JPH0989891A - Method and kit for measuring antigen or igm antibody - Google Patents
Method and kit for measuring antigen or igm antibodyInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】この発明は、補体を利用した
抗原またはIgM抗体の測定法およびそのためのキット
に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for assaying an antigen or an IgM antibody using complement and a kit therefor.
【0002】[0002]
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】抗原
抗体反応を利用した抗原または抗体蛋白の定量法は近年
めざましく発展した。これには沈降反応、凝集反応、溶
解反応、補体結合反応などを用いるものおよびビーズや
ラテックス粒子を用いた固相法などがある。多くのもの
は標識を用いており、標識の種類によってラジオイムノ
アッセイ、エンザイムイムノアッセイ、発光イムノアッ
セイなどと称されている。しかし、これらの測定は試薬
が不安定であったり、人為的操作を多く必要としたり、
また標識によっては高価な専用分析機の必要を生じる場
合があり、若干の問題を残している。PRIOR ART AND PROBLEM TO BE SOLVED BY THE INVENTION Recently, a method for quantifying an antigen or antibody protein utilizing an antigen-antibody reaction has been remarkably developed. This includes those that use precipitation reactions, agglutination reactions, lysis reactions, complement fixation reactions, etc., and solid-phase methods that use beads or latex particles. Many of them use a label, which is called a radioimmunoassay, an enzyme immunoassay, a luminescence immunoassay, or the like depending on the type of the label. However, these measurements are unstable reagents, require a lot of human intervention,
In addition, depending on the label, an expensive dedicated analyzer may be required, leaving some problems.
【0003】上記の抗原または抗体の測定法に補体と抗
原抗体複合体の反応を利用する測定法としては、赤血球
に結合させた抗体に抗原と補体を反応させて溶血反応を
起させる方法が既に提案されている(特公平2−30
664号および特公平2−30665号)。しかし、
この方法は、使用する赤血球が不安定であるという欠点
を有する。また、酵素を封入したリポソームに抗原を感
作させ、これに抗体と補体を反応させてリポソームを破
壊させ、溶出した酵素をマーカー物質として用いる方法
(特開平5−264551号)がある。さらに、酵素
に代えてマーカー物質として蛍光色素を封入したリポソ
ームを用いる方法(特開平5−60758号)もあ
る。As a measuring method utilizing the reaction of complement and antigen-antibody complex in the above-mentioned measuring method of antigen or antibody, a method in which an antibody bound to erythrocyte is reacted with antigen and complement to cause a hemolytic reaction Has already been proposed (Tokuhei 2-30
664 and Japanese Patent Publication No. 2-30665). But,
This method has the disadvantage that the red blood cells used are unstable. There is also a method (Japanese Patent Laid-Open No. 5-264551) in which a liposome encapsulating an enzyme is sensitized with an antigen, an antibody and a complement are reacted with the liposome to destroy the liposome, and the eluted enzyme is used as a marker substance. Further, there is also a method (JP-A-5-60758) in which a liposome encapsulating a fluorescent dye as a marker substance is used instead of the enzyme.
【0004】これらの従来の方法はリポソームにマーカ
ー物質を封入しなければならないこと、および補体C1
〜C9の活性連鎖反応を用いており、補体としてC1〜
C9を用意しなければならない。そこで、この発明者は
蛋白の新規な定量法を開発するにあたり、補体の溶血反
応や溶解作用ではなく、補体と抗原抗体複合体が反応し
たとき補体が活性型に移行することによって生ずる酵素
活性を利用することを考え、開発を続けてきた。These conventional methods require that a marker substance be encapsulated in liposomes, and complement C1.
~ C9 active chain reaction is used, and as a complement, C1 ~
You have to prepare C9. Therefore, the present inventor, when developing a novel method for quantifying a protein, is caused not by the hemolytic reaction or lytic action of complement, but by the transfer of complement to an active form when the complement and the antigen-antibody complex react. We have continued to develop, considering the use of enzyme activity.
【0005】この測定方法の原理を概説すると次の通り
である。補体系活性化の機構には、古典経路と第二経路
があることが知られている。古典経路は、主として免疫
複合体により活性化される。補体にはC1〜C9の成分
が知られており、これらがC1、C4、C2、C3、C
5、C6、C7、C8、C9の順に活性化されて最終的
に形成されたC5b−C9複合体の作用により溶血また
は溶菌のような細胞溶解反応を起すに至る。この古典経
路を利用したのが上記の従来技術〜である。The principle of this measuring method is as follows. It is known that the mechanism of complement system activation includes the classical pathway and the alternative pathway. The classical pathway is activated primarily by immune complexes. The components C1 to C9 are known to be complement, and these are C1, C4, C2, C3 and C.
5, C6, C7, C8, C9 are activated in this order, and the finally formed C5b-C9 complex acts to cause a cytolytic reaction such as hemolysis or lysis. The above-mentioned prior arts ~ utilize this classical route.
【0006】本発明の測定方法はまず第一に補体成分C
1〜C9のうちの第1成分であるC1のみを用いるもの
であり、抗原または抗体の量に応じて生成した抗原抗体
複合体にC1が直接結合する反応を定量に利用すること
を考えた。In the measuring method of the present invention, first of all, the complement component C
Only C1, which is the first component of 1 to C9, is used, and it was considered to utilize quantitatively the reaction in which C1 directly binds to the antigen-antibody complex formed according to the amount of the antigen or antibody.
【0007】これをさらに詳しく説明すると、第一の成
分であるC1は、Ca++を介してClq、C1r、C1
sの各構成因子が複合体となった分子量700,000の高分
子であるが、抗原抗体反応により生成した抗原抗体複合
体の抗体のFc部分にClqが直接結合することによ
り、C1rの活性化を始動させる因子となる。なお、そ
の際、Clqは2個の免疫複合体の抗体のFc部分に直
接結合する必要がある。To explain this in more detail, the first component, C1, is Clq, C1r, C1 via Ca ++.
Although each component of s is a high molecular weight polymer with a molecular weight of 700,000, Clq directly binds to the Fc part of the antibody of the antigen-antibody complex generated by the antigen-antibody reaction, and thereby activates C1r. It will be a factor that causes. At that time, Clq needs to directly bind to the Fc portion of the antibody of the two immune complexes.
【0008】C1rとC1sはチモーゲン型のプロテア
ーゼ前駆体で、Clqにより活性化された活性型C1r
はC1sの活性化因子として作用し、活性型C1s及び
活性型C1rは合成基質を水解し発色させる。活性型の
C1rとC1sは、セリンプロテアーゼに属する酵素で
C1−エステラーゼに特異性の高い合成基質(例えばC
H3OCO-Lys(ε-Cbo)-Gly-Arg-pNA.AcOH)を
用いて測定することができる。C1r and C1s are zymogen-type protease precursors, which are activated C1r activated by Clq.
Acts as an activator of C1s, and activated C1s and activated C1r hydrolyze a synthetic substrate to develop a color. Active forms of C1r and C1s are enzymes belonging to serine proteases and are synthetic substrates with high specificity for C1-esterase (eg C
It can be measured using H 3 OCO-Lys (ε-Cbo) -Gly-Arg-pNA.AcOH).
【0009】本発明者は、既にC1qが2個のFcに同
時に結合し得るように固相に所定の間隔で結合させたI
gG抗体を用いることによって感度のよい抗原または抗
体を定量する方法を開示した(特開平4−241791
号)。すなわち、この方法はIgM抗体ではなく、Ig
G抗体の補体活性化作用を利用するものであり、既述の
ように、Clqが活性化因子となるためには、2個の免
疫複合体のFc部分に直接結合する必要がある。従っ
て、Clqが2個の免疫複合体のIgGに直接結合し得
る位置にIgGを最適間隔で固定するために固相を必須
とするものであった。そこで、この発明者らは固相を用
いることの煩雑さを回避することを目的として、さらに
鋭意研究を行った。The present inventor has already bound I to the solid phase at a predetermined interval so that C1q can bind to two Fc simultaneously.
A method for quantifying a sensitive antigen or antibody by using a gG antibody has been disclosed (JP-A-4-241791).
issue). That is, this method uses IgM instead of IgM antibodies.
It utilizes the complement activating action of G antibody, and as described above, in order for Clq to become an activator, it is necessary to directly bind to the Fc part of two immune complexes. Therefore, a solid phase was essential to immobilize IgG at optimal intervals at positions where Clq could directly bind to IgG of two immune complexes. Therefore, the present inventors have conducted further studies for the purpose of avoiding the complexity of using a solid phase.
【0010】[0010]
【課題を解決するための手段】本発明はIgG抗体に代
えてIgM抗体またはIgM抗体類似物質を用いること
により、IgGを所定の間隔で固相に結合させる必要を
なくし得るとの知見を得て完成されたものである。すな
わち、5量体であるIgMでは、Clqが2個の免疫複
合体に結合するのに都合良い位置関係にあるものと思わ
れる。従って、IgMまたはIgM抗体類似物質を用い
ることによって固相を用いることなく、全く液相のみの
均一系で測定できるという利点がある。Means for Solving the Problems In the present invention, it was found that it is possible to eliminate the need to bind IgG to a solid phase at a predetermined interval by using an IgM antibody or an IgM antibody-like substance instead of an IgG antibody. It has been completed. That is, in the pentamer IgM, Clq seems to have a convenient positional relationship for binding to two immune complexes. Therefore, the use of IgM or IgM antibody-analogous substance has the advantage that the measurement can be performed in a homogeneous system having only a liquid phase without using a solid phase.
【0011】すなわち、この発明は、(1)試料中の抗
原またはIgM抗体に、それぞれIgM抗体もしくはI
gM抗体類似物質、または抗原を反応させて抗原抗体複
合体を生成させ、これに非活性型補体成分C1を反応さ
せて活性型C1を生成させ、活性型C1を例えば活性化
C1がその酵素作用により加水分解を受けて測定し得る
シグナルを生ずるシグナル発生性基質と反応させてシグ
ナルを発生させ、シグナルの強度を測定して抗原または
IgM抗体の量と関係づけることを液相のみの均一系で
行うことを特徴とする、抗原またはIgM抗体の測定法
である。That is, the present invention relates to (1) an IgM antibody or an IgM antibody or an IgM antibody in a sample, respectively.
A gM antibody analog or an antigen is reacted to form an antigen-antibody complex, which is reacted with an inactive complement component C1 to form an active form C1. A homogeneous system in a liquid phase in which a signal is generated by reacting with a signal-generating substrate which is hydrolyzed by an action to produce a measurable signal, and the intensity of the signal is measured and correlated with the amount of an antigen or an IgM antibody. The method for measuring an antigen or an IgM antibody, which is characterized in that
【0012】さらに、(2)非活性補体成分C1がプロ
テアーゼインヒビターを伴っていてもよく、また、
(3)(イ)IgM抗体もしくはIgM抗体類似物質、ま
たは抗原、(ロ)非活性型補体成分C1またはそれを含む
組成物、および(ハ)活性型C1酵素活性測定用基質を含
む、抗原またはIgM抗体測定用キットを提供するもの
である。Further, (2) the inactive complement component C1 may be accompanied by a protease inhibitor, and
(3) An antigen containing (a) an IgM antibody or an IgM antibody analog, or an antigen, (b) a non-active complement component C1 or a composition containing the same, and (c) a substrate for measuring an active C1 enzyme activity. Alternatively, a kit for IgM antibody measurement is provided.
【0013】上記「試料」としては、測定すべき抗原も
しくはIgM抗体を含む疑いがあるか、または測定者が
測定の対象として意図するあらゆる対象物が含まれる。
試料は通常溶液、乳液またはけんだく液のような液体で
あり、化学的に調製されたものであるか、器物を洗浄し
て得た洗液であるか、または生物(例えば脊椎動物、好
ましくは哺乳類、特にひと)から由来する液体であり得
る。試料の一例は臨床試料であり、これには血液(血し
ょう、血清)、リンパ液、髄液、組織液、唾液、涙液、
胃液、汗、尿等を含む。The above-mentioned "sample" includes any object suspected of containing the antigen or IgM antibody to be measured or intended by the measurer as the object of measurement.
The sample is usually a liquid, such as a solution, emulsion or suspension, which is either chemically prepared, is a wash obtained by washing a container, or is a living organism (e.g. vertebrate, preferably It may be a liquid derived from a mammal, especially a human. An example of a sample is a clinical sample, which includes blood (plasma, serum), lymph, spinal fluid, tissue fluid, saliva, tear fluid,
Including gastric juice, sweat, urine, etc.
【0014】測定の対象となる「抗原」としては、抗原
決定基を有するか、またはIgM抗体を誘導し得るあら
ゆる化合物および混合物が含まれる。抗原の例は生体成
分(例えば腫瘍関連抗原、ウイルス、ホルモンなど)、
医薬品(例えば抗てんかん剤、強心配糖体、気管支拡張
剤、抗生物質など)、アナフィラキシー誘導物質(例え
ば花粉、害虫など)である。The "antigen" to be measured includes all compounds and mixtures having an antigenic determinant or capable of inducing an IgM antibody. Examples of antigens are biological components (eg tumor-associated antigens, viruses, hormones, etc.),
Pharmaceuticals (eg, antiepileptic agents, cardiac glycosides, bronchodilators, antibiotics, etc.) and anaphylaxis inducers (eg, pollen, pests, etc.).
【0015】抗原と結合し得る測定に用いられる「Ig
M抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル
抗体が含まれる。ポリクローナル抗体は、例えば抗原を
抗体産生動物(例えば脊椎動物、好ましくは哺乳類)ま
たはその抗体産生系に注入または接触させて産生させる
ことができる。モノクローナル抗体は、例えば感作した
抗体産生動物から得た抗体産生細胞またはそれと不死化
細胞との融合細胞を培養して得られる。産生したポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体からIgM抗体
を分離して得る。IgM抗体類似物質とは、生物学的に
産生させて得られるIgM抗体ではなく、人工的に合成
されるIgM抗体に類似する構造または/および免疫学
的に類似する特徴を有する物質をいう。[Ig used for measurement capable of binding to antigen]
"M antibody" includes a polyclonal antibody and a monoclonal antibody. Polyclonal antibodies can be produced, for example, by injecting or contacting the antigen with an antibody-producing animal (eg, vertebrate, preferably mammal) or its antibody-producing system. The monoclonal antibody can be obtained, for example, by culturing antibody-producing cells obtained from a sensitized antibody-producing animal or fused cells of the antibody-producing cells and immortalized cells. The IgM antibody is obtained by separating it from the produced polyclonal antibody or monoclonal antibody. The IgM antibody-like substance refers to a substance having a structure or / and immunologically similar characteristics to an artificially synthesized IgM antibody, not an IgM antibody obtained by being biologically produced.
【0016】測定の対象となる「IgM抗体」として
は、IgM型の抗体を測定することに臨床的意義を見い
出すもの、例えば、トキソプラズマIgM抗体、麻疹I
gM抗体、風疹IgM抗体、クラミジア・トラコマティ
スIgM抗体、寒冷凝集素IgM抗体などを挙げること
ができる。The "IgM antibody" to be measured is one that finds clinical significance in measuring IgM type antibodies, for example, Toxoplasma IgM antibody, measles I.
Examples thereof include gM antibody, rubella IgM antibody, Chlamydia trachomatis IgM antibody, and cold agglutinin IgM antibody.
【0017】上記のIgM抗体に結合し得、測定に用い
られる「抗原」としては、トキソプラズマ、麻疹ウイル
ス、風疹ウイルス、クラウジミア・トラコマティス、寒
冷凝集素などが用いられる。As the "antigen" which can bind to the above IgM antibody and is used for the measurement, Toxoplasma, measles virus, rubella virus, Claudia trachomatis, cold agglutinin and the like are used.
【0018】「抗原抗体複合体」は、抗原と抗体が反応
した結果生ずるこれらの結合体である。なお、IgM抗
体と同時にIgG抗体も抗原抗体複合体を生成するが、
非活性補体C1が結合し得る位置に2個のIgG免疫複
合体が都合良く存在することは起こり得ても、非常にま
れであると考えられるので無視し得る。An "antigen-antibody complex" is a conjugate of an antigen and an antibody, which is the result of a reaction between them. It should be noted that, at the same time as the IgM antibody, the IgG antibody also forms an antigen-antibody complex
The convenient presence of two IgG immune complexes at the position where non-active complement C1 may bind is possible, but negligible as it is considered very rare.
【0019】「非活性型補体成分C1」は、それ自体と
しては未だ酵素活性を獲得していない成分C1またはそ
の混合物である。ここで、混合物には、無傷の補体その
ものおよびC1を含有するフラクションが含まれる。非
活性型Clは通常用いられる方法、例えば、ヒト又は動
物の血清、クエン酸添加またはEDTA添加血漿(好ま
しくは、新鮮なものが望ましい)などを出発原料とし
て、通常の補体C1の精製法である真性グロブリン沈殿
法、ゲル濾過法によるか、IgG−Sepharoseによるア
フィニティークロマトグラフィー後ゲル濾過して精製す
る。The "inactive complement component C1" is the component C1 or a mixture thereof which has not yet acquired enzyme activity. Here, the mixture includes intact complement itself and the fraction containing C1. The inactive Cl can be prepared by a conventional method such as human or animal serum, citrate-supplemented or EDTA-supplemented plasma (preferably fresh) is used as a starting material, and a conventional method for purifying complement C1. Purification is carried out by a certain globulin precipitation method or gel filtration method, or by affinity chromatography with IgG-Sepharose followed by gel filtration.
【0020】「活性型C1」は、C1が2個の抗原抗体
複合体の抗体のFc部分に結合した結果生ずる例えばコ
ンホメーション的変化により酵素活性を獲得した状態で
ある。"Active C1" is a state in which enzymatic activity is acquired by, for example, a conformational change resulting from the binding of C1 to the Fc portion of the antibody of the two antigen-antibody complexes.
【0021】「シグナル発生性基質」とは、例えば特定
の波長の波動を放射または吸収することにより検出可能
となる原子団および酵素反応により変化し得る部分を有
する分子であって、酵素作用により原子団が検出可能な
形に変化し得る物質である。上記のような原子団の例は
o−もしくはp−ニトロまたは2,4−ジニトロフェニ
ルである。基質の例はZ-Gly-Arg-SBu-i、Z-Ala-
Arg-SBu-i、Z-Gln-Leu-Gly-Arg-SBzl、Z-M
et-Gln-Leu-Gly-Arg-SBzl、Z-Met-Gln-Leu-
Gly-Arg-Ala-DBHA、Z-Met-Lys-Gly-Arg-A
la-DBHAなどである。酵素活性に対応する適当な基
質は市販されている。このような基質には、例えばCH
3OCO-Lys(ε-Cbo)-Gly-Arg-pNA.AcOHが含
まれる。The "signal-generating substrate" is a molecule having an atomic group that can be detected by, for example, radiating or absorbing a wave having a specific wavelength and a portion that can be changed by an enzymatic reaction, and is an atom by an enzymatic action. It is a substance that can transform into a detectable form. Examples of such atomic groups are o- or p-nitro or 2,4-dinitrophenyl. Examples of substrates are Z-Gly-Arg-SBu-i, Z-Ala-
Arg-SBu-i, Z-Gln-Leu-Gly-Arg-SBzl, Z-M
et-Gln-Leu-Gly-Arg-SBzl, Z-Met-Gln-Leu-
Gly-Arg-Ala-DBHA, Z-Met-Lys-Gly-Arg-A
For example, la-DBHA. Suitable substrates for enzymatic activity are commercially available. Such substrates include, for example, CH
3 OCO-Lys (ε-Cbo) -Gly-Arg-pNA.AcOH.
【0022】「シグナルの強度を測定して抗原または抗
体の量と関係づける」とは、例えば既知量の抗原または
抗体を用いて得たシグナルの強度から検量線を作り、試
料から得たシグナルの強度と比較する等の方法により、
シグナルの強度から抗原または抗体の量を計算または作
図することである。"Measuring the intensity of a signal and correlating it with the amount of an antigen or antibody" means, for example, making a calibration curve from the intensity of a signal obtained using a known amount of an antigen or antibody, and measuring the signal obtained from a sample. By the method of comparing with strength,
To calculate or plot the amount of antigen or antibody from the intensity of the signal.
【0023】本発明の測定系には、通常用いられる緩衝
液、安定剤、賦活剤、界面活性剤、防腐剤、蛋白分解酵
素阻止剤(プロテアーゼインヒビター)を添加すること
ができる。The buffer system, stabilizer, activator, surfactant, preservative and proteolytic enzyme inhibitor (protease inhibitor) usually used can be added to the assay system of the present invention.
【0024】緩衝液としては、トリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタンやリン酸・ホウ酸やその塩、ベロナー
ル緩衝液、グッド緩衝液などの一般的な緩衝液が挙げら
れる。安定剤には、グリセロール・ラクトース・スクロ
ース・ソルビトール・エチレングリコールなどのポリオ
ール類、アルブミン・ゼラチンなどの蛋白類、グルタチ
オン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなど
SH基保護剤、EDTAなどのキレート剤などが含まれ
る。賦活剤の例としては、ポリエチレングリコール(P
EG)、ポリビニルピロリドン(PVP)などが挙げられ
る。界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)
のような陰イオン性界面活性剤、ドデシルトリメチルア
ンモニウムクロリド(DTAC)のような陽イオン界面活
性剤、N−ドデシル−ベタインなどの両性界面活性剤、
ポリオキシエチレンアルキルエーテルなどの非イオン性
界面活性剤、コール酸ナトリウムのようなステロイド系
界面活性剤などであるが、これらに限定されない。防腐
剤には、窒化ナトリウム、ホウ酸、フェノールや各種抗
生物質などが含まれる。Examples of the buffer solution include common buffer solutions such as tris (hydroxymethyl) aminomethane, phosphoric acid / boric acid and salts thereof, veronal buffer solution and Good's buffer solution. Stabilizers include glycerol, lactose, sucrose, sorbitol, ethylene glycol, and other polyols, albumin, gelatin, and other proteins, glutathione, mercaptoethanol, dithiothreitol, and other SH group-protecting agents, and EDTA and other chelating agents. Be done. Examples of the activator include polyethylene glycol (P
EG), polyvinylpyrrolidone (PVP) and the like. Sodium dodecyl sulfate (SDS) is used as a surfactant.
Anionic surfactants such as, cationic surfactants such as dodecyltrimethylammonium chloride (DTAC), amphoteric surfactants such as N-dodecyl-betaine,
Non-ionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ethers, steroidal surfactants such as sodium cholate, etc., but are not limited thereto. Preservatives include sodium nitride, boric acid, phenol and various antibiotics.
【0025】蛋白分解酵素阻止剤には、セリンプロテア
ーゼインヒビターや金属プロテアーゼインヒビターやシ
ステインプロテアーゼインヒビターなどの一般的プロテ
アーゼインヒビターが挙げられ、特に大豆トリプシンイ
ンヒビターやε−アミノカプロン酸やセルピンやジイソ
プロピルフルホロリン酸や4−(2−aminoethyl)−benz
enesulfonyl fluorideなどのセリンプロテアーゼインヒ
ビター・ファミリーが好ましい。プロテアーゼインヒビ
ターは非活性補体成分C1に混在させておくのが好まし
い。Examples of the protease inhibitor include general protease inhibitors such as serine protease inhibitors, metalloprotease inhibitors and cysteine protease inhibitors, particularly soybean trypsin inhibitor, ε-aminocaproic acid, serpin and diisopropylflurophosphoric acid. 4- (2-aminoethyl) -benz
The serine protease inhibitor family such as enesulfonyl fluoride is preferred. The protease inhibitor is preferably mixed with the inactive complement component C1.
【0026】好ましい実施方法の一例を示すと例えば次
の通りである。抗原またはIgM抗体を含有するかまた
は含有する疑のある試料をIgM抗体もしくはIgM抗
体類似物質または抗原に加えて抗原抗体複合体を形成さ
せる。これにプロテアーゼインヒビターを伴うC1溶解
液を加え、さらにシグナル発生性合成(人工)基質液を
加える。ニトロフェニル基の吸収ピーク405nmで吸
光度を測定する。測定値から、計算式により、または検
量線との比較により、試料中の抗原またはIgM抗体量
を知る。An example of a preferred method of implementation is as follows. A sample containing or suspected of containing the antigen or IgM antibody is added to the IgM antibody or IgM antibody analog or antigen to form an antigen-antibody complex. To this, C1 solution with protease inhibitor is added, and further a signal generating synthetic (artificial) substrate solution is added. The absorbance is measured at the absorption peak of nitrophenyl group at 405 nm. From the measured value, the amount of antigen or IgM antibody in the sample is known by a calculation formula or by comparison with a calibration curve.
【0027】より具体的には、抗原測定の方法として、
測定対象である抗原を含有するかまたは含有する疑いの
ある抗原被検体と測定対象である抗原に特異性を示すI
gM抗体もしくはIgM抗体類似物質を0.01μg/dl〜
100mg/dl、好ましくは1μg/dl〜5mg/dl、より好ま
しくは100μg/dl〜500μg/dlを含む緩衝液(pH
4〜10、好ましくはpH6〜9、より好ましくはpH
7〜9、反応温度は4〜40℃、好ましくは25〜37
℃、より好ましくは37℃)中で一定時間反応させ、補
体C1溶液を0.1μg/dl〜200mg/dl、好ましくは1
0μg/dl〜20mg/dl、より好ましくは1mg/dl〜5mg/d
lを加えて更に一定時間反応させる(pH4〜10、好
ましくはpH6〜9、より好ましくはpH7〜9、反応
温度は4〜40℃、好ましくは25〜37℃、より好ま
しくは37℃)。その後、合成基質溶液を、0.01〜
100μmol、好ましくは0.1〜10μmol、より好ま
しくは0.5〜5μmolを入れ直ちに一定加温されたキッ
ベットで吸光度の変化を時間経過で測定する。単位時間
当たりの吸光度変化でもって既知検量曲線から抗原被検
体の濃度を算出する。More specifically, as an antigen measuring method,
An antigen that contains or is suspected of containing an antigen to be measured, and I showing specificity to the antigen to be measured
gM antibody or IgM antibody analogue is added in an amount of 0.01 μg / dl-
Buffer containing 100 mg / dl, preferably 1 μg / dl-5 mg / dl, more preferably 100 μg / dl-500 μg / dl (pH
4-10, preferably pH 6-9, more preferably pH
7-9, the reaction temperature is 4-40 ° C, preferably 25-37.
C., more preferably 37.degree. C.) for a certain period of time, and the complement C1 solution is added at 0.1 .mu.g / dl to 200 mg / dl, preferably 1
0 μg / dl to 20 mg / dl, more preferably 1 mg / dl to 5 mg / d
l is added and the reaction is continued for a certain period of time (pH 4 to 10, preferably pH 6 to 9, more preferably pH 7 to 9, reaction temperature is 4 to 40 ° C., preferably 25 to 37 ° C., more preferably 37 ° C.). Then, the synthetic substrate solution is added from 0.01 to
100 μmol, preferably 0.1 to 10 μmol, more preferably 0.5 to 5 μmol was added and immediately the change in absorbance was measured with time using a constant-heated kibbet. The concentration of the antigen analyte is calculated from the known calibration curve based on the change in absorbance per unit time.
【0028】IgM抗体の測定の方法として、測定対象
であるIgM抗体を含有するかまたは含有する疑いのあ
るIgM抗体被検体と、抗体に特異的な抗原0.01μg
/dl〜100mg/dl、好ましくは1μg/dl〜5mg/dl、よ
り好ましくは100μg/dl〜500μg/dlを含む緩衝液
(pH4〜10、好ましくはpH6〜9、より好ましく
はpH7〜9、反応温度は4〜40℃、好ましくは25
〜37℃、より好ましくは37℃)中で一定時間反応さ
せ、補体C1溶液を0.1μg/dl〜200mg/dl、好まし
くは、10μg/dl〜20mg/dl、より好ましくは1mg/dl
〜5mg/dlを加えて、更に一定時間反応させる(pH4
〜10、好ましくはpH6〜9、より好ましくはpH7
〜9、反応温度は4〜40℃、好ましくは25〜37
℃、より好ましくは37℃)。その後、合成基質溶液
を、0.01〜100μmol、好ましくは0.1〜10μm
ol、より好ましくは0.5〜5μmolを入れ直ちに一定加
温されたキッベットで吸光度の変化を時間経過で測定す
る。単位時間当たりの吸光度変化でもって既知検量曲線
からIgM抗体被検体の濃度を算出する。As a method for measuring the IgM antibody, an IgM antibody sample containing or suspected of containing the IgM antibody to be measured, and an antibody-specific antigen of 0.01 μg
/ dl to 100 mg / dl, preferably 1 μg / dl to 5 mg / dl, more preferably 100 μg / dl to 500 μg / dl (pH 4 to 10, preferably pH 6 to 9, more preferably pH 7 to 9, reaction) The temperature is 4 to 40 ° C., preferably 25
To 37 ° C., more preferably 37 ° C.) for a certain period of time, and the complement C1 solution is added to 0.1 μg / dl to 200 mg / dl, preferably 10 μg / dl to 20 mg / dl, more preferably 1 mg / dl.
Add ~ 5mg / dl and react for a certain time (pH 4
-10, preferably pH 6-9, more preferably pH 7
~ 9, the reaction temperature is 4 ~ 40 ℃, preferably 25 ~ 37
C, more preferably 37 C). Then, the synthetic substrate solution is added in an amount of 0.01 to 100 μmol, preferably 0.1 to 10 μm.
ol, more preferably 0.5 to 5 μmol, is immediately added, and the change in absorbance is immediately measured with a kibbet which is heated at a constant temperature. The concentration of the IgM antibody test substance is calculated from the known calibration curve by the change in absorbance per unit time.
【0029】上記のような方法を例えば臨床検査として
実施するには、使用する器具および試薬をキットにして
おくのが便利である。このようなキットには、例えば抗
原、IgM抗体もしくはIgM抗体類似物質、非活性型
C1、シグナル発生性合成基質、緩衝液および使用法を
記載した指示書を含ませることができる。In order to carry out the above method as a clinical test, it is convenient to prepare a kit of the instruments and reagents to be used. Such a kit can include, for example, an antigen, an IgM antibody or an IgM antibody analog, an inactive C1, a signal-generating synthetic substrate, a buffer, and instructions describing the method of use.
【0030】[0030]
【発明の効果】上記のようなこの発明の方法は、標識を
使用しないで、操作および使用器具、試薬の面から種々
の利点が得られる。また、赤血球のような不安定なもの
を使用しないで操作が容易である。さらに、固相固定化
およびBF分離を全く必要とすることなく、均一系(ホ
モジニアス)で行うため、操作が短時間で実施でき、種
々の抗原またはIgM抗体に利用できるという利点を有
する。INDUSTRIAL APPLICABILITY The method of the present invention as described above can obtain various advantages in terms of operation, instruments used and reagents without using a label. Further, the operation is easy without using unstable things such as red blood cells. Furthermore, since solid phase immobilization and BF separation are not required at all and the procedure is carried out in a homogeneous system (homogeneous system), the procedure can be carried out in a short time, and there is an advantage that it can be used for various antigens or IgM antibodies.
【0031】[0031]
【実施例】以下、この発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。 実施例1 抗原抗体複合体の材料としてヒトC反応性タンパク質
(CRP:C−reactiveprotein)標準血清(ヤトロ
ン)と抗ヒトCRPウサギIgM抗体(自家製)を用い
た。非活性型Clは通常用いられる方法により、ひと血
清から精製した。シグナル発生性基質は、Clエステラ
ーゼ測定用の合成基質CH3OCO−Lys−(ε−Cb
o)−Gly−Arg−pNA.AcOH(ペンタファーム社:
スイス)を使用した。生じた抗原抗体複合体にC1溶液
を加え、更に基質液を加えた。発色の吸収ピーク405
nmで吸光度を測定して抗体量を求めた。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. Example 1 Human C-reactive protein (CRP) standard serum (Yatron) and anti-human CRP rabbit IgM antibody (homemade) were used as materials for the antigen-antibody complex. Inactive Cl was purified from human serum by a commonly used method. The signal-generating substrate is a synthetic substrate CH 3 OCO-Lys- (ε-Cb for measuring Cl esterase.
o) -Gly-Arg-pNA.AcOH (Pentafarm:
Switzerland) was used. The C1 solution was added to the resulting antigen-antibody complex, and the substrate solution was further added. Color development absorption peak 405
The amount of antibody was determined by measuring the absorbance at nm.
【0032】材料 (a)50mMトリス塩酸緩衝液(250mM NaCl、5
mM CaCl2を含むpH8.4) (b)抗ヒトCRPウサギIgM抗体((a)緩衝液にて蛋白
量40μg/ml) (c)非活性型Cl(200μg/ml) (d)合成基質(3μg/ml) (e)被検体CRP標準血清Materials (a) 50 mM Tris-HCl buffer (250 mM NaCl, 5
(pH 8.4 containing mM CaCl 2 ) (b) Anti-human CRP rabbit IgM antibody ((a) Protein amount 40 μg / ml in buffer) (c) Inactive Cl (200 μg / ml) (d) Synthetic substrate ( 3 μg / ml) (e) Test sample CRP standard serum
【0033】方法 (1)試薬(a)を200μlを試験管分注する。 (2)抗体液25μlを入れる。 (3)被検体を25μl入れる。 (4)Cl溶液を50μl入れる。 (5)37℃に5分間インキュベーションする。 (6)合成基質溶液を100μl入れ、直ちに37℃に加温
されたキュベットで405nmの吸光度を時間経過で測
定する。 (7)単位時間当たりの吸光度変化でもって検量線から蛋
白量を算出する。 (8)次の計算式で抗体濃度の吸光度が求められる。 測定吸光度=(ST−SI)−(RBT−RBI) ST :反応時間(T)における被検体の吸光度 SI :最終試薬添加後の被検体の吸光度(I<T) RBT :反応時間(T)における試薬ブランクの吸光度 RBI :最終試薬添加後の試薬ブランクの吸光度(I<
T)Method (1) Dispense 200 μl of the reagent (a) into a test tube. (2) Add 25 μl of antibody solution. (3) Add 25 μl of test sample. (4) Add 50 μl of Cl solution. (5) Incubate at 37 ° C for 5 minutes. (6) Add 100 μl of the synthetic substrate solution, and immediately measure the absorbance at 405 nm in a cuvette heated to 37 ° C. over time. (7) Calculate the amount of protein from the calibration curve based on the change in absorbance per unit time. (8) Absorbance at antibody concentration is calculated by the following formula. Measuring absorbance = (S T -S I) - (RB T -RB I) S T: reaction time the absorbance of the subject in (T) S I: Final reagent analyte absorbance after the addition (I <T) RB T : Absorbance of reagent blank at reaction time (T) RB I : absorbance of reagent blank after final reagent addition (I <
T)
【0034】結果 実施例1で得られた結果を図1および2に示す。 CRP9mg/dlを連続希釈した各CRP濃度における
反応曲線は図1のとおりとなった。 各CRP濃度の反応曲線340秒から400秒まで
(1分間)の吸光度の変化を濃度の検量線としてグラフ
化すると図2となった。 ここに用意した被検体(10/10=CRP9mg/
dl)でシグモイド曲線を示すグラフ(図2)は、8/
10までの測定を可能であることを示した。 このシグモイド曲線を標準曲線として未知濃度の試料
を定量することができる。最近の分析機では、数種類の
濃度を測定して多点検量線を作成しその濃度を自動計算
するものがあるのでそれらに応用することができる。
又、今回のCRPの実施例での蛋白濃度や測定時間は一
例であって、測定したい対象の試料によって最適な蛋白
濃度や測定時間を設定することになる。Results The results obtained in Example 1 are shown in Figures 1 and 2. The reaction curve at each CRP concentration obtained by serially diluting CRP 9 mg / dl is shown in FIG. FIG. 2 shows the change in absorbance from 340 seconds to 400 seconds (1 minute) of the reaction curve of each CRP concentration as a concentration calibration curve. The specimen prepared here (10/10 = CRP 9 mg /
The graph (FIG. 2) showing the sigmoid curve in dl) is 8 /
It was shown that up to 10 measurements were possible. A sample of unknown concentration can be quantified using this sigmoid curve as a standard curve. Some recent analyzers measure several kinds of concentrations, create a multi-inspection curve, and automatically calculate the concentrations, so they can be applied to them.
The protein concentration and measurement time in this example of CRP are examples, and the optimum protein concentration and measurement time are set according to the sample to be measured.
【図1】 CRP9mg/dlを希釈した各濃度の反応曲線
を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing a reaction curve of each concentration obtained by diluting CRP 9 mg / dl.
【図2】 CRPの検量線を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing a calibration curve of CRP.
Claims (3)
M抗体類似物質を反応させるか、または試料中のIgM
抗体に抗原を反応させて抗原抗体複合体を生成させ、こ
れに非活性型補体成分C1を反応させて活性型C1を生
成させ、活性型C1をシグナル発生性基質と反応させて
シグナルを発生させ、シグナルの強度を測定して抗原ま
たはIgM抗体の量と関係づけることを液相のみの均一
系で行うことを特徴とする、抗原またはIgM抗体の測
定法。1. An IgM antibody or Ig as an antigen in a sample
IgM in sample reacted with M antibody analog
An antigen is reacted with an antibody to form an antigen-antibody complex, an inactive complement component C1 is reacted with this to generate active C1, and the active C1 is reacted with a signal-generating substrate to generate a signal. And measuring the signal intensity and correlating it with the amount of the antigen or IgM antibody in a homogeneous system only in the liquid phase.
インヒビターを伴うものである、請求項1記載の測定
法。2. The assay method according to claim 1, wherein the inactive complement component C1 is associated with a protease inhibitor.
特異的なIgM抗体またはIgM抗体類似物質または抗
原、(ロ)非活性型補体成分C1またはそれを含む組成
物、および(ハ)活性型C1酵素活性測定用基質を含
む、液相のみの均一系における抗原またはIgM抗体測
定用キット。(A) The antigen or IgM antibody in the sample,
A homogeneous liquid phase containing a specific IgM antibody or IgM antibody-like substance or antigen, (b) non-active complement component C1 or a composition containing the same, and (c) a substrate for measuring active C1 enzyme activity Kit for measuring an antigen or IgM antibody in a system.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24427495A JPH0989891A (en) | 1995-09-22 | 1995-09-22 | Method and kit for measuring antigen or igm antibody |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24427495A JPH0989891A (en) | 1995-09-22 | 1995-09-22 | Method and kit for measuring antigen or igm antibody |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0989891A true JPH0989891A (en) | 1997-04-04 |
Family
ID=17116317
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP24427495A Pending JPH0989891A (en) | 1995-09-22 | 1995-09-22 | Method and kit for measuring antigen or igm antibody |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JPH0989891A (en) |
-
1995
- 1995-09-22 JP JP24427495A patent/JPH0989891A/en active Pending
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