JPH0984586A - コンニャクモザイクウイルスのゲノムおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コンニャクモザイクウイルスゲノムのヌクレ
オチド配列および該ウイルス外被タンパク質のアミノ酸
配列を提供し、さらには、該ウイルスの外被タンパク質
を発現させて抗コンニャクモザイクウイルス活性を有す
る有用植物を作成する。 【解決手段】 コンニャクモザイクウイルスのゲノムま
たはそのｃＤＮＡに特異的なヌクレオチド配列を有する
ポリヌクレオチド、これを有する組換えベクターおよび
細胞、ならびにコンニャクモザイクウイルスによる病害
防除のための該ポリヌクレオチドの使用方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コンニャクモザイ
クウイルスのゲノムに関する。さらに詳しくは、コンニ
ャクモザイクウイルスゲノムの３’末端領域のヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は
また、上記ウイルス病害を防除するための上記ポリヌク
レオチドの使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物病原ウイルスであるコンニャクモザ
イクウイルス（以下、ＫＭＶという）は、長径がおよそ
８００nmの紐状の形態を有しているウイルスである。Ｋ
ＭＶは、ほとんどのコンニャク種に対して感染性を有
し、アブラムシにより非永続的に伝搬されることが知ら
れている（下山ら(1992)、日本植物病理学会報、58:706
-712および713-718）。このため、ＫＭＶ感染によるコ
ンニャクの被害は甚大であり、収量および品質の深刻な
低下をもたらしてきた。それにもかかわらず、ＫＭＶの
感染を防止する効果的な手段は、従来、まったく存在し
ない。これは、ＫＭＶの遺伝子構造およびヌクレオチド
配列がこれまで全く明らかにされなかったことが一因で
ある。

【０００３】近年、分子生物学的手法によって、植物の
ウイルス病害を防除する方法が、多数報告されている。
この方法に関する好ましいアプローチの一つが、植物ウ
イルスがコードする外被タンパク質を植物組織で発現さ
せることを目的としたトランスジェニック植物の作成で
ある（Beachy, R. N.ら(1990)、Annu. Rev. Phytopatho
l.、28:451-474、Grumet, R.(1990)、HortScience、25:
508-513、Nelson, R.S.ら(1990)「ウイルス感染に対す
る外被タンパク質を介した防除」、「GeneticEngineeri
ng of Crop Plants」(Lycett, G. W.およびGrierson,
D.編、Butterworths刊、英国）の13-24頁）。上記アプ
ローチは、種々のポティウイルスの防除に関しても適用
され、一定の成果を収めている（Stark, D. M.およびBe
achy, R.N.(1989)、Bio/Technology、7:1257-1262、Lin
g, K.ら(1990)、Bio/Technology、9:752-758、Namba,
S.ら(1992)、Phytopathology、82:940-946）。例えば、
ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）の外被タ
ンパク質をコードする遺伝子の全長あるいはそのＮ末端
領域欠失タイプを導入したトランスジェニックメロン
は、ＺＹＭＶの感染を抑制することが知られている（Fa
ng, G.およびGrumet,R.(1993)、Mol. Plant-Microbe In
teract.、6:358-367）。

【０００４】植物のウイルス病害を防除する他の好まし
いアプローチは、病原ウイルスに感染したか否かの診断
である。単離されたウイルスゲノムに特異的なヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドは、病原ウイルスの
遺伝子診断法におけるプローブとして使用され得る。こ
の診断法が適用されれば、被験植物が当該ウイルスに感
染しているか否かを早期に知ることができ、ウイルス病
害の発生防止に寄与する（Wetzel, Tら(1991)、Journal
of Virological Methods、33:355-365）。しかしなが
ら、これらアプローチは、ＫＭＶの遺伝子構造およびヌ
クレオチド配列が全く明らかにされていないため、コン
ニャク等におけるＫＭＶ病害を防除する手段として、従
来全く適用されていない。従って、ＫＭＶのゲノム構造
およびそのヌクレオチド配列の解明が要望されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題を
解決するものであり、その目的とするところは、ＫＭＶ
ゲノムの遺伝子構造およびヌクレオチド配列情報に基づ
いて作成される、ＫＭＶに特異的なヌクレオチド配列を
含むポリヌクレオチドを提供することであり、さらに
は、ＫＭＶによる病害を防除するために、該ポリヌクレ
オチドを使用する方法およびそれに関する手段を提供す
ることである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＫＭＶゲノム
またはそのｃＤＮＡに特異的なヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチド
という）を提供するものである。さらに詳しくは、配列
番号１によって示される、ＫＭＶゲノムの３’末端領域
のヌクレオチド配列およびそれにコードされるアミノ酸
配列に関する。本発明はまた、ＫＭＶゲノムにコードさ
れる外被タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチドに関する。本発明
の実施に好ましいＫＭＶ外被タンパク質のアミノ酸配列
は、配列番号２に記載の配列である。

【０００７】さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチ
ドを有する組換えベクターに関する。本明細書において
「ベクター」とは、外来のポリヌクレオチドを、宿主細
胞中に伝達する媒体をいう。好ましいベクターはプラス
ミドである。植物細胞および／または細菌に伝達するも
のが特に好ましい。上記ベクターのタイプおよび使用さ
れる各調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変更
し得ることは、当該分野における周知事項である。

【０００８】また、本発明は、本発明のポリヌクレオチ
ドを導入された細胞に関する。本発明の実施に好ましい
細胞は植物細胞である。組織培養法および細胞またはカ
ルスからの再分化技術が確立している高等植物の細胞が
特に好ましい。

【０００９】さらにまた、本発明は、ＫＭＶの病害を防
除するため、本発明のポリヌクレオチドを使用する方法
に関する。本方法の好ましい一態様は、本発明のポリヌ
クレオチドを植物細胞に導入し、該植物細胞を形質転換
する工程を包含する方法、ならびに、本発明のポリヌク
レオチドとＫＭＶゲノムまたはそのｃＤＮＡとをハイブ
リダイズする工程を包含する方法である。

【００１０】以下、本発明について詳細に説明する。

【００１１】本発明者は、血清学的判定法である寒天ゲ
ル内拡散法およびウエスタンブロッティング法等によっ
て、ＫＭＶが、植物ウイルスの分類上、ポティウイルス
（potyvirus）と呼ばれるＲＮＡウイルス群のメンバー
であることを解明した。本発明者は、ＫＭＶのゲノムが
３'末端にポリＡ配列を伴う一本鎖の正鎖ＲＮＡからな
ることを想到し、ＫＭＶ感染植物からＫＭＶを調製し、
さらにゲノムＲＮＡを単離し、得られたゲノムＲＮＡよ
りｃＤＮＡクローンを合成し、そのヌクレオチド配列を
解析することにより、本発明を完成するに至った。

【００１２】本発明者によって単離されたＫＭＶゲノム
由来のｃＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を、配
列番号１に示す。このｃＤＮＡフラグメントがＫＭＶゲ
ノムの３’末端領域（非翻訳領域を含む）に対応するも
のであることは、該ｃＤＮＡ配列と他の既知のポティウ
イルスゲノムのヌクレオチド配列との比較によって、確
認されている。

【００１３】本明細書において「ＫＭＶ」とは、以下に
示す特徴： .３’末端にポリＡ配列を含む一本鎖の正鎖ＲＮＡゲ
ノムを有する； .ウイルス粒子は、長径がおよそ８００nmである紐状
の形状を有する； .３’末端非翻訳領域のヌクレオチドの相同性が、配
列番号１によって示される配列に対して少なくとも９０
％の相同性を有する、または、外被タンパク質のアミノ
酸の相同性が配列番号２によって示される配列に対して
少なくとも９０％の相同性を有する：および .コンニャクに感染する；によって、明確に定義され
ている。

【００１４】本発明のポリヌクレオチドは、ＫＭＶのゲ
ノムまたはそのｃＤＮＡに特異的なヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドであって、本発明者らによって
開示された配列番号１に示されるヌクレオチド配列の一
部または全長を含有するポリヌクレオチドである。本発
明のポリヌクレオチドは、分子生物学的および分子育種
学的アプローチによる、ＫＭＶ病害の防除に好ましく使
用され得る。本発明のポリヌクレオチドは、ＫＭＶ感染
の有無を診断するためのハイブリダイゼーションアッセ
イ等の遺伝子診断法において、プライマーおよび／また
はプローブとして特に好適に使用され得る。

【００１５】本明細書において「ポリヌクレオチド」と
は、ヌクレオチドの重合体を意味するものであって、特
定の鎖長に限定されない。また、本明細書において「Ｋ
ＭＶのゲノムまたはそのｃＤＮＡに特異的なヌクレオチ
ド配列」とは、ＫＭＶのゲノムまたはそれに対応するｃ
ＤＮＡ配列に認められる配列であって、その他の配列公
知のポティウイルス群のウイルスには存在しない配列を
いう。この配列の独自性は、例えば、配列番号１によっ
て示されるヌクレオチド配列と、「ＤＤＢＪ」、「ＥＭ
ＢＬ」、「ＧｅｎＢａｎｋ」等のヌクレオチド配列デー
タベースに収録されているポティウイルスのヌクレオチ
ド配列との比較によって決定し得る。従って、本発明の
ポリヌクレオチドは、本明細書において開示されたＫＭ
Ｖの配列情報に基づけば、通常の遺伝子工学的手法によ
り容易に作成され得る。化学的ＤＮＡ合成法の適用も、
本発明のポリヌクレオチドの作製に好ましい。

【００１６】本明細書の配列番号１の第８７３位から第
１７１５位までのヌクレオチド配列は、ＫＭＶの外被タ
ンパク質の全アミノ酸配列をコードする領域である。得
られたＫＭＶ外被タンパク質の全アミノ酸配列を配列番
号２に示す。本発明のポリヌクレオチドの好ましい一態
様は、配列番号第８７３位から第１７１５位までのヌク
レオチドを含有するポリヌクレオチドである。上記ポリ
ヌクレオチドは、ＫＭＶ外被タンパク質を産生するトラ
ンスジェニック植物作成のために、特に好適に使用され
得る。配列番号２に記載のＫＭＶ外被タンパク質のアミ
ノ酸配列をコードするポリヌクレオチドもまた、上記目
的のために好適に使用され得る。

【００１７】配列番号１の第３位から第８７２位までの
ヌクレオチド配列は、ＫＭＶの核封入体タンパク質（Ｎ
Ｉｂ）のＣ末端部分アミノ酸配列をコードしている。当
該アミノ酸配列を、配列番号３に示す。本明細書に開示
された上記ＮＩｂの一部分を植物に導入することによ
り、ＫＭＶに対する抵抗性が付与された植物が得られ得
る（Audy, Pら(1994)、Molecular Plant-Microbe Inter
actions、7(1)：15-22）。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明は、以下のように実施され
得る。本発明の実施は、特に記載がない限り、分子生物
学、生化学、遺伝学、遺伝子工学、植物育種学、および
植物病理学等の分野の従来技法を用いて実施し得る。

【００１９】（１）ｃＤＮＡライブラリーの調製 ＫＭＶに感染したコンニャク苗の葉を凍結し、0.1Mクエ
ン酸緩衝液、クロロホルムおよび四塩化炭素を用いて磨
砕する。次いで、分画遠心分離および平衡密度勾配遠心
分離により、ＫＭＶウイルス粒子を調製する（下山ら(1
992)、日本植物病理学会報、58:706-712）。得られたウ
イルス粒子にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および
プロテアーゼＫ処理を施し、フェノール抽出およびエタ
ノール沈澱をくり返すことによって、ウイルスＲＮＡを
調製する。次いで、オリゴｄＴプライマーを用いて、上
記ウイルスＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する。合
成されたｃＤＮＡは、適当な制限酵素で切断後、あるい
は、ＤＮＡポリメラーゼにより両末端を平滑にした後、
クローニングベクター（例えばｐＵＣ系プラスミド）に
クローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。

【００２０】（２）ＫＭＶゲノム由来のｃＤＮＡフラグ
メントの単離および配列決定 精製したＫＭＶゲノムＲＮＡをプローブとして用いたハ
イブリダイゼーションアッセイによって、上記（１）で
得られたｃＤＮＡライブラリーからＫＭＶ陽性ｃＤＮＡ
クローンを単離する。得られた陽性クローンよりｃＤＮ
Ａフラグメントを取得し、種々の欠失ｃＤＮＡサブクロ
ーンを作製する。次いで、当該分野で公知のヌクレオチ
ド配列解析法（Sangerらのジデオキシ法等）または市販
されている自動シーケンサー（例えば、ファルマシア社
製A.L.F. DNA SeaquencerII）により、各ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を決定する。

【００２１】（３）本発明のポリヌクレオチドの作製 本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法
により、上記単離されたｃＤＮＡフラグメントの全長す
なわちＫＭＶゲノムの３’末端領域を含むヌクレオチド
配列、またはその一部のヌクレオチド配列を含有するよ
うに構築され得る。本明細書の配列番号１に示されるヌ
クレオチド配列のみからなるポリヌクレオチドを上記ｃ
ＤＮＡクローンから切り出して使用してもよい。さら
に、上記ｃＤＮＡフラグメントまたはＫＭＶゲノムＲＮ
Ａを鋳型として、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）（Sa
ikiら(1988)、Science、230:1350-1354）を実施し、増
幅された領域のヌクレオチド配列を使用することも容易
である。本願に開示のヌクレオチド配列を基に、公知の
ＤＮＡ合成法（例えば、ホスホアミダイト法）により化
学的に合成されたＤＮＡフラグメントもまた、本発明の
ポリヌクレオチドとして好適に用いられ得る。ＫＭＶの
外被タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）をコード
するヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの作
製において、上記合成法は、特に好ましい。

【００２２】得られた本発明のポリヌクレオチドはその
ままもしくは適切なリンカーを連結させて以下に示す組
換えベクターの構築に利用される。

【００２３】（４）組換えベクターの構築 ＫＭＶ外被タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドと、該アミノ酸
配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメ
ント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネー
ター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシス
エレメントを包含する）とからなる外来タンパク質発現
用遺伝子構築物を有する組換えベクターの構築において
は、当該分野でよく理解されている種々の制限酵素によ
るポリヌクレオチド切断技法（restriction）およびポ
リヌクレオチド断片連結技法（ligation）が用いられ
る。ベクターおよびその構築に使用される調節エレメン
トの種類は、宿主細胞のタイプに依存している。

【００２４】植物細胞を宿主とした場合の上記ベクター
の構築例を以下に説明する。

【００２５】プロモーターとして、カリフラワーモザイ
クウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ノパリ
ン合成酵素（ＮＯＳ）プロモーター等が一般的に使用さ
れ得るがこれらに限定されない。本発明の実施において
は、高発現プロモーターの使用が特に好ましい。本発明
の実施に用いられ得るターミネーターは、特に限定され
ない。ＣａＭＶ３５ＳあるいはＮＯＳのターミネーター
が好適に使用され得る。

【００２６】ＫＭＶ外被タンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチドはそれ単独で、あ
るいは、該タンパク質との融合タンパク質を作製するの
に好適な他のタンパク質（例えば、ＧＵＳ）をコードす
るヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと連結し
て、上記各調節エレメントと宿主細胞内で作動可能なよ
うに連結して作製され得る。さらに上記組換えベクター
は、目的の上記遺伝子構築物に加え、選択可能なマーカ
ー遺伝子を含有し得る。選択可能なマーカー遺伝子は上
記発現カセットを有する宿主細胞のみを選択するのに使
用される。一般に使用される選択可能なマーカー遺伝子
は、カナマイシン耐性を付与するネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼII（ＮＴＰII）であるが、これに限定
されない。ハイグロマイシン耐性を付与するハイグロマ
イシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)もまた好適に使
用され得る。

【００２７】作製された上記遺伝子構築物を、アグロバ
クテリウム属細菌を介して植物に導入し得るプラスミド
（例えばｐＢＩ系プラスミド(クロンテック社)）、あるいは、
ｐＵＣ系プラスミドに導入することによって、本発明の
組換えベクターが構築され得る。

【００２８】（５）宿主細胞の形質転換 使用する宿主細胞に依存して、その細胞に適する標準的
技法を用いて、上記ベクターによる宿主細胞の形質転換
を行い得る。

【００２９】原核生物細胞の場合、Cohen, S. N.ら(197
2)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、69、2110頁）により
報告された塩化カルシウム処理法が用いられ得る。電気
穿孔法（エレクトロポレーション）は、原核生物細胞の
他、植物細胞および動物細胞のいずれにも適用できる。

【００３０】ある種の高等植物細胞においては、アグロ
バクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tum
efaciens）を介する方法（Shaw, C. H.ら(1983)、Gen
e、23:315）が広く用いられ得る。この方法は、まず構
築したベクター（ｐＢＩ系プラスミド等）を、エレクト
ロポレーション等によってアグロバクテリウム・チュメ
ファシエンスに導入し、次いで形質転換された該細菌
を、リーフディスク法（Horsch, R. B.ら(1985)、Scien
ce、227:1229-1231）等の周知の手法により、宿主植物
細胞に導入する。

【００３１】（６）形質転換細胞および再分化した形質
転換植物体におけるＫＭＶ外被タンパク質の産生 上記形質転換された植物細胞を、植物種に対応した公知
の再分化法（例えば、タバコの場合、Horsch, R. B.ら
(1985)、Science、227:1229-1231）により再分化させ、
確立した形質転換植物体において産生させる。

【００３２】得られた形質転換植物体は、発現したＫＭ
Ｖ外被タンパク質によって、抗ＫＭＶ活性を有し得る。

【００３３】（７）ＫＭＶの遺伝子診断法 ＫＭＶ感染が疑われる植物体（コンニャク等）から常法
により、ＲＮＡを抽出、精製する。得られたＲＮＡ試料
を鋳型とし、本発明のポリヌクレオチドを標識プローブ
として通常のハイブリダイゼーションアッセイを実施
し、該ＲＮＡ試料中におけるＫＭＶゲノムＲＮＡの存在
の有無を診断し得る。あるいは、本発明のポリヌクレオ
チドをプライマーとして用いたＰＣＲ（Saikiら(198
8)、Science、230:1350-1354）により、被験植物中のＫ
ＭＶゲノムＲＮＡの存在の有無を診断し得る。

【００３４】以下の実施例において、本発明をさらに詳
細に説明するが、これらはなんら本発明を限定するもの
ではない。

【００３５】

【実施例】実施例１ （コンニャク苗からのｃＤＮＡライブラリーの作製）Ｋ
ＭＶ感染コンニャク苗の葉を採取し、-70℃の超低温槽
で凍結保存した。凍結した感染葉を、0.1Ｍクエン酸緩
衝液、クロロホルムおよび四塩化炭素を添加して磨砕し
た。次に、この磨砕物から分画遠心分離および平衡密度
勾配遠心分離（条件記入）によりＫＭＶ粒子を調製し
た。得られたウイルス粒子をドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）およびプロテアーゼＫ処理後、フェノール抽
出およびエタノール沈澱をくり返し、ウイルスＲＮＡを
調製した。

【００３６】ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア社
製）、およびオリゴｄＴプライマーを常法（Gubler, U.
およびHoffman, B. J.(1983)、Gene、25:263-269）に従
って使用し、上記ウイルスＲＮＡ試料２μｇからｃＤＮ
Ａを合成した。得られたｃＤＮＡフラグメントは、Ｔ4
ＤＮＡポリメラーゼにより、両末端を平滑化し、プラス
ミドｐＵＣ18のＨｉｎｃIIサイトに導入した。得られた
構築プラスミドを大腸菌ＨＢ１０１に導入して、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製した。

【００３７】実施例２ （ＫＭＶゲノム由来ｃＤＮＡのクローニング）上記ウイ
ルスＲＮＡ試料をワサビペルオキシダーゼ（アマシャム社）
で標識し、実施例１で調製したｃＤＮＡライブラリーか
らＫＭＶゲノム由来のｃＤＮＡフラグメントをクローニ
ングするためのプローブとした。このプローブを用いた
通常のサザンハイブリダイゼーション法により、上記ｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。

【００３８】陽性シグナルが検出されたクローンの中で
最大のｃＤＮＡを含むクローンをＫＭ２７と命名した。
ＫＭ２７は約1.9ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを有して
いた。

【００３９】実施例３ （ｃＤＮＡクローンの配列決定およびアミノ酸配列の解
析）上記ｃＤＮＡクローンＫＭ２７を、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩおよびＰｓｔＩで処理し、解離したｃＤＮＡ部分を
プラスミドpBluescriptIISK+（Stratagene社製）のＢａ
ｍＨＩ・ＰｓｔＩサイトに導入した。こうして得られた
クローンＫＭＢ２について、エキソヌクレアーゼIIIお
よびＳ１ヌクレアーゼ処理による通常のデリーション操
作（Henikoff, S.(1984)、Gene、28:351）をErase-a-ba
se(登録商標)Systemキット(Promega社製)を用いて行ない、
ＫＭ２７由来の種々の欠失ｃＤＮＡサブクローンを作製
した。得られた一連の欠失ｃＤＮＡサブクローンを図１
に示す。図１中の各矢印は、各サブクローンの配列を決
定した領域を示している。

【００４０】これら一連のサブクローンを用いて、市販
のＤＮＡシーケンサー(ファルマシア社製、A.L.F. DNA Seaque
ncerII）を製造者の提供した使用説明書に準じて使用し
て、ＫＭ２７にクローンされたｃＤＮＡフラグメントの
配列を決定した（配列番号１）。その結果、ＫＭ２７に
クローンされたｃＤＮＡフラグメントは、1,902塩基か
らなり、その3'末端に存在するポリＡ配列（69塩基）を
含む非翻訳領域（187塩基）の上流は、一つのＯＲＦ
（オープンリーディングフレーム）を形成していること
が明らかとなった。

【００４１】得られたヌクレオチド配列と既知のポティ
ウイルスゲノムとの比較から、上記ｃＤＮＡは、ＫＭＶ
の外被タンパク質および核封入体タンパク質（ＮＩｂ）
の一部をコードするものであった。図２に上記ｃＤＮＡ
の遺伝子構造を示す。上記ｃＤＮＡにコードされたＫＭ
Ｖ外被タンパク質の全アミノ酸配列（281アミノ酸残
基）およびＮＩｂの部分アミノ酸配列（290アミノ酸残
基）は、各々、配列番号２および３に示す。

【００４２】次に、公知のデータベース「ＤＤＢＪ」か
らの検索データを用いて、上記ＫＭＶ外被タンパク質お
よび部分ＮＩｂのアミノ酸配列と既知のポティウイルス
の外被タンパク質およびＮＩｂのアミノ酸配列との間の
相同性を比較した。結果を、各々、表１、表２（外被タ
ンパク質）および表３（ＮＩｂ）に示す。

【００４３】

【表１】

【００４４】

【表２】

【００４５】

【表３】

【００４６】ＫＭＶの外被タンパク質と他のポティウイ
ルスの外被タンパク質との相同性は、いずれのポティウ
イルス種についても６０％をこえるものではなく、ＫＭ
Ｖが既知のポティウイルスとは異なるウイルスであるこ
とを裏付けた。さらに、ＮＩｂアミノ酸配列に関して
も、ＫＭＶとＴｕＭＶ（カフ゛モサ゛イクウイルス）との間に明確な
差異が認められた（表３）。

【００４７】実施例４ （ＫＭＶ外被タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む組換えプラスミドの構築）ＫＭＶ外被タンパク質
をコードする領域の上流にＸｂａＩサイトおよびＡＴＧ
開始コドンを有する以下の合成オリゴヌクレオチドプラ
イマー（5'末端用）： KMVCP-5: 5' GGCCTCTAGAAACATGAGTGGGAAAGAAGAGAAAGACG
3'（配列番号４） およびＫＭＶ外被タンパク質をコードする領域内にある
ＢｇｌIIサイト（配列番号１の1148位〜1153位）の下流
のヌクレオチド配列に相補的な以下の合成オリゴヌクレ
オチドプライマー（3'末端用）： KMVCP-3: 5' GCGAATTGATTTTGTGTTGCTC 3'（配列番号
５） を用いた通常のＰＣＲ法により、上記単離されたｃＤＮ
Ａクローンを鋳型にして、ＫＭＶ外被タンパク質遺伝子
の5'末端側部分を増幅した。得られたフラグメントを、
さらにＸｂａＩ−ＢｇｌIIで切断後、同様にＸｂａＩ−
ＢｇｌIIで切断した上記ＫＭＢ２の開裂部位に挿入し
た。得られたプラスミドをＥｃｏＲＶで切断後、平滑末
端化した。さらにＸｂａＩ処理により、外被タンパク質
遺伝子部分を切り出し、植物発現用ベクターｐＢＩ１２
１（クロンテック社）からＧＵＳコーディング領域（XbaI-Sac
I断片）を除いたものに導入した。

【００４８】実施例５ （組換えプラスミドのタバコ細胞への導入） （１）アク゛ロハ゛クテリウム・チュメファシエンスの形質転換アク゛ロハ゛クテリウム・チュメファシエンス LBA4404株（クロンテック社）を２５０
μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと５０μｇ／ｍｌのリ
ファンピシンを含むＬＢ培地中、２８℃で培養した。Na
gelら(1990)（Microbiol. Lett.、67:325）の方法に従
って、細胞懸濁液を調製し、実施例４で構築したプラス
ミドベクターをエレクトロポレーションにより、上記菌
株に導入した。

【００４９】（２）ＫＭＶ外被タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドのタバコ細胞への導入 上記（１）で得られた形質転換アク゛ロハ゛クテリウム・チュメファシエンスL
BA4404株とタバコ（N.tabacum 'Samsun'）葉片とを共存
培養したリーフディスク法（Horsch, R. B.ら(1985)、S
cience、227:1229-1231）により、タバコ細胞に上記ポ
リヌクレオチドを有する組換えベクターを導入した。培
養を開始して２〜３日後に抗生物質を含む培地で上記細
菌を除去した。２週間ごとに上記葉片を継代し、上記ポ
リヌクレオチドと同時にタバコ細胞に導入されたｐＢＩ
１２１由来のＮＰＴII遺伝子発現によるカナマイシン抵
抗性の有無で形質転換したタバコ細胞を選抜した。選抜
した形質転換タバコ細胞は、常法により、植物体に再分
化させた。

【００５０】実施例６ （本発明のポリヌクレオチドをプローブとしたドットブ
ロットアッセイ）健常コンニャク葉およびＫＭＶ感染コ
ンニャク葉からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出した。得られ
た各ＲＮＡ試料１〜10μｇ相当を、ナイロンメンブレン
にドットした。次いで、市販のＵＶクロスリンカーを用
いて該メンブレン上に転写した上記ＲＮＡ試料を架橋固
定した。プレハイブリダイゼーションは５×ＳＳＣ、１
％ＳＤＳ、５％ブロッキング剤（アマシャム社製）、および
５０％ホルムアミドを含む50mMリン酸クエン酸バッファ
ー(pH6.5)中、４２℃で一晩行った。

【００５１】ハイブリダイゼーションには、上記ｃＤＮ
ＡフラグメントのＫＭＶ外被タンパク質をコードする領
域をＰＣＲにより増幅したポリヌクレオチドを、アマシャム
社製ECL遺伝子検出システムキットによりワサビペルオ
キシダーゼで標識して、プローブとして用いた。この標
識プローブを、上記バッファー中に最終濃度が10〜100
ｎｇ／ｍｌとなるように加え、４２℃で一晩インキュベ
ートして行った。その後、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ
の条件下、１５分づつ室温で４回洗浄し、さらに０.１
×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳの条件下、１５分づつ室温で
２回洗浄した。ハイブリダイズされたＫＭＶゲノムＲＮ
Ａの検出は化学発光（chemiluminescence）に基づくオ
ートラジオグラフィーにより行った。

【００５２】その結果、ＫＭＶ感染コンニャク葉から抽
出したＲＮＡを含むドットでは、明確な陽性シグナルが
認められた。健常コンニャク葉から抽出したＲＮＡを含
むドットには、このようなシグナルは認められない。

【００５３】

【発明の効果】本発明によれば、ＫＭＶのゲノムまたは
そのｃＤＮＡに特異的なヌクレオチド配列を有するポリ
ヌクレオチドが提供される。本発明のポリヌクレオチド
は、ＫＭＶによる病害の防除のために使用され得る。本
発明のポリヌクレオチドにより、ＫＭＶの遺伝子診断法
が提供される。さらに、ＫＭＶの外被タンパク質をコー
ドする本発明のポリヌクレオチドを、植物に導入するこ
とにより、ＫＭＶ抵抗性植物品種が提供される。

【００５４】

【配列表】

【００５５】

【配列番号：１】 配列の長さ：1833 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to Genomic RNA 配列 CA AAG TTT TAC GGG GGT TGG AAT GTC TTG CTG AAA TCC TTA CCA GAA 47 Lys Phe Tyr Gly Gly Trp Asn Val Leu Leu Lys Ser Leu Pro Glu 1 5 10 15 GAT TGG GTT TAT TGT GAT GCG GAT GGC AGT CAA TTT GAC AGC TCC CTA 95 Asp Trp Val Tyr Cys Asp Ala Asp Gly Ser Gln Phe Asp Ser Ser Leu 20 25 30 TCA CCA TAC CTA ATT AAC TCA ATA CTC AAC GCA AGG TTG AAG ATG ATG 143 Ser Pro Tyr Leu Ile Asn Ser Ile Leu Asn Ala Arg Leu Lys Met Met 35 40 45 GAG CCG TGG GAG ATT GGT GAG CAG ATG CTA TGC AAT TTA TAC ACA GAG 191 Glu Pro Trp Glu Ile Gly Glu Gln Met Leu Cys Asn Leu Tyr Thr Glu 50 55 60 ATA ACT TAC ACA CCA ATT GCA ACC CCA GAT GGA ACT ATT GTG AAG AAA 239 Ile Thr Tyr Thr Pro Ile Ala Thr Pro Asp Gly Thr Ile Val Lys Lys 65 70 75 TTC AAG GGG AAC AAT AGT GGT CAA CCA TCA ACT GTA GTT GAC AAC ACG 287 Phe Lys Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr 80 85 90 95 CTA ATG GTT TTA ACG GCA ATG TAT TAC TCC CTA TTG CGA TCT GGC ATC 335 Leu Met Val Leu Thr Ala Met Tyr Tyr Ser Leu Leu Arg Ser Gly Ile 100 105 110 TCA CTA GAA GAG CAC ATG GAA GTA ATT CAA TTC TTT ATA AAT GGT GAT 383 Ser Leu Glu Glu His Met Glu Val Ile Gln Phe Phe Ile Asn Gly Asp 115 120 125 GAC CTC ATC ATA GCA GTC AAA CCT GAT GCA CAA CAT CTT CTG GAT GTG 431 Asp Leu Ile Ile Ala Val Lys Pro Asp Ala Gln His Leu Leu Asp Val 130 135 140 ATG GCA GCA CAC TTC TCA GAA TTG GGA CTC AAT TAT GAC TTC ACT TCG 479 Met Ala Ala His Phe Ser Glu Leu Gly Leu Asn Tyr Asp Phe Thr Ser 145 150 155 AGG ACA ACA CAA AAG GGG AAT CTT TGG TTC ATG TCT CAC AGG GGC GTT 527 Arg Thr Thr Gln Lys Gly Asn Leu Trp Phe Met Ser His Arg Gly Val 160 165 170 175 GAA CGG GAA GGG ATC TAC ATA CCA AAA TTG GAG GAA GAG CGC ATA GTC 575 Glu Arg Glu Gly Ile Tyr Ile Pro Lys Leu Glu Glu Glu Arg Ile Val 180 185 190 TCA ATC CTG GAG TGG GAT AGG TCA ACA GAA CCA TCG CAC AGA CTC GAA 623 Ser Ile Leu Glu Trp Asp Arg Ser Thr Glu Pro Ser His Arg Leu Glu 195 200 205 GCT ATT TGT GCA GCC ATG ATT GAG GCA TGG GGT TAC GAC TGG CTA GTG 671 Ala Ile Cys Ala Ala Met Ile Glu Ala Trp Gly Tyr Asp Trp Leu Val 210 215 220 CAC GAA ATC CGA CTT TTC TAT AGT TGG GTG CTT GAG CAA TAT CCA TAT 719 His Glu Ile Arg Leu Phe Tyr Ser Trp Val Leu Glu Gln Tyr Pro Tyr 225 230 235 AAC CAG TTG GCG GCG CAA GGT AGG GCA CCA TAC ATA GCA GAG ACG GCG 767 Asn Gln Leu Ala Ala Gln Gly Arg Ala Pro Tyr Ile Ala Glu Thr Ala 240 245 250 255 TTG CGT AAA CTC TAC CTA GAT CGT GAC GCT AAT GAA GAG GAA CTC CTA 815 Leu Arg Lys Leu Tyr Leu Asp Arg Asp Ala Asn Glu Glu Glu Leu Leu 260 265 270 AGG TAC GCC ACA GAG CAA AAT TTT GAA TGG CCA CAG GAA GAG CAA GTT 863 Arg Tyr Ala Thr Glu Gln Asn Phe Glu Trp Pro Gln Glu Glu Gln Val 275 280 285 TAT CAT CAG AGT GGG AAA GAA GAG AAA GAC GAG GAC AAG AAG CTG GAT 911 Tyr His Gln Ser Gly Lys Glu Glu Lys Asp Glu Asp Lys Lys Leu Asp 290 295 300 GCT GGA AAG CAA CCG CTA GTG AAG GAC AAA GAA AAA GAG TCC GAG TTT 959 Ala Gly Lys Gln Pro Leu Val Lys Asp Lys Glu Lys Glu Ser Glu Phe 305 310 315 GTC AAC AAA AAC AAA GAT GAG AGT AAA CAA GTG CAA ACA ATT AAG GAC 1007 Val Asn Lys Asn Lys Asp Glu Ser Lys Gln Val Gln Thr Ile Lys Asp 320 325 330 335 AAG GAT ATT GAC ATG GGC ACT AGT GGT GCA ATT GCT GTT CCA AGG TAC 1055 Lys Asp Ile Asp Met Gly Thr Ser Gly Ala Ile Ala Val Pro Arg Tyr 340 345 350 AAA ATT TTC AAA TCC AGG CTT AGA TTT CCC ATG GTG CGA GGA AGA AAA 1103 Lys Ile Phe Lys Ser Arg Leu Arg Phe Pro Met Val Arg Gly Arg Lys 355 360 365 ATC ATG AAC ATG AAC CAC CTT GCT CAA TAC AAT CCA GAA CAA ACA GAT 1151 Ile Met Asn Met Asn His Leu Ala Gln Tyr Asn Pro Glu Gln Thr Asp 370 375 380 CTA GCG AAC ACG AGA GCA ACA CAA AAT CAA TTT GCA CGC TGG TTT GAT 1199 Leu Ala Asn Thr Arg Ala Thr Gln Asn Gln Phe Ala Arg Trp Phe Asp 385 390 395 GGT GTC AAA GGG GAT TAT GGA TTG ACC GAC GCA GAG ATG GAC GTC ATG 1247 Gly Val Lys Gly Asp Tyr Gly Leu Thr Asp Ala Glu Met Asp Val Met 400 405 410 415 TTA AAT GGT CTT GTT GTC TGG TGC ATC GAG AAT GGG ACA TCC CCA AAC 1295 Leu Asn Gly Leu Val Val Trp Cys Ile Glu Asn Gly Thr Ser Pro Asn 420 425 430 ATA AAC GGA TTG TGG ACT ATG ATG GAT GGT GAG GAA CAA GTT GAA TAT 1343 Ile Asn Gly Leu Trp Thr Met Met Asp Gly Glu Glu Gln Val Glu Tyr 435 440 445 CCA ATC AAA CCA TTG ATA GAT CAT GCG TCA CCC ACA TTT CGT CAA ATT 1391 Pro Ile Lys Pro Leu Ile Asp His Ala Ser Pro Thr Phe Arg Gln Ile 450 455 460 ATG GCG CAT TTC AGT GAC ATT GCC GAG GCG TAT ATA GAG AAA CGC AAC 1439 Met Ala His Phe Ser Asp Ile Ala Glu Ala Tyr Ile Glu Lys Arg Asn 465 470 475 TTT GAT GGT AAA TAT ATG CCA CGG TAC GGT CTA CTT AGA AAC TTG AAC 1487 Phe Asp Gly Lys Tyr Met Pro Arg Tyr Gly Leu Leu Arg Asn Leu Asn 480 485 490 495 GAC TTC AGT CTT GCA AGA TAT GCA TTT GAT TTT TAT GAA ATG ACA TCC 1535 Asp Phe Ser Leu Ala Arg Tyr Ala Phe Asp Phe Tyr Glu Met Thr Ser 500 505 510 AAG ACA CCC AAC AGG GCA AGA GAG GCT CAC TTG CAG ATG AAA GCA GCC 1583 Lys Thr Pro Asn Arg Ala Arg Glu Ala His Leu Gln Met Lys Ala Ala 515 520 525 GCC CTG CGA AGC GCG AAC ACG CGC ATG TTT GGT TTA GAC GGG AAA GTT 1631 Ala Leu Arg Ser Ala Asn Thr Arg Met Phe Gly Leu Asp Gly Lys Val 530 535 540 ACA ACA AAG GAA GAG GAC ACA GAG AGA CAT ACA GCT GAA GAC GTA TCG 1679 Thr Thr Lys Glu Glu Asp Thr Glu Arg His Thr Ala Glu Asp Val Ser 545 550 555 CGC GAC CTA CAC ACT CTG ATG GGT GTG CGC ACT ATC TGATTAAAGT 1725 Arg Asp Leu His Thr Leu Met Gly Val Arg Thr Ile 560 565 570 TTCTCTGGAC GAGCCTGCCT TCGTATTATA GCATCGTATA ATAGTCGTGT TTATCTGCCA 1785 TGCCTCATCT TTTAGTGAGT GCTTCACTCG TGATGAGTCG TGTCTTTT 1833

【００５６】

【配列番号：２】 配列の長さ：281 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Lys Glu Glu Lys Asp Glu Asp Lys Lys Leu Asp Ala Gly Lys 1 5 10 15 Gln Pro Leu Val Lys Asp Lys Glu Lys Glu Ser Glu Phe Val Asn Lys 20 25 30 Asn Lys Asp Glu Ser Lys Gln Val Gln Thr Ile Lys Asp Lys Asp Ile 35 40 45 Asp Met Gly Thr Ser Gly Ala Ile Ala Val Pro Arg Tyr Lys Ile Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Leu Arg Phe Pro Met Val Arg Gly Arg Lys Ile Met Asn 65 70 75 80 Met Asn His Leu Ala Gln Tyr Asn Pro Glu Gln Thr Asp Leu Ala Asn 85 90 95 Thr Arg Ala Thr Gln Asn Gln Phe Ala Arg Trp Phe Asp Gly Val Lys 100 105 110 Gly Asp Tyr Gly Leu Thr Asp Ala Glu Met Asp Val Met Leu Asn Gly 115 120 125 Leu Val Val Trp Cys Ile Glu Asn Gly Thr Ser Pro Asn Ile Asn Gly 130 135 140 Leu Trp Thr Met Met Asp Gly Glu Glu Gln Val Glu Tyr Pro Ile Lys 145 150 155 160 Pro Leu Ile Asp His Ala Ser Pro Thr Phe Arg Gln Ile Met Ala His 165 170 175 Phe Ser Asp Ile Ala Glu Ala Tyr Ile Glu Lys Arg Asn Phe Asp Gly 180 185 190 Lys Tyr Met Pro Arg Tyr Gly Leu Leu Arg Asn Leu Asn Asp Phe Ser 195 200 205 Leu Ala Arg Tyr Ala Phe Asp Phe Tyr Glu Met Thr Ser Lys Thr Pro 210 215 220 Asn Arg Ala Arg Glu Ala His Leu Gln Met Lys Ala Ala Ala Leu Arg 225 230 235 240 Ser Ala Asn Thr Arg Met Phe Gly Leu Asp Gly Lys Val Thr Thr Lys 245 250 255 Glu Glu Asp Thr Glu Arg His Thr Ala Glu Asp Val Ser Arg Asp Leu 260 265 270 His Thr Leu Met Gly Val Arg Thr Ile 275 280

【００５７】

【配列番号：３】 配列の長さ：290 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列 Lys Phe Tyr Gly Gly Trp Asn Val Leu Leu Lys Ser Leu Pro Glu Asp 1 5 10 15 Trp Val Tyr Cys Asp Ala Asp Gly Ser Gln Phe Asp Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Pro Tyr Leu Ile Asn Ser Ile Leu Asn Ala Arg Leu Lys Met Met Glu 35 40 45 Pro Trp Glu Ile Gly Glu Gln Met Leu Cys Asn Leu Tyr Thr Glu Ile 50 55 60 Thr Tyr Thr Pro Ile Ala Thr Pro Asp Gly Thr Ile Val Lys Lys Phe 65 70 75 80 Lys Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu 85 90 95 Met Val Leu Thr Ala Met Tyr Tyr Ser Leu Leu Arg Ser Gly Ile Ser 100 105 110 Leu Glu Glu His Met Glu Val Ile Gln Phe Phe Ile Asn Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Ile Ile Ala Val Lys Pro Asp Ala Gln His Leu Leu Asp Val Met 130 135 140 Ala Ala His Phe Ser Glu Leu Gly Leu Asn Tyr Asp Phe Thr Ser Arg 145 150 155 160 Thr Thr Gln Lys Gly Asn Leu Trp Phe Met Ser His Arg Gly Val Glu 165 170 175 Arg Glu Gly Ile Tyr Ile Pro Lys Leu Glu Glu Glu Arg Ile Val Ser 180 185 190 Ile Leu Glu Trp Asp Arg Ser Thr Glu Pro Ser His Arg Leu Glu Ala 195 200 205 Ile Cys Ala Ala Met Ile Glu Ala Trp Gly Tyr Asp Trp Leu Val His 210 215 220 Glu Ile Arg Leu Phe Tyr Ser Trp Val Leu Glu Gln Tyr Pro Tyr Asn 225 230 235 240 Gln Leu Ala Ala Gln Gly Arg Ala Pro Tyr Ile Ala Glu Thr Ala Leu 245 250 255 Arg Lys Leu Tyr Leu Asp Arg Asp Ala Asn Glu Glu Glu Leu Leu Arg 260 265 270 Tyr Ala Thr Glu Gln Asn Phe Glu Trp Pro Gln Glu Glu Gln Val Tyr 275 280 285 His Gln 290

【００５８】

【配列番号：４】 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列 ＧＧＣＣＴＣＴＡＧＡ ＡＡＣＡＴＧＡＧＴＧ ＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡ ＧＡＡ
ＡＧＡＣＧ ３８

【００５９】

【配列番号：５】 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列 GCGAATTGAT TTTGTGTTGC TC 22

【図面の簡単な説明】

【図１】ＫＭ２７から得られた一連のサブクローンによ
る、配列解析マップを示す。

【図２】クローニングされたＫＭＶゲノムｃＤＮＡの遺
伝子構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コンニャクモザイクウイルスのゲノムま
   たはそのｃＤＮＡに特異的なヌクレオチド配列を有する
   ポリヌクレオチドであって、配列番号１によって示され
   るヌクレオチド配列の一部または全長を含有するポリヌ
   クレオチド。
2. 【請求項２】 配列番号１の第８７３位から第１７１５
   位までのヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載
   のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 配列番号２によって示されるアミノ酸配
   列をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレ
   オチド。
4. 【請求項４】 請求項１から３のいずれかに記載のポリ
   ヌクレオチドを有する、組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項１から３のいずれかに記載のポリ
   ヌクレオチドを導入された細胞。
6. 【請求項６】 コンニャクモザイクウイルスによる病害
   防除のための、該ウイルスのゲノムまたはそのｃＤＮＡ
   に特異的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
   の使用方法：ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号１
   によって示されるヌクレオチド配列の一部または全長を
   含有する。
7. 【請求項７】 前記ポリヌクレオチドを植物細胞に導入
   し、該植物細胞を形質転換する工程を包含する、請求項
   ６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記ポリヌクレオチドと、コンニャクモ
   ザイクウイルスのゲノムまたはそのｃＤＮＡとをハイブ
   リダイズする工程を包含する、請求項６に記載の方法。