JPH10108678A - Heat shock promoter, stress-sensing gene and detection of stress - Google Patents

Heat shock promoter, stress-sensing gene and detection of stress

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JPH10108678A
JPH10108678A JP8266320A JP26632096A JPH10108678A JP H10108678 A JPH10108678 A JP H10108678A JP 8266320 A JP8266320 A JP 8266320A JP 26632096 A JP26632096 A JP 26632096A JP H10108678 A JPH10108678 A JP H10108678A
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JP
Japan
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gene
heat shock
stress
sequence
dna
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JP8266320A
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Taro Iiizumi
太郎 飯泉
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Kurita Water Industries Ltd
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Kurita Water Industries Ltd
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new heat shock promoter comprising a stress-sensing gene derived from bacteria belonging to genus nitrosomonas, and capable of readily and speedily detecting a stress of ammonium oxidizing bacteria caused by various factors in the environment. SOLUTION: This heat shock promoter is the new one derived from bacteria belonging to genus nitrosomonas, and a stress of ammonium oxidizing bacteria caused by various factors in the environment can be readily and speedily detected by transforming ammonium oxidizing bacteria by introducing a fused gene obtained by bonding a structure gene coding a protein at the downstream of the promoter, culturing the recombinant body in a stress condition, and measuring the amount of expression of the structure gene. The heat shock promoter is obtained by forming a gene library by using a gene DNA derived from Nitrosomonas europaea IFO14298 strain, and screening the library by using a heat shock gene fragment of different creature as a probe.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、アンモニア酸化細
菌由来の熱ショックプロモーター、このプロモーターを
含むストレス感知遺伝子、このストレス感知遺伝子を細
胞内に保持するアンモニア酸化細菌組換え体、およびこ
の組換え体を用いたアンモニア酸化細菌のストレスの測
定方法に関する。
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a heat shock promoter derived from an ammonia oxidizing bacterium, a stress sensing gene containing the promoter, a recombinant ammonia oxidizing bacterium having the stress sensing gene in a cell, and this recombinant The present invention relates to a method for measuring the stress of ammonia-oxidizing bacteria using the method.

【0002】[0002]

【従来の技術】アンモニア酸化細菌はアンモニアを酸化
して亜硝酸を生成する化学反応を通じてエネルギーを獲
得する独立栄養細菌であり、この細菌によるアンモニア
酸化反応は自然環境中の窒素循環において重要な役割を
担っている。ニトロソモナス属細菌はこのようなアンモ
ニア酸化細菌に属する細菌であり、土壌、水中、排水プ
ラント等の環境中に広く生息することが知られている。
2. Description of the Related Art Ammonia-oxidizing bacteria are autotrophic bacteria that obtain energy through a chemical reaction that oxidizes ammonia to produce nitrite, and the ammonia-oxidizing reaction by these bacteria plays an important role in the nitrogen cycle in the natural environment. I am carrying it. Nitrosomonas bacteria are bacteria belonging to such ammonia-oxidizing bacteria, and are known to widely inhabit the environment such as soil, water, and drainage plants.

【0003】環境浄化における排水中のアンモニア性窒
素分除去は自然環境中の窒素循環を模擬したプロセスに
よって行われている。すなわち、排水中のアンモニアを
アンモニア酸化細菌および亜硝酸酸化細菌を用いて亜硝
酸または硝酸に酸化し、さらに窒素呼吸能を持つ細菌に
よって硝酸、亜硝酸を還元して窒素ガスとして空気中に
放出する。しかしながら、BOD除去と比べて窒素分除去
プロセスはやや不安定である場合が多く、時として処理
能力が低下して処理水の水質悪化が起こる場合があり、
排水処理プラントの運転管理上の問題点となっている。
[0003] In environmental purification, the removal of ammonia nitrogen from wastewater is carried out by a process simulating the circulation of nitrogen in the natural environment. In other words, ammonia in wastewater is oxidized to nitrite or nitric acid using ammonia oxidizing bacteria and nitrite oxidizing bacteria, and then nitric acid and nitrite are reduced by bacteria having nitrogen respiration ability and released into the air as nitrogen gas. . However, compared with BOD removal, the nitrogen removal process is often somewhat unstable, and sometimes the treatment capacity is reduced and the quality of the treated water deteriorates.
This is a problem in the operation management of the wastewater treatment plant.

【0004】この主な原因としては、活性汚泥中に含ま
れるアンモニア酸化細菌が他の従属栄養微生物と比べ、
環境変化に対して感受性が強く、温度やpH変化等の物理
的要因や、排水中に存在する低濃度の化学物質によっ
て、その生物活性が低下し易いことがあげられる。分子
微生物学観点から見た場合、アンモニア酸化の最初の酸
化反応において触媒として働くアンモニア酸化酵素(ア
ンモニアモノオキシゲナーゼ)が、様々な化学物質や物
理的要因によって失活し易いことが指摘されている。
[0004] The main cause of this is that ammonia oxidizing bacteria contained in activated sludge are different from other heterotrophic microorganisms.
It is highly susceptible to environmental changes, and its biological activity is easily reduced by physical factors such as temperature and pH changes and low-concentration chemical substances present in wastewater. From the viewpoint of molecular microbiology, it has been pointed out that ammonia oxidase (ammonia monooxygenase), which acts as a catalyst in the first oxidation reaction of ammonia oxidation, is easily deactivated by various chemical substances and physical factors.

【0005】このような物理的、化学的要因によるアン
モニア酸化細菌の生物活性低下を初期段階で検知し、迅
速に処理工程を改善するなどの方法をもって対応するこ
とは、排水処理プラントの運転管理上望ましいことであ
るが、環境中に存在する阻害物質や影響を与える物理的
要因は多岐にわたっており、機器分析や化学分析を用い
て個々の要因を分離定量することは事実上不可能であ
る。そのため、細胞に対する阻害要因を総括的に評価で
きるような、硝化細菌を利用した測定方法が必要とな
る。具体的には、環境条件を模擬した条件下でのアンモ
ニア酸化速度の比較から推定することができる。
It is necessary to detect such a decrease in the biological activity of ammonia-oxidizing bacteria due to physical and chemical factors at an early stage and to take measures by quickly improving the treatment process. Desirably, the inhibitors present in the environment and the physical factors that affect them are so diverse that it is virtually impossible to separate and quantify individual factors using instrumental or chemical analysis. For this reason, a measurement method using nitrifying bacteria that can comprehensively evaluate factors inhibiting cells is required. Specifically, it can be estimated from a comparison of ammonia oxidation rates under conditions simulating environmental conditions.

【0006】すなわち、アンモニア酸化細菌またはこの
細菌を含む活性汚泥等の生物群を、アンモニアを含む試
験水中に懸濁し、環境条件を模擬した条件下で好気的に
インキュベーションし、アンモニア濃度、溶存酸素濃
度、亜硝酸濃度などを指標としてアンモニア酸化速度の
増減を測定することができる。より簡便には、アンモニ
ア酸化細菌を固定化した酸素電極を用いて、排水中のア
ンモニア酸化細菌の酸素消費速度の変化を測定する方法
などが開発されている。
That is, a group of organisms such as ammonia-oxidizing bacteria or activated sludge containing the bacteria is suspended in test water containing ammonia, aerobically incubated under conditions simulating environmental conditions, and ammonia concentration, dissolved oxygen The increase or decrease of the ammonia oxidation rate can be measured by using the concentration, nitrite concentration and the like as indices. More simply, a method has been developed in which a change in the oxygen consumption rate of ammonia-oxidizing bacteria in wastewater is measured using an oxygen electrode on which ammonia-oxidizing bacteria are immobilized.

【0007】一方、最近、生物細胞の半致死的状態を評
価するために、熱ショック遺伝子(ストレス遺伝子)の
発現を定量する技術が開発されてきた。熱ショック遺伝
子は、高温条件、毒性物質の接触、ウイルスの感染等の
ストレスによって細胞が半致死的な影響を受けた際にそ
の発現レベルが短時間において特異的に増大する遺伝子
の総称であり、ストレス遺伝子と称される場合もある。
熱ショック遺伝子は真核細胞、原核細胞を問わず全ての
生物が共通してコードする必須の遺伝子であり、groEL
hsp60)、dnaKhsp70)などの遺伝子が知られてい
る。遺伝子産物(熱ショック蛋白質)の一次構造は異種
生物間においても高度に保存されており、生命活動にお
いて必須の遺伝子と考えられている。
On the other hand, recently, in order to evaluate a semi-lethal state of a biological cell, a technique for quantifying the expression of a heat shock gene (stress gene) has been developed. Heat shock gene is a generic term for genes whose expression level is specifically increased in a short time when cells are semi-lethal affected by stress such as high temperature conditions, contact with toxic substances, virus infection, It is sometimes called a stress gene.
Heat shock gene is an essential gene that all organisms encoded in common regardless of eukaryotic cells, prokaryotic cells, groEL
Genes such as ( hsp60 ) and dnaK ( hsp70 ) are known. The primary structure of a gene product (heat shock protein) is highly conserved among heterologous organisms, and is considered to be an essential gene for life activity.

【0008】これら熱ショック蛋白質は、主として変性
した蛋白質の立体構造の復元に作用するいわゆる分子シ
ャペロンとして機能し、細胞内恒常性の安定化に働く。
大腸菌等のグラム陰性細菌においては、熱ショック遺伝
子上流には特異的なプロモーター配列が存在し、このプ
ロモーター(熱ショックプロモーター)は、通常時に存
在するRNAポリメラーゼσ因子とは異なるσ因子、すな
わちストレス時に特異的に細胞内の分子数が増大する特
別なσ因子(σ32)によって認識される。熱ショック遺
伝子の発現は、この特別なσ因子の分子数に依存して転
写レベルで制御される。
[0008] These heat shock proteins mainly function as so-called molecular chaperones that act to restore the three-dimensional structure of the denatured protein, and act to stabilize intracellular homeostasis.
In Gram-negative bacteria such as Escherichia coli, a specific promoter sequence exists upstream of the heat shock gene, and this promoter (heat shock promoter) is different from the normally present RNA polymerase sigma factor, that is, the sigma factor during stress, It is recognized by a special σ factor (σ 32 ) that specifically increases the number of molecules in the cell. Expression of the heat shock gene is regulated at the transcriptional level depending on the number of molecules of this particular sigma factor.

【0009】熱ショック遺伝子の発現を定量的に測定す
ることによって、細胞がストレス状態に置かれているか
どうかを迅速、簡便に知ることができる。熱ショック遺
伝子の発現機構を応用した試みは、これまでに動物細
胞、大腸菌等の原核微生物を用いて行われている。
[0009] By quantitatively measuring the expression of the heat shock gene, it is possible to quickly and easily know whether or not the cell is under stress. Attempts to apply the heat shock gene expression mechanism have been made using prokaryotic microorganisms such as animal cells and Escherichia coli.

【0010】例えば、米国、Chemistry and Biotechnol
ogy Research International Corp.のSandersらは毒物
にさらされたイガイ等の細胞内における熱ショック遺伝
子の発現を、ドットブロットによるmRNAの定量および抗
原抗体反応による熱ショック蛋白質の定量によって検出
する手法を提案している(WO 90/02947)。また米国XEN
OMETRIXが販売しているPRO-TOX stress gene assay kit
は、変異源性物質や毒性物質に対して応答するストレス
遺伝子を含む16種類の遺伝子プロモーターとlacZ遺伝子
とからなる融合遺伝子を用いた大腸菌細胞を用いて、毒
性評価を行うものである。また米国DuPont社のVan Dyk
らは大腸菌ストレス遺伝子、具体的にはdnaKgrpE遺伝
子のプロモーター領域下流に細菌ルシフェラーゼ遺伝子
を連結した融合遺伝子を含む組換え体大腸菌を構築し、
この組換え体が示す生物発光の強度から毒性物質の検出
を行う方法を提案している(Appl. Environ. Microbio
l.,60, 1414-1420 (1994))。しかしながら、熱ショッ
ク遺伝子の発現を定量的に測定する方法はアンモニア酸
化細菌には応用されていない。
For example, Chemistry and Biotechnol, USA
Sanders et al. of ogy Research International Corp. have proposed a method to detect the expression of heat shock genes in cells of mussels exposed to toxicants by quantifying mRNA by dot blot and quantifying heat shock proteins by antigen-antibody reaction. (WO 90/02947). Also US XEN
PRO-TOX stress gene assay kit sold by OMETRIX
Is a method for evaluating toxicity using Escherichia coli cells using a fusion gene composed of a lacZ gene and 16 types of gene promoters including a stress gene that responds to a mutagenic substance or a toxic substance. Also, DuPont's Van Dyk
Constructed recombinant Escherichia coli containing a fusion gene in which a bacterial luciferase gene was linked downstream of the promoter region of the Escherichia coli stress gene, specifically, dnaK and grpE genes.
A method for detecting toxic substances from the bioluminescence intensity of this recombinant has been proposed (Appl. Environ. Microbio
l., 60, 1414-1420 (1994)). However, the method for quantitatively measuring the expression of the heat shock gene has not been applied to ammonia oxidizing bacteria.

【0011】[0011]

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、アンモニ
ア酸化細菌の熱ショック遺伝子の発現を定量的に検出す
ることにより、熱、pH変化などの物理的ストレスや毒性
物質などの化学的ストレスによって引起こされるアンモ
ニア酸化細菌の生物活性の低下をその初期段階において
検知することができると考えた。このような応答を検知
することができれば、アンモニア酸化細菌の生物活性が
強いダメージを受ける前に運転条件を改善して水質悪化
を防ぐことが可能となり、運転管理上有意義である。し
かしながら、アンモニア酸化細菌由来の熱ショック遺伝
子、およびそのプロモーター領域はこれまでクローニン
グされておらず、その構造も知られていない。
SUMMARY OF THE INVENTION The present inventors quantitatively detect the expression of the heat shock gene of ammonia-oxidizing bacteria, thereby allowing the physical stress such as heat and pH change and the chemical stress such as toxic substances. It was thought that the resulting decrease in the biological activity of ammonia oxidizing bacteria could be detected in its early stages. If such a response can be detected, it becomes possible to improve operating conditions and prevent water quality deterioration before the biological activity of the ammonia-oxidizing bacteria is strongly damaged, which is significant in operation management. However, a heat shock gene derived from an ammonia-oxidizing bacterium and its promoter region have not been cloned and its structure is not known.

【0012】本発明の目的は、熱ショック遺伝子の転写
を制御するニトロソモナス属細菌由来の熱ショックプロ
モーターを提供することである。本発明の他の目的は、
上記熱ショックプロモーターと構造遺伝子とからなり、
細菌のストレスの検知に利用することができるストレス
感知遺伝子を提供することである。本発明の別の目的
は、上記ストレス感知遺伝子を保持し、ストレスの検知
に利用することができるアンモニア酸化細菌組換え体を
提供することである。本発明のさらに別の目的は、上記
組換え体を用いて、環境中の様々な要因によって引起こ
されるアンモニア酸化細菌のストレスを簡便かつ迅速に
検知することができる方法を提案することである。
An object of the present invention is to provide a heat shock promoter derived from a bacterium of the genus Nitrosomonas, which controls the transcription of a heat shock gene. Another object of the present invention is to
The heat shock promoter and a structural gene,
An object of the present invention is to provide a stress sensing gene that can be used for detecting bacterial stress. Another object of the present invention is to provide a recombinant ammonia-oxidizing bacterium which retains the stress sensing gene and can be used for detecting stress. Still another object of the present invention is to propose a method for easily and rapidly detecting the stress of ammonia-oxidizing bacteria caused by various environmental factors using the above-mentioned recombinant.

【0013】[0013]

【課題を解決するための手段】本発明は、次の熱ショッ
クプロモーター、このプロモーターを含むストレス感知
遺伝子、このストレス感知遺伝子を細胞内に保持するア
ンモニア酸化細菌組換え体、およびこの組換え体を用い
たアンモニア酸化細菌のストレスの測定方法である。 (1)ニトロソモナス(Nitrosomonas)属細菌由来の熱
ショックプロモーター。 (2)−35配列がCTTGA、−10配列がCCCCATTTAであ
ることを特徴とする上記(1)記載の熱ショックプロモ
ーター。 (3)上記(1)または(2)記載の熱ショックプロモ
ーターを含むDNA断片と、このDNA断片の下流に位
置し、形質発現量を容易に検出できる蛋白質をコードす
る構造遺伝子を含むDNA断片との融合遺伝子からなる
ことを特徴とするストレス感知遺伝子。 (4)上記(3)記載のストレス感知遺伝子を細胞内に
保持することを特徴とするアンモニア酸化細菌組換え
体。 (5)上記(4)記載の組換え体をストレス条件下で培
養した後、上記(3)記載のストレス感知遺伝子の形質
発現量を測定することを特徴とするアンモニア酸化細菌
のストレスの測定方法。
Means for Solving the Problems The present invention provides the following heat shock promoter, a stress sensing gene containing the promoter, a recombinant ammonia-oxidizing bacterium having the stress sensing gene in a cell, and a recombinant This is a method for measuring the stress of ammonia-oxidizing bacteria used. (1) Heat shock promoter derived from bacteria of the genus Nitrosomonas . (2) The heat shock promoter according to the above (1), wherein the -35 sequence is CTTGA and the -10 sequence is CCCCATTTA. (3) a DNA fragment containing the heat shock promoter according to the above (1) or (2), and a DNA fragment containing a structural gene encoding a protein which is located downstream of the DNA fragment and whose expression level can be easily detected. A stress sensing gene comprising a fusion gene of (4) A recombinant ammonia-oxidizing bacterium, which retains the stress sensing gene according to (3) above in a cell. (5) A method for measuring the stress of ammonia-oxidizing bacteria, comprising culturing the recombinant according to (4) under stress conditions, and then measuring the expression level of the stress-sensing gene according to (3). .

【0014】本発明の熱ショックプロモーターはニトロ
ソモナス(Nitrosomonas)属細菌に由来し、ニトロソモ
ナス属細菌内で機能する熱ショックプロモーターであ
る。このような熱ショックプロモーターの遺伝子供与体
として使用するニトロソモナス(Nitrosomonas)属細菌
はアンモニアを酸化して亜硝酸を生成し、このとき得ら
れるエネルギーを用いて二酸化炭素の同化を行う独立栄
養細菌であり、具体的にはNitrosomonas europaeaなど
が使用できる。ニトロソモナス属細菌はATCC(American
Type Culture Collection)、IFO(Institute for Fer
mentation, Osaka)などの公的微生物保存機関から入手
可能であり、これらの機関から分譲されたものを使用す
ることができる。具体的にはNitrosomonas europaea IF
O14298株などがあげられる。また硝化脱窒処理系の生物
汚泥などから分離したニトロソモナス属細菌を使用する
こともできる。
The heat shock promoter of the present invention is a heat shock promoter derived from a bacterium of the genus Nitrosomonas and functioning in the bacterium of the genus Nitrosomonas . Nitrosomonas bacteria used as gene donors for such heat shock promoters are autotrophic bacteria that oxidize ammonia to produce nitrous acid and use the energy obtained to assimilate carbon dioxide. Yes , specifically Nitrosomonas europaea and the like can be used. Nitrosomonas bacteria are ATCC (American
Type Culture Collection), IFO (Institute for Fer)
mentation, Osaka) and can be obtained from these institutions. Specifically, Nitrosomonas europaea IF
O14298 strain and the like. Nitrosomonas bacteria isolated from biological sludge of a nitrification and denitrification treatment system can also be used.

【0015】ニトロソモナス属細菌内で機能する本発明
の熱ショックプロモーターを得るには、最初にニトロソ
モナス属細菌由来の熱ショック遺伝子をクローニング
し、得られた熱ショック遺伝子の上流域を検索しなけれ
ばならない。
In order to obtain a heat shock promoter of the present invention that functions in a bacterium of the genus Nitrosomonas, a heat shock gene derived from a bacterium of the genus Nitrosomonas must first be cloned, and the upstream region of the obtained heat shock gene must be searched. Must.

【0016】上記ニトロソモナス属細菌由来の熱ショッ
ク遺伝子は物理的、化学的ストレスなどのストレスにさ
らされた細菌細胞において短時間にかつ特異的にその発
現が誘導される遺伝子である。Nitrosomonas europaea
IFO14298株から分離して決定した熱ショック遺伝子であ
dnaK遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号1、アミノ
基との対応を配列番号2に示す。
The heat shock gene derived from the above-mentioned bacterium of the genus Nitrosomonas is a gene whose expression is induced in a short time and specifically in bacterial cells subjected to stress such as physical or chemical stress. Nitrosomonas europaea
The nucleotide sequence of the dnaK gene, which is a heat shock gene isolated and determined from the IFO14298 strain, is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and SEQ ID NO: 2 corresponding to the amino group.

【0017】配列番号1で示されるdnaK遺伝子は、Nitr
osomonas europaea IFO14298株染色体DNAを制限酵素
KpnIで消化して得られる11.5kbのDNA断片中に存在す
る1,935bpの塩基配列の遺伝子である。
The dnaK gene represented by SEQ ID NO: 1 is Nitr
osomonas europaea IFO14298 strain Chromosomal DNA restriction enzyme
It is a 1,935 bp nucleotide sequence gene present in a 11.5 kb DNA fragment obtained by digestion with KpnI.

【0018】ニトロソモナス属細菌からの熱ショック遺
伝子のクローン化には、次に示すような方法が用いられ
る。すなわち、ニトロソモナス属細菌染色体DNAを市販
されている適当な制限酵素で部分的または完全に消化し
たのち、大腸菌内で自立的に複製できるクローニングベ
クター、例えばpUC19、pBR322等のプラスミドに連結す
る。このようにして得られる組換えDNA分子を用いて大
腸菌を形質転換し、ニトロソモナス属細菌染色体DNA由
来の様々なDNA断片を内在する大腸菌形質転換体によっ
て構成される遺伝子ライブラリーを構築する。
The following method is used for cloning a heat shock gene from a bacterium of the genus Nitrosomonas. That is, the chromosomal DNA of the bacterium of the genus Nitrosomonas is partially or completely digested with an appropriate commercially available restriction enzyme, and then ligated to a cloning vector capable of autonomous replication in E. coli, for example, a plasmid such as pUC19 or pBR322. Escherichia coli is transformed with the thus obtained recombinant DNA molecule, and a gene library composed of Escherichia coli transformants having various DNA fragments derived from the chromosomal DNA of the genus Nitrosomonas bacteria is constructed.

【0019】遺伝子ライブラリーから熱ショック遺伝子
を含む形質転換体をスクリーニングするには、(1)異
種生物の熱ショック遺伝子と相補性を持つDNA断片をプ
ローブとし、コロニーハイブリダイゼーションによって
スクリーニングする方法、(2)ニトロソモナス属細菌
において熱ショック誘導される蛋白質を精製し、その部
分的アミノ酸配列に相当する遺伝子暗号を基にした合成
遺伝子をプローブとし、コロニーハイブリダイゼーショ
ンによってスクリーニングする方法、(3)精製された
熱ショック蛋白質の抗体を作製し、大腸菌形質転換体が
産生する外来蛋白質に対する抗原抗体反応でスクリーニ
ングする方法、(4)熱ショック遺伝子の欠損変異株と
して表現形を示す大腸菌を宿主とし、その形質を相補で
きる遺伝子をスクリーニングする方法などがあげられ
る。
To screen a transformant containing a heat shock gene from a gene library, (1) screening by colony hybridization using a DNA fragment complementary to the heat shock gene of a heterologous organism as a probe, 2) A method of purifying a protein induced by heat shock in a bacterium of the genus Nitrosomonas and screening by colony hybridization using a synthetic gene as a probe based on a genetic code corresponding to a partial amino acid sequence of the protein. A method of preparing an antibody against the heat shock protein and screening by an antigen-antibody reaction against a foreign protein produced by a transformant of Escherichia coli; (4) Escherichia coli showing a phenotype as a heat shock gene-deficient mutant host; Screen for genes that can complement And a method of training and the like.

【0020】熱ショック遺伝子の多くは真核、原核を問
わずすべての生物において存在が知られており、蛋白質
の一次構造は生物間を越えて高度に保存されていること
から、すでに塩基配列の決定されている異種生物の熱シ
ョック遺伝子(ストレス遺伝子)と相補性を持つDNA断
片をプローブとして利用する(1)の方法が最も簡便で
あり適している。利用できるDNAプローブとしては、具
体的には異種生物の熱ショック遺伝子の全長またはその
一部を用いることができる。また、異種生物の熱ショッ
ク遺伝子の一部をプライマーとし、ニトロソモナス属細
菌染色体DNAを鋳型としてPCR(ポリメラーゼチェインリ
アクション、polymerase chain reaction)を行い、増
幅されたDNAをプローブとして用いることもできる。
Many heat shock genes are known to exist in all organisms, eukaryotic and prokaryotic, and the primary structure of proteins is highly conserved across organisms. The method (1) in which a DNA fragment complementary to the determined heat shock gene (stress gene) of a heterologous organism is used as a probe is the simplest and most suitable method. As a DNA probe that can be used, specifically, the full-length heat shock gene of a heterologous organism or a part thereof can be used. Alternatively, PCR (polymerase chain reaction, polymerase chain reaction) using a part of the heat shock gene of a heterologous organism as a primer and chromosomal DNA of a genus Nitrosomonas bacterium as a template, and the amplified DNA can be used as a probe.

【0021】このようにしてスクリーニングされたDNA
断片は、大腸菌を宿主として増幅できる。この増幅され
たDNA断片を用いて制限酵素地図を作成し、遺伝子構造
を特定することができる。さらに、サンガー法など公知
の方法を用いて塩基配列を決定し、熱ショック遺伝子と
推定されるオープンリーディングフレームを特定するこ
とができる。特定されたオープンリーディングフレーム
が熱ショック遺伝子であるかどうかは、コードされるペ
プチドの一次構造と異種生物由来の熱ショック蛋白質と
の相同性、または精製された熱ショック蛋白質のアミノ
酸配列との相違を調べることによって確認することがで
きる。
The DNA screened in this way
The fragment can be amplified using E. coli as a host. Using the amplified DNA fragment, a restriction map can be prepared to identify the gene structure. Furthermore, the nucleotide sequence is determined using a known method such as the Sanger method, and an open reading frame presumed to be a heat shock gene can be identified. Whether the specified open reading frame is a heat shock gene depends on the homology between the primary structure of the encoded peptide and the heat shock protein from a heterologous organism, or the difference between the amino acid sequence of the purified heat shock protein and It can be confirmed by checking.

【0022】本発明の熱ショックプロモーターは、ニト
ロソモナス属細菌に由来し、前記熱ショック遺伝子dnaK
遺伝子の転写を制御するプロモーターであって、−35
配列がCTTGA、−10配列がCCCCATTTAであるプロモータ
ーである。この熱ショックプロモーターは熱ショックな
どのストレス時に特異的に分子数が増大する特別なRNA
ポリメラーゼσ因子によって認識されると思われる。
The heat shock promoter of the present invention is derived from a bacterium belonging to the genus Nitrosomonas, and comprises the heat shock gene dnaK.
A promoter that controls gene transcription, comprising -35
The promoter has a sequence of CTTGA and a sequence of -10 as CCCCATTTA. This heat shock promoter is a special RNA whose number of molecules increases specifically during stress such as heat shock.
It appears to be recognized by the polymerase sigma factor.

【0023】熱ショックプロモーターの構造を明らかに
するには、転写開始点を明らかにする必要がある。原核
生物においては、通常転写開始点より約10塩基および
約35塩基上流にRNAポリメラーゼσ因子に特異的に認
識される配列を有している場合が多い。このような配列
は、それぞれ−10配列、−35配列と呼ばれ、その周
辺配列によってプロモーター構造を特定することができ
る。本発明の熱ショックプロモーターも、−10配列お
よび−35配列によって特徴づけられる。
To clarify the structure of the heat shock promoter, it is necessary to clarify the transcription start site. Prokaryotes often have a sequence that is specifically recognized by RNA polymerase sigma factor at about 10 bases and about 35 bases upstream from the transcription start site. Such sequences are called a -10 sequence and a -35 sequence, respectively, and the promoter structure can be specified by the surrounding sequences. The heat shock promoter of the present invention is also characterized by -10 and -35 sequences.

【0024】転写開始点を決定するには熱ショック誘導
を行ったアンモニア酸化細菌よりmRNAを抽出、精製し、
その5'末端を決定することにより明らかにすることがで
きる。アンモニア酸化細菌からのmRNAの抽出、精製には
塩酸グアニジン法、ホットフェノール法、ISOGEN法など
の公知の方法を用いることができる。また、熱ショック
遺伝子mRNAの5'末端はプライマー伸長法、S1マッピング
法などの公知の方法によって決定することができる。
In order to determine the transcription start point, mRNA is extracted and purified from heat-shock-induced ammonia-oxidizing bacteria.
It can be revealed by determining its 5 'end. Known methods such as the guanidine hydrochloride method, the hot phenol method, and the ISOGEN method can be used for extraction and purification of mRNA from ammonia-oxidizing bacteria. In addition, the 5 ′ end of the heat shock gene mRNA can be determined by a known method such as a primer extension method and an S1 mapping method.

【0025】本発明のストレス感知遺伝子は、前記熱シ
ョックプロモーターを含むDNA断片と、このDNA断
片の下流に位置し、形質発現量を容易に検出できる蛋白
質をコードする構造遺伝子を含むDNA断片との融合遺
伝子からなるものであり、熱ショックプロモーターの下
流に上記構造遺伝子を連結することにより得られる。
[0025] The stress sensing gene of the present invention comprises a DNA fragment containing the heat shock promoter and a DNA fragment containing a structural gene which is located downstream of the DNA fragment and encodes a protein whose expression level can be easily detected. It consists of a fusion gene and is obtained by ligating the above structural gene downstream of the heat shock promoter.

【0026】熱ショックプロモーターを含むDNA断片
は、熱ショックプロモーターだけからなるDNA断片で
あってもよく、またこのようなDNA断片の上流または
下流に塩基配列が結合しているDNA断片であってもよ
い。
The DNA fragment containing the heat shock promoter may be a DNA fragment consisting only of the heat shock promoter, or a DNA fragment having a base sequence bound upstream or downstream of such a DNA fragment. Good.

【0027】例えば、熱ショックプロモーターを含むD
NA断片(以下、熱ショックプロモーター領域という場
合がある)は、ニトロソモナス属細菌染色体DNAを制
限酵素KpnIで消化して11.5kbのDNA断片を得、さらに
このDNA断片を制限酵素EcoRIおよびEcoT22Iで消化し
た0.65kbのDNA断片として得ることができる。また化
学合成することもできる。このようにして得られた熱シ
ョックプロモーター領域はPCRにより増幅することもで
きる。
For example, D containing a heat shock promoter
NA fragment (hereinafter sometimes referred to heat shock promoter region) is Nitrosomonas bacterial chromosomal DNA was digested with restriction enzymes Kpn I to obtain a DNA fragment of 11.5 kb, further the DNA fragment restriction enzymes Eco RI and Eco It can be obtained as a 0.65 kb DNA fragment digested with T22I. It can also be chemically synthesized. The heat shock promoter region thus obtained can be amplified by PCR.

【0028】ストレス感知遺伝子を構成する構造遺伝子
も、構造遺伝子だけからなるDNA断片であってもよ
く、またこのようなDNA断片の上流または下流に塩基
配列が結合しているDNA断片であってもよい。このよ
うな構造遺伝子としては、形質発現量が容易に検出でき
る公知の遺伝子が使用でき、例えばβ-ガラクトシダー
ゼをコードするlacZ遺伝子等の酵素をコードする遺伝子
などがあげられる。lacZ遺伝子は、例えばEscherichia
coli K12株から公知の方法によりDNA断片として切出
すことができる。酵素をコードする遺伝子はその形質発
現量を酵素の活性として容易に測定することができる。
The structural gene constituting the stress sensing gene may be a DNA fragment consisting of only the structural gene, or a DNA fragment having a base sequence bound upstream or downstream of such a DNA fragment. Good. As such a structural gene, a known gene whose expression level can be easily detected can be used, and examples thereof include a gene encoding an enzyme such as the lacZ gene encoding β-galactosidase. The lacZ gene is, for example, Escherichia
It can be cut out as a DNA fragment from E. coli K12 strain by a known method. The amount of expression of the gene encoding the enzyme can be easily measured as the activity of the enzyme.

【0029】本発明のアンモニア酸化細菌組換え体は、
上記ストレス感知遺伝子を細胞内に保持する細菌であ
り、ストレス感知遺伝子を連結したプラスミドベクター
をアンモニア酸化細菌に導入して形質転換することによ
り得られる。宿主となるアンモニア酸化細菌はアンモニ
アを酸化する細菌であり、ニトロソモナス属細菌に限定
されない。
The recombinant ammonia-oxidizing bacterium of the present invention comprises:
A bacterium that holds the stress sensing gene in a cell, and is obtained by introducing a plasmid vector linked with the stress sensing gene into an ammonia-oxidizing bacterium and transforming the bacterium. Ammonia-oxidizing bacteria serving as hosts are bacteria that oxidize ammonia, and are not limited to bacteria of the genus Nitrosomonas.

【0030】ストレス感知遺伝子をアンモニア酸化細菌
に導入するためのプラスミドベクターとしてはアンモニ
ア酸化細菌内で自立複製可能なプラスミドが使用可能で
あり、例えばpKT240などの公知のグラム陰性細菌用プラ
スミドがあげられる。ストレス感知遺伝子を連結したプ
ラスミドベクターは、エレクトロポレーション、接合伝
達等の公知の方法を用いてアンモニア酸化細菌に導入す
ることができる。
As a plasmid vector for introducing the stress sensing gene into the ammonia-oxidizing bacterium, a plasmid capable of autonomously replicating in the ammonia-oxidizing bacterium can be used, and examples thereof include a known plasmid for gram-negative bacteria such as pKT240. The plasmid vector linked with the stress sensing gene can be introduced into ammonia-oxidizing bacteria using a known method such as electroporation or conjugation transfer.

【0031】本発明のストレスの測定方法は、上記アン
モニア酸化細菌組換え体をストレス条件下で培養した
後、ストレス感知遺伝子中の構造遺伝子の形質発現量を
測定する方法である。ストレス条件としては、生育に不
適な高温環境、成育に不適なpH環境、重金属、毒性物
質その他の阻害物質の存在する環境、これらの複合環境
などがあげられる。
The method for measuring stress of the present invention is a method for measuring the expression level of the structural gene in the stress sensing gene after culturing the above-mentioned recombinant ammonia-oxidizing bacteria under stress conditions. Examples of the stress conditions include a high-temperature environment unsuitable for growth, a pH environment unsuitable for growth, an environment in which heavy metals, toxic substances and other inhibitors are present, and a composite environment thereof.

【0032】このようなストレス環境下でアンモニア酸
化細菌組換え体が培養されると、熱ショックプロモータ
ーの下流に位置する構造遺伝子が特異的に誘導され、そ
の形質が発現する。従って、この形質発現量を測定する
ことにより、アンモニア酸化細菌がストレスにさらされ
ているかどうかを検知することができる。
When a recombinant ammonia-oxidizing bacterium is cultured under such a stress environment, a structural gene located downstream of the heat shock promoter is specifically induced, and its trait is expressed. Therefore, by measuring the expression level of the trait, it is possible to detect whether or not the ammonia-oxidizing bacterium is exposed to stress.

【0033】アンモニア酸化細菌における形質発現量を
測定するには、ストレス感知遺伝子中の構造遺伝子に応
じて種々の方法を採用することができ、例えば(1)ス
トレス感知遺伝子中の構造遺伝子に対応するmRNAの発現
量をドットブロッティング、ノーザンブロッティング等
の公知方法で定量する方法、(2)ストレス感知遺伝子
中の構造遺伝子から生産される蛋白質の発現活性で定量
する方法、例えば酵素活性を吸光度等により測定する方
法、(3)ストレス感知遺伝子中の構造遺伝子から生産
される蛋白質の抗体を作成し、抗原抗体反応により、生
産された蛋白質の生産量を定量する方法などが利用でき
る。これらの中では、(2)の方法がより簡便にかつ定
量的に定量できる点で望ましい。
In order to measure the expression level of the trait in the ammonia oxidizing bacterium, various methods can be adopted depending on the structural gene in the stress sensing gene. For example, (1) corresponding to the structural gene in the stress sensing gene A method for quantifying the expression level of mRNA by a known method such as dot blotting or Northern blotting, (2) a method for quantifying the expression activity of a protein produced from a structural gene in a stress sensing gene, for example, measuring an enzyme activity by absorbance or the like (3) a method of preparing an antibody of a protein produced from the structural gene in the stress sensing gene, and quantifying the amount of the produced protein by an antigen-antibody reaction. Among them, the method (2) is preferable because it can be more easily and quantitatively quantified.

【0034】[0034]

【発明の効果】本発明の熱ショックプロモーターは、細
菌が高温などのストレス環境に置かれた場合に特異的に
認識されるプロモーターであり、その下流に構造遺伝子
を連結することにより、ストレスの検知に利用すること
ができる。
The heat shock promoter of the present invention is a promoter that is specifically recognized when a bacterium is placed in a stress environment such as a high temperature, and detects a stress by linking a structural gene downstream thereof. Can be used for

【0035】本発明のストレス感知遺伝子は、上記熱シ
ョックプロモーターまたはこれと同様の機能を示す塩基
配列を含むDNA断片と、構造遺伝子を含むDNA断片
との融合遺伝子からなっているので、細菌のストレスの
検知に利用することができる。
The stress sensing gene of the present invention comprises a fusion gene of the above-mentioned heat shock promoter or a DNA fragment containing a nucleotide sequence having a similar function to a DNA fragment containing a structural gene. Can be used to detect

【0036】本発明のアンモニア酸化細菌組換え体は、
上記ストレス感知遺伝子を保持しているので、アンモニ
ア酸化細菌のストレスの検知に利用することができる。
The recombinant ammonia-oxidizing bacterium of the present invention comprises:
Since the above-mentioned stress sensing gene is retained, it can be used for detecting the stress of ammonia-oxidizing bacteria.

【0037】本発明のアンモニア酸化細菌のストレスの
測定方法は、上記組換え体を用いているので、環境中の
様々な要因によって引起こされるアンモニア酸化細菌の
ストレスを簡便かつ迅速に検知することができる。
Since the method for measuring the stress of ammonia-oxidizing bacteria of the present invention uses the above-mentioned recombinant, it is possible to easily and quickly detect the stress of ammonia-oxidizing bacteria caused by various factors in the environment. it can.

【0038】[0038]

【発明の実施の形態】次の本発明の実施例について説明
する。実施例で使用したプラスミド、微生物などは次の
通りである。 《Nitrosomonas europaea IFO14298株》IFO発行の「Lis
t of Cultures 1992 Microorganisms 9th Edition」に
記載されている。 《Escherichia coli DH5株》コンピテントセルとして東
洋紡績株式会社より市販されている。 《Escherichia coli K12株》ATCCから入手できる。ATCC
No.10798 (Catalogue of Bacteria & Phages 17thedit
ion, 1991)。
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The following is a description of embodiments of the present invention. The plasmids and microorganisms used in the examples are as follows. 《 Nitrosomonas europaea IFO14298 shares》
t of Cultures 1992 Microorganisms 9th Edition ". << Escherichia coli DH5 strain >> It is commercially available from Toyobo Co., Ltd. as a competent cell. << Escherichia coli K12 strain >> Available from ATCC. ATCC
No.10798 (Catalogue of Bacteria & Phages 17thedit
ion, 1991).

【0039】《pUC19》大腸菌用プラスミドベクター。
東洋紡績株式会社より市販されている。 《pHSG296》大腸菌用プラスミドベクター。宝酒造株式
会社より市販されている。 《pKK223-3》大腸菌用プラスミドベクター。ファルマシ
アバイオテク株式会社より市販されている。 《pKT240》IncQ系のプラスミド。ATCCから入手できる。
ATCC No.37258 (Catalogue of Recombinabt DNA Materi
als 2nd edition, 1991)
<< pUC19 >> A plasmid vector for Escherichia coli.
Commercially available from Toyobo Co., Ltd. << pHSG296 >> Plasmid vector for E. coli. Commercially available from Takara Shuzo Co., Ltd. << pKK223-3 >> Plasmid vector for E. coli. Commercially available from Pharmacia Biotech. << pKT240 >> IncQ plasmid. Available from ATCC.
ATCC No. 37258 (Catalogue of Recombinabt DNA Materi
als 2nd edition, 1991)

【0040】実施例1 《N. europaea由来dnaK遺伝子のクローニング》これま
でに報告されている各種生物のDnaK(Hsp70)蛋白質の
一次構造における共通性の高い2か所の領域のアミノ酸
配列に相当するオリゴヌクレオチドミックスプライマ
ー、NDK-N、NDK-Cを合成した。これらのオリゴヌクレオ
チドの配列を表1に示す。
Example 1 << Cloning of dnaK Gene Derived from N. europaea >> This corresponds to the amino acid sequences of two regions having high commonality in the primary structure of DnaK (Hsp70) protein of various organisms reported so far. Oligonucleotide mix primers, NDK-N and NDK-C, were synthesized. The sequences of these oligonucleotides are shown in Table 1.

【0041】[0041]

【表1】 アミノ酸配列両端の数字は大腸菌DnaK蛋白質における残
基番号を示す。また、RはA,G、YはT,C、NはA,G,T,Cの等
モル混合物を示す。
[Table 1] The numbers at both ends of the amino acid sequence indicate the residue numbers in the Escherichia coli DnaK protein. R represents A, G, Y represents T, C, and N represents an equimolar mixture of A, G, T, C.

【0042】次に、合成された上記2種類のオリゴヌク
レオチド(NDK-N、NDK-C)をプライマーとし、N. europ
aea IFO14298株(以下、単にN. europaeaと記す)由来
の染色体DNAを鋳型としたPCRを行った。PCRの試薬は宝
酒造株式会社製Takara PCR amplification kitを用い
た。すなわち、0.5μgのN. europaea染色体DNA、20pmol
の各プライマー、5μlの10 x PCR buffer、5μlの2.5
mM dNTP mixture、0.5μlの5U/ml Takara Taq polymera
seをパーキンエルマー社製Micro Ampチューブ(商標)
に加え、蒸留水で50μlに調整した。これを、パーキン
エルマー社製 GeneAmp PCR System 2400に移して、94℃
で30秒間の前処理の後、1サイクルが94℃で30秒、55℃
で1分間、72℃で1.5分間の連続する反応よりなる反応
を25サイクル繰返した。さらに、72℃で10分間の後処理
を行った。
Next, the synthesized two oligonucleotides (NDK-N and NDK-C) were used as primers and N. europ
PCR was performed using chromosomal DNA derived from aea IFO14298 strain (hereinafter simply referred to as N. europaea ) as a template. As a PCR reagent, Takara PCR amplification kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used. That is, 0.5 μg of N. europaea chromosomal DNA, 20 pmol
Of each primer, 5 μl of 10 x PCR buffer, 5 μl of 2.5
mM dNTP mixture, 0.5μl 5U / ml Takara Taq polymera
se to PerkinElmer Micro Amp Tube (trademark)
And adjusted to 50 μl with distilled water. Transfer this to PerkinElmer GeneAmp PCR System 2400,
After 30 seconds of pre-treatment, one cycle is 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C
, And a reaction consisting of a continuous reaction at 72 ° C. for 1.5 minutes was repeated 25 cycles. Further, a post-treatment was performed at 72 ° C. for 10 minutes.

【0043】増幅されたPCR産物はフェノール−クロロ
ホルム処理後、エタノール沈殿によって回収した。すな
わち、反応終了液は25:24:1の容量比のTE飽和フェノー
ル:クロロホルム:イソアミルアルコール混合液を加
え、10,000 x g、5分間の遠心分離後、上清を得た。上
清の1/10容量に相当する3M 酢酸ナトリウムを加え、よ
く混合したのち、2.5容量に相当するエタノールを加
え、混合後、-80℃に15分間放置した。10,000 x g、10
分間の遠心分離によって沈殿物として得られたPCR産物
を70%エタノールでリンスした後、減圧乾燥した。
The amplified PCR product was recovered by ethanol precipitation after phenol-chloroform treatment. That is, the reaction-terminated liquid was mixed with a TE-saturated phenol: chloroform: isoamyl alcohol mixture at a volume ratio of 25: 24: 1, and centrifuged at 10,000 × g for 5 minutes to obtain a supernatant. 3 M sodium acetate corresponding to 1/10 volume of the supernatant was added and mixed well, and then ethanol corresponding to 2.5 volumes was added. After mixing, the mixture was allowed to stand at -80 ° C for 15 minutes. 10,000 xg, 10
The PCR product obtained as a precipitate by centrifugation for 70 minutes was rinsed with 70% ethanol, and then dried under reduced pressure.

【0044】得られたPCR産物はTE緩衝液(10mM Tris-C
l(pH 8.0), 1mM EDTA)に溶解し、2%アガロースゲル
電気泳動に供した。泳動終了後、ゲルを10μg/mlの臭化
エチジウム溶液に移し、室温で30分間放置した。ゲルを
充分に水洗後、紫外線照射によってDNAバンドを検出し
た。その結果、0.65kbに相当する位置に明瞭なDNAバン
ドを検出した。同DNAバンドを含むゲルを切出し、DNA C
ELL(草野科学器械製作所製、商標)を用いて、ゲル中
に含まれるDNAを抽出した。DNA溶液はフェノール・クロ
ロホルム処理後、エタノール沈殿によって回収した。回
収したDNA 1μgを鋳型とし、ベーリンガー・マンハイム
社製Nonradioactive DNA Labeling Kitを用いたランダ
ムプライマー法によりジオキシゲニンでラベルしたDNA
プローブを作製した。
The obtained PCR product was prepared in a TE buffer (10 mM Tris-C).
(pH 8.0), 1 mM EDTA) and subjected to 2% agarose gel electrophoresis. After completion of the electrophoresis, the gel was transferred to a 10 μg / ml ethidium bromide solution and left at room temperature for 30 minutes. After sufficiently washing the gel with water, DNA bands were detected by ultraviolet irradiation. As a result, a clear DNA band was detected at a position corresponding to 0.65 kb. Cut out the gel containing the same DNA band, DNA C
DNA contained in the gel was extracted using ELL (trademark, manufactured by Kusano Scientific Instruments). The DNA solution was recovered by ethanol precipitation after phenol / chloroform treatment. Using 1 μg of the recovered DNA as a template, DNA labeled with dioxygenin by a random primer method using a Boehringer Mannheim Nonradioactive DNA Labeling Kit
A probe was made.

【0045】N. europaea染色体DNA 3μgをKpnIで完全
消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動に供した後、ニ
トロセルロースフィルターに移した。80℃、2時間の熱
処理によってDNAをフィルターに固定した後、上記ジオ
キシゲニンでラベルしたDNAプローブを用いたサザンハ
イブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーショ
ンは、5xSSC; blocking reagent, 0.5%; N-lauroylsarc
osine Na-salt, 0.05%(w/v); SDS, 0.1%(w/v)の組成よ
りなるハイブリダイゼーション溶液を用い、68℃の温度
条件で行った。シグナルの検出はベーリンガー・マンハ
イム社製Nonradioactive DNA Detection Kitを用いて行
った。その結果、およそ11.5kbの位置にシグナルが検出
された。
3 μg of N. europaea chromosomal DNA was completely digested with KpnI , subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and then transferred to a nitrocellulose filter. After immobilizing the DNA on the filter by heat treatment at 80 ° C. for 2 hours, Southern hybridization using the DNA probe labeled with dioxygenin was performed. Hybridization: 5xSSC; blocking reagent, 0.5%; N-lauroylsarc
The hybridization was performed at a temperature of 68 ° C. using a hybridization solution having a composition of osine Na-salt, 0.05% (w / v); SDS, 0.1% (w / v). The detection of the signal was performed using the Nonradioactive DNA Detection Kit manufactured by Boehringer Mannheim. As a result, a signal was detected at a position of about 11.5 kb.

【0046】次に、再びN. europaea染色体DNA 10μgを
KpnIで完全消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動に供
した。臭化エチジウムでゲルを染色した後、11.5kbに相
当するDNAを含むゲルを切出し、DNA CELL(草野科学器
械製作所製、商標)を用いて、ゲル中に含まれるDNAを
抽出した。DNA溶液はフェノール・クロロホルム処理
後、エタノール沈殿によって回収した。
Next, 10 μg of chromosomal DNA of N. europaea was again
The whole was digested with KpnI and subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis. After the gel was stained with ethidium bromide, a gel containing DNA corresponding to 11.5 kb was cut out, and DNA contained in the gel was extracted using DNA CELL (trademark, manufactured by Kusano Scientific Instruments). The DNA solution was recovered by ethanol precipitation after phenol / chloroform treatment.

【0047】得られたDNA断片約0.1μgと、KpnIで完全
消化しアルカリホスファターゼ処理を施したpUC19プラ
スミド0.05μgとを混合し、ライゲーションを行った。
ライゲーションには宝酒造株式会社製DNAライゲーショ
ンキットを用いた。すなわち、混合DNA溶液の4倍量に
相当するライゲーション溶液Aを加えよく混合した後、
混合DNA溶液と等量のライゲーション溶液Bを添加し、
混合後16℃で1時間の反応を行った。
About 0.1 μg of the obtained DNA fragment was mixed with 0.05 μg of pUC19 plasmid completely digested with KpnI and treated with alkaline phosphatase, and ligated.
For ligation, a DNA ligation kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used. That is, after adding the ligation solution A corresponding to 4 times the amount of the mixed DNA solution and mixing well,
Add the same amount of ligation solution B as the mixed DNA solution,
After mixing, the reaction was carried out at 16 ° C. for 1 hour.

【0048】得られたライゲーション産物を大腸菌DH5
株コンピテントセル(東洋紡績株式会社製)に導入して
形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体を得た。任
意に選んだ形質転換体800株は、50μg/mlのアンピシリ
ンを含む新たなLB平板培地にプレートあたり100コロニ
ーとなるようにレプリカし、前記ジオキシゲニンでラベ
ルしたDNAプローブを用いてコロニーハイブリダイゼー
ションを行った。ハイブリダイゼーションは、5xSSC; b
locking reagent, 0.5%; N-lauroylsarcosineNa-salt,
0.05%(w/v); SDS, 0.1%(w/v)の組成よりなるハイブリダ
イゼーション溶液を用い、68℃の温度条件で行った。
The obtained ligation product was used for E. coli DH5
The strain was introduced into competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and transformed to obtain transformants resistant to ampicillin. 800 transformants arbitrarily selected were replicated on a new LB plate medium containing 50 μg / ml of ampicillin so as to have 100 colonies per plate, and colony hybridization was performed using the DNA probe labeled with dioxygenin. Was. Hybridization is 5xSSC; b
locking reagent, 0.5%; N-lauroylsarcosineNa-salt,
Using a hybridization solution having a composition of 0.05% (w / v); SDS, 0.1% (w / v), the temperature was 68 ° C.

【0049】シグナルの検出はベーリンガー・マンハイ
ム社製Nonradioactive DNA Detection Kitを用いて行っ
た。その結果、シグナルを示す6個のポジティブクロー
ンを得た。これらのポジティブクローンよりアルカリ-S
DS法を用いてプラスミドを精製し、そのKpnI消化物をア
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、すべてのプラス
ミドは11.5kbの外来DNA断片を保持していることが明ら
かになった。これらのプラスミドから任意のひとつを選
び、pNEK10と命名し、以降の実験に用いた。pNEK10に含
まれる11.5kbのKpnI領域の制限酵素地図を図1に示す。
図1中、細線はpUC19由来のDNA、太線はN. europaea
来の外来DNA、白線部分は塩基配列を決定した2.6kbのEc
oRI-HindIII領域を示す。狭い斜線はDNAプローブの位置
を、広い斜線はdnaK遺伝子の位置を示す。また矢印とそ
の下の記号は、解析に用いたプライマーDNAの位置と方
向および名称を示す。
The detection of the signal was carried out using a Nonradioactive DNA Detection Kit manufactured by Boehringer Mannheim. As a result, six positive clones showing a signal were obtained. Alkaline-S from these positive clones
The plasmid was purified by the DS method, and the Kpn I digest was analyzed by agarose gel electrophoresis. As a result, it was revealed that all plasmids had a foreign DNA fragment of 11.5 kb. Any one of these plasmids was selected, named pNEK10, and used in subsequent experiments. The restriction enzyme map of Kpn I region of 11.5kb included in pNEK10 shown in FIG.
In FIG. 1, the thin line is DNA derived from pUC19, the thick line is foreign DNA derived from N. europaea , and the white line is 2.6 kb Ec whose base sequence was determined.
o RI- shows the Hin dIII region. The narrow hatching indicates the position of the DNA probe, and the wide hatching indicates the position of the dnaK gene. The arrows and symbols below them indicate the position, direction, and name of the primer DNA used in the analysis.

【0050】上記pNEK10に含まれる11.5kbのKpnI領域の
どの位置に、dnaK遺伝子のクローニングに用いたDNAプ
ローブと相同性のある領域が存在するかを明確にするた
めに、pNEK10を鋳型DNAとしてPCRを行った。各種プライ
マーを組合せ、AからDの4系列の反応を行った。プラ
イマーの組合せは、A;M13-47(宝酒造株式会社製)お
よびNDK-N、B;M13-47およびNDK-C、C;RV-M(宝酒造
株式会社製)およびNDK-N、D;RV-MおよびNDK-Cとし
た。その結果、A系では3.5kbに、D系では8.5kbの位置
に特異的なDNAバンドが検出された。B系およびC系に
おいてはDNAの増幅は認められなかった。以上の結果か
ら、DNAプローブに用いた配列と相同性のある領域は図
1中、狭い斜線で示される領域に存在することがわかっ
た。
[0050] in which position the Kpn I region of 11.5kb included in the PNEK10, in order to clarify whether a region is present a DNA probe homologous used for cloning of the dnaK gene, the PNEK10 as template DNA PCR was performed. Various primers were combined, and four series of reactions from A to D were performed. The combination of primers is as follows: A; M13-47 (Takara Shuzo) and NDK-N, B; M13-47 and NDK-C, C; RV-M (Takara Shuzo) and NDK-N, D; RV -M and NDK-C. As a result, a specific DNA band was detected at 3.5 kb in the A system and at 8.5 kb in the D system. No DNA amplification was observed in the B and C lines. From the above results, it was found that a region having a homology to the sequence used for the DNA probe was present in a narrow hatched region in FIG.

【0051】DNAプローブに用いた配列と相同性のある
領域を含む2.6kbのEcoRI-HindIII領域(図1中、白線)
について全塩基配列を決定した。その結果、この断片は
2,618塩基対より構成されるDNAであることが明らかにな
った。主要なオープンリーディングフレーム(ORF)を
検索したところ、EcoRIサイトより321塩基下流より始ま
る1,935bpよりなるORFが見いだされた。このORFの位置
は、図1中、広い斜線で示される。
[0051] The 2.6kb containing a region of sequence homology using the DNA probe Eco RI-Hin dIII region (in FIG. 1, the white line)
Was determined for the entire nucleotide sequence. As a result, this fragment
The DNA was found to be composed of 2,618 base pairs. When a major open reading frame (ORF) was searched, an ORF consisting of 1,935 bp starting 321 bases downstream from the Eco RI site was found. The position of this ORF is indicated by a wide oblique line in FIG.

【0052】上記ORFから推定されるアミノ酸配列と相
同性を示す蛋白質を既知データーベースより探索した結
果、異種微生物のHsp70(DnaK)蛋白質と全領域を通じ
て相同性を示すことがわかった。例えば、大腸菌由来の
DnaK蛋白質との比較においては73.9%の相同性を示し
た。この結果から、前記ORFをN. europaea由来ののdnaK
遺伝子と断定した。このdnaK遺伝子の塩基配列および遺
伝子産物の一次構造を配列番号1および2に示す。
A search for a protein having homology with the amino acid sequence deduced from the ORF from a known database revealed that the protein exhibits homology with the Hsp70 (DnaK) protein of a heterologous microorganism throughout the entire region. For example, from E. coli
In comparison with DnaK protein, it showed 73.9% homology. From the results, the ORF was converted to dnaK derived from N. europaea.
It was determined to be a gene. The nucleotide sequence of this dnaK gene and the primary structure of the gene product are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2.

【0053】《N. europaea由来dnaK遺伝子の転写開始
点の決定》N. europaeaを、P培地〔2.5g/l (NH4)2SO4,
0.7g/l KH2PO4, 19.5g/l Na2HPO 4, 0.5g/l NaHCO3, 0.
1g/l MgSO4・7H2O, 5mg/l CaCl2・2H2O, 1mg/l Fe-EDTA,
pH8.0〕を用いて、亜硝酸濃度が約5mMとなるまで28℃で
好気的に培養した。培養液400mlからGVWP04700フィルタ
ー(日本ミリポアリミテッド製)を用いて菌体を集菌
し、新鮮なP培地で洗浄したのち、100mlの新鮮なP培
地2本に移し、28℃で再び好気的に培養した。
<<N. europaeaOrigindnaKInitiation of gene transcription
Point Determination >>N. europaeaWith 2.5 g / l (NHFour)TwoSOFour,
 0.7g / l KHTwoPOFour, 19.5g / l NaTwoHPO Four, 0.5g / l NaHCOThree, 0.
1g / l MgSOFour・ 7HTwoO, 5mg / l CaClTwo・ 2HTwoO, 1mg / l Fe-EDTA,
pH 8.0) at 28 ° C until the nitrite concentration is approximately 5 mM.
Cultured aerobically. GVWP04700 filter from 400ml culture
-Collect cells using Nippon Millipore Limited
After washing with fresh P medium, 100 ml of fresh P medium
It was transferred to two grounds and cultured again aerobically at 28 ° C.

【0054】3時間培養後、再度集菌し、660nmにおけ
る吸光度が2となるように新鮮なP培地に懸濁した。懸
濁液1mlを1.5ml容微量遠心管2本にそれぞれ移し、一方
を28℃、もう一方をヒートショックを与えるために42℃
でインキュベーションし、経時的(0, 10, 30, 90分
後)にサンプリングした。懸濁液330μlから、遠心分離
(10,000 x g, 1分)により直ちに菌体を集菌し、Isoge
n(日本ジーン社製)を用いて全RNAの抽出・精製を行っ
た。懸濁液330μlあたり(培養液60ml相当)4〜12μgの
RNAを抽出・精製できた。
After culturing for 3 hours, the cells were collected again and suspended in a fresh P medium so that the absorbance at 660 nm became 2. Transfer 1 ml of the suspension to two 1.5 ml microcentrifuge tubes, one at 28 ° C. and the other at 42 ° C. to give heat shock.
And sampled over time (after 0, 10, 30, 90 minutes). The cells were immediately collected from 330 μl of the suspension by centrifugation (10,000 × g, 1 minute),
n (Nippon Gene) was used to extract and purify total RNA. 4 to 12 μg per 330 μl of suspension (equivalent to 60 ml of culture solution)
RNA was extracted and purified.

【0055】上記精製RNAを鋳型として、蛍光標識を施
したK337プライマー(図2参照)をアニーリングし、さ
らに定法に従って逆転写酵素による伸長反応を行った。
すなわち、微量遠心管に、3μgの全RNA、5'末端をロー
ダミンでラベルした3pmolのK337プライマー(5'-GTTGGT
AGTCCCAAGGTCGATGCC-3'、配列番号1の塩基配列の16番
目から39番目までの配列に対応)、1.7μlの3M KCl、2.
0μlの10mM TE緩衝液(pH8.0)を加え、滅菌水を用いて
20μlとした。60℃で1時間アニーリング反応を行った
後、室温に戻し、60μlのRTase緩衝液(16.7mM KCl, 1
3.3mM MgCl2, 23.3mM Tris-Cl(pH8.3), 13.3mM DTT, 0.
33mM dNTP mixture, 0.14mg/ml actinomycin D)、1μl
のRNase inhibitor(20U/ml ; 東洋紡績株式会社製)、
1μlのAMV Reverse transcriptase XL(30U/ml ; 東洋
紡績株式会社製)を添加し、37℃で1時間伸長反応を行
った。
Using the purified RNA as a template, a fluorescently labeled K337 primer (see FIG. 2) was annealed, and an extension reaction was performed with a reverse transcriptase according to a standard method.
That is, 3 μg of total RNA and 3 pmol of K337 primer (5′-GTTGGT
AGTCCCAAGGTCGATGCC-3 ′, corresponding to the 16th to 39th sequences of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1), 1.7 μl of 3M KCl, 2.
Add 0 μl of 10 mM TE buffer (pH 8.0) and use sterile water
20 μl. After an annealing reaction at 60 ° C. for 1 hour, the temperature was returned to room temperature, and 60 μl of an RTase buffer (16.7 mM KCl, 1
3.3mM MgCl 2 , 23.3mM Tris-Cl (pH8.3), 13.3mM DTT, 0.
33mM dNTP mixture, 0.14mg / ml actinomycin D), 1μl
RNase inhibitor (20U / ml; manufactured by Toyobo Co., Ltd.)
1 μl of AMV Reverse transcriptase XL (30 U / ml; manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was added, and extension reaction was performed at 37 ° C. for 1 hour.

【0056】伸長産物はエタノール沈殿後、風乾し、泳
動用緩衝液(95% ホルムアミド、20mM EDTA、0.05% Met
hyl Violet)に懸濁した。懸濁液は、尿素-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、FMBIO-100蛍光イメージ
アナライザー(日立ソフトエンジニアリング株式会社
製)を用いてその鎖長を測定した。その結果、28℃でイ
ンキュベーションしたN. europaea由来のサンプルから
は伸長産物は得られなかったが、42℃でヒートショック
を施したN. europaea由来のサンプルからは、70塩基と7
1塩基の長さの伸長産物が確認された(図3)。
The extension product was ethanol-precipitated, air-dried, and electrophoresis buffer (95% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% Met).
hyl Violet). The suspension was subjected to urea-polyacrylamide gel electrophoresis, and its chain length was measured using a FMBIO-100 fluorescence image analyzer (manufactured by Hitachi Software Engineering Co., Ltd.). As a result, no extension product was obtained from the sample derived from N. europaea incubated at 28 ° C., but from the sample derived from N. europaea subjected to heat shock at 42 ° C., 70 bases and 7 bases were obtained.
An extension product having a length of one base was confirmed (FIG. 3).

【0057】この結果から、熱ショックによってdnaK
伝子の転写が誘導されることがわかった。また、図2に
示すように、転写開始点は開始コドンより、31塩基また
は32塩基上流のAまたはCであることが明らかになっ
た。転写開始点のAから7〜35塩基上流には、大腸菌の
σ32依存性プロモーターに相同性を持つ配列(CTTGA-15
bp-CCCCATTTA)が認められた。以上の結果から、上記配
列をN. europaea dnaK由来の熱ショックプロモーターで
あると結論した。このようにして得られたN. europaea
dnaKプロモーターおよび大腸菌の熱ショックプロモータ
ーの塩基配列を表2に示す。
From these results, it was found that heat shock induced transcription of the dnaK gene. Further, as shown in FIG. 2, it was revealed that the transcription start point was A or C 31 or 32 bases upstream from the start codon. The 7-35 bases upstream from the A of the transcription initiation point, sequences with homology to the sigma 32 dependent promoters of E. coli (CTTGA-15
bp-CCCCATTTA). From the above results, it was concluded that the above sequence was a heat shock promoter derived from N. europaea dnaK . N. europaea obtained in this way
Table 2 shows the nucleotide sequences of the dnaK promoter and the E. coli heat shock promoter.

【0058】[0058]

【表2】 N. europaea dnaKの塩基配列の両端の数字は、配列番号
1の1番目のAから数えた塩基の数を示し、マイナスは
上流にあることを示す。
[Table 2] The numbers at both ends of the base sequence of N. europaea dnaK indicate the number of bases counted from the first A in SEQ ID NO: 1, and a minus indicates that the base is upstream.

【0059】《融合遺伝子ベクターの構築および形質転
換体の作製》dnaK遺伝子プロモーター下流に、dnaK-lac
Zの翻訳的融合遺伝子をコードするプラスミド、pKLAC72
8の構築を行った。概略図を図4および図5に示す。最
初にTn903由来のカナマイシンアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子(カナマイシン耐性遺伝子)のPCRクローニ
ングを行った。すなわち、pHSG296プラスミドを鋳型DNA
として、表3に示す2種類のオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとしてPCRを行った。
<< Construction of Fusion Gene Vector and Preparation of Transformant >> Downstream of the dnaK gene promoter, dnaK - lac
PKLAC72, a plasmid encoding a translational fusion gene for Z
Eight constructions were made. Schematic diagrams are shown in FIGS. First, PCR cloning of the kanamycin acetyltransferase gene (kanamycin resistance gene) derived from Tn903 was performed. That is, the pHSG296 plasmid was used as the template DNA
PCR was performed using the two oligonucleotides shown in Table 3 as primers.

【0060】[0060]

【表3】 [Table 3]

【0061】PCRの結果、1.2kbの増幅産物を得た。この
増幅産物をPstI、PvuIIで消化し、あらかじめpKT240をP
stI、PvuIIで消化した5.8kb断片とライゲーションし
た。ライゲーション産物は大腸菌DH5株に形質転換し、
得られた形質転換体より、目的とするpKKM712を得た
(図4参照)。
As a result of the PCR, an amplification product of 1.2 kb was obtained. The amplification products Pst I, digested with Pvu II, the advance PKT240 P
st I, and ligated with the 5.8kb fragment was digested with Pvu II. The ligation product is transformed into E. coli DH5 strain,
The desired pKKM712 was obtained from the obtained transformant (see FIG. 4).

【0062】次に、大腸菌5S RNA遺伝子のターミネータ
ー領域のPCRクローニングを行った。すなわち、pKK223-
3プラスミドDNAを鋳型DNAとして、表4に示す2種類の
オリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。
Next, PCR cloning of the terminator region of the Escherichia coli 5S RNA gene was performed. That is, pKK223-
3 PCR was performed using plasmid DNA as template DNA and two kinds of oligonucleotides shown in Table 4 as primers.

【0063】[0063]

【表4】 [Table 4]

【0064】PCRの結果、0.3kbの増幅産物を得た。この
増幅産物をEcoT22I、PstIで消化し、あらかじめPstIで
消化しアルカリフォスファターゼ処理したpKKM712とラ
イゲーションした。ライゲーション産物は大腸菌DH5株
に形質転換し、得られた形質転換体より、目的とするpK
TK40を得た(図4参照)。
As a result of the PCR, an amplification product of 0.3 kb was obtained. The amplified product Eco T22I, was digested with Pst I, and ligated with pKKM712 was alkaline phosphatase treated previously digested with Pst I. The ligation product was transformed into Escherichia coli DH5 strain, and the desired pK
TK40 was obtained (see FIG. 4).

【0065】次に、大腸菌染色体DNA由来lacZ遺伝子のP
CRクローニングを行った。すなわち、大腸菌K12株染色
体DNAを鋳型DNAとして、表5に示す2種類のオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてPCRを行った。
Next, the P of the lacZ gene derived from E. coli chromosomal DNA
CR cloning was performed. That is, PCR was performed using chromosomal DNA of the Escherichia coli K12 strain as a template DNA and two types of oligonucleotides shown in Table 5 as primers.

【0066】[0066]

【表5】 [Table 5]

【0067】PCRの結果、3.1kbの増幅産物を得た。この
増幅産物をEcoT22I、PstIで消化し、あらかじめPstIで
消化しアルカリフォスファターゼ処理したpKTK40とライ
ゲーションした。ライゲーション産物は大腸菌DH5株に
形質転換し、得られた形質転換体より、目的とするpKLA
C726を得た(図5参照)。
As a result of the PCR, an amplification product of 3.1 kb was obtained. This amplification product was digested with Eco T22I and Pst I, and ligated with pKTK40 previously digested with Pst I and treated with alkaline phosphatase. The ligation product was transformed into Escherichia coli DH5 strain, and the obtained pKLA
C726 was obtained (see FIG. 5).

【0068】上記pKLAC726とライゲーションするための
dnaK遺伝子のプロモーター領域およびDnaK蛋白質N-末端
領域をコードするDNA断片を、次のようにして得た。概
略図を図6に示す。すなわち、前記pNEK10より、dnaK
伝子のプロモーター領域およびDnaK蛋白質N-末端領域を
コードする1.05kbのEcoRI断片を取出し、あらかじめEco
RIで消化しアルカリフォスファターゼ処理しておいたpU
C19とライゲーションした(図6参照)。ライゲーショ
ン産物は大腸菌DH5株に形質転換し、得られた形質転換
体より、dnaK遺伝子のプロモーター領域が0.62kbのPstI
-EcoT22I領域中に存在するプラスミドpNEK12を得た(図
6参照)。
For ligation with the above pKLAC726
DNA fragments encoding the promoter region of the dnaK gene and the N-terminal region of the DnaK protein were obtained as follows. A schematic diagram is shown in FIG. That is, a 1.05 kb Eco RI fragment encoding the promoter region of the dnaK gene and the N-terminal region of the DnaK protein was removed from pNEK10 , and Eco
PU digested with RI and treated with alkaline phosphatase
Ligation with C19 (see FIG. 6). The ligation product was transformed into Escherichia coli DH5 strain, and the resulting transformant was found to have a Pst I promoter having a promoter region of dnaK gene of 0.62 kb.
-A plasmid pNEK12 present in the Eco T22I region was obtained (see FIG. 6).

【0069】このpNEK12より、dnaK遺伝子のプロモータ
ー領域およびDnaK蛋白質N-末端領域をコードする0.62kb
PstI-EcoT22I断片を取出し、あらかじめPstIで消化し
アルカリフォスファターゼ処理しておいたpKLAC726とラ
イゲーションした(図5参照)。ライゲーション産物は
大腸菌DH5株に形質転換し、得られた形質転換体より、
目的とする11.0kbのpKLAC728を得た(図5参照)。
From this pNEK12, 0.62 kb encoding the promoter region of the dnaK gene and the N-terminal region of the DnaK protein
Taken out of the Pst I- Eco T22I fragment was ligated with pKLAC726 which had been digested with alkaline phosphatase previously treated with Pst I (see Figure 5). The ligation product was transformed into Escherichia coli DH5 strain, and from the resulting transformant,
The desired 11.0 kb pKLAC728 was obtained (see FIG. 5).

【0070】得られたpKLAC728はdnaK-lacZの翻訳的融
合遺伝子を含み、この融合遺伝子はdnaKプロモーター領
域によって転写制御される。また、このプロモーター領
域上流には大腸菌由来5Sターミネーターが存在し、上流
からのリードスルーを抑制する。さらに、pKLAC728プラ
スミドはN. europaea細胞内で発現するマーカー遺伝子
としてカナマイシン耐性遺伝子を保持する。
The resulting pKLAC728 contains a translational fusion gene of dnaK - lacZ , which is transcriptionally controlled by the dnaK promoter region. Escherichia coli-derived 5S terminator is present upstream of this promoter region, and suppresses read-through from upstream. Furthermore, the pKLAC728 plasmid carries a kanamycin resistance gene as a marker gene expressed in N. europaea cells.

【0071】《形質転換体の熱ショック応答》pKLAC728
はエレクトロポレーション法によりN. europaeaに導入
し、形質転換体(組換え体)を得た。なお装置としては
バイオラッド(Bio-Rad)社製のジーンパルサーおよびキ
ュベットを使用した。すなわち、pKLAC728およびN. eur
opaeaの混合液を氷冷しておいたキュベット(電極間隔
0.2cm)に移し、直ちにジーンパルサー・キュベットチ
ャンバーに装着して電気パルスをかけた。パルスの設定
条件は、5〜12.5kV/cm、5.0msecとした。
<< Heat Shock Response of Transformant >> pKLAC728
Was introduced into N. europaea by electroporation to obtain a transformant (recombinant). The apparatus used was a Gene Pulser and a cuvette manufactured by Bio-Rad. That is, pKLAC728 and N. eur
Ice-cooled cuvette of opaea mixture (electrode spacing
0.2 cm) and immediately attached to a Gene Pulser cuvette chamber and subjected to an electric pulse. The pulse setting conditions were 5 to 12.5 kV / cm and 5.0 msec.

【0072】このようにして得た組換え体N. europaea
(pKLAC728)株を、25μg/mlのカナマイシンを含むP培地
300mlを用いて、亜硝酸濃度が約5mMとなるまで30℃で暗
所にて好気的に振盪培養した。菌体はGVWP04700フィル
ター(日本ミリポアリミテッド製)を用いて集菌し、25
μg/mlのカナマイシンを含む新鮮なP培地100mlを含む
フラスコに移し、30℃の温度条件下で暗所にて好気的に
4時間振盪培養した。菌体は再びGVWP04700フィルター
を用いて集菌し、直ちに新鮮な25μg/mlのカナマイシン
を含むP培地に660nmにおける吸光度がおよそ5となる
ように懸濁した。懸濁液0.05mlを、5mlの新鮮な25μg/m
lのカナマイシンを含むP培地を含む培養用試験管に移
し、1本は30℃で、もう1本は37℃で振盪培養した。経
時的に培養液からその0.1mlをサンプリングし、β-ガラ
クトシダーゼ活性を測定した。
The recombinant thus obtainedN. europaea
(pKLAC728) strain, P medium containing 25 μg / ml kanamycin
Using 300 ml, darken at 30 ° C until the nitrite concentration becomes about 5 mM.
The cells were cultured aerobically with shaking. The cells are GVWP04700 fill
Bacteria (manufactured by Nippon Millipore Limited), and 25
Contains 100 ml of fresh P medium containing μg / ml kanamycin
Transfer to a flask and aerobically in the dark at 30 ° C
The cells were cultured with shaking for 4 hours. Bacterial filter again GVWP04700
Harvest cells and immediately use fresh 25 μg / ml kanamycin
Absorbance at 660 nm is about 5 in P medium containing
As above. Add 0.05 ml of suspension to 5 ml of fresh 25 μg / m
Transfer to a culture tube containing P medium containing 1 kanamycin
One was cultured at 30 ° C and the other at 37 ° C with shaking. Sutra
Occasionally sample 0.1 ml from the culture and
Cuctosidase activity was measured.

【0073】β-ガラクトシダーゼ活性はMillerの方法
を修飾した方法を用いた。すなわち、培養液0.1mlと0.0
05% SDSを含むZ緩衝液(4.27g/l Na2HPO4, 2.75g/l Na
H2PO 4・H2O, 0.375g/l KCl, 0.125g/l MgSO4・7H2O, pH
7.0)とを混合し、30℃で5分間プレインキュベーショ
ンした。4mg/mlオルトニトロフェノールガラクトピラノ
シド(ONPG)水溶液0.2mlを加えて反応を開始し、30℃
で一定時間反応を行った。0.5mlの1M Na2CO3を加えて反
応を停止し、直ちに420nmと550nmの波長における吸光度
を求めた。またブランク試験として、サンプルの代わり
に新鮮なP培地を用いて同様の反応を行った。また、サ
ンプルの660nmにおける吸光度も別に測定した。結果を
図7に示す。
Β-galactosidase activity was determined according to Miller's method.
Was used. That is, 0.1 ml of culture solution and 0.0
Z buffer containing 05% SDS (4.27 g / l NaTwoHPOFour, 2.75g / l Na
HTwoPO Four・ HTwoO, 0.375g / l KCl, 0.125g / l MgSOFour・ 7HTwoO, pH
7.0) and pre-incubation at 30 ℃ for 5 minutes
I did. 4mg / ml ortho-nitrophenol galactopyrano
The reaction is started by adding 0.2 ml of an aqueous solution of Sid (ONPG),
For a certain period of time. 0.5ml 1M NaTwoCOThreePlus anti
Stop the reaction and immediately absorb at 420 and 550 nm wavelengths.
I asked. As a blank test, instead of a sample
A similar reaction was performed using fresh P medium. Also,
The absorbance of the sample at 660 nm was also measured separately. The result
As shown in FIG.

【0074】サンプル中のβ-ガラクトシダーゼ活性は
次式で計算した。
The β-galactosidase activity in the sample was calculated by the following equation.

【数1】 (Equation 1)

【0075】その結果、図7に見られるように、37℃に
培養温度を上昇させた系においては顕著な活性の上昇が
認められ、N. europaea(pKLAC728)株を用いて熱ショッ
ク応答を検出可能なことが明らかになった。
As a result, as shown in FIG. 7, a remarkable increase in the activity was observed in the system in which the culture temperature was increased to 37 ° C., and the heat shock response was detected using the N. europaea (pKLAC728) strain. It became clear what was possible.

【0076】[0076]

【配列表】 配列番号:1 配列の長さ:1935 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Nitrosomonas europaea 株名:IFO14298 配列 ATGGCAAAAA TAATTGGCAT CGACCTTGGG ACTACCAACT CATGCGTTGC CGTCATGGAA 60 GGCAACAAAC CCAAGGTCAT TGAAAATGCT GAAGGTGCAA GGACGACGCC GTCGATTGTC 120 GCCTATGCGG AAGACAATGA AATTCTGGTA GGGGCATCGG CCAAGCGTCA GGCAGTCACC 180 AATCCGGAAA ATACCCTGTT TGCGATCAAA CGGTTGATTG GCCGTCGTTT CGATGAAGAA 240 GTGGTGCAAA AGGATATCAG TGTAACGCCC TACAAAATCG TGCGTGCCGA TAACAACGAT 300 GCATGGATAG AAGCACGCGG AAGGAAAATC GCACCGCCGG AGGTTTCTGC ACAGGTGCTG 360 ATAAAAATGA AAAAAACGGC TGAAGATTAT CTGGGTGAGC CGGTTACAGA AGCCGTCATC 420 ACCGTTCCAG CGTATTTCAA CGATTCTCAG CGTCAGGCTA CCAAGGATGC AGGCCGTATC 480 GCAGGGCTGG AAGTCAAACG TATCATCAAT GAACCAACTG CTGCCGCACT TGCATTCGGT 540 TTAGATAAGA AGGAAGGTGA TCGCAAAATT GCGGTATACG ATCTGGGCGG AGGTACGTTT 600 GATATTTCGA TCATCGAAAT CGCAGAAGTC GAAGGCGAAC ACCAGTTCGA AGTGCTGGCA 660 ACCAATGGTG ACACTTTCCT CGGCGGTGAG GATTTCGACT CCAGAGTGAT CGAATATCTG 720 GTGGATGAAT TCAGGAAAGA GAGTGGTATC GATCTGAAAA AAGATATGCT GGCATTGCAA 780 CGGCTCAAAG ATGCAGCGGA AAAAGCCAAA ATCGAGCTGT CATCCAGCCA ACAGACCGAA 840 GTGAATCTAC CCTATATCAC GGCAGATGCA TCAGGCCCAA AACACCTGGC TGTCAAGATC 900 ACCCGTGCCA AGCTGGAGAG TCTGGTCGAA GAACTGATCG AGCGTACTGC AGGCCCTTGC 960 CGGACTGCGC TTAAAGATGC GGGTTTGTCG GTTTCTGACA TCAATGACGT CATTCTGGTC 1020 GGTGGACAGA CCCGTATGCC GAAAGTCCAG GAGAAGGTCA AGGAAATCTT CGGCAAAGAG 1080 CCGCGCAAAG ATGTCAATCC TGACGAGGCA GTTGCCATCG GTGCTGCGAT CCAGGGCGGG 1140 GTGCTGAAAG GAGATGTCAA GGATGTGCTG CTGCTGGATG TGACTCCACT GTCGTTGGGA 1200 ATCGAAACAC TGGGTGGCGT CATGACCAAG TTGATCCAGA AGAACACCAC CATTCCGACC 1260 AAGGCGCAGC AGGTGTTCTC GACAGCGGAC GATAACCAGA CAGCGGTGAC CATTCACGTA 1320 TTGCAGGGTG AGCGGGAAGT GGCCTCCGGC AATAAAAGTC TAGGCCAGTT CAACCTGACC 1380 GATATTCCGT CAGCACCCCG CGGAATGCCT CAGATCGAGG TGATTTTCGA TATCGATGCC 1440 AACGGTATTC TGCATGTTTC AGCTAAAGAC AAGGCAACCG GCAAGGAAAA CAAGATCAAG 1500 ATCCAGGCAA GCTCCGGGCT GTCTGAAGAT GAAATCCAGA AAATGGTAAA AGATGCCGAA 1560 GCGCATGCGG AAGAAGACAA AAAAGCACTG GATCTGGTCA ACAGTCGTAA CCAGTGTGAC 1620 GCCATGATTC ATTCAGTCAG AAAATCACTG GCTGAATACG GTGACAAACT GGAAGGGGAT 1680 GAAAAATCCA GAATCGAGGC AGCGTTGAAA GAGGCCGAGG AAGCACTCAA ATCCGGCGAT 1740 AAACAGACGA TCGATGCCAA AACCCAGGCG TTGACCGAAG CTTCGCATAA ACTGGCTGAG 1800 AAGATGTACG CCCAGGAGCA GGCGCAGGCT GGTCAGCAGG CAGGTGCCGG GACTGCATCC 1860 GATCAGTCTC AGGATAAGCC GGTTGAAGGC GAAGTCGTCG ATGCCGAATT CGAGGAAGTC 1920 AAAGATAAAA AATGA[Sequence List] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 1935 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Nitrosomonas europaea Strain name: IFO14298 Sequence ATGGCAAAAA TAATTGGCAT CGACCTTGGG ACTACCAACT CATGCGTTGC CGTCATGGAA 60 GGCAACAAAC CCAAGGTCAT TGAAAATGCT GAAGGTGCAA GGACGACGCC GTCGATTGTC 120 GCCTATGCGG AAGACAATGA AATTCTGGTA GGGGCATCGG CCAAGCGTCA GGCAGTCACC 180 AATCCGGAAA ATACCCTGTT TGCGATCAAA CGGTTGATTG GCCGTCGTTT CGATGAAGAA 240 GTGGTGCAAA AGGATATCAG TGTAACGCCC TACAAAATCG TGCGTGCCGA TAACAACGAT 300 GCATGGATAG AAGCACGCGG AAGGAAAATC GCACCGCCGG AGGTTTCTGC ACAGGTGCTG 360 ATAAAAATGA AAAAAACGGC TGAAGATTAT CTGGGTGAGC CGGTTACAGA AGCCGTCATC 420 ACCGTTCCAG CGTATTTCAA CGATTCTCAG CGTCAGGCTA CCAAGGATGC AGGCCGTATC 480 GCAGGGCTGG AAGTCAAACG TATCATCAAT GAACCAACTG CTGCCGCACT TGCATTCGGT 540 TTAGATAAGA AGGAAGGTGA TCGCAAAATT GCGGTATACG ATCTGGGCGG AGGTACGTTT 600 GATATTTCGA TCATCGGAGAGATCGAGATCGAGAGATCGAGATCGAGATCGAGATCGAGATCGAGCACGATCGAGCACGAGATCGAGCACGATCGAGCACGATCGAGCAGGAGATCGAGCGAGACGCGCAGA GTG ACACTTTCCT CGGCGGTGAG GATTTCGACT CCAGAGTGAT CGAATATCTG 720 GTGGATGAAT TCAGGAAAGA GAGTGGTATC GATCTGAAAA AAGATATGCT GGCATTGCAA 780 CGGCTCAAAG ATGCAGCGGA AAAAGCCAAA ATCGAGCTGT CATCCAGCCA ACAGACCGAA 840 GTGAATCTAC CCTATATCAC GGCAGATGCA TCAGGCCCAA AACACCTGGC TGTCAAGATC 900 ACCCGTGCCA AGCTGGAGAG TCTGGTCGAA GAACTGATCG AGCGTACTGC AGGCCCTTGC 960 CGGACTGCGC TTAAAGATGC GGGTTTGTCG GTTTCTGACA TCAATGACGT CATTCTGGTC 1020 GGTGGACAGA CCCGTATGCC GAAAGTCCAG GAGAAGGTCA AGGAAATCTT CGGCAAAGAG 1080 CCGCGCAAAG ATGTCAATCC TGACGAGGCA GTTGCCATCG GTGCTGCGAT CCAGGGCGGG 1140 GTGCTGAAAG GAGATGTCAA GGATGTGCTG CTGCTGGATG TGACTCCACT GTCGTTGGGA 1200 ATCGAAACAC TGGGTGGCGT CATGACCAAG TTGATCCAGA AGAACACCAC CATTCCGACC 1260 AAGGCGCAGC AGGTGTTCTC GACAGCGGAC GATAACCAGA CAGCGGTGAC CATTCACGTA 1320 TTGCAGGGTG AGCGGGAAGT GGCCTCCGGC AATAAAAGTC TAGGCCAGTT CAACCTGACC 1380 GATATTCCGT CAGCACCCCG CGGAATGCCT CAGATCGAGG TGATTTTCGA TATCGATGCC 1440 AACGGTATTC TGCATGTTTC AGCTAAAGAC AAGGCAACCG GCAAGGAAAA CAAGATCAAG 1500 ATCCAGGCAA GCTCCGG GCT GTCTGAAGAT GAAATCCAGA AAATGGTAAA AGATGCCGAA 1560 GCGCATGCGG AAGAAGACAA AAAAGCACTG GATCTGGTCA ACAGTCGTAA CCAGTGTGAC 1620 GCCATGATTC ATTCAGTCAG AAAATCACTG GCTGAATACG GTGACAAACT GGAAGGGGAT 1680 GAAAAATCCA GAATCGAGGC AGCGTTGAAA GAGGCCGAGG AAGCACTCAA ATCCGGCGAT 1740 AAACAGACGA TCGATGCCAA AACCCAGGCG TTGACCGAAG CTTCGCATAA ACTGGCTGAG 1800 AAGATGTACG CCCAGGAGCA GGCGCAGGCT GGTCAGCAGG CAGGTGCCGG GACTGCATCC 1860 GATCAGTCTC AGGATAAGCC GGTTGAAGGC GAAGTCGTCG ATGCCGAATT CGAGGAAGTC 1920 AAAGATAAAA AATGA

【0077】配列番号:2 配列の長さ:1935 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Nitrosomonas europaea 株名:IFO14298 配列 ATG GCA AAA ATA ATT GGC ATC GAC CTT GGG ACT ACC AAC TCA TGC GTT 48 Met Ala Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Cys Val 1 5 10 15 GCC GTC ATG GAA GGC AAC AAA CCC AAG GTC ATT GAA AAT GCT GAA GGT 96 Ala Val Met Glu Gly Asn Lys Pro Lys Val Ile Glu Asn Ala Glu Gly 20 25 30 GCA AGG ACG ACG CCG TCG ATT GTC GCC TAT GCG GAA GAC AAT GAA ATT 144 Ala Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val Ala Tyr Ala Glu Asp Asn Glu Ile 35 40 45 CTG GTA GGG GCA TCG GCC AAG CGT CAG GCA GTC ACC AAT CCG GAA AAT 192 Leu Val Gly Ala Ser Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Glu Asn 50 55 60 ACC CTG TTT GCG ATC AAA CGG TTG ATT GGC CGT CGT TTC GAT GAA GAA 240 Thr Leu Phe Ala Ile Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe Asp Glu Glu 65 70 75 80 GTG GTG CAA AAG GAT ATC AGT GTA ACG CCC TAC AAA ATC GTG CGT GCC 288 Val Val Gln Lys Asp Ile Ser Val Thr Pro Tyr Lys Ile Val Arg Ala 85 90 95 GAT AAC AAC GAT GCA TGG ATA GAA GCA CGC GGA AGG AAA ATC GCA CCG 336 Asp Asn Asn Asp Ala Trp Ile Glu Ala Arg Gly Arg Lys Ile Ala Pro 100 105 110 CCG GAG GTT TCT GCA CAG GTG CTG ATA AAA ATG AAA AAA ACG GCT GAA 384 Pro Glu Val Ser Ala Gln Val Leu Ile Lys Met Lys Lys Thr Ala Glu 115 120 125 GAT TAT CTG GGT GAG CCG GTT ACA GAA GCC GTC ATC ACC GTT CCA GCG 432 Asp Thr Leu Gly Glu Pro Val Thr Glu Ala Val Ile Thr Val Pro Ala 130 135 140 TAT TTC AAC GAT TCT CAG CGT CAG GCT ACC AAG GAT GCA GGC CGT ATC 480 Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Arg Ile 145 150 155 160 GCA GGG CTG GAA GTC AAA CGT ATC ATC AAT GAA CCA ACT GCT GCC GCA 528 Ala Gly Leu Glu Val Lys Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala 165 170 175 CTT GCA TTC GGT TTA GAT AAG AAG GAA GGT GAT CGC AAA ATT GCG GTA 576 Leu Ala Phe Gly Leu Asp Lys Lys Glu Gly Asp Arg Lys Ile Ala Val 180 185 190 TAC GAT CTG GGC GGA GGT ACG TTT GAT ATT TCG ATC ATC GAA ATC GCA 624 Thr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile Ser Ile Ile Glu Ile Ala 195 200 205 GAA GTC GAA GGC GAA CAC CAG TTC GAA GTG CTG GCA ACC AAT GGT GAC 672 Glu Val Glu Gly Glu His Gln Phe Glu Val Leu Ala Thr Asn Gly Asp 210 215 220 ACT TTC CTC GGC GGT GAG GAT TTC GAC TCC AGA GTG ATC GAA TAT CTG 720 Thr Phe Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Ser Arg Val Ile Glu Thr Leu 225 230 235 240 GTG GAT GAA TTC AGG AAA GAG AGT GGT ATC GAT CTG AAA AAA GAT ATG 726 Val Asp Glu Phe Arg Lys Glu Ser Gly Ile Asp Leu Lys Lys Asp Met 245 250 255 CTG GCA TTG CAA CGG CTC AAA GAT GCA GCG GAA AAA GCC AAA ATC GAG 816 Leu Ala Leu Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu 260 265 270 CTG TCA TCC AGC CAA CAG ACC GAA GTG AAT CTA CCC TAT ATC ACG GCA 864 Leu Ser Ser Ser Gln Gln Thr Glu Val Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Ala 275 280 285 GAT GCA TCA GGC CCA AAA CAC CTG GCT GTC AAG ATC ACC CGT GCC AAG 912 Asp Ala Ser Gly Pro Lys His Leu Ala Val Lys Ile Thr Arg Ala Lys 290 295 300 CTG GAG AGT CTG GTC GAA GAA CTG ATC GAG CGT ACT GCA GGC CCT TGC 960 Leu Glu Ser Leu Val Glu Glu Leu Ile Glu Arg Thr Ala Gly Pro Cys 305 310 315 320 CGG ACT GCG CTT AAA GAT GCG GGT TTG TCG GTT TCT GAC ATC AAT GAC 1008 Arg Thr Ala Leu Lys Asp Ala Gly Leu Ser Val Ser Asp Ile Asn Asp 325 330 335 GTC ATT CTG GTC GGT GGA CAG ACC CGT ATG CCG AAA GTC CAG GAG AAG 1056 Val Ile Leu Val Gly Gly Gln Thr Arg Met Pro Lys Val Gln Glu Lys 340 345 350 GTC AAG GAA ATC TTC GGC AAA GAG CCG CGC AAA GAT GTC AAT CCT GAC 1104 Val Lys Glu Ile Phe Gly Lys Glu Pro Arg Lys Asp Val Asn Pro Asp 355 360 365 GAG GCA GTT GCC ATC GGT GCT GCG ATC CAG GGC GGG GTG CTG AAA GGA 1152 Glu Ala Val Ala Ile Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Leu Lys Gly 370 375 380 GAT GTC AAG GAT GTG CTG CTG CTG GAT GTG ACT CCA CTG TCG TTG GGA 1200 Asp Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly 385 390 395 400 ATC GAA ACA CTG GGT GGC GTC ATG ACC AAG TTG ATC CAG AAG AAC ACC 1248 Ile Glu Thr Leu Gly Glu Val Met Thr Lys Leu Ile Gln Lys Asn Thr 405 410 415 ACC ATT CCG ACC AAG GCG CAG CAG GTG TTC TCG ACA GCG GAC GAT AAC 1296 Thr Ile Pro Thr Lys Ala Gln Gln Val Phe Ser Thr Ala Asp Asp Asn 420 425 430 CAG ACA GCG GTG ACC ATT CAC GTA TTG CAG GGT GAG CGG GAA GTG GCC 1344 Gln Thr Ala Val Thr Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Glu Val Ala 435 440 445 TCC GGC AAT AAA AGT CTA GGC CAG TTC AAC CTG ACC GAT ATT CCG TCA 1392 Ser Gly Asn Lys Ser Leu Gly Gln Phe Asn Leu Thr Asp Ile Pro Ser 450 455 460 GCA CCC CGC GGA ATG CCT CAG ATC GAG GTG ATT TTC GAT ATC GAT GCC 1440 Ala Pro Arg Gly Met Pro Gln Ile Glu Val Ile Phe Asp Ile Asp Ala 465 470 475 480 AAC GGT ATT CTG CAT GTT TCA GCT AAA GAC AAG GCA ACC GGC AAG GAA 1488 Asn Gly Ile Leu His Val Ser Ala Lys Asp Lys Ala Thr Gly Lys Glu 485 490 495 AAC AAG ATC AAG ATC CAG GCA AGC TCC GGG CTG TCT GAA GAT GAA ATC 1536 Asn Lys Ile Lys Ile Gln Ala Ser Ser Gly Leu Ser Glu Asp Glu Ile 500 505 510 CAG AAA ATG GTA AAA GAT GCC GAA GCG CAT GCG GAA GAA GAC AAA AAA 1584 Gln Lys Met Val Lys Asp Ala Glu Ala His Ala Glu Glu Asp Lys Lys 515 520 525 GCA CTG GAT CTG GTC AAC AGT CGT AAC CAG TGT GAC GCC ATG ATT CAT 1632 Ala Leu Asp Leu Val Asn Ser Arg Asn Gln Cys Asp Ala Met Ile His 530 535 540 TCA GTC AGA AAA TCA CTG GCT GAA TAC GGT GAC AAA CTG GAA GGG GAT 1680 Ser Val Arg Lys Ser Leu Ala Glu Thr Gly Asp Lys Leu Glu Gly Asp 545 550 555 560 GAA AAA TCC AGA ATC GAG GCA GCG TTG AAA GAG GCC GAG GAA GCA CTC 1728 Glu Lys Ser Arg Ile Glu Ala Ala Leu Lys Glu Ala Glu Glu Ala Leu 565 570 575 AAA TCC GGC GAT AAA CAG ACG ATC GAT GCC AAA ACC CAG GCG TTG ACC 1776 Lys Ser Gly Asp Lys Gln Thr Ile Asp Ala Lys Thr Gln Ala Leu Thr 580 585 590 GAA GCT TCG CAT AAA CTG GCT GAG AAG ATG TAC GCC CAG GAG CAG GCG 1824 Glu Ala Ser His Lys Leu Ala Glu Lys Met Thr Ala Gln Glu Gln Ala 595 600 605 CAG GCT GGT CAG CAG GCA GGT GCC GGG ACT GCA TCC GAT CAG TCT CAG 1872 Gln Ala Gly Gln Gln Ala Glu Ala Glu Thr Ala Ser Asp Gln Ser Gln 610 615 620 GAT AAG CCG GTT GAA GGC GAA GTC GTC GAT GCC GAA TTC GAG GAA GTC 1920 Asp Lys Pro Val Glu Gly Glu Val Val Asp Ala Glu Phe Glu Glu Val 625 630 635 640 AAA GAT AAA AAA TGA 1935 Lys Asp Lys LysSEQ ID NO: 2 Sequence length: 1935 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism: Nitrosomonas europaea Strain: IFO14298 Sequence ATG GCA AAA ATA ATT GGC ATC GAC CTT GGG ACT ACC AAC TCA TGC GTT 48 Met Ala Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Cys Val 1 5 10 15 GCC GTC ATG GAA GGC AAC AAA CCC AAG GTC ATT GAA AAT GCT GAA GGT 96 Ala Val Met Glu Gly Asn Lys Pro Lys Val Ile Glu Asn Ala Glu Gly 20 25 30 GCA AGG ACG ACG CCG TCG ATT GTC GCC TAT GCG GAA GAC AAT GAA ATT 144 Ala Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val Ala Tyr Ala Glu Asp Asn Glu Ile 35 40 45 CTG GTA GGG GCA TCG GCC AAG CGT CAG GCA GTC ACC AAT CCG GAA AAT 192 Leu Val Gly Ala Ser Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Glu Asn 50 55 60 ACC CTG TTT GCG ATC AAA CGG TTG ATT GGC CGT CGT TTC GAT GAA GAA 240 Thr Leu Phe Ala Ile Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe Asp Glu Glu 65 70 75 80 GTG GTG CAA AAG GAT ATC AGT GTA ACG CCC TAC AAA ATC GTG CGT GCC 288 Val Val Gln Lys Asp Ile Ser Val Thr Pro Tyr Lys Ile Val Arg Ala 85 90 95 GAT AAC AAC GAT GCA TGG ATA GAA GCA CGC GGA AGG AAA ATC GCA CCG 336 Asp Asn Asn Asp Ala Trp Ile Glu Ala Arg Gly Arg Lys Ile Ala Pro 100 105 110 CCG GAG GTT TCT GCA CAG GTG CTG ATA AAA ATG AAA AAA ACG GCT GAA 384 Pro Glu Val Ser Ala Gln Val Leu Ile Lys Met Lys Lys Thr Ala Glu 115 120 125 GAT TAT CTG GGT GAG CCG GTT ACA GAA GCC GTC ATC ACC GTT CCA GCG 432 Asp Thr Leu Gly Glu Pro Val Thr Glu Ala Val Ile Thr Val Pro Ala 130 135 140 TAT TTC AAC GAT TCT CAG CGT CAG GCT ACC AAG GAT GCA GGC CGT ATC 480 Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Arg Ile 145 150 155 160 GCA GGG CTG GAA GTC AAA CGT ATC ATC AAT GAA CCA ACT GCT GCC GCA 528 Ala Gly Leu Glu Val Lys Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ala 165 170 175 CTT GCA TTC GGT TTA GAT AAG AAG GAA GGT GAT CGC AAA ATT GCG GTA 576 Leu Ala Phe Gly Leu Asp Lys Lys Glu Gly Asp Arg Lys Ile Ala Val 180 185 190 TAC GAT CTG GGC GGA GGT ACG TTT GAT ATT TCG ATC ATC GAA AT C GCA 624 Thr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile Ser Ile Ile Glu Ile Ala 195 200 205 GAA GTC GAA GGC GAA CAC CAG TTC GAA GTG CTG GCA ACC AAT GGT GAC 672 Glu Val Glu Gly Glu His Gln Phe Glu Val Leu Ala Thr Asn Gly Asp 210 215 220 ACT TTC CTC GGC GGT GAG GAT TTC GAC TCC AGA GTG ATC GAA TAT CTG 720 Thr Phe Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Ser Arg Val Ile Glu Thr Leu 225 230 235 240 GTG GAT GAA TTC AGG AAA GAG AGT GGT ATC GAT CTG AAA AAA GAT ATG 726 Val Asp Glu Phe Arg Lys Glu Ser Gly Ile Asp Leu Lys Lys Asp Met 245 250 255 CTG GCA TTG CAA CGG CTC AAA GAT GCA GCG GAA AAA GCC AAA ATC GAG 816 Leu Ala Leu Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu 260 265 270 CTG TCA TCC AGC CAA CAG ACC GAA GTG AAT CTA CCC TAT ATC ACG GCA 864 Leu Ser Ser Ser Gln Gln Thr Glu Val Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Ala 275 280 285 GAT GCA TCA GGC CCA AAA CAC CTG GCT GTC AAG ATC ACC CGT GCC AAG 912 Asp Ala Ser Gly Pro Lys His Leu Ala Val Lys Ile Thr Arg Ala Lys 290 295 300 CTG GAG AGT CTG GTC GAA GAA CTG ATC GAG CGT AC T GCA GGC CCT TGC 960 Leu Glu Ser Leu Val Glu Glu Leu Ile Glu Arg Thr Ala Gly Pro Cys 305 310 315 320 CGG ACT GCG CTT AAA GAT GCG GGT TTG TCG GTT TCT GAC ATC AAT GAC 1008 Arg Thr Ala Leu Lys Asp Ala Gly Leu Ser Val Ser Asp Ile Asn Asp 325 330 335 GTC ATT CTG GTC GGT GGA CAG ACC CGT ATG CCG AAA GTC CAG GAG AAG 1056 Val Ile Leu Val Gly Gly Gln Thr Arg Met Pro Lys Val Gln Glu Lys 340 345 350 GTC AAG GAA ATC TTC GGC AAA GAG CCG CGC AAA GAT GTC AAT CCT GAC 1104 Val Lys Glu Ile Phe Gly Lys Glu Pro Arg Lys Asp Val Asn Pro Asp 355 360 365 GAG GCA GTT GCC ATC GGT GCT GCG ATC CAG GGC GGG GTG CTG AAA GGA 1152 Glu Ala Val Ala Ile Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Leu Lys Gly 370 375 380 GAT GTC AAG GAT GTG CTG CTG CTG GAT GTG ACT CCA CTG TCG TTG GGA 1200 Asp Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly 385 390 395 400 400 ATC GAA ACA CTG GGT GGC GTC ATG ACC AAG TTG ATC CAG AAG AAC ACC 1248 Ile Glu Thr Leu Gly Glu Val Met Thr Lys Leu Ile Gln Lys Asn Thr 405 410 415 ACC ATT CCG ACC AAG GCG CAG CAG GTG TTC TCG ACA GCG GAC GAT AAC 1296 Thr Ile Pro Thr Lys Ala Gln Gln Val Phe Ser Thr Ala Asp Asp Asn 420 425 430 CAG ACA GCG GTG ACC ATT CAC GTA TTG CAG GGT GAG CGG GAA GTG GCC 1344 Gln Thr Ala Val Thr Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Glu Val Ala 435 440 445 TCC GGC AAT AAA AGT CTA GGC CAG TTC AAC CTG ACC GAT ATT CCG TCA 1392 Ser Gly Asn Lys Ser Leu Gly Gln Phe Asn Leu Thr Asp Ile Pro Ser 450 455 460 GCA CCC CGC GGA ATG CCT CAG ATC GAG GTG ATT TTC GAT ATC GAT GCC 1440 Ala Pro Arg Gly Met Pro Gln Ile Glu Val Ile Phe Asp Ile Asp Ala 465 470 475 480 AAC GGT ATT CTG CAT GTT TCA GCT AAA GAC AAG GCA ACC GGC AAG GAA 1488 Asn Gly Ile Leu His Val Ser Ala Lys Asp Lys Ala Thr Gly Lys Glu 485 490 495 AAC AAG ATC AAG ATC CAG GCA AGC TCC GGG CTG TCT GAA GAT GAA ATC 1536 Asn Lys Ile Lys Ile Gln Ala Ser Ser Gly Leu Ser Glu Asp Glu Ile 500 505 510 CAG AAA ATG GTA AAA GAT GCC GAA GCG CAT GCG GAA GAA GAC AAA AAA 1584 Gln Lys Met Val Lys Asp Ala Glu Ala His Ala Glu Glu Asp Lys Lys 515 520 525 GCA C TG GAT CTG GTC AAC AGT CGT AAC CAG TGT GAC GCC ATG ATT CAT 1632 Ala Leu Asp Leu Val Asn Ser Arg Asn Gln Cys Asp Ala Met Ile His 530 535 540 TCA GTC AGA AAA TCA CTG GCT GAA TAC GGT GAC AAA CTG GAA GGG GAT 1680 Ser Val Arg Lys Ser Leu Ala Glu Thr Gly Asp Lys Leu Glu Gly Asp 545 550 555 560 GAA AAA TCC AGA ATC GAG GCA GCG TTG AAA GAG GCC GAG GAA GCA CTC 1728 Glu Lys Ser Arg Ile Glu Ala Ala Leu Lys Glu Ala Glu Glu Ala Leu 565 570 575 AAA TCC GGC GAT AAA CAG ACG ATC GAT GCC AAA ACC CAG GCG TTG ACC 1776 Lys Ser Gly Asp Lys Gln Thr Ile Asp Ala Lys Thr Gln Ala Leu Thr 580 585 590 GAA GCT TCG CAT AAA CTG GCT GAG AAG ATG TAC GCC CAG GAG CAG GCG 1824 Glu Ala Ser His Lys Leu Ala Glu Lys Met Thr Ala Gln Glu Gln Ala 595 600 605 CAG GCT GGT CAG CAG GCA GGT GCC GGG ACT GCA TCC GAT CAG TCT CAG 1872 Gln Ala Gly Gln Gln Ala Glu Ala Glu Thr Ala Ser Asp Gln Ser Gln 610 615 620 GAT AAG CCG GTT GAA GGC GAA GTC GTC GAT GCC GAA TTC GAG GAA GTC 1920 Asp Lys Pro Val Glu Gly Glu Val Val Asp Ala Glu Phe Glu Glu Va l 625 630 635 640 AAA GAT AAA AAA TGA 1935 Lys Asp Lys Lys

【0078】配列番号:3 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成プライマーDNA 配列 CAR GCN ACN AAR GAY GCN GG 20 Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly 1 5SEQ ID NO: 3 Sequence length: 20 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic primer DNA sequence CAR GCN ACN AAR GAY GCN GG 20 Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly 1 5

【0079】配列番号:4 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成プライマーDNA 配列 GCN ACN GCY TCR TCN GGR TT 20 Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala 1 5Sequence number: 4 Sequence length: 20 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic primer DNA sequence GCN ACN GCY TCR TCN GGR TT 20 Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala 1 5

【0080】配列番号:5 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成プライマーDNA 配列 GTTGGTAGTC CCAAGGTCGA TGCC 24SEQ ID NO: 5 Sequence length: 24 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic primer DNA sequence GTTGGTAGTC CCAAGGTCGA TGCC 24

【0081】配列番号:6 配列の長さ:13 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Nitrosomonas europaea 株名:IFO14298 配列の特徴 特徴を表す記号:-35 signal 存在位置:8..12 特徴を決定した方法:E 配列 AAGGGTACTT GAG 13SEQ ID NO: 6 Sequence length: 13 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Nitrosomonas europaea Strain name: IFO14298 Sequence characteristics Symbol representing -35 signal Location: 8..12 Method for determining characteristics: E sequence AAGGGTACTT GAG 13

【0082】配列番号:7 配列の長さ:10 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Nitrosomonas europaea 株名:IFO14298 配列の特徴 特徴を表す記号:-10 signal 存在位置:1..9 特徴を決定した方法:E 配列 CCCCATTTAC 10SEQ ID NO: 7 Sequence length: 10 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Nitrosomonas europaea Strain name: IFO14298 Sequence characteristics Features Symbol representing the symbol: -10 signal Location: 1..9 Method used to determine characteristics: E sequence CCCCATTTAC 10

【0083】配列番号:8 配列の長さ:13 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Escherichia coli 配列の特徴 特徴を表す記号:-35 signal 存在位置:1..13 特徴を決定した方法:S 配列 TTTCCCCCTT GAA 13SEQ ID NO: 8 Sequence length: 13 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Escherichia coli sequence characteristics Characteristic symbols: -35 signal Location: 1..13 Method for determining characteristics: S sequence TTTCCCCCTT GAA 13

【0084】配列番号:9 配列の長さ:10 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Escherichia coli 配列の特徴 特徴を表す記号:-10 signal 存在位置:1..10 特徴を決定した方法:S 配列 CCCCATTTCT 10SEQ ID NO: 9 Sequence length: 10 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Escherichia coli sequence characteristics Characteristic symbols: -10 signal Location: 1..10 Method for determining features: S array CCCCATTTCT 10

【0085】配列番号:10 配列の長さ:13 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Escherichia coli 配列の特徴 特徴を表す記号:-35 signal 存在位置:1..13 特徴を決定した方法:S 配列 TCTCCCCCTT GAT 13SEQ ID NO: 10 Sequence length: 13 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Escherichia coli sequence characteristics Characteristic symbols: -35 signal Location: 1..13 Characteristic determination method: S sequence TCTCCCCCTT GAT 13

【0086】配列番号:11 配列の長さ:10 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Escherichia coli 配列の特徴 特徴を表す記号:-10 signal 存在位置:1..10 特徴を決定した方法:S 配列 CCCCATTTAG 10SEQ ID NO: 11 Sequence length: 10 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Escherichia coli sequence characteristics Characteristic symbols: -10 signal Location: 1..10 Method for determining characteristics: S array CCCCATTTAG 10

【0087】配列番号:12 配列の長さ:13 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Escherichia coli 配列の特徴 特徴を表す記号:-35 signal 存在位置:1..13 特徴を決定した方法:S 配列 TTGGGCAGTT GAA 13SEQ ID NO: 12 Sequence length: 13 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Escherichia coli sequence characteristics Characteristic symbols: -35 signal Location: 1..13 Method for determining characteristics: S sequence TTGGGCAGTT GAA 13

【0088】配列番号:13 配列の長さ:10 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Escherichia coli 配列の特徴 特徴を表す記号:-10 signal 存在位置:1..10 特徴を決定した方法:S 配列 CCCCTATTAC 10SEQ ID NO: 13 Sequence length: 10 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Escherichia coli sequence characteristics Characteristic symbols: -10 signal Location: 1..10 Method for determining characteristics: S array CCCCTATTAC 10

【0089】配列番号:14 配列の長さ:13 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Escherichia coli 配列の特徴 特徴を表す記号:-35 signal 存在位置:1..13 特徴を決定した方法:S 配列 TCTCGGCGTT GAA 13SEQ ID NO: 14 Sequence length: 13 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Escherichia coli sequence characteristics Characteristic symbols: -35 signal Location: 1..13 Method for determining characteristics: S sequence TCTCGGCGTT GAA 13

【0090】配列番号:15 配列の長さ:10 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Escherichia coli 配列の特徴 特徴を表す記号:-10 signal 存在位置:1..10 特徴を決定した方法:S 配列 CCCCATATAC 10SEQ ID NO: 15 Sequence length: 10 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Escherichia coli sequence characteristics Characteristic symbols: -10 signal Location: 1..10 Method for determining characteristics: S array CCCCATATAC 10

【0091】配列番号:16 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成プライマーDNA 配列 GGCTGCAGGA TCCAGCCAGA AAGTGAGGG 29SEQ ID NO: 16 Sequence length: 29 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic primer DNA sequence GGCTGCAGGA TCCAGCCAGA AAGTGAGGG 29

【0092】配列番号:17 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成プライマーDNA 配列 GGCAGCTGCC GTCCCGTCAA GTCAGCG 27SEQ ID NO: 17 Sequence length: 27 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic primer DNA sequence GGCAGCTGCC GTCCCGTCAA GTCAGCG 27

【0093】配列番号:18 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成プライマーDNA 配列 GGATGCATGC GAGAGTAGGG AACTGCC 27SEQ ID NO: 18 Sequence length: 27 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Synthetic primer DNA sequence GGATGCATGC GAGAGTAGGG AACTGCC 27

【0094】配列番号:19 配列の長さ:37 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成プライマーDNA 配列 GGCTGCAGCA TGCGACAGGA AGAGTTTGTA GAAACGC 37SEQ ID NO: 19 Sequence length: 37 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Synthetic primer DNA sequence GGCTGCAGCA TGCGACAGGA AGAGTTTGTA GAAACGC 37

【0095】配列番号:20 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成プライマーDNA 配列 GGCTGCAGCC GTCGTTTTAC AACGTCG 27SEQ ID NO: 20 Sequence length: 27 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic primer DNA sequence GGCTGCAGCC GTCGTTTTAC AACGTCG 27

【0096】配列番号:21 配列の長さ:31 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成プライマーDNA 配列 CCATGCATAC GGGCAGACAT GGCCTGCCCG G 31SEQ ID NO: 21 Sequence length: 31 Sequence type: number of nucleic acid strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Synthetic primer DNA sequence CCATGCATAC GGGCAGACAT GGCCTGCCCG G31

【0097】配列番号:23 配列の長さ:180 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Nitrosomonas europaea 株名:IFO14298 配列の特徴 特徴を表す記号:-35 signal 存在位置:85..89 特徴を決定した方法:E 配列の特徴 特徴を表す記号:-10 signal 存在位置:105..113 特徴を決定した方法:E 配列 CATGCAAAAA GGTTATATGT TGCACGATCG GGTAATTCGT CCCGCTATGG TGACTGTTTC 60 AAAGGCCAAG GGTACTTGAG ATTTTCAGGA GAGCCCCCAT TTACGCTACA GGATAAATTT 120 CAATTCATAA AGGACATACT ATGGCAAAAA TAATTGGCAT CGACCTTGGG ACTACCAACT 180SEQ ID NO: 23 Sequence length: 180 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Nitrosomonas europaea Strain name: IFO14298 Sequence characteristics Features Symbol indicating -35 signal Location: 85..89 Method for determining characteristics: E sequence characteristics Symbol for characteristic: -10 signal Location: 105..113 Method for determining characteristics: E sequence CATGCAAAAA GGTTATATGT TGCACGATCG GGTAATTCGT CCCGCTATGG TGACTGTTTC 60 AAAGGCCAAG GGTACTTGAG ATTTTCAGGA GAGCCCCCAT TTACGCTACA GGATAAATTT 120 CAATTCATAA AGGACATACT ATGGCAAAAA TAATTGGCAT CGACCTTGGG ACTACCAACT 180

【0098】配列番号:24 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 融合DNA 配列 GATAACAACG ATGCAGCCGT CGTTTTA 27SEQ ID NO: 24 Sequence length: 27 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Fusion DNA sequence GATAACAACG ATGCAGCCGT CGTTTTA 27

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図1】実施例で得たpNEK10に含まれる11.5kbのKpnI断
片の制限酵素地図。地図中、細線はpUC19由来のDNA、太
線はN. europaea 由来の外来DNA、白線部分は塩基配列
を決定した2.6kbのEcoRI-HindIII領域を示す。狭い斜線
はDNAプローブの位置を、広い斜線はdnaK遺伝子の位置
を示す。また、矢印とその下の記号は、解析に用いたプ
ライマーDNAの位置と方向および名称を示す。
[1] restriction enzyme map of Kpn I fragment of 11.5kb included in pNEK10 obtained in Example. The map, the thin line DNA derived from pUC19, the thick line is the foreign DNA, the white line portion derived from N. europaea indicates the Eco RI-Hin dIII region of 2.6kb was sequenced. The narrow diagonal lines indicate the position of the DNA probe, and the wide diagonal lines indicate the position of the dnaK gene. The arrows and symbols below them indicate the position, direction, and name of the primer DNA used in the analysis.

【図2】dnaK遺伝子の上流域の塩基配列。FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the upstream region of the dnaK gene.

【図3】28℃または42℃で培養したN. europaea
ら精製したRNAのポリアクリルアミドゲル電気泳動のイ
メージ図。左側のレーンは、K377プライマーを用いてdn
aK上流域をシークエンシング(sequencing)した時のラ
ダー(ladder)を示す。
FIG. 3 is an image diagram of polyacrylamide gel electrophoresis of RNA purified from N. europaea cultured at 28 ° C. or 42 ° C. The left lane is dn using K377 primer.
Shows the ladder when the aK upstream region was sequenced.

【図4】実施例1におけるpKLAC728の構築過程を示す概
略図。
FIG. 4 is a schematic diagram showing the construction process of pKLAC728 in Example 1.

【図5】実施例1におけるpKLAC728の構築過程を示す概
略図。
FIG. 5 is a schematic diagram showing the construction process of pKLAC728 in Example 1.

【図6】実施例1で用いたdnaK遺伝子のプロモーター領
域およびDnaK蛋白質N-末端領域をコードするDNA断片の
構築過程を示す概略図。
FIG. 6 is a schematic diagram showing the process of constructing a DNA fragment encoding the promoter region of the dnaK gene and the N-terminal region of the DnaK protein used in Example 1.

【図7】N. europaea (pKLAC728)株の熱ショック応答。
図中、白丸が30℃で、黒丸が37℃で培養を続けた細胞の
β-ガラクトシダーゼ活性。
FIG. 7. Heat shock response of N. europaea (pKLAC728) strain.
In the figure, open circles indicate the β-galactosidase activity of cells cultured at 30 ° C. and solid circles at 37 ° C.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12R 1:01) (C12N 1/21 C12R 1:01) ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12R 1:01) (C12N 1/21 C12R 1:01)

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 ニトロソモナス(Nitrosomonas)属細菌
由来の熱ショックプロモーター。
1. A heat shock promoter derived from a bacterium of the genus Nitrosomonas .
【請求項2】 −35配列がCTTGA、−10配列がCCCCA
TTTAであることを特徴とする請求項1記載の熱ショック
プロモーター。
2. The -35 sequence is CTTGA, and the -10 sequence is CCCCA.
The heat shock promoter according to claim 1, which is TTTA.
【請求項3】 請求項1または2記載の熱ショックプロ
モーターを含むDNA断片と、このDNA断片の下流に
位置し、形質発現量を容易に検出できる蛋白質をコード
する構造遺伝子を含むDNA断片との融合遺伝子からな
ることを特徴とするストレス感知遺伝子。
3. A DNA fragment containing the heat shock promoter according to claim 1 or 2, and a DNA fragment containing a structural gene encoding a protein which is located downstream of the DNA fragment and whose expression level can be easily detected. A stress sensing gene comprising a fusion gene.
【請求項4】 請求項3記載のストレス感知遺伝子を細
胞内に保持することを特徴とするアンモニア酸化細菌組
換え体。
4. A recombinant ammonia-oxidizing bacterium comprising the stress-sensing gene according to claim 3 in a cell.
【請求項5】 請求項4記載の組換え体をストレス条件
下で培養した後、請求項3記載のストレス感知遺伝子の
形質発現量を測定することを特徴とするアンモニア酸化
細菌のストレスの測定方法。
5. A method for measuring the stress of ammonia-oxidizing bacteria, comprising culturing the recombinant according to claim 4 under stress conditions, and then measuring the expression level of the stress-sensing gene according to claim 3. .
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000034465A3 (en) * 1998-12-08 2000-10-26 Stressgen Biotechnologies Corp HEAT SHOCK GENES AND PROTEINS FROM NEISSERIA MENINGITIDIS, CANDIDA GLABRATA AND $i(ASPERGILLUS FUMIGATUS)
JP2003079365A (en) * 2001-09-07 2003-03-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Method for detecting environmentally harmful chemical substance in high sensitivity

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