JPH10313899A - Identification of microorganism - Google Patents
Identification of microorganismInfo
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- JPH10313899A JPH10313899A JP14451197A JP14451197A JPH10313899A JP H10313899 A JPH10313899 A JP H10313899A JP 14451197 A JP14451197 A JP 14451197A JP 14451197 A JP14451197 A JP 14451197A JP H10313899 A JPH10313899 A JP H10313899A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ビール混濁菌であ
るラクトバチルス属の菌、特にラクトバチルスブレビ
ス、ラクトバチルス プランタラム、ラクトバチルス
カゼイ、ラクトバチルス リンドネリ、ラクトバチルス
コリニフォルミスを同定するための方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a bacterium belonging to the genus Lactobacillus, which is a beer turbidity bacterium, especially Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus.
The present invention relates to a method for identifying Lactobacillus casei, Lactobacillus lindneri, and Lactobacillus coriniformis.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ラクトバチルス属菌は、ビール混濁菌の
一種で、グラム染色陽性、カタラーゼ陰性の非運動性桿
菌である。このラクトバチルス属菌の検出については、
各方面からの検討されてきており、例えば、オリゴヌク
レオチド プライマーを用いたRAPD-PCR法によりラクト
バチルス属細菌を検出する方法（Thomas, A. J. Amer.
Soc. Brew. Chem., Vol. 54 p91 1996）や、抗体を用い
て選択的に検出する方法（特開平６−３１１８９４、特
開平６−３１１８９５等）などが報告されている。2. Description of the Related Art Lactobacillus spp. Is a kind of beer turbidity bacterium and is a non-motile bacillus that is positive for Gram staining and negative for catalase. Regarding the detection of this Lactobacillus genus,
Various methods have been studied, for example, a method of detecting Lactobacillus bacteria by RAPD-PCR using oligonucleotide primers (Thomas, AJ Amer.
Soc. Brew. Chem., Vol. 54 p91 1996) and methods for selective detection using antibodies (JP-A-6-31894, JP-A-6-31895, etc.) have been reported.
【０００３】しかし、これらの方法は全て種（specie
s）を特定するもので、株（strain）を特定できるもの
ではない。前記のような株の特定に対応できる技術とし
て、本発明では、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ、restri
ction fragment length polymorphism）について検討を
加えた。この制限断片長多形性とは、制限酵素によって
切断された断片のパターンの解析であり、バンドパター
ンを電気泳動により検出して比較検討するものである。
この制限断片長多形性を利用した遺伝子型の決定法とし
ては、特開昭６２−１１１６９９、特表平６−５１１３
８０、特開平７−５９５６８、特開平７−５９５７７な
どがあり、すでに医薬、植物、飲食品の分野で利用され
ている。このうち、リボソームＲＮＡ遺伝子の多型性に
着目したものを、リボタイピングと称している。この方
法によれば、試験に供する菌株の種（species）、亜種
（subspeices）、株（strain）のレベルでの同定が可能
となることが報告されている。[0003] However, all of these methods are species (specie).
It specifies s), but not strain. As a technique capable of coping with the above-described strain identification, the present invention employs restriction fragment length polymorphism (RFLP, restri
ction fragment length polymorphism). The restriction fragment length polymorphism is an analysis of a pattern of a fragment cleaved by a restriction enzyme, and a band pattern is detected by electrophoresis and compared with each other.
A method for determining a genotype utilizing the restriction fragment length polymorphism is described in JP-A-62-111699 and JP-A-6-5113.
80, JP-A-7-59568, JP-A-7-59577, and the like, which are already used in the fields of medicine, plants, and foods and beverages. Among them, those focusing on the polymorphism of the ribosomal RNA gene are called ribotyping. It has been reported that this method enables identification at the level of the species, subspeices, and strain of the strain to be tested.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このリボタ
イピングを利用した判定法を利用して、ビール混濁菌で
あるラクトバチルス属の菌、特にラクトバチルス ブレ
ビス、ラクトバチルスプランタラム、ラクトバチルス
カゼイ、ラクトバチルス リンドネリ、ラクトバチルス
コリニフォルミスを同定することを課題とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method of lactobacillus, which is a beer turbidity bacterium, particularly Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum,
The objective is to identify Lactobacillus casei, Lactobacillus lindneri and Lactobacillus coriniformis.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は制限断片
長多形性を利用した遺伝子型の決定法において、リボタ
イピングでハイブリダイズするＤＮＡ断片を比較してラ
クトバチルス属菌の存在を同定することを特徴とする微
生物の同定法である。リボタイピングによる同定方法は
すでに公知の方法（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.
92, pp5229, 1995、 J. CLIN. MICROBIOL., VOL.34, N
O.9, 2294-2296, 1996）に基づき実施することができ
る。基本となる操作方法は次のとおりである。すなわ
ち、細菌から全ＤＮＡを抽出し、制限酵素を用いて切断
する。その後、アガロースゲル電気泳動を行い、切断さ
れたＤＮＡ断片は大きさによって分離される。膜に転写
されたＤＮＡを１本鎖化して適当なプローブを用いてサ
ザンブロッテイング法によってハイブリダイゼーション
を行い、洗浄後標識をし、標識に基づきプローブがつい
た部分が確認される。That is, the present invention relates to a method for determining a genotype utilizing restriction fragment length polymorphism, wherein DNA fragments hybridized by ribotyping are compared to identify the presence of a genus Lactobacillus. This is a method for identifying a microorganism. The identification method by ribotyping is a known method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.
92, pp5229, 1995, J. CLIN. MICROBIOL., VOL. 34, N
O.9, 2294-2296, 1996). The basic operation method is as follows. That is, total DNA is extracted from the bacterium and cut with a restriction enzyme. Thereafter, agarose gel electrophoresis is performed, and the cut DNA fragments are separated according to size. The DNA transcribed on the membrane is made into a single strand, hybridized by a Southern blotting method using an appropriate probe, labeled after washing, and the portion with the probe is confirmed based on the label.
【０００６】この基本操作方法をもとに、本発明ではビ
ール混濁菌であるラクトバチルス属菌の同定方法を完成
した。本方法についてさらに詳しく説明する。Based on this basic operation method, the present invention has completed a method for identifying Lactobacillus sp., Which is a beer turbidity bacterium. The method will be described in more detail.
【０００７】[0007]
【発明の実施の形態】ラクトバチルス属菌は全ＤＮＡを
抽出するにあたって、MRS培地（Merck）で25℃、3日間
嫌気条件下で増殖させた後、菌体を滅菌蒸留水にて洗浄
し、遠心回収した。ＤＮＡ抽出は、リゾチーム、N-アセ
チルムラミダーゼにて細胞壁を溶解後、プロテイナーゼ
Kで蛋白質の分解を行った。その後、クロロホルム／イ
ソペンタノール抽出後、RNaseによるＲＮＡ分解、再び
クロロホルム／イソペンタノール抽出を経て、冷エタノ
ールにより、ＤＮＡを沈殿させ、回収した。最終精製と
してCHROMA SPINTM Columns（CLONTECH）を用いた。制
限酵素による処理方法、アガロースゲル電気泳動は、サ
ザンブロッテイング法は、Molecular Cloning （second
edition, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis
(ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載
されている通常の方法を用いておこなった。プローブ
は、大腸菌のリボソームＲＮＡ遺伝子を用いておこなっ
た。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Lactobacillus spp. Is grown in an MRS medium (Merck) at 25 ° C. for 3 days under anaerobic conditions to extract total DNA, and the cells are washed with sterile distilled water. Collected by centrifugation. DNA extraction was performed by lysing the cell wall with lysozyme and N-acetylmuramidase, followed by proteinase
Protein degradation was performed with K. Thereafter, after extraction with chloroform / isopentanol, RNA degradation by RNase and chloroform / isopentanol extraction again were performed, and DNA was precipitated and recovered with cold ethanol. CHROMA SPINTM Columns (CLONTECH) was used for final purification. Restriction enzyme treatment, agarose gel electrophoresis, Southern blotting, Molecular Cloning (second
edition, J. Sambrook, EF Fritsch, T. Maniatis
(ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press). The probe was performed using the ribosomal RNA gene of E. coli.
【０００８】なお、最近では菌の培養以降の工程をすべ
て機械で自動的に行うことが可能である。例えば、機械
としてはクオリコン社のRiboPrinterTM Microbial Cha
racterization System（Qualicon L.L.C., USA）があ
る。しかし、もちろん手動でこれらの試験を行っても差
し支えないが、効率的、精度的あるいは再現性に注意を
要する。[0008] In recent years, it is possible to automatically perform all the steps after the cultivation of the bacteria with a machine. For example, as a machine, the RiboPrinter TM Microbial Cha
racterization System (Qualicon LLC, USA). However, it is of course possible to perform these tests manually, but attention must be paid to efficiency, accuracy, and reproducibility.
【０００９】これらの手法により多数のラクトバチルス
属菌を分析した結果、株毎に特異なパターンを示すと同
時にラクトバチルス ブレビス、ラクトバチルス プラ
ンタラム、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチルス
リンドネリ、ラクトバチルスコリニフォルミスを同定す
ることが可能なバンドが確認された。従って、これらの
種特異的な共通バンドに注目することにより、試験菌を
ラクトバチルス ブレビス、ラクトバチルス プランタ
ラム、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチルス リン
ドネリ、ラクトバチルス コリニフォルミスか否かの同
定ができる。As a result of analyzing a large number of Lactobacillus strains by these techniques, a specific pattern is shown for each strain and Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus
Bands capable of identifying Lindonelli and Lactobacillus coliniformis were confirmed. Therefore, by paying attention to these species-specific common bands, it is possible to identify whether or not the test strain is Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus lindneri, or Lactobacillus coriniformis.
【００１０】ラクトバチルス ブレビスで確認される共
通のバンドとして、3〜4、4〜5、6〜8kbpにあり、さら
に2〜3または30〜40kbpのバンドがある。ラクトバチル
スプランタラムで確認される共通のバンドとして、0〜
1、2〜3、4、6kbpにあり、さらに7または9kbpのバンド
がある。ラクトバチルス カゼイで確認される共通のバ
ンドとして、4、5、6〜7、10〜20、20〜30、30〜40kbp
のバンドがある。ラクトバチルス リンドネリで確認さ
れる共通のバンドとして8〜9、10〜20、20〜35kbpのバ
ンドがある。さらに、ラクトバチルス コリニフォルミ
スで確認される共通のバンドとして、3〜4、5〜6、8〜
9、10〜20kbpのバンドがある。[0010] Common bands identified in Lactobacillus brevis include bands at 3-4, 4-5, 6-8 kbp, and further 2-3 or 30-40 kbp. Common bands identified in Lactobacillus plantarum, 0-
There are bands at 1, 2-3, 4, 6 kbp, plus 7 or 9 kbp. Common bands identified in Lactobacillus casei include 4, 5, 6-7, 10-20, 20-30, 30-40 kbp
There is a band. Common bands identified in Lactobacillus lindneri include bands at 8-9, 10-20, and 20-35 kbp. Furthermore, as common bands confirmed in Lactobacillus coriniformis, 3-4, 5-6, 8-
There is a band of 9, 10-20 kbp.
【００１１】[0011]
【実施例】以下、具体的な実施例をもって本発明を説明
する。 実施例１ ラクトバチルス ブレビス、ラクトバチルス
プランタラム、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチ
ルス リンドネリ、ラクトバチルス コリニフォルミス
のリボタイピングでの共通バンドの確認 10mlの液体培地で増殖させたラクトバチルス ブレビ
ス、ラクトバチルス プランタラム、ラクトバチルス
カゼイ、ラクトバチルス リンドネリ、ラクトバチルス
コリニフォルミスを4℃、3500rpm、10分間で遠心した
後、10mlの滅菌蒸留水に懸濁し、再度4℃、3500rpm、10
分間遠心し菌体を回収した。次に1mlの懸濁緩衝液（10m
M Tris-HCl，1mM EDTA，0.35Mスクロース pH8.0）に懸
濁し、リゾチームを1mg/ml、N-アセチルムラミダーゼを
50μg/mlになるように添加し、37℃、1時間インキュベ
ートを行った。2mlの2×CTAB（0.1M Tris-HCl，1.5M Na
Cl，20mM EDTA，2% CTAB，2% 2-メルカプトエタノール,
pH8.0）を加え、プロテイナーゼ Kを80μg/mlとなるよ
うに添加し、50℃、2時間インキュベートした。2mlのク
ロロフォルム−イソペンタノール（97:3）を加え、20分
間懸濁振とうした後、室温で3500rp、10分間遠心した。
上部の水層を別のチューブに移し、これに2mlのクロロ
フォルム−イソペンタノール（97:3）を加え、20分間懸
濁振とうした後、室温で3500rpm、10分間遠心した。こ
の操作を計２回行った。上部の水層に、等量の2-プロパ
ノールを添加し、氷上で１時間以上静置した。4℃で350
0rpm、10分間遠心して上清を捨てた後、沈殿物に2mlの7
0％エタノールを添加し、4℃で3500rpm、10分間遠心し
て上清を捨てた。沈殿したＤＮＡを30分間減圧乾燥を行
った後、0.5ml TE（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0）
に溶解し、RNaseAを500μg/mlとなるように添加して、3
7℃で1時間インキュベートを行った。The present invention will be described below with reference to specific examples. Example 1 Confirmation of common band in ribotyping of Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus coriniformis Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum grown in 10 ml liquid medium , Lactobacillus
Casei, Lactobacillus lindoneli and Lactobacillus coriniformis were centrifuged at 4500C and 3500 rpm for 10 minutes, then suspended in 10 ml of sterile distilled water, and again suspended at 4 ° C and 3500 rpm and 10 minutes.
After centrifugation for minutes, the cells were collected. Then 1 ml of suspension buffer (10m
M Tris-HCl, 1mM EDTA, 0.35M sucrose pH 8.0), lysozyme 1mg / ml, N-acetylmuramidase
It was added to 50 μg / ml and incubated at 37 ° C. for 1 hour. 2 ml of 2 × CTAB (0.1 M Tris-HCl, 1.5 M Na
Cl, 20mM EDTA, 2% CTAB, 2% 2-mercaptoethanol,
pH 8.0), proteinase K was added to a concentration of 80 μg / ml, and the mixture was incubated at 50 ° C. for 2 hours. 2 ml of chloroform-isopentanol (97: 3) was added, the suspension was shaken for 20 minutes, and then centrifuged at 3500 rp for 10 minutes at room temperature.
The upper aqueous layer was transferred to another tube, and 2 ml of chloroform-isopentanol (97: 3) was added thereto. The suspension was shaken for 20 minutes and then centrifuged at 3500 rpm at room temperature for 10 minutes. This operation was performed twice in total. An equal amount of 2-propanol was added to the upper aqueous layer, and the mixture was allowed to stand on ice for 1 hour or more. 350 at 4 ° C
Centrifuge at 0 rpm for 10 minutes and discard the supernatant.
0% ethanol was added, and the mixture was centrifuged at 3500 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was discarded. The precipitated DNA was dried under reduced pressure for 30 minutes, and then 0.5 ml TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
And RNaseA was added to a concentration of 500 μg / ml.
Incubation was performed at 7 ° C for 1 hour.
【００１２】次に0.5mlのクロロフォルム−イソペンタ
ノール（97:3）を加え、5分間懸濁振とうした後、室温
で3500rpm、10分間遠心した。上部の水層に0.5mlのクロ
ロフォルム−イソペンタノール（97:3）を加え、５分間
懸濁振とうした後、室温で3500rpm、10分間遠心した。
この操作を計２回行った。上清に50μlの3M酢酸ナトリ
ウム（pH5.2）を添加し、1mlの冷却エタノール（99.5
%）を添加し、-20℃で1時間以上静置した。14000rpm、5
分間遠心した後、上清を捨て、沈殿したＤＮＡに1mlの
冷却エタノール（70%）を添加し、14000rpm、5分間遠心
した後、上清を捨て、15分間減圧乾燥を行った。100μl
のTE（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)に溶解し、CHR
OMA SPINカラム（CLONTECH, TOYOBO）を用い、最終精製
を行った。Next, 0.5 ml of chloroform-isopentanol (97: 3) was added, the suspension was shaken for 5 minutes, and then centrifuged at room temperature at 3,500 rpm for 10 minutes. 0.5 ml of chloroform-isopentanol (97: 3) was added to the upper aqueous layer, suspended and shaken for 5 minutes, and then centrifuged at room temperature at 3500 rpm for 10 minutes.
This operation was performed twice in total. 50 μl of 3M sodium acetate (pH 5.2) was added to the supernatant, and 1 ml of cold ethanol (99.5%) was added.
%) And allowed to stand at -20 ° C for 1 hour or more. 14000 rpm, 5
After centrifugation for 1 minute, the supernatant was discarded, 1 ml of cold ethanol (70%) was added to the precipitated DNA, and the mixture was centrifuged at 14000 rpm for 5 minutes. Then, the supernatant was discarded and dried under reduced pressure for 15 minutes. 100 μl
Dissolved in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
Final purification was performed using an OMA SPIN column (CLONTECH, TOYOBO).
【００１３】得られたＤＮＡをEcoRI処理し、その300ng
を1%アガロースゲル（Nusieve 3.1,TBE）にて50V、１時
間、室温で電気泳動を行った。エチジウムブロマイド染
色により、泳動バンドを確認した後、そのゲルを脱プリ
ン溶液（250mM HCl）に浸し15分間穏やかに振とうした
後、蒸留水を３回交換して洗浄した。つぎに変性溶液
（1.5M NaCl, 0.5M NaOH）にゲルを浸し、15分間穏やか
に振とうした後、蒸留水を3回交換して洗浄した。つぎ
に中和溶液（1.5M NaCl, 0.5M Tris-Hcl pH7.5）にゲル
を浸し、20分間穏やかに振とうした。さらに中和溶液を
交換し、同様の操作を行った。このゲルにナイロンメン
ブラン（Hybond-N+, Amersham）を重ね合わせ、アルカ
リブロッティングを行った。このメンブランをハイブリ
ダイゼーション溶液（5×SSC；1%(w/v)ブロッキング試
薬, 0.1%(w/v) N-ラウロイルサルコシン, 0.2%(w/v) SD
S）の入ったプラスチックバッグに入れてシールし、68
℃で1時間以上振とうしながらインキュベートした。次
に、ジゴキシゲニン標識した大腸菌のrRNA遺伝子を熱変
性し、ハイブリダイゼーション溶液に10ng/mlとなるよ
うに加え、68℃、16時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。洗浄溶液Ｉ（0.1%(w/v)SDS, 2×SSC）にて室温で5
分間メンブランを洗浄した後、予め68℃に加温した洗浄
溶液II（0.1%(w/v) SDS,0.1×SSC）で15分間洗浄し、さ
らに新しい洗浄溶液IIに交換して15分間洗浄した。The obtained DNA is treated with EcoRI, and 300 ng thereof is treated.
Was electrophoresed on a 1% agarose gel (Nusieve 3.1, TBE) at 50 V for 1 hour at room temperature. After confirming the migration band by ethidium bromide staining, the gel was immersed in a depurinated solution (250 mM HCl), gently shaken for 15 minutes, and then washed by changing distilled water three times. Next, the gel was immersed in a denaturing solution (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH), gently shaken for 15 minutes, and then washed by changing distilled water three times. Next, the gel was immersed in a neutralization solution (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-Hcl pH 7.5) and gently shaken for 20 minutes. Further, the neutralizing solution was replaced, and the same operation was performed. A nylon membrane (Hybond-N + , Amersham) was overlaid on the gel, and alkali blotting was performed. This membrane was mixed with a hybridization solution (5 × SSC; 1% (w / v) blocking reagent, 0.1% (w / v) N-lauroyl sarcosine, 0.2% (w / v) SD
Place in a plastic bag containing S) and seal
Incubate at ° C with shaking for 1 hour or more. Next, the digoxigenin-labeled rRNA gene of Escherichia coli was heat-denatured, added to the hybridization solution at 10 ng / ml, and hybridized at 68 ° C. for 16 hours. Washing solution I (0.1% (w / v) SDS, 2 × SSC) at room temperature
After washing the membrane for 15 minutes, the membrane was washed for 15 minutes with a washing solution II (0.1% (w / v) SDS, 0.1 × SSC) preheated to 68 ° C., and further replaced with a new washing solution II for washing for 15 minutes. .
【００１４】次に、0.3%（w/v）Tween20含むマレイン酸
緩衝液（0.1Mマレイン酸, 0.15M NaCl, pH7.5）で1分間
穏やかに洗浄した後、ブロッキング溶液（1%(w/v)ブロ
ッキング試薬（ベーリンガーマンハイム)を含むマレイ
ン酸溶液）で30分間室温でインキュベートした後、抗ジ
ゴキシゲニン−アルカリフォスファターゼ複合体を150m
U/mlとなるように加え、30分間室温で反応させた。次に
マレイン酸緩衝液で15分間の洗浄を2回行い、トリス緩
衝液（0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 50mM MgCl2pH9.5）
に2分間浸し、発光基質（CSPD, ベーリンガーマンハイ
ム）をトリス緩衝液で100倍希釈したものをメンブラン
のＤＮＡ面に添加し、X線フィルムに感光した。Next, after gently washing for 1 minute with a maleic acid buffer (0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, pH 7.5) containing 0.3% (w / v) Tween 20, the blocking solution (1% (w / v) v) After incubating for 30 minutes at room temperature with a maleic acid solution containing a blocking reagent (Boehringer Mannheim), the anti-digoxigenin-alkaline phosphatase complex was
U / ml and reacted at room temperature for 30 minutes. Next, washing is performed twice with a maleic acid buffer for 15 minutes, and a Tris buffer (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl 2 pH 9.5) is used.
The plate was immersed for 2 minutes in the sample, and a luminescent substrate (CSPD, Boehringer Mannheim) diluted 100-fold with Tris buffer was added to the DNA surface of the membrane, and exposed to an X-ray film.
【００１５】実施例２ 1.5％（w/v）寒天を含む平板培地上にラクトバチルス属
菌のコロニーを形成させた後、そのコロニーを釣菌し
て、試料緩衝液（RiboPrinterTM専用試薬）に10８cells
/mlとなるように懸濁した後、熱処理ステーション（Rib
oPrinterTM付属装置）で加熱冷却後、その菌懸濁液30μ
ｌにLysing Agent A, B（いずれもRiboPrinterTM専用
試薬）をそれぞれ5μｌ添加し、RiboPrinterTM Microb
ial Characterization System（Qualicon L.L.C. US
A）にて分析を行った。Example 2 After a colony of Lactobacillus sp. Was formed on a plate medium containing 1.5% (w / v) agar, the colony was picked up and placed in a sample buffer (reagent for RiboPrinter ™ ). 108 cells
/ ml, and heat treatment station (Rib
After heating and cooling with the oPrinter TM accessory device, the bacterial suspension 30μ
respectively 5μl added Lysing Agent A, B (both RiboPrinter TM special reagent) in l, RiboPrinter TM Microb
ial Characterization System (Qualicon LLC US
The analysis was performed in A).
【００１６】図の説明 ラクトバチルス属細菌のリボタイピングの結果 図１、２、３、４、５はクオリコン社のRiboPrinterTM
Microbial Characterization System（Qualicon L.L.
C., USA）を用いておこなった結果である。図から明ら
かなようにラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus
brevis）で確認される共通のバンドとして、3〜4、4
〜5、6〜8kbpにあり、さらに2〜3または30〜40kbpにバ
ンドが、ラクトバチルス プランタラム（Lactobacillu
s plantarum）で確認される共通のバンドとして、0〜
1、2〜3、4、6kbpにあり、さらに7または9kbpにバンド
が、ラクトバチルス カゼイ（Lactobacillus casei）
で確認される共通のバンドとして、4、5、6〜7、10〜2
0、20〜30、30〜40kbpにバンドが、ラクトバチルス リ
ンドネリ（Lactobacillus lindneri）で確認される共
通のバンドとして、8〜9、10〜20、20〜35kbpにバンド
が、ラクトバチルス コリニフォルミス（Lactobacillu
s coryniformis）で確認される共通のバンドとして、3
〜4、5〜6、8〜9、10〜20kbpにバンドが、観察された。Description of the Figures Results of Ribotyping of Lactobacillus Bacteria FIGS. 1, 2, 3, 4, and 5 show RiboPrinter ™ manufactured by Qualicon.
Microbial Characterization System (Qualicon LL
C., USA). As is clear from the figure, Lactobacillus brevis (Lactobacillus
brevis), 3-4, 4
-5, 6-8 kbp, and a band at 2-3 or 30-40 kbp, Lactobacillus plantarum (Lactobacillu
s plantarum), 0-
Lactobacillus casei has bands at 1, 2-3, 4, and 6 kbp, and at 7 or 9 kbp
4, 5, 6-7, 10-2 as common bands confirmed in
Bands at 0, 20-30, 30-40 kbp and Lactobacillus lindneri as common bands confirmed in 8-9, 10-20, 20-35 kbp, Lactobacillus coriniformis ( Lactobacillu
s coryniformis), 3
Bands at ~ 4, 5-6, 8-9, 10-20 kbp were observed.
【００１７】従って、これらの共通のバンドパターンを
利用すると、ラクトバチルス ブレビス、ラクトバチル
ス プランタラム、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバ
チルス リンドネリ、ラクトバチルス コリニフォルミ
スを同定することが可能である。Therefore, using these common band patterns, it is possible to identify Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus lindneri, and Lactobacillus coriniformis.
【図１】ラクトバチル属細菌ラクトバチルス ブレビス
のリボタイピングの結果を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the results of ribotyping of Lactobacillus brevis bacteria.
【図２】ラクトバチル属細菌ラクトバチルス プランタ
ラムのリボタイピングの結果を示す図である。FIG. 2 shows the results of ribotyping of Lactobacillus plantarum bacteria of the genus Lactobacillus.
【図３】ラクトバチル属細菌ラクトバチルス カゼイの
リボタイピングの結果を示す図である。FIG. 3 shows the results of ribotyping of Lactobacillus casei.
【図４】ラクトバチル属細菌ラクトバチルス リンドネ
リのリボタイピングの結果を示す図である。FIG. 4 shows the results of ribotyping of Lactobacillus bacterium Lactobacillus lindoneli.
【図５】ラクトバチル属細菌ラクトバチルス コリニフ
ォルミスのリボタイピングの結果を示す図である。FIG. 5 shows the results of ribotyping of Lactobacillus bacterium Lactobacillus coriniformis.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 坂井 和久 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社酒類研究所内 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (72) Inventor Kazuhisa Sakai 2-13-1 Omorikita, Ota-ku, Tokyo Asahi Breweries, Ltd.
Claims (7)
定法において、リボタイピングでハイブリダイズするＤ
ＮＡ断片を比較してラクトバチルス属細菌の存在を同定
することを特徴とする微生物の同定法。The present invention relates to a method for determining a genotype utilizing restriction fragment length polymorphism.
A method for identifying a microorganism, comprising comparing NA fragments to identify the presence of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus.
定法において、制限酵素EcoRI処理により得られるＤＮ
Ａ断片を比較してラクトバチルス属細菌の存在を同定す
ることを特徴とする微生物の同定法。2. A method for determining a genotype utilizing restriction fragment length polymorphism, wherein DN obtained by restriction enzyme EcoRI treatment is used.
A method for identifying a microorganism, comprising comparing the A fragments to identify the presence of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus.
ブレビス（Lactobacillus brevis）であり、リボタイ
ピングでハイブリダイズするＤＮＡ断片が制限酵素EcoR
Iで処理した場合、3〜4、4〜5、6〜8kbpにあり、さらに
2〜3または30〜40kbpに存在することを確認して同定す
ることを特徴とする請求項１記載の同定法。3. The bacterium of the genus Lactobacillus is Lactobacillus.
Brevis (Lactobacillus brevis), a DNA fragment that hybridizes by ribotyping is a restriction enzyme EcoR
When treated with I, it is at 3-4, 4-5, 6-8 kbp, and
2. The identification method according to claim 1, wherein the identification is carried out by confirming that it exists at 2-3 or 30-40 kbp.
プランタラム（Lactobacillus plantarum）であり、リ
ボタイピングでハイブリダイズするＤＮＡ断片が制限酵
素EcoRIで処理した場合、0〜1、2〜3、4、6kbpにあり、
さらに7または9kbpに存在することを確認して同定する
ことを特徴とする請求項１記載の同定法。4. The bacterium of the genus Lactobacillus is Lactobacillus.
Plantarum (Lactobacillus plantarum), when the DNA fragment to be hybridized by ribotyping is treated with the restriction enzyme EcoRI, it is in 0-1, 2, 3, 4, 6 kbp,
2. The identification method according to claim 1, wherein the identification is further performed by confirming the presence at 7 or 9 kbp.
カゼイ（Lactobacillus casei）であり、リボタイピン
グでハイブリダイズするＤＮＡ断片が制限酵素EcoRIで
処理した場合、4、5、6〜7、10〜20、20〜30、30〜40kb
pに存在することを確認して同定することを特徴とする
請求項１記載の同定法。5. The bacterium of the genus Lactobacillus is Lactobacillus.
Case 5 (Lactobacillus casei), when the DNA fragment hybridized by ribotyping was treated with the restriction enzyme EcoRI, 4, 5, 6-7, 10-20, 20-30, 30-40 kb
2. The identification method according to claim 1, wherein the identification is performed by confirming the presence of p.
リンドネリ（Lactobacillus lindneri）であり、リボ
タイピングでハイブリダイズするＤＮＡ断片が制限酵素
EcoRIで処理した場合、8〜9、10〜20、20〜35kbpに存在
することを確認して同定することを特徴とする請求項１
記載の同定法。6. The bacterium of the genus Lactobacillus is Lactobacillus.
DNA fragment that hybridizes by ribotyping is restriction enzyme (Lactobacillus lindneri)
When treated with EcoRI, identification is carried out by confirming that it is present at 8 to 9, 10 to 20, and 20 to 35 kbp.
The described identification method.
コリニフォルミス（Lactobacilluscoryniformis）であ
り、リボタイピングでハイブリダイズするＤＮＡ断片が
制限酵素EcoRIで処理した場合、3〜4、5〜6、8〜9、10
〜20kbpに存在することを確認して同定することを特徴
とする請求項１記載の同定法。7. The bacterium of the genus Lactobacillus is Lactobacillus.
Coryneformis (Lactobacilluscoryniformis), and when a DNA fragment hybridized by ribotyping is treated with a restriction enzyme EcoRI, 3-4, 5-6, 8-9, 10
2. The identification method according to claim 1, wherein the identification is carried out by confirming that it is present at 2020 kbp.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14451197A JPH10313899A (en) | 1997-05-20 | 1997-05-20 | Identification of microorganism |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14451197A JPH10313899A (en) | 1997-05-20 | 1997-05-20 | Identification of microorganism |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10313899A true JPH10313899A (en) | 1998-12-02 |
Family
ID=15364067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14451197A Pending JPH10313899A (en) | 1997-05-20 | 1997-05-20 | Identification of microorganism |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10313899A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002034572A (en) * | 2000-07-28 | 2002-02-05 | Asahi Breweries Ltd | Base sequence for detecting lactobacillus casei, and method for detecting the bacterium |
| CN110982736A (en) * | 2019-11-28 | 2020-04-10 | 中国农业科学院饲料研究所 | Food-derived extracellular polysaccharide-producing lactobacillus corynebacteria and application thereof |
-
1997
- 1997-05-20 JP JP14451197A patent/JPH10313899A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002034572A (en) * | 2000-07-28 | 2002-02-05 | Asahi Breweries Ltd | Base sequence for detecting lactobacillus casei, and method for detecting the bacterium |
| CN110982736A (en) * | 2019-11-28 | 2020-04-10 | 中国农业科学院饲料研究所 | Food-derived extracellular polysaccharide-producing lactobacillus corynebacteria and application thereof |
| CN110982736B (en) * | 2019-11-28 | 2021-09-24 | 中国农业科学院饲料研究所 | Food-derived extracellular polysaccharide-producing lactobacillus corynebacteria and application thereof |
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