JPH0951734A - Bluegrass and introduction of symbiotic microorganism into bluegrass - Google Patents
Bluegrass and introduction of symbiotic microorganism into bluegrassInfo
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- JPH0951734A JPH0951734A JP7228506A JP22850695A JPH0951734A JP H0951734 A JPH0951734 A JP H0951734A JP 7228506 A JP7228506 A JP 7228506A JP 22850695 A JP22850695 A JP 22850695A JP H0951734 A JPH0951734 A JP H0951734A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は共生菌を導入して成
るブルーグラスおよびブルーグラスへの共生菌の導入方
法に関する。またここでブルーグラスとはイネ科植物中
のイチゴツナギ亜科、イチゴツナギ連のイチゴツナギ属
に属する植物である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a bluegrass obtained by introducing a symbiotic bacterium and a method for introducing the symbiotic bacterium into the bluegrass. The bluegrass is a plant belonging to the genus Strawberry Alliaceae in the family Gramineae, belonging to the family Strawberry Allele.
【0002】[0002]
【従来の技術】ブルーグラスとして、従来よりケンタッ
キーブルーグラス、カナダブルーグラス、スズメノカタ
ビラ、ラフメドウグラス、ブルボウズメドウグラス、ア
ルペンメドウグラス、ウエービーメドウグラス、ウッド
メドウグラス、バルフォースメドウグラス、スワンプメ
ドウグラス、ブロードリーフメドウグラス、ナローリー
フメドウグラス、スムースメドウグラス、スプレッディ
ングメドウグラス、フラッテンドメドウグラス等の植物
が知られている。2. Description of the Related Art Conventionally, as bluegrass, Kentucky Bluegrass, Canadian Bluegrass, Poa annua, Rough Meadowgrass, Bullbow Meadowgrass, Alpen Meadowgrass, Wave Meadowgrass, Wood Meadowgrass, Balfour Meadowgrass, Swamp Meadowglass Plants such as grass, broadleaf meadowgrass, narrow leaf meadowgrass, smooth meadowgrass, spreading meadowgrass, and flattened meadowgrass are known.
【0003】これらの植物はイネ科植物に含まれるとと
もに、イチゴツナギ亜科中のイチゴツナギ連に属し、し
かもイチゴツナギ連中のイチゴツナギ属の植物である。
例えばケンタッキーブルーグラスは学名Poa pra
tensisと呼ばれている。なおPoa prate
nsisとは、Claytonら(Genera Gr
aminium, Grass of the Wor
ld 1986)によって分類された植物に相当する。These plants are included in the Gramineae family and belong to the family Strawberry Rhododendron in the subfamily Strawberry Rhododendron and are plants belonging to the genus Strawberry Rhododendron in the family Strawberry Rhododendron.
For example, Kentucky Bluegrass has the scientific name Poa pra
It is called tensis. Poa plate
nsis means Clayton et al. (Genera Gr.
aminium, Grass of the Wor
ld) 1986).
【0004】ケンタッキーブルーグラスに代表されるイ
ネ科のブルーグラスは多くのブルーグラス類の中でも人
類にとって重要で、芝草、牧草等に広く利用されてい
る。Bluegrass of the grass family represented by Kentucky bluegrass is important for humans among many bluegrass, and is widely used for grass and grass.
【0005】ところがブルーグラスは利用用途が広く、
しかも使用面積が広大であるために、病害や虫害による
被害が大きく、Bluegrass webworm
(和名シバツトガ)による被害が大きく、ふ化直後の幼
虫に対して薬剤散布が行き届かないところでは一夜にし
て芝がなくなるほどの大きな被害が発生している。However, blue grass has a wide range of uses,
Moreover, because of its vast area of use, damage due to diseases and insect damage is great, and the Bluegrass website
The damage caused by (Japanese name Shibatatsuga) is so great that the larvae immediately after hatching are in a place where the chemical spray cannot reach them, and the damage is so great that the grass disappears overnight.
【0006】ところでイネ科植物について、従来から行
なわれている育種、栽培方法としては、人工交配法、選
抜法、突然変異法、細胞融合法、遺伝子導入法等が存在
する。近年のバイオテクノロジーの進歩によって、これ
まで10年以上要した育種期間は数年に短縮されてい
る。とくに形質転換技術である遺伝子導入法は、アグロ
バクテリウムによる方法、エレクトロポレーション法、
パーティクルガン法等が存在し、多くの作物への応用が
実施されている。[0006] By the way, conventional breeding and cultivation methods for gramineous plants include an artificial crossing method, a selection method, a mutation method, a cell fusion method, a gene introduction method and the like. Recent advances in biotechnology have reduced the breeding period, which has taken over 10 years, to several years. In particular, the gene transfer method, which is a transformation technique, is a method using Agrobacterium, electroporation,
There is a particle gun method and the like, and application to many crops is being implemented.
【0007】しかしイネ科の植物においては、上記の遺
伝子導入法は効率が非常に低いことが指摘されている。
アグロバクテリウム法では、イネ科植物へのアグロバク
テリウムの感染が困難なために、遺伝子導入が非常に難
しい。またエレクトロポレーション法では、イネ科植物
のプロトプラストからの再生系の開発が必須であり、再
生が可能であったとしても、培養変異等によって、本来
の植物の形質を損うことが知られている。[0007] However, it has been pointed out that the above-mentioned gene transfer method is extremely low in the efficiency of the above-mentioned gene transfer method in plants of the Poaceae family.
In the Agrobacterium method, gene transfer is very difficult because of the difficulty in infecting gramineous plants with Agrobacterium. In addition, in the electroporation method, it is essential to develop a regeneration system from protoplasts of gramineous plants, and even if regeneration is possible, it is known that the characteristics of the original plant are impaired due to culture mutation and the like. I have.
【0008】またパーティクルガン法は、遺伝子をラン
ダムに植物体または培養物に導入するために、与えられ
た植物がキメラになることが多いことが知られている。In the particle gun method, it is known that a given plant often becomes a chimera because a gene is randomly introduced into a plant or a culture.
【0009】ケンタッキーブルーグラスに代表されるブ
ルーグラスにおいても、細胞融合や遺伝子導入を含む細
胞育種法は、煩雑な操作を必要とし、その効率も低いた
めに、実用レベルでの開発に成功した例は非常に少な
い。[0009] Even in bluegrass represented by Kentucky bluegrass, a cell breeding method including cell fusion and gene transfer requires a complicated operation and its efficiency is low, so that it has been successfully developed at a practical level. Is very few.
【0010】ところで自然界に存在する野生の植物の中
には、内部共生菌である糸状菌、すなわちエンドファイ
トが共生している植物が存在する。植物体の組織中に、
とくに細胞間隙と呼ばれる細胞と細胞との間の間隙でこ
のような共生菌が生育している。By the way, among wild plants existing in nature, there are filamentous fungi which are endosymbiotic bacteria, that is, plants in which endophytes coexist. In the tissues of the plant,
In particular, such symbiotic bacteria grow in gaps between cells called cell gaps.
【0011】このような内部共生菌、すなわちエンドフ
ァイトは共生する糸状菌であって、宿主の植物に対して
悪影響を及さないばかりか、宿主植物に対して有用な物
質を提供し、環境ストレスに対して抵抗性を有する性質
を植物に付与することに貢献ている。Such an endosymbiotic bacterium, ie, endophyte, is a symbiotic filamentous fungus that not only has no adverse effect on the host plant, but also provides a useful substance to the host plant, and has an environmental stress. It contributes to imparting a property having resistance to the plant.
【0012】すなわちエンドファイトは共生している植
物の耐虫性(Siegelら、1987 Ann. R
ev. Phytopathol、25:293−31
5)、耐病性(Gwinn and Gavin、19
92 Plant Disease 76:911−9
14)、環境ストレス(乾燥等)耐性(Arachev
altaら、1989 Agron. J. 81:8
3−90)、生長促進(Latchら、1985 N.
Z. J. Agric. Res. 28:165
−168)等を向上させることが公知となっている。と
くにエンドファイトが感染したペレニアルライグラスに
おいては、このエンドファイトが生産する忌避物質やア
ルカロイドによって耐虫性が向上することが知られてい
る。That is, endophyte is an insect resistance of symbiotic plants (Siegel et al., 1987 Ann. R).
ev. Phytopathol, 25: 293-31
5), disease resistance (Gwinn and Gavin, 19)
92 Plant Disease 76: 911-9
14), environmental stress (dryness, etc.) resistance (Arachev)
alta et al., 1989 Agron. J. 81: 8
3-90), growth promotion (Latch et al., 1985 N.P.
Z. J. Agric. Res. 28: 165
-168) is known to be improved. Particularly in perennial ryegrass infected with endophyte, it is known that insect resistance is improved by repellent substances and alkaloids produced by this endophyte.
【0013】またニュージーランドのライチ(Latc
h)らは、ペレニアルライグラスのエンドファイトを収
集調査し、家畜に対して毒性が少なく耐虫性に優れたエ
ンドセーフと呼ばれているエンドファイトの探索を試み
ている。Also, New Zealand lychees (Latc
h) et al. have collected and investigated the endophyte of perennial ryegrass and tried to find an endfight called end safe which is less toxic to livestock and has excellent insect resistance.
【0014】しかしこのようなエンドファイトが共生し
ている多くの植物は、人類に対して有用性に乏しい野生
植物であって、エンドファイトの有効性を有用なイネ科
植物に導入する必要性が生じている。そこで主要牧草で
あるペレニアルライグラスへのエンドファイトの導入が
これまで試みられてきた。その技術は人工交配法と人工
接種法とに大別される。However, many plants in which such endophytes coexist are wild plants with poor utility to humans, and it is necessary to introduce the efficacy of endophytes into useful gramineae plants. Has occurred. Therefore, attempts have been made to introduce endfight into perennial ryegrass, a major grass. The techniques are roughly divided into artificial hybridization and artificial inoculation.
【0015】人工交配法は、エンドファイトに感染して
いる植物を母親として有用形質を花粉によって導入する
方法であるが、従来の方法においては交配の可能な種
間、品質間の導入に限定されている。また人工接種法で
は、植物体や培養組織に分離培養したエンドファイトを
接種感染させる方法である。The artificial mating method is a method of introducing a useful trait by pollen using a plant infected with endophyte as a mother, but in the conventional method, it is limited to introduction between species and qualities capable of mating. ing. In the artificial inoculation method, a plant body or a cultured tissue is inoculated and infected with endophyte isolated and cultured.
【0016】人工接種法は、人工交配法と比較すると、
導入の範囲が拡大されるが、しかしエンドファイトの栽
培法、接種時の条件、植物体の条件等の手法的な問題か
ら、ペレニアルライグラスに限定されていた。また感染
効率を向上させるために接種する植物体側の組織にカル
スを利用する方法が報告されている。この方法によれ
ば、カルスからの植物体の再生系の開発が要求されるた
めに、やはりペレニアルライグラスへの導入例に止まっ
ている。Compared with the artificial mating method, the artificial inoculation method is
Although the range of introduction was expanded, it was limited to perennial ryegrass due to technical problems such as the cultivation method of endophyte, inoculation conditions, and plant conditions. In addition, a method has been reported in which callus is used in tissues of a plant to be inoculated to improve the infection efficiency. According to this method, development of a system for regenerating a plant from callus is required, and thus, the method has only been introduced into perennial ryegrass.
【0017】[0017]
【発明が解決しようとする課題】従来の細胞育種法にお
いては、煩雑な操作と熟練とを要する一方、形質転換や
細胞融合によれば、培養変異等の理由によって、導入形
質または導入形質以外の形質に影響を及すために、実用
化が困難になっていた。In the conventional cell breeding method, complicated operations and skill are required. On the other hand, according to the transformation or the cell fusion, the transduced trait or the transfected trait may be lost due to culture mutation or the like. Practical application has been difficult due to the influence on the traits.
【0018】また遺伝子導入法において、遺伝子導入に
際し、植物の形質や形態に及す遺伝子が解明されていな
い場合には、それらの形質を導入することが不可能であ
った。Further, in the gene introduction method, when the gene affecting the plant trait or morphology was not elucidated at the time of gene introduction, it was impossible to introduce these traits.
【0019】とくに環境ストレス等の複雑な要因に関連
する形質は、遺伝子導入法等の方法では、導入すること
ができなかった。また細胞育種法によって作出された植
物は、多くの場合に種子稔性の低下が認められている。
これはイネ科植物において、種子稔性の低下が収量の低
下を招くために致命的な欠陥になる。In particular, traits related to complicated factors such as environmental stress could not be introduced by a method such as a gene introduction method. Further, in many cases, a decrease in seed fertility has been observed in plants produced by the cell breeding method.
This is a fatal defect in gramineous plants because reduced seed fertility leads to reduced yield.
【0020】このような現状に鑑みて、エンドファイト
を利用した育種法、あるいは形質の改善は、上記の問題
を解決するための全く新しい手法である。In view of the above situation, the breeding method using endophyte or the improvement of traits is a completely new method for solving the above problems.
【0021】エンドファイトの人工接種を行なう場合に
は、エンドファイトの探索、培養系の検討等から、ペレ
ニアルライグラスに限定されており、他の有用なイネ科
植物、例えばケンタッキーブルーグラスへの応用が全く
なされていない。さらにカルス接種法においては、導入
植物の再生系の開発が不可欠である。また接種時におい
ても、エンドファイトの感染効率を向上させる接種条件
が開発されていない。In the case of artificial inoculation of endophyte, it is limited to perennial ryegrass because of the search for endophyte, examination of culture system, etc., and application to other useful gramineous plants such as Kentucky bluegrass is recommended. Not done at all. Furthermore, in the callus inoculation method, it is essential to develop a regeneration system for the introduced plant. At the time of inoculation, no inoculation conditions have been developed to improve the infection efficiency of endophyte.
【0022】エンドファイトの種類において、現在有用
なエンドファイトは、ペレニアルライグラス、トールフ
ェスク、メドウフェスクからしか探索されておらず、導
入の大きな障害になっている。とくにこれらのエンドフ
ァイトの宿主植物は外来の種であり、日本に在来の植物
から日本の環境に適応したエンドファイトはこれまで発
見されていない。Among the types of endophytes, currently useful endophytes have been searched only from perennial ryegrass, tall fescue, and meadow fescue, which is a major obstacle to introduction. In particular, the host plants of these endophytes are exotic species, and no endophytes adapted to the Japanese environment have been found from plants native to Japan.
【0023】[0023]
【発明の目的】本発明は人為的にエンドファイトを導入
したブルーグラス、およびエンドファイトに感染してい
ないブルーグラスにエンドファイトを人為的に導入する
方法を提供することを目的とする。An object of the present invention is to provide a bluegrass artificially introduced with endophyte and a method for artificially introducing endophyte into bluegrass not infected with endophyte.
【0024】[0024]
【課題を解決するための手段】本発明は、糸状菌から成
る共生菌、すなわちエンドファイトに感染していないブ
ルーグラスにエンドファイトを人為的に導入して成るブ
ルーグラスに関するものである。ここでブルーグラス
は、イネ科植物であって、イチゴツナギ亜科中のイチゴ
ツナギ連に含まれるイチゴツナギ属の植物であって、ケ
ンタッキーブルーグラス、カナダブルーグラス、スズメ
ノカタビラ、ラフメドウグラス、ブルボウズメドウグラ
ス、アルペンメドウグラス、ウエービーメドウグラス、
ウッドメドウグラス、バルフォースメドウグラス、スワ
ンプメドウグラス、ブロードリーフメドウグラス、ナロ
ーリーフメドウグラス、スムースメドウグラス、スプレ
ッディングメドウグラス、フラッテンドメドウグラス等
の植物が含まれるものである。The present invention relates to a symbiotic bacterium consisting of a filamentous fungus, that is, bluegrass obtained by artificially introducing endophyte into bluegrass not infected with endophyte. Here, bluegrass is a gramineous plant, and is a plant of the genus Strawberry, which is included in the family Strawberry Rhododendron in the subfamily Rosaceae, Kentucky bluegrass, Canadian bluegrass, bluegrass, rough meadow grass, bullbows Meadow Glass, Alpine Meadow Glass, Wavy Meadow Glass,
The plants include plants such as wood meadow glass, balforce meadow glass, swamp meadow glass, broadleaf meadow glass, narrow leaf meadow glass, smooth meadow glass, spreading meadow glass, and flattened meadow glass.
【0025】このようなブルーグラスへのエンドファイ
トの導入は、自然界に生育する植物中に共生するエンド
ファイトを探索発見するとともに、植物中からエンドフ
ァイトを分離しかつ人工的に培養したものを上記のブル
ーグラスに人為的に導入するものである。なお自然界に
生育する植物であってエンドファイトが存在する植物
は、自然界にカヤツリグサ科、イグサ科等に存在するこ
とが知られている。Introducing such endophytes into bluegrass involves searching for and discovering endophytes that coexist in plants that grow in nature, and separating endophytes from plants and artificially culturing them. It is artificially introduced into the bluegrass. It is known that a plant that grows in the natural world and has endophyte exists in the cyperaceae, rush family and the like in the natural world.
【0026】例えば本願発明者らが探索発見するととも
に培養したエンドファイトであって、下記のエンドファ
イトが用いられてよい。For example, the following endophytes that have been discovered and cultivated by the present inventors and have been cultured, and the following endophytes may be used.
【0027】Acremonium sp. Po−0
01(生工研寄託菌 FERM P−14798) Acremonium sp. Po−023(生工研
寄託菌 FERM P−15029) Epichloё sp. Po−048(生工研寄託
菌 FERMP−15030) このようなエンドファイトが導入されるブルーグラスに
は、その後代も含まれるものである。Acremonium sp. Po-0
01 (Deposited Bacteria, FERM P-14798) Acremonium sp. Po-023 (Seikokuken deposit FERM P-15029) Epichloё sp. Po-048 (Seikokuken deposit FERMP-15030) The bluegrass into which such an endophyte is introduced also includes the progeny thereof.
【0028】次にブルーグラスへの糸状菌から成る共生
菌、すなわちエンドファイトの導入方法について説明す
ると、この方法は自然界に存在する植物に共生している
エンドファイトを分離して人工増殖を行なうとともに、
人工増殖されたエンドファイトをブルーグラスに人工接
種するものである。そして人工接種されたエンドファイ
トをブルーグラスに感染させて共生させることにより、
ブルーグラスへのエンドファイトの導入が行なわれる。Next, a method of introducing a symbiotic bacterium consisting of a filamentous fungus into bluegrass, that is, an endophyte will be described. This method separates endophytes coexisting with plants existing in the natural world to perform artificial growth. ,
Bluegrass is artificially inoculated with artificially grown endophyte. And by infecting bluegrass with artificially inoculated endophyte and coexisting,
Introducing End Fight to Bluegrass.
【0029】ここでエンドファイトを人工接種する工程
において、とくにエンドファイトの分生子を用いるよう
にしてよい。また生工研に寄託されている上記のエンド
ファイトの何れかを人工接種するようにしてもよい。ま
たブルーグラスに対するエンドファイトの導入は、必ず
しも1種類のエンドファイトである必要はなく、2種類
以上のエンドファイトを併用して導入してもよい。In the step of artificially inoculating the endophyte, conidia of the endophyte may be used. In addition, any of the above endophytes deposited at the Institute of Industrial Science may be artificially inoculated. Further, the introduction of the endophyte into the bluegrass is not necessarily one type of the endophyte, and two or more types of the endophytes may be introduced together.
【0030】[0030]
【発明の実施の形態】本発明に係るブルーグラスへのエ
ンドファイトの導入をその手順に従って詳細に説明す
る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The introduction of endophyte into bluegrass according to the present invention will be described in detail according to the procedure thereof.
【0031】段階1 エンドファイトの存在の有無の
検出と分離工程 (1)エンドファイトの検出工程 探索等によって採取した植物の葉および葉鞘部分の表皮
を剥ぎ、アニリンブルー染色液に入れて染色し、組織内
のエンドファイトを光学顕微鏡下において検出し、エン
ドファイトの存在の有無の確認を行なう。Step 1 Detection step of presence / absence of endophyte and separation step (1) Detection step of endophyt The epidermis of leaves and leaf sheaths of the plant collected by search and the like is peeled off, and put in an aniline blue dyeing solution for staining. Endophytes in the tissue are detected under an optical microscope to confirm the presence or absence of endophytes.
【0032】(2)エンドファイトの分離・培養工程 エンドファイトが確認された植物片を滅菌処理後に、エ
ンドファイトの分離培地へ置床し、数ヵ月間培養を行な
う。(2) Separation / Culturing Step of Endophyte After sterilizing a plant piece in which endophyt is confirmed, it is placed on an endophyte separation medium and cultured for several months.
【0033】(3)エンドファイトの分類工程 分離されたエンドファイトを宿主によって分類する。あ
るいはまた平板培養法を用いて環境条件を変化させた状
態で培養を行ない、形態的な部分で分類する。また液体
培養を行ない、形態的な部分で分類する。またスライド
カルチャーを行ない、形態的な部分で分類する。(3) Endophite classification process The separated endophytes are classified according to the host. Alternatively, cultivation is performed in a state where environmental conditions are changed using a plate culture method, and the cells are classified by morphological part. In addition, liquid culture is performed, and the cells are classified by morphological part. In addition, slide culture is performed, and classification is performed based on morphological parts.
【0034】段階2 アルカロイドの分析工程 菌単体もしくは植物体との共生下において、エンドファ
イトから生産されるアルカロイドを分析し、とくに耐虫
性の確認を行なう。このときに併せて耐病性、環境スト
レス耐性、生長促進性等についての検定を行なうことを
妨げない。Step 2 Alkaloid Analysis Step Alkaloids produced from endophyte are analyzed under symbiosis with the fungus alone or with a plant to confirm the insect resistance. At this time, it does not prevent the test for disease resistance, environmental stress resistance, growth promoting property, and the like.
【0035】段階3 エンドファイトの導入工程 分離したエンドファイトを目的あるいは対象とするブル
ーグラスへ人工的に導入する。エンドファイトの導入方
法は、植物体に直接接種する方法と、植物体を1度カル
ス等の未分化の細胞にした後に接種し、カルスから植物
体を再生させる方法とがある。これらはエンドファイト
の導入の対象となる植物の種類に応じて任意に選択され
てよい。Step 3 Introduction Step of Endophite The separated endophyte is artificially introduced into a target or target bluegrass. Methods for introducing endophyte include a method of directly inoculating a plant and a method of once inoculating a plant into undifferentiated cells such as callus and then regenerating the plant from the callus. These may be arbitrarily selected according to the type of plant to which endophyte is introduced.
【0036】段階4 導入確認工程 エンドファイトを導入した個体は、外植片を染色液にて
染色し、光学顕微鏡下において顕鏡し、さらに酵素免疫
測定法を用いてエンドファイトの存在あるいは感染の有
無を検出する。Step 4 Introduction Confirmation Step In the individual into which the endophyte was introduced, the explants were stained with a staining solution, observed under a light microscope, and examined for the presence of endophyte or infection by enzyme immunoassay. Detect the presence or absence.
【0037】段階5 エンドファイト導入植物の検定
工程 (1)耐虫性検定 エンドファイトを導入して共生させた植物と、エンドフ
ァイトが存在しない植物とを用い、虫害の対象となる昆
虫を飼育し、人工的に食害試験を行なう。Step 5 Endophyte-introduced plant assay step (1) Insect resistance assay Using an endophyte-introduced symbiotic plant and an endophyte-free plant, an insect to be damaged by insects is bred. , Artificially perform feeding damage test.
【0038】(2)耐病性検定工程 エンドファイトを導入したブルーグラスと、エンドファ
イトが存在しない同一種類のブルーグラスとを用い、病
害の対象となる病原菌を用い、上記2種類の植物に対し
て人為的に病原菌の接種を行なって発病の程度により病
害抵抗性検定を行なう。(2) Disease resistance test step Using the bluegrass into which endophyte was introduced and the same type of bluegrass without endophyte, and using the pathogenic fungus to be the disease target, The pathogen is inoculated artificially, and the disease resistance test is performed according to the degree of disease.
【0039】(3)後代を用いた検定 エンドファイトが存在する種子を採集し、発芽させてエ
ンドファイトの存在を確認後、上述の各検定を行なう。(3) Assay using progeny After seeds in which endophyte is present are collected and germinated to confirm the presence of endophyte, each assay described above is performed.
【0040】[0040]
(1)エンドファイトの検出 野生のイネ科植物であって自生するPoa属の植物体か
ら次の方法によってエンドファイトの検出を行なった。(1) Detection of Endophyte Endophyte was detected from a plant belonging to the genus Poa, which is a wild grass family plant, by the following method.
【0041】上記の植物の葉および葉鞘部分の表皮を剥
ぎ、光学顕微鏡下において組織内のエンドファイトの有
無の確認を行なった。この確認はスライドガラスに、乳
酸5ml、グリセリン10ml、水5ml、アニリンブ
ルー水溶液0.02gの染色液を数滴滴下する。そして
葉鞘部分を剥がし、裏面表皮をピンセットで葉脈方向に
向って剥いだ。剥ぎ取った表皮をスライドガラスの上に
置き、カバーガラスで覆い、ガスバーナの炎で沸騰さ
せ、光学顕微鏡下において組織を観察した。この条件で
エンドファイトが存在すれば菌糸が青色に呈色するため
に、これによってエンドファイトの検出が行なわれる。The epidermis of the leaves and leaf sheaths of the above plants were peeled off, and the presence or absence of endophytes in the tissues was confirmed under an optical microscope. For this confirmation, several drops of a staining solution of 5 ml of lactic acid, 10 ml of glycerin, 5 ml of water and 0.02 g of an aqueous aniline blue solution are dropped on a slide glass. Then, the leaf sheath was peeled off, and the back surface epidermis was peeled off with tweezers in the vein direction. The peeled epidermis was placed on a slide glass, covered with a cover glass, boiled with a gas burner flame, and the tissue was observed under an optical microscope. If endophyte is present under these conditions, the mycelium will be colored blue, thereby detecting endophyte.
【0042】検出の結果、3種類のPoa属植物からエ
ンドファイトが検出された。そして菌のライフサイクル
から、その内の2種類は植物体外へ出ることのない無性
世代のみのAcremonium型エンドファイトであ
り、残りの1種類が有性世代をもち、植物の出穂時期に
チョークと呼ばれる子座の塊を形成するEpichlo
ё型エンドファイトであった。As a result of the detection, endophytes were detected in three kinds of Poa plants. And from the life cycle of the fungus, two of them are Acremonium type endophytes that do not go out of the plant only for the asexual generation, and the other one has a sexual generation and chokes at the heading time of the plant. Epichlo forming the mass of the called Constellation
It was a ё type end fight.
【0043】(2)エンドファイトの分類 上記(1)項でエンドファイトが確認された3種のPo
a属植物体から以下の方法でエンドファイトの分離を行
なった。(2) Classification of end fights Three types of Po whose end fights were confirmed in the above item (1)
Endophyte was separated from the plant a genus by the following method.
【0044】植物体からのエンドファイトの分離は、葉
および葉鞘部分を水洗後、70%エタノール水溶液に1
0秒間浸漬し、次いで2.5%次亜塩素酸ナトリウム水
溶液に10分間浸漬した後、滅菌水で3回洗浄し、エン
ドファイト分離培地上に置床し、25℃暗条件下で培養
を行なった。The endophyte was separated from the plant body by washing the leaves and the sheath portion with water and then using 1% aqueous 70% ethanol solution.
After immersion for 0 second and then for 10 minutes in a 2.5% aqueous sodium hypochlorite solution, the plate was washed three times with sterile water, placed on an endophyte separation medium, and cultured at 25 ° C. in the dark. .
【0045】分離培地は、pH5.6に調整したPDA
(ポテト デキストロース アガー)培地を121℃、
15分間で滅菌後、ペニシリンとストレプトマイシンと
をそれぞれ100mg/lの濃度になるように添加し、
直径9cmのプラスチックシャーレに20mlずつ分注
して使用した。The separation medium is PDA adjusted to pH 5.6.
(Potato dextrose agar) Medium at 121 ° C.
After sterilization for 15 minutes, penicillin and streptomycin were added to a concentration of 100 mg / l each,
20 ml each was dispensed into a 9 cm-diameter plastic petri dish and used.
【0046】置床後約3〜8週間後に外植片から菌糸が
分離され、形成されたコロニーを直径が5mmのコルク
ボーラにて取出し、同PDA培地に移植して増殖を行な
った。Approximately 3 to 8 weeks after the placement, the hyphae were separated from the explants, and the formed colonies were taken out with a cork borer having a diameter of 5 mm and transplanted to the same PDA medium for growth.
【0047】(3)平板培養法による菌叢でのエンドフ
ァイトの分類同定 PDA培地へ移植した菌糸は、25℃の暗条件下におい
て培養し、形成される菌叢を調査した。調査の結果、培
地上での菌叢は総て白色の綿状であって、増殖速度は非
常に遅く、コロニーは1カ月で半径が約2cm程度にま
でしか増殖しなかった。(3) Classification and identification of endophytes in the flora by the plate culture method The mycelia transplanted to the PDA medium were cultured under dark conditions at 25 ° C, and the flora formed was investigated. As a result of the investigation, the flora on the medium was all white and flocculent, the growth rate was very slow, and the colonies grew only to a radius of about 2 cm in one month.
【0048】これらの内で、分離した3種類のエンドフ
ァイトを工業技術院生命工学工業技術研究所へ寄託を行
なった。菌の表示および寄託番号は以下に示す通りであ
る。Of these, three kinds of separated end fights were deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology. The display of the bacteria and the deposit number are as shown below.
【0049】Acremonium sp. Po−0
01 FERM P−14798 Acremonium sp. Po−023 FER
M P−15029 Epichloё sp. Po−048 FERM
P−15030 (4)スライドカルチャーによる菌糸の状態 スライドガラス上に厚さが2〜3mmのPDA培地を載
せ、その上で菌糸を増殖させて菌糸の形態と分生子の形
成とを調査した。なおこの培養は25℃暗条件下におい
て行なった。Acremonium sp. Po-0
01 FERM P-14798 Acremonium sp. Po-023 FER
MP-15029 Epicloё sp. Po-048 FERM
P-15030 (4) State of hyphae by slide culture A PDA medium having a thickness of 2 to 3 mm was placed on a slide glass, and hyphae were proliferated thereon to investigate the morphology of hyphae and the formation of conidia. This culture was performed under dark conditions at 25 ° C.
【0050】調査の結果、菌糸は総て無色であって、幅
が1〜2μmで総てに隔壁が観察された。分生子は、総
てのエンドファイトで容易に形成することが可能であっ
た。As a result of the examination, all the hyphae were colorless, and the partition walls were observed with a width of 1 to 2 μm. Conidia could be easily formed with all endophytes.
【0051】分生子は菌糸の先端あるいは側面より直立
した単生のフィアライドの先端に形成され、ほとんどが
単生の分生子であった。Conidia were formed at the tip of hyphae or the tip of monophyllic phialide standing upright from the side, and most of them were conidia.
【0052】分生子の色は総て無色で、細胞も1細胞性
であった。分生子の形状はほとんどが腎臓形の形状をな
し、大きさは3〜8×1〜3μmであった。また形成さ
れたフィアライドは、総て円筒形で、先端に行くに従っ
て細くなり、隔壁によって菌糸から区切られていた。All the conidia were colorless and the cells were unicellular. Most of the conidia had a kidney shape, and the size was 3 to 8 × 1 to 3 μm. Further, the formed phialides were all cylindrical, thinned toward the tip, and separated from the mycelium by partition walls.
【0053】(5)植物体からのアルカロイドの分析 FERM P−14798、FERM P−1502
9、FERM P−15030の各宿主植物から以下の
方法で、アルカロイドの分析を行なった。(5) Analysis of alkaloids from plants FERM P-14798, FERM P-1502
9, alkaloids were analyzed from each host plant of FERM P-15030 by the following method.
【0054】各植物の葉および葉鞘部分を凍結乾燥後、
100mgをサンプルとして乳鉢に入れて磨砕し、メタ
ノールとクロロホルムとをそれぞれ1.5mlずつ加え
て混合し、遠沈管へ回収した。18℃で30分間ゆっく
り混合し、この後にn−ヘキサンと水とをそれぞれ3m
lずつ加え、30分間撹拌した。次いで2000r.
p.m.で10分間遠心分離した。これによって有機層
と水とを分取した。After freeze-drying the leaves and leaf sheaths of each plant,
100 mg of a sample was put in a mortar and ground, and 1.5 ml each of methanol and chloroform was added and mixed, and collected in a centrifuge tube. Slowly mix at 18 ° C for 30 minutes, then add 3 m each of n-hexane and water.
l and stirred for 30 minutes. Then 2000r.
p. m. For 10 minutes. Thereby, the organic layer and water were separated.
【0055】分取した水層部分は3mlをBioRad
AG2×8とAnalytichem Blond
Elut CBAのカラムで精製し、濃縮後80%メタ
ノールを100μl添加し、メルクのシリカゲル60を
使用した薄層プレートに各サンプルを20μlずつ滴下
し、展開触媒として、クロロホルム:メタノール:酢
酸:水を20:10:1:1の割合で混合したものを使
用し、展開し、TLC(薄層クロマトグラフ)法により
分析を行なった。The water layer portion collected was 3 ml of BioRad.
AG2 × 8 and Analychem Blond
After purifying with an Elut CBA column, concentrating and adding 100 μl of 80% methanol, 20 μl of each sample was dropped on a thin-layer plate using Merck silica gel 60, and chloroform: methanol: acetic acid: water was used as a developing catalyst. The mixture was developed at a ratio of 10: 10: 1, developed, and analyzed by TLC (thin layer chromatography).
【0056】有機層部分は2mlをエッペンドルフチュ
ーブにサンプルを各500μlずつ入れ、遠心エバポレ
ータにて一度溶媒を完全に蒸散させた後に、クロロホル
ムで最終的に200μlに希釈した。希釈後に、薄層プ
レートにはメルクのシリカゲル60を使用し、各サンプ
ルを3μlずつ滴下し、展開溶媒として、クロロホル
ム:エタノールを9:1の割合で混合したものを使用
し、TLC法によって分析を行なった。For the organic layer portion, 2 ml of the sample was placed in an Eppendorf tube, 500 μl of each sample, and the solvent was completely evaporated with a centrifugal evaporator, and finally diluted with chloroform to 200 μl. After dilution, Merck silica gel 60 was used for the thin layer plate, 3 μl of each sample was dropped, and chloroform: ethanol mixed at a ratio of 9: 1 was used as a developing solvent, and analyzed by TLC. Done.
【0057】水層および有機層の抽出物は展開後に、U
Vで確認し、Ehrlich試液(p−ジメチルベンズ
アルデヒド1.0gを96%エタノールに溶解したも
の)とニトロソナフトール試液を用い、呈色反応とRf
値とを測定した。After the extraction of the aqueous layer and the organic layer, U
V, the color reaction and Rf were measured using Ehrlich reagent (1.0 g of p-dimethylbenzaldehyde dissolved in 96% ethanol) and nitrosonaphthol reagent.
And measured.
【0058】この結果、FERM P−14798、F
ERM P−15029、FERMP−15030の各
宿主植物からの水層抽出物は、Ehrlich試液を用
いた場合に青紫色のスポットが確認され、試薬による呈
色反応とRf値とからこれらがインドールアルカロイド
であることを確認した。As a result, FERM P-14798, F
Aqueous layer extracts from ERM P-15029 and FERMP-15030 host plants were confirmed to have blue-violet spots when the Ehrlich reagent was used, and these were indole alkaloids based on the color reaction with the reagent and the Rf value. I confirmed that there is.
【0059】またFERM P−14798、FERM
P−15029、FERM P−15030の各宿主
植物からの有機層抽出物は、Ehrlich試液を用い
た総ての植物から青紫色のスポットが、ニトロソナフト
ール試液を用いた場合に、FERM P−15030の
宿主植物からのみ赤紫色のスポットが同様の位置に確認
され、試薬による呈色反応からこれらがインドールアル
カロイドであることを確認した。FERM P-14798, FERM
The organic layer extract from each host plant of P-15029 and FERM P-15030 has a blue-violet spot from all the plants using the Ehrlich reagent, and when the nitrosonaphthol reagent was used, the organic layer extract of FERM P-15030 was obtained. A reddish purple spot was confirmed at the same position only from the host plant, and it was confirmed from the color reaction by the reagent that these were indole alkaloids.
【0060】(6)液体増殖培地 FERM P−14798、FERM P−1502
9、FERM P−15030をそれぞれ25℃の暗条
件下においてPDA培地で2カ月間培養後、コロニーを
直径が5mmのコルクボーラで取出し、300mlの振
とうフラスコにPD(ポテト デキストロース ブロー
ス)培地を100ml入れ、121℃で15分間滅菌し
たものに各フラスコに1個ずつ入れ、25℃で150
r.p.m.の往復振とうを行なった。(6) Liquid growth medium FERM P-14798, FERM P-1502
9. After culturing FERM P-15030 in PDA medium under dark conditions at 25 ° C. for 2 months respectively, colonies were taken out with a cork borer having a diameter of 5 mm, and 100 ml of PD (potato dextrose broth) medium was put into a shake flask of 300 ml. Put one in each flask in sterilized at 121 ℃ for 15 minutes, 150 ℃ at 25 ℃
r. p. m. Shaking was performed.
【0061】この結果総ての菌は、1カ月間でフラスコ
一杯に増殖した。As a result, all the bacteria grew in a flask in one month.
【0062】(7)植物体を用いた人工接種 分離したエンドファイト FERM P−14798、
FERM P−15029、FERM P−15030
を用いてブルーグラス中のケンタッキーブルーグラスへ
の人工接種を行なった。(7) Artificial inoculation using plants Endophyte FERM P-14798 isolated,
FERM P-15029, FERM P-15030
Was used to artificially inoculate Kentucky bluegrass in bluegrass.
【0063】ここで用いられた対象の植物は、次の通り
である。すなわちケンタッキーブルーグラスであって、
バロン、メリオン、ケンブルー、トロイのそれぞれ品種
を用いた。The target plants used here are as follows. I mean Kentucky Bluegrass,
The varieties of Baron, Merion, Kenblue and Troy were used.
【0064】また上記のエンドファイトは(6)項の方
法によって増殖した後に、フレッシュなPD培地へ移植
し、同条件下において5〜12日間培養したものを用い
た。接種はMS(Murashige−Skoog)培
地に3.0%シュークロスと0.7%ゲランガムとを加
えたMS基本培地において発芽させ、発芽1週間後に、
植物体にメスで切込みを入れ、(6)項で液体培養した
菌糸を10μl滴下した。The above endophyte was used after being grown by the method of item (6), transplanted to a fresh PD medium and cultured under the same conditions for 5 to 12 days. For inoculation, germination was performed in MS basic medium in which 3.0% shoe cloth and 0.7% gellan gum were added to MS (Murashige-Skoog) medium, and 1 week after germination,
The plant was incised with a scalpel, and 10 μl of the mycelium that had been liquid-cultured in item (6) was dropped.
【0065】これらを25℃および30℃の暗条件下で
数週間培養した後に、16時間照明下に移すかあるいは
直ちに16時間照明下に移して培養し、緑色に成長して
きた個体を同組成の培地に移植して1カ月間培養した。After culturing these under dark conditions of 25 ° C. and 30 ° C. for several weeks, they were transferred to 16 hours of illumination or immediately transferred to 16 hours of illumination and cultured, and individuals that had grown to green had the same composition. The cells were transferred to a medium and cultured for 1 month.
【0066】これらの個体に対して、(1)項の方法を
用いてエンドファイトの導入を確認した結果、FERM
P−14798、FERM P−15029、FER
MP−15030は総て植物への導入が確認された。ま
た感染効率は25℃よりも30℃の方が明らかに高かっ
た。As a result of confirming the introduction of the endophyte in these individuals using the method of (1), FERM
P-14798, FERM P-15029, FER
It was confirmed that all of MP-15030 were introduced into plants. The infection efficiency was clearly higher at 30 ° C than at 25 ° C.
【0067】(8)カルスを用いた人工接種 人工接種用の試料として、ケンタッキーブルーグラスの
カルス誘導を行なった。材料はケンタッキーブルーグラ
ス中のバロン、メリオン、ケンブルー、トロイの各品種
を使用し、MS基本培地に2.0mg/lのPIC(ピ
クロラム)と0.2mg/lのBAP(6−ベンジルア
ミノプリン)を添加し、カルス誘導培地とした。(8) Artificial inoculation using callus Callus induction of Kentucky bluegrass was performed as a sample for artificial inoculation. The materials used were Baron, Merion, Kenblue and Troy varieties in Kentucky Bluegrass, and 2.0 mg / l PIC (picloram) and 0.2 mg / l BAP (6-benzylaminopurine) were added to MS basic medium. ) Was added to give a callus induction medium.
【0068】MS培地において発芽直後の種子をカルス
誘導培地へ移植し、25℃の暗条件下において2カ月間
培養することにより、再分化能を有するカルスを得た。Seeds immediately after germination in MS medium were transplanted to a callus induction medium and cultured under dark conditions at 25 ° C. for 2 months to obtain callus having redifferentiation ability.
【0069】FERM P−14798、FERM P
−15029、FERM P−15030を用いて、ケ
ンタッキーブルーグラスのカルスを用いた人工接種を行
なった。各カルスは上述の誘導培地で誘導したものであ
って、得られたカルスを植物ホルモン無添加のMS基本
培地へ移植した。FERM P-14798, FERM P
-15029 and FERM P-15030 were used for artificial inoculation using callus of Kentucky bluegrass. Each callus was induced in the above-mentioned induction medium, and the obtained calli were transplanted to an MS basic medium without a plant hormone.
【0070】そして移植後直ちにカルスをメスで切断
し、(6)項で増殖させた菌糸を1カルス当り50μl
滴下した。Immediately after the transplantation, the callus was cut with a scalpel, and the mycelia grown in the item (6) were added in an amount of 50 μl per callus.
It was dropped.
【0071】カルスは25℃および30℃の暗条件下で
それぞれ数週間培養した後に、16時間照明下に移すか
あるいは直ちに16時間照明下に移して培養し、再生し
てできた個体をフレッシュなMS培地に移植し、1カ月
間培養した。これらを(1)項の方法を用いてエンドフ
ァイトの導入を確認した結果、FERM P−1479
8、FERM P−15029、FERM P−150
30は総ての品種で導入が確認された。Callus was cultivated under dark conditions of 25 ° C. and 30 ° C. for several weeks, and then either transferred under illumination for 16 hours or immediately transferred under illumination for 16 hours for culturing, and regenerated individuals were kept fresh. It was transplanted to MS medium and cultured for 1 month. As a result of confirming the introduction of the endophyte using the method of the item (1), FERM P-1479
8, FERM P-15029, FERM P-150
The introduction of 30 was confirmed in all varieties.
【0072】また(8)項と同様の方法を用い、FER
M P−14798とFERM P−15030の2種
類の菌をケンタッキーブルーグラスの品種バロンへ導入
した。導入された植物体から菌糸を分離し、培養した結
果、菌叢が若干異なる2種類の菌が分離検出された。Further, using the same method as the item (8), FER
Two types of bacteria, MP-14798 and FERM P-15030, were introduced into Kentucky bluegrass variety Baron. As a result of separating the mycelium from the introduced plant and culturing, two types of bacteria with slightly different flora were separated and detected.
【0073】これらをPCR法を用いて分析した結果、
FERM P−14798 とFERM P−1503
0特有のバンドパターンと同様のパターンを示し、2種
類のエンドファイトを導入したケンタッキーブルーグラ
スから2種類のエンドファイトの共生が確認された。As a result of analyzing these using the PCR method,
FERM P-14798 and FERM P-1503
A band pattern similar to that of 0 was shown, and symbiosis of two types of endophytes was confirmed from Kentucky bluegrass into which two types of endophytes were introduced.
【0074】(9)分生子の大量生産 液体培地で分生子の形成が確認されるFERM P−1
4798を用い、分生子の大量生産を行なった。FER
M P−14798を(6)項と同様の方法によって培
養し、フレッシュなPD培地に移植し、分生子の形成能
がピークに達する5〜12日後に培養液を20ml取出
し、20μmのメッシュを2枚重ねしたもので不要な菌
糸を除去し、瀘液を10mlの遠沈管に入れて1000
r.p.m.で10分間遠心分離した。遠心分離の後の
上清み液を捨てて1mlのPD培地を添加し、分生子懸
濁液を得た。(9) Mass production of conidia FERM P-1 confirmed to form conidia in a liquid medium
4798 was used for mass production of conidia. FER
MP-14798 was cultured by the same method as in (6), transplanted to a fresh PD medium, and 5 to 12 days after the conidial formation ability reached its peak, 20 ml of the culture solution was taken out, and a 20 μm mesh was used to Unnecessary hyphae are removed with a stack of layers, and the filtrate is put into a 10 ml centrifuge tube for 1000
r. p. m. For 10 minutes. The supernatant after centrifugation was discarded, and 1 ml of PD medium was added to obtain a conidium suspension.
【0075】(10)分生子を用いた接種法 FERM P−14798の分生子懸濁液を(8)項の
カルス接種法を用いてケンタッキーブルーグラス中の品
種バロン、メリオン、ケンブルー、トロイにそれぞれ人
工接種を行なった。得られたそれぞれの個体を(1)項
の方法で検定した結果、高頻度にエンドファイト導入個
体が確認され、それらは菌糸を用いた接種法である
(8)項の方法と比較しても大きな有意差が認められ
た。(10) Inoculation method using conidia FERM P-14798 conidial suspension was cultivated in Kentucky bluegrass using the callus inoculation method described in (8) to produce varieties Baron, Merrion, Kenblue and Troy. Each was artificially inoculated. As a result of assaying each obtained individual by the method of (1), endophite-introduced individuals were confirmed at high frequency, and even if compared with the method of (8) which is an inoculation method using hyphae. A significant difference was recognized.
【0076】(11)酵素免疫測定法(ELISA)に
よるエンドファイトの検出 (7)項、(8)項、および(9)項の人工接種法によ
ってエンドファイトが確認された植物体の葉片から次の
ような方法でエンドファイトの検出を行なった。(11) Detection of endophyte by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) From leaf pieces of a plant in which endophyte was confirmed by the artificial inoculation method described in (7), (8), and (9), The end fight was detected by the following method.
【0077】植物の外植片の生重量の0.5gに緩衝液
を入れ、乳鉢で磨砕し、抽出液を得た。50μlの抽出
液をマイクロプレートのウェルへ入れ、室温において3
0分間吸着させた。そして未結合の抗原を洗浄した。A buffer solution was added to 0.5 g of the fresh weight of the explant of the plant and ground in a mortar to obtain an extract. Add 50 μl of the extract to the wells of a microplate and
The adsorption was performed for 0 minutes. Then, the unbound antigen was washed.
【0078】ウェル内をブロッキング液(3%脱脂粉乳
溶液)で満たし、30分後に洗浄した。また抗エンドフ
ァイトのウサギ抗血清(1次抗体)をウェルに加え、室
温で60分間反応させた。そして未結合の抗体を洗浄し
た。The inside of the well was filled with a blocking solution (3% skim milk powder solution) and washed 30 minutes later. Further, anti-endophyte rabbit antiserum (primary antibody) was added to the wells and reacted at room temperature for 60 minutes. Then, the unbound antibody was washed.
【0079】希釈した2次抗体(アルカリホスファター
ゼ標識したヤギ抗ウサギIgG抗体)をウェルに加え、
室温で60分間反応させた。未結合の抗体を洗浄した。
この後に基質溶液にウェルを加え、アルカリホスファタ
ーゼ反応を起させた。そして0.5NのNaOHで反応
を停止し、405nmの波長で吸光度を測定した。A diluted secondary antibody (goat anti-rabbit IgG antibody labeled with alkaline phosphatase) was added to the wells,
The reaction was performed at room temperature for 60 minutes. Unbound antibody was washed out.
Thereafter, wells were added to the substrate solution to cause an alkaline phosphatase reaction. Then, the reaction was stopped with 0.5N NaOH, and the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm.
【0080】この結果(7)項、(8)項、および
(9)項で作出したエンドファイト導入個体の全てから
呈色反応が確認され、これらのエンドファイトのケンタ
ッキーブルーグラスへの導入が証明された。As a result, a color reaction was confirmed from all of the endophyte-introduced individuals produced in (7), (8), and (9), and the introduction of these endophytes into Kentucky bluegrass was proved. Was done.
【0081】(12)シバツトガによる抵抗性検定 (8)項によりエンドファイトFERM P−1479
8を導入したケンタッキーブルーグラス(品種バロン)
(以下KB−Baron 14798という)を用い、
シバツトガに対する抵抗性検定を行なった。(12) Resistance test with shibatatoga Endophite FERM P-1479 according to item (8).
Kentucky Bluegrass with 8 introduced (variety Baron)
(Hereinafter referred to as KB-Baron 14798),
A resistance test against grasshopper was carried out.
【0082】KB−Baron 14798は接種後2
カ月目の個体を馴化し、対照区として接種を行なってい
ないバロンの種子を70%エタノールに10秒間浸漬
し、次に2.5%次亜塩素酸ナトリウム水溶液に10分
間浸漬した後に、滅菌水で3回洗浄し、風乾し、MS基
本培地に移植し、発芽後2カ月間培養したものを馴化し
て使用した。KB-Baron 14798 was 2 after inoculation
Baron seeds that had not been inoculated as a control were soaked in 70% ethanol for 10 seconds, then immersed in 2.5% sodium hypochlorite aqueous solution for 10 minutes, and then sterilized water. The cells were washed 3 times with the above, air-dried, transplanted to MS basic medium, and cultured for 2 months after germination, which was acclimated and used.
【0083】これらの材料を20×30×10cmのプ
ラントボックス内に培養土を高さ8cmのところまで入
れ、材料を20個体ずつ植込み、温室内にて120日間
管理した。120日後にシバツトガの卵を70%エタノ
ールに10秒間浸漬し、滅菌水で3回洗浄し、風乾させ
たものを各プラントボックスに約200粒ずつ播いた。Each of these materials was placed in a plant box of 20 × 30 × 10 cm with a culture soil up to a height of 8 cm, and 20 individuals of each material were planted and managed in a greenhouse for 120 days. After 120 days, the eggs of the grasshopper were soaked in 70% ethanol for 10 seconds, washed with sterilized water three times, and air-dried, and about 200 seeds were sown in each plant box.
【0084】この結果、卵は1週間でふ化し、食害が始
まった。シバツトガの幼虫は始めKB−Baron 1
4798と対照区の双方を食害したが、エンドファイト
が存在するKB−Baron 14798は食害が止ま
り、対照区が3〜4日間で完全に食害されたのに対し、
KB−Baron 14798は初期の食害だけであっ
た。As a result, the eggs hatched in 1 week and feeding damage started. The larvae of Shibattoga started from KB-Baron 1
Both 4798 and control were eaten, but KB-Baron 14798 with endophyte stopped eating and the control was completely eaten in 3 to 4 days.
KB-Baron 14798 was the only early feeding damage.
【0085】(13)葉枯れ病に対する抵抗性検定 ケンタッキーブルーグラスに発生した葉枯れ病より分離
した病原菌Drechslera sp. 、Curv
ularia sp. 、およびBipolaris
sp. をそれぞれPDA培地上で2週間培養し、菌叢
の表面に形成された分生子をニードルでかき取り、滅菌
水に懸濁して5000〜10000個/mlに濃度を調
整した。(13) Assay for resistance to leaf blight Drechslera sp., A pathogen isolated from leaf blight occurring in Kentucky bluegrass , Curv
ularia sp. , And Bipolaris
sp. Was cultured on a PDA medium for 2 weeks, conidia formed on the surface of the microflora were scraped off with a needle, and suspended in sterile water to adjust the concentration to 5,000 to 10,000 cells / ml.
【0086】KB−Baron 14798は接種後2
カ月目の個体を、対照区は接種を行なっていないバロン
の種子を、70%エタノールに10秒間浸漬し、次に
2.5%次亜塩素酸ナトリウム水溶液に10分間浸漬し
た後、滅菌水で3回洗浄し、風乾した後、MS基本培地
に移植し、発芽後2カ月間培養したものを6×6×10
cmのプラントボックスに滅菌した培養土を入れ、材料
を10個体ずつ植込み、2週間培養を行なった。KB-Baron 14798 was 2 after inoculation
In the control group, the non-inoculated baron seeds were soaked in 70% ethanol for 10 seconds, and then in 2.5% sodium hypochlorite aqueous solution for 10 minutes. After washing 3 times, air-drying, transplanting to MS basic medium, and culturing for 2 months after germination, 6 × 6 × 10
Sterilized culture soil was placed in a cm plant box, 10 materials were planted each, and the culture was performed for 2 weeks.
【0087】病原菌の接種は、植物体の表面全体に噴霧
あるいは塗布し、28℃で16時間日長条件下で1カ月
間培養した。The pathogen was inoculated by spraying or coating on the entire surface of the plant and culturing at 28 ° C. for 16 hours with a photoperiod of 1 month.
【0088】この結果総ての菌でエンドファイトの含有
しない対照区は、接種1週間目から葉の先端から葉腐れ
が始まり、3週間で植物体は完全に枯死したのに対し、
エンドファイトを含有するKB−Baron 1479
8は、葉に直径2mmほどの感染初期の黒色のスポッ
ト、および葉の先端1cm程度の葉枯れが検出された
が、その後の病斑の広がりはほとんどなく、Drech
slera sp. 、Curvularia s
p.、およびBipolaris sp.による葉枯れ
病の発生に対して、明らかに有意な差が見られた。As a result, in the control group in which all the bacteria did not contain endophyte, leaf rot started from the tip of the leaf 1 week after the inoculation and the plant completely died within 3 weeks, whereas
KB-Baron 1479 containing Endophyte
In No. 8, a black spot with a diameter of about 2 mm in the early stage of infection and a leaf withering of about 1 cm at the tip of the leaf were detected, but there was almost no spread of lesions after that, and Drech
slera sp. , Curvularias
p. And Bipolaris sp. There was a clear significant difference in the occurrence of leaf blight caused by the disease.
【0089】(14)さび病に対する抵抗性検定 黒さび病に感染したケンタッキーブルーグラスの葉に形
成された夏胞子を、5×5mmの湿った瀘紙の上に付着
させた。夏胞子のついた瀘紙を(12)項と同様の方法
にて調整したKB−Baron 14798および対照
区の植物の葉に貼付け、接種を行なった。接種した植物
は湿度の高い20℃、暗条件下で12時間インキュベー
トした後、16時間照明下に移し、3週間培養した。(14) Assay for resistance to rust The spores formed on the leaves of Kentucky bluegrass infected with black rust were adhered to a 5 × 5 mm damp paper. A paper filter with summer spores was attached to leaves of KB-Baron 14798 and control plants prepared in the same manner as in (12), and inoculated. The inoculated plants were incubated for 12 hours in a humid, 20 ° C., dark condition, then transferred to light for 16 hours, and cultured for 3 weeks.
【0090】この結果接種10日後に、KB−Baro
n 14798および対照区の双方の葉の表面に夏胞子
堆が形成された。その後対照区は、2週間で植物体全体
が2次的に形成された大量の夏胞子堆で覆われたのに対
して、KB−Baron 14798においては、新た
に形成された夏胞子堆は極少量で植物体全体が夏胞子堆
で覆われることはなく、病徴の発生に明らかに有意な差
が見られた。As a result, 10 days after the inoculation, KB-Baro was used.
n. spores were formed on the surface of the leaves of both n 14798 and the control. After that, in the control section, the whole plant body was covered with a large amount of summer spore stacks formed secondarily in 2 weeks, whereas in KB-Baron 14798, the newly formed summer spore stacks were very polar. A small amount did not cover the whole plant with summer spore deposits, and there was a significant difference in the occurrence of symptom.
【0091】[0091]
【発明の効果】以上のように本発明は、糸状菌から成る
共生菌、すなわちエンドファイトが存在しないブルーグ
ラスにエンドファイトを人為的に導入して成るブルーグ
ラスおよび人為的にブルーグラスに対してエンドファイ
トを導入する方法に関するものである。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, according to the present invention, a symbiotic bacterium consisting of a filamentous fungus, that is, a bluegrass obtained by artificially introducing endophyte into a bluegrass in which endophyte does not exist, and an artificial bluegrass It is about how to introduce End Fight.
【0092】従って本発明によれば、ブルーグラスに対
してエンドファイトを導入し、ブルーグラス内において
エンドファイトを共生させることにより、少なくとも耐
虫性および耐病性を付与することが可能になる。従って
ブルーグラスの形質改善が図られるとともに、優れた形
質を有する有用なブルーグラスの提供が可能になる。Therefore, according to the present invention, at least insect resistance and disease resistance can be imparted by introducing the endophyte into the bluegrass and causing the endophyte to coexist in the bluegrass. Therefore, the traits of bluegrass can be improved, and useful bluegrass having excellent traits can be provided.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:645) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Office reference number FI technical display location C12R 1: 645)
Claims (6)
糸状菌から成る共生菌を人為的に導入して成るブルーグ
ラス。1. A bluegrass obtained by artificially introducing a symbiotic bacterium comprising a filamentous fungus into an individual in which a symbiotic bacterium comprising a filamentous fungus does not exist.
cremonium sp. Po−001、Acre
monium sp. Po−023、またはEpic
hloё sp. Po−048(生工研寄託菌 FE
RM P−14798、FERM P−15029、ま
たはFERM P−15030)であることを特徴とす
る請求項1の記載のブルーグラス。2. The symbiotic bacterium introduced into the bluegrass is A
cremonium sp. Po-001, Acre
monium sp. Po-023, or Epic
hloё sp. Po-048 (Deposited Bacteria of RIETI FE
RM P-14798, FERM P-15029, or FERM P-15030), The bluegrass according to claim 1.
を分離して人工増殖する工程と、 人工増殖された共生菌をブルーグラスに人工接種する工
程と、 人工接種された共生菌をブルーグラスに共生させて感染
させる工程と、 をそれぞれ具備するブルーグラスへの共生菌の導入方
法。3. A step of isolating and artificially growing a symbiotic bacterium comprising a filamentous fungus that is symbiotic with a plant, a step of artificially inoculating bluegrass with the artificially symbiotic bacterium, and the artificially inoculated symbiotic bacterium. A method of introducing symbiotic bacteria into bluegrass, which comprises the steps of coexisting with bluegrass to infect.
接種することを特徴とする請求項3に記載のブルーグラ
スへの共生菌の導入方法。4. The method of introducing symbiotic bacteria into bluegrass according to claim 3, wherein conidia of the symbiotic bacteria are artificially inoculated in the inoculating step.
Acremonium sp. Po−001、Acr
emonium sp. Po−023、またはEpi
chloё sp. Po−048(生工研寄託菌 F
ERM P−14798、FERM P−15029ま
たはFERM P−15030)であることを特徴とす
る請求項3に記載のブルーグラスへの共生菌の導入方
法。5. A symbiotic bacterium artificially inoculated into the bluegrass is Acremonium sp. Po-001, Acr
emonium sp. Po-023, or Epi
chloё sp. Po-048 (Strain deposited by the Institute of Industrial Science and Technology F
ERM P-14798, FERM P-15029 or FERM P-15030), The method for introducing a symbiotic bacterium into bluegrass according to claim 3, wherein
を人工的に導入することを特徴とする請求項3に記載の
ブルーグラスへの共生菌の導入方法。6. The method for introducing a symbiotic bacterium into bluegrass according to claim 3, wherein one symbiotic bacterium or two or more symbiotic bacterium is artificially introduced.
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7228506A JPH0951734A (en) | 1995-08-14 | 1995-08-14 | Bluegrass and introduction of symbiotic microorganism into bluegrass |
US08/661,774 US5880343A (en) | 1995-06-15 | 1996-06-11 | Grass and method of introducing endophytic fungi into a grass |
DE69623203T DE69623203T2 (en) | 1995-06-15 | 1996-06-13 | Grass and method of introducing endophytic fungi |
EP96304422A EP0753259B1 (en) | 1995-06-15 | 1996-06-13 | A grass and method of introducing endophytic fungi into a grass |
US09/219,829 US6180855B1 (en) | 1995-06-15 | 1998-12-23 | Method of introducing endophytic fungi into a grass |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7228506A JPH0951734A (en) | 1995-08-14 | 1995-08-14 | Bluegrass and introduction of symbiotic microorganism into bluegrass |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0951734A true JPH0951734A (en) | 1997-02-25 |
Family
ID=16877516
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7228506A Pending JPH0951734A (en) | 1995-06-15 | 1995-08-14 | Bluegrass and introduction of symbiotic microorganism into bluegrass |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0951734A (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5914107A (en) * | 1996-09-27 | 1999-06-22 | Mayekawa Manufacturing Co., Ltd. | Method of introducing an endophytic fungus into rough bluegrass belonging to Poa trivialis and Poa compressa |
JP2001231365A (en) * | 2000-02-22 | 2001-08-28 | Japan Forage Seed Association | Italian ryegrass infected with mycorrhizal fungus and introducing method of the mycorrhizal fungus into the italian ryegrass |
-
1995
- 1995-08-14 JP JP7228506A patent/JPH0951734A/en active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5914107A (en) * | 1996-09-27 | 1999-06-22 | Mayekawa Manufacturing Co., Ltd. | Method of introducing an endophytic fungus into rough bluegrass belonging to Poa trivialis and Poa compressa |
JP2001231365A (en) * | 2000-02-22 | 2001-08-28 | Japan Forage Seed Association | Italian ryegrass infected with mycorrhizal fungus and introducing method of the mycorrhizal fungus into the italian ryegrass |
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A521 | Written amendment |
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