JPH10500573A - A rapid separation and identification method for contaminating microorganisms from composite matrices - Google Patents

A rapid separation and identification method for contaminating microorganisms from composite matrices

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JPH10500573A
JPH10500573A JP7530329A JP53032995A JPH10500573A JP H10500573 A JPH10500573 A JP H10500573A JP 7530329 A JP7530329 A JP 7530329A JP 53032995 A JP53032995 A JP 53032995A JP H10500573 A JPH10500573 A JP H10500573A
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コパトシス，アレクサンダー・デメトリオス
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イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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Abstract

(57)【要約】 食品のような複合マトリックスから標的微生物を分離および同定する方法が提供される。その方法は、水性二相高分子分離系を使用して、バックグラウンド菌叢に対して標的微生物の数を選択的に増強し、次いで、標的微生物の選択的増殖および同定を行う。 (57) Abstract: A method is provided for separating and identifying a target microorganism from a complex matrix such as food. The method uses an aqueous two-phase polymer separation system to selectively enhance the number of target microorganisms over background flora, and then to selectively grow and identify the target microorganisms.

Description

【発明の詳細な説明】 複合マトリックスからの汚染微生物の迅速な分離および同定方法 発明の分野 本発明は、汚染された複合マトリックス（ｃｏｍｐｌｅｘ ｍａｔｒｉｘ）か ら特定の微生物を分離および検出するための微生物学の分野、ならびに方法に関 する。より具体的には、本発明は、特定の標的微生物のメンバーを単離するため の水性二相高分子系の使用に関する。 背景 食品に保持される汚染細菌は、発展途上国と同様に先進国においても健康を害 する顕著なものである。例えば、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の食中毒 については２〜３百万例が、毎年、米国において発生すると試算されている。こ の疾病の急性症候は、悪心、嘔吐、下痢、悪寒、発熱および疲憊を含む。約２， ０００〜３，０００（０．１％）人が、毎年、米国においてサルモネラ中毒によ り死亡するが、これらの犠牲者は、幼児、病人および老人を含むのが普通である 。家禽、赤肉、海産食品、卵、およびこれらの生産物を含むすべての食品は、特 に、細菌性病原体を担持している可能性を有する。食品微生物学者への挑戦は、 しばしば、多数の種々の他の細菌群を含む食料品から少数のこれらの選択された 病原体を回収できるようにすることである。死滅寸前までに傷害を受けた細菌性 病原体の回収は、なお一層困難である。加熱、凍結、化学薬品および他の加工段 階は、食品中の病原細菌を死滅寸前まで損傷もしくは衰弱させることができる。 ５百万回以上のサルモネラの分析が、米国において年間実施されると試算され る。臨床、食品、酪農、環境、および水のサンプルにおける細菌性病原体の慣用 的検出は、少なくとも２種類の集積培養ブロスにおいて目的とする特定微生物を 増殖させることを必要とする。最初は、サンプルが、１種類のブロス（前集積） に添加され、次いで、一定温度で一定時間培養される。次に、このブロスの一定 量が、第２の種類の（選択的）集積ブロス中に添加され、次いで、一定温度で一 定時間培養される。集積過程の目的は、サンプル中の極端に低いレベルの病原体 を、検出に十分なレベルまで増殖させることである。例えば、２５グラムの食品 サンプル中には、わずか１個の生きているサルモネラ細胞が存在するだけかも知 れない。かくして、純粋培養アッセイ、免疫アッセイ、運動性固定アッセイおよ びハイブリダイゼーション・プローブアッセイのようなアッセイにおいて検出を 可能とするのに十分な高い濃度まで、サルモネラを増殖させることが必要である 。もっとも感度の高い免疫アッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイは、 一般に、集積培養において１ｍｌ当たり少なくとも１００，０００細胞、好まし くは１０，０００，０００細胞の存在を必要とする。 典型的には、食品に保持される細菌性病原体の同定は、３つの基本段階を伴う ： １．非選択的または前集積増殖： 一般に、食品サンプルは、先ず、ストマッカーまたはブレンダーを用いて、非 選択的、液体培地（前集積ブロス）中にホモジナイズされる。食品サンプルは、 すべてが病原体ではないが、広範なスペクトルの細菌を含有している。これらの 非病原菌叢は、検出されるべき病原種が標的 生物体として既知であるのに対して、バックグラウンド生物体として言及される 。しばしば、食品サンプル中に含有される標的生物体は、食品加工環境において 損傷を受けており、蘇生させるためには非選択ブロスが必要である。食品に応じ て、前集積の末期における標的対バックグラウンド生物体の比は、１：１から１ ：１００，０００までにわたることができる。サルモネラの典型的な前集積培地 は、若干の変更はあるが、Bacteriological Analytical Manual，6th Edition， Association of Official Analytical Chemists，Arlington，VA(1984)に記載の 種々の食品に対するラクトースブロスである。 ２．選択的集積： 次に、サンプルは、標的微生物の選択的増殖を促進する培地で培養される。こ の段階では、選択的な阻害試薬をさらに含んでもよい増殖促進培地において、サ ンプルがさらに集積させられる。標的生物体の連続増殖は、バックグラウンド細 菌の増殖を同時に抑制しながら達成される。 ３．選択平板培養： この段階は、バックグラウンド細菌の生育を抑制し、そして病原性標的である と考えられる純粋な分離したコロニーを肉眼的に識別できる固体選択培地を用い る。単離される「陽性の疑いのある」コロニーの相対的な数は、食品マトリック ス、そしてまた液体および固体培地の選択性に依って異なる。望ましくは、単離 されるべき疑いのある標的コロニーの数が、多数のバックグラウンドのコロニー の存在下に十分存在して、初期の生化学的確認、すなわち仮に陽性または陰性と 同定するための標的物の統計的選択を可能にすることである。 ４．仮定的同定： 陽性の疑いのあるコロニーは、さらに、適当な鑑別アガーに移植される。もし 、これらの試験が陽性であれば、そのコロニーは、仮定的に陽性と考えられ、次 いで、最終的確認と同定のために一連の生化学的および血清学的試験にかけられ る。かくして、慣用の方法を用いると、陽性の疑いのある信号は、３日以内に作 成でき、仮定的陽性は、４〜５日以内に、そして確認と血清学的同定は、５〜７ 日以内に行うことができる。 陽性の同定までには時間がかかるので、食品がもつ細菌性病原体を、より一層 迅速に陽性と同定する方法に対するニーズが存在する。例えば、もし、今、病原 体決定に要する増殖段階の一つが、取り除かれたり、または短縮することができ て、より迅速な同定が可能になれば、それは望ましいことであろう。本発明者は 、水性二相分配が、食品マトリックスからの汚染細菌の標的対バックグラウンド 比を選択的に高め、その結果、実際に、先に議論された先行技術の段階２に置き 換わる能力を有することを発見した。 水性二相分配技術は、粒子分離に対して長い間適用されてきた（Bronsted，J ．N．，Z ．Phys．Chem．Abt. A 257，(1931)）。Per-Ake Albertssonは、生物実 質の分離のためにその方法の潜在力を実現させた最初の一人である（Per-Ake Al bertsson，"Partition of cell particles and macromolecules"，3rd edition ，J．Wiley & Sons，(1986)）。Albertssonの仕事以来、水性二相系における分 配は、細胞表面の性質を明らかにしたり、決定するために、そして例えばタンパ ク質、酵素および核酸を分離するために使用されてきた。米国特許第4,980,065 号は、生化学剤および光学異性体の分離および精製に有用な水性二相系の使用を 教 示している。国際特許WO 90/05768は、汚染微生物を除去して工業滑沢剤を精製 するための高分子二相系の使用を記述している。 また、水性二相分配は、生物細胞分離のために、種々の方法で使用されてきた 。例えば、Johanssonら（Anal ．Biochem，155，215，(1986)）は、種々の生物実 質例えば、酵素、核酸、細胞オルガネラ、真核細胞、およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏ ｌｉ ）、サルモネラおよびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の菌株を含む細菌細胞の 分配のための水性二相系の使用の総説を提供している。同様に、Tortoliら（Eur ．J．Clin．Microbiol．Enfect．Dis ．12，425，(1993)）は、臨床標本からのミ コバクテリア単離のための水性二相系を開示している。 種々の生物細胞を分離する二相系の能力に関与するメカニズムは、液体系に接 する細胞壁もしくは細胞膜の生化学的組成に見いだされる変化に依っている。生 物細胞、特に細菌細胞は、さまざまの構造体や生化学高分子、例えば、細胞表面 に発現される線毛、鞭毛、タンパク質、酸性炭水化物およびリポ多糖をもってい る。構造体や生化学的化合物の種類、および細胞表面上のそれらの発現程度や濃 度は、物理化学的表面特性を決定する。異なる属、種もしくは菌株に属する細胞 は、他の細菌群からそれらを区別し、識別する異なる物理化学的表面特性をもつ 。例えば表面特性の一般的セットは、すべての細菌に共通するかもしれないが、 これらの特性の変化の程度は、その細胞集団をその他から識別するであろう。こ れらの性質は、表面電荷、疎水性／親水性、細胞密度、サイズおよび形状におけ る差異、ならびに、細胞が、他の細胞および／または他の種類の表面／界面（固 体、液体もしくは空気）に接する時に働く表面力を規定する「表面エネルギー」 を含む。二相系は、細菌細胞の表面特 性の間の差異を利用して、非常に近い関係にある菌株をも分離するために、独特 な適格性をもつ。例えば、Leviveら（J ．Liq．Chromatogr.，7，403，(1984)） は、表面特性が、長い多糖鎖と短い多糖鎖をもつリポ多糖分子の割合を除いては 、同一であるサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ ）の細胞を分離するために、向流分配クロマトグラフィーの使用を 教示している。 もっとも普遍的な水性二相高分子系の１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）およびデキストランを含む。ＰＥＧ−デキストラン系は、特に、細菌細胞の 分離に利用される。例えば、WO 9002948は、高分子二相系が、穀物産物における 真菌胞子もしくは細菌細胞の定量的または半定量的測定に有用であることを例証 している。さらに、Xiuら（J ．Gen．Microbiol.，129，3075，(1983)）は、異な る血清グループに属するサルモネラを分離するためのデキストラン−ポリエチレ ングリコールにおける水性二相分配の使用を開示し、そしてStendahlら（Acta P athol ．Microbiol．Scand．Sect．B Microbiol .，85，334，(1977)）は、平滑お よび粗面サルモネラ・チフィムリウムの表面電荷特性における差異を利用して、 ６．２％（ｗｔ／ｗｔ）デキストラン５００と４．４％（ｗｔ／ｗｔ）ポリ（エ チレングリコール）６０００の使用に続くフリーゾーン電気泳動によって細菌を 分離している。 上記方法は、緊密な関係にある細菌の分離に有用であるけれども、食品または 他の複合マトリックスから病原菌を単離、検出する問題に対して、水性二相系を 適用する努力はなされなかった。また、今日まで、水性二相系は、種々のバック グラウンド細菌集団からある細菌属のすべてのメンバーを分離するというよりも 、むしろ関連する細菌菌株を互いに 分離するために使用されてきた。本発明者は、水性二相高分子系が、バックグラ ウンド微生物から特定の標的細菌属の全メンバーを、分離、濃縮するのに適応で きることを発見した。標的病原体に関しては包含し、そしてバックグラウンド生 物体と複合マトリックスの他の要素に関しては排除するという両面をもつ本方法 の能力は、技術的に独特である。その上、二相分離は、実施にわずかな時間を必 要とするだけであるので、この方法は、かなりの培養時間を要する選択的増殖過 程を要求する従来の方法以上に、相当の時間の節減をもたらす。さらに、本発明 者は、二相分離系の使用が、慣用法によっては検出されない病原体のある菌株の 検出を可能にすることを発見した。それ故、汚染されたマトリックスからの病原 体の分離および同定のための水性二相高分子分離技術の使用は、微生物検出技術 における重要な進歩を表すものである。 発明の概要 本発明は、次の段階を含む、複合マトリックス内に含まれる標的微生物の分離 方法を提供する： ｉ）該複合マトリックスをホモジナイズし、そして、前集積培地の存在下、該 複合マトリックスを培養して、該標的微生物を蘇生し、増殖させ、それによって 該複合マトリックス中の該標的微生物の数が増強させる段階； ｉｉ）段階ｉ）の該増強された複合マトリックスのサンプルを、少なくとも１ 種の水性高分子二相分離系中に乳化させる段階；ならびに ｉｉｉ）該乳化系を上相と下相に分離させ、それによってサンプルからの著量 の該標的微生物が、該上相か該下相のいずれかに見い出す段階。 また、本発明は、次の段階を含む、複合マトリックス内に含まれる標 的微生物の分離および検出方法を提供する： ａ）該複合マトリックスをホモジナイズし、そして、前集積ブロスの存在下、 該複合マトリックスを培養して、該標的微生物を蘇生し、増殖させ、それによっ て該複合マトリックス中の該標的微生物の数が増強させる段階； ｂ）段階ａ）の該増強された複合マトリックスのサンプルを、少なくとも１種 の水性高分子二相分離系中に乳化させる段階； ｃ）該乳化された系を上相と下相に分離させ、それによってサンプルからの著 量の該標的微生物が、該上相か該下相のいずれかに見い出す段階；ならびに ｄ）著量の該標的微生物を含む段階ｃ）の相から一定分量を採取し、そしてそ の一定分量中の該標的微生物の存在を検出する段階。 その好適な実施態様では、標的微生物が細菌であり、複合マトリックスが食品 であり、そして水性二相系がＰＥＧ／デキストランである。 図の簡単な説明 図１は、いずれかの二相液体高分子系に関する典型的な相図である。 図２は、上相および下相の高分子組成を決定する方法を例証する、いずれかの 二相液体高分子系に関する典型的な相図である。 図３は、ＰＥＧ（６０００）およびデキストラン（５００）系の相図である。 図４Ａは、種々の量のＮａＣｌを含むＰＥＧおよびデキストランにおけるＥ．コ リ菌株の二相分離のプロットである。 図４Ｂは、種々の量のＮａＣｌを含むＰＥＧおよびデキストランにおけるクレ ブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）菌株の二相分 離のプロットである。 図５は、フィードポイント組成における種々の量のＮａＣｌによる、Ｅ．コリ およびクレブシエラ・オキシトカの二相分離の結果を図示する。 図６は、汚染された複合マトリックスからの標的病原微生物単離のための単系 列の二相分離法を図示する。 図７は、汚染複合マトリックスからの標的病原微生物単離のための２系列の二 相分離法を図示する。 図８は、前集積培地における混合菌の増殖時から二相分離スキムの末期までの 、Ｅ．コリ、Ｅ．クロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）およびＣ．フロインディイ （Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）の混合集団の存在下で、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔ ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ）の標的細菌対バックグラウンド細菌比における縮小を示 すデータである。 図９は、前集積培地における混合菌の増殖時から二相分離スキムの末期までの 、摩砕牛肉中に接種されたＳ．チフィムリウムの標的細菌対バックグラウンド細 菌比における縮小を示すデータである。 図１０は、前集積培地における混合菌の増殖時から二相分離スキムの末期まで の、乾燥ミルク中に接種されたＳ．チフィムリウムの標的細菌対バックグラウン ド細菌比における縮小を示すデータである。 図１１は、前集積培地における混合菌の増殖時から二相分離スキムの末期まで の、摩砕牛肉、鶏肉、摩砕七面鳥および豚肉ソーセージ中に接種された多数のサ ルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種の標的細菌対バックグラウンド細菌比にお ける縮小を示すデータである。 発明の詳細な記述 本明細書で使用される場合、次の用語は、請求の範囲および明細書の解釈のた めに使用されてもよい。 用語「マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）」または「複合マトリックス（ｃｏｍｐ ｌｅｘ ｍａｔｒｉｘ）」は、種々の微生物の生育を支えるであろうすべての有 機または無機物質を指すであろう。本発明のマトリックスは、事実上複合物であ り、そして種々の生物の成長を支える種々の物質からなるであろう。典型的なマ トリックスは、食品材料、生物組織、有機廃棄物、排泄物、血液、土壌、地下水 、汚水およびそれに類するものの成分を含む。 本明細書で使用される場合、用語「ストマッカー（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）」ま たは「ホモジナイザー」または「ブレンダー」は、互換可能に使用され、そして 微生物と食品マトリックスを徹底的にブレンドおよび混合することができる機器 を指すであろう。「ホモジナイズする」ことは、複合マトリックスが、小さいか なり均一な物質片に破砕されるように、機械的にブレンドまたは混合することを 意味する。マトリックスが、既に微粒子状にされている場合には、「ホモジナイ ズ」段階は、マトリックスの単なる撹拌または混合によって行われて、微生物の 均一な分布が達成される。 用語「水性二相系」または「水性高分子系」または「二相系」は、激しい混合 により、２種の高分子の分子構造、イオン的および静電的性質の間の差異に基づ いて２相に分離するであろう、すべての２種の水溶性高分子の組み合わせを指す であろう。普通の二相水性高分子系は、他の高分子も可能であり、しばしば使用 されるけれども、ポリエチレングリコールおよびデキストランを含んでなる。他 の典型的な二相系は、それには限定されないが、ヒドロキシプロピル澱粉−ＰＥ Ｇ／Ｈ2Ｏ；フィコール−ＰＥＧ／Ｈ2Ｏ；フィコール−デキストラン／Ｈ2Ｏ； ポリビニ ルアルコール−デキストラン／Ｈ2Ｏ；カルボキシメチルデキストランナトリウ ム−ＰＥＧ−ＮａＣｌ／Ｈ2Ｏ；ＰＥＧ−リン酸カリウム／Ｈ2Ｏ；および高分子 両性電解質アクリル酸コポリマーを含んでもよい。いずれか１つまたは両方の高 分子が、非イオン性か高分子電解質のいずれかである場合、または高分子の１種 が、低分子量成分により置換できる場合には、さらに、その他の組み合わせ物も 可能である。 多相、好ましくは二相水性系は、単回でも、または連続「向流」系の部分とし て使用されてもよい。ここに使用される用語「向流分離」は、水性二相系の少な くとも２段階が使用される場合、および乳化が実施され、平衡が達成された後、 各段階における高分子の相対重量％組成が同じである場合の二相水性分配を指す であろう。この方式では、目的の標的生物体に対するより高い選択性が得られる 。用語「標的微生物」または「標的生物体」または「標的細菌」は、本方法によ って単離され、同定されるべき微生物を指すであろう。標的微生物は、原核生物 か真核生物のいずれでもよく、そして合成された混合培養のメンバーでもよいし 、また複合マトリックス中の汚染菌として存在してもよい。特に興味ある標的微 生物は、食品に保持される細菌である。 用語「バックグラウンド微生物」または「バックグラウンド細菌」または「バ ックグラウンド生物体」は、標的生物体の存在下に見いだされるが標的生物体で はないすべての生物体を指すであろう。標的生物体と同様に、バックグラウンド 生物体は、原核生物か真核生物かいずれでもよく、そして標的生物体に、遺伝的 または生化学的に関連していても、関連しないなくてもよい。本発明の文脈上、 もっとも興味あるそれらのバックグラウンド生物体は、食品に保持される細菌で ある。用語、あ るサンプルの「著量の標的微生物」は、そのサンプルからの過半数の標的生物体 を意味する。 用語「選択増殖培地」は、標的生物体の増殖を増強し、バックグラウンド生物 体の増殖を抑制するために、特別に作成された固体か液体かいずれかの増殖培地 を指すであろう。その上、選択増殖培地は、標的生物体の検出を、一般に肉眼観 察によって容易にするように計画された成分を含有してもよい。 用語「前集積培地」は、標的およびバックグラウンド両微生物の増殖を促進す るよう計画された液体か固体かいずれかの培地を指すであろう。微生物は、存在 するすべての微生物数を増強させるために前集積培地に接種され、培養され、そ して初期のサンプル処理において損傷を受けたかもしれないすべての標的生物体 を蘇生させる。本発明の前集積培地は、種々の食品マトリックスのｐＨにおける 変化を許容するよう緩衝化されるであろう。 用語「集積」または「増強」培養物は、標的および非標的微生物数が増加する 前集積培地における培養後に得られる培養物を指すであろう。 用語「フィードポイント組成」は、混合および乳化前の、そして存在する各高 分子成分の全重量％に基づき、そして相図に基づいて計算された、少なくとも２ 種の液相高分子の始発組成を指すであろう。 本発明は、複合マトリックスからの標的微生物の迅速な単離および同定方法を 提供する。標的微生物を含むと疑われるマトリックスのサンプルは、最初に、ホ モジナイズされ、次いで、前集積培地に接種される。前集積培地における培養は 、バックグラウンド微生物と検出されるべき標的微生物の両方の数を増強するの に役立つ。十分な培養時間の後、集 積培養のサンプルは、典型的にはＰＥＧとデキストランを含む二相向流二相水性 高分子系による分離にかけられる。二相系で行われる分離は、バックグラウンド 上の標的生物体を単離（すなわち、優先的に選択）し、同定操作を容易にするの に役立つ。 同定過程は、本好適な実施態様におけるように、選択的平板培養と肉眼的同定 を用いて遂行できる。しかしながら、同定の別法は、例えば、同種またはハイブ リダイゼーションアッセイ用の十分な標的ＤＮＡを得るためのポリメラーゼ連鎖 反応のような遺伝子増幅技術；または例えばＥｌｉｓａ型アッセイを用いる抗体 検出法を含むであろう。 標的集積： 食品に保持される細菌病原体の検出に関する最小工業基準は、食品マトリック ス２５ｇ中１個の病原細胞の存在を確実に検出する方法である。この厳格な試験 に適合するために、生化学的、免疫学的または核酸ハイブリダイゼーション手段 によるその検出を容易にする目的で、標的病原細胞の増殖を増強するべく集積方 法および培地が開発されてきた。典型的な集積操作は、標的生物体の増殖と正常 化を増強するだけでなく、存在するいかなるバックグラウンドまたは非標的微生 物の増殖をも促進するであろう培地を使用する。例えば、米国食品、医薬品局は 、Andrewsら記載のサルモネラ・アッセイ法、”Isolation and Identification of Salmonella Species,”Chapter 7 in Bacteriological Analytical Manual． 6th Edition，Association of Official Analytical Chemists，Arlington，VA( 1984)を承認している。この方法では、少なくとも２回の集積段階が記載されて いる。最初の段階は、食品サンプルが、栄養的、非選択ブロス培地で増菌されて 、傷害を受けたサルモネラ細胞を安 定な状態へ回復させ、増殖を促進させる。次には、前集積ブロス（すなわち、第 １の集積ブロス）のサンプルが、２種の選択集積ブロス（すなわち、第２の集積 ブロス）に添加されるが、そこでは、サンプルが、選択試薬を含む増殖促進培地 において、さらに集積される。各選択集積ブロスは、ほとんどの他の細菌の増殖 を同時に抑制しながら、サルモネラ生物体の連続的増加を可能にする。 本発明は、食品マトリックスからの細菌病原体の検出に特に適応された、特別 に作成された前集積培地を用いることによって、上記標的集積法を改良した。２ 種の異なる培地が、本発明の好適な実施態様における使用のために開発されたが 、１つは、具体的には、サルモネラに対するものであり、他は、リステリア（Ｌ ｉｓｔｅｒｌａ ）に対するものである。これらの培地は、種々の食品マトリック スのｐＨの変化を許容できるよう高度に緩衝化されている。サルモネラ培地は、 ラクトースブロス、リン酸カリウム、マニトール、塩化マグネシウムおよびペプ トンからなる。リステリア培地は、ブレインハートインフュージョンブロス、グ ルコース、塩化リチウム、クエン酸第二鉄、高分子酸およびリン酸カリウムから なる。標準法において典型的な細菌標的の選択集積段階は除外され、そして本発 明では、下記の二相水性分離系によって置換される。 本発明の合成前集積培地が有効であることは、本培地におけるサルモネラおよ びリステリアの増殖が、ＦＤＡによって示され、Bacteriological Analytical M anual．6th Edition前出に記載の培地と比較される場合に見られる。サルモネラ 前集積ブロス（ＢＢＳＭ）とＦＤＡ’ｓＢＡＭラクトースブロスとの比較は、両 培地における純粋なサルモネラ菌株の比増殖速度を比較することによって可能で ある。液体培地での増殖の 場合に、生物体がたどるＳ型増殖曲線が与えられれば、曲線の対数増殖部分は、 次の式によって記述できる： １ｎＮ＝１ｎＮ0＋Ψｔ 式中、 Ｎ ＝ ある時間における細胞濃度「＝」細胞／ｍｌ Ｎ0 ＝ 時間０における始発細胞濃度 Ψ ＝（生物体の）比増殖速度［＝］１／ｈｒ ｔ ＝ 増殖時間［＝］ｈｒ 比増殖速度(Ψ)は、また、倍加時間(ｔD)または平均世代時間に関係し、もし 、１つがＮ＝２Ｎ0に設定されれば、すなわち、１倍加は： ｔD＝（１／Ψ）１ｎ２＝０．６９（１／Ψ） ＢＢＳＭ培地で増殖するサルモネラ菌株の比増殖速度は、ＦＤＡのＢＡＭラク トースブロスにおける比増殖速度と有利に比較される。比増殖速度は、以下のと おり比較される： ＢＢＳＭは、少なくともラクトースブロスに匹敵されることが証明される。 水性二相高分子分離系： 液体高分子相分離は、それが非常に温和な分画方法であり、さらに、 生物材料を区別する広範な表面の装いや物理化学的性質の利点を利用するので、 生物実質の分離に特によく適合される。もっとも単純な系は、一定の割合におけ る２種の混和しない水性高分子の混合液を必要とする。高分子系の激しい混合は 、最初に乳濁液をもたらし、最後に、２つの異なる相への高分子の分離をもたら す。 手元の問題に対する適当な二相系の選択は不可避である。生物実質、（具体的 には、分離操作を通して細胞の生存が維持されることが重要である生物細胞）の 分離では、相は、温和であらねばならず、そして水含量、イオン組成、浸透圧お よび変性効果に対する考慮が払われねばならない。これらの配慮のほとんどは、 有機溶媒を含む相を排除し、そして基本的に水溶性の高分子を残す。 二相系による分離の基礎は、相間への物質の選択的分配である。溶解性物質で は、分配は、主として２つの大きな相の間で起き、そして分配は、分配係数Ｋ、 Ｋ＝Ｃt／Ｃb によって特徴付けられるが、式中、ＣtおよびＣbは、それぞれ、上相および下相 の分配物質の濃度（ｍｏｌｅ／ｌ）である。分配係数は、相の容積には依らず、 ２相の性質、分配物質の性質および温度によって影響される。分配を支配するメ カニズムは、完全には理解されてないが、しかしながら、粒子および２つの高分 子相間の水素、イオンおよび疎水的結合の相互作用が一緒になった結果であると 思われる。一般に、分配への最大効果をもつ性質は、粒子の表面電荷、粒子の大 きさ、および粒子の疎水性である。二相系における粒子の分配を支配する理論の 完全な総括については、Per-Ake Albertsson、前出、または本明細書に引用によ っ て組み入れられる米国特許第5,110,733号を参照せよ。 単段階分離は、しばしば、細菌胞子のＤＮＡのように、均一な分配係数をもつ 粒子の分離には十分である。種々の分配係数をもつ他の材料は、向流分配のよう な多段階操作を必要とするであろう。向流二相系は、乳化が実施され、平衡が達 成された後、各段階における高分子の相対重量％組成が同じである水性二相系の 少なくとも２段階を使用する。向流技術においては、サンプルは、先ず、第１段 階の分離にかけられる。二相が平衡になった後、標的物に富む相の一定量が、第 ２段階に移される。第２段階は、移された標的物に富む相と混合されて、第１段 階のそれと等しい高分子の相対重量％組成をもたらす特定バランスの高分子を含 有する。段階の数が、１０または１００のオーダーに増えるにしたがって、「向 流」系は、可変滞留時間を通して混合物を分離することにおいてクロマトグラフ ィーカラムのように働き始める。繰り返される相の分割と再混合は、さらに一層 の精製を進める。典型的な向流法は、特定の物質の許容純度を得るために、しば しば、５０〜６０の別れた抽出を必要とする。 理論上は、どんな段階数も、向流の実施には使用できる、しかしながら、本発 明の目的のためには、３段階法が好適であり、そして必要ならば、例えばサルモ ネラの単離には、３段階法が２系列に分けられる。２系列に分けられた二相分離 法は、各々が３段階をもち、向流方式で実施される２つの別々の異なる水性二相 系セットを組み入れる方法を指す。２系列のアプローチにおいて、サンプルの第 １の一定量が、第１の二相系での分離にかけられ、一方、サンプルの第２の一定 量が、第２の二相系での分離にかけられる。両系の第３段階の完了で、各二相系 の標的物 に富んだ相のサンプルが、別々の選択増殖培地上に塗布される。標的物に富んだ 相は、集積された量の標的微生物か、減少された量のバックグラウンド微生物、 または両方の組み合わせ物を含む。この方式では、より高度に選択された目的の 標的生物体が得られる。標的物が濃厚になるであろう相は、適当な水性二相系を 用いて行われる純粋培養の単段階分配実験に基づいて予め決定される。 適切な高分子： 少なくとも２種の水性高分子からなる種々の高分子系が、本発明のために適切 であり、そしてそれに限定されないが、次のものを含んでもよい： ポリエチレングリコール／デキストラン；ポリプロピレングリコール／デキスト ラン；ポリエチレングリコール／ポリビニルアルコール；ポリエチレングリコー ル／フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンのコポリマー、Pharmacia Fi ne Chemicals，Uppsala，Sweden）；ポリビニルアルコール／デキストラン；メ チルセルロース／デキストラン；ポリプロピレングリコール／ポリビニルピロリ ドン；電荷ポリエチレングリコール／デキストラン；ポリプロピレングリコール ／メトキシポリエチレングリコール；ポリプロピレングリコール／ポリビニルア ルコール；ポリプロピレングリコール／ヒドロキシプロピルデキストラン；ポリ エチレングリコール／ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール／澱粉； およびポリビニルアルコール／メチルセルロース高分子両性電解質−ポリビニル アルコール。これらと他の高分子のさらなる組み合わせ物も、また適切であり、 文献（Per-Ake Albertsson,前出）から周知である。本単離に好適な高分子系は 、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ） およびデキストラン（Ｄｘ）の高分子を含む。ＰＥＧは、種々の分子量において 入手できる直鎖の合成ポリマーである。ＰＥＧは、溶液において、それが発売さ れている乾燥粉末かフレーク状において、全く安定である。本発明の相分配法に 使用されたUnion Carbide Corporationによって供給されたＰＥＧの通常の画分 は、範囲約３００〜５０，０００、好ましくは範囲３００〜３０，０００の分子 量をもつＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３，４００、Ｐ ＥＧ８，０００およびＰＥＧ２０，０００を含む。他のＰＥＧの市販名は、ポリ グリコールＥ（Dow Chemical）、Ｃａｒｂｏｗａｘ（Union Carbide）、および ｐｏｕｒａｃｏｌＥ（BASF）を含む。３０〜４０重量％のＰＥＧ保存液は、粉末 の正確な秤取と室温での溶解によって作成される。ＰＥＧは、数時間の撹拌で容 易に溶解し、そして新鮮な適切に保存されたＰＥＧ末は、通常０．５％未満の水 分を含む。保存濃度は、屈折率によって測定できる。 デキストラン、主としてポリ（α−１，６−グルコース）は、分子量画分の範 囲約２，０００〜２百万において市販されている。また、誘導体についても同様 の分子量のものが有用である。デキストラン２０〜３０重量％の保存溶液は、粉 末を等重量の水を用いてペースト状に混合し、次いで、デキストラン中の水を考 慮するために、目的より約１０％高い見かけの濃度を得るのに十分量の水を添加 することによって作成される。デキストラン保存溶液は、室温で２〜３時間撹拌 されるが、その時間は、加熱により短縮されてもよい。デキストラン保存溶液の 濃度は、旋光分析によって測定できる。 溶解度、相分離またはキラリティーを増進するために、水溶性高分子 に塩類、例えばリン酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグ ネシウム、硫酸銅および硫酸リチウム、単糖類および二糖類を添加することは、 また、本発明の範囲内にあると考えられる。 水性二相系は、高分子の保存溶液から調製されてもよい。保存溶液は、ｐＨを 調節するために既知のバッファーを、そして溶液の張性を増すために塩を含んで もよい。好ましくは、リン酸カリウムバッファーが、ｐＨ調整に使用される。こ れらのバッファーおよび塩は、分離されるべき材料の性質に応じて選択され、そ して前述の基準を用いて、容易に当業者によって決定できる。例えば、水溶性高 分子は、一般に、電荷をもたず、高分子量であるので、それらの高濃度における 溶液の張性への寄与は小さい。もし、分離されるべき混合物が、低イオン強度の 溶液によって破壊されるであろう細菌細胞を含む場合には、塩の添加が指示され るであろう。相の張性は、蒸気圧浸透計を用いて測定できる。 塩、バッファー、糖類およびポリマーのような添加物が、相分離や分離ファク ターを増進するために添加されてもよい。適切な添加物は、リン酸カリウム、グ ルコース、グリセロール、ブチルセルソルブ、プロピルアルコールおよび塩化ナ トリウムを含む。二相間の密度または疎水性における差を増し、いずれかの相の 粘度を低下し、あるいは二相間の界面張力を増すことができる添加物は、相分離 と分離ファクターを増進するであろう。 また、温度および圧力も、相分離と分配係数を増進するために操作できる。適 切な温度は、水性二相系が凍結始めるところから、水の沸点までの範囲、一般に は、約−１０℃から１００℃までにわたる。しかしながら、標的微生物が生きて いることが望ましいので、本発明の好適な温 度は、０℃から３７〜４３℃の間までである。圧力の範囲は、二相系をもたらす すべての圧力、一般に０．０１〜１，０００大気圧を含む。好適な圧力は周囲圧 力である。 種々の分子量の種々のＰＥＧおよびデキストランが利用できるけれども、好適 なＰＥＧは、ＰＥＧ（８０００）もしくはＰＥＧ（３４００）であり、好適なデ キストランはＤｘＴ５００である。 二相系の選択： 特定の分離のための適当な高分子の選択は、相図の使用によって容易になされ る。２種の高分子と水の混合液において、二相系は、構成分が、ある範囲の割合 において存在する場合に、生じるであろう。相分離が起きる構成分組成は、図１ に示されるような相図において表される。図１では、２種の高分子の濃度は、水 中の高分子の重量％としてプロットされる。２つの領域を分ける曲線は、バイノ ーディアル・ルーカス・オブ・ポイント（ｂｉｎｏｄｉａｌ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｐｏｉｎｔｓ）と呼ばれる。線より上の点によって表される組成をもつすべて の混合液は、二相分離を起こし、一方、線より下の点によって表される混合液は 均質溶液を与える。 平衡にある二相系は、図２の相図によって具体的に説明される。もし、図２の 線Ｃ−Ｂ上の点Ａが、全系の組成を表すならば、その時、下相と上相の組成は、 それぞれ、点ＢおよびＣによって表されるであろう。点Ａは、乳化前の系に添加 される高分子系の成分の組成であるフィードポイント組成を表す。乳化および沈 静の後、上相と下相の相対組成は変化し、そしてもはや、フィードポイントパラ メーターを反映しない。かくして、相図は、フィードポイントの組成が知られる 場合に、両相の組成 を決定するために使用される。相図を支配する理論および二相系の組成の決定に おけるそれらの使用の完全な議論については、Per-Ake Albertsson、前出、また は本明細書に引用によって組み入れられる米国特許第5,110,733号を参照せよ。 本発明は、バックグラウンド微生物により汚染された複合マトリックスからの 特定の微生物集団の単離を実施するために、生物実質の二相分離のために使用さ れる標準技術の改良を提供する。本発明の方法は、微生物細胞表面のパラメータ ーおよび二相系の性質の利点を利用し、そして細胞／二相系の動力学をうまく模 して、特定の標的微生物に対する効果的な特殊な二相法を開発した。目的の標的 生物体の単離のために適当なフィードポイント組成を決定する適切な段階的操作 は、次の通りである： ａ）分離すべき細胞または生物実質に基づいて、使用される高分子の種類、分 子量、ポリマー・リガンド、電解質、バッファー性能、沈静時間および温度を選 択する； ｂ）前記Albertssonによる記述のように、一相と二相間、およびその逆の転移 指標としてゲル浸透クロマトグラフィーか濁度のいずれかを使用することによっ て、上記系の二相図を構築する； ｃ）バイノーディアル曲線内に良好なフィードポイントを選択し、そしてサン プル中に共存すると思われる数種の標的およびバックグラウンド微生物を選択す る； ｄ）微生物単離法の一部として使用される前集積培地において、これらの微生 物の純粋培養を増殖させて、単離操作に対して典型的に提供される標的およびバ ックグラウンド生物体のバランスを達成する； ｅ）技術上周知の技術および方法（すなわち、コールターカウンター装置、光 学密度、非選択アガ−上への塗布、等）を用いて培養物中の標的およびバックグ ラウンド細胞の細胞数を決定することによって、上記純粋培養物の各々を用いる 単段階分配実験を行う； ｆ）標的およびバックグラウンド細胞について、上相、下相およびまた乳化（ 混合）相をサンプリングする； ｇ）適当なマスバランス式を書くことによって、上相と下相および界面におけ る細胞画分を決定する； ｈ）上相か下相いずれかにおいて、バックグラウンドからの標的物の最大分離 が最適である、全標的およびバックグラウンド生物体の分配結果を比較する； ｉ）もし、分離が不十分であれば、バイノーディアル曲線により近いフィード ポイントを選択し、段階ｄ）〜ｈ）を繰り返す； ｊ）もし、操作条件が、二相を満足なものにしなければ、段階ａ）に進む。 サルモネラおよびリステリアの分離のための二相高分子系： サルモネラおよびリステリアの分離のために有用な本二相系は、細胞分離のた めの先のそれらの使用に基いて選ばれたＰＥＧおよびデキストランからなる（P ．A.Albertsson、前出）。ＰＥＧとデキストランの始発フィードポイント組成は 、図３に示された相図を基に決定された。水中５〜６．５％デキストランと水中 ３．５〜６．５％ＰＥＧの組み合わせが、前記段階的フィードポイント選択法を 用いる標的およびバックグラウンド微生物の純粋培養の分配データを基に使用さ れた。高分子系が選択された後、電解質とバッファーの濃度が、６種の細菌菌株 の純粋培 養を用いて決定された。電解質の濃度は、種々の電解質濃度に応じた純粋な標的 およびバックグラウンド微生物の分配挙動に基づき、そしてまた、ＮａＣｌリン 酸バッファーが、前集積ブロスからの固定量の種菌が添加される時に、二相系に 持ち込まれるという知識により決定された。さらに、ＰＥＧ−ビス（アミン）（ 正電荷のＰＥＧ分子）が、細胞表面の電荷特性の利点を生かすため、そして標的 およびバックグラウンド微生物の分配を増進するために二相系に添加される。細 菌は、種々のＮａＣｌ量を含む０．０１２リン酸カリウムバッファー中４％（ｗ ／ｗ）ＰＥＧ（ＭＷ８０００）および０．０１２リン酸カリウムバッファー中５ ％（ｗ／ｗ）Ｄｘ（ＭＷ５００，０００）における二相分配にかけられた。図４ Ａは、は、Ｅ．コリを用いるそのような分配の１つの結果を図示する。図４Ａに おいて見られるように、二相系のフィードポイント組成においてＮａＣｌ濃度を 増大することは、先ず、上相に見いだされるＥ．コリを、下相に見いだされる大 多数の細菌へとシフトし、そして最後に、高塩濃度では２相の界面における著量 の細胞へのシフトをもたらした。この一般的パターンは、クレブシエラ・オキシ トカ（図４Ｂ）およびすべての試験された細胞菌株について真実であったが、し かし各相における細胞の相対濃度は、種々の割合で変化した。例えば、０．０４ ＭＮａＣｌで、そしてＥ．コリおよびＫ．オキシトカのそれぞれ５．８ｘ１０９ および１．２ｘ１０８の細胞濃度では、Ｅ．コリ細胞の８８％およびＫ．オキシ トカ細胞の９６％が、それぞれ上相および下相において濃縮された。次に、試験 は、種々の量のＮａＣｌを用いる混合２種培養物の二相分配に関して実施された 。図５は、フィードポイント組成において種々の量のＮａＣｌを用いるＥ．コリ およびＫ．オキシトカの 二相分配の結果を図示する。混合培養のデータは、０．０４ＭＮａＣｌではＥ． コリ細胞の４６％のみが上相に動き、一方、Ｋ．オキシトカ細胞の９５％が下相 に留まり、そしてＥ．コリ細胞の５２％が、界面に移動した点で、純粋培養とは 異なった。これら、および他の混合培養からの結果に基づき、向流分離が、細菌 細胞の分離に好適な方法であると結論された。 それ故、潜在的な標的細菌病原体による実地試験を基に、そして細胞表面の性 質の知識を用いて、本発明者は、各標的微生物のための向流二相分離系を築く方 法を開発した。図７は、サルモネラ属に対する２系列の３段階向流二相分離系を 略述する。前集積培養のサンプル１ｍｌが、２種の異なる二相分離系、Ａおよび Ｂに添加された。系Ａは、上相中に標的細菌を分配するように計画され、一方、 系Ｂは、下相中に標的細菌を分配するように計画される。向流操作は、わずか３ 段階で上記のように行われ、その時点で、標的物を含有する相が、選択鑑別培地 上に塗布され、そして検出のために培養される。食品マトリックスを含む実験に おいては、食品マトリックスが、一般にそして予期せぬことに、界面中に分配し たことは注目されねばならない。かくして、３段階の最終段階では、ほとんどま たは全く、汚染している食品マトリックスは系中に残されない。 二系列法の開発は、サルモネラ属標的細菌のすべての菌株および種の単離を可 能にするために必要であった。実験的データは、サルモネラ菌株の分配係数には 、大きな差があるので、すべての菌株が、非常に高い分配数と不明瞭な属の包括 なしには、同じ相中に確実には分配できないということを示唆した。例えば、サ ルモネラ属は、非常に多様であり、 約２，０００菌株からなる。本方法は、すべてのサルモネラ菌株を包括し、いか なる食品マトリックスからもすべてのサルモネラを単離させるものでなければな らない。かくして、必要な分配数を減少させ、すべての標的細菌株の全包括を可 能にするために、二系列法が考案された。 リステリア種および属の細胞表面の性質の変異は、サルモネラよりも低く、そ してリステリアの属内の種菌株変異は、サルモネラよりも低いので、リステリア を分配するには、わずか１回の３段階水性二相系を必要とするだけであった。リ ステリアを標的とする水性二相系は、純粋なリステリアと他の拮抗する微生物の 分配実験に基づき、そしてまたリステリア集積培地に適合させられる。 食品マトリックス： 実地状況への適用について本方法を試験する目的で、広い範囲の生鮮および加 工食品が、サルモネラおよびリステリアの種々の菌株と混合され、そしてその混 合物が、二相分離系にかけられた。食品マトリックスは、２つの分類、生鮮およ び加工物に分けられた。生鮮食品は、摩砕牛肉、摩砕七面鳥、鶏肉、鶏バック（ ｂａｃｋ）、摩砕鶏肉、豚肉ソーセージおよび卵を含む。加工食品は、乾燥ミル ク、全乳、ココア、サラダドレッシング、コテージチーズ、粗挽きコショウ、お よびアイスクリームを含む。各種類の食品は、分離工程に大きく影響する種々の パラメーターを示した。例えば、多くの生鮮食品は、高濃度の非病原性微生物叢 をもち、それが、接種された（または自然に存在する）サルモネラまたはリステ リア標的菌株の増殖速度に拮抗的圧力を加えることができる。その結果、多くの 標的菌株は、バックグラウンド細菌の拮抗的圧力により、バックグラウンド濃度 よりも３桁〜４桁低い濃度レベルで増殖する ことが分かった。さらに、加工食品は、しばしば、損傷されたバックグラウンド の非病原性細菌を含むが、それらは、接種された標的菌株の増殖を特異的に妨げ るだけでなく、標的細胞の増殖を阻害するであろう増殖阻害剤を含むかもしれな い。しばしば、加工食品中に見いだされる発酵産物は、その生産物の発酵には有 用であるが、接種されたり自然に存在する標的菌株には阻害的であるスターター 、生菌を有する。最後に、食品の破片は、平板塗布や細菌培養の選択的増殖を阻 害するので、食品マトリックス自体およびそれから発する種々の溶質化合物の存 在でさえ、克服されるべき問題を提供する。予期せぬことに、好適な３段階向流 二相分配系は、その系からすべての食品破片を事実上除去した。本水性二相系で は、食品破片は、速やかに界面に移動して、その結果、第２段階に移行される量 を低下した。同じ過程が、再度繰り返された時、事実上、標的相に残されるすべ ての食品は、除去され、そして移植および／または細胞塗布の妨害が防がれた。 選択的増殖： 本発明において、同定に使用される選択鑑別アガーは、微生物学の分野におけ る基本であり、日常的に多くの参考方法とともに使用される。本発明の目的では 、Ｈｅｃｋｔｒｏｎ Ｅｎｔｅｒｉｃ（ＨＥ）およびＸｙｌｏｓｅ Ｌｙｓｍｅ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＸＬＤ）アガーが使用された。両アガーは、ラク トースおよび／またはスクロースの細菌の利用に基づいている。これらのアガー におけるサルモネラの同定は、不溶性の鉄−硫黄塩として代謝Ｈ2Ｓガスの捕捉 からもたらされる黒色コロニーの出現によって容易になる（Bacteriological An alytical Manual．6th Edition,前出）。 酵母および藻類の分配： 本発明の教示を用いて、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）およびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄ ａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ）のような種々の酵母を含む、他の微生物の混合物が 、水性ＰＥＧ／デキストラン系において分離できた（実施例参照）。本発明の柔 軟性を例証するために、酵母および藻類の数種の純粋培養物の分配特性が、サル モネラおよびリステリアについて開発された水性二相系を用いて試験された。酵 母および藻類の混合物の分離は、たとえ水性二相系が、これらの細胞に最適では なくても、数種については十分達成することができた。 次の実施例は、本発明の重要な態様を具体的に説明することを意図するが、い かなる点においても限定されるものと考えてはならない。 実施例 材料および方法 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Sigma Co.）種々の分子量の直鎖合成ポ リマー、およびＰＥＧ−ビス（アミン）（Sigma Co.）ＰＥＧの正電荷誘導体は 、それぞれ２０％ｗ／ｗおよび１０％ｗ／ｗバッチで調製され、４℃で保存され 、そして３〜４週間以内に使用される。同様に、種々の重量のデキストラン（Ph armacia）が、２０％ｗ／ｗバッチで調製され、４℃で保存され、そして３〜４ 週間以内に使用される。また、ヒドロキシプロピル澱粉（Reppe AB）が、同様に 調製される。 微生物培地（ブロス、選択および鑑別アガー）は、設定されたレシピーおよび 滅菌条件にしたがい、そしてDifco Co.またはBecton-Dickson and Co.のような 販売者から購入して、実験室において調製される。 細菌菌株は、内部DuPontコレクションの１部である。酵母菌株は、the Americ an Tissue Culture Collection(ATCC)から、そして藻類菌株は、Ward's Natural Science Establishment，Live Materials Departmentからのものである。水性 二相系における純粋培養物の挙動の位置付けは、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅ ｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Coulter Corp.）および／または非選択ヌートリエ ントアガー上への十倍希釈による直接平板塗布によって決定される。 微生物： 次の実施例において試験された微生物菌株は、種々の細菌、酵母および藻類か らなり、以下に列挙される： サルモネラ属：（内部DuPontデータベース） Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｙｍｕｒｉｕｍ），Ｓ．ハイデルベルグ（Ｓ．ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ）、Ｓ．ブレデネイ（Ｓ．ｂｒｅｄｅｎｅｙ），Ｓ． エンテリジチス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ），Ｓ．ハダール（Ｓ．ｈａｄａ ｒ ），Ｓ．トンプソン（Ｓ．ｔｈｏｍｐｓｏｎ），Ｓ．インファンチス（Ｓ．ｉ ｎｆａｎｔｉｓ ），Ｓ．ニューポルト（Ｓ．ｎｅｗｐｏｒｔ），Ｓ．アリゾナエ （Ｓ．ａｒｉｚｏｎａｅ），Ｓ．ベルタ（Ｓ．ｂｅｒｔａ），Ｓ．モンテビデオ （Ｓ．ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ），Ｓ．ガリナルム（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ） ，Ｓ．アゴナ（Ｓ．ａｇｏｎａ），Ｓ．ケドウゴウ（Ｓ．ｋｅｄｏｕｇｏｕ）， Ｓ．ビンザ（Ｓ．ｂｉｎｚａ），Ｓ．ビルコウ（Ｓ．ｖｉｒｃｈｏｗ），Ｓ．ア ナタム（Ｓ．ａｎａｔｕｍ），Ｓ．セントポール（Ｓ．ｓａｉｎｔｐａｕｌ）， Ｓ．スタンレイ（Ｓ．ｓｔａｎｌｅｙ），Ｓ．ブランデンブルグ（Ｓ．ｂｒａｎ ｄｅｎｂｕｒｇ ），Ｓ．ナポリ（Ｓ．ｎａｐｏｌｉ） ，Ｓ．ブラエンデオウプ（Ｓ．ｂｒａｅｎｄｅｏｕｐ），Ｓ．ブロックレイ（Ｓ ．ｂｌｏｃｋｌｅｙ ），Ｓ．マンチェスター（Ｓ．ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ） リステリア属：（内部DuPontデータベース） Ｌ．モノシトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），Ｌ．ウェルシメリ （Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ），Ｌ．イバノビイ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ），Ｌ ．ムライ（Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ），Ｌ．イノクア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ），Ｌ． グライ（Ｌ．ｇｒａｙｉ） 真菌類： サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ ）ＡＴＣＣ２３４１，カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏ ｐｉｃａｌｉｓ ）ＡＴＣＣ７５０ 藻類：（Ward's Natural Science Establishment） （Rochester，New York） ナビクラ・ペリクロサ（Ｎａｖｉｃｕｌｌａ ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）（褐 色珪藻類）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏ ｓａ ）（緑藻類）、ペリジミウム種（Ｐｅｒｉｄｉｍｉｕｍ ｓｐ．）（渦鞭毛 藻類；黄金色）、アナシスチス・ニヅランス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ ｎｉｄｕｌ ａｎｓ ）（藍藻類）、カリタミオン種（Ｃａｌｉｔｈａｍｍｉｏｎ ｓｐ．）（ 紅藻類） 増殖条件： 全サルモネラは、前集積培地、ＢＢＳＭ中、３７℃、振盪で培養された。 リステリア培養は、前集積ＬＢＨＩブロス中、３０℃、高速（３００ ｒｐｍ）で激しく撹拌する振盪機／培養機で培養された。 酵母培養は、標準Ｓａｂａｒａｕｄデキストロースブロス（Difco）中、２７ ℃で増殖された。種々の藻類は、次のような販売元によって提供されるそれぞれ の特殊培地において増殖された： ナビクラ・ペリクロサは、Ｂｒｉｓｔｏｌ液（Ward's,前出）において、クロ レラ・ピレノイドサは、Ｂｒｉｓｔｏｌ液（Ward's,前出）において、ペリジミ ウム種は、土壌培地培養（Ward's,前出）において、アナシスチス・ニヅランス は、Ｂｒｉｓｔｏｌ液および／またはＥｒｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ液（Ward's,前 出）において、カリタミオン種は、Ｅｒｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ液において増殖さ れた。 藻類は、１８〜２４℃、蛍光下で培養された。 前集積ブロス： ＢＢＳＭおよびＬＢＨＩの組成は、以下の通りである： ＢＢＳＭ（サルモネラ） ラクトースブロス １３ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ３４ｇ／ｌ マニトール ７.５ｇ／ｌ ＭｇＣ１２．６Ｈ２Ｏ ５.０ｇ／ｌ 水 １.０ １* *ＮａＯＨでｐＨ７.０に調整 ＬＢＨＩ（リステリア） ブレインハートインフュージョン ３７.０ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ６.８ｇ／ｌ グルコース ５.０ ＬｉＣｌ １０.０ｇ.ｌ クエン酸第二鉄 ２０.０ｍｇ／ｌ ピルビン酸ナトリウム ０.２ｇ／ｌ アクリフラビン ７.５ｍｇ／ｌ シクロヘキシミド ２５ｍｇ／ｌ ナリジキシン酸 ２０.０ｍｇ／ｌ 木炭 １.０ｇ／ｌ 水 １.０ １* *ＮａＯＨでｐＨ７.０に調整 選択的増殖： サルモネラの同定用選択培地は、Ｈｅｃｈｔｒｏｎ Ｅｎｔｅｒｉｃ（ＨＥ） またはＸｙｒｏｓｅ Ｌｙｓｍｅ Ｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＸＬＤ）アガ ー（Difco）である。 リステリアの同定用選択培地は、LiC1濃度を増大した改変ｏｘｆｏｒｄアガー (ＭＯＸＡ)である。ＭＯＸＡの組成は、以下の通りである： ＭＯＸＡ コロンビアブラッドアガーベース ３９ｇ／ｌ エスクリン １０ｇ／ｌ クエン酸第二鉄アンモニウム ５ｇ／ｌ ＬｉＣｌ １５ｇ／ｌ 水 １ １* *ＮａＯＨでｐＨ７.０に調整 酵母は、ＢＨＩアガープレート（Difco）で選択的に増殖される。 藻類は、平板培養されず、液体培地で増殖した時の色を基に同定される。 二相水性高分子系： 本発明で使用されるフィードポイント二相水性高分子系は、以下の表１〜２に 列挙される。系は、サルモネラおよびリステリアの単離のために開発された。ま た、これらの組成物は、酵母および藻類の混合培養の分離に有用であるように決 定された。 実施例１ 純粋培養の混合集団からの標的細菌の分離 実施例１は、細菌の分離のための二相水性高分子系に有効な組成物を決定する ために使用された方法を例証する。単段階水性二相分配実験は、クレブジラ・オ キシトカ、Ｅ．コリ（６５６）、スタフィロコッカス・エピデルミチス（Ｓｔａ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｔｉｓ ）およびラクトバチルス・カ ルニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｉｓ）の純粋培養を用いて行わ れた。細胞は、Ｐｅｎａｓｓａｙブロスで一夜増殖され、翌日、低速遠心によっ て集菌され、そして ２０ｍＭリン酸カリウムバッファーで２回洗浄された。その細胞は、最後に、１ ０ｍＭリン酸カリウムバッファーに再懸濁された。全容量は１０ｍｌであった。 水性二相系のフィードポイント組成は、ＮａＣｌ含有および不含の１００ｍＭ カリウム中、４％ｗ／ｗＰＥＧ（８０００）、５％ｗ／ｗデキストラン（Ｔ５０ ０）であった。マスバランスは、種菌容量１ｍｌ、上相および下相中の細菌を数 えることによって行った。全容量は、１０ｍｌであった。分配は、室温で３０〜 ５０分間放置（沈静時間）して実施した。 純粋培養の分配挙動が最初に解析され、その結果が、以下の表３に示される： 表３のデータは、基準化され、各画分中の細胞％を表す。 純粋培養の分配結果に基づき、Ｅ．コリ（６５６）とスタフィロコッカス・エ ピデルミチス、またはＥ．コリ（６５６）とクレブジラ・オキシトカのような二 種混合物が、同じ組成の単段階水性二相系中に添加され、そして各微生物の分配 挙動が、マスバランスチェックと前記標的各微生物の選択鑑別アガーを実施する ことによって測定された。二種の細菌混合物の単段階分配結果は、以下の表４に 一覧される： 表４のデータは、基準化され、各画分中の細胞％を表す。 表４のデータから例証されるように、Ｅ．コリ（６５６）を上相そしてＫ．オ キシトカを下相に選択することが先験的に知られていれば、水性二相分配の１段 階において、Ｅ．コリ（６５６）／Ｋ．オキシトカの二種混合物を分離すること が十分可能であった。二種混合物Ｅ．コリ（６５６）／Ｓ．エピデルミチスの分 離は、両微生物の大部分が界面に移動したので、理想的には行かなかった。しか しながら、残りの部分は、反対相、Ｅ．コリ（６５６）を上相、そしてＳ．エピ デルミチスを下相に 分配した。細胞が、可逆的に界面に吸着するならば、向流多段階操作が、Ｅ．コ リ（６５６）とＳ．エピデルミチスを効果的に分離するであろうと決定した。 実施例２ 純粋培養の混合集団からのサルモネラの単離 実施例２の目的は、前集積ブロスにおける増殖２０時間後に、バックグラウン ド細菌の混合集団からサルモネラを分離する能力を例証することである。 次の細菌株が、分離されるべき混合物を作るために、一緒に増殖された： Ｓ．チフィムリウム（ＬＴ２） 標的 Ｅ．コリ（９２５） バックグラウンド細菌 Ｅｎｔ．クロアカエ（１０７４） バックグラウンド細菌 Ｃ．フロインディイ（８９４） バックグラウンド細菌 分離は、３段階の向流スキームを用いて実施された（図６）。 使用された始発フィードポイント組成は、次の通りであった： 段階＃１： ５％ｗ／ｗデキストラン（Ｔ５００） ４％ｗ／ｗＰＥＧ（８０００） ０．０２５ＭＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １ｍｌサルモネラ細胞 第１段階の総容量は、二相成分１０ｇの総容積に対応する約９．５ｍｌであっ た。段階１〜３の分配は、次の操作にしたがって実施された： （ａ）細胞を含まない段階＃１と同じ組成をもつ「マスター」二相系が、調製 され、乳化され、そして約１時間沈静化するために放置された。 （ｂ）段階１の下相の一定量が、向流スキームの段階＃２と＃３になる空のチ ューブ中にピペットで注入された。下相の量は、段階＃２では約５．３、そして 段階＃３では４．０ｍｌであった。 （ｃ）混合培養を含む前集積ブロス１ｍｌが、段階＃１のチューブに添加され た。混合および沈静化の後、段階＃１の上相約５．５ｍｌが段階＃２に転移され た。段階＃２の内容物が、上記のように混合され、沈静化され、次いで、上相内 容物の約４．１ｍｌが、段階＃３成分を含むチューブに転移された。混合および 沈静化がもう１回実施された。 （ｄ）段階＃３が、３０分間沈静化のため放置され、次に、その上相の内容物 が連続的に希釈され、そして菌数を数えるためにＢＨＩおよびＸＬＤアガー上に 塗布された。上記の用に、ＢＨＩアガーは、全細菌濃度を測定するために使用さ れたが、ＸＬＤアガーは、サルモネラ濃度を測定するために使用された。 この分配操作は、第１，２および３段階のフィードポイント組成が、相図（図 ３）において互いに近く、二相の枠内によく当てはまることを確認した。いかな る容量の組み合わせも、二相系が二相の枠内に長い間よく留まるようにすること が可能である。 標的およびバックグラウンド細菌濃度は、ＢＨＩおよびＸＬＤアガー上の希釈 塗布により、時間０，２０、および３段階向流分配スキームの終了後に、測定さ れた。菌数を数えれば、標的−バックグラウンド比が、各操作時間において計算 され、そしてデータは、図８に示される。 この実施例は、向流３段階スキームで実施された水性二相分配が、バックグラ ウンド微生物の混合集団からの標的サルモネラの効果的な分離に使用できること を例証している。 実施例３ 摩砕牛肉および乾燥ミルク食品マトリックスからのサルモネラの単離 実施例３は、３段階向流水性二相系が、食品マトリックスからサルモネラの１ 種を分離し、単離するために使用できることを例証する。 Ｓ．チフィムリウムＡＴＣＣ（１０８４）細胞が、食品マトリックス２５ｇを 含むサルモネラ前集積ブロス（ＢＢＳＭ）（２２５ｍｌ）中に接種された。食品 マトリックスは、摩砕牛肉か乾燥ミルクのいずれかからなった。各食品マトリッ クスからの在来微生物叢が、バックグラウンド微生物を提供し、具体的には特定 されなかった。サルモネラを接種された食品マトリックスは、前述のように増殖 され、実施例２で使用されたと同じ分配操作にかけられた。向流系の段階＃３か らのサンプルが、実施例２記載のように、鑑別のために平板塗布され、そして分 配結果が、図９および図１０に示される。図９は、摩砕牛肉中に接種されたサル モネラの分配データを示し、図１０は、乾燥ミルク中に接種されたサルモネラの 同様データを示す。 図９および図１０のデータによって分かるように、本二相系は、種々のバック グラウンド微生物で汚染された複合食品マトリックスからのサルモネラ種の単離 に有効である。 実施例４ 食品マトリックスの種々の組み合わせからの広範囲なサルモネラ種の単離 図４は、種々のバックグラウンド細菌に汚染された複合食品マトリックスから 、広範囲なサルモネラ種を単離するための本方法の能力を例証する。サルモネラ の１１２株が、「材料および方法」の項に列挙した種 に対応して試験された。 食品マトリックスは、２分類、生鮮および加工物に分けられた。生鮮食品は、 摩砕牛肉、摩砕七面鳥、鶏肉、鶏バック（ｂａｃｋ）、摩砕鶏肉、豚肉ソーセー ジおよび卵を含む。加工食品は、乾燥ミルク、全乳、ココア、サラダドレッシン グ、コテージチーズ、粗挽きコショウ、およびアイスクリームを含む。すべての 食品は、地方の販売店から市販品を得た。実施例２のように、単離方法は向流系 を含むが、より大きくサルモネラ属を包括するために、その方法は、図７に具体 的に説明されるように、２系列に分けられた３段階向流系に改変された。使用さ れた二相系のフィードポイント組成は、Ａ，Ａ＊；Ｂ，Ｂ＊として言及され、そ して「材料および方法」の項の表１に記載される。 種々のサルモネラ株の培養は、１２０ｒｐｍの振盪機／培養機において、１２ ５ｍｌフラスコ中ヌートリエントブロスで、３７℃一夜増殖された。試験された 各食品マトリックスでは、２５ｇのサンプルが、ＦＤＡ’ｓ ＢＡＭ ｓｐｅｃ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Bacteriological Analytical Mannual．6th Edition,前出 ）によって、サルモネラ前集積ブロス（ＢＢＳＭ）２２５ｍｌとともに、ストマ ッカー中で混合された。これらの混合物の各々に、種々のサルモネラ菌株が、約 ０．０１細胞／ｍｌの細胞濃度で接種された。この細胞濃度は、ＦＤＡ’ｓ ｓ ｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Bacteriological Analytical Mannual．6th Editio n,前出）によって要求される食品マトリックス２５ｇ中サルモネラ細胞１個の最 小検出レベルに対応した。次いで、接種されたブロスは、滅菌５００ｍｌエルレ ンマイヤーフラスコ中に移され、静置条件下で２０時間、３７℃で培養された。 ＢＢＳＭブロス２２５ｍｌ中に未接種の食品 マトリックスを含むネガティブ対照フラスコは、常に、試験される各セットの１ 部であった。 前集積の後、前集積ブロス１ｍｌづつの２分量が、図７に示される水性二相系 ＡおよびＢにそれぞれ添加された。２種の水性二相系ＡまたはＡ＊、およびＢま たはＢ＊（表１）は、サルモネラ株７７株の純粋培養の単段階分配挙動の実施例 １記載の広範なスクリーニング実験に基づいて、決定された。 ３段階向流分離を実施するために使用された操作法は、実施例２および３記載 のものとはやや異なっていた。水性二相系の全量（すべて他の価値の１０または ５ｍｌのいずれか）に応じて、段階＃１または＃２からの系Ａ（またはＡ＊）の 上相の一定量（４または２ｍｌ）または系Ｂ（またはＢ＊）の下相の一定量（３ ．０または２ｍｌ）が、それぞれ段階＃２または＃３に移された。適当な量およ び相を移すことにより、全体でのフィードポイント成分が、段階＃１と丁度同じ にするために、段階＃２および＃３は、適当なバランスの水性二相成分を含んだ 。かくして、段階＃１のフィードポイント組成（系Ａ／Ａ＊またはＢ／Ｂ＊）が 、ポイントＡ’であったならば（図２）、段階＃２および＃３の転移を実施する には、またポイントＡ’か、最小ではそれに非常に近いポイントであった。 二相分離に続いて、上相（第３段階、系Ａ／Ａ＊）または下相（第３段階、系 Ｂ／Ｂ＊）の１０μｌが、前記ＸＬＤまたはＨＥ選択鑑別アガーにストリークさ れた。各プレートは、３７℃で２４時間培養された。標的サルモネラコロニーの 同定は、不溶性ＦｅＳ塩のようなＨ2Ｓ沈殿による黒色形成に基づいた。データ は、水性二相分配段階後０時間、２ ０時間および直後に収集された。測定されたサルモネラおよび全細菌濃度に基づ いて、標的対バックグラウンド比が、各工程時間において計算され、全工程、特 に二相段階の成績を評価するのに使用された。 標的対バックグラウンド比による種々の食品マトリックスからの標的サルモネ ラ濃度の単離を例証するデータは、図１１に示される。図１１のデータによって 分かるように、試験されたすべてのサルモネラ種の大部分は、食品マトリックス の如何にかかわらず、組成Ａの上相か、または組成Ｂの下相のいずれかに分配さ れた。 １１２種の接種された食品実験のすべてに基づいて、前述の食品マトリックス のいずれかにおける種菌サルモネラ回収の統計的数値は、次に通りである： 回収されたサルモネラ： いくつかの場合では、接種されたものと異なる在来サルモネラが、ネガティブ 対照およびある接種食品サンプルにおいて回収されたことは、指摘する価値があ る。粗挽き黒コショウのサンプルは、Ｓ．ニューポルトＡＴＣＣ（１２６６）（ ポリグループＢ）を接種され；単離された疑いのあるコロニーの数種は、在来サ ルモネラ菌株の潜在的存在を示唆するポリグループＡと確認された。摩砕七面鳥 のネガティブ対照サンプルは、血清グループＢの在来サルモネラをもつと確認さ れた。分離株は、 両水性二相系ＡおよびＢから釣菌された。さらに、同じ食品マトリックスのいく つかの接種サンプルは、接種されたサルモネラ菌株Ｓ．パナマＡＴＣＣ（１２５ ０）、ポリグループＡ／血清グループＩに加えて、血清グループＢサルモネラ（ 系Ａ）をもつことが確認された。同様に、ポリグループＡにはいるＳ．ハイデル ベルグＡＴＣＣ（１２３９）を接種された摩砕七面鳥サンプルについても、事実 、血清グループＢサルモネラが両系ＡおよびＢにおいて回収された。 食品マトリックスが、向流法の第３段階の最後には完全に除去されたことは、 注目すべき重要なことである。 本方法が、種々の食品マトリックスから広範囲のサルモネラ菌株を単離するこ とができることは、実施例４から明白である。さらに、本方法が、最初に実験的 に導入されたものでない、食品からのサルモネラ菌株を単離できる感度の高いも のであることも明らかである。 実施例５ ＦＤＡ’ｓＢＡＭ法と二系列サルモネラ法の比較 実施例５は、本二系列二相向流法が、汚染された食品からのサルモネラの検出 および単離に関する工業基準と、有利に比較されることを例証する。 １０種の実験が、生鮮および加工食品、および８種のサルモネラを用いて実施 された。実験は、二相系についての実施例４記載のように実質的に行われた。同 じ食品マトリックスとサルモネラ菌株が、前出のBacteriological Analytical M anual．6th Editionに記載のＢＡＭ法により解析され、そして比較結果は、下記 の表６に示される。 二系列サルモネラ法が、ＦＤＡ’ｓＢＡＭ法と比較されたが、前者は、後者よ りも少なくとも２４時間迅速な方法であった。 実施例６ 食品マトリックスからのリステリアの単離 食品マトリックスにおいて他のバックグラウンド生物体からのリステリア属を 単離するための水性二相系が、前記実施例記載のサルモネラの方法と同じ方式に おいて開発された。 最適な水性二相系は、ＬＬ−ＰまたはＡ2Ｐ−８２と命名され、そして「材料 および方法」の項の表２に記載される。これらの組成物は、数 種のリステリア種、および潜在的に拮抗菌として知られる他のバックグラウンド 細菌の純粋培養についての単段階分配データを用いて、候補の二相系を幅広くス クリーニングした後に選択された。 食品マトリックスからのリステリア単離の提案されたスキムは、サルモネラの それと類似するが、例外として、二系列分配スキムの場合における図６に記載の ３段階向流水性二相系を、１系列で実施した。また、実施例４におけるように、 ほとんど全食品マトリックスは、リステリア二相系による第３段階の最後に除去 されることが観察された。 リステリアが存在すると予想される数種の新鮮および加工食品が試験された。 これらは、乾燥ミルク、サラミ、リコッタチーズ、摩砕豚肉、ベーコン、ブリー チーズおよびサワークリームを含んだ。食品は、実施例４に略述される操作にし たがって種々のリステリア種を用いて、低レベル（約１．０ｘ１０-2および１． ０ｘ１０-1細胞／ｍｌ）で接種された。振盪機／培養機（３００ｒｐｍ；強い撹 拌）において３０℃２４時間、接種およびネガティブ対照サンプルを培養した後 、リステリア集積ブロスからの１つのサンプルが、水性二相系の第１段階に転移 された。向流分配が一度行われた後、標的の上相（系ＬＬ−Ｐ）１０μｌが、改 変Ｏｘｆｏｒｄ Ａｇａｒ（ＭＯＸＡ）プレート上にストリークされた。そのプ レートは、３０℃で２４時間培養された。疑いのあるリステリアコロニーは、メ タリック灰色、およびａｅｓｃｕｌｉｎ加水分解の結果であるコロニー周辺のレ ンガ／ベーコン色に基づき、バックグラウンドから区別された。 選択鑑別アガー（ＭＯＸＡ）上のリステリア単離に加えて、リステリアおよび 全バックグラウンド微生物の濃度が、集積／増殖段階の末期（ｔ ＝２４時間）に、そして水性二相段階の後に、ＢＨＩおよびＭＯＸＡプレート上 で希釈／計数することによって測定された。また、標的対バックグラウンド比の 評価が、ストリークプレートの結果とともに使用されて、接種リステリア種の単 離および水性二相分配段階の有用性を評価した。全食品マトリックスは、３並列 のフラスコにおいてリステリアを接種された。その結果の総括が、下記表７に示 される： 実施例７ 酵母および藻類の分配挙動 実施例７は、細菌以外の生物体が、本方法により単離および検出されることを 例証する。 水性二相系Ａ＊，Ｂ＊およびＡ2Ｐ８２（単段階）において数種の酵 母および藻類の分配特性が試験された。酵母および藻類の種は、次の通りであっ た： 酵母： サッカロミセス・セレビシエ（２３４１）ＡＴＣＣ カンジダ・トロピカリス（７５０）ＡＴＣＣ 藻類： ナビクラ・ペリクロサ（褐藻類） クロレラ・ピレノイドサ（緑藻類） ペリジニウム種（黄金色藻類） アナシスチス・ニヅランス（藍藻類） カリタミオン種（紅藻類）。 酵母の分配挙動は、実施例１）のようにマスバランスを実施することによって 決定された。各相の計数は、ＢＨＩアガー上での１０倍希釈およびプレート塗布 によって行われた。藻類が示す色彩の利点を生かして、上相または下相のいずれ か、または界面における藻類の移動を肉眼的に検査して定性的に決定され、そし てまた写真撮影された。酵母および藻類の分配挙動は、下記表８に総括される： 上記データに基づき、本発明者は、酵母および藻類の限定的分離が、二系列ま たは単段階の二相系を用いる本方法を適用することによって得ることができると 確信する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION     A rapid separation and identification method for contaminating microorganisms from composite matrices                               Field of the invention   The present invention relates to a contaminated complex matrix. The field of microbiology and methods for separating and detecting specific microorganisms from I do. More specifically, the invention relates to isolating members of a particular target microorganism. To the use of aqueous two-phase polymer systems.                                  background   Contaminating bacteria in food can harm health in developed countries as well as in developing countries. To be remarkable. For example, Salmonella (Salmonella) Food poisoning Has been estimated to occur in the United States each year. This Acute symptoms of the disease include nausea, vomiting, diarrhea, chills, fever and exhaustion. About 2, Every year, 000-3,000 (0.1%) people are infected with Salmonella poisoning in the United States. But these victims usually include infants, the sick and the elderly . Poultry, red meat, seafood, eggs, and all foods containing these products are special In addition, it has the possibility of carrying a bacterial pathogen. The challenge for food microbiologists is Often a small number of these selected from foodstuffs containing a large number of various other bacterial groups To be able to recover the pathogen. Bacterial injuries that were inflicted shortly before death Recovery of pathogens is even more difficult. Heating, freezing, chemical and other processing steps The floor can damage or weaken the pathogenic bacteria in the food to near death.   It is estimated that more than 5 million Salmonella analyzes will be performed annually in the United States. You. Bacterial pathogen usage in clinical, food, dairy, environmental, and water samples Is to detect the target microorganism in at least two kinds of enrichment culture broths. Need to grow. Initially, the sample is a single broth (pre-accumulation) And then cultured at a constant temperature for a fixed time. Then this broth constant The amount is added into a second type of (selective) enrichment broth and then at constant temperature Incubate for a fixed time. The purpose of the accumulation process is to measure extremely low levels of pathogens in the sample. Is grown to a level sufficient for detection. For example, 25 grams of food It may be that there is only one living Salmonella cell in the sample. Not. Thus, pure culture assays, immunoassays, motility fixation assays and Detection in assays such as hybridization and hybridization probe assays. It is necessary to grow Salmonella to a concentration high enough to allow . The most sensitive immunoassays and hybridization assays are Generally, at least 100,000 cells / ml in enrichment culture are preferred. Or the presence of 10,000,000 cells.   Typically, the identification of bacterial pathogens retained in food involves three basic steps :   1.Non-selective or pre-enrichment propagation:   In general, food samples are first prepared using a stomacher or blender. Selective, homogenized in liquid medium (pre-enrichment broth). Food samples Not all are pathogens, but contain a broad spectrum of bacteria. these Nonpathogenic flora targets pathogenic species to be detected Known as an organism, but referred to as a background organism . Often, target organisms contained in food samples are Damaged, non-selective broth required for resuscitation. According to food Thus, the ratio of target to background organism at the end of pre-accumulation is from 1: 1 to 1 : Up to 100,000. Typical pre-enrichment medium for Salmonella Has some changes, but the Bacteriological Analytical Manual, 6th Edition, Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA (1984) Lactose broth for various foods.   2.Selective integration:   Next, the sample is cultured in a medium that promotes selective growth of the target microorganism. This In the step, the growth promoting medium may further contain a selective inhibitory reagent. The sample is further accumulated. Continuous growth of target organisms Achieved while simultaneously inhibiting bacterial growth.   3.Selective plate culture:   This stage suppresses the growth of background bacteria and is a pathogenic target Use a solid selective medium that can visually distinguish pure isolated colonies You. The relative number of "suspect positive" colonies isolated is And also depends on the selectivity of the liquid and solid media. Preferably, isolated If the number of target colonies suspected to be Are present in the presence of the biochemical confirmation of the early stage, The goal is to enable statistical selection of targets for identification.   4.Hypothetical identification:   Colonies suspected of being positive are further transplanted to a suitable differential agar. if If these tests are positive, the colony is hypothetically considered positive and Undergoes a series of biochemical and serological tests for final confirmation and identification. You. Thus, using conventional methods, a signal suspected of being positive is produced within three days. With positive hypotheses within 4-5 days and confirmation and serologic identification between 5-7 Can be done within days.   Since it takes time to identify positives, more bacterial pathogens can be identified in foods. There is a need for a method to quickly identify positives. For example, if the pathogen One of the growth stages required for body determination can be eliminated or shortened It would be desirable if faster identification was possible. The inventor , Aqueous two-phase partitioning, target versus background of contaminating bacteria from food matrices The ratio is selectively increased so that, in practice, it can be placed in the prior art stage 2 discussed above. Have found the ability to replace it.   Aqueous two-phase partitioning techniques have long been applied to particle separation (Bronsted, J . N. ,Z . Phys. Chem. Abt. A 257, (1931)). Per-Ake Albertsson He was one of the first to realize the potential of the method for quality separation (Per-Ake Al bertsson, "Partition of cell particles and macromolecules", 3rd edition , J. et al. Wiley & Sons, (1986)). Since Albertsson's work, Arrangements can be used to characterize or determine cell surface properties, and It has been used to separate proteins, enzymes and nucleic acids. US Patent 4,980,065 No. 4 describes the use of aqueous two-phase systems useful for the separation and purification of biochemicals and optical isomers. Teaching Is shown. International patent WO 90/05768 purifies industrial lubricants by removing contaminating microorganisms Describes the use of a polymeric two-phase system to perform   Aqueous two-phase partitioning has also been used in various ways for biological cell separation. . For example, Johansson et al. (Anal . Biochem, 155, 215, (1986)) Qualities such as enzymes, nucleic acids, cell organelles, eukaryotic cells, and E. coli. Kori (E. FIG. co li ), Salmonella and Shigella (Shigella) Of bacterial cells containing strains It provides a review of the use of aqueous two-phase systems for partitioning. Similarly, Tortoli et al. (Eur . J. Clin. Microbiol. Enfect. Dis . 12, 425, (1993)) An aqueous two-phase system for the isolation of C. bacteria is disclosed.   The mechanisms involved in the ability of biphasic systems to separate various biological cells are connected to liquid systems. It depends on changes found in the biochemical composition of the cell wall or cell membrane. Living Bacterial cells, especially bacterial cells, contain various structures and biochemical macromolecules, such as cell surfaces With pili, flagella, proteins, acidic carbohydrates and lipopolysaccharides expressed on You. Types of structures and biochemical compounds, and their expression and concentration on the cell surface The degree determines the physicochemical surface properties. Cells belonging to different genera, species or strains Have different physicochemical surface properties that distinguish and distinguish them from other bacterial communities . For example, the general set of surface properties may be common to all bacteria, The degree of change in these properties will distinguish the cell population from others. This Their properties include surface charge, hydrophobic / hydrophilic, cell density, size and shape. Differences and the cells may have other cells and / or other types of surfaces / interfaces (solid "Surface energy" that defines the surface force that acts when in contact with the body, liquid, or air) including. Biphasic systems are surface characteristics of bacterial cells. Unique to isolate even closely related strains using gender differences Qualifications. For example, Levive et al. (J . Liq. Chromatogr., 7, 403, (1984)) Except for the proportion of lipopolysaccharide molecules with long and short polysaccharide surface properties , Which are the same Salmonella typhimurium (Salmonella typhi murium ) To use countercurrent partition chromatography to separate cells Teaching.   One of the most common aqueous two-phase polymer systems is polyethylene glycol (PE) G) and dextran. The PEG-dextran system is particularly useful for bacterial cells. Used for separation. For example, WO 9002948 states that polymeric two-phase systems are used in cereal products. Demonstrated useful for quantitative or semi-quantitative measurement of fungal spores or bacterial cells doing. In addition, Xiu et al. (J . Gen. Microbiol., 129, 3075, (1983)) Dextran-polyethylene for separating Salmonella belonging to different serogroups Discloses the use of aqueous two-phase partitioning in glycols, and Stendahl et al. (Acta P athol . Microbiol. Scand. Sect. B Microbiol ., 85, 334, (1977)) Utilizing the difference in surface charge properties of rough and rough Salmonella typhimurium, 6.2% (wt / wt) dextran 500 and 4.4% (wt / wt) poly (d Bacteria using free zone electrophoresis following the use of Are separated.   Although the above method is useful for isolating closely related bacteria, To solve the problem of isolating and detecting pathogens from other complex matrices, use aqueous two-phase systems. No effort was made to apply. To date, aqueous two-phase systems have been Rather than separating all members of a genus from a ground bacterial population But rather related bacterial strains It has been used to separate. The present inventor has reported that aqueous two-phase polymer Adaptable to isolate and concentrate all members of a specific target bacterial genus from und microorganisms I found that I could. Include for target pathogen and background The method has the dual purpose of eliminating objects and other elements of the composite matrix The ability is technically unique. Moreover, two-phase separation requires a short time to perform. This method only requires selective growth, which requires considerable culture time. It offers significant time savings over conventional methods that require time. Furthermore, the present invention Responders should be able to isolate strains with pathogens that would not be detected using conventional methods. Has been found to allow detection. Therefore, pathogens from contaminated matrices The use of aqueous two-phase polymer separation techniques for body separation and identification It represents an important advance in                               Summary of the Invention   The present invention provides a method for separating a target microorganism contained in a composite matrix, comprising the following steps: Provide a way:   i) homogenizing the composite matrix and, in the presence of a pre-enrichment medium, Culturing the composite matrix to resuscitate and grow the target microorganism, thereby Increasing the number of the target microorganisms in the composite matrix;   ii) providing a sample of the enhanced composite matrix of step i) for at least 1 Emulsifying in two aqueous polymer two-phase separation systems; and   iii) Separation of the emulsified system into an upper phase and a lower phase, whereby significant amounts from the sample Finding said target microorganism in either said upper phase or said lower phase.   The present invention also provides a marker included in a composite matrix, comprising the following steps: Provide methods for isolating and detecting selective microorganisms:   a) homogenizing the composite matrix and, in the presence of a pre-assembled broth, Culturing the composite matrix to resuscitate and grow the target microorganism, thereby Increasing the number of said target microorganisms in said composite matrix;   b) providing a sample of the enhanced composite matrix of step a) with at least one Emulsifying in an aqueous polymer two-phase separation system;   c) Separating the emulsified system into an upper phase and a lower phase, whereby significant Finding an amount of said target microorganism in either said upper phase or said lower phase;   d) An aliquot is taken from the phase of step c) containing a significant amount of the target microorganism, and Detecting the presence of said target microorganism in an aliquot of the target microorganism.   In a preferred embodiment, the target microorganism is a bacterium and the composite matrix is a food And the aqueous two-phase system is PEG / dextran.                             Brief description of figures   FIG. 1 is a typical phase diagram for any two-phase liquid polymer system.   FIG. 2 illustrates a method for determining the polymer composition of the upper and lower phases, 1 is a typical phase diagram for a two-phase liquid polymer system.   FIG. 3 is a phase diagram of the PEG (6000) and dextran (500) systems. FIG. 4A shows E. coli in PEG and dextran with varying amounts of NaCl. Ko 2 is a plot of the two-phase separation of the strain.   FIG. 4B shows cleavage in PEG and dextran with varying amounts of NaCl. Bushiella Oxytoka (Klebsiella oxytoca) Two phases of strain It is a plot of separation.   FIG. 5 shows E. coli with varying amounts of NaCl in the feedpoint composition. Stiff And the results of the two-phase separation of Klebsiella oxytoca.   FIG. 6 shows a single system for isolation of target pathogenic microorganisms from a contaminated composite matrix. 2 illustrates a two-phase separation method for a row.   FIG. 7 shows a two-line system for isolation of target pathogenic microorganisms from a contaminated composite matrix. 3 illustrates the phase separation method.   FIG. 8 shows the time from the growth of the mixed bacteria in the pre-enrichment medium to the end of the two-phase separation scheme. , E .; E. coli. Black-backedE. FIG. cloacae) And C.I. Freundy (C. freundii) In the presence of a mixed population of Chifimurium (S. t yphimurium ) Shows a reduction in the ratio of target bacteria to background bacteria Data.   FIG. 9 shows the time from the growth of the mixed bacteria in the pre-enrichment medium to the end of the two-phase separation scheme. S. inoculated into ground beef. Target bacteria of Typhimurium versus background cells It is data showing reduction in the bacterial ratio.   FIG. 10 shows the time from the growth of mixed bacteria in the pre-enrichment medium to the end of the two-phase separation scheme. S. inoculated in dried milk. Typhimurium target bacteria vs background 9 is data showing a reduction in bacterial ratio.   FIG. 11 shows the time from the growth of mixed bacteria in the pre-enrichment medium to the end of the two-phase separation scheme. A large number of sacks inoculated in ground beef, chicken, ground turkey and pork sausages The ratio of target bacteria to background bacteria of Salmonella sp. This is data indicating the size reduction.                           Detailed description of the invention   As used herein, the following terms are used in interpreting the claims and specification. May be used for   The term “matrix” or “composite matrix (comp) lex matrix) is all that will support the growth of various microorganisms. Or inorganic material. The matrix of the present invention is effectively a composite. And will consist of various substances that support the growth of various organisms. Typical ma Tricks are food material, biological tissue, organic waste, excrement, blood, soil, groundwater , Sewage and the like.   As used herein, the term "stomacher" Or "homogenizer" or "blender" is used interchangeably, and Equipment that can thoroughly blend and mix microorganisms and food matrices Would point to. “Homogenizing” means that the composite matrix is small Mechanically blending or mixing so that means. If the matrix is already in particulate form, The `` step '' is performed by simple stirring or mixing of the matrix to A uniform distribution is achieved.   The term “aqueous two-phase system” or “aqueous polymer system” or “two-phase system” refers to vigorous mixing. Based on the differences between the molecular structures, ionic and electrostatic properties of the two macromolecules Refers to the combination of all two water-soluble polymers that will separate into two phases Will. Ordinary two-phase aqueous polymer system, other polymers are also possible and often used But comprises polyethylene glycol and dextran. other Typical two-phase systems include, but are not limited to, hydroxypropyl starch-PE G / HTwoO: Ficoll-PEG / HTwoO: Ficoll-dextran / HTwoO; Polyvinyl Alcohol-dextran / HTwoO: carboxymethyldextran sodium -PEG-NaCl / HTwoO: PEG-potassium phosphate / HTwoO; and polymer An amphoteric electrolyte acrylic acid copolymer may be included. Either one or both high If the molecule is either non-ionic or polyelectrolyte, or one of the polymers However, if it can be replaced by a low molecular weight component, other combinations may also be used. It is possible.   The multi-phase, preferably two-phase, aqueous system may be single or as part of a continuous "countercurrent" system. May be used. As used herein, the term "countercurrent separation" refers to the small amount of aqueous two-phase systems. If at least two stages are used, and after emulsification has been performed and equilibrium has been achieved, Refers to biphasic aqueous partitioning where the relative weight percent composition of the polymer in each stage is the same Will. In this way, higher selectivity for the target organism of interest is obtained . The term “target microorganism” or “target organism” or “target bacterium” is used according to the method. And the microorganism to be isolated and identified. The target microorganism is a prokaryote Or eukaryotes, and may be members of a synthetic mixed culture. , Or as contaminants in the composite matrix. Targets of particular interest Organisms are bacteria that are retained in food.   The term "background microorganism" or "background bacteria" or "ba Background organisms '' are found in the presence of the target organism but are Will not refer to any organism. As with the target organism, the background An organism can be either prokaryotic or eukaryotic, and has a genetic Or they may or may not be biochemically related. In the context of the present invention, The most interesting of these background organisms are bacteria that are carried in food is there. Term, a The “significant amount of target microorganisms” in a given sample is the majority of target organisms from that sample. Means   The term “selective growth medium” is used to enhance the growth of a target organism, Specially formulated solid or liquid growth media to control body growth Would point to. In addition, selective growth media provides for the detection of target organisms, generally by visual inspection. It may also contain ingredients designed to facilitate it.   The term "pre-enrichment medium" promotes the growth of both target and background microorganisms. It will refer to either liquid or solid media designed to. Microbes exist Inoculate, culture, and inoculate the pre-enrichment medium to increase the number of all microorganisms Target organisms that may have been damaged during initial sample processing Revive. The pre-enrichment medium of the present invention can be used at pH of various food matrices. Will be buffered to allow for change.   The term "enrichment" or "enhancement" culture increases the number of target and non-target microorganisms It will refer to the culture obtained after culturing in the pre-enrichment medium.   The term “feedpoint composition” refers to each height present before mixing and emulsification and present. At least 2 calculated based on the total weight percent of the molecular components and based on the phase diagram It will refer to the initial composition of the species liquid phase polymer.   The present invention provides a method for rapid isolation and identification of a target microorganism from a composite matrix. provide. A sample of the matrix suspected of containing the target microorganism is first Modified and then inoculated into a pre-enrichment medium. Culture in pre-enrichment medium Increase the number of both background and target microorganisms to be detected Help. After sufficient incubation time, Co-culture samples are typically biphasic countercurrent biphasic aqueous containing PEG and dextran It is subjected to separation by a polymer system. The separation performed in the two-phase system is background To isolate (ie, preferentially select) the above target organisms to facilitate the identification procedure. Help.   The identification process comprises selective plating and gross identification as in the preferred embodiment. Can be accomplished using However, alternative methods of identification include, for example, allogeneic or hybrid Polymerase chain to obtain enough target DNA for redidation assays Gene amplification techniques, such as reactions; or antibodies using, for example, Elisa-type assays Will include detection methods.   Target accumulation:   The minimum industry standard for the detection of bacterial pathogens retained in food is the food matrix. This is a method for reliably detecting the presence of a single pathogenic cell in 25 g of a cell. This rigorous test Biochemical, immunological or nucleic acid hybridization means to suit Collection method to enhance the growth of target pathogenic cells in order to facilitate their detection by Methods and media have been developed. A typical enrichment operation involves the growth of the target organism and normal Any background or non-target microbes present, as well as enhancing Use a medium that will also promote growth of the product. For example, the US Food and Drug Administration Salmonella Assay, Andrews et al., “Isolation and Identification ofSalmonella Species, “Chapter 7 in Bacteriological Analytical Manual. 6th Edition, Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA ( 1984). In this method, at least two integration steps are described. I have. The first step is that the food sample is enriched in a nutrient, non-selective broth medium. Reduce damaged Salmonella cells Restores a stable state and promotes proliferation. Next, the pre-collection broth (ie, A sample of one enrichment broth is composed of two selective enrichment broths (ie, a second enrichment broth). Where the sample is a growth-promoting medium containing a selection reagent. , Are further integrated. Each selective enrichment broth will grow most other bacteria Allows for a continuous increase in Salmonella organisms while simultaneously controlling   The present invention is particularly adapted for the detection of bacterial pathogens from food matrices. The above-mentioned target accumulation method was improved by using the pre-enrichment medium prepared in (1). 2 Different media have been developed for use in a preferred embodiment of the present invention. One specifically for Salmonella and the other for Listeria (L istella ). These media are used for various food matrices. It is highly buffered to allow for changes in the pH of the solution. Salmonella medium is Lactose broth, potassium phosphate, mannitol, magnesium chloride and pep Consisting of tons. Listeria medium is Brain Heart Infusion Broth, Group From Lucose, lithium chloride, ferric citrate, polymeric acids and potassium phosphate Become. The standard method excludes the step of selection and accumulation of typical bacterial targets, and In the light, it is replaced by the two-phase aqueous separation system described below.   The effectiveness of the pre-synthesis enrichment medium of the present invention is demonstrated by the fact that Salmonella and And Listeria growth has been demonstrated by the FDA and the Bacteriological Analytical M anual. 6th Edition Seen when compared to the medium described above. Salmonella Comparison of pre-accumulated broth (BBSM) with FDA's BAM lactose broth Possible by comparing the specific growth rates of pure Salmonella strains in culture is there. Growth in liquid media In some cases, given an S-type growth curve followed by an organism, the logarithmic growth portion of the curve is It can be described by the following formula:                     1nN = 1nN0+ Δt   Where:     N = cell concentration at a certain time “=” cells / ml     N0 = Initial cell concentration at time 0     ＝= specific growth rate (of organism) [=] 1 / hr     t = growth time [=] hr   The specific growth rate (Ψ) also depends on the doubling time (tD) Or average generation time, if One is N = 2N0, Ie, doubling is:             tD= (1 / Ψ) 1n2 = 0.69 (1 / Ψ)   The specific growth rate of Salmonella strains grown on BBSM medium was determined by FDA's BAM Advantageously compared to specific growth rates in toast broth. The specific growth rate is as follows: And compared:   BBSM proves to be at least comparable to lactose broth.   Aqueous two-phase polymer separation system:   Liquid polymer phase separation is a very gentle fractionation method, It takes advantage of the wide range of surface dressing and physicochemical properties that distinguish biological material, It is particularly well adapted for the separation of biological matter. The simplest system has a fixed percentage A mixture of two immiscible aqueous polymers is required. Intense mixing of polymer systems , Resulting first in the emulsion and finally in the separation of the macromolecules into two different phases You.   The choice of an appropriate two-phase system for the problem at hand is inevitable. Biological substance, (specific It is important to maintain the viability of cells throughout the separation process. For separation, the phases must be mild and water content, ionic composition, osmolality and Consideration must be given to denaturing effects. Most of these considerations are The phase containing the organic solvent is eliminated, leaving an essentially water-soluble polymer.   The basis of separation in a two-phase system is the selective distribution of substances between the phases. With soluble substances Implies that the partitioning occurs primarily between the two large phases, and that the partitioning has a partition coefficient K,                     K = Ct/ Cb Where C istAnd CbAre the upper and lower phases, respectively. Is the concentration (mole / l) of the partitioning substance. The partition coefficient does not depend on the phase volume, Affected by the nature of the two phases, the nature of the partitioning material and the temperature. The method that governs distribution Canism is not fully understood; however, particles and two It is the result of the combined interaction of hydrogen, ions and hydrophobic bonds between the child phases. Seem. In general, the properties that have the greatest effect on distribution are the surface charge of the particles, Size and hydrophobicity of the particles. Of the theory governing particle distribution in two-phase systems For a complete review, see Per-Ake Albertsson, supra, or cited herein. Tsu See U.S. Patent No. 5,110,733, incorporated herein by reference.   Single-step separations often have a uniform partition coefficient, such as bacterial spore DNA Sufficient for particle separation. Other materials with different distribution coefficients are like countercurrent distribution. Would require extensive multi-step operation. Countercurrent two-phase systems are emulsified and equilibrated After being formed, an aqueous two-phase system in which the relative weight percent composition of the polymer in each stage is the same Use at least two stages. In countercurrent technology, the sample is first placed in the first stage Separated floor. After the two phases have equilibrated, a certain amount of the target-rich phase is Moved to two stages. The second stage is mixed with the transferred target rich phase to form the first stage Contains a specific balance of polymers that results in a relative weight percent composition of the polymer equal to that of the floor. Have. As the number of stages increases to the order of 10 or 100, A "stream" system is a chromatographic method that separates a mixture through a variable residence time. Start working like a column. Repeated phase splitting and remixing is even more Purification of A typical countercurrent method is often used to obtain acceptable purity for a particular substance. Often, 50-60 separate extractions are required.   In theory, any number of stages could be used for countercurrent implementation, however, For the purpose of clarification, the three-stage method is preferred, and if necessary For the isolation of Nera, the three-step method is divided into two lines. Two-phase separation divided into two series The process consists of two separate different aqueous two-phases, each having three stages and carried out in countercurrent mode. Refers to the method of incorporating a system set. In a two-line approach, One aliquot is subjected to separation in a first two-phase system, while a second constant The amount is subjected to a separation in a second two-phase system. Upon completion of the third phase of both systems, each two-phase system Target The rich phase sample is spread on a separate selective growth medium. Rich in targets The phase can be an accumulated amount of target microorganisms or a reduced amount of background microorganisms, Or a combination of both. In this scheme, a more highly selected purpose A target organism is obtained. The phase in which the target will be enriched should be a suitable aqueous two-phase system. It is predetermined on the basis of a single-step distribution experiment of a pure culture carried out using.   Suitable polymer:   Various polymer systems consisting of at least two aqueous polymers are suitable for the present invention. And may include, but is not limited to: Polyethylene glycol / Dextran; Polypropylene glycol / Dext Run; polyethylene glycol / polyvinyl alcohol; polyethylene glycol / Ficoll (copolymer of sucrose and epichlorohydrin, Pharmacia Fi ne Chemicals, Uppsala, Sweden); polyvinyl alcohol / dextran; Chill cellulose / dextran; polypropylene glycol / polyvinylpyrroli Don; charged polyethylene glycol / dextran; polypropylene glycol / Methoxypolyethylene glycol; polypropylene glycol / polyvinyl alcohol Alcohol; polypropylene glycol / hydroxypropyl dextran; poly Ethylene glycol / polyvinyl pyrrolidone; polyethylene glycol / starch; And polyvinyl alcohol / methylcellulose polymer ampholyte-polyvinyl alcohol. Further combinations of these and other macromolecules are also suitable, It is well known from the literature (Per-Ake Albertsson, supra). The preferred polymer system for this isolation is , Polyethylene glycol (PEG) And dextran (Dx) macromolecules. PEG is available at various molecular weights It is an available linear synthetic polymer. PEG is launched in solution It is quite stable in dry powder or flake form. The phase partitioning method of the present invention Normal fraction of PEG supplied by Union Carbide Corporation used Is a molecule in the range of about 300-50,000, preferably in the range of 300-30,000 PEG with a quantity such as PEG300, PEG400, PEG3,400, P Includes EG 8,000 and PEG 20,000. Other PEG commercial names are poly Glycol E (Dow Chemical), Carbowax (Union Carbide), and pouracolE (BASF). 30 to 40% by weight of PEG stock solution is powder Prepared by accurate weighing and dissolution at room temperature. PEG can be mixed with stirring for several hours. Easily soluble and freshly properly stored PEG powder usually contains less than 0.5% water. Including minutes. The storage density can be measured by the refractive index.   Dextran, mainly poly (α-1,6-glucose), is in the range of molecular weight fractions. It is commercially available in boxes of about 2,000 to 2 million. The same applies to derivatives Those having a molecular weight of are useful. Dextran 20-30% by weight preservation solution is powdered The powder is mixed into a paste using an equal weight of water, and then the water in dextran is considered. Add enough water to get an apparent concentration about 10% higher than intended Created by doing. Dextran stock solution is stirred at room temperature for 2-3 hours However, the time may be shortened by heating. Dextran storage solution The concentration can be measured by optical rotation analysis.   Water-soluble polymers to enhance solubility, phase separation or chirality Salts such as potassium phosphate, sodium chloride, ammonium sulfate, and magnesium sulfate Adding nesium, copper and lithium sulfate, monosaccharides and disaccharides, It is also considered to be within the scope of the present invention.   The aqueous two-phase system may be prepared from a stock solution of the polymer. The storage solution should have a pH Contains known buffers to adjust and salts to increase the tonicity of the solution Is also good. Preferably, a potassium phosphate buffer is used for pH adjustment. This These buffers and salts are chosen depending on the nature of the material to be separated and Then, it can be easily determined by those skilled in the art using the aforementioned criteria. For example, high water solubility Molecules are generally uncharged and of high molecular weight, so at their high concentrations The contribution to the tonicity of the solution is small. If the mixture to be separated has low ionic strength If it contains bacterial cells that will be destroyed by the solution, the addition of salt is indicated. Will be. Phase tonicity can be measured using a vapor pressure osmometer.   Additives such as salts, buffers, sugars and polymers can It may be added to enhance the tar. Suitable additives include potassium phosphate, Lucose, glycerol, butyl cellosolve, propyl alcohol and sodium chloride Including thorium. Increase the difference in density or hydrophobicity between the two phases, Additives that can lower the viscosity or increase the interfacial tension between the two phases include phase separation And will increase the separation factor.   Also, temperature and pressure can be manipulated to enhance phase separation and partition coefficients. Suitable Severe temperatures range from the point at which the aqueous two-phase system begins to freeze to the boiling point of water, typically Ranges from about −10 ° C. to 100 ° C. However, if the target microorganism is alive It is desirable to have a suitable temperature of the present invention. The degree is between 0 ° C and 37-43 ° C. Pressure range results in a two-phase system Including all pressures, generally from 0.01 to 1,000 atmospheres. Preferred pressure is ambient pressure Power.   Although various PEGs and dextrans of various molecular weights are available, The preferred PEG is PEG (8000) or PEG (3400), Kistran is DxT500.   Choice of two-phase system:   Selection of the appropriate macromolecule for a particular separation is easily made through the use of phase diagrams. You. In a mixture of two types of polymer and water, the two-phase system has a component in a certain range of proportion. Will occur if present at Figure 1 shows the composition of constituents where phase separation occurs. In the phase diagram as shown in FIG. In FIG. 1, the concentrations of the two polymers are water Plotted as weight percent of polymer in. The curve separating the two regions is Vino -Dialial Lucas of Point   points). All with a composition represented by a point above the line Mixture undergoes two-phase separation, while the mixture represented by the point below the line Give a homogeneous solution.   A two-phase system in equilibrium is illustrated by the phase diagram of FIG. If in Figure 2 If point A on line CB represents the composition of the entire system, then the composition of the lower and upper phases is Will be represented by points B and C, respectively. Point A is added to the system before emulsification Represents the feed point composition, which is the composition of the polymer component to be used. Emulsification and sedimentation After resting, the relative composition of the upper and lower phases has changed and is no longer a feed point parameter. Does not reflect the meter. Thus, the phase diagram is known for the composition of the feed points In case, the composition of both phases Used to determine Theory governing phase diagrams and determining the composition of two-phase systems For a complete discussion of their use in, see Per-Ake Albertsson, supra, and See U.S. Patent No. 5,110,733, which is incorporated herein by reference.   The present invention relates to a method for preparing a composite matrix contaminated by background microorganisms. It is used for two-phase separation of organisms to perform isolation of specific microbial populations. Provide improved standard technology. The method of the present invention comprises the steps of: Take advantage of the properties of bio- and biphasic systems and successfully mimic the dynamics of cellular / biphasic systems. And developed a special two-phase method that is effective against specific target microorganisms. Target of purpose Appropriate step-by-step procedures to determine the appropriate feedpoint composition for organism isolation Is as follows:   a) Based on the cell or biological substance to be separated, Size, polymer ligand, electrolyte, buffer performance, settling time and temperature. Select;   b) As described by Albertsson above, transition between one and two phases and vice versa By using either gel permeation chromatography or turbidity as an indicator To construct a two-phase diagram of the above system;   c) Select a good feed point within the binodial curve and Select several target and background organisms that may coexist in the pull The   d) In the pre-enrichment medium used as part of the microorganism isolation method, A pure culture of the product is grown to provide targets and buffers typically provided for the isolation procedure. Achieve a balance of background organisms;   e) techniques and methods known in the art (ie, Coulter counter equipment, light Density, plating on non-selective agar, etc.) Use each of the above pure cultures by determining the cell number of round cells Perform a single-step partitioning experiment;   f) For target and background cells, upper phase, lower phase and also emulsification ( Sampling the mixed) phase;   g) By writing an appropriate mass balance equation, the upper and lower phases and the interface Determine the cell fraction   h) Maximum separation of target from background in either upper or lower phase Comparing the distribution results of all target and background organisms, where is optimal;   i) If the separation is insufficient, feed closer to the binodial curve Select a point and repeat steps d) -h);   j) If the operating conditions do not satisfy the two phases, proceed to step a).   Two-phase polymer system for the separation of Salmonella and Listeria:   This two-phase system, useful for the separation of Salmonella and Listeria, is useful for cell separation. Consisting of PEG and dextran selected based on their use above (P . A. Albertsson, supra). The starting feedpoint composition of PEG and dextran is 3 was determined based on the phase diagram shown in FIG. 5-6.5% dextran in water and water The combination of 3.5-6.5% PEG makes the stepwise feedpoint selection method Used based on the distribution data of the target and background microorganisms used for the pure culture. Was. After the selection of the polymer system, the concentration of electrolytes and buffers was increased to 6 bacterial strains. Pure culture It was determined using nutrition. Electrolyte concentration is a pure target for various electrolyte concentrations And based on the partitioning behavior of background microorganisms, and also The acid buffer is added to the two-phase system when a fixed amount of inoculum from the pre-enrichment broth is added. Determined by knowledge of being brought in. Further, PEG-bis (amine) ( Positively charged PEG molecules) to take advantage of cell surface charge properties and target And added to the two-phase system to enhance the distribution of background microorganisms. Fine The bacteria are 4% (w) in 0.012 potassium phosphate buffer containing various amounts of NaCl. / W) 5 in PEG (MW8000) and 0.012 potassium phosphate buffer % (W / w) Dx (MW 500,000) underwent biphasic partitioning. FIG. A is E. 1 illustrates one result of such a distribution using stiffeners. In FIG. 4A As can be seen in the two-phase feedpoint composition, Increasing is the first to be found in the upper phase. Kori, a large found in the lower phase Shifts to large numbers of bacteria and finally, at high salt concentrations, significant amounts at the two-phase interface Resulted in a shift to cells. This general pattern is Klebsiella oxy True for Toka (FIG. 4B) and all tested cell strains, However, the relative concentration of cells in each phase varied at different rates. For example, 0.04 With MNaCl and E.C. Coli and K .; 5.8x109 each of Oxytoka And at a cell concentration of 1.2 × 10 8, 88% of E. coli cells and K. Oxy 96% of the toka cells were enriched in the upper and lower phases, respectively. Next, test Was performed for two-phase partitioning of mixed bicultures using various amounts of NaCl. . FIG. 5 shows E. coli using various amounts of NaCl in the feedpoint composition. Stiff And K. Oxytoca 2 illustrates the results of a two-phase distribution. Mixed culture data show E. coli at 0.04 M NaCl. Only 46% of E. coli cells move to the upper phase, while K. 95% of oxytoca cells are in the lower phase And stay in E. Pure culture means that 52% of E. coli cells have migrated to the interface. Different. Based on these and other results from mixed cultures, countercurrent separation is It was concluded that this was a suitable method for cell separation.   Therefore, based on field tests with potential target bacterial pathogens and on cell surface With the knowledge of quality, the inventor has learned how to build a countercurrent two-phase separation system for each target microorganism. The law was developed. Figure 7 shows two series of three-stage countercurrent two-phase separation systems for Salmonella. Briefly. A 1 ml sample of the pre-enrichment culture contains two different two-phase separation systems, A and B. System A is designed to partition the target bacteria into the upper phase, while System B is designed to partition the target bacteria into the lower phase. Only 3 countercurrent operations The steps are performed as described above, at which point the phase containing the target is Coated on top and cultured for detection. For experiments involving food matrices In general, and unexpectedly, food matrices partition at the interface. That must be noted. Thus, in the final stage of the three stages, almost all Or no contaminating food matrix is left in the system.   The development of a two-line method allows the isolation of all strains and species of Salmonella target bacteria. It was necessary to make it work. Experimental data show that the partition coefficient of Salmonella Due to the large differences, all strains have very high partition numbers and Without it suggested that they could not be reliably distributed in the same phase. For example, The genus Lumonella is very diverse, Consists of about 2,000 strains. The method covers all Salmonella strains and Must be able to isolate all Salmonella from different food matrices. No. Thus, the number of partitions required is reduced and full coverage of all target bacterial strains is possible. To make it work, a two-sequence method was devised.   Variations in the cell surface properties of Listeria species and genera are lower than in Salmonella. The strain variation within the genus Listeria is lower than that of Salmonella, Required only one three-stage aqueous two-phase system. Re Aqueous two-phase systems targeting S. terriers combine pure Listeria with other antagonistic microorganisms. Based on partitioning experiments and also adapted to Listeria enrichment media.   Food matrix:   A wide range of fresh and processed foods is used to test this method for practical application. Artificial foods are mixed with various strains of Salmonella and Listeria, and The compound was subjected to a two-phase separation system. The food matrix is divided into two categories, fresh and And processed products. Fresh food is ground beef, ground turkey, chicken, chicken bag ( back), ground chicken, pork sausage and eggs. Processed food dried mill Ku, whole milk, cocoa, salad dressing, cottage cheese, coarsely ground pepper, o And ice cream. Each type of food has various effects that greatly affect the separation process. The parameters are shown. For example, many fresh foods have high levels of non-pathogenic microflora. With the inoculated (or naturally occurring) Salmonella or Liste Antagonistic pressure can be applied to the growth rate of the rear target strain. As a result, many The target strain is set to background concentration by the antagonistic pressure of background bacteria. Grows at concentration levels three to four orders of magnitude lower than I understood that. In addition, processed foods often have a damaged background Non-pathogenic bacteria, but they specifically interfere with the growth of the inoculated target strain. May also contain growth inhibitors that will inhibit the growth of target cells. No. Often, fermented products found in processed foods are useful for fermenting the product. Starter that is useful but is inhibitory for inoculated or naturally occurring target strains , With viable bacteria. Finally, food debris prevents selective growth of plating and bacterial cultures. The presence of the food matrix itself and various solute compounds emanating from it. Even now, they offer problems to be overcome. Unexpectedly, a good three-stage countercurrent The two-phase distribution system removed virtually all food debris from the system. In this aqueous two-phase system Is the amount of food debris that moves quickly to the interface and consequently moves to the second stage Dropped. When the same process is repeated again, virtually anything remains in the target phase. All food was removed and interference with transplantation and / or cell application was prevented.   Selective growth:   In the present invention, the selective differential agar used for identification is used in the field of microbiology. It is a basic and is used on a daily basis with many reference methods. For the purposes of the present invention , Hecktron Enterprise (HE) and Xylose Lysme   Deoxycholate (XLD) agar was used. Both agars are easy Based on bacterial utilization of toose and / or sucrose. These agar The identification of Salmonella in H.TwoCapture of S gas Facilitated by the emergence of black colonies from Bacteriological An alytical Manual. 6th Edition, supra).   Distribution of yeast and algae:   Using the teachings of the present invention, Saccharomyces cerevisiae (Saccharomy ces cerevisiae ) And Candida tropicalis (Candid a tropicalis Mixtures of other microorganisms, including various yeasts such as And aqueous PEG / dextran system (see Examples). The softness of the present invention To illustrate softness, the partitioning characteristics of several pure cultures of yeast and algae were Tested using an aqueous two-phase system developed for Monella and Listeria. Yeast Separation of a mixture of mother and algae, even though aqueous two-phase systems are not optimal for these cells Even without it, several were successfully achieved.   The following examples are intended to illustrate important aspects of the present invention, but It should not be considered limiting in any way.                                 Example   Materials and methods   Polyethylene glycol (PEG) (Sigma Co.) And positively charged derivatives of PEG-bis (amine) (Sigma Co.) PEG Prepared in 20% w / w and 10% w / w batches respectively and stored at 4 ° C. And used within 3-4 weeks. Similarly, dextran of various weights (Ph armacia) are prepared in 20% w / w batches, stored at 4 ° C., and Used within a week. Also, hydroxypropyl starch (Reppe AB) Prepared.   The microbial medium (broth, selection and differentiation agar) depends on the set recipe and Follow sterile conditions and, such as Difco Co. or Becton-Dickson and Co. Purchased from the vendor and prepared in the laboratory.   Bacterial strains are part of the internal DuPont collection. The yeast strain is the Americ from the Tissue Culture Collection (ATCC) and from Algae strains, Ward's Natural  From Science Establishment, Live Materials Department. aqueous The positioning of pure culture behavior in a two-phase system is described in Coulter Counte. r Instrument (Coulter Corp.) and / or non-selective nutrients Determined by direct splatting with 10-fold dilutions on non-agar.   Microorganism:   The microbial strains tested in the following examples were from various bacteria, yeasts and algae. And are listed below:   Salmonella: (Internal DuPont database)   S. Chifimurium (S. typhymurium), S.P. Heidelberg (S. Heidelberg ), S.P. Bredenay (S. breadney), S.P. Enteritidis (S. enteritidis), S.P. Hadar (S. hada r ), S.P. Thompson (S. thompson), S.P. Infantis (S. i nfantis ), S.P. New Porto (S. newport), S.P. Arizona (S. arizonae), S.P. Bertha (S. berta), S.P. Montevideo (S. montevideo), S.P. Galinarum (S. gallinarum) , S .; Agona (S. agona), S.P. Kedougou (S. kedougou), S. Binza (S. binza), S.P. Birko (S. virchow), S.P. A Natam (S. anatum), S.P. Saint Paul (S. Saintpaul), S. Stanley (S. stanley), S.P. Brandenburg (S. bran denburg ), S.P. Naples (S. napoli) , S .; Braendeoop (S. brainendup), S.P. Blocklay (S . blockley ), S.P. Manchester (S. manchester)   Listeria: (Internal DuPont database)   L. Monocytogenes (L. monocytogenes), L .; Welsimeri (L. welshimeri), L .; Ivanobii (L. ivanovii), L . Murai (L. murrayi), L .; Inocqua (L. innocua), L .; Gry (L. grayi)   Fungi:   Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevis iae ) ATCC 2341, Candida tropicalis (Candida tro picalis ) ATCC750   Algae: (Ward's Natural Science Establishment)         (Rochester, New York)   Navikura Periclosa (Naviculla pelliculosa) (Brown Diatoms), Chlorella pyrenoidsa (Chorella pyrenoido sa ) (Green algae), peridimium species (Peridium sp.) (Dinoflagellate Algae; golden color), Anasistis niperans (Anacys nidul ans ) (Blue algae), caritamion species (Calitammion sp.) ( Red algae)   Growth conditions:   All Salmonella were cultured in pre-enrichment medium, BBSM, at 37 ° C. with shaking.   Listeria cultures were performed in pre-enriched LBHI broth at 30 ° C., high speed (300 (rpm) with vigorous shaking / incubator.   Yeast cultures were grown in standard Sabaraud dextrose broth (Difco) for 27 days. Grown at ℃. Various algae are provided by the following vendors, respectively. Grown in special medium:   Navikura Periclosa is used in Bristol solution (Ward's, supra) Rela pyrenoidsa is used in Bristol solution (Ward's, supra) Um species were grown in soil medium culture (Ward's, supra) in Anastis niger. Can be obtained from Bristol solution and / or Erdschreiber solution (Ward's, In c), the caritamion species was grown in Erdschreiber's solution. Was.   Algae were cultured under fluorescence at 18-24 ° C.   Pre-accumulation broth:   The composition of BBSM and LBHI is as follows:                   BBSM (Salmonella)     Lactose broth 13g / l     KH2PO4 34g / l     Manitol 7.5g / l     MgC12.6H2O 5.0 g / l     Water 1.0 1*         *Adjust to pH 7.0 with NaOH                 LBHI (Listeria)     Brain Heart Infusion 37.0g / l     KH2PO4 6.8 g / l     Glucose 5.0     LiCl 10.0 g.l     Ferric citrate 20.0mg / l     Sodium pyruvate 0.2g / l     Acriflavine 7.5mg / l     Cycloheximide 25mg / l     Nalidixic acid 20.0mg / l     Charcoal 1.0g / l     Water 1.0 1*         *Adjust to pH 7.0 with NaOH   Selective growth:   The selection medium for Salmonella identification was Hechtron Enteric (HE). Or Xyrose Lysme Desoxycholate (XLD) Aga -(Difco).   Selection medium for Listeria identification is a modified oxford agar with increased LiC1 concentration. (MOXA). The composition of MOXA is as follows:                           MOXA     Columbia Blood Agar Base 39g / l     Esculin 10g / l     Ferric ammonium citrate 5g / l     LiCl 15g / l     Water 1 1*         *Adjust to pH 7.0 with NaOH   Yeasts are selectively grown on BHI agar plates (Difco).   Algae are not plated and are identified based on their color when grown in liquid media.   Two-phase aqueous polymer system:   The feedpoint biphasic aqueous polymer systems used in the present invention are listed in Tables 1-2 below. Enumerated. The system has been developed for the isolation of Salmonella and Listeria. Ma In addition, these compositions have been determined to be useful for separating mixed cultures of yeast and algae. Was decided.                               Example 1                Isolation of target bacteria from a mixed population of pure cultures   Example 1 determines an effective composition for a two-phase aqueous polymer system for bacterial isolation Figure 2 illustrates the method used to The single-stage aqueous two-phase partitioning experiment Xitka, E. Coli (656), Staphylococcus epidermitis (Sta phylococcus epidermitis ) And Lactobacillus mosquitoes Lunis (Lactobacillus carnisPerformed using pure culture Was. Cells are grown overnight in Penassay broth and the next day by low speed centrifugation. Harvested, and Washed twice with 20 mM potassium phosphate buffer. Finally, the cell Resuspended in 0 mM potassium phosphate buffer. The total volume was 10 ml.   The feedpoint composition of the aqueous two-phase system is 100 mM with and without NaCl. In potassium, 4% w / w PEG (8000), 5% w / w dextran (T50 0). The mass balance is based on the inoculum volume of 1 ml and the number of bacteria in the upper and lower phases. I went by The total volume was 10 ml. Partition at room temperature 30- The test was carried out by standing for 50 minutes (settling time).   The partitioning behavior of the pure culture was first analyzed and the results are shown in Table 3 below: The data in Table 3 was normalized and represents the percentage of cells in each fraction.   Based on the distribution results of the pure culture, E. coli Cori (656) and Staphylococcus et Pidermitis, or E. coli. Coli (656) and two such as Klebzilla oxytoca The seed mixture is added into a single-stage aqueous two-phase system of the same composition and the distribution of each microorganism Behavior is to perform mass balance check and selective discrimination agar of each target microorganism Was measured by: The results of the single-stage partitioning of the two bacterial mixtures are shown in Table 4 below. Listed: The data in Table 4 has been normalized and represents the percentage of cells in each fraction.   As exemplified by the data in Table 4, E. coli. E. coli (656) and K. coli. Oh If it is known a priori to select xitoca as the lower phase, one stage of aqueous two-phase partitioning On the floor, Coli (656) / K. Separating binary mixtures of oxytoca Was possible enough. Binary mixture E. Coli (656) / S. Epidermitis Minutes Separation was not ideal because most of both microorganisms migrated to the interface. Only While the rest are in opposition, E. Coli (656) as the upper phase, and Epi Delmitis in the lower phase Distributed. If the cells reversibly adsorb to the interface, a counter-current multi-step operation will Ko Li (656) and S.M. It was determined that Epidermicis would be effectively separated.                                Example 2               Isolation of Salmonella from a mixed population of pure cultures   The purpose of Example 2 was to increase the background in the pre-enrichment broth after 20 hours. Is to illustrate the ability to isolate Salmonella from a mixed population of bacteria.   The following bacterial strains were grown together to make the mixture to be separated:     S. Typhimurium (LT2) Target     E. FIG. Coli (925) background bacteria     Ent. Black-backed moss (1074) Background bacteria     C. Freundy (894) background bacteria   Separation was performed using a three-stage countercurrent scheme (FIG. 6).   The starting feedpoint composition used was as follows:     Step # 1: 5% w / w dextran (T500)                   4% w / w PEG (8000)                   0.025M MgClTwo・ 6HTwoO                   1 ml Salmonella cells   The total volume of the first stage was about 9.5 ml, corresponding to the total volume of 10 g of the two-phase component. Was. The distribution of steps 1-3 was performed according to the following procedure:   (A) A “master” biphasic system having the same composition as step # 1 without cells is prepared The mixture was emulsified and allowed to settle for about 1 hour.   (B) An empty ch of a certain amount of the lower phase of stage 1 will be in stages # 2 and # 3 of the countercurrent scheme. It was pipetted into the tube. The amount of the lower phase is about 5.3 in stage # 2, and In stage # 3, it was 4.0 ml.   (C) 1 ml of the pre-enrichment broth containing the mixed culture is added to the tube of step # 1 Was. After mixing and settling, about 5.5 ml of the upper phase of stage # 1 is transferred to stage # 2 Was. The contents of Step # 2 are mixed and allowed to settle as described above, and then Approximately 4.1 ml of the volume was transferred to a tube containing stage # 3 components. Mixing and Another settling was performed.   (D) Step # 3 is left to settle for 30 minutes, then the contents of the upper phase Are serially diluted and placed on BHI and XLD agar to count bacteria Applied. For the above, BHI agar was used to measure total bacterial concentration. However, XLD agar was used to measure Salmonella concentration.   In this dispensing operation, the feed point compositions of the first, second and third stages are represented by phase diagrams (FIG. In 3), it was confirmed that they were close to each other and well fit within the two-phase framework. I wonder Make sure that the two-phase system stays well within the two-phase framework for a long time Is possible.   Target and background bacterial concentrations were determined by dilution on BHI and XLD agar. The coating was measured at time 0, 20 and after the end of the three-stage countercurrent distribution scheme. Was. Count the number of bacteria and calculate the target-background ratio at each run time And the data is shown in FIG.   This example demonstrates that aqueous two-phase partitioning performed in a countercurrent three-stage scheme Can be used for effective isolation of target Salmonella from mixed populations of und microorganisms Is illustrated.                                Example 3   Isolation of Salmonella from ground beef and dried milk food matrices   Example 3 shows that a three-stage countercurrent aqueous two-phase system comprises It illustrates that species can be separated and used to isolate.   S. Typhimurium ATCC (1084) cells provide 25 g of food matrix Inoculated Salmonella pre-enrichment broth (BBSM) (225 ml). Food The matrix consisted of either ground beef or dried milk. Each food matrix Native microflora from the grounds provide background microorganisms, specifically Was not done. Food matrix inoculated with Salmonella grows as described above And subjected to the same dispensing operation as used in Example 2. Stage # 3 of countercurrent system These samples were plated for identification as described in Example 2 and dispensed. The distribution results are shown in FIG. 9 and FIG. Fig. 9 shows monkeys inoculated in ground beef. FIG. 10 shows distribution data for Monella, FIG. 10 showing Salmonella inoculated in dry milk. The same data is shown.   As can be seen from the data in FIGS. 9 and 10, the two-phase system Of Salmonella species from complex food matrices contaminated with background microorganisms It is effective for                                Example 4 Isolation of a wide range of Salmonella species from different combinations of food matrices   Figure 4 shows a composite food matrix contaminated with various background bacteria. Illustrates the ability of the method to isolate a wide range of Salmonella species. Salmonella Of the species listed in the "Materials and Methods" section Tested in response to   The food matrix was divided into two categories, fresh and processed. Fresh food Ground beef, ground turkey, chicken, chicken back, ground chicken, pork sausage Including di and eggs. Processed foods include dried milk, whole milk, cocoa, salad dressin Cottage cheese, coarse pepper, and ice cream. All The food was obtained commercially from local distributors. As in Example 2, the isolation method was countercurrent However, to encompass Salmonella more broadly, the method is illustrated in FIG. As described above, the system was modified into a three-stage countercurrent system divided into two series. Used The feed point compositions of the two-phase systems referred to are referred to as A, A *; And in Table 1 in the "Materials and Methods" section.   Culture of the various Salmonella strains was performed on a shaker / incubator at 120 rpm for 12 hours. Grow overnight in nutrient broth in a 5 ml flask at 37 ° C. Tested For each food matrix, a 25 g sample is filled with FDA's BAM spec. information (Bacteriological Analytical Mannual. 6th Edition, supra) ), Along with 225 ml of Salmonella pre-assembled broth (BBSM) Mixed in the locker. In each of these mixtures, various Salmonella strains are Inoculated at a cell concentration of 0.01 cells / ml. This cell concentration is determined by FDA's s specification (Bacteriological Analytical Mannual. 6th Editio n, supra) required for one Salmonella cell in 25 g of food matrix Added support for small detection levels. The inoculated broth is then sterile 500 ml The cells were transferred into a Meyer flask and cultured at 37 ° C. for 20 hours under static conditions. Uninoculated food in 225ml BBSM broth Negative control flasks containing the matrix always have one of each set tested. Department.   After pre-accumulation, two aliquots of 1 ml pre-accumulation broth were added to the aqueous two-phase system shown in FIG. A and B respectively. Two aqueous two-phase systems A or A * and B Or B * (Table 1) are examples of single-step partitioning behavior of a pure culture of 77 Salmonella strains. It was determined based on the extensive screening experiment described in 1.   The procedure used to perform the three-stage countercurrent separation is described in Examples 2 and 3. It was slightly different from the one. Total amount of aqueous two-phase system (all 10 or Of system A (or A *) from steps # 1 or # 2, depending on A fixed amount of the upper phase (4 or 2 ml) or a fixed amount of the lower phase of the system B (or B *) (3 . 0 or 2 ml) were transferred to stage # 2 or # 3, respectively. Appropriate amount and By shifting the phases, the overall feedpoint component is exactly the same as in Step # 1 Steps # 2 and # 3 included a suitable balance of aqueous two-phase components to . Thus, the feed point composition of stage # 1 (system A / A * or B / B *) , If point A '(FIG. 2), perform steps # 2 and # 3 transfer Was point A 'or, at a minimum, a point very close to it.   Following the two-phase separation, the upper phase (third stage, system A / A *) or the lower phase (third stage, system A / A *) B / B *) streaked on the XLD or HE selection discriminating agar. Was. Each plate was incubated at 37 ° C. for 24 hours. Target Salmonella colony The identification is based on H, such as insoluble FeS salts.TwoBased on black formation due to S precipitation. data 0 hours after the aqueous two-phase partitioning step, 2 hours Collected at time 0 and immediately thereafter. Based on measured Salmonella and total bacterial concentrations And the target to background ratio is calculated at each step time, Was used to assess the performance of the two-phase stage.   Target salmonone from different food matrices with target to background ratio Data demonstrating isolation of LA concentration is shown in FIG. According to the data in FIG. As can be seen, the majority of all Salmonella species tested are Irrespective of the distribution in either the upper phase of composition A or the lower phase of composition B Was.   Based on all 112 inoculated food experiments, the aforementioned food matrix The statistical figures for inoculum Salmonella recovery in any of the following are:   Salmonella recovered:   In some cases, native Salmonella that differs from the inoculated It is worth pointing out that control and some inoculated food samples were recovered. You. A sample of coarsely ground black pepper was S.P. New Port ATCC (1266) ( Polygroup B); some of the suspected colonies isolated It was identified as polygroup A, suggesting the potential presence of a L. strain. Ground turkey Negative control samples were identified as having serogroup B native Salmonella Was. The isolates are It was picked from the bi-aqueous two-phase systems A and B. In addition, the same food matrix Some inoculated samples were from the inoculated Salmonella strain S. aureus. Panama ATCC (125 0), polygroup A / serogroup I plus serogroup B Salmonella ( It was confirmed to have system A). Similarly, S.S. Heidel The fact is also true for ground turkey samples inoculated with Berg ATCC (1239). , Serogroup B Salmonella was recovered in both lines A and B.   The fact that the food matrix was completely removed at the end of the third stage of the countercurrent method, It is important to note.   This method allows the isolation of a wide range of Salmonella strains from various food matrices. It is clear from Example 4 that this is possible. Furthermore, the method was first experimentally High sensitivity to isolate Salmonella strains from food that are not introduced into It is also clear that                                Example 5            Comparison of FDA's BAM method and two-line Salmonella method   Example 5 shows that the two-phase two-phase countercurrent method detects salmonella from contaminated food. And that it compares favorably with industry standards for isolation.   10 experiments with fresh and processed foods and 8 Salmonella Was done. The experiment was performed substantially as described in Example 4 for a two-phase system. same The same food matrix and Salmonella strain were obtained from the Bacteriological Analytical M anual. It was analyzed by the BAM method described in the 6th Edition, and the comparison results were as follows: Is shown in Table 6.   The two-line Salmonella method was compared to the FDA's BAM method, but the former was better than the latter. It was a quick method for at least 24 hours.                                Example 6                Isolation of Listeria from food matrices   Listeria from other background organisms in food matrices The aqueous two-phase system for isolation is in the same manner as the Salmonella method described in the previous example. Was developed in   The optimal aqueous two-phase system is LL-P or ATwoP-82 and "Material And methods "in Table 2. These compositions have a number Species of Listeria species and other backgrounds potentially known as antimicrobial Using single-step partition data on pure bacterial cultures, a wide range of candidate biphasic systems were Selected after cleaning.   The proposed skim for isolation of Listeria from food matrices is based on Salmonella Similar to that, with the exception of the two-sequence distribution scheme shown in FIG. A three-stage countercurrent two-phase system was run in one series. Also, as in Example 4, Almost all food matrices are removed at the end of the third stage with the Listeria two-phase system Was observed.   Several fresh and processed foods where Listeria was expected to be present were tested. These include dried milk, salami, ricotta cheese, ground pork, bacon, brie Included cheese and sour cream. The food was processed as outlined in Example 4. Therefore, low levels (approximately 1.0 × 10-2And 1. 0x10-1Cells / ml). Shaker / incubator (300 rpm; strong agitation) After inoculation and culturing the negative control sample at 30 ° C. for 24 hours at 30 ° C. , One sample from Listeria-enriched broth transfers to the first stage of an aqueous two-phase system Was done. Once the countercurrent distribution has been performed, 10 μl of the target upper phase (system LL-P) is Streaked on a modified Oxford Agar (MOXA) plate. That The rates were incubated at 30 ° C. for 24 hours. The suspected Listeria colony is Taric grey, and the area around colonies resulting from aesculin hydrolysis Distinguished from background based on nunga / bacon color.   In addition to Listeria isolation on selective differentiation agar (MOXA), Listeria and The concentration of all background microorganisms is at the end of the accumulation / growth phase (t = 24 hours) and after the aqueous two-phase step, on BHI and MOXA plates It was determined by dilution / counting. Also, the target to background ratio The assessment is used in conjunction with the streak plate results to identify the inoculated Listeria species The utility of the separation and aqueous two-phase partitioning steps was evaluated. All food matrices are 3 parallel Listeria were inoculated in flasks. Table 7 below summarizes the results. Will be:                               Example 7                       Partition behavior of yeast and algae   Example 7 demonstrates that organisms other than bacteria can be isolated and detected by this method. Illustrate.   Aqueous two-phase systems A *, B * and ATwoSeveral kinds of yeast in P82 (single stage) The partitioning properties of mother and algae were tested. Yeast and algae species are as follows: Was:   yeast:     Saccharomyces cerevisiae (2341) ATCC     Candida tropicalis (750) ATCC   Algae:     Nabikura periclosa (brown algae)     Chlorella pyrenoidsa (green algae)     Peridinium species (golden algae)     Anacistis nidurans (blue algae)     Calitamion species (red algae).   The distribution behavior of yeast can be determined by performing mass balance as in Example 1). It has been determined. Counts for each phase are 10-fold diluted on BHI agar and plated Made by Taking advantage of the color benefits of algae, whether in the upper or lower phase Or qualitatively determined by visual inspection of algal movement at the interface, and Was taken again. The distribution behavior of yeasts and algae is summarized in Table 8 below:   Based on the above data, the inventor concluded that limited isolation of yeast and algae was performed in two lines. Or by applying this method using a single-stage two-phase system. Believe.

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年５月２８日 【補正内容】 請求の範囲 １． 下記段階を含んでなる複合マトリックス内に含まれる多様なバックグラ ウンド生物体集団からの特定の属の標的微生物の分離方法。 ｉ）該複合マトリックスをホモジナイズし、そして前集積培地の存在下、該ホ モジナイズされた複合マトリックスを培養して、該標的微生物と該バックグラウ ンド微生物を蘇生し、増殖させる段階； ｉｉ）段階ｉ）の該ホモジナイズされた複合マトリックスのサンプルを、特定 のフィードポイント組成をもつ少なくとも１種の水性高分子二相分離系中で乳化 する段階； ｉｉｉ）該乳化されたサンプルを、各々の水性高分子二相分離系の上相と下相 に分離させ、それによって乳化されたサンプルからの著量の該標的微生物を、該 上相か該下相のいずれかに見い出し、著量の該バックグラウンド微生物を、その 他の該上相か該下相に見い出す段階； ｉｖ）段階（ｉｉｉ）の該上相の一定分量および新しい水性成分が、段階（ｉ ｉ）の特定のフィードポイント組成を達成するような新鮮な水性高分子成分のバ ランスにおいて、その一定分量を乳化する段階； ｖ）段階（ｉｉｉ）の該下相の一定分量および新しい水性成分が、段階（ｉｉ ）のフィードポイント組成を達成するような新鮮な水性高分子成分のバランスに おいて、その一定分量を乳化する段階； ｖｉ）場合により、段階（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を、一回以上繰り 返す段階；ならびに ｖｉｉ）段階ｖｉ）の該上相か該下相のいずれかにおいて、該標的微生物の存 在を検出する段階。 ２． 検出段階（ｖｉｉ）が、下記のように遂行される、請求の範囲 １の方法。 ａ）段階（ｉｉｉ）、（ｉｖ）または（ｖ）の上相または下相から一定分量を 採取し； ｂ）該一定分量を、１種以上の固体、選択増殖培地上に平板塗布し； そして ｃ）該標的微生物の肉眼的検出を可能にするのに十分な時間、該接種された固 体、選択増殖培地を培養する。 ３． 特定の属の該標的微生物が病原細菌である、請求の範囲１の方法。 ４． 該病原細菌が、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌ ｉｓｔｅｒｉａ ）、クレブシエラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリヒア（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ）またはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである、 請求の範囲３の方法。 ５． 該複合マトリックスが食品である、請求の範囲１の方法。 ６． 該食品が、摩砕牛肉、摩砕家禽、摩砕豚肉、卵、乾燥ミルク、全乳ココ ア、サラダドレッシング、スパイスまたはチーズ製品である、請求の範囲５の方 法。 ７． 段階ｉ）において、該標的微生物がサルモネラ属のメンバーであり、そ して該前集積ブロスがＢＢＳＭである、請求の範囲１の方法。 ８． 段階ｉｉ）において、該サンプルが、さらに、２種の異なる水性高分子 二相系である、第１の二相系および第２の二相系中で乳化され該第１の二相系が 、６．５％ｗ／ｗデキストランＴ５００および６．５％ｗ／ｗポリエチレングリ コール３４００を含み；そして該第２の二相 系が、５．０％ｗ／ｗデキストランＴ５００および３．５％ｗ／ｗポリエチレン グリコール８０００を含む請求の範囲７の方法。 ９． 段階ｉｖ）が、さらに、該第１の二相系の該上相の一定分量および新鮮 な水性高分子成分が、第１の二相系の特定のフィードポイント組成を達成するよ うに新鮮な水性高分子成分のバランスにより、その一定分量を乳化することを含 み；そして段階ｖ）が、さらに、該第２の二相系の下相の一定分量および新鮮な 水性高分子成分が、該第２の二相系の特定のフィードポイント組成を達成するよ うに新鮮な水性高分子成分のバランスにより、その一定分量を乳化することを含 む、請求の範囲８の方法。 １０．段階ｖｉｉ）における該標的微生物の存在が、固体、選択増殖培地上へ の平板塗布によって、第１の二相系か第２の二相系のいずれかにおいて検出され る、請求の範囲９の方法。 １１．該標的微生物が細菌属リステリアのメンバーであり、そして該前集積培 地がＬＢＨＩである、請求の範囲１の方法。 １２．段階ｉｉ）において、該サンプルが、３％ｗ／ｗデキストランＴ５００ 、１．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００、１％ｗ／ｗポリオキシエチ レングリコールビス（ＮＨ2）３３５０および６．０％ｗ／ｗポリエチレングリ コール２０００か、または１８％ｗ／ｗヒドロキシプロピル澱粉Ｐ＆Ｓ２００、 ５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００および１％ｗ／ｗポリオキシエチレ ンビス（ＮＨ2）３３５０のいずれかを含む水性高分子二相分離系により乳化さ れる、請求の範囲１１の方法。 １３．該固体、選択培地が、ヘクトン・エンテリック・アガー（Ｈｅ ｋｔｏｅｎ Ｅｎｔｅｒｉｃ ａｇａｒ）およびキシロース・リジン・デスオキ シコレート・アガー（Ｘｙｌｏｓｅ Ｌｙｓｉｎｅ Ｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔ ｅ ａｇａｒ）からなる群より選ばれる、請求の範囲２または１０の方法。 １４．検出段階ｖｉｉ）が、下記のように遂行される、請求の範囲１２の方法 。 ａ）段階（ｉｉｉ）、（ｉｖ）または（ｖ）の上相または下相から一定分量を 採取し； ｂ）該一定分量を、１種以上の固体、選択増殖培地上に平板塗布し； そして ｃ）該標的微生物の肉眼的検出を可能にするのに十分な時間、該接種された固 体、選択増殖培地を培養する。 １５．該固体選択培地が、モディファィド・オックスフォード・アガー（Ｍｏ ｄｉｆｉｅｄ Ｏｘｆｏｒｄ Ａｇａｒ）である、請求の範囲１４の方法。 【図１】 【図２】 【図３】 【図４】 【図５】 【図６】 【図７】 【図８】 【図８】 【図８】 【図９】 【図９】 【図９】 【図１０】 【図１０】 【図１０】 【図１１】 【図１１】 【図１１】 [Procedural Amendment] Article 184-8 of the Patent Act [Submission Date] May 28, 1996 [Content of Amendment] Claims 1. A method for isolating a target microorganism of a specific genus from a diverse background population of organisms contained within a composite matrix comprising the steps of: i) homogenizing the composite matrix and culturing the homogenized composite matrix in the presence of a pre-enrichment medium to resuscitate and grow the target microorganism and the background microorganism; ii) of step i) Emulsifying a sample of the homogenized composite matrix in at least one aqueous polymer biphasic separation system having a specific feedpoint composition; iii) emulsifying the emulsified sample with each aqueous polymer biphasic system. The separation system is separated into an upper phase and a lower phase, whereby a significant amount of the target microorganism from a sample emulsified thereby is found in either the upper or lower phase, and a significant amount of the background microorganism is determined. Iv) an aliquot of the upper phase of step (iii) and a fresh aqueous component are found in the upper or lower phase; Emulsifying the aliquot in a balance of the fresh aqueous polymeric component to achieve a feed point composition; v) the aliquot of the lower phase and the fresh aqueous component of step (iii) are fed to step (ii) Emulsifying an aliquot thereof in a balance of fresh aqueous polymer components to achieve a point composition; vi) optionally, repeating steps (iii), (iv) and (v) one or more times; And vii) detecting the presence of the target microorganism in either the upper phase or the lower phase of step vi). 2. The method of claim 1, wherein the detecting step (vii) is performed as follows. a) taking an aliquot from the upper or lower phase of step (iii), (iv) or (v); b) plating the aliquot on one or more solid, selective growth media; c) Incubating the inoculated solid, selective growth medium for a time sufficient to allow for macroscopic detection of the target microorganism. 3. 2. The method of claim 1, wherein said target microorganism of a particular genus is a pathogenic bacterium. 4. Said pathogenic bacteria, Salmonella (Salmonella), Listeria (L isteria), Klebsiella (Klebsiella), Escherichia (E scherichia), a member of the Staphylococcus (Staphylococcus) or Lactobacillus (Lactobacillus) genus, ranging 3 claims Method. 5. 2. The method of claim 1, wherein said composite matrix is a food. 6. 6. The method of claim 5, wherein said food product is ground beef, ground poultry, ground pork, eggs, dried milk, whole milk cocoa, salad dressings, spices or cheese products. 7. 2. The method of claim 1, wherein in step i) said target microorganism is a member of the genus Salmonella and said pre-enrichment broth is BBSM. 8. In step ii), the sample is further emulsified in two different aqueous polymer two-phase systems, a first two-phase system and a second two-phase system, wherein the first two-phase system is Comprising 6.5% w / w dextran T500 and 6.5% w / w polyethylene glycol 3400; and wherein the second two-phase system comprises 5.0% w / w dextran T500 and 3.5% w / w. The method of claim 7 comprising polyethylene glycol 8000. 9. Step iv) further comprises the step of causing the aliquot of the upper phase of the first two-phase system and the fresh aqueous macromolecular component to be freshly aqueous so as to achieve the specific feedpoint composition of the first two-phase system. Step v) comprises emulsifying the aliquot with the balance of the polymeric component; and step v) further comprises the aliquot of the lower phase of the second two-phase system and the fresh aqueous polymeric component. 9. The method of claim 8 comprising emulsifying an aliquot thereof with a balance of fresh aqueous polymeric components to achieve a particular feedpoint composition of the two-phase system. 10. 10. The method of claim 9, wherein the presence of said target microorganism in step vii) is detected in either the first two-phase system or the second two-phase system by plating on a solid, selective growth medium. . 11. 2. The method of claim 1, wherein said target microorganism is a member of the genus Listeria and said pre-enrichment medium is LBHI. 12. In step ii), the sample is 3% w / w dextran T500, 1.5% w / w polyethylene glycol 8000, 1% w / w polyoxyethylene glycol bis (NH 2 ) 3350 and 6.0% w / Aqueous polymer biphasic containing either polyethylene glycol 2000 or 18% w / w hydroxypropyl starch P & S 200, 5% w / w polyethylene glycol 8000 and 1% w / w polyoxyethylene bis (NH 2 ) 3350 12. The method of claim 11, wherein the method is emulsified by a separation system. 13. The method of claim 2 or 10, wherein said solid, selective medium is selected from the group consisting of Hektoen Enteric agar and Xylose Lysine Desoxycholate agar. . 14． 13. The method of claim 12, wherein the detecting step vii) is performed as follows. a) taking an aliquot from the upper or lower phase of step (iii), (iv) or (v); b) plating the aliquot on one or more solid, selective growth media; c) Incubating the inoculated solid, selective growth medium for a time sufficient to allow for macroscopic detection of the target microorganism. 15. 15. The method of claim 14, wherein said solid selective medium is Modified Oxford Agar. FIG. FIG. 2 FIG. 3 FIG. 4 FIG. 5 FIG. 6 FIG. 7 FIG. 8 FIG. 8 FIG. 8 FIG. 9 FIG. 9 FIG. 9 FIG. 10 FIG. 10 FIG. 10 FIG. 11 FIG. 11 FIG. 11

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 下記段階を含む、複合マトリックス内に含まれる標的微生物の分離方法 。 ｉ）該複合マトリックスをホモジナイズし、そして前集積培地の存在下、該複 合マトリックスを培養して、該標的微生物を蘇生し、増殖させ、それによって該 複合マトリックス中の該標的微生物の数を増強させる段階； ｉｉ）段階ｉ）の該増強された複合マトリックスのサンプルを、少なくとも１ 種の水性高分子二相分離系中で乳化する段階；ならびに ｉｉｉ）該乳化された系を上相と下相に分離させ、それによってサンプルから の著量の該標的微生物が、該上相か該下相のいずれかに見い出す段階。 ２． 該標的微生物が細菌である、請求の範囲１の方法。 ３． 該細菌が病原細菌である、請求の範囲２の方法。 ４． 該病原細菌が、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌ ｉｓｔｅｒｉａ ）、クレブシエラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃ ｏｌｉ ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはラクト バチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である、請求の範囲３の方法。 ５． 該複合マトリックスが食品である、請求の範囲１の方法。 ６． 該食品が、摩砕牛肉、摩砕七面鳥、摩砕豚肉、卵、乾燥ミルク、全乳コ コア、サラダドレッシング、スパイスまたはチーズ製品である、請求の範囲５の 方法。 ７． 段階ｉ）において、該標的微生物がサルモネラであり、そして 該前集積ブロスがＢＢＳＭである、請求の範囲１の方法。 ８． 段階ｉｉ）において、該サンプルが、さらに、２種の異なる水性高分子 二相系、第１の系および第２の系中で乳化される、請求の範囲７の方法であって 、該第１の系が、６．５％ｗ／ｗデキストランＴ５００および６．５％ｗ／ｗポ リエチレングリコール３４００を含み；そして該第２の系が、５．０％ｗ／ｗデ キストランＴ５００および３．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００を含 む方法。 ９． 段階ｉｉｉ）の後に、さらに、次の段階を含む、請求の範囲８の方法。 ｉｖ）著量の該標的微生物を含む該第１の系の上相の一定分量を採取し、そし て該一定分量を、新鮮な第１の水性高分子二相系中で乳化する段階；その間、さ らに、著量の該標的微生物を含む該第２の系の下相の一定分量を採取し、そして 該第２の系の該一定分量を、新しい第２の水性高分子二相系中で乳化する段階； ならびに ｖ）段階ｉｉｉ）を繰り返す段階。 １０．段階ｉｖ）とｖ）を、さらに、１回以上連続的に繰り返すことを含む、 請求の範囲９の方法。 １１．該細菌がリステリアであり、そして該前集積ブロスがＬＢＨＩである、 請求の範囲１の方法。 １２．段階ｉｉ）において、該サンプルが、さらに、３％ｗ／ｗデキストラン Ｔ５００、１．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００および６．０％ｗ／ ｗポリエチレングリコール２０００を含む水性高分子二相系中で乳化される、請 求の範囲１１の方法。 １３．段階ｉｉｉ）の後に、さらに、次の段階を含む、請求の範囲１ ２の方法。 ｉｖ）著量の該標的微生物を含む該水性高分子二相分離系の上相の一定分量を 採取し、そして該一定分量を、段階ｉｉ）の新鮮な水性高分子二相系中で乳化す る段階；ならびに ｖ）段階ｉｉｉ）を繰り返す段階。 １４．段階ｉｖ）とｖ）を、さらに、１回以上連続的に繰り返すことを含む、 請求の範囲１３の方法。 １５．下記段階を含む、複合マトリックス内に含まれる標的微生物の分離およ び検出方法。 ａ）該複合マトリックスをホモジナイズし、そして、前集積ブロスの存在下、 該複合マトリックスを培養して、該標的微生物を蘇生し、増殖させ、それによっ て該複合マトリックス中の該標的微生物の数を増強させる段階； ｂ）段階ａ）の該増強された複合マトリックスのサンプルを、少なくとも１種 の水性高分子二相分離系中で乳化させる段階； ｃ）該乳化された系を上相と下相に分離させ、それによってサンプルからの著 量の該標的微生物が、該上相か該下相のいずれかに見い出す段階；ならびに ｄ）著量の該標的微生物を含む段階ｃ）の相から一定分量を採取し、そしてそ の一定分量中の該標的微生物の存在を検出する段階。 １６．段階ｄ）において、該検出が、固体選択増殖培地上に該一定分量を接種 し、そして該固体選択増殖培地を培養することによって行われ、それによって該 培地に増殖する単離された標的微生物が肉眼的に検出される、請求の範囲１５の 方法。 １７．段階ａ）において、該標的微生物がサルモネラであり、そして該前集積 ブロスがＢＢＳＭであり；そして 段階ｂ）において、２種の異なる水性高分子二相分離系；６．５％ｗ／ｗデキ ストランＴ５００および６．５％ｗ／ｗデキストランＴ５００および６．５％ｗ ／ｗポリエチレングリコール３４００を含む第１の系、ならびに５．０％ｗ／ｗ デキストランＴ５００および３．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００を 含む第２の系が使用され；そして 段階ｂ）およびｃ）が、連続的に３回実施されるが、第２回と第３回の間で、 著量のサルモネラを含む段階ｃ）の相から採取されたサンプルが、段階ｂ）にお けるサンプルとして使用され；そして 段階ｄ）において、該固体選択増殖培地が、ＨＥまたはＸＬＤ培地である、請 求の範囲１６の方法。 １８．段階ａ）において、該標的微生物がリステリアであり、そして該前集積 ブロスがＬＢＨＩであり；そして 段階ｂ）において、該水性高分子二相分離系が、３％ｗ／ｗデキストランＴ５ ００、１．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００および６．０％ｗ／ｗポ リエチレングリコール２０００を含み；そして 段階ｂ）およびｃ）が、連続的に３回実施されるが、第２回と第３回の間で、 著量のリステリアを含む段階ｃ）の相から採取されたサンプルが、段階ｂ）にお けるサンプルとして使用され；そして 段階ｄ）において、該固体選択増殖培地が、改変ＭＯＸＡである、請求の範囲 １６の方法。[Claims] 1. A method for separating a target microorganism contained in a composite matrix, comprising the following steps. i) homogenizing the composite matrix and culturing the composite matrix in the presence of a pre-enrichment medium to resuscitate and grow the target microorganism, thereby enhancing the number of the target microorganism in the composite matrix Ii) emulsifying the sample of the enhanced composite matrix of step i) in at least one aqueous polymer two-phase separation system; and iii) converting the emulsified system into an upper phase and a lower phase. Separating, whereby a significant amount of the target microorganism from a sample is found in either the upper phase or the lower phase. 2. 2. The method of claim 1, wherein said target microorganism is a bacterium. 3. 3. The method of claim 2, wherein said bacterium is a pathogenic bacterium. 4. It said pathogenic bacteria, Salmonella (Salmonella), Listeria (L isteria), Klebsiella (klebsiella), E. Coli (E.c oli), a Staphylococcus (Staphylococcus) or Lactobacillus (Lactobacillus), a method in the range 3 claims. 5. 2. The method of claim 1, wherein said composite matrix is a food. 6. 6. The method of claim 5, wherein the food product is a ground beef, ground turkey, ground pork, egg, dried milk, whole milk cocoa, salad dressing, spice or cheese product. 7. 2. The method of claim 1, wherein in step i) said target microorganism is Salmonella and said pre-enrichment broth is BBSM. 8. 8. The method of claim 7, wherein in step ii), the sample is further emulsified in two different aqueous polymer two-phase systems, a first system and a second system. System comprises 6.5% w / w dextran T500 and 6.5% w / w polyethylene glycol 3400; and the second system comprises 5.0% w / w dextran T500 and 3.5% w / w dextran T500. / W containing polyethylene glycol 8000. 9. 9. The method of claim 8, further comprising, after step iii), the following steps. iv) taking an aliquot of the upper phase of the first system containing a significant amount of the target microorganism and emulsifying the aliquot in a fresh first aqueous polymer two-phase system; In addition, an aliquot of the lower phase of the second system containing a significant amount of the target microorganism is taken and the aliquot of the second system is emulsified in a new second aqueous polymer two-phase system. And v) repeating step iii). 10. 10. The method of claim 9, further comprising repeating steps iv) and v) one or more times continuously. 11. 2. The method of claim 1, wherein said bacterium is Listeria and said pre-enrichment broth is LBHI. 12. In step ii), the sample is further subjected to an aqueous polymer biphasic system comprising 3% w / w dextran T500, 1.5% w / w polyethylene glycol 8000 and 6.0% w / w polyethylene glycol 2000 12. The method of claim 11, wherein the method is emulsified. 13. 13. The method of claim 12, further comprising, after step iii), the following steps. iv) taking an aliquot of the upper phase of the aqueous polymer biphasic separation system containing a significant amount of the target microorganism and emulsifying the aliquot in the fresh aqueous polymer biphasic system of step ii) And v) repeating step iii). 14． 14. The method of claim 13, further comprising repeating steps iv) and v) one or more times continuously. 15. A method for separating and detecting a target microorganism contained in a composite matrix, comprising the following steps. a) homogenizing the composite matrix and culturing the composite matrix in the presence of a pre-enrichment broth to resuscitate and grow the target microorganism, thereby enhancing the number of the target microorganism in the composite matrix B) emulsifying the sample of the enhanced composite matrix of step a) in at least one aqueous polymer two-phase separation system; c) bringing the emulsified system into an upper phase and a lower phase Separating, whereby a significant amount of said target microorganism from a sample is found in either said upper phase or said lower phase; and d) removing an aliquot from the phase of step c) containing significant amount of said target microorganism. Harvesting and detecting the presence of the target microorganism in the aliquot. 16. In step d), the detection is performed by inoculating the aliquot on a solid selective growth medium and culturing the solid selective growth medium, whereby the isolated target microorganism growing on the medium is isolated. 16. The method of claim 15, wherein said method is detected visually. 17． In step a) the target microorganism is Salmonella and the pre-enrichment broth is BBSM; and in step b) two different aqueous polymer two-phase separation systems; 6.5% w / w dextran T500 And a first system comprising 6.5% w / w dextran T500 and 6.5% w / w polyethylene glycol 3400, and 5.0% w / w dextran T500 and 3.5% w / w polyethylene glycol 8000. A second system is used; and steps b) and c) are performed three times in succession, but between the second and third phase the phase of step c) containing significant amounts of Salmonella Used in step b) as sample in step b); and in step d) the solid selective growth medium is HE or XLD medium. 16 method of. 18. In step a), the target microorganism is Listeria, and the pre-enrichment broth is LBHI; and, in step b), the aqueous polymer two-phase separation system is 3% w / w dextran T500,1. Comprising 5% w / w polyethylene glycol 8000 and 6.0% w / w polyethylene glycol 2000; and steps b) and c) are performed three times in succession, but between the second and third Wherein a sample taken from the phase of step c) containing a significant amount of Listeria is used as the sample in step b); and in step d) the solid selective growth medium is a modified MOXA. 16 methods.
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