JPH10500485A - Screening for cytokine modulators - Google Patents

Screening for cytokine modulators

Info

Publication number
JPH10500485A
JPH10500485A JP7529916A JP52991695A JPH10500485A JP H10500485 A JPH10500485 A JP H10500485A JP 7529916 A JP7529916 A JP 7529916A JP 52991695 A JP52991695 A JP 52991695A JP H10500485 A JPH10500485 A JP H10500485A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
receptor
promoter
protein
rel
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP7529916A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
ヘルマン，トーマス
パイク，ジョン・ダブリュー
Original Assignee
リガンド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by リガンド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド filed Critical リガンド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Publication of JPH10500485A publication Critical patent/JPH10500485A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、サイトカインにより影響される疾患および病理学的状態の処置に有用である薬剤のスクリーニング法を提供する。これらの薬剤は直接または間接的に細胞内受容体（順次ｒｅｌ様タンパク質、ｒｅｌ様タンパク質複合体またはサイトカイン遺伝子のプロモーター上のｒｅｌ部位に対する他の転写タンパク質の結合を調節する）と相互作用する。該細胞内受容体はエストロゲン受容体、レチノイド酸受容体、レチノイドＸ受容体、グルココルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体またはビタミンＤ受容体であってよい。選択した薬剤は、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、炎症、乾癬、カポジ肉腫、敗血症性ショックおよび多発性骨髄腫の治療に使用することができる。   (57) [Summary] The present invention provides methods for screening for agents that are useful in treating diseases and pathological conditions affected by cytokines. These agents interact directly or indirectly with intracellular receptors, which in turn regulate the binding of rel-like proteins, rel-like protein complexes or other transcribed proteins to the rel site on the promoter of cytokine genes. The intracellular receptor may be an estrogen receptor, a retinoid acid receptor, a retinoid X receptor, a glucocorticoid receptor, a progesterone receptor, an androgen receptor, a thyroid hormone receptor or a vitamin D receptor. The selected drugs can be used to treat osteoporosis, rheumatoid arthritis, inflammation, psoriasis, Kaposi's sarcoma, septic shock and multiple myeloma.

Description

【発明の詳細な説明】 サイトカインモジュレーターのスクリーニング 発明の技術分野 本発明は、サイトカインにより影響される疾患および病理学的状態の処置に有 用である薬剤のスクリーニング方法およびこのようなスクリーニング方法を使用 することにより同定された新規な薬剤に関する。 発明の背景 サイトカインは細胞の増殖を情報伝達（signaling）することができる分子の 群である。サイトカインの異常な発現が自己免疫疾患、敗血症性ショック、慢性 関節リウマチ、乾癬、炎症、閉経後の骨粗鬆症およびいくらかの腫瘍を含む病理 学的状態に関連することが知られている。これらの病理学的状態に関する一般的 な処置はレチノイド、免疫抑制剤、グルココルチコイドおよび他のステロイド剤 である。エストロゲンは閉経後の骨粗鬆症の予防に特に使用される。 ステロイドおよびその関連ホルモン剤は、遺伝子転写の調節因子である細胞内 受容体（ＩＲｓ）のスーパーファミリーに結合することによってその治療学的効 果を及ぼす。ＩＲｓは特定のサイトカイン遺伝子のアクチベーターならびにリプ レッサーとして機能することができる。ＩＲｓの活性は、ホルモンまたは他のＩ Ｒｓに結合するリガンドによって調節されている。 ＩＲｓによる転写調節の典型的なメカニズムは、該調節された遺伝子のプロモ ーター内で特定の応答要素に対するＩＲｓの結合（例えば、ビトロゲニン遺伝子 内の応答領域に対するエストロゲン受容体の結合）に関する（クライン−ヒトパ ス（Ｋlein-Ｈitpass）ら、Ｃell ４６：１０５３−１０６１、１９８６）。よ り最近では、ＩＲｓの直接的なＤＮＡ結合を要求しないグルココルチコイド受容 体によって媒体されたＡＰ−１転写調節において、ＩＲｓの異なる機能が記述さ れている（ヤン−イェン（Ｙang-Ｙen）ら、Ｃell ６２：１２０５−１２１５ 、１９９０）。 ステロイド剤はあるサイトカインのレベルを抑圧することが示されているが、 ステロイドの組織特異性の欠如および副作用は治療薬剤としてのその使用を制限 するかもしれない。これらの副作用は一層特異的に作用する化合物によって減少 または完全に回避されるかもしれない。 プファール（Ｐfahl）およびカリン（Ｋarin）（ＰＣＴ公開、ＷＯ９２／０７ ０７２、１９９２）は非ｒｅｌ様タンパク質ＡＰ−１またはＡＰ−１構成要素に 結合するまたはこれらと相互作用する複合体を形成する核受容体に結合するリガ ンドに関するサンプルのスクリーニング法を記載している。 発明の概要 本発明は新規の治療薬剤の同定およびサイトカインにより影響される疾患およ び状態（以下に限られるものではないが、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、炎症、 乾癬、敗血症性ショック、カポジ肉腫および多発性骨髄腫など）を治療するこれ らの薬剤の使用法に関する。この方法は、細胞内受容体が介する経路を通してサ イトカインの転写に影響する治療薬剤に関する天然の、半合成または合成化合物 の大量の収集物をスクリーニングすることができる。 「サイトカイン」とは、一般に細胞調節の化学的メディエーター（mediator） として機能する分泌タンパク質を意味する。より特異的には、細胞の増殖、分化 および機能を調節する成長因子およびホルモンなどの可溶性ポリペプチドの種々 の群（以下に限られるものではないが、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、 ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１１）を意味する。 本発明は、エストロゲン−エストロゲン受容体複合体によるインターロイキン ６（ＩＬ−６）の発現の抑制が、ＮＦκＢまたは密接に関連したタンパク質のＩ Ｌ−６プロモーターに対する転写活性の調節によって媒体されることの確定に関 する。このメカニズムはＥＲがＩＬ−６プロモーターへ直接結合することを含ま ないが、該活性化されたＮＦκＢおよびｒｅｌファミリーのタンパク質のあり得 る他の成員のＩＬ−６プロモーター上の特異的応答要素（すなわちｒｅｌ部位） に対するＤＮＡ結合特性を調節する。 ＮＦκＢは多様なサイトカインおよびその受容体、ウイルスタンパク質および 急性期応答に関するタンパク質をコードする遺伝子の調節に関するので、エスト ロゲンおよびあり得る他のホルモンによるＮＦκＢの活性の調節は概して重要で ある（ボーエール（Ｂaeuerle）、Ｂiochemica et Ｂiophysica Ａcta、１０７ ２：６３−８０、１９９３、を一般に参照（参照のため本明細書に引用する）） 。例えば、＋／＋ＬＤＡ１１細胞および他の組織におけるＩＬ−６の発現を強く 抑制するレチノイン酸処置（グロス（Ｇross，Ｖ.）、ビリガー（Ｐ．Ｍ．Ｖill iger）、ザン（Ｂ．Ｚhang）およびロッツ（Ｍ．Ｌotz）、１９９３、『レチノ イン酸はヒト単球におけるインターロイキン１誘発サイトカインの合成を抑制す る』（“Ｒetinoic acid inhibits interleukin-1-induced cytokine synthesis in human monocytes”）、Ｊ．Ｌeukoc．Ｂiol. ５４：１２５−１３２）はＩ Ｌ−６プロモーターとのＮＦκＢ関連複合体に対するエストロゲンと同様の効果 を有する。これは細胞内受容体ファミリーの成員およびＮＦκＢ転写因子間の混 線的相互作用（cross-talk）に関する転写調節の一般的な経路を示唆している。 上記決定により、公知のステロイド剤の副作用なしに該ｒｅｌ転写因子により 調節される遺伝子（すなわち、炎症、敗血症、皮膚ならびに腎臓障害、骨粗鬆症 、ある種の腫瘍および造血機能障害に関係する遺伝子）に特異的に影響を及ぼす 薬剤のスクリーニングができる。列挙した疾患は通常、ＮＦκＢまたは他のｒｅ ｌタンパク質の調節下にあるＩＬ−１、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−８など のサイトカインの異常発現に相関する。 従って、本発明は細胞内受容体を活性化することによって、サイトカイン遺伝 子のプロモーターまたは該プロモーターの一部上のｒｅｌ部位に対するｒｅｌ様 タンパク質または他の転写タンパク質の結合における有意な減少を引き起こし、 それにより該サイトカインの転写を減少させる薬剤の同定方法を特徴づける。 「細胞内受容体」とは、その活性が小さな分子の結合によって調節される細胞 内転写因子を意味する（以下に限られるものではないが、エストロゲン受容体、 レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、グルココルチコイド受容体、プロゲ ステロン受容体、アンドロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体およびビタミンＤ 受容体を含む）。 「ｒｅｌ様タンパク質」とは、ｒｅｌドメインにおけるホモロジーを共有し遺 伝子調節に関係するタンパク質またはｒｅｌファミリーのタンパク質複合体（以 下に限られるものではないが、ＮＦκＢ、Ｌｙｔ−１０、ｃ−ｒｅｌおよびｒｅ ｌＢを含む）を意味する（リオウ（Ｌiou）およびバルチモア（Ｂaltimore）、 Ｃurrent Ｏpinion in Ｃell Ｂiology、５：４７７−４８７、１９９３を参照 （参照のため本明細書に引用する））。 「転写タンパク質」とは、活性化されたときに該プロモーターに直接、または 該プロモーターの転写活性を調節するタンパク質の複合体を介して間接的に結合 する細胞質または核のタンパク質を意味する。 「ｒｅｌ部位」とは、ｒｅｌ様タンパク質または１つまたはそれより多いｒｅ ｌタンパク質を含む複合体の結合部位として機能するＤＮＡ配列（以下に限られ るものではないが、ＩＬ−６上のＮＦκＢ結合部位のように、ボーエール、Ｂio chemica et Ｂiophysica Ａcta、１０７２：６３−８０、１９９３（参照のため 本明細書に引用する）に同定されているκＢモチーフが含まれる）を意味する。 「プロモーター」とは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに直接または間接的に結 合し下流の（３'方向）コーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ 調節領域を意味する。ＤＮＡ構築物のプロモーター（本明細書に記載のオリゴヌ クレオチド配列を含む）は該プロモーターの存在が異種遺伝子（ルシフェラーゼ 、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼお よび分泌型胎盤アルカリホスファターゼなどのリポーター配列に関する遺伝子を 含む）からの転写に影響する場合、異種遺伝子に結合していてよい。 好ましい態様において、該アッセイはスクリーニングされた薬剤、プロモータ ーまたはｒｅｌ部位を有するプロモーターの一部およびｒｅｌ様タンパク質また はｒｅｌ部位において結合する他の転写タンパク質の標的である細胞内受容体を 有する全細胞システムにおいて行われる；ここで該細胞内受容体はｒｅｌ様タン パク質または転写タンパク質のｒｅｌ部位への結合を調節する。該細胞内受容体 、該プロモーターまたは該プロモーターの一部またはｒｅｌ部位に結合するタン パク質は該細胞に内在するかまたは該細胞にトランスフェクションされていてよ い。 別の好ましい態様において、該アッセイはｒｅｌ部位およびｒｅｌ様タンパク 質またはｒｅｌ部位に結合する他のタンパク質を有する細胞内受容体プロモータ ーまたはプロモーターの一部を有する細胞の抽出物において行われる；ここで該 細胞内受容体はｒｅｌ様タンパク質または転写タンパク質のｒｅｌ部位への結合 を調節する。 ｒｅｌ様タンパク質または他の転写タンパク質のｒｅｌ部位への結合は以下に 限られるものではないが、移動度シフトアッセイ（mobility shift assay）、コ トランスフェクションアッセイ（co-transfection assay）および該プロモータ ーに結合するリポーター遺伝子の発現を含む当業者に知られた技術によって測定 されてよい。 さらに好ましい態様において、該プロモーターはエフェクター（以下に限られ るものではないが、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１、ウイルス、内毒素、 ホルボールエステル、上皮増殖因子、白血病阻害因子およびｃＡＭＰアゴニスト を含む）によって活性化される。 「エフェクター」とは、サイトカインの発現を測定可能なレベルにまで刺激す る薬剤を意味する。あるエフェクターはある細胞に内在的に産生されるまたは細 胞に外在的に付加されてよい。 さらに他の好ましい態様において、請求されているアッセイはエストロゲン受 容体、インターロイキン６プロモーターまたはインターロイキン６プロモーター の一部およびＮＦκＢを含むシステムにおいて行われる；ここでＥＲはＮＦκＢ または関連タンパク質のＩＬ−６プロモーター上のＮＦκＢ部位への結合を調節 する。 上記アッセイによって認められた薬剤は細胞内受容体とは直接的に相互作用す るかまたは細胞内受容体とリガンドの相互作用を調節してよい。従って、さらに 好ましい態様において、細胞内受容体のリガンドは該アッセイにおいて含まれる 。 ステロイドおよびステロイド類似体は本発明によって同定された薬剤を例示し てよいが、本出願人は特に低分子量の、容易に有用である治療薬剤を処方するこ とができる薬剤（１０,０００ダルトンより小さい、好ましくは５,０００ダルト ンより小さく、最も好ましくは１,０００ダルトンより小さい）に関心を抱いて いる。 ついでこのような薬剤は、サイトカインが、該薬剤が治療的または予防的様式 において使用することができる健常な組織に殆どまたは全く影響がない病理学的 状態を課されている組織に特異的である、ということを確実にするためスクリー ニングされてよい。このような薬剤が健常な組織に幾分か影響を及ぼす場合、該 薬剤は治療的処置において、特に生命を脅かすカポジ肉腫または多発性骨髄腫な どの疾患において、それでもなお有用であるかもしれない。 一度単離されると、候補薬剤は製薬学的に許容し得る剤型にされ、健常な組織 に殆どまたは全く影響がない疾患または病理学的状態の特異的処置に使用するこ とができる。 本発明の他の特徴および利点は、以下に続く発明の詳細な説明および特許請求 の範囲から明らかである。 図面の簡単な説明 図１は、ＩＬ−１およびＴＮＦαが誘発した近位（proximal）ＩＬ−６プロモ ーター上の複合体の形成を示す。 図２は、ＩＬ−１およびＴＮＦαによって誘発されたいくつかの明瞭なＮＦκ Ｂ関連複合体がエストロゲンによって調節されていることを示す。 図３は、エストロゲンアゴニストおよびアンタゴニストおよびタンパク質合成 およびプロテインキナーゼＣのインヒビターのＮＦκＢ関連複合体の形成に及ぼ す効果を示す。 図４は、ＮＦκＢオリゴヌクレオチドを有するＮＦκＢ関連複合体におけるタ ンパク質の結合の特徴を示す。 図５は、複合体Ａ、ＢおよびＣにおけるＮＦκＢ関連複合体を示す。 発明の詳細な説明 ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１１を含む多数のサイトカインは関連生物学 的な影響、すなわち免疫および急性期応答を刺激することによる感染に対する応 答における細胞防御および骨吸収を増加させることにより骨代謝に対する影響を 有する。これらのサイトカインのうちのいずれかの異常な発現は、同様の病理学 的状態（例えば、列挙した全てのサイトカインは敗血症ショックに関係する）と なる。他の例において、ＩＬ−６同様ＩＬ−８の過剰な産生はいくつかのタイプ の炎症反応、特に好中球依存性組織損傷（neutrophil-dependent tissue damage s）の病原産生に関係するかもしれない。これらのサイトカインは同様のプロモ ーター構造（例えば、それらのプロモーターはＮＦκＢまたは他のｒｅｌタンパ ク質の結合部位を含む）を有する。それゆえ、ＩＬ−６のみならず上記の他のサ イトカインはＮＦκＢまたは他のｒｅｌタンパク質のそのプロモーター部位への 結合を細胞内受容体を介して調節する薬剤によって標的化されることができる。 インターロイキン６および疾患 インターロイキン６（ＩＬ−６）は、多数の異なる細胞（単球、マクロファー ジ、いくらかのＢリンパ球およびＴリンパ球、グリア細胞、線維芽細胞、骨芽細 胞および間質細胞を含む）によって分泌される多面的なサイトカイン（pleiotop ic cytokine）である（ヒラノ（Ｈirano，Ｔ.）（１９９２）、“Ｔhe biology of interleukin-6”、Ｃhem．Ｉmmunol. ５１：１５３−１８０．；キシモト（ Ｋishimoto，Ｔ.）（１９８９）”Ｔhe biology of interleukin-6”、Ｂlood７ ４：１−１０．；キシモト、ヒビ（Ｍ．Ｈibi）、ムラカミ（Ｍ．Ｍurakami）、 ナラザキ（Ｍ．Ｎarazaki）、サイトウ（Ｍ．Ｓaito）およびタガ（Ｔ．Ｔaga） （１９９２）“Ｔhe molecular biology of interleukin6 and its receptor” 、Ｃiba Ｆound．Ｓymp. １６７：５−１６；考察１６−２３；およびウォルベ カンプ（Ｗolvekamp，Ｍ．Ｃ.）およびマーケト（Ｒ．Ｌ．Ｍarquet）（１９９ ０）『インターロイキン−６：歴史的背景、遺伝学および生物学的意義』（“Ｉ nterleukin-6：historical background，genetics and biological significanc e”）、Ｉmmunol．Ｌett. ２４：１−９の参照文に概説されている）。組織の損 傷、炎症および感染に対する応答におけるその誘発のため、ＩＬ−６の機能は主 として宿主の免疫および急性期応答に関係している。 ＩＬ−６は、病理学的状態だけでなく通常の生理学的状態の下でも細胞内伝達 の重要なメディエーターである。ＩＬ−６は神経の分化に関係する（サトウ（Ｓ atoh，Ｔ.）、ナカムラ（Ｓ．Ｎakamura）、タガ、マツダ（Ｔ．Ｍatsuda）、 ヒラノ、キシモトおよびカジロ（Ｙ．Ｋaziro）（１９８８）『Ｂ細胞刺激因子 ２／インターロキン６によるＰＣ１２細胞における神経の分化の誘発』（“Ｉnd uction of neuronal differentiation in ＰＣ１２ cells by Ｂ-cell stimulat ory factor 2/interleukin 6”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. ８：３５４６−３５ ４９）および造血時の増殖および分化（イケブチ（Ｉkebuchi，Ｋ.）、ウォン（ Ｇ．Ｇ．Ｗong）、クラーク（Ｓ．Ｃ．Ｃlark）、イール（Ｊ．Ｎ．Ｉh le）、 ヒライ（Ｙ．Ｈirai）およびオガワ（Ｍ．Ｏgawa）（１９８７））、Ｍoll．Ｃe ll Ｂiol. ８：３５４６−３５４９）および増殖および造血時の分化（イケブ チ、ウォン、クラーク、イール、ヒライおよびオガワ（１９８７）『多能造血前 駆体のインターロイキン３依存増殖のインターロキン６の増強』（“Interleuki n 6 enhancement of interleukin 3-dependent proliferaion of multipotentio al hemopoietic progenitors”）、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ．Ｓ．Ａ. ８４：９０３５−９０３９）。しかしながら、上昇されたＩＬ−６発現は通常疾 患に関連する（ユー（Ｙｕ，Ｘ．Ｐ．），ベリド（Ｔ．Ｂellido）、ライス（Ｎ ．Ｒice）およびマノラガス（Ｓ．Ｃ．Ｍanolagas）（１９９３））。 インターロイキン−６の発現bは他の因子によってきっちりと調節されている 。特定の細胞タイプに依存して、該ＩＬ−６の発現は様々な刺激（腫瘍壊死因子 （ＴＮＦα）およびインターロイキン−１、ウイルス、内毒素（リポ多糖）、ホ ルボールエステル、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および ｃＡＭＰアゴニストを含む）により活性化されることができる。 これらのエフェクターは、トランスフェクションの研究によって示されるよう に、該ＩＬ−６プロモーターに転写効果を及ぼすことを通してそれらの活性を示 す（グラス（Ｇruss，Ｈ．Ｊ.）、ブラク（Ｍ．Ａ．Ｂrach）およびヘルマン（ Ｆ．Ｈerrmann）（１９９２）『白血病阻害因子によるインターロイキン−６遺 伝子の誘発における核因子−κＢの関与』（“Ｉnvolvement of nuclear factor -kappa Ｂ in induction of the interleukin-6 gene by leukemia inhibitoryf actor”）、Ｂlood ８０：２５６３−２５７０；レイ（Ｒay，Ａ.）、タッタ− （Ｓ．Ｂ．Ｔatter）、メイ（Ｌ．Ｔ．Ｍay）およびセーガル（Ｐ．Ｂ． Ｓehgal）（１９８８）『サイトカイン、ウイルスおよびセカンドメッセンジャ ーアゴニストによるヒト「β２−インターフェロン／肝細胞刺激因子／インター ロイキン６」プロモーターの活性化』（“Ａctivation of the human“beta 2-i nterferon/hepatocyte-stimulating factor/interleukin 6” promoter by cyt okines，viruses，and second messenger agonists”）、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad ．Ｓci．Ｕ．Ｓ．Ａ. ８５：６７０１−６７０５）。配列比較により、いくつか の潜在的な転写調節要素がＩＬ−６プロモーター（ｃＡＭＰ応答要素、ＡＰ−１ 結合部位および転写因子ＮＦ−ＩＬ６（Ｃ／ＥＢＰＢ、ＬＡＰ、ＡＧＰ／ＥＢＰ ）およびＮＦκＢの結合要素を含む）において同定されている（イッシキ（Ｉss hiki，Ｈ.）、アキラ（Ｓ．Ａkira）、タナベ（Ｏ．Ｔanabe）、ナカジマ（Ｔ． Ｎakajima）、シマモト（Ｔ．Ｓhimamoto）、ヒラノおよびキシモト（１９９０ ）『ＩＬ−６遺伝子におけるＩＬ−１応答要素と相互作用する構成的およびイン ターロイキン−１（ＩＬ−１）−誘発因子』（“Ｃonstitutive and interleuki n-1（ＩＬ−１）-inducible factors interact with the ＩＬ-1-responsive el ement in the ＩＬ-6 gene”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：２７５７−２７ ６４）。 ＮＦ−ＩＬ６およびＮＦκＢの該ＩＬ−６プロモーターへの直接的な結合が確 立されている（アキラ、イッシキ、スギタ（Ｔ．Ｓugita）、タナベ、キノシタ （Ｓ．Ｋinoshita）、ニシオ（Ｙ．Ｎishio）、ナカジマ、ヒラノおよびキシモ ト（１９９０）『ＩＬ−６発現に関する核因子（ＮＦ−ＩＬ６）はＣ／ＥＢＰフ ァミリーの一員である』（“Ａ nuclear factor for ＩＬ-6 expression（ＮＦ −ＩＬ６）is a member of a Ｃ／ＥＢＰ family”）、ＥＭＢＯ Ｊ. ９：１８ ９７−１９０６；リーベルマン（Ｌibermann，Ｔ．Ａ.）およびバルチモア、（ １９９０）『ＮＦ−κＢ転写因子を介するインターロイキン−６遺伝子発現の活 性化』（“Ａctivation of interleukin-6 gene expression through the ＮＦ −kappa Ｂ transcription factor”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：２３２ ７−２３３４）。ＮＦ−ＩＬ６はロイシンジッパータンパク質のＣ／ＥＢＰファ ミリーに属する。ＮＦ−ＩＬ６はＩＬ−１、ＩＬ−６およびリポ多糖（ＬＰＳ） により誘発され、ＩＬ−６プロモーター上の結合部位と相互作用し、ＩＬ−６の 発 現を活性化すると示されている（アキラ、イッシキ、スギタ、タナベ、キノシタ 、ニシオ、ナカジマ、ヒラノおよびキシモト、（１９９０）、『ＩＬ−６発現に 関する核因子（ＮＦ−ＩＬ６）はＣ／ＥＢＰファミリーの一員である』（“Ａ n uclear factor for ＩＬ-6 expression（ＮＦ−ＩＬ６）is a member of a Ｃ／ ＥＢＰ family”）、ＥＭＢＯ Ｊ. ９：１８９７−１９０６；チャン（Ｃhang ，Ｃ．Ｊ.）、チェン（Ｔ．Ｔ．Ｃhen）、レイ（Ｈ．Ｙ．Ｌei）、チェン（Ｄ． Ｓ．Ｃhen）およびリー（Ｓ．Ｃ．Ｌee）（１９９０）、『Ｃ／ＥＢＰファミリ ーの成員に属する転写因子ＡＧＰ／ＥＢＰのモレキュラークローニング』（“Ｍ olecular cloning of a transcription factor，ＡＧＰ／ＥＢＰ，that belongs to members of the Ｃ／ＥＢＰ family”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：６ ６４２−６６５３）；デスコーム（Ｄescombes，Ｐ.）、チョイキエール（Ｍ． Ｃhojkier）、リヒツタイナー（Ｓ.Ｌichtsteiner）、ファルベイ（Ｅ．Ｆalvey ）およびシープラー（Ｕ．Ｓhiebler）（１９９０）『Ｃ／ＥＢＰ遺伝子ファミ リーの新規な一員であるＬＡＰは肝臓−豊富転写活性化タンパク質』（“ＬＡＰ ，a novel member of the Ｃ／ＥＢＰ gene family，encodes a liver-enriched transcriptional activator protein”）、Ｇenes Ｄev. ４：１５４１−１５ ５１；デスコーム，チョイキエール、リヒツタイナー、ファルベイおよびシープ ラー（１９９０）『Ｃ／ＥＢＰ遺伝子ファミリーの新規な一員であるＬＡＰは肝 臓−豊富転写活性化タンパク質』（“ＬＡＰ，a novel member of the Ｃ／ＥＢ Ｐgene family，encodes a liver-enriched transcriptional activator protei n”）、Ｇenes Ｄev. ４：１５４１−１５５１；ポリ（Ｐoli，Ｖ.）、マンシニ （Ｆ．Ｐ．Ｍancini）およびコルテーゼ（Ｒ．Ｃortese）（１９９０）『インタ ーロイキン−６シグナル伝達に関与する核タンパク質ＩＬ−６ＤＢＰはＣ／ＥＢ Ｐに関連するロイシンジッパータンパク質の新規なファミリーを定義する イン ターロイキン−６シグナル伝達に関与する核タンパク質ＩＬ−６ＤＢＰはＣ／Ｅ ＢＰに関連するロイシンジッパータンパク質の新規なファミリーを定義する』（ “ＩＬ−６ＤＢＰ，a nuclear protein involved in interleukin-6 signal tra nsduction，defines a new family of leucine zipper proteins related to Ｃ／ＥＢＰ ＩＬ−６ＤＢＰ，a nuclear protein involved in interleukin-6 s ignal transduction，defines a new family of leucine zipper proteins rela ted to Ｃ／ＥＢＰ”）、Ｃell ６３：６４３−６５３）。ＮＦκＢは免疫グロ ブリンκ軽鎖エンハンサー内の要素に結合する５０ｋｄタンパク質（ｐ５０）お よび６５ｋｄタンパク質（ｐ６５）よりなるヘテロダイマー複合体として元来は 同定された転写因子である。両タンパク質は、ショウジョウバエのモルホゲンで あるｄｏｒｓａｌおよびｃ−ｒｅｌガン原遺伝子産物（proto-oncogeny product ）に高いホモロジーを示す。該ｐ６５サブユニットは機能的にもまたｃ−ｒｅｌ に関連している（ボーレール（１９９１）『転写誘発アクチベーターＮＦ−κＢ ：顕著なタンパク質サブユニットによる調節』（“Ｔhe inducible transcripti on activator ＮＦ-kappa Ｂ：regulation by distinct protein subunits”）Ｂiochim．Ｂiophys．Ａcta １０７２：６３−８０；ブランク（Ｂlank，Ｖ.） 、コウリルスキー（Ｐ．Ｋourilsky）およびイスラエル（Ａ．Ｉsrael）（１９ ９２）『ＮＦ−κＢおよび関連タンパク質：Ｒel/dorsalホモロジーがアンキリ ン様繰り返しと合致する』（“ＮＦ-kappa Ｂ and related proteins：Ｒel/dor salhomologies meet ankyrin-like repeats”）、Ｔrends．Ｂiochem．Ｓci. １７：１３５−１４０；およびリオウおよびバルチモア（１９９３）『ＮＦ−κ Ｂ／rel転写因子およびＩκＢ抑制システムの調節』（“Ｒegulation of the Ｎ Ｆ-kappa Ｂ/rel transcription factor and Ｉ kappa Ｂ inhibitor sysytem” ）、Ｃurr．Ｏpin．Ｃell．Ｂiol. ５：４７７−４８７）。最近、さらに機能 的にｐ５０およびｐ６５に関連するタンパク質（ｐ４９／ｐ５２およびｒｅｌＢ ／ｐ６８）が同定されている（ヘンケル（Ｈenkel，Ｔ.）、マクレイト（Ｔ．Ｍ achleidt）、アルカレイ（Ｉ．Ａlkalay）、クロンケ（Ｍ．Ｋronke）、ベン− ネリアー（Ｙ．Ｂen-Ｎeriah）およびボーレール（１９９３）『ＩκＢ−αの迅 速なタンパク質分解は転写因子ＮＦ−κＢの活性化に必要である』（“Ｒapid p roteolysis of I kappa Ｂ-alpha is necessary for activation of transcript ion factor ＮＦ-kappa Ｂ”）、Ｎature ３６５：１８２−１８５；ペルキン ズ(Ｐerkins，Ｎ．Ｄ.)、シュミット（Ｒ．Ｍ．Ｓchmid）、ダケッ ト（Ｃ．Ｓ．Ｄuckett）、ロング（Ｋ．Ｌeung）、ライス（Ｎ．Ｒ．Ｒice）お よびナベル（Ｇ．Ｊ．Ｎabel）（１９９２）『ＮＦ−κＢサブユニットの顕著な 組み合わせが転写活性化の特異性を決定する』（“Ｄistinct combinations of ＮＦ-kappa Ｂ subunits determine the specificity of transcriptional acti vation”）、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ．Ｓ．Ａ. ８９：１５２９−１５ ３３）；リセック(Ｒyseck，Ｒ．Ｐ.)、ブル（Ｐ．Ｂull）、タカミヤ（Ｍ．Ｔa kamiya）、バーズ（Ｖ．Ｂours）、ジーベンリスト（Ｕ．Ｓiebenlist）、ドブ ルザンスキ（Ｐ．Ｄobrzanski）およびブラボ（Ｒ．Ｂravo）（１９９２）『Ｒe lＢ、ｐ５０−ＮＦ−κＢと相互作用することができる新規なＲｅｌファミリー 転写アクチベーター』（“ＲelＢ，a new Ｒel family transcription activato r that can interact with p50-NF-kappa Ｂ”）、Ｍoll．Ｃell．Ｂiol.１２： ６７４−６８４）；リセック、ブル、タカミヤ、バーズ、ジーベンリスト、ドブ ルザンスキおよびブラボ（１９９２）『ＲelＢ、ｐ５０−ＮＦ−κＢと相互作用 することができる新規なＲｅｌファミリー転写アクチベーター』（“ＲelＢ，a new Rel family transcription activator that can interact with p50-NＦ-ka ppa Ｂ”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １２：６７４−６８４）；シュミット、ペ ルキンズ、ダケット、アンドリューズ（Ｐ．Ｃ．Ａndrews）およびナベル（１９ ９１）『ｐ６５との相乗作用におけるＨＩＶ転写を刺激するＮＦ−κＢサブユニ ットのクローニング』“Ｃloning of an ＮＦ-kappa Ｂ subunit which stimula tes ＨＩＶ transcription in synergy with p65”、Ｎature ３５２：７３３ −７３６）。ＮＦκＢはＩκＢファミリーの抑制タンパク質を有する細胞質ゾル 複合体に位置する。誘発と同時に、ＮＦκＢはＩκＢから分離し、特定のプロモ ーターに結合し活性化する核にトランスロケートする（ボーエールおよびバルチ モア（１９８８）『ＩκＢ：ＮＦ−κＢ転写因子の特異的インヒビター』（“Ｉ kappa Ｂ：a specific inhibitor of the ＮＦ-kappa Ｂ transcription facto r”）、Ｓcience ２４２：５４０−５４６；ゴーシュ（Ｇhosh，Ｓ.）およびバ ルチモア（１９９０）『ＮＦ−κＢのインヒビターＩκＢのリン酸化によるＮＦ −κＢのイン・ビトロでの活性化』（“Ａctivation in vitro of ＮＦ- kappa Ｂ by phosphorylation of its inhibitor I kappa Ｂ”）Ｎature ３４ ４：６７８−６８２）。ＩＬ−６プロモーターの一致部位に対するＮＦκＢ様因 子の結合は、特定の細胞タイプにより変化するが、ＩＬ−１、ＴＮＦα、ＬＩＦ 、ＬＰＳおよびホルボールエステルによって誘発される（グラス、ブラクおよび ヘルマン（１９９２）『白血病阻害因子によるインターロイキン−６遺伝子の誘 発における核因子−κＢの関与』、Ｂlood ８０：２５６３−２５７０；リーベ ルマンおよびバルチモア、（１９９０）『ＮＦ−κＢ転写因子を介するインター ロイキン−６遺伝子発現の活性化』、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：２３２７− ２３３４；シミズ（Ｓhimizu，Ｈ.）、ミトモ（Ｋ．Ｍitomo）、ワタナベ（Ｔ． Ｗatanabe）、オカモト（Ｓ．Ｏkamoto）およびヤマモト（Ｋ．Ｙamamoto）『炎 症性リンホカインによるインターロイキン−６の活性化におけるＮＦκＢ様転写 因子の関与』（“Ｉnvolvement of a ＮＦ-kappa Ｂ-like transcription facto r in the activation of the interleukin-6 gene by inflammatory lymphokine s”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：５６１−５６８；ザン（Ｚhang，Ｙ．Ｈ. ）、リン（Ｊ．Ｘ．Ｌin）およびビルセック（Ｊ．Ｖilcek）（１９９０）『ヒ ト線維芽細胞における腫瘍壊死因子およびインターロイキン−１によるインター ロイキン−６誘発はκＢ様配列に結合する核因子の活性化に関与する』（“Ｉnt erlerukin-6 induction by tumor necrosis factor and interleukin-1in human fibroblasts involves activation of a nuclear factor binding to a kappa Ｂ-like sequence”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：３８１８−３８２３）。 ＩＬ−６の調節されていない発現は複数の疾患に関連しており（バウエル（Ｂ auer，Ｊ.）およびヘルマン（１９９１）『臨床医学におけるインターロイキン −６』（“Ｉnterleukin-6 in clinical medicine”）、Ａnn．Ｈematol. ６２ ：２０３−２１０；ヒラノ（１９９２）『インターロイキン−６と炎症および疾 患との関連』（“Ｉnterleukin-6 and its relation to inflammation and dise ase”）、Ｃlin．Ｉmmunol．Ｉmmunopathol. ６２：Ｓ６０−６５）、その例と しては卵巣機能喪失後の閉経後骨粗鬆症などである（ルードマン（Ｒoodman， Ｇ．Ｄ.）（１９９２）『インターロイキン−６：骨栄養因子（osteotropic fac tor）か?』（“Ｉnterleukin-6：an osteotropic factor?”）Ｊ．Ｂone Ｍine r．Ｒes. ７：４７５−４７８）。卵巣を摘出したマウスからの骨髄のエックス ・ビボでの培養はみかけの手術を施した動物（sham-operated animals）からの 培養に比較して破骨細胞の産生増加を示している。破骨細胞の増殖におけるこの 増加は抗−ＩＬ−６抗体の注入またはエストロゲンの投与によって防ぐことがで きる（ジルカ（Ｊilka，Ｒ．Ｌ.）、ハンゴック（Ｇ．Ｈangoc）、ギラソール（ Ｇ．Ｇirasole）、パセリ（Ｇ．Ｐasseri）、ウィリアムズ（Ｄ．Ｃ．Ｗilliams ）、アブラムズ（Ｊ．Ｓ．Ａbrams）、ボイス（Ｂ．Ｂoyce）、ブロキシミエル （Ｈ．Ｂroxmeyer）およびマノラガス（１９９２）『エストロゲンの喪失後の破 骨細胞の増殖の増力：インターロキン−６による媒介』（“Ｉncleased osteocl ast development after estrogen loss：mediation by interleukin-6”）、Ｓc ience ２５７：８８−９１）。ＩＬ−６に関する無発現変異を有するマウスに おいて卵巣の摘出は、正常マウスに見られるように骨容量または破骨細胞の数に 影響を及ぼさない（バレナ（Ｂalena，Ｒ.）、コスタンチニ（Ｆ．Ｃostantini ）、ヤマモト（Ｍ．Ｙamamoto）、マルカトス（Ａ．Ｍarkatos）、コルテーゼ、 ロダン（Ｇ．Ａ．Ｒodan）およびポリ（１９９３）『ＩＬ−６遺伝子をノックア ウトしたマウスは卵巣摘出後に多孔質状の骨（cancellous bone）を失わない』 （“Ｍice ｗith ＩＬ−６ gene knock-out do not lose cancellous bone afte r ovariectomy”）、Ｊ．Ｂone Ｍiner．Ｒes. ８：Ｓ１３０［要約］）。エストロゲンによるインターロイキン６の調節 エストロゲンは、ラットおよびマウスの骨由来間質細胞株および骨芽細胞同様 に形質転換していないヒト骨細胞においてＩＬ−６の発現を抑制すると認められ ている（ギラソール、ジルカ、パセリ、ボスウェル(Ｓ．Ｂoswell)、ボーダー（ Ｇ．Boder）、ウィリアムズおよびマノラガス（１９９２）『エストラジオール −１７βはイン・ビトロにて骨髄由来間質細胞および骨芽細胞によってインター ロイキン−６の産生を抑制する：エストロゲンの抗骨粗鬆症的効果の可能性のあ るメカニズム』（“１７ beta-estradiol inhibits interleukin-6 production by bone marrow-derived stromal cells and osteoblasts in vitro：a potenti almechanism for the antiosteoporotic effect of estrogens”）Ｊ．Ｃlin． Ｉnvest. ８９：８８３−８９１）。エストロゲンのＩＬ−６の発現に及ぼすこ の効果は骨組織に限定されているのではなく、子宮細胞に関しても示されている （ヤコブ（Ｊacobs，Ａ．Ｌ.）、セーガル、ジュリアン（Ｊ．Ｊulian）および カーソン（Ｄ．Ｄ．Ｃarson（１９９２）『イン・ビトロで培養したマウス子宮 間質細胞および分裂した上皮細胞によるインターロイキン−６の分泌およびホル モン調節』（“Ｓecretion and hormonal regulation of interleukin-6 produc tion by mouse uterine stromal and polarized epithelial cells cultured in vitro”）、Ｅndocrinology １３１：１０３７−１０４６；タビブザデー（Ｔ abibzadeh，Ｓ．Ｓ.）、サンタナム（Ｕ．Ｓanthanam）、セーガルおよびメイ（ １９８９）『新鮮移植したヒト子宮内膜間質細胞によるサイトカインの誘発した ＩＦＮ−β ２／ＩＬ−６の産生。エストラジオール−１７βによる調節』（“ Ｃytokine-induced production of ＩＦＮ-beta 2/ＩＬ-6 by freshly explante d human endometrial stromal cells．Ｍodulation by estradiol-17 beta”） 、Ｊ．Ｉmmunol. １４２：３１３４−３１３９）。エストロゲンアゴニストによ り本来調節されるとして知られる他の遺伝子は多数存在する（アドラー（Ａdler ，Ｓ.）、ウォーターマン（Ｍ．Ｌ．Ｗaterman）、ヘー（Ｘ．Ｈe）およびロー ゼンフェルド（Ｍ．Ｇ．Ｒosenfeld）（１９８８）『ラットプロラクチン遺伝子 の発現のステロイド受容体を介する抑制は受容体ＤＮＡ結合部位を必要としない 』 （“Ｓteroid receptor-mediated inhibition of rat prolactin gene expressi on does not require the receptor ＤＮＡ-binding domain”）、Ｃell ５２ ：６８５−６９５；リー（Ｒee，Ａ．Ｈ．）、ランドマーク（Ｂ．Ｆ．Ｌandmar k）、エスキルド（Ｗ．Ｅskild）、レビー（Ｆ．Ｏ．Ｌevy）、ラフーティ（Ｈ ．Ｌahooti）、ジャーンセン（Ｔ．Ｊahnsen）、アークバーグ（Ａ．Ａakvaag） およびハンソン（Ｖ．Ｈansson）（１９８９）『ＭＣＦ−７細胞におけるエスト ロゲン受容体に関するｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの自己調節の低下（au tologousdown-regulation）：プロゲステロン受容体のレベルとの逆相関』（“ Ａutologousdown-regulation of messenger ribonucleic acid and protein lev els for estrogen receptors in ＭＣＦ-7 cells: an inverse correlation to progesterone receptor Ievels”）、Ｅndocrinology １２４：２５７７−２５ ８３）。 エストロゲン効果のメカニズムを調査するため、本出願人はヒトＩＬ−６プロ モーターを使用して一連のＤＮＡ結合実験を行った。コトランスフェクション（ co-transfection）研究は、ＩＬ−６プロモーターの近位（proximal）２２５ｂ ｐｓはＩＬ−１およびＴＮＦαによるリポーター遺伝子の誘発ならびにエストラ ジオールによる抑制の両方を媒介することを示している。エストラジオールによ る抑制はまた、エストロゲン受容体（ＥＲ）の発現を要求した。 ゲル遅延アッセイ（gel retardation assay）を使用して該ＥＲの近位２２５ ｂｐへの特異的な結合は検出されなかった。しかしながら、ＩＬ−１、ＴＮＦα およびエストラジオールによるＩＬ−６の調節を明らかにした＋／＋ＬＤＡ１１ 骨髄間質細胞からの核抽出物は、該細胞がＩＬ−１、ＴＮＦαで処理された場合 に−２２５〜−５２プロモーター断片を有する誘発された複合体を示した。該複 合体の誘発は急速（１０分）だが一過性であった。エストラジオールによる該細 胞の前処置は該複合体の強度（intensity）ならびに移動度（mobility）を増加 させた。 該複合体の形成に関するタンパク質を同定するため、抗体超シフト（antibody supershift）実験をｃ−ｊｕｎ、ＮＦ−ＩＬ６、ｃ−ｒｅｌおよびＮＦκＢ ｐ ５０およびｐ６５タンパク質を含む、このプロモーター断片における結合可能な 部位を有する因子に対する抗体を使用して行った。抗−ｐ５０および抗−ｐ６５ のみが効果を有し、誘発複合体を形成しなかった。 該ＩＬ−６プロモーターの潜在的なＮＦκＢ部位をカバーするオリゴヌクレオ チドはこの断片への誘発された結合に対して競合する一方、ＮＦ−ＩＬ６部位を カバーするオリゴヌクレオチドは無効であった。該ＮＦκＢオリゴヌクレオチド がプローブとして使用されるとき、３つのＩＬ−１／ＴＮＦα誘発複合体が観察 された。 エストラジオールでの前処置は最もゆっくりと移動する複合体の強度を減少さ せ、最も速く移動する複合体の強度を強力に増加した。該３バンドは抗−ｐ５０ および抗−ｐ６５抗体により別個に超移動した（すなわち、該複合体の移動度に おけるさらなる減少は該抗体の結合による）一方、抗−ＥＲ抗体を含む試験した 他のいくつかの抗体のうち効果を有するものは１つもなかった。メチル化妨害ア ッセイ（methylation interference assay）は全ての３つの複合体に関する同一 のＤＮＡ接触部位を示した。 先行技術であると認めていないが、レイ（Ｒay）ら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.、２ ６９（１７）：１２９４０−９４６（１９９４）はＮＦ−ＩＬ６およびＮＦκＢ のｐ６５サブユニットの組み合わせにより引き出された該ＩＬ−６プロモーター の活性化はｗｔ ＥＲにより抑制されるがそのＤＮＡ結合ドメインにおける突然 変異を含むＥＲによっては抑制されることができないと記載している。さらに、 ＥＲおよび１７−βエストラジオールの組み合わせによるＩＬ−６プロモーター の抑制は該プロモーターへの該受容体の高アフィニティー結合を介して媒体され ているようではなかった。 これらのデータはエストロゲンによる負の調節（negative regulation）はＩ Ｌ−６プロモーターを介して媒体され、エストロゲン受容体依存性であることを 示唆している。エストロゲンによるＩＬ−６発現の抑制はＮＦκＢまたは密接に 関連したタンパク質のＩＬ−６プロモーターに対する転写活性の調節によって媒 体される。 先行技術であると認めていないが、ムカイダ（Ｍukaida）ら、Ｊ．Ｂiol．Ｃh em. 、２６９（１８）：１３２８９−２９５（１９９４）はグルココルチコイド であるデキサメタゾンは転写レベルでＩＬ−８産生を抑制したと記載している。 該ＩＬ−８プロモーター上のＡＰ−１またはＮＦ−ＩＬ６結合部位の突然変異は 、デキサメタゾンによってＩＬ−８の遺伝子発現を抑制し、このことはこれらの 部位がデキサメタゾンの標的でなかったことを示唆している。しかしデキサメタ ゾンはＩＬ−１により誘発したＮＦκＢ複合体の形成を減少させた。 本発明は、以下に限るものではないが、エストロゲン受容体によるインターロ イキン６の転写の調節に関する実施例を参照のため詳細にわたって記載する。 実施例 候補となる薬剤はＡ）ｒｅｌ部位へ結合するタンパク質の直接評価またはＢ） ｒｅｌ部位へ結合するタンパク質の間接評価によりスクリーニングされる。Ａ）ｒｅｌ部位へ結合するタンパク質の直接評価 必須要素の発現に関して選択された細胞を、該薬剤またはビヒクル調節および インデューサー（例えば、ホルボールエステル、サイトカイン、リポ多糖）で処 理する。それらの細胞から調製された細胞抽出物（例えば、細胞全体、細胞質ゾ ルまたは核抽出物）を、サイトカインプロモーター断片またはプローブとしての 多様なｒｅｌ部位を使用してＤＮＡ結合に関して分析する。結合についてはビヒ クルまたは薬剤で処理した細胞からの抽出物を比較して定性的（qualitatively ）（すなわちパターンを比較する）および定量的に分析する。Ｂ）ｒｅｌ部位への結合の間接評価 １）内在性サイトカインの発現を測定することによる 必須要素の発現に関して選択された細胞およびサイトカインの産物を、該薬剤 またはビヒクル調節およびインデューサー（例えば、ホルボールエステル、サイ トカイン、リポ多糖）で処理する。該薬剤の活性を、当業者に公知の標準アッセ イを使用してサイトカインを測定することによって定量的に評価する。 ２）細胞に導入したリポーターの発現を測定することによる トランスフェクション手法により、リポーター構築物をサイトカインプロモー ターまたはその断片または単離したｒｅｌ部位の制御下で容易に測定することが できるタンパク質を発現する細胞に導入する。他の必須要素は、該細胞によって 内在的に発現されているかまたは特定の要素に関する発現ベクターのコトランス フェクションにより提供される。細胞は、該薬剤またはビヒクル調節およびイン デューサー（例えば、ホルボールエステル、サイトカイン、リポ多糖）で処理す る。該薬剤の活性をリポータータンパク質の発現を測定することによって定量的 に分析する。 薬剤をまた、従来の結合アッセイによりＩＲｓへの結合ならびにＩＲｓによる 遺伝子調節の典型的なメカニズムに影響する活性に関して試験する。ＩＲｓに結 合し、ｒｅｌタンパク質のサイトカインプロモーターへの結合を調節するがＩＲ の作用の典型的なメカニズムを活性化しない薬剤は、サイトカインの異常な発現 に関連する疾患の特定の処置に関する候補薬剤としての可能性がある。 本明細書に記載されている実施例に使用される実験的手続きを以下に示す：一過性のトランスフェクションおよび哺乳動物の発現構築物 ｐＥＲＥ−ｔｋ−ＬｕｃリポータープラスミドおよびＥＲgly（ｐＲＳｈＥＲ ）を発現しているベクターの構築物は記載されている（ツカーマン（Ｔzukerman ，Ｍ.）、エスティー（Ａ．Ｅsty）、サンチソ−メアー（Ｄ．Ｓantiso-Ｍere） 、ダニエリアン（Ｐ．Ｄanielian）、パーカー（Ｍ．Ｇ．Ｐarker）、ステイン （Ｒ．Ｂ．Ｓtein）、パイク（Ｊ．Ｗ．Ｐike）およびマクドネル（Ｄ．Ｐ．Ｍc Ｄonnell）（１９９４）『ヒトエストロゲン受容体のトランス活性化能力（tran sactivational capacity）は細胞およびプロモーター環境の両方によって決定さ れ、２つの機能的に異なる細胞内領域によって媒体される』（“Ｈuman estroge n receptor transactivational capacity is determined by both cellular and promoter context and mediated by two functionally distinct intramolecul ar regions”）、Ｍol．Ｅndocrinol. ８：２１−３０、参照のため引用する） 。該ｐＩＬ６［−２２５］Ｌｕｃリポーター構築物は、ＮheＩ−ＢamＨＩ断片の 切り出しおよびクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、該ベクター断 片の再ライゲーション（religation）により親のｐＬＩ６［−１２ ００］Ｌｕｃから得た。該親のｐＬＩ６［−１２００］Ｌｕｃを、ｐＣＡＴ−Ｍ ５４−ＩＬ−６（−）からＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切り出した１.２ｋｂの ＩＬ−６プロモーターインサートをルシフェラーゼベクターＬｕｃｐ１の対応部 位にクローニングすることにより構築した。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をウェル当たり８０,０００細胞で１０％ＦＢＳを補 充したフェノールレッドを有さないＤＭＥＭにて播種した。該細胞を０.５ｍｇ ｐＩＬ６［−２２５］Ｌｕｃ単独または０.０５ｍｇのｐＲＳｈＥＲまたは０.１ ｍｇのＨＥ０とともに、トランスフェクション混合物における２ｍｇの総ＤＮＡ に調整するためｐＧＥＭをキャリアとして使用して、リン酸カルシウム沈澱によ りトランスフェクションした（ピーターソン（Ｐeterson，Ｊ．Ｌ.）、マクブラ イド（Ｏ．Ｗ．ＭcＢride）（１９８０）『結合した真核生物遺伝子のコトラン スファー（cotransfer）およびＤＮＡ媒介遺伝子伝達によるヒポキサンチンホス ホリボシルトランスフェラーゼの有効な伝達』（“Ｃotransfer of linked euka ryotic genes and efficient transfer of hypoxanthine phosphoribosyltransf erase by ＤＮＡ-mediated gene transfer”）、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci． Ｕ．Ｓ．Ａ. ７７：１５８３−１５８７）。３７℃にて４時間後、該細胞を７％ ＤＭＳＯで３０分間処理し、ついで培地を替え、ホルモンを添加した。その翌日 、該細胞をＴＮＦαおよびＩＬ−１ｂ（各１ｎＭ）で２４時間誘発した。ＰＢＳ で短時間洗浄した後、細胞を２００ｍｌの溶菌バッファー（Iysis buffer）（２ ５ｍＭ トリス［ｐＨ７.８］、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ １,２−ジアミノシクロ ヘキサン−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−四酢酸、１０％グリセロール、１％ Ｔriron Ｘ−１ ００）内で溶菌した。試薬（２０ｍＭ トリシン［ｐＨ７.８］、１.０７ｍＭ(Ｍ ｇＣＯ3)4Ｍｇ(ＯＨ)2、２.６７ｍＭ ＭgＳＯ4、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３.３ ｍＭ ＤＴＴ、２７９ｍＭ 補酵素Ａ、４７０ｍＭ ルシフェリン、５３０ｍＭ Ａ ＴＰ）の１００ｍｌの各抽出物の２０ｍｌまでを添加し、ルシフェラーゼ活性を 循環様式（cycle mode）でディナテック・ルミノメーター（Ｄynatech luminome ter）を用いてただちに測定した。抗体、ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡおよびＥＲアッセイ 以下のウサギにおける抗体を作製するために使用するペプチドは、マウスｃ− ｊｕｎの９１−１０５のアミノ酸残基（ライダー（Ｒyder）およびナタンズ（Ｎ athans）（１９８８）『血清成長因子によるガン原遺伝子ｃ−ｊｕｎの誘発』（ “Ｉnduction of protooncogene c-jun by serum growth factors”)、Ｐroc． Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ８５：８４６４−８４６７）、マウスＮＦ−ＩＬ ６の２７８−２９６のアミノ酸残基（チャン、チェン、レイ、チェンおよびリー （１９９０）『Ｃ／ＥＢＰファミリーの成員に属する転写因子ＡＧＰ／ＥＢＰの モレキュラークローニング』、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：６６４２−６６５ ３）、マウスｃ−ｒｅｌの１５２−１７６のアミノ酸残基（ブル、モーリー（Ｋ ．Ｌ．Ｍorley）、ホウクストラ（Ｍ．Ｆ．Ｈoekstra）、ハンター（Ｔ．Ｈunte r）およびベルマ（Ｉ．Ｍ．Ｖerma）（１９９０）『マウスｃ−ｒｅｌタンパク 質はＮ末端調節ドメインおよびＣ末端転写トランスアクチベーションドメインを 有する』（“Ｔhe mousec-crel protein has an Ｎ-terminal regulatory domai n and a Ｃ-terminal transcriptional transactivation domain”）Ｍoll．Ｃe ll Ｂiol. １０：５４７３−５４８５）；イノウエ（Ｉnoue，Ｊ.）、ケール（ Ｌ．Ｄ．Ｋerr）、ランソン（Ｌ．Ｊ．Ｒansone）、ベンガル（Ｅ．Ｂengal）、 ハンターおよびベルマ（１９９１）『ｃ−ｒｅｌはκＢ部位からの転写を活性化 させるがｖ−ｒｅｌは抑制する』（“c-rel activates but v-rel suppresses t ranscription from kappa Ｂ sites”）、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ．Ｓ ．Ａ. ８８：３７１５−３７１９）、マウスｐ５０の３４７−３６１のアミノ酸 残基（ゴーシュ、ギッフォード（Ａ．Ｍ．Ｇifford）、リビール（Ｌ．Ｒ．Ｒiv iere）、テンプスト（Ｐ．Ｔempst）、ノラン（Ｇ．Ｐ．Ｎolan）およびバルチ モア（１９９０）『ＮＦκＢのｐ５０ＤＮＡ結合サブユニットのクローング：ｒ ｅｌおよびｄｏｒｓａｌへのホモロジー』（“Ｃloning of the p50 ＤＮＡ bin ding subunit of ＮＦ-kappa Ｂ:homology to rel and dorsal”）、Ｃell ６ ２：１０１９−１０２９）およびヒトｐ６５（マウスｐ６５と８８％のホモロジ ーがある）３−１９のアミノ酸残基（ノラン、リオウ、テンプストおよびバル チモア（１９９１）『ｒｅｌ関連ポリペプチドであるクローニングされたＮＦκ Ｂのｐ６５サブユニットのＤＮＡ結合およびＩκＢ抑制』（“ＤＮＡ binding a nd Ｉ kappa B inhibition of the cloned p65 subunit of ＮＦ-kappa Ｂ，a r el-related polypeptide”）Ｃell ６４：９６１−９６９；ルーベン（Ｒuben, Ｓ．Ｍ.）、ディロン（Ｐ．Ｊ．Ｄillon）、シュレック（Ｒ．Ｓchreck）、ヘン ケル、チェン、マヘル（Ｍ．Ｍaher）、ボーエールおよびローゼン（Ｃ．Ａ．Ｒ osen）（１９９１）『ＮＦκＢの６５ｋＤのサブユニットをコードすることがで きるｒｅｌ関連ヒトｃＤＮＡの単離［レター］』（“Ｉsolation of a rel-rela ted human cＤＮＡ that potentially encodes the 65-kＤ subunit of ＮＦ-ka ppa Ｂ［letter］”）、Ｓcience ２５４：１１）に対応する。上記参照文献を 全て本明細書に参照のため引用する。上記に列挙した全ての抗体は、サンタ・ク ルズ・バイオテクノロジー社（Ｓanta Ｃruz Ｂiotechnology，Ｉnc.)（サンタ クルズ（Ｓanta Ｃruz）、ＣＡ）より１ｍｇ／ｍｌの濃度でアフィニティー精製 されたものを得た。抗ＴＢＰは、ヒト組換えタンパク質の全長で免疫したウサギ からのプロテインＡ精製した血清調製物であり、マウス、ラットおよびヒト由来 （サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社）のＴＢＰと反応すると報告された。 抗ＥＲはマウスＥＲの８−２２のアミノ酸残基に対応するペプチドに対して作製 されたマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ）である。組織培養物の上清にお けるＩＬ−６の濃度を通常と同様にＩＬ−６を使用して、ＩＬ−６ＥＬＩＳＡキ ット（エンドゲン社（Ｅndogen，Ｉnc.）、ボストン、ＭＡ）を用いて決定した 。 ＋／＋ＬＤＡ１１細胞におけるＥＲを全細胞抽出物において測定した。洗浄お よびカウント後、細胞を５０ｍＭ トリス［ｐＨ７.５］、３０％グリセロール、 ５００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび５ｍＭ ＤＴＴを 含むバッファーにおいてホモジナイズ（homogenize）した。氷上で３０分置いた 後、該ホモジェネートを遠心した（１００，０００ｇ、４℃、１時間）。該上清 を全細胞抽出物として採取し、０.５％ ＣＨＡＰＳと調和させ、２００倍過剰の ＤＥＳの不在下または存在下にて、一晩４℃で５ｎＭの［3Ｈ］でインキュベー トした。抗ＥＲ抗体でインキュベートした後、形成した複合体をプロテインＡ− セファロース（ファルマシア（Ｐharmacia））で沈澱させ、１０ｍＭトリス［ｐ Ｈ７.５］／０．５％ＣＨＡＰＳで３回洗浄し、液体シンチレーションカウント により測定した。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）およびメチル化妨害アッセイ（meth ylation interference assay） ＤＮＡ結合の実験を＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの核抽出物、組換え体ヒトＥＲgly を発現している酵母からの抽出物および精製したｐ５０およびｐ４９タンパ ク質で行なった。＋／＋ＬＤＡ１１細胞を記載された条件下で維持した（ギラソ ール、ジルカ、パセリ、ボスウェル、ボーダー、ウィリアムズおよびマノラガス （１９９２）『エストラジオール−１７βはイン・ビトロにて骨髄由来間質細胞 および骨芽細胞によってインターロイキン−６の産生を抑制する：エストロゲン の抗骨粗鬆症的効果の可能性のあるメカニズム』Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest. ８９：８ ８３−８９１）。核抽出物を調製するために、該細胞を１０％ＦＢＳを補充した フェノールレッド有さないマッコイ培地（ＭcＣoy's medium）に播種し、何も指 示していなければ２４時間ホルモンで前処置した。培地を２％ＦＢＳと調和させ た後、該細胞を多様な期間ＴＮＦαおよびＩＬ−１ｂ（各１ｎＭ）で誘発した。 シクロヘキシミド（１０ｍｇ／ｍｌ）またはキナーゼインヒビターＨ７（５０ｍ Ｍ）を含む場合、それらの化合物を誘発の５分前に添加した。氷で冷却したＰＢ Ｓで２回洗浄することによってインキュベーションを停止させ、細胞を冷却した バッファーＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７.９］、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ ０Ｍｍ ＫＣｌ、０.５ｍＭ ＤＴＴ、０.２％ Ｎonidet ｐ−４０）にてイン・サ イチュで溶菌した。リゼイト（ｌysate）をマイクロフュージチューブ（microfu ge tube）に移して、核をペレット化し（８０００ｒｐｍ、１分）、バッファー Ｃ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、１．５ｍＭ ＭgＣｌ2、４２０ｍＭ ＮａＣｌ、２５％グリセロール、０.２ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ ＤＴＴ、０. ５ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁した。４℃で４０分間振盪した後、サンプルを遠心 し（１５，０００ｒｐｍ、１０分）、上清を核抽出物として採取した。ブラッ ドフォードタンパク質アッセイ（Ｂradford protein assay）（ブラッドフォー ド（Ｂradford，Ｍ．Ｍ.）（１９７６）『タンパク質−染料結合方法を利用する タンパク質のマイクログラム量の定量化のための迅速でかつ高感度の方法』（“ Ａrapid and sensitive method for the quantitatiion of microgram quantiti es of protein utilizing the principle of protein-dye binding”）、Ａnal ．Ｂiochem. ７２：２４８−２５４）はホルモンまたはサイトカイン処理に相 関しないタンパク質濃度において僅か最少の変化のみを示した。組換え体として ＥＲglyを発現する酵母の抽出物を記載されたようにＹＥｐＥ１０で形質転換し たＢＪ２１６８株から調製した（ツカーマン、エスティー、サンチオ−メアー、 ダニエリアン、パーカー、ステイン、パイクおよびマクドネル（１９９４）『ヒ トエストロゲン受容体のトランス活性化能力（transactivational capacity）は 細胞およびプロモーター環境の両方によって決定され、２つの機能的に異なる細 胞内領域によって伝達される』、Ｍol．Ｅndocrinol. ８：２１−３０）。精製 したヒトｐ５０およびｐ４９タンパク質を発現する大腸菌（Ｅscherichia coli ）はプロメガ（Ｐromega）（マディソン、ＷＩ）より購入した。 ＥＭＳＡに関して、該抽出物の２ｍｌを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７.９］ 、４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、２.５ｍＭ ＭgＣｌ2、１０％グリセロ ール、０.１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび１ｍＭ ＤＴＴに調整した結合バッファー 中で２ｍｇ ポリ［ｄＩ−ｄＣ］でプレインキュベートした（preincubated）。 −２２５〜−５２ ＩＬ−６プロモーター断片をプローブとして使用する場合、 Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ストラタジーン（Ｓtratagene）、ラ・ホラ （Ｌa Ｊolla）、ＣＡ）の０.５ｍｇも含有した。氷上で２０分間置いた後、該 プローブを添加し、室温でインキュベートを２０分間続行した。抗体を含む場合 、１ｍｇを該プローブの２０分後に添加し、４℃にてインキュベートを４０分間 続行した。形成した複合体を、４℃で０.２５×ＴＢＥ中で１５Ｖ／ｃｍの速度 で非変成ポリアクリルアミドゲル（４％アクリルアミド／０.０５％ＢＩＳ；２ ×２００ｍｍ）上で分析した。プローブはヒトＩＬ−６プロモーターおよびビテ ロゲニンプロモーターのＥＲＥに対応する−８２〜−４７の 領域および−１７２〜−１３１の 二本鎖オリゴヌクレオチド（ツカーマン、ザン、ヘルマン、ウィルス（Ｋ．Ｎ． Ｗills）、グラウプナー（Ｇ．Ｇraupner）およびプファール（１９９０）『ヒ トエストロゲン受容体はリガンドの不在下で転写アクチベーターおよびリプレッ サー機能を有する』（“Ｔhe human estrogen receptor has transcriptional a ctivator and repressor functions in the absence of ligand”）、Ｎew Ｂio l. ２：６１３−６２０）または−２２５〜−５２ＮheＩ−ＳspＩ ＩＬ−６プロ モーター断片であった。全てのプローブはＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを使 用して［γ32Ｐ］ｄＡＴＰで標識するかまたはクレノウポリメラーゼを使用して ［α32Ｐ］ｄＡＴＰで標識し、続いてポリアクリルアミドゲル電気泳動によって 精製した。 メチル化妨害アッセイに関しては、上鎖または下鎖上で［γ32Ｐ］ｄＡＴＰで 標識した−８２〜−４７のプローブを限定したＤＭＳ−メチル化にかけた（マキ サム（Ｍaxam，Ａ.Ｍ.）およびギルバート（Ｗ．Ｇilbert）（１９８０）『塩基 特異的化学的開裂を有する末端標識ＤＮＡのシークエンシング』（“Ｓequencin g end-labeled ＤＮＡ with base-specific chemical cleavages”）、Ｍethods Ｅnzymol. ６５：４９９−５６０）。ＥＭＳＡは、１０倍の規模にかさ上げし て上記のように行った。ゲルを０.５×ＴＢＥ中で３０分間３０Ｖにて、ＮＡ４ ５陰イオン交換メンブレーン（シュライヒァー（Ｓchleicher）およびシュエル （Ｓchuell）上でブロットした（シン（Ｓingh，Ｈ.）、ルボウィッツ（Ｊ．Ｈ ．ＬeＢowitz）、バルドウィン（Ａ．Ｓ．Ｂaldwin，Ｊr.）およびシャープ（Ｐ ．Ａ．Ｓharp）（１９８８）『エンハンサー結合タンパク質のモレキュラークロ ーニング：認識部位ＤＮＡを有する発現ライブラリーのスクリーニングによる単 離』（“Ｍolecular cloning of an enhancer binding protein:isolation by s creening of an expression library with a recognition site ＤＮＡ”）、Ｃ ell ５２：４１５−４２３）。オートラジオグラフィーの後、多様な複合体 および遅延していない（unretarded）プローブに対応するＤＮＡを溶離し（６５ ℃で１０分間、２０ｍＭトリス［ｐＨ８.０］、１Ｍ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＤ ＴＡ中で）、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって精製 した。１Ｍピペリジン中での鎖の開裂（９０℃で３０分間）の後、該断片を非変 成ポリアクリルアミドゲル（１２％アクリルアミド／０.６％ＢＩＳ）上で分析 した。実施例１．ＩＬ−６プロモーター活性のＥＲ媒体の抑制のスクリーニング ＩＬ−６の抑制がｍＲＮＡレベルでエストラジオールによって調節されている ことが示されている（ギラソール、ジルカ、パセリ、ボスウェル、ボーダー、ウ ィリアムズおよびマノラガス（１９９２）『エストラジオール−１７βはイン・ ビトロにて骨髄由来間質細胞および骨芽細胞によってインターロイキン−６の産 生を抑制する：エストロゲンの抗骨粗鬆症的効果の可能性のあるメカニズム』Ｊ ．Ｃlin．Ｉnvest. ８９：８８３−８９１；ヤコブ、セーガル、ジュリアンおよ びカーソン（１９９２）『イン・ビトロにおけるマウス子宮間質細胞および分裂 した上皮細胞によるインターロイキン−６の分泌およびホルモン調節』、Ｅndoc rinology １３１：１０３７−１０４６）。エストロゲンまたは候補薬剤が直接 ＩＬ−６の転写に作用するかどうかを決定するため、本発明者らは−２２５〜＋ １４までのヒトＩＬ−プロモーター領域の制御下でホタルのルシフェラーゼを発 現するリポーター構築物をマウス線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２にトランスフ ェクションした。これらの細胞は骨形態形成タンパク質−２（bone morphogenic protein-2）に応答して骨形成細胞に分化するため、前骨芽細胞とみなされてよ い（カタギリ（Ｋatagiri，Ｔ.）、ヤマグチ（Ａ．Ｙamaguchi）、イケダ（Ｔ． Ｉkeda）、ヨシキ（Ｓ．Ｙoshiki）、ウォズニー（Ｊ．Ｍ．Ｗozney）、ローゼ ン（Ｖ．Ｒosen）、ワン（Ｅ．Ａ．Ｗang）、タナカ（Ｈ．Ｔanaka）、オムラ（ Ｓ．Ｏmura）およびスダ（Ｔ．Ｓuda）（１９９０）『組換え体ヒト骨形態形成 タンパク質−２は非骨形成マウス多分化能性細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の骨芽細 胞への分化を誘発する』（“Ｔhe non-osteogenic mouse pluripotent cell lin e，C3H10T1/2，is induced to differentiate into osteoblastic cells by recombinant human bone morphogenetic protein-2”）、Ｂiochem．Ｂiophy s．Ｒes．Ｃommun. １７２：２９５−２９９）。 従って、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を近位ヒトＩＬ−６プロモーター（ｐＩＬ− ６［−２２５］Ｌｕｃ）単独または野性型ヒトＥＲgly（ｐＲＳｈＥＲ）の発現 ベクターを伴った制御下でルシフェラーゼ発現ベクターでトランスフェクション した。２４時間の多様な濃度でのエストラジオールでの前処置の後、該培養をＴ ＮＦαおよびＩＬ−１の各１ｎＭで誘発するかまたは誘発せずにそのままの状態 にしておき、ついで２４時間後に細胞を回収し、抽出物をルシフェラーゼ活性に 関して分析した。 ＴＮＦαおよびＩＬ−１でトランスフェクションした細胞の処理は基本レベル を超えてのルシフェラーゼ活性における５倍の増加を誘発した。エストロゲン受 容体を発現するプラスミドのコトランスフェクションを行わない場合は、エスト ラジオールでの処理は無効であった。しかしながら、コトランスフェクションに よるエストロゲン受容体の発現がみられる場合は、エストラジオールでの処理は ルシフェラーゼ活性の強い、投与量依存性の抑制となった。 野性型ヒトＥＲ（ＥＲgly）同様にホルモン結合ドメインにおけるグリシンか らバリンへの点突然変位を有するＥＲ変異体（ＥＲval）でも抑制が観察された （トラ（Ｔora，Ｌ.）、ムリック（Ａ．Ｍullick）、メツガー（Ｄ．Ｍetager） 、ポングリキトモングコル（Ｍ．Ｐonglikitmongkol）、パーク（Ｉ．Ｐark）お よびシャンボン（Ｐ．Ｃhambon）（１９８９）『クローニングされたヒトエスト ロゲン受容体はそのホルモン結合性を変える変異を有する』（“Ｔhe cloned hu manoestrogen receptor contains a mutation which alters its hormone bindi ng properties”）、ＥＭＢＯ Ｊ. ８：１９８１−１９８６）。ＥＲvalは高濃 度のエストラジオールを要したが、強い抑制を示した。これは誘発実験において ＥＲvalは低濃度のホルモンに応答するがかなり基礎的な活性しか有さないとい う結果に矛盾しない（ツカーマン、ザン、ヘルマン、ウィルス、グラウプナーお よびプファール（１９９０）『ヒトエストロゲン受容体はリガンドの不在下で転 写アクチベーターおよびリプレッサー機能を有する』、Ｎew Ｂiol. ２：６１ ３−６２０）。 コトランスフェクションしたＥＲへのエストロゲン効果の依存性はＣ３Ｈ１０ Ｔ１／２細胞は機能的に内在的なＥＲを発現しないということを示唆した。これ は、ビテロゲニンエストロゲン応答要素（ＥＲＥ）の制御下でのルシフェラーゼ リポーターで細胞をトランスフェクションすることによって確認された（クライ ン−ヒトパス、ショーップ（Ｍ．Ｓchorpp）、ワグナー（Ｕ．Ｗagner）および リッフェル（Ｇ．Ｕ．Ｒyffel）（１９８６）『アフリカツメガエルビテロゲニ ンＡ２遺伝子の５'フランキング領域由来のエストロゲン応答性要素はトランス フェクションしたヒト細胞において機能する』（“Ａn estrogen-responsive el ement derived from the 5'flanking region of the Ｘenopus vitellogenin Ａ 2 gene functions in transfected human cells”）、Ｃell ４６：１０５３− １０６１）。 従って、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を最少の（minimal）チミジンキナーゼプロ モーターおよびビテロゲニンエストロゲン応答要素（ｐＥＲＥ−tk−Ｌuc）単独 またはｐＲＳｈＥＲを伴った制御下で、ルシフェラーゼ発現ベクターでトランス フェクションした。１０ｎＭ エストラジオールまたはビヒクルでの処理の２４ 時間後に細胞を回収し、抽出物をルシフェラーゼ活性に関して分析した。エスト ラジオールによるルシフェラーゼ活性の誘発はコトランスフェクションしたＥＲ の存在下でのみ観察された。 さらに、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を１０ｎＭ エストラジオールでインキュベ ートするかまたは該物質なしでインキュベートした。２４時間後、該培養をＴＮ ＦαおよびＩＬ−１（各１ｎＭ）で誘発するかまたはさらに２４時間誘発せずに そのままの状態にした。該上清におけるＩＬ−６をマウスＩＬ−６に特異的なＥ ＬＩＳＡによってアッセイした。内在的ＩＬ−６の産生を強く増加させるＩＬ− １およびＴＮＦα処理にＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は応答したが、内在的ＥＲを有 する他の骨形成細胞または間質細胞のようではなく（ギラソール、ジルカ、パセ リ、ボスウェル、ボーダー、ウィリアムズおよびマノラガス（１９９２）『エス トラジオール−１７βはイン・ビトロにて骨髄由来間質細胞および骨芽細胞によ ってインターロイキン−６の産生を抑制する：エストロゲンの抗骨粗鬆症効果の 可能性のあるメカニズム』、Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest. ８９：８８３−８９１）、 ＩＬ−６のレベルはエストラジオールによって低下しなかった。これらのデータ はＩＬ−６発現の抑制は転写レベルでありＥＲを介して媒体されることを示唆す る。前骨芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を使用するコトランスフェクションの実験 により、本発明者らは近位ＩＬ−６プロモーター領域のＩＬ−１／ＴＮＦα−誘 発活性化はエストロゲンによって抑制されることができることを示した。この抑 制はエストロゲン受容体依存性であり野性型ヒトＥＲ（ＥＲgly）およびＥＲval 変異体の両者で観察された。同様の結果をＥＲvalでコトランスフェクションし たＨeＬa細胞および内在性のＥＲを発現している前骨芽細胞株ＭＢＡ１３細胞の 両者において他者によって得た。ＩＬ−６ ｍＲＮＡへのエストロゲンの記載さ れた効果と共に（ギラソール、ジルカ、パセリ、ボスウェル、ボーダー、ウィリ アムズおよびマノラガス（１９９２）『エストラジオール−１７βはイン・ビト ロにて骨髄由来間質細胞および骨芽細胞によってインターロイキン−６の産生を 抑制する：エストロゲンの抗骨粗鬆症効果の可能性のあるメカニズム』、Ｊ．Ｃ lin．Ｉnvest. ８９：８８３−８９１；ヤコブ、セーガル、ジュリアンおよびカーソン（１９９ ２）『イン・ビトロにおけるマウス子宮間質細胞および分裂した上皮細胞による インターロイキン−６の文筆およびホルモン調節』、Ｅndocrinology １３１： １０３７−１０４６）、これらの結果はエストロゲン誘発性の抑制の転写メカニ ズムを示唆する 候補薬剤は上記アッセイを使用してスクリーニングでき、該薬剤をエストラジ オールの代わりとすることができる。実施例２．ＮＦκＢ関連タンパク質の近位ＩＬ−６プロモーターへの結合を調節 する薬剤のスクリーニング ＥＲを発現する細胞株（＋／＋ＬＤＡ１１） 模範的なアッセイシステムは、ＥＲを含むすべての必須要素を内在的に発現す る細胞株である。マウス間質細胞株＋／＋ＬＤＡ１１由来の骨髄はＩＬ−６の分 泌を強く増加させるＩＬ−１およびＴＮＦα処理に応答することを示している。 エストラジオールでの処理は、該タンパク質およびそのｍＲＮＡに関して示され るようにＩＬ−６の誘発を抑制する（ギラソール、ジルカ、パセリ、ボスウェル 、ボーダー、ウィリアムズおよびマノラガス（１９９２）『エストラジオール− １７βはイン・ビトロにて骨髄由来間質細胞および骨芽細胞によってインターロ イキン−６の産生を抑制する：エストロゲンの抗骨粗鬆症効果の可能性のあるメ カニズム』、Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest. ８９：８８３−８９１）。 ＥＲが＋／＋ＬＤＡ１１細胞において実際に存在することを証明するため、ホ ルモン結合実験を行った。初期の実験はこれらの細胞からの高塩抽出物における エストラジオールに特異的な結合部位の数が少ないことを示した。該ＥＲのアミ ノ末端に直接対するモノクローナル抗体を使用して、ＥＲを表す結合部位を確実 にするため特異的に結合した［3Ｈ］エストラジオールを免疫沈降した。それら の実験により本発明者らは＋／＋ＬＤＡ１１細胞は細胞当たり約１０００のＥＲ 分子を有すると計算した。 しかしながら、プローブとしてのビテロゲニンＥＲＥと組み合わせて電気泳動 移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用する場合、ＥＲ特異的ＤＮＡ結合活性 はエストラジオールおよび／またはＩＬ−１およびＴＮＦαで処理した＋／＋Ｌ ＤＡ１１からの核抽出物において検出できなかった。指示どおりエストラジオー ル（１０ｎＭ）およびＴＮＦαおよびＩＬ−１（各１ｎＭで４０分間）で前処置 した＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの核抽出物または組換え体的に発現するヒト野性 型ＥＲglyを含む酵母抽出物を抗ＥＲ抗体の不在下または存在下でプローブとし てのビテロゲニンＥＲＥでインキュベートした。形成した複合体をＥＭＳＡによ って分析した。 検出した複合体は抗ＥＲ抗体によって有意に影響されなかったため、該ＥＲに 関連していない。酵母発現系から得た抽出物を含むＥＲを使用する調節によって 、抗ＥＲ抗体で特異的にシフトした２つのゆっくりと移動する複合体を生じた。 これらのデータはＥＲが＋／＋ＬＤＡ１１細胞に存在するがＥＭＳＡによっては 濃度が低過ぎて検出できないことを示唆している。核抽出物のＩＬ−６プロモーターへのＤＮＡ結合活性 ＩＬ−６誘発およびエストロゲンによる抑制の分子メカニズムを研究するため 、＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの核抽出物をコトランスフェクション実験における サイトカイン誘発およびエストロゲン抑制を媒体する該ＩＬ−６プロモーター領 域へのＤＮＡ結合活性に関して分析した。このＤＮＡ断片が核抽出物と高いバッ クグランド結合を示すため、ＴＡＴＡボックスを含む最も近位の領域は転写開始 部位の上流−２２５〜−５２の断片を残して除去した。該プロモーターのこの領 域はｃＡＭＰ応答要素のコア配列（ＣＲＥ）、ロイシンジッパータンパク質ＮＦ −ＩＬ６に関する結合部位およびＮＦκＢ部位を含む幾つかの転写因子の一致結 合部位を含む（イッシキ、アキラ、タナベ、ナカジマ、シマモト、ヒラノおよび キシモト（１９９０）『ＩＬ−６遺伝子におけるＩＬ−１応答要素と相互作用す る構成的およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）−誘発因子』、Ｍol．Ｃell Ｂiol. １０：２７５７−２７６４）。 ＮＦ−ＩＬ６およびＮＦκＢ様タンパク質のこれらの部位への結合は証明され ている（アキラ、イッシキ、スギタ、タナベ、キノシタ、ニシオ、ナカジマ、ヒ ラノおよびキシモト（１９９０）『ＩＬ−６発現に関する核因子（ＮＦ−ＩＬ６ ） はＣ／ＥＢＲファミリーの一員である』、ＥＭＢＯ Ｊ. ９：１８９７−１９０ ６；リーベルマンおよびバルチモア（１９９０）『ＮＦ−κＢ転写因子を介する インターロイキン−６遺伝子発現の活性化』、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：２ ３２７−２３３４）。この断片を多様な時間ＩＬ−１およびＴＮＦαで処理した ＋／＋ＬＤＡ１１からの核抽出物でインキュベートした。＋／＋ＬＤＡ１１細胞 を指示どおりエストラジオール（１０ｎＭ）で前処置した。２４時間後、該細胞 をＴＮＦαおよびＩＬ−１（各１ｎＭ）で様々な期間誘発した。誘発を細胞溶解 によって停止し、ついで核抽出物を−２２５〜−５２のＩＬ−６プロモーター断 片をプローブとして使用するＥＭＳＡによって分析した（図１ａ）。 形成した複合体をＥＭＳＡによって分析した。サイトカインで処理した後、誘 発可能な複合体が観察された。該複合体の強度はＩＬ−１およびＴＮＦαでの処 理の１０分後にすでに最大となり、時間経過と共に徐々に低下した。誘発の２時 間後、該複合体の強度は有意に減少した。 エストラジオールでの細胞の前処置は、誘発していない細胞からの抽出物の結 合能力に影響を及ぼさなかった。しかしながらエストラジオール前処置は、誘発 間隔が１０分〜４０分間である誘発複合体の顕著な増加、しかし誘発の２時間後 には該複合体にほんの僅かな効果しか及ぼさないという結果となった。増強され た強度に加えて、エストラジオールでの前処置がまた定量的変化である該複合体 の移動度の増加を引き起こした。ＤＮＡ結合複合体の組成物の検出 該複合体および関連のありそうなタンパク質の特性を調査するため、本発明者 らは結合反応物をいくつかの潜在的な結合因子に直接対する抗体でインキュベー トした。指示どおりエストラジオール（１０ｎＭ）およびＴＮＦαおよびＩＬ− １（各１ｎＭで１０分間）で処置した＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの核抽出物を多 様な抗体の不在下または存在下で−２２５〜−５２プローブでインキュベートし た。形成した複合体をＥＭＳＡによって分析した。 図１ｂは検査した抗体のうち誘発していない細胞由来の抽出物のＤＮＡ結合に 影響を及ぼすものが１つもなかったことを示す。抗−ｃ−ｊｕｎまたは抗−ｃ− ｒｅｌ、または抗−ＮＦ−ＩＬ６抗体のいずれもサイトカイン誘発複合体に影響 を及ぼさなかった。 しかしながら、ＮＦκＢ複合体における２つのタンパク質に直接対する抗体、 抗−ｐ５０、抗−ｐ６５は該複合体を形成しなかった（レーン１０−１３）。こ れはエストラジオールで処理したまたは処理していない細胞からの抽出物で、サ イトカイン誘発の全期間にわたり観察された（図１ｂは誘発１０分後の結果を示 す）。長く接触させればさせるほど、おそらく抗−ｐ５０、抗−ｐ６５による誘 発複合体の超シフトという結果から低移動度の非常に弱い複合体が検出された。 ＥＲのビテロゲニンＥＲＥへの結合活性は＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの抽出物 では検出されなかったが、本発明者らは該ＥＲがＩＬ−６プロモーター断片上に おける複合体形成に関与するかどうかを検査した。指示どおりエストラジオール （１０ｎＭ）およびＴＮＦαおよびＩＬ−１（各１ｎＭで４０分間）で前処置し た＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの核抽出物または組換え体的に発現するヒト野性型 ＥＲglyを含む酵母抽出物を抗−ＥＲ抗体の不在下または存在下で−２２５〜− ５２プローブでインキュベートした。形成した複合体をＥＭＳＡによって分析し た。 図１ｃはサイトカイン誘発またはエストラジオール処理とは独立して、抗−Ｅ Ｒ抗体の添加は誘発されたものであれ構造的なものであれ、該複合体のいずれに も有意な影響は及ぼさなかった。さらに、高濃度の組換え体ＥＲを含む酵母抽出 物をＩＬ−６プロモーター断片でインキュベートした場合、該ＥＲの特異的な結 合は全く検出されなかった（レーン７および８）。観察された弱いバンドは抗− ＥＲ−抗体によって影響されなかったため、該ＥＲに関連しないものである。 該抗体ゲルシフト実験からの結果はさらにオリゴヌクレオチド競合実験によっ て支持された。指示どおりエストラジオール（１０ｎＭ）およびＴＮＦαおよび ＩＬ−１（各１ｎＭで１０分間）で前処置した＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの核抽 出物を、ヒトＩＬ−６プロモーターの−８２〜−４７および−１７２〜−１３１ の領域に対応する４００倍モル過剰なオリゴヌクレオチドの不在下または存在下 で、−２２５〜−５２プローブでインキュベートした。形成した複合体をＥＭＳ Ａ によって分析した。 図１ｄにおける矢印はＴＮＦαおよびＩＬ−１での誘発で形成した複合体を示 す。標識した−２２５〜−５２断片の４００倍過剰な量での結合反応におけるＮ Ｆ−ＩＬ６部位、ＣＲＥおよびＩＬ−６プロモーターの近隣ＣＣＡＡＴボックス （−１７２〜−１３１）をカバーする含有物は、構造的なものであれ、サイトカ イン誘発されたものであれ、該複合体のいずれにも有意な影響は及ぼさなかった （レーン４および７）。しかしながら、推定ＮＦκＢ部位およびその近隣配列（ −８２〜−４７）をカバーするオリゴヌクレオチドは特に、サイトカイン誘発複 合体を形成しなかった（レーン３および６）。 抗体実験およびオリゴヌクレオチド競合実験は、ＩＬ−１およびＴＮＦαがＮ ＦκＢまたは関連タンパク質を特に活性化することを示唆した。ｃ−ｊｕｎ（Ａ Ｐ−１）、ＮＦ−ＩＬ６、ｃ−ｒｅｌまたはＥＲの結合は検出されなかった。 ＮＦ−ＩＬ６結合の欠如は、他の細胞においてＩＬ−１に応答してこの転写因 子の誘発および結合が報告されているので驚くべきものである（アキラ、イッシ キ、スギタ、タナベ、キノシタ、ニシオ、ナカジマ、ヒラノおよびキシモト（１ ９９０）『ＩＬ−６発現に関する核因子（ＮＦ−ＩＬ６）はＣ／ＥＢＲファミリ ーの一員である』、ＥＭＢＯ Ｊ. ９：１８９７−１９０６；イノウエ、ケール 、ランソン、ベンガル、ハンターおよびベルマ（１９９１）、Ｐroc．Ｎatl．Ａ cad．Ｓci．ＵＳＡ ８８：３７１５−３７１９）。本発明者らのＤＮＡ結合実 験は＋／＋ＬＤＡ１１細胞由来の骨髄において、ＩＬ−１およびＴＮＦαはＮＦ κＢまたは密接に関連したタンパク質のＩＬ−６プロモーターへの結合を誘発す ると示している。同様の結果が異なる細胞タイプにおいて得られている（シミズ 、ミトモ、ワタナベ、オカモト、およびヤマモト（１９９０）『炎症性リンホカ インによるインターロイキン−６遺伝子の活性化におけるＮＦκＢ様転写因子の 関与』、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：５６１−５６８；ザン、リン、およびビ ルセック（１９９０）『ヒト線維芽細胞における腫瘍壊死因子およびインターロ イキン−１によるインターロイキン−６誘発はκＢ様配列に結合する核因子の活 性化に関与する』、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：３８１８−３８２３）。ＡＰ −１を含 む、誘発されたまたは誘発されていない近位１１−６プロモーター断片における 潜在的な結合部位を有するいくつかの他の因子の結合は検出されることができな かった。この転写因子は、ＧＲ、ＲＡＲおよびＴＲを含む細胞内受容体による直 接的な抑制に関する典型例の１つである。ＡＰ−１抑制のメカニズムはタンパク 質−タンパク質相互作用および／または特定の遺伝子に依存するＤＮＡ結合に関 する競合に関与することができる（ダイアモンド（Ｄiamond，Ｍ．Ｉ.）、マイ ナー（Ｊ．Ｎ．Ｍiner）、ヨシナガ（Ｓ．Ｋ．Ｙoshinaga）およびヤマモト（Ｋ ．Ｒ．Ｙamamoto）（１９９０）『転写因子相互作用：単−ＤＮＡ要素からの正 または負の調節のセレクター』（“Ｔranscription factor inteactions:select ors of positive or negative regulation from a single ＤＮＡ element”） 、Ｓcience ２４９：１２６６−１２７２；シュール(Ｓchule，Ｒ.)、ウメソノ （Ｋ．Ｕmesono）、マンゲルスドルフ（Ｄ．Ｊ．Ｍangelsdorf）、ボラド（Ｊ． Ｂolado）、パイクおよびエバンズ（Ｒ．Ｍ．Ｅvans）（１９９０）『Ｊｕｎ− ＦｏｓおよびビタミンＡおよびＤの受容体はヒトオステオカルシン遺伝子におい て共通の応答要素を認識する』（“Ｊun-Ｆos and receptors for vitamins Ａ and Ｄ recognize a common response element in the human osteocalcin gene ”）、Ｃell ６１：４９７−５０４；ヤン−イェン、チャンバード（Ｊ．Ｃ． Ｃhambard）、サン（Ｙ．Ｌ．Ｓun）、スミール（Ｔ．Ｓmeal）、シュミット（ Ｔ．Ｊ．Ｓchmidt）、ドロウイン（Ｊ．Ｄrouin）およびカリン（Ｍ．Ｋarin） （１９９０）『ｃ−Ｊｕｎおよびグルココルチコイド受容体間の転写妨害』（“ Ｔranscriptional interference between c-Jun and the glucocorticoid recep tor：mutual inhibition of ＤＮＡ binding due to direct protein-protein i nteraction”）、Ｃell ６２：１２０５−１２１５；ヤン−イェン、ザン、グ ラウプナー、ツカ−マン、サカモト（Ｂ．Ｓakamoto）、カリンおよびプファー ル（１９９１）『レチノイン酸受容体およびＡＰ−１間のアンタゴニズム：腫瘍 促進および炎症への暗示』（“Ａntagonism between retinoic acid receptors and ＡＰ−１：implications for tumor promotion and inflammation”）、Ｎe w Ｂiol. ３：１２０６−１２１９；ザン、ウィルス、フスマン(Ｍ．Ｈusmann) およびプファー ル（１９９１）『ｊｕｎおよびｆｏｓがん遺伝子活性との相互作用を介しての甲 状腺ホルモン受容体作用に関する新規な経路』（“Ｎovel pathway for thyroid hormone receptor action through interaction with jun and fos oncogene ac tivities”）Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １１：６０１６−６０２５）。いくつかの 報告はまたＥＲおよびＡＰ−１間の混線様相互作用をも示唆しているが、しかし ながらＡＰ−１活性のエストロゲン依存性の抑制に関する証拠は全くない（ゴー ブ（Ｇaub，Ｍ．Ｐ.）、ベラード（Ｍ．Ｂellard）、シュエウアー（Ｉ．Ｓcheu er）、シャンボンおよびサッソン−コルシ（Ｐ．Ｓassone-Ｃorsi）（１９９０ ）『エストロゲン受容体によるオボアルブミンの活性化はｆｏｓ−ｊｕｎ複合体 に関与する』（“Ａctivation of the ovalbumin gene by the estrogen recept or involves the fos-jun comprex”）、Ｃell ６３：１２６７〜１２７６；ツ カーマン、ザンおよびプファール（１９９１）『腫瘍プロモーター１２−Ｏ−テ トラデカノイルホルボール １３−アセテートによるエストロゲン受容体活性の 抑制』（“Ｉnhibition of estrogen receptor activity by the tumor promote r 12-Ｏ-tetradeconylphorbol-13-acetate：ａmolecular analysis”）、Ｍol． Ｅndocrinol. ５：１９８３−１９９２）。従って、ΛＰ−１がエストロゲンに よるＩＬ−６発現の負の調節において役割を果たしているとはあまりありそうで ない。実施例３．ＩＬ−６プロモーターを有する明らかな複合体に別個に効果を及ぼす 薬剤のスクリーニング ＩＬ−６プロモーターを有する明らかな複合体 ＩＬ−１およびＴＮＦαでの＋／＋ＬＤＡ１１細胞の処理は、ＮＦκＢまたは 関連したタンパク質のＩＬ−６プロモーターへの結合を誘発した。エストラジオ ール前処置は該複合体の強度ならびに移動度を増加させたため、本発明者らは、 ＋／＋ＬＤＡ１１核抽出物の推定ＮＦκＢ部位（−８２〜−４７）をカバーする オリゴヌクレオチドへの結合を調査した。 ＋／＋ＬＤＡ１１細胞を指示どおりエストラジオール（１０ｎＭ）で前処置し た。２４時間後、該細胞をＴＮＦαおよびＩＬ−１（各１ｎＭ）で様々な期間誘 発した。誘発を細胞溶解によって停止し、ついで核抽出物を−８２〜−４７のＩ Ｌ−６プロモーター断片をプローブとして使用するＥＭＳＡによって分析した。 図２はＩＬ−１およびＴＮＦαで処理した細胞からの抽出物が、処理していない 細胞からの抽出物と比較した場合に３つの誘発複合体（Ａ、Ｂ、Ｃ）を現すこと を示している。 最も速く移動する複合体（Ｃ）は特に、誘発のうち（１０−１２０分）に強度 が低下した。興味深いことに、エストラジオール前処置は最もゆっくりと移動す る複合体（Ａ）の強度を低下させる一方、最も速いバンドの強度を非常に増強し た。これは複合体はエストラジオール処理によって一層速く移動するようである −２２５〜−５２の断片で得られるパターンに一致している（図３）。 両断片で類似する複合体が形成されたようである；しかしながら、短い方のオ リゴヌクレオチドのみだけが完全に分析された。指示どおりエストラジオール（ １０ｎＭ）およびＴＮＦαおよびＩＬ−１（各１ｎＭで４０分間）で前処置した ＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの核抽出物をヒトＩＬ−６プロモーターの−８２〜− ４７および−１７２〜−１３１の領域に対応する１００倍モル過剰なオリゴヌク レオチドまたはビテロゲニンＥＲオリゴヌクレオチドの不在下または存在下で− ８２〜−４７プローブでインキュベートした。形成した複合体をＥＭＳＡによっ て分析した。 すべての３つの複合体（Ａ、Ｂ、Ｃ）は標識されていないプローブの１００倍 の過剰量の含有により形成しなかったため（図２ｂ、レーン６および１０）特異 的である一方、同モルの過剰量のＮＦ−ＩＬ６オリゴヌクレオチド（−１７２〜 −１３１）またはビテロゲニンＥＲＥは無効であった（図２ｂ）レーン７、８、 １１および１２）。 図２ｃは該抽出物のＮＦ−ＩＬ６部位（−１７２〜−１３１）をカバーするオ リゴヌクレオチドへの結合を調査したとき、幾つかの複合体が検出されたことを 示す。指示どおりエストラジオール（１０ｎＭ）およびＴＮＦαおよびＩＬ−１ （各１ｎＭで４０分間）で前処置した＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの核抽出物を１ ００倍モル過剰な標識していないオリゴヌクレオチドの不在下または存在下で− １７２〜−１３１プローブでインキュベートした。形成した複合体をＥＭＳＡに よって分析した。図２ｃにおける矢印はＴＮＦαおよびＩＬ−１での誘発で形成 した複合体Ａ、ＢおよびＣを示す。 複合体のうちの２つは標識されていないオリゴヌクレオチドの過剰量と競合す ることができたため（レーン２，４および６）特異的であった。しかしながらす べての複合体はサイトカイン誘発またはエストラジオール処理と独立して構成的 に形成され、このことは該複合体がＩＬ−１、ＴＮＦαおよびエストロゲンによ るＩＬ−６発現の調節に関連しなかったことを示唆している。明らかな複合体の形成に影響を及ぼす化合物のスクリーニング 一層詳細な実験において本発明者らは複合体Ａ、ＢおよびＣの形成への他の化 合物の影響を分析した（図３）。＋／＋ＬＤＡ１１細胞をＴＮＦαおよびＩＬ− １で誘発する（各１ｎＭ、３０分間）前、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）または該 キナーゼインヒビターＨ７を５分間、またはエストラジオール（１０ｎＭ）およ び／またはＩＣＩ １６４，３８４（１００ｎＭ）を２４時間または６０分間で 調製した。処置を細胞溶解で停止しついで核抽出物を−８２〜−４７断片をプロ ーブとして使用してＥＭＳＡで分析した。矢印は複合体Ａ、ＢおよびＣを示す。 サイトカインを添加する前にタンパク質合成インヒビターシクロヘキシミドで の細胞の前処置は該複合体の形成を妨害しなかった（レーン８）。これは結合の 迅速な誘発として一致し、ＮＦκＢの活性化に関して以前に示されている（ヘン ケル、マクレイト、アルカレイ、クロンケ、ベン−ネリア−およびボーレール（ １９９３）『ＩκＢ−αの迅速なタンパク質分解は転写因子ＮＦ−κＢの活性化 に必要である』、Ｎature ３６５；１８２−１８５；セン（Ｓen，Ｒ.）および バルチモア（１９８６）『トランスロケーショナルメカニズムによるκ免疫グロ ブリンエンハンサー結合タンパク質ＮＦ−κＢの誘発可能性』（“Ｉnducibilit y of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein Nf-kappa Ｂ by a post translocational mechanism”）Ｃell４７：９２１−９２８）。シクロヘキシミ ド処理はＮＦκＢ結合を活性化させると報告されている（センおよびバルチモア （１９８６）『トランスロケーショナルメカニズムによるκ免疫グロブ リンエンハンサー結合タンパク質ＮＦ−κＢの誘発可能性』、Ｃell４７：９２ １−９２８；ザン、リン、およびビルセック（１９９０）『ヒト線維芽細胞にお ける腫瘍壊死因子およびインターロイキン−１によるインターロイキン−６誘発 はκＢ様配列に結合する核因子の活性化に関与する』、Ｍoll．Ｃell Ｂiol.１ ０：３８１８−３８２３）。しかしながら、＋／＋ＬＤＡ１１細胞においては本 発明者らはシクロヘキシミドによって全く誘発を観察しなかった（レーン７）。 さらに、Ｈ−７での前処置、潜在的なプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビ ター（カワモト（Ｋawamoto，Ｓ.）およびヒダカ（Ｈ．Ｈidaka）（１９８４） 『１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７）はウ サギ血小板におけるプロテインキナーゼＣの選択的なインヒビターである』（“ １−（５−Ｉsoquinolinesulfonyl）−２−methylpiperazine（Ｈ−７）is a se lective inhibitor of protein kinase Ｃ in rabbit platelets”）、Ｂiochem ．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun. １２５：２５８−２６４）は、ＩＬ−１およびＴ ＮＦαによる複合体の形成の誘発を妨害しなかった（レーン１０）。これは複合 体Ａ、ＢおよびＣの誘発はＰＫＣ独立の経路を介して伝達され、ＩＬ−１および ＴＮＦαはＮＦκＢを活性化し、ＰＫＣから独立してＩＬ−６を誘発することを 示唆している（１１、５５、９９）。 ホルボールエステルによるＮＦκＢの活性化はおそらくＰＫＣによって伝達さ れる（ボーエールおよびバルチモア（１９８８）『ＩκＢ：ＮＦ−κＢ転写因子 の特異的インヒビター』、Ｓcience ２４２：５４０−５４６）。しかしながら １２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール １３−アセテート（ＴＰＡ）での＋／ ＋ＬＤＡ１１細胞の処理はＩＬ−６の産生を有意に誘発せず、また−８２〜−４ ７の断片での複合体の形成も誘発しなかった。 エストラジオール効果、すなわち複合体Ａの減少および複合体Ｃの増加（図３ 、レーン２と３を比較せよ）は誘発前の短時間のエストラジオール前処置（６０ 分間）では観察されなかった（レーン６）。さらに、純粋な抗エストロゲンＩＣ Ｉ１６４，３８４（ウェイクリング（Ｗakeling，Ａ．Ｅ.）およびボウラー（Ｊ ．Ｂowler）（１９８８）『純粋な抗エストロゲン作用の生物学および様式』 （“Ｂiology and mode of action of pure antioestrogens”)、Ｊ．Ｓteroid Ｂiochem. ３０：１４１−１４７）は複合体のパターンに効果を及ぼさなかっ た（レーン４）。しかしながら、ＩＣＩ １６４,３８４がエストラジオールと組 み合わせて添加された場合、エストロゲンによって伝達される効果を阻害した。 ＩＣＩ １６４,３８４はＥＲに結合することを介したアンタゴニストとして作 用するため、これらの結果はさらに、エストラジオールの誘発された複合体への 効果が受容体を介するものであるという仮説を支持する。しかしながら、エスト ロゲン作用のメカニズムは、短期間のエストラジオール処置への応答の欠如荷よ り示されるように、おそらく間接的である。明らかな複合体における該タンパク質の結合特性に効果を及ぼす薬剤のスクリー ニング ＮＦκＢオリゴヌクレオチドを有する複合体Ａ、ＢおよびＣにおけるタンパク 質の結合特性を調査するため、メチル化妨害実験を行った（図４）。ＴＮＦαお よびＩＬ−１（各１ｎＭ）で誘発した細胞からの＋／＋ＬＤＡ１１核抽出物を上 鎖または下鎖上で標識し、限定したＤＭＳメチル化にかけた−８２〜−４７のプ ローブでインキュベートした。予備ＥＭＳＡの後、複合体Ａ、ＢおよびＣからの および関連していないプローブ（Ｆ）からのＤＮＡを単離し、ピペリジンで開裂 し、１２％の変性ゲル上で電気泳動した。ＮＦκＢ−致部位に対応する配列は枠 で囲って示され、暗号を用いたＡＰ−１部位は影を付してある。 ＮＦκＢ部位内（−７３〜−６３、枠囲み）のグアニン塩基の両鎖のＮ−７− メチル化は複合体形成を妨害し、一方一致部位をフランキングする（flanking） グアニンのメチル化は観察できる効果を有さなかった。全ての３つの複合体（Ａ 、Ｂ、Ｃ）の妨害パターンは同一であった。 ちょうどＮＦκＢ部位の外側（−７５、−６０、−５８）のグアニンのメチル 化が最大の複合体（Ａ）の形成でさえ効果を及ぼさなかったという観察は、全て の３つの複合体において、ＤＮＡ構築物は同様のコア領域内で生成されることを 示唆している。さらに、グアニン−６０、−５８および−５６のメチル化でのＤ ＮＡ結合妨害の欠如は、この領域（−６１〜−５５）における任意のサイトカ インが誘発した因子の一致していない（ＴＧＡＧＴＣＴ、陰影部位）ＡＰ−１部 位への結合に対して強く主張する（タナベ、アキラ、カミヤ（Ｔ．Ｋamiya）、 ウォン（Ｇ．Ｇ．Ｗong）、ヒラノおよびキシモト（１９８８）『マウスＩＬ− ６遺伝子のゲノム構造。マウスとヒト間における潜在的な調節配列の高度の保存 』（“Ｇenomic structure of the murine ＩＬ−６ gene．Ｈighdegree conser vation of potential regulatory sequences between mouse and human”）、Ｊ ．Ｉmmunol. １４１：３８７５−３８８１）。 本発明者らの研究はＮＦκＢ ｐ５０およびｐ６５または非常に密接に関連し たタンパク質に関するＩＬ−６のプロモーターを有する複合体の形成にエストロ ゲンが効果を及ぼすということを示している。ＩＬ−１およびＴＮＦαでの＋／ ＋ＬＤＡ１１細胞の処理は特にＩＬ−６プロモーターにおけるＮＦκＢ−致部位 を有する少なくとも３つの明らかな複合体の形成を誘発する。多様なサイズでは あるが、全ての３つの複合体において、該ＤＮＡ構築物はＮＦκＢ部位のコア配 列に限定されている。他のＮＦκＢ要素の対応コア配列はｐ５０およびｐ６５に よって保護されている（バルドウィンおよびシャープ（１９８８）『２つの転写 因子、ＮＦκＢおよびＨ２ＴＦ１はクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体におけ る単一の調節配列と相互作用する』（“Ｔwo transcription factors，ＮＦ−ka ppa Ｂ and Ｈ２ＴＦ１，interact with a single regulatory sequence in the class Ｉ major histocompatibility complex promoter”）、Ｐroc．Ｎatl． Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ８５：７２３−７２７；キエラン（Ｋieran，Ｍ.）、ブ ランク（Ｖ．Ｂlank）、ロジート（Ｆ．Ｌogeat）、バンデカルクホーブ（Ｊ． Ｖandekerckhove）、ロッツペイック（Ｆ．Ｌottspeich）、ル・ベイル（Ｏ．Ｌ e Bail）、アーバン（Ｍ．Ｂ．Ｕrban），コウリルスキ、ボーエールおよびイス ラエル（１９９０）『ＮＦκＢのＤＮＡ結合サブユニットはＫＢＦＩ因子と同一 であり、ｒｅｌガン遺伝子産物に類似（homologous）している』（“Ｔhe ＤＮ Ａ binding subunit of ＮＦ−kappa Ｂ is identical to factor ＫＢＦ１ and homologous to the rel oncogene product”）、Ｃell ６２：１００７−１０ １８；センおよびバルチモア（１９８６）『多数の核因子は免疫グロブリンエン ハンサー配列と相互 作用する』（“Ｍultiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences”）、Ｃell ４６：７０５−７１６）、その両者はＤＮＡ と直接相互作用することが示されている（ノラン、ゴーシュ、リオウ、テンプス トおよびバルチモア（１９９１）『ｒｅｌ関連ポリペプチドであるクローニング されたＮＦκＢのｐ６５サブユニットのＤＮＡ結合およびＩκＢ抑制』（“ＤＮ Ａ binding and Ｉ kappa Ｂ，a rel-related polypeptide”）、Ｃell ６４： ９６１−９６９；アーバン、シュレックおよびボーエール（１９９１）『ＮＦκ ＢはＤＮＡにｐ５０およびｐ６５サブユニットのヘテロダイマーにより接触する 』（“ＮＦ−kappa Ｂ contacts ＤＮＡ by a heterodimer of the p50 and p65 subunit”）、ＥＭＢＯ Ｊ. １０：１８１７−１８２５）。ｐ５０を有する Ｃ−ｒｅｌホモダイマーおよびヘテロダイマーはＩＬ−６はプロモーターにおけ るＮＦκＢ部位と結合すると示されている（ナカヤマ（Ｎakayama，Ｋ.）、シミ ズ、ミトモ、ワタナベ、オカモトおよびヤマモト（１９９２）『ｃ−Ｒｅｌ様タ ンパク質を有するリンパ球細胞特異的核因子は特にリンパ球細胞において活性が よく制されているＩＬ６κＢ関連モチーフと相互作用する』（“Ａ lymphoid ce ll-specific nuclear factor containing c-Rel-like proteins preferentially interacts with interleukin-6 kappa Ｂ-related motifs whose activities a re repressed in lymphoid cells”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １２：１７３６ −１７４６）。 さらに、本研究はリンパ球細胞においてｃ−ｒｅｌまたは免疫学的に関連した 因子はＩＬ−６プロモーターのＮＦκＢ部位に結合し構造的リプレッサーとして 機能する一層大きな複合体の要素であることを示す。＋／＋ＬＤＡ１１細胞にお いて、本発明者らはｃ−ｒｅｌ特異的結合活性を検出できなかった。他複数のＮ ＦκＢに関連しないタンパク質がＮＦκＢ−致部位において結合すると示されて いる。それらはａＡ−ＣＲＹＢＰ１（ナカムラ（Ｎakamura，Ｔ.)、ドノバン（ Ｄ．Ｍ．Ｄonovan）、ハマダ（Ｋ．Ｈamada）、サックス（Ｃ．Ｍ．Ｓax）、ノ ーマン（Ｂ．Ｎorman）、フラナガン（Ｊ．Ｒ．Ｆlanagan）、オザト（Ｋ．Ｏza to）、ウェストファル（Ｈ．Ｗestphal）およびピアチゴルスキ（Ｊ．Ｐiatigor sky）（１９９０）『マウスαＡ−クリスタリン遺伝子の調節：クラスＩ主要組 織適合性遺伝子複合体および他の遺伝子と共有するシス配列モチーフに結合する タンパク質をコードするｃＤＮＡの単離』（“Ｒegulation of the mouse alpha Ａ-crystallin gene:isolation of a cＤＮＡ encoding a protein that binds to a cis sequence motif shared with the major histocompatibility comple x class Ｉ gene and other genes”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：３７００ −３７０８）、ＭＢＰ−１／ＰＲＤＩＩ−ＢＦＩ（バルドウィン、ルクレアー（ Ｋ．Ｐ．ＬeＣlair）、シン（Ｈ．Ｓingh）およびシャープ（１９９０）『ジン クフィンガードメインを有する大タンパク質はクラスＩ主要組織適合性遺伝子複 合体およびκ免疫グロブリン遺伝子のエンハンサーにおける関連配列要素に結合 する』（“Ａ large protein containing zinc finger domains binds to rela ted sequence elements in the enhancers of the class Ｉ major histocompat ibility comprex and kappa immunoglobulin genes”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １０：１４０６−１４１４）；ファン（Ｆan，Ｃ．Ｍ．）およびマニアチス（ Ｔ．Ｍaniatis）（１９９０）『同じＤＮＡ配列を認識する２つの広範囲に分離 したジンクフィンフガーモチーフを有するＤＮＡ結合タンパク質』（“Ａ ＤＮ Ａ-binding protein containing two widely separared zinc finger motifs th at recognize the same ＤＮＡ sequence”）、Ｇenes Ｄev. ４:２９−４２） およびＡＧＩＥ−ＢＰ１（ロン（Ｒon，Ｄ.）、ブラシエル（Ａ．Ｒ．Ｂrasier ） およびハベナー（Ｊ．Ｆ．Ｈabener）（１９９１）『アンギオテンシノーゲン遺 伝子誘発エンハンサー結合タンパク質１、ジンクフィンガーモチーフを介する核 因子κＢ結合部位を認識する大核タンパク質の新規なファミリーの一員』（“Ａ ngiotensinogen gene-inducible enhancer-binding protein 1，a member of a new family of large nuclear proteins that recognize nuclear factor kappa B-binding sites through a zinc finger motif”）Ｍoll．Ｃell Ｂiol.１１ ：２８８７−２８９５）である。 Ｃ／ＥＢＲ様タンパク質はアンギオテンシン遺伝子の急性期応答要素のＮＦκ Ｂが介するトランスアクチベーションを低下させることが知られている（ブラシ エル、ロン、テート（Ｊ．Ｅ．Ｔate）およびハベナー（１９９０）『構造的Ｃ ／ＥＢＰ様ＤＮＡ結合タンパク質のファミリーは、ＩＬ−１αが誘発するＮＦκ Ｂが介するアンギオテンシノーゲン遺伝子の急性期応答要素のトランスアクチベ ーションを低下させる』（“Ａ family of constitutive C/EBP-like DNA bindi ng proteins attenuate the IL-1 alpha induced，NF kappa B mediated transa ctivation of the angiotensinogen gene acute-phase response element”）、ＥＭＢＯ Ｊ. ９：３９３３−３９４４）。最近では本発明者らは、それらのタ ンパク質または他のタンパク質は該観察された複合体の一部であること、または エストロゲンによるＩＬ−６の発現の抑制による関与することを排除できない。 最近の研究は子宮細胞において、エストラジオールがＮＦκＢ要素を有する複合 体の形成を誘発することを示唆した（シャマラ（Ｓhyamala，Ｇ.）およびギオッ ト（Ｍ．Ｃ．Ｇuiot）（１９９２）『エストラジオールによるκＢ特異的タンパ ク質の活性化』（“Ａctivation of kappa B-specific proteins by estradior ”）、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ８９：１０６２８−１０６３２） 。該誘発された複合体はｐ５０またはｐ６５を含まなかったゆえに、他の因子を 発現するかもしれない。実施例４．ｐ６５のＩＬ−６プロモーターへの結合に効果を及ぼす薬剤のスクリ ーニング ＮＦκＢ部位で形成された複合体の構成要素の分析 大きい方のプロモーター断片に関して、本発明者らはＮＦκＢオリゴヌクレオ チド（−８２〜−４７）で形成された複合体の性質を抗体シフト実験により分析 した（図５ａ）。指示どおりエストラジオール（１０ｎＭ）およびＴＮＦαおよ びＩＬ−１（各１ｎＭで１０分間）で前処置した＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの核 抽出物を多様な抗体の不在下または存在下で−８２〜−４７プローブでインキュ ベートした。形成した複合体をＥＭＳＡによって分析した。 本発明者らは抗ｐ５０または抗ｐ６５（レーン１７−２０）が結合反応に含ま れる場合に、誘発された複合体に強い影響が及ぶことを観察した。興味深いこと に、抗ｐ５０は複合体ＢおよびＣを特異的に形成せず（複合体Ａは影響を受けて いないようであるが）、単一の超シフトバンド（Ｓ１）を存在させた。しかしな がら、抗ｐ６５は全ての３つの誘発複合体の形成を抑制し、２本の超シフトバン ド（Ｓ１、Ｓ２）を産生した。これはｐ６５または免疫学的に密接な関連のある タンパク質は全ての３つの誘発複合体の一部であるが、ｐ５０または関連タンパ ク質は複合体ＢおよびＣに存在するのみであることを示唆した。 組換え体的に発現したｃ−ｒｅｌはＩＬ−６プロモーターにおけるＮＦκＢ部 位とｐ５０でヘテロダイマーとして、特に高アフィニティーでホモダイマーとし て結合すると報告されている（ナカヤマ、シミズ、ミトモ、ワタナベ、オカモト およびヤマモト（１９９２）『ｃ−Ｒｅｌ様タンパク質を有するリンパ球細胞特 異的核因子は特にリンパ球細胞において活性が抑制されているＩＬ６κＢ関連モ チーフと相互作用する』、Ｍｏll．Ｃell Ｂiol. １２：１７３６−１７４６） である。抗ｃ−ｒｅｌが＋／＋ＬＤＡ１１細胞からの抽出物とともに結合反応に 含まれた場合、該抗体は誘発複合体を全く抑制しなかった。長く接触させると弱 い超シフト複合体が検出できた。この複合体は抗ｐ５０で観察された超シフトと 同様の位置に移動し、これは一層大きなｃ−ｒｅｌタンパク質を含まなかったこ とを示唆している。抗ｃ−ｒｅｌ抗体を作製するために使用したペプチドはｐ５ ０類似配列に５６％のホモロジーを有したため（ゴーシュ、ギッフォード、リビ ール、テンプスト、ノランおよびバルチモア（１９９０）『ＮＦκＢのｐ５０ ＤＮＡ結合サブユニットのクローニング：ｒｅｌおよびｄｏｒｓａｌへのホモロ ジー』、Ｃell ６２：１０１９−１０２９；イノウエ、ケール、ランソン、ベ ンガル、ハンターおよびベルマ（１９９１）『ｃ−ｒｅｌはκＢ部位からの転写 を活性化させるがｖ−ｒｅｌは抑制する』、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳ Ａ ８８：３７１５−３７１９）、この弱いバンドはクロス応答性（cross-reac tivity）の結果でｃ−ｒｅｌには関係ないようである。一層大きなプロモーター 断片に関しては抗−ｃ−ｊｕｎは複合体形成に効果を及ぼさなかった（レーン１ ３および１４）。示された結果は１０分の誘発時点を示し、本質的により長いサ イトカインの処置と本質的に同一であることを示している。 試験した抗体で誘発されていない抽出物での複合体形成に顕著な影響を有した ものは全くなかった。抗ｐ５０だけが、誘発した抽出物で観察されたようにＳ１ 位置で移動している非常に弱い超シフトした複合体産生した（一層長い接触でや っと見ることができるのみ）。超シフトした場合にのみ検出できるこの弱い結合 活性は、細胞質ゾルの汚染によるかまたは培養条件下の基礎活性化を表すことが できた。 別のＥＭＳＡ実験に、本発明者らは、組換え体ｐ５０ならびにＥＲ発現酵母の 精製調製を含んだ（図５ｂ）。指示どおりエストラジオール（１０ｎＭ）および ＴＮＦαおよびＩＬ−１（各１ｎＭで３０分間）で前処置した＋／＋ＬＤＡ１１ 細胞からの核抽出物ならびに精製したヒトｐ５０タンパク質および組換え体的に 発現したヒトＥＲを含む酵母抽出物を多様な抗体の不在下または存在下で−８２ 〜−４７プローブでインキュベートした。形成した複合体をＥＭＳＡによって分 析した。矢印はサイトカイン処置により誘発した複合体Ａ、ＢおよびＣおよび抗 体超シフトによって得られた複合体Ｓ１およびＳ２を示す。 期待したとおり、ＥＲ発現酵母はＭＦκＢ−８２〜−４７断片に結合せず（レ ーン５、９、１３および１７）、抗ＥＲ抗体効果のすべての欠如によって指示さ れた誘発複合体の形成に関するＥＲ（レーン１４−１７）にも結合しなかった。 精製したｐ５０はこの断片に結合し、抗ｐ５０により超シフトされたが抗ｐ６５ によっては超シフトされなかった（レーン４、８および１２を比較せよ）。 驚くべきことに、精製組換え体ｐ５０で形成した複合体は複合体ＢおよびＣよ りゆっくりと移動した。低濃度の精製ｐ５０の使用は移動に効果を及ぼさず、こ のことはｐ５０ホモダイマーを表すバンドおよびそれ程高等でない複合体（ダケ ット、ペルキンズ、コワリック（Ｔ．Ｆ．Ｋowalik）、シュミット、ヒュアング （Ｅ．Ｓ．Ｈuang）、バルドウィンおよびナベル（１９９３）『ＲｅｌＡ（ｐ６ ５）を伴ったＮＦ−κＢのダイマー化はＩκＢα（ＭＡＤ−３）によるＤＮＡ結 合、転写の活性化および抑制を調節する』（“Dimerization of NF-KB2 with Re lA（p65）regulates DNA binding，transcriptional activation，and inhibiti on by an Ｉ kappa B-alpha(MAD-3)”）、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １３：１３１ ５−１３２２）を表すことを示唆している。しかしながら、抗体シフト実験はＮ ＦκＢタンパク質、ｐ５０およびｐ６５の両方は複合体ＢおよびＣの一部であり （レーン６、７、１１および１２）結果的に両方の複合体はｐ５０ホモダイマー よりゆっくりと移動すべきであることを示唆した（アーバン、シュレック（Ｒ． Ｓchreck）およびボーエール（１９９１）『ＮＦκＢはｐ５０およびｐ６５サブ ユニットのヘテロダイマーによるＤＮＡと接触する』（“NF-kappa B contacts DNA by a heterodimer of the p50 and p65 subunit”）、ＥＭＢＯ Ｊ. １０ ：１８１７−１８２５）。 複合体ＢおよびＣにおける該タンパク質はｐ５０およびｐ６５に実際小さなサ イズを除いては免疫学的にのみ関連を有する可能性がある。ｐ５０のホモログで あるｐ４９は複合体の一部であり、速い移動を担っているという推測は確認する ことはできなかった。精製したｐ４９は−８２〜−４７ ＩＬ−６断片に結合し 抗ｐ５０抗体で強くクロス反応（cross-reacted）したが、形成した複合体はｐ ５０複合体より相当ゆっくりと移動した。これは他のＮＦκＢ部位で得られた結 果に一致する（ダケット、ペルキンズ、コワリック、シュミット、フアング、バ ルドウィンおよびナベル（１９９３）『ＲｅｌＡ（ｐ６５）を伴ったＮＦ−κＢ のダイマー化はＩκＢα（ＭＡＤ−３）によるＤＮＡ結合、転写の活性化および 抑制を調節する』、Ｍoll．Ｃell Ｂiol. １３：１３１５−１３２２）。 しかしながら、抗ｐ５０抗体はｐ４９と強くクロス反応するという発見が、使 用した抗体が複合体内で他のＮＦκＢ関連タンパク質を検出するかもしれない。 別の方法では、複合体ＢおよびＣの移動は、転写後の修飾で得た構造上の相違に よる組換え体ｐ５０で観察された移動より高速でできた。これは抗ｐ５０を含有 し複合体ＢおよびＣを含まないことは組換え体ｐ５０で得られた超シフトした複 合体よりゆっくりと移動する超シフトした複合体（Ｓ１）を産生した（図５ｂ、 レーン６−８）。 バンドシフトの結果の厳密な調査は抗ｐ５０抗体も複合体Ａに効果を及ぼすこ とを示した。以前に考察したとおり、エストラジオール処置は複合体Ｃの強度を 増加し複合体Ａの強度を低下させる（レーン２および３）。本発明者らは抗ｐ５ ０の含有は非常に類似の効果を及ぼすことを一貫して観察した：該抗体はエスト ラジオールで処理していない細胞からの抽出物で形成した複合体Ａの強度を特異 的に低下させ、その結果エストラジオール処理をした、またはしていない細胞か らの抽出物を使用したバンドの強度と等しくした（図５ｂ、レーン２および７を 比較せよ）。これらの結果は、エストラジオールの不在下でのＩＬ−１およびＴ ＮＦαにより誘発したバンドＡは２つの別個の不溶性複合体、一方は（Ａ１）エ ストラジオールの存在下でも誘発されｐ５０を含まず、他方は（Ａ２）、ｐ５０ を含む（または免疫学的に関連タンパク質）ものからなることを示唆する。 エストラジオールでの処理は複合体Ａ２を犠牲にして複合体Ｃの強度を増加し てよい。複合体Ａ２が転写的により活性のある状態を表す場合、これはエストラ ジオールのＩＬ−６発現への抑制効果を説明するであろう。ＴＡＴＡ結合タンパ ク質（ＴＢＰまたはＴＦＩＩＤＴ）はＮＦκＢと直接相互作用することを示した （ケール、ランソン、ワムスリー（Ｐ．Ｗamsley）、シュミット、ボイヤー（Ｔ ．Ｇ．Ｂoyer）、ゾウ（Ｑ．Ｚhou）、バーク（Ａ．Ｊ．Ｂerk）およびベルマ（ １９９３）『ガン原タンパク質ＲｅｌおよびＴＡＴＡ結合タンパク質間の関連は ＮＦκＢによる転写の活性化を伝達する』（“Ａssociation between proto-onc oprotein Rel and TATA-binding protein mediates transcriptional activatio n by NF-kappa B”）、Ｎature ３６５：４１２−４１９）。それゆえ、本発明者 らはＴＢＰが誘発した複合体の形成に関与するかどうかに関心をよせた。しかし ながら、抗ＴＢＰ抗体を使用して本発明者らは複合体Ａ、ＢおよびＣにおいてＴ ＢＰの関与を検出することはできなかった。 本発明者らの抗体ゲルシフト実験はｐ６５が全ての３つの観察された複合体の 構成要素であることを示唆した。この特定のタンパク質はトランスアクチベーシ ョンドメインを有するＮＦκＢ要素である（シュミッツ（Ｓchmitz，Ｍ．Ｌ.） およびボーエール（１９９１）『ｐ６５サブユニットはＮＦκＢの強い転写活性 化能力を担う』（“Ｔhe p65 subunit is responsible for the strong transcr iption activating potential of NF-kappa B”）、ＥＭＢＯ Ｊ. １０：３８ ０５−３８１７）。異なる複合体において、トランスアクチベーション機能は別 個に活性であってよい。該抗体シフト実験はエストラジオールはＡ２複合体を減 少させるが複合体Ｃを増加させることを示唆している。ゆっくりと移動するＡ２ 複合体はトランスアクチベーション過程に関与する他の因子を含んでいてよい。 ＴＡＴＡ結合タンパク質ＴＢＰ（ＴＦＩＩＤ複合体の一部）はｃ−ｒｅｌおよび ｐ６５に強く相互作用するがｐ５０またはｐ４９には作用しないことが報告され てている（ケール、ランソン、ワムスリー、シュミット、ボイヤー、ゾウ、バー クおよびベルマ（１９９３）『ガン原タンパク質ＲｅｌおよびＴＡＴＡ結合タン パク質間の関連はＮＦκＢによる転写の活性化を伝達する』、Ｎature ３６５ ：４１２−４１９）。しかしながら、ＴＢＰ特異的抗体を使用して本発明者らは 、ＩＬ−６プロモーターにおけるＮＦκＢで形成した複合体のいずれかの一部で あるとしてのＴＢＰを検出できなかった。実施例５．推定サイトカインモジュレーターの効能試験 推定サイトカインモジュレーターの効能試験の方法を提供する。各候補薬剤は 、その効能を当業者に公知の方法を使用して、細胞株、動物モデルおよび制御さ れた臨床研究におけるサイトカインの発現の調節において試験され、連邦記録（ The Federal Register）４７（ｎo．５６）：１２５５８−１２５６４、１９８ ２年３月２３日に公表されたもの（これに限られるわけではない）ものなどは 食品および薬品局（the Food and Drug Administration）により認知されている 。実施例６．推定サイトカインモジュレーターの毒性試験 上記に列挙した方法のいずれかにおいて活性のある薬剤が健常な細胞に殆どま たは全く影響しないかどうかを決定するために方法を提供する。このような薬剤 はついで製薬学的に許容し得るバッファーまたは標準的な動物試験に有用なバッ ファーにおいて調合される。 「製薬学的に許容し得るバッファー」とは、保存および引き続きの投与のため に調製されたまたは希釈剤製薬学的組成物（製薬学的に許容し得る担体において 本明細書で記載される薬剤の製薬学的に有効量を含む）において使用することが できる任意のバッファーをいう。治療学的な使用のための許容し得る担体または 希釈剤は製薬技術においてよく知られており、例えば、レミングトンズ・ファー マシューティカル・サイエンスィズ （Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓciences ）、マック・パブリッシング・コ（Ｍack Ｐublishing Ｃo.）（ゲンナロ（Ａ． Ｒ．Ｇennaro）編、１９８５）に記載されている。防腐剤、安定剤、染料および 風味を付けるための薬剤でさえも製薬学的組成物に提供されてよい。例えば、安 息香酸ナトリム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルは代表物 として添加されてよい。上記、１４４９ページ。さらに、酸化防止剤および浮遊 薬剤は使用されてよい。上記。 Ａ．毒性のさらなるスクリーニング：方法１ サイトカインが調節する活性を有するものとして同定された薬剤を培養ヒト細 胞に対する毒性に関して評価する。この評価は２,３,−ビス［２−メトキシ−４ −ニトロ−５−スルホニルフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］ −２Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシド］を、さもなくばＸＴＴとしていわれるも のを還元する生存細胞の能力に基づく（パウル（Ｐaull）ら、Ｊ．Ｈeterocyl． Ｃhem. ２５：７６３−７６７（１９８７）；ワイスロウ（Ｗeislow）ら、（１ ９８９）、Ｊ．Ｎatl．Ｃanc．Ｉnst. ８１：５７７）。生存可能な哺乳動物の 細胞はＸＴＴのテトラゾル環におけるＮ−Ｎ結合を還元的に開裂してＸＴＴホル マザンを生成することができる。死亡細胞または害されたエネルギー代謝を有す る細胞はこの開裂反応ができない。開裂の程度は試験した生存細胞の数に直接比 例する。ＨｅＬａ細胞などのヒト細胞株からの細胞を、９６ウエルのマイクロタ イタープレートのウエルにおいて、ウエルあたり、細胞培養培地（１０％ウシ胎 児血清を補ったダルベッコ改変最少必須培地）０.１ｍｌ中１０3にて播種する。 細胞を３７℃で１気圧９５％の空気および５％のＣＯ2で培養することによりプ レートに接着させることができる。一晩の培養の後、試験物質の溶液を８半減ｌ ｏｇ希釈（eight half-decade log dillutions）を表す濃度でウエルに２重に添 加する。同時に、分解するために使用した溶剤を他のウエルに２重に添加する。 細胞の培養を典型的には２４時間しばらく続く。その期間の終わりに、ＸＴＴの 溶液および結合剤（coupler）（メチルフェナゾニウムサルフェート）を各試験 ウエルに添加し、インキュベーションをさらに４時間、自動プレートリーダーに おける４５０ｎｍで各ウエルの最適密度が決定されるまで続ける。哺乳動物細胞 を殺すまたはそのエネルギー代謝またはそのゆっくりとした成長を害する物質を 試験する物質を、それらを全く付与していないウエルに比較して、ウエル内での ４５０ｎｍの最適密度における減少によって検出する。 Ｂ．毒性のさらなるスクリーニング：方法２ サイトカインモジュレーターを細胞の生存のインジケーターとして35Ｓメチオ ニンのタンパク質に取り込みを使用して培養したヒト細胞に及ぼす毒性効果似関 して試験する。ＨｅＬａ細胞を１０％ウシ胎児血清および５０μg／ｍｌのペニ シリンおよびストレプロマイシンを補ったダルベッコ改変最少必須培地で増殖さ せる。細胞を最初は１０3細胞／ウエル、０.１ｍｌ／ウエルで播種する。サイト カインモジュレーターに接触させずに４８時間細胞を増殖させ、ついで除去し、 ついでサイトカインモジュレーターを全く与えられないコントロールウエルとと もに、完全培地で調製した多様な希釈度のサイトカインモジュレーターを各ウエ ルに添加する。細胞をさらに４８−７２時間インキュベートする。培地を２４時 間ごとに変え、同じ濃度のサイトカインモジュレーターを含む新鮮な培地と取り 替える。ついで培地を除去し、抗菌剤なしの完全培地と交換する。細胞を２４時 間サイトカインモジュレーターの不在下でインキュベートし、ついで生存性を35 Ｓメチオニンのタンパク質に取り込みによって推定する。培地を除去し、メチ オニンなしの完全培地と交換し、ついで３０分インキュベートする。培地を再度 除去し、ついでメチオニンなしだが０．１μＣi／ｍｌ 35Ｓメチオニンを含む 完全培地と交換する。細胞を３時間インキュベートする。ウエルをＰＢＳで３回 洗浄し、ついで細胞を１００％メタノールを１０分間添加することで透過させる 。氷で冷却した１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）をウエルー杯に添加する；プレ ートを氷上で１０分間インキュベートする。このＴＣＡ洗浄をさらに２回繰り返 す。ウエルを再びメタノールで洗浄し、ついで風乾する。５０μlのシンチレー ションカクテルを各ウエルに添加し、遠心によってウエル上で乾燥させる。プレ ートをＸ線フィルムを露光するのに使用する。抗菌剤なしのウエルを含むオート ラジオグラムのデンシトメータースキャンを５０％の細胞が生存できない（ＩＤ50 ）割の投与量を決定するのに使用する（動物細胞の培養（Ｃulture of Ａnima l Ｃells.）。基本的技術のマニュアル（Ａ manual of basic technique.）。（ １９８７）。イアン・フレシュニー（Ｒ．Ｉan Ｆreshney）。ジョン・ウィリー アンドサンズ、インク（Ｊohn Ｗiley ＆ Ｓons，Ｉnc.）、ニューヨーク）。実施例７．サイトカインモジュレーターの投与 本発明は上記方法によって見出された新規なサイトカインモジュレーター特徴 づける。本発明は、上記に記載されたように見い出されたサイトカインモジュレ ーターを含む製薬学的に許容し得る剤型に調合された新規な製薬学的な組成物を も含む。 さらに、本発明はサイトカインモジュレーターの治療学的に有効な量を投与す ることによるサイトカインのレベルによって影響される病理学的状態を負った被 験体を処置する方法を特徴づける。このような投与は当業者に公知のいずれかの 方法であってよく、例えば、局部投与または全身投与によってよい。 「治療学的に有効な量」とは、患者の疾患または状態の１つまたはそれより多 い兆候を（ある程度まで）和らげる量をいう。さらに「治療学的に有効な量」と は、部分的であれ完全であれ、関連する生理学的または生化学的パラメーターま たは真菌症または状態の原因を通常に戻す量をいう。一般に、その量は、そのＥ Ｃ50および患者の年齢、大きさおよび罹患した疾患に依存し、該分子の１ｎｍｏ ｌと１μｍｏｌの間である。 本発明の他の態様を以下の特許請求の範囲に開示する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                 Screening for cytokine modulators                               TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION   The present invention is useful for treating diseases and pathological conditions affected by cytokines. Screening method for drugs for use and use of such screening method A novel drug identified by                                 Background of the Invention   Cytokines are molecules that can signal cell growth. Group. Abnormal expression of cytokines causes autoimmune disease, septic shock, chronic Pathology including rheumatoid arthritis, psoriasis, inflammation, postmenopausal osteoporosis and some tumors It is known to be associated with a biological condition. General about these pathological conditions Treatments include retinoids, immunosuppressants, glucocorticoids and other steroids It is. Estrogens are particularly used for preventing postmenopausal osteoporosis.   Steroids and their related hormonal drugs are intracellular, regulators of gene transcription Therapeutic efficacy by binding to the superfamily of receptors (IRs) Give fruit. IRs are activators and liposomes of specific cytokine genes. It can function as a lesser. The activity of IRs is determined by hormones or other I It is regulated by ligands that bind to Rs.   The typical mechanism of transcriptional regulation by IRs is based on the promoter of the regulated gene. Binding of IRs to specific response elements within the Binding of estrogen receptor to response region in (Klein-Hitpass et al., Cell 46: 1053-1061, 1986). Yo More recently, glucocorticoid receptors that do not require direct DNA binding of IRs Different functions of IRs in body-mediated AP-1 transcriptional regulation have been described. (Yang-Yen et al., Cell 62: 1205-1215). , 1990).   Steroids have been shown to suppress the levels of certain cytokines, Lack of tissue specificity and side effects of steroids limit their use as therapeutic agents Maybe. These side effects are reduced by more specific compounds Or may be completely avoided.   Pfahl and Karin (PCT publication, WO 92/07) 072, 1992) are non-rel-like proteins AP-1 or AP-1 components. Riga that binds to nuclear receptors that form complexes that bind or interact with them It describes a method for screening samples for antibodies.                                 Summary of the Invention   The present invention is directed to the identification of novel therapeutic agents and diseases and And conditions (including, but not limited to, osteoporosis, rheumatoid arthritis, inflammation, Which treat psoriasis, septic shock, Kaposi's sarcoma and multiple myeloma) The use of these drugs. This method is supported through an intracellular receptor-mediated pathway. Natural, semi-synthetic or synthetic compounds for therapeutic agents that affect the transcription of Itokine Large collections can be screened.   "Cytokine" is generally a chemical mediator of cell regulation Means a secreted protein that functions as More specifically, cell proliferation and differentiation Of soluble polypeptides, such as growth factors and hormones that regulate cell and function (Including, but not limited to, GM-CSF, G-CSF, IL-2, IL-6, IL-8 and IL-11).   The present invention relates to an interleukin with an estrogen-estrogen receptor complex. Suppression of IL-6 (IL-6) expression is associated with NFκB or closely related protein I Regulation of transcriptional activity on the L-6 promoter I do. This mechanism involves the direct binding of the ER to the IL-6 promoter. No, but possible of the activated NFκB and rel family proteins Specific response elements on other members of the IL-6 promoter (ie rel sites) Regulates DNA binding properties for   NFκB contains various cytokines and their receptors, viral proteins and As it relates to the regulation of the gene encoding the protein for the acute phase response, Regulation of NFκB activity by logens and possibly other hormones is generally important. Yes (Baeuerle, Biochemica et Biophysica Acta, 107) 2: 63-80, 1993, generally incorporated herein by reference.) . For example, strong expression of IL-6 in + / + LDA11 cells and other tissues Suppress retinoic acid treatment (Gross, V.), Villiger (PM Vill) iger), B. Zhang and M. Lotz, 1993, "Retino. Inic acid suppresses interleukin-1-induced cytokine synthesis in human monocytes ("Retinoic acid inhibits interleukin-1-induced cytokine synthesis  in human monocytes ”),J. Leukoc. Biol. 54: 125-132) is I Estrogen-like effect on NFκB-related complex with L-6 promoter Having. This is a mixture between intracellular receptor family members and the NFκB transcription factor. Suggests a general pathway of transcriptional regulation for cross-talk.   By the above determination, the rel transcription factor can be used without the side effects of known steroids. Regulated genes (ie inflammation, sepsis, skin and kidney disorders, osteoporosis) Specifically affects certain tumors and genes involved in hematopoietic dysfunction) Can screen drugs. The diseases listed are usually NFκB or other IL-1, TNFα, IL-6 and IL-8, etc. under the control of 1 protein Correlates with abnormal expression of cytokines.   Thus, the present invention provides cytokine genetics by activating intracellular receptors. Rel-like to the rel site on the offspring promoter or part of the promoter Causing a significant decrease in the binding of proteins or other transcribed proteins, It features a method of identifying an agent that reduces transcription of the cytokine.   "Intracellular receptors" are cells whose activity is regulated by the binding of small molecules. Means internal transcription factor (including but not limited to estrogen receptor, Retinoic acid receptor, retinoid X receptor, glucocorticoid receptor, proge Sterone receptor, androgen receptor, thyroid hormone receptor and vitamin D Receptors).   “Rel-like proteins” share homology in the rel domain and Proteins involved in gene regulation or protein complexes of the rel family (hereinafter Without limitation, NFκB, Lyt-10, c-rel and re IB) (including Liou and Baltimore), See Current Opinion in Cell Biology, 5: 477-487, 1993. (Cited herein for reference)).   "Transcriptional protein" refers to the promoter either directly upon activation, or Indirect binding via a complex of proteins that regulates the transcriptional activity of the promoter Cytoplasmic or nuclear proteins.   A “rel site” is a rel-like protein or one or more re1 DNA sequence that functions as a binding site for a complex containing Although not exclusive, as in the NFκB binding site on IL-6, Bauer, Bio chemica et Biophysica Acta, 1072: 63-80, 1993 (for reference) (Including the kappa B motif identified herein)).   A "promoter" is one that directly or indirectly binds to RNA polymerase in a cell. DNA capable of initiating transcription of the downstream (3 'direction) coding sequence Mean regulatory region. DNA construct promoter (the oligonucleotides described herein) The presence of the promoter is a heterologous gene (luciferase). , Chloramphenicol acetyltransferase, β-galactosidase and And genes related to reporter sequences such as secreted placental alkaline phosphatase ) May be linked to a heterologous gene.   In a preferred embodiment, the assay comprises a screened agent, a promoter Or a portion of the promoter having a rel site and a rel-like protein or Regulates the intracellular receptor that is the target of other transcriptional proteins that bind at the rel site Performed in a whole-cell system, wherein the intracellular receptor is a rel-like Regulates the binding of proteins or transcribed proteins to the rel site. The intracellular receptor Tannin which binds to the promoter or part of the promoter or rel site The protein may be endogenous to or transfected into the cell. No.   In another preferred embodiment, the assay comprises a rel site and a rel-like protein. Intracellular receptor promoter having a protein or other protein that binds to the rel site Or an extract of cells having a portion of the promoter or promoter; Intracellular receptor binds rel-like or transcribed protein to rel site Adjust   Binding of rel-like or other transcribed proteins to the rel site is described below. Although not limited, mobility shift assay, Co-transfection assay and the promoter Measured by techniques known to those skilled in the art, including expression of reporter genes that bind to May be.   In a further preferred embodiment, the promoter is an effector (limited to But not tumor necrosis factor, interleukin-1, virus, endotoxin, Phorbol ester, epidermal growth factor, leukemia inhibitory factor and cAMP agonist ).   An “effector” stimulates cytokine expression to a measurable level. Means a drug. Some effectors are endogenously produced or expressed in certain cells. It may be added exogenously to the vesicle.   In yet another preferred embodiment, the claimed assay is an estrogen receiving assay. Condition, interleukin-6 promoter or interleukin-6 promoter Of NFκB and where ER is NFκB Or the binding of related proteins to the NFκB site on the IL-6 promoter I do.   Drugs recognized by the above assay interact directly with intracellular receptors Or may modulate the interaction of the ligand with an intracellular receptor. Therefore, further In a preferred embodiment, a ligand for an intracellular receptor is included in the assay. .   Steroids and steroid analogs are illustrative of the agents identified by the present invention. Applicants may prescribe therapeutic agents that are particularly useful, especially of low molecular weight. Drug (less than 10,000 daltons, preferably 5,000 daltons) Less than 1,000 daltons, most preferably less than 1,000 daltons) I have.   Such drugs may then be treated with cytokines, if the drug is in a therapeutic or prophylactic manner. Pathological with little or no effect on healthy tissue that can be used in Screens to ensure that they are specific to the tissue being conditioned. May be used. If such drugs have any effect on healthy tissue, The drug may be used in therapeutic treatments, especially for life-threatening Kaposi's sarcoma or multiple myeloma. In any disease, it may still be useful.   Once isolated, the candidate drug is placed in a pharmaceutically acceptable dosage form and Use in the specific treatment of diseases or pathological conditions that have little or no effect on Can be.   Other features and advantages of the invention will be set forth in the following detailed description and claims. It is clear from the range.                              BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows IL-1 and TNFα-induced proximal IL-6 promoter. 2 shows the formation of a complex on the probe.   FIG. 2 shows several distinct NFκ induced by IL-1 and TNFα. 4 shows that the B-related complex is regulated by estrogen.   FIG. 3 shows estrogen agonists and antagonists and protein synthesis. And inhibitors of protein kinase C affect the formation of NFκB-related complexes Show the effect.   FIG. 4 shows that the NFκB-related complex with the NFκB oligonucleotide Shows the characteristics of protein binding.   FIG. 5 shows NFκB-related complexes in complexes A, B and C.                              Detailed description of the invention   Numerous cytokines, including IL-6, IL-8 and IL-11, are relevant biology Response to infection by stimulating immune and acute phase responses. Influence on bone metabolism by increasing cell defense and bone resorption in the answer Have. Aberrant expression of any of these cytokines will result in similar pathology Status (eg, all cytokines listed are associated with septic shock) and Become. In other instances, overproduction of IL-8 as well as IL-6 is associated with some types. Inflammatory response, especially neutrophil-dependent tissue damage s) may be involved in pathogenesis. These cytokines have similar promoters Protein structures (eg, their promoters are NFκB or other rel proteins). (Including binding sites for proteins). Therefore, not only IL-6 but also other Itokine binds NFκB or other rel proteins to their promoter site. It can be targeted by agents that modulate binding via intracellular receptors.                       Interleukin 6 and diseases   Interleukin 6 (IL-6) is found in many different cells (monocytes, macrophages). Di, some B and T lymphocytes, glial cells, fibroblasts, osteoblasts Pleiotropic cytokines (pleiotops) secreted by vesicles and stromal cells ic cytokine) (Hirano, T. (1992), "The biology of interleukin-6 ”,Chem. Immunol. 51: 153-180. ; Kishimoto ( Kishimoto, T.) (1989) "The biology of interleukin-6",Blood7 4: 1-10. Kishimoto, M. Hibi, M. Murakami, M. Narazaki, M. Saito and T. Taga (1992) "The molecular biology of interleukin6 and its receptor" ,Ciba Found. Symp. 167: 5-16; Discussion 16-23; and Wolbe Wolvekamp, M.C. and RL Marquet (199) 0) Interleukin-6: Historical Background, Genetics and Biological Significance ("I nterleukin-6: historical background, genetics and biological significanc e ”),Immunol. Lett. 24: 1-9). Organizational damage Because of its induction in response to wounds, inflammation and infection, the function of IL-6 is primarily As involved in host immunity and the acute phase response.   IL-6 is intracellularly transmitted not only under pathological conditions but also under normal physiological conditions Is an important mediator. IL-6 is involved in neural differentiation (Sato (S atoh, T.), Nakamura, Saga, T. Matsuda, Hirano, Kishimoto and Kaziro (1988) B-cell stimulating factor 2 / Induction of neural differentiation in PC12 cells by interlokin 6 "(“ Ind uction of neuronal differentiation in PC12 cells by B-cell stimulat ory factor 2 / interleukin 6 ”),Moll. Cell Biol.  8: 3546-35 49) and proliferation and differentiation during hematopoiesis (Ikebuchi, K.), won ( G. FIG. G. FIG. Wong), Clark (SC), Eir (JN Ihle), Hirai and M. Ogawa (1987)),Moll. Ce ll Biol.   8: 3546-3549) and differentiation during proliferation and hematopoiesis (Ikeb Ji, Won, Clark, Eel, Hirai and Ogawa (1987) "Pluripotency before hematopoiesis. Enhancement of Interleukin 6 in Interleukin-3 Dependent Proliferation of the Progenitor "(“ Interleuki n 6 enhancement of interleukin 3-dependent proliferaion of multipotentio al hemopoietic progenitors ”),Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.  84: 9035-9039). However, elevated IL-6 expression usually results in disease. Disease-related (Yu, XP), T. Bellido, Rice (N. . Rice) and SC Manolagas (1993)).   Interleukin-6 expression b is tightly regulated by other factors . Depending on the specific cell type, the expression of the IL-6 can be different stimuli (tumor necrosis factor). (TNFα) and interleukin-1, virus, endotoxin (lipopolysaccharide), Rubol ester, epidermal growth factor (EGF), leukemia inhibitory factor (LIF) and (including cAMP agonists).   These effectors are as demonstrated by transfection studies. Show their activity through exerting a transcriptional effect on the IL-6 promoter. (Gruss, HJ), MA Brach and Hermann ( F. Herrmann) (1992), Interleukin-6 by Leukemia Inhibitor. Involvement of nuclear factor-κB in induction of genes ”(“ Involvement of nuclear factor -kappa B in induction of the interleukin-6 gene by leukemia inhibitoryf actor ”),Blood  80: 2563- 2570; Ray, A., Tutter (SB Tatter), LT (May) and Sagar (P.B. Sehgal) (1988) "Cytokines, viruses and second messengers." -Human [β2-interferon / hepatocyte stimulating factor / inter Activation of the Leukin 6 ”promoter” (“Activation of the human“ beta 2-i nterferon / hepatocyte-stimulating factor / interleukin 6 ”promoter by cyt okines, viruses, and second messenger agonists "),Proc. Natl. Acad . Sci. U. S. A.  85: 6701-6705). By sequence comparison, some Is a potential transcriptional regulatory element of the IL-6 promoter (cAMP response element, AP-1). Binding site and transcription factor NF-IL6 (C / EBPB, LAP, AGP / EBP ) And NFκB (including the binding element). hiki, H.), Akira (S. Akira), Tanabe (O. Tanabe), Nakajima (T. Nakajima), T. Shimamoto, Hirano and Kishimoto (1990) ) "Constitutive and introns that interact with the IL-1 response element in the IL-6 gene. Tarleukin-1 (IL-1) -inducing factor "(" Constitutive and interleuki n-1 (IL-1) -inducible factors interact with the IL-1-responsive el ement in the IL-6 gene ”),Moll. Cell Biol.  10: 2775-27 64).   Direct binding of NF-IL6 and NFκB to the IL-6 promoter was confirmed. Standing (Akira, Issiki, Sugita (T. Sugita), Tanabe, Kinoshita (S. Kinoshita), Y. Nishio, Nakajima, Hirano and Kisimo (1990), "Nuclear factor for IL-6 expression (NF-IL6) is a C / EBP protein. "A nuclear factor for IL-6 expression (NF -IL6) is a member of a C / EBP family "),EMBO J. 9:18 97-1906; Libermann, TA, and Baltimore, ( 1990) "Activation of interleukin-6 gene expression through NF-κB transcription factor "Activation of interleukin-6 gene expression through the NF −kappa B transcription factor ”),Moll. Cell Biol.  10: 232 7-2334). NF-IL6 is a leucine zipper protein C / EBP file. Belongs to Millie. NF-IL6 is IL-1, IL-6 and lipopolysaccharide (LPS) And interacts with the binding site on the IL-6 promoter, Departure It has been shown to activate the present (Akira, Issiki, Sugita, Tanabe, Kinoshita Nishio, Nakajima, Hirano and Kishimoto, (1990), Nuclear factor (NF-IL6) is a member of the C / EBP family ”(“ A n uclear factor for IL-6 expression (NF-IL6) is a member of a C / EBP family "),EMBO J. 9: 1897-1906; Chang , C.I. J.), Chen (TT Chen), Ray (HY Lei), Chen (D. S. Chen and Lee (1990), C / EBP Family. Molecular Cloning of AGP / EBP, a Transcription Factor That Is a Member of molecular cloning of a transcription factor, AGP / EBP, that belongs  to members of the C / EBP family ”),Moll. Cell Biol.  10: 6 642-6653); Descombes, P., Choikiere (M. Chojkier), S. Lichtsteiner, E. Falvey ) And Sheepler (1990) "C / EBP gene family. LAP, a new member of Lee, is a liver-rich transcriptional activator protein ("LAP , A novel member of the C / EBP gene family, encodes a liver-enriched  transcriptional activator protein ”),Genes Dev. 4: 1541-15 51; descome, choikierre, Richtsteiner, farbay and sheep Ra (1990), LAP, a new member of the C / EBP gene family, Stomach-Abundant Transcription Activating Protein "(" LAP, a novel member of the C / EB Pgene family, encodes a liver-enriched transcriptional activator protei n "),Genes Dev. 4: 1544-1551; Poli, V., Mancini (FP Mancini) and R. Cortese (1990) Inter. -The nuclear protein IL-6DBP involved in leukin-6 signaling is C / EB Defining a Novel Family of Leucine Zipper Proteins Related to P The nuclear protein IL-6DBP involved in terleukin-6 signaling is C / E Defines a New Family of Leucine Zipper Proteins Related to BP "( “IL-6DBP, a nuclear protein involved in interleukin-6 signal tra nsduction 、 defines a new family of leucine zipper proteins related to C / EBP IL-6DBP, a nuclear protein involved in interleukin-6 s ignal transduction, defines a new family of leucine zipper proteins rela ted to C / EBP "), Cell 63: 643-653). 50 kd protein (p50) that binds to elements within the blink kappa light chain enhancer Originally as a heterodimer complex consisting of and 65 kd protein (p65) It is an identified transcription factor. Both proteins are found in Drosophila morphogen Some dorsal and c-rel proto-oncogeny product ) Shows high homology. The p65 subunit is functionally also c-rel (Bohrer (1991) “Transcription-induced activator NF-κB : Regulation by prominent protein subunits ”(“ The inducible transcripti on activator NF-kappa B: regulation by distinct protein subunits ”)Biochim. Biophys. Acta   1072: 63-80; Blank, V. Kourilsky and A. Israel (19) 92) "NF-κB and related proteins: Rel / dorsal homology (“NF-kappa B and related proteins: Rel / dor salhomologies meet ankyrin-like repeats ”),Trends. Biochem. Sci.   17: 135-140; and Liou and Baltimore (1993) NF-κ. Regulation of the B / rel transcription factor and the IκB repression system ”(“ Regulation of the N F-kappa B / rel transcription factor and I kappa B inhibitor sysytem ” ),Curr. Opin. Cell. Biol.  5: 477-487). Recently more features Proteins related to p50 and p65 (p49 / p52 and relB / P68) have been identified (Henkel, T.), McLate (TM) achleidt), I. Alkalay, M. Kronke, Ben- Neriah (Y. Ben-Neriah) and Bohrer (1993), “IκB-α Rapid proteolysis is required for activation of the transcription factor NF-κB ”(“ Rapid p roteolysis of I kappa B-alpha is necessary for activation of transcript ion factor NF-kappa B "),Nature  365: 182-185; Perkin (Perkins, ND), Schmidt (RM Schmid), CS (Duckett), Long (K. Leung), Rice (NR Rice) and And GJ Nabel (1992) “Prominent NF-κB subunits. Combinations determine the specificity of transcriptional activation ”(“ Distinct combinations of NF-kappa B subunits determine the specificity of transcriptional acti vation ”),Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 1529-15 33); Ryseck (RP), Bull (P. Bull), Takamiya (M. Ta) kamiya), Birds (V. Bours), U. Siebenlist, Dob P. Dobrzanski and R. Bravo (1992) "Re IB, a novel Rel family that can interact with p50-NF-κB Transcription activator ”(“ RelB, a new Rel family transcription activato r that can interact with p50-NF-kappa B ”),Moll. Cell. Biol.12: 675-684); Lisek, Bull, Takamiya, Birds, Severen List, Dob Luzanski and Bravo (1992) “RelB interacts with p50-NF-κB. Novel Rel Family Transcriptional Activator That Can Be Performed ”(“ RelB, a new Rel family transcription activator that can interact with p50-NF-ka ppa B "),Moll. Cell Biol.  12: 674-684); Schmidt, Pa Luckins, Duquette, PC Andrews and Navel (19 91) "NF-κB subunits that stimulate HIV transcription in synergy with p65. Cloning of an NF-kappa B subunit which stimula tes HIV transcription in synergy with p65 ”,Nature  352: 733 -736). NFκB is a cytosol containing an IκB family inhibitory protein Located in the complex. Upon induction, NFκB dissociates from IκB and produces a specific promoter. Translocates to the nucleus which binds and activates the protein (Boale and Balch) More (1988) "IκB: a specific inhibitor of the NF-κB transcription factor" ("I  kappa B: a specific inhibitor of the NF-kappa B transcription facto r "),Science  242: 540-546; Ghosh, S .; Luchimore (1990) "NF-κB inhibitor NF by phosphorylation of IκB -Activation of κB in vitro ”(“ Activation in vitro of NF- kappa B by phosphorylation of its inhibitor I kappa B ")Nature  34 4: 678-682). NFκB-like factor for the matching site of IL-6 promoter The binding of offspring varies with the specific cell type, but IL-1, TNFα, LIF , LPS and phorbol esters (glass, black and Herman (1992) "Induction of interleukin-6 gene by leukemia inhibitory factor. Involvement of nuclear factor-κB in development ”,Blood  80: 2563-2570; Ribe Le Mans and Baltimore, (1990) "Interaction through NF-κB transcription factor. Activation of Leukin-6 gene expression ”,Moll. Cell Biol.  10: 2327- 2334; Shimizu, H., K. Mitomo, Watanabe (T. Watanabe), Okamoto (S. Okamoto) and Yamamoto (K. Yamamoto) "Flame NFKB-like transcription upon activation of interleukin-6 by symptomatic lymphokines "Involvement of a NF-kappa B-like transcription facto r in the activation of the interleukin-6 gene by inflammatory lymphokine s ”),Moll. Cell Biol.  10: 561-568; Zhang, YH. J. Lin and J. Vilcek (1990) "H. Of tumor necrosis factor and interleukin-1 in fibroblasts Leukin-6 induction is involved in the activation of nuclear factors that bind to κB-like sequences ”(“ Int erlerukin-6 induction by tumor necrosis factor and interleukin-1in human  fibroblasts involves activation of a nuclear factor binding to a kappa B-like sequence ”),Moll. Cell Biol.  10: 3818-3823).   Unregulated expression of IL-6 has been implicated in several diseases (Bawell (B auer, J.) and Hermann (1991) Interleukins in clinical medicine. -6] (“Interleukin-6 in clinical medicine”),Ann. Hematol.  62 : 203-210; Hirano (1992) Interleukin-6 and inflammation and disease. "Interleukin-6 and its relation to inflammation and dise ase ”),Clin. Immunol. Immunopathol.  62: S60-65), and examples thereof And postmenopausal osteoporosis after loss of ovarian function (Roodman, G. FIG. D.) (1992) "Interleukin-6: Osteotropic fac. tor)? ”(“ Interleukin-6: an osteotropic factor? ”)J. Bone Mine r. Res.   7: 475-478). X of bone marrow from ovariectomized mice ・ Cultivation in vivo is from sham-operated animals It shows increased production of osteoclasts compared to culture. This in osteoclast proliferation The increase can be prevented by injection of anti-IL-6 antibody or administration of estrogen. Kiruru (Jilka, RL), Hangok (G. Hangoc), Girasol ( G. FIG. Girasole), Parsley (G. Passeri), Williams (DC Williams) ), Abrams (JS Abrams), B. Boyce, Broxmiel (H. Broxmeyer) and Manoragas (1992) "Break after estrogen loss. Enhancing Bone Cell Proliferation: Mediation by Interlokin-6 ”(“ Incleased osteocl ast development after estrogen loss: mediation by interleukin-6 ”),Sc ience   257: 88-91). Mice with a silenced mutation for IL-6 Ovariectomy can be used to reduce bone volume or osteoclast numbers, as seen in normal mice. Have no effect (Balena, R., F. Costantini ), M. Yamamoto, A. Markatos, Cortese, Rodan (GA) and Poly (1993) "Knock IL-6 gene. Mouth mice do not lose porous bone after ovariectomy. " (“Mice wit IL-6 gene knock-out do not lose cancellous bone afte r ovariectomy ”),J. Bone Miner. Res.  8: S130 [Summary]).Regulation of interleukin 6 by estrogen   Estrogen is similar to rat and mouse bone-derived stromal cell lines and osteoblasts Is found to suppress the expression of IL-6 in human bone cells that have not been transformed (Girasol, Zirca, Parsley, Boswell (S. Boswell), border ( G. FIG. Boder), Williams and Manoragas (1992) Estradiol -17β is intercalated in vitro by bone marrow-derived stromal cells and osteoblasts. Inhibits leukin-6 production: possible anti-osteoporotic effects of estrogen Mechanism ("17 beta-estradiol inhibits interleukin-6 production by bone marrow-derived stromal cells and osteoblasts in vitro: a potenti almechanism for the antiosteoporotic effect of estrogens ”)J. Clin. Invest.  89: 883-891). Effect of estrogen on IL-6 expression Effects are not limited to bone tissue, but are also shown for uterine cells (Jacobs, AL), Segal, J. Julian and Carson (DD Carson (1992) "Mouse uterus cultured in vitro." Interleukin-6 Secretion and Hormone by Stromal Cells and Divided Epithelial Cells Mon regulation ”(“ Secretion and hormonal regulation of interleukin-6 produc tion by mouse uterine stromal and polarized epithelial cells cultured in  vitro ”),Endocrinology  131: 1037-1046; Tabibusaday (T abibzadeh, S.A. S.), U. Santanam, Sagar and May ( 1989) "Induction of cytokines by freshly transplanted human endometrial stromal cells. Production of IFN-β2 / IL-6. Regulation by estradiol-17β ”(“ Cytokine-induced production of IFN-beta 2 / IL-6 by freshly explante d human endometrial stromal cells. Modulation by estradiol-17 beta ”) ,J. Immunol. 142: 3134-3139). By estrogen agonist There are many other genes known to be naturally regulated (Adler , S.), ML Waterman, X. He and Lo. MG Rosenfeld (1988) "Rat prolactin gene Receptor-mediated Inhibition of Expression Is Not Required for Receptor DNA Binding Sites 』 (“Steroid receptor-mediated inhibition of rat prolactin gene expressi on does not require the receptor DNA-binding domain ”),Cell  52 : 685-695; Lee, AH, Landmark (BF Landmar). k), W. Eskild, FO Levy, Lahuti (H) . Lahooti), T. Jahnsen, A. Aakvaag And V. Hansson (1989), Est in MCF-7 Cells. Decreased autoregulation of mRNA and protein levels for the logen receptor (au tologousdown-regulation: inverse correlation with progesterone receptor levels ”(“ Autologousdown-regulation of messenger ribonucleic acid and protein lev els for estrogen receptors in MCF-7 cells: an inverse correlation to progesterone receptor Ievels ”),Endocrinology  124: 2577-25 83).   To investigate the mechanism of estrogen effects, Applicants used human IL-6 pro- A series of DNA binding experiments were performed using a motor. Co-transfection ( Co-transfection studies were performed on the proximal 225b of the IL-6 promoter. ps induces reporter gene by IL-1 and TNFα and estra It is shown to mediate both inhibition by diols. By estradiol Repression also required expression of the estrogen receptor (ER).   Proximal 225 of the ER using a gel retardation assay No specific binding to bp was detected. However, IL-1, TNFα + / + LDA11 revealed regulation of IL-6 by and estradiol Nuclear extracts from bone marrow stromal cells were obtained when the cells were treated with IL-1, TNFα The induced complex with the -225 to -52 promoter fragment is shown. The compound Induction of coalescence was rapid (10 minutes) but transient. The fineness by estradiol Pretreatment of vesicles increases the intensity and mobility of the complex I let it.   To identify proteins involved in the formation of the complex, an antibody hypershift (antibody  supershift) experiments with c-jun, NF-IL6, c-rel and NFκB p Bindable in this promoter fragment, including the 50 and p65 proteins This was performed using an antibody against the factor having the site. Anti-p50 and anti-p65 Only had an effect and did not form a triggering complex.   Oligonucleotides covering a potential NFκB site of the IL-6 promoter Tide competes for induced binding to this fragment, while NF-IL6 site The covering oligonucleotide was ineffective. The NFκB oligonucleotide When IL is used as a probe, three IL-1 / TNFα-induced complexes are observed Was done.   Pretreatment with estradiol reduces the strength of the slowest migrating complex And strongly increased the strength of the fastest moving complex. The three bands are anti-p50 And were separately hypertranslocated by the anti-p65 antibody (i.e., (A further reduction in this was due to the binding of the antibody), while an anti-ER antibody was tested. None of the other antibodies were effective. Methylation interference The assay (methylation interference assay) is identical for all three complexes DNA contact sites are shown.   Although not admitted prior art, Ray et al.J. Biol. Chem., 2 69 (17): 12940-946 (1994) describes NF-IL6 and NFκB. The IL-6 promoter derived by the combination of the p65 subunits of Activation is suppressed by wt ER but suddenly in its DNA binding domain It states that it cannot be suppressed by the ER containing the mutation. further, IL-6 promoter by combination of ER and 17-β estradiol Repression is mediated through high affinity binding of the receptor to the promoter. It didn't seem like that.   These data indicate that negative regulation by estrogen is I That it is mediated through the L-6 promoter and is estrogen receptor dependent. Suggests. Estrogen suppresses IL-6 expression by NFκB or closely Regulation of transcriptional activity of related proteins on the IL-6 promoter Be embodied.   Although not acknowledged as prior art, Mukaida et al.J. Biol. Ch em. , 269 (18): 13289-295 (1994) is a glucocorticoid Dexamethasone suppressed IL-8 production at the transcriptional level. Mutation of the AP-1 or NF-IL6 binding site on the IL-8 promoter is Suppresses IL-8 gene expression by dexamethasone, which indicates that This suggests that the site was not a target for dexamethasone. But dexametha Zon reduced IL-1 induced NFκB complex formation.   The present invention is not limited to, but is not limited to, the interrogation by estrogen receptors. Examples relating to the regulation of ikin6 transcription are described in detail for reference.                                   Example   Candidate agents are A) direct evaluation of proteins binding to the rel site or B) Screened by indirect evaluation of proteins binding to the rel site.A) Direct evaluation of protein binding to rel site   Cells selected for the expression of essential elements can be treated with the drug or vehicle and Treatment with inducers (eg, phorbol esters, cytokines, lipopolysaccharides) Manage. Cell extracts prepared from those cells (eg, whole cells, cytoplasmic Or nuclear extract) as a cytokine promoter fragment or probe. Analyze for DNA binding using various rel sites. Behi for binding Qualitatively compared with extracts from cells treated with ) (Ie comparing patterns) and quantitatively.B) Indirect evaluation of binding to the rel site     1) by measuring the expression of endogenous cytokines   The products of cells and cytokines selected for the expression of essential elements Or vehicle controls and inducers (eg, phorbol esters, Tocaine, lipopolysaccharide). The activity of the drug is determined by standard assays known to those skilled in the art. Quantitative evaluation is performed by measuring cytokines using a.     2) by measuring the expression of the reporter introduced into the cells   Transfection techniques allow the reporter construct to be cytokine-promoted. Can be easily measured under the control of the The resulting protein is introduced into cells expressing the protein. Another essential element is that Co-transformation of expression vectors for endogenously expressed or specific elements Provided by fection. The cells are regulated by the drug or vehicle Treat with a transducer (eg, phorbol ester, cytokine, lipopolysaccharide) You. Quantitatively determine the activity of the drug by measuring reporter protein expression To analyze.   The drug can also be coupled to IRs by conventional binding assays as well as by IRs. Test for activity affecting typical mechanisms of gene regulation. Ties to IRs Regulates the binding of the rel protein to the cytokine promoter, Drugs that do not activate the typical mechanism of action of As a candidate drug for specific treatment of diseases associated with   The experimental procedure used in the examples described herein is as follows:Transient transfection and mammalian expression constructs   pERE-tk-Luc reporter plasmid and ERgly(PRShER ) Have been described (Tzukerman). , M.), A. Esty, D. Santiso-Mere , Danielian, Parker, MG, Stain (RB Stein), JW Pike and McDonnell (DP Mc) Donnell) (1994) "Transactivation ability of human estrogen receptor (tran sactivational capacity) is determined by both the cell and promoter environment. And are mediated by two functionally distinct intracellular domains ”(“ Human estroge n receptor transactivational capacity is determined by both cellular and  promoter context and mediated by two functionally distinct intramolecul ar regions ”),Mol. Endocrinol. 8: 21-30, cited for reference) . The pIL6 [-225] Luc reporter construct was constructed from the NheI-BamHI fragment. After excision and blunt-ending with Klenow DNA polymerase, the vector was cut. Re-ligation of the piece resulted in parental pLI6 [-12 00] Luc. The parental pLI6 [-1200] Luc was replaced with pCAT-M 1.2 kb cut out from 54-IL-6 (-) with BamHI and KpnI Insert the IL-6 promoter insert into the corresponding part of the luciferase vector Lucp1 Constructed by cloning in position.   C3H10T1 / 2 cells supplemented with 10% FBS at 80,000 cells per well Seeding was performed in DMEM without filled phenol red. 0.5 mg of the cells pIL6 [-225] Luc alone or 0.05 mg pRShER or 0.1 2 mg total DNA in the transfection mixture, along with mg HE0 PGEM as a carrier to adjust the pH Transfected (Peterson, JL), McBra Id (OW McBride) (1980) "Cotran, a linked eukaryotic gene. Hypoxanthine phos by cotransfer and DNA-mediated gene transfer Effective transfer of horibosyltransferase ”(“ Cotransfer of linked euka ryotic genes and efficient transfer of hypoxanthine phosphoribosyltransf erase by DNA-mediated gene transfer ”),Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.  77: 1583-1587). After 4 hours at 37 ° C., the cells are reduced to 7% The cells were treated with DMSO for 30 minutes, the medium was changed, and hormone was added. The next day , The cells were induced with TNFα and IL-1b (1 nM each) for 24 hours. PBS After briefly washing with 200 ml of lysis buffer (2 5 mM Tris [pH 7.8], 2 mM DTT, 2 mM 1,2-diaminocyclo Hexane-N, N, N ', N'-tetraacetic acid, 10% glycerol, 1% Triron X-1 00). Reagents (20 mM Tricine [pH 7.8], 1.07 mM (M gCOThree)FourMg (OH)Two, 2.67 mM MgSOFour, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 279 mM coenzyme A, 470 mM luciferin, 530 mM A TP), add up to 20 ml of each extract and luciferase activity Dynatech luminome in cycle mode ter).Antibodies, IL-6 ELISA and ER assays   The peptide used to generate antibodies in the following rabbits was mouse c- jun 91-105 amino acid residues (Ryder and Natands (N athans) (1988) "Induction of proto-oncogene c-jun by serum growth factor" ( “Induction of protooncogene c-jun by serum growth factors”),Proc. Natl. Acad. Sci. USA   85: 8464-8467), mouse NF-IL 6, 278-296 amino acid residues (Chang, Chen, Ray, Chen and Lee (1990) "A transcription factor AGP / EBP belonging to a member of the C / EBP family. Molecular cloning ”,Moll. Cell Biol. 10: 6642-665 3), mouse c-rel 152-176 amino acid residues (Bull, Morley (K . L. Morley), MF Hoekstra, Hunter (T. Hunte) r) and IM Verma (1990) "Mouse c-rel protein" Quality includes N-terminal regulatory domain and C-terminal transcriptional transactivation domain ("The mousec-crel protein has an N-terminal regulatory domai n and a C-terminal transcriptional transactivation domain ”)Moll. Ce ll Biol.  10: 5473-5485); Inoue, J., Kale ( L. D. Kerr), LJ Ransone, E. Bengal, Hunter and Verma (1991) "c-rel activates transcription from the kappa B site. But v-rel is suppressed ”(“ c-rel activates but v-rel suppresses t ranscription from kappa B sites ”),Proc. Natl. Acad. Sci. U. S . A.  88: 3715-3719), amino acids 347-361 of mouse p50. Residues (Gauche, Gifford, L.R.Riv) iere), P. Tempst, GP Nolan and Balch More (1990) "Cloning of the p50 DNA binding subunit of NFKB: r homology to el and dorsal ”(“ Cloning of the p50 DNA bin ding subunit of NF-kappa B: homology to rel and dorsal ”),Cell6 2: 1019-1029) and human p65 (88% homology with mouse p65). 3-19 amino acid residues (Nolan, Liou, Tempst and Bal Timoa (1991) "Cloned NFκ, a rel-related polypeptide. B. DNA binding and IκB suppression of the p65 subunit of B ”(“ DNA binding a nd I kappa B inhibition of the cloned p65 subunit of NF-kappa B, ar el-related polypeptide ”)Cell  64: 961-969; Ruben, S. M.), PJ Dillon, R. Schreck, Hen Kel, Chen, M. Maher, Beauere and Rosen (CAR) osen) (1991) "Can encode the 65 kD subunit of NFκB. Isolation of rel-related human cDNA [Letter] "(“ Isolation of a rel-rela ted human cDNA that potentially encodes the 65-kD subunit of NF-ka ppa B [letter] ”),Science  254: 11). The above reference All are incorporated herein by reference. All antibodies listed above are from Santa Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) Affinity purification from Cruz (Santa Cruz, CA) at a concentration of 1 mg / ml Got what was done. Rabbit immunized with full length human recombinant protein Protein A purified serum preparation from mouse, rat and human (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) reported to react with TBP. Anti-ER generated against peptide corresponding to 8-22 amino acid residues of mouse ER Mouse monoclonal antibody (IgG2a). Tissue culture supernatant The concentration of IL-6 in the IL-6 ELISA was determined using IL-6 as usual. (Endogen, Inc., Boston, Mass.) .   ER in + / + LDA11 cells was measured in whole cell extracts. Washing After counting and counting, cells were treated with 50 mM Tris [pH 7.5], 30% glycerol, 500 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF and 5 mM DTT Homogenized in the containing buffer. Left on ice for 30 minutes Thereafter, the homogenate was centrifuged (100,000 g, 4 ° C., 1 hour). The supernatant Was harvested as a whole cell extract, harmonized with 0.5% CHAPS, and a 200-fold excess 5 nM [4 ° C. overnight in the absence or presence of DESThreeH] to incubate I did it. After incubation with the anti-ER antibody, the formed complex was converted to protein A- Precipitated on Sepharose (Pharmacia) and 10 mM Tris [p H7.5] /0.5% CHAPS three times, liquid scintillation counting Was measured byElectrophoretic mobility shift assay (EMSA) and methylation interference assay (meth ylation interference assay)   DNA binding experiments + / + nuclear extracts from LDA11 cells, recombinant human ERgly Extract from yeast expressing and purified p50 and p49 proteins It was performed in the quality. + / + LDA11 cells were maintained under the conditions described (Gilasso , Zirca, parsley, bosswell, border, williams and manoragas (1992) "Estradiol-17β is a bone marrow-derived stromal cell in vitro. Of interleukin-6 production by osteoblasts and osteoblasts: estrogen Possible Mechanism of Anti-osteoporotic Effect ofJ. Clin. Invest. 89: 8 83-891). The cells were supplemented with 10% FBS to prepare nuclear extracts Seed on McCoy's medium without phenol red, Untreated, hormone pretreatment was performed for 24 hours. Media in 2% FBS After that, the cells were induced with TNFα and IL-1b (1 nM each) for various periods of time. Cycloheximide (10 mg / ml) or Kinase inhibitor H7 (50 m If included, the compounds were added 5 minutes before induction. Ice-cooled PB The incubation was stopped by washing twice with S and the cells were cooled. Buffer A (10 mM HEPES [pH 7.9], 1.5 mM MgClTwo, 1 0 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.2% Nonidet p-40). Lysed in Ichu. Lysate is placed in a microfuge tube (microfu ge tube), pellet the nuclei (8000 rpm, 1 minute), buffer C (20 mM HEPES [pH 7.9], 1.5 mM MgClTwo, 420 mM NaCl, 25% glycerol, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.2 mM (5 mM PMSF). After shaking at 4 ° C for 40 minutes, centrifuge the sample. (15,000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was collected as a nuclear extract. Black Bradford protein assay (Bradford protein assay) Bradford, MM (1976), "Using the Protein-Dye Binding Method. A rapid and sensitive method for quantifying microgram quantities of protein ”(“ Arapid and sensitive method for the quantitatiion of microgram quantiti es of protein utilizing the principle of protein-dye binding ”),Anal . Biochem.   72: 248-254) is suitable for hormone or cytokine treatment. Only minimal changes in protein concentration were shown. As a recombinant ERglyWas transformed with YEpE10 as described. BJ2168 strain (Tuckerman, Estee, Santhio-Mere, Danielle, Parker, Stain, Pike and McDonnell (1994) The transactivational capacity of the toestrogen receptor is Determined by both the cell and promoter environment, two functionally distinct cells Transmitted by the intracellular area ”,Mol. Endocrinol. 8: 21-30). Purification Escherichia coli expressing isolated human p50 and p49 proteins ) Was purchased from Promega (Madison, Wis.).   For EMSA, 2 ml of the extract was added to 20 mM HEPES [pH 7.9]. , 40 mM NaCl, 20 mM KCl, 2.5 mM MgClTwo, 10% glycero Buffer, binding buffer adjusted to 0.1 mg / ml BSA and 1 mM DTT Preincubated with 2 mg poly [dI-dC] in water. When using the −225 to −52 IL-6 promoter fragment as a probe, Bluescript plasmid (Stratagene, La Jolla) (La Jolla), CA). After 20 minutes on ice, The probe was added and the incubation continued at room temperature for 20 minutes. When including antibodies 1 mg is added 20 minutes after the probe and incubation at 4 ° C for 40 minutes Continued. The formed complex is subjected to a rate of 15 V / cm in 0.25 × TBE at 4 ° C. Non-denaturing polyacrylamide gel (4% acrylamide / 0.05% BIS; 2) × 200 mm). The probe was a human IL-6 promoter and -82 to -47 corresponding to the ERE of the logenin promoter Region and -172 to -131 Double-stranded oligonucleotides (Tuckerman, Zan, Herman, virus (KN. Wills), G. Graupner and Pfaal (1990) H Toestrogen receptor is a transcriptional activator and repressor in the absence of ligand. Has a circulatory function ”(“ The human estrogen receptor has transcriptional a ctivator and repressor functions in the absence of ligand ”),New Bio l. 2: 613-620) or -225 to -52NheI-SspI IL-6 pro It was a motor fragment. All probes use T4-polynucleotide kinase [Γ32P] dATP or using Klenow polymerase [Α32P] dATP followed by polyacrylamide gel electrophoresis Purified.   For methylation inhibition assays, [γ32P] dATP Labeled -82 to -47 probes were subjected to limited DMS-methylation (Macchi Maxam, A.M. and Gilbert (1980) "Base Sequencing of End-Labeled DNA with Specific Chemical Cleavage ”(“ Sequencin g end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages "),Methods Enzymol.  65: 499-560). EMSA has been scaled up ten times Performed as described above. Gels were run in 0.5 × TBE for 30 minutes at 30V, NA4 5 Anion exchange membranes (Schleicher and Schuelich) (Schuell), Singh (H.), Lubowitz (JH). . LeBowitz), AS Baldwin, Jr. and Sharp (P. . A. Sharp) (1988) "Molecular chromatography of enhancer binding proteins. Screening: simply by screening an expression library having a recognition site DNA Release ”(“ Molecular cloning of an enhancer binding protein: isolation by s creening of an expression library with a recognition site DNA ”),C ell   52: 415-423). Various complexes after autoradiography And the DNA corresponding to the unretarded probe was eluted (65 20 mM Tris [pH 8.0], 1 M NaCl, 0.1 mM ED at 10 ° C. for 10 minutes. Purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation (in TA) did. After cleavage of the chain in 1 M piperidine (30 min at 90 ° C.), the fragment was left unchanged. Analyze on synthetic polyacrylamide gel (12% acrylamide / 0.6% BIS) did.Embodiment 1 FIG. Screening for suppression of ER mediation of IL-6 promoter activity   IL-6 repression is regulated by estradiol at the mRNA level Have been shown (Girasol, Zirca, Parsley, Boswell, Border, C Williams and Manoragas (1992) Estradiol-17β Production of interleukin-6 by bone marrow-derived stromal cells and osteoblasts in vitro Inhibiting Birth: Possible Mechanisms of Estrogen's Antiosteoporotic EffectJ . Clin. Invest.  89: 883-891; Jacob, Segal, Julian and And Carson (1992), Mouse uterine stromal cells and division in vitro. Secretion and Hormonal Regulation of Interleukin-6 by Isolated Epithelial Cells ",Endoc rinology   131: 1037-1046). Estrogen or candidate drug directly To determine whether it affects IL-6 transcription, we determined that -225- + Firefly luciferase under the control of up to 14 human IL-promoter regions The resulting reporter construct was transfected into the mouse fibroblast cell line C3H10T1 / 2. Was taken. These cells contain bone morphogenic protein-2.  Differentiate into osteogenic cells in response to protein-2) (Katagiri, T.), Yamaguchi (A. Yamaguchi), Ikeda (T. Ikeda), Yoshiki (S. Yoshiki), J.M. Wozney, Rose (V. Rosen), Wan (EA Wang), H. Tanaka, Omura ( S. Omura) and T. Suda (1990) "Recombinant human bone morphogenesis." Protein-2 is the osteoblast of non-osteogenic mouse pluripotent cell line C3H10T1 / 2. Induce differentiation into vesicles ”(“ The non-osteogenic mouse pluripotent cell lin e, C3H10T1 / 2, is induced to differentiate into osteoblastic cells by recombinant human bone morphogenetic protein-2 ”),Biochem. Biophy s. Res. Commun.  172: 295-299).   Therefore, C3H10T1 / 2 cells were transformed with the proximal human IL-6 promoter (pIL- 6 [-225] Luc) alone or wild type human ERglyExpression of (pRShER) Transfection with luciferase expression vector under control with vector did. After pretreatment with estradiol at various concentrations for 24 hours, the cultures were Induced or not induced at 1 nM each of NFα and IL-1 The cells were harvested 24 hours later and the extract was allowed to luciferase activity. Was analyzed.   Treatment of cells transfected with TNFα and IL-1 is at basal level Elicited a 5-fold increase in luciferase activity beyond. Estrogen If co-transfection of a plasmid expressing the Treatment with ladiol was ineffective. However, in co-transfection If estrogen receptor expression is observed, treatment with estradiol The dose-dependent suppression of luciferase activity was strong.   Wild type human ER (ERgly) Similarly glycine in the hormone binding domain? Mutant with a point mutation to valine (ERval) Also observed suppression (Tora, L.), A. Mullick, D. Metager , Mong Ponglikitmongkol, Park (I. Park) And P. Chambon (1989) "Cloned Human Est" Rogen receptors have mutations that alter their hormone binding properties ”(“ The cloned hu manoestrogen receptor contains a mutation which alters its hormone bindi ng properties ”),EMBO J. 8: 1981-1986). ERvalIs Takano Although estradiol was required, it showed strong inhibition. This is a provocation experiment ERvalResponds to low levels of hormones but has fairly basic activity Consistent with the results (Tuckerman, Zan, Hermann, Wills, Graupner and And Pfarl (1990) "Human estrogen receptor is translocated in the absence of ligand. It has a photo activator and repressor function ”,New Biol. 2:61 3-620).   The dependence of the estrogen effect on the co-transfected ER was C3H10 T1 / 2 cells suggested that they did not express functionally endogenous ER. this Is a luciferase under the control of the vitellogenin estrogen response element (ERE) Confirmed by transfecting cells with a reporter (client M. Schorpp, U. Wagner and GU Ryffel (1986), Xenopus laevigtelogeni The estrogen responsive element derived from the 5 'flanking region of the Functions in transfected human cells ”(“ An estrogen-responsive el ement derived from the 5'flanking region of the Xenopus vitellogenin A 2 gene functions in transfected human cells ”),Cell  46: 1053- 1061).   Therefore, C3H10T1 / 2 cells were transformed into a minimal Motor and vitellogenin estrogen response element (pERE-tk-Luc) alone Alternatively, transfected with a luciferase expression vector under control with pRShER. Transfected. 24 of treatment with 10 nM estradiol or vehicle After hours, cells were harvested and extracts were analyzed for luciferase activity. Est Induction of luciferase activity by ladiol was determined by co-transfected ER Was observed only in the presence of   In addition, C3H10T1 / 2 cells were incubated with 10 nM estradiol. Or incubated without the material. After 24 hours, the culture is Induced with Fα and IL-1 (1 nM each) or without additional 24 hours It was left as it was. IL-6 in the supernatant was converted to mouse IL-6 specific E Assayed by LISA. IL- that strongly increases endogenous IL-6 production C3H10T1 / 2 cells responded to TNFα1 and TNFα treatment, but had intrinsic ER. Are not like other bone-forming or stromal cells (Girasol, Zirca, Li, Boswell, Border, Williams and Manoragas (1992) Tradiol-17β is expressed by bone marrow-derived stromal cells and osteoblasts in vitro. Suppresses interleukin-6 production: estrogen's anti-osteoporotic effect Possible Mechanisms ",J. Clin. Invest.  89: 883-891), IL-6 levels were not reduced by estradiol. These data Suggests that suppression of IL-6 expression is at the transcriptional level and is mediated via the ER You. Experiment of co-transfection using pre-osteoblast cell line C3H10T1 / 2 Thus, we have found that the IL-1 / TNFα-induction of the proximal IL-6 promoter region It has been shown that activation can be suppressed by estrogen. This suppression Is dependent on the estrogen receptor, and the wild-type human ER (ERgly) And ERval It was observed in both mutants. ERvalCo-transfection with HeLa cells and pre-osteoblastic cell line MBA13 cells expressing endogenous ER Obtained by others in both. Description of estrogen in IL-6 mRNA (Girasol, Zirca, Parsley, Boswell, Border, Willi Ams and Manoragas (1992) "Estradiol-17β is in vitro (B) Production of interleukin-6 by bone marrow-derived stromal cells and osteoblasts Suppress: Potential mechanism of estrogen's anti-osteoporotic effect ",J. C lin. Invest. 89: 883-891; Jacob, Segal, Julian and Carson (199 2) "In vitro by mouse uterine stromal cells and divided epithelial cells Interleukin-6 writing and hormone regulation ”,Endocrinology 131: 1037-1046), these results indicate a transcriptional mechanism of estrogen-induced repression. Suggests   Candidate drugs can be screened using the assays described above, and Can be used instead of oars.Embodiment 2. FIG. Regulates binding of NFκB-related proteins to the proximal IL-6 promoter Screening for drugs Cell line expressing ER (+ / + LDA11)   An exemplary assay system expresses all essential elements, including the ER, endogenously Cell line. Bone marrow derived from mouse stromal cell line + / + LDA11 contains IL-6 It is shown to respond to IL-1 and TNFα treatment which strongly increases ligation. Treatment with estradiol is indicated for the protein and its mRNA. Suppress the induction of IL-6 (Girasol, Zirca, Parsley, Boswell , Border, Williams and Manoragas (1992) "Estradiol- 17β is interrogated by bone marrow-derived stromal cells and osteoblasts in vitro Inhibits Ikin-6 production: a possible anti-osteoporotic effect of estrogen Kanism ”,J. Clin. Invest.  89: 883-891).   To demonstrate that ER is actually present in + / + LDA11 cells, A Lumont binding experiment was performed. Early experiments on high salt extracts from these cells It showed that the number of binding sites specific for estradiol was small. The ER Use a monoclonal antibody directly to the non-terminal end to ensure the binding site representing the ER Specifically bound toThree[H] estradiol was immunoprecipitated. Those Experiments showed that + / + LDA11 cells had about 1000 ERs per cell. Calculated to have a molecule.   However, electrophoresis in combination with vitellogenin ERE as a probe When using the mobility shift assay (EMSA), ER-specific DNA binding activity + / + L treated with estradiol and / or IL-1 and TNFα No detectable in nuclear extract from DA11. Estradio as instructed (10 nM) and TNFα and IL-1 (1 nM for 40 min each) Nuclear extract from + / + LDA11 cells or recombinantly expressed human wild type Type ERglyYeast extract containing E. coli as a probe in the absence or presence of anti-ER antibody Incubated with all vitellogenin ERE. The formed complex is analyzed by EMSA. Was analyzed.   Since the detected complex was not significantly affected by the anti-ER antibody, Not relevant. By regulation using ER containing extract obtained from yeast expression system Resulted in two slow-moving complexes specifically shifted with anti-ER antibodies. These data show that ER is present in + / + LDA11 cells but depending on EMSA It suggests that the concentration is too low to detect.DNA binding activity of nuclear extract to IL-6 promoter   To study the molecular mechanisms of IL-6 induction and suppression by estrogen , + / + Nuclear extracts from LDA11 cells in co-transfection experiments The IL-6 promoter region mediating cytokine induction and estrogen suppression The region was analyzed for DNA binding activity. This DNA fragment is combined with the nuclear extract The most proximal region, including the TATA box, initiates transcription to show background binding The fragment -225 to -52 upstream of the site was removed. This region of the promoter The region is the core sequence of the cAMP response element (CRE), leucine zipper protein NF -Coincidence of several transcription factors including the binding site for IL6 and the NFκB site Including joint sites (Issiki, Akira, Tanabe, Nakajima, Simamoto, Hirano and Kishimoto (1990) "Interacts with the IL-1 response element in the IL-6 gene. Constitutive and interleukin-1 (IL-1) -inducing factors ",Mol. Cell Biol.  10: 2757-2765).   Binding of NF-IL6 and NFKB-like proteins to these sites has been demonstrated. (Akira, Issiki, Sugita, Tanabe, Kinoshita, Nishio, Nakajima, Hi Rano and Kishimoto (1990) "Nuclear factor for IL-6 expression (NF-IL6 ) Is a member of the C / EBR family. "EMBO J. 9: 1897-190 6; Lieberman and Baltimore (1990) "through the NF-κB transcription factor. Activation of interleukin-6 gene expression ”,Moll. Cell Biol. 10: 2 327-2334). This fragment was treated with IL-1 and TNFα for various times + / + Incubated with nuclear extract from LDA11. + / + LDA11 cells Were pretreated with estradiol (10 nM) as indicated. After 24 hours, the cells Were induced with TNFα and IL-1 (1 nM each) for various periods of time. Triggering cell lysis And the nuclear extract was excised from -225 to -52 IL-6 promoter. The pieces were analyzed by EMSA using as a probe (FIG. 1a).   The complex formed was analyzed by EMSA. After treatment with cytokines, A possible complex was observed. The strength of the complex was treated with IL-1 and TNFα. Already 10 minutes later, it reached its maximum and gradually decreased over time. 2 o'clock of trigger After a short time, the strength of the complex decreased significantly.   Pretreatment of cells with estradiol results in the extraction of extracts from uninduced cells. Did not affect the ability. However, estradiol pretreatment is provocative Significant increase in triggering complex with an interval of 10-40 minutes, but 2 hours after triggering Had only a slight effect on the composite. Augmented Complex in which pretreatment with estradiol is also a quantitative change Caused an increase in mobility.Detection of the composition of the DNA binding complex   To investigate the properties of the complex and possibly related proteins, the present inventors And others incubated the binding reaction with antibodies directed against several potential binding agents. I did it. Estradiol (10 nM) and TNFα and IL- as indicated Nuclear extracts from + / + LDA11 cells treated with 1 (1 nM each for 10 minutes) Incubated with the -225 to -52 probe in the absence or presence of such antibodies. Was. The complex formed was analyzed by EMSA.   FIG. 1b shows the DNA binding of extracts from uninduced cells among the tested antibodies. Indicates that nothing was affected. Anti-c-jun or anti-c- Neither rel nor anti-NF-IL6 antibodies affect cytokine-induced complexes Had no effect.   However, antibodies to two proteins directly in the NFκB complex, Anti-p50 and anti-p65 did not form the complex (lanes 10-13). This These are extracts from cells treated or untreated with estradiol. It was observed over the entire period of itokine induction (FIG. 1b shows the results 10 minutes after induction). ). The longer the contact, the more likely anti-p50, anti-p65 Very weak complexes with low mobilities were detected as a result of the supershift of the onset complex.   ER binding activity to vitellogenin ERE + / + extract from LDA11 cells Were not detected, but we found that the ER was located on the IL-6 promoter fragment. Was tested for its involvement in complex formation. Estradiol as instructed (10 nM) and TNFα and IL-1 (1 nM each for 40 min) Nuclear extract from + / + LDA11 cells or recombinantly expressed human wild type ERgly-225- in the absence or presence of anti-ER antibody Incubated with 52 probes. The complex formed is analyzed by EMSA Was.   FIG. 1c shows anti-E independent of cytokine induction or estradiol treatment. The addition of the R antibody, whether triggered or structural, can be added to any of the complexes. Had no significant effect. Furthermore, yeast extraction containing high concentrations of recombinant ER When the product was incubated with the IL-6 promoter fragment, the specific binding of the ER was Was not detected at all (lanes 7 and 8). The weak band observed was anti- Not related to the ER because it was not affected by the ER-antibody.   The results from the antibody gel shift experiments were further analyzed by oligonucleotide competition experiments. Was supported. Estradiol (10 nM) and TNFα and Nuclear extraction from + / + LDA11 cells pretreated with IL-1 (1 nM for 10 min each) The products were expressed at -82 to -47 and -172 to -131 of the human IL-6 promoter. In the absence or presence of a 400-fold molar excess of oligonucleotide corresponding to the region And incubated with the -225 to -52 probe. EMS formed A Was analyzed by   The arrow in FIG. 1d indicates the complex formed upon induction with TNFα and IL-1. You. N in a binding reaction with a 400-fold excess of labeled -225-52 fragments F-IL6 site, CRE and CCAAT box adjacent to IL-6 promoter Ingredients covering (-172 to -131), whether structural or Had no significant effect on any of the complexes, even if induced (Lanes 4 and 7). However, the putative NFκB site and its neighboring sequences ( Oligonucleotides covering -82 to -47) are particularly useful for cytokine-induced No coalescence was formed (lanes 3 and 6).   Antibody experiments and oligonucleotide competition experiments showed that IL-1 and TNFα It has been suggested to specifically activate FκB or related proteins. c-jun (A No binding of P-1), NF-IL6, c-rel or ER was detected.   Lack of NF-IL6 binding causes this transcription factor to respond to IL-1 in other cells. It is surprising that the induction and binding of offspring has been reported (Akira, Isshi Ki, Sugita, Tanabe, Kinoshita, Nishio, Nakajima, Hirano and Kishimoto (1 990) "The nuclear factor for IL-6 expression (NF-IL6) is a member of the C / EBR family. -Is a member ofEMBO J. 9: 1897-1906; Inoue, kale , Lanson, Bengal, Hunter and Verma (1991),Proc. Natl. A cad. Sci. USA   88: 3715-3719). Our DNA binding fruit In the bone marrow derived from + / + LDA11 cells, IL-1 and TNFα Induces binding of kappa B or closely related proteins to the IL-6 promoter Is shown. Similar results have been obtained in different cell types (Shimizu , Mitomo, Watanabe, Okamoto, and Yamamoto (1990) Inflammatory Lymphoca Of NFκB-like transcription factor in activation of interleukin-6 gene Involvement ”,Moll. Cell Biol. 10: 561-568; Zan, Lynn, and Bi Lusek (1990) "Tumor necrosis factor and interlo in human fibroblasts. Induction of interleukin-6 by ikin-1 activates nuclear factors that bind to κB-like sequences. Is involved in sexual development ”,Moll. Cell Biol. 10: 3818-3823). AP Including -1 In the induced or uninduced proximal 11-6 promoter fragment Binding of some other factors with potential binding sites cannot be detected won. This transcription factor is directly regulated by intracellular receptors, including GR, RAR and TR. This is one of the typical examples related to indirect suppression. The mechanism of AP-1 suppression is protein Protein-protein interaction and / or DNA binding dependent on a particular gene. (Diamond, MI), My JN Miner, SK Yoshinaga and Yamamoto (K . R. Yamamoto) (1990) "Transcription factor interaction: positive from single-DNA elements. Or negative adjustment selector ”(“ Transcription factor inteactions: select ors of positive or negative regulation from a single DNA element ”) ,Science  249: 1266-1272; Schule, R., Umesono (K. Umesono), DJ Mangelsdorf, Borad (J. Bolado), Pike and RM Evans (1990) Jun- Fos and vitamin A and D receptors are located on the human osteocalcin gene Recognize common response elements ”(“ Jun-Fos and receptors for vitamins A and D recognize a common response element in the human osteocalcin gene ”),Cell  61: 497-504; Yang-Yen, Chambered (J.C. Chambard), Sun (YL Sun), T. Smeal, Schmid ( T. J. Schmidt), J. Drouin and M. Karin (1990) "Transcriptional Interference Between c-Jun and Glucocorticoid Receptors" (" Transcriptional interference between c-Jun and the glucocorticoid recep tor: Mutual inhibition of DNA binding due to direct protein-protein i nteraction "),Cell  62: 1205-1215; Jan-Yen, Zan, Gu Raupner, Tsuka-Man, B. Sakamoto, Karin and Puffer Ru (1991) Antagonism between retinoic acid receptor and AP-1: tumor "Antagonism between retinoic acid receptors and AP-1: implications for tumor promotion and inflammation ”),Ne w Biol.  3: 1206-1219; Zan, Virus, Ms. Husmann. And fur Ru (1991) "Analysis through interaction with jun and fos oncogene activity. Novel pathway for thyroid receptor action " hormone receptor action through interaction with jun and fos oncogene ac tivities ”)Moll. Cell Biol. 11: 6016-6025). Several The report also suggests a crosstalk-like interaction between ER and AP-1, but However, there is no evidence for estrogen-dependent suppression of AP-1 activity (Go Gaub, MP, M. Bellard, I. Scheu er), Chambon and P. Sassone-Corsi (1990) ) "Activation of ovalbumin by the estrogen receptor is associated with the fos-jun complex ("Activation of the ovalbumin gene by the estrogen recept or involves the fos-jun comprex ”),Cell  63: 1267 to 1276; Kerman, Zan and Pfarl (1991) "Tumor promoter 12-O-te Tradecanoylphorbol 13-acetate estrogen receptor activity Suppression ”(“ Inhibition of estrogen receptor activity by the tumor promote r 12-O-tetradeconylphorbol-13-acetate: amolecular analysis ”),Mol. Endocrinol.  5: 1983-1992). Therefore, ΔP-1 becomes estrogen Is likely to play a role in the negative regulation of IL-6 expression by Absent.Embodiment 3 FIG. Affects distinct complexes with the IL-6 promoter separately Drug screening Obvious complex with IL-6 promoter   Treatment of + / + LDA11 cells with IL-1 and TNFα is either NFκB or Related proteins were induced to bind to the IL-6 promoter. Estradio Since the pretreatment of the complex increased the strength and mobility of the complex, we Covers the putative NFκB site (−82 to −47) of + / + LDA11 nuclear extract The binding to the oligonucleotide was investigated.   + / + LDA11 cells were pretreated with estradiol (10 nM) as indicated Was. After 24 hours, the cells were induced with TNFα and IL-1 (1 nM each) for various periods of time. Emitted. Induction was stopped by cell lysis, and the nuclear extract was then treated with -82 to -47 I The L-6 promoter fragment was analyzed by EMSA using as a probe. FIG. 2 shows extracts from cells treated with IL-1 and TNFα, but not treated Exhibit three triggering complexes (A, B, C) when compared to extracts from cells Is shown.   The fastest-moving complex (C) is particularly intense during the induction (10-120 min) Decreased. Interestingly, estradiol pretreatment moves most slowly While the intensity of the fastest band is greatly enhanced while reducing the intensity of the complex (A). Was. It appears that the complex moves faster with estradiol treatment This is consistent with the pattern obtained with the fragments from -225 to -52 (Fig. 3).   A similar complex appears to form in both fragments; however, the shorter Only lignonucleotides were completely analyzed. Estradiol (as instructed 10 nM) and TNFα and IL-1 (1 nM for 40 min each) Nuclear extracts from + / + LDA11 cells were purified from -82 to-of the human IL-6 promoter. 100-fold molar excess of oligonucleotides corresponding to regions 47 and -172 to -131 In the absence or presence of a leotide or vitellogenin ER oligonucleotide- Incubated with the 82 to -47 probe. The formed complex is And analyzed.   All three complexes (A, B, C) are 100 times more than unlabeled probe (Figure 2b, lanes 6 and 10) While the same molar excess of NF-IL6 oligonucleotide (-172- -131) or vitellogenin ERE was ineffective (FIG. 2b), lanes 7, 8, 11 and 12).   FIG. 2c shows the NF-IL6 site (-172 to -131) of the extract. When investigating binding to lignonucleotides, several complexes were detected. Show. Estradiol (10 nM) and TNFα and IL-1 as indicated Nuclear extracts from + / + LDA11 cells pretreated (1 nM for 40 min each) In the absence or presence of a 00-fold molar excess of unlabeled oligonucleotide- Incubated with 172-131 probe. The formed complex is converted to EMSA Therefore, it was analyzed. Arrows in FIG. 2c are formed upon induction with TNFα and IL-1 Shown are composites A, B and C.   Two of the complexes compete with the excess of unlabeled oligonucleotide (Lanes 2, 4 and 6). However All complexes are constitutive independent of cytokine induction or estradiol treatment Which means that the complex is formed by IL-1, TNFα and estrogen. Did not implicate the regulation of IL-6 expression.Screening for compounds that affect the formation of apparent complexes   In a more detailed experiment we have realized other adaptations to the formation of complexes A, B and C. The effect of the compound was analyzed (FIG. 3). + / + LDA11 cells with TNFα and IL− Before induction with 1 (1 nM for 30 min each), cycloheximide (CHX) or Kinase inhibitor H7 for 5 minutes or estradiol (10 nM) and And / or ICI 164,384 (100 nM) for 24 hours or 60 minutes Prepared. The treatment was stopped by cell lysis and the nuclear extract was purified by the -82 to -47 fragment. And analyzed by EMSA. Arrows indicate complexes A, B and C.   Before adding the cytokine, use the protein synthesis inhibitor cycloheximide. Pretreatment of cells did not interfere with the complex formation (lane 8). This is Consistent with rapid induction, previously shown for NFκB activation (Hen Kel, McLeit, Alcaray, Kronke, Ben-Neria and Bohrer ( 1993) "Rapid proteolysis of IκB-α activates the transcription factor NF-κB. Is necessary forNature  365; 182-185; Sen (R.) and Baltimore (1986), Kappa immunoglobulin by a translocational mechanism. Inducibility of Bryn enhancer binding protein NF-κB ”(“ Inducibilit y of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein Nf-kappa B by a post translocational mechanism ”)Cell47: 921-928). Cycloheximi Treatment has been reported to activate NFκB binding (Sen and Baltimore (1986) "Kappa immunoglob by translocational mechanism" Possibility of inducing the phosphorus enhancer binding protein NF-κB ”,Cell47:92 1-928; Zan, Lynn, and Bilsek (1990), "Human fibroblasts -6 induced by tumor necrosis factor and interleukin-1 in mice Is involved in the activation of nuclear factors that bind to κB-like sequences. ”Moll. Cell Biol.1 0: 3818-3823). However, in + / + LDA11 cells, We observed no induction by cycloheximide (lane 7). In addition, pretreatment with H-7, a potential protein kinase C (PKC) inhibitor Tar (Kawamoto, S.) and H. Hidaka (1984) “1- (5-Isoquinoline sulfonyl) -2-methylpiperazine (H-7) is It is a selective inhibitor of protein kinase C in heron platelets ”(“ 1- (5-Isoquinolinesulfonyl) -2-methylpiperazine (H-7) isase lective inhibitor of protein kinase C in rabbit platelets ”),Biochem . Biophys. Res. Commun.  125: 258-264), IL-1 and T It did not prevent the induction of complex formation by NFα (lane 10). This is a composite Induction of bodies A, B and C is transmitted via a PKC-independent pathway, and IL-1 and TNFα activates NFκB and induces IL-6 independently of PKC Suggest (11, 55, 99).   Activation of NFκB by phorbol ester is probably mediated by PKC (Bauer and Baltimore (1988) “IκB: NF-κB transcription factor. Specific inhibitor ”,Science  242: 540-546). However +/- with 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA) Treatment of + LDA11 cells did not significantly induce IL-6 production, and -82 to -4 7 did not induce complex formation.   The estradiol effect, ie, decrease of complex A and increase of complex C (FIG. 3) Compare lanes 2 and 3) with brief estradiol pretreatment before induction (60). Min) (lane 6). Furthermore, pure anti-estrogen IC I164, 384 (Wakeling, A.E.) and Bowler (J. . Bowler) (1988) "Biology and mode of pure antiestrogenic action". (“Biology and mode of action of pure antioestrogens”),J. Steroid Biochem.  30: 141-147) has no effect on the pattern of the complex (Lane 4). However, ICI 164,384 has partnered with estradiol When added in combination, it inhibited the effects transmitted by estrogen.   ICI 164,384 acts as an antagonist through binding to the ER These results further implicate estradiol in the induced complex We support the hypothesis that the effect is receptor mediated. However, Est The mechanism of action of logogens is due to the lack of response to short-term estradiol treatment. As shown, it is probably indirect.Screening of drugs that affect the binding properties of the protein in apparent complexes Ning   Proteins in complexes A, B and C with NFκB oligonucleotide To investigate the binding properties of the quality, a methylation inhibition experiment was performed (FIG. 4). TNFα + / + LDA11 nuclear extracts from cells induced with and IL-1 (1 nM each) -82 to -47 labeled on the strand or lower strand and subjected to limited DMS methylation Incubated in lobe. After the preliminary EMSA, the complex A, B and C And DNA from unrelated probe (F) is isolated and cleaved with piperidine And electrophoresed on a 12% denaturing gel. The sequence corresponding to the NFκB-lethal site is framed The AP-1 site using the code is shaded.   N-7- of both chains of the guanine base in the NFκB site (-73 to -63, boxed) Methylation interferes with complex formation while flanking identical sites Guanine methylation had no observable effect. All three complexes (A , B, C) were identical.   Guanine methyl just outside the NFκB site (−75, −60, −58) Observations that the transformation had no effect even on the formation of the largest complex (A) In the three complexes, DNA constructs are produced in similar core regions. Suggests. In addition, D at the methylation of guanine-60, -58 and -56 The lack of NA binding interference indicates that any cytokine in this region (-61 to -55) Inconsistent with the factor induced by in (TGAGCTCT, shaded area) AP-1 part (Tanabe, Akira, T. Kamiya) GG Wong, Hirano and Kishimoto (1988) "Mouse IL- Genomic structure of 6 genes. High degree of conservation of potential regulatory sequences between mouse and human ("Genomic structure of the murine IL-6 gene. High degree conser vation of potential regulatory sequences between mouse and human ”),J . Immunol.  141: 3875-3881).   Our work is related to NFκB p50 and p65 or very closely related. Formation of a complex having an IL-6 promoter for a protein It shows that Gen has an effect. +/- with IL-1 and TNFα + LDA11 cell treatment is particularly important for NFκB-lethal sites in the IL-6 promoter Induces the formation of at least three distinct complexes with In various sizes However, in all three complexes, the DNA constructs have a core arrangement at the NFκB site. Limited to columns. Corresponding core sequences for other NFκB elements are at p50 and p65. (Baldwin and Sharp (1988) "Two Transfers Factors, NFκB and H2TF1, are in the class I major histocompatibility complex Interacts with a single regulatory sequence ”(“ Two transcription factors, NF-ka ppa B and H2TF1, interact with a single regulatory sequence in the  class I major histocompatibility complex promoter ”),Proc. Natl. Acad. Sci. USA   85: 723-727; Kieran, M .; Rank (V. Blank), Rosito (F. Logeat), Bande Calk Hove (J. Vandeckerckhove, F. Lottspeich, Le Veil (OL) e Bail), Urban (MB Urban), Kourilski, Beauere and Chair Rael (1990) "The DNA binding subunit of NFκB is identical to the KBFI factor. And is homologous to the rel oncogene product ”(“ The DN A binding subunit of NF-kappa B is identical to factor KBF1 and  homologous to the rel oncogene product ”),Cell  62: 1007-10 18; Sen and Baltimore (1986) "Many nuclear factors are immunoglobulin enzymes. Mutual with Hanser sequence ("Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin  enhancer sequences ”),Cell  46: 705-716), both of which are DNA Have been shown to interact directly with (Nolan, Gauche, Liou, Tempus And Baltimore (1991) "Cloning is a rel-related polypeptide. DNA binding and IκB repression of the p65 subunit of NFκB ”(“ DN A binding and I kappa B, a rel-related polypeptide "),Cell  64: 961-969; Urban, Shrek and Beauere (1991) "NFκ". B contacts DNA with heterodimers of p50 and p65 subunits ("NF-kappa B contacts DNA by a heterodimer of the p50 and p65  subunit ”),EMBO J.  10: 1817-1825). has p50 C-rel homodimers and heterodimers are IL-6 in the promoter. Has been shown to bind to NFκB sites (Nakayama, K.) , Mitomo, Watanabe, Okamoto and Yamamoto (1992) "c-Rel-like Lymphocyte cell-specific nuclear factors with protein are particularly active in lymphocyte cells. Interacts with well-regulated IL6κB-related motifs ”(“ A lymphoid ce ll-specific nuclear factor containing c-Rel-like proteins preferentially  interacts with interleukin-6 kappa B-related motifs whose activities a re repressed in lymphoid cells ”),Moll. Cell Biol. 12: 1736 -1746).   In addition, this study showed that c-rel or immunologically The factor binds to the NFκB site of the IL-6 promoter and acts as a structural repressor Indicates a component of a larger complex that works. + / + LDA11 cells Thus, the present inventors could not detect c-rel specific binding activity. Other multiple N Proteins not associated with FκB have been shown to bind at the NFκB-lethal site I have. They are aA-CRYBP1 (Nakamura, T.), Donovan ( D. M. Donovan), Hamada (K. Hamada), Sax (CM Sax), B. Norman, JR Flanagan, Ozato (K. Oza) to), H. Westphal and J. Piatigor. sky) (1990) "Regulation of mouse αA-crystallin gene: Class I major group Binds to woven sequence-compatible gene complexes and cis-sequence motifs shared with other genes Isolation of cDNA Encoding Protein ”(“ Regulation of the mouse alpha  A-crystallin gene: isolation of a cDNA encoding a protein that binds  to a cis sequence motif shared with the major histocompatibility comple x class I gene and other genes ”),Moll. Cell Biol. 10: 3700 -3708), MBP-1 / PRDII-BFI (Baldwin, Lucrea ( K. P. LeClair), H. Singh and Sharp (1990) "Gin The large protein with the finger domain is a class I major histocompatibility complex. Binding to related sequence elements in enhancers of the combined and kappa immunoglobulin genes ("A large protein containing zinc finger domains binds to rela ted sequence elements in the enhancers of the class I major histocompat ibility comprex and kappa immunoglobulin genes ”),Moll. Cell Biol.  10: 1406-1414); Fan (CM) and Maniatis ( T. Maniatis) (1990) "Two widely separated sequences recognizing the same DNA sequence. DNA-Binding Protein Having a Selected Zinc Finger Motif ”(“ A DN A-binding protein containing two widely separared zinc finger motifs th at recognize the same DNA sequence ”),Genes Dev. 4: 29-42) And AGIE-BP1 (Ron, D., A. R. Brasier) ) And JF Havener (1991), Angiotensinogen Gene-induced enhancer binding protein 1, nucleus via zinc finger motif Member of a New Family of Macronuclear Proteins Recognizing the Factor κB Binding Site ”(“ A ngiotensinogen gene-inducible enhancer-binding protein 1, a member of a new family of large nuclear proteins that recognize nuclear factor kappa  B-binding sites through a zinc finger motif ”)Moll. Cell Biol.11 : 2887-2895).   The C / EBR-like protein is the acute phase response element of the angiotensin gene, NFκ B is known to reduce transactivation via El, Ron, JE Tate and Havenar (1990) Structural C The family of EBP / EBP-like DNA binding proteins is IL-1α-induced NFκ B-mediated transactivation of the acute phase response element of the angiotensinogen gene ("A family of constitutive C / EBP-like DNA bindi ng proteins attenuate the IL-1 alpha induced, NF kappa B mediated transa ctivation of the angiotensinogen gene acute-phase response element ”),EMBO J.  9: 3933-3944). More recently, the present inventors have The protein or other protein is part of the observed complex, or The involvement of estrogen in suppressing the expression of IL-6 cannot be ruled out. Recent studies have shown that estradiol has a complex with the NFκB element in uterine cells. Suggests that it induces body formation (Shyamala, G.) (GC Guiot) (1992) “κB-specific tamper with estradiol. "Activation of kappa B-specific proteins by estradior ”),Proc. Natl. Acad. Sci. USA  89: 10628-10632). . Since the induced complex did not contain p50 or p65, other factors May develop.Embodiment 4. FIG. Drug Screening Effect on p65 Binding to IL-6 Promoter Learning Analysis of the components of the complex formed at the NFκB site   With respect to the larger promoter fragment, we determined that the NFκB oligonucleotide Analysis of the properties of the complex formed by the tides (-82 to -47) by antibody shift experiments (FIG. 5a). Estradiol (10 nM) and TNFα and From + / + LDA11 cells pretreated with IL-1 and IL-1 (1 nM for 10 min each) Extracts were incubated with -82 to -47 probes in the absence or presence of various antibodies. I was vate. The complex formed was analyzed by EMSA.   We included anti-p50 or anti-p65 (lanes 17-20) in the binding reaction. , It was observed that the effect on the induced complex had to be affected. Interesting thing In the meantime, anti-p50 does not specifically form complexes B and C (complex A is affected and Apparently not, but there was a single supershift band (S1). But However, anti-p65 suppresses the formation of all three induced complexes, and (S1, S2). It is p65 or immunologically closely related The protein is part of all three triggering complexes, but contains p50 or related proteins. The protein was suggested to be only present in complexes B and C.   Recombinantly expressed c-rel is located in the NFκB region of the IL-6 promoter. Position and p50 as a heterodimer, especially as a high-affinity homodimer (Nakayama, Shimizu, Mitomo, Watanabe, Okamoto And Yamamoto (1992) "Lymphocyte cells having c-Rel-like protein" Heterologous nuclear factor is an IL6κB-related model whose activity is particularly suppressed in lymphocyte cells. Interact with the chief ”,Moll. Cell Biol. 12: 1736-1746) It is. Anti-c-rel together with extract from + / + LDA11 cells in binding reaction When included, the antibody did not suppress the triggering complex at all. Long contact makes it weak A super-shifted complex was detected. This complex has the supershift observed with anti-p50 and Moved to a similar position, which did not include the larger c-rel protein. And suggests. The peptide used to generate the anti-c-rel antibody was p5 0 because of 56% homology to similar sequences (Gauche, Gifford, Livi , Tempst, Nolan and Baltimore (1990), p50 of NFκB. Cloning of DNA binding subunit: homologous to rel and dorsal Gee ",Cell  62: 1019-1029; Inouye, Kale, Lanson, Ba Ngal, Hunter and Verma (1991) "c-rel is transcribed from the κB site. Activates, but suppresses v-rel.],Proc. Natl. Acad. Sci. US A   88: 3715-3719), this weak band is cross-reac tivity) does not seem to be related to c-rel. Larger promoters For fragments, anti-c-jun had no effect on complex formation (lane 1 3 and 14). The results shown indicate a 10 minute induction time point, which is essentially longer. It shows that it is essentially the same as the treatment with itokaine.   Has significant effect on complex formation in extracts not induced by the tested antibodies There was nothing at all. Only anti-p50 was found in S1 as observed in the evoked extract. Produced a very weak super-shifted complex migrating in position (with longer contact I can just see it). This weak binding that can only be detected if it is super-shifted Activity may be due to cytosol contamination or basal activation under culture conditions. did it.   In another EMSA experiment, we found that recombinant p50 as well as ER-expressing yeast A purification preparation was included (FIG. 5b). Estradiol (10 nM) and + / + LDA11 pretreated with TNFα and IL-1 (1 nM each for 30 minutes) Nuclear extract from cells and purified human p50 protein and recombinantly Yeast extracts containing the expressed human ER were expressed in the absence or presence of various antibodies at -82. Incubated with ~ -47 probe. The formed complex was separated by EMSA. Was analyzed. Arrows indicate complexes A, B and C and cytokines induced by cytokine treatment. 2 shows complexes S1 and S2 obtained by hyperbody shift.   As expected, ER-expressing yeast did not bind to the MFκB-82- 5, 9, 13 and 17), indicated by all lack of anti-ER antibody effect Did not bind to the ER (lanes 14-17) for the formation of the induced complex. Purified p50 bound to this fragment and was hypershifted by anti-p50 but anti-p65 Were not supershifted (compare lanes 4, 8 and 12).   Surprisingly, the complexes formed with the purified recombinant p50 are complex B and C I moved slowly. The use of low concentrations of purified p50 had no effect on transfer and This means that the band representing the p50 homodimer and the less sophisticated complex (Dake , Perkins, TF Kowalik, Schmidt, Huang (ES Huang), Baldwin and Navel (1993) RelA (p6 The dimerization of NF-κB accompanied by 5) was caused by DNA binding by IκBα (MAD-3). Regulates transcriptional activation and repression ”(“ Dimerization of NF-KB2 with Re lA (p65) regulates DNA binding, transcriptional activation, and inhibiti on by an I kappa B-alpha (MAD-3) ”),Moll. Cell Biol. 13: 131 5-1322). However, antibody shift experiments have The FκB proteins, both p50 and p65, are part of complexes B and C (Lanes 6, 7, 11 and 12) consequently both complexes are p50 homodimers Suggested that they should move more slowly (Urban, Shrek (R. Schreck) and Beauers (1991) "NFκB has p50 and p65 subtypes. Contact with DNA by unit heterodimer ”(“ NF-kappa B contacts DNA by a heterodimer of the p50 and p65 subunit ”),EMBO J. 10 : 1817-1825).   The proteins in complexes B and C are actually small proteins in p50 and p65. It may be relevant only immunologically, excluding the virus. With a homolog of p50 Speculation confirms that a p49 is part of a complex and is responsible for fast movement I couldn't do that. The purified p49 bound to the -82 to -47 IL-6 fragment. Although strongly cross-reacted with the anti-p50 antibody, the complex formed Migrated much more slowly than the 50 complex. This is the result obtained at other NFκB sites. Fruit (ducket, perkins, kowalik, schmidt, huang, ba Ludwin and Nabel (1993) "NF-κB with RelA (p65)". Dimerization of DNA by IκBα (MAD-3), activation of transcription and Adjust suppression ”,Moll. Cell Biol. 13: 1315-1322).   However, the finding that anti-p50 antibodies cross-react strongly with p49 was used. The antibodies used may detect other NFκB-related proteins in the complex. Alternatively, the movement of complexes B and C is due to the structural differences resulting from post-transcriptional modification. The migration was faster than that observed with the recombinant p50. It contains anti-p50 However, the absence of complexes B and C was due to the supershifted complex obtained with recombinant p50. A super-shifted complex (S1) that migrated more slowly than coalescence was produced (FIG. 5b, Lanes 6-8).   Close examination of the band shift results indicates that anti-p50 antibodies also have an effect on complex A. Was shown. As discussed previously, estradiol treatment increases the strength of complex C. Increases and decreases the strength of complex A (lanes 2 and 3). We anti-p5 0 was consistently observed to have a very similar effect: the antibody Specific strength of complex A formed from extracts from cells not treated with ladiol Cells with or without estradiol treatment These extracts were equal in intensity to the bands used (FIG. 5b, lanes 2 and 7). Compare). These results indicate that IL-1 and T in the absence of estradiol Band A induced by NFα has two distinct insoluble complexes, one of which is (A1) Induced also in the presence of stradiol and free of p50, the other (A2), p50 (Or an immunologically related protein).   Treatment with estradiol increases the strength of complex C at the expense of complex A2. May be. If complex A2 represents a more transcriptionally active state, This will explain the inhibitory effect of diols on IL-6 expression. TATA binding tamper Protein (TBP or TFIIDT) has been shown to interact directly with NFκB (Kale, Lanson, P. Wamsley, Schmidt, Boyer (T . G. FIG. Boyer), elephants (Q. Zhou), AJ Berk and Verma ( 1993) "The association between the proto-oncoprotein Rel and the TATA binding protein is Transmits transcriptional activation by NFκB ”(“ Association between proto-onc oprotein Rel and TATA-binding protein mediates transcriptional activatio n by NF-kappa B ”),Nature  365: 412-419). Therefore, the present inventor Were concerned whether TBP was involved in induced complex formation. However However, using anti-TBP antibodies we used T in complex A, B and C. No BP involvement could be detected.   Our antibody gel shift experiments showed that p65 did not affect all three observed complexes. Suggested to be a component. This particular protein is transactivated Is an NFκB element having an application domain (Schmitz, ML). And Beauere (1991) “p65 subunit is a strong transcriptional activity of NFκB. "The p65 subunit is responsible for the strong transcr iption activating potential of NF-kappa B ”),EMBO J. 10:38 05-3817). Transactivation function is different in different complexes It may be individually active. In the antibody shift experiment, estradiol reduced A2 complex. Less is suggested to increase complex C. A2 that moves slowly The complex may include other factors involved in the transactivation process. The TATA binding protein TBP (part of the TFIID complex) contains c-rel and It has been reported that it interacts strongly with p65 but not p50 or p49. (Kale, Lanson, Wamsley, Schmidt, Boyer, Elephant, Bar And Verma (1993) "Oncoprotein Rel and TATA binding tan. The relationship between proteins mediates the activation of transcription by NFκB ”,Nature  365 : 412-419). However, using TBP-specific antibodies we have At any part of the complex formed with NFκB in the IL-6 promoter No TBP could be detected.Embodiment 5 FIG. Potency testing of putative cytokine modulators   Methods for testing efficacy of putative cytokine modulators are provided. Each candidate drug Cell lines, animal models and controlled efficacy using methods known to those of skill in the art. Has been tested in the regulation of cytokine expression in clinical studies The Federal Register)47(No. 56): 12558-12564, 198 What was announced on March 23, 2008 (but not limited to) Recognized by the Food and Drug Administration .Embodiment 6 FIG. Toxicity testing of putative cytokine modulators   Drugs that are active in any of the above-listed methods are almost exclusively present in healthy cells. Or provide a method to determine if it has no effect. Such drugs Then use a pharmaceutically acceptable buffer or a buffer useful for standard animal testing. Formulated in fur.   "Pharmaceutically acceptable buffer" means for storage and subsequent administration Or a diluent pharmaceutical composition prepared in a pharmaceutically acceptable carrier (Including pharmaceutically effective amounts of the agents described herein). Refers to any buffer that can. An acceptable carrier for therapeutic use or Diluents are well known in the pharmaceutical arts, for example,Remington's Fur Matthewical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences ), Mac Publishing Co. (Gennaro (A. R. Gennaro), ed., 1985). Preservatives, stabilizers, dyes and Even a flavoring agent may be provided in the pharmaceutical composition. For example, cheap Esters of sodium benzoate, sorbic acid and p-hydroxybenzoic acid are representative May be added.the above, P. 1449. In addition, antioxidants and flotation Drugs may be used.the above.                 A. Further Screening for Toxicity: Method 1   Drugs identified as having cytokine-regulating activity in cultured human cells Evaluate for toxicity to vesicles. This evaluation was based on 2,3, -bis [2-methoxy-4 -Nitro-5-sulfonylphenyl] -5-[(phenylamino) carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide], otherwise referred to as XTT (Paul et al., Based on the ability of viable cells to reduceJ. Heterocyl. Chem.  25: 763-767 (1987); Weislow et al., (1) 989),J. Natl. Canc. Inst. 81: 577). Viable mammal Cells reductively cleave the NN bond in the tetrazole ring of XTT to form Mazan can be generated. Has dead cells or impaired energy metabolism Some cells cannot undergo this cleavage reaction. The degree of cleavage is directly proportional to the number of viable cells tested. For example. Cells from human cell lines, such as HeLa cells, were In the wells of the interplate, the cell culture medium (10% Dulbecco's modified essential medium supplemented with infant serum) 10 in 0.1 mlThreeSeeding at Cells are grown at 37 ° C. and 1 atmosphere 95% air and 5% CO 2TwoCulture by Can be glued to the rate. After overnight incubation, reduce the solution of the test substance by half Double addition to wells at a concentration representing og dilution (eight half-decade log dillutions) Add. At the same time, the solvent used for decomposition is added twice to the other wells. The culturing of the cells typically lasts some time for 24 hours. At the end of that period, XTT Each test for solution and coupler (methylphenazonium sulfate) Add to wells and incubate for an additional 4 hours in an automated plate reader Continue until the optimal density of each well at 450 nm is determined. Mammalian cells Substances that kill or impair its energy metabolism or its slow growth The substances to be tested are compared to the wells without any It is detected by a decrease in the optimal density at 450 nm.                 B. Further Screening for Toxicity: Method 2   Cytokine modulators as indicators of cell survival35S Methio Toxic effects on human cells cultured using incorporation of nin into protein Test. HeLa cells were treated with 10% fetal bovine serum and 50 μg / ml Grow in Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium supplemented with cylin and strepromycin Let Initially 10 cellsThreeSeed cells / well, 0.1 ml / well. site The cells are grown for 48 hours without contact with the cytokine modulator, then removed, Then, with a control well to which no cytokine modulator is given Initially, various dilutions of cytokine modulators prepared in complete medium were added to each well. To the bottle. The cells are incubated for a further 48-72 hours. Medium at 24:00 Change from time to time with fresh medium containing the same concentration of cytokine modulator. Replace. The medium is then removed and replaced with complete medium without antimicrobial agents. 24 hours for cells Incubation in the absence of cytokine modulators for35 Estimated by incorporation of S-methionine into protein. Remove the medium and remove Replace with complete medium without onin, then incubate for 30 minutes. Medium again Removed and then without methionine but 0.1 μCi / ml35Contains S methionine Replace with complete medium. Incubate the cells for 3 hours. Well 3 times with PBS Wash, then permeate cells by adding 100% methanol for 10 minutes . Add ice-cold 10% trichloroacetic acid (TCA) to the Welsh cup; Incubate the plate on ice for 10 minutes. Repeat this TCA cleaning twice more You. The wells are washed again with methanol and then air-dried. 50 μl scintillation Add the cocktail to each well and dry on the wells by centrifugation. Pre The sheet is used to expose the X-ray film. Auto with wells without antimicrobial A radiogram densitometer scan shows that 50% of the cells cannot survive (ID50 ) Used to determine the relative dosage (culture of animal cells) l Cells.). A manual of basic technique. ( 1987). R. Ian Freshney. John Willie And Sons, Inc. (John Wiley & Sons, Inc., New York).Embodiment 7 FIG. Administration of cytokine modulator   The present invention relates to a novel cytokine modulator characteristic found by the above method. Attach. The present invention relates to cytokine modulators that have been found as described above. New pharmaceutical compositions formulated into pharmaceutically acceptable dosage forms containing Including.   Further, the present invention provides for administering a therapeutically effective amount of a cytokine modulator. Suffered a pathological condition affected by cytokine levels Characterize the method of treating the specimen. Such administration can be any of those known to those of skill in the art. The method may be by local or systemic administration, for example.   A “therapeutically effective amount” is one or more of the disease or condition of the patient. It is the amount that relieves (to a certain extent) a sign. And a "therapeutically effective amount" Related to physiological or biochemical parameters, whether partial or complete. Or the amount that returns the cause of a mycosis or condition to normal. Generally, the amount is the E C50And depending on the age, size and disease of the patient, 1 nmo of the molecule between 1 and 1 μmol.   Other aspects of the invention are disclosed in the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 パイク，ジョン・ダブリュー アメリカ合衆国92024カリフォルニア州 エンシニタス、スプリングウッド・レイン 911番────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, C Z, EE, FI, GE, HU, IS, JP, KE, KG , KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, RO, R U, SD, SG, SI, SK, TJ, TT, UA, UZ , VN (72) Inventor Pike, John W.             United States 92024 California             Encinitas, Springwood Rain             911

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．潜在的な治療薬剤を細胞内受容体、プロモーターまたはｒｅｌ部位を有する 該プロモーターの一部および該プロモーター上の該ｒｅｌ部位に結合するタンパ ク質を含むシステムと接触させ、該プロモーター上の該ｒｅｌ部位に対する該タ ンパク質の結合を測定する（該薬剤の不在下での該タンパク質の結合に比較して 該プロモーター上の該ｒｅｌ部位に対する該タンパク質の結合の減少は該薬剤が 潜在的に該条件の処置に有用であることを示す）工程からなる、サイトカインの レベルによって影響される病理学的状態の処置のための治療薬剤のスクリーニン グ方法。 ２．該タンパク質がｒｅｌ様タンパク質である請求項１に記載の方法。 ３．該ｒｅｌ様タンパク質がＮＦκＢである請求項２に記載の方法。 ４．該システムに該細胞内受容体のリガンドをさらに含む請求項１に記載の方法 。 ５．該状態が骨粗鬆症である請求項１に記載の方法。 ６．該状態が慢性関節リウマチである請求項１に記載の方法。 ７．該状態が炎症である請求項１に記載の方法。 ８．該状態が乾癬である請求項１に記載の方法。 ９．該状態がカポジ肉腫である請求項１に記載の方法。 １０．該状態が敗血症性ショックである請求項１に記載の方法。 １１．該状態が多発性骨髄腫である請求項１に記載の方法。 １２．該細胞内受容体がステロイド受容体である請求項１に記載の方法。 １３．該細胞内受容体がエストロゲン受容体である請求項１に記載の方法。 １４．該細胞内受容体がレチノイド酸受容体、レチノイドＸ受容体、グルココル チコイド受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、甲状腺ホルモン 受容体およびビタミンＤ受容体よりなる群から選択される請求項１に記載の方法 。 １５．該測定にサイトカインまたは急性期タンパク質の発現レベルを決定するこ とを含む請求項１に記載の方法。 １６．該測定に該プロモーターに結合したリポーター遺伝子の発現レベルを決定 することを含む請求項１に記載の方法。 １７．該システムに該プロモーターのエフェクターをさらに含む請求項１に記載 の方法。 １８．該エフェクターが腫瘍壊死因子、インターロイキン−１、ウイルス、内毒 素、ホルボールエステル、上皮増殖因子、白血病阻害因子およびｃＡＭＰアゴニ ストよりなる群から選択される請求項１７に記載の方法。 １９．該サイトカインがインターロイキン−６である請求項１に記載の方法。 ２０．該サイトカインがインターロイキン−８である請求項１に記載の方法。 ２１．該システムが細胞である請求項１に記載の方法。 ２２．該システムが細胞の抽出物である請求項１に記載の方法。 ２３．該細胞内受容体がトランスフェクションしたベクターから発現している請 求項２１に記載の方法。 ２４．該プロモーターまたは該プロモーターの一部が該細胞にトランスフェクシ ョンされている請求項２１に記載の方法。[Claims] 1. Potential therapeutic agents with intracellular receptors, promoters or rel sites A portion of the promoter and a protein that binds to the rel site on the promoter And contact the system with the rel site on the promoter. Measure protein binding (compared to protein binding in the absence of the drug) Decreased binding of the protein to the rel site on the promoter is due to the Potentially useful for the treatment of said conditions). Screening of therapeutic agents for the treatment of pathological conditions affected by levels Method. 2. 2. The method according to claim 1, wherein said protein is a rel-like protein. 3. The method according to claim 2, wherein the rel-like protein is NFκB. 4. 2. The method of claim 1, wherein the system further comprises a ligand for the intracellular receptor. . 5. 2. The method of claim 1, wherein said condition is osteoporosis. 6. 2. The method of claim 1, wherein said condition is rheumatoid arthritis. 7. 2. The method of claim 1, wherein said condition is inflammation. 8. 2. The method according to claim 1, wherein said condition is psoriasis. 9. 2. The method of claim 1, wherein said condition is Kaposi's sarcoma. 10. 2. The method of claim 1, wherein said condition is septic shock. 11. 2. The method of claim 1, wherein said condition is multiple myeloma. 12. The method according to claim 1, wherein the intracellular receptor is a steroid receptor. 13. 2. The method according to claim 1, wherein said intracellular receptor is an estrogen receptor. 14． The intracellular receptor is a retinoid acid receptor, a retinoid X receptor, or glucocor; Ticoid receptor, progesterone receptor, androgen receptor, thyroid hormone 2. The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of a receptor and a vitamin D receptor. . 15. The level of expression of cytokines or acute phase proteins may be determined in the measurement. The method of claim 1, comprising: 16. Determine the expression level of the reporter gene bound to the promoter for the measurement The method of claim 1, comprising: 17． 2. The system of claim 1, wherein the system further comprises an effector of the promoter. the method of. 18. The effector is tumor necrosis factor, interleukin-1, virus, endotoxin Element, phorbol ester, epidermal growth factor, leukemia inhibitory factor and cAMP agoni 18. The method of claim 17, wherein the method is selected from the group consisting of a strike. 19. 2. The method according to claim 1, wherein said cytokine is interleukin-6. 20. 2. The method according to claim 1, wherein said cytokine is interleukin-8. 21. 2. The method of claim 1, wherein said system is a cell. 22. 2. The method of claim 1, wherein said system is an extract of cells. 23. Insulin expression of the intracellular receptor from a transfected vector 22. The method according to claim 21. 24. The promoter or a part of the promoter is transfected into the cell. 22. The method of claim 21, wherein the method is modified.
JP7529916A 1994-05-18 1995-05-15 Screening for cytokine modulators Pending JPH10500485A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US24547094A 1994-05-18 1994-05-18
US08/245,470 1994-05-18
PCT/US1995/006524 WO1995031722A1 (en) 1994-05-18 1995-05-15 Screening for cytokine modulators

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10500485A true JPH10500485A (en) 1998-01-13

Family

ID=22926786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7529916A Pending JPH10500485A (en) 1994-05-18 1995-05-15 Screening for cytokine modulators

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0765475A1 (en)
JP (1) JPH10500485A (en)
AU (1) AU2646295A (en)
CA (1) CA2190275A1 (en)
WO (1) WO1995031722A1 (en)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9424497D0 (en) * 1994-12-05 1995-01-25 Karobio Ab Reporter cell line
GB9608133D0 (en) * 1996-04-19 1996-06-26 Gemini International Holdings Diagnostic method and apparatus
US5728534A (en) * 1996-07-19 1998-03-17 New England Medical Center Hospitals, Inc. Methods for identifying cardiovascular therapeutic agents
US6692928B1 (en) 1996-07-19 2004-02-17 New England Medical Center Hospitals, Inc. Methods for identifying cardiovascular agents
AU7377196A (en) * 1996-09-27 1998-04-17 Jim Cai Steroid receptor binding compositions and steroid-sparing preparations thereof in immunosuppression and inflammation
EP0987552A3 (en) * 1998-08-31 2000-06-07 Pfizer Products Inc. Diarylsulfonylurea binding proteins
EP1158297A4 (en) * 1999-02-18 2002-04-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for screening compound having affinity for vitamin d receptor
AU2001275530A1 (en) 2000-06-08 2001-12-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibitors of c-reactive protein induced inflammation
CA2453399A1 (en) 2001-07-09 2003-01-23 Combinatorx, Incorporated Combinations for the treatment of inflammatory disorders
US20060051295A1 (en) * 2002-02-25 2006-03-09 Boersma Christine J C Estrogen receptor interaction with a transcription factor
WO2005030994A1 (en) 2003-09-26 2005-04-07 International Institute Of Molecular And Cell Biology In Warsaw Cells and methods useful in characterising the immunotoxic activity of xenobiotic substances
WO2005090282A1 (en) 2004-03-12 2005-09-29 Ligand Pharmaceuticals Incorporated Androgen receptor modulator compounds and methods
EP2511382A1 (en) * 2011-04-14 2012-10-17 Université de Strasbourg Process for identifying novel anti-inflammatory molecules with reduced direct transrepression of genes induced by glucocorticoids

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06502532A (en) * 1990-10-10 1994-03-24 ラ　ジョラ　キャンサー　リサーチ　ファウンデーション Method of transcription suppression using nuclear receptors

Also Published As

Publication number Publication date
CA2190275A1 (en) 1995-11-23
WO1995031722A1 (en) 1995-11-23
EP0765475A1 (en) 1997-04-02
AU2646295A (en) 1995-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Maruyama et al. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium
Srivastava et al. Estrogen blocks M-CSF gene expression and osteoclast formation by regulating phosphorylation of Egr-1 and its interaction with Sp-1.
Clark et al. The POU homeodomain transcription factor Oct-1 is essential for activity of the gonadotropin-releasing hormone neuron-specific enhancer
Bodor et al. cAMP inducibility of transcriptional repressor ICER in developing and mature human T lymphocytes.
Edbrooke et al. Identification of cis-acting sequences responsible for phorbol ester induction of human serum amyloid A gene expression via a nuclear factor κB-like transcription factor
Zemel et al. Agouti regulation of intracellular calcium: role in the insulin resistance of viable yellow mice.
Akira et al. NF-IL6 and NF-κB in cytokine gene regulation
Chen et al. The steroid receptor coactivator, GRIP-1, is necessary for MEF-2C-dependent gene expression and skeletal muscle differentiation
Scott et al. Molecular cloning of the bovine prolactin receptor and distribution of prolactin and growth hormone receptor transcripts in fetal and utero-placental tissues
JPH10500485A (en) Screening for cytokine modulators
Wissink et al. NF-κB/Rel family members regulating the ICAM-1 promoter in monocytic THP-1 cells
Wang et al. Groucho homologue Grg5 interacts with the transcription factor Runx2–Cbfa1 and modulates its activity during postnatal growth in mice
McKinsey et al. Transcription factor NF-κB regulates inducible CD83 gene expression in activated T lymphocytes
Felli et al. Retinoic acid-induced down-regulation of the interleukin-2 promoter via cis-regulatory sequences containing an octamer motif
Alemany et al. Transcriptional stimulation of the delta 1-crystallin gene by insulin-like growth factor I and insulin requires DNA cis elements in chicken.
JP2002525602A (en) GPR10 as a target for identifying compounds that modulate body weight
US5928881A (en) Method of identifying agonists and antagonist for CC-CKR5 receptor
Itoh et al. 17β-Estradiol induces IL-1α gene expression in rheumatoid fibroblast-like synovial cells through estrogen receptor α (ERα) and augmentation of transcriptional activity of Sp1 by dissociating histone deacetylase 2 from ERα
Tidwell et al. Characterization of a new ARID family transcription factor (Brightlike/ARID3C) that co-activates Bright/ARID3A-mediated immunoglobulin gene transcription
Devlin et al. HCaRG is a novel regulator of renal epithelial cell growth and differentiation causing G2M arrest
Khromykh et al. Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells
Merola et al. The κB enhancer of the human interleukin-6 promoter is necessary and sufficient to confer an IL-1β and TNF-α response in transfected human cell lines: Requirement for members of the C/EBP family for activity
Saisanit et al. Regulation of the pro-B-cell-specific enhancer of the Id1 gene involves the C/EBP family of proteins
JP2002506004A (en) Methods and compositions for modulating leptin activity
Miyazawa et al. IL-6 synthesis by rheumatoid synoviocytes is autonomously upregulated at the transcriptional level