JPH10111295A - チトクロームｐ４５０ ２ｄ６依存性薬物の検出方法及び検出試薬キット - Google Patents
チトクロームｐ４５０ ２ｄ６依存性薬物の検出方法及び検出試薬キットInfo
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- JPH10111295A JPH10111295A JP8268792A JP26879296A JPH10111295A JP H10111295 A JPH10111295 A JP H10111295A JP 8268792 A JP8268792 A JP 8268792A JP 26879296 A JP26879296 A JP 26879296A JP H10111295 A JPH10111295 A JP H10111295A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】薬物代謝酵素であるヒトチトクロームＰ４５０
２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６）活性の特異的でかつ簡便な測
定方法、及びそれを利用したＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物の
検出方法の提供。 【構成】少なくとも(i)ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応、
（ii)ミカエリス定数が１５０μＭ以上という特性を有
する化合物を被験薬の存在下でＣＹＰ２Ｄ６と反応させ
て該化合物の生成物の生成量を測定することによるＣＹ
Ｐ２Ｄ６依存性薬物の検出方法、及びＣＹＰ２Ｄ６依存
性薬物の検出試薬キット。
２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６）活性の特異的でかつ簡便な測
定方法、及びそれを利用したＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物の
検出方法の提供。 【構成】少なくとも(i)ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応、
（ii)ミカエリス定数が１５０μＭ以上という特性を有
する化合物を被験薬の存在下でＣＹＰ２Ｄ６と反応させ
て該化合物の生成物の生成量を測定することによるＣＹ
Ｐ２Ｄ６依存性薬物の検出方法、及びＣＹＰ２Ｄ６依存
性薬物の検出試薬キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、チトクロームＰ４
５０ ２Ｄ６（本発明において、以下ＣＹＰ２Ｄ６とも
いう。）に特異的に反応する特定の基質を使用すること
によるＣＹＰ２Ｄ６の活性測定法を利用したＣＹＰ２Ｄ
６依存性薬物の検出方法及びその検出試薬キットに関す
る。
５０ ２Ｄ６（本発明において、以下ＣＹＰ２Ｄ６とも
いう。）に特異的に反応する特定の基質を使用すること
によるＣＹＰ２Ｄ６の活性測定法を利用したＣＹＰ２Ｄ
６依存性薬物の検出方法及びその検出試薬キットに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】チトクロームＰ４５０（以下、単にＰ４
５０もしくはＣＹＰともいう。）は、薬物代謝にとって
極めて重要な酵素であり、この酵素を介しておこる薬物
相互間の作用には重要なものが多い。これらの相互作用
の多くは、Ｐ４５０が特定の薬物より阻害または誘導を
受けることによって惹起される。Ｐ４５０の阻害または
誘導を起こす薬物としては、サルファ剤、マクロライド
系抗生物質、アゾール系の抗真菌剤、抗癲癇薬など多く
の薬物が知られている。これらの薬物は、Ｐ４５０で代
謝されるすべての医薬品と相互作用を起こすわけでな
く、ある特定の薬物群の代謝を阻害または誘導する。
５０もしくはＣＹＰともいう。）は、薬物代謝にとって
極めて重要な酵素であり、この酵素を介しておこる薬物
相互間の作用には重要なものが多い。これらの相互作用
の多くは、Ｐ４５０が特定の薬物より阻害または誘導を
受けることによって惹起される。Ｐ４５０の阻害または
誘導を起こす薬物としては、サルファ剤、マクロライド
系抗生物質、アゾール系の抗真菌剤、抗癲癇薬など多く
の薬物が知られている。これらの薬物は、Ｐ４５０で代
謝されるすべての医薬品と相互作用を起こすわけでな
く、ある特定の薬物群の代謝を阻害または誘導する。
【０００３】チトクロームＰ４５０がなぜ特定の薬物群
の代謝を阻害または誘導するのかについての研究は、こ
こ数年で急速に進展している。また、多種存在するとい
われるＰ４５０の分子種が、遺伝子クローニング、酵素
の分離精製技術、遺伝多型性の分析技術等の向上によっ
て詳細に分類できるようになり、個々の分子種がどの薬
物によって阻害または誘導されるのかが明らかになりつ
つある。
の代謝を阻害または誘導するのかについての研究は、こ
こ数年で急速に進展している。また、多種存在するとい
われるＰ４５０の分子種が、遺伝子クローニング、酵素
の分離精製技術、遺伝多型性の分析技術等の向上によっ
て詳細に分類できるようになり、個々の分子種がどの薬
物によって阻害または誘導されるのかが明らかになりつ
つある。
【０００４】実際、動物種差、人種差はもとより、更に
は個人差によっても遺伝的に特定のＰ４５０分子種（酵
素）を欠損する例があることがわかっており、このため
特定の症例においては薬物の作用が異常に強く出現した
り副作用が増強することが知られている。
は個人差によっても遺伝的に特定のＰ４５０分子種（酵
素）を欠損する例があることがわかっており、このため
特定の症例においては薬物の作用が異常に強く出現した
り副作用が増強することが知られている。
【０００５】一方、新規薬物の開発においては、ヒトに
おける薬物の代謝、効果、毒性を早期に予測・評価する
ために、各種薬物が対応するＰ４５０の分子種、その分
布及び存在量を測定することが重要となっている。Ｐ４
５０の多数の分子種のうち、ヒトの薬物代謝にかかわる
Ｐ４５０分子種は１５種類以上存在するといわれるが、
その中でも医薬品の代謝に重要な役割を果たしているも
のは、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、
ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４と呼ばれるの５つの分子種
であり、９５％以上の医薬品についての代謝はこれらの
Ｐ４５０で説明ができると言われている。
おける薬物の代謝、効果、毒性を早期に予測・評価する
ために、各種薬物が対応するＰ４５０の分子種、その分
布及び存在量を測定することが重要となっている。Ｐ４
５０の多数の分子種のうち、ヒトの薬物代謝にかかわる
Ｐ４５０分子種は１５種類以上存在するといわれるが、
その中でも医薬品の代謝に重要な役割を果たしているも
のは、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、
ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４と呼ばれるの５つの分子種
であり、９５％以上の医薬品についての代謝はこれらの
Ｐ４５０で説明ができると言われている。
【０００６】また、臨床においては、同じＰ４５０分子
種で代謝される薬剤を併用した場合、２つの薬剤は相互
に代謝を競合的に阻害し、いずれの薬剤の代謝クリアラ
ンスも低下することが知られている。
種で代謝される薬剤を併用した場合、２つの薬剤は相互
に代謝を競合的に阻害し、いずれの薬剤の代謝クリアラ
ンスも低下することが知られている。
【０００７】Ｐ４５０分子種のうち特にＣＹＰ２Ｄ６に
関して、ＣＹＰ２Ｄ６により代謝される薬剤メトプロロ
ール（β遮断剤）とプロパフェノン（抗不整脈剤）と同
時に投与した場合、メトプロロールのＡＵＣ(Area Unde
r Concentration：血中濃度時間曲線化面積）が平均で
２倍に増加し、プロパフェノンのＡＵＣも約２０％増加
したという報告がある。
関して、ＣＹＰ２Ｄ６により代謝される薬剤メトプロロ
ール（β遮断剤）とプロパフェノン（抗不整脈剤）と同
時に投与した場合、メトプロロールのＡＵＣ(Area Unde
r Concentration：血中濃度時間曲線化面積）が平均で
２倍に増加し、プロパフェノンのＡＵＣも約２０％増加
したという報告がある。
【０００８】また、作用上もしくは臨床的に同時に投与
される薬物が共にＣＹＰ２Ｄ６によって代謝される薬物
である場合には（例えば、シメチジンとプロプラノロー
ル又はイミプラミン等の組み合わせが挙げられる。）、
ＡＵＣの増加等によって単独投与のケースからは予測で
きない副作用を招くおそれが懸念される。さらにＣＹＰ
２Ｄ６の活性を阻害する各種薬物の存在が知られている
が、これらの薬物を他の薬物と併用すると、該他の薬物
の効果が増強されて思わぬ副作用を招くおそれがあり、
殊更、該薬物がＣＹＰ２Ｄ６以外の酵素では代謝されな
いものである場合はその安全性が問題となる。
される薬物が共にＣＹＰ２Ｄ６によって代謝される薬物
である場合には（例えば、シメチジンとプロプラノロー
ル又はイミプラミン等の組み合わせが挙げられる。）、
ＡＵＣの増加等によって単独投与のケースからは予測で
きない副作用を招くおそれが懸念される。さらにＣＹＰ
２Ｄ６の活性を阻害する各種薬物の存在が知られている
が、これらの薬物を他の薬物と併用すると、該他の薬物
の効果が増強されて思わぬ副作用を招くおそれがあり、
殊更、該薬物がＣＹＰ２Ｄ６以外の酵素では代謝されな
いものである場合はその安全性が問題となる。
【０００９】このような薬物の相互作用は、予め薬物が
どの型のＰ４５０分子種で代謝されるか、またどの種の
薬物がＰ４５０活性を阻害するかを知ることにより、あ
る程度予測可能である。薬物の有効量、副作用の発現量
に影響を及ぼすこれら特定のＰ４５０種の分布、存在量
を知ることは臨床上あるいは新規な薬剤を開発する上で
必要欠くことができない。
どの型のＰ４５０分子種で代謝されるか、またどの種の
薬物がＰ４５０活性を阻害するかを知ることにより、あ
る程度予測可能である。薬物の有効量、副作用の発現量
に影響を及ぼすこれら特定のＰ４５０種の分布、存在量
を知ることは臨床上あるいは新規な薬剤を開発する上で
必要欠くことができない。
【００１０】このような背景の下、従来から特にヒトで
の薬物の代謝、効果、毒性などの早期の評価のために、
Ｐ４５０の分子種を正確に評価する方法の開発が望まれ
ていた。Ｐ４５０を測定する方法としては、抗体を用い
た免疫学的測定があるが、生体内での存在意義を考える
と特定のＰ４５０に特異的に反応する基質薬物を用いて
活性を測定することが好ましい。しかし、多くの薬物は
複数のＰ４５０種に反応し、唯一のＰ４５０種に反応す
る薬物は少なく、特定のＰ４５０種測定のための基質と
して理想的なものは未だないのが現状である。
の薬物の代謝、効果、毒性などの早期の評価のために、
Ｐ４５０の分子種を正確に評価する方法の開発が望まれ
ていた。Ｐ４５０を測定する方法としては、抗体を用い
た免疫学的測定があるが、生体内での存在意義を考える
と特定のＰ４５０に特異的に反応する基質薬物を用いて
活性を測定することが好ましい。しかし、多くの薬物は
複数のＰ４５０種に反応し、唯一のＰ４５０種に反応す
る薬物は少なく、特定のＰ４５０種測定のための基質と
して理想的なものは未だないのが現状である。
【００１１】また、従来からＣＹＰ２Ｄ６に比較的特異
的な薬物としてはブフラロールが知られており、反応基
質として測定に用いられているが、その特異性は十分で
なく、より特異性に優れる基質の開発、並びにそれを用
いたＣＹＰ２Ｄ６の特異的検出法が求められていた。
的な薬物としてはブフラロールが知られており、反応基
質として測定に用いられているが、その特異性は十分で
なく、より特異性に優れる基質の開発、並びにそれを用
いたＣＹＰ２Ｄ６の特異的検出法が求められていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＣＹＰ２Ｄ
６依存性薬物の検出方法及び検出試薬キットを提供する
ことを目的とするものである。
６依存性薬物の検出方法及び検出試薬キットを提供する
ことを目的とするものである。
【００１３】当該発明は、Ｐ４５０分子種のうち特にＣ
ＹＰ２Ｄ６に、従来基質として使用されているブフラロ
ールよりも優れた特異性をもって反応する基質の発見に
基づくものであって、かかる基質を用いることによるＣ
ＹＰ２Ｄ６活性の選択的な測定方法を基礎とするもので
ある。
ＹＰ２Ｄ６に、従来基質として使用されているブフラロ
ールよりも優れた特異性をもって反応する基質の発見に
基づくものであって、かかる基質を用いることによるＣ
ＹＰ２Ｄ６活性の選択的な測定方法を基礎とするもので
ある。
【００１４】従って、本発明は、ＣＹＰ２Ｄ６に特異的
に反応する基質の提供、及びかかる基質を用いることに
よるＣＹＰ２Ｄ６活性測定方法の提供をも目的とするも
のである。
に反応する基質の提供、及びかかる基質を用いることに
よるＣＹＰ２Ｄ６活性測定方法の提供をも目的とするも
のである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来技術の問題点を解決すべく、鋭意研究を重ねていたと
ころ、偶然にも、多くの薬物代謝に関与する数種のＰ４
５０分子種のうちＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応する化合
物を見つけ、(1)その特異性が従来の公知の基質である
ブフラロールより優れて高いこと、(2)ミカエリス定数
が１５０μＭ以上と、従来ＣＹＰ２Ｄ６によって代謝さ
れることが知られている薬物より顕著に大きいこと等、
該化合物がＣＹＰ２Ｄ６の活性を検出する基質として理
想的な特性を有していることを確認した。
来技術の問題点を解決すべく、鋭意研究を重ねていたと
ころ、偶然にも、多くの薬物代謝に関与する数種のＰ４
５０分子種のうちＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応する化合
物を見つけ、(1)その特異性が従来の公知の基質である
ブフラロールより優れて高いこと、(2)ミカエリス定数
が１５０μＭ以上と、従来ＣＹＰ２Ｄ６によって代謝さ
れることが知られている薬物より顕著に大きいこと等、
該化合物がＣＹＰ２Ｄ６の活性を検出する基質として理
想的な特性を有していることを確認した。
【００１６】本発明者らは、かかる知見に基づいて、か
かる化合物を基質としたＣＹＰ２Ｄ６活性の選択的測定
方法を開発するとともに、かかる測定方法を基礎とした
Ｐ４５０２Ｄ６依存性薬物の検出方法を確立するに至っ
た。
かる化合物を基質としたＣＹＰ２Ｄ６活性の選択的測定
方法を開発するとともに、かかる測定方法を基礎とした
Ｐ４５０２Ｄ６依存性薬物の検出方法を確立するに至っ
た。
【００１７】すなわち、本発明は、次の項１〜項４であ
る。
る。
【００１８】項１：次の特性： （ｉ）ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応する （ii）ミカエリス定数が１５０μＭ以上である を少なくとも有する化合物を被験薬の存在下でＣＹＰ２
Ｄ６と反応させて、該化合物の生成物の生成量を測定す
ることによる、ＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物の検出方法。
Ｄ６と反応させて、該化合物の生成物の生成量を測定す
ることによる、ＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物の検出方法。
【００１９】項２：カルテオロールを被験薬の存在下で
ＣＹＰ２Ｄ６と反応させて、８−水酸化カルテオロール
の生成量を測定することを特徴とする項１記載のＣＹＰ
２Ｄ６依存性薬物の検出方法。
ＣＹＰ２Ｄ６と反応させて、８−水酸化カルテオロール
の生成量を測定することを特徴とする項１記載のＣＹＰ
２Ｄ６依存性薬物の検出方法。
【００２０】項３：ＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物を検出する
ための試薬キットであって、 （ｉ）ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応する （ii）ミカエリス定数が１５０μＭ以上である という特性を有する化合物、及びＣＹＰ２Ｄ６を少なく
とも含有する試薬キット。
ための試薬キットであって、 （ｉ）ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応する （ii）ミカエリス定数が１５０μＭ以上である という特性を有する化合物、及びＣＹＰ２Ｄ６を少なく
とも含有する試薬キット。
【００２１】項４：化合物が、カルテオロールである項
３記載のＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物の検出試薬キット。
３記載のＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物の検出試薬キット。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明のＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物
の検出方法は、被験薬を、少なくとも （ｉ）ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応する （ii）ミカエリス定数が１５０μＭ以上である という特性を有する化合物の存在下でＣＹＰ２Ｄ６と反
応させて、該化合物の生成物の生成量を測定することを
特徴とするものである。
の検出方法は、被験薬を、少なくとも （ｉ）ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応する （ii）ミカエリス定数が１５０μＭ以上である という特性を有する化合物の存在下でＣＹＰ２Ｄ６と反
応させて、該化合物の生成物の生成量を測定することを
特徴とするものである。
【００２３】かかるＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物の検出方法
は、上記(i)及び(ii)の特性を有する化合物を基質とし
て用いることを特徴としたＣＹＰ２Ｄ６の活性測定法を
基礎とするものである。
は、上記(i)及び(ii)の特性を有する化合物を基質とし
て用いることを特徴としたＣＹＰ２Ｄ６の活性測定法を
基礎とするものである。
【００２４】そこで、まず本発明の基礎となるＣＹＰ２
Ｄ６の活性測定法について説明する。
Ｄ６の活性測定法について説明する。
【００２５】かかる測定法は上述するように少なくとも
上記の(i)及び(ii)の特性を有する化合物を基質として
使用するものである。
上記の(i)及び(ii)の特性を有する化合物を基質として
使用するものである。
【００２６】(i)でいうＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応す
るとは、基質化合物がＣＹＰ２Ｄ６以外のＰ４５０分子
種、特に薬物代謝に関して重要でかつヒト肝臓中の含有
量の多いＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｅ１及
びＣＹＰ３Ａ４の各分子種、遺伝的多型性を示すＣＹＰ
２Ｃ１９によっては、実質的に代謝・分解されないこと
を意味するものであり、かかる性質は多数の酵素が存在
する肝臓に由来するＣＹＰ２Ｄ６の活性を選択的にかつ
正確に測定する上では極めて重要な性質である。
るとは、基質化合物がＣＹＰ２Ｄ６以外のＰ４５０分子
種、特に薬物代謝に関して重要でかつヒト肝臓中の含有
量の多いＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｅ１及
びＣＹＰ３Ａ４の各分子種、遺伝的多型性を示すＣＹＰ
２Ｃ１９によっては、実質的に代謝・分解されないこと
を意味するものであり、かかる性質は多数の酵素が存在
する肝臓に由来するＣＹＰ２Ｄ６の活性を選択的にかつ
正確に測定する上では極めて重要な性質である。
【００２７】また、ＣＹＰ２Ｄ６に対する特異性が高い
ことを理由に従来基質として用いられていたブフラロー
ルのＣＹＰ２Ｄ６に対するＫｍ値（ミカエリス定数）は
６１μＭであるのに対して、本発明で用いる基質化合物
のＫｍ値（ミカエリス定数）は１５０μＭ以上、好まし
くは１５０〜１０００μＭ、より好ましくは１８０〜５
００μＭと著しく大きいが、このことからも、当該基質
化合物がＣＹＰ２Ｄ６に対して高い特異性を有している
ことが分かる。
ことを理由に従来基質として用いられていたブフラロー
ルのＣＹＰ２Ｄ６に対するＫｍ値（ミカエリス定数）は
６１μＭであるのに対して、本発明で用いる基質化合物
のＫｍ値（ミカエリス定数）は１５０μＭ以上、好まし
くは１５０〜１０００μＭ、より好ましくは１８０〜５
００μＭと著しく大きいが、このことからも、当該基質
化合物がＣＹＰ２Ｄ６に対して高い特異性を有している
ことが分かる。
【００２８】本発明において、基質として用いられる化
合物は、上記 (i）及び(ii）の特性を有するものであれ
ば特に制限はされないが、更に、下記の(iii)乃至(v)の
特性を有していても良い。
合物は、上記 (i）及び(ii）の特性を有するものであれ
ば特に制限はされないが、更に、下記の(iii)乃至(v)の
特性を有していても良い。
【００２９】(iii）ＣＹＰ２Ｄ６を活性化及び／又は阻
害しない (iv) ＣＹＰ２Ｄ６との反応により単一の生成物を生じ
る (v) 該生成物が容易に測定できる 薬物によってはＰ４５０の活性が誘導もしくは阻害され
ることが知られているが、(iii)の性質を有する化合物
は、本来ＣＹＰ２Ｄ６が有する活性を正確に測定できる
点で有用である。さらに、ＣＹＰ２Ｄ６との反応により
実質的に単一の生成物を生じ、かつ 該生成物が容易に
測定できるという性質は、それを基質とした場合にＣＹ
Ｐ２Ｄ６の活性を正確にかつ簡便に測定できる点で有用
である。
害しない (iv) ＣＹＰ２Ｄ６との反応により単一の生成物を生じ
る (v) 該生成物が容易に測定できる 薬物によってはＰ４５０の活性が誘導もしくは阻害され
ることが知られているが、(iii)の性質を有する化合物
は、本来ＣＹＰ２Ｄ６が有する活性を正確に測定できる
点で有用である。さらに、ＣＹＰ２Ｄ６との反応により
実質的に単一の生成物を生じ、かつ 該生成物が容易に
測定できるという性質は、それを基質とした場合にＣＹ
Ｐ２Ｄ６の活性を正確にかつ簡便に測定できる点で有用
である。
【００３０】本発明において、基質として用いられる具
体的な化合物として好ましくはカルテオロールが例示さ
れる。カルテオロールのＣＹＰ２Ｄ６に対する反応のミ
カエリス定数は１５０μＭ以上であるが、より具体的に
は、ヒト肝ＣＹＰ２Ｄ６による８−水酸化カルテオロー
ル生成の初速度をラインウィーバー・バーク・プロット
して得られたミカエリス定数は、約１８３μＭであった
（図１参照）。
体的な化合物として好ましくはカルテオロールが例示さ
れる。カルテオロールのＣＹＰ２Ｄ６に対する反応のミ
カエリス定数は１５０μＭ以上であるが、より具体的に
は、ヒト肝ＣＹＰ２Ｄ６による８−水酸化カルテオロー
ル生成の初速度をラインウィーバー・バーク・プロット
して得られたミカエリス定数は、約１８３μＭであった
（図１参照）。
【００３１】なお、かかるカルテオロールは、塩酸、硫
酸等の無機酸もしくは有機酸とともに塩を形成していて
もよい。
酸等の無機酸もしくは有機酸とともに塩を形成していて
もよい。
【００３２】カルテロールは下記反応式中、式（１）で
示される５−〔３−（ｔ−ブチルアミノ）−２−ヒドロ
キシプロポキシ〕−３,４−ジヒドロカルボスチリルで
あり、ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応して、縮合環の８位
が水酸化されることにより、単一の化合物、すなわち下
式中、式（２）で示される８−水酸化カルテオロールを
生成する。
示される５−〔３−（ｔ−ブチルアミノ）−２−ヒドロ
キシプロポキシ〕−３,４−ジヒドロカルボスチリルで
あり、ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応して、縮合環の８位
が水酸化されることにより、単一の化合物、すなわち下
式中、式（２）で示される８−水酸化カルテオロールを
生成する。
【００３３】
【化１】
【００３４】上記反応により生成される８−水酸化カル
テオロールは、オクタデシルシリカ（ＯＤＳ）系などの
常法の樹脂を充填したカラムを備えた液体クロマトグラ
フィー等を用いることによって、基質であるカルテオロ
ールと容易に分離することができ、また、吸光光度計
（波長：２５４ｎｍ）で容易に検出できる。
テオロールは、オクタデシルシリカ（ＯＤＳ）系などの
常法の樹脂を充填したカラムを備えた液体クロマトグラ
フィー等を用いることによって、基質であるカルテオロ
ールと容易に分離することができ、また、吸光光度計
（波長：２５４ｎｍ）で容易に検出できる。
【００３５】なおＣＹＰ２Ｄ６の活性測定は、例えば次
のように行われる。
のように行われる。
【００３６】塩酸カルテオロール、β-ＮＡＤＰＨ及び
β-ＮＡＤＨを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７〜８、好
適にはｐＨ７．５程度）に、ＣＹＰ２Ｄ６活性を測定す
べき目的の被測定物を加えて３５〜４０℃、好ましくは
３７℃程度で５〜２０分間、好ましくは１０分間程度イ
ンキュベートした後、反応停止液を加えて反応を停止す
る。この溶液に酢酸エチルを加え振盪抽出後、遠心分離
する。有機相に窒素ガスを通じて乾燥した後メタノール
で溶かし、ＨＰＬＣで波長２５４ｎｍにて生成される８
−水酸化カルテオロールを検出し、産生量を求める。
β-ＮＡＤＨを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７〜８、好
適にはｐＨ７．５程度）に、ＣＹＰ２Ｄ６活性を測定す
べき目的の被測定物を加えて３５〜４０℃、好ましくは
３７℃程度で５〜２０分間、好ましくは１０分間程度イ
ンキュベートした後、反応停止液を加えて反応を停止す
る。この溶液に酢酸エチルを加え振盪抽出後、遠心分離
する。有機相に窒素ガスを通じて乾燥した後メタノール
で溶かし、ＨＰＬＣで波長２５４ｎｍにて生成される８
−水酸化カルテオロールを検出し、産生量を求める。
【００３７】本発明ＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物の検出方法
は、上記方法によるＣＹＰ２Ｄ６活性の測定を被験薬の
存在下で行うことを特徴とするものである。
は、上記方法によるＣＹＰ２Ｄ６活性の測定を被験薬の
存在下で行うことを特徴とするものである。
【００３８】上述するように本発明で基質として用いる
化合物は、１５０μＭ以上のミカエリス定数を有するも
のであるが、かかる値は従来ＣＹＰ２Ｄ６で代謝される
ことが知られている化合物のミカエリス定数の値より高
く（例えば、ブフラロールは６１μＭ、スパルテインは
７３μＭ、デブリソキンは１３０μＭ）、このことは当
該基質化合物が、他の化合物（被験薬）のＣＹＰ２Ｄ６
に対する親和性、即ち被験薬のＣＹＰ２Ｄ６に対する依
存性の程度を測る指標として有用であることを意味して
いる。
化合物は、１５０μＭ以上のミカエリス定数を有するも
のであるが、かかる値は従来ＣＹＰ２Ｄ６で代謝される
ことが知られている化合物のミカエリス定数の値より高
く（例えば、ブフラロールは６１μＭ、スパルテインは
７３μＭ、デブリソキンは１３０μＭ）、このことは当
該基質化合物が、他の化合物（被験薬）のＣＹＰ２Ｄ６
に対する親和性、即ち被験薬のＣＹＰ２Ｄ６に対する依
存性の程度を測る指標として有用であることを意味して
いる。
【００３９】すなわち、被験薬の存在下で上記特性(i)
及び(ii)を有する化合物をＣＹＰ２Ｄ６と反応させた際
に、該化合物の生成物の産生が阻害される場合は、被験
薬の方が該化合物よりもＣＹＰ２Ｄ６に対する親和性が
高いこと、即ち被験薬がＣＹＰ２Ｄ６依存性であること
を意味する。
及び(ii)を有する化合物をＣＹＰ２Ｄ６と反応させた際
に、該化合物の生成物の産生が阻害される場合は、被験
薬の方が該化合物よりもＣＹＰ２Ｄ６に対する親和性が
高いこと、即ち被験薬がＣＹＰ２Ｄ６依存性であること
を意味する。
【００４０】例えば被験薬と共存させる基質化合物とし
てカルテオロールを用いる場合は、カルテオロールの８
位水酸化反応を追跡することによって、他の任意の薬物
（化合物）のＣＹＰ２Ｄ６に対する親和性を測ることが
できる。
てカルテオロールを用いる場合は、カルテオロールの８
位水酸化反応を追跡することによって、他の任意の薬物
（化合物）のＣＹＰ２Ｄ６に対する親和性を測ることが
できる。
【００４１】なお、本発明においてＣＹＰ２Ｄ６依存性
薬物であるとは、ＣＹＰ２Ｄ６によって代謝を受ける薬
物であること、又はＣＹＰ２Ｄ６の活性を阻害する薬物
であることの両者の意味が包含されるが、これは上記す
る化合物の代謝生成物の産生阻害が被験薬の濃度に依存
するか否かをみることにより区別することができる。す
なわち、共存させる被験薬の濃度にかかわらず、化合物
の代謝生成物の産生が阻害される場合は、その被験薬は
ＣＹＰ２Ｄ６に対する阻害剤として位置づけられ、また
被験薬の濃度に依存して化合物の代謝生成物の産生が阻
害される場合は、該被験薬はＣＹＰ２Ｄ６の反応基質
（代謝系薬物）として位置づけられる。
薬物であるとは、ＣＹＰ２Ｄ６によって代謝を受ける薬
物であること、又はＣＹＰ２Ｄ６の活性を阻害する薬物
であることの両者の意味が包含されるが、これは上記す
る化合物の代謝生成物の産生阻害が被験薬の濃度に依存
するか否かをみることにより区別することができる。す
なわち、共存させる被験薬の濃度にかかわらず、化合物
の代謝生成物の産生が阻害される場合は、その被験薬は
ＣＹＰ２Ｄ６に対する阻害剤として位置づけられ、また
被験薬の濃度に依存して化合物の代謝生成物の産生が阻
害される場合は、該被験薬はＣＹＰ２Ｄ６の反応基質
（代謝系薬物）として位置づけられる。
【００４２】本発明のＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物の検出方
法によれば、任意の薬物（被験薬）がＣＹＰ２Ｄ６代謝
薬物であるか否か、ＣＹＰ２Ｄ６に対する依存性の程
度、被験薬がＣＹＰ２Ｄ６阻害剤であるか否かを調べる
ことができ、これをもとに各種薬物の安全でかつ効果が
確実な投与方法を設定することができる。特に、従来か
ら各種薬物の併用によって作用が増強され副作用が生じ
るケースが知られているが、このような併用による副作
用の発現を予測して最小限に抑えることができる点で有
用である。
法によれば、任意の薬物（被験薬）がＣＹＰ２Ｄ６代謝
薬物であるか否か、ＣＹＰ２Ｄ６に対する依存性の程
度、被験薬がＣＹＰ２Ｄ６阻害剤であるか否かを調べる
ことができ、これをもとに各種薬物の安全でかつ効果が
確実な投与方法を設定することができる。特に、従来か
ら各種薬物の併用によって作用が増強され副作用が生じ
るケースが知られているが、このような併用による副作
用の発現を予測して最小限に抑えることができる点で有
用である。
【００４３】本発明のＣＹＰ２Ｄ６依然性薬物の検出方
法の一実施態様として、具体的には次の方法が例示され
る。
法の一実施態様として、具体的には次の方法が例示され
る。
【００４４】リン酸緩衝液（ｐＨ７〜８、好ましくはｐ
Ｈ７．５程度）に塩酸カルテオロール、β-ＮＡＤＰ
Ｈ、β-ＮＡＤＨ及びＣＹＰ２Ｄ６を加えてなるＣＹＰ
２Ｄ６活性測定系に、目的とする被験薬物を添加して３
０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で５〜２０分間、好
ましくは１０分間程度インキュベートした後、反応停止
液を加えて反応を停止する。この溶液に酢酸エチルを加
え振盪抽出後、遠心分離する。有機相に窒素ガスを通じ
て乾燥した後メタノールで溶かし、ＨＰＬＣで波長２５
４ｎｍにて、産生される８−水酸化カルテオロールを検
出しその生成量を測定する。そして、その生成量と、予
め対照として被験薬物を添加しない系で測定した８−水
酸化カルテオロールの生成量とを比較することにより、
被験薬物のＣＹＰ２Ｄ６に対する親和性の程度、依存性
の程度を知ることができる。
Ｈ７．５程度）に塩酸カルテオロール、β-ＮＡＤＰ
Ｈ、β-ＮＡＤＨ及びＣＹＰ２Ｄ６を加えてなるＣＹＰ
２Ｄ６活性測定系に、目的とする被験薬物を添加して３
０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で５〜２０分間、好
ましくは１０分間程度インキュベートした後、反応停止
液を加えて反応を停止する。この溶液に酢酸エチルを加
え振盪抽出後、遠心分離する。有機相に窒素ガスを通じ
て乾燥した後メタノールで溶かし、ＨＰＬＣで波長２５
４ｎｍにて、産生される８−水酸化カルテオロールを検
出しその生成量を測定する。そして、その生成量と、予
め対照として被験薬物を添加しない系で測定した８−水
酸化カルテオロールの生成量とを比較することにより、
被験薬物のＣＹＰ２Ｄ６に対する親和性の程度、依存性
の程度を知ることができる。
【００４５】本発明のＣＹＰ２Ｄ６依存性薬物の検出試
薬キットは、上記検出法に用いられて有用なものであ
り、前述の(i)及び(ii)の特性を有する化合物、及びＣ
ＹＰ２Ｄ６を少なくとも含むものである。なお、これら
は、試薬キット自身によって反応が進行しないように調
製されていればよく、例えばＣＹＰ２Ｄ６と基質化合物
とが異なる系から構成される試薬キットであって用時混
合して使用されるものであってもよい。本発明の試薬キ
ットは、必要に応じて例えば、ＮＡＤＰＨ又は／及びＮ
ＡＤＨ等の補酵素、反応停止剤、酢酸エチル等の抽出
液、メタノール等の溶解用液等を含んでいてもよい。
薬キットは、上記検出法に用いられて有用なものであ
り、前述の(i)及び(ii)の特性を有する化合物、及びＣ
ＹＰ２Ｄ６を少なくとも含むものである。なお、これら
は、試薬キット自身によって反応が進行しないように調
製されていればよく、例えばＣＹＰ２Ｄ６と基質化合物
とが異なる系から構成される試薬キットであって用時混
合して使用されるものであってもよい。本発明の試薬キ
ットは、必要に応じて例えば、ＮＡＤＰＨ又は／及びＮ
ＡＤＨ等の補酵素、反応停止剤、酢酸エチル等の抽出
液、メタノール等の溶解用液等を含んでいてもよい。
【００４６】ここで用いられるＣＹＰ２Ｄ６はその起源
によって特に限定されないが、好ましくはヒトの肝臓由
来のものである。また取得の由来や精製度等も特に制限
されず、ＣＹＰ２Ｄ６を含むものであれば、肝ミクロソ
ーム抽出物、肝臓ホモジネートであってもよく、また遺
伝子組換え技術によって産生されるＣＹＰ２Ｄ６、もし
くは培養抽出物であってもよい。好ましくは肝ミクロソ
ーム抽出分である。
によって特に限定されないが、好ましくはヒトの肝臓由
来のものである。また取得の由来や精製度等も特に制限
されず、ＣＹＰ２Ｄ６を含むものであれば、肝ミクロソ
ーム抽出物、肝臓ホモジネートであってもよく、また遺
伝子組換え技術によって産生されるＣＹＰ２Ｄ６、もし
くは培養抽出物であってもよい。好ましくは肝ミクロソ
ーム抽出分である。
【００４７】なお、本発明には、前述するＣＹＰ２Ｄ６
依存性薬物の検出方法及び検出試薬キットに加えて、次
の項５及び項６に掲げるＣＹＰ２Ｄ６の活性測定用試薬
及び活性測定方法が含まれる。
依存性薬物の検出方法及び検出試薬キットに加えて、次
の項５及び項６に掲げるＣＹＰ２Ｄ６の活性測定用試薬
及び活性測定方法が含まれる。
【００４８】項５：次の特性： （i）ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応する (ii) ミカエリス定数が１５０μＭ以上である を少なくとも有する化合物、好ましくはカルテオロール
を含むことを特徴とするＣＹＰ２Ｄ６の活性測定用試
薬。
を含むことを特徴とするＣＹＰ２Ｄ６の活性測定用試
薬。
【００４９】項６：被測定物と、次の特性： （i）ＣＹＰ２Ｄ６に特異的に反応する (ii) ミカエリス定数が１５０μＭ以上である を有する化合物（好ましくはカルテオロール）とを混合
して、該混合物中で生成される該化合物の生成物（例え
ば８−水酸化カルテオロール）を測定することを特徴と
するＣＹＰ２Ｄ６の選択的活性測定方法。
して、該混合物中で生成される該化合物の生成物（例え
ば８−水酸化カルテオロール）を測定することを特徴と
するＣＹＰ２Ｄ６の選択的活性測定方法。
【００５０】ＣＹＰ２Ｄ６の活性測定用試薬は、基質と
して少なくとも上記(i)及び(ii)の特性を有する化合物
を含むことを特徴とするものであり、かかる基質の特性
に基づいてＣＹＰ２Ｄ６の活性が選択的にかつ簡便に測
定できる点で有用な試薬である。また、上記化合物は、
(iii）ＣＹＰ２Ｄ６を活性化及び／又は阻害しない、(i
v)ＣＹＰ２Ｄ６との反応により単一の生成物を生じる、
及び(v) 該生成物が容易に測定できるという性質を有し
ていても良い。
して少なくとも上記(i)及び(ii)の特性を有する化合物
を含むことを特徴とするものであり、かかる基質の特性
に基づいてＣＹＰ２Ｄ６の活性が選択的にかつ簡便に測
定できる点で有用な試薬である。また、上記化合物は、
(iii）ＣＹＰ２Ｄ６を活性化及び／又は阻害しない、(i
v)ＣＹＰ２Ｄ６との反応により単一の生成物を生じる、
及び(v) 該生成物が容易に測定できるという性質を有し
ていても良い。
【００５１】本発明の試薬は、少なくとも上記化合物を
含むものであればよいが、他の成分としてＮＡＤＨ、Ｎ
ＡＤＰＨ等の補酵素等が含まれていてもよい。
含むものであればよいが、他の成分としてＮＡＤＨ、Ｎ
ＡＤＰＨ等の補酵素等が含まれていてもよい。
【００５２】本発明の試薬の測定対象はＣＹＰ２Ｄ６で
あり、好ましくは肝組織、肝ミクロソーム画分、遺伝子
発現系細胞に含まれるＣＹＰ２Ｄ６である。
あり、好ましくは肝組織、肝ミクロソーム画分、遺伝子
発現系細胞に含まれるＣＹＰ２Ｄ６である。
【００５３】本発明の試薬は、その用途や使用方法によ
って特に限定されないが、例えば次のように用いること
も可能である。
って特に限定されないが、例えば次のように用いること
も可能である。
【００５４】(1)本発明の試薬をヒトもしくは他の哺乳
動物に経口投与し、投与後尿中に排泄される基質化合物
の生成物、例えば８−水酸化カルテオロール量を測定す
る。
動物に経口投与し、投与後尿中に排泄される基質化合物
の生成物、例えば８−水酸化カルテオロール量を測定す
る。
【００５５】これにより、ヒトもしくは動物の肝臓中の
ＣＹＰ２Ｄ６活性を評価することができる。
ＣＹＰ２Ｄ６活性を評価することができる。
【００５６】一般に薬物を患者に投与してから薬効が発
揮されるまでには、吸収、分布、代謝及び排泄などの種
々の過程が介在している。これらのうち、特に代謝は肝
臓に存在する酵素量や活性等に依存するものであり、個
体差によって大きく影響される。従って、代謝等による
薬物の体内動態を適格に把握することは、個々の患者に
合った合理的な投与方法（投与経路、投与量、投与間隔
等）を設定して、効果を確実にかつ最大限に引き出すた
めに、又副作用等の発現を最小限に食い止めるのに大い
に役立つであろう。
揮されるまでには、吸収、分布、代謝及び排泄などの種
々の過程が介在している。これらのうち、特に代謝は肝
臓に存在する酵素量や活性等に依存するものであり、個
体差によって大きく影響される。従って、代謝等による
薬物の体内動態を適格に把握することは、個々の患者に
合った合理的な投与方法（投与経路、投与量、投与間隔
等）を設定して、効果を確実にかつ最大限に引き出すた
めに、又副作用等の発現を最小限に食い止めるのに大い
に役立つであろう。
【００５７】このように使用される場合は、本発明の試
薬は上記化合物の他、通常経口用薬剤の調製に用いられ
る結合剤、滑沢剤、香味剤、崩壊剤等の担体を含んでい
ても良い。 （２）ヒトもしくは動物の肝組織、肝ミクロソーム等を
被験試料として、本発明の試薬を反応させて、８−水酸
化カルテオロール等の基質生成物の量を測定する。
薬は上記化合物の他、通常経口用薬剤の調製に用いられ
る結合剤、滑沢剤、香味剤、崩壊剤等の担体を含んでい
ても良い。 （２）ヒトもしくは動物の肝組織、肝ミクロソーム等を
被験試料として、本発明の試薬を反応させて、８−水酸
化カルテオロール等の基質生成物の量を測定する。
【００５８】これによりインビトロで肝臓等に含まれる
ＣＹＰ２Ｄ６活性を直接評価することができる。
ＣＹＰ２Ｄ６活性を直接評価することができる。
【００５９】このように使用される場合は、本発明の試
薬は上記化合物の他、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等を含んで
いても良い。
薬は上記化合物の他、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等を含んで
いても良い。
【００６０】一方、ＣＹＰ２Ｄ６の活性測定法は、上述
の特性を有する化合物を基質として用いることを特徴と
するものであり、既に述べたように、当該化合物を被測
定物に添加、混合して、該混合物中に生成される該化合
物の生成物を測定することから構成される。
の特性を有する化合物を基質として用いることを特徴と
するものであり、既に述べたように、当該化合物を被測
定物に添加、混合して、該混合物中に生成される該化合
物の生成物を測定することから構成される。
【００６１】
【実施例】以下、実施例等により本発明を詳細に説明す
るが、かかる実施例は本発明の一態様を示すものであ
り、本発明はこれらの実施例になんら限定されるもので
はない。
るが、かかる実施例は本発明の一態様を示すものであ
り、本発明はこれらの実施例になんら限定されるもので
はない。
【００６２】参考例１ 下記の成分： ２ｍＭ βーＮＡＤＰＨ １ｍＭ βーＮＡＤＨ １００ｐｍｏｌ ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ｄ６ ５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．４ を含む反応系に、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２
５０μＭ及び５００μＭの各濃度の塩酸カルテオロール
をそれぞれ加えて、反応容量を０．５ｍｌにした。
５０μＭ及び５００μＭの各濃度の塩酸カルテオロール
をそれぞれ加えて、反応容量を０．５ｍｌにした。
【００６３】なお、使用したヒトチトクロームＰ４５０
２Ｄ６は、市販のマイクロゾーム懸濁液凍結品（米国
ＧＥＮＴＥＳＴ社製：Cell microsomes containing ove
r expressed human CYP2D6-val＋reductase）である。
２Ｄ６は、市販のマイクロゾーム懸濁液凍結品（米国
ＧＥＮＴＥＳＴ社製：Cell microsomes containing ove
r expressed human CYP2D6-val＋reductase）である。
【００６４】次いで、３７℃で１０分間インキュベート
し、反応停止液〔５００μｇ／ｍｌのｐ−アミノ安息香
酸（ＨＰＬＣの内部標準：Ｉ．Ｓ．）及び２０ｍｇ／ｍ
ｌの亜硫酸水素ナトリウム（重亜硫酸ナトリウム）を含
む２０％Ｎａ2ＣＯ3水溶液〕０．５ｍｌを加えて反応を
停止した。
し、反応停止液〔５００μｇ／ｍｌのｐ−アミノ安息香
酸（ＨＰＬＣの内部標準：Ｉ．Ｓ．）及び２０ｍｇ／ｍ
ｌの亜硫酸水素ナトリウム（重亜硫酸ナトリウム）を含
む２０％Ｎａ2ＣＯ3水溶液〕０．５ｍｌを加えて反応を
停止した。
【００６５】該反応液に酢酸エチルを５ｍｌ加えて１０
分間振盪した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を
行った。分離した有機相の４ｍｌを採取して窒素ガスを
通じて一旦乾固し、これを１００μｌのメタノールに溶
かして、下記の条件で高速液体クロマトグラフラフィー
（ＨＰＬＣ）で測定した。なお、ＨＰＬＣでのサンプル
量は３０μｌを使用した。
分間振盪した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を
行った。分離した有機相の４ｍｌを採取して窒素ガスを
通じて一旦乾固し、これを１００μｌのメタノールに溶
かして、下記の条件で高速液体クロマトグラフラフィー
（ＨＰＬＣ）で測定した。なお、ＨＰＬＣでのサンプル
量は３０μｌを使用した。
【００６６】 ＨＰＬＣの測定条件 溶出液： １０．５％ ＣＨ3ＣＮ，１％ＡｃＯＨ 流速： ０．８ｍｌ／ｍｉｎ カラム： ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，ＯＤＳ（カラム温度は室温） 検出波長： ２５４ｎｍ ８−水酸化カルテオロール、塩酸カルテオロール及び内
部標準であるｐ−アミノ安息香酸はきれいに分離され、
それらの保持時間はそれぞれ１０ｍｉｎ、１２ｍｉｎ及
び１６ｍｉｎであった。
部標準であるｐ−アミノ安息香酸はきれいに分離され、
それらの保持時間はそれぞれ１０ｍｉｎ、１２ｍｉｎ及
び１６ｍｉｎであった。
【００６７】上記操作をそれぞれ２回繰り返して、基質
として用いる塩酸カルテオロールの濃度とそれに対する
ＣＹＰ２Ｄ６の水酸化反応速度との関係を調べた。その
ラインウイーバー・バーク（Lineweaver-Burk）プロッ
トを図１に示す。
として用いる塩酸カルテオロールの濃度とそれに対する
ＣＹＰ２Ｄ６の水酸化反応速度との関係を調べた。その
ラインウイーバー・バーク（Lineweaver-Burk）プロッ
トを図１に示す。
【００６８】このプロットから、ラインウイーバー・バ
ーク式 Ｙ＝７.００７５Ｘ ＋ ０.０３８３ （ｒ＝０.９９
９４） が求められ、これから、カルテオロールのＣＹＰ２Ｄ６
に対するミカエリス定数（Ｋｍ）：１８３μＭ、及び最
大反応速度（Ｖｍａｘ）：２６．０８pmol/min/pmol CY
P2D6 が得られた。
ーク式 Ｙ＝７.００７５Ｘ ＋ ０.０３８３ （ｒ＝０.９９
９４） が求められ、これから、カルテオロールのＣＹＰ２Ｄ６
に対するミカエリス定数（Ｋｍ）：１８３μＭ、及び最
大反応速度（Ｖｍａｘ）：２６．０８pmol/min/pmol CY
P2D6 が得られた。
【００６９】比較例１ ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ｄ６（１００ｐｍｏｌ）
の代わりに、参考例１記載の反応系（２ｍＭ βーＮＡ
ＤＰＨ、１ｍＭ βーＮＡＤＨ、１００μｍｏｌ カル
テオロール、５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）に
Ｐ４５０の分子種である１Ａ１、１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ
６、２Ｃ９、２Ｃ８、２Ｃ１９、２Ｅ１又は３Ａ４（各
１００ｐｍｏｌ）をそれぞれ加えて反応させ、１時間後
の８−水酸化カルテオロールの生成量を測定した。
の代わりに、参考例１記載の反応系（２ｍＭ βーＮＡ
ＤＰＨ、１ｍＭ βーＮＡＤＨ、１００μｍｏｌ カル
テオロール、５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）に
Ｐ４５０の分子種である１Ａ１、１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ
６、２Ｃ９、２Ｃ８、２Ｃ１９、２Ｅ１又は３Ａ４（各
１００ｐｍｏｌ）をそれぞれ加えて反応させ、１時間後
の８−水酸化カルテオロールの生成量を測定した。
【００７０】それらの結果をＣＹＰ２Ｄ６の結果と合わ
せて表１に示す。
せて表１に示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】このことから、カルテロールは、各種Ｐ４
５０分子種のうち、ＣＹＰ２Ｄ６によって特異的に代謝
をうけて８−水酸化カルテオロールを生成する、ＣＹＰ
２Ｄ６特異的基質であることが分かった。
５０分子種のうち、ＣＹＰ２Ｄ６によって特異的に代謝
をうけて８−水酸化カルテオロールを生成する、ＣＹＰ
２Ｄ６特異的基質であることが分かった。
【００７３】実施例１ 下記の成分： ２ｍＭ βーＮＡＤＰＨ １ｍＭ βーＮＡＤＨ １００ｐｍｏｌ ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ｄ６ ５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．４ を含む反応系に目的とする被験薬（キニジン、プロプラ
ノロール、ノルトリプチリン、デキストロメトルファ
ン、スパルテイン、(±)ブフラロール、(±)ワ−ファリ
ン）のそれぞれと１００μＭ 塩酸カルテオロールを加
えて反応容量を０．５ｍｌにした。次いで、３７℃で１
０分間インキュベートし、反応停止液〔５００μｇ／ｍ
ｌのｐ−アミノ安息香酸（ＨＰＬＣの内部標準：Ｉ．
Ｓ．）及び２０ｍｇ／ｍｌの亜硫酸水素ナトリウムを含
む２０％Ｎａ2ＣＯ3水溶液〕０．５ｍｌを加えて反応を
停止した。
ノロール、ノルトリプチリン、デキストロメトルファ
ン、スパルテイン、(±)ブフラロール、(±)ワ−ファリ
ン）のそれぞれと１００μＭ 塩酸カルテオロールを加
えて反応容量を０．５ｍｌにした。次いで、３７℃で１
０分間インキュベートし、反応停止液〔５００μｇ／ｍ
ｌのｐ−アミノ安息香酸（ＨＰＬＣの内部標準：Ｉ．
Ｓ．）及び２０ｍｇ／ｍｌの亜硫酸水素ナトリウムを含
む２０％Ｎａ2ＣＯ3水溶液〕０．５ｍｌを加えて反応を
停止した。
【００７４】該反応液に酢酸エチルを５ｍｌ加えて１０
分間振盪した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を
行った。分離した有機相の４ｍｌを採取して窒素ガスを
通じて一旦乾固し、これを１００μｌのメタノールに溶
かして、参考例１に記載する条件と同一条件を用いてＨ
ＰＬＣで測定した。なお、ＨＰＬＣでのサンプル量は３
０μｌを使用した．なお、用いた被験薬は、従来の知見
によると、キニジンはＣＹＰ２Ｄ６阻害剤、プロプラノ
ロール、ノルトリプチリン、デキストロメトルファン、
スパルテイン及び(±)ブフラロールはＣＹＰ２Ｄ６依存
型代謝系の薬剤、(±)ワ−ファリンはＣＹＰ２Ｄ６非依
存型代謝系薬剤であって１Ａ２，２Ｃ９及び３Ａ４の各
Ｐ４５０によって代謝される薬剤であることが知られて
いる。
分間振盪した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を
行った。分離した有機相の４ｍｌを採取して窒素ガスを
通じて一旦乾固し、これを１００μｌのメタノールに溶
かして、参考例１に記載する条件と同一条件を用いてＨ
ＰＬＣで測定した。なお、ＨＰＬＣでのサンプル量は３
０μｌを使用した．なお、用いた被験薬は、従来の知見
によると、キニジンはＣＹＰ２Ｄ６阻害剤、プロプラノ
ロール、ノルトリプチリン、デキストロメトルファン、
スパルテイン及び(±)ブフラロールはＣＹＰ２Ｄ６依存
型代謝系の薬剤、(±)ワ−ファリンはＣＹＰ２Ｄ６非依
存型代謝系薬剤であって１Ａ２，２Ｃ９及び３Ａ４の各
Ｐ４５０によって代謝される薬剤であることが知られて
いる。
【００７５】結果を表２に示す。表から分かるように、
キニジンは１×１０ー7Ｍの極めて低い濃度においても８
−水酸化カルテオロールの生成を完全に阻害し、ＣＹＰ
２Ｄ６の阻害剤であることを示した。また、ＣＹＰ２Ｄ
６依存型代謝系の各薬剤は、用量依存的に本反応を阻害
し、また(±)ワーファリンは本反応を阻害せず、従来の
知見と一致した結果を示した（表２）。このことから、
本発明の測定系によれば、新規薬物等体内へ投与される
化合物について、ＣＹＰ２Ｄ６阻害剤であるか、依存型
代謝化合物であるか等を正確に調べることができること
が判明した。
キニジンは１×１０ー7Ｍの極めて低い濃度においても８
−水酸化カルテオロールの生成を完全に阻害し、ＣＹＰ
２Ｄ６の阻害剤であることを示した。また、ＣＹＰ２Ｄ
６依存型代謝系の各薬剤は、用量依存的に本反応を阻害
し、また(±)ワーファリンは本反応を阻害せず、従来の
知見と一致した結果を示した（表２）。このことから、
本発明の測定系によれば、新規薬物等体内へ投与される
化合物について、ＣＹＰ２Ｄ６阻害剤であるか、依存型
代謝化合物であるか等を正確に調べることができること
が判明した。
【００７６】
【表２】
【図１】 チトクロームＰ４５０ ２Ｄ６によるカルテ
オロール８位の水酸化反応初速度のラインウィーバー・
バーク・プロットを示す図である。 Ｙ＝７．００７５Ｘ ＋ ０．０３８３（γ＝０．９９
９４） 図中●は、△（Ｎｏ１）と□（Ｎｏ２）の２回の測定の
平均値を表わす。
オロール８位の水酸化反応初速度のラインウィーバー・
バーク・プロットを示す図である。 Ｙ＝７．００７５Ｘ ＋ ０．０３８３（γ＝０．９９
９４） 図中●は、△（Ｎｏ１）と□（Ｎｏ２）の２回の測定の
平均値を表わす。
Claims (4)
- 【請求項１】次の特性： （ｉ）チトクロームＰ４５０ ２Ｄ６に特異的に反応す
る （ii）ミカエリス定数が１５０μＭ以上である を少なくとも有する化合物を被験薬の存在下でチトクロ
ームＰ４５０ ２Ｄ６と反応させて、該化合物の生成物
の生成量を測定することによる、チトクロームＰ４５０
２Ｄ６依存性薬物の検出方法。 - 【請求項２】カルテオロールを被験薬の存在下でチトク
ロームＰ４５０ ２Ｄ６と反応させて、８−水酸化カル
テオロールの生成量を測定することを特徴とする請求項
１記載のチトクロームＰ４５０ ２Ｄ６依存性薬物の検
出方法。 - 【請求項３】チトクロームＰ４５０ ２Ｄ６依存性薬物
を検出するための試薬キットであって、 （ｉ）チトクロームＰ４５０ ２Ｄ６に特異的に反応す
る （ii）ミカエリス定数が１５０μＭ以上である という特性を有する化合物、及びチトクロームＰ４５０
２Ｄ６を少なくとも含有する試薬キット。 - 【請求項４】化合物がカルテオロールである、請求項３
記載のチトクロームＰ４５０ ２Ｄ６依存性薬物の検出
試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8268792A JPH10111295A (ja) | 1996-10-09 | 1996-10-09 | チトクロームｐ４５０ ２ｄ６依存性薬物の検出方法及び検出試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8268792A JPH10111295A (ja) | 1996-10-09 | 1996-10-09 | チトクロームｐ４５０ ２ｄ６依存性薬物の検出方法及び検出試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10111295A true JPH10111295A (ja) | 1998-04-28 |
Family
ID=17463342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8268792A Pending JPH10111295A (ja) | 1996-10-09 | 1996-10-09 | チトクロームｐ４５０ ２ｄ６依存性薬物の検出方法及び検出試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10111295A (ja) |
-
1996
- 1996-10-09 JP JP8268792A patent/JPH10111295A/ja active Pending
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