JPH10501974A - Methods and compositions for cDNA synthesis - Google Patents

Methods and compositions for cDNA synthesis

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JPH10501974A JP8502600A JP50260095A JPH10501974A JP H10501974 A JPH10501974 A JP H10501974A JP 8502600 A JP8502600 A JP 8502600A JP 50260095 A JP50260095 A JP 50260095A JP H10501974 A JPH10501974 A JP H10501974A
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Abstract

(57)【要約】 合成ポリヌクレオチド鋳型分子が用いられる、ｃＤＮＡを合成する方法及び組成物が開示される。 (57) SUMMARY Disclosed are methods and compositions for synthesizing cDNA using a synthetic polynucleotide template molecule.

Description

【発明の詳細な説明】 ｃＤＮＡ合成のための方法及び組成物 技術分野 本発明はＤＮＡ合成、そしてより詳しくは相補的ＤＮＡ合成のための方法及び 組成物に係わる。発明の背景 本発明は分子生物学のための道具である。分子生物学の術語、ＤＮＡ、ＲＮＡ 及びタンパクの構造、及びこれら分子間の相互関係についての概説は、Darnell et al.の Synthesis of Proteins and Nucleic Acids 第４章、Molecular Cell Biology，Scientific American Books（1989）に見られる。これらの問題につい ては、Darnell et al.,（1989）の本文全体及び Lewin，Genes IV，Oxford Univ ersity Press（1990）に、より詳細に取り扱われている。 遺伝情報は生物の遺伝子にコードされている。遺伝子は核酸のポリマーからな る。高等生物ではこの核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。ＤＮＡは４種 のヌクレオチド塩基の連続からなり、遺伝子に担持される遺伝子情報はＤＮＡ分 子中のヌクレオチド塩基の特異的配列によりコードされる。構造遺伝子内の遺伝 情報はタンパクをコードし、特定のタンパクの配列及び構造（従って機能）は、 そのタンパクをコードする遺伝子内のヌクレオチド塩基の順序により決定される 。タンパクは、細胞構造から環境に対するその生物の応答まで、生物のアイデン ティティーを決定する。即ち、これらのタンパクをコードする遺伝子が生物のア イデンティティーを決定する。 構造遺伝子内にコードされる情報は、転写及び翻訳の過程を経て細胞により「 発現」される。転写によりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる遺伝子 コードの中間担体が生産される。メンセンジャーＲＮＡは遺伝子の効率的なコピ ーであり、デオキシリボ核酸ではなくリボ核酸（それゆえＲＮＡ）のポリマーで ある。 真核生物（これは一般に細菌よりも複雑な生物である）においては、遺伝子は コード領域（「エキソン」と呼ばれる）と非コード領域（「イントロン」と呼ば れる）からなる。エキソンは遺伝子のタンパク配列を直接コードする。イントロ ンは非常に大きいものもあり、特定の遺伝子中には多数のイントロン配列が存在 し得る。非コードイントロン配列の役割は明確ではない。しかし、これらの介在 配列は少なくとも３種の重要な役割を果たす証拠がある。即ち、第１にこれらは 細胞に発生期のＲＮＡ転写物を生成せしめ、このものが幾通りかにスプライスさ れて多数の異なるタンパクを生成させることができる。第２にそれらはイントロ ン領域内に制御エレメントを包含せしめそのものが遺伝子発現の調節を高め、そ して第３にタンパク配列の別々の部分あるいはカセットを進化の間により容易に 組み換えられうるエキソン単位に制御し、そしてそれゆえ新たなタンパクの発生 を容易にし、そのことが究極的にはその種の生き残りを高めうるものである。 転写工程は遺伝子全体のｍＲＮＡコピーの形成を含む。即ち、転写工程により 生産されたｍＲＮＡは非コードイントロン配列とタンパクコードエキソン配列の 両方のコピーを含んでいる。従って、転写により最初に生成されるｍＲＮＡはそ れがコピーされた遺伝子と同じ長さを有する。次にこの未成熟ｍＲＮＡはプロセ シング段階を受け、その間に非コードイントロン配列がスプライシングにより除 かれる。従って得られるプロセシングを受けたｍＲＮＡ分子はタンパクをコード するのに必要な情報のみを含む（即ち、結合されたエキソン配列のみのコピーを 含む）。従ってこれらのプロセシングを受けたｍＲＮＡ分子はそのｍＲＮＡが最 初にコピーされた「ゲノム配列」（クロモゾーム中に存在するままの遺伝子エキ ソン及びイントロン）よりも長さがかなり短い。プロセシングを受けたｍＲＮＡ はこの段階においてポリリボアデニル酸、ポリ(A)、のテイルを分子の一方の末 端（3'- 末端）に含み、分子の他端（5'- 末端）に「キャップ」構造を含むよう に修飾もされる（標準的な命名法によれば、分子の末端化学基に従いＤＮＡ及び ＲＮＡ分子の一方の末端を5'末端とし、他端を3'末端としている）。イントロン を除去するようにプロセシングを受け、5'- キャップと3'- ポリ(A)テイルを有 するｍＲＮＡ分子は「成熟」ｍＲＮＡ分子と呼ばれる。非コードイントロン配列 の除去を説明する、転写工程の極めて簡略化された図を図１に示す。 成熟メッセンジャーＲＮＡにより担持される情報をタンパクに変換する段階は 翻訳と呼ばれる。翻訳は、構造遺伝子中にあるヌクレオチド配列によりコードさ れた情報をアミノ酸の配列からなる特定のタンパクに変換する手段の最後の段階 である。 遺伝子のクローニングは1970年代に可能になった。初期の実験においては、細 菌及びファージ（細菌性ウイルス）から小さい遺伝子がクローン化された。それ 以来、分子生物学及び遺伝子工学の進歩はとてつもない速度で進行し、ヒトゲノ ム全体の配列が現在決定されつつあるまでになった。しかしこの分野の技術の急 速な進歩にもかかわらず、多数の限界が依然として明らかである。その１つは非 常に大きな構造遺伝子のクローニングが困難なことである。 遺伝子のサイズは、それが含むヌクレオチド塩基の数により決定され、通常は 塩基の千単位（キロ塩基、kb）で表される。より大きな遺伝子のいくつかの例は あるものの、大部分の構造遺伝子（エキソン）の全コード配列は典型的には合計 １〜10kbである。しかし、エキソンセグメントの間の多数の大きなイントロン配 列の存在により、ゲノムレベルではこれらの遺伝子はずっと大きな領域にわたっ て拡がり、数十あるいは数百キロ塩基にわたることも多い。例えばＹＡＣ(Yeast Artificial Chromosome)のような現在の遺伝子クローニングベクターにより非 常に大きな（100〜300kb）ゲノムセグメントのクローニングが可能であるが、こ のようなゲノムインサートは非コードイントロン配列を含有しており、そのこと が人工的な系におけるタンパクの発現を妨げている。部分的遺伝子配列、あるい はイントロンを含有する配列は、非機能的な、先端を切断されたタンパクの発現 を生じ、あるいは5'翻訳開始部位の配列がない場合は、関係のない誤ったタンパ ク配列の発現を生じる。それゆえ、たとえスクリーニング工程によって部分的な 遺伝子が同定されうる場合でも、遺伝子の残りの部分を回収する必要がある。こ れは極めて複雑な工程でありうる。遺伝子が多くのイントロン配列を有しそれ故 に遺伝子が大きい場合、遺伝子の残りの部分を回収しようとすると何年もの努力 を必要とするかもしれない。その後に遺伝子フラグメントの相対的な順序を決定 し、そしてイントロン配列からエキソン配列を区別するためにさらに労力を要し よう。遺伝子を連続してつながったタンパクをコードカセットとしてクローン化 する能力は、遺伝子の同定が、クローン化された遺伝子を検出する通常の技術で ある組換え細菌またはウイルス系におけるタンパクの生成及び所望のタンパクの 機能または構造に関する「スクリーニング」に基づく検出技術によりなされる場 合は特 に重要である。 構造遺伝子をクローン化するには、分子生物学者は上記の細胞性ｍＲＮＡプロ セシング機能を利用し、その際イントロン配列はスプライシングにより未成熟ｍ ＲＮＡから除去され、当初の遺伝子よりもかなり小さい成熟ｍＲＮＡが生成され る。成熟ｍＲＮＡ分子を変換してＤＮＡ分子に戻す（従って「逆転写」と呼ばれ る）ことにより、本質的部分ではないイントロン配列を含まない当初のコード配 列（エキソン）を得ることができる。そのようなＤＮＡ分子はそれが由来するｍ ＲＮＡ分子に相補的なものであるので、相補的ＤＮＡと呼ばれる。相補的ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）合成は遺伝子クローニングの好ましい方法であり、これは組換えタ ンパク生産に順応できる比較的小さな連続してつながったタンパクコードカセッ ト中に所望の遺伝子を回収できるからである。 ｃＤＮＡ技術のもう一つのそして重要な使用は、特定の時期に細胞により発現 される遺伝子を同定することである。遺伝子発現は細胞の部分においてかなりの エネルギー消費を必要とし、そしてｍＲＮＡ分子は短命な「タンパクを要請する 者（protein requests）」として設計されている。従って僅かな例外（特に発生 中の卵における）を除いて、すぐに必要なタンパクをコードする遺伝子のみがｍ ＲＮＡに転写される。研究者は、細胞中に存在するｍＲＮＡ集団のｃＤＮＡコピ ーを作成し生成されたｃＤＮＡをクローニングすることにより、その時に発現さ れた遺伝子からｃＤＮＡライブラリーを作成することができる。従って研究者は 、発生の所与の段階において、あるいは与えた刺激に応答して、どの遺伝子が所 与の組織タイプにおいて発現されるかを明細に決定することができる。 相補的ＤＮＡクローンは、研究及び産業の両方において極度に重要である。研 究においては、タンパクの機能及び構造を決定するためにクローン化された遺伝 子の発現を必要とする。さらに、大量のタンパクがＸ線結晶学的構造分析に及び ポリクローナルまたはモノクローナル抗体生産の両方に必要であり、これら抗体 は研究プロトコールによる少量のタンパクの追跡に及び細胞中におけるタンパク の位置を決定するのに不可欠である。 細菌はクローン化された遺伝子を発現する宿主として通常使用される。細菌を 含む原核生物の遺伝子はイントロンを含んでいないので、これらの細胞は未成熟 ｍＲＮＡを機能的にタンパクに翻訳できる成熟ｍＲＮＡにプロセシングするのに 必要なスプライシング機構を有していない。真核生物遺伝子（即ちイントロン及 びエキソンを含有）のゲノムクローンは細菌宿主中では発現され得ないが、同じ 遺伝子のｃＤＮＡコピーは原核生物あるいは真核生物のいずれかにおいても発現 され得る。従ってｃＤＮＡクローンは大規模タンパク生産に日常的に使用されて いる。この人工的なタンパク発現は、「組換えタンパク」生産と呼ばれ、長年他 の動物組織からの単調で退屈な抽出により少量でしか手に入れることができなか った多くの医薬の益々日常的な製造方法となりつつある。 現在使用されるｃＤＮＡ合成方法は Berger and Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，in Methods in Enzymology Volume 152，Academic Press Inc．(1987); Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Lab oratory Press(1989); Okayama，H.，et al.，Meth．Enzymol．159:3-27(1987); Van Gelder，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1663-1667(1990); 及び Embleton，M.J.，et al.，Nucleic Acid Res.，20:3831-3837（1992）に概説さ れている。ｍＲＮＡ単離技術の概説は Sambrook et al．(1989)の７章及び８章 にある。 ｍＲＮＡの単離は、多くの技術的に困難な段階を伴う長くて単調な工程である 。要約すると、細胞からのｍＲＮＡ単離のための代表的な手順は、(1)細胞を破 壊して細胞内容物を放出させること、(2)細胞からの全ＲＮＡを単離すること、( 3)抽出されたＲＮＡをオリゴ（dT）セルロースカラムに通すことによりｍＲＮＡ 集団を選択すること、及び(4)単離されたｍＲＮＡをサイズにより分画化するこ とを必要とする。すべての段階において、調製物がＲＮＡを破壊し得る活性なリ ボヌクレアーゼ酵素と接触しないよう確保するため細心の注意が必要である。ｃ ＤＮＡクローニング操作の目的は、遺伝子の全コード配列を含有する「完全長」 ｃＤＮＡクローンを得ることであるので、ｍＲＮＡの完全性を保持する操作を使 用することが非常に重要である。リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）酵素は非常に 安定であるので、この活性酵素の非常に少量がｍＲＮＡ調製物中に存在するだけ で問題を惹起しよう。ＲＮアーゼは、ヒト皮膚を含む事実上すべての表面に存在 し、従って非常に容易にＲＮＡ調製物に侵入し得る。汚染の問題をさけるため、 全ての溶液、ガラス製品及びプラスチック製品を特別に処理しておかなければな らない。ｍＲＮＡを単離する予定の細胞は、非常に過酷で、どこにでもあるリボ ヌクレアーゼ酵素を直ちに不活性化する成分を含有する溶液中で破壊され、ＲＮ Ａ調製において使用される後続の全ての溶液は、ＲＮアーゼを不活性化する、発 癌物質と考えられているジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）により処理され る。研究室においては、「リボヌクレアーゼフリー」と指定されるような特定の 設備及び作業空間を別に確保しておくことも多いであろう。ＲＮＡ分解の可能性 は細胞を破り開ける最初の段階で始まり（細胞自体がリボヌクレアーゼを含み、 これが細胞の溶解に際してＲＮＡと接触する）、操作期間中にわたって継続する 。 細胞から抽出された全ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランス ファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）からなる。ｍＲＮ Ａは代表的には全細胞ＲＮＡのわずか１〜３％を構成するのみである（真核細胞 あたり約１×10-12g ｍＲＮＡ，Sargent，T.D.，Methods Enzymol．152:423-432 (1987)）。大部分のｃＤＮＡ合成反応は、成熟ｍＲＮＡ転写物中にのみ存在する ポリ(A)テイルの存在に依存している。成熟ＲＮＡ転写物は細胞ＲＮＡ全体の中 から、通常はアフィニティクロマトグラフィーにより選択的に抽出される。これ はインビトロでうまくｃＤＮＡを合成するのに必須の段階であり、成熟ｍＲＮＡ を富化できない場合は、低品質のｃＤＮＡが低収率で得られる。 ｃＤＮＡ合成の前の最後の段階として、ｍＲＮＡ調製物をサイズにより選択で きよう。これは通常、より小さいサイズの分子（通常はより大きいｍＲＮＡの分 解された形態である）を除くため行われ、これらは除かれないとｃＤＮＡクロー ニング工程を妨害しよう。サイズによる選択は、既知サイズのｍＲＮＡ種を富化 するためにも行われうる。サイズ選択はアガロースゲルを通す電気泳動、カラム クロマトグラフィー、あるいはシュクロース勾配を通す沈降により行うことがで きる。これらの方法は低収率を招き、二次的な分子内構造を破壊するために水酸 化メチル水銀の存在を必要とし得る。水酸化メチル水銀は極度に毒性が強く、揮 発性であり、取り扱いに細心の注意を要する。より安全な代替物（例えばグリオ キサール／ジメチルスルホキシドまたはホルムアルデヒドを含有するゲルの使用 ）が利用できるが、これらの技術もやはり危険を化学物質を必要とするものであ り それに関連する不利な点を有する。 現在の技術の状況においてはｃＤＮＡ合成に先立って細胞からｍＲＮＡを抽出 する必要があることから別の欠点が発生する。例えば、特定の条件または生物の 発生における特定の段階において細胞中でどの遺伝子が発現されるかを調べるの にｃＤＮＡクローニングがよく使用される。ｍＲＮＡを抽出するのに必要な時間 及び条件はそれ自体が細胞の遺伝子発現パターンに変化を起こしかねない。さら に、非常に少量でしか存在しない（細胞あたり20コピーと考えられる）か又は不 安定なｍＲＮＡ分子は、ＲＮＡ単離工程の間に失われてしまい得る。現在のとこ ろ、ｍＲＮＡ単離工程に内在する損失のために、ｃＤＮＡライブラリーを作成す るのに必要な細胞数には下限がある。本発明は、最初のｍＲＮＡ単離の必要を完 全に避けることによりこの問題を解決しようとするものである。 ｍＲＮＡの抽出及び精製の後、ｃＤＮＡの合成はインビトロで行われる。ｃＤ ＮＡ合成に現在使用されている方法は全て、ｍＲＮＡの抽出と精製の後に行うも のであるか、またはその場でまたはインビトロの条件下に行われるものである。 これらの方法については、Kimmel and Berger(1987); Okayama，H.，et al.，(1 987); Van Gelder，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1663-1667(1990); 及び Embleton，M.J.，et al.，Nucleic Acid Res.，20:3831-3837（1992）に 詳細に記載されている。 現在利用可能な方法は全てＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素（より一般的 には逆転写酵素と呼ばれる）を使用してｍＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡの第１の鎖を 合成する。 逆転写酵素は新たに核酸合成を開始できない。むしろ、これらの酵素はＲＮＡ 鋳型分子に結合された分子のヒドロキシル基に、発生期のｃＤＮＡ鎖の第１のヌ クレオチドを付加するのである。前記酵素が第１のヌクレオチドを付加する、こ の結合された分子はプライマーと呼ばれ、酵素の起源に関係なく逆転写酵素活性 にとって絶対に必要であると思われる。しかしながら、インビトロ及びインビボ 条件下にｃＤＮＡ合成を開始させるための要件には大きな相違があることが明ら かである。 インビトロ（細胞環境外）またはイン シテュのｃＤＮＡ合成条件下では、レ トロウイルス酵素のプライマーに対する要求を満たすことが基本的であって、オ リゴヌクレオチドプライマーと呼ばれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の短いセグ メントが最も一般的に使用される。このプライマーはしばしばデオキシリボチミ ジル酸のポリマー（オリゴ（dT））である。現在利用可能なすべてのｃＤＮＡプ ロトコルにおいて、このＤＮＡプライマーはＲＮＡ鋳型分子にただ単にアニール するように設計されており、そして逆転写酵素の結合に寄与してプライマー−酵 素複合体を形成する特異的な構造を形成することができない（Kimmel and Berge r(1987); Okayama，H.，et al.，(1987); Van Gelder，et al.，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 87:1663-1667(1990); 及び Embleton，M.J.，et al.，Nucleic Ac ids Res.，20:3831-3837（1992）。あるいは、インビトロｃＤＮＡ合成ではＲＮ Ａ分子内の別の配列と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用し得るが、 しかしアニーリングが起こるのに必要な相捕的ヌクレオチドの範囲が広いために 、そのようなプライマーは、それがアニールするように設計されたｍＲＮＡ分子 にとって「配列特異的」なものであろう。そのような配列特異的プライマーの合 成にはｍＲＮＡの部分のヌクレオチド配列を予め知っておく必要がある。逆転写 酵素のプライマーの要件に関しては、Sambrook，et al.，(1989)の５章に記載さ れている。 レトロウイルスにおいては、以前の感染期間中に宿主細胞からウイルスが排除 した構造特異的な細胞ｔＲＮＡ分子と逆転写酵素がすでに複合体形成している。 トランスファーＲＮＡ分子は短い（70〜80ヌクレオチド長）ＲＮＡ分子であり、 これは複雑な三次元構造に折り畳まれている。これらの通常の細胞での役割は翻 訳過程にある（Darnell et al.，(1989)，４章）。この逆転写酵素複合体が次に ウイルスＲＮＡ鋳型分子上のｃＤＮＡ合成開始部位に結合し、そしてプライマー −逆転写酵素複合体として働く。 ウイルスが新たに感染した細胞に入った後、逆転写酵素−ｔＲＮＡ複合体は、 この複合体が既に結合したウイルスＲＮＡ分子をＲＮＡ鋳型として使用するイン ビボ（細胞内）逆転写酵素反応のためのプライマーとして作用する。 このインビボ反応から作られた当初のｃＤＮＡ産物は「マイナス鎖強力停止」 と呼ばれる短いｃＤＮＡセグメントである。このｃＤＮＡが次に分子内または分 子間開始事象でプライマー分子として作用して、レトロウイルスＲＮＡ鋳型上の ｃＤＮＡ合成を再開及び完成せしめる。このｃＤＮＡ分子が次に同じ逆転写酵素 複合体により二本鎖ＤＮＡに変換され、感染細胞のクロモソームに組み込まれる 。 レトロウイルスのライフサイクルと正に同様に、ヘパドナ(hepadna)ウイルス 複製におけるインビボｃＤＮＡ合成反応の当初の産物は「マイナス鎖ＤＮＡ」産 物の形成であり、そしてここでもまた、レトロウイルスにより用いられた戦略と 同様であり、この当初のｃＤＮＡ産物が第２のポリヌクレオチド部位で開始させ てｃＤＮＡ合成を再開させる作用をする。 レトロウイルス複製に必要な逆転写酵素−ｔＲＮＡプライマー複合体が大部分 の細胞性ｍＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡ合成にとってのプライマーとして作用しな いであろうことに注目するのは重要である。逆転写酵素に親和性を有する同族ｔ ＲＮＡ種（細胞中に存在する約40種のｔＲＮＡ分子のうちの２種）は特異的ＲＮ Ａ鋳型分子上に存在する配列と相補的であり、従ってこれのみから開始するであ ろう。しかし、レトロウイルスに強い相同性を有する領域を持つマウス細胞中に 存在するウイルス様の30S(VL30)エレメントが存在することに注目することは興 味深い。これらのエレメントは欠陥Ｃ型ウイルスの性質を有し、逆転写され、レ トロウイルスビリオン中にパッケージされる(Howk，R.S.，et al.，J.Virol.25 ：115-123(1987); Besmer，P.U.，et al.，J.Virol．29:1168-1176(1979); Sher win，S.A.，et al.，J.Virol．26:257-264(1978); Scolnick，E.M.，et al.，J. Virol．29:964-972(1979); Scadden，D.T.，et al.，J.Virol．64:424-427(1990 ); Rodland,K.D.，et al.，Mol．Cell．Biol．7:2296-2298(1987); Hatzoglou， M.，et al.，Human Gene Therapy 1:385-397(1990))。 同様に、ヘパドナウイルス逆転写酵素は結合してｃＤＮＡ合成を開始するため にはヘパドナウイルスＲＮＡ鋳型分子内に特異的な構造上の標的エレメントを必 要とすると思われる（Wang and Seeger，J．Virol．67:6507-6512(1993)）。 最初のインビトロ逆転写酵素反応の産物は、ｍＲＮＡ分子の一本鎖相補的ＤＮ Ａ複製物である。この反応は、「第１鎖ｃＤＮＡ合成」と称されることが多い。 その後、前記ｃＤＮＡの第２の鎖を生成するために種々の方法が使用される。得 られた二本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）分子は次に末端で修飾され、そして「ベクター 」に挿入され、それにより各コピーの増殖、選択及び増幅が可能となる。最も一 般的に使用される方法（例えば、Okayama and Berg，Molecular and Cellular B iology 2:161-170(1982)）は、以下のように要約することができる。ｍＲＮＡの 抽出と精製、及びｍＲＮＡのインビトロでの逆転写により一本鎖ｃＤＮＡ分子を 生産した後、ｍＲＮＡ鋳型を除去してＤＮＡの第２の鎖を合成できるようにし、 それにより二本鎖ｃＤＮＡ分子を形成させることができる。次に特異的なＤＮＡ リンカーを二本鎖ｃＤＮＡの平滑末端に付加させ、そのｃＤＮＡを適当なクロー ニングベクターに連結する。 現在使用されている方法は全て、ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを製造する逆転写 酵素触媒段階を常にインビトロ条件下で行うものである。ｃＤＮＡ合成の品質（ 即ち、正確かつ完全長の相補的ＤＮＡを生成する能力）は、選択した酵素の忠実 度と処理能力（processivity）、及び反応を行った条件に依存する。完全長ｃＤ ＮＡよりも明らかに短いｃＤＮＡは許容できないし、高いエラー率は生成される ｃＤＮＡの有用性を減じるであろう。逆転写酵素はそれらの細胞性ＤＮＡポリメ ラーゼ相対物と異なり、酵素による３'→５'エキソヌクレアーゼを（プルーフリ ーディング）活性に欠けるので、忠実度は重合期間中の塩基識別に依存する。酵 素が機能するように進化したインビボ条件下ではなく、インビトロで逆転写酵素 を使用すると、酵素の忠実度及び処理能力に悪影響を与えるようである。MuLV逆 転写酵素のインビトロにおける忠実度は10-4（即ち、10,000塩基について１つの 誤ったヌクレオチド、あるいは100kb について10の誤り）と見積もられており、 最近の研究によればインビボにおける忠実度は約２×10-5（50,000塩基コピーに ついて１つの誤り、100kb あたり２つの誤り；Mont et al.，J．Virol．66: 368 3-3689(1992)）と測定されている。さらに、人工的な環境下では完全長の第１鎖 の合成を得ることは困難であるが、インビボｃＤＮＡ合成反応における酵素の処 理能力は優れており、10kbの範囲を十分に越えて延びるｃＤＮＡ導入が可能であ る（記載のデータを参照）。インビトロにおける逆転写酵素の性能を最適化する ために条件が開発されてきたが、これらの条件は一定の頻度のエラー及び第１鎖 ｃＤＮＡ合成の未成熟な終結を招く。インビトロ条件は酵素についての最適な条 件を反映するものではないことは明らかである。 加えて、現在知られているｃＤＮＡ合成技法のどれも構造−及び逆転写酵素− 特異的ポリヌクレオチド標的分子を提供することによるｃＤＮＡ合成のプライミ ング及び開始の促進は行わない。またｃＤＮＡ合成のための現在の技法も、その ｃＤＮＡ産物が第２のポリヌクレオチド部位でプライマー分子として作用してそ こでｃＤＮＡ合成が再開し当初の相補的ＤＮＡの連結を完結するものであるポリ ヌクレオチド鋳型プライマー分子、及び任意の後続のポリヌクレオチド分子を用 いる遺伝子エレメントの封入ができるようなメカニズムを提供しない。 従って、現在のｃＤＮＡ合成方法は、ｍＲＮＡが細胞から抽出、精製また取り 出されなければならないという必要、またはインビトロ条件下における逆転写酵 素の性能に制限される。これらのファクターは、ｃＤＮＡ合成の容易さ；ｃＤＮ Ａ合成の効率（それゆえ代表的なｃＤＮＡライブラリーを構築するには多数の細 胞を必要とする）；生成できるｃＤＮＡ分子のサイズ（それによりこの方法で容 易にクローン化できる遺伝子）；特定の条件下においてどの遺伝子が発現される かの決定におけるｃＤＮＡ合成の正確さ；及び生成されたｃＤＮＡの忠実度を制 限する。 本発明の目的は細胞からのポリヌクレオチド鋳型分子の単離、回収または除去 を必要としないｃＤＮＡ合成方法を提供することである。 本発明の目的はまた、逆転写酵素のインビトロにおける活性を必要としないｃ ＤＮＡ合成方法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、方法の効率、生成されるｃＤＮＡの忠実度、及び その方法により製造できるｃＤＮＡのサイズが、現在使用されているあらゆる方 法よりも優れた、ｃＤＮＡの合成方法を提供することである。 本発明の目的はまた、その産物が第２のポリヌクレオチド部位でのｃＤＮＡ合 成再開のためのプライマーとして作用するものである第１のポリヌクレオチド鋳 型プライマー分子を用いることによる、ｃＤＮＡ合成のプライミング効率を高め ることである。 本発明の目的はまた、その産物が第２のポリヌクレオチド部位でのｃＤＮＡ合 成再開にとってのプライマーとして作用するものである第１のポリヌクレオチド 鋳型プライマー分子を用いることによる、種々の遺伝子エレメントを最終的なｃ ＤＮＡ産物中にコードする手段を提供することである。 本発明のさらなる目的は、真核生物細胞に関するインビボ細胞発現パターンを 判定する手段を提供することである。 本発明の他の目的は、生存可能な細胞に感染するインビボｃＤＮＡ合成を開始 する感染性の複製に欠陥のある組換えウイルスを製造する手段を提供することで ある。発明の開示 本発明はポリヌクレオチド鋳型の相補的ＤＮＡ複製物を合成するための方法及 び組成物に関する。 本発明によれば、複数のポリヌクレオチド分子の相補的ＤＮＡ複製物を合成す るための方法が提供される。 本方法はポリヌクレオチド鋳型プライマー分子を提供することを含み、この分 子は少なくとも１種の逆転写酵素またはその複合体に結合するものであって、ま たｃＤＮＡ合成が開始する部位を供給する第１領域、及び該第１領域の5'側に位 置し、該分子のｃＤＮＡ産物が少なくとも１つの別のポリヌクレオチド鋳型分子 にアニールできるようにする第２領域を含む。加えて、ポリヌクレオチド鋳型プ ライマー分子の第１領域からＤＮＡ合成を開始する少なくとも１種の逆転写酵素 またはその複合体が提供される。次に逆転写酵素または酵素複合体及びポリヌク レオチド鋳型分子を含む混合物を形成し、そしてポリヌクレオチド鋳型分子に対 して相補的な領域を含むＤＮＡ分子の合成が可能な条件下でインキュベートする 。 本発明のさらなる局面では、ポリヌクレオチド鋳型分子の相補的なＤＮＡ複製 物の製造方法が提供される。 この局面においては、本方法は少なくとも１種の逆転写酵素またはその複合体 に結合するものであって、またｃＤＮＡ合成が開始する部位を供給する第１領域 、第１領域の5'側に位置し、該第１領域により結合された鋳型の部分の3'側に位 置するポリヌクレオチド鋳型の領域に該分子のｃＤＮＡ産物がアニールできるよ うにする第２領域、該第１領域の3'側に位置し、該第２領域の相補的ＤＮＡ産物 が第３領域にアニールして、相補的ＤＮＡの合成を再び開始させるほど、該第２ 領域に配列が十分に類似している第３領域を含む。加えて、ポリヌクレオチド鋳 型プライマー分子の第１領域からＤＮＡ合成を開始する少なくとも１種の逆転写 酵素またはその複合体が提供される。次に逆転写酵素または酵素複合体及びポリ ヌクレオチド鋳型分子を含有する混合物を形成させ、そしてポリヌクレオチド鋳 型分子と相補的な領域を含むＤＮＡ分子の合成が可能な条件下にインキュベート する。 本発明の別の局面では、生存可能な細胞内でプライマー特異的な細胞発現パタ ーを生成させるための方法が提供される。 この方法は、3'領域が細胞性ポリヌクレオチド鋳型分子のサブ集団に選択的に アニールするよう改変されている逆転写酵素−同族プライマートランスファーＲ ＮＡ分子を提供することを含む。さらに、プライマー分子からのＤＮＡ合成を開 始する少なくとも１種の逆転写酵素が提供される。次に逆転写酵素及びプライマ ー分子を含む混合物を生存可能な細胞中に形成しそして細胞性ポリヌクレオチド 鋳型分子に対して相補的な領域を含むＤＮＡ分子の合成が可能な条件下にインキ ュベートする。然る後、このようにして産生ｃＤＮＡ産物を分析してそこからパ ターンを形成させる。 あるいはまた、かかる方法は、少なくとも１種の逆転写酵素またはその複合体 に結合し、またｃＤＮＡ合成が開始する部位を供給する第１領域、及び該第１領 域の5'側に位置し、該分子のｃＤＮＡ産物が細胞性ポリヌクレオチド鋳型分子の サブ集団にアニールできるようにする第２領域、を含むポリヌクレオチド鋳型プ ライマー分子を提供することによっても達成される。次にこのプライマー分子を たった今記載した方法において逆転写酵素−同族プライマートランスファーＲＮ Ａ分子の代りに利用する。 本発明によればまた、本発明方法を実施するのに有用な組成物も提供される。 かかる組成物には、生存可能な真核生物細胞に導入されるとインビボでｃＤＮＡ 合成を開始することのできる組換えウイルス粒子及びポリヌクレオチド鋳型プラ イマー分子が含まれる。このような組換えウイルス粒子は、ウイルスパッケージ ングに必要とされる配列エレメントの機能的配列同等物を含む少なくとも１つの ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子（例えばヘパドナウイルスのε領域、レト ロウイルスのψ、ＤＲ及びψ＋領域）、逆転写酵素またはその複合体を結合する 領域、及びそのｃＤＮＡ産物が第２のポリヌクレオチド部位でｃＤＮＡ合成の再 開を起こさせる働きをするであろう5'配列、を含む。かかる組換えウイルス粒子 はすべての他の必要な処理エレメント（例えばキャプシド、ヌクレオキャプシド タンパク）を提供してポリヌクレオチド鋳型プライマー分子の感染性粒子中への パッケージングをもたらすであろう混合物中に使用されよう。 本発明で提供される他の組成物は、少なくとも１種の逆転写酵素またはその複 合体に結合しそして鋳型プライマー分子の相補的ＤＮＡ複製物合成のための鋳型 分子として働く遺伝子エレメント（ＧＥ）鋳型プライマーポリヌクレオチド分子 を含む。この鋳型プライマー分子の5'領域のｃＤＮＡ産物が次にポリヌクレオチ ド分子上の少なくとも他の一つの部位でのｃＤＮＡ合成を再開させる作用をする であろう。ｃＤＮＡ合成反応は少なくとも１つのポリヌクレオチド鋳型のｃＤＮ Ａ産物を共有結合する。 本発明の組成物はまた、本発明のポリヌクレオチド分子をコードする組換えＤ ＮＡベクター及びＤＮＡ分子、及びかかる組成物を含有するキットをも含む。図面の簡単な説 明 図１は、真核生物のＲＮＡ転写工程の簡略化された図を示すものであり、ｍＲ ＮＡプロセシング中の非コードイントロン配列の除去を説明するものである。 図２は、本発明における遺伝子カセットのクローニングを示すものであり、こ こで、 図２Ａは、ｃＲＮＡPro遺伝子カセットのクローニングに使用する特定の方法 の概略図を示し、そして 図２Ｂは、モロニーマウス白血病ウイルスにより利用される「野性型」マウス ｃＲＮＡPro 1,2に対応するｔＲＮＡ分子の構造及び配列を示し、実線はビリオン ＲＮＡ鋳型にアニールし、レトロウイルス逆転写酵素反応を開始する3'ヌクレオ チド配列を示す。 図３は、ｃＤＮＡ合成に必要な、逆転写酵素、ｔＲＮＡプライマー、及びＲＮ Ａ鋳型の相互作用における関係を示し、ここで、 図３Ａは、モロニーマウス白血病ウイルスにより利用される同族のｔＲＮＡPr o Wt の3'領域と、該ｔＲＮＡが結合する、レトロウイルスＲＮＡセグメント（真 っ直ぐな実線）上の相補的プライマー結合部位の両方についてのレトロウイルス ｃＤＮＡ合成配列、及びレトロウイルス複製の最初の段階（破線はｃＤＮＡ合成 を示す）を示し、そして 図３Ｂは、ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡからのインビボｃＤＮＡ合成 を示し、ここではインビトロで改変され合成されたｔＲＮＡPro polyUの3'領域と 、該ｔＲＮＡが結合するｍＲＮＡポリアデニル化3'セグメントの両方について配 列が示され、さらにインビボｃＤＮＡ合成の最初の段階（破線）が示されている 。 図４は、ｔＲＮＡ−コードプロモーター−ｔＲＮＡカセットの増幅−突然変異 発生に関わる段階を示すものであり、ここでは第１及び第２のプライマーが破線 で示され、5'から3'への方向を示す矢印が付されており、第２のプライマーは曲 がった破線で示され、5'塩基が最初の鋳型ＤＮＡ分子中の非相補的塩基にアニー ルできないことを示しており、下側の概略図は、3'の殆どの塩基が第２のプライ マー中にコードされた規定配列に変化された、増幅及び修飾された転写カセット を示し、カセットの3'末端はこの第２のプライマー配列の末端で切断されている 。 図５は、昆虫Sf9 細胞からのインビボにおけるｃＤＮＡ産物のエチジウムプロ ミド染色１％アガロース／ＴＡＥゲルを写真により再現したものであり、ここで レーン１及び10は１kbラダー（ＢＲＬ）を示す、レーン２及び６は対照（［α-3 2 P］dCTP単独）を示し、レーン３及び７は対照（［α-32P］dCTP＋逆転写酵素） を示し、レーン４及び８は対照（［α-32P］dCTP＋逆転写酵素＋ｔＲＮＡWt）を 示し、レーン５、９、11及び12は改変ｔＲＮＡプライマーを用いる実験（［α- 32 P］dCTP＋逆転写酵素＋ｔＲＮＡpolyU）を示す。この実験においては、レーン 11及び12の試料はＲＮアーゼＡ処理せず、レーン２〜５、及び11の試料は0.4 cm キュベット中でのエレクトロポレーションであり、レーン６〜９、及び12におけ る試料は0.2 cmキュベット中でのエレクトロポレーションである。 図６は、図５に示したゲル像のオートラジオグラフの写真による再現である。 図７は、ハムスター（ＣＨＯ）細胞からのインビボにおけるｃＤＮＡ産物のエ チジウムブロミド染色１％アガロース／ＴＡＥゲルを写真により再現したもので あり、ここでレーン１及び10は１kbラダー（ＢＲＬ）を示し、レーン２及び６は 対照（［α-32P］dCTP単独）を示し、レーン３及び７は対照（［α-32P］dCTP＋ 逆転写酵素）を示し、レーン４及び８は対照（［α-32P］dCTP＋逆転写酵素＋ｔ ＲＮＡWt）を示し、レーン５、９は修飾ｔＲＮＡプライマーを用いる実験（［α -32P］dCTP＋逆転写酵素＋ｔＲＮＡpolyU）を示す。 図８は、図６に表されたオートラジオグラフのゲル画像の写真再現である。 図９は、ハムスター（ＣＨＯ）細胞由来のin vivo でのｃＤＮＡ産物の臭化エ チジウム染色１％アガロース／ＴＡＥゲルの写真再現である。ここで、レーン１ および８は、１ｋｂラダー（ＢＲＬ）を表し、レーン２および３は、対照（〔α −32Ｐ〕ｄＣＴＰ＋逆転写酵素＋ｔＲＮＡWt）を表し、レーン４および５は、修 飾ｔＲＮＡプライマーを用いた実施例（〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ＋逆転写酵素＋ｔ ＲＮＡpolyU）を表し、そしてレーン６および７は、対照（〔α−32Ｐ〕ｄＣＴ Ｐ＋逆転写酵素＋オリゴ（ｄＴ）（５μｇ）を表す。この実施例の内、レーン３ 、５および７中のサンプルをＳ１ヌクレアーゼで処理した。 図１０は、図９に表されたオートラジオグラフのゲル画像の写真再現である。 図１１は、レトロウイルス性プロウイルス合成の簡略図を表す。破線はｔＲＮ Ａプライマー（ループ構造）およびレトロウイルス−特異的プライマー結合部位 （ＰＢＳ）の相補的配列にアニールされた逆転写酵素（ＲＴ）を有するウイルス ＲＮＡゲノムセグメントを表す。「Ｒ」領域は、ゲノムＲＮＡセグメントの各末 端近くに存在する反復配列である。太い実線は、ＲＮＡ鋳型配列により指示され るｃＤＮＡ合成を表す。 図１２は、ベクター制御エレメント（ＶＣＥ）ＲＮＡ鋳型の存在下でin vivo でのｃＤＮＡ合成の代表例の簡略図を表す。破線は、ＲＮＡ分子を表す。ポリＡ 区域は、ＲＮＡ鋳型分子の５’−末端配列の１つの選択であるポリアデニル酸に 該当する。「Ｎｅｏ」は、真核細胞中で抗生物質Ｇ４１８（原核細胞中でネオマ イシン）に生物学的耐性を与える領域をコードするＲＮＡ配列に該当する。「Ｏ ｒｉ」は、生物宿主中のポリヌクレオチド分子の複製の起点として一般に許容さ れる略号である。「プロモーター」の語を囲む矢印は、生物分子をコードするい ずれかのポリヌクレオチドセグメントに機能し得る状態で結合したプロモーター エレメントの１つの方向性を示している。そして、 図１３は、生細胞中のプライマー特異的細胞発現パターンを発生するのに関与 した態様を表す。ここで、 図１３Ａは、細胞集団ＡおよびＢに存在するＲＮＡ転写物およびそれらの連結サ イズの図式表現を提供する。そして 図１３Ｂは、特異的鋳型プライマーまたは修飾された同族体ｔＲＮＡプライマ ー分子を使用するin vivoでのｃＤＮＡ合成から得られるｃＤＮＡ産物の１つの 可能なパターンを表す。発明の詳細な説明 本発明は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するための方法および組成物に関 する。この発明は、初めて、逆転写酵素または逆転写酵素複合体の天然の標的部 位に対する構造特異的類似体を利用することでｃＤＮＡ合成を可能にした方法を 提供する。この方法では、逆転写酵素または逆転写酵素複合体に結合する第１の 部位を有する適切な鋳型または鋳型プライマー分子を、逆転写酵素または逆転写 酵素複合体の存在下で混合物中に導入し、そして、少なくとも１つのポリヌクレ オチド鋳型分子に相補なＤＮＡ分子が生成されるような条件下で、その混合物を インキュベートする。 さらに、特定の時間に、または特定の刺激に応答して生細胞中に存在する細胞 転写物の量および分子サイズを反映するｃＤＮＡ産物の製造パターンの主成が、 本発明により可能になる。このin vivoでの細胞特異的およびプライマー特異的 「バーコード」または「転写物フィンガープリント」パターンは研究、臨床診断 および法廷を含む多くの目的に非常に有用であることを立証する。この技術は、 遺伝学的分析に総ゲノムＤＮＡの制限フラグメント長多型性（ＲＦＬＰ）分析に 相当する「発現遺伝子」をもたらすはずである。 本発明では、in vivo環境でｃＤＮＡ合成を開始する必要性は、in vitro でよ り厳格であるように見え、そしてオリゴ（ｄＴ）プライマー分子、および他のＤ ＮＡプライマーは、in vivoでのｃＤＮＡ合成条件下で機能しないように見える （実施例の節を参照）。現在まで、in vivo条件下で機能する全ての公知の逆転写 酵素は、構造特異的ポリヌクレオチド分子によるｃＤＮＡ合成開始の部位を指向 する。実際、逆転写酵素自身から得られるチロシン残基からのヒドロキシル基側 鎖を利用してｃＤＮＡ合成を開始するものであるヘパドナウイルス由来の逆転写 酵素（WangおよびSeeger,Cell 71:663-670(1992); WangおよびSeeger，J．Virol ．67:6507-6512(1993)）さえ、鋳型特異的結合部位、イプシロン（ε）（Weber, M ら，J.Virol.68:2994-2999(1994)）の構造配列エレメントによりヘパドナ ウイルスのｃＤＮＡ合成開始の部位に対する標的にされる。したがって、全ての in vivoでのｃＤＮＡ合成反応の開始に含まれる第１の段階は、構造特異的ポリ ヌクレオチド標的に対する逆転写酵素の指向性結合であるらしい。 レトロウイルスでは、構造特異的ポリヌクレオチド分子の役割は逆転写酵素同 族体転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子（類）に該当する細胞分子により果たされる。 それらは、２つの理由：（１）その特異的レトロウイルスにより生産される逆転 写酵素が非常に限られたサブセットの細胞ｔＲＮＡ分子の特異的な構造を認識し そしてそれに結合すること、そして（２）同族体ｔＲＮＡ分子の３’−領域が、 次には、レトロウイルスに特異的で、レトロウイルスＲＮＡゲノム鋳型分子中に コードされるｃＤＮＡ開始部位（プライマー結合部位）で相補的配列に結合する こと、から「同族体」を意味する。 ヘパドナウイルスでは、構造特異的ポリヌクレオチド分子の役割は、ヘパドナ ウイルスの前ゲノムＲＮＡ鋳型特異的結合部位、イプシロン（ε）により果たさ れ、そしてそれはレトロウイルス同族体ｔＲＮＡ分子に対してヘパドナウイルス 類似体として働くらしい。 本発明の特定の具体例では、ポリヌクレオチド鋳型または鋳型プライマー分子 はＲＮＡであり、そして多くの具体例では、ポリヌクレオチド鋳型または鋳型プ ライマー分子は、修飾されたレトロウイルス鋳型ＲＮＡ分子またはヘパドナウイ ルス鋳型ＲＮＡ分子である。さらに、本発明は、最初に非相同性遺伝子エレメン トの生物学的選択、複製および増幅、組込みおよび発現のために必要な全ての遺 伝的エレメントが、in vivo過程で接触するｃＤＮＡ産物として共有結合的に包 含され得る手段を提供する。したがって、in vivoでの細胞間環境で生細胞によ り、分子クローニングの多くの重要な段階が行われる。この遺伝的制御情報は、 遺伝エレメント（ＧＥ）ポリヌクレオチド鋳型、または鋳型プライマー分子中に コードされる。本発明の特定の具体例では、このポリヌクレオチド鋳型または鋳 型プライマー分子は、生細胞内に転写される。多くの具体例では、このＧＥポリ ヌクレオチド鋳型または鋳型プライマー分子は、適切な逆転写酵素または逆転写 酵素複合体の存在下で標的生細胞中に導入される。 ＧＥポリヌクレオチド鋳型または鋳型プライマー分子は、レトロウイルスの逆 転写酵素および修飾同族体ｔＲＮＡ分子を一緒に使用すると、レトロウイルスの ゲノムＲＮＡ鋳型中のＵ５−リーダーおよびＵ５−ＩＲステムのものに類似する 構造を形成する配列エレメントを包含することができる。これらの配列は、ウイ ルス複製で重要であることが示され（Cobrink,D.ら、J．Virol．62:3622-3630(1 988)）、ｔＲＮＡプライマーのＴΨＣループと相互作用して、ｃＤＮＡ合成のプ ライミングにおいて有意に効力を改善しているらしい（Cobrink,D.ら、J．Virol ．65:3864-872(1991): MurphyおよびGoff，J．Virol．63:319-327(1989); Aiyar ,A.ら、J．Virol．66:2464-2472(1992)）。したがって、修飾ｔＲＮＡプライマ ー分子は、類似体ＲＮＡ構造を再生するＲＮＡ鋳型配列を用いエネルギー的にさ らに好ましい方法で相互作用することができる。さらに、ヌクレオカプシドタン パク質（または他のタンパク質）の封入は、ＲＮＡ鋳型、ｔＲＮＡプライマーお よび逆転写酵素より成る開始複合体の形成を促進することができ（Meric および GoffのJ．Virol．63:1558-1568(1989); カーンおよびジエドルコのJ．Biol．Che m．267:6689-6695(1992)）、したがってｃＤＮＡ合成の効率を改善する。 また、ＧＥポリヌクレオチド鋳型または鋳型プライマー分子が、ヘパドナウイ ルス逆転写酵素と一緒に使用されると、それらは特異的結合部位、イプシロン（ ε）前ゲノムＲＮＡ鋳型のものと同様の構造を形成する配列エレメントを含むこ とができる。これらの配列エレメントは、ｃＤＮＡ合成の開始、およびヘパドナ ウイルスゲノムのパッケージングの両方にとって重要であることが示された。 同じ鋳型分子の３’−末端に表される最初のポリヌクレオチド鋳型分子の５’ −末端での配列の封入は、これらの３’−配列で最初のマイナス鎖の強力停止ｃ ＤＮＡ産物の分子内アニーリングを促進する。これは、第２のポリヌクレオチド 部位での分子内プライミングの結果として生じ、ここでｃＤＮＡ合成の再開が起 こる。 他に定義されない限り、全ての技術および科学的用語は本発明が関連する業界 で当業者の共通の理解にしたがって使用される。ここに使用されるように、用語 が使用される内容から反対の定義が明瞭に示されない限り、以下の用語は付与さ れた意味を示す。 鋳型の語は、相補的配列が作られるヌクレオチド配列を示す。 鋳型プライマーの語は、ｃＤＮＡ合成を開始されそして伸長されるポリヌクレ オチド配列を示し、そして上述の鋳型プライマー分子のｃＤＮＡ産物は、第２の ポリヌクレオチド部位でｃＤＮＡ合成を再開させるように働く。 遺伝子エレメント（ＧＥ）およびベクター制御エレメント（ＶＣＥ）鋳型プラ イマー分子の語は、相互に交換可能に使用され、そして原核細胞または真核細胞 での増幅、選択、複製、挿入、分離、組込み、切除、安定化、精製、発現、検出 、位置決め、プロセシング、またはパッケージングを含むがそれらにより限定さ れない機能のためにコードされた遺伝子領域を包含することができる鋳型プライ マー分子を示す。 類似体の語は、天然に生じるヌクレオチドの全ての配列特定代表例を示すため に使用される。 逆転写酵素の語は、ＲＮＡ鋳型にアニールされたプライマーに、デオキシヌク レオチドまたはその類似体を添加するのを触媒することができる全てのポリメラ ーゼを意味するのに使われる。 ポリヌクレオチドの語は、デオキシリボ核酸、リボ核酸およびそれらの類似体 のホモ−およびヘテロ−高分子を含む。 修飾逆転写酵素同族体プライマー移転ＲＮＡ分子の語は、人工的な生物系の手 段により化学的に製造するか、あるいは生物学的材料から精製される全てのｔＲ ＮＡ分子に該当し、そしてそれは、特異的逆転写酵素の活性をプライムするため に修飾されている。 プライマー結合部位（「ＰＢＳ」）の語は、特定の逆転写酵素の天然に生じる 同族体プライマーがアニールしてｃＤＮＡ合成を開始するＲＮＡ鋳型分子中の特 異的ヌクレオチド配列に該当する。したがって、プライマーがアニールするＲＮ Ａ鋳型配列中で多様化を起こす、天然に生じる同族体プライマー中でのいかなる ヌクレオチドの付加、欠失または他の修飾も、プライマー結合部位以外の部位で の結合を構成する。 Ｒ領域配列の語は、レトロウイルスのゲノムＲＮＡの３’−および５’−末端 の両方に発見される天然の反復配列をいう。 発現カセットの語は、コード化産物の発現に必要な全ての配列を含むＤＮＡ構 築物をいう。したがって、発現カセットは、少なくともプロモーター領域をコー ド化するＤＮＡ、目的の配列および転写最終領域を含む。 ベクターおよびプラスミドの語は、相互に交換可能に使用され、ＤＮＡが特定 の系で複製されそして選択され得る全ての手段を包含する。 機能しうる結合の語は、連結の各々の側の配列の間で機能的な関係を保存する 方法で連結されているヌクレオチドをいう。例えば、ＤＮＡ配列に機能し得るよ うに連結されたプロモーターは、転写の方向について、そして転写開始部位につ いての両方共、上流であり、転写伸長がＤＮＡ配列を介して進行するような方法 で挿入される。 本発明のｃＤＮＡ合成の方法の具体例は、細胞からｍＲＮＡを分離する必要が ないことが多い。このようなｃＤＮＡ合成は従来のin vitro 技術に関する問題 を解消させる。その問題とは、：１）ｍＲＮＡの分離が要求されること、２）細 胞成分が人工的環境中に引っ込んでしまう、または３）細胞が殺され、苛酷な条 件に供されることである。したがって、ｍＲＮＡ鋳型はより完全であるようであ り、全長ｃＤＮＡクローンがより確実に得られる。さらにin vitro でのｃＤＮ Ａ合成は、逆転写酵素のin vivoでの活性を必要とせず、むしろ逆転写酵素の効 率、忠実度および処理性が至適化されるようなin vivo（すなわち、細胞環境内 ）で逆転写段階が行われることを可能にする。したがって、ｃＤＮＡクローンが 長いほど、この方法によるヌクレオチドの配列エラーは、ほとんど生じないかも しれない。さらに、かなり短い時間しか必要とせず、実行がより容易で、そして その手段により、より少数の開始細胞で始まるｃＤＮＡ産物が潜在的に提供され る。 上述の本発明の背景の節で記載されたとおり、従来のｃＤＮＡ合成は、細胞由 来のｍＲＮＡを分離しそして精製すること、または人工的環境中に反応成分を引 き込むことを必要とし、in vitro でのｃＤＮＡ合成段階が続く。このin vitro でのｃＤＮＡ合成段階では、逆転写酵素のためのプライマーについての要請は、 ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）尾部にアニールするオリゴ（ｄＴ）プライマー分子、 または標的ｍＲＮＡ配列の公知部分に相補的であるオリゴヌクレオチド分子を供 給することにより最も一般的に応じられている。しかし、これらの型のオリゴ ヌクレオチドプライマーは、いずれもin vitro で有効であるようには思われな い（以下の実施例参照）。なぜin vivoでのｃＤＮＡ合成反応を首尾よく開始す る相補的配列の単純なポリヌクレオチドオリゴマーがin vivoでのｃＤＮＡ合成 反応を開始させられないのかを確認する特定の証拠は欠くが、その失敗に帰する とする考えられる説明が少なくとも２つある：１）レトロウイルスの逆転写酵素 は、特定の配列を有しそして、その結果３次元の構造をとる同族体ｔＲＮＡを認 識しそして結合することが知られている。このことは、ＨＩＶ由来の逆転写酵素 を用いたゲル移動度シフト実験により天然のそして合成のｔＲＮＡ分子の両方を 用いて詳細に研究されてきた（バラット，シー．らのEMBO J．8:3279-3285(1989 );バラット，シー．らのNucleic Acids Res．19:751-757(1991)；ワイズ，エス ．らのGene 111:183-197(1992)）。単純なオリゴマープライマーはこの構造的要 請を含まず、そしてそのためポリヌクレオチドプライマーがｍＲＮＡ鋳型にアニ ールすることができる場合でさえ、レトロウイルスの逆転写酵素はin vivo条件 下でプライマーを認識しそして結合しないかもしれない。同様に、ヘパドナウイ ルスの逆転写酵素は、前ゲノムＲＮＡ鋳型分子上に存在する特異的構造領域であ るイプシロン（ε）を認識し、そして結合する（ウエバー，エム．らのJ．Virol ．68:2994-2999(1994)）。ε領域での突然変異は、マイナス鎖ＤＮＡの形成を妨 害し（6508頁、ワンおよびシーガーのJ．Virol．67:6507-6512(1993))、そして これは、ＤＲ１でプラス鎖合成のための強制プライマーとして働く。２）代わり に、in vitro 条件下で鋳型にアニールするポリヌクレオチドプライマーは、in vivoでｍＲＮＡ鋳型に効率的にアニールすることが単に不可能であるのかもしれ ない。 レトロウイルスの自然のライフサイクルで、ウイルスの逆転写酵素は、一本鎖 のレトロウイルス性ＲＮＡゲノムのＤＮＡ複製物を合成するために宿主ｔＲＮＡ 分子をプライマーとして利用する。動物細胞中に４０以上の異なる型のｔＲＮＡ が存在するかもしれない。各感染性レトロウイルス粒子は、その各々がプライマ ー結合部位と称されるレトロウイルスのＲＮＡの特定の領域にアニールする特異 的宿主のｔＲＮＡ分子と結合する一本鎖のウイルス性ＲＮＡ染色体の２つの複製 物を含有する。逆転写過程を開始するために、ｔＲＮＡの３’−末端での塩基の 配列は、レトロウイルスのＲＮＡのプライマー結合部位にアニールする。逆転写 酵素（この複合体とすでに結合している）は、その後このｔＲＮＡをプライマー 分子として利用して、ｔＲＮＡの３’−ヒドロキシ末端に発生しようとしている ＤＮＡ分子の最初のヌクレオチドを付加する。 レトロウイルスの逆転写をプライミングすることの特異性は、レトロウイルス のゲノムにアニールするｔＲＮＡ分子の３’−末端での塩基対配列により決定さ れる。各レトロウイルスは、レトロウイルスのゲノム中に存在する特異的プライ マー結合部位配列にアニーリングできるｔＲＮＡプライマーを利用する。例えば 、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ゲノムはｔＲＮＡLys 3をプライマーとして利 用する。ＨＩＶウイルスのＤＮＡ複製物の合成を開始するために、ｔＲＮＡLys 3 の３’−末端にある１８ヌクレオチドを変性させ、そして塩基がＨＩＶプライマ ー結合部位と対になる（ワイズらのRNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor(19 82); ゴフ，ジェイ．のJ．Acquired Immune Deficiency Syndrome 3:817-831(19 90)）。したがって、ｔＲＮＡLys 3の３’−末端にある１８ヌクレオチドは、Ｈ ＩＶプライマー結合部位配列と相補的である。このウイルスのＲＮＡ鋳型にｔＲ ＮＡプライマーをアニールすることに加え、同じｔＲＮＡ分子の一部分が、ウイ ルスの逆転写酵素により認識され、そのため３分子複合体が最後に形成される（ ｔＲＮＡプライマー−逆転写酵素−ＲＮＡ鋳型）。 したがって、in vivoのｃＤＮＡ合成反応全てにとって、ポリヌクレオチド鋳 型または鋳型プライマー分子は２つの要件を満たすべきである。最初に、分子は 、逆転写酵素または逆転写酵素複合体に結合することができなければならない。 第２に、結合された酵素または酵素複合体は、その部位の領域からｃＤＮＡ合成 を開始し、そのポリヌクレオチド鋳型に相補的な開始ｃＤＮＡ分子を作らなけれ ばならない。現在レトロウイルスの逆転写酵素とともに使用されてin vitro で のｃＤＮＡ合成を開始させる単純なオリゴヌクレオチドプライマーは、in vivo で機能しない（列挙されるデータを参照）。さらに、特異的ｔＲＮＡ分子はレト ロウイルスのゲノム上で逆転写酵素のin vivoの作用のためのプライマーとして 機能することができる一方で、これらのｔＲＮＡプライマーはレトロウイルスの プライマー結合部位に特異的にアニールし、全ての成熟した細胞ｍＲＮＡ分子 に存在する配列にアニールするように設計されてはいない。同様に、ヘパドナウ イルス由来の逆転写酵素はヘパドナウイルスの前ゲノムＲＮＡ鋳型分子中に存在 する特異的結合部位（ε）を認識し結合するが、結合したり、全ての成熟した細 胞ｍＲＮＡ分子上に存在する領域からのｃＤＮＡ合成を開始したりしない。 本発明は、そのｃＤＮＡ産物が全てのポリアデニル化された細胞ｍＲＮＡ分子 にアニールし、プライマー分子がアニールするｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡ複製物が 作られるような逆転写酵素により利用される鋳型プライマー分子を提供すること によりin vivoでのｃＤＮＡ合成の方法を提供する。本発明は、ウイルス鋳型分 子を修飾レトロウイルスまたはヘパドナウイルスの鋳型分子または鋳型プライマ ー分子に置換するレトルウイルスおよびヘパドナウイルス複製過程（実際にはin vivoでのｃＤＮＡ合成反応）に類似である。 本発明の具体例で、鋳型プライマー分子は、鋳型のｃＤＮＡ産物が成熟した細 胞ｍＲＮＡ分子中に存在する３’−ポリ（Ａ）尾部にアニールするのように、分 子の５’−領域が、ポリアデニル酸配列に置換されている修飾レトロウイルス鋳 型分子である。 本発明の別の具体例で、鋳型プライマー分子は、鋳型のｃＤＮＡ産物が成熟し た細胞ｍＲＮＡ分子中に存在する３’−ポリ（Ａ）尾部にアニールするのように 、分子の５’−領域が、ポリアデニル酸配列で置換されている修飾ヘパドナウイ ルス鋳型分子である。 このような好ましい鋳型プライマー分子は、生細胞内に含有される全ての成熟 ｍＲＮＡ分子のin vivoでのｃＤＮＡ複製物を合成するのに使用することができ る。この鋳型プライマーの産物は、全ての成熟ｍＲＮＡ分子にアニールするので 、鋳型プライマーはｃＤＮＡライブラリーを製造するのに使用できる。すなわち 、それは将来その与えられた点で細胞内に発現される構造的遺伝子の全部を表す ｃＤＮＡ分子の集合である。 本発明の１つの具体例で、ｃＤＮＡ合成反応が、細胞にｍＲＮＡ抽出、分離ま たは人工的in vitro 環境中に細胞含有物を引き込むという圧力および摂動(pert urbation)をかけることなく、in vivo条件下で生細胞で起こる。したがって、ｃ ＤＮＡ合成産物は、ｃＤＮＡ合成が開始された時に細胞内でｍＲＮＡ集団の断 片をより正確に反映し、そしてその産物はin vivo環境で合成される。さらに、 少量の初期細胞からライブラリーを作るのに必要な人工の増幅段階はなく、そし てまれな構成物を含む複数のライブラリーを、限られた量の特定の細胞（例えば 、多分化能造血幹細胞）からさらに十分に製造することができる。 本発明の別の具体例で、初期の特定のポリヌクレオチド鋳型プライマー分子は 、新生ｃＤＮＡ転写物のアニーリングおよびプライミングの可能性を両方とも増 加させ、そして追加のコード化遺伝子エレメントまたはベクター 制御エレメン トを最終的なin vivoでのｃＤＮＡ産物に組み込むための手段を提供するのに利 用される。 本発明の別の具体例では、鋳型プライマー分子の５’−領域が修飾されるので 特異的ポリヌクレオチド配列の部分に相補的である。これは、所望のポリヌクレ オチド鋳型分子のヌクレオチド配列がすでに知られているか、または誰かがその 相補的配列を含有する鋳型分子の集団からｃＤＮＡを作りたいということを必要 とする。特異的ｃＤＮＡ分子の合成は、以下のものを含むがそれに限定されない 多くの異なった方法に有用であるかもしれない：配列特異的鋳型プライマーは公 知配列でｃＤＮＡをクローンすること、特異的遺伝子属（共通配列を共有する全 てのもの）を表す遺伝子からクローン化すること、または２つの別々の関係のな い転写物上でスプライス変異体の比率を測定することに利用することができる。 さらに、鋳型プライマー分子は、細胞間突然変異誘発またはｃＤＮＡ架橋反応 に使用することができる；所望の配列エレメント３’から５’配列をコードする 鋳型プライマー分子、別個の細胞転写物にアニールし、５’から誰かが変異する ことを望む領域のｃＤＮＡ合成を再開させるそのｃＤＮＡ産物は、細胞転写情報 ３’の付随する損失をこの鋳型プライマーアニーリングの部位を、細胞転写配列 ３’を鋳型プライマーｃＤＮＡ産物アニーリングの部位と置換させる。 ３’から５’−末端の特異的ポリヌクレオチド配列が位置決めされた多数のポ リアデニル酸残基を含む配列を有する鋳型プライマーは、鋳型プライマー分子の ｃＤＮＡ産物にそれ自身を再位置決めさせ、第２のポリヌクレオチド鋳型分子上 で（例えば、成熟メッセンジャーＲＮＡ上に存在するポリアデニル酸伸縮に近位 の連結領域で）プライマーとして作用させ、そのため相補的連結配列を含有する 構成物の断片がｃＤＮＡ産物に変換される。ｃＤＮＡ合成を開始する際の緊縮性 (stringency)は、統計式１／４n〔ここで、ｎ＝鋳型プライマーのポリアデニル 酸領域の５’−末端に加えられた特異的塩基の数（例えば、５塩基が一連の３０ −５０アデニル酸残基を伴う特異的配列であれば、その後１／45 ＝１／１０２ ４メッセージがｃＤＮＡ産物によりプライム(prime)され、そしてｃＤＮＡに変 換されることが予測されるかもしれない。〕に概略で対応する。細胞が１０，０ ００の異なるメッセージを発現する場合、その後およそ１０の産物がプライムさ れそして、このような鋳型プライマーでｃＤＮＡ産物に変換されることが予測さ れるかもしれない。発生された、得られたプライマー−および細胞−特異的パタ ーンに影響する他の要因があることに注目することが重要である：ＲＮＡ鋳型サ イズおよび頻度、ｃＤＮＡ産物検出の感度、組み込まれたヌクレオチド類似体の 選択、３’−末端以外でのｍＲＮＡ鋳型中の領域でのプライミング、およびｃＤ ＮＡ合成の効率に影響する他の因子が、その例である。抽出、分画、および検出 につづいて、この技術は、プライマー−特異的細胞発現パターンを展開させるこ とができる。このパターンが適切なプライマー配列で発生される場合、このパタ ーンは細胞または組織の型または発達段階について特異的である。このパターン は細胞の摂動（例えば、形質転換または感染）、または与えられた刺激物に応答 した変化について診断できる可能性がある。変化は、このパターンを作る種々の ｃＤＮＡ産物の密度での変化によりもっぱら特徴づけることができる（図１３参 照）。 外科的生検で摘出した組織の量は、技術者が、しばしば人工物の導入に帰する 増幅技術に頼ることなく、診断に使用することができるプライマー−選択的細胞 発現パターンを開発することを可能にするのに十分であるので、これは特別に有 用で強力な診断ツールである。一度パターンの構成が同定されると、このパター ン技術は診断で強力なツールとなる。 また、ＲＮＡ鋳型に対して選択的である鋳型プライマーを、in vivoでのＤＮ Ａシーケンシング反応に使用して、鋳型をクローン化しさらに分離することを必 要とせずに、所望のＲＮＡ鋳型の５’−配列を決定することができる。 さらに、特定のｍＲＮＡ種の発現が特定の疾病状態の信頼できる指標であると 、in vivoでのｃＤＮＡ合成は、診断技術に基づいたポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）に対する有用な代替でありうるかまたは、上述の診断技術と関連して治療 剤として活用されることができるかもしれない。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）は、過去にこの目的のために使用されてきたが、増幅中に起こる問題のために どうみても信頼されずそして偏りが生じる（ジリランド，ジー．らのPCR Protoc ol: A Guide to Methods and Applications ，Academic Press(1990)）。 その後特異的プライマーは、存在しているｍＲＮＡ鋳型を、翻訳されることが もはやできないｃＤＮＡ産物に変換する反応の能力に基づいたアンチセンス治療 の形態として異常細胞内でin vivoでのｃＤＮＡ合成を開始させるのに使用する ことができる。別の実施例では、ＨＩＶ特異的相補的プライマーが、修飾デオキ シヌクレオチド塩基を、検出、シーケンシングまたは分類のために使用されるこ とができるｃＤＮＡに組み込むことができるはずである（リンク，エイチらのJ ．Med．Virol．37:143-148(1992); プローバー，ジェイ．エム．らの(1989)）し 、またはその塩基は、組み込まれたヌクレオチド類似体が細胞毒性になるため感 染していないＣＤ４細胞を生きたままで残しながら、感染したＣＤ４細胞のみが 排除されるように設計することができた。 したがって、本発明は、in vivoでのｃＤＮＡ合成に使用することができる鋳 型および鋳型プライマー分子を包含する。さらに特異的でそして好ましい具体例 で、これらの分子は修飾レトロウイルスまたはヘパドナウイルスのＲＮＡ鋳型分 子である。 当業者では、本発明を実施するとき、先に存在するウイルスのゲノム鋳型分子 から誘導されるｃＤＮＡ合成に使用される鋳型または鋳型プライマー分子が必要 でないことに気づく。したがって、そのポリヌクレオチド鋳型分子に相補的なＤ ＮＡ分子の開始および合成を生じさせられるような（ａ）逆転写酵素または酵素 複合体を結合すること、および（ｂ）逆転写酵素または酵素複合体のための鋳型 として作用することが可能である全てのポリヌクレオチドは、本発明のｃＤＮＡ 合成方法に利用することができる。ｃＤＮＡ合成に使用するための特定の鋳型ま たは鋳型プライマー分子の適合性は、以下に記述されるようにｃＤＮＡ合成を行 うこと、およびその合成の産物を分析することにより評価されうる。 鋳型（または鋳型プライマー）および逆転写酵素（または逆転写酵素複合体） は、その細胞に存在するか、またはいずれか１つまたは両方が細胞で合成される か細胞に導入される可能性がある。したがって、本発明の１つの具体例で、in v ivoでのｃＤＮＡ合成は、逆転写酵素および鋳型（または鋳型プライマー）分子 をコード化する遺伝子を担う細胞系統で行うことができる。これらの遺伝子の発 現は、細胞内での逆転写酵素および鋳型（または鋳型プライマー）の合成に帰着 する。他の具体例で、逆転写酵素および鋳型（または鋳型プライマー）分子をコ ード化する遺伝子は、誘導プロモーターの制御下で発現することができるので、 遺伝子の誘導が逆転写酵素と鋳型分子の発現を導き、それによってｃＤＮＡ合成 を開始させるだろう。 さらに一般的に、鋳型（または鋳型プライマー）分子および逆転写酵素（また は逆転写酵素複合体）が、外部の源から細胞に導入される。多数の技術が生細胞 中に生物材料を搬送するために確立されている。これらの技術の内の多くが記述 されており［Molecular Cloning; A Laboratory Manual Cold Spring Harbor La boratory Press，Cold Spring Harbor，NY．(1989); コーウン，ダブリィ．エイ ．らのMeth．Enzymol．185:527-537(1990)］、エレクトロポレーション［（ニュ ーマン，イーらのEMBO J．1:841-845(1982);Electroporation and electrofusio n in cell biology ニューマン，イー．ら編、Plenum Press、ニューヨーク(19 89)；カムダー，ピー．らのNocleic Acids Res．20:3526(1992); ロルス，エム −ピーらのEur.J.Biochem．206:115-121(1992); ソンガリス，ジー．ジェイ．ら のMutat．Res．244:257-263(1990);ラムバート，エイチ．らのBiochem．Cell Bi ol．68:729-734(1990); ヨリフジ，ティー．およびエイチ．ミカワのMutat．Res ．243:121-126(1990);ワインガー，アール．エイ．らのMutat．Res．225:49-53( 1989）］、DEAE- デキストラン［レベスク，ジェイ．ピー．らのBiotechniques 11:313-4，316-8(1991);イシカワ，ワイ．およびシー．ジェイ．ホムシーのNucl eic Acids Res．20:4367(1992)］、陽イオン性リポソーム[ジャーナジン，ダブ リュ．アールらのNucleic Acids Res．20:4205-4211(1992)]または陽イオン性脂 質[ワーカー，シー．らのProc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7915-7918(1992)]、 受容体媒介デリバリー（搬送）[ワグナー，イーらのProc．Natl．Acad．Sci．U SA 89:6099-6103(1992)]、マイクロインジェクション［マーチン，ピーらのDev ．Biol.,117:574-580(1986)］、プロトプラスト融合、レーザーまたは粒子衝撃 、およびウイルス性ベクター 搬送を含むがこれにより限定されるものでない。 当業者は、これらの技術の各々は関連する利点および欠点を有することを認識し 、そして使用される細胞型に最も適切な搬送技術を選択することができるだろう 。 本発明の特定の具体例では、in vivoでのｃＤＮＡ合成プライマー、鋳型およ び鋳型プライマーを細胞中に搬送するための技術としては、エレクトロポレーシ ョンおよびリポソーム移入が挙げられる。以下に記述されるとおり、これらの技 術は、修飾ｔＲＮＡプライマー、逆転写酵素、および修飾デオキシヌクレオシド 三リン酸を多くの異なる細胞型に導入するのに使用することができる。 逆転写酵素が外部の源由来の細胞に導入されると、in vivoでのｃＤＮＡ合成 プライマー、鋳型および鋳型プライマーを選択するのは、選ばれた逆転写酵素の 型により決定される。２つの一般に使用され、そして市販されている型の逆転写 酵素としては：鳥類の骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素およびモロニーマウス白血 病ウイルス逆転写酵素(MoMLV)がある。これらの酵素は、このような販売者から 市販品で入手できる：Stratagene，カリフォルニア92037、ラ ホーラ、エヌ． トーレイ パインズ ロード 11011番; Bethesda Research Laboratories，Inc. ，メリーランド20877、ジャイサーズバーグ、ピー．オー．ボックス 6009;New E ngland Bio Labs，Inc.、マサチューセッツ01915、ビバリー、トーザー ロード 32 番；およびBoehringer Mannheim Biochemicals、インディアナ46250、イン ディアナポリス、ピー．オー．ボックス 50816、ハーグ ロード 9115 番。種々 の酵素は、固有のパラメーター: 忠実度（誤差率）、処理性（ｃＤＮＡ合成を完 成する能力）および構造（異種ダイマー対モノマー）と、入手可能性や容認(acc eptance)のような市場パラメーターとの両方を示し、そしてそれらは酵素を選択 する際に考慮されるべき因子である。さらに、具体例の細胞型および生物で機能 するレトロウイルスまたはレトロエレメントから由来する逆転写酵素を使用する （例えば、ヒト細胞中でｃＤＮＡを合成するためにヒトレトロウイルス由来の逆 転写酵素を使用する。）ことは重要でありうる。 本発明の目的のために、プロモーター配列に機能するように連結したコード化 された修飾ｔＲＮＡ配列を含有するＤＮＡカセットを、細菌性ベクター 中にク ローン化した。これが、プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用 して、in vitro で修飾ｔＲＮＡプライマーを製造することを可能にした。in vi voでのｃＤＮＡ合成プライマーがin vitro で転写されるべき場合に用いるプロ モーターの選択は、ポリメラーゼ酵素により指示されて、選択されたin vitro での転写系で使用される。本発明の好適な具体例で、修飾ｔＲＮＡpro GGG プラ イマーが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用してin vitro 転写系でバクテリ オファージＴ７プロモーターの制御下で発現した。製造された修飾ｔＲＮＡプラ イマーが、分離されそして逆転写酵素、修飾ＭｏＭＬＶ鋳型プライマー分子およ び放射性標識されたデオキシヌクレオチドと一緒に細胞に導入された。これらの 外因性成分の導入に続いて、細胞を、十分な長さの時間、in vivoでのｃＤＮＡ 合成を起こさせるために適切な条件でインキュベートした。適切な条件は、一般 的に、問題にされる細胞型が通常どおり増殖する条件である。本発明の好ましい 具体例で、標的細胞はその細胞型のための通常の培養条件で０．５−２時間イン キュベートし、、その後プライマーおよび逆転写酵素の導入を行った。以下に列 記される実施例で記述されるとおり、放射性標識ｄＮＴＰ（例えば、〔α−32Ｐ 〕ｄＣＴＰ）の導入は、特定の条件で、そして特定のプライマーを用いてin viv oでのｃＤＮＡ合成の有効性を決定するのに使用されてもよい。細胞のインキュ ベーション後、in vivoで製造されたｃＤＮＡはその後ハート(Hirt)抽出液プロ トコールを利用して標的細胞から抽出された（ハート ビー．らのJ．Mol．Biol ．26:365-369(1967)）。抽出されたｃＤＮＡ産物は一般のクローニング手段を使 用して首尾よくクローン化される２本鎖核酸であるらしい。代替的方法として、 プライマー、鋳型および鋳型プライマーおよび／または酵素は、細胞内に導入さ れた遺伝子から製造することができた。酵素は、細胞内で遺伝子から発現され、 そしてプライマー、鋳型および鋳型プライマーは、細胞に導入され得た。または 、プライマー、鋳型および鋳型プライマーは、細胞内で発現されることができ、 そして逆転写酵素は、外側から導入されることができた。反応で修飾（放射性標 識化）デオキシヌクレオシド三リン酸の封入は、デオキシヌクレオチドの組み込 みを行うための道具として使用されたが、その方法の要件ではない。しかし、修 飾デオキシヌクレオチドの封入は、（α標識デオキシヌクレオチドが使用される 場合）以下の組み込みおよび合成の両方の簡便な技術を提供し、（ビオチン化さ れたまたは他のデオキシヌクレオチド類似体を使用して）in vivoでのｃＤＮＡ 組み込み反応の産物を選択または区別する手段を提供することに注目するべきで ある。修飾デオキシヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチド類似体は、全ての 型のポリメラーゼ反応で首尾よく使用されてきた。そして当業者には自明の技術 である（フローバー，ジェイ．エム．らのScience 238:336-341(1987);クレバン ，エル．およびジー．ゲベヤフのMeth．Enzymol.，154:561-577(1987);チャン， ブイ．ティー- ダブリュらのNucleic Acids Res．13:8083-8091(1985);ロー，ワ イ- エム．ディー．らのNucleic Acids Res．16:8719(1988)）。 これらの反応の産物は、消去式ｃＤＮＡライブラリーの構築、特異的細胞毒性 または軽感受性ｃＤＮＡ産物の製造、in vivoでのＤＮＡシーケンシング、およ び分析的、診断的または製造的用途のＤＮＡプローブを含むが、これにより限定 されるものでない種々の方法で使用することができる。 以下の実施例は、本発明の特定の好ましい具体例および態様を例示する役目を 果たし、それらの範囲を限定するように解釈されるべきではない。 実験 以下の実験の開示において、下記の略号を適用する：eq（当量）；Ｍ（モル） ；mM（ミリモル）；μM(マイクロモル)；Ｎ（規定）；モル（モル数）；ミリモ ル（ミリモル数）；μモル（マイクロモル数）；ｎモル（ナノモル数）；kg（キ ログラム）；g（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；ng（ナ ノグラム）；Ｌ（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル） ；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm(マイクロメートル)；nm（ ナノメートル）；Ｖ（ボルト）；μF(マイクロファラッド)および℃（摂氏温度 ）。 以下の実施例において、特にことわらない限り、制限酵素、T4DNA リガーゼ、 およびポリヌクレオチドキナーゼはニューイングランド・バイオラボから得られ る。［α-32P］dCTP、［α-32P］UTP、および［γ-32P］ATP はアマシャム社か ら得られ、Molonyマウス白血病ウイルス逆転写酵素緩衝液、リポソーム調製物お よび酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリィズから得られる。これらの物質は 、特にことわらない限り、製造業者の指示に従って使用される。エレクトロポレ ーションは、インビトロゲン社からのエレクトロポレーター、およびバイオラド 社からのエレクトロポレーションキュベットを使用して行われる。オリゴヌクレ オチドはオペロン・テクノロジーズ社から得られ、または、例えば、製造業者の 指示に従ってアプライド・バイオシステムズDNA 合成装置で合成し得る。サーマ ス・アクアチクス(Thermus aquaticus)DNA ポリメラーゼＩはパーキン−エルマ ー・シータスから入手される。全ての通常の分子生物学技術は、参考として本明 細書に含まれるSambrookら(1989)またはBergerおよびKimmel（1987）に従って行 われる。 本明細書に開示された核酸配列は便宜上10-mer以下のオリゴヌクレオチドに分 けられ、特にことわらない限り、連続配列と解されるべきである。 実施例１ I.tRNA プライマーをコードする遺伝子の合成 Molonyマウス白血病ウイルス(MoMuLV)は、レトロウイルス DNA の合成のため のプライマーとしてマウスtRNAPro 1,2イソアクセプター 分子を使用する(Harad a，F．ら，J.Biol.Chem．254: 10979-10985(1979); PetersおよびDahlberg，J.V irol．31:398(1979))。これらの特定のtRNA分子はウイルス粒子中にMoMuLV逆転 写酵素と複合体形成されて見られ、この複合体は、順に、ウイルスRNA ゲノムの プライマー結合部位にアニールする（図2Bおよび3Aを参照のこと）。アニールさ れたtRNA分子をプライマーとして使用できるMoMuLV逆転写酵素がDNA 合成を開始 し、そしてtRNAプライマーがアニールする鋳型RNA 分子に相補的であるDNA 分子 を合成し続ける。 マウスtRNAProGGG プライマーのヌクレオチド配列が知られている(Harada ら ，(1979))。このtRNA分子の２種のバージョンは遺伝子カセットからインビトロ で転写され、これらのカセットはオリゴヌクレオチドを使用して合成され、次に クローン化され、そして配列分析により確認される。これらの反応を使用したデ オキシリボヌクレオチドプライマーを以下に示す。 オリゴヌクレオチドプライマーNo.1およびNo.2を、図2Aに示された“野生型” マウスtRNAProGGG プライマーに相当する組換えtRNA分子を生成するように設計 する。インビトロで転写されたtRNAは、それらの細胞相対物中に存在する改変リ ボヌクレオチド塩基を含まない点で、或る種の相違がある。しかしながら、これ らの改変は逆転写酵素-tRNA 相互作用、および天然産の同系tRNA（Barat，C．ら (1989); Weiss，S.ら(1992); Barat，C.ら(1991)）のようにインビトロでのcDNA 合成を開始するそれらの能力の両方に関して同じ効力を有することがわかった。 これらのプライマーの3'末端は相補的であり、その結果、プライマーNo.1および プライマーNo.2の3'末端がインビトロでアニールされ、次にdNTPの存在下でDNA ポリメラーゼＩのクレノーフラグメントで処理されてT7 RNAポリメラーゼプロモ ーター−tRNAwtをコードするカセットを含む二本鎖DNA 分子を生成し得る。（図 2Aを参照のこと）。このプライマー対を、このバクテリオファージT7プロモータ ー配列がtRNA分子の5'末端に操作により結合されるように設計する。このプロモ ーター-tRNA カセットは制限部位と隣接してそのカセットがクローニングベクタ ーから開裂されることを可能にし、そしてEarI制限部位をカセットの3'末端にと り込み、その結果、インビトロでの転写反応の前のEarIエンドヌクレアーゼによ るカセットの消化が、コードされたtRNA配列の正確な3'末端で鋳型の直鎖化（そ れ故、転写の終止）をもたらす。プライマーNo.1およびNo.2のヌクレオチド配列 をそれぞれ配列番号１および配列番号２に示す。 第二プライマー対（プライマーNo.3およびNo.4）を、下記のtRNAの改変形態（ その改変tRNA分子はtRNApolyUと称される）をコードするように設計する。 tRNAwt、と同様に、バクテリオファージT7プロモーター配列を、tRNA配列およ び隣接制限部位の5'末端に操作により結合し、EarI部位をとり込む。そのtRNApo lyU 分子の3'末端を含むプライマーNo.4は、野生型tRNA分子の3'末端ヌクレオチ ドに代えてポリ(U)配列をコードする（図3Aおよび3B中のtRNA配列と比較のこと ）。プライマーNo.3およびNo.4をそれぞれ配列番号３および配列番号４に示す。 等モル比のプライマーNo．１＆２、および３＆４を、T4 DNAキナーゼ（ポリヌ クレオチドキナーゼ）を使用してキナーゼ処理する。キナーゼ処理されたオリゴ マープライマー対No.1およびNo.2、並びにプライマーNo.3およびNo.4を、２mMの dNTPを含むクレノー緩衝液（50mMのトリス−クロリド(pH7.6)、25℃、10mMのMgC l2、10mMのβ−メルカプトエタノール）中でアニールする（80℃で３分間、20分 間にわたって600℃から37℃に徐々に冷却する）。次に、アニールしたプライマ ー対を、30μl の容積中のDNA ポリメラーゼＩのクレノーフラグメント10単位と ともに37℃で30分間インキュベートして二本鎖DNA 合成を完結する。次に、普通 に利用できる技術を使用してこれらの二本鎖DNA カセットを抽出し、沈殿させ、 1/10TE緩衝液（１mMのトリス−クロリド、0.1 mMのEDTA(pH8.0)）中で再度懸濁 させ、そしてpUC18 クローニングベクター(Yannish- Perronら，Gene 33:103-11 9(1985))中の脱ホスホリル化SmaI部位に連結する。プライマーNo.1およびNo.2の 組み合わせにより生じた野生型tRNA遺伝子をpUC18 にクローン化してpUC18-T7tR NAwtをつくる。プライマーNo.3およびNo.4の組み合わせにより生じた改変tRNA遺 伝子をpUC18 にクローン化してpUC18-T7tRNApolyUをつくる。これらの２種のプ ロモーター-tRNA カセットの配列および方向をDNA 配列決定により確かめる（こ の配列決定は、供給業者の推奨に従ってシーケナーゼ（商標）2.0(U.S.バイオケ ミカルズ)を使用して行う）。 II．tRNA プライマーの合成 tRNAwtまたはtRNApolyUのいずれかをコードするクローン化DNA 分子を上記の ようにして生成する。そのtRNA遺伝子をバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ の存在下でインキュベートすることにより、これらのクローン化tRNA遺伝子から トランスファーRNA 分子を生成する。RNA ポリメラーゼは、それらが鋳型DNA 配 列中の転写終止シグナルに出会い、またはDNA 鋳型を単に複写する(run off)ま で鋳型DNA に相補的であるRNA 分子を合成し続ける。T7 RNAポリメラーゼの作用 により生成されたtRNA分子がそのtRNA遺伝子の末端で適当に終止することを確実 にするために、与えられた tRNA 鋳型をtRNA遺伝子の末端で直鎖化する。これは 、幾つかの方法で行い得る。 一つの技術はクローン化インサートを制限酵素消化により切断することを伴う 。EarI制限エンドヌクレアーゼによる消化はプロモーター-tRNA カセットをpUC1 8-T7tRNAwtから除去し、ベクター配列中で実質的に5'からT7プロモーター配列を 消化し、そしてtRNA遺伝子鋳型の3'末端で正確に消化する。 tRNApolyUインサートの3'末端にあるEarI制限部位は消化に対し耐性であるこ とがわかっているので、上記のアプローチはpUC18-T7tRNApolyUクローニングベ クターと共に使用されなくてもよい。この問題を回避するために、ポリメラーゼ 連鎖反応(PCR)を利用する別の技術を使用して特定のプロモーター- tRNApolyUフ ラグメントを増幅するとともに、鋳型をコードするtRNApolyUの末端を規定する 。この目的のために、２種のプライマーを使用する：第一プライマーはT7プロモ ーター領域配列に向けられた3'末端を有する挿入T7プロモーター領域に対し5'に 位置されたpUC18 ベクター 中の配列にアニールする市販のプライマーであり、 第二プライマーは所望のT7プロモーター- tRNApolyUカセットの塩基にアニール する“逆RNA プライマー”(配列番号５に示される)であり、その結果、逆RNA プ ライマーの最も5'側の塩基は、以下のようなコードされたtRNApolyU鋳型の最も3 '側の塩基である。 そのPCR を下記の条件に従って行う：PCR 緩衝液：67mMのトリス(25℃でpH9.2 )、16.6mMの(NH4)2SO4、1.5 mMのMgCl2; 50ng のそれぞれのプライマー、約1x108 分子のpUC18-T7tRNApolyU構築物、および250 μＭ濃度のそれぞれのデオキシヌ クレオチドトリホスフェート。その反応混合物を100 ℃で３分間加熱し、次 に15℃に冷却する。チューブを短時間遠心分離して内容物を回収し、次に１単位 のTaq ポリメラーゼおよび１滴の鉱油をそれぞれ20μl の反応液に添加する。そ の反応を下記のレジメで40サイクルで行う：94℃で１分間；次に55℃で１分間。 増幅生成物を５つの反応からプールし、クレノーフラグメントおよび１mMのdNTP でブラント末端にし、抽出してタンパク質および痕跡の鉱油を除去し、そして通 常のプロトコルを使用してEtOH沈殿する。そのペレットを70％のエタノール(EtO H)ですすぎ、乾燥させる。次にそのペレットを 1/10 TE 中で再度懸濁し、そし てフラグメントを既知のサイズの標準物質に対して２％のアガロース／TAE ゲル で調べる。 PCR は、鋳型依存性様式で増幅生成物の末端への単一ヌクレオチド（通常、デ オキシリボアデニル酸残基）のとり込みを可能にすることが知られていることに 留意すべきである（Clark，J．M.，Nucleic Acids Res．16:9677-9686(1988)） 。しかしながら、この鋳型依存性とり込みは稀に起こり、そして余分なアデニン 残基が付加されると、それは鋳型をコードする配列にではなく3'末端（これはT7 プロモーターの上流である）に付加される。これらの鋳型を使用するその後の試 験管内の転写反応の放射能標識生成物を、既知のサイズの標準物質を用いて変性 ポリアクリルアミド電気泳動を使用して調べたところ、所望のサイズのものであ る。 T7プロモーター -tRNAwtカセットおよびT7プロモーター -tRNApolyUカセット を含む直鎖状DNA フラグメントを、tRNA分子をインビトロで生成するための鋳型 分子として使用する。これを、バクテリオファージT7 RNA ポリメラーゼ酵素を 使用するラン−オフ(run-off)転写により行う（以下を参照のこと）。 tRNAwtのインビトロでの生成につき、EarI直鎖化pUC18-tRNAwt鋳型を使用して 反応を行う。tRNApolyUのインビトロでの生成につき、PCR 増幅T7- tRNApolyUカ セットを鋳型として使用する。また、DraI感受性T7- tRNApolyUカセットを直鎖 化にし、インビトロでの転写反応のための鋳型として使用する（EarI適合性T7- tRNApolyU鋳型の生成に使用されたのと同じプロトコルを使用して、オリゴマーN o.3および6 を用いて生成した）。インビトロ反応につき、下記の条件が使用し 得る（Gurevich，V.V.ら，Anal.Biochem．195:207-213(1991): 簡単に言えば、 RNase を含まないエッペンドルフチューブに、下記の成分を25℃で添加する：80 mMのHepes-KOH(pH7.5)、12mMのMgCl2、20mMのDTT、５mMのdNTP、２mMのスペルミ ジン；RNase を含まないdH2O; 50-100μg/mlの鋳型DNA および５μl の［α-32P ］ATP（30 μCi; 3000Ci/ ミリモル；生成物を調べ、定量するために添加した） 。反応成分を混合し、次にその反応をT7 RNAポリメラーゼ酵素反応ミックス(120 0-1800 U/ml の最終濃度まで)の添加で開始する。次にチューブを37℃で４時間 インキュベートする。RNase を含まないDNase を反応に添加し、そして鋳型DNA の消化を15〜30分間進行させる。この時点で、とり込みの効率を測定するために 、反応混合物の少量のアリコートを除去することができる。この測定を、過剰の RNase を含まないキャリヤーDNA の存在下で反応混合物のアリコートの低温トリ クロロ酢酸沈殿により行うことができる。この測定、合計カウントの対照を、同 反応混合物から沈殿されなかった物質で行う。次に反応混合物のそれぞれに、15 0 μl のRNase を含まないdH2Oおよび20μl の3MのNaOAc を添加し、その混合物 を等容積のフェノール／CHCl3(pH6.5)（pH6.5 で緩衝されたフェノールを使用し てRNA 生成物の塩基触媒加水分解の可能性を最小にする）、続いてCHCl3により 抽出する。生成物を２−プロパノールで沈殿させ、ペレットをすすぎ、沈殿を乾 燥させる。プライマー生成物をRNase を含まないdH2O中で再度懸濁させ、そして 既知のサイズの標準物質で行われるポリアクリルアミド／尿素ゲルのオートラジ オグラフィー露出を使用してアリコートをサイズにつきチェックする。 III.固相担体を使用する化学合成 改変されていないオリゴヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌク レオチドを固相で高収率で化学合成できることは、本発明を分取用、分析用およ び治療用に容易に採用されることを可能にする。改変オリゴリボヌクレオチド生 成に有益な合成技術および試薬（例えば、本明細書に参考として含まれるSprout ,B.S.ら，Nucleic Acids Res．17:3373-3386(1989)）は、RNA プライマーがDNA 鋳型からインビトロで生成される場合に行い得なかった幾つかの実施態様を与え る。例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドはRNase 活性に耐性であ ることが知られている(Sprout，B.S.ら，(1989); Inoue，H．ら，FEBS Lett．2 15:327- 330(1987))。それ故、オリゴリボヌクレオチドに代えて、インビボでの cDNA合成反応のプライマーとしてのこれらの改変RNA 分子の使用は、初期のcDNA 合成プライマーのRNase H 触媒除去（あらゆる既存の改変を含む）に対する耐性 をもたらす。次に、これらのプライマーはビオチニル化でき、32P 標識でき、ま たは初期の鋳型の塩基触媒加水分解後の第二鎖cDNA合成中に占有され、とり込ま れる制限部位の如き配列要素を含むことができる（２’−Ｏ−メチルプライマー は、初期のRNA 鋳型のアニールした相捕部分も同様に保護するであろう）。これ らの改変はタンパク質と会合するプライマーの能力を損なわないことが明らかで あり（Sprout，B.S.ら，(1989)）、そして改変オリゴリボヌクレオチドは予想さ れた特異性でアニールする。２’−ＯＨ基の脱離はRNA プライマーを隣接３’， ５’−ホスホジエステル結合に対する塩基触媒（求核性）攻撃に対し更に耐性に し、またそれは種々の汎存RNase に耐性である。 IV．実験設計 上記のようにして合成された改変tRNAプライマーを多種の細胞系におけるイン ビボcDNA合成反応に使用する。また、対照反応は、プライマーの不在下で、プラ イマーとしてオリゴ(dT)プライマー、またはインビトロで転写された野生型tRNAwt 分子を用いて行う。これらの実験において、プライマーを、Molonyマウス白血 病ウイルス逆転写酵素および［α-32P］dCTPと共に、エレクトロポレーションに より細胞に導入する。放射能標識dCTPは、これらの反応の生成物の分析を容易に するのに含まれる。インビボでのcDNA合成反応のための標的細胞の調製における 注意が重要であり、そしてプライマー−逆転写酵素（そして、おそらく改変デオ キシヌクレオチドトリホスフェート、またはアナローグ）送出の方式の評価を慎 重に考慮すべきである。当業者に自明であるように、多くの別法が存在する。こ れらの技術の幾つかが上記されており、下記の実施例におけるエレクトロポレー ションの使用は本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。 標的細胞への反応成分のエレクトロポレーションおよび細胞のインキュベーシ ョン後に、反応の生成物をハート抽出技術(Hirt,B.，J.Mol.Biol．26:365-369(1 967))により細胞から抽出し、リボヌクレアーゼＡで完全に消化する。フェノ ール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿後に、とり込みを定量化すること により、またオートラジオグラフィーを使用して、既知のサイズの標準物質を用 いてアガロースゲルで分離された生成物のサイズを調べることにより生成物を分 析する。更にS1ヌクレアーゼ処理、およびRNase H 処理を使用してDNA 生成物の 性質を測定する。 V.昆虫細胞中のインビボでのcDNA合成 昆虫Sf9 細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から 入手し、供給者により推奨されたように維持する。インビボでのcDNA合成につき 、細胞をグレース培地中で 1x107細胞/ mlの濃度で懸濁させる。 エレクトロポレーションの前に、逆転写酵素(1000 単位)、tRNAプライマー(5 μg)および［α-32P］dCTP（50μCi）を含む反応成分を、ジチオスレイトール(D TT)(10mM)を含む逆転写緩衝液(BRLから入手した)中で合計容積50μl で混合し、 そして室温で10分間インキュベートする。次にSf9 細胞（0.5 ml中 5x106細胞） を反応成分に添加し、その混合物を冷却した0.4cm のエレクトロポレーションキ ュベットに移す。次にエレクトロポレーションを200V、250 μF および無限抵抗 にセットしたエレクトロポレーターで行う。 エレクトロポレーション後に、温めたグレース培地１mlをキュベットに添加し 、その混合物をプラスチックチューブ(ファルコン#2059)に移す。次にその混合 物を37℃で１時間インキュベートする。Sf9 昆虫細胞系を維持するのに通常の温 度は約25℃であるが、改変された酵素活性の取得が主たる関心事項である。 37℃のインキュベーション期間後に、細胞をエッペンドルフ型式5415C マイク ロフュージ（または均等物）中でセッティング５で５分間の遠心分離によりペレ ットにする。放射性上澄みを注意して除去し、適当に処理し、そして0.6 ％のド デシル硫酸ナトリウム(SDS)1ml、10mMのEDTA(pH7.5)を細胞ペレットに添加する 。直ちに、このペレットを大きな穴のピペットマンP1000 チップで軽く再度懸濁 させる（チップの一部を除去して穴の直径を増大し、こうして剪断力およびゲノ ムDNA の断片化を低下する）。粘稠な溶解産物を氷上に５分間置き、次に5MのNa Cl 250μl を添加し、チューブを数回倒立させて混合する。次に管を氷上に置く 。 このハート抽出のインキュベーション期間（２〜12時間）後に、抽出物を低温エ ッペンドルフ・マイクロフュージ中でトップスピードで20分間遠心分離する。上 澄みをペレット（これは放射性廃棄物中に捨てられる）から抜取り、そして上澄 みを二つの新しい1.5 mlのマイクロフュージ管の間で分離する。これらの上澄み をフェノール／クロロホルム(1:1)で２回抽出し、クロロホルムで１回抽出する 。次に核酸フラクションを1/10容積の3MのNaOAc および1/6 容積の２−プロパノ ールの添加で沈殿させる。そのペレットを70％のエタノールですすぎ、次に乾燥 させる。ペレットを18μl の１mMのトリス−クロリド、0.1 mMのEDTA(pH7.0)中 で再度懸濁させる。再度懸濁した核酸フラクションをリボヌクレアーゼＡ（10mg /ml の原液２μl）で37℃で15分間処理し、続いて30μl の１mMのトリス−クロ リド、0.1 mMのEDTA(pH7.0)を添加する。次にその溶液をフェノール／クロロホ ルム(1:1)で１回抽出し、次にクロロホルムで１回抽出する。次に核酸フラクシ ョンを1/10容積の3MのNaOAc および２容積のエタノールの添加で沈殿させる。ペ レットを70％のエタノールですすぎ、乾燥させる。セレンコフ(Cerenkov)・カウ ントを乾燥ペレットに関して得、ペレットを再度懸濁し、そしてアリコートをシ ンチラントでカウントする。放射標識した分子量標準物質を用いて、生成物をア ガロース/ TAE ゲルで電気泳動にかける。次にゲルを臭化エチジウムで染色し、 乾燥し、オートラジオグラフィーにより調べる。 VI．ハムスター 細胞中のインビボでのcDNA合成 ハムスターCHO 細胞系をATCCから入手し、ATCCにより推奨されたようにして維 持する。エレクトロポレーションの前に、トリプシン/EDTA 溶液を使用してCHO 細胞を単層培養から回収する。はがした細胞をカウントし、PBS 中ですすぎ、そ して1x107または1x108の細胞/ml でPBS 中で再度懸濁する。反応成分はDTT（10 mM）を含む逆転写緩衝液(BRL)中で50μl の合計容積で混合した逆転写酵素(1000 単位)、tRNAプライマー(5μg)、および［α-32P］dCTP（50μCi）であり、室温 で10分間インキュベートする。プレインキュベーション後に、CHO 細胞0.5 mlを その混合物に添加し、細胞を混合し、直ちに冷却した0.4cm のエレクトロポレー ションキュベットに移す。エレクトロポレーションを下記の条件下で行う： 330V、1000μF および無限抵抗。エレクトロポレーション後に、温めたCO2平衡 ハム(Ham's)培地（ギブコ）１mlをキュベットに添加し、その混合物をプラスチ ックチューブ(ファルコン#2059)に移し、その混合物を37℃で１時間インキュベ ートする。 そのインキュベーション期間後に、細胞をエッペンドルフ型式5415C マイクロ フュージ（または均等物）中でセッティング５で５分間の遠心分離によりペレッ トにする。放射性上澄みを注意して除去し、適当に処理し、そして0.6 ％のSDS （ドデシル硫酸ナトリウム）１ml、10mMのEDTA(pH7.5)を細胞ペレットに添加す る。直ちに、このペレットを大きくした穴のピペットマンP1000 チップで穏やか に再度懸濁する。粘稠な溶解産物を氷上に５分間置き、次に5MのNaCl 250μl を 添加し、チューブを数回倒立させて混合する。次に管を氷上に置く。このハート 抽出のインキュベーション期間（２〜12時間）後に、抽出物を低温エッペンドル フ・マイクロフュージ中でトップスピードで20分間遠心分離する。上澄みをペレ ット（これは放射性廃棄物中に捨てられる）から抜取り、そして上澄みを二つの 新しい1.5 mlのマイクロフュージ管の間で分離する。これらの上澄みをフェノー ル／クロロホルム(1:1)で２回抽出し、次にクロロホルムで１回抽出する。次に 核酸フラクションを1/10容積の3MのNaOAc および1/6 容積の２−プロパノールの 添加で沈殿させる。そのペレットを70％のエタノールですすぎ、乾燥させる。ペ レットを18μl の１mMのトリス−クロリド、0.1 mMのEDTA(pH7.0)中で再度懸濁 する。再度懸濁した核酸フラクションをリボヌクレアーゼＡ（10mg/ml の原液２ μl）で37℃で15分間処理し、続いて30μl の１mMのトリス−クロリド、0.1 mM のEDTA(pH7.0)を添加する。次にその溶液をフェノール／クロロホルム(1:1)で１ 回抽出し、次にクロロホルムで１回抽出する。次に核酸フラクションを1/10容積 の3MのNaOAc および２容積のエタノールの添加で沈殿させる。ペレットを70％の エタノールですすぎ、乾燥させる。次に第Ｖ節に記載されたようにしてセレンコ フ・カウントを乾燥ペレットに関して得る。 VII.ヒト細胞中のインビボでのcDNA合成 ヒトヒーラ（HeLa）細胞系をATCCから入手し、ATCCにより推奨されたようにし て維持する。エレクトロポレーションの前に、トリプシン/ EDTA溶液を使用して ヒーラ細胞を単層培養から回収する。はがした細胞をカウントし、PBS 中ですす ぎ、そして1x107の細胞/ mlでPBS 中で再度懸濁する。反応成分はDTT（10 mM） を含む逆転写緩衝液(BRL)中で50μl の合計容積で混合した逆転写酵素(1000 単 位)、tRNAプライマー(5μg)、および［α-32P］dCTP（50 μCi）であり、室温で 10分間インキュベートする。次にヒーラ細胞(5x106)0.5 mlをその反応成分に添 加し、その混合物を冷却した0.4cm のエレクトロポレーションキュベット（バイ オラド）に移す。次にエレクトロポレーションを下記のセッティングで行う：33 0V、1000μF および無限抵抗。エレクトロポレーション後に、温めた CO2−平衡 イーグル最小必須培地（ギブコ）１mlをキュベットに添加し、その混合物をプラ スチックチューブ(ファルコン#2059)に移し、次にその混合物を37℃で１時間イ ンキュベートする。 そのインキュベーション期間後に、細胞を第Ｖ節に記載されたようにしてハー ト抽出にかけ、そしてセレンコフ・カウントを乾燥ペレットに関して得る。 下記の条件を、試験した細胞系の全てにおけるインビボでのcDNA合成反応の対 照として使用する：全ての反応液は［α-32P］dCTP 50μCi（約3000Ci/ ミリモ ル）を含む。含む場合、逆転写酵素(MoMuLV; BRL)1000 単位を反応混合物に添加 する。tRNAプライマーを必要とする反応において、プライマー１〜10μg を細胞 0.5 mlに対し添加し、その量を全ての利用可能な逆転写酵素と複合体を形成する のに所望される量により決定する。オリゴ(dT)プライマーは、デオキシリボチミ ジル酸の12〜18塩基のオリゴマーからなることが好ましい。示される場合、この オリゴヌクレオチドプライマー１または５μg を反応液に添加する。 VIII．生成物の分析 第Ｖ、VIおよびVII 節において記載するように、セレンコフ・カウントを乾燥 ペレットに関して得ることができる。ペレットを再度懸濁することができ（そし てアリコートをシンチラントでカウントし）、そして生成物をアガロース/TAEゲ ルで電気泳動にかけることができる。これらのゲルを放射標識した分子量標準物 質を用いて泳動し、そしてゲルをEtBrで染色することができ（図５、７、および ９を参照のこと）、乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーにより調べること ができる（図６、８、および10を参照のこと）。 反応生成物をS1ヌクレアーゼで処理してポリデオキシリボヌクレオチド生成物 の性質を調べる。S1ヌクレアーゼは二本鎖核酸分子を制限された範囲で消化する が、その酵素は一本鎖核酸基質に対し最も有効に作用する。こうして、一本鎖で ある（または一本鎖領域を含む）ポリヌクレオチドをS1ヌクレアーゼ処理(Sambr ook 1989)により非常に迅速に完全に消化する。図10に見られるように、S1ヌク レアーゼで処理された試料は、未処理の試料と比較した場合、認められる分解を 示さない（図10；レーン２＆３、およびレーン４＆５を比較のこと）。実際に、 主要なcDNA生成物（約1.9 kbのサイズ）（これはtRNAwtプライマーで得られたイ ンビボでのcDNA合成反応中に現れる）は、S1ヌクレアーゼ処理の前後で認められ る相違を示さない（図10：レーン２と３を比較のこと）。 インビボでのcDNA生成物を更に同定するために、S1ヌクレアーゼ処理をリボヌ クレアーゼＨ処理の前後の並行試料につき行う。リボヌクレアーゼＨはDNA-RNA ヘテロ二本鎖のRNA 鎖を消化する活性を有する。二本鎖cDNA生成物がヘテロ二本 鎖である場合、リボヌクレアーゼＨによるその物質の処理、続いてS1ヌクレアー ゼによる処理は、その物質の分解およびアガロース/ TAE 電気泳動ゲルの高分子 量範囲におけるオートラジオグラフィーシグナルの損失をもたらすであろう。こ れらの実験を行う時、反応生成物はS1ヌクレアーゼによる処理単独の生成物から 区別できないで現れる。しかしながら、RNase H およびS1ヌクレアーゼ処理で行 われる実験は、生体内のcDNA生成物中のヘテロ二本鎖を除くために反復されるで あろう。 IX．インビボで合成されたcDNA生成物のクローニング 上記の反応からの二本鎖cDNA生成物を、認められたクローニング技術を使用し てベクターにクローン化する。簡単に言えば、細胞を改変tRNAプライマー、逆転 写酵素、および［α-32P］dCTP（とり込みを追跡するため）を用いてエレクトロ ポレーションにかける。エレクトロポレーション及びとり込みの後に、細胞を上 記の第Ｖ、VIおよびVII 節に記載されたようにして処理する。最終ペレットを 70％のエタノールですすぎ、乾燥させる。セレンコフ・カウントを乾燥ペレット に関して得、ペレットを再度懸濁させ、そしてアリコートをシンチラントでカウ ントする。放射能標識した分子量標準物質を用いて生成物をアガロース/TAEゲル で電気泳動にかける。ゲルをEtBrで染色し（図５、７、および９を参照のこと） 、乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにより調べる（図６、８、および10を 参照のこと）。 このインビボでのcDNA合成反応で生じる第二鎖cDNA合成は、いずれも第一鎖cD NA生成物の3'末端により開始されることが可能である。RNase 活性はRNA 鋳型分 解中に作用して第一鎖cDNA生成物の3'末端を遊離し、隣接配列をこの3'末端によ りアニーリングを受け易くなるようにする。これがこの酵素によるインビトロで のcDNA合成に共通の機構である（Okayama，H．ら，Recombinant DNA Methodolog y ，Academic Press，Inc.，235-260頁(1989)）。cDNA生成物の末端がクローニン グを受け易くすることを確実にするために、インビボのcDNA反応生成物をS1ヌク レアーゼで処理し、そしてアダプター 分子またはリンカー分子の添加の前に、T 4 DNAポリメラーゼおよび高濃度のdNTPでブラント末端にする。S1ヌクレアーゼ は使用直前に希釈されること、そして使用される濃度はスケールアップ反応の前 にcDNA生成物の小部分を用いて測定することが重要である。RNase A 処理、抽出 および沈殿後に、cDNAをS1ヌクレアーゼ緩衝液：200 mMのNaCl、50mMのNaOAc(pH 4.5)、１mMのZnSO4、0.5 ％のグリセロール中で再度懸濁し、そして37℃で30分 間にわたってcDNA 1μg 当たり約100 単位の希釈S1ヌクレアーゼで処理する(Kim mel，A.R.,およびS.L.Berger，Guide to Molecular Cloning Techniques，Acade mic Press，328-329(1987))。EDTAを20mMまで添加して反応を停止する。生成物 を緩衝されたフェノール/ クロロホルムで２回抽出し、次にクロロホルムで１回 抽出する。水相を含むチューブに、1/10容積の酢酸ナトリウムおよび２容積のエ タノールを添加し、その反応混合物を-70 ℃で30分間放置する。チューブを低温 マイクロフュージ中で15分間にわたって遠心分離し、上澄みを捨てる。ペレット を80％のエタノールで注意してすすぎ、スピードバック（Savant）中で乾燥させ る。 その生成物を高レベルのdNTPの存在下でT4 DNAポリメラーゼで処理して末端を ブラントにすることを確実にする。cDNA生成物をT4 DNAポリメラーゼ緩衝液(50m Mのトリス-HCl(pH8.3)、50mMのNaCl、10mMのMgCl2、10mMのDTT)中で懸濁させる 。それぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェートを含む原液を添加して500 μM の最終濃度を得る。次に10単位のT4 DNAポリメラーゼを50μl の最終濃度ま で添加し、その反応を37℃で30分間インキュベートする。その反応を20mMまでの EDTAの添加により停止する。もう一度、生成物を抽出し、沈殿させ、そしてペレ ットを第Ｖ節に記載されたようにしてすすぎ、乾燥させる。 それから、アダプターまたはリンカーをcDNA生成物に添加することができる。 アニールしたヘミホスホリル化アダプター（プロメガ: アダプターの5'ブラント 末端のみがホスホリル化される）は、それが、リンカーコンカテマーを除去する ためのcDNAインサートの消化をしないで、アダプターの結合および過剰の未結合 のアダプターの排除後にcDNA生成物のクローニングを可能にする点で有利と考え られる。加えて、“リンカーライブラリー”構築物を排除するのに必要な過剰の アダプターを除去する工程が、ベクターへの結合の前にcDNAをサイジング(sizin g)するのに同様に利用し得る。 また、アニールした、ホスホリル化されていないリンカー（ベーリンガー・マ ンハイム）を使用することができ、そして過剰の未結合のリンカーを、その結合 生成物を60℃〜70℃の範囲で短時間加熱することにより簡単に除去することがで きる。これは結合されていない付着末端を溶融し、そして連結したリンカー付き のcDNA生成物をカラムクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により分離するこ とができる。 cDNAの末端およびアダプターのモル当量の濃度を計算し、そして約20倍過剰の アダプターまたはリンカーを結合反応に使用する(Wu，R．ら，Meth．Enzymol．1 52:343-349(1987))。その結合反応を、以下のようにして行う。チューブに、合 計容積20μl 中、２μl の10X 連結緩衝液(666mMのトリス-HCl(pH7.6)、100 mM のMgCl2、100 mMのDTT、３mMのATP、10mMのスペルミジン-HCl、10mMのヘキサミ ンコバルトクロリド、２mg/ml のウシ血清アルブミン)、ヘミホスホリル化アダ プター、二本鎖ブラントcDNA、および５単位のT4 DNAリガーゼを添加する。その 混合物を15℃で一夜インキュベートする。ブラント末端の結合をPEG8000 の添 加により増進することができる。しかしながら、ポリエチレングリコールはファ ージパッケージング反応を抑制し、このためこれらの反応の前に完全に除去すべ きである。次にその結合反応液を１mlの床容積のセファクリルS400スピンカラム （プロメガ）に装填し、これを800xg で遠心分離して過剰のアダプターおよびア ダプター二量体を除去する。cDNA生成物の更に正確なサイズ選択を可能にする別 の技術は、アガロースゲル電気泳動、続いて陽イオンニトロセルロース（例えば 、DEAEニトロセルロース）からの捕捉および溶離、または低融点のアガロースの 回収部分から直接回収することを含む。 シンチレーションを使用してcDNAを定量し、そのモル末端を計算する（量およ び平均サイズを基準とした）。今、cDNAインサートが選択されるベクターへの連 結に供される（インサートのサイズおよび付着末端の適合性により若干拘束され る）。もう一度、連結を上記のようにして行う。ヘミホスホリル化アダプターま たはホスホリル化されていないアダプターの使用により、多重インサートクロー ニングが起こりそうにない。何となれば、ベクターのみが接近可能なホスホリル 化末端を有するからである。 次にその結合反応をファージパッケージングに使用し、または化学変換もしく はエレクトロポレーションのために希釈する。現れるコロニーまたはファージを 最初に豊富な遺伝子につき青色／白色の色選別（α相補性）、またはプローブで スクリーニングする。加えて、ランダムコロニーまたはプラークを、クローニン グ部位に隣接するプライマーによるPCR を使用して、または制限消化分析により インサートサイズにつき調べる。 これらの一般的な技術を使用して、インビボでのcDNA合成方法を使用してCHO 細胞からつくられたcDNAからライブラリーを構築する。ライブラリーの一つをCH O 細胞からのtRNAwtで開始された生体内のcDNA生成物(約1.9kb)からつくり（図 ８、レーン４および８を参照のこと）、これをクローニングの前にDEAEニトロセ ルロース（NA45、Ｓ＆Ｓ）捕捉／溶離操作を使用してアガロースゲルでサイズ選 別する。別のライブラリーをCHO 細胞からのtRNApolyU開始されたインビボでのc DNA生成物からつくり、これをアガロースゲル電気泳動を使用して4-10 kb の間 でcDNAにつきサイズ選別する。 tRNAwtプライマーによりCHO 細胞中に現れるcDNA生成物（約1.9 kb）は、試験 した全てのCHO 細胞系(Anderson，K.P．ら，Virol.181:305-311(1991)）に見ら れる保存された適度に反復性のＣ型配列および細胞質内Ａ型粒子(IAP)配列から の配列特異性プライミングおよび合成を代表し得る。これらの種はマウス白血病 ウイルスのゲノムに対し広範な相同性を有する。 実施例２ I.インビボでのcDNA合成に関するプライマーの適性を評価するための一般的な 方法 改変リボヌクレオチド塩基（図2Bを参照のこと）を含む細胞の逆転写酵素同族 tRNA分子は、ウイルス複製中にレトロウイルスのcDNA合成を開始する。これらの 分子は、本発明により実証され、またインビトロで先に行われた研究(Barat，C. ら，Nucleic Acids Res．19:751-757(1991); Weiss，S．ら，Gene 111:183-197( 1992); Kohlstaedt，L.A.およびT.A．Steitz，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 89:965 2-9656(1992))から推定されるように、インビボでのcDNA合成を全く開始するこ とができない。実際に、塩基改変を欠いている合成tRNA分子のフラグメントはイ ンビトロでRNA 鋳型にアニールでき、そしてこれらの鋳型からインビトロでのcD NA合成を誘導することができる(Weiss，S.ら，Gene 111:183-197(1992))。 ショウジョウバエ属において、コピアレトロウイルス様粒子中の逆転写はショ ウジョウバエtRNAi Met分子からの開裂および開始から起こる(Kikuchi，Y.ら，Pr oc.Natl.Acad.Sci．USA 87:8105-8109(1990))。それ故、逆転写酵素の同族tRNA プライマー分子の、先端を切ったアナローグである合成ポリヌクレオチドは本発 明のプライマーとして同様に機能し得ることが明らかである。インビボでのcDNA 合成反応に関するポリヌクレオチドプライマーの適性の測定は直接的である。前 記のように、プライマーは二つの重要な基準を満足できるであろう。(a)インビ ボでRNA 鋳型分子に結合でき、かつ(b)そのRNA 鋳型分子に相補的なDNA の合成 が起こるように少なくとも一つの逆転写酵素のプライマーとして作用できるあら ゆるオリゴヌクレオチドが、本発明のインビボでのcDNA合成の真正プライマーで ある。有望なプライマーの適性を定性的かつ定量的に評価する実験が、チ ャイニーズハムスター 卵巣(CHO)細胞を使用して行い得る（上記の実施例１を参 照のこと）。 インビボアッセイは、エレクトロポレーションによる細胞への［α-32P］dCTP 、推定プライマー、およびMolonyマウス白血病ウイルス逆転写酵素の導入からな る。インビボでのcDNA合成のプライマーの適性を評価するための対照として、下 記の陰性対照が挙げられる。 1)［α-32P］dCTP単独のエレクトロポレーション 2)逆転写酵素と共に［α-32P］dCTPのエレクトロポレーション実際のプライマ ー試験反応は、 3)“候補”ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素と共に［α-32P］dC TPのエレクトロポレーションからなることができる。 陽性対照反応は、 4)改変tRNApolyUプライマーおよび逆転写酵素と共に［α-32P］dCTPのエレク トロポレーションからなることができる。 ハムスターCHO 細胞系をATCCから入手し、実施例１に記載されたようにして維 持する。エレクトロポレーションの前に、トリプシン/ EDTA溶液を使用してCHO 細胞を単層培養から回収する。はがした細胞をカウントし、PBS 中ですすぎ、そ して 1x108細胞/ mlでPBS 中で再度懸濁する。反応成分はDTT（10 mM）を含む逆 転写緩衝液(BRL)中で50μl の合計容積で混合された逆転写酵素(1000 単位）、t RNAプライマー(5μg;またはモル当量の候補プライマー）、および［α-32P］dCT P（50 μCi）を含み、室温で10分間インキュベートする。プレインキュベーショ ン後に、CHO細胞0.5 mlをその混合物に添加し、細胞を混合し、直ちにエレクト ロポレーションキュベットに移す。エレクトロポレーションを下記の条件下で行 う：330V、1000μF および無限抵抗。エレクトロポレーション後に、温めたCO2 平衡ハム培地（ギブコ）１mlをキュベットに添加し、その混合物をプラスチック チューブ（ファルコン#2059)に移し、次にその混合物を37℃で１時間インキュベ ートする。 そのインキュベーション期間後に、細胞をエッペンドルフ型式5415C マイクロ フュージ（または均等物）中でセッティング５で５分間の遠心分離によりペレッ トにし、実施例１、第VI節に記載されたようにして抽出プロトコルにかけ、そし てセレンコフ・カウントを乾燥ペレットに関して得る。 ペレットを再度懸濁し、アリコートをシンチラントでカウントする。放射標識 した分子量標準物質を用いて、生成物をアガロース/TAEゲルで電気泳動にかける 。次にゲルを臭化エチジウムで染色し、乾燥させ、オートラジオグラフィーによ り調べる。 結果の解釈 候補ポリヌクレオチドプライマーを用いる実験からの最終ペレットへの標識デ オキシリボヌクレオチドのとり込みのセレンコフ・カウントの結果が陰性対照で 見られたとり込みを越え、また陽性対照で見られたとり込みが陰性対照で見られ たレベルより高い場合、その試験プライマーはcDNA合成を開始しているかもしれ ない。しかしながら、cDNA生成物の性質が非常に重要であり、調べるべきである 。 それ故、第二の基準は生成物の定性評価であり、最初にアガロース/TAEゲルで 、放射標識した分子量標準物質と並行して実験された10のアリコートから得られ たオートラジオグラフィーシグナルのパターンおよび密度から測定される。ポリ ヌクレオチドプライマーが異なるサイズのRNA 鋳型、またはRNA 鋳型分子の5'か らの異なる距離にある結合部位にアニールするように設計される場合、cDNA生成 物の異種集団が予想される。しかしながら、プライマーが特定の同種RNA 鋳型に アニールするように設計される場合、特定のcDNA生成物が生成されるべきである （例えば、図８、レーン４および５、並びにレーン８および９を比較のこと）。 それ故、定性パラメーターおよび定量パラメーターの両方を調べて有望なプライ マーの効力を測定すべきである。 実施例３ I.配列特異的インビボcDNA合成プライマーの発生 また、本発明は、適合性逆転写酵素および、所望により、改変デオキシヌクレ オチドトリホスフェートまたはデオキシヌクレオチドトリホスフェートアナロー グと組み合わせて細胞に導入される配列特異的プロモーターを使用する配列特異 的インビボcDNA合成反応を提供する。これらの配列特異的プライマーは、DNA 鋳 型から調製される転写産物として、または化学手段（例えば、固相担体による） により合成し得る。 II．固相担体を使用する化学合成 改変されていないオリゴヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌ クレオチドを固相で高収率で化学合成できることは、本発明を分取用、分析用お よび治療用に容易に採用されることを可能にする。改変オリゴリボヌクレオチド 生成に有益な合成技術および試薬（例えば、本明細書に参考として含まれるSpro ut，B.S.ら，Nucleic Acids Res．17:3373-3386(1989)）は、RNA プライマーがD NA 鋳型からインビトロで生成される場合に行い得なかった幾つかの実施態様を 与える。例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドはRNase 活性に耐性 であることが知られている(Sprout，B.S.ら，(1989); Inoue，H．ら，FEBS Lett ．215:327- 330(1987))。それ故、オリゴリボヌクレオチドに代えて、インビボ でのcDNA合成反応のプライマーとしてのこれらの改変RNA 分子の使用は、初期の cDNA合成プライマーのRNase H 触媒除去（あらゆる既存の改変を含む）に対する 耐性をもたらす。次にこれらのプライマーは蛍光団若しくはハプテンと結合でき 、ビオチニル化でき、32P 標識でき、または初期の鋳型の塩基触媒加水分解後の 第二鎖cDNA合成中に占有され、とり込まれる制限部位の如き配列要素を含むこと ができる（２’−Ｏ−メチルプライマーは初期のRNA 鋳型のアニールした相補部 分をも同様に保護するであろう）。これらの改変はタンパク質と会合するプライ マーの能力を損なわないようであり（Sprout，B.S.ら，(1989)）、そして改変オ リゴリボヌクレオチドは予想された特異性でアニールする。２’−ＯＨ基の脱離 はRNA プライマーを隣接３’，５’−ホスホジエステル結合に対する塩基触媒（ 求核性）攻撃に対し更に耐性にし、またそれは種々の汎存RNase に耐性である。 III.配列特異的DNA 鋳型からの転写 所望の配列特異的tRNAプライマーを生成できる一つの実施態様は、一般に下記 のように、DNA 鋳型からのインビトロ転写からなる。 配列特異的tRNAプライマーをコードする発現カセットの生成のための初期の鋳 型は、pUC18-T7tRNAwtベクター構築物であり得る。この構築物はtRNAwt分子をコ ードする（図2Bおよび3Aを参照のこと）。２種のプライマーのうちの第一プライ マーは、pUC18 ベクター中の5'からT7プロモーター配列に向けて存在し（図４を 参照のこと）、T7プロモーター配列に向かって3'方向に延びる配列にアニールす る。市販のプライマーをこのようにしてpUC18-T7tRNApolyU発現カセットの増幅 に使用した。 第二プライマーは、インビボcDNA合成反応のRNA 鋳型（例えば、既知の配列の RNA 鋳型）中の配列に相補的であるが、初期のDNA 鋳型の配列に相補的ではない プライマーの5'末端にある塩基を含むことが望ましいであろう（図４を参照のこ と）。プライマー中の残りの塩基は、pUC18-T7tRNAwtDNA ベクター中のコードさ れたtRNA鋳型の正確な3'末端から同様の距離にあり、そしてT7プロモーター配列 に向かって3'方向に延びるDNA 鋳型中の塩基に相補性であろう（即ち、この第二 プライマーの5'末端にある20の塩基はインビボcDNA合成のRNA 標的に相補的であ り、次に残りの塩基はその3'末端から20の塩基で開始するコードされたT7tRNAwt DNA 中の塩基に相補的であろう）。この状況が図４に表される。 PCR においてこれらの２種のプライマーを使用して、増幅されたDNA T7発現カ セット中にコードされたtRNAプライマーを、初期のtRNAwt型から増幅プロセス中 に所望のtRNAspecific鋳型に改変する（図４を参照のこと）。同時に、第二プラ イマーの5'塩基が、得られたtRNAspecificをコードするカセットの3'境界を形成 する。このカセットは、第二PCR プライマー中にコードされた5'配列、およびイ ンビボcDNA合成反応についてのRNA 標的の両方に相補的である3'末端を有するtR NAspecisic分子を生じる（図４を参照のこと）。 そのPCR を20μl の容積で下記の条件に従って行う：PCR 緩衝液：67mMのトリ ス（pH9.2、25℃)、16.6mMの(NH4)2SO4、1.5 mMのMgCl2; 50ng のそれぞれのプ ライマー、約1x108分子のpUC18-T7tRNAwt構築物、および250 μＭ濃度のそれぞ れのデオキシヌクレオチドトリホスフェート。その反応混合物を100 ℃で３分間 加熱し、次に15℃に冷却する。チューブを短時間遠心分離して内容物を回収し、 次に１単位のTaq ポリメラーゼおよび１滴の鉱油をそれぞれ20μl の反応液に添 加する。その反応を下記のレジメで40サイクルで行う：94℃で１分間；次に55℃ で１分間。生成物を５つの反応からプールし、クレノーフラグメントでブラント 末端にし、抽出してタンパク質および痕跡の鉱油を除去し、そして通常のプロト コルを使用してEtOH沈殿させる。フラグメントを１mMのトリス−クロリド(pH8.0 )、0.1 mMのDTA中で再度懸濁し、そしてアリコートを既知のサイズの標準物質で ２％のアガロース／TAE ゲルで調べてサイズを確かめ、定量する。典型的な収量 はそれぞれの20μl の反応につき約500ng 〜１μg であると予想される。 次にtRNAspecific分子を上記のtRNApolyUの生成に使用されたインビトロでの 転写反応と同様の転写反応で生成する。簡単に言えば、RNase を含まないエッペ ンドルフチューブに、下記の成分を25℃で添加する：80mMのHepes-KOH(pH7.5)、 12mMのMgCl2、20mMのDTT、５mMのdNTP、２mMのスペルミジン；RNase を含まない dH2O; 50-100μg/mlの鋳型DNA および５μlの［α-32P］ATP（30 μCi; 3000Ci/ ミリモル；生成物を調べ、定量するために添加した）。反応成分を混合し、次 にその反応をT7 RNAポリメラーゼ酵素反応ミックス(1200-1800 U/ml の最終濃度 まで）の添加で開始する。次にチューブを37℃で４時間インキュベートする。次 にRNase を含まないDNase を反応に添加し、そして鋳型DNA の消化を15〜30分間 進行させる。この時点で、とり込みの効率を測定するために、反応混合物の少量 のアリコートを除去することができる。（これは、過剰のRNase を含まないキャ リヤーDNA の存在下で反応混合物のアリコートの低温トリクロロ酢酸沈殿により 行うことができる。この測定、合計カウントの対照は、同反応混合物から沈殿さ れなかった物質で行う。）次に反応混合物のそれぞれに、150 μl のRNase を含 まないdH2Oおよび20μl の3MのNaOAc を添加し、その混合物を等容積のフェノー ル／CHCl3(pH6.5)、続いてCHCl3により抽出する。生成物を２−プロパノールで 沈殿させ、ペレットをすすぎ、沈殿を乾燥させる。プライマー生成物をRNase を 含まないdH2O中で再度懸濁し、そして既知のサイズの標準物質で行われるポリア クリルアミド／尿素ゲルのオートラジオグラフィー露出を使用してアリコートを サイズにつきチェックする。細胞への導入の前に、プライマーを精製し、定量す る。 このアプローチは、MoMuLV逆転写酵素と共に使用するための配列特異的tRNAプ ライマーのインビトロでの生成に使用されるDNA カセットの直接の増幅を可能に する。その技術は単一の配列特異的DNA プライマー、5'ユニバーサルプライマー およびカセット増幅のためのtRNAwtDNA 鋳型を使用する。 実施例４ I.細胞中のスプライス変異体の比を測定するための配列特異的プライマーの使 用 インビボcDNA反応に使用するために配列特異的プライマーを生成できることは 、研究者らが標的細胞または組織中に存在する転写パターンの実時間“スナップ ショット”をとることを可能にする。インビボcDNA合成技術の、この分析用標的 細胞の調製に際する注意は、おそらく簡単な分取用（例えば、cDNAライブラリー 構築物）よりも更に重要であり、そしてRNA プライマーの型の実際の評価、プラ イマー−逆転写酵素（および、おそらく改変デオキシヌクレオチドトリホスフェ ート、またはアナローグ）および送出の方式が慎重に考慮されるべきである。プ ライマー／酵素複合体を送出するための多くの別法が存在し、そして代表的な選 択が先に概説された。 配列特異的プライマーのインビトロでの生成を可能にするDNA カセットの製造 のための一つの技術が上記の実施例３に概説される。 このような合成後に、プライマー生成物をRNase を含まない dH2O中で再度懸 濁し、そして既知のサイズの標準物質で行われるポリアクリルアミド／尿素ゲル のオートラジオグラフィー露出を使用してアリコートをサイズにつきチェックす る。細胞への導入の前に、プライマーを精製し、定量する。 別のそして更に直接のアプローチは、実施例３、第II節に一般に記載されるよ うに、固相担体上でRNA プライマーを化学合成することである。このアプローチ は配列特異的プライマーの直接合成を可能にするだけでなく、cDNA生成物の検出 、精製および／または改変（例えば、それぞれ、32P−標識、ビオチニル化、お よび／または配列とり込み）に有益であるような改変された安定なリボ核酸アナ ローグをとり込む機会を与える。 細胞を、所望の条件に対する最小の変動を可能にする方法で調製し、そして反 応成分の送出の速度を最大にし、かつ細胞または組織へのストレスを最小にする のに最良であると評価される送出系を使用する。 一つのこのような実施態様において、配列特異的プライマー、逆転写酵素、お よび［α-32P］dCTPを、細胞または組織への添加の前に、インビトロで一緒に短 時間インキュベートする（上記の実施例１に記載されたようにして）。細胞また は組織への導入後に、細胞または組織を特異的RNA 鋳型に相補的であるDNA 分子 の合成を可能にする条件下でインキュベートする。この反応の対照は、下記のも のを含む。 1)［α-32P］dCTP単独の送出 2)逆転写酵素と共に［α-32P］dCTPの送出 3)インビトロで転写された“野生型”プライマーおよび適当な逆転写酵素と共 に［α-32P］dCTPの送出 上記のような抽出および精製後に、cDNA生成物を適当な放射標識サイズ標準物 質を用いて行われるゲルのオートラジオグラフィー分析により定性的に調べるこ とができる。加えて、特定の生成物を分析電気泳動ゲルの走査オートラジオグラ フィーまたは分取電気泳動ゲルから切除されたバンドの液体シンチレーションカ ウンティングにより定量することができる。PCR を使用して処理されていないRN A 鋳型から生成されるcDNAを検出することができる。 実施例５ I.細胞中の遺伝子転写産物の比を測定するための多重配列特異的プライマーの 使用 インビボcDNA反応に使用するために配列特異的プライマーを生成できることは 、標的細胞転写パターンの実時間“スナップショット”を使用して特異な転写パ ターンおよび転写レベル（これらは多数の病気の症状と関連している）を検出す ることをまた可能にする。内部対照転写産物（例えば、“ハウスキーピング遺伝 子”）のレベルに対して、種々のオンコジーン転写産物のレベルを同定すること は、診断および研究の予想の両方から望ましい。PCR がこの目的のために過去に 使用されていたが、増幅中に起こる問題のため、よくても信頼性がなく、かたよ っている（Gilliland，Gら，(1990)）。 このような本発明の使用、および配列特異的プライマーのインビトロでの生成 を可能にするDNA カセットの製造技術に関する考察を上記の実施例３および４に 概説する。この実施態様における望ましいアプローチは、実施例３、第II節に一 般に記載されたようにして、固相担体上でRNA プライマーを化学合成することで ある。このアプローチは異なる配列特異的プライマーの直接合成を可能にし、そ してcDNA生成物の差別的検出、精製および／または改変（例えば、それぞれ、32 P−標識、ビオチニル化、および／または配列とり込み）に有益であるような異 なる改変されたリボ核酸アナローグをそれぞれのプライマーにとり込む機会を与 える。 このような合成後に、異なるプローブおよび対照プライマー生成物をRNase を 含まないdH2O中で再度懸濁し、そして既知のサイズの標準物質で行われるポリア クリルアミド／尿素ゲルのオートラジオグラフィー露出を使用してアリコートを サイズにつきチェックする。標的細胞または組織への同時導入の前に、プライマ ーを精製し、定量する。 細胞を、所望の条件に対する最小の変動を可能にする方法で調製し、そして反 応成分の送出の速度を最大にし、かつ細胞または組織へのストレスを最小にする のに最良であると評価される送出系を使用する。 一つのこのような実施態様において、オンコジーン配列特異的プライマーおよ びアクチン配列特異的プライマーをそれぞれプローブプライマーおよび対照とし て使用する。これらの異なるプライマー、逆転写酵素、および［α-32P］dCTPを 、細胞または組織への添加の前に、インビトロで一緒に短時間インキュベートす る（上記の実施例１に記載されたようにして）。導入後に、細胞または組織を特 異的RNA 鋳型に相補性であるDNA 分子の合成を可能にする条件下でインキュベー トする。この反応の対照は、下記のものを含む。 1)［α-32P］dCTP単独の送出 2)逆転写酵素と共に［α-32P］dCTPの送出 3)所望のRNA鋳型の一つのプライマーおよび適当な逆転写酵素と共に［α-32P ］dCTPの送出 4)それぞれの付加的な所望のRNA 鋳型のプライマーおよび適当な逆転写酵素と 共に［α-32P］dCTPの送出 上記のような抽出および精製後に、cDNA生成物を適当な放射能標識サイズ標準 物質を用いて行われるゲルのオートラジオグラフィー分析により定性的に調べる ことができる。加えて、特定の生成物の同一性を、例えば、ビオチニル化された 分子量標準物質を使用して確かめることができ、そしてゲルを移し、サザンブロ ットをストレプトアビジン／アルカリ性ホスファターゼ接合系（例えば、ブルジ ーン(BluGENE)系、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリィズ、ガイザースブルグ、M D）を使用して調べることができる。 実施例６ I.特定の遺伝子ファミリーのメンバーをクローン化するための配列特異的プラ イマーの使用 インビボcDNA反応に使用するために配列特異的プライマーを生成できることは 、研究者らが特定の配列を含むRNA 鋳型からcDNAを選択的に生成することを可能 にする。 インビトロでの配列特異的プライマーの生成を可能にするDNA カセットの製造 のための一つの技術が上記の実施例３に概説され、記載されたようにして使用し 得る。細胞への導入の前に、プライマーを精製し、定量する。 更に直接の別法は、実施例３に記載されたような固相化学合成技術を使用する ことである。 細胞を、所望の条件に対する最小の変動を可能にする方法で調製し、そして反 応成分の送出の速度を最大にし、かつ細胞または組織へのストレスを最小にする のに最良であると評価される送出系を使用する。これらの別法の幾つかが上記の 発明の詳細な説明に概説される。 最初に分析プロトコルに従う。予想されるサイズまたはサイズ分布の生成物が 得られると、分取cDNA合成反応を行うことができる。 プライマーおよび技術の分析評価につき、［α-32P］dCTPを入れてインビボで のcDNA合成反応の結果を定量的かつ定性的の両方で迅速に研究することができる 。 一つの実験スキームにおいて、配列特異的プライマー、逆転写酵素、および［ α-32P］dCTPを、細胞または組織への添加の前に、上記の実施例１に記載され たようにして、インビトロで一緒に短時間インキュベートする。細胞または組織 への導入後に、細胞または組織を特異的RNA 鋳型に相補的であるDNA 分子の合成 を可能にする条件下でインキュベートする。この反応の対照は、下記のものを含 み得る。 1)［α-32P］dCTP単独のエレクトロポレーション 2)逆転写酵素と共に［α-32P］dCTPのエレクトロポレーション 3)インビトロ で転写された“野生型”プライマーおよび適当な逆転写酵素と共に［α-32P］dC TPのエレクトロポレーション 上記の抽出および精製後に、cDNA生成物をエチジウム染色ゲル（図７、レーン ４および８を参照のこと）、または適当な放射標識サイズ標準物質を用いて行わ れるゲルのオートラジオグラフィー分析（図８、レーン４および８を参照のこと ）により定性的に調べることができる。加えて、とり込みのレベルをセレンコフ ・カウントの測定により、または、再度の懸濁後に、アリコートの液体シンチレ ーションカウンティングにより測定することができる。 分析試験後に、同様の反応を放射標識デオキシヌクレオチドトリホスフェート の不在下で（またはトレーサーとして減少された量を使用して）行うことができ る。所望の生成物を得るのに必要とされる反応の数が先の分析反応により決めら れる。 上記の反応からのcDNA生成物を、実施例１、第IX節に記載されたようにして、 認められたクローニング技術を使用してベクターにクローン化する。 実施例７ I.インビボcDNA生成物の直接配列決定のための配列特異的プライマーおよび４ 種の蛍光ジデオキシヌクレオチドアナローグの使用 別個の蛍光放出スペクトルを有し、かつ逆転写酵素によりDNA に容易にとり込 まれる一連の蛍光ジデオキシヌクレオチドトリホスフェートアナローグが開発さ れていた(Prober，J.M.ら,(1987))。それぞれのアナローグは特定のジデオキシ ヌクレオチド鎖末端塩基を置換し、そして鋳型誘導様式でDNA にとり込まれる。 配列特異的プライマーから誘導された、インビボで改変ジデオキシヌクレオチド アナローグをとり込む能力は、所望の3'配列を含み、かつ検出可能な量で存在す るRNA 鋳型の直接の配列決定を可能にする。 典型的な真核細胞中にはおそらく約15,000の異なる転写産物がある(Sargent， T.D．(1987))。配列特異的プライマーが3'末端付近でのポリウリジル酸伸長（RN A 鋳型のポリアデニル化3'末端にプライマーを位置するように設計される）と、 それに続く極限の3'末端での特定の８塩基配列でもって生成される場合、唯一の cDNA生成物がおそらく真核細胞中に存在するmRNA鋳型から生成される(0.258=1/6 5,536)。 適合性逆転写酵素、bio-11-dUTP デオキシヌクレオチドアナローグ（プライマ ーがビオチニル化されていない場合；実施例３；下記の実施例８を参照のこと） 、および４種の蛍光塩基特異的およびスペクトル特異的ジデオキシヌクレオチド トリホスフェートアナローグ(Prober，J.M.ら,(1987))と共に、この改変tRNAプ ライマー（実施例３に記載された技術と同様の方法で生成された）の導入は、一 群のcDNA合成生成物をもたらし、これらを、例えば、アビジン被覆ポリスチレン （バクスター・ヘルスケアー、ムンデレイン、IL）またはストレプトアビジン結 合ビードを使用して抽出し、濃縮し、ゲル装填緩衝液中で加熱することにより溶 離し、そして分析用変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。そのゲル 装置をレーザーを装備したスペクトル識別蛍光励起、検出装置に取り付ける。こ れは、先のクローニング、または更には配列の既存の知識を必要としないで、生 物からの発現遺伝子の直接のDNA 配列決定を可能にする。勿論、単一cDNA種がプ ライマーで生成されることを確かめるために、同様の予備実験（［α-32P］dCTP のとり込み、およびジデオキシ鎖末端アナローグの不在を伴う）を行うことがで きる。これは、アガロース/TAE電気泳動ゲルでのオートラジオグラフィーによる 抽出後に確認し得る。 クローニングしないでインビボcDNA生成物から直接にDNA 配列情報を得るため の別の技術は、低融点のアガロース電気泳動ゲルで特定のcDNAバンドをゲル精製 することである。これらの生成物は、ビオチニル化プライマーを使用する場合の 固相配列決定を含む現在認められている配列決定技術(Syvanen,A-C．ら，FEBS L ett．258:71-74(1989))を使用して直接に配列決定し得る。cDNA合成に使用さ れる配列特異的tRNAプライマー分子は、その反応に使用される配列決定プライマ ーを示唆する。 更に別の有益なアプローチは、［α-32P］dNTP、ビオチニル化された配列特異 的tRNAプライマー、逆転写酵素、および４種のジデオキシヌクレオチドトリホス フェート鎖末端分子の一つを標的細胞に導入することである。このようにして、 ４つの別個の導入を行い、それぞれ異なる鎖末端ジデオキシヌクレオチド塩基を 導入する。次に細胞を、とり込みを可能にする時間、および方法でインキュベー トする。一群のcDNA生成物を、例えば、アビジン被覆ポリスチレン（バクスター ・ヘルスケアー、ムンデレイン、IL）またはストレプトアビジン結合ビードを使 用して抽出し、濃縮し、そして配列決定ゲルを装填する直前に配列決定ゲル装填 緩衝液中で加熱することによりビードから溶離する。次に配列をオートラジオグ ラフィーにより決定することができる。 加えて、これらの技術は、3'配列に関する情報が人手できる場合に、クローン の5'配列を決定する直接アプローチを可能にする。特定の18塩基プライマー配列 の選択は、cDNA生成物をクローニングする時間および困難を生じないで、インビ ボの特異的配列決定を可能にするであろう。 実施例８ I.インビボcDNA合成反応中のビオチニル化dUTPのとり込み デオキシヌクレオチドアナローグをインビボcDNA生成物にとり込むことができ ることは、幾つかの重要な分野で有益であり得るビオチニル化cDNAの調製および 回収を可能にする。特定のビオチニル化デオキシヌクレオチドアナローグが特定 の実験に適しており、多くの候補基質が存在する(Klevan，L．およびGebeyehu， G.，Meth．E-nzymol．154:561-577(1987))。下記の実施例は一つのアプローチを 使用し、インビボcDNA生成物のビオチニル化の別の方法または技術を特定または 限定するものと見なされるべきではない。別法、例えば、RNA プライマーのビオ チニル化（実施例３を参照のこと）またはインビボcDNA合成反応中のdATPアナロ ーグN6-（- アミノアルキル）dATPのとり込み、続いて、抽出そして精製後のア ミン標識cDNAとリポーター 分子、ビオチン-N- ヒドロキシスクシンイミドエス テ ルの反応が、有益なアプローチである。 ハムスターCHO 細胞系をATCCから入手し、推奨されるように管理する。エレク トロポレーションの前に、トリプシン/EDTA 溶液を使用してCHO 細胞を単層培養 から除去する。脱着細胞をカウントし、食塩加リン酸緩衝液中ですすぎ、そして 1x108の細胞/ml で食塩加リン酸緩衝液中に再度懸濁させる。反応成分は、DTT（ 10mM）を含む逆転写緩衝液(BRL)中50μl の合計容積で混合される逆転写酵素(10 00 単位)、tRNAプライマー(5μg;配列特異性であってもよく、または一般のプラ イマー、例えば、tRNApolyUであってもよい)、およびbio-11-dUTP（0.03mMまた は0.3 mM最終）であり、室温で10分間インキュベートされる。プレインキュベー ション後に、CHO 細胞0.5 mlをその混合物に添加し、細胞を混合し、直ちに冷却 した0.4cm のエレクトロポレーションキュベットに移す。エレクトロポレーショ ンを下記の条件で行う：330 ボルト(V)、1000マイクロファラッド（μF）および 無限抵抗。エレクトロポレーション後に、温めたCO2平衡ハム培地（ギブコ）１m lをキュベットに添加し、その混合物をプラスチック管(ファルコン#2059)に移し 、次に混合物を37℃で１時間インキュベートする。そのインキュベーション期間 後に、細胞をエッペンドルフ型式5415C マイクロフュージ（またはその均等物） 中でセッティング５で５分間の遠心分離によりペレットにし、cDNA生成物を実施 例１に記載されたようにして回収する。そのビオチニル化cDNAペレットを再度懸 濁させ、生成物をアガロース/TAEゲルで電気泳動にかける。これらのゲルをビオ チニル化された分子量標準物質で実験することができ、そしてゲルを移し、スト レプトアビジン／アルカリ性ホスファターゼ接合系（例えば、BluGENE系、ベセ スダ・リサーチ・ラボラトリィズ、ガイザースブルグ、MD）を使用してサザンブ ロットを調べる。 生成物は分取アガロースゲルから精製し、抽出することができ、そしてその生 成物は電子顕微鏡のプローブ（ストレプトアビジン−金を使用する）、in situ ハイブリダイゼーション（ストレプトアビジン／アルカリ性ホスファターゼ検出 系(Chan ら(1985))、消去(subtractive)ライブラリー構築、並びにその他の分取 目的、分析目的および治療目的に使用し得る。 実施例９ I.消去(subtractive)ライブラリー構築におけるビオチニル化インビボcDNAの 使用 cDNAライブラリーの構築そしてスクリーニングの前に誘発特異性メッセージ、 または細胞もしくは組織特異性メッセージの相対頻度を増大できることは、大き な戦略上の利点であり、そして多くの場合低アバンダンスのmRNAにより提示され る遺伝子の同定および回収の唯一の希望である(Hedrick，S.ら，Nature 308:149 (1984))。既に知られている消去技術(subtraction techniques)は分離戦略を使 用し、それにより一本鎖cDNA（所望の細胞、組織または条件から選択されたmRNA から生成される）を別の細胞、組織または条件から抽出された過剰のmRNAにアニ ールする。ヒドロキシルアパタイト、またはその他の選択的マトリックスを使用 して、ヘテロ二本鎖分子を一本鎖cDNA（およびmRNA）から分離する。 デオキシヌクレオチドアナローグをインビボcDNA生成物にとり込むことができ ることは、ビオチニル化cDNAの調製および回収を可能にする。 このインビボのとり込みのビオチニル化cDNA生成物の使用の一つは、消去(sub tractive)ライブラリー構築にある。ライブラリー構築のこの別の技術は、所望 の鋳型、および消去(subtracting)鋳型分子の両方がcDNAであり、従来可能では ないハイブリダイゼーションおよび選択プロセス中の安定性を可能にする点で、 従来技術より優れている。加えて、cDNA生成物が、インビトロで生成された生成 物の性質を越え得る適合度およびプロセシビティで、初期の少数の細胞から生成 される。この方法は、交互に増殖又は処理した細胞の第一ストランド合成のｃＤ ＮＡ生成物と、ある細胞集団のビオチニル化第二ストランドｃＤＮＡ生成物との ハイブリダイゼーションに依存する。従って、ビオチニル化された第二ストラン ド生成物が効果的に得られるようにパラメーターを見積もらなければならない。 逆転写酵素などの選択は重要であり、第二ストランド生成物の量が十分でなけれ ば、ビオチニル化されていないインビボｃＤＮＡの合成が、インビトロの第二ス トランド合成（ビオチニル化アナローグの導入を用いた）と共役して、この物質 の量を増加させ得る。 とり込み反応を実施例３または８に記載されたようにして、または別の手段に より行うことができる。ビオチニル化cDNAを、所望のcDNAライブラリーの条件以 外の条件下で増殖される細胞または組織中で生成する。抽出され、単離されたビ オチニル化cDNA生成物をS1ヌクレアーゼで処理して一つ以上のヘアピン構造（こ れは第二ストランド生成物から第一ストランド生成物を結合し得る）を開裂し、 カラムクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により汚染している共有ゲノムDN A から分離し、そして所望の細胞または組織、または別の所望の条件下で増殖さ れた細胞または組織から生成された（そしてゲノムDNA 汚染物質から同様に分離 された）ビオチニル化されていないcDNA生成物の量の約1/30にアニールする。ル ーチンハイブリダイゼーション条件は、約5mg/mlの最終 DNA 濃度で120 mMのNa H2PO4(pH 6.8)、820 mMのNaCl、１mMの EDTA、0.1 ％のSDS である。その反応混 合物を５分間にわたって90℃に加熱し、次に12〜18時間にわたって65℃に保つ。 その反応液をリン酸緩衝液(120mMのNaH2PO4、pH 6.8)で希釈し、そしてアニール された共通のcDNA配列を含むビオチニル化cDNAをストレプトアビジンカラムで単 離する。フロー−スルーcDNAフラクションをエタノール沈殿により濃縮し、そし て許された方法および技術(Sambrook，(1989))を使用してクローン化する。 実施例10 I. HIV 感染CD4 リンパ球を同定するための、HIV 配列特異的プライマーから導 かれるインビボcDNA合成の間の蛍光デオキシヌクレオチドアナローグの導入 多くの蛍光デオキシヌクレオチドトリホスフェートアナローグが市販品として 利用可能であり、これらは特有の蛍光発光スペクトルを有し、ポリメラーゼ酵素 により容易にDNA に導入することができる。それぞれのアナローグは、鋳型によ り導かれる方法でDNA に導入される。配列特異的プライマーにより導かれる、こ れらの改変されたデオキシヌクレオチドアナローグをインビボで導入する能力に より、フローサイトメトリーを使用したHIV-感染CD4 リンパ球のスクリーニング のための迅速で直接的な方法が可能となる。このスクリーニングは分析的な目的 に使用することができ、あるいは感染していないCD4 リンパ球から感染したCD4 リンパ球を分離するのに使用することができ、それによりHIV 陽性の個体の治療 方法が得られる。 本発明のインビボcDNA合成において使用するためのヒト免疫不全ウィルスＩ型 配列特異的プライマーは、適当なHIV 特異的配列を使用して形成される。SK69プ ライマーの配列に基づいた１つのそのようなPCR プライマーが製造され(Ou，C-Y et al.，Science 239:295-297(1988); Zack，J.A．et al.，Cell 61:213-222(1 990)、これは下記のHIV のenv 領域: に対応し、これは実施例３に記載したPCR に使用してHIV-特異的tRNAプライマー の製造のためのDNA カセットを生成できる。 あるいは、Watoson & Wilburn(1992)のM666プライマーに基づいたPCR プライ マーも可能であり、これは下記のLAV-1BRUのU3領域: に対応する。 次に、精製され、試験され、定量されたプライマーを、適当な方法（特にエレ クトロポレーション及びカチオン性脂質媒介導入）を使用して、MoMuLV逆転写酵 素及び蛍光デオキシヌクレオチドトリホスフェートアナローグとともに、サイト カイン活性化(Poli，G．and A.S．Fauci，AIDS Res．Hum．Retroviruses 8:191( 1992))リンパ球（分画化されたものあるいは分画化されていないもの）に導入す る。標的細胞中にあるHIV-特異的RNA 鋳型の任意の存在するものに対してcDNAを 製造するのに必要な条件下にそれに必要な時間、細胞をインキュベートする。同 様の非感染細胞集団について、対照の反応を行うことができる。蛍光団と結合し た多くのヌクレオチドアナローグが重合によりスペクトル変化を受けることが有 利であるとわかる。これにより、鋳型により導かれるｃＤＮＡ合成を行なう細胞 と対照細胞集団との区別をすることができる。 細胞を洗浄し、次いで所望によりCD4 分子に対する抗体（例えばATCCからのOK T4）とともに氷上で30分間インキュベートし、洗浄し、そしてFITC- 標識F(ab')2 ヤギ抗マウスIgG とともにインキュベートする。さらに細胞を再び洗浄し、調 製し、導入された蛍光標識を励起しスクリーニングするのに必要なパラメーター (例えば細胞サイズ、蛍光、及び閾値スペクトルについてのゲーティング(gating ))を使用して蛍光活性化細胞ソーテイング(Fluorescence Activated Cell Sorti ng，FACS)によりスクリーニングする。適当なパラメーターは、陰性対照細胞集 団を使用して決定できる。 抗CD4 抗体（適当な代わりの発光波長を有する）を含ませて実験を行った場合 は、これらの方法によりHIV-感染リンパ球の定量及び分離の両方が可能となる。 あるいは、インビボcDNA合成の後、試験の前に細胞を固定し透過性にすること ができる。しかしこれは調製的なものではなく、主として分析的態様である。 実施例１１ 単層細胞培養物におけるin vivo ｃＤＮＡ合成 転写物集団を最大にする条件下（例えば、インターフェロンを添加してインタ ーフェロンに誘導される遺伝子の転写を増大させる）で、60 mmの皿で単層培養 物として細胞を60-90%の密度まで増殖させる。反応成分：逆転写酵素(1000U)、 ｔＲＮＡプライマー(2-5μg)および[α-32P]dCTP(50μCi)を全容量が50-100μl となるようにDTTを含有する逆転写酵素緩衝液(BRL)中で混合し、室温で10分間イ ンキュベートした。これらの成分を、3:1(w/w)のDOSPA(2,3-ジオレイルオキシ- N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウム トリフルオロアセテート):DOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン) 、1:1(w/w)のDDAB(ジメチル-ジオクタデシルアンモニウムブロマイド):DOPE、ま たは1:1(w/w)のDOTMA(N-(1,2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル アンモニウムクロライド):DOPEリポソームを50μg含有する無血清培地で0.5 ml に希釈し、そして混合物を室温で5-30分間インキュベートする。さらに0.5 mlの 無血清培地を混合物に加える。培地を吸引して細胞単層より除去し、無血清培地 を用いてこの単層を2 回洗浄する。反応混合物を皿に滴下し、直ちに皿を揺り動 かして反応混合物を単層に一様にかぶせる。細胞を定期的に揺り動かして、37℃ CO2インキュベーターを用いた２時間のインキュベーション間中、単層の全領域 が反応混合物によって等しくおおわれるようにする。次に、血清を含有する3 ml の培地を皿に加え、これを37℃インキュベーターに1 時間戻す。または、2 時間 のインキュベーションの後、放射性標識反応物を放射性廃棄物に移し、単層をリ ン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄してから、ｃＤＮＡ産物を直ちに回収すること もできる。 インキュベーションの終了後、培地を単層より除去し、1.5 mlの冷培地と交換 する。使い捨てのポリスマンを用いて細胞を皿からこすり取り、微量遠心管(mic ro fuge)に移す。残りの細胞を0.5 mlの培地を用いて皿から洗い落とし、この培 地を細胞と混合する。エッペンドルフモデル5415C 微量遠心機（または同等のも の）を用いて設定を５にして遠心し、細胞をペレット化する。放射性上清を注意 深く除去し、適切に廃棄する。細胞ペレットを用いてHirt抽出を実施して、in v ivo ｃＤＮＡ産物をゲノム細胞ＤＮＡの大部分と分離する。フェノール／クロロ ホルム抽出およびそれに続くクロロホルム抽出により、タンパク質および他の混 入物をｃＤＮＡ産物から除去する。次に、標準的技法を用いてｃＤＮＡ産物を沈 殿させる。 実施例１２ 懸濁細胞培養物におけるin vivo ｃＤＮＡ合成 細胞を懸濁培養で増殖させ、プロトコールを開始する前に一定の間隔を置いて 分割し、最適の生存力を保証する。反応成分：逆転写酵素(1000U)、ｔＲＮＡプ ライマー(1-10μg)および[α-32P]dCTP(50μCi)を全容量が50-100μlとなるよう にDTTを含有する逆転写酵素緩衝液(BRL)中で混合し、室温で10分間インキュベー トする。これらの成分を、3:1(w/w)のDOSPA(2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペル ミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロ アセテート):DOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)、1:1(w/w)の DDAB(ジメチル-ジオクタデシルアンモニウムブロマイド):DOPE、または1:1(w/w) のDOTMA(N-(1,2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム クロライド):DOPEリポソームを50μg含有する無血清培地で0.5 mlに希釈し、そ して混合物を室温で5-30分間インキュベートする。次に、さらに0.5 mlの無血清 培地を混合物に加える。細胞をペレット化し、培地を吸引して細胞ペレットから 除去する。細胞ペレットを無血清培地に穏やかに再懸濁し、ペレット化する。培 地を吸引して細胞ペレットから除去する。反応混合物を試験管に加え、試験管を 直ちに軽くはじいて細胞ペレットを反応溶液中に穏やかに再懸濁する。37℃ CO2 インキュベーターを用いた１時間のインキュベーション間中、細胞を定期的に軽 く振り再懸濁する。次に、あらかじめ温めておいた、CO2で平衡化させた血清含 有培地3 mlを細胞に添加し、細胞を60 mmの皿(Falcon)に移し、そしてこの皿を1 -4時間37℃インキュベーターに戻す。または、１時間のインキュベーション期間 の終了後、放射性標識反応物を放射性廃棄物に移し、細胞ペレット をリン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄してから、ｃＤＮＡ産物を直ちに回収する こともできる。 インキュベーション期間の終了後、エッペンドルフモデル5415C 微量遠心機（ または同等のもの）を用いて設定を５にして遠心し、細胞をペレット化する。放 射性上清を注意深く除去し、適切に廃棄する。細胞ペレットを用いてHirt抽出を 実施して、in vivo ｃＤＮＡ産物をゲノム細胞ＤＮＡの大部分と分離する。フェ ノール／クロロホルム抽出およびそれに続くクロロホルム抽出により、タンパク 質および他の混入物をｃＤＮＡ産物から除去する。次に、標準的技法を用いてｃ ＤＮＡ産物を沈殿させる。 実施例１３ 全身性in vivo ｃＤＮＡ合成 成体マウスをJackson Labsより入手し、病原体の無い条件下に維持し、食料と 水とを自由摂取させる。in vivo ｃＤＮＡ反応成分：逆転写酵素(1000U-5000U) 、IgG Ｈ鎖特異的ｔＲＮＡプライマー(2-20μg)、および[α-32P]dCTP(50-500μ Ci)を全容量が200μlとなるようにDTTを含有する逆転写酵素緩衝液(BRL)中で混 合し、室温で10分間インキュベートする。これらの成分を、1:1(w/w)のDOTMA(N- (1,2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド ):DOPEリポソームを1 μmol 含有する無血清培地で0.5 mlに希釈し、そして混合 物を室温で5-30分間インキュベートする。上記0.5 ml混合物をマウスの腹腔内ま たは尾静脈にゆっくり注入する。4-24時間後にマウスを殺す。心臓、肝臓、脳、 膵臓、リンパ節および脾臓を摘出し、重量を測定する。組織切片をシンチラント (scintillant)でカウントし、組織サンプルの重量によりそのカウント値を補正 する。標準化されたカウント値は、脾臓およびリンパ節組織切片の両方において 高い。 特定のin vivo ｃＤＮＡ産物を可視化するため、組織を穏やかに破壊し、破片 を除去し、そして細胞をHirt抽出にかける。フェノール／クロロホルムを用い、 続いてクロロホルムを用いると、エピソームのｃＤＮＡ産物が抽出される。次に 、標準的技法を用いてｃＤＮＡ産物を沈殿させる。ｃＤＮＡ産物を分画化（例え ば、緩衝化アガロースマトリックスによる電気泳動）し、オートラジオグラフィ ーにより可視化する。放射性標識デオキシヌクレオチドの使用および組み込みに 代わるものとして、蛍光団またはハプテン結合デオキシヌクレオチド類似体を体 内に導入でき（または、プライマーを標識でき）、組織切片（または抽出された 産物）の蛍光、または組み込まれた類似体に向けられた第２の試薬により、in v ivo ｃＤＮＡ産物の位置を確認することができる。 実施例１４ プライマー特異的細胞発現パターン 図13に示すように、修飾された同属ｔＲＮＡプライマー（特定のポリヌクレオ チド配列を有する５’から３’末端領域に多数のポリウリジル酸残基を含む配列 を有する）と複合化させたレトロウイルス逆転写酵素は、相補的連結配列を含有 する部分の断片がｃＤＮＡ産物に変換されるように、ＲＮＡ鋳型分子上の酵素複 合体を、成熟メッセンジャーＲＮＡ上に存在するポリアデニル酸部位に最も近い 連結領域に位置させる。 プライミングおよびｍＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡ産物に変換する際のストリンジェ ンシー(stringency)は、統計学的式１／４nに概ね一致する。式中、n = プライ マーのポリウリジル酸領域の３’末端に付加された特異的塩基の数である（例え ば、13-15ウリジル酸残基に続く5個の塩基が配列特異的であるならば、１／４5= 1/1024 個のメッセージがプライミングされてｃＤＮＡに変換されることが予想 される）。もし細胞が10,000個の異なるメッセージを発現するならば、このよう なプライマーが存在すると約10個の産物がプライミングされｃＤＮＡ産物に変換 されると予想される。 最初の特定のポリヌクレオチド鋳型プライマー分子もまた、この目的のために 使用できること、そして以下の点で有利であることが実証できること、に留意す べきである。すなわち、(1)最初の特定のＲＮＡ鋳型分子がプロトコールに含ま れている場合、最初の鋳型分子の５’末端領域をはるかに広範な塩基パターンを コードするよう指定できる。これは、エネルギー的により好ましく、また可能性 としてより区別できるアニーリングプラットホーム（ここから細胞メッセージの プライミングが起こりうる）を提供するであろう；そして(2)配列要素をこの最 初の鋳型プライマー分子中に含ませることができ、このことはｃＤＮＡ合成開始 の効率を高めるであろう。 生成されるプライマーおよび細胞特異的パターン（ＤＮＡ鋳型サイズおよび頻 度を含む）、プロトコールに使用する逆転写酵素および関連するRNase H活性の 選択、ｃＤＮＡ産物に組み込む核酸類似体の選択、ｃＤＮＡ産物検出法の感度、 ｍＲＮＡ鋳型上の３’末端以外の領域におけるプライミング、および未成熟鎖転 移反応の可能性に影響を及ぼす別の事実があること、並びにｃＤＮＡ合成の効率 に影響を及ぼす他の因子に注意するのは大切である。抽出、分画化および検出に 次いで、この技術はプライマー特異的細胞発現パターンを発生させることを可能 とする。このパターンが特定のプライマー配列を用いて生成される場合、このパ ターンは細胞または組織の種類または発達段階に特異的である。このパターンは 細胞の混乱(cellular perturbation)（例えば形質転換または感染）、または与 えられた刺激への応答の変化の診断に役立ちうる。変化は、パターンを作ってい る種々のｃＤＮＡ産物の密度における変化によってのみ特徴付けることができる 。このパターン技術は、診断上の目的、および細胞集団における発展的変化また は血統コミットメントの追跡、の両方にとって強力な手段となろう。 蛍光団またはハプテン結合デオキシヌクレオシドトリホスフェート類似体を用 いて、in vivo ｃＤＮＡ産物の検出を増強することができる。または、ヌクレア ーゼ耐性（例えば2'-O-メチル）および標識化プライマーを反応に使用すること ができる。 実施例１５ in vivo アンチセンス療法 導かれたin vivo ｃＤＮＡ合成は、特定の細胞転写物の、発現には利用できな い形への特異的変換を可能とする。特定のプライマーまたはＶＣＥ ＲＮＡ鋳型 プライマーが種々の手段（実施例 1，11および13参照）のうち任意のものにより 細胞に導入されると、または、ｃＤＮＡ産物が最終標的ポリヌクレオチド分子の アニーリング部位に相補的である鋳型プライマー分子を含む（そして、この最初 の鋳型の３’末端領域においてアニーリングする同族の修飾ｔＲＮＡプライマー および適切な逆転写酵素とウイルス内で複合している）欠陥のあるレトロウイル ス要素によって細胞が感染すると、プライマーによって導かれるＲＮＡ鋳型から ｃＤＮＡ産物への変換は、正常な細胞使用または発現に必要とされるプロセス由 来の転写物を効果的に除去する。さらに、酵素的変換の使用は、単純なハイブリ ダイゼーション（例えばアンチセンスヌクレオチド）または開裂工程（例えばリ ボザイム）とは異なり、不活性な分子形態への鋳型の効率的で安定した変換をも たらす。これはさらに有利な点を提供する。なぜなら、アンチセンス反応の産物 は容易に検出し、定量し、評価することができるからである。さらに、逆転写酵 素またはその複合体に関連するＶＣＥ鋳型プライマー分子を、含まれる異種遺伝 子のアンチセンス発現を推進するプロモーター要素（誘導性またはその他）と共 に含有する、組換えの、欠陥のある、特定の方向性をもつ(defined-tropic)ビリ オンまたは粒子の導入は、持続的遺伝子療法のための手段を提供するであろう。 実施例１６ 鋳型によってコードされる制御要素のin vivo ｃＤＮＡ合成産物への封入 プロウイルスによる合成の間に、逆転写酵素がウイルスのゲノムＲＮＡ鋳型の ５’末端に達した時、最初の一本鎖「マイナス鎖強ストップ」(”minus-strand strong-stop”)ｃＤＮＡ産物が形成される（図１１参照）。このヘテロ２本鎖ｃ ＤＮＡ：ＲＮＡのＲＮＡ鋳型部分を除去した後、このｃＤＮＡ産物の３’末端（ これは、ウイルスゲノムＲＮＡの５’末端近くの「Ｒ」領域を相補するように作 られた配列を含む）は、ウイルスゲノムＲＮＡ部分の３’末端付近に位置する第 ２の「Ｒ」領域（反復のための）に「ジャンプする」か、またはアニーリングす る。次に、ｃＤＮＡ合成がもう一度進行し、最終的には宿主ゲノムへの組込み統 合 に重要な末端配列を有するウイルスゲノムの複製がもたらされる。このプロセス に関与する種々の工程の総論が、Varmus，H.E.，Science 216:812-821(1992); G ilboa，E.S.ら，Cell 18:93-100(1979)に詳細に記載されている。 この戦略の最初の工程は、最初のＲＮＡ鋳型にｃＤＮＡに変換される配列を含 ませることにより、活用することができる。次に、プロウイルスの複製における ように、最初のＲＮＡ鋳型は逆転写酵素関連RNase H 活性により加水分解され、 そして残りの一本鎖ｃＤＮＡは最初のｃＤＮＡ分子の３’末端に相補的な配列を 有するポリヌクレオチド鋳型にアニーリングする。次に、ｃＤＮＡ合成が再開さ れ、第２の鋳型が生存細胞内の第１のｃＤＮＡ転写物に共有結合的に結合する。 図１２に示すように、この戦略により、所望のベクター配列の包含による利用可 能な任意のＲＮＡ鋳型分子の細胞内クローニングを可能となる。第１のＲＮＡ鋳 型の５’末端のポリアデニル酸残基の領域は、最初のｃＤＮＡ産物におけるポリ チミジル酸３’領域となり、これは利用可能な任意のポリアデニル化メッセンジ ャーＲＮＡとアニーリングする。これにより、ｃＤＮＡライブラリーのin vivo 合成および構築が可能となる。または、特定の転写物からのｃＤＮＡ合成をプラ イミングするため、特定の配列を最初のＲＮＡ鋳型の５’末端に含ませることが できる。任意のポリプリン領域の長さおよび配列の選択は、鎖転移に先立つ鎖合 成の開始をあらかじめ排除するうえで重要である。同じ理由により、逆転写酵素 の選択も重要でありうる。 反応成分：逆転写酵素(1000U)、修飾ｔＲＮＡプライマー(1-10μg)および[α-32 P]dCTP(50μCi)を全容量が50-100μlとなるようにDTTを含有する逆転写酵素緩 衝液(BRL)中で混合し、室温で10分間インキュベートする。次に、さらに30-50 μlの緩衝液を用いて、ベクター制御要素（ＶＣＥ）ＲＮＡ鋳型プライマー分子 を加え（量は鋳型部分の大きさによる）、混合物を室温でさらに5-10分間インキ ュベートする。次にこの混合物をエレクトロポレーションまたは他の方法により 生存可能な真核細胞に導入し、そしてin vivo ｃＤＮＡ合成が起こり得る条件下 で細胞を1時間インキュベートする。 または、ある実施態様では、逆転写酵素を加える前に、修飾ｔＲＮＡプライマ ーをＶＣＥ ＲＮＡ鋳型プライマー分子とアニーリングさせることができる。し かし、より多くの場合には、ＲＮＡ鋳型分子を加える前に、逆転写酵素に修飾ｔ ＲＮＡプライマーとの複合体を形成させることができる。 ＶＣＥ ＲＮＡ鋳型プライマーは、修飾ｔＲＮＡプライマーがアニーリングし てｃＤＮＡ合成を開始する第１の配列を有し、そして第２のＲＮＡ鋳型分子の３ ’領域に相補的に設計されていて、そこにアニーリングするポリヌクレオチド配 列を５’末端に含む。ＲＮＡ鋳型プライマーにアニーリングする修飾ｔＲＮＡプ ライマーにおける３’側ヌクレオチド残基の数は、プライマー分子の大きさと構 造により拘束されるが、ＶＣＥ ＲＮＡ鋳型プライマーはこの拘束を排除する。 プライマー相補領域の大きさにおけるこの緩和により、特別に設計した一本鎖ｃ ＤＮＡプライマーを用いた、ＲＮＡ鋳型の非常に効率的な第２のプライミングが 可能となる。さらに、この最初のＲＮＡ（ＧＥまたはＶＣＥ）鋳型プライマーは 、以下に記述するものの１つまたは２つ以上がコードされていてもよい：生物選 択のための耐性を付与する遺伝子に機能しうる形で連結されたプロモーター；制 限酵素認識部位を含むポリクローニング部位であるcre/lox 部位；原核または真 核細胞複製のための複製起点；プロモーター配列の３’側に挿入された任意のｃ ＤＮＡに機能しうる形で連結されたプロモーター（または、「アンチセンス」メ ッセージを生成するように、挿入された任意のｃＤＮＡに連結されたプロモータ ー）；転写エンハンサーまたは組織特異的制御要素；および、挿入配列から生成 された産物の検出または回収を助ける産物をコードする領域（例えば、金属結合 配列またはエピトープ標識；融合プロテアーゼ）。 インキュベーションの終了後、エッペンドルフモデル5415C 微量遠心機（また は同等のもの）を用いて設定を５にして遠心し、細胞をペレット化する。放射性 上清を注意深く除去し、適切に廃棄する。細胞ペレットを用いてHirt抽出を実施 して、in vivo ｃＤＮＡ産物をゲノム細胞ＤＮＡの大部分と分離する。フェノー ル／クロロホルム抽出およびそれに続くクロロホルム抽出により、タンパク質お よび他の混入物をｃＤＮＡ産物から除去する。次に、標準的技法を用いてｃＤＮ Ａ産物を沈殿させる。 ｃＤＮＡ産物を再懸濁して、導かれた第２鎖ｃＤＮＡ合成または他のin vitro 修飾を受けさせることができる。最終産物を分子内結合に有利な条件（希薄条件 ）のもとで結合する。次にｃＤＮＡ産物を細菌に導入して形質転換し、コードさ れた遺伝子によって、またはＶＣＥ ＲＮＡ鋳型プライマー分子によってコード される遺伝子によって付与される耐性に関して生物選択をするのに有利な標準的 条件下で細菌を培養する。 実施例１７ In vivo 転写物の所在決定 ハプテンのウリジンまたはデオキシウリジントリホスフェート結合体（例えば 、DNP または蛍光団（例：フルオレセイン-12-、テトラメチルローダミン-5-、T exas Red-5-、Cascade Blue-7-、BODIPY-FL-X-14、BODIPY-TMR-X-14-、およびBO DIPY-TR-X-14-UTPまたはdUTP; Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon））は 、酵素反応においてヌクレオシドトリホスフェートまたはデオキシヌクレオシド トリホスフェートの基質類似体として役立つ。デオキシウリジントリホスフェー ト類似体を、in vivo ｃＤＮＡ合成の間にｃＤＮＡに組み込むことができる。デ オキシヌクレオチド類似体の選択は、用途に依存する。各蛍光団は蛍光団基と結 合とに特異的なスペクトル特性（励起および発光の両方）を有する。そして、種 々の類似体に関連する細胞毒性または細胞誘導特性には差がありうる。さらに、 それぞれの蛍光団は種々の用途に重要な膜分割(partitioning)係数を有する。こ の後者のパラメーターは、細胞または組織内での基質利用可能性に影響を及ぼし 、酵素組み込みの後のバックグラウンド蛍光に寄与し、おそらくデリバリー系に おける選択を制限するであろう。 種々のデリバリー系と組み合わせたこれらの類似体、または以下に記述する「 かごに入れた(caged)」類似体の使用は、検出可能なレベルのＲＮＡ鋳型分子を 含有する細胞へのｃＤＮＡ産物のin vivo組み込みを可能とする。このデリバリ ーは、個々の細胞および組織へ向けたものでありうる。あるいは、成分を全体に 導入することができる。 配列特異的プライマー分子は、転写物の識別を可能とする。そして、放射性標 識プライマー（または、異なる波長で吸収または発光する基を用いて標識したプ ライマー）、およびin vivo ｃＤＮＡ合成の間に組み込まれる検出可能なヌクレ オチド類似体と共に導入される第２のプライマー、の組み合わせ使用は、細胞お よび組織の二重標識または示差的標識を可能とする。 In vivoで標識されたｃＤＮＡ産物は、以下のものを含む任意の数の手段で検 出することができる。すなわち、細胞のFACS分析；オートラジオグラフィー若し くは蛍光励起と組み合わせた、組織および動物の薄片作成(sectioning)；組み込 まれたヌクレオチド類似体に向けられた第２試薬の使用および検出；または、こ れらの方法の組み合わせ（例えば、１個のプライミングしたｃＤＮＡ産物のオー トラジオグラフィーおよび第２のｃＤＮＡ産物の蛍光検出、または複数のｃＤＮ Ａ産物を区別するための示差的発光スペクトル）。 蛍光団結合類似体の多くは、ポリヌクレオチドに組み込まれるとスペクトル変 化を受ける(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。そしてこれは、組み込まれ ていない基質によるバックグラウンドシグナルと、ｃＤＮＡ産物由来の所望のシ グナルとを区別するにあたって有利に使用できる。In vivo ｃＤＮＡ合成の後、 標識化類似体の組み込まれていない画分が細胞から効率的に除去されない場合は 特に有利である。 「かごに入れた」ヌクレオチド（例えば、dATPの(2-ニトロフェニル)-エチル エステル、Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon）は、光活性化の結果放出 されて、酵素基質として使用可能となるヌクレオチド類似体である。したがって 、光活性化の結果、生理学的活性および膜溶解性の両方において変化がある。標 識化した、かごに入れたヌクレオチド類似体を本発明のｃＤＮＡ合成と共に使用 すると、光に導かれたｃＤＮＡ合成および結果として生ずるｃＤＮＡ産物の検出 が可能となるであろう。 実施例１８ レトロウイルスパッケージング細胞系 感染性ベクターとして複製欠陥レトロウイルスを用いて真核細胞に遺伝子を導 入する。典型的には、興味のある遺伝子を含有する配列を、必要であるがプロウ イルス鋳型には欠けているトランス作用機能を発現する細胞系にパッケージする 有する(Armentanoら，J．Virol.，61:1647(1987); Benderら，J．Virol.，61:16 39(1987); AdamおよびMiller，J．Virol.，62:3802(1988))。レトロウイルスに おいて、効率はシグナルの位置付けによって影響を受ける可能性があるが(Hatzo glou，M.ら，Human Gene Therapy 1:385-397(1990))、これらのシス作用領域は 位置に対してよりもむしろ配向に対してより感受性が高いようである(Mann およ びBaltimore，J．Virol.，54:401-407(1983); AronoffおよびLineal，J．Virol. ，65:71-80(1991)）。 パッケージング細胞系から産生された複製欠陥ウイルスを用いた細胞感染に伴 う多くの困難のうちの1つは、パッケージング細胞系にパッケージされた他の異 種細胞転写物の導入である。 トランス作用機能を発現する細胞系によってパッケージされうる異種細胞転写 物は、細胞を逆転写酵素またはその複合体とともにパッケージングシグナル特異 的プライマー配列（修飾ｔＲＮＡプライマーまたは最初のＶＣＥ ＲＮＡ鋳型プ ライマーを用いる）で処理することにより効果的に同定することができ、除去す ることができる。または、意図された標的パッケージングシグナルと偶然的な混 入物である細胞配列とを区別するようにプライマー配列を設計することもできる 。 実施例１９ 遺伝子療法 レトロウイルス媒介遺伝子治療の障害は、ベクターをパッケージするのに必要 なトランス作用因子を提供する細胞系により産生される組換えウイルスに関連し た困難を含む。ベクター 制御要素（ＶＣＥ）ＲＮＡ鋳型を用いたin vivo ｃＤ ＮＡ合成は、統合することができる、またはエピソーム要素として維持すること ができるプロウイルス形態へのＲＮＡ鋳型のin vivo変換を可能とする。プロモ ーター要素、セントロメア要素、テロメア要素、複製起点、および他の制御要素 の 封入は、エピソーム要素のコピー数の制御を可能とし、長期的な減数分裂および 分裂の安定性を提供する。 実施例２０ ｃＤＮＡ合成を促進するための成分の封入 反応混合物中の他の成分の封入は、in vivo ｃＤＮＡ合成反応によって生成さ れる産物の効率を上昇させるために多くの実施態様において有用でありうる。レ トロウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質および他のレトロウイルスタンパ ク質は、二量体形成およびレトロウイルスゲノムのパッケージングに重要である ことが示され、そしてこれらのタンパク質は本発明の方法においても同様に効率 を最大にするのに有用であると予想されうる(Aiyar，A.ら，J．Virol．66:2464- 2472(1992); KahnおよびGeidroc，J．Biol．Chem．267:6689-6695(1992); Prats ，A.C．EMBO J．7:1777-1783(1988))。このような付加的成分のすべての効果が 各実施態様について評価されるであろう。そして封入は使用される酵素／プライ マーの組み合わせ、およびin vivo ｃＤＮＡ合成反応の細胞または組織標的にあ る程度依存するであろう。 このように、本発明が有用なcDNA合成のための方法及び組成物を提供すること が示された。(a)不均一なmRNA鋳型集団を使用したcDNA合成反応について予測さ れるような、種々のサイズのポリヌクレオチドフラクションへのデオキシヌクレ オチドの導入（図６のレーン５、９、11、及び12、図８のレーン５及び９参照） 、(b)反応が逆転写酵素及びプライマーの両方を含めることに依存すること（図 ６のレーン３及び５、レーン７及び９、図８のレーン３及び５、レーン７及び９ を比較せよ）、(c)反応産物がリボヌクレアーゼＡ処理に抵抗性を有すること（ 抽出物中に存在するリボソームRNA フラクションが完全に消化される場合でも） （図５及び６においてレーン５及び11、レーン９及び12を比較せよ）、及び(d) 産物の不均一な性質が、ポリアデニル化メッセンジャーRNA の不均一な細胞集団 にアニールし開始させる(prime off)ように設計された改変tRNAプライマーを含 めることに依存することと、特異的なプライマーを使用したときに単一の優勢な cDNA産物が得られる反応（〜1.9 kb）の対比（図７及び８、レーン４及び５、及 びレーン８及び９を比較せよ）により証拠付けられるように、インビボcDNA合成 反応が効率的に進行することが示された。 また、いくつかの関連のないタイプの細胞により（試みた全ての真核生物細胞 、Sf9(昆虫細胞)、CHO 細胞（ハムスター 細胞）、ヒーラー細胞（ヒト細胞）に おいて）、インビボcDNA合成反応がうまく起こったことが示された。 さらに、(a)S1ヌクレーアーゼによる処理により反応産物に有意な分解が起こ らなかったこと（図10、レーン２及び３、レーン４及び５を比較せよ）、(b)産 物をリボヌクレアーゼH により処理し、次いでS1ヌクレアーゼにより処理した場 合に反応産物の識別できる分解は起こらなかったようであること、(c)リボヌク レアーゼH 活性を欠く逆転写酵素を使用した場合に、インビボcDNA合成反応は起 こらないこと（インビボcDNA合成反応の成功は、当初のRNA 鋳型を消化除去する 逆転写酵素の能力にある程度依存しているようである。当初のRNA 鋳型はインビ トロ及びレトロウィルス複製の両方において第２の鎖の合成のブロックとなる(T anese，N.，et al.，J．Virol．65:4387-4397(1991))、及び(d)産物は慣用のク ローニング方法を用いてクローン化可能であることにより証拠付けられるように 、インビボcDNA合成反応の産物は明らかに二本鎖ポリヌクレオチド（二本鎖DNA である可能性が最も高い）であることが示された。 本明細書中で引用した全ての刊行物及び特許出願については、それぞれ個々の 刊行物及び特許出願について引用により本明細書の一部とすることを具体的に個 々に明記したものとして、引用により本明細書の一部とする。 上記の発明については明確さと理解のために例示及び実施例により詳細に記載 したが、本発明の教示によれば、添付の請求の範囲の概念あるいは範囲を逸脱す ることなくそれらに対して一定の変更及び改変を加え得ることは当業者に明らか であろう。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                     Methods and compositions for cDNA synthesis Technical field   The present invention relates to DNA synthesis, and more particularly to a method for complementary DNA synthesis and Related to the composition.Background of the Invention   The present invention is a tool for molecular biology. Terminology of molecular biology, DNA, RNA For a general review of the structure of proteins and proteins and the interrelationships between these molecules, see Darnell. et al., Chapter 4, Synthesis of Proteins and Nucleic Acids, Molecular Cell Biology, Scientific American Books (1989). About these issues The entire text of Darnell et al., (1989) and Lewin, Genes IV, Oxford Univ. ersity Press (1990) deals in more detail.   Genetic information is encoded in the genes of an organism. Genes are made up of polymers of nucleic acids. You. In higher organisms, this nucleic acid is deoxyribonucleic acid (DNA). 4 kinds of DNA The genetic information carried by the gene consists of a sequence of nucleotide bases It is encoded by a specific sequence of nucleotide bases in the offspring. Inheritance in structural genes Information encodes a protein, and the sequence and structure (and thus function) of a particular protein is: Determined by the order of nucleotide bases in the gene encoding the protein . From the cellular structure to the organism's response to the environment, proteins are Decide the titty. In other words, genes encoding these proteins are Determine your identity.   The information encoded in the structural gene is passed through the process of transcription and translation, Expressed. A gene called messenger RNA (mRNA) by transcription An intermediate carrier of the cord is produced. Mensenger RNA is an efficient copy of genes Is a polymer of ribonucleic acid (and therefore RNA) rather than deoxyribonucleic acid is there.   In eukaryotes, which are generally more complex than bacteria, genes are Coding regions (called "exons") and non-coding regions (called "introns") ). Exons code directly for the protein sequence of the gene. Intro Can be very large, and there are many intron sequences in a particular gene I can do it. The role of non-coding intron sequences is not clear. But these interventions There is evidence that the sequence plays at least three important roles. That is, first of all, Causes cells to produce nascent RNA transcripts that are spliced in several ways. Can produce a number of different proteins. Second, they are intro The inclusion of regulatory elements within the regulatory region itself enhances the regulation of gene expression, Third, separate parts or cassettes of protein sequences can be more easily evolved during evolution. Regulate exotic units that can be recombined, and therefore generate new proteins Which can ultimately enhance the survival of the species.   The transcription step involves the formation of an mRNA copy of the entire gene. That is, by the transfer process The produced mRNA contains non-coding intron sequence and protein coding exon sequence. Includes both copies. Therefore, the first mRNA produced by transcription is It has the same length as the copied gene. This immature mRNA is then processed A non-coding intron sequence during splicing. I will Thus, the resulting processed mRNA molecule encodes a protein Containing only the information necessary to perform Including). Therefore, these processed mRNA molecules have the highest The first copied “genomic sequence” (the gene that remains in the chromosome) Sons and introns). Processed mRNA At this stage, the tail of polyriboadenylic acid, poly (A), is attached to one end of the molecule. Include at the end (3'-end) and include a "cap" structure at the other end (5'-end) of the molecule (According to standard nomenclature, DNA and One end of the RNA molecule is the 5 'end and the other end is the 3' end). Intron With a 5'-cap and a 3'-poly (A) tail. The resulting mRNA molecule is called a "mature" mRNA molecule. Non-coding intron sequence FIG. 1 shows a very simplified view of the transfer process, illustrating the removal of   The step of converting the information carried by the mature messenger RNA into protein Called translation. Translation is encoded by nucleotide sequences found in the structural gene. The last step in the process of converting information into a specific protein consisting of amino acid sequences It is.   Gene cloning became possible in the 1970s. In early experiments, Small genes have been cloned from fungi and phages (bacterial viruses). It Since then, advances in molecular biology and genetic engineering have progressed at tremendous speed, The sequence of the entire system is now being determined. However, the technology Despite rapid progress, a number of limitations are still apparent. One of them is non It is always difficult to clone large structural genes.   The size of a gene is determined by the number of nucleotide bases it contains, usually Expressed in thousands of bases (kilobases, kb). Some examples of larger genes are Although present, the entire coding sequence of most structural genes (exons) is typically the sum of It is 1 to 10 kb. However, many large intron arrangements between exon segments Due to the presence of the sequence, at the genomic level, these genes span a much larger area. Spreads often span dozens or hundreds of kilobases. For example, YAC (Yeast  (Artificial Chromosome) Although it is always possible to clone large (100-300 kb) genomic segments, Genomic inserts such as contain non-coding intron sequences, Prevent protein expression in artificial systems. Partial gene sequence or Is a sequence containing introns, which is a non-functional, truncated protein expression If the 5 'translation initiation site is missing, Resulting in expression of the cloning sequence. Therefore, even if the screening process Even if the gene can be identified, the rest of the gene needs to be recovered. This It can be a very complicated process. The gene has many intron sequences and therefore If the gene is large, years of effort trying to recover the rest of the gene May need. Then determine the relative order of the gene fragments And more effort is needed to distinguish exon sequences from intron sequences. Like. Cloning of a continuous gene sequence as a code cassette The ability to identify genes is determined by standard techniques for detecting cloned genes. Production of proteins in certain recombinant bacterial or viral systems and the production of desired proteins If the detection is based on “screening” for function or structure Special Is important.   To clone the structural gene, the molecular biologist must use the cellular mRNA Utilizing the sexing function, in which the intron sequence is immature by splicing. RNA is removed from the RNA, producing a much smaller mature mRNA than the original gene. You. Convert the mature mRNA molecule back to a DNA molecule (hence the term "reverse transcription") The original coding sequence without intronic sequences that are not essential. Rows (exons) can be obtained. The DNA molecule from which it is derived It is called complementary DNA because it is complementary to an RNA molecule. Complementary DNA (CDNA) synthesis is a preferred method of gene cloning, A relatively small, continuously connected protein cord cassette that can adapt to protein production This is because the desired gene can be recovered in the sample.   Another and important use of cDNA technology is expression by cells at specific times. The purpose is to identify the gene that is performed. Gene expression is considerable in parts of cells Requires energy expenditure, and mRNA molecules demand short-lived "proteins" Designed as "protein requests". Therefore, a few exceptions (especially Except in the middle egg), only the gene encoding the immediately required protein Transcribed into RNA. Researchers should be able to copy the mRNA population present in the cells. By creating a clone and cloning the resulting cDNA, A cDNA library can be prepared from the obtained genes. So the researchers Which genes are located at a given stage of development or in response to a given stimulus It can be specifically determined whether it is expressed in a given tissue type.   Complementary DNA clones are extremely important in both research and industry. Laboratory In order to determine the function and structure of the protein, Require expression of offspring. In addition, a large amount of protein was subjected to X-ray crystallographic These antibodies are required for both polyclonal and monoclonal antibody production. Traces small amounts of protein by research protocols and Is indispensable in determining the position.   Bacteria are commonly used as hosts to express cloned genes. Bacteria These cells are immature because the prokaryotic genes that contain them do not contain introns. Processing mRNA into mature mRNA that can be functionally translated into protein Does not have the necessary splicing mechanism. Eukaryotic genes (ie, introns and Genomic clones cannot be expressed in bacterial hosts, but CDNA copies of genes are expressed in either prokaryotes or eukaryotes Can be done. Therefore, cDNA clones are routinely used for large-scale protein production. I have. This artificial protein expression is called “recombinant protein” production and has been used for many years. Monotonous and tedious extraction from animal tissues can only be obtained in small quantities Only a number of medicaments are becoming increasingly routine methods of manufacture.   Currently used cDNA synthesis methods are described by Berger and Kimmel, Guide to Molecular.  Cloning Techniques, in Methods in Enzymology Volume 152, Academic Press  Inc. (1987); Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. oratory Press (1989); Okayama, H., et al., Meth. Enzymol. 159: 3-27 (1987);  Van Gelder, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1663-1667 (1990); and  Embleton, M.J., et al., Nucleic Acid Res., 20: 3831-3837 (1992). Have been. For an overview of mRNA isolation techniques, see Sambrook et al. Chapters 7 and 8 of (1989) It is in.   mRNA isolation is a long and tedious process with many technically difficult steps . In summary, representative procedures for isolating mRNA from cells include (1) disrupting cells Breaking down to release cell contents, (2) isolating total RNA from cells, 3) mRNA is extracted by passing the extracted RNA through an oligo (dT) cellulose column. Selecting a population and (4) fractionating the isolated mRNA by size. And need. At all stages, the preparation is an active reagent capable of destroying RNA. Great care must be taken to ensure that it does not come in contact with the nuclease enzyme. c The purpose of the DNA cloning operation is to use "full length" containing the entire coding sequence of the gene. Since the procedure is to obtain a cDNA clone, use procedures that preserve the integrity of the mRNA. It is very important to use Ribonuclease (RNase) enzymes are very Being stable, only very small amounts of this active enzyme are present in the mRNA preparation Let's raise the problem. RNase is present on virtually all surfaces, including human skin And thus can penetrate the RNA preparation very easily. To avoid pollution problems, All solutions, glassware and plasticware must be specially treated. No. The cells from which mRNA is to be isolated are very harsh and ubiquitous RNase is destroyed in a solution containing components that immediately inactivate the nuclease enzyme. All subsequent solutions used in the A preparation will inactivate RNase, Treated with diethylpyrocarbonate (DEPC), which is considered a cancer substance You. In the lab, certain ribonuclease-free It is often the case that the equipment and the working space are kept separately. Possibility of RNA degradation Begins in the first stage of breaking cells open (the cells themselves contain ribonucleases, This comes into contact with the RNA when the cells are lysed) and continues throughout the operation .   Total RNA extracted from cells is messenger RNA (mRNA), trans It consists of far RNA (tRNA) and ribosomal RNA (rRNA). mRN A typically comprises only 1-3% of total cellular RNA (eukaryotic cells About 1 × 10 per-12g mRNA, Sargent, T.D., Methods Enzymol. 152: 423-432 (1987)). Most cDNA synthesis reactions are only present in mature mRNA transcripts Depends on the presence of the poly (A) tail. Mature RNA transcripts in total cellular RNA Is usually selectively extracted by affinity chromatography. this Is an essential step for successful cDNA synthesis in vitro, If is not enriched, low quality cDNA is obtained in low yield.   As a final step before cDNA synthesis, mRNA preparations can be selected by size. Let's come. This is usually the size of the smaller molecule (usually the fraction of larger mRNA). (Which is in the unraveled form); Let's interrupt the ning process. Size selection enriches mRNA species of known size Can also be done. Size selection is electrophoresis through agarose gel, column This can be done by chromatography or by sedimentation through a sucrose gradient. Wear. These methods lead to low yields and the use of hydroxyl to destroy secondary intramolecular structures. It may require the presence of methylmercury bromide. Methylmercury hydroxide is extremely toxic and volatile It is devastating and requires careful handling. Safer alternatives (eg glio Use of gels containing xal / dimethylsulfoxide or formaldehyde ) Can be used, but these techniques also involve hazards and require chemicals. R It has disadvantages associated with it.   In the current state of the art, mRNA is extracted from cells prior to cDNA synthesis Another drawback arises from the need to do so. For example, specific conditions or organisms To determine which genes are expressed in cells at specific stages of development CDNA cloning is often used. Time required to extract mRNA And conditions can themselves alter the gene expression pattern of the cell. Further Are present in very small amounts (considered as 20 copies per cell) or Stable mRNA molecules can be lost during the RNA isolation step. Current location Alternatively, create a cDNA library due to the losses inherent in the mRNA isolation process. There is a lower limit on the number of cells required to perform The present invention completes the need for initial mRNA isolation. It seeks to solve this problem by avoiding it altogether.   After mRNA extraction and purification, cDNA synthesis is performed in vitro. cD All methods currently used for NA synthesis are performed after mRNA extraction and purification. Or performed in situ or under in vitro conditions. See Kimmel and Berger (1987); Okayama, H., et al., (1) 987); Van Gelder, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1663-1667 (1990);  And Embleton, M.J., et al., Nucleic Acid Res., 20: 3831-3837 (1992). It is described in detail.   All currently available methods are RNA-dependent DNA polymerase enzymes (more general Is called reverse transcriptase) to remove the first strand of cDNA from the mRNA template. Combine.   Reverse transcriptase cannot initiate new nucleic acid synthesis. Rather, these enzymes are RNA The first nucleotide of the nascent cDNA strand is attached to the hydroxyl group of the molecule attached to the template molecule. It adds nucleotides. The enzyme adding a first nucleotide, The conjugated molecule is called a primer and reverse transcriptase activity is independent of the enzyme's origin. Seems absolutely necessary for However, in vitro and in vivo Significant differences in requirements to initiate cDNA synthesis under conditions Is.   Under in vitro (outside the cell environment) or in situ cDNA synthesis conditions, It is fundamental to meet the requirements for primers for torovirus enzymes, Short segments of deoxyribonucleic acid (DNA) called lignonucleotide primers Is most commonly used. This primer is often It is a polymer of dilic acid (oligo (dT)). All currently available cDNA templates In the protocol, this DNA primer simply anneals to the RNA template molecule. Primer-enzyme that contributes to reverse transcriptase binding Cannot form a specific structure that forms an elementary complex (Kimmel and Berge r (1987); Okayama, H., et al., (1987); Van Gelder, et al., Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 87: 1663-1667 (1990); and Embleton, M.J., et al., Nucleic Ac ids Res., 20: 3831-3837 (1992). Alternatively, for in vitro cDNA synthesis, RN An oligonucleotide primer complementary to another sequence in the A molecule may be used, However, due to the large range of complementary nucleotides required for annealing to occur, , Such a primer is an mRNA molecule that it is designed to anneal to Would be "sequence specific" to The combination of such sequence-specific primers For this purpose, it is necessary to know the nucleotide sequence of the mRNA portion in advance. Reverse transcription Enzyme primer requirements are described in Chapter 5 of Sambrook, et al., (1989). Have been.   For retroviruses, the virus is eliminated from host cells during a previous infection The structure-specific cellular tRNA molecule and the reverse transcriptase have already formed a complex. Transfer RNA molecules are short (70-80 nucleotides in length) RNA molecules, It is folded into a complex three-dimensional structure. Their role in normal cells is reversed. (Darnell et al., (1989), Chapter 4). This reverse transcriptase complex Binds to the cDNA synthesis initiation site on the viral RNA template molecule, and -Serves as a reverse transcriptase complex.   After the virus enters the newly infected cells, the reverse transcriptase-tRNA complex becomes This complex uses an already bound viral RNA molecule as an RNA template. Acts as a primer for the in vivo (intracellular) reverse transcriptase reaction.   The initial cDNA product generated from this in vivo reaction is "minus strand strong termination" This is a short cDNA segment called This cDNA is then Acts as a primer molecule in the offspring initiation event, causing the Restart and complete cDNA synthesis. This cDNA molecule is then the same reverse transcriptase Converted into double-stranded DNA by the complex and incorporated into the chromosome of infected cells .   Just as with the retrovirus life cycle, the hepadna virus The initial product of the in vivo cDNA synthesis reaction in replication is “minus-strand DNA” Product, and again, the strategy used by the retrovirus Similarly, this original cDNA product is initiated at the second polynucleotide site. Acts to restart cDNA synthesis.   Most reverse transcriptase-tRNA primer complexes required for retrovirus replication Do not act as primers for cDNA synthesis from cellular mRNA templates It is important to note that it will be. Cognate t with affinity for reverse transcriptase RNA species (two of the approximately 40 tRNA molecules present in the cell) are specific RNs A is complementary to the sequence present on the template molecule, and will therefore only start from this. Would. However, in mouse cells that have regions with strong homology to retroviruses, It is interesting to note that there is a virus-like 30S (VL30) element present. Tasteful. These elements have the properties of defective type C virus, are reverse transcribed, and Packaged in torovirus virions (Howk, R.S., et al., J. Virol. 25 : 115-123 (1987); Besmer, P.U., et al., J. Virol. 29: 1168-1176 (1979); Sher win, S.A., et al., J. Virol. 26: 257-264 (1978); Scolnick, E.M., et al., J. Virol. 29: 964-972 (1979); Scadden, D.T., et al., J. Virol. 64: 424-427 (1990 ); Rodland, K.D., et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2296-2298 (1987); Hatzoglou, M., et al., Human Gene Therapy 1: 385-397 (1990)).   Similarly, hepadnavirus reverse transcriptase binds and initiates cDNA synthesis. Requires specific structural target elements within the hepadnavirus RNA template molecule. It seems to be necessary (Wang and Seeger, J. Virol. 67: 6507-6512 (1993)).   The product of the first in vitro reverse transcriptase reaction is a single-stranded complementary DN A copy. This reaction is often referred to as "first strand cDNA synthesis." Thereafter, various methods are used to generate the second strand of the cDNA. Profit The resulting double-stranded DNA (dsDNA) molecule is then modified at the termini and the "vector , Which allows the growth, selection and amplification of each copy. Most one Commonly used methods (eg, Okayama and Berg, Molecular and Cellular B iology 2: 161-170 (1982)) can be summarized as follows. mRNA Extraction and purification and reverse transcription of mRNA in vitro to produce single-stranded cDNA molecules After production, the mRNA template is removed to allow the second strand of DNA to be synthesized, Thereby, a double-stranded cDNA molecule can be formed. Next, specific DNA A linker is added to the blunt end of the double-stranded cDNA and the cDNA is Ligation vector.   All methods currently used are reverse transcription to produce cDNA copies of mRNA. The enzyme catalysis step is always performed under in vitro conditions. Quality of cDNA synthesis ( That is, the ability to produce accurate and full-length complementary DNA) depends on the fidelity of the selected enzyme. Depends on the degree and processivity, and the conditions under which the reaction was performed. Full length cD CDNAs clearly shorter than NA are unacceptable and high error rates are generated It will reduce the usefulness of the cDNA. Reverse transcriptase is responsible for their cellular DNA Unlike the counterpart of the enzyme, 3 '→ 5' exonuclease by the enzyme (proofing Lack of activity, the fidelity depends on base discrimination during the polymerization. Yeast Reverse transcriptase in vitro, but not in vivo conditions under which the element evolved to function It appears that the use of detrimentally affects the fidelity and throughput of the enzyme. MuLV reverse In vitro fidelity of transcriptase is 10-Four(Ie, one for 10,000 bases Incorrect nucleotide, or 10 errors for 100kb) Recent studies show that in vivo fidelity is about 2 × 10-Five(To 50,000 base copies One error, two errors per 100 kb; Mont et al. Virol. 66: 368 3-3689 (1992)). In addition, full length first strand in artificial environment Is difficult to obtain, but the processing of the enzyme in the in vivo cDNA synthesis reaction is difficult. The ability to transfer cDNAs that extend well beyond the 10 kb range is possible. (See data provided). Optimize reverse transcriptase performance in vitro Conditions have been developed, but these conditions have a certain frequency of errors and It leads to premature termination of cDNA synthesis. In vitro conditions are optimal conditions for the enzyme. Obviously, it does not reflect the matter.   In addition, none of the currently known cDNA synthesis techniques have the structure-and reverse transcriptase- Priming cDNA synthesis by providing specific polynucleotide target molecules There is no promotion of start and start. Current techniques for cDNA synthesis also The cDNA product acts as a primer molecule at the second polynucleotide site and Here, cDNA synthesis resumes and completes ligation of the original complementary DNA. Uses nucleotide template primer molecules and any subsequent polynucleotide molecules It does not provide a mechanism that allows the inclusion of certain genetic elements.   Therefore, current methods for cDNA synthesis require that mRNA be extracted, purified, or recovered from cells. Need to be released or reverse transcriptase under in vitro conditions Limited to raw performance. These factors determine the ease of cDNA synthesis; cDN A. Efficiency of synthesis (hence a number of details to construct a representative cDNA library). Cell); the size of the cDNA molecule that can be produced (so that Genes that can be easily cloned); which genes are expressed under specific conditions Accuracy of cDNA synthesis in the determination of Limit.   It is an object of the present invention to isolate, recover or remove polynucleotide template molecules from cells. It is to provide a cDNA synthesis method that does not require the above.   It is also an object of the present invention to provide a method which does not require the in vitro activity of reverse transcriptase. It is to provide a DNA synthesis method.   Yet another object of the present invention is the efficiency of the method, the fidelity of the cDNA generated, and The size of cDNA that can be produced by that method is An object of the present invention is to provide a method for synthesizing cDNA which is superior to the method.   It is also an object of the present invention that the product can be used to synthesize cDNA at a second polynucleotide site. First polynucleotide casting that acts as a primer for resuming growth The priming efficiency of cDNA synthesis by using primers Is Rukoto.   It is also an object of the present invention that the product can be used to synthesize cDNA at a second polynucleotide site. First polynucleotide that acts as a primer for resumption of growth By using template primer molecules, various genetic elements can be The purpose is to provide a means to encode in the DNA product.   It is a further object of the invention to define in vivo cell expression patterns for eukaryotic cells. It is to provide means for determining.   Another object of the invention is to initiate in vivo cDNA synthesis that infects viable cells. By providing a means of producing recombinant viruses defective in infectious replication is there.Disclosure of the invention   The present invention provides a method and a method for synthesizing a complementary DNA copy of a polynucleotide template. And compositions.   According to the present invention, a complementary DNA copy of a plurality of polynucleotide molecules is synthesized. A method is provided for:   The method includes providing a polynucleotide template primer molecule. The offspring bind to at least one reverse transcriptase or a complex thereof, and A first region providing a site where cDNA synthesis is initiated, and a position 5 ′ to the first region. Placing the cDNA product of the molecule in at least one other polynucleotide template molecule A second region that allows annealing to be performed. In addition, polynucleotide template templates At least one reverse transcriptase that initiates DNA synthesis from a first region of a primer molecule Or a conjugate thereof is provided. Next, reverse transcriptase or enzyme complex and polynuclease Form a mixture containing the reotide template molecule and react with the polynucleotide template molecule. And incubate under conditions that allow synthesis of DNA molecules containing complementary regions .   In a further aspect of the invention, a complementary DNA replication of the polynucleotide template molecule is provided. An article manufacturing method is provided.   In this aspect, the method comprises at least one reverse transcriptase or complex thereof. And a first region that provides a site where cDNA synthesis begins , Located 5 ′ to the first region and 3 ′ to the portion of the template bound by the first region. The cDNA product of the molecule can anneal to the region of the polynucleotide template to be placed. A second region to be removed, located on the 3 'side of the first region, the complementary DNA product of the second region Anneal to the third region to restart the synthesis of complementary DNA, It includes a third region whose sequence is sufficiently similar to the region. In addition, polynucleotide casting At least one reverse transcription that initiates DNA synthesis from a first region of a template primer molecule An enzyme or a complex thereof is provided. Next, reverse transcriptase or enzyme complex and poly Forming a mixture containing the nucleotide template molecules, and Incubation under conditions that allow the synthesis of DNA molecules containing regions complementary to the template molecules I do.   In another aspect of the invention, a primer-specific cell expression pattern in viable cells is provided. A method is provided for generating a key.   This method allows the 3 'region to be selectively applied to a subpopulation of cellular polynucleotide template molecules. Reverse transcriptase-cognate primer transfer R modified to anneal Providing an NA molecule. Furthermore, DNA synthesis from primer molecules has been started. At least one reverse transcriptase is provided. Next, reverse transcriptase and primer -Forming a mixture containing the molecules into viable cells and the cellular polynucleotide Under conditions that allow the synthesis of DNA molecules containing a region complementary to the template molecule, Lab. Thereafter, the produced cDNA product is analyzed in this way, and Form a turn.   Alternatively, such a method comprises the use of at least one reverse transcriptase or complex thereof. A first region that binds to and provides a site for initiation of cDNA synthesis; Region of the cellular polynucleotide template molecule. A second region that allows annealing to the subpopulation. This can also be achieved by providing a primer molecule. Next, this primer molecule Reverse transcriptase-cognate primer transfer RN in the method just described Use instead of A molecule.   The present invention also provides compositions useful for performing the methods of the present invention. Such compositions contain cDNA in vivo when introduced into viable eukaryotic cells. Recombinant virus particle and polynucleotide template plasmid capable of initiating synthesis Immer molecules are included. Such a recombinant virus particle is a virus package At least one functional sequence equivalent of a sequence element required for A polynucleotide template primer molecule (eg, the ε region of hepadnavirus, Binds reverse transcriptase or its complex The region, and its cDNA product, is used to restart cDNA synthesis at a second polynucleotide site. 5 'sequence that will serve to effect the opening. Such recombinant virus particles Represents all other necessary processing elements (eg, capsids, nucleocapsids) Protein) to provide polynucleotide template primer molecules into infectious particles. Will be used in mixtures that will result in packaging.   Other compositions provided by the present invention comprise at least one reverse transcriptase or a combination thereof. A template for the synthesis of a complementary DNA copy of a template primer molecule that binds to the coalescence Gene element (GE) template primer polynucleotide molecule acting as molecule including. The cDNA product of the 5 'region of this template primer molecule is then Acts to resume cDNA synthesis at at least one other site on the molecule Will. The cDNA synthesis reaction is performed using at least one polynucleotide template cDN. Covalently bind the A product.   Compositions of the invention also include a recombinant D encoding a polynucleotide molecule of the invention. Also included are NA vectors and DNA molecules, and kits containing such compositions.Simple theory of drawing Light   FIG. 1 shows a simplified diagram of the eukaryotic RNA transcription step, where mR FIG. 4 illustrates the removal of non-coding intron sequences during NA processing.   FIG. 2 shows the cloning of the gene cassette in the present invention. Where   FIG. 2A shows cRNAProSpecific methods used to clone gene cassettes Shows a schematic diagram of   FIG. 2B shows "wild-type" mice utilized by Moloney murine leukemia virus. cRNAPro 1,2Shows the structure and sequence of the tRNA molecule corresponding to 3'nucleotide that anneals to RNA template and initiates retroviral reverse transcriptase reaction 2 shows a tide sequence.   FIG. 3 shows reverse transcriptase, tRNA primer, and RN necessary for cDNA synthesis. A shows the relationship in the interaction of the A template, where:   FIG. 3A shows the cognate tRNA utilized by Moloney murine leukemia virus.Pr o Wt 3 'region and the retroviral RNA segment (true Retrovirus for both complementary primer binding sites on the straight solid line) cDNA synthesis sequence and the first step of retroviral replication (dashed line indicates cDNA synthesis ), And   FIG. 3B shows in vivo cDNA synthesis from polyadenylated messenger RNA. Wherein tRNA modified and synthesized in vitroPro polyU3 'area and And for both the mRNA polyadenylation 3 'segments to which the tRNA binds. Rows are shown, with the first step (dashed line) of in vivo cDNA synthesis indicated. .   FIG. 4 shows amplification-mutation of tRNA-encoded promoter-tRNA cassette. Indicate the stages involved in development, where the first and second primers are indicated by dashed lines , And an arrow indicating the direction from 5 ′ to 3 ′ is attached, and the second primer is The 5 'base is annealed to the non-complementary base in the first template DNA molecule, as indicated by the stippled dashed line. The lower schematic shows that most of the 3 'bases are in the second primer. Amplified and modified transcription cassette that has been changed to a defined sequence encoded in a marker And the 3 ′ end of the cassette is truncated at the end of this second primer sequence .   Figure 5 shows the ethidium pro-cDNA product in vivo from insect Sf9 cells. This is a photograph of a 1% agarose / TAE gel stained with mid dye, reproduced here. Lanes 1 and 10 show a 1 kb ladder (BRL), lanes 2 and 6 are controls ([α-Three Two P] dCTP alone, and lanes 3 and 7 are controls ([α-32P] dCTP + reverse transcriptase) And lanes 4 and 8 show the control ([α-32P] dCTP + reverse transcriptase + tRNAWt) As shown, lanes 5, 9, 11, and 12 show experiments using modified tRNA primers ([α-32 P] dCTP + reverse transcriptase + tRNApolyU). In this experiment, the lane The samples of 11 and 12 were not treated with RNase A, and the samples of lanes 2 to 5 and 11 were 0.4 cm Electroporation in cuvettes, in lanes 6-9 and 12 The sample is electroporated in a 0.2 cm cuvette.   FIG. 6 is a photograph reproduction of the autoradiograph of the gel image shown in FIG.   Figure 7 shows the in vivo cDNA product from hamster (CHO) cells. Tidium bromide stained 1% agarose / TAE gel And where lanes 1 and 10 show a 1 kb ladder (BRL) and lanes 2 and 6 Control ([α-32P] dCTP alone, and lanes 3 and 7 are controls ([α-32P] dCTP + Reverse transcriptase), and lanes 4 and 8 show controls ([α-32P] dCTP + reverse transcriptase + t RNAWt), And lanes 5 and 9 show experiments using the modified tRNA primer ([α -32P] dCTP + reverse transcriptase + tRNApolyU).   FIG. 8 is a photographic reproduction of the gel image of the autoradiograph shown in FIG.   FIG. 9 shows the in vivo bromination of cDNA products from hamster (CHO) cells. It is a photograph reproduction of a 1% agarose / TAE gel stained with thidium. Here, lane 1 And 8 represent a 1 kb ladder (BRL) and lanes 2 and 3 show the control ([α −32P] dCTP + reverse transcriptase + tRNAWt), And lanes 4 and 5 are repaired. Example using a decorated tRNA primer ([α-32P] dCTP + reverse transcriptase + t RNApolyU) And lanes 6 and 7 show the control ([α-32P] dCT P + reverse transcriptase + oligo (dT) (5 μg). In this example, lane 3 , 5 and 7 were treated with S1 nuclease.   FIG. 10 is a photographic reproduction of the gel image of the autoradiograph shown in FIG.   FIG. 11 depicts a simplified diagram of retroviral proviral synthesis. The dashed line is tRN A primer (loop structure) and retrovirus-specific primer binding site With reverse transcriptase (RT) annealed to the complementary sequence of (PBS) Represents an RNA genome segment. The "R" region is the end of each genomic RNA segment. It is a repetitive sequence existing near the end. The thick solid line is indicated by the RNA template sequence. Represents cDNA synthesis.   FIG. 12 shows in vivo in the presence of a vector control element (VCE) RNA template. 1 shows a simplified diagram of a representative example of cDNA synthesis in FIG. Dashed lines represent RNA molecules. Poly A The area is for polyadenylic acid, one of the 5'-terminal sequences of the RNA template molecule. Applicable. "Neo" is the antibiotic G418 in eukaryotic cells (neoma in prokaryotic cells). (Isin) corresponds to an RNA sequence encoding a region that confers biological resistance. "O "ri" is a commonly accepted origin of replication of a polynucleotide molecule in a biological host. Abbreviation. The arrow surrounding the word "promoter" indicates that the A promoter operably linked to one of the polynucleotide segments. One direction of the element is shown. And   FIG. 13 is involved in generating primer-specific cell expression patterns in living cells. It shows the aspect which did. here, FIG. 13A shows RNA transcripts present in cell populations A and B and their ligation Provides a graphical representation of the is. And   FIG. 13B shows specific template primers or modified homologous tRNA primers. -One of the cDNA products obtained from in vivo cDNA synthesis using molecules Represents possible patterns.Detailed description of the invention   The present invention relates to methods and compositions for synthesizing complementary DNA (cDNA). I do. This invention is, for the first time, the natural target of reverse transcriptase or the reverse transcriptase complex. A method that enables cDNA synthesis by using a structure-specific analog for the position provide. In this method, a first binding to a reverse transcriptase or a reverse transcriptase complex is performed. A suitable template or template primer molecule with a site, reverse transcriptase or reverse transcription Introducing into the mixture in the presence of the enzyme complex and at least one polynucleotide The mixture is subjected to conditions such that a DNA molecule complementary to the otide template molecule is produced. Incubate.   In addition, cells present in living cells at a particular time or in response to a particular stimulus The main component of the production pattern of the cDNA product that reflects the amount and molecular size of the transcript is This is made possible by the present invention. This in vivo cell-specific and primer-specific “Barcode” or “transcript fingerprint” patterns are research, clinical diagnostics And prove to be very useful for many purposes, including court. This technology is Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of total genomic DNA for genetic analysis It should result in a corresponding “expressed gene”.   In the present invention, the need to initiate cDNA synthesis in an in vivo environment is more important in vitro. Appear to be more stringent, and oligo (dT) primer molecules, and other D NA primers do not seem to function under conditions of cDNA synthesis in vivo (See Examples section). To date, all known reverse transcriptions that function under in vivo conditions Enzyme directs site of initiation of cDNA synthesis by structure-specific polynucleotide molecule I do. In fact, the hydroxyl side from the tyrosine residue obtained from the reverse transcriptase itself Reverse transcription from hepadnavirus, which uses the strand to initiate cDNA synthesis Enzyme (Wang and Seeger, Cell 71: 663-670 (1992); Wang and Seeger, J. Virol . 67: 6507-6512 (1993)), a template-specific binding site, epsilon (ε) (Weber, M et al., J. Virol. 68: 2994-2999 (1994)). Targeted to the site of viral cDNA synthesis initiation. Therefore, all The first step involved in initiating the cDNA synthesis reaction in vivo is the structure-specific polycloning. It appears to be a directional binding of reverse transcriptase to the nucleotide target.   In retroviruses, the role of structure-specific polynucleotide molecules is similar to that of reverse transcriptase. It is performed by cell molecules that correspond to the homologue transfer RNA (tRNA) molecule (s). They are for two reasons: (1) the reversal produced by that specific retrovirus Transcriptase recognizes the specific structure of a very limited subset of cellular tRNA molecules And binding to it, and (2) the 3'-region of the homologous tRNA molecule Next, it is specific for the retrovirus and is included in the retroviral RNA genome template molecule. Binds to complementary sequence at encoded cDNA start site (primer binding site) This means "homolog".   In hepadnaviruses, the role of structure-specific polynucleotide molecules is Evidence for epsilon (ε), a viral pregenomic RNA template-specific binding site And it is a hepadnavirus against a retroviral homolog tRNA molecule. It seems to work as an analog.   In certain embodiments of the invention, the polynucleotide template or template primer molecule Is RNA, and in many embodiments, a polynucleotide template or template template. Limer molecules can be modified retroviral template RNA molecules or hepadnawi. Lus template RNA molecule. In addition, the present invention relates to the first All necessary components for biological selection, replication and amplification, integration and expression of Transgenic elements are covalently encapsulated as cDNA products that come into contact during in vivo processes Provide means that can be included. Therefore, live cells in an intercellular environment in vivo Thus, many important steps of molecular cloning take place. This genetic control information Genetic element (GE) in a polynucleotide template or template primer molecule Coded. In certain embodiments of the invention, the polynucleotide template or template The type primer molecule is transcribed into living cells. In many embodiments, this GE poly Nucleotide template or template primer molecule must have the appropriate reverse transcriptase or reverse transcription It is introduced into target living cells in the presence of the enzyme complex.   The GE polynucleotide template or template primer molecule is the reverse of the retrovirus. When used together with transcriptase and modified homologous tRNA molecules, retroviral Similar to that of U5-leader and U5-IR stem in genomic RNA template Sequence elements forming the structure can be included. These arrays are Ruth replication has been shown to be important (Cobrink, D. et al., J. Virol. 62: 3622-3630 (1 988)), interacts with the TΨC loop of the tRNA primer, and It appears to have significantly improved efficacy in liming (Cobrink, D. et al., J. Virol . 65: 3864-872 (1991): Murphy and Goff, J. et al. Virol. 63: 319-327 (1989); Aiyar A. et al. Virol. 66: 2464-2472 (1992)). Therefore, the modified tRNA primer -Molecules are energetic using an RNA template sequence that regenerates the analog RNA structure. It can interact in a more favorable way. In addition, nucleocapsidtan Encapsulation of protein (or other proteins) can be performed using RNA templates, tRNA primers, Can promote the formation of an initiation complex consisting of and transcriptase (Meric and Goff J. Virol. 63: 1558-1568 (1989); J. Khan and Diedorco. Biol. Che m. 267: 6689-6695 (1992)), thus improving the efficiency of cDNA synthesis.   Also, the GE polynucleotide template or template primer molecule may be When used in conjunction with Rus reverse transcriptase, they bind to a specific binding site, epsilon ( ε) contain sequence elements that form a structure similar to that of the pregenomic RNA template. Can be. These sequence elements are used to initiate cDNA synthesis, and hepadna. It has been shown to be important for both packaging of the viral genome.   5 'of the first polynucleotide template molecule represented at the 3'-end of the same template molecule -Encapsulation of sequences at the ends results in strong termination of the first minus strand in these 3'-sequences c Promotes intramolecular annealing of DNA products. This is the second polynucleotide Occurs as a result of intramolecular priming at the site, where resumption of cDNA synthesis occurs. This.   Unless defined otherwise, all technical and scientific terms are used in the art to which this invention pertains. Used according to the common understanding of those skilled in the art. The term as used here Unless the opposite definition is explicitly given in the context where Shows the meaning.   The term template indicates the nucleotide sequence from which the complementary sequence is made.   The term template primer refers to a polynucleotide that initiates cDNA synthesis and is extended. The cDNA product of the template primer molecule described above, It serves to restart cDNA synthesis at the polynucleotide site.   Gene element (GE) and vector control element (VCE) template The term immer molecule is used interchangeably and refers to prokaryotic or eukaryotic cells. Amplification, selection, replication, insertion, separation, integration, excision, stabilization, purification, expression, detection Including, but not limited to, positioning, processing, or packaging Template ply that can include a gene region encoded for a unique function 1 shows a mer molecule.   The term analog is used to indicate all sequence specific representatives of naturally occurring nucleotides. Used for   The term reverse transcriptase refers to the addition of a deoxynucleotide to a primer annealed to an RNA template. All polymers capable of catalyzing the addition of leotide or its analogues Used to mean ose.   The term polynucleotide refers to deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid and their analogs Of homo- and hetero-polymers.   The term modified reverse transcriptase homolog primer primer transfer RNA molecule is used in artificial biological systems. All tRs produced chemically by a step or purified from biological material Correspond to NA molecules, which are to prime the activity of specific reverse transcriptase Has been qualified.   The term primer binding site ("PBS") refers to the naturally occurring nature of a particular reverse transcriptase Features in the RNA template molecule at which the homologous primer anneals and initiates cDNA synthesis Corresponds to a different nucleotide sequence. Therefore, the RN where the primer anneals A Diversity in the template sequence Nucleotide additions, deletions or other modifications may also occur at sites other than the primer binding site. Make up the join.   The term R region sequence refers to the 3'- and 5'-ends of the retroviral genomic RNA. And the natural repetitive sequences found in both.   The term expression cassette is a DNA construct that contains all sequences necessary for the expression of the encoded product. I say a building. Therefore, the expression cassette has at least a promoter region. DNA, the sequence of interest, and the final transcription region.   The terms vector and plasmid are used interchangeably and identify DNA All means that can be replicated and selected in the system.   The term operable linkage preserves a functional relationship between sequences on each side of the linkage Refers to nucleotides linked in a manner. For example, it can work on DNA sequences The promoters are ligated in the direction of transcription and at the transcription start site. Are both upstream, such that transcription elongation proceeds via the DNA sequence Is inserted.   A specific example of the method for cDNA synthesis of the present invention requires the isolation of mRNA from cells. Often not. Such cDNA synthesis is a problem with conventional in vitro technology. To eliminate. The problems are: 1) the need to separate mRNA; Cell components retract into the artificial environment, or 3) cells are killed and severe It is to be offered to the matter. Therefore, the mRNA template appears to be more complete. Thus, a full-length cDNA clone can be obtained more reliably. In addition, cDN in vitro A synthesis does not require the in vivo activity of reverse transcriptase, but rather the effectiveness of reverse transcriptase. In vivo (i.e., within the cellular environment) to optimize efficiency, fidelity and processability ) Allows a reverse transcription step to be performed. Therefore, the cDNA clone The longer the sequence, the less likely it will be for nucleotide sequence errors unknown. In addition, it requires significantly less time, is easier to perform, and By that means, potentially a cDNA product that starts with fewer starting cells is provided. You.   As described in the Background section above, conventional cDNA synthesis is cell-based. Isolating and purifying the native mRNA or drawing the reaction components into an artificial environment. And an in vitro cDNA synthesis step follows. This in vitro In the cDNA synthesis step, the requirement for a primer for reverse transcriptase is an oligo (dT) primer molecule that anneals to the poly (A) tail of the mRNA molecule, Alternatively, provide an oligonucleotide molecule that is complementary to a known portion of the target mRNA sequence. It is most commonly served by paying. However, these types of oligos None of the nucleotide primers seem to be effective in vitro (See the following example). Why successfully initiate an in vivo cDNA synthesis reaction In Vivo cDNA Synthesis of Simple Polynucleotide Oligomers with Complementary Sequences Lack of specific evidence to confirm that reaction cannot be initiated, but attribute to failure There are at least two possible explanations: 1) Retroviral reverse transcriptase Recognizes homologous tRNAs that have a specific sequence and, thus, adopt a three-dimensional structure. It is known to know and join. This is because HIV-derived reverse transcriptase Gel mobility shift experiments using both natural and synthetic tRNA molecules (Barrat, C. et al., EMBO J. 8: 3279-3285 (1989) ); Ballat, C. Et al. Nucleic Acids Res. 19: 751-757 (1991); Wise, S . Gene 111: 183-197 (1992)). Simple oligomer primers have this structural No primers, and thus the polynucleotide primer is added to the mRNA template. Retroviral reverse transcriptase can be used in vivo Under the primers may not recognize and bind. Similarly, Hepadnawi Ruth reverse transcriptase is a specific structural region present on pregenomic RNA template molecules. Recognizes and binds epsilon (ε) (Weber, M. et al., J. Virol . 68: 2994-2999 (1994)). Mutations in the ε region prevent the formation of minus-strand DNA. Harm (page 6508, Wang and Seeger, J. Virol. 67: 6507-6512 (1993)), and This serves as a forced primer for positive strand synthesis at DR1. 2) Instead In addition, polynucleotide primers that anneal to the template under in vitro conditions It may simply be impossible to anneal efficiently to the mRNA template in vivo Absent.   In the natural life cycle of a retrovirus, the viral reverse transcriptase is single-stranded. Host tRNA to synthesize a DNA copy of the retroviral RNA genome of Use the molecule as a primer. More than 40 different types of tRNA in animal cells May exist. Each infectious retroviral particle has its own primer Specificity that anneals to a specific region of retroviral RNA called a binding site Replication of a single-stranded viral RNA chromosome that binds to the tRNA molecule of the target host Material. To initiate the reverse transcription process, the base at the 3'-end of the tRNA is The sequence anneals to the primer binding site of the retroviral RNA. Reverse transcription The enzyme (already bound to this complex) then primes this tRNA Utilizing as a molecule, about to occur at the 3'-hydroxy end of tRNA Add the first nucleotide of the DNA molecule.   The specificity of priming retroviral reverse transcription is Determined by the base pair sequence at the 3'-end of the tRNA molecule that anneals to the genome of It is. Each retrovirus is a specific primer present in the retrovirus genome. A tRNA primer that can anneal to the mer binding site sequence is utilized. For example The human immunodeficiency virus (HIV) genome is tRNALys ThreeAs a primer To use. To initiate the synthesis of the HIV virus DNA replica, tRNALys Three Denatures the 18 nucleotides at the 3'-terminus of the HIV primer -Paired with the binding site (Wise et al.RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor (19 82); Goff, Jay. J. Acquired Immune Deficiency Syndrome 3: 817-831 (19 90)). Therefore, tRNALys ThreeThe 18 nucleotides at the 3'-end of H Complementary to the IV primer binding site sequence. The RNA template of this virus contains tR In addition to annealing the NA primer, a portion of the same tRNA molecule is Is recognized by Rus's reverse transcriptase, so that a trimolecular complex is finally formed ( tRNA primer-reverse transcriptase-RNA template).   Therefore, polynucleotide casting is required for all in vivo cDNA synthesis reactions. The type or template primer molecule should meet two requirements. First, the molecule is Must be able to bind to reverse transcriptase or the reverse transcriptase complex. Second, the bound enzyme or enzyme complex is used to synthesize cDNA from the region at that site. To create a starting cDNA molecule that is complementary to the polynucleotide template. Must. Currently used in vitro with retroviral reverse transcriptase A simple oligonucleotide primer to initiate cDNA synthesis of Does not work with (see enumerated data). In addition, specific tRNA molecules As a primer for the in vivo action of reverse transcriptase on the rovirus genome While capable of functioning, these tRNA primers All mature cellular mRNA molecules that anneal specifically to the primer binding site It is not designed to anneal to sequences present in Similarly, Hepadnau Reverse transcriptase from irs is present in hepadnavirus pregenomic RNA template molecules Recognizes and binds to the specific binding site (ε) It does not initiate cDNA synthesis from the region present on the vesicle mRNA molecule.   The present invention relates to all polyadenylated cellular mRNA molecules whose cDNA products And the primer molecule anneals to the cDNA copy of the mRNA molecule. Providing a template primer molecule utilized by a reverse transcriptase as produced Provides a method for cDNA synthesis in vivo. The present invention relates to a virus template Modified retrovirus or hepadnavirus template molecule or template primer -Retroviral and hepadnavirus replication processes that replace molecules (actually, in  cDNA synthesis reaction in vivo).   In an embodiment of the present invention, the template primer molecule is a matured cDNA product of the template. Anneal to the 3'-poly (A) tail present in the vesicle mRNA molecule. Modified retroviral template in which the 5'-region of the promoter is replaced with a polyadenylate sequence Type molecule.   In another embodiment of the present invention, the template primer molecule is one in which the cDNA product of the template is matured. Anneal to the 3'-poly (A) tail present in the cell mRNA molecule Modified hepadnawi wherein the 5'-region of the molecule is replaced with a polyadenylic acid sequence Luth template molecule.   Such a preferred template primer molecule contains all mature primers contained in living cells. Can be used to synthesize in vivo cDNA copies of mRNA molecules You. Since the product of this template primer anneals to all mature mRNA molecules, The template primer can be used to produce a cDNA library. Ie , It represents all of the structural genes that will be expressed intracellularly at that given point in the future A collection of cDNA molecules.   In one embodiment of the invention, a cDNA synthesis reaction is performed on a cell to extract or isolate mRNA. Or the perturbation (pert) of drawing cell contents into an artificial in vitro environment. It occurs in living cells under in vivo conditions without urbation. Therefore, c The DNA synthesis product will disrupt the mRNA population within the cell when cDNA synthesis is initiated. The pieces reflect more accurately and their products are synthesized in an in vivo environment. further, There is no artificial amplification step required to make a library from a small amount of early cells, and Multiple libraries containing rare components can be stored in limited amounts of specific cells (eg, , Pluripotent hematopoietic stem cells).   In another embodiment of the invention, the initial particular polynucleotide template primer molecule is Increases both the annealing and priming potential of nascent cDNA transcripts And additional coding genetic elements or vector control elements To provide a means to incorporate the protein into the final in vivo cDNA product. Used.   In another embodiment of the invention, the 5'-region of the template primer molecule is modified so that Complementary to a portion of a specific polynucleotide sequence. This is the desired polynucleus The nucleotide sequence of the otide template molecule is already known or Need to make cDNA from a population of template molecules containing complementary sequences And Synthesis of specific cDNA molecules includes, but is not limited to: May be useful in many different ways: sequence-specific template primers Cloning cDNA with known sequence, specific gene genus (all genes sharing a common sequence) Cloned from a gene that represents Can be used to determine the ratio of splice variants on different transcripts.   In addition, template primer molecules can be used for cell-to-cell mutagenesis or cDNA crosslinking reactions. Encodes the desired sequence element 3 'to 5' sequence Template primer molecule, annealed to a separate cell transcript and someone mutates from 5 ' The cDNA product that resumes cDNA synthesis in the region of interest The site of this template primer annealing to the concomitant loss of 3 ' Replace 3 'with the site of template primer cDNA product annealing.   A number of positions where specific polynucleotide sequences from the 3 'to 5'-end are located. A template primer having a sequence containing a riadenylic acid residue is used as a template primer molecule. The cDNA product repositions itself on the second polynucleotide template molecule. (Eg, proximal to the polyadenylate stretch present on mature messenger RNA) Act as primers and thus contain complementary linking sequences The constituent fragments are converted to cDNA products. Stringency in initiating cDNA synthesis (stringency) is a statistical formula 1 / 4n [where n = polyadenyl of the template primer The number of specific bases added to the 5'-end of the acid region (e.g., 5 bases For a specific sequence with a −50 adenylate residue, then 1/45 = 1/102 4 messages are primed by the cDNA product and converted to cDNA May be expected to be replaced. ]. Cells are 10,000 When expressing 00 different messages, approximately 10 products are then primed. It is expected that these template primers will convert to cDNA products. Might be. Generated and obtained primer- and cell-specific patterns It is important to note that there are other factors that influence the sequence: RNA template Size and frequency, sensitivity of cDNA product detection, Selection, priming at a region in the mRNA template other than at the 3'-end, and cD Other factors affecting the efficiency of NA synthesis are examples. Extraction, fractionation, and detection Subsequently, this technique can be used to develop primer-specific cell expression patterns. Can be. If this pattern is generated with the appropriate primer sequence, A cell is specific for a cell or tissue type or stage of development. This pattern Responds to cell perturbations (eg, transformation or infection), or applied stimuli May be able to diagnose changes that have occurred. Variations are the various things that make this pattern It can be characterized exclusively by changes in the density of the cDNA product (see FIG. 13). See).   The amount of tissue removed during a surgical biopsy is often attributed to technicians by introducing an artificial Primers-selective cells that can be used for diagnosis without relying on amplification technology This is especially useful as it is enough to allow the development of expression patterns. And a powerful diagnostic tool. Once the composition of the pattern is identified, Technology can be a powerful tool in diagnostics.   In addition, a template primer that is selective for an RNA template is It is necessary to clone and further separate the template for use in A sequencing reactions. Without need, the 5'-sequence of the desired RNA template can be determined.   Furthermore, expression of a particular mRNA species is a reliable indicator of a particular disease state. , CDNA synthesis in vivo is based on the polymerase chain reaction (P CR) may be a useful alternative to or a treatment in connection with the diagnostic techniques described above. It could be used as an agent. Polymerase chain reaction (PCR ) Has been used for this purpose in the past, but due to problems that occur during amplification At best, they are unreliable and biased (Gilliland, G. et al.PCR Protoc ol: A Guide to Methods and Applications , Academic Press (1990)).   The specific primer can then translate the existing mRNA template. Antisense therapy based on the ability of the reaction to convert to a cDNA product that is no longer possible Used to initiate in vivo cDNA synthesis in abnormal cells be able to. In another embodiment, the HIV specific complementary primer is a modified deoxy Nucleotide bases can be used for detection, sequencing or classification. Should be able to be incorporated into a cDNA that can be . Med. Virol. 37: 143-148 (1992); Prober, Jay. M. (1989)) , Or its base, is sensitive because the incorporated nucleotide analog becomes cytotoxic. Only infected CD4 cells remain, while leaving unstained CD4 cells alive. Could be designed to be eliminated.   Accordingly, the present invention provides a method for synthesizing cDNA in vivo. Includes template and template primer molecules. More specific and preferred embodiments These molecules are the components of the modified retrovirus or hepadnavirus RNA template. I am a child.   One of skill in the art will appreciate that when practicing the present invention, the genome template molecule of a pre-existing virus Requires template or template primer molecules used for cDNA synthesis derived from Notice that it is not. Therefore, the D complementary to the polynucleotide template molecule (A) a reverse transcriptase or enzyme capable of effecting initiation and synthesis of the NA molecule; Binding the complex, and (b) a template for the reverse transcriptase or enzyme complex All polynucleotides capable of acting as It can be used for synthesis methods. Specific templates for use in cDNA synthesis Alternatively, the suitability of the template primer molecule can be determined by performing cDNA synthesis as described below. And analyzing the products of its synthesis.   Template (or template primer) and reverse transcriptase (or reverse transcriptase complex) Is present in the cell or either one or both are synthesized in the cell Or may be introduced into cells. Therefore, in one embodiment of the present invention, in v In vivo cDNA synthesis uses reverse transcriptase and template (or template primer) molecules Can be performed in a cell line that carries the gene encoding The expression of these genes Now results in the synthesis of reverse transcriptase and template (or template primer) in cells. I do. In another embodiment, the reverse transcriptase and template (or template primer) molecules are Since the gene to be transcribed can be expressed under the control of an inducible promoter, Gene induction leads to the expression of reverse transcriptase and template molecules, thereby synthesizing cDNA. Would start.   More generally, template (or template primer) molecules and reverse transcriptase (and Reverse transcriptase complex) is introduced into the cell from an external source. Many technologies are living cells Established for transporting biological material into. Many of these technologies are described It has been [Molecular Cloning; A Laboratory Manual Cold Spring Harbor La boratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1989); Coun, Dubley. Stingray . Meth. Enzymol. 185: 527-537 (1990)], electroporation [(New EMBO J. 1: 841-845 (1982); Electroporation and electrofusio n in cell biology Newman, E. Ed., Plenum Press, New York (19 89); Camder, P. Nonoic Acids Res. 20: 3526 (1992); Lorus, M -Eur. J. Biochem. 206: 115-121 (1992); Songaris, G. Jay. La Mutat. Res. 244: 257-263 (1990); Lambert, H .; Biochem. Cell Bi ol. 68: 729-734 (1990); And H. Mikawa's Mutat. Res . 243: 121-126 (1990); Weinger, R .; A. Mutat. Res. 225: 49-53 ( 1989)], DEAE-dextran [Levesque, J. P. Biotechniques 11: 313-4, 316-8 (1991); Ishikawa, W. And C. Jay. Homsy's Nucl eic Acids Res. 20: 4367 (1992)], cationic liposomes [Jarazine, Dub Ryu. Earl et al., Nucleic Acids Res. 20: 4205-4211 (1992)] or cationic fats Quality [Worker, Sea. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7915-7918 (1992)], Receptor mediated delivery [Wagner, Ei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 89: 6099-6103 (1992)], microinjection [Martin, P. et al. . Biol., 117: 574-580 (1986)], protoplast fusion, laser or particle bombardment And viral vector delivery, but are not limited thereto. One skilled in the art will recognize that each of these techniques has associated advantages and disadvantages. , And will be able to select the most appropriate transport technology for the cell type used .   In certain embodiments of the invention, primers, templates and templates for in vivo cDNA synthesis are provided. Electroporation is one of the techniques for transferring primers and template primers into cells. And liposome transfer. These techniques are described below. Surgery includes modified tRNA primers, reverse transcriptase, and modified deoxynucleosides. Triphosphate can be used to introduce into many different cell types.   In vivo cDNA synthesis when reverse transcriptase is introduced into cells from an external source The choice of primers, templates and template primers depends on the chosen reverse transcriptase. Determined by type. Reverse transcription of two commonly used and commercially available types Enzymes: avian myeloblastosis virus reverse transcriptase and Moloney mouse leukemia Disease virus reverse transcriptase (MoMLV). These enzymes are available from such sellers Commercially available: Stratagene, California 92037, La Jolla, NJ. Toray Pines Road 11011; Bethesda Research Laboratories, Inc. , Maryland 20877, Jaisersburg, P.E. Oh. Box 6009; New E ngland Bio Labs, Inc., Mass. 01915, Beverly, Tozer Road  No. 32; and Boehringer Mannheim Biochemicals, Indiana 46250, Dianapolis, P. Oh. Box 50816, Hague Road 9115. many kinds Some enzymes have unique parameters: fidelity (error rate), processability (complete cDNA synthesis). Capacity) and structure (heterodimer versus monomer), and availability and acceptance (acc eptance), and they select enzymes Factors that should be considered when In addition, it works with specific cell types and organisms Use reverse transcriptase derived from retroviruses or retroelements (For example, to synthesize cDNA in human cells, reverse Use transcriptase. That can be important.   Coding operably linked to a promoter sequence for the purposes of the present invention The DNA cassette containing the modified tRNA sequence is cloned into a bacterial vector. Got a loan. This uses an RNA polymerase that recognizes the promoter sequence Thus, it has become possible to produce modified tRNA primers in vitro. in vi vo cDNA synthesis primers should be used when primers are to be transcribed in vitro The choice of motor is dictated by the polymerase enzyme and the selected in vitro Used in transcription systems. In a preferred embodiment of the present invention, a modified tRNApro GGG plasmid Immersed bacteria in an in vitro transcription system using the T7 RNA polymerase enzyme. Expressed under the control of the ophage T7 promoter. Manufactured modified tRNA plasmid Immers are isolated and reverse transcriptase, modified MoMLV template primer molecules and And radioactively labeled deoxynucleotides into the cells. these Following the introduction of the exogenous component, the cells are allowed to grow for a sufficient length of time in vivo for the cDNA. Incubation was performed under appropriate conditions to allow synthesis to occur. Suitable conditions are generally In particular, conditions under which the cell type in question grows normally. Preferred of the present invention In a specific example, the target cells are incubated for 0.5-2 hours at normal culture conditions for that cell type. Cuvated, followed by introduction of primers and reverse transcriptase. Columns below As described in the Examples described below, radiolabeled dNTPs (eg, [α-32P ] The introduction of dCTP) is performed in vivo under specific conditions and using specific primers. o may be used to determine the effectiveness of cDNA synthesis at o. Cell Incubation After the incubation, the cDNA produced in vivo is then purified by the Hirt extract solution. Extracted from target cells using a protocol such as Hartby et al., J. Mol. Biol. . 26: 365-369 (1967)). Extracted cDNA products can be prepared using standard cloning techniques. It appears to be a double-stranded nucleic acid that has been successfully cloned. As an alternative, Primers, templates and template primers and / or enzymes are introduced into cells. Could be produced from the selected gene. Enzymes are expressed from genes in cells, The primer, template and template primer could then be introduced into the cells. Or , Primers, templates and template primers can be expressed in cells, And the reverse transcriptase could be introduced from the outside. Modification by reaction (radioactive label Intellectualization) Incorporation of deoxynucleoside triphosphate involves incorporation of deoxynucleotides It was used as a tool to do this, but not a requirement of that method. But repair For the encapsulation of the decorated deoxynucleotide, (α-labeled deoxynucleotide is used Provide convenient techniques for both incorporation and synthesis of (biotinylated In vivo (using isolated or other deoxynucleotide analogs) It should be noted that it provides a means to select or distinguish products of the integration reaction. is there. Modified deoxynucleotides and deoxynucleotide analogs It has been used successfully in a type of polymerase reaction. And technology obvious to those skilled in the art (Flober, J. M. et al., Science 238: 336-341 (1987); Kleban , El. And G. Meth of Gebeyahu. Enzymol., 154: 561-577 (1987); buoy. Nucleic Acids Res. 13: 8083-8091 (1985); Lo, wa I-M. Dee. Et al. Nucleic Acids Res. 16: 8719 (1988)).   The products of these reactions are used to construct eradicable cDNA libraries, specific cytotoxicity Alternatively, production of light-sensitive cDNA products, DNA sequencing in vivo, and Including, but not limited to, DNA probes for analytical, diagnostic or manufacturing applications It can be used in a variety of different ways.   The following examples serve to illustrate certain preferred embodiments and aspects of the present invention. It should not be construed as limiting their scope.   Experiment   In the following experimental disclosure, the following abbreviations apply: eq (equivalent); M (mol) MM (mmol); μM (micromol); N (normative); mol (mol number); Μmol (micromoles); nmol (nanomoles); kg (g G (gram); mg (milligram); μg (microgram); L (liter); ml (milliliter); μl (microliter) Cm (centimeter); mm (millimeter); μm (micrometer); nm ( Nanometers); V (volts); μF (microfarads) and ° C. (degrees Celsius) ).   In the following examples, unless otherwise specified, restriction enzymes, T4 DNA ligase, And polynucleotide kinase from New England Biolabs You. [Α-32P] dCTP, [α-32P] UTP and [γ-32P] Is ATP Amersham? Molony mouse leukemia virus reverse transcriptase buffer, liposome preparation and And enzymes are obtained from Bethesda Research Laboratories. These substances are Used according to manufacturer's instructions unless otherwise noted. Electro Pole Electroporators from Invitrogen and Biorad This is done using an electroporation cuvette from the company. Oligonucleotide Otides can be obtained from Operon Technologies or, for example, from the manufacturer. It can be synthesized on an Applied Biosystems DNA synthesizer according to the instructions. Sarma Thermus aquaticus DNA polymerase I is a Perkin-Elma -Obtained from Cetus. All conventional molecular biology techniques are used for reference only. Lines according to Sambrook et al. (1989) or Berger and Kimmel (1987) contained in the booklet. Will be   The nucleic acid sequences disclosed herein are conveniently separated into oligonucleotides of 10-mer or less. And should be interpreted as a continuous sequence unless otherwise noted.   Example 1   I.tRNA Synthesis of genes encoding primers   Molony mouse leukemia virus (MoMuLV) is used for retroviral DNA synthesis. Mouse tRNA as primerPro 1,2Use an isoacceptor molecule (Harad a, F. J. Biol. Chem. 254: 10979-10985 (1979); Peters and Dahlberg, J.V. irol. 31: 398 (1979)). These specific tRNA molecules reverse MoMuLV in virions The complex is found to form a complex with the transcriptase, which, in turn, Anneal at the primer binding site (see FIGS. 2B and 3A). Annealed MoMuLV reverse transcriptase can use DNA tRNA molecule as primer to start DNA synthesis DNA molecules that are complementary to the template RNA molecule to which the tRNA primer anneals Continue to synthesize.   Mouse tRNAProThe nucleotide sequence of the GGG primer is known (Harada et al. , (1979)). Two versions of this tRNA molecule are available from gene cassettes in vitro. And these cassettes are synthesized using oligonucleotides and then Cloned and confirmed by sequence analysis. Data using these reactions The oxyribonucleotide primer is shown below.   Oligonucleotide primers No. 1 and No. 2 were replaced with the “wild type” shown in FIG. 2A. Mouse tRNAProDesigned to generate recombinant tRNA molecules equivalent to GGG primers I do. In vitro transcribed tRNAs are used to modify the RNA present in their cell counterparts. There are certain differences in not including nucleotide bases. However, this These modifications are based on reverse transcriptase-tRNA interactions, and naturally occurring cognate tRNAs (Barat, C. et al.). (1989); Weiss, S. et al. (1992); Barat, C. et al. (1991)) It was found to have the same potency for both of their ability to initiate synthesis. The 3 'ends of these primers are complementary, so that primers No. 1 and The 3 'end of Primer No. 2 was annealed in vitro, and then DNA in the presence of dNTPs Treated with the Klenow fragment of polymerase I -TRNAwtCan produce a double-stranded DNA molecule containing a cassette encoding (Figure See 2A). This primer pair is used for the bacteriophage T7 promoter. -The sequence is designed to be operatively linked to the 5 'end of the tRNA molecule. This promo -TRNA cassette is adjacent to the restriction site and the cassette is And an EarI restriction site at the 3 'end of the cassette. And consequently by EarI endonuclease prior to the in vitro transcription reaction. Digestion of the resulting cassette results in linearization of the template (at that exact 3 'end of the encoded tRNA sequence). This results in termination of transcription). Nucleotide sequence of primer No. 1 and No. 2 Are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.   The second pair of primers (Primers No. 3 and No. 4) was modified with the following modified form of tRNA ( The modified tRNA molecule is tRNApolyU).   tRNAwtSimilarly, the tRNA sequence and the bacteriophage T7 promoter And the 5 'end of the adjacent restriction site by manipulation to incorporate the EarI site. Its tRNApo lyU Primer No. 4 containing the 3 'end of the molecule is the 3' end nucleotide of the wild type tRNA molecule. Encodes a poly (U) sequence in place of ). Primers No. 3 and No. 4 are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively.   Primer No. of equimolar ratio 1 & 2 and 3 & 4 were converted to T4 DNA kinase (Polynu (Nucleotide kinase). Kinase treated oligos The primer pairs No. 1 and No. 2 and primer No. 3 and No. 4 were Klenow buffer containing dNTPs (50 mM Tris-chloride (pH 7.6), 25 ° C, 10 mM MgC lTwoAnneal in 10 mM β-mercaptoethanol (80 ° C. for 3 minutes, 20 minutes) Cool slowly from 600 ° C to 37 ° C over time). Next, the annealed primer Pair with 10 units of the Klenow fragment of DNA polymerase I in a volume of 30 μl. Incubate both at 37 ° C for 30 minutes to complete double-stranded DNA synthesis. Next, usually Extract and precipitate these double-stranded DNA cassettes using techniques available to Re-suspend in 1 / 10TE buffer (1 mM Tris-chloride, 0.1 mM EDTA (pH 8.0)) And the pUC18 cloning vector (Yannish-Perron et al., Gene 33: 103-11). 9 (1985)) at the dephosphorylated SmaI site. Primer No.1 and No.2 The wild-type tRNA gene generated by the combination is cloned into pUC18 to obtain pUC18-T7tR NAwtCreate Modified tRNA residue generated by the combination of primers No. 3 and No. 4 The gene was cloned into pUC18 to obtain pUC18-T7 tRNApolyUCreate These two types of programs The sequence and orientation of the promoter-tRNA cassette is confirmed by DNA sequencing. Sequencing was performed using Sequenase ™ 2.0 (U.S. Done using Michals)).   II.tRNA Primer synthesis   tRNAwtOr tRNApolyUA cloned DNA molecule encoding any of the above Generated as follows. Bacteriophage T7 RNA polymerase From these cloned tRNA genes by incubating in the presence of Generate transfer RNA molecules. RNA polymerases recognize that they are Until a transcription termination signal in the sequence is encountered or the DNA template is simply run off. Continue to synthesize RNA molecules that are complementary to the template DNA. Action of T7 RNA polymerase Ensures that the tRNA molecule produced by is properly terminated at the end of the tRNA gene To achieve this, a given tRNA template is linearized at the end of the tRNA gene. this is Can be done in several ways.   One technique involves cutting the cloned insert by restriction digestion . Digestion with EarI restriction endonuclease removes promoter-tRNA cassette from pUC1 8-T7tRNAwtFrom the 5 'to the T7 promoter sequence in the vector sequence. Digest, and digest exactly at the 3 'end of the tRNA gene template.   tRNApolyUAn EarI restriction site at the 3 'end of the insert should be resistant to digestion. So, the above approach works with pUC18-T7tRNApolyUCloning May not be used with the technician. To avoid this problem, Specific promoter-tRNA using another technique that utilizes chain reaction (PCR)polyUH TRNA that amplifies fragment and encodes templatepolyUSpecify the end of . Two primers are used for this purpose: the first primer is the T7 promoter 5 'to the inserted T7 promoter region with a 3' end directed to the promoter region sequence A commercially available primer that anneals to the sequence in the located pUC18 vector, The second primer is the desired T7 promoter-tRNApolyUAnneal to base of cassette "Reverse RNA primer" (shown in SEQ ID NO: 5), resulting in a reverse RNA primer The 5'-most base of the primer is a coded tRNA such as:polyUMost of mold 3 The base on the 'side.   The PCR is performed according to the following conditions: PCR buffer: 67 mM Tris (pH 9.2 at 25 ° C). ), 16.6 mM (NHFour)TwoSOFour1.5 mM MgClTwo; 50ng of each primer, about 1x108 Molecular pUC18-T7tRNApolyUConstruct, and 250 μM concentration of each deoxygen Creotide triphosphate. The reaction mixture was heated at 100 ° C. for 3 minutes, To 15 ° C. Centrifuge the tube briefly to collect the contents, then 1 unit Of Taq polymerase and one drop of mineral oil are each added to 20 μl of the reaction. So Is carried out in the following regime in 40 cycles: 1 minute at 94 ° C; then 1 minute at 55 ° C. Amplification products were pooled from 5 reactions, Klenow fragment and 1 mM dNTP To blunt ends, extract to remove proteins and trace mineral oils, and pass through EtOH precipitate using conventional protocol. The pellet is immersed in 70% ethanol (EtO H) Rinse and dry. The pellet is then resuspended in 1/10 TE and 2% agarose / TAE gel against a standard of known size Find out with.   PCR involves a single nucleotide (usually a de- (Oxyriboadenylic acid residue) It should be noted (Clark, JM, Nucleic Acids Res. 16: 9677-9686 (1988)). . However, this template-dependent incorporation occurs rarely, and extra adenine When a residue is added, it is not at the sequence encoding the template but at the 3 'end (this is the T7 Upstream of the promoter). Subsequent trials using these molds Denature radiolabeled products of in vitro transcription reactions using standards of known size When examined using polyacrylamide electrophoresis, it was You.   T7 promoter-tRNAwtCassette and T7 promoter-tRNApolyUcassette A linear DNA fragment containing a template for generating tRNA molecules in vitro Used as a molecule. This is called bacteriophage T7 RNA polymerase enzyme. Performed by the run-off transfer used (see below).   tRNAwtEarl linearized pUC18-tRNA for in vitro production ofwtUsing mold Perform the reaction. tRNApolyUPCR in vitro production of T7-tRNApolyUMosquito Use the set as a template. Also, DraI sensitive T7-tRNApolyUStraight chain cassette And used as a template for an in vitro transcription reaction (EarI compatible T7- tRNApolyUUsing the same protocol used for template generation, oligomer N o.3 and 6). The following conditions were used for in vitro reactions. (Gurevich, V.V. et al., Anal. Biochem. 195: 207-213 (1991): Briefly, Add the following components to an RNase-free Eppendorf tube at 25 ° C: 80 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 12 mM MgClTwo, 20 mM DTT, 5 mM dNTP, 2 mM sperm Gin; dH without RNaseTwoO; 50-100 μg / ml of template DNA and 5 μl of [α-32P ATP (30 μCi; 3000 Ci / mmol; added to examine and quantify product) . The reaction components are mixed and the reaction is then mixed with the T7 RNA polymerase enzyme reaction mix (120 0-1800 U / ml to a final concentration). Then tube at 37 ° C for 4 hours Incubate. RNase-free DNase is added to the reaction and template DNA Allow digestion to proceed for 15-30 minutes. At this point, to measure the efficiency of the acquisition A small aliquot of the reaction mixture can be removed. This measurement is Aliquots of the reaction mixture in the presence of RNase-free carrier DNA This can be done by chloroacetic acid precipitation. This measurement, the total count control, Performed with material that did not precipitate from the reaction mixture. Then, for each of the reaction mixtures, 15 0 μl RNase-free dHTwoO and 20 μl of 3M NaOAc were added and the mixture An equal volume of phenol / CHClThree(pH 6.5) (using phenol buffered at pH 6.5) To minimize the potential for base-catalyzed hydrolysis of the RNA product), followed by CHClThreeBy Extract. The product is precipitated with 2-propanol, the pellet is rinsed and the precipitate is dried. Let dry. RNase-free dH primer productTwoResuspend in O, and Autoradiation of polyacrylamide / urea gels performed with standards of known size Check aliquots for size using ographic exposure.   III.Chemical synthesis using solid support   Unmodified oligonucleotides and 2'-O-methyl oligoribonuclei The ability to chemically synthesize leotide in a solid phase with high yield makes the present invention useful for preparative, analytical and analytical applications. And can be easily adopted for therapeutic use. Modified oligoribonucleotide raw Synthetic techniques and reagents useful for synthesis (eg, Sprout, incorporated herein by reference). , B.S. et al., Nucleic Acids Res. 17: 3373-3386 (1989)) indicates that RNA primers are DNA Given some embodiments that could not be performed when produced in vitro from a template, You. For example, 2'-O-methyl oligoribonucleotides are resistant to RNase activity. (Sprout, B.S. et al., (1989); Inoue, H. et al., FEBS Lett. 2 15: 327-330 (1987)). Therefore, instead of oligoribonucleotides, in vivo The use of these modified RNA molecules as primers in cDNA synthesis reactions Resistance of synthetic primers to RNase H catalyzed removal, including any existing modifications Bring. These primers can then be biotinylated,32P sign can be Or occupied during second-strand cDNA synthesis after base-catalyzed hydrolysis of the initial template (2'-O-methyl primers). Will also protect the annealed capture portion of the initial RNA template as well). this It is clear that these modifications do not impair the ability of the primer to associate with the protein. Yes (Sprout, B.S. et al., (1989)), and modified oligoribonucleotides are expected. Anneal with the specified specificity. Removal of the 2'-OH group will cause the RNA primer to flank 3 ', More resistant to base-catalyzed (nucleophilic) attack on 5'-phosphodiester bonds And it is resistant to various ubiquitous RNases.   IV.Experimental design   The modified tRNA primer synthesized as described above can be used in various cell lines. Used for the in vivo cDNA synthesis reaction. Control reactions were also performed in the absence of primers. Oligo (dT) primers as immersers, or wild-type tRNAs transcribed in vitrowt This is performed using molecules. In these experiments, primers were Disease virus reverse transcriptase and [α-32P] For electroporation with dCTP More into cells. Radiolabeled dCTP facilitates analysis of the products of these reactions Included to do. In preparing target cells for in vivo cDNA synthesis reactions Attention is important, and primer-reverse transcriptase (and possibly modified Xynucleotide triphosphate or analog) Should be taken into account. Many alternatives exist, as will be apparent to those skilled in the art. This Some of these techniques have been described above and the electroporation in the examples below The use of options should not be deemed to limit the scope of the invention.   Electroporation of reaction components to target cells and incubation of cells After the reaction, the product of the reaction was extracted using a heart extraction technique (Hirt, B., J. Mol. Biol. 26: 365-369 (1. 967)) and completely digested with ribonuclease A. Pheno Quantification of uptake after extraction with ethanol / chloroform and ethanol precipitation Using a standard of known size, and using autoradiography The product is separated by examining the size of the product separated on an agarose gel. Analyze. Furthermore, the DNA product was treated using S1 nuclease treatment and RNase H treatment. Measure properties.   V.In vivo cDNA synthesis in insect cells.   Insect Sf9 cell line from American Type Culture Collection (ATCC) Obtain and maintain as recommended by the supplier. For in vivo cDNA synthesis 1x10 cells in Grace's medium7Suspend at a concentration of cells / ml.   Before electroporation, reverse transcriptase (1000 units), tRNA primer (5 μg) and [α-32P] The reaction components containing dCTP (50 μCi) were converted to dithiothreitol (D TT) (10 mM) mixed in a reverse transcription buffer (obtained from BRL) in a total volume of 50 μl, Then incubate at room temperature for 10 minutes. Next, Sf9 cells (5x106cell) Was added to the reaction components and the mixture was cooled to a cooled 0.4 cm Transfer to the uvette. Then electroporate to 200 V, 250 μF and infinite resistance Perform with an electroporator set to.   After electroporation, add 1 ml of warm Grace's medium to the cuvette. , Transfer the mixture to a plastic tube (Falcon # 2059). Then the mixture Incubate at 37 ° C. for 1 hour. Normal temperature to maintain Sf9 insect cell line Although at a temperature of about 25 ° C., obtaining modified enzyme activity is of primary concern.   After a 37 ° C incubation period, the cells are transferred to an Eppendorf Model 5415C microphone. Pellet by centrifugation for 5 minutes at setting 5 in Lofuge (or equivalent). To make The radioactive supernatant is carefully removed, treated appropriately, and 0.6% Add 1 ml of sodium decyl sulfate (SDS), 10 mM EDTA (pH 7.5) to the cell pellet . Immediately resuspend the pellet gently with a large-hole Pipetman P1000 tip (A portion of the tip is removed to increase the diameter of the hole, thus providing shear and Reduces DNA fragmentation). Place viscous lysate on ice for 5 minutes, then 5M Na Add 250 μl of Cl and invert the tube several times to mix. Then put the tube on ice . After the incubation period of this heart extraction (2-12 hours), the extract was Centrifuge at top speed for 20 minutes in a Toppendorf microfuge. Up The supernatant is removed from the pellet, which is discarded in radioactive waste, and the supernatant Separate the mixture between two new 1.5 ml microfuge tubes. These supernatants Is extracted twice with phenol / chloroform (1: 1) and once with chloroform . The nucleic acid fraction was then combined with 1/10 volume of 3M NaOAc and 1/6 volume of 2-propanol. Precipitate upon the addition of the phenolic acid. Rinse the pellet with 70% ethanol and then dry Let it. The pellet is dissolved in 18 μl of 1 mM Tris-chloride, 0.1 mM EDTA (pH 7.0). Re-suspend with. The resuspended nucleic acid fraction was treated with ribonuclease A (10 mg / ml of stock solution at 37 ° C for 15 minutes, followed by 30 µl of 1 mM Tris-clo Lido, 0.1 mM EDTA (pH 7.0) is added. The solution is then phenol / chlorophore Extract once with lume (1: 1) and then once with chloroform. Next, the nucleic acid flux The solution is precipitated by the addition of 1/10 volume of 3M NaOAc and 2 volumes of ethanol. Pe Rins are rinsed with 70% ethanol and dried. Cerenkov Cow A pellet is obtained for the dried pellet, the pellet is resuspended, and an aliquot is Count in the nunchland. The product is amplified using a radiolabeled molecular weight standard. Perform electrophoresis on a Galose / TAE gel. Next, the gel is stained with ethidium bromide, Dry and examine by autoradiography.   VI.In vivo cDNA synthesis in hamster cells.   A hamster CHO cell line was obtained from the ATCC and maintained as recommended by the ATCC. Carry. Prior to electroporation, CHO using trypsin / EDTA solution Cells are harvested from monolayer culture. Count the detached cells and rinse in PBS. Then 1x107Or 1x108Resuspend in PBS at 2 cells / ml. The reaction component is DTT (10 reverse transcriptase (1000 mM) mixed in a total volume of 50 μl in reverse transcription buffer (BRL) containing  Unit), tRNA primer (5 μg), and [α-32P] dCTP (50μCi) at room temperature And incubate for 10 minutes. After preincubation, 0.5 ml of CHO cells Add the mixture, mix the cells and immediately cool a 0.4 cm electroporation Transfer to cuvette. Electroporation is performed under the following conditions: 330V, 1000μF and infinite resistance. After electroporation, warmed COTwoequilibrium Add 1 ml of Ham's medium (Gibco) to the cuvette and pour the mixture into plastic. Transfer tube (Falcon # 2059) and incubate the mixture at 37 ° C for 1 hour. To   After the incubation period, the cells are transferred to an Eppendorf Model 5415C Micro Pellet by centrifugation for 5 minutes at setting 5 in a fuse (or equivalent). To The radioactive supernatant is carefully removed, treated appropriately, and 0.6% SDS (Sodium dodecyl sulfate) 1 ml, 10 mM EDTA (pH 7.5) is added to the cell pellet You. Immediately gently pour this pellet into a larger hole pipetman P1000 tip Resuspend again. Place viscous lysate on ice for 5 minutes, then add 250 μl of 5M NaCl Add and invert tube several times to mix. Then place the tube on ice. This heart After the extraction incubation period (2-12 hours), extract Centrifuge at top speed for 20 minutes in a microfuge. Pele the supernatant (Which is discarded in radioactive waste), and remove the supernatant into two Separate between new 1.5 ml microfuge tubes. Fenault these supernatants Extraction twice with chloroform / chloroform (1: 1) and then once with chloroform. next The nucleic acid fraction was combined with 1/10 volume of 3M NaOAc and 1/6 volume of 2-propanol. Precipitate on addition. The pellet is rinsed with 70% ethanol and dried. Pe The pellet is resuspended in 18 μl of 1 mM Tris-chloride, 0.1 mM EDTA (pH 7.0) I do. The resuspended nucleic acid fraction was treated with ribonuclease A (10 mg / ml stock solution 2). μl) for 15 minutes at 37 ° C., followed by 30 μl of 1 mM Tris-chloride, 0.1 mM Of EDTA (pH 7.0) is added. The solution is then diluted with phenol / chloroform (1: 1). Extract once and then once with chloroform. Next, 1/10 volume of nucleic acid fraction With 3M NaOAc and 2 volumes of ethanol. 70% pellet Rinse with ethanol and dry. Then, as described in Section V, A count is obtained for the dried pellets.   VII.In vivo cDNA synthesis in human cells   The human HeLa (HeLa) cell line was obtained from the ATCC and was as recommended by the ATCC. To maintain. Use a trypsin / EDTA solution before electroporation HeLa cells are harvested from monolayer culture. Count the detached cells and rinse in PBS And 1x107Resuspend in PBS with cells / ml. The reaction component is DTT (10 mM) Reverse transcriptase (1000 units) mixed in a total volume of 50 μl in reverse transcription buffer (BRL) containing Position), tRNA primer (5 μg), and [α-32P] dCTP (50 μCi) at room temperature Incubate for 10 minutes. Next healer cells (5x106) Add 0.5 ml to the reaction components And cooled the mixture to a cooled 0.4 cm electroporation cuvette. Orad). Then electroporate with the following settings: 33 0V, 1000μF and infinite resistance. After electroporation, warmed COTwo-Equilibrium Add 1 ml of Eagle's minimum essential medium (Gibco) to the cuvette and pour the mixture. Transfer to a stick tube (Falcon # 2059) and then incubate the mixture at 37 ° C for 1 hour. Incubate.   After the incubation period, the cells are harvested as described in Section V. And a Selenkov count is obtained on the dried pellets.   The following conditions were used to control in vivo cDNA synthesis reactions in all of the cell lines tested. Use as control: All reactions are [α-32P] dCTP 50μCi (about 3000Ci / Le). If present, add 1000 units of reverse transcriptase (MoMuLV; BRL) to the reaction mixture I do. For reactions requiring tRNA primers, add 1-10 μg of primer to cells Add to 0.5 ml and complex with all available reverse transcriptase Determined by the amount desired. Oligo (dT) primer is It preferably comprises an oligomer of 12 to 18 bases of dilic acid. If indicated, this Add 1 or 5 μg of the oligonucleotide primer to the reaction solution.   VIII.Product analysis   Dry the selenkov counts as described in Sections V, VI and VII. Can be obtained for pellets. The pellet can be resuspended (and Aliquots with scintillant) and agarose / TAE gel For electrophoresis. Molecular weight standards that radiolabel these gels Gels can be run and the gel stained with EtBr (FIGS. 5, 7, and 9), dried and examined by autoradiography (See FIGS. 6, 8, and 10).   The reaction product is treated with S1 nuclease to produce a polydeoxyribonucleotide product Investigate the nature of S1 nuclease digests double-stranded nucleic acid molecules to a limited extent However, the enzyme works most effectively on single-stranded nucleic acid substrates. Thus, in a single strand A certain (or single-stranded region) polynucleotide is treated with S1 nuclease (Sambr ook 1989) digests very quickly and completely. As seen in FIG. 10, S1 Nuku Samples treated with lease show no noticeable degradation when compared to untreated samples. Not shown (FIG. 10; compare lanes 2 & 3 and lanes 4 & 5). actually, Major cDNA product (about 1.9 kb in size) (this is the tRNAwtI obtained with the primer Appears during the in vivo cDNA synthesis reaction) before and after S1 nuclease treatment. (FIG. 10: compare lanes 2 and 3).   To further identify cDNA products in vivo, S1 nuclease treatment was Performed on parallel samples before and after creatase H treatment. Ribonuclease H is DNA-RNA It has the activity of digesting heteroduplex RNA strands. Double-stranded cDNA product is heteroduplex If so, treatment of the material with ribonuclease H, followed by S1 nuclease Treatment with zeolites will degrade the material and increase the molecular weight of the agarose / TAE electrophoresis gel. It will result in loss of autoradiographic signal in the dose range. This When performing these experiments, the reaction products were derived from the products of S1 nuclease treatment alone. Appears indistinguishable. However, RNase H and S1 nuclease treatment Experiments are repeated to remove heteroduplexes in cDNA products in vivo. There will be.   IX.Cloning of cDNA products synthesized in vivo   The double-stranded cDNA product from the above reaction was purified using recognized cloning techniques. To clone into a vector. Briefly, modify cells with modified tRNA primers, reverse Transcriptase, and [α-32P] dCTP (to track uptake) Put on poration. After electroporation and uptake, lift cells Work up as described in sections V, VI and VII above. Final pellet Rinse with 70% ethanol and dry. Pellets dried selenkov count The pellet, resuspend the pellet, and aliquot with scintillant. To Agarose / TAE gel using radiolabeled molecular weight standards And electrophoresis. The gel was stained with EtBr (see FIGS. 5, 7, and 9). , Dried, and examined by autoradiography (FIGS. 6, 8, and 10 See).   The second strand cDNA synthesis that occurs in this in vivo cDNA synthesis reaction It can be initiated by the 3 'end of the NA product. RNase activity depends on RNA template Acts during the digestion to release the 3 'end of the first strand cDNA product and direct the flanking sequence to this 3' end. Make it more susceptible to annealing. This is the in vitro (Okayama, H. et al.,Recombinant DNA Methodolog y , Academic Press, Inc., pp. 235-260 (1989)). Clonin at the end of the cDNA product In vivo cDNA reaction products should be S1 Treated with Lase, and prior to addition of the adapter or linker molecules, 4 Blunt with DNA polymerase and high concentration of dNTPs. S1 nuclease Should be diluted just before use, and the concentration used should be It is important to measure using a small portion of the cDNA product. RNase A treatment, extraction And after precipitation, the cDNA was converted to S1 nuclease buffer: 200 mM NaCl, 50 mM NaOAc (pH 4.5) 1 mM ZnSOFourResuspend in 0.5% glycerol and at 37 ° C. for 30 minutes Treated with approximately 100 units of diluted S1 nuclease per μg of cDNA (Kim mel, A.R., and S.L.Berger, Guide to Molecular Cloning Techniques, Acade mic Press, 328-329 (1987)). The reaction is stopped by adding EDTA to 20 mM. Product Extracted twice with buffered phenol / chloroform, then once with chloroform Extract. In a tube containing the aqueous phase, add 1/10 volume of sodium acetate and 2 Tanol is added and the reaction mixture is left at -70 ° C for 30 minutes. Cool tubes Centrifuge in microfuge for 15 minutes and discard supernatant. pellet Carefully rinse with 80% ethanol and dry in a speed bag (Savant) You.   The product is treated with T4 DNA polymerase in the presence of high levels of dNTPs to terminate the ends. Make sure it is blunt. Transfer the cDNA product to T4 DNA polymerase buffer (50m M Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM NaCl, 10 mM MgClTwo, 10 mM DTT) . Add the stock solution containing each deoxynucleotide triphosphate and add 500 Obtain a final concentration of μM. Then add 10 units of T4 DNA polymerase to a final concentration of 50 μl. And incubate the reaction at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction to 20 mM Stop by adding EDTA. Once again, extract the product, precipitate, and pellet The kit is rinsed and dried as described in Section V.   Then, an adapter or linker can be added to the cDNA product. Annealed hemiphosphorylated adapter (Promega: 5 'blunt of adapter Only the ends are phosphorylated), which removes the linker concatamer Adapter digestion and excess unbound without digesting the cDNA insert Would be advantageous in allowing cloning of cDNA products after elimination of the adapter Can be In addition, the excess needed to eliminate the “linker library” construct The step of removing the adapter involves sizing the cDNA prior to ligation to the vector. g) can be used as well.   An annealed, non-phosphorylated linker (Boehringer Ma And the excess unbound linker can be The product can be easily removed by heating for a short time between 60 ° C and 70 ° C. Wear. It melts unattached cohesive ends and attaches a linked linker CDNA products can be separated by column chromatography or gel electrophoresis. Can be.   Calculate the molar equivalent concentrations of the ends of the cDNA and the adapter, and add about a 20-fold excess An adapter or linker is used for the coupling reaction (Wu, R. et al., Meth. Enzymol. 1). 52: 343-349 (1987)). The binding reaction is performed as follows. Tube In a total volume of 20 μl, 2 μl of 10 × ligation buffer (666 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM MgClTwo, 100 mM DTT, 3 mM ATP, 10 mM spermidine-HCl, 10 mM hexamide Cobalt chloride, 2 mg / ml bovine serum albumin), hemiphosphorylated ada Add puter, double-stranded blunt cDNA, and 5 units of T4 DNA ligase. That The mixture is incubated at 15 ° C. overnight. Add PEG8000 Can be increased by addition. However, polyethylene glycol is not The packaging reaction and should be completely removed prior to these reactions. It is. Next, the binding reaction solution was applied to a Sephacryl S400 spin column having a bed volume of 1 ml. (Promega) and centrifuge at 800xg to remove excess adapters and adapters. Remove the adapter dimer. Separate allows for more accurate size selection of cDNA products The technique is agarose gel electrophoresis followed by cationic nitrocellulose (eg, And elution from DEAE nitrocellulose) or low-melting agarose Includes collecting directly from the collection section.   Quantify the cDNA using scintillation and calculate its molar end (quantity and And average size). Now, the cDNA insert is linked to the vector to be selected. (Slightly constrained by insert size and cohesive end compatibility) ). Once again, concatenation is performed as described above. Hemiphosphorylated adapter Or the use of non-phosphorylated adapters Is unlikely to happen. What is the only vector accessible phosphoryl This is because it has a modified end.   The binding reaction is then used for phage packaging or chemical conversion or Is diluted for electroporation. Appearing colonies or phages First, blue / white color selection (α complementation) for abundant genes, or probe Screen. In addition, random colonies or plaques are Using PCR with primers flanking the restriction site or by restriction digest analysis Check for insert size.   Using these general techniques, CHO using in vivo cDNA synthesis methods A library is constructed from cDNA made from cells. CH one of the libraries ORNA tRNAwtFrom in vivo cDNA product (approximately 1.9 kb) initiated by 8, see lanes 4 and 8), which were cloned prior to cloning with DEAE Nitrose Size selection on agarose gels using Lulose (NA45, S & S) capture / elution procedure Separate. Separate library for tRNA from CHO cellspolyUIn vivo c initiated Made from the DNA product and used for agarose gel electrophoresis between 4-10 kb Size-selection for cDNA.   tRNAwtThe cDNA product (approximately 1.9 kb) that appears in CHO cells due to primers is tested All CHO cell lines (Anderson, K.P. et al., Virol. 181: 305-311 (1991)). From conserved moderately repetitive C-type and cytoplasmic A-type particle (IAP) sequences May be representative of the sequence-specific priming and synthesis of These species are mouse leukemia It has extensive homology to the viral genome.   Example 2   I.A general method for assessing the suitability of primers for cDNA synthesis in vivo Method   Cell reverse transcriptase homologs containing modified ribonucleotide bases (see Figure 2B) The tRNA molecule initiates retroviral cDNA synthesis during viral replication. these The molecule has been demonstrated according to the present invention and has been previously studied in vitro (Barat, C. et al. Et al., Nucleic Acids Res. 19: 751-757 (1991); Weiss, S .; Et al., Gene 111: 183-197 ( 1992); Kohlstaedt, L.A. and T.A. Steitz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 965 2-9656 (1992)). I can't do that. In fact, fragments of a synthetic tRNA molecule that lack base modifications In vitro can anneal to RNA templates and in vitro cD NA synthesis can be induced (Weiss, S. et al., Gene 111: 183-197 (1992)).   In Drosophila, reverse transcription in copier retrovirus-like particles is Drosophila tRNAi MetOccurs from cleavage and initiation from molecules (Kikuchi, Y. et al., Pr. oc.Natl.Acad.Sci. USA 87: 8105-8109 (1990)). Therefore, the reverse transcriptase cognate tRNA The synthetic polynucleotide, a truncated analog of the primer molecule, It is clear that it can function similarly as a clear primer. CDNA in vivo Determining the suitability of a polynucleotide primer for a synthesis reaction is straightforward. Before As noted, primers may meet two important criteria. (a) Imbi (B) Synthesis of DNA complementary to the RNA template molecule Can act as a primer for at least one reverse transcriptase so that Any oligonucleotide is a true primer for in vivo cDNA synthesis of the present invention. is there. Experiments to qualitatively and quantitatively evaluate the suitability of promising primers This can be done using Chinese hamster ovary (CHO) cells (see Example 1 above). See).   In vivo assays are performed on cells by electroporation with [α-32P] dCTP , Putative primers, and the introduction of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase. You. As a control to assess the suitability of primers for in vivo cDNA synthesis, And the negative control described above.   1) [α-32P] Electroporation of dCTP alone   2) [α-32P] dCTP electroporation actual primer -The test reaction is   3) Along with “candidate” polynucleotide primer and reverse transcriptase [α-32P] dC It can consist of electroporation of TP. The positive control reaction is   4) modified tRNApolyUWith primer and reverse transcriptase [α-32P] dCTP Elec It can consist of troporation.   A hamster CHO cell line was obtained from the ATCC and maintained as described in Example 1. Carry. Prior to electroporation, CHO using trypsin / EDTA solution Cells are harvested from monolayer culture. Count the detached cells and rinse in PBS. Then 1x108Resuspend in PBS at cells / ml. The reaction components are reversed with DTT (10 mM) Reverse transcriptase (1000 units) mixed in a total volume of 50 μl in transcription buffer (BRL), t RNA primers (5 μg; or molar equivalents of candidate primers), and [α-32P] dCT Contain P (50 μCi) and incubate for 10 minutes at room temperature. Place Cube Show After the addition, add 0.5 ml of CHO cells to the mixture, mix the cells and immediately elect Transfer to the loporation cuvette. Perform electroporation under the following conditions. ：: 330V, 1000μF and infinite resistance. After electroporation, warmed COTwo Add 1 ml of equilibrium ham medium (Gibco) to the cuvette and mix the mixture with plastic Transfer to a tube (Falcon # 2059), then incubate the mixture at 37 ° C for 1 hour. To   After the incubation period, the cells are transferred to an Eppendorf Model 5415C Micro Pellet by centrifugation for 5 minutes at setting 5 in a fuse (or equivalent). And subjected to the extraction protocol as described in Example 1, Section VI. To obtain a selenkov count for the dried pellets.   Resuspend the pellet and count aliquots with scintillant. Radioactive sign Run the product on an agarose / TAE gel using the calibrated molecular weight standards . The gel is then stained with ethidium bromide, dried and analyzed by autoradiography. Check.   Interpreting the results   Labeling of final pellets from experiments with candidate polynucleotide primers Selenkov counting results for oxyribonucleotide incorporation The uptake seen in the positive control exceeds the uptake seen in the positive control Test primers may have initiated cDNA synthesis. Absent. However, the nature of the cDNA product is very important and should be investigated .   Therefore, the second criterion is a qualitative evaluation of the product, Obtained from 10 aliquots that were run in parallel with radiolabeled molecular weight standards Determined from the pattern and density of the resulting autoradiographic signal. Poly Whether the nucleotide primer is a different size RNA template, or 5 'of the RNA template molecule CDNA generation when designed to anneal to binding sites at different distances A heterogeneous population of objects is expected. However, if the primers Certain cDNA products should be generated when designed to anneal (See, for example, FIG. 8, lanes 4 and 5, and lanes 8 and 9). Therefore, probing both qualitative and quantitative parameters The potency of the mer should be measured.   Example 3   I.Generation of sequence-specific in vivo cDNA synthesis primers   The present invention also relates to a compatible reverse transcriptase and, if desired, a modified deoxynucleotide. Otide triphosphate or deoxynucleotide triphosphate analog Sequence-specific using a sequence-specific promoter introduced into cells in combination with In vivo cDNA synthesis reaction. These sequence-specific primers are As a transcript prepared from a mold or by chemical means (eg, on a solid support) Can be synthesized by   II.Chemical synthesis using solid support   Unmodified oligonucleotide and 2'-O-methyl oligoribonucleic acid The ability to chemically synthesize nucleotides in the solid phase in high yields makes the present invention useful for preparative and analytical applications. And can be easily adopted for therapeutic use. Modified oligoribonucleotide Synthetic techniques and reagents useful for production (eg, Spro, incorporated herein by reference) ut, B.S. et al., Nucleic Acids Res. 17: 3373-3386 (1989)) indicates that the RNA primer is D Some embodiments that could not be performed when produced in vitro from NA templates give. For example, 2'-O-methyl oligoribonucleotides are resistant to RNase activity (Sprout, B.S. et al., (1989); Inoue, H. et al., FEBS Lett. . 215: 327-330 (1987)). Therefore, instead of oligoribonucleotides, in vivo The use of these modified RNA molecules as primers for cDNA synthesis reactions in For RNase H catalyzed removal of cDNA synthesis primers (including any existing modifications) Provides resistance. These primers can then bind to fluorophores or haptens. , Can be biotinylated,32Can be P-labeled or after initial template-catalyzed hydrolysis of template Including sequence elements such as restriction sites occupied and incorporated during second strand cDNA synthesis (The 2'-O-methyl primer is the annealed complement of the initial RNA template. Minutes will be protected as well). These modifications are associated with a protein-associated primer. Does not appear to impair the ability of the hammer (Sprout, B.S. et al. (1989)), and Rigoribonucleotides anneal with the expected specificity. Elimination of 2'-OH group Base-catalyzes the RNA primer for the adjacent 3 ', 5'-phosphodiester bond ( It makes it more resistant to (nucleophilic) attacks, and it is resistant to various ubiquitous RNases.   III.Transcription from sequence-specific DNA templates   One embodiment that can produce the desired sequence-specific tRNA primer is generally described below. And in vitro transcription from a DNA template.   Initial casting for the generation of expression cassettes encoding sequence-specific tRNA primers Type is pUC18-T7tRNAwtIt can be a vector construct. This construct is a tRNAwtThe molecule (See FIGS. 2B and 3A). The first ply of the two primers The marker is located 5 'to the T7 promoter sequence in the pUC18 vector (Fig. Anneal to a sequence that extends 3 'towards the T7 promoter sequence. You. Commercially available primers are thus used for pUC18-T7tRNApolyUAmplification of expression cassette Used for   The second primer serves as an RNA template (eg, of a known sequence) for the in vivo cDNA synthesis reaction. RNA template), but not the sequence of the initial DNA template It may be desirable to include the base at the 5 'end of the primer (see FIG. 4). When). The remaining bases in the primers are pUC18-T7tRNAwtCoded in DNA vector At the same distance from the exact 3 'end of the tRNA template and the T7 promoter sequence Will be complementary to the bases in the DNA template extending in the 3 'direction (ie, this second The 20 bases at the 5 'end of the primer are complementary to the RNA target for in vivo cDNA synthesis. And then the remaining bases are encoded T7 tRNAs starting at 20 bases from their 3 'endwt Will be complementary to bases in DNA). This situation is illustrated in FIG.   Using these two primers in PCR, the amplified DNA T7 expression Replace the tRNA primers encoded in the set with the initial tRNAwtDuring the amplification process from the mold Desired tRNAspecificModify to a template (see FIG. 4). At the same time, The 5 'base of the immer is the resulting tRNAspecificForm the 3 'boundary of the cassette encoding I do. This cassette contains the 5 'sequence encoded in the second PCR primer, and TR with a 3 'end that is complementary to both RNA targets for in vivo cDNA synthesis reactions NAspecisicGenerates a molecule (see FIG. 4).   The PCR is performed in a volume of 20 μl according to the following conditions: PCR buffer: 67 mM bird (PH 9.2, 25 ° C), 16.6 mM (NHFour)TwoSOFour1.5 mM MgClTwo; 50ng each Limer, about 1x108Molecular pUC18-T7tRNAwtConstructs and 250 μM each Deoxynucleotide triphosphate. The reaction mixture is kept at 100 ° C for 3 minutes Heat and then cool to 15 ° C. Centrifuge the tube briefly to collect the contents, Next, add 1 unit of Taq polymerase and 1 drop of mineral oil to each 20 μl reaction. Add. The reaction is performed in the following regime for 40 cycles: 94 ° C. for 1 minute; then 55 ° C. For 1 minute. Product is pooled from 5 reactions and blunted with Klenow fragment Terminate, extract to remove proteins and trace mineral oils, and EtOH precipitation using a col. The fragment was treated with 1 mM Tris-chloride (pH 8.0 ), Resuspend in 0.1 mM DTA, and aliquot with standard of known size Check on 2% agarose / TAE gel to confirm size and quantify. Typical yield Is expected to be about 500 ng to 1 μg for each 20 μl reaction.   Then tRNAspecificMolecule with the above tRNApolyUIn vitro used to produce It is produced by the same transcription reaction as the transcription reaction. Simply put, RNase-free Eppe Add the following components at 25 ° C. to the tube: 80 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 12 mM MgClTwo, 20 mM DTT, 5 mM dNTP, 2 mM spermidine; RNase free dHTwoO; 50-100 μg / ml of template DNA and 5 μl of [α-32P] ATP (30 μCi; 3000Ci /  Mmol; added to examine and quantify the product). Mix the reactants, then The reaction to a T7 RNA polymerase enzyme reaction mix (final concentration of 1200-1800 U / ml). ). The tubes are then incubated at 37 ° C for 4 hours. Next RNase-free DNase to the reaction, and digest the template DNA for 15-30 minutes. Let go. At this point, a small amount of the reaction mixture is used to determine the efficiency of the uptake. Aliquots can be removed. (This is a capacity without excess RNase. By low-temperature trichloroacetic acid precipitation of an aliquot of the reaction mixture in the presence of It can be carried out. The control for this measurement, a total count, was precipitated from the same reaction mixture. Perform with substances that were not removed. ) Next, add 150 μl RNase to each of the reaction mixtures. DHTwoO and 20 μl of 3M NaOAc are added and the mixture is made up to an equal volume of phenol / CHClThree(pH 6.5), followed by CHClThreeExtract by Product with 2-propanol Allow the pellet to settle, rinse the pellet and dry the pellet. Primer product with RNase Not including dHTwoResuspend in O, and run on a standard of known size. Aliquot aliquots using autoradiographic exposure of a acrylamide / urea gel. Check for size. Purify and quantitate primers prior to introduction into cells. You.   This approach is a sequence-specific tRNA template for use with MoMuLV reverse transcriptase. Enables direct amplification of DNA cassettes used for in vitro generation of primers I do. The technology is a single sequence-specific DNA primer, 5 'universal primer And tRNA for cassette amplificationwtUse a DNA template.   Example 4   I.Use of sequence-specific primers to determine the ratio of splice variants in cells for   The ability to generate sequence-specific primers for use in in vivo cDNA reactions Researchers Real-Time “Snap” on Transcription Patterns Present in Target Cells or Tissues "Shot". This analytical target of in vivo cDNA synthesis technology Precautions when preparing cells should probably be for simple sorting (eg, cDNA library Construct), and the actual evaluation of RNA primer types, Immer-reverse transcriptase (and possibly modified deoxynucleotide triphosphate (Or analog) and the manner of delivery should be carefully considered. Step There are many alternatives for delivering the primer / enzyme complex, and The choices were outlined above.   Manufacture of DNA cassettes to enable in vitro generation of sequence-specific primers One technique for this is outlined in Example 3 above.   After such synthesis, the primer product was converted to RNase-free dHTwoAgain in O Polyacrylamide / urea gels that are turbid and run on standards of known size Check aliquots for size using autoradiographic exposure You. Prior to introduction into cells, primers are purified and quantified.   An alternative and more direct approach is described generally in Example 3, Section II. That is, chemically synthesizing an RNA primer on a solid support. This approach Not only allows direct synthesis of sequence-specific primers, but also detects cDNA products , Purification and / or modification (eg,32P-labeled, biotinylated, And / or sequence incorporation) that have been modified to be beneficial to Gives the opportunity to capture the rogue.   Cells are prepared in a manner that allows minimal variability to desired conditions, and Maximize the rate of delivery of reactive components and minimize stress on cells or tissues Use the delivery system that is evaluated to be the best.   In one such embodiment, sequence-specific primers, reverse transcriptase, And [α-32P] dCTP is added together in vitro briefly before addition to cells or tissues. Incubate for time (as described in Example 1 above). Cells or Is a DNA molecule that is complementary to a specific RNA template after introduction into a tissue. Incubate under conditions that allow for the synthesis of The controls for this reaction are: Including   1) [α-32P] Transmission of dCTP alone   2) [α-32P] dCTP transmission   3) In vitro transcribed with “wild-type” primer and appropriate reverse transcriptase In [α-32P] dCTP transmission   After extraction and purification as described above, the cDNA product is placed in a suitable radiolabeled size standard. Can be qualitatively examined by autoradiographic analysis of gels Can be. In addition, specific products are analyzed by scanning autoradiography on analytical electrophoresis gels. Liquid scintillation curer of band excised from fee or preparative electrophoresis gel It can be determined by counting. RNs not processed using PCR A The cDNA generated from the template can be detected.   Example 5   I.Multiple sequence-specific primers to measure the ratio of gene transcripts in cells use   The ability to generate sequence-specific primers for use in in vivo cDNA reactions Use a real-time “snapshot” of the target cell transcription pattern Detect turn and transcription levels, which are associated with a number of disease symptoms Also allows you to Internal control transcripts (eg, “housekeeping genetics” Identify the level of various oncogene transcripts relative to the level of offspring Is desirable from both a diagnostic and research perspective. PCR has been used in the past for this purpose Had been used but was unreliable at best due to problems that occurred during amplification. (Gilliland, G et al., (1990)).   Such uses of the invention and generation of sequence-specific primers in vitro Examples 3 and 4 above discuss the considerations for the DNA cassette production technology that enables Outline. The preferred approach in this embodiment is described in Example 3, Section II. Chemical synthesis of RNA primers on a solid support, as generally described, is there. This approach allows for the direct synthesis of different sequence-specific primers, And differential detection, purification and / or modification of the cDNA product (eg,32 P-labelling, biotinylation, and / or sequence incorporation). Opportunity to incorporate a modified ribonucleic acid analog into each primer I can.   After such synthesis, the different probe and control primer products are Not including dHTwoResuspend in O, and run on a standard of known size. Aliquot aliquots using autoradiographic exposure of a acrylamide / urea gel. Check for size. Prior to co-transfection into target cells or tissues, Purify and quantify.   Cells are prepared in a manner that allows minimal variability to desired conditions, and Maximize the rate of delivery of reactive components and minimize stress on cells or tissues Use the delivery system that is evaluated to be the best.   In one such embodiment, an oncogene sequence-specific primer and And actin sequence-specific primers as the probe primer and control, respectively. To use. These different primers, reverse transcriptase, and [α-32P] dCTP Briefly incubate together in vitro before addition to cells or tissues (As described in Example 1 above). After transfection, cells or tissues Incubate under conditions that allow the synthesis of DNA molecules that are complementary to the heterologous RNA template. To Controls for this reaction include:   1) [α-32P] Transmission of dCTP alone   2) [α-32P] dCTP transmission   3) With one primer of the desired RNA template and an appropriate reverse transcriptase [α-32P ] Transmission of dCTP   4) With each additional desired RNA template primer and appropriate reverse transcriptase Both [α-32P] dCTP transmission   After extraction and purification as described above, the cDNA product is placed in a suitable radiolabeled size standard. Qualitative investigation by gel autoradiographic analysis performed with substances be able to. In addition, the identity of a particular product, e.g., biotinylated The molecular weight standards can be verified and the gel transferred and The cells are treated with a streptavidin / alkaline phosphatase conjugate system (eg, (BluGENE), Bethesda Research Laboratories, Geysersburg, M D) can be examined using:   Example 6   I.Sequence-specific plasmids for cloning members of a particular gene family Use of Immer   The ability to generate sequence-specific primers for use in in vivo cDNA reactions Enables Researchers to Selectively Generate cDNA from RNA Templates Containing Specific Sequences To   Manufacture of DNA cassettes to enable generation of sequence-specific primers in vitro One technique for use is outlined in Example 3 above and used as described. obtain. Prior to introduction into cells, primers are purified and quantified.   A more direct alternative uses solid phase chemical synthesis techniques as described in Example 3. That is.   Cells are prepared in a manner that allows minimal variability to desired conditions, and Maximize the rate of delivery of reactive components and minimize stress on cells or tissues Use the delivery system that is evaluated to be the best. Some of these alternatives are Outlined in the detailed description of the invention.   First follow the analysis protocol. Products of the expected size or size distribution Once obtained, a preparative cDNA synthesis reaction can be performed.   [Α-32P] In vivo with dCTP Rapidly and quantitatively and qualitatively study the results of cDNA synthesis reactions .   In one experimental scheme, sequence-specific primers, reverse transcriptase, and [ α-32P] dCTP is described in Example 1 above, prior to addition to cells or tissues. And incubate together briefly in vitro. Cell or tissue Synthesis of a DNA molecule that is complementary to a specific RNA template after introduction into the cell or tissue Incubate under conditions that allow for Controls for this reaction include: I can see.   1) [α-32P] Electroporation of dCTP alone   2) [α-32P] dCTP electroporation 3) In vitro With the "wild-type" primer transcribed at32P] dC TP electroporation   After the above extraction and purification, the cDNA product was purified on an ethidium stained gel (FIG. 7, lane 4 and 8) or using appropriate radiolabeled size standards. Autoradiographic analysis of the gel obtained (see FIG. 8, lanes 4 and 8) ) Can be qualitatively examined. In addition, the level of uptake Aliquots of liquid scintillation, either by counting or after resuspension It can be measured by solution counting.   After the analytical test, a similar reaction was performed using radiolabeled deoxynucleotide triphosphate. Can be performed in the absence of (or using the reduced amount as a tracer) You. The number of reactions required to obtain the desired product is determined by previous analytical reactions. It is.   The cDNA product from the above reaction was prepared as described in Example 1, Section IX, Clone into a vector using recognized cloning techniques.   Example 7   I.Sequence specific primers for direct sequencing of in vivo cDNA products and 4 Use of some fluorescent dideoxynucleotide analogs   Has a separate fluorescence emission spectrum and is easily incorporated into DNA by reverse transcriptase Series of fluorescent dideoxynucleotide triphosphate analogs have been developed (Prober, J.M. et al., (1987)). Each analog is a specific dideoxy The nucleotide bases at the end of the nucleotide chain are replaced and incorporated into the DNA in a template-guided manner. In vivo modified dideoxynucleotides derived from sequence-specific primers The ability to incorporate the analog contains the desired 3 'sequence and is present in detectable amounts. Enables direct sequencing of RNA templates.   There are probably about 15,000 different transcripts in a typical eukaryotic cell (Sargent, T.D. (1987)). A sequence-specific primer is used to extend polyuridylic acid near the 3 'end (RN A designed to position the primer at the polyadenylation 3 'end of the template) If it is generated with a specific 8-base sequence at the extreme 3 'end that follows, only one cDNA products are generated from mRNA templates that are probably present in eukaryotic cells (0.258= 1/6 5,536).   Compatible reverse transcriptase, bio-11-dUTP deoxynucleotide analog (primer Is not biotinylated; Example 3; see Example 8 below) , And four fluorescent base-specific and spectral-specific dideoxynucleotides Along with the triphosphate analog (Prober, J.M. et al., (1987)), this modified tRNA probe The introduction of the primer (produced in a manner similar to the technique described in Example 3) Group of cDNA synthesis products, which are, for example, avidin-coated polystyrene (Baxter Healthcare, Mundelein, IL) or streptavidin Extract using concentrated beads, concentrate and dissolve by heating in gel loading buffer. Release and run on an analytical denaturing polyacrylamide gel. That gel The instrument is attached to a laser-equipped spectral identification fluorescence excitation and detection device. This It can be produced without the need for prior cloning, or even existing knowledge of the sequence. Allows direct DNA sequencing of expressed genes from the product. Of course, a single cDNA species A similar preliminary experiment ([α-32P] dCTP Incorporation and the absence of dideoxy chain terminal analogs) Wear. This was determined by autoradiography on an agarose / TAE electrophoresis gel. Can be confirmed after extraction.   To obtain DNA sequence information directly from in vivo cDNA products without cloning Another technique is to gel purify specific cDNA bands on a low melting point agarose gel. It is to be. These products are useful when using biotinylated primers. Currently recognized sequencing techniques including solid phase sequencing (Syvanen, A-C. Et al., FEBS L ett. 258: 71-74 (1989)). Used for cDNA synthesis The sequence-specific tRNA primer molecule to be used is the sequencing primer used in the reaction. Suggest.   Yet another useful approach is [α-32P] dNTP, biotinylated sequence specific TRNA primer, reverse transcriptase, and four dideoxynucleotide triphos Introducing one of the terminal molecules of the fate chain into the target cell. In this way, Perform four separate introductions, each with a different chain end dideoxynucleotide base Introduce. The cells are then incubated for a time and in a manner that allows for uptake. To A group of cDNA products can be used, for example, avidin-coated polystyrene (Baxter ・ Healthcare, Mundelein, IL) or streptavidin-conjugated beads Extract, concentrate, and load the sequencing gel just before loading the sequencing gel. Elute from the beads by heating in buffer. Then autoradiog the array It can be determined by Luffy.   In addition, these techniques can be used when cloned information is available. Allows a direct approach to determining the 5 'sequence of Specific 18 base primer sequence Selection does not create the time and difficulty of cloning the cDNA product, Specific sequencing of the cells.   Example 8   I.Incorporation of biotinylated dUTP during in vivo cDNA synthesis   Deoxynucleotide analogs can be incorporated into in vivo cDNA products Preparing and preparing biotinylated cDNAs, which may be beneficial in several important areas, Enable recovery. Specific biotinylated deoxynucleotide analogs identified And many candidate substrates exist (Klevan, L. and Gebeyehu, G., Meth. E-nzymol. 154: 561-577 (1987)). The example below illustrates one approach Used to identify or identify alternative methods or techniques for biotinylation of in vivo cDNA products. It should not be considered limiting. Alternatively, e.g., biomarking RNA primers DATP analogs during tinylation (see Example 3) or in vivo cDNA synthesis reactions Log N6Incorporation of-(-aminoalkyl) dATP followed by extraction and purification Min-labeled cDNA and reporter molecule, biotin-N-hydroxysuccinimide Te Response is a useful approach.   Hamster CHO cell lines are obtained from the ATCC and managed as recommended. Elek Prior to troporation, monolayer culture of CHO cells using trypsin / EDTA solution Remove from Count detached cells, rinse in phosphate buffered saline, and 1x108Resuspended in phosphate buffered saline at a concentration of cells / ml. The reaction component is DTT ( Reverse transcriptase (10 mM) mixed in a total volume of 50 μl in reverse transcription buffer (BRL) 00 units), tRNA primer (5 μg; may be sequence-specific, or Immer, for example, tRNApolyUBio-11-dUTP (0.03 mM or Is 0.3 mM final) and incubated at room temperature for 10 minutes. Plain cuvee After the addition, add 0.5 ml of CHO cells to the mixture, mix the cells and immediately cool. Transfer to a 0.4 cm electroporation cuvette. Electroporation Under the following conditions: 330 volts (V), 1000 microfarads (μF) and Infinite resistance. After electroporation, warmed COTwo1m equilibrium ham medium (Gibco) l to the cuvette and transfer the mixture to a plastic tube (Falcon # 2059). The mixture is then incubated at 37 ° C. for 1 hour. The incubation period Later, cells are transferred to an Eppendorf model 5415C microfuge (or equivalent). Pellet by centrifugation for 5 minutes in setting 5 and run the cDNA product in Recover as described in Example 1. Resuspend the biotinylated cDNA pellet. After turbidity, the product is electrophoresed on an agarose / TAE gel. Bio these gels Experiments can be performed with a tinylated molecular weight standard, and the gel transferred and stored. Leptoavidin / alkaline phosphatase conjugate system (eg, BluGENE system, Using the Suda Research Laboratories, Geysersburg, MD) Examine the lot.   The product can be purified from a preparative agarose gel, extracted, and The product was probed with an electron microscope (using streptavidin-gold), in situ Hybridization (streptavidin / alkaline phosphatase detection System (Chan et al. (1985)), construction of a subtractive library, and other fractionation. Can be used for purpose, analysis and therapeutic purposes.   Example 9   I.Biotinylated in vivo cDNA in constructing a subtractive library use   Induction specificity message before construction and screening of cDNA library, Or being able to increase the relative frequency of cell or tissue specific messages Strategic advantage, and often presented by low abundance mRNA Is the sole hope of identifying and recovering such genes (Hedrick, S. et al., Nature 308: 149). (1984)). Known elimination techniques use separation strategies. The single-stranded cDNA (mRNA selected from the desired cells, tissues or conditions). From extracellular mRNA extracted from another cell, tissue or condition. To Uses hydroxylapatite or other selective matrix Thus, the heteroduplex molecule is separated from the single-stranded cDNA (and mRNA).   Deoxynucleotide analogs can be incorporated into in vivo cDNA products This allows for the preparation and recovery of biotinylated cDNA.   One use of biotinylated cDNA products for this in vivo uptake is the elimination (sub) tractive) in library construction. This alternative technique for library construction is desirable Both the template and the subtracting template molecule are cDNAs, In that it allows for no hybridization and stability during the selection process. Superior to prior art. In addition, cDNA products may be produced in vitro. Generates from a small number of early cells, with fitness and processivity beyond the properties of the product Is done. This method is based on the cD of the first strand synthesis of cells grown or treated alternately. NA product and a biotinylated second-strand cDNA product of a cell population Depends on hybridization. Therefore, the biotinylated second strand The parameters must be estimated so that the effective product is obtained. Selection of reverse transcriptase etc. is important, and the amount of second strand product must be sufficient. For example, the synthesis of non-biotinylated in vivo cDNA is In conjugation with strand synthesis (using the introduction of biotinylated analogs), May be increased.   The incorporation reaction was performed as described in Example 3 or 8, or by another means. More can be done. The biotinylated cDNA is prepared under the conditions of the desired cDNA library. Produced in cells or tissues grown under external conditions. Extracted and isolated Otinylated cDNA product is treated with S1 nuclease to generate one or more hairpin structures (this Which can bind the first strand product from the second strand product) Shared genomic DN contaminated by column chromatography or gel electrophoresis A and grown under the desired cells or tissue, or another desired condition. Produced from isolated cells or tissues (and similarly separated from genomic DNA contaminants) Anneal to about 1/30 of the amount of unbiotinylated cDNA product). Le The hybridization conditions were 120 mM Na at a final DNA concentration of about 5 mg / ml. HTwoPOFour(pH 6.8), 820 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% SDS. The reaction mixture The mixture is heated to 90 ° C for 5 minutes and then kept at 65 ° C for 12-18 hours. The reaction solution was added to a phosphate buffer (120 mM NaHTwoPOFour, PH 6.8) and annealed Biotinylated cDNA containing the shared common cDNA sequence on a streptavidin column. Let go. The flow-through cDNA fraction is concentrated by ethanol precipitation and Using the methods and techniques allowed (Sambrook, (1989)). Example 10 I.HIV Derived from HIV sequence-specific primers to identify infected CD4 lymphocytes Introduction of fluorescent deoxynucleotide analogs during in vivo cDNA synthesis   Many fluorescent deoxynucleotide triphosphate analogs are commercially available Available, these have a unique fluorescence emission spectrum, Can be easily introduced into DNA. Each analog is based on a mold. Is introduced into DNA in a guided manner. This is guided by sequence-specific primers. The ability to introduce these modified deoxynucleotide analogs in vivo Of HIV-infected CD4 lymphocytes using flow cytometry A quick and direct way for This screening is for analytical purposes CD4 that can be used for or infected from uninfected CD4 lymphocytes Can be used to separate lymphocytes, thereby treating HIV-positive individuals A method is obtained.   Human immunodeficiency virus type I for use in in vivo cDNA synthesis of the invention Sequence specific primers are formed using the appropriate HIV specific sequence. SK69P One such PCR primer based on the sequence of the primer was prepared (Ou, C-Y  et al., Science 239: 295-297 (1988); Zack, J.A. et al., Cell 61: 213-222 (1 990), which is the following HIV env region: Corresponding to the HIV-specific tRNA primer used in the PCR described in Example 3. DNA cassettes for the production of DNA.   Alternatively, a PCR primer based on the M666 primer from Watoson & Wilburn (1992) Is also possible, this is the LAV-1 belowBRUUThreeregion: Corresponding to   The purified, tested and quantified primers are then applied to the appropriate method (especially MoMuLV reverse transcriptase using tropoporation and cationic lipid-mediated transfer). Sites with elemental and fluorescent deoxynucleotide triphosphate analogs Cain activation (Poli, G. and AS Fauci, AIDS Res. Hum. Retroviruses 8: 191 ( 1992)) Introduce into lymphocytes (fractionated or unfractionated) You. CDNA for any HIV-specific RNA template present in target cells The cells are incubated under the conditions necessary for production and for the required time. same Control reactions can be performed on such uninfected cell populations. Binds to the fluorophore Many nucleotide analogs can undergo spectral changes due to polymerization. It turns out that it is profitable. This allows cells that perform cDNA synthesis guided by the template And the control cell population.   The cells are washed, and then, if desired, an antibody against the CD4 molecule (eg, OK from ATCC). Incubate with T4) on ice for 30 minutes, wash and FITC-labeled F (ab ')Two Incubate with goat anti-mouse IgG. Wash the cells again and prepare Parameters required to excite and screen the fluorescent label (E.g. gating on cell size, fluorescence, and threshold spectra) )) Using Fluorescence Activated Cell Sorti ng, FACS). Appropriate parameters are negative control cell collection You can make decisions using groups.   When experiments were performed with anti-CD4 antibody (having a suitable alternative emission wavelength) These methods allow both quantification and separation of HIV-infected lymphocytes.   Alternatively, fix cells to make them permeable after in vivo cDNA synthesis and before testing Can be. However, this is not preparative and is primarily an analytical aspect.                                 Example 11                In vivo cDNA synthesis in monolayer cell cultures.   Conditions that maximize the transcript population (e.g., -Increases feron-induced gene transcription) in monolayer culture in 60 mm dishes The cells are grown to a density of 60-90%. Reaction components: reverse transcriptase (1000U), tRNA primer (2-5 μg) and [α-32P] dCTP (50μCi) in a total volume of 50-100μl And mix in reverse transcriptase buffer (BRL) containing DTT at room temperature for 10 minutes. Incubated. These components are combined with 3: 1 (w / w) DOSPA (2,3-dioleyloxy- N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminium (Trifluoroacetate): DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine) , 1: 1 (w / w) DDAB (dimethyl-dioctadecyl ammonium bromide): DOPE, Or 1: 1 (w / w) DOTMA (N- (1,2,3-dioleyloxy) propyl) -N, N, N-trimethyl Ammonium chloride): 0.5 ml in serum-free medium containing 50 μg of DOPE liposome And incubate the mixture at room temperature for 5-30 minutes. An additional 0.5 ml Add serum-free medium to the mixture. Aspirate medium and remove from cell monolayer, serum-free medium Wash this monolayer twice using. Drop the reaction mixture on the dish and immediately shake the dish The reaction mixture is then evenly applied to the monolayer. Shake the cells periodically to 37 ° C  COTwoAll areas of the monolayer during the 2 hour incubation in the incubator Are equally covered by the reaction mixture. Then 3 ml containing serum Of medium to the dish and return it to the 37 ° C. incubator for 1 hour. Or 2 hours After incubation, transfer the radiolabeled reaction to radioactive waste and remove the monolayer. Immediate recovery of the cDNA product after washing twice with phosphate-buffered saline Can also.   At the end of incubation, remove medium from monolayer and replace with 1.5 ml cold medium I do. Scrape the cells from the dish using a disposable policeman and place in a microcentrifuge tube (mic ro fuge). The remaining cells are washed from the dishes with 0.5 ml of medium and the medium Mix the ground with the cells. Eppendorf Model 5415C microcentrifuge (or equivalent) ) And centrifuge at 5 settings to pellet the cells. Beware of radioactive supernatant Remove deeply and dispose of properly. Perform Hirt extraction using the cell pellet and The ivo cDNA product is separated from the bulk of the genomic cellular DNA. Phenol / chloro Extracting proteins and other contaminants by form extraction followed by chloroform extraction The input is removed from the cDNA product. Next, the cDNA product is precipitated using standard techniques. In the hall.                                 Example 12                 In vivo cDNA synthesis in suspension cell culture   Grow cells in suspension culture and wait at regular intervals before starting the protocol. Split and ensure optimal viability. Reaction components: reverse transcriptase (1000U), tRNA Lymer (1-10 μg) and [α-32P] dCTP (50μCi) so that the total volume is 50-100μl Mix in reverse transcriptase buffer (BRL) containing DTT and incubate for 10 minutes at room temperature. To These components are combined with 3: 1 (w / w) DOSPA (2,3-dioleyloxy-N- [2 (spelled Mincarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoro (Acetate): DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), 1: 1 (w / w) DDAB (dimethyl-dioctadecyl ammonium bromide): DOPE, or 1: 1 (w / w) DOTMA (N- (1,2,3-dioleyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium Chloride): Dilute to 0.5 ml with serum-free medium containing 50 μg of DOPE liposome, and And incubate the mixture at room temperature for 5-30 minutes. Next, add another 0.5 ml serum-free Medium is added to the mixture. Pellet cells, aspirate media and remove from cell pellet Remove. The cell pellet is gently resuspended in serum-free medium and pelleted. Culture Aspirate ground to remove from cell pellet. Add the reaction mixture to the test tube and remove the tube. Immediately flick gently to resuspend the cell pellet in the reaction solution. 37 ℃ COTwo Cells are periodically lighted during the 1 hour incubation in the incubator. Shake and resuspend. Next, pre-heated COTwoWith serum equilibrated in Add 3 ml of medium to the cells, transfer the cells to a 60 mm dish (Falcon), and add Return to 37 ° C incubator for -4 hours. Or 1 hour incubation period After completion of the procedure, transfer the radiolabeled reaction to radioactive waste and Is washed twice with phosphate buffered saline and the cDNA product is immediately recovered You can also.   After the incubation period has ended, the Eppendorf Model 5415C microcentrifuge ( Or equivalent) and centrifuge at a setting of 5 to pellet the cells. Release Carefully remove the radioactive supernatant and discard appropriately. Hirt extraction using cell pellet In practice, the in vivo cDNA product is separated from the bulk of the genomic cellular DNA. Fe The extraction of the protein with knol / chloroform followed by chloroform extraction Quality and other contaminants are removed from the cDNA product. Then, using standard techniques, c Precipitate the DNA product.                                 Example 13                         Systemic in vivo cDNA synthesis   Adult mice were obtained from Jackson Labs, maintained under pathogen-free conditions, and Free access to water. In vivo cDNA reaction component: reverse transcriptase (1000U-5000U) , An IgG heavy chain-specific tRNA primer (2-20 μg), and [α-32P] dCTP (50-500μ Ci) in reverse transcriptase buffer (BRL) containing DTT to a total volume of 200 μl. And incubate at room temperature for 10 minutes. These components are combined with 1: 1 (w / w) DOTMA (N- (1,2,3-dioleyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride ): Dilute to 0.5 ml with serum-free medium containing 1 μmol DOPE liposome, and mix Incubate at room temperature for 5-30 minutes. The above 0.5 ml mixture is intraperitoneally Or inject slowly into the tail vein. Kill the mice after 4-24 hours. Heart, liver, brain, The pancreas, lymph nodes and spleen are removed and weighed. Scintillant tissue section Count with (scintillant) and correct the count value according to the weight of the tissue sample I do. Standardized counts were obtained for both spleen and lymph node tissue sections. high.   To visualize specific in vivo cDNA products, gently disrupt tissue and remove debris. And the cells are subjected to Hirt extraction. Using phenol / chloroform, Subsequent use of chloroform extracts episomal cDNA products. next Precipitate the cDNA product using standard techniques. Fractionation of cDNA products (eg, Electrophoresis on a buffered agarose matrix) and autoradiography Visualize with For use and incorporation of radiolabeled deoxynucleotides Alternatively, use fluorophores or hapten-conjugated deoxynucleotide analogs Can be introduced into (or labeled with primers), tissue sections (or extracted Product) or a second reagent directed to the incorporated analog. The position of the ivo cDNA product can be confirmed.                                 Example 14                       Primer-specific cell expression pattern   As shown in FIG. 13, modified cognate tRNA primers (specific polynucleotides) Sequence containing multiple polyuridylic acid residues in the 5 'to 3' terminal region having a tide sequence The retroviral reverse transcriptase complexed with () has a complementary linking sequence. Enzyme fragment on the RNA template molecule so that the fragment Coalesce closest to the polyadenylate site present on the mature messenger RNA It is located in the connection area.   Stringing in priming and converting mRNA templates to cDNA products Stringency is the statistical formula 1/4nApproximately matches. Where n = ply The number of specific bases added to the 3 'end of the polyuridylic acid region of the mer (e.g., For example, if the 5 bases following the 13-15 uridylic acid residue are sequence-specific,Five= Expected that 1/1024 messages will be primed and converted to cDNA Is done). If a cell expresses 10,000 different messages, About 10 products are primed and converted to cDNA products Expected to be.   The first specific polynucleotide template primer molecule may also be used for this purpose. Note that it can be used, and that it can be demonstrated to be advantageous in the following respects: Should. That is, (1) the first specific RNA template molecule is included in the protocol The base region of the first template molecule to a much broader base pattern. Can be specified to code. This is more energetically favorable and possible As a more distinctive annealing platform (from here the cellular message Priming can occur); and (2) It can be included in the first template primer molecule, which will initiate cDNA synthesis. Will increase efficiency.   Generated primers and cell-specific patterns (DNA template size and frequency) Of the reverse transcriptase and related RNase H activity used in the protocol. Selection, selection of nucleic acid analog to be incorporated into cDNA product, sensitivity of cDNA product detection method, Priming in regions other than the 3 'end on the mRNA template, and immature strand turnover There are other facts affecting the potential for transfer reactions, and the efficiency of cDNA synthesis It is important to note the other factors that affect For extraction, fractionation and detection This technique can then generate primer-specific cell expression patterns And If this pattern is generated using a specific primer sequence, Turns are specific to a cell or tissue type or stage of development. This pattern is Cellular perturbation (eg, transformation or infection), or It may be useful for diagnosing changes in response to the obtained stimulus. Change is making a pattern Can be characterized only by changes in the density of various cDNA products . This pattern technology is useful for diagnostic purposes and for evolving changes in cell populations. Would be a powerful tool for both tracking pedigree commitments.   Use fluorophores or hapten-linked deoxynucleoside triphosphate analogs Thus, detection of in vivo cDNA products can be enhanced. Or nucleus Use of enzyme-resistant (eg, 2'-O-methyl) and labeled primers in the reaction Can be.                                 Example 15                           in vivo antisense therapy   Guided in vivo cDNA synthesis is not available for the expression of specific cellular transcripts. Enables specific conversion to a new shape. Specific primer or VCE RNA template The primer can be prepared by any of a variety of means (see Examples 1, 11 and 13). When introduced into a cell, or when the cDNA product is Include a template primer molecule that is complementary to the annealing site (and Cognate modified tRNA primer that anneals in the 3 'terminal region of the template Defective retrovirus (complexed in the virus with the appropriate reverse transcriptase) When a cell is infected by a DNA element, the RNA template Conversion to a cDNA product may be due to processes required for normal cell use or expression. Effective removal of incoming transcripts. Furthermore, the use of enzymatic conversion is a simple hybrid A ditization (eg, antisense nucleotide) or cleavage step (eg, Unlike bozyme, it also provides efficient and stable conversion of the template to an inactive molecular form. Sprinkle. This offers further advantages. Because the product of the antisense reaction Can be easily detected, quantified, and evaluated. In addition, reverse transcriptase The VCE template primer molecule associated with the element or its complex With promoter elements (inducible or otherwise) that drive antisense expression in offspring Recombinant, defective, defined-tropic On or particle introduction will provide a means for continuous gene therapy.                                 Example 16   Encapsulation of regulatory elements encoded by the template into in vivo cDNA synthesis products   During proviral synthesis, reverse transcriptase binds to the viral genomic RNA template. When the 5 'end is reached, the first single-strand "minus-strand stop" ("minus-strand strong-stop ") cDNA product (see FIG. 11). This heteroduplex c DNA: After removing the RNA template portion of the RNA, the 3 'end ( This works to complement the "R" region near the 5 'end of the viral genomic RNA. Sequence located near the 3 'end of the viral genomic RNA portion. "Jump" or anneal to two "R" regions (for repetition) You. Next, cDNA synthesis proceeds once more, and eventually integrates into the host genome. Combination Results in the replication of the viral genome with terminal sequences important to This process For a review of the various processes involved in the process, see Varmus, H.E., Science 216: 812-821 (1992); Ilboa, E.S. et al., Cell 18: 93-100 (1979).   The first step in this strategy is to include the sequence to be converted into cDNA into the first RNA template. You can take advantage of it. Next, in provirus replication Thus, the first RNA template is hydrolyzed by reverse transcriptase-related RNase H activity, The remaining single-stranded cDNA has a sequence complementary to the 3 'end of the first cDNA molecule. Anneal to the polynucleotide template you have. Next, cDNA synthesis was resumed. The second template covalently binds to the first cDNA transcript in living cells. As shown in FIG. 12, this strategy allows access by inclusion of the desired vector sequence. It enables intracellular cloning of any functional RNA template molecule. First RNA casting The region of the polyadenylic acid residue at the 5 'end of the form is the polyadenylic acid residue in the original cDNA product. The thymidylate 3 'region, which can be any available polyadenylation message. Anneal with cooler RNA. As a result, cDNA library in vivo Synthesis and construction are possible. Alternatively, purify cDNA synthesis from specific transcripts. It is important to include a specific sequence at the 5 'end of the initial RNA template for imaging. it can. The choice of length and sequence for any polypurine region will depend on the strand binding prior to strand transfer. It is important to eliminate the onset of growth in advance. For the same reason, reverse transcriptase The choice of can also be important.   Reaction components: reverse transcriptase (1000 U), modified tRNA primer (1-10 μg) and [α-32 P] dCTP (50 μCi) was added to reverse transcriptase buffer containing DTT so that the total volume was 50-100 μl. Mix in buffer (BRL) and incubate at room temperature for 10 minutes. Then another 30-50 Vector control element (VCE) RNA template primer molecule using μl buffer (The amount depends on the size of the mold part), and the mixture is incubated at room temperature for another 5-10 minutes. Lab. The mixture is then electroporated or otherwise Conditions that can be introduced into viable eukaryotic cells and in which in vivo cDNA synthesis can occur And incubate the cells for 1 hour.   Alternatively, in one embodiment, the modified tRNA primer is added prior to adding the reverse transcriptase. Can be annealed to the VCE RNA template primer molecule. I However, more often, the modified transcriptase is modified before adding the RNA template molecule. A complex with the RNA primer can be formed.   The VCE RNA template primer is annealed by the modified tRNA primer. Having a first sequence to initiate cDNA synthesis and a second RNA template molecule 'Region designed to complement and anneal to the' region A row is included at the 5 'end. Modified tRNA primer that anneals to RNA template primer The number of 3 'nucleotide residues in the primer depends on the size and composition of the primer molecule. The VCE RNA template primer eliminates this constraint. This relaxation in the size of the primer complement region results in a specially designed single-stranded c Very efficient second priming of RNA template using DNA primers It becomes possible. In addition, this first RNA (GE or VCE) template primer , One or more of the following may be coded: A promoter operably linked to a gene conferring resistance for selection; Cre / lox site, a polycloning site containing a restriction enzyme recognition site; prokaryotic or true Origin of replication for nuclear cell replication; optional c inserted 3 'to promoter sequence A promoter (or "antisense" medium) operably linked to DNA. Promoter linked to any inserted cDNA to generate a message -); Transcription enhancers or tissue-specific regulatory elements; and generated from inserted sequences Product-encoding regions (eg, metal-binding Sequence or epitope tag; fusion protease).   After the incubation is complete, use an Eppendorf Model 5415C microcentrifuge (also The cells are pelleted at a setting of 5 using the equivalent). Radioactive Carefully remove the supernatant and discard appropriately. Perform Hirt extraction using cell pellet Thus, the in vivo cDNA product is separated from most of the genomic cellular DNA. Fenault Protein / chloroform extraction followed by chloroform extraction And other contaminants from the cDNA product. Then, using standard techniques, the cDN The A product precipitates.   Resuspend the cDNA product and direct second-strand cDNA synthesis or other in vitro It can be modified. The final product is treated under conditions favorable for intramolecular binding (dilute conditions). ). The cDNA product is then transformed into bacteria by Encoded by the gene or by the VCE RNA template primer molecule Standard to favor organism selection for the resistance conferred by a given gene Culture the bacteria under the conditions.                                 Example 17                           In vivo transcript location   Hapten uridine or deoxyuridine triphosphate conjugates (eg, , DNP or fluorophore (eg fluorescein-12-, tetramethylrhodamine-5-, T exas Red-5-, Cascade Blue-7-, BODIPY-FL-X-14, BODIPY-TMR-X-14-, and BO DIPY-TR-X-14-UTP or dUTP; Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)) , Nucleoside triphosphate or deoxynucleoside in enzymatic reaction Serves as a substrate analog of triphosphate. Deoxyuridine triphosphate Analogs can be incorporated into the cDNA during in vivo cDNA synthesis. De The choice of the oxynucleotide analog will depend on the application. Each fluorophore is linked to a fluorophore group Together they have specific spectral properties (both excitation and emission). And seed There may be differences in the cytotoxic or cell-inducing properties associated with the various analogs. further, Each fluorophore has a significant partitioning factor for various applications. This The latter parameter affects substrate availability in cells or tissues. , Contributes to background fluorescence after enzyme incorporation, and possibly to delivery systems Will limit your choices.   These analogs in combination with various delivery systems, or " The use of `` caged '' analogs results in detectable levels of RNA template molecules. Allows in vivo integration of the cDNA product into the containing cells. This delivery Can be directed to individual cells and tissues. Alternatively, the ingredients Can be introduced.   Sequence-specific primer molecules allow transcript identification. And radioactive markers Primers (or primers labeled with groups that absorb or emit at different wavelengths) Limers), and detectable nucleic acids incorporated during in vivo cDNA synthesis The combined use of a second primer, introduced together with the otide analog, is And dual or differential labeling of tissues.   In vivo labeled cDNA products can be detected by any number of means, including: Can be issued. FACS analysis of cells; autoradiography Or sectioning of tissues and animals, combined with fluorescence excitation; Use and detection of a second reagent directed to the targeted nucleotide analog; or Combinations of these methods (eg, the priming of a single primed cDNA product) Toradiography and fluorescence detection of a second cDNA product, or multiple cDNs (Differential emission spectrum for distinguishing A products).   Many of the fluorophore-linked analogs undergo spectral alterations when incorporated into polynucleotides. (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). And this is built Background signal from the unsubstituted substrate and the desired signal from the cDNA product. It can be used to advantage in distinguishing from the signal. After in vivo cDNA synthesis, If the unincorporated fraction of the labeled analog is not efficiently removed from the cells It is particularly advantageous.   "Caged" nucleotides (eg, dATP (2-nitrophenyl) -ethyl Esters, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon) are released as a result of photoactivation Are nucleotide analogs that can be used as enzyme substrates. Therefore As a result of photoactivation, there are changes in both physiological activity and membrane solubility. Mark Use of intelligent, caged nucleotide analogs with the cDNA synthesis of the present invention Then, light-guided cDNA synthesis and detection of the resulting cDNA product Will be possible.                                 Example 18                     Retrovirus packaging cell line   Gene transfer to eukaryotic cells using a replication defective retrovirus as an infectious vector Enter. Typically, sequences containing the gene of interest are required, but not Package in a cell line that expresses a trans-acting function that is missing from the ils template (Armentano et al., J. Virol., 61: 1647 (1987); Bender et al., J. Virol., 61:16. 39 (1987); Adam and Miller, J. et al. Virol., 62: 3802 (1988)). Retro virus Efficiency may be affected by signal positioning (Hatzo glou, M. et al., Human Gene Therapy 1: 385-397 (1990)). It appears to be more sensitive to orientation rather than position (Mann and And Baltimore, J .; Virol., 54: 401-407 (1983); Aronoff and Linear, J. et al. Virol. , 65: 71-80 (1991)).   Accompanying cell infection with a replication defective virus produced from a packaging cell line One of the many difficulties is that other differences packaged in the packaging Introduction of seed cell transcripts.   Heterologous cell transcription that can be packaged by cell lines expressing trans-acting functions The product is specific to the packaging signal with reverse transcriptase or its complex. Primer sequence (modified tRNA primer or first VCE RNA template primer) (Using a primer) can be effectively identified and removed. Can be Or, accidental mixing with the intended target packaging signal Primer sequences can also be designed to distinguish between incoming cell sequences .                                 Example 19                                 Gene therapy   Impairments in retrovirus-mediated gene therapy are required for packaging vectors Associated with recombinant viruses produced by cell lines that provide Including difficulties. In vivo cD using vector regulatory element (VCE) RNA template NA synthesis can be integrated or maintained as an episomal element Enables in vivo conversion of the RNA template to a proviral form. promotion Data element, centromere element, telomere element, replication origin, and other control elements of Encapsulation allows for control of the copy number of episomal elements, long-term meiosis and Provides fission stability.                                 Example 20                   Inclusion of components to promote cDNA synthesis   Encapsulation of other components in the reaction mixture was generated by an in vivo cDNA synthesis reaction. It may be useful in many embodiments to increase the efficiency of the resulting product. Les Torovirus nucleocapsid proteins and other retroviral proteins Proteins are important for dimer formation and packaging of the retroviral genome And these proteins are equally efficient in the method of the invention. (Aiyar, A. et al., J. Virol. 66: 2464- 2472 (1992); Kahn and Geidroc, J. et al. Biol. Chem. 267: 6689-6695 (1992); Prats , A.C. EMBO J. 7: 1777-1783 (1988)). All the effects of these additional ingredients Each embodiment will be evaluated. And encapsulation is the enzyme / ply used Combination and the cell or tissue target of the in vivo cDNA synthesis reaction. To some extent.   Thus, the present invention provides useful methods and compositions for cDNA synthesis. It has been shown. (a) Predicted for cDNA synthesis reaction using heterogeneous mRNA template population Deoxynucleotides to various sizes of polynucleotide fractions Otide introduction (see lanes 5, 9, 11, and 12 in FIG. 6 and lanes 5 and 9 in FIG. 8) , (B) that the reaction depends on the inclusion of both reverse transcriptase and primers (Fig. 6, lanes 3 and 5, lanes 7 and 9, lanes 3 and 5, lanes 7 and 9 in FIG. (C) that the reaction product is resistant to ribonuclease A treatment ( Even if the ribosomal RNA fraction present in the extract is completely digested) (Compare lanes 5 and 11, lanes 9 and 12 in FIGS. 5 and 6), and (d) The heterogeneous nature of the product results in a heterogeneous population of polyadenylated messenger RNA. Includes a modified tRNA primer designed to anneal to and prime off And a single dominant primer when using specific primers. Contrasting reactions (~ 1.9 kb) yielding cDNA products (Figures 7 and 8, lanes 4 and 5, and And lanes 8 and 9), as evidenced by The reaction was shown to proceed efficiently.   Also, some unrelated types of cells (all eukaryotic cells tried) , Sf9 (insect cells), CHO cells (hamster cells), Healer cells (human cells) ), Indicating that the in vivo cDNA synthesis reaction was successful.   In addition, (a) treatment with S1 nuclease caused significant degradation of the reaction product. (FIG. 10, compare lanes 2 and 3, lanes 4 and 5), (b) Treated with ribonuclease H and then with S1 nuclease (C) ribonucleic acid In vivo cDNA synthesis reactions occur when using reverse transcriptase that lacks Don't be afraid (a successful in vivo cDNA synthesis reaction digests and removes the original RNA template) It appears to be dependent in part on the ability of reverse transcriptase. The initial RNA template was It blocks the synthesis of the second strand in both toro and retroviral replication (T anese, N., et al. Virol. 65: 4387-4397 (1991)), and (d) the product is As evidenced by being cloneable using cloning methods The product of the in vivo cDNA synthesis reaction is clearly a double-stranded polynucleotide (double-stranded DNA Is most likely).   For all publications and patent applications cited herein, each It is specifically stated that publications and patent applications are hereby incorporated by reference. Each of which is expressly incorporated herein by reference.   The above invention is described in more detail by way of illustration and example for clarity and understanding. However, in accordance with the teachings of the present invention, departures are made from the concept or scope of the appended claims. It will be apparent to those skilled in the art that certain changes and modifications can be made to them without Will.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．複数のポリヌクレオチド鋳型分子の、共有結合した相補的ＤＮＡ複製物を合 成する方法であって： (a) 少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体に結合し、またｃＤＮＡ合成 が開始する部位を供給する第１領域、および該第１領域の５’側に位置し、ポリ ヌクレオチド鋳型プライマー分子のｃＤＮＡ産物が少なくとも一つの別のポリヌ クレオチド鋳型分子にアニールできるようにする第２領域とを含む該プライマー 分子を供給し； (b) 該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子の第１領域からＤＮＡ合成を開始す る少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体を供給し； (c) 該ポリヌクレオチド鋳型分子の存在下で該逆転写酵素または酵素複合体を含 む混合物を形成し；そして (d) 該ポリヌクレオチド鋳型分子に相補的な領域を含むＤＮＡ分子の合成を可能 にする条件下で該混合物をインキュベートすることを含む、該方法。 ２．該ポリヌクレチド鋳型分子の少なくとも一つがＲＮＡを含む、請求項１に記 載の方法。 ３．該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子が改変レトロウイルスＲＮＡ鋳型分 子を含む、請求項２に記載の方法。 ４．該改変レトロウイルスＲＮＡ鋳型分子のｃＤＮＡ産物がメッセンジャーＲＮ Ａ鋳型分子上でプライマー分子として機能する、請求項３に記載の方法。 ５．該レトロウイルスＲＮＡ鋳型分子が５’−末端においてポリリボアデニル酸 配列により改変されている、請求項４に記載の方法。 ６．該レトロウイルスＲＮＡ鋳型分子が改変モロニー(Moloney)マウス白血球ウ イルスＲＮＡ鋳型分子を含む、請求項４に記載の方法。 ７．該逆転写酵素複合体が、モロニーマウス白血球ウイルス逆転写酵素および合 成逆転写酵素−同族プライマートランスファーＲＮＡ分子を含む、請求項６に記 載の方法。 ８．該改変逆転写酵素−同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が、プライマ ー結合部位にアニールするであろう配列以外の配列を含むように３’−末端にお いて改変されている、請求項７に記載の方法。 ９．該ＲＮＡ鋳型プライマー分子が、改変ヘパドナウイルスプレゲノムＲＮＡ鋳 型分子を含む、請求項２に記載の方法。 10．該逆転写酵素が同族逆転写酵素を含む、請求項９に記載の方法。 11．該改変ヘパドナウイルスプレゲノムＲＮＡ鋳型プライマー分子が特定の結合 部位配列イプシロン（ε）以外の機能的配列を含むように第１領域において改変 されている、請求項９に記載の方法。 12．該混合物が生存可能な標的細胞内に形成される、請求項１に記載の方法。 13．該逆転写酵素またはその複合体が生存可能な標的細胞内に導入される、請求 項12に記載の方法。 14．該逆転写酵素が生存可能な標的細胞内で合成される、請求項12に記載の方法 。 15．該逆転写酵素またはその複合体、および該ポリヌクレオチド鋳型プライマー 分子が該生存可能な標的細胞内に別々に導入される、請求項12に記載の方法。 16．該逆転写酵素またはその複合体、および該ポリヌクレオチド鋳型プライマー 分子が該生存可能な標的細胞内に同時に導入される、請求項12に記載の方法。 17．該導入工程がエレクトロポレーションによって行われる、請求項16に記載の 方法。 18．該生存可能な標的細胞が真核細胞である、請求項12に記載の方法。 19．ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子であって、 少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体に結合し、またｃＤＮＡ合成が開 始する部位を供給する第１領域、および 該第１領域の５’側に位置し、該分子のｃＤＮＡ産物が別のポリヌクレオチド鋳 型分子にアニールできるようにする第２領域とを含む、該分子。 20．該別のポリヌクレオチド鋳型分子がメッセンジャーＲＮＡを含む、請求項19 に記載の分子。 21．該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子が改変レトロウイルスＲＮＡ鋳型分 子を含む、請求項19に記載の分子。 22．該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子が改変モロニーマウス白血球ウイル スＲＮＡ鋳型分子を含む、請求項19に記載の分子。 23．該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子が改変ヘパドナウイルスプレゲノム ＲＮＡ鋳型分子を含む、請求項19に記載の分子。 24．該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子の第２領域が、メッセンジャーＲＮ Ａ分子の３'ポリ（Ａ）尾部にアニールできる、請求項19に記載の分子。 25．該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子が、５’−末端においてポリリボア デニル酸配列で改変されたＲＮＡ分子を含む、請求項24に記載の分子。 26．該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子が、５’−末端においてポリリボア デニル酸配列で改変された改変モロニーマウス白血球ウイルスＲＮＡ鋳型分子を 含む、請求項25に記載の分子。 27．該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子が、５’−末端においてポリリボア デニル酸配列で改変された改変ヘパドナウイルスプレゲノムＲＮＡ鋳型分子を含 む、請求項25に記載の分子。 28．ポリヌクレオチド鋳型分子の相補的ＤＮＡ複製物を合成するためのキットで あって: (a) 少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体に結合し、またｃＤＮＡ合成 が開始する部位を供給する第１領域、および該第１領域の５’側に位置し、ポリ ヌクレオチド鋳型プライマー分子のｃＤＮＡ産物が別のポリヌクレオチド鋳型分 子にアニールできるようにする第２領域とを含む該プライマー分子の調製物；お よび (b) 該鋳型プライマー分子の第１領域から転写を開始し、そして該ポリヌクレオ チド鋳型分子に相補的な領域を含むＤＮＡ分子を合成する少なくとも１種の逆転 写酵素またはその複合体の調製物を含む、該キット。 29．該鋳型プライマー分子が、５’−末端においてポリリボアデニル酸配列で改 変された改変レトロウイルスＲＮＡ鋳型分子を含み、そして該逆転写酵素複合体 が同族逆転写酵素および同族ｔＲＮＡ分子である、請求項28に記載のキット。 30．該鋳型プライマー分子が、５’−末端においてポリリボアデニル酸配列で改 変された改変ヘパドナウイルスプレゲノムＲＮＡ鋳型分子を含み、そして逆転写 酵素が同族逆転写酵素である、請求項28に記載のキット。 31．該キットが、該ポリヌクレオチド鋳型分子の少なくとも一つの相補的ＤＮＡ 複製物の合成を完了させるために十分なデオキシヌクレオシドトリホスフェート をさらに含む、請求項28に記載のキット。 32．該キットが、得られる相補的ＤＮＡ分子を検出可能にするのに十分な量の少 なくとも一種のデオキシヌクレオシドトリホスフェート類似体をさらに含む、請 求項28に記載のキット。 33．該キットが、生存可能な標的細胞内に該調製物を導入するための試薬をさら に含む、請求項28に記載のキット。 34．ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子をコードする第１のＤＮＡ配列を含む ＤＮＡ分子であって、該プライマー分子は、少なくとも一種の逆転写酵素または その複合体に結合し、またｃＤＮＡ合成が開始する部位を供給する第１領域、お よび該第１領域の５’側に位置し、該分子のｃＤＮＡ産物が別のポリヌクレオチ ド鋳型分子にアニールできるようにする第２領域とを含む、該ＤＮＡ分子。 35．該ＤＮＡ分子が、第１のＤＮＡ配列の５’−末端に機能しうる形で連結され 、そして第１のＤＮＡ配列の転写を引き出すことができるプロモーター配列をさ らに含む、請求項34に記載のＤＮＡ分子。 36．合成ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子であって、その相補的ＤＮＡ産物 が天然に存在するＲ領域配列以外の部位で別のポリヌクレオチド鋳型分子にアニ ールし、そしてＤＮＡポリメラーゼ酵素が該ポリヌクレオチド鋳型分子に相補的 な領域を含むＤＮＡ分子の合成を開始するのを可能とする、該分子。 37．ポリヌクレオチド鋳型分子の相補的ＤＮＡ複製物を合成する方法であって： (a) 少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体に結合し、またｃＤＮＡ合成 が開始する部位を供給する第１領域、 該第１領域の５’側に位置し、該分子のｃＤＮＡ産物が、該第１領域によっ て結合された鋳型部分の３’側に位置するポリヌクレオチド鋳型の領域にアニー ルできるようにする第２領域、および 該第１領域の３’側に位置し、該第２領域の相補的ＤＮＡ産物が第３領域に アニールして、相補的ＤＮＡの合成を再び開始させるほど、該第２領域に配列が 十分に類似している第３領域、 を含む少なくとも一つのポリヌクレオチド鋳型分子を供給し； (b) 該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子の第１領域からＤＮＡ合成を開始す る少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体を供給し； (c) 該ポリヌクレオチド鋳型分子の存在下で該ポリヌクレオチド鋳型分子、およ び該逆転写酵素または酵素複合体を含む混合物を形成し；そして (d) 該ポリヌクレオチド鋳型分子に相補的な領域を含むＤＮＡ分子の合成を可能 にする条件下で該混合物をインキュベートすることを含む、該方法。 38．該ポリヌクレオチド鋳型分子がＲＮＡを含む、請求項37に記載の方法。 39．該ポリヌクレオチド鋳型分子が改変レトロウイルスＲＮＡ鋳型分子を含む、 請求項38に記載の方法。 40．該レトロウイルスＲＮＡ鋳型分子が改変モロニーマウス白血球ウイルスＲＮ Ａ鋳型分子を含む、請求項39に記載の方法。 41．該逆転写酵素複合体が、モロニーマウス白血球ウイルス逆転写酵素および合 成逆転写酵素−同族プライマートランスファーＲＮＡ分子を含む、請求項40に記 載の方法。 42．該改変逆転写酵素−同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が、プライマ ー結合部位にアニールする配列以外の配列を含むように３’−末端において改変 されている、請求項41に記載の方法。 43．該ＲＮＡ鋳型プライマー分子が、改変ヘパドナウイルスプレゲノムＲＮＡ鋳 型分子を含む、請求項38に記載の方法。 44．該逆転写酵素が該同族逆転写酵素を含む、請求項43に記載の方法。 45．該改変ヘパドナウイルスプレゲノムＲＮＡ鋳型プライマー分子が特定の結合 部位配列イプシロン（ε）以外の機能的配列を含むようにその第１領域において 改変されている、請求項43に記載の方法。 46．該混合物が生存可能な標的細胞内で形成される、請求項37に記載の方法。 47．該逆転写酵素またはその複合体が生存可能な標的細胞内に導入される、請求 項46に記載の方法。 48．該逆転写酵素またはその複合体のメンバーが、生存可能な標的細胞内で合成 される、請求項46に記載の方法。 49．該逆転写酵素またはその複合体、および該ポリヌレクオチド鋳型分子が該生 存可能な標的細胞内に別々に導入される、請求項46に記載の方法。 50．該逆転写酵素またはその複合体、および該ポリヌレクオチド鋳型分子が該生 存可能な標的細胞内に同時に導入される、請求項46に記載の方法。 51．該導入工程がエレクトロポレーションによって行われる、請求項50に記載の 方法。 52．該生存可能な標的細胞が真核細胞である、請求項46に記載の方法。 53．ポリヌクレオチド鋳型分子であって、 少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体に結合し、またｃＤＮＡ合成が 開始する部位を供給する第１領域、 該第１領域の５’側に位置し、該分子のｃＤＮＡ産物が、該第１領域によって 結合された鋳型部分の３’側に位置するポリヌクレオチド鋳型の領域にアニール できるようにする第２領域、および 該第１領域の３’側に位置し、該第２領域の相補的ＤＮＡ産物が第３領域にア ニールして、相補的ＤＮＡの合成を再び開始させるほど、該第２領域に配列が十 分に類似している第３領域を含む、該分子。 54．該ポリヌクレオチド鋳型分子が改変レトロウイルスＲＮＡ鋳型分子を含む、 請求項53に記載の分子。 55．該ポリヌクレオチド鋳型分子が改変モロニーマウス白血球ウイルスＲＮＡ鋳 型分子を含む、請求項53に記載の分子。 56．該ポリヌクレオチド鋳型分子が改変ヘパドナウイルスプレゲノムＲＮＡ鋳型 分子を含む、請求項53に記載の分子。 57．該ポリヌクレオチド鋳型分子が第２領域および第３領域に天然に存在するＲ 領域配列以外の配列を含み、そしてＤＮＡポリメラーゼ酵素が該ポリヌクレオチ ド鋳型分子に相補的な領域を含むＤＮＡ分子の合成を再び開始することを可能に する、請求項53に記載の分子。 58．ポリヌクレオチド分子の相補的ＤＮＡ複製物を合成するためのキットであっ て： (a) 少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体に結合し、またｃＤＮＡ合成 が開始する部位を供給する第１領域、 該第１領域の５’側に位置し、該分子のｃＤＮＡ産物が、該第１領域によって 結合された鋳型部分の３’側に位置するポリヌクレオチド鋳型の領域にアニール できるようにする第２領域、および 該第１領域の３’側に位置し、該第２領域の相補的ＤＮＡ産物が第３領域にア ニールして、相補的ＤＮＡの合成を再び開始させるほど、該第２領域に配列が十 分に類似している第３領域を含むポリヌクレオチド鋳型分子をコードするＤＮＡ 分子の調製物；および (b) 該鋳型分子の第１領域からＤＮＡ合成を開始し、そして該ポリヌクレオチド 鋳型分子に相補的な配列を含むＤＮＡ分子を合成する少なくとも一種の逆転写酵 素またはその複合体の調製物を含む、該キット。 59．該鋳型プライマー分子が、５’−末端においてポリリボアデニル酸配列で改 変された改変レトロウイルスＲＮＡ鋳型分子を含み、そして該逆転写酵素複合体 が同族逆転写酵素および同族ｔＲＮＡ分子である、請求項58に記載のキット。 60．該鋳型プライマー分子が、５’−末端においてポリリボアデニル酸配列で改 変された改変ヘパドナウイルスプレゲノムＲＮＡ鋳型分子を含み、そして該逆転 写酵素が同族逆転写酵素である、請求項58に記載のキット。 61．該キットが、該ポリヌクレオチド鋳型分子の少なくとも一つの相補的ＤＮＡ 複製物の合成を完了させるのに十分なデオキシトリホスフェートをさらに含む、 請求項58に記載のキット。 62．該キットが、得られる相補的ＤＮＡ分子を検出可能にするのに十分な量の少 なくとも一種のデオキシヌクレオシドトリホスフェート類似体をさらに含む、請 求項58に記載のキット 63．該キットが、生存可能な標的細胞内に調製物を導入するための試薬をさらに 含む、請求項58に記載のキット。 64．ポリヌクレオチド鋳型分子をコードする第１のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子 であって、該ポリヌクレオチド鋳型分子は、 少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体に結合し、またｃＤＮＡ合成 が開始する部位を供給する第１領域、 該第１領域の５’側に位置し、該分子のｃＤＮＡ産物が、該第１領域によって 結合された鋳型部分の３’側に位置するポリヌクレオチド鋳型の領域にアニール できるようにする第２領域、および 該第１領域の３’側に位置し、該第２領域の相補的ＤＮＡ産物が第３領域にア ニールして相補的ＤＮＡを合成を再び開始させるほど、該第２領域に配列が十分 に類似している第３領域を含む、該ＤＮＡ分子。 65．第１のＤＮＡ配列の５’−末端に機能しうる形で連結していて、第１のＤＮ Ａ配列の転写を引き出すことのできるプロモーター配列をさらに含む、請求項64 に記載のＤＮＡ分子。 66．合成ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子であって、その相補的ＤＮＡ産物 は天然に存在するＲ領域配列以外の部位で第２のポリヌクレオチド分子にアニー ルし、そしてＤＮＡポリメラーゼ酵素が該第１および第２ポリヌクレオチド鋳型 分子に相補的な領域を含むＤＮＡ分子の合成を開始できるようにする、該分子。 67．ＰＢＳ及びＲ配列を含む配列が代わりの機能的配列類似体で置換されており 、インビボ逆転写酵素ポリメラーゼ活性の鋳型として機能する改変レトロウイル ス鋳型分子を含む、組み換えＲＮＡ分子。 68．プライマー特異的な細胞発現パターンを生存可能な細胞内で生成する方法で あって： (a) ３’領域が細胞性ポリヌクレオチド鋳型分子のサブ集団に選択的にアニール するよう改変されている逆転写酵素−同族プライマートランスファーＲＮＡ分子 を供給し； (b) 該ポリヌクレオチド鋳型分子の第１領域からＤＮＡ合成を開始する少なくと も一種の逆転写酵素を供給し； (c) 該ポリヌクレオチド鋳型分子の存在下で生存可能な細胞内に該ポリヌクレオ チド鋳型分子および該逆転写酵素を含む混合物を形成し； (d) 該ポリヌクレオチド鋳型分子に相補的な領域を含むＤＮＡ分子の合成を可能 にする条件下で該混合物をインキュベートし；そして (e) プライマー特異的細胞発現パターンを生成させるために工程(d)で産生され たｃＤＮＡ産物を分析することを含む、該方法。 69．プライマー特異的な細胞発現パターンを生存可能な細胞内で生成する方法で あって： (a) 少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体に結合し、またｃＤＮＡ合成 が開始する部位を供給する第１領域、および該第１領域の５’側に位置し、該分 子のｃＤＮＡ産物が細胞性ポリヌクレオチド鋳型分子のサプ集団にアニールでき るようにする第２領域とを含むポリヌクレオチド鋳型プライマー分子を供給し； (b) 該ポリヌクレオチド鋳型プライマー分子の第１領域からＤＮＡ合成を開始す る少なくとも一種の逆転写酵素またはその複合体を供給し； (c) 該ポリヌクレオチド鋳型分子の存在下でポリヌクレオチド鋳型分子、および 逆転写酵素またはその複合体とを含む混合物を生存可能な細胞中に生成し； (d) 該ポリヌクレオチド鋳型分子に相補的な領域を含むＤＮＡ分子の合成を可能 にする条件下で該混合物をインキュベートし；そして (e) プライマー特異的細胞発現パターンを生成させるために工程(d)で産生され たｃＤＮＡ産物を分析することを含む、該方法。 70．生存可能な細胞中に導入されると、インビボでｃＤＮＡ合成を開始すること のできる組み換えウイルス粒子であって、 ウイルスパッケージングに必要な配列エレメントの機能的配列同等物、逆転写酵 素またはその複合体に結合する領域、およびｃＤＮＡ産物が第二のポリヌクレオ チド部位でｃＤＮＡ合成を再開させる５’配列を含むポリヌクレオチド鋳型プラ イマー分子を含む、該粒子。 71．ポリヌクレオチド鋳型分子であって、少なくとも一種の逆転写酵素またはそ の複合体に結合し、生物学的な選択、複製、および異種遺伝子の発現に必要な遺 伝子エレンメントをコードする配列を含む相補的ＤＮＡ複製物の合成のための鋳 型分子として働き、そしてその複製物がポリヌクレオチド分子上で少なくとも一 つの他の部位でｃＤＮＡ合成を再開させる、該分子。[Claims] 1. A covalently linked complementary DNA copy of multiple polynucleotide template molecules is combined. The method is to: (a) binding to at least one reverse transcriptase or a complex thereof, and cDNA synthesis; Region that provides a site for initiation of, and a polyregion located 5 'to the first region, The cDNA product of the nucleotide template primer molecule is at least one other polynucleotide A second region capable of annealing to the nucleotide template molecule. Supply molecules; (b) Initiating DNA synthesis from the first region of the polynucleotide template primer molecule Providing at least one reverse transcriptase or complex thereof; (c) containing the reverse transcriptase or enzyme complex in the presence of the polynucleotide template molecule; Forming a mixture; (d) A DNA molecule containing a region complementary to the polynucleotide template molecule can be synthesized. Incubating the mixture under conditions that result in 2. 2. The method of claim 1, wherein at least one of said polynucleotide template molecules comprises RNA. The method described. 3. The polynucleotide template primer molecule is a modified retrovirus RNA template component. 3. The method of claim 2, comprising a child. 4. The cDNA product of the modified retroviral RNA template molecule is messenger RN 4. The method of claim 3, wherein the method functions as a primer molecule on the A template molecule. 5. The retroviral RNA template molecule is polyriboadenylic acid at the 5'-end. 5. The method of claim 4, wherein the method has been modified by a sequence. 6. The retroviral RNA template molecule is a modified Moloney mouse leukocyte cell. 5. The method of claim 4, comprising an ils RNA template molecule. 7. The reverse transcriptase complex contains Moloney murine leukocyte virus reverse transcriptase and 7. The method of claim 6, comprising a reverse transcriptase-cognate primer transfer RNA molecule. The method described. 8. The modified reverse transcriptase-cognate primer transfer RNA molecule comprises a primer. At the 3'-end to include sequences other than those that will anneal to the binding site. 9. The method of claim 7, wherein said method has been modified. 9. The RNA template primer molecule is a modified hepadnavirus pregenomic RNA template. 3. The method of claim 2, comprising a type molecule. Ten. 10. The method of claim 9, wherein said reverse transcriptase comprises a cognate reverse transcriptase. 11． The modified hepadnavirus pregenomic RNA template primer molecule has specific binding Modified in the first region to include a functional sequence other than the site sequence epsilon (ε) 10. The method of claim 9, wherein the method is performed. 12． 2. The method of claim 1, wherein said mixture is formed in viable target cells. 13. Wherein the reverse transcriptase or a complex thereof is introduced into a viable target cell. Item 13. The method according to Item 12. 14. 13. The method of claim 12, wherein the reverse transcriptase is synthesized in a viable target cell. . 15． The reverse transcriptase or its complex, and the polynucleotide template primer 13. The method of claim 12, wherein molecules are separately introduced into said viable target cells. 16． The reverse transcriptase or its complex, and the polynucleotide template primer 13. The method of claim 12, wherein molecules are co-transfected into said viable target cells. 17． The method according to claim 16, wherein the introducing step is performed by electroporation. Method. 18． 13. The method of claim 12, wherein said viable target cell is a eukaryotic cell. 19. A polynucleotide template primer molecule, Binds to at least one reverse transcriptase or its complex and opens cDNA synthesis. A first area for providing a site to start, and Located 5 'to the first region, the cDNA product of the molecule is A second region allowing annealing to the type molecule. 20. 20. The additional polynucleotide template molecule comprises a messenger RNA. The molecule according to [1]. twenty one. The polynucleotide template primer molecule is a modified retrovirus RNA template component. 20. The molecule of claim 19, comprising a child. twenty two. The polynucleotide template primer molecule is a modified Moloney mouse leukocyte virus 20. The molecule of claim 19, comprising an SRNA template molecule. twenty three. The polynucleotide template primer molecule is a modified hepadnavirus pregenome. 20. The molecule of claim 19, comprising an RNA template molecule. twenty four. The second region of the polynucleotide template primer molecule is a messenger RN 20. The molecule of claim 19, which can anneal to the 3 'poly (A) tail of the A molecule. twenty five. The polynucleotide template primer molecule is a polyribonucleotide at the 5'-end. 25. The molecule of claim 24, comprising an RNA molecule modified with a denylic acid sequence. 26. The polynucleotide template primer molecule is a polyribonucleotide at the 5'-end. A modified Moloney mouse leukocyte virus RNA template molecule modified with a 26. The molecule of claim 25 comprising. 27. The polynucleotide template primer molecule is a polyribonucleotide at the 5'-end. Includes a modified hepadnavirus pregenomic RNA template molecule modified with a denylic acid sequence 26. The molecule according to claim 25. 28. A kit for synthesizing a complementary DNA copy of a polynucleotide template molecule There: (a) binding to at least one reverse transcriptase or a complex thereof, and cDNA synthesis; Region that provides a site for initiation of, and a polyregion located 5 'to the first region, The cDNA product of the nucleotide template primer molecule is A preparation of said primer molecule comprising: a second region allowing annealing of said primer molecule; and And (b) starting transcription from a first region of the template primer molecule, and At least one inversion to synthesize a DNA molecule containing a region complementary to the tide template molecule The kit comprising a preparation of a transcriptase or a complex thereof. 29. The template primer molecule is modified at the 5'-end with a polyriboadenylate sequence. Comprising a modified, modified retroviral RNA template molecule and the reverse transcriptase complex 29. The kit of claim 28, wherein is a cognate reverse transcriptase and a cognate tRNA molecule. 30. The template primer molecule is modified at the 5'-end with a polyriboadenylate sequence. Including altered modified hepadnavirus pregenomic RNA template molecule and reverse transcription 29. The kit of claim 28, wherein the enzyme is a cognate reverse transcriptase. 31. The kit comprises at least one complementary DNA of the polynucleotide template molecule. Sufficient deoxynucleoside triphosphate to complete replication synthesis 29. The kit according to claim 28, further comprising: 32. The kit comprises an aliquot of a small amount sufficient to render the resulting complementary DNA molecule detectable. Further comprising at least one deoxynucleoside triphosphate analog; The kit according to claim 28. 33. The kit further adds reagents for introducing the preparation into viable target cells. 29. The kit according to claim 28, comprising: 34. Including a first DNA sequence encoding a polynucleotide template primer molecule A DNA molecule, wherein said primer molecule is at least one reverse transcriptase or A first region that binds to the complex and provides a site where cDNA synthesis begins And the cDNA product of the molecule located on the 5 'side of the first region is another polynucleotide. A second region allowing annealing to the template molecule. 35. The DNA molecule is operably linked to the 5'-end of the first DNA sequence. And a promoter sequence capable of driving transcription of the first DNA sequence. 35. The DNA molecule of claim 34, further comprising: 36. A synthetic polynucleotide template primer molecule, the complementary DNA product of which is Is added to another polynucleotide template molecule at a site other than the naturally occurring R region sequence. And the DNA polymerase enzyme is complementary to the polynucleotide template molecule. Molecule that enables the initiation of the synthesis of a DNA molecule that contains a unique region. 37. A method for synthesizing a complementary DNA copy of a polynucleotide template molecule, comprising: (a) binding to at least one reverse transcriptase or a complex thereof, and cDNA synthesis; A first area that supplies the site where     Located 5 'to the first region, the cDNA product of the molecule is Anneal to the region of the polynucleotide template located 3 'to the joined template portion. A second area to allow     Located on the 3 'side of the first region, the complementary DNA product of the second region As the annealing anneals to restart the synthesis of the complementary DNA, the sequence in the second region A third region that is sufficiently similar, Providing at least one polynucleotide template molecule comprising: (b) Initiating DNA synthesis from the first region of the polynucleotide template primer molecule Providing at least one reverse transcriptase or complex thereof; (c) in the presence of the polynucleotide template molecule, the polynucleotide template molecule; and And forming a mixture comprising the reverse transcriptase or the enzyme conjugate; and (d) A DNA molecule containing a region complementary to the polynucleotide template molecule can be synthesized. Incubating the mixture under conditions that result in 38. 38. The method of claim 37, wherein said polynucleotide template molecule comprises RNA. 39. The polynucleotide template molecule comprises a modified retroviral RNA template molecule, 39. The method of claim 38. 40. The retroviral RNA template molecule is a modified Moloney mouse leukocyte virus RN 40. The method of claim 39, comprising an A template molecule. 41. The reverse transcriptase complex contains Moloney murine leukocyte virus reverse transcriptase and 41. The method of claim 40, comprising a reverse transcriptase-cognate primer transfer RNA molecule. The method described. 42. The modified reverse transcriptase-cognate primer transfer RNA molecule comprises a primer. -Modified at the 3'-end to include sequences other than those that anneal to the binding site 42. The method of claim 41, wherein 43. The RNA template primer molecule is a modified hepadnavirus pregenomic RNA template. 39. The method of claim 38, comprising a type molecule. 44. 44. The method of claim 43, wherein said reverse transcriptase comprises said cognate reverse transcriptase. 45. The modified hepadnavirus pregenomic RNA template primer molecule has specific binding Site sequence in the first region to include a functional sequence other than epsilon (ε) 44. The method of claim 43, wherein said method has been modified. 46. 38. The method of claim 37, wherein said mixture is formed in viable target cells. 47. Wherein the reverse transcriptase or a complex thereof is introduced into a viable target cell. Item 46. The method according to Item 46. 48. The member of the reverse transcriptase or its complex is synthesized in a viable target cell. 47. The method of claim 46, wherein the method is performed. 49. The reverse transcriptase or its complex and the polynucleotide template molecule are 47. The method of claim 46, wherein the method is introduced separately into a viable target cell. 50. The reverse transcriptase or its complex and the polynucleotide template molecule are 47. The method of claim 46, wherein the method is co-transfected into a viable target cell. 51. The method according to claim 50, wherein the introducing step is performed by electroporation. Method. 52. 47. The method of claim 46, wherein said viable target cells are eukaryotic cells. 53. A polynucleotide template molecule,   Binds to at least one reverse transcriptase or a complex thereof, and A first area for providing a site to start,   Located 5 'to the first region, the cDNA product of the molecule is Anneal to the region of the polynucleotide template located 3 'to the bound template portion A second area to allow; and   Located on the 3 'side of the first region, the complementary DNA product of the second region The more the DNA is neglected and the synthesis of complementary DNA is started again, the more the sequence is present in the second region. Said molecule comprising a third region resembling a minute. 54. The polynucleotide template molecule comprises a modified retroviral RNA template molecule, 54. The molecule of claim 53. 55. The polynucleotide template molecule is a modified Moloney mouse leukocyte virus RNA mold. 54. The molecule of claim 53, comprising a type molecule. 56. The polynucleotide template molecule is a modified hepadnavirus pregenomic RNA template 54. The molecule of claim 53, comprising a molecule. 57. The polynucleotide template molecule may have a naturally occurring R in the second and third regions. And the DNA polymerase enzyme contains a sequence other than the region sequence. To restart the synthesis of DNA molecules containing regions complementary to the template molecule 54. The molecule of claim 53, wherein 58. A kit for synthesizing a complementary DNA copy of a polynucleotide molecule. hand: (a) binding to at least one reverse transcriptase or a complex thereof, and cDNA synthesis; A first area that supplies the site where   Located 5 'to the first region, the cDNA product of the molecule is Anneal to the region of the polynucleotide template located 3 'to the bound template portion A second area to allow; and   Located on the 3 'side of the first region, the complementary DNA product of the second region The more the DNA is neglected and the synthesis of complementary DNA is started again, the more the sequence is present in the second region. DNA encoding a polynucleotide template molecule containing a third region similar to A preparation of the molecule; and (b) initiating DNA synthesis from a first region of the template molecule; and At least one reverse transcriptase for synthesizing a DNA molecule containing a sequence complementary to a template molecule The kit comprising a preparation of element or a complex thereof. 59. The template primer molecule is modified at the 5'-end with a polyriboadenylate sequence. Comprising a modified, modified retroviral RNA template molecule and the reverse transcriptase complex 59. The kit of claim 58, wherein is a cognate reverse transcriptase and a cognate tRNA molecule. 60. The template primer molecule is modified at the 5'-end with a polyriboadenylate sequence. Comprising an altered modified hepadnavirus pregenomic RNA template molecule, and wherein said reversal 59. The kit of claim 58, wherein the transcriptase is a cognate reverse transcriptase. 61. The kit comprises at least one complementary DNA of the polynucleotide template molecule. Further comprising sufficient deoxytriphosphate to complete the synthesis of the replica, The kit of claim 58. 62. The kit comprises an aliquot of a small amount sufficient to render the resulting complementary DNA molecule detectable. Further comprising at least one deoxynucleoside triphosphate analog; The kit according to claim 58 63. The kit further comprises reagents for introducing the preparation into viable target cells. 59. The kit of claim 58, comprising: 64. DNA molecule comprising a first DNA sequence encoding a polynucleotide template molecule Wherein the polynucleotide template molecule is     Binds at least one reverse transcriptase or its complex and synthesizes cDNA A first area that supplies the site where   Located 5 'to the first region, the cDNA product of the molecule is Anneal to the region of the polynucleotide template located 3 'to the bound template portion A second area to allow; and   Located on the 3 'side of the first region, the complementary DNA product of the second region The second region has sufficient sequence to negate and re-start synthesis of complementary DNA. The DNA molecule comprising a third region similar to: 65. Operably linked to the 5'-end of the first DNA sequence, wherein the first DN 64. The method according to claim 64, further comprising a promoter sequence capable of driving transcription of the A sequence. A DNA molecule according to claim 1. 66. A synthetic polynucleotide template primer molecule, the complementary DNA product of which is Anneals to the second polynucleotide molecule at a site other than the naturally occurring R region sequence. And a DNA polymerase enzyme binds the first and second polynucleotide templates. A molecule capable of initiating the synthesis of a DNA molecule comprising a region complementary to the molecule. 67. A sequence comprising the PBS and R sequences has been replaced with an alternative functional sequence analog Retrovirus that functions as a template for in vivo reverse transcriptase polymerase activity A recombinant RNA molecule, including a template molecule. 68. By generating primer-specific cell expression patterns in viable cells There: (a) The 3 'region selectively anneals to a subpopulation of cellular polynucleotide template molecules Transcriptase-cognate primer transfer RNA molecules that have been modified to Supply; (b) at least initiating DNA synthesis from the first region of the polynucleotide template molecule; Also supplies a kind of reverse transcriptase; (c) placing the polynucleotide in a cell that can survive in the presence of the polynucleotide template molecule; Forming a mixture comprising the tide template molecule and the reverse transcriptase; (d) A DNA molecule containing a region complementary to the polynucleotide template molecule can be synthesized. Incubating the mixture under conditions that: (e) produced in step (d) to generate a primer-specific cell expression pattern; Analyzing said cDNA product. 69. By generating primer-specific cell expression patterns in viable cells There: (a) binding to at least one reverse transcriptase or a complex thereof, and cDNA synthesis; A first region for supplying a site at which the first region starts, and a region located on the 5 'side of the first region, Child cDNA products can anneal to a subpopulation of cellular polynucleotide template molecules Providing a polynucleotide template primer molecule comprising: (b) Initiating DNA synthesis from the first region of the polynucleotide template primer molecule Providing at least one reverse transcriptase or complex thereof; (c) a polynucleotide template molecule in the presence of the polynucleotide template molecule, and Producing a mixture comprising reverse transcriptase or a complex thereof in viable cells; (d) A DNA molecule containing a region complementary to the polynucleotide template molecule can be synthesized. Incubating the mixture under conditions that: (e) produced in step (d) to generate a primer-specific cell expression pattern; Analyzing said cDNA product. 70. Initiating cDNA synthesis in vivo when introduced into viable cells A recombinant virus particle capable of Functional sequence equivalents of sequence elements required for viral packaging, reverse transcriptase A region that binds to the element or its complex, and the cDNA product is a second polynucleotide. Polynucleotide template containing 5 'sequence to resume cDNA synthesis at the peptide site The particle comprising an immer molecule. 71. A polynucleotide template molecule comprising at least one reverse transcriptase or That bind to the complex and are required for biological selection, replication, and expression of heterologous genes. A template for the synthesis of a complementary DNA copy containing a sequence encoding a gene element Act as a mold molecule and its replica is at least one on the polynucleotide molecule. The molecule that resumes cDNA synthesis at two other sites.
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