が、健康な細胞に対して ほとんどまたは全く作用しないかどうかを確認するために与えられる。次に、こ のような薬剤を、薬学的に許容しうる緩衝液中または標準的な動物試験に有用な 緩衝液中に配合する。 「薬学的に許容しうる緩衝液」とは、薬学的有効量の本明細書中に記載の薬剤 を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む貯蔵および引続きの投与用に調 製された薬剤組成物中で用いることができる任意の緩衝液を意味する。治療的使 用に許容しうる担体または希釈剤は当薬学技術分野において周知であり、例えば 、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ，マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ ｏ．）（Ａ．Ｒ．ジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）監修、１９８５年）に記載されて いる。保存剤、安定剤、染料、そして着香剤も、薬剤組成物中に与えられてよい 。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸エ ステル を保存剤として加えることができる。同上、１４４９。更に、酸化防止剤および 懸濁化剤を用いることができる。同上。 Ａ． 毒性のもう一つのスクリーニング：方法１ 培養されたヒト細胞に対する推定上のＮＵＣ阻害剤の毒性について評価する。 この評価は、ＸＴＴとも称される２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５ −スルホニルフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テト ラゾリウム水酸化物］を減少させる生細胞の能力に基いている（ポール（Ｐａｕ ｌｌ）ら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｌ．Ｃｈｅｍ．２５：７６３〜７６７（１９８ ７）；ワイスロー（Ｗｅｉｓｌｏｗ）ら（１９８９）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ ．Ｉｎｓｔ． ８１：５７７）。 生存しうる哺乳動物細胞は、ＸＴＴのテトラゾール環中のＮ−Ｎ結合を還元的 に開裂してＸＴＴホルマザンを生成することができる。死滅した細胞またはエネ ルギー代謝が損なわれている細胞は、この開裂反応ができない。開裂の程度は、 試験された生細胞の数に正比例する。 ヒーラ細胞などのヒト細胞系からの細胞を、９６ウェル微量滴定プレートのウ ェル中の細胞培地（１０％ウシ胎児血清を補足したダルベッコ修飾最少必須培地 ）０．１ｍｌ中に１０3個／ウェルで播種する。空気９５％、ＣＯ2５％の雰囲気 中の３７℃での培養によって細胞をプレートに付着させる。 一晩中培養後、試験物質の溶液を、二重反復試験においてウェルに対して８倍 の半桁対数希釈を示す濃度で加える。平行して、試験物質を溶解させるのに用い られる溶媒を、二重反復試験において他のウェルに対して加える。細胞の培養は 、一定の時間、典型的には２４時間続けられる。 その時間の最後に、ＸＴＴおよびカプラー（硫酸メチルフェナゾニウム）の溶 液を各試験ウェルに対して加え、そしてインキュベーションを更に４時間続けた 後、各ウェルの光学濃度を自動プレートリーダーにおいて４５０ｎｍで測定する 。哺乳動物細胞を死滅させる、またはそれらのエネルギー代謝を損傷する、また はそれらの増殖を遅らせる物質は、試験物質を与えられなかったウェルと比較さ れたウェル中の４５０ｎｍでの光学濃度の減少によって検出される。 Ｂ． 毒性のもう一つのスクリーニング：方法２ 培養されたヒト細胞系に対する推定上のＮＵＣ阻害剤の細胞障害作用について 、細胞生存能力の指標として35Ｓメチオニンのタンパク質中への取込みを用いて 試験する。 ヒーラ細胞を、９６ウェルプレート中において、１０％ウシ胎児血清並びにペ ニシリンおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを補足したダルベッコ最少必 須培地中で増殖させる。最初に、細胞を１０3個／ウェル、０．１ｍｌ／ウェル で播種する。細胞をＮＵＣ阻害剤に対して暴露することなく４８時間増殖させた 後、培地を除去し、そして完全培地中で調製されたＮＵＣ阻害剤の種々の希釈液 を各ウェルに対して加えるが、対照ウェルにはＮＵＣ阻害剤を与えない。 細胞を更に４８〜７２時間インキュベートする。培地を２４時間毎に取り替え 、同じ濃度のＮＵＣ阻害剤を含む新鮮な培地と交換する。次に、培地を除去し、 ＮＵＣ阻害剤を含まない完全培地と交換する。 細胞をＮＵＣ阻害剤の不存在下で２４時間インキュベートした後、タンパク質 中への35Ｓの取込みによって生存能力を推定する。培地を除去し、メチオニン不 含完全培地と交換し、そして３０分間インキュベートする。培地を再度除去し、 メチオニンを含まないが35Ｓメチオニン０．１μＣｉ／ｍｌを含む完全培地と交 換する。細胞を３時間インキュベートする。 ウェルをＰＢＳ中で３回洗浄した後、１００％メタノールを加えることによっ て細胞を１０分間浸透させる。氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えてウ ェルを満たし；プレートを氷上で５分間インキュベートする。このＴＣＡ洗浄を 更に２回繰り返す。ウェルをメタノール中で再度洗浄した後、自然乾燥させる。 シンチレーションカクテル５０μｌを各ウェルに対して加え、そして遠心分離に よってウェル上に乾燥させる。プレートを用いて、Ｘ線フィルムに感光させる。 ＮＵＣ阻害剤不含ウェルを含むオートラジオグラムのデンシトメーター走査を用 いて、細胞の５０％が生存できない用量（ＩＤ50）を決定する（動物細胞の培養 。基本技術要覧。（１９８７）Ｒ．イアン・フレッシュニー（Ｉａｎ Ｆｒｅｓ ｈｎｅｙ）。ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレーテッド（Ｊｏ ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク）。実施例７． ＮＵＣ阻害剤の製剤および投与 ｈＮＵＣ１活性および目的の病理学的状態に影響を与える特定の薬剤は、患者 に対して単独でか、或いはそれが適当な担体または１種類若しくは複数の賦形剤 と混合されている薬剤組成物で投与することができる。 ｈＮＵＣ１活性レベルによって誘発されたまたは悪化した病理学的状態を示す 患者の治療においては、これらの１種類または複数の薬剤の治療的有効量を投与 する。「治療的有効量」とは、患者の疾患または状態の１種類またはそれ以上の 症状を（ある程度まで）軽減する量を意味する。更に、「治療的有効量」とは、 疾患または状態に関係したまたは原因となる生理学的または生化学的パラメータ ーを部分的にかまたは完全に正常まで回復する量を意味する。 このような化合物の毒性および治療的効力は、細胞培養または実験動物におけ る薬学的標準法、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ50 （集団の５０％での治療的有効量）を測定することによって決定することができ る。各候補化合物は、ｈＮＵＣ１によるＰＰＲＡαおよびＴＲの抑制を軽減する 場合のその効力について、細胞系、動物モデル、および当業者に知られ且つ米国 食品医薬品庁によって認可された方法、例えば、限定されないが、米国官報４７ （５６号）：１２５５８〜１２５６４，１９８２年３月２３日で公表された方法 を用いる制御臨床実験で試験される。毒性作用と治療効果との用量比は治療係数 であり、それをＬＤ50／ＥＤ50比として表わすことかできる。治療係数が大きい 化合物が好ましい。これらの細胞培養検定および動物実験から得られたデータは 、ヒトにおいて用いるための一定範囲の用量を配合する場合に用いることができ る。このような化合物の用量は、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ50を含む循 環濃度の範囲内であるのが好ましい。該用量は、用いられる剤形および用いられ る投与経路に応じてこの範囲内で変化しうる。 本発明の方法において用いられる任意の化合物に対して、治療的有効量は、最 初に細胞培養検定から推定することができる。例えば、動物モデルにおいて、細 胞培養で測定されたＩＣ50を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、タンパク質複合 体の半最大破壊、または細胞レベルおよび／または複合体成分の活性の半最大阻 害に達する試験化合物の濃度）に達する用量を配合することができる。このよう な情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定することができる。 血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することが できる。 正確な配合、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によっ て選択されることができる（例えば、フィングル（Ｆｉｎｇｌ）ら、Ｔｈｅ Ｐ ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ，１９７５年，第１章，１頁を参照されたい）。担当医師は、投薬をどのように およびいつ終結させ、中断しまたは調整するかを毒性または臓器機能不全によっ て判断するであろうということは留意されるべきである。担当医師はまた、逆に 、臨床反応が適切でなかった場合、更に高い水準まで処置を調整する（毒性を除 外する）ように判断するであろう。目的の心臓血管障害の処置における投与量の 程度は、治療される症状の重さによっておよび投与経路に対して変更することが できる。症状の重さは、例えば、部分的には標準的な予後徴候評価法によって評 価することができる。更に、投与量およびおそらくは投与回数は、個々の患者の 年齢、体重および反応によっても異なるであろう。上記で論及されたのと同様の プログラムは、獣医学において用いることができる。 治療される具体的な症状に応じて、このような薬剤を配合し且つ全身または局 所に投与することができる。配合および投与のための技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏ ｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ，第１８巻，マック ・パブリッシング・カンパニー，イーストン，ＰＡ（１９９０）で見ることがで きる。適当な経路としては、いくつか挙げると、経口、肛門、経皮、経腟、経粘 膜または腸管投与；筋肉内、皮下、髄内注射、並びに脊髄内、直接脳室内、静脈 内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射を含めた非経口デリバリーを挙げることがで きる。 注射用には、本発明の薬剤を水溶液、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液 、例えば、ハンクス液、リンガー液または生理的塩類緩衝液中に配合することが できる。該経粘膜投与用には、透過すべき障壁に対して適当な浸透剤を配合物中 で用いる。該浸透剤は、概して、当該技術分野において知られている。 本発明の実施のために本明細書中に開示された化合物を全身投与に適当な剤形 に配合するための薬学的に許容しうる担体の使用は、発明の範囲内である。担体 の適当な選択および適当な製造実施により、本発明の組成物、特に、液剤として 配合されたものは、静脈内注射などの非経口によって投与することができる。化 合物は、当該技術分野において周知の薬学的に許容しうる担体を用いて経口投与 に適当な剤形に容易に配合することができる。このような担体は、本発明の化合 物を、治療される患者による経口摂取用の錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル 剤、シロップ、スラリー、懸濁剤等として配合することを可能にする。 細胞内に投与するための薬剤は、当業者に周知の技法を用いて投与することが できる。例えば、このような薬剤は、リポソーム中に封入した後、上記のように 投与することができる。リポソームは、水性内部を含む球状脂質二重層である。 リポソーム生成時に水溶液中に存在する分子は全て、水性内部に包含される。リ ポソーム内容物は、外部微環境から保護されるし、しかもリポソームが細胞膜と 融合するので、細胞質中に効率よく供給される。更に、それらの疎水性のために 、小有機分子を細胞内に直接的に投与することができる。 本発明において用いるのに適当な薬剤組成物としては、活性成分が、その目的 を達成する有効量で含まれている組成物がある。有効量の決定は、本明細書中に 与えられた詳細な開示を特に考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。 活性成分の他に、これらの薬剤組成物は、活性化合物を薬学的に用いることが できる製剤に加工することを容易にする賦形剤および添加剤を含む適当な薬学的 に許容しうる担体を含んでいてよい。経口投与用に配合された製剤は、錠剤、糖 衣錠、カプセル剤または液剤の形であってよい。 本発明の薬剤組成物は、それ自体知られている方法で、例えば、慣用的な混合 、溶解、造粒、糖衣錠製造、水簸、乳化、カプセル封入、閉じ込めまたは凍結乾 燥処理によって製造することができる。 非経口投与用の製剤としては、水溶性の形の活性化合物水溶液がある。更に、 活性成分の懸濁液は、適当な油状注射用懸濁剤として製造することができる。適 当な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油または合成脂肪酸 エステル、例えば、オレイン酸エチル若しくはトリグリセリド、或いはリポソー ムがある。水性注射用懸濁剤は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カル ボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含んで いてよい。場合により、懸濁液は、適当な安定剤、または化合物の溶解度を増加 させて高濃度溶液の製造を可能にする薬剤を更に含んでいてよい。 経口使用の製剤は、活性化合物と固体賦形剤とを混合し、場合により、得られ た混合物を粉砕し、そして所望ならば、錠剤または糖衣錠心を得るように適当な 添加剤を加えた後に、顆粒混合物を加工することによって得ることができる。適 当な賦形剤は、特に、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール またはソルビトールを含む糖；セルロース製剤、例えば、トウモロコシデンプン 、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカン トゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシ メチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）で ある。所望ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸若しくは その塩、例えば、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を加えてよい。 糖衣錠心は、適当なコーティングを伴って与えられる。この目的のために、場 合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポ リエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー液並びに適当な有 機溶剤または溶剤混合物を含んでいてよい濃厚糖溶液を用いることができる。同 定のためにまたは活性化合物用量の種々の組合わせを特徴付けるために、色素ま たは顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。 経口によって用いることができる製剤としては、ゼラチンから製造された押込 嵌めカプセル剤、並びにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの 可塑剤から製造された軟質密封カプセル剤がある。押込嵌めカプセル剤は、活性 成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタル ク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、そして場合により安定剤と の混合物で含むことができる。軟質カプセル剤において、活性化合物は、脂肪油 、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールなどの適当な液体中に溶解 させるかまたは懸濁させることができる。更に、安定剤を加えることができる。 論及された刊行物はいずれも、それぞれの刊行物中に挙げられた核酸配列およ びアミノ酸配列を含めて本明細書中に援用される。 他の実施態様も以下の請求の範囲の範囲内である。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                        Screening for NUC inhibitors                        Cross Reference of Related Applications   This application was filed October 25, 1993 by Mukherjee. U.S. Patent Application No. 0 entitled "Human Peroxisome Proliferator-Activated Receptor" No. 8 / 143,215, which is issued by McKersey, October 1993. Application No. 08 entitled "Human peroxisome proliferator-activated receptor" filed on the 22nd / 141,500 is a continuation of the specification; the disclosure of which is incorporated herein by reference. You.                                 Field of the invention   The present invention relates to peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) and thyroid glands. For screening drugs that are active against molecules related to lemon receptor (TR) I do. The present invention further provides a novel human peroxisomal enrichment designated hNUClB. Cloning and sequencing of growth factor active receptors.                                 Background of the Invention   Peroxisomes are subcellular organelles found in animals and plants . Peroxisomes are enzymes for cholesterol and lipid metabolism and respiration including.   Various chemical agents called peroxisome proliferators act on peroxisomes. Causes proliferation. Peroxisome proliferators include unsaturated fatty acids and blood fats. Fat-lowering drugs (Reddy, JK and Azarnov) f), D. L. (1980)Nature  283, 397-398), weeding Agents, leukotriene antagonists and plasticizers (for a review, see Green ( Green), S.M. ,Biochem. Pharmacol.43: 393-4 00, 1992). Low blood fat such as clofibrate Laxatives reduce plasma triglyceride and cholesterol levels, Beneficial in preventing ischemic heart disease in individuals with high levels of cholesterol (Havel, RJ and Kane). ), J. et al. P. ,Ann. Rev .. Pharmac.13: 287-308, 19 1973). However, the therapeutic use of such drugs is that clofibrate It is questionable because it is a carcinogen in rats.   There are two hypotheses for peroxisome proliferation. The "lipid overload hypothesis" is that fatty acids That increased intracellular levels of is a major stimulus for peroxisome proliferation Suggest (Nestle, PJ (1990)Ann. Re v. Nutr. 10 , 149-167, and Phillipsson (Phillips). on), B.I. E. FIG. Rothrock, D .; W. , Connor (Co nnor), W.C. E. FIG. Harris, W .; S. And Ellingwer (Illingworth), D.S. R. (1985)N. Engld. J. M ed. 312 , 1210-1216). Another hypothesis was receptor-mediated The mechanism is assumed. Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) It has been isolated and cloned from various species (Issman, I. And Greene, S.M. (1990)Nature  347, 645-650 Dreyer, C .; Krey, G .; , Hansjörg (Hansjorg), K. et al. Gibel, F .; , Herftenbine (Helftenbein), G.A. And Wahli, W.W. (199 2)Cell  68Gottricher, 879-887; ), M.C. Widmer, E .; Li, Q .; And Gus Gustafsson, J.A. A. (1992)Proc. Natl . Acad. Sci. USA. 89 , 4653-4657; Sher , T .; , Yi, H .; F. McBride, W.C. O. And Gonzales, F.M. J. (1993)Biochem istry   32, 5598-5604; and Schmidt , A. , N .; Endo, S.M. J. Ruttlege , R.A. Vogel, D.E. Shinar and G.S. A. Rodan (1992)Mol. Endocrinol. 6, 1 634-16414-8). No ligand for PPAR has yet been identified.   Isman and Green,Nature  347: 645-650, 1990 . Years were calculated from mouse liver complementary DNA (cDNA) libraries The xysome proliferator-activated receptor (mPPAR) gene was cloned. Gott Re USA.89: 4653-4657, 1992 is a rat liver cDNA library. From rat peroxisome proliferator-activated receptor (rPPAR) gene. Got a loan. PPAR from mouse and rat has 97% amino acid sequence They share the same and especially well-conserved putative ligand binding domains. Three members of the Xenopus nuclear hormone receptor superfamily ( That is, XPPARα, XPPARβ and XPPARγ) are also mPPA R have been found to be structurally and functionally related to R (Dreia et al.,Ce ll   68: 879-887, 1992)   Schmidt et al.Molecular Endocrinology  6:16 34-1641, 1992, a human osteosarcoma cell cDNA library The Lloyd hormone receptor gene hNUCl was cloned. Amino of hNUC1 The homology between the acid sequence and that of mPPAR is 62%.   Shah,Biochemistry  32: 5598-5604, 1993 In the year, the human PPAR gene was cloned from a human liver cDNA library. This clone has 85% nucleotide sequence homology with the mPPAR clone and 9 Has 1% amino acid sequence homology.   Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) is a member of the steroid receptor family Be a member. PPARs have several subgroups based on their primary sequence homology. Divided into Fang et al.Biochem. Biophy. Re s. Com. 196: 671-677, 1993, XPPARα, XPPA Rβ, XPPARγ, mPPAR and hNUCl were discussed.                                 Summary of the Invention   The present invention provides a human peroxisome proliferator-activated receptor subtype hNUC1B. Cloning, sequencing and expression. hNUC1B has one The amino acid sequence is changed to hNUCl by the amino acid (ie, alanine at position 292). different.   Applicants have reported that the hNUClB protein is hPPARα (US patent application Ser. HPPARα, which is referred to as hPPAR1 in US Pat. PAR) and inhibiting TR protein activity; and It has been confirmed that such reduction of suppression is therapeutically useful.   Therefore, the present invention relates to PPARα protein and TR protein activity. For identifying therapeutic agents that alleviate the inhibitory action of NUC proteins Diseases and pathological conditions affected by C protein activity levels, such as Treats, but is not limited to, hyperlipidemia, hypercholesterolemia and hyperlipoproteinemia It is characterized by the use of these drugs for treatment. These methods are based on the NUC Numerous therapeutic agents reduce the inhibition of PPARα or TR activity by proteins Natural, semi-synthetic or synthetic compounds.   "PPARα protein" includes hPPARα, but is not limited thereto. Substantially homologous to the PPARα protein (ie, 90% amino acid sequence (Which is homologous above) means a PPAR subtype protein.   “NUC protein” refers to hNUC1B protein, hNUC1 protein And a protein having a sequence homologous to hNUC1B or hNUC1 protein PPARα protein and / or TR protein, including but not limited to quality PPAR subtype protein or PP that suppresses the transcriptional activation activity of protein AR-related protein is meant.   The present invention further provides for regulating processes affected by NUC protein activity. Induced and caused by NUC protein activity levels Compounds, compositions and compositions useful for treating patients with And method. More specifically, the present invention relates to PPARα by NUC protein. COMPOUNDS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS TO REDUCE INHIBITION OF PROTEIN AND TR PROTEIN ACTIVITY About.   Thus, in one embodiment, the present invention provides a method for reducing NUC protein activity levels. A method for identifying a therapeutic agent for the treatment of a pathological condition affected thereby, comprising the steps of NU The above method comprising the step of screening for an inhibitor of C protein activity. You.   One method is for systems containing NUC and PPARα proteins. Of PPARα protein activity by NUC protein when added Identifying a therapeutic agent that alleviates the disease.   In a preferred embodiment, the system is for PPARα protein activation. Including a responsive reporter gene, suppression of PPARα by NUC protein Decreased or reduced regulation is measured by the expression level of the reporter gene .   A "reporter gene" is easily detected by techniques known to those of skill in the art. And the gene encoding the product to be tested. In the present invention, Porter genes include acyl coenzyme A oxidase, enoyl-CoA hydrater Ze / 3-hydrosacyl-CoA dehydrogenase bifunctional enzyme or 3-keto Including but not limited to the natural promoters of genes such as acylthiolases No promoter responsive to PPARα protein or TR protein Actuated by the motor.   In a further preferred embodiment, the screening assays are performed in cells.   In an even more preferred embodiment, the NUC gene, the PPARα gene and The reporter gene is encoded in the vector and is Is introduced into cells. Reporter gene is responsive to peroxisome proliferator Element (PPRE) and can be activated by PPARα protein .   In another more preferred embodiment, the screening assay comprises an in v It is performed in cell extracts by in vitro transcription.   In a third more preferred embodiment, screening for PPAR activators Add to the test.   "PPAR activator" refers to the activation of transcriptional activation of PPARα protein. Chemical agents that can be converted, such as, but not limited to, CFA (Clofibri Acid (clofibric acid)), ETYA (5,8,11,14-E) Eicosatetranoic acid) or WY-14,643 ([4-chloro-6- (2,3-xylidino) -2-pyrimi Dinylthio] acetic acid).   Another method is for systems containing NUC and TR proteins. When added, reduces the suppression of TR protein activity by NUC protein Identifying therapeutic agents.   In a preferred embodiment, the system is responsive to TR protein activity. Further comprising a reporter gene, wherein NUC suppresses or reduces TR by TR. It is measured by the expression level of the reporter gene.   In a further preferred embodiment, the screening assays are performed in cells.   In a still further preferred embodiment, the NUC gene, TR gene and reporter The target gene is encoded in the vector and Is introduced into the cell. The reporter gene has a thyroid hormone responsive element (TRE) And can be activated by the TR protein. TRE is limited Not all, but TREP (palindrome TRE) and DR4 (4 nucleotides) Tandem repeats with a pace of 5'-AGGTCACAGGAGGTCA-3 ') is there.   In another more preferred embodiment, the screening assay comprises an in v It is performed in cell extracts by in vitro transcription.   In a third more preferred embodiment, a screening assay for TR activators And activate TR.   "TR activator" means to activate the transcriptional activation activity of TR protein For example, but not limited to, LT3 (3,3 ', 5-triyo Do-L-thyronine), LT4 (L-thyroxine) or triac (Triac) (3,3 ′, 5-triiodotyroxyacetic acid).   A third method involves NUC protein and PPRE containing nucleic acids (eg, oligonucleotides). Nucleotide) when added to a system containing Identifying agents that reduce binding of proteins. The binding level was determined by gel Or other assays known to those skilled in the art.   A fourth method is for systems containing NUC and PPARα proteins. Identifies Agents that Reduce NUC-PPARα Complex Formation When Added Including doing.   In a preferred embodiment, the NUC protein is labeled and NUC-P The formation of the PARα complex was determined by the labeled NUC tag precipitated by the PPARα-specific antibody. It is measured by the amount of protein.   A fifth method is to add a system containing NUC protein and TR protein. Identifying agents that reduce the formation of the NUC-TR complex when No.   In a preferred embodiment, the NUC protein is labeled and NUC-T R complex formation is determined by the amount of labeled NUC protein precipitated by the TR-specific antibody. Is measured by   In another embodiment, the present invention provides that the level of NUC protein activity is A method for treating an affected pathological condition, said method comprising inhibiting said NUC protein activity Alternatively, the method is characterized by providing a reducing agent. By this method Pathologic conditions treated for, but not limited to, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, There is rollemia and hyperlipoproteinemia.   The present invention further relates to a novel or unique therapeutic agent, In other words, drugs not known per se or NUC protein activity levels Therefore, drugs not known to be used for the treatment of pathological conditions affected by I do.   Applicants believe that low molecular weight (10%) compounds can be readily formulated as useful therapeutics. Less than 5,000 daltons, preferably less than 5,000 daltons, and most preferably Or less than 1,000 Daltons).   Next, we screen for such drugs and make them available to healthy tissues. Has little or no effect and is induced or harmful by the NUC protein. Confirmed that it is specific for tissue having a pathological condition Can be used in therapy or prophylaxis. like this Even though new drugs have certain effects on healthy tissues, they It may still be useful in the therapeutic treatment of life-threatening diseases.   Next, the therapeutic agent found by the above assay is converted by methods known to those skilled in the art. Can be screened for tissue specificity and toxicity. They are , NUC protein activity, which can be in a pharmaceutically acceptable formulation For the treatment of diseases and pathological conditions induced or worsened by Can be.   Once identified, PPARα and TR proteins are identified using NUC inhibitors. The mechanism of NUC inhibition of quality activity can be studied. Techniques known to those skilled in the art For example, J.I. Sambrook, E.M. F. Fritsch (Fr itsch) and T.I. Maniatis,Molecula r Cloning: A Laboratory Manual , Second Edition, Co Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring) Harbor Laboratory Press), Cold Spring Applying what is described in Harbor, New York, 1989, The harmful agent may also be a NUC protein when the inhibitor binds to a NUC protein. Structural changes in quality, and interacts with other proteins and binds to DNA To study how the binding affects the ability of NUC proteins Can be.   Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description of the invention and the claims. It will be obvious.                              BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 (A-C) is a graph showing normalized luciferase activity. H The epG2 cells were prepared using the (A) vector pCMVhPPARα or pBKCMV (gene (See "Vector construction" in the detailed description of Ming.) And processed by CFA. Cells are pCMVhNUC1B (detailed description of the invention). See the detailed description “Vector construction”) or trans And treated with CFA (B) or ETYA (C), and Luciferase and β-galactosidase assays were performed as described in Materials and Methods. I went to.   FIG. 2 shows the normalized response of the reporter gene to increasing doses of hNUClB. This is a graph. HepG2 cells contain 0.1 μg of pCMVhPPARα and Transfected with increasing amounts of pCMVhNUClB (shown in μg) Was. CFA was added to a final concentration of 1 mM. Control cells contain an equal volume of ethanol ( Vehicle).   FIG. 3 (AE) shows the normalized responses of various receptors to hNUClB. It is rough. HepG2 cells were prepared using (A) the ER expression vector HEO (1 μg) and And pLPwtCAT (see "Vector Construction" in the Detailed Description of the Invention) ( 1.5 μg) reporter, (B) pRShRARα ("Bec" in the detailed description of the invention. And MTV-TRep2-LUC, (C) pRS hRARα and CRBPII-tk-LUC, (D) pRShTRβ (of the invention See "Vector construction" for detailed description) and MTV-TRep2-L Transfected by UC. 0.1 μg of expression plasmid and Lucif 0.5 μg of the cellulase reporter was used (BD). pCMVhNUC1B is Where indicated, 1 μg (A) and 0.1 μg (BD) were co-transformed. Sfected. Each ligand of the transfected receptor has a β -Estradiol (100 nM), ATRA (all-trans-retinoic acid) (1 μ M), 9-cis-RA (1 μM) and L-T3 (100 nM), Concentrations are shown in parentheses. Where indicated, add CFA to a final concentration of 1m M. In FIG. 3E, transfection was performed when the reporter gene was DR. Except having 2 copies of 4 elements (direct repeats separated by 4 nucleotides) Was performed as in the case of FIG. 3D. The sequence of the DR4 element used was 5'-AG GTCACAGGAGGTCA-3 '. Repeat sequences are listed in the upper row. Is shown.   FIG. 4 shows the relationship between hNUC1B according to the increase rate of hPPARα relative to hNUC1B. 4 is a graph showing the normalized response of hPPARα. HepG2 cells are pCM VhNUC1B 0.05 μg and different amounts of pCMVhPPARα plasmid (Shown in μg). Add CFA to final concentration The temperature was adjusted to 1 mM.   FIG. 5 is a radiograph of a gel delay test.   DNA binding assays are performed as described in Materials and Methods for pCMVhNUC1B or Or extract from COS cells transfected by pRShRXRα Was performed using Extract from mock transfected cells was used as control .                              Detailed description of the invention NUC protein and peroxisome proliferation   Gemfibrozil with significant cardioprotective action The effects of blood fat lowering drugs, such as, are mediated by PPARs. Human PPAR To study the effects of various fibrates on subtypes, Applicants Two human PPAR subtypes, PPARα and hNUClB, Isolated. Applicants have reported that hNUClB is capable of inhibiting PPAR activity such as clofibric acid. It was not activated by the activation factor. Further, the applicant has proposed that hNUC1 B is a transcriptional activator affected by PPARα and thyroid hormone receptors. It was confirmed that it was a specific inhibitor. N for PPARα and TR receptors The inhibitory effect of the UC protein is due to PPARα and TR activators (eg, (Brates, synthroids) may limit the clinical efficacy. Reduce this suppression Agents increase the activity of PPARα and TR and increase the efficacy of existing drugs Or make these drugs unnecessary.   HNUC1, a subtype of NUC protein, is activated by PPAR and TR. It has been found to be present in human heart, brain and liver tissue where it is sexual. Therefore, the screening method of the present invention and the drug identified thereby , Can be broadly therapeutically significant.   Applicants have identified hNUClB and RNU for the PPAR response element PPRE. The cooperative binding of XRα was demonstrated. You are not bound by any particular theory However, Applicants believe that the inhibition of PPARα by hNUClB was probably due to DNA Competition for binding or level of titration of factors required for PPARα and TR activity Suggest that it happens in hNUClB binds to PPRE It is believed that this can antagonize the activation of PPARα protein. COU P-TF (chicken albumin upstream promoter transcription factor) has a similar mechanism. Therefore, it is known that PPAR activation is inhibited (Miyata) , K .; S. Zhang, B .; Marcus, S .; L. Capone, J .; P. And Rakubinski k i), R.C. A. (1993)Journal. Biol. Chem. 268, 191 69-19172). If the transcriptional activation function of hNUClB is absent, this mechanism Could explain the suppression of PPARα activity by hNUClB.   Reference is now made to the following examples relating to screening for NUC inhibitors. Describes the invention in more detail. However, the present invention provides Not limited to co-transfection assays, gel delay assays and immunoprecipitation assays No. Skilled industry for assaying drugs that reduce the inhibitory effect of proteins on cell activity Other methods known to those skilled in the art can also be used.Example   Candidate agents include (A) for PPARα or TR-responsive gene derepression. Indirect evaluation or (B) NUC protein against PPARα or TR responsive element Direct evaluation for binding or (C) NUC protein and PPARα protein By direct assessment of complex formation with proteins or TR proteins. Can be cleaned.   The experimental procedures and reagents used in the examples described herein are described below. .reagent   ETYA, β-estradiol, ATRA, LT3 (3,3 ', 5-triyo C-LD-Tyrosine) and CFA were obtained from Sigma and WY- 14,643 is Chemsyn Science Laboratories (Chemsyn Sci. ence Laboratories), purchased from Lenexa, Kansas, USA did. Stock solutions of these compounds are ethanol, methanol or dimethyl sulfo Manufactured in oxide.   The preparation of buffers, media and solutions in the following examples is described in Sambrook, E.A. F . Fritsch and T.W. Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Ha Laboratories Press, Cold Spring Harbor, New York , 1989.Vector construction   For expression in mammalian cells, the hPPARα cDNA was cloned into pBKCMV (Str Cloning into NotI site of Stratagene and pCM VhPPARα was generated.   hNUClB cDNA was inserted directly into the SalI-SacII site of pBKCMV. Was cloned to generate pCMVhNUClB.   The reporter plasmid pPPREA3-tk-luc is an acyl-CoA ox Sidase gene regulatory sequences (Osumi, T., Wen, J . And Hashimoto, T .; (1991)Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 866-871) Part A Synthetic oligonucleotides containing a position (5'-CCCGACGTGACCTTTG TCCTGGTCC-3 ') was replaced with the previously described pBLtk-Lucif. Erase vectors (Gigure, V., Holenberg enberg), S.M. M. Rosenfeld, M .; G . Evans, R .; M. (1986)Cell  46, 645- 652) by insertion into the XhoI site 5 'of the tk promoter. Was made.   pRShRARa, pRSShRXRa, MTV-TRep2-LUC and C RBPII-tk-LUC is described in Gigre, V. et al. Ong, E.C. S. , Segi (Segui), P .; And Evans, R.A. M. (1987)Nature  3 30 (2), 624-629; Manglsdorf, D. J. , ON, E. S. Dyck, J .; A. And Evans, R . M. (1990)Nature  345, 224-229; Umesono (Umeson) sono), K. et al. Gigre, V .; Glass, C.I. K. And low Zembeld, M.A. G. FIG. (1988)Nature  336, 262-265; And Manglesdorf, D.M. J. Umesono, K .; , Kleiber er), S.M. A. Borgmeyer, U.S.A. , ON, E. S. And Evans, R.A. M. (1991)Cell  66, 555-561 Described.   pRShTRβ is available from Thomson, C .; C. And Evans, R. M. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 3494-3498.   Human TRα1 cDNA (Nakai A., Sakura ai), A.I. Bell, G .; I. And DeGroot t), L. J. (1988)Molec. Endoc. 2, 1087-1092 ) Is released from pME21 by digestion with EcoRI and Blunt ends by digestion with mung bean nuclease did. pRS plasmid (Zigre, V., Holenberg, SM, Rosenf Erdo, M .; G. FIG. Evans, R .; M. (1986)Cell  46 , 645-652) are digested with BamHI, dephosphorylated and digested. Repaired by Lennoy enzyme. Next, TRα1 cDNA was cloned into the vector. Linked by runt end ligation.   The TR expression plasmid HEO was obtained from (Kumar, V. and Chambo). (Chambon), P .; (1988)Cell  55145-156) Are listed.   The estrogen-induced brain creatine kinase promoter is located in pUCPLCAT. To generate pLPwtCAT.Co-transfection assay   HepG2 cells were transformed with 10% (v / v) fetal calf serum (Hycl (Hycl) one)), 2 mM L-glutamine and gentamicin (Biowhittaca) -(BioWhittaker)) Dulbecco Modified A supplemented with 55 μg / ml Were grown in Google media (DMEM). Cells were plated in 12-well cell culture dishes (cost 2 x 10 cells for HepG2 in CostarFivePieces / we Plates. The medium was replaced by fresh medium after 20 hours. 4 After time, DNA was added by the calcium phosphate co-precipitation technique (Burger (Be) rger), T.M. S. Paradish, Z .; , Perry ( Perry), B.S. And Stein, R.A. B. (1992)J. Steroid. Biochem. Molec. Biol. 41 , 733-73 8). Typically, 0.1 μg expression plasmid, β-gal expression plasmid pCH 110 (internal control) and 0.5 mg of reporter plasmid were added to each well. Added to le.   Where indicated, hNUC1B plasmid (repressor) 0-0.5 μg Was added. The suppressor plasmid dose should be adjusted to the appropriate amount of empty It was kept constant by adding the current vector pBKCMV. The total amount of DNA By adding pGEM DNA (Promega). maintained in μg.   After 14 hours, cells are washed with 1 × PBS and fresh medium (10% charcoal) Contains fetal bovine serum (high clone) stripped with and the above additives DMEM) was added. The ligand or PPAR activator is added to the indicated final concentration. Added to the degree. Control cells were treated with vehicle.   After an additional 24 hours, cells were harvested and luciferase and β-galactosyl Dase activity was measured by Dynatech ML1000 Luminome, respectively. And Beckman Biomek 100 Quantified at 0 workstation. The normalization reaction is based on the luciferase activity of the extract. Is divided by the same β-galactosidase activity. Each data point Is the average of three transfections. Error bars indicate the standard deviation from the mean. Indicates quasi-deviation. The CAT test is described by Ausbel, F. et al. M. , Bren Brent, R.A. Kingston, R .; E. FIG. , Mu (Moore), D.A. D. See, Seidman, J .; G. FIG. , Sumi Smith, J.M. A. And Struhl, K .; (198 7),Current Protocols in Molecular Bi oldy , Wiley Interscience ce).Gel delay test   COS cells were transformed with pCMVhNUC1B or pRShRXRα (Putashun ( Ptashne), M.P. (1988)Nature  335, 683-689). Transfected with 5 μg / 100 mm dish for 48 hours. Whole cell extract Four freeze-thaw cycles in buffer containing 0.4 M KCl, followed by centrifugation Manufactured by. Gel retardation was 10 mM Hepes (7.8), 5 0 mM KCl, 1 mM DTT, 2.5 mM MgClTwo, DIdC 0.5m 5 μg of cell extract in a buffer containing g / ml and 20% glycerol This was done by incubating at 4 ° C. for 5 minutes. next,32P-terminal label Add about 100,000 cpm of probe and incubate at 25 ° C for another 5 minutes did.   The protein-DNA complex was purified with 5% polyacrylamide gel in 0.5X TBE. Separation by electrophoresis on a plate. Acyl-coenzyme A used as a probe The PPRE sequence from the oxidase (AOX) gene 5'-CTAGCGATATCATGACCTTTGTCCTAGGCCC- 3 '(upper chain) and 5'-CTAGGAGGCCTAGGACAAAGTGTCATGATATCG- 3 '(lower chain) It is.Embodiment 1 FIG. Cloning of hPPARα   The human homologue of rat PPARα was ligated to the human liver 5'-extended Ibrary (Clontech). The library is With moderate stringency (40% formaldehyde at 37 ° C., 5 × S SC), rPPAR nicks specific for A / B and DNA binding domains Translation DNA fragments (EcoRI to BglII sites, nucleo Cid 450-909) (Gottricher, M., Widmer, E., Lee, Q. et al. And Gustavson, J.M. A. (1992)Proc. Natl. Acad. S ci. USA. 89 , 4653-4657). Correct Clones and Bluescript K for sequencing. Subcloned into the S vector (Stratagene). The sequence is at position 268. Shah et al. (Except that the two amino acids of lanine and glycine at position 296 are different. Shah, T. E., H .; F. McBride, W .; O. And Gonzales, F . J. (1993)Biochemistry  32, 5598-5604) Therefore, it is the same as published.   The activation profile of hPPARα by CFA is shown in FIG. 1A. This receptor Is also another known activation of PPARs in HepG2 and CV-1 cells Activated by factors such as WY-14,643 and ETYA.Embodiment 2. FIG. Cloning of hNUC1B   hNUClB was purified from rat PPAR DN using the procedure described in Example 1 above. Probe specific for the A-binding domain (PvuII-BglII site, Reotide 618-909, references (Gottricher, M., Widmer, E. et al. Lee, Q .; And Gustavson, J.M. A. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 , 4653-4657)) And isolated from a human kidney cDNA library. Recombinant clone Isolated, subcloned into pGEM-5Zf, and sequenced. This Is identical to that of the hNUCl sequence except for alanine at position 292. (Schmidt, A., N. Endo, SJ Rutledge, R. Vogel, D. Shiner and G.W. A. Rodin (1992)Mol. Endocrino l. 6 , 1634-1641).   hNUClB is a member of the PPAR group. hNUC1B is hPPAR 61% homologous to α and two cysteine residues in the “D” box are three Amino acids (E, R and S) at positions 112-114 of the amino acid sequence) Have been. This is the feature of PPAR (Dreia, C., Clay, G., Ha Nsjolg, K. Gibel, F .; Helftenbine, G .; And Wari, W.M. (1992)Cell  68879-887). All other nuclear receptors are the same. It has 5 amino acids in the same part.   The hNUC1B protein is different from hPPARα in that CFA, ETYA and Is transcriptionally activated by WY-14,643 in HepG2 and CV-1 cells. (FIGS. 1B and C). Slightly observed in the absence of transfected receptor Kana activation is believed to be due to the endogenous PPAR of the cell line used. This is also described in Schmidt, A .; , N .; Endo, S.M. J. Rutledge, R.A. Pho -Gel, D.E. Shiner and G.W. A. Rodin (1992)Mol. Endoc rinol. 6 HNUC1 and some fatty acids Observed together. This data is based on the PPAR activator-induced trigger in hNUClB. This suggests the absence of a lance activating function.   However, the transfected hNUClB was derived from endogenous PPAR. Decreased the response. This indicates that hNUC1B is a suppressor of hPPAR function. It was suggested that it could work. FIG. 4 shows increase in hPPARα relative to hNUC1B. This shows that the rate overwhelmed the suppression by hNUClB.Embodiment 3 FIG. Screening of hNUC1B inhibitor by co-transfection assay Learning   Increasing amounts of hNUC1B plasmid are added to a fixed amount of hPPARα expression plasmid. Thus, they were co-transfected into cells. FIG. 2 shows hN in the presence of CFA. 9 shows strong dose-dependent suppression of hPPARα activity by UC1B. Suppression is simultaneous 85% with 0.1 μg of transfected hNUClB plasmid Was. Inhibition by hNUCl was also observed in the presence of ETYA and WY-14,643. Rat PPAR (Gottrich, M., Widmer, E., Lee, Q . And Gustavson, J.M. A. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 , 4653-4657) and hPPARα Was done.   To confirm whether hNUC1B is a specific inhibitor of hPPARα In the meantime, the Applicant has reported that the production of hNUClB against other members of Was tested (FIGS. 3A-C).   hNUC1B inhibits their respective resources against ER and RARα activation. Gand has minimal effect. hNUC1B is in the absence of CFA Does not inhibit RXRa, but only 25% inhibition was detected in the presence.   However, for hTRβ1 and palindrome TRE, CFA In the absence, hNUC1 showed 65% suppression (FIG. 3D). CFA In the presence of increased inhibition increased to 75%. Less about hTRα To a lesser extent, suppression was observed.   Thus, hNUClB is not a general transcription repressor, but hPPARα And a dominant negative inhibitor of hTR. Inhibition in the absence of clofibric acid But what happened was promoted in its presence.   hNUC1B inhibits PPARα and agents that reduce TR activity To clean, PPARα and hNUC1B or TR and hN The UC1B expression plasmid was converted to CV-1 (monkey kidney cell line) or HepG2 (human In hepatocyte cells, PPAR activators (eg, clofibric acid, WY- 14,643) or in the presence of a TR activator (eg, LT3) A reporter comprising an AR or TR binding element (eg, PPRE or TRE); Co-transfect together.   Clofibric acid or LT3 usually activates their respective receptors And will therefore give a strong signal. In the presence of hNUC1B Thus, due to the inhibition of these receptors by hNUClB, the signal is extremely Will be weak. Applicants have shown that various compounds can be administered to transfected cells. And select those that reduce the inhibition by hNUClB.   The above screening scheme also involves the use of appropriate vectors and reporters It will be performed in a matrix assay.Embodiment 4. FIG. Screening of hNUClB inhibitors by gel delay assay   The gel retardation assay shows that hNUClB binds to the PPAR element PPRE. I showed you. With hNUClB or hRXRa alone, a slightly delayed complex Coalescence was seen (FIG. 5, lanes 1 and 2). The addition of RXRα results in hNUC1B HNUC1B and hRXRα synergistic to PPRE Demonstration of binding. Similar results are seen for mPPARα and rPPAR (Kliewer, SA, Umesono, K., Noonan (N oonan), D.C. J. Heyman, R .; A. And Evans , R .; M. (1992)Nature(London)358, 771-774; And Isman, I .; Prince, R .; A. , Tagwood (Tu gwood), J.M. D. And Greene, S.M. (1993)Biochemie   75, 251-256; Gearing, K. et al. L. , Gottli Heer, M .; Tebouul, M .; , Widmark k), E. And Gustavson (1993)Proc. Natl. Acad. S ci. USA. 90 , 1440-1444).   hNUClB activates PPARα or TR by these receptors. Because it can be easily suppressed by binding to a normally bound DNA sequence Applicants have discovered that the hNUClB-PPRE conjugate can be added during the ligation reaction. Are screened for compounds that interfere with the production of A similar reaction assay is TRα And TRβ.Embodiment 5 FIG. Screening of hNUClB inhibitor by immunoprecipitation assay   hNUClB is easily dimerized and inactive with PPARα or TR Produces a heterodimer. hNUC1B inhibits PPARα and TR activity To screen for alleviating agents, Applicants report that labeled hN Mix UC1B with unlabeled TR or PPARα. Next, TR or PPA HNUClB-TR or hNUClB-PPARα using Ra specific antibodies. Each complex is immunoprecipitated. A test compound is added to the formulation and Only those that disrupt the formation of these heterodimers are selected. Next, these compounds Whether they reduce the suppression of PPAR and TR by hNUClB Further testing is done by the method described above to check.Embodiment 6 FIG. Toxicity testing of putative NUC inhibitors   The method comprises providing an active agent in any of the above methods for healthy cells. Given to see if it has little or no effect. Next, Agents in pharmaceutically acceptable buffers or useful in standard animal tests Formulate in buffer.   "Pharmaceutically acceptable buffer" refers to a pharmaceutically effective amount of an agent described herein. In a pharmaceutically acceptable carrier or diluent for storage and subsequent administration. Means any buffer that can be used in the prepared pharmaceutical composition. Therapeutic use Acceptable carriers or diluents are well known in the pharmaceutical art and include, for example, ,Remington's Pharmaceutical Sciences , Mac Publishing Company o. ) (A. R. Gennaro, 1985) I have. Preservatives, stabilizers, dyes, and flavoring agents may also be provided in the pharmaceutical composition. . For example, sodium benzoate, sorbic acid, and p-hydroxybenzoic acid Steal Can be added as a preservative. Ibid., 1449. In addition, antioxidants and Suspending agents can be used. Same as above.   A. Another Screen for Toxicity: Method 1   The toxicity of putative NUC inhibitors on cultured human cells is evaluated. This evaluation was based on 2,3-bis [2-methoxy-4-nitro-5, also referred to as XTT. -Sulfonylphenyl] -5-[(phenylamino) carbonyl] -2H-tetra Lazolium hydroxide] based on the ability of living cells to reduce (Pau 11) et al.J. Heterocyl. Chem.25: 763-767 (198 7); Weislow et al. (1989),J. Natl. Canc . Inst. 81: 577).   Viable mammalian cells are capable of reducing NN bonds in the tetrazole ring of XTT. To form XTT formazan. Dead cells or energy Cells with impaired lug metabolism cannot undergo this cleavage reaction. The degree of cleavage is It is directly proportional to the number of live cells tested.   Cells from human cell lines, such as HeLa cells, are transferred to 96-well microtiter plates Cell culture medium (Dulbecco's modified essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum) 10) in 0.1 mlThreeSeeds per well. 95% air, COTwo5% atmosphere The cells are attached to the plate by culturing at 37 ° C. in.   After overnight culture, the solution of the test substance was added 8 times to the wells in duplicate. At a concentration that indicates a half-order log dilution of In parallel, used to dissolve the test substance The resulting solvent is added to the other wells in duplicate. Cell culture For a period of time, typically 24 hours.   At the end of that time, dissolve XTT and coupler (methylphenazonium sulfate). Fluid was added to each test well and incubation continued for an additional 4 hours Later, the optical density of each well is measured at 450 nm in an automatic plate reader . Kill mammalian cells or damage their energy metabolism, or Substances that slow their growth are compared to wells that did not receive the test substance. Detected by a decrease in optical density at 450 nm in the pooled wells.   B. Another Screen for Toxicity: Method 2   On cytotoxic effects of putative NUC inhibitors on cultured human cell lines As an indicator of cell viability35Using incorporation of S-methionine into proteins test.   HeLa cells were plated in a 96-well plate with 10% fetal bovine serum and Dulbecco's minimal supplementation with 50 μg / ml of nicillin and streptomycin Grow in medium. First, add 10 cellsThreeCells / well, 0.1 ml / well Seed with. Cells were grown for 48 hours without exposure to NUC inhibitor Later, the medium was removed and various dilutions of NUC inhibitor prepared in complete medium Is added to each well, but control wells receive no NUC inhibitor.   The cells are incubated for a further 48-72 hours. Change medium every 24 hours Replace with fresh medium containing the same concentration of NUC inhibitor. Next, remove the medium, Replace with complete medium without NUC inhibitor.   After incubating the cells for 24 hours in the absence of a NUC inhibitor, the protein Into35Survivability is estimated by S uptake. Remove the medium and remove methionine. Replace with complete medium containing and incubate for 30 minutes. Remove the medium again, Does not contain methionine35Exchange with complete medium containing 0.1 μCi / ml of S-methionine Replace. Incubate the cells for 3 hours.   After washing the wells three times in PBS, the wells were added by adding 100% methanol. To infiltrate the cells for 10 minutes. Add ice-cold 10% trichloroacetic acid (TCA) and add Fill well; incubate plate on ice for 5 minutes. This TCA cleaning Repeat two more times. The wells are washed again in methanol and air dried. Add 50 μl of scintillation cocktail to each well and centrifuge Therefore, it is dried on the well. The plate is exposed to X-ray film. Using densitometer scanning of autoradiograms containing NUC inhibitor-free wells Dose that does not allow 50% of the cells to survive (ID50) (Animal cell culture) . Basic technical manual. (1987) R.A. Ian Fresney hney). John Willy and Sons, Inc. (Jo hn Wiley & Sons, Inc. ),New York).Embodiment 7 FIG. Formulation and administration of NUC inhibitors   Certain drugs that affect hNUCl activity and the pathological condition of interest are patients Alone or with a suitable carrier or excipient or excipients Can be administered in a pharmaceutical composition that has been mixed with   Indicates a pathological condition induced or exacerbated by hNUCl activity levels In treating a patient, a therapeutically effective amount of one or more of these drugs is administered. I do. A “therapeutically effective amount” is one or more of the disease or condition of the patient. Means an amount that reduces (to some extent) symptoms. Further, a "therapeutically effective amount" Physiological or biochemical parameters related or responsible for the disease or condition Refers to the amount that restores normal or partial recovery to normal.   The toxic and therapeutic efficacy of such compounds has been demonstrated in cell cultures or experimental animals. Pharmaceutical standard methods, such as LD50(Lethal dose for 50% of the population) and ED50 (Therapeutically effective amount in 50% of the population). You. Each candidate compound attenuates hNUCl-induced suppression of PPRAα and TR Cell lines, animal models, and those known to those of skill in the Methods approved by the Food and Drug Administration, including, but not limited to, US Gazette 47 (No. 56): 12558-12564, Method published on March 23, 1982 Tested in a controlled clinical experiment using The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index And LD it50/ ED50It can be expressed as a ratio. Large therapeutic index Compounds are preferred. The data obtained from these cell culture assays and animal studies Can be used to formulate a range of doses for use in humans. You. The dose of such compounds should be such that ED with little or no toxicity50Including circulation It is preferably within the range of the ring concentration. The dosage depends on the dosage form used and the It may vary within this range depending on the route of administration.   For any compound used in the method of the invention, the therapeutically effective amount will be It can be estimated initially from cell culture assays. For example, in animal models, IC measured in cell culture50Circulating plasma concentration range that includes Half-maximal destruction of the body, or half-maximal inhibition of cellular levels and / or activity of complex components A dose that reaches the concentration of the test compound that causes harm) can be formulated. like this Such information can be used to more accurately determine useful doses in humans. Plasma concentrations can be measured, for example, by high performance liquid chromatography. it can.   The exact formulation, route of administration, and dosage will be determined by the individual physician, taking into account the patient's condition. (Eg, Fingl et al.,The P Pharmacological Basis of Therapeutics , 1975, Chapter 1, page 1). How your doctor will administer medication And when it should be terminated, interrupted or adjusted by toxicity or organ dysfunction It should be noted that the decision will be made by The doctor in charge also If clinical response is inappropriate, adjust treatment to higher levels (excluding toxicity). To remove). Of dose in the treatment of cardiovascular disorders of interest The degree may vary with the severity of the condition being treated and for the route of administration. it can. Severity may be assessed, for example, in part by standard prognostic sign evaluation methods. Can be valued. In addition, the dose and possibly the number of doses will vary depending on the individual patient. It will also depend on age, weight and response. Similar to that discussed above The program can be used in veterinary medicine.   Depending on the particular condition being treated, such agents may be formulated and administered systemically or locally. Can be administered locally. Techniques for formulation and administration are:Remingto n's Pharmaceutical Sciences , Volume 18, Mac · Seen at the Publishing Company, Easton, PA (1990) Wear. Suitable routes include oral, anal, transdermal, transvaginal, Membrane or intestinal administration; intramuscular, subcutaneous, intramedullary injection, and intraspinal, direct intraventricular, venous Parenteral delivery may include intra-, intraperitoneal, intra-nasal or intra-ocular injection. Wear.   For injection, an agent of the invention may be in an aqueous solution, preferably a physiologically compatible buffer. For example, it can be incorporated into Hanks's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer. it can. For such transmucosal administration, penetrants appropriate to the barrier to be permeated are included in the formulation. Used in Such penetrants are generally known in the art.   Formulations suitable for systemic administration of the compounds disclosed herein for the practice of the present invention The use of a pharmaceutically acceptable carrier to formulate a pharmaceutically acceptable carrier is within the scope of the invention. Carrier With the appropriate choice of and the appropriate manufacturing practice, the compositions of the present invention, in particular, Formulations can be administered parenterally, such as by intravenous injection. Conversion The compound is orally administered using a pharmaceutically acceptable carrier well known in the art. Can be easily formulated into a suitable dosage form. Such a carrier is a compound of the present invention. Tablets, pills, capsules, liquids, gels for oral ingestion by the patient being treated Agents, syrups, slurries, suspensions and the like.   Agents for intracellular administration can be administered using techniques well known to those skilled in the art. it can. For example, such agents are encapsulated in liposomes and then Can be administered. Liposomes are spherical lipid bilayers that contain an aqueous interior. All molecules present in the aqueous solution at the time of liposome formation are contained within the aqueous interior. Re Pososome contents are protected from the external microenvironment, and liposomes interact with cell membranes. Because they fuse, they are efficiently supplied into the cytoplasm. Furthermore, due to their hydrophobicity Alternatively, small organic molecules can be administered directly into cells.   Pharmaceutical compositions suitable for use in the present invention include those in which the active ingredient There are compositions that are included in an effective amount to achieve Determination of an effective amount is described herein. It is well within the capabilities of those skilled in the art, especially in light of the detailed disclosure provided.   In addition to the active ingredient, these pharmaceutical compositions will allow the active compound to be used pharmaceutically. Suitable pharmaceuticals, including excipients and additives to facilitate processing into May include an acceptable carrier. Formulations formulated for oral administration include tablets, sugar It may be in the form of a tablet, capsule or liquid.   The pharmaceutical compositions according to the invention can be prepared in a manner known per se, for example by means of conventional mixing. Dissolution, granulation, dragee production, elutriation, emulsification, encapsulation, entrapment or lyophilization It can be manufactured by a drying process.   Formulations for parenteral administration include aqueous active compound solutions in water-soluble form. Furthermore, Suspensions of the active ingredients may be prepared as appropriate oily injection suspensions. Suitable Suitable lipophilic solvents or vehicles include fatty oils such as sesame oil or synthetic fatty acids. Esters, such as ethyl oleate or triglycerides, or liposomes There is a system. Aqueous injection suspensions are substances that increase the viscosity of the suspension, such as Including sodium boxymethylcellulose, sorbitol or dextran May be. In some cases, suspensions may increase the solubility of suitable stabilizers or compounds It may further comprise an agent which allows the production of a highly concentrated solution.   Preparations for oral use are obtained by mixing the active compound with a solid excipient and, optionally, Milled, and if necessary, suitable for obtaining tablets or dragees. It can be obtained by processing the granule mixture after adding the additives. Suitable Such excipients are, in particular, fillers, such as lactose, sucrose, mannitol Or sugars containing sorbitol; cellulose preparations, such as corn starch , Wheat starch, rice starch, potato starch, gelatin, tragacan Rubber, methylcellulose, hydroxypropyl methylcellulose, carboxy With sodium methylcellulose and / or polyvinylpyrrolidone (PVP) is there. If desired, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar or alginic acid or A disintegrant such as a salt thereof, for example, sodium alginate, may be added.   Dragee cores are provided with suitable coatings. For this purpose, Depending on the case, gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, carbopol gel, Ethylene glycol and / or titanium dioxide, lacquer solution and suitable Concentrated sugar solutions, which may include organic solvents or solvent mixtures, can be used. same Dyes or to characterize different combinations of active compound doses. Alternatively, pigments can be added to the tablets or dragee coatings.   Preparations that can be used orally include indentations made from gelatin Fitted capsules, such as gelatin and glycerol or sorbitol There are soft, sealed capsules made from plasticizers. Push-fit capsules are active Ingredients include fillers such as lactose, binders such as starch, and / or Lubricating agents such as butter or magnesium stearate, and optionally stabilizers Can be included in the mixture. In soft capsules, the active compounds are fatty oils Dissolved in a suitable liquid, such as liquid paraffin or liquid polyethylene glycol Can be suspended or suspended. In addition, stabilizers can be added.   Any publications discussed are subject to the nucleic acid sequences and nucleic acid sequences listed in their respective publications. And amino acid sequences are incorporated herein.   Other embodiments are also within the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, C N, CZ, ES, FI, GE, HU, IS, JP, KE , KG, KP, KR, KZ, LK, LT, LV, MD, MG, MN, MW, NO, NZ, PL, PT, RO, R U, SD, SG, SI, SK, TJ, TT, UA, UZ , VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． ＮＵＣタンパク質活性レベルによって影響される病理学的状態の治療用 の治療薬をスクリーニング方法であって、ＮＵＣタンパク質活性の阻害剤をスク リーニングする工程を含む上記方法。 ２． 前記スクリーニングが、 可能性のある薬剤と、ＮＵＣタンパク質およびＰＰＡＲαタンパク質を含む系 とを接触させ、ここにおいて該ＰＰＡＲαタンパク質の活性は該ＮＵＣタンパク 質によって抑制されまたは低下し； 該ＰＰＡＲαタンパク質の活性を測定する 工程を含み； ここにおいて該薬剤の不存在下の活性と比較された該ＰＰＡＲαタンパク質の 活性の増加は、該薬剤が前記状態の治療に有用であるかもしれないという指標で ある請求項１に記載の方法。 ３． 前記系が、前記ＰＰＡＲαタンパク質活性によって発現が活性化される リポーター遺伝子を更に含み；そして該ＰＰＡＲαタンパク質活性が該リポータ ー遺伝子の発現レベルによって測定される請求項２に記載の方法。 ４． 前記系が細胞を含む請求項３に記載の方法。 ５． 前記ＮＵＣタンパク質が、前記細胞中にトランスフェクトされたベクタ ーから発現される請求項４に記載の方法。 ６． 前記ＰＰＡＲαタンパク質が、前記細胞中にトランスフェクトされたベ クターから発現される請求項４に記載の方法。 ７． 前記リポーター遺伝子が、ベクター中において前記細胞中にトランスフ ェクトされている請求項４に記載の方法。 ８． 前記系が細胞の抽出物を含む請求項３に記載の方法。 ９． 前記系がＰＰＡＲ活性化因子を更に含む請求項３に記載の方法。 １０．前記活性化因子が、ＣＦＡ、ＥＴＹＡおよびＷＹ−１４，６４３から成 る群より選択される請求項９に記載の方法。 １１．前記リポーター遺伝子がＰＰＲＥ要素を含む請求項３に記載の方法。 １２．前記ＮＵＣタンパク質がｈＮＵＣ１Ｂタンパク質から成る請求項２に記 載の方法。 １３．前記ＮＵＣタンパク質がｈＮＵＣ１タンパク質から成る請求項２に記載 の方法。 １４．前記スクリーニングが、 可能性のある薬剤と、ＮＵＣタンパク質およびＴＲタンパク質を含む系とを接 触させ、ここにおいて該ＴＲタンパク質の活性は該ＮＵＣタンパク質によって抑 制されまたは低下し； 該ＴＲタンパク質の活性を測定する 工程を含み； ここにおいて該薬剤の不存在下の活性と比較された該ＴＲタンパク質の活性の 増加は、該薬剤が前記状態の治療に有用であるかもしれないという指標である請 求項１に記載の方法。 １５．前記系が、前記ＴＲタンパク質活性によって発現が活性化されるリポー ター遺伝子を更に含み；そして該ＴＲタンパク質活性が該リポーター遺伝子の発 現レベルによって測定される請求項１４に記載の方法。 １６．前記系が細胞を含む請求項１５に記載の方法。 １７．前記ＮＵＣタンパク質が、前記細胞中にトランスフェクトされたベクタ ーから発現される請求項１６に記載の方法。 １８．前記ＴＲタンパク質が、前記細胞中にトランスフェクトされたベクター から発現される請求項１６に記載の方法。 １９．前記リポーター遺伝子が、ベクター中において前記細胞中にトランスフ ェクトされている請求項１６に記載の方法。 ２０．前記系が細胞の抽出物を含む請求項１５に記載の方法。 ２１．前記系がＴＲ活性化因子を更に含む請求項１５に記載の方法。 ２２．前記活性化因子が、ＬＴ３、ＬＴ４およびトリアクから成る群より選択 される請求項２１に記載の方法。 ２３．前記リポーター遺伝子がＴＲＥ要素を含む請求項１５に記載の方法。 ２４．前記ＮＵＣタンパク質がｈＮＵＣ１Ｂタンパク質から成る請求項１４に 記載の方法。 ２５．前記ＮＵＣタンパク質がｈＮＵＣ１タンパク質から成る請求項１４に記 載の方法。 ２６．前記スクリーニングが、 可能性のある薬剤と、ＮＵＣタンパク質およびＰＰＲＥ要素を含む核酸を含む 系とを接触させ、ここにおいて該ＮＵＣタンパク質は該核酸に対して結合して複 合体を生成し； 該ＮＵＣタンパク質と該核酸との間の結合の活性レベルを測定する 工程を含み； ここにおいて該薬剤の不存在下の結合と比較された結合の減少は、該薬剤が前 記状態の治療に有用であるかもしれないという指標である請求項１に記載の方法 。 ２７．前記測定が、前記複合体中の前記核酸と前記複合体を含まない前記核酸 との比率を決定することを含む請求項２６に記載の方法。 ２８．前記ＮＵＣタンパク質がｈＮＵＣ１Ｂタンパク質から成る請求項２６に 記載の方法。 ２９．前記ＮＵＣタンパク質がｈＮＵＣ１タンパク質から成る請求項２６に記 載の方法。 ３０．前記スクリーニングが、 可能性のある薬剤と、ＮＵＣタンパク質およびＰＰＡＲαタンパク質を含む系 とを接触させ、ここにおいて該ＮＵＣタンパク質は該ＰＰＡＲαタンパク質に対 して結合してＮＵＣ−ＰＰＡＲα複合体を生成し； 該ＮＵＣ−ＰＰＡＲα複合体の量を測定する 工程を含み； ここにおいて該薬剤の不存在下の量と比較された該ＮＵＣ−ＰＰＡＲα複合体 の量の減少は、該薬剤が前記状態の治療に有用であるかもしれないという指標で ある請求項１に記載の方法。 ３１．前記系がＰＰＡＲα抗体を含み、そして前記測定が、該ＰＰＡＲα抗体 によって沈降した前記ＮＵＣ−ＰＰＡＲα複合体の量を決定することを含む請求 項３０に記載の方法。 ３２．前記ＮＵＣタンパク質が放射性元素によって標識されている請求項３１ に記載の方法。 ３３．前記ＮＵＣタンパク質がｈＮＵＣ１Ｂタンパク質から成る請求項３０に 記載の方法。 ３４．前記ＮＵＣタンパク質がｈＮＵＣ１タンパク質から成る請求項３０に記 載の方法。 ３５．前記スクリーニングが、 可能性のある薬剤と、ＮＵＣタンパク質およびＴＲタンパク質を含む系とを接 触させ、ここにおいて該ＮＵＣタンパク質は該ＴＲタンパク質に対して結合して ＮＵＣ−ＰＰＡＲα複合体を生成し； 該ＮＵＣ−ＴＲ複合体の量を測定する 工程を含み; ここにおいて該薬剤の不存在下の量と比較された該ＮＵＣ−ＴＲ複合体の量の 減少は、該薬剤が前記状態の治療に有用であるかもしれないという指標である請 求項１に記載の方法。 ３６．前記系がＴＲ抗体を含み、そして前記測定が、該ＴＲ抗体によって沈降 した前記ＮＵＣ−ＴＲ複合体の量を決定することを含む請求項３５に記載の方法 。 ３７．前記ＮＵＣタンパク質が放射性元素によって標識されている請求項３６ に記載の方法。 ３８．前記ＮＵＣタンパク質がｈＮＵＣ１Ｂタンパク質から成る請求項３５に 記載の方法。 ３９．前記ＮＵＣタンパク質がｈＮＵＣ１タンパク質から成る請求項３５に記 載の方法。 ４０．ＮＵＣタンパク質活性のレベルによって影響される病理学的状態の治療 方法であって、前記ＮＵＣタンパク質活性を抑制するまたは低下させる薬剤を提 供する工程を含む上記方法。 ４１．前記病理学的状態が、高脂血症、高コレステロール血症および高リポタ ンパク血症から成る群より選択される請求項４０に記載の方法。 ４２．配列番号１で示されたヌクレオチド配列を含む精製核酸。 ４３．請求項４２に記載の核酸を含むベクター。 ４４．請求項４２に記載の前記核酸から発現される組換え体ｈＮＵＣ１Ｂタン パク質。[Claims]   1. For treating pathological conditions affected by NUC protein activity levels A method of screening for a therapeutic agent for a drug, comprising screening for an inhibitor of NUC protein activity. The above method comprising the step of leaning.   2. Said screening,   Potential drug and system containing NUC protein and PPARα protein Wherein the activity of the PPARα protein is determined by the NUC protein Inhibited or reduced by quality;   Measuring the activity of the PPARα protein Including steps;   Wherein the PPARα protein compared to the activity in the absence of the drug Increased activity is an indicator that the agent may be useful in treating the condition. The method of claim 1.   3. The system is activated for expression by the PPARα protein activity Further comprising a reporter gene; and wherein said PPARα protein activity is -The method according to claim 2, which is measured by the expression level of the gene.   4. 4. The method of claim 3, wherein said system comprises a cell.   5. Vector wherein the NUC protein has been transfected into the cell 5. The method of claim 4, wherein said method is expressed from   6. The PPARα protein is transfected into the cells. 5. The method of claim 4, wherein said method is expressed from a vector.   7. The reporter gene is transferred into the cell in a vector. 5. The method according to claim 4, wherein the method comprises:   8. 4. The method of claim 3, wherein said system comprises an extract of a cell.   9. 4. The method of claim 3, wherein said system further comprises a PPAR activator.   10. The activator comprises CFA, ETYA and WY-14,643. 10. The method of claim 9, wherein the method is selected from the group consisting of:   11. 4. The method according to claim 3, wherein said reporter gene comprises a PPRE element.   12. 3. The method according to claim 2, wherein the NUC protein comprises a hNUClB protein. The method described.   13. 3. The method according to claim 2, wherein the NUC protein comprises a hNUC1 protein. the method of.   14． Said screening,   Connect potential drugs to systems containing NUC and TR proteins Wherein the activity of the TR protein is suppressed by the NUC protein Control or decline;   Measuring the activity of the TR protein Including steps;   Here, the activity of the TR protein compared to the activity in the absence of the agent. An increase is an indication that the agent may be useful in treating the condition. The method of claim 1.   15. A reporter system wherein expression is activated by the TR protein activity. Further comprising a reporter gene; and wherein said TR protein activity is 15. The method of claim 14, measured by a current level.   16. 17. The method of claim 15, wherein said system comprises a cell.   17． Vector wherein the NUC protein has been transfected into the cell 17. The method of claim 16, wherein said method is expressed from   18. A vector in which the TR protein is transfected into the cell 17. The method of claim 16, wherein the method is expressed from   19. The reporter gene is transferred into the cell in a vector. 17. The method of claim 16, wherein the method comprises:   20. 16. The method of claim 15, wherein said system comprises an extract of a cell.   21. 16. The method of claim 15, wherein said system further comprises a TR activator.   22. The activator is selected from the group consisting of LT3, LT4 and Triac 22. The method of claim 21, wherein the method is performed.   23. 16. The method according to claim 15, wherein said reporter gene comprises a TRE element.   24. 15. The method according to claim 14, wherein the NUC protein comprises a hNUClB protein. The described method.   25. 15. The method of claim 14, wherein the NUC protein comprises a hNUCl protein. The method described.   26. Said screening,   Includes potential agents and nucleic acids containing NUC protein and PPRE elements Contacting the NUC protein with the nucleic acid to bind to the nucleic acid. Producing coalescence;   Measuring the level of activity of binding between the NUC protein and the nucleic acid Including steps;   Here, the decrease in binding as compared to the binding in the absence of the agent indicates that the agent 2. The method of claim 1, which is an indicator that it may be useful in treating the condition. .   27. The measurement may be such that the nucleic acid in the complex and the nucleic acid without the complex 27. The method of claim 26, comprising determining a ratio to:   28. 27. The method of claim 26, wherein the NUC protein comprises a hNUClB protein. The described method.   29. 27. The method according to claim 26, wherein the NUC protein comprises the hNUCl protein. The method described.   30. Said screening,   Potential drug and system containing NUC protein and PPARα protein Wherein the NUC protein is associated with the PPARα protein. To form a NUC-PPARα complex;   Measuring the amount of the NUC-PPARα complex Including steps;   Wherein the NUC-PPARα complex is compared to an amount in the absence of the agent. A decrease in the amount of is an indication that the agent may be useful in treating the condition. The method of claim 1.   31. The system comprises a PPARα antibody, and wherein the measuring comprises detecting the PPARα antibody Determining the amount of said NUC-PPARα complex precipitated by Item 30. The method according to Item 30,   32. 32. The NUC protein is labeled with a radioactive element. The method described in.   33. 31. The method of claim 30, wherein said NUC protein comprises the hNUClB protein. The described method.   34. 31. The method of claim 30, wherein the NUC protein comprises a hNUCl protein. The method described.   35. Said screening,   Connect potential drugs to systems containing NUC and TR proteins Wherein the NUC protein binds to the TR protein Producing a NUC-PPARα complex;   Determining the amount of the NUC-TR complex Including steps;   Where the amount of the NUC-TR complex compared to the amount in the absence of the agent A decrease is an indication that the agent may be useful in treating the condition. The method of claim 1.   36. The system comprises a TR antibody, and the measurement is performed by precipitation with the TR antibody. 36. The method of claim 35, comprising determining the amount of said NUC-TR complex. .   37. 37. The NUC protein is labeled with a radioactive element. The method described in.   38. 36. The method of claim 35, wherein the NUC protein comprises a hNUClB protein. The described method.   39. 36. The method of claim 35, wherein the NUC protein comprises a hNUCl protein. The method described.   40. Treatment of pathological conditions affected by levels of NUC protein activity A method for inhibiting or reducing the NUC protein activity. The above method comprising the step of providing.   41. The pathological condition is hyperlipidemia, hypercholesterolemia and hyperlipota. 41. The method of claim 40, wherein the method is selected from the group consisting of proteinemia.   42. A purified nucleic acid comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.   43. A vector comprising the nucleic acid of claim 42.   44. A recombinant hNUClB tan expressed from the nucleic acid of claim 42. Park quality.
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