JPH10210998A - Test of bacterium - Google Patents
Test of bacteriumInfo
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- JPH10210998A JPH10210998A JP2979697A JP2979697A JPH10210998A JP H10210998 A JPH10210998 A JP H10210998A JP 2979697 A JP2979697 A JP 2979697A JP 2979697 A JP2979697 A JP 2979697A JP H10210998 A JPH10210998 A JP H10210998A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、細菌の検査方法に関す
るものである。具体的には発光反応による細菌の抗菌性
薬剤感受性試験、同定試験に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for detecting bacteria. More specifically, the present invention relates to an antibacterial drug susceptibility test and an identification test of bacteria by a luminescence reaction.
【0002】[0002]
【従来の技術】細菌検査において、検査材料より分離さ
れた細菌の抗菌性薬剤感受性試験および同定試験は非常
に重要なことである。しかし大部分の検査施設では、分
離培養により得られた細菌を市販の微生物検査試薬を用
いて分離後18〜24時間もしくは対象細菌によっては
それ以上の時間を費やして検査成績を得ているのが現状
である2. Description of the Related Art In a bacterial test, an antimicrobial drug susceptibility test and an identification test of bacteria isolated from a test material are very important. However, in most laboratories, the test results are obtained after 18 to 24 hours or more depending on the target bacteria after the bacteria obtained by the separation and culture are separated using a commercially available microbial test reagent. As is
【0003】検査材料より分離された疾患の起因細菌に
ついて、治療薬の選択等の目的でこれらの細菌に対する
抗菌剤、抗結核剤などの抗菌性薬剤(以下薬剤と略す)
の感受性試験が日常的に実施されている。その方法は、
薬剤を段階的に希釈した濃度を含む培地液に分離培養で
得た細菌を一定量接種し培養した後、その細菌の発育を
阻害した薬剤の最小濃度(MIC)を求める微量液体希
釈法。また指定された寒天培地の表面に上述細菌を塗布
した後、薬剤が一定量含有されているディスクを置き培
養後に現出する阻止円を分類的解釈(感性、中等度感
性、耐性)する方法。以上の2方法に大別される。しか
しいずれの方法も18〜24時間菌種によってはそれ以
上の培養時間を必要とするのが現状である。[0003] Antibacterial agents such as antibacterial agents and antituberculous agents (hereinafter abbreviated as agents) against these bacteria for the purpose of selecting a therapeutic agent, etc. for the disease-causing bacteria isolated from the test material.
Susceptibility tests are routinely performed. The method is
A microfluidic dilution method in which a certain amount of bacteria obtained by separation and culturing is inoculated into a medium containing a concentration of a drug that is diluted stepwise and cultured, and then the minimum concentration (MIC) of the drug that inhibited the growth of the bacteria is determined. In addition, a method of applying the above bacteria on the surface of a designated agar medium, placing a disk containing a certain amount of the drug, and classifying interpretation (sensitivity, moderate sensitivity, resistance) of the inhibition circle that appears after culture. These are roughly divided into the above two methods. However, at present, all methods require a longer culture time depending on the bacterial species for 18 to 24 hours.
【0004】また薬剤感受性試験と同様に臨床材料より
分離された細菌の同定試験も日常的に行われている。そ
の方法は以下のような原理に基づくもので、大多数の施
設では市販の細菌同定システムにより機械化されてい
る。人工的な培地に接種された細菌は、培地中の各種の
栄養素を酵素的に代謝することによって増殖する。酵素
には多くの種類が有り、その中には細菌の同定のための
指標として利用できるものの存在が知られている。酵素
反応は、特定の基質の消費に伴う変化を観察することで
検出される。酵素反応が基質特異的なものであれば、酵
素基質を添加した培地を利用して酵素の存在を確認する
ことができる。具体的には、たとえば炭素源を代謝する
酵素は、基質である糖類の酵素的な分解に伴って酸を生
成するとき、培地のpH変化として捉えることができ
る。また窒素源を代謝する酵素は、基質であるアミノ酸
類の分解に伴ってアンモニアを生成するとき、やはりp
Hの変化として捉えることができる。市販の細菌同定シ
ステムは、同定の指標となる酵素の組み合せに基づいて
被検菌株がどの菌種に属するのかについてその可能性を
算出する。この方法では、接種した微生物の増殖が必要
である。したがって信頼できる成績を得るには、微生物
の増殖のための培養を18〜24時間、菌種によっては
それ以上の時間を要するものもある。[0004] Similarly to drug sensitivity tests, tests for identifying bacteria isolated from clinical materials are also routinely performed. The method is based on the following principle, and most facilities are mechanized by a commercially available bacterial identification system. Bacteria inoculated in an artificial medium grow by enzymatically metabolizing various nutrients in the medium. There are many types of enzymes, some of which are known to be used as indicators for identifying bacteria. Enzymatic reactions are detected by observing changes associated with the consumption of a particular substrate. If the enzyme reaction is substrate-specific, the presence of the enzyme can be confirmed using a medium to which the enzyme substrate has been added. Specifically, for example, an enzyme that metabolizes a carbon source can be regarded as a change in the pH of a medium when an acid is generated by enzymatic decomposition of a saccharide as a substrate. Enzymes that metabolize nitrogen sources also produce p when ammonia is produced along with the decomposition of amino acids as substrates.
H can be regarded as a change. Commercially available bacterial identification systems calculate the possibility of which strain the test strain belongs to based on the combination of enzymes that serve as identification indicators. This method requires growth of the inoculated microorganism. Therefore, in order to obtain reliable results, it takes 18 to 24 hours for culturing for the growth of microorganisms, and more time may be required depending on the species.
【0005】これらの薬剤感受性・同定試験成績を得る
以前に臨床医の経験をふまえた予測治療として薬剤投与
などの処置がなされるが、時としてこれが病気の持続及
び状態の悪化を伴うケースもある。特に近年薬剤の多用
による薬剤耐性菌の出現や、海外旅行者の増加に伴う輸
入感染症の増加が問題になっており、患者の状態を正確
に治癒させ得る処置の決定がなされる為の情報を、迅速
に臨床医に提供できる細菌の薬剤感受性試験法・同定法
の開発が強く要望されている。Prior to obtaining these drug sensitivity / identification test results, treatments such as drug administration are performed as predictive treatments based on the experience of clinicians, but in some cases this may be accompanied by continuation of the disease and deterioration of the condition. . In particular, the emergence of drug-resistant bacteria due to the frequent use of drugs and the increase of imported infectious diseases due to the increase in overseas travelers have become a problem in recent years, and information for making decisions on treatments that can accurately cure patient conditions has been made. There is a strong demand for the development of a method for testing and identifying bacterial drug susceptibility that can be rapidly provided to clinicians.
【0006】この問題の解決のために多くの方法が発表
されてきた。例えば薬剤を含む培地にテトラゾリウム塩
を添加して細菌を培養し、テトラゾリウム塩の還元によ
る発色により細菌の代謝活性を求め、この成績を薬剤の
感受性決定に利用した方法(特開昭55-39763、特開平1-
187097)。またレサズリン等の蛍光原性基質を細菌の増
殖時に作用させ、生産される蛍光物質の蛍光強度を定量
することにより薬剤感受性を決定する方法等である(特
開平2-211899)。[0006] Many methods have been published to solve this problem. For example, a method of adding a tetrazolium salt to a medium containing a drug, culturing the bacterium, determining the metabolic activity of the bacterium by coloring by reduction of the tetrazolium salt, and using the results to determine the sensitivity of the drug (Japanese Patent Laid-Open No. 55-39763, JP-A-1-
187097). Also, there is a method in which a fluorogenic substrate such as resazurin is allowed to act during the growth of bacteria, and the drug sensitivity is determined by quantifying the fluorescence intensity of the produced fluorescent substance (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2- 211899).
【0007】商品化されたものとしては前述のMIC測
定を目的として開発されたSensititer(商品名)システ
ムがあげられる。これは蛍光原性基質を細菌に作用させ
ることにより、細菌の増殖時に生産される蛍光物質の蛍
光強度を培養5時間後に測定し、その結果を専用ソフト
ウェアで解析してその細菌に対するMICを算出するこ
とが可能なシステムである。しかしこの方法は増殖の遅
い菌種(代表的な例としてブドウ糖非発酵菌群の中の数
菌種)、また非常に短時間で十分な蛍光レベルに達して
しまう菌種では信頼できないことが見いだされている。
またこれらの欠点を補う方法として、ただ1回の早期単
測定ではなく、連続して測定(3〜15時間)を行いそ
こから得られる情報を専用ソフトウェアで解析すること
により薬剤感受性情報を得ることを目的とした方法も近
年発表されている(特公平7-114708)。しかしこれらの
方法では特に増殖の遅い菌種では依然として長時間の培
養時間(15〜18時間)を必要とする問題が残され
る。As a commercialized product, there is a Sensititer (trade name) system developed for the purpose of MIC measurement. In this method, the fluorescence intensity of a fluorescent substance produced during the growth of bacteria is measured after 5 hours of culture by causing a fluorogenic substrate to act on the bacteria, and the result is analyzed with dedicated software to calculate the MIC for the bacteria. It is a system that can do it. However, this method was found to be unreliable for slow growing strains (typically several strains of non-glucose non-fermenting bacteria) and those that achieved sufficient fluorescence levels in a very short time. Have been.
As a method of compensating for these disadvantages, drug sensitivity information can be obtained by performing continuous measurements (3 to 15 hours) and analyzing the information obtained therefrom with dedicated software, rather than just a single early measurement. In recent years, a method has been announced (Japanese Patent Publication No. 7-114708). However, these methods still have a problem that a long culture time (15 to 18 hours) is still required particularly for a slow-growing bacterial species.
【0008】発色あるいは蛍光を利用した高感度検出系
では、電子伝達剤あるいは酸化還元促進剤としてメナジ
オンが用いられるが、メナジオンは細菌に対する発育阻
害作用を持つため、その濃度設定は慎重を要する。特開
平2-211898ではメナジオンの至適濃度を1〜10μg/
ml好ましくは2.5〜7.5μg/mlと規定した上
で蛍光基質であるレサズリンとともに予めブイヨンに添
加して細菌を培養している。この方法は実施例でも示さ
れているグラム陰性桿菌では有効であるが、メナジオン
に対する感受性が高いグラム陽性球菌ではメナジオンの
濃度を1μg/ml以下にしないと十分な発育結果を得
ることができない。In a high-sensitivity detection system utilizing color development or fluorescence, menadione is used as an electron transfer agent or a redox accelerator. Since menadione has a growth inhibitory effect on bacteria, its concentration must be carefully set. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-211898 discloses that the optimal concentration of menadione is 1 to 10 μg /
The bacterium is cultured by adding it to a broth in advance together with a fluorescent substrate, resazurin, after defining the concentration to preferably 2.5 to 7.5 μg / ml. Although this method is effective for Gram-negative bacilli described in Examples, sufficient growth results cannot be obtained unless the concentration of Menadione is 1 μg / ml or less for Gram-positive cocci having high sensitivity to menadione.
【0009】本発明者はグラム陽性球菌についてメナジ
オンを発育に支障のない濃度に設定して特開平2-211898
の方法で薬剤感受性試験を試みた。その結果、106C
FU/ml以上の接種菌量で試験を行うと偽陽性が生じ
ることが判明した。グラム陽性球菌はグラム陰性桿菌に
比べて菌体自身の還元能が強く、そのために菌体接種時
の菌体の還元能の影響を受けて薬剤感受性とは無関係に
偽陽性を生じ、薬剤感受性試験成績が耐性になってしま
うと考えられる。メナジオン、およびレサズリンの一
方、または両方を菌体培養後に添加した場合には、感度
不足から対照菌も検出できず、薬剤感受性試験不能とな
ってしまった。The present inventors set the concentration of menadione for gram-positive cocci to a concentration that does not hinder growth and disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 2-121898.
A drug sensitivity test was attempted by the method described above. As a result, 10 6 C
It was found that false positives occurred when the test was performed at an inoculum amount of FU / ml or more. Gram-positive cocci have a stronger reducing ability of the cells themselves than gram-negative bacilli, so they are affected by the reducing ability of the cells at the time of inoculation of the cells and give rise to false positives regardless of drug sensitivity. It is considered that the grades become resistant. When one or both of menadione and resazurin were added after cell culture, the control bacterium could not be detected due to insufficient sensitivity, and the drug susceptibility test was impossible.
【0010】さらに培養時間を短縮することが可能な高
感度の検出系としては、生物発光、化学発光を利用した
ものをあげることができる。特開平8-103293は、生菌由
来のATPにルシフェリン・ルシフェラーゼの発光試薬
を作用させ、発光反応により薬剤感受性試験を行うもの
で、培養時間は4〜5時間程度に短縮できる。しかし、
フィルター上に菌を採取したり、菌体を破壊してATP
を抽出する操作が必要であるなど、操作は従来法に比べ
て煩雑である。同様に菌体の破壊をファージにより行う
方法もある(特表平8-503847)。ファージを利用するこ
とで菌に対する特異性は高まるが、ファージという生物
材料を扱うことで前述の方法よりもさらに操作は煩雑に
なる。[0010] Examples of a highly sensitive detection system capable of further reducing the culture time include those utilizing bioluminescence and chemiluminescence. Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-103293 discloses a method in which a luminescent reagent of luciferin / luciferase is allowed to act on ATP derived from a living bacterium to perform a drug sensitivity test by a luminescent reaction. The culturing time can be reduced to about 4 to 5 hours. But,
ATP by collecting bacteria on the filter or destroying the cells
The operation is complicated as compared with the conventional method, for example, the operation of extracting Similarly, there is a method in which bacterial cells are destroyed by phage (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-503847). Utilization of phage increases specificity to bacteria, but handling biological material called phage makes operation more complicated than the above-mentioned method.
【0011】化学発光法は、原理的には細菌の増殖を6
30nmの吸光度で定量する濁度法、同様にテトラゾリ
ウム塩等の酸化還元指示薬を用いた発色法、そして蛍光
原性基質を用いる蛍光法のいずれの方法よりも測定感度
の優れた方法である。従ってこの測定原理を採用する薬
剤感受性試験法は、従来発表されているいずれの方法よ
りも培養時間の短縮化が可能であると考えられる。[0011] In principle, the chemiluminescence method inhibits the growth of bacteria by six.
It is a method having a higher measurement sensitivity than any of the turbidity method for quantification by absorbance at 30 nm, the color development method using a redox indicator such as a tetrazolium salt, and the fluorescence method using a fluorogenic substrate. Therefore, it is considered that the drug sensitivity test method employing this measurement principle can reduce the culture time more than any of the conventionally published methods.
【0012】化学発光を利用した検出系としては、特公
平6-30628をあげることができる。この方法は、細胞に
酸化型キノンを作用させ、細胞膜酵素の還元作用によっ
て発生した過酸化水素を発光試薬により検出するもので
ある。この方法は酵母においては良好な成績をあげるこ
とが実施例でも示されている。しかしながら、酵母のよ
うな大型の菌では還元作用を示す酵素量も十分なので菌
体量に比例した発光強度が得られるが、臨床検査の対象
となる細菌は酵母よりも小さく、この方法では感度不足
となって測定することができない。As a detection system utilizing chemiluminescence, there is Japanese Patent Publication No. 6-30628. In this method, oxidized quinone is allowed to act on cells, and hydrogen peroxide generated by the reducing action of a cell membrane enzyme is detected by a luminescent reagent. The examples show that this method gives good results in yeast. However, for large bacteria such as yeast, the amount of enzyme that exhibits a reducing action is sufficient, so that luminescence intensity proportional to the amount of bacterial cells can be obtained.However, bacteria to be subjected to clinical tests are smaller than yeast, and this method lacks sensitivity. And cannot be measured.
【0013】感度不足を解消するために培養開始時にメ
ナジオンを添加しておくことも可能だが、先に述べたメ
ナジオンの細菌に対する発育阻害作用や、薬剤感受性試
験における培養初期の菌体の還元能の影響の他に、培養
中に菌体由来のペルオキシダーゼやカタラーゼにより、
発生した過酸化水素が消費されることも考慮しなくては
ならない。感度的には最も有利な化学発光系も過酸化水
素を介した反応系ではあるが、その長所を生かした細菌
試験方法は実用化されていない。[0013] Menadione can be added at the start of culture to eliminate the sensitivity deficiency. However, the growth inhibitory effect of menadione on bacteria and the reduction of bacterial cells in the initial stage of culture in a drug sensitivity test are mentioned. In addition to the effect, peroxidase and catalase derived from bacterial cells during culture,
It must be taken into account that the generated hydrogen peroxide is consumed. The most advantageous chemiluminescence system in terms of sensitivity is also a reaction system via hydrogen peroxide, but a bacterial test method taking advantage of the advantage has not been put to practical use.
【0014】このように感度・精度ともに十分な性能を
備え、なおかつ広範囲な臨床細菌に適用可能な迅速細菌
試験方法は存在しなかった。As described above, there has been no rapid bacterial test method which has sufficient performance in both sensitivity and accuracy and is applicable to a wide range of clinical bacteria.
【0015】[0015]
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、化学発光を利用した広範囲な臨床細菌(腸
内細菌群、ブドウ糖非発酵菌群、グラム陽性球菌群、ヘ
モフィルス菌群、抗酸菌群)のための試験方法である。The problem to be solved by the present invention is to solve a wide range of clinical bacteria (intestinal bacteria, non-glucose nonfermenting bacteria, gram-positive cocci, hemophilus, etc.) utilizing chemiluminescence. (Acid bacteria group).
【0016】[0016]
【課題を解決するための手段】本発明者は鋭意検討を行
った結果、化学発光を利用した広範囲な臨床細菌に対し
て実施可能な試験方法を完成した。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies, the present inventors have completed a test method which can be applied to a wide range of clinical bacteria utilizing chemiluminescence.
【0017】本発明は以下のような細菌検査方法あるい
はその応用からなる。 (1)電子移動剤の存在下で細菌を培養し、菌体内に存
在する酸化還元酵素がニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドあるいはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸を補酵素として電子移動剤を還元する作用を、化
学発光により検出することを特徴とする細菌検査方法。 (2)酸化還元酵素が電子移動剤を還元することにより
発生する、過酸化水素を検出することを特徴とする
(1)の細菌検査方法。 (3)電子移動剤が酸化型キノンであることを特徴とす
る(2)の細菌検査方法。 (4)酸化型キノンがメナジオン、ベンゾキノン、ナフ
トキノン、ジフェノキノン、アントラキノンからなる群
から選ばれたものであることを特徴とする(3)の細菌
検査方法。 (5)酸化型キノンがメナジオンであることを特徴とす
る(4)の細菌検査方法。 (6)検査対象の細菌がグラム陽性球菌である(5)の
細菌検査方法。 (7)メナジオンの濃度が0.01μg/ml以上、1
μg/ml未満の範囲である(6)の細菌検査方法。 (8)メナジオンの濃度が0.5μg/ml以上、1μ
g/ml未満の範囲である(7)の細菌検査方法。 (9)発光試薬がルシゲニンを含むアクリジン誘導体、
ルミノール誘導体、過シュウ酸エステルからなる群から
選ばれたものであることを特徴とする(1)の細菌検査
方法。 (10)アクリジン誘導体としてルシゲニンを用いるこ
とを特徴とする(9)の細菌検査方法。 (11)抗菌性薬剤と電子移動剤の存在下で細菌を培養
し、菌体内に存在する酸化還元酵素がニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドあるいはニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸を補酵素として電子移動剤を還元
する作用を、化学発光により検出することを特徴とする
抗菌性薬剤感受性試験方法。 (12)基質特異的酵素の基質と電子移動剤の存在下で
細菌を培養し、菌体内に存在する基質特異的酵素がニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドあるいはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素として電子
移動剤を還元する作用を、化学発光により検出すること
を特徴とする同定試験方法。 (13)細菌の発育に必要な栄養成分、抗菌性薬剤、な
らびに電子移動剤を含む培地と、発光試薬が組み合わさ
れた(11)の抗菌性薬剤感受性試験方法を実施するた
めのキット。 (14)細菌の発育に必要な栄養成分、基質特異的酵素
の基質、ならびに電子移動剤を含む培地と、発光試薬が
組み合わされた(12)の同定試験方法を実施するため
のキット。The present invention comprises the following bacterial test method or its application. (1) The bacterium is cultured in the presence of an electron transfer agent, and the oxidoreductase present in the cells reduces the electron transfer agent using nicotinamide adenine dinucleotide or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate as a coenzyme. A bacterial test method characterized by detecting by chemiluminescence. (2) The bacteria test method according to (1), wherein hydrogen peroxide generated by reduction of the electron transfer agent by the oxidoreductase is detected. (3) The method according to (2), wherein the electron transfer agent is an oxidized quinone. (4) The method according to (3), wherein the oxidized quinone is selected from the group consisting of menadione, benzoquinone, naphthoquinone, diphenoquinone, and anthraquinone. (5) The method for testing bacteria according to (4), wherein the oxidized quinone is menadione. (6) The bacteria test method according to (5), wherein the bacteria to be tested are gram-positive cocci. (7) When the concentration of menadione is 0.01 μg / ml or more,
(6) The method for testing a bacterium according to (6), wherein the range is less than μg / ml. (8) The concentration of menadione is 0.5 μg / ml or more and 1 μm
The bacteria test method according to (7), which is less than g / ml. (9) an acridine derivative whose luminescent reagent contains lucigenin,
(1) The method for testing bacteria according to (1), which is selected from the group consisting of a luminol derivative and a peroxalate. (10) The method for testing bacteria according to (9), wherein lucigenin is used as the acridine derivative. (11) Bacteria are cultured in the presence of an antibacterial agent and an electron transfer agent, and the oxidoreductase present in the cells reduces the electron transfer agent using nicotinamide adenine dinucleotide or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate as a coenzyme. A method of testing antimicrobial drug susceptibility, characterized in that the action of the drug is detected by chemiluminescence. (12) The bacterium is cultured in the presence of the substrate of the substrate-specific enzyme and the electron transfer agent, and the substrate-specific enzyme present in the cells is converted to nicotinamide adenine dinucleotide or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate as a coenzyme. An identification test method, wherein the action of reducing a transfer agent is detected by chemiluminescence. (13) A kit for performing the antimicrobial drug susceptibility test method according to (11), wherein a luminescent reagent is combined with a nutrient necessary for the growth of bacteria, an antimicrobial agent, and a medium containing an electron transfer agent. (14) A kit for performing the identification test method of (12), wherein a luminescent reagent is combined with a nutrient necessary for the growth of bacteria, a substrate of a substrate-specific enzyme, and a medium containing an electron transfer agent.
【0018】薬剤の一定量を含む各細菌群専用のブイヨ
ンに接種された細菌は、菌体内に存在する種々の酸化還
元酵素の働きにより菌体外の栄養成分を菌体内に取り込
み増殖を開始する。そのときに作用する酸化還元酵素反
応には還元型補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド(NADH)やそのリン酸化合物(NADPH)の
介在が必要なものがある。したがって、菌体外に存在す
る被還元物質が菌体内に存在する酵素により還元されれ
ば、同時にブイヨンに存在する電子移動剤を介して溶存
酸素が還元され過酸化水素が生産されると推察される。
この過酸化水素の生産量は、細菌の増殖に伴い加速度的
に増加するものと考えられる(酵素サイクリング原理に
よる。)。本発明は、この生産された過酸化水素を化学
発光法により定量し、より迅速に試験結果を得るという
原理に基づいている。Bacteria inoculated in a broth dedicated to each group of bacteria containing a certain amount of the drug take in extracellular nutrients into the cells and start to proliferate by the action of various oxidoreductases present in the cells. . Some of the oxidoreductase reactions acting at that time require the intervention of reduced coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) or its phosphate compound (NADPH). Therefore, it is presumed that when the substance to be reduced existing outside the cells is reduced by the enzyme present in the cells, dissolved oxygen is simultaneously reduced via the electron transfer agent present in the broth to produce hydrogen peroxide. You.
It is considered that the production amount of hydrogen peroxide increases at an accelerating rate as the bacteria grow (according to the principle of enzyme cycling). The present invention is based on the principle that the produced hydrogen peroxide is quantified by a chemiluminescence method and the test result is obtained more quickly.
【0019】すなわち本発明は、(1)に述べたような
構成により化学発光反応による細菌の検査方法を実現し
た。本発明の検査方法はグラム陰性細菌やグラム陽性細
菌に限定されず幅広い種類の細菌に応用することができ
る。中でも、従来の化学発光反応に基づく方法では試験
が困難であったグラム陽性球菌にも応用可能なことは本
発明の大きな特徴である。本発明の最大の特徴は電子移
動剤の存在下で細菌を培養することにある。電子移動剤
には、酸化型キノンを利用できる。具体的には、メナジ
オン、ベンゾキノン、ナフトキノン、ジフェノキノン、
アントラキノンのような酸化型キノンが公知である。こ
れらの酸化型キノンのうち、発光試薬添加後の発光強度
の上昇が速い点からメナジオンが適している。また、メ
ナジオンは各種の細菌に対して増殖を阻害しない濃度を
容易に設定することができる。たとえばメナジオンに対
して感受性を示すグラム陽性球菌においても、培養環境
におけるメナジオンの濃度を0.01μg/ml以上、
1μg/ml未満、望ましくは0.5μg/ml以上、
1μg/ml未満とすることにより細菌の試験が可能で
ある。他方メナジオンに対して感受性を示さない細菌
(E.coliやK.pneumoniae等)では、1μg/ml以上、
10μg/ml未満の濃度で用いると良い。本発明の検
査方法において指標としている酸化還元酵素とは、補酵
素を水素受容体とするものであって、細菌の増殖や菌種
の指標として知られている酵素である。このような酸化
還元酵素には、糖類、アミノ酸。有機酸等の基質を特異
的に分解するグルコースデヒドロゲナーゼやアラビノー
スデヒドロゲナーゼ等の各種デヒドロゲナーゼを挙げる
ことができる。本発明は酸化還元反応を化学発光反応に
よって検出しているので、必ずしも酵素反応によって培
地pHの変動をもたらすものである必要はない。本発明
で用いる補酵素には、指標として選んだ酸化還元酵素が
要求するものを組み合せる。一般的な補酵素としては、
NADやNADPを示すことができる。That is, the present invention has realized a method for detecting bacteria by a chemiluminescence reaction with the configuration described in (1). The test method of the present invention is not limited to Gram-negative bacteria and Gram-positive bacteria, but can be applied to a wide variety of bacteria. Above all, a major feature of the present invention is that it can be applied to Gram-positive cocci, for which a test based on a conventional chemiluminescence reaction was difficult. The most important feature of the present invention resides in culturing bacteria in the presence of an electron transfer agent. Oxidized quinone can be used as the electron transfer agent. Specifically, menadione, benzoquinone, naphthoquinone, diphenoquinone,
Oxidized quinones such as anthraquinone are known. Among these oxidized quinones, menadione is suitable because it rapidly increases the luminescence intensity after the addition of the luminescence reagent. In addition, menadione can be easily set to a concentration that does not inhibit the growth of various bacteria. For example, even in gram-positive cocci that are sensitive to menadione, the concentration of menadione in the culture environment is 0.01 μg / ml or more,
Less than 1 μg / ml, desirably 0.5 μg / ml or more,
Bacteria can be tested by using less than 1 μg / ml. On the other hand, for bacteria not sensitive to menadione (such as E. coli and K. pneumoniae), 1 μg / ml or more,
It is preferable to use a concentration of less than 10 μg / ml. The oxidoreductase used as an indicator in the test method of the present invention uses a coenzyme as a hydrogen acceptor and is an enzyme known as an indicator of bacterial growth and bacterial species. Such oxidoreductases include sugars and amino acids. Examples include various dehydrogenases such as glucose dehydrogenase and arabinose dehydrogenase that specifically decompose substrates such as organic acids. In the present invention, since the oxidation-reduction reaction is detected by a chemiluminescence reaction, it is not always necessary to cause a change in the medium pH by an enzyme reaction. The coenzymes used in the present invention are combined with those required by the oxidoreductase selected as an indicator. As a general coenzyme,
NAD or NADP can be indicated.
【0020】本発明では、メナジオンを菌体内に存在す
る酵素により還元するので、メナジオンの濃度と添加の
タイミングが重要なポイントとなる。菌体の還元性の弱
いグラム陰性桿菌の薬剤感受性試験を行うためにはメナ
ジオンは培地に予め添加しておく必要がある。また、メ
ナジオンに対する感受性が高いグラム陽性球菌の発育に
支障のないように、メナジオンの濃度は0.01μg/
ml以上、1μg/ml未満、好ましくは0.5μg/
ml以上、1μg/ml未満になるように培地に添加す
るとよい。In the present invention, menadione is reduced by an enzyme present in the cells, so that the concentration of menadione and the timing of its addition are important points. Menadione must be added to the medium in advance in order to perform a drug susceptibility test on Gram-negative bacilli, which have a low cell-reducing property. In addition, the concentration of menadione is 0.01 μg / m so as not to hinder the growth of gram-positive cocci having high sensitivity to menadione.
ml or more and less than 1 μg / ml, preferably 0.5 μg / ml.
It is advisable to add the medium to the culture medium in an amount of at least 1 ml / ml and less than 1 μg / ml.
【0021】本発明で使用する発光試薬には、過酸化水
素により発光し、薬剤や特異的酵素による影響を受けな
いものであれば特に制限はない。このような発光試薬と
してはアクリジン誘導体、ルミノール誘導体、およびシ
ュウ酸誘導体等をあげることができる。アクリジン誘導
体の発光試薬としては、ルシゲニン、各種アクリジニウ
ム塩、および各種アクリジニウムエステルを、また、ル
ミノール誘導体としてはルミノール、イソルミノール等
をあげることができる。シュウ酸誘導体としては、クロ
ライド、エステル、およびオキサミドをあげることがで
きる。シュウ酸誘導体を発光試薬として用いる場合に
は、ペリレン、ピレン等の蛍光物質を共存させる必要が
ある。また、発光試薬には過酸化水素を消費する酵素の
活性を阻害するためのアジ化ナトリウムや、発光反応を
促進する鉄、マンガン、あるいはニッケル等の金属イオ
ン、酸化物、錯体を添加することも好ましい。The luminescent reagent used in the present invention is not particularly limited as long as it emits light by hydrogen peroxide and is not affected by drugs or specific enzymes. Such luminescent reagents include acridine derivatives, luminol derivatives, oxalic acid derivatives, and the like. Luminescent reagents of acridine derivatives include lucigenin, various acridinium salts and various acridinium esters, and luminol derivatives include luminol and isoluminol. Examples of the oxalic acid derivative include chloride, ester, and oxamide. When an oxalic acid derivative is used as a luminescent reagent, it is necessary to coexist a fluorescent substance such as perylene or pyrene. In addition, the luminescent reagent may be added with sodium azide for inhibiting the activity of an enzyme consuming hydrogen peroxide, or metal ions, oxides or complexes such as iron, manganese, or nickel for promoting the luminescent reaction. preferable.
【0022】本発明では、発光試薬は培養初期の菌体の
還元性の影響を避けるために、菌体の培養後に添加する
必要がある。従来用いられてきた発色系あるいは蛍光系
の試薬では、培養後に添加すると感度不足となってしま
い測定できないが、化学発光系の試薬は感度が高いので
培養後に添加しても十分測定可能である。In the present invention, the luminescent reagent needs to be added after the culturing of the cells in order to avoid the influence of the reducing properties of the cells at the beginning of the culture. With conventional coloring or fluorescent reagents, if added after cultivation, the sensitivity becomes insufficient and measurement cannot be performed. However, chemiluminescent reagents have high sensitivity and can be sufficiently measured even after addition after culturing.
【0023】本発明を実施する細菌発育検出用培地には
既知のブイヨンを用いることができる。培地中には細菌
の栄養源と物質、無機塩類等が含まれる。細胞の栄養源
となる物質としては、ブドウ糖、酵母エキス、各種アミ
ノ酸、ピルビン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が
あげられる。また、無機塩類としては、塩化ナトリウ
ム、りん酸一カリウム、りん酸二ナトリウム、硫酸マグ
ネシウム、塩化カルシウム等があげられる。これらの無
機塩類は浸透圧調製剤、緩衝剤としても機能する。具体
的にはM70培地等をあげることができる。A known broth can be used as the medium for detecting bacterial growth for carrying out the present invention. The culture medium contains bacterial nutrients and substances, inorganic salts and the like. Substances serving as nutrient sources for cells include glucose, yeast extract, various amino acids, sodium pyruvate, sodium citrate and the like. Examples of the inorganic salts include sodium chloride, monopotassium phosphate, disodium phosphate, magnesium sulfate, calcium chloride and the like. These inorganic salts also function as osmotic pressure adjusting agents and buffers. Specifically, an M70 medium and the like can be mentioned.
【0024】本発明は、細菌の迅速薬剤感受性試験に応
用することができる。この方法を施行する為に必要な成
分は、細菌を増殖させるのに必要な各種栄養物質、指定
された各濃度の薬剤、補酵素より遊離されるプロトンの
電子移動剤、そして生産された過酸化水素を定量する化
学発光基質である。前3者は薬剤感受性試験の対象であ
る細菌を接種するマイクロタイタープレートに安定な状
態で含有されているのが望ましい。このマイクロタイタ
ープレートに試験対象の細菌を接種する。それぞれの細
菌群に指定された培養を行った後、専用のマイクロタイ
タープレート・リーダーを用いて発光基質の添加を行い
ながらその時の化学発光量の検出を行う。その時、薬剤
の効果が認められない為に細菌の増殖がなされたプレー
ト・ウェルは大きな発光量を得る。しかしながら、薬剤
により細菌の増殖が阻止されたプレート・ウェルは極小
量またはまったく発光量の認めない発光値となる。そし
てこれら測定された発光値は定められた成績解析法によ
り各薬剤の最小発育阻止濃度が決定される。また各細菌
群の薬剤感受性試験の為の培養時間は、腸内細菌群、ブ
ドウ糖非発酵菌群、グラム陽性球菌群、そしてヘモフィ
ルス菌群は35℃・4時間(希に6時間の培養を必要と
する菌株も存在する)で大多数の菌株が現在普及してい
る方法の成績と良好な一致率を得る事ができる。The present invention can be applied to a rapid drug susceptibility test for bacteria. The components required to carry out this method are various nutrients necessary for the growth of bacteria, specified concentrations of drugs, electron transfer agents for protons released from coenzymes, and peroxidation produced. It is a chemiluminescent substrate for quantifying hydrogen. The former three are desirably contained in a stable state in a microtiter plate inoculated with the bacteria to be subjected to the drug sensitivity test. The microtiter plate is inoculated with the bacteria to be tested. After performing the culture specified for each bacterial group, the amount of chemiluminescence at that time is detected while adding a luminescent substrate using a dedicated microtiter plate reader. At that time, since the effect of the drug is not recognized, the plate well in which the bacteria are grown obtains a large luminescence. However, plate wells in which bacterial growth has been inhibited by the drug have luminescence values that are minimal or have no luminescence. Then, based on these measured luminescence values, the minimum growth inhibitory concentration of each drug is determined by a predetermined performance analysis method. The culture time for the drug susceptibility test of each bacterial group is 35 ° C for 4 hours for the enteric bacteria group, non-glucose non-fermenting bacteria group, Gram-positive cocci group, and Haemophilus bacteria group. A good agreement with the results of the method in which the majority of the strains are currently widespread can be obtained.
【0025】本発明において薬剤感受性試験に使用可能
な薬剤としては以下の物質をあげることができる。これ
らの薬剤は通常は塩として流通している。また、後に示
す実施例においてはカッコ内の略称を使用した。 供試薬剤(略称) ペニシリンG(PCG) アンピシリン(ABPC) ピペラシリン(PIPC) オキサシリン(MPIPC) セファゾリン(CEZ) セフォチアム(CTM) セフタジジム(CAZ) セフスロジン(CFS) セフォタキシム(CTX) セファクロール(CCL) アズトレオナム(AZT) フロモキセフ(FMOX) ラタモキセフ(LMOX) イミペネム(IPM) メロペネム(MEPM) クリンダマイシン(CLDM) アミカシン(AMK) アルベカシン(ABK) ミノサイクリン(MINO) トブラマイシン(TOB) バンコマイシン(VCM) エリスロマイシン(EM) クロラムフェニコール(CP) オフロキサシン(OFLX) レボフロキサシン(LVFX)In the present invention, the following substances can be used as drugs that can be used in a drug sensitivity test. These drugs are usually distributed as salts. In the examples described later, abbreviations in parentheses are used. Reagents (abbreviation) Penicillin G (PCG) Ampicillin (ABPC) Piperacillin (PIPC) Oxacillin (MPIPC) Cefazolin (CEZ) Cefotiam (CTM) Ceftazidime (CAZ) Cefthrosin (CFS) Cefotaxime (CTX) Cefaclor (CCL) Aztreo AZT) Flomoxef (FMOX) Latamoxef (LMOX) Imipenem (IPM) Meropenem (MEPM) Clindamycin (CLDM) Amikacin (AMK) Arbekacin (ABK) Minocycline (MINO) Tobramycin (TOB) Vancomycin (VCM) Eromycin (VCM) Phenicol (CP) Ofloxacin (OFLX) Levofloxacin (LVFX)
【0026】本発明は、細菌の迅速細菌同定試験方法に
も応用可能であり、具体的には以下のようにして実施す
ることができる。同定試験を施行するために必要な成分
は、特異的酵素の存在を確認する為の基質、その基質に
対する酵素反応を円滑に進める為の反応環境調整剤、補
酵素より遊離されるプロトンの電子移動剤、そして生産
された過酸化水素を定量する発光試薬である。前3者は
薬剤感受性試験と同様に予めマイクロタイタープレート
に安定な状態で含有されているのが望ましい。このマイ
クロタイタープレートに試験を必要とする細菌を接種す
る。2時間37℃でインキュベート後、専用のマイクロ
プレートリーダーを用いて発光試薬の添加を行いながら
化学発光量の測定を行う。その時、基質に特異的酵素が
認められない場合は、対照ウェルとほぼ同等またはそれ
以下の発光量となる。しかしながら、基質特異的酵素が
確認されるウェルは対照ウェルと比較すると大きな発光
量を得ることができる。そしてこれら測定された発光値
は、予め決められた成績解析法により該当菌種名が決定
される。本発明では直接基質特異的酵素の活性測定を行
うことから、インキュベーション時間は120分程度の
短時間でよく、この方法で得られた成績は現在多くの施
設で行われている方法と高い成績一致率を得ることがで
きる。The present invention is also applicable to a rapid bacterial identification test method for bacteria, and can be specifically carried out as follows. The components required for conducting the identification test are a substrate for confirming the presence of a specific enzyme, a reaction environment regulator for facilitating the enzymatic reaction to the substrate, and electron transfer of protons released from the coenzyme. It is a luminescent reagent that quantifies the agent and the produced hydrogen peroxide. It is desirable that the former three be contained in a microtiter plate in a stable state in advance similarly to the drug sensitivity test. The microtiter plate is inoculated with the bacteria requiring testing. After incubation at 37 ° C. for 2 hours, the amount of chemiluminescence is measured while adding a luminescent reagent using a dedicated microplate reader. At that time, if no specific enzyme is found in the substrate, the luminescence is almost equal to or less than that of the control well. However, a well in which a substrate-specific enzyme is confirmed can obtain a larger amount of luminescence than a control well. The names of the bacterial species are determined from these measured luminescence values by a predetermined performance analysis method. In the present invention, since the activity of the substrate-specific enzyme is directly measured, the incubation time may be as short as about 120 minutes, and the results obtained by this method are in high agreement with the methods currently used in many facilities. Rate can be obtained.
【0027】[0027]
【実施例】本発明の実施例を以下に示すが、例示は詳細
説明の為であり、発明思想の限定を意図したものではな
い。 実施例1(迅速薬剤感受性試験) 現在大多数の施設で行われている微量液体希釈法の精
度管理菌株の1つであるEscherichia coli(以下E.coli
と略す)ATCC25922 の培養された十分の数のコロニーを
滅菌生理食塩水に懸濁し、その濃度をマクファーランド
No.1濁度標準に等価な調整液を作製した。(名目菌濃度
約3×108CFU/ml) 前記調整液を名目濃度 約3×106CFU/mlとす
るため、更に滅菌生理食塩水で100倍希釈し、これを
試験用菌液とした。 予め薬剤および細菌増殖のための下記の培地が安定な
形で含有されている化学発光用マイクロタイタープレー
トに前記試験用菌液を100μl/ウェルの量で接種し
た。 [培地成分] イーストエキストラクト 0.5g ブドウ糖 1.0g 塩化ナトリウム 5.0g リン酸1カリウム 4.0g リン酸2ナトリウム 2.0g NAD 0.2g メナジオン 0.5〜10mg 水 1000ml 細菌の接種を終えたマイクロタイタープレートは、専
用の培養機の中で4時間培養した。 培養を終えたマイクロタイタープレートは、専用の化
学発光測定用マイクロプレートリーダー(ダイナテック
社製:ML−3000)にセットし、以下に示す組成の
発光試薬を同時に65μlずつ各ウェルに分注し、試薬
添加後0〜1秒までの発光量を測定した。 [発光試薬A] ルシゲニン 0.15g 水 1000ml [発光試薬B] 炭酸水素ナトリウム 67.0g 水酸化カリウム 48.0g 水 1000ml (pH11.0) 表1は、薬剤を含まない(P.C.)ウェルと各薬剤指
定濃度含有ウェルの化学発光値である。(上段に薬剤
名、中段に薬剤濃度(単位:μg/ml)、そして下段
に測定値を示した。)EXAMPLES Examples of the present invention will be described below, but the examples are for the purpose of detailed explanation and are not intended to limit the inventive concept. Example 1 (rapid drug susceptibility test) Escherichia coli (hereinafter referred to as E. coli) which is one of the precision control strains of the microfluidic dilution method currently used in most facilities.
Sufficiently cultured ATCC25922 colonies were suspended in sterile saline and the concentration was adjusted to McFarland.
An adjustment solution equivalent to the No. 1 turbidity standard was prepared. (Nominal bacterial concentration of about 3 × 10 8 CFU / ml) In order to make the above-mentioned adjusted liquid a nominal concentration of about 3 × 10 6 CFU / ml, it was further diluted 100-fold with sterile physiological saline and used as a test bacterial liquid. . The test bacterial solution was inoculated in an amount of 100 μl / well into a chemiluminescence microtiter plate previously containing a drug and the following medium for bacterial growth in a stable form. [Medium components] Yeast extract 0.5 g Glucose 1.0 g Sodium chloride 5.0 g Monopotassium phosphate 4.0 g Disodium phosphate 2.0 g NAD 0.2 g Menadione 0.5-10 mg Water 1000 ml Finished inoculation of bacteria The microtiter plate was cultured for 4 hours in a special incubator. After the culture, the microtiter plate was set in a special chemiluminescence measurement microplate reader (manufactured by Dynatech: ML-3000), and 65 μl of a luminescent reagent having the following composition was simultaneously dispensed into each well. The amount of luminescence from 0 to 1 second after the addition of the reagent was measured. [Luminescent reagent A] Lucigenin 0.15 g water 1000 ml [Luminescent reagent B] sodium bicarbonate 67.0 g potassium hydroxide 48.0 g water 1000 ml (pH 11.0) Table 1 shows wells containing no drug (PC) And the chemiluminescence values of the wells containing the specified concentration of each drug. (The upper row shows the drug name, the middle row shows the drug concentration (unit: μg / ml), and the lower row shows the measured values.)
【0028】[0028]
【表1】 [Table 1]
【0029】表1中P.C.の発光量を基に算出した
各薬剤のMIC値を以下に示す。併せて、現在多数の施
設で行われている微量液体希釈法によるMIC値も以下
に示す。なお本発明でのMICの算出は、検体発光値が
陽性コントロール発光値の20%以上を発育陽性、20
%未満を発育陰性(発育阻止)とした。In Table 1, P.I. C. The MIC value of each drug calculated based on the amount of luminescence is shown below. In addition, the MIC values obtained by the micro-liquid dilution method currently used in many facilities are also shown below. In the present invention, the MIC was calculated as follows: the sample luminescence value was 20% or more of the positive control luminescence value,
% Was regarded as growth negative (growth inhibition).
【0030】[0030]
【表2】 [Table 2]
【0031】実施例2(迅速薬剤感受性試験) 患者からの臨床材料より分離された臨床上重要と思われ
る細菌について実施例1と同様の方法で薬剤感受性試験
を行った。供試細菌と培養時間は以下に示す通りであ
る。Example 2 (Rapid drug susceptibility test) A drug susceptibility test was carried out in the same manner as in Example 1 for bacteria considered to be clinically important isolated from clinical materials from patients. The test bacteria and the culture time are as shown below.
【0032】 培養時間は化学発光法(本発明):4時間、微量液体希
釈法(従来法):20時間である。 *一部の菌株で十分な発光量の上昇あるいは発育が認め
られなかったため、化学発光法では6時間培養後に、微
量液体希釈法では45時間培養後に判定を行った。[0032] The culture time is 4 hours for the chemiluminescence method (the present invention) and 20 hours for the microfluidic dilution method (the conventional method). * Because a sufficient increase or growth of luminescence was not observed in some strains, judgment was made after culturing for 6 hours in the chemiluminescence method and after culturing for 45 hours in the trace liquid dilution method.
【0033】表3に微量液体希釈法との成績の比較を示
す。有効性は微量液体希釈法成績と本発明方法(化学発
光法)成績の一致率で報告する。またそれぞれの成績の
一致率の解釈は、両法の成績(MIC値)が1管差迄を
成績一致と見なし、2管差以上を成績不一致とした。表
3に示した結果の通り、本発明による臨床細菌に対する
薬剤感受性試験成績は、検査に費やす時間が現在多くの
施設で行われている微量液体希釈法所用時間の1/6〜
1/10に短縮化されるにも関わらず、その成績は80
%以上の成績一致が認められた。Table 3 shows a comparison of results with the microfluidic dilution method. The efficacy is reported by the agreement between the results of the microfluid dilution method and the results of the method of the present invention (chemiluminescence method). Regarding the interpretation of the matching rate of the results, the results (MIC values) of both methods were regarded as the results matching up to one tube difference, and the results were mismatched when the difference was two tubes or more. As shown in Table 3, the results of the drug susceptibility test for clinical bacteria according to the present invention were 1/6 to 1/6 of the time for the microfluidic dilution laboratory currently used in many facilities.
Despite being shortened to 1/10, the result is 80
% Or more was consistent.
【0034】[0034]
【表3】 [Table 3]
【0035】実施例3(迅速同定試験) L−リジン塩酸塩を基質とした時の種々の細菌の分解酵
素活性(対象酵素はリジンデヒドロゲナーゼ)を下記の
方法により試験した。 臨床材料より分離・保存され、予め菌種の同定がなさ
れてある下記各菌株をサブ・カルチャーし、得られた十
分の数のコロニーを滅菌生理食塩水にその濃度マクファ
ーランドNo.1濁度標準になるように調整した。(名目菌
濃度3×108CFU/ml) 1)E.coli 2)C.freundii 3)K.pneumoniae 4)E.aerogenes L−リジン塩酸塩(基質)1mg/ml、M70培
地、メナジオン0.8μg/mlが含まれているマイク
ロタイタープレートウェルに、上述細菌菌液100μl
を接種する。同時にL−リジン塩酸塩のみを含まない
マイクロタイタープレートウェルにも同様に接種する。 35℃・120分間インキュベート後、薬剤感受性試
験同様に専用のマイクロプレートリーダーを用いて各ウ
ェルの化学発光量を測定する。それぞれの測定結果(測
定発光値)を表4に示す。基質添加ウェルの発光値が基
質未添加ウェルの発光値の3倍以上の数値を示したと
き、基質利用陽性と判定した。Example 3 (Rapid Identification Test) The degrading enzyme activities of various bacteria (target enzyme was lysine dehydrogenase) using L-lysine hydrochloride as a substrate were tested by the following method. The following strains, which are separated and stored from clinical materials and whose strains have been identified in advance, are subcultured, and a sufficient number of colonies obtained are sterilized in physiological saline at a concentration of McFarland No. 1 turbidity. Adjusted to be standard. (Nominal bacterial concentration 3 × 10 8 CFU / ml) 1) E. coli 2) C. freundii 3) K. pneumoniae 4) E. aerogenes L-lysine hydrochloride (substrate) 1 mg / ml, M70 medium, menadione 0. In a microtiter plate well containing 8 μg / ml, 100 μl of the above bacterial cell solution was added.
Inoculate. At the same time, microtiter plate wells containing only L-lysine hydrochloride are similarly inoculated. After incubating at 35 ° C. for 120 minutes, the amount of chemiluminescence in each well is measured using a dedicated microplate reader as in the drug sensitivity test. Table 4 shows the measurement results (measured luminescence values). When the luminescence value of the substrate-added well showed a value three times or more the luminescence value of the substrate-free well, it was determined that the substrate was used positively.
【0036】[0036]
【表4】 [Table 4]
【0037】表4の結果から、本基質を分解する酵素
活性は、E.coli,K.pneumoniae,E.aerogenes では認めら
れるものの C.freundii では認められなかった。したが
って基質にL-リジン塩酸塩を使用してそれを分解する酵
素活性を測定することにより上述の菌群の中から短時間
で C.freundiiのみを識別することが可能であった。From the results shown in Table 4, the activity of the enzyme for degrading the present substrate was observed in E. coli, K. pneumoniae and E. aerogenes, but not in C. freundii. Therefore, by using L-lysine hydrochloride as a substrate and measuring the enzymatic activity for decomposing it, it was possible to identify only C. freundii in a short period of time from the above bacterial groups.
【0038】実施例4(迅速同定試験) クエン酸を基質とした時、種々の細菌の分解酵素活性
(対象酵素はクエン酸デヒドロゲナーゼ)を上述と同様
の方法により試験した。 菌液の作製方法及び供試株は実施例3と同様とした。 対象基質をクエン酸(1mg/ml)とし、他のマイ
クロタイタープレートへの必要成分の添加方法及び接種
方法も実施例3と同一方法で行った。 インキュベート及び測定条件についても実施例3と同
一方法で行った。なお測定結果を表5に示した。Example 4 (Rapid Identification Test) When citric acid was used as a substrate, various bacterial degrading enzyme activities (the target enzyme was citrate dehydrogenase) were tested by the same method as described above. The method for preparing the bacterial solution and the test strain were the same as in Example 3. The target substrate was citric acid (1 mg / ml), and the method of adding the necessary components to other microtiter plates and the method of inoculation were performed in the same manner as in Example 3. Incubation and measurement conditions were performed in the same manner as in Example 3. Table 5 shows the measurement results.
【0039】[0039]
【表5】 [Table 5]
【0040】表5の結果から、本基質を分解する酵素
活性は、C.freundii,K.pneumoniae,E.aerogenes では認
められるものの E.coli では認められなかった。したが
って基質にクエン酸を使用してそれを分解する酵素活性
を測定することにより、上述の菌群の中から短時間で
E.coli のみを識別することが可能であった。From the results shown in Table 5, the activity of the enzyme for degrading the present substrate was observed in C. freundii, K. pneumoniae and E. aerogenes but not in E. coli. Therefore, by measuring the enzymatic activity of decomposing it using citric acid as a substrate, it is possible to quickly
Only E.coli could be identified.
【0041】[0041]
【発明の効果】以上説明した通り、本発明は臨床細菌検
査の方法の為の発明である。現在最も多くの施設で使用
されている細菌検査法は、患者の臨床材料より分離培養
した細菌を培養18〜24時間または細菌の種類によっ
てはそれ以上の時間を費やして検査の成績を得ている。
しかし本発明による検査方法を使用すれば、臨床上重要
と思われるほとんどの細菌が薬剤感受性試験では4時間
の培養時間(希に6時間を必要とする細菌もある。)
で、そして同定試験では2時間以内(対象となる基質に
よりインキュベート時間が異なる。)で現在行われてい
る方法の成績とほぼ同等の成績を得ることができる。検
査に費やす時間を短縮化することは、より適切な患者治
療が可能となると考えられる。また、適用範囲の広いこ
とも本発明の特徴である。たとえばグラム陽性球菌のよ
うな従来の方法では化学発光反応を応用することができ
なかった菌種についても適用可能である。したがって、
本発明は医療分野の研究開発及び実際の患者治療分野の
発展に大いに貢献し得るものである。As described above, the present invention is an invention for a method of clinical bacterial examination. Bacterial testing methods currently used in most facilities use bacteria that have been isolated and cultured from clinical materials of patients for 18 to 24 hours or more depending on the type of bacteria to obtain test results. .
However, when the test method according to the present invention is used, most bacteria considered to be clinically important are cultured for 4 hours in a drug susceptibility test (some bacteria require 6 hours in rare cases).
In the identification test, the results can be obtained within about 2 hours (incubation time varies depending on the target substrate), which is almost the same as that of the method currently used. Reducing the time spent on examinations would allow for more appropriate patient treatment. Further, a wide application range is also a feature of the present invention. For example, the present invention can be applied to bacterial species such as gram-positive cocci, for which chemiluminescent reaction could not be applied by conventional methods. Therefore,
The present invention can greatly contribute to the research and development in the medical field and the development of the actual patient treatment field.
Claims (14)
内に存在する酸化還元酵素がニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドあるいはニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸を補酵素として電子移動剤を還元する作用
を、化学発光により検出することを特徴とする細菌検査
方法。1. A method of culturing bacteria in the presence of an electron transfer agent, wherein an oxidoreductase present in the cells reduces the electron transfer agent using nicotinamide adenine dinucleotide or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate as a coenzyme. A bacterial test method, wherein the bacteria are detected by chemiluminescence.
により発生する、過酸化水素を検出することを特徴とす
る請求項1の細菌検査方法。2. The method according to claim 1, wherein hydrogen peroxide generated by reduction of the electron transfer agent by the oxidoreductase is detected.
徴とする請求項2の細菌検査方法。3. The method according to claim 2, wherein the electron transfer agent is an oxidized quinone.
ン、ナフトキノン、ジフェノキノン、アントラキノンか
らなる群から選ばれたものであることを特徴とする請求
項3の細菌検査方法。4. The method according to claim 3, wherein the oxidized quinone is selected from the group consisting of menadione, benzoquinone, naphthoquinone, diphenoquinone, and anthraquinone.
徴とする請求項4の細菌検査方法。5. The method according to claim 4, wherein the oxidized quinone is menadione.
求項5の細菌検査方法。6. The method according to claim 5, wherein the bacteria to be tested are gram-positive cocci.
上、1μg/ml未満の範囲である請求項6の細菌検査
方法。7. The method according to claim 6, wherein the menadione concentration is in the range of 0.01 μg / ml or more and less than 1 μg / ml.
上、1μg/ml未満の範囲である請求項7の細菌検査
方法。8. The method according to claim 7, wherein the concentration of menadione is in the range of 0.5 μg / ml or more and less than 1 μg / ml.
誘導体、および過シュウ酸エステルからなる群から選ば
れたものであることを特徴とする請求項1の細菌検査方
法。9. The method according to claim 1, wherein the luminescent reagent is selected from the group consisting of acridine derivatives, luminol derivatives, and peroxalates.
いることを特徴とする請求項9の細菌検査方法。10. The method according to claim 9, wherein lucigenin is used as the acridine derivative.
を培養し、菌体内に存在する酸化還元酵素がニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドあるいはニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸を補酵素として電子移動剤
を還元する作用を、化学発光により検出することを特徴
とする抗菌性薬剤感受性試験方法。11. A bacterium is cultured in the presence of an antibacterial agent and an electron transfer agent, and the oxidoreductase present in the cells is nicotinamide adenine dinucleotide or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate as a coenzyme. A method for testing sensitivity to antibacterial drugs, which comprises detecting an action of reducing lipase by chemiluminescence.
と電子移動剤の存在下で細菌を培養し、菌体内に存在す
るこの酵素がニコチンアミドアデニンジヌクレオチドあ
るいはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を
補酵素として電子移動剤を還元する作用を、化学発光に
より検出することを特徴とする同定試験方法。12. A bacterium is cultured in the presence of an electron transfer agent and a substrate of a specific enzyme which serves as an indicator for identifying the bacterium, and the enzyme present in the cell is nicotinamide adenine dinucleotide or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. An identification test method comprising detecting, by chemiluminescence, an action of reducing an electron transfer agent by using as a coenzyme.
剤、ならびに電子移動剤を含む培地と、発光試薬が組み
合わされた請求項11の抗菌性薬剤感受性試験方法を実
施するためのキット。13. A kit for carrying out the method for testing antimicrobial drug susceptibility according to claim 11, wherein a luminescent reagent is combined with a nutrient necessary for the growth of bacteria, an antimicrobial agent, and a medium containing an electron transfer agent.
の指標となる特異的酵素の基質、ならびに電子移動剤を
含む培地と、発光試薬が組み合わされた請求項12の同
定試験方法を実施するためのキット。14. The identification test method according to claim 12, wherein a luminescent reagent is combined with a nutrient necessary for the growth of bacteria, a substrate of a specific enzyme serving as an indicator of bacterial identification, and a medium containing an electron transfer agent. Kit to do.
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