JPH10280182A - Protein fixed modifying electrode - Google Patents
Protein fixed modifying electrodeInfo
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- JPH10280182A JPH10280182A JP9093301A JP9330197A JPH10280182A JP H10280182 A JPH10280182 A JP H10280182A JP 9093301 A JP9093301 A JP 9093301A JP 9330197 A JP9330197 A JP 9330197A JP H10280182 A JPH10280182 A JP H10280182A
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、生体材料を用いて
構成された電極に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an electrode formed using a biomaterial.
【０００２】[0002]
【従来の技術】これまでに電極上へのタンパク質の固定
については、数多くの試みがなされている。その方法と
して例えば、電極に直接タンパク質を吸着させる、ある
いは電極に化学的結合種を固定した後、その結合種を介
してタンパク質を固定させることなどであった。これら
の方法では、結果的に電極表面上が全てタンパク質で覆
われることになり、タンパク質の固定様式が一様になら
ない。2. Description of the Related Art Many attempts have been made to immobilize proteins on electrodes. Examples of such a method include directly adsorbing a protein to an electrode, or immobilizing a protein via a chemically bonded species after immobilizing the chemically bonded species on the electrode. In these methods, as a result, the entire electrode surface is covered with the protein, and the mode of immobilizing the protein is not uniform.
【０００３】例えば、特開平５−１３３７９５号公報で
は、脂質二重層中に生体物質及び生体類似物質の双方又
は一方と、電位感受性イオンチャンネルと、生体応答性
物質、例えばバクテリオロドプシンとからなる球状のリ
ポソームを基板上に二次元配列してなることを特徴とす
るバイオ素子について開示している。このバイオ素子
は、結合種として抗体分子等の単分子膜により形成され
たＬＢ膜（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ膜）に
生物応答性物質を含むリポソームを結合させることによ
って作製されている。[0003] For example, in Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 5-13395, a spherical bilayer composed of a biological substance and / or a biological analogue substance, a voltage-sensitive ion channel, and a biologically responsive substance such as bacteriorhodopsin is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 5-13395. A biodevice characterized in that liposomes are two-dimensionally arranged on a substrate is disclosed. This biodevice is produced by binding a liposome containing a bioresponsive substance to an LB film (Langmuir-Blodgett film) formed of a monomolecular film such as an antibody molecule as a binding species.
【０００４】この特開平５−１３３７９５号公報では、
脂質二重層中に生物応答性物質が多数の分子からなる球
状のリポソームの形で基板に付着していて、単分子膜レ
ベルで付着しているわけではない。[0004] In Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 5-133595,
The bioresponsive substance is attached to the substrate in the form of spherical liposomes composed of a large number of molecules in the lipid bilayer, and is not attached at the monolayer level.
【０００５】さらに、タンパク質には特定の配向性があ
る。タンパク質は、その配行性を持った状態で、生体膜
あるいは他のタンパク質と相互作用して、その機能を発
現できる。そのため、タンパク質を電極に固定して工業
的に応用するには、配向性が非常に重要となる。また、
シトクロムなどの電子伝達タンパク質は、生体膜の主成
分である脂質と相互作用することで、その活性をより発
揮することが報告されている。[0005] Furthermore, proteins have a specific orientation. Proteins can express their functions by interacting with biological membranes or other proteins while maintaining their arrangement properties. Therefore, in order to immobilize a protein on an electrode and apply it industrially, orientation is very important. Also,
It has been reported that an electron transfer protein such as cytochrome exerts its activity by interacting with a lipid which is a main component of a biological membrane.
【０００６】電子伝達タンパク質、特にシトクロムｃ3
はバイオ素子の材料として注目されており、固定化法の
開発が望まれている。しかし、配向性を無視した従来の
方法では、タンパク質本来の機能を十分に発揮できない
ことが多い。また、タンパク質を直接電極に吸着させる
と、タンパク質の変性が起き、タンパク質の持つ機能が
損なわれることも指摘されている。[0006] Electron transfer proteins, especially cytochrome c 3
Is attracting attention as a material for biodevices, and development of an immobilization method is desired. However, the conventional method ignoring the orientation often cannot sufficiently exhibit the original function of the protein. It has also been pointed out that if a protein is directly adsorbed to an electrode, the protein will be denatured and the function of the protein will be impaired.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】したがって、ナノメー
トルレベルでのタンパク質の制御・応用を目指す上で、
これら従来の方法は不向きであり、より少ないタンパク
質分子で電気化学的な制御を目指す必要がある。そこ
で、本発明の目的は、タンパク質が機能を持った状態で
電極表面を被覆し、固定された、ナノメートルレベルで
のタンパク質の制御と応用ができる電極を提供すること
にある。Therefore, in order to control and apply proteins at the nanometer level,
These conventional methods are unsuitable and require electrochemical control with fewer protein molecules. Therefore, an object of the present invention is to provide an electrode which covers an electrode surface in a state where a protein has a function and is capable of controlling and applying the protein at a nanometer level.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明は、電極基板の表
面を脂質とタンパク質が実質的に単分子膜の状態で被覆
してなる電極を提供する。また、前記脂質は、リン脂質
が好ましい。前記タンパク質は色素タンパク質が好まし
く、さらにシトクロムがより好ましい。より好ましく
は、シトクロムｃ3 である。The present invention provides an electrode in which the surface of an electrode substrate is coated with lipid and protein in a substantially monomolecular state. Further, the lipid is preferably a phospholipid. The protein is preferably a chromoprotein, and more preferably cytochrome. More preferably, a cytochrome c 3.
【０００９】本発明では、生体膜の主成分である脂質を
電極とタンパク質との結合の仲介物質として利用し、電
極に固定したタンパク質が配向性を持つようにする。あ
らかじめ脂質とタンパク質に特定の配向性を持たせて結
合させた後、電極上に修飾（被覆および固定）すれば、
より効率的なタンパク質の機能発現が可能である。さら
にタンパク質を脂質に保持させた状態で電極上に修飾す
ることで、タンパク質の電極吸着による変性を防ぎ、か
つ、その脂質と相互作用して活性を発揮させることがで
きる。In the present invention, lipids, which are the main components of a biological membrane, are used as mediators for binding between an electrode and a protein so that the protein immobilized on the electrode has orientation. After binding lipids and proteins with specific orientation in advance, then modifying (coating and immobilizing) on the electrodes,
More efficient protein function expression is possible. Further, by modifying the protein on the electrode while retaining the protein in the lipid, it is possible to prevent denaturation of the protein due to electrode adsorption and to exert its activity by interacting with the lipid.
【００１０】これらの脂質で修飾したタンパク質を単分
子膜の状態に制御しつつ、電極上に固定した本発明の電
極を提供することによって、バイオ素子への利用が可能
なナノレベル電極を開発できる。[0010] By providing the electrode of the present invention immobilized on an electrode while controlling the protein modified with these lipids to a monomolecular state, a nano-level electrode that can be used for a bioelement can be developed. .
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】図１に推定される本発明の電極表
面の模式図を示す。本発明の電極は、電極基板１を脂質
２が単分子膜の状態で被覆し、さらに脂質の間をタンパ
ク質３が配行性を持って被覆している。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS FIG. 1 shows a schematic diagram of an electrode surface of the present invention estimated. In the electrode of the present invention, the lipid 2 covers the electrode substrate 1 in the form of a monomolecular film, and the protein 3 covers the gap between the lipids in a distributed manner.
【００１２】電極を単分子膜で修飾する方法の一例とし
て、図２、図３を参照しながら、ＬＢ膜作成装置を用い
た本発明の電極作成方法を示す。なお、図２では、タン
パク質の例としてシトクロームｃ3 が、図２及び図３中
では、脂質の例としてリン脂質が示してある。As an example of a method for modifying an electrode with a monomolecular film, a method for forming an electrode of the present invention using an LB film forming apparatus will be described with reference to FIGS. FIG. 2 shows cytochrome c 3 as an example of a protein, and FIGS. 2 and 3 show phospholipids as an example of a lipid.
【００１３】あらかじめＬＢ膜作成装置のトラフ４中を
既知濃度のタンパク質を含む緩衝液５で満たしておき、
マイクロシリンジ６によってクロロホルムに溶かした一
定量のリン脂質を、緩衝液５の界面上に展開する。展開
前には、ＬＢ膜作成装置のバリヤー７を稼働して表面圧
の変化を測定して、液面表面上に汚れがないかを調べ
る。汚れがあるようであれば、アスピレーターなどを用
いて液面表面のクリーニングを行う。展開されたリン脂
質を含むクロロホルム溶液は、トラフ中の水溶液とは混
ざらず、さらにはクロロホルムは非常に揮発性が高いた
め、すぐさま揮発してしまう。その結果、リン脂質が単
分子膜として緩衝液５の表面上に形成される。またリン
脂質は両親媒性物質であるため、一定の向きを保った単
分子膜が形成される。すなわち、親水性のリン脂質頭部
が液相（緩衝液）と面し、疎水性の炭化水素鎖が気相に
面することになる。リン脂質頭部が液相、炭化水素鎖が
気相に面するように形成された単分子膜に水溶液中のタ
ンパク質が吸着あるいは結合していく。このような方法
をとることで、リン脂質とタンパク質は決まった配向性
を持って結合する。[0013] The trough 4 of the LB film forming apparatus is filled with a buffer 5 containing a protein of a known concentration in advance.
A certain amount of phospholipid dissolved in chloroform by the micro syringe 6 is spread on the interface of the buffer 5. Before the development, the barrier 7 of the LB film forming apparatus is operated to measure the change in the surface pressure, and it is checked whether or not there is any dirt on the liquid surface. If there is dirt, the liquid surface is cleaned using an aspirator or the like. The chloroform solution containing the developed phospholipids does not mix with the aqueous solution in the trough, and chloroform volatilizes immediately because it is very volatile. As a result, a phospholipid is formed on the surface of the buffer 5 as a monomolecular film. In addition, since phospholipids are amphiphilic substances, a monomolecular film with a fixed orientation is formed. That is, the hydrophilic phospholipid head faces the liquid phase (buffer solution), and the hydrophobic hydrocarbon chains face the gas phase. The protein in the aqueous solution is adsorbed or bound to a monomolecular film formed such that the phospholipid head faces the liquid phase and the hydrocarbon chain faces the gas phase. By adopting such a method, the phospholipid and the protein bind with a predetermined orientation.
【００１４】ここで、バランス８とプレート９は、表面
圧の検出に用いられる。バランス８は、プレート９につ
ながり、プレート９の重量を計測する。プレート９が清
浄な液面に接している場合は、バランス８は、緩衝液の
表面張力を測定していることになるが、液面上に単分子
膜が存在すると、単分子膜の表面圧の分だけ、緩衝液の
表面張力は見かけ上小さく測定される。従って、単分子
膜がある場合とない場合の表面圧を測定することによ
り、緩衝液の表面圧の減少分、つまり単分子膜の表面圧
を測定できる。Here, the balance 8 and the plate 9 are used for detecting the surface pressure. The balance 8 is connected to the plate 9 and measures the weight of the plate 9. When the plate 9 is in contact with a clean liquid surface, the balance 8 measures the surface tension of the buffer solution. However, when a monomolecular film exists on the liquid surface, the surface pressure of the monomolecular film is measured. , The surface tension of the buffer is measured to be apparently small. Therefore, by measuring the surface pressure with and without the monomolecular film, the decrease in the surface pressure of the buffer solution, that is, the surface pressure of the monomolecular film can be measured.
【００１５】タンパク質をリン脂質膜に結合させた複合
単分子膜の電極上への修飾には、図３に示すようなＬＢ
膜作成装置による垂直浸漬法を用いることができる。こ
の方法では、電極基板１を上方から単分子膜を形成して
いる緩衝液に向かって素早く下ろして行き、電極基板１
の修飾面を液中につける。その後、すぐさま非常にゆっ
くりとしたスピードで上方に上げていく。このような方
法をとることで、複合単分子膜は電極基板１を下ろして
いく過程では電極基板１上に移し取られず、電極基板１
を上げていく過程で単分子膜を移し取ることができる。
この際、単分子膜が電極基板１上へ移し取られる時の表
面圧は、電極基板１上が膜の重なりのない単分子膜での
み修飾されるよう検討するのが好ましい。例えば、卵黄
フォスファチジルコリンとカルジオリピンのリン脂質単
分子膜では、２０〜３０ｍＮ／ｍ程度に表面圧を調節す
るのが好ましい。この表面圧は、当業者が用いる脂質に
合わせて好ましい表面圧を適宜選択することができる。
この電気化学的な測定により、単分子膜中に埋まり込ん
でいるタンパク質の電気の流れを確認することが可能で
ある。The modification of the composite monolayer in which the protein is bound to the phospholipid membrane on the electrode is performed by LB as shown in FIG.
A vertical immersion method using a film forming apparatus can be used. In this method, the electrode substrate 1 is quickly lowered from above toward a buffer solution forming a monomolecular film, and the electrode substrate 1
Soak the modified surface in the liquid. Then immediately climb upwards at a very slow speed. By adopting such a method, the composite monomolecular film is not transferred onto the electrode substrate 1 in the process of lowering the electrode substrate 1, and
The monomolecular film can be transferred in the process of raising the molecular weight.
At this time, it is preferable to consider the surface pressure when the monomolecular film is transferred onto the electrode substrate 1 so that the surface of the electrode substrate 1 is modified only by a monomolecular film having no overlapping film. For example, in a phospholipid monolayer of yolk phosphatidylcholine and cardiolipin, it is preferable to adjust the surface pressure to about 20 to 30 mN / m. As the surface pressure, a person skilled in the art can appropriately select a preferable surface pressure according to the lipid used.
By this electrochemical measurement, it is possible to confirm the flow of electricity of the protein embedded in the monomolecular film.
【００１６】本発明で用いるタンパク質は、ヘムタンパ
ク質が好ましいが、ヘムタンパク質の代わりに、他の色
素タンパク質、例えば鉄以外の金属イオンを含むもの
（ヘモシアニンなど）、フラビンを含むもの（グルコー
ス酸化酵素など）、カロチンを含むもの（ロドプシンな
ど）、ピロール誘導体を含むもの（クロロフィルタンパ
ク質など）などを用いることができる。また、電子伝達
に関わるタンパク質、例えば、キノン、フェレドキシン
などのタンパク質を用いることも可能である。The protein used in the present invention is preferably a heme protein. Instead of the heme protein, other chromoproteins, for example, those containing metal ions other than iron (such as hemocyanin) and those containing flavin (such as glucose oxidase) ), Those containing carotene (such as rhodopsin), those containing a pyrrole derivative (such as chlorophyll protein), and the like. It is also possible to use proteins involved in electron transfer, for example, proteins such as quinone and ferredoxin.
【００１７】本発明で用いることのできるヘムタンパク
質は、特にシトクロムが好ましい。本発明で用いること
のできるシトクロムとしては、例として、シトクロム
ｂ、シトクロムｃ3 、シトクロムｃ2 、シトクロムｃ
551 、シトクロムｃ552 、シトクロムｃ553 などが挙げ
られる。このうち、シトクロムｃ3 が以下の点から好ま
しい。すなわち、シトクロームｃ3 は、温度に対する安
定性が高く、１２１度まで耐熱性を有する点、電極と直
接電子授受が可能である点、および、酸化還元電位が高
エネルギー側（負に大きい値）であり、他の物質を還元
する能力が高い点である。また、分子量が小さく、４つ
のヘムを持っており、ヘム密度が高いこともシトクロム
ｃ3 が好ましい理由である。なお、本発明では、１種類
のタンパク質を電極に被覆させることのみならず、２種
類以上のタンパク質を適当な混合比で電極に被覆させる
ことも可能である。The heme protein which can be used in the present invention is particularly preferably cytochrome. Examples of the cytochrome that can be used in the present invention include cytochrome b, cytochrome c 3 , cytochrome c 2 , and cytochrome c
551 , cytochrome c 552 and cytochrome c 553 . Of these, cytochrome c 3 are preferable from the following points. That is, cytochrome c 3 has high temperature stability, has heat resistance up to 121 ° C., can directly exchange electrons with electrodes, and has a redox potential on the high energy side (negatively large value). Yes, it has a high ability to reduce other substances. Cytochrome c 3 is also preferable because it has a low molecular weight and has four hemes and a high heme density. In the present invention, not only one type of protein can be coated on the electrode, but also two or more types of proteins can be coated on the electrode at an appropriate mixing ratio.
【００１８】本発明で用いることのできる脂質は、リン
脂質及び糖脂質を含む複合脂質、単純脂質、誘導脂質を
用いることができる。糖脂質の例としては、ガラクトセ
レブロシド、グリセロフォスフェート、グリコシルジグ
リセリド、セレブロシドを挙げることができ、単純脂質
の例としては、トリアシルグリセロール、コレステロー
ル、パルミナン酸セチルを挙げることができる。これら
の脂質のうち、複合脂質が好ましい。リン脂質は、生体
膜を構成する主な脂質であり、ヘムタンパク質の機能を
十分発揮することができるため、特に好ましい脂質であ
る。As the lipid that can be used in the present invention, complex lipids including phospholipids and glycolipids, simple lipids, and derived lipids can be used. Examples of glycolipids include galactocerebroside, glycerophosphate, glycosyl diglyceride, and cerebroside, and examples of simple lipids include triacylglycerol, cholesterol, and cetyl palminate. Of these lipids, complex lipids are preferred. Phospholipids are particularly preferred lipids because they are the main lipids that make up biological membranes and can sufficiently exert the function of heme proteins.
【００１９】本発明で用いることのできるリン脂質は、
フォスファチジルコリン、カルジオリピン、フォスファ
チジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、ス
フィンゴミエリン、フォスファチジルグリセロール、フ
ォスファチジルイノシトール、フォスファチジルアミノ
アシルグリセロールを例として挙げられる。また、これ
らのリン脂質を２種類以上適当な混合比で混合したリン
脂質を用いることができる。このうち、フォスファチジ
ルコリン、カルジオリピン、フォスファチジルグリセロ
ール、フォスファチジルエタノールアミン及びそれらの
混合物が、タンパク質を保持する疎水性の強さ、電位を
安定に修飾する親水性の強さ、並びに取り扱いの容易さ
から好ましい。The phospholipids that can be used in the present invention include:
Examples include phosphatidylcholine, cardiolipin, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, sphingomyelin, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, and phosphatidylaminoacylglycerol. Further, a phospholipid obtained by mixing two or more of these phospholipids at an appropriate mixing ratio can be used. Among them, phosphatidylcholine, cardiolipin, phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, and mixtures thereof have the hydrophobicity of retaining proteins, the hydrophilicity of stably modifying the potential, and the handling. It is preferable because of its ease.
【００２０】本発明で用いることのできる電極は、利用
しようとする電位領域において、溶解したり、化学変化
を起こさない限り、特に限定されない。例えば、シトク
ロムｃは、−４８６ｍＶｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌに半波電
極があるため、シトクロムｃで修飾した電極は、−６０
０ｍＶ程度まで還元または溶解しない必要がある。電極
の例としては、酸化インジウム錫電極、酸化錫電極、酸
化チタン電極や、金電極、アルミニウム電極などの金属
電極や、グラファイト、カーボンペーストなどの炭素電
極や、水銀電極等を挙げることができる。The electrodes that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they do not dissolve or undergo a chemical change in the potential region to be used. For example, cytochrome c is -486 mVvs. Since Ag / AgCl has a half-wave electrode, the electrode modified with cytochrome c is -60
It is necessary not to reduce or dissolve to about 0 mV. Examples of the electrode include a metal electrode such as an indium tin oxide electrode, a tin oxide electrode, a titanium oxide electrode, a gold electrode and an aluminum electrode, a carbon electrode such as graphite and carbon paste, and a mercury electrode.
【００２１】[0021]
【実施例】以下に、例としてシトクロムｃ3 を用いた本
発明の電極について説明するが、本願は、シトクロムｃ
3 を用いた電極のみに限定されるものではなく、他のタ
ンパク質にも広く本発明を適用できる。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS An electrode of the present invention using cytochrome c 3 will be described below as an example.
The present invention is not limited to only the electrode using No. 3 , but can be widely applied to other proteins.
【００２２】（方法）複合単分子膜の作成及び電極上へ
の修飾には、ＬＢ膜作成装置ＫＳＶ５０００を利用し
た。トラフは表面積５８５．０３cm2 、深さ０．３cmの
ものを用いた。単分子膜形成には、卵黄フォスファチジ
ルコリン（中性リン脂質，ＰＣ）とカルジオリピン（酸
性リン脂質，ＣＬ）を重量比４：１で混合した混合リン
脂質（ＰＣ：ＣＬ系リン脂質）を用いた。またタンパク
質としては、硫酸還元菌宮崎Ｆ株（Ｄv ＭＦ）由来のシ
トクロムｃ3 を用いた。(Method) An LB film forming apparatus KSV5000 was used for forming a composite monomolecular film and modifying the electrode. The trough used had a surface area of 585.03 cm 2 and a depth of 0.3 cm. For the formation of a monomolecular film, a mixed phospholipid (PC: CL phospholipid) obtained by mixing yolk phosphatidylcholine (neutral phospholipid, PC) and cardiolipin (acid phospholipid, CL) at a weight ratio of 4: 1 is used. Using. As the protein, cytochrome c 3 derived from sulfate-reducing bacteria Miyazaki F strain (Dv MF) was used.
【００２３】単分子膜の作成ために、まずトラフを２．
０μＭのシトクロムｃ3 を含む緩衝液で満たし、その表
面（界面）上にクロロホルム（ＣＨ3 Ｃｌ）に溶かして
調製した２mg／mlの混合リン脂質を展開した。クロロホ
ルムが揮発することで表面上にリン脂質単分子膜が形成
され、その単分子膜にシトクロムｃ3 が静電気的相互作
用により結合あるいは吸着する。このとき、リン脂質と
シトクロムｃ3 との結合又は吸着が十分に平衡状態に達
するまで放置した。In order to prepare a monomolecular film, first, a trough is set to 2.
The mixture was filled with a buffer containing 0 μM cytochrome c 3, and 2 mg / ml mixed phospholipid prepared by dissolving in chloroform (CH 3 Cl) was developed on the surface (interface). As the chloroform evaporates, a phospholipid monolayer is formed on the surface, and cytochrome c 3 is bound or adsorbed to the monolayer by electrostatic interaction. At this time, the mixture was allowed to stand until the binding or adsorption between the phospholipid and cytochrome c 3 reached a sufficient equilibrium state.
【００２４】このようにして作成した複合単分子膜（Ｐ
Ｃ：ＣＬ−シトクロムｃ3 複合単分子膜）を垂直浸漬法
によって電極上に移し取るが、この際複合単分子膜の表
面圧を２５ｍＮ／ｍに調整した。この表面圧は、図４の
表面圧−面積曲線から判断して、この付近の表面圧状態
にある単分子膜が均一に形成されていることから選ばれ
た。図４において、「PC:CL lipid monolayer 」、「cy
t.c3+lipid monolayer」は、それぞれ「ＰＣ：ＣＬ系脂
質混合単分子膜」、「シトクロムｃ3 脂質混合単分子
膜」を表す。田中らは顕微鏡により、この表面圧の単分
子膜が均一に形成されていることを報告している（田
中、近藤：Journal of Biochem. 117 巻、1151 1155 ペ
ージ、1995年）。The composite monomolecular film (P
C: CL-cytochrome c 3 composite monolayer) was transferred onto the electrode by a vertical immersion method. At this time, the surface pressure of the composite monolayer was adjusted to 25 mN / m. The surface pressure was determined from the surface pressure-area curve shown in FIG. 4 because a monomolecular film in the vicinity of the surface pressure was uniformly formed. In FIG. 4, “PC: CL lipid monolayer”, “cy
“t.c3 + lipid monolayer” represents “PC: CL-based lipid mixed monolayer” and “cytochrome c 3 lipid mixed monolayer”, respectively. Tanaka et al. Reported by a microscope that a monomolecular film having this surface pressure was formed uniformly (Tanaka, Kondo: Journal of Biochem. 117, 1151 1155, 1995).
【００２５】電極は酸化インジウム錫（Indium Tin Oxi
de、以下、「ＩＴＯ」という) 電極を用いた。電極への
複合単分子膜の移し取りの方法は前項の通り、電極を上
方から素早く下ろして行き、電極の修飾面を液中につ
け、その後すぐさま非常にゆっくりとしたスピードで上
方に上げていく方法をとった。このような方法をとるこ
とで、複合単分子膜は電極を下ろしていく過程では電極
上に移し取られず、電極を上げていく過程で移し取られ
た。このとき、累積比は、ほぼ１であり、均一に複合単
分子膜を修飾できたことがわかった。ここで、累積比と
は、界面から単分子膜が減少した面積と、実際に電極に
累積された面積との比であり、界面をおおっていた単分
子膜がどれだけ電極面に移しとられたかを示すものであ
る。累積比が１より小さい場合、電極面は膜でおおわれ
ていない部分があることになる。The electrode is made of indium tin oxide (Indium Tin Oxi
de, hereinafter referred to as “ITO”). As described in the previous section, the method of transferring the composite monolayer to the electrode is to quickly lower the electrode from above, immerse the modified surface of the electrode in the liquid, and then immediately raise it at a very slow speed. Was taken. By adopting such a method, the composite monolayer was not transferred onto the electrode in the process of lowering the electrode, but was transferred in the process of raising the electrode. At this time, the cumulative ratio was approximately 1, indicating that the composite monomolecular film could be uniformly modified. Here, the cumulative ratio is the ratio of the area where the monomolecular film has decreased from the interface to the area actually accumulated on the electrode, and how much the monomolecular film covering the interface is transferred to the electrode surface. It shows what it is. If the cumulative ratio is smaller than 1, the electrode surface has a portion that is not covered with the film.
【００２６】このようにして作成した修飾ＩＴＯ電極に
ついてディファレンシャル・パルス・ボルタンメトリー
（以下、「ＤＰＶ」という）による電気化学的測定を行
った。この測定において、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣ
ｌ、対電極として白金線を用い、作用電極面積は１．０
４cm2 、支持電解液として０．１ＭのＫＣｌ、測定装置
としてＢＡＳ−１００Ｂ（B.S.A. Inc.)を用いた。The thus-prepared modified ITO electrode was subjected to electrochemical measurement by differential pulse voltammetry (hereinafter referred to as "DPV"). In this measurement, Ag / AgC was used as a reference electrode.
1, using a platinum wire as the counter electrode, the working electrode area is 1.0
4 cm 2 , 0.1 M KCl as a supporting electrolyte, and BAS-100B (BSA Inc.) as a measuring device were used.
【００２７】（結果） （ＰＣ：ＣＬ−シトクロムｃ3 複合単分子膜を修飾した
ＩＴＯ電極のＤＰＶ測定） ＤＰＶ測定では、その測定
結果から算出される半波電位により定性的な評価を行っ
た。天然と同じ状態の構造を保持しているシトクロムｃ
3 の半波電位は、−４８６ｍＶ( 対Ａｇ／ＡｇＣｌ電
極) と報告されている（仁木、小林、松田：Journal of
Electroanalytical Chemistry、178 巻、333 341 ペー
ジ、1984年）。(Results) (PC: DPV Measurement of ITO Electrode Modified with CL-cytochrome c 3 Composite Monolayer) In the DPV measurement, a qualitative evaluation was performed based on the half-wave potential calculated from the measurement result. Cytochrome c that retains the same structure as in nature
The half-wave potential of 3 was reported to be -486 mV (vs. Ag / AgCl electrode) (Niki, Kobayashi, Matsuda: Journal of Japan)
Electroanalytical Chemistry, 178, 333, 341, 1984).
【００２８】ＰＣ：ＣＬ−シトクロムｃ3 複合単分子膜
を修飾したＩＴＯ電極のＤＰＶ測定では、その半波電位
は−４８６ｍＶと算出された。この電位は、前記仁木、
小林、松田により報告されている半波電位と一致した。
このことは、複合単分子膜中のシトクロムｃ3 が変性せ
ずに天然と同じ状態の構造を保持して電極と反応してい
ることを示している。PC: In the DPV measurement of the ITO electrode modified with the CL-cytochrome c 3 composite monolayer, the half-wave potential was calculated to be −486 mV. This potential depends on the Niki,
It was consistent with the half-wave potential reported by Kobayashi and Matsuda.
This indicates that the composite cytochrome c 3 in monolayer is reacted with holding the structure in the same state as the natural electrode without modification.
【００２９】（比較例１） （ＩＴＯ電極に吸着したシトクロムｃ3 のＤＰＶ測定）
高濃度のシトクロムｃ3 溶液（１２８μＭ）中にＩＴＯ
電極を十分付けておき、電極上にシトクロムｃ3 を吸着
させ、その電極について実施例と同じ条件でＤＰＶ測定
を行った。その結果、図６に示すように、その半波電位
は−５０２ｍＶと算出され、天然と同じ状態のシトクロ
ムｃ3 より低い電位となった。これまでの報告によれ
ば、ヘムタンパク質が変性してヘムが露出するほど、そ
の酸化還元電位は負にシフトするとわかっている。この
結果から、ＩＴＯ電極上に吸着したシトクロムｃ3 は、
電極上に吸着することで変性し、ヘムが露出してきてい
るのではないかと考えられる。この結果と実施例の結果
を比較すると、リン脂質単分子膜に保持されたシトクロ
ムｃ3 は電極上での変性を受けにくく、天然と同じ構造
に近い状態で電極反応を行っていると考えられる。(Comparative Example 1) (DPV measurement of cytochrome c 3 adsorbed on ITO electrode)
ITO in high concentration cytochrome c 3 solution (128 μM)
An electrode was sufficiently attached, cytochrome c 3 was adsorbed on the electrode, and DPV measurement was performed on the electrode under the same conditions as in the example. As a result, as shown in FIG. 6, the half-wave potential was calculated to be −502 mV, which was lower than that of cytochrome c 3 in the same state as in nature. Previous reports have shown that the more heme is denatured and the more heme is exposed, the more its redox potential shifts negatively. From these results, cytochrome c 3 adsorbed on the ITO electrode was
It is thought that heme is denatured by adsorbing on the electrode and heme is being exposed. Comparing this result with the result of the example, it is considered that the cytochrome c 3 held on the phospholipid monolayer is less likely to be denatured on the electrode, and the electrode reaction is performed in a state close to the same structure as natural. .
【００３０】（比較例２） （ＰＣ：ＣＬ系リン脂質分子膜のみを修飾したＩＴＯ電
極のＤＰＶ測定）実施例及び比較例１の測定で確認でき
たピーク（図５及び図６）が本当にシトクロムｃ3 由来
のピークであるか確認するため、ＰＣ：ＣＬ系リン脂質
単分子膜のみをＩＴＯ電極に修飾して、シトクロムｃ3
を含まない電極を作製し、ＤＰＶ測定を行った。この修
飾電極の調製法は実施例と同じであり、トラフ中をシト
クロムｃ3 を含む緩衝液のかわりに超純水を用いて行っ
た。その結果を図７に示す。図７では、ピークが確認さ
れないことから、図５及び図６に見られるピークがシト
クロムｃ3 由来のピークであることが確認できた。Comparative Example 2 (PC: DPV Measurement of ITO Electrode Modified Only with CL-Based Phospholipid Molecular Membrane) The peaks (FIGS. 5 and 6) confirmed in the measurements of Examples and Comparative Example 1 were truly cytochromes. to confirm whether the peak derived from c 3, PC: only be modified to ITO electrodes CL system phospholipid monolayer, cytochrome c 3
Was prepared and DPV measurement was performed. The preparation of the modified electrode is the same as in Example was carried out with ultrapure water trough instead of buffer containing cytochrome c 3. FIG. 7 shows the result. In Figure 7, since the peak is not confirmed, it was confirmed that peaks seen in FIGS. 5 and 6 is the peak derived from cytochrome c 3.
【００３１】[0031]
【発明の効果】本発明により、タンパク質を配向性を維
持し、しかもそのタンパク質の機能を保ったまま固定化
することができる。したがって、本発明の電極を用いれ
ば、様々な反応を電気化学的に制御できる。本発明の電
極は、電子伝達タンパク質を用いた、例えば燃料電池に
おける水分解用電極やバイオ素子の構築に利用できる。
また、本発明の電極と酸化還元酵素を共存させること
で、電気制御による物質変換も可能になると考えられ
る。According to the present invention, a protein can be immobilized while maintaining its orientation while maintaining the function of the protein. Therefore, various reactions can be electrochemically controlled by using the electrode of the present invention. INDUSTRIAL APPLICABILITY The electrode of the present invention can be used for, for example, construction of an electrode for water splitting or a bioelement in a fuel cell using an electron transfer protein.
Further, it is considered that the coexistence of the electrode of the present invention and the oxidoreductase also enables the substance conversion by electric control.
【図１】本発明の電極基板の想像図。FIG. 1 is an imaginary view of an electrode substrate according to the present invention.
【図２】本発明の電極を作成するＬＢ膜作成装置の一例
を示す図。FIG. 2 is a diagram showing an example of an LB film forming apparatus for forming an electrode according to the present invention.
【図３】本発明の電極を作成する方法の一例である垂直
浸漬法を示す図。FIG. 3 is a diagram showing a vertical immersion method which is an example of a method for producing an electrode of the present invention.
【図４】電極を作成する際のＰＣ：ＣＬ−シトクロムｃ
3 の表面圧−表面積曲線図。FIG. 4 PC for preparing an electrode: CL-cytochrome c
3 is a surface pressure-surface area curve diagram.
【図５】本発明のＰＣ：ＣＬ−シトクロムｃ3 複合単分
子膜を修飾したＩＴＯ電極のＤＰＶ測定図。FIG. 5 is a DPV measurement diagram of an ITO electrode modified with a PC: CL-cytochrome c 3 composite monolayer of the present invention.
【図６】従来法によりＩＴＯ電極に吸着させたシトクロ
ムｃ3 のＤＰＶ測定図。FIG. 6 is a DPV measurement diagram of cytochrome c 3 adsorbed on an ITO electrode by a conventional method.
【図７】比較例のＰＣ：ＣＬ系リン脂質単分子膜のみを
修飾したＩＴＯ電極のＤＰＶ測定図。FIG. 7 is a DPV measurement diagram of an ITO electrode obtained by modifying only the PC: CL-based phospholipid monolayer of the comparative example.
１ 電極基板 ２ 脂質 ３ タンパク質 ４ トラフ ５ 緩衝液 ６ シリンジ ７ バリヤー ８ バランス ９ プレート 1 electrode substrate 2 lipid 3 protein 4 trough 5 buffer 6 syringe 7 barrier 8 balance 9 plate
Claims (4)
質的に単分子膜の状態で被覆してなる電極。1. An electrode comprising a surface of an electrode substrate coated with lipids and proteins in a substantially monomolecular state.
載の電極。2. The electrode according to claim 1, wherein the lipid is a phospholipid.
請求項１又は２に記載の電極。3. The electrode according to claim 1, wherein the protein is a chromoprotein.
請求項３に記載の電極。4. The electrode according to claim 3, wherein the chromoprotein is cytochrome.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9093301A JPH10280182A (en) | 1997-04-11 | 1997-04-11 | Protein fixed modifying electrode |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9093301A JPH10280182A (en) | 1997-04-11 | 1997-04-11 | Protein fixed modifying electrode |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10280182A true JPH10280182A (en) | 1998-10-20 |
Family
ID=14078533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9093301A Withdrawn JPH10280182A (en) | 1997-04-11 | 1997-04-11 | Protein fixed modifying electrode |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10280182A (en) |
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1997
- 1997-04-11 JP JP9093301A patent/JPH10280182A/en not_active Withdrawn
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