【発明の詳細な説明】
ランチオニン含有抗菌化合物
本発明は、概して、バクテリア株スタフィロコッカス・ハイカス(Staphyloco
ccus・hyicus)株664 の培養基から得られるランチオニン(lanthionine)−含有
抗菌(antimicrobial)ペプチド、医薬として許容されるその酸付加塩、及びその
ペプチドの製造方法に関する。本発明は、さらに、本発明に係るランチオニン含
有抗菌ペプチドを含んで成る医薬組成物、及びその組成物の製造方法に関する。
本発明に係るランチオニン含有ペプチド又はその酸付加塩は、医薬剤としてであ
るが、特にウシ乳房炎(bovine mastitis)の治療又は防止における治療剤(抗−
乳房炎薬)として使用されることができる。乳頭(Teat)浸漬薬も包含される。
広い活性スペクトルを示す多数の抗菌ペプチドが、文献中に記載されている。
これらの中で、ランチオニン含有ペプチドは、興味ある抗菌薬群を提示する。な
ぜなら、それらは、バクテリア病原体に対して広い活性スペクトルを示すからで
ある。典型的な代表は、ズブチリン(subtilin)、シナマイシン(cinamycin)、
ニジン(nisin)、デュラマイシン(duramycin)、アンコベニン(ancovenin)、Ro 0
9-0198、pep5、ガリデルミン(gallidermin)及びエピデルミン(epidermin)である
。これらのペプチドのいくつかは、ウシ乳房炎を引き起こすものを含む多くのバ
クテリアに対して高い活性をもつ。例えば、ニジンは、食品産業及び化粧製剤に
おける保存料として既に使用されている。ペプチド抗菌剤は、それらが消費者に
より消化されるという利点をもち、そしてこれが、それらを温血動物に対して無
毒なものにしている。このように、これらのペプチド抗菌化合
物のいくつかは、既に乳房炎処置における使用について提案されており、そして
その乳中に残るいずれの残渣も、ヒトの健康に対するリスクを全く課すはずがな
い。
乳房炎は、哺乳類の乳腺の炎症性疾患である。獣医薬においては、最も重要で
、かつ、最も頻発に遭遇する乳房炎は、乳牛(dairy cows)のものである。乳牛
は、乳生産のために高く特殊化されている。それらは、子ウシを養うのに必要で
あるよりもかなり多量の乳を生産する。その超生産、及び24時間の間に2回又は
多くとも3回乳牛を乳絞りする慣習は、それらの乳腺をバクテリア感染に対して
感受性なものにする。さらに、それらは、牛から牛に渡される機械装置により乳
絞りされ、そしてその感染が、動物から動物へ伝播される。
乳腺は、バクテリア病原体に対して多くの天然の防御機構をもっている(Cullo
r et al.,1990)。これらは、高レベルのバクテリア負荷、そしてまたその防御
機構の妥協により打ち負かされることができる。この妥協は、管理の悪さにより
、又は泌乳サイクルにおける特定時における生理学的変化を通じてもたらされる
ことができる(Cullor et al.,1990)。乳が出ない(drying off)及び分娩付近
の期間は、相対的に高い乳房炎の発病率と関連する。
乳房炎は、多くの種のバクテリアにより引き起こされることができる。ウシ乳
房炎において最も一般的に含意されるものは、2つのカテゴリーIとIIに分類さ
れる:カテゴリーIは、宿主病原体、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス
(Staphylococcus aureus)とストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus
agalactiae)を包含する。これらは、乳房(udder)の皮膚上又は乳房内で生き、
そして個々のウシは、群の中の他への感染源である。カテゴリーIIは、環境的病
原体、例えば、ストレプトコッカス・ウベリス(St
reptococcus uberis)及び大腸菌(Escherichia coli)を包含する。それらの名
が示唆するように、これらのカテゴリーIIのバクテリアは、乳牛の間近の環境に
見い出され、そしてこれ故、一定のリスクを提示する(Cullor et al.,1990)。
先に特徴付けられたバクテリアにより引き起こされる乳房炎は、臨床的又は亜
臨床的な疾患のいずれかとして顕示されることができる(Cullor et al.,1990)
。臨床的疾患は、乳中の感染により緩やかに罹患した乳房区(quarters)から、
その乳房区の来たるべき損失を伴うかなり感染した乳房区を通って、死ぬかもし
れない全身に罹患したウシまで、変化することができる。より緩やかな提示が、
より普通である。
亜臨床的な乳房炎は、その名が示唆するように、明白には存在しない。しかし
ながら、それは、多くの乳群にひじょうに行き渡る。亜臨床的に罹患した乳房区
は、バクテリアが存在し、そして乳のその細胞含量は、正常よりも大きい。この
徴候はより低い生産を伴う。実際に、乳房炎による農場主のもつ経済的損失の70
%超が、亜臨床的な疾患からの生産減に帰されることができると推定されている
(Philpot,W.N.,1984)。
近年、乳房炎は、乳絞りにおける徹底的な衛生の経験を通じて、慣性的な亜臨
床的な感染ウシの検出し、そして非感染ウシの後にそれらを乳絞りするか又はさ
らにその群からそれらを排除するかのいずれかにより、管理されている。臨床ケ
ースは、一般的に、それらが生じたとき抗生物質により処置される。これは、乳
が販売から回収されなければならず、そして結果として農場主に経済的損失を生
じさせることを意味する。亜臨床的な乳房炎の抗菌療法は、乳の出ない期間に行
われなければならない。結果として、感染の確立と乳の出ない間の期間にわたり
、感染ウシは、彼女の隣のものに対して
脅威となる。
それ故、本発明の目的は、特にウシ、そしてより特に、乳の出ない期間にない
ウシにおける乳房炎の治療又は防止において有利に使用されることができる抗菌
化合物を提供することである。
この目的は、驚ろくべきことに、医薬剤として使用されることができるが、ウ
シ乳房炎の治療において特に有用であると証明されることができるランチオニン
含有抗菌ペプチド又は医薬として許容されるその酸付加塩をさらに提供すること
により、本発明の範囲内に落ちた。ハイシンM51(hyicin M51)とも命令された
本発明に係るランチオニン含有抗菌ペプチドは、例えば、慣用のカラム・クロマ
トグラフィーの一連の段階を使用してバクテリア株スタフィロコッカス・ハイカ
ス(Staphylococcus hyicus)株664 の培養基から得られることができる。それは
、約2119±2ダルトンの分子量をもち、そしてトリプシンにより解裂されること
ができ、それぞれ、約1256±2ダルトンと約881 ±2ダルトンの分子量の2つの
断片が得られる。
それ故、本発明は、バクテリア株スタフィロコッカス・ハイカス(Staphylococ
cus hyicus)株664 の培養基から得ることができるランチオニン含有抗菌ペプチ
ド、又は医薬として許容されるその酸付加塩;好適な担体に加えてそのペプチド
を含んで成る抗菌又は医薬組成物、並びにそのペプチド及びその組成物の製造方
法に関する。本発明は、さらに、哺乳類における乳房炎を治療又は防止するため
の又は哺乳類における乳房炎を治療又は防止するための薬物の製造のための本発
明に係るペプチド及び組成物の使用を含む。最後に、本発明は、本発明に係るラ
ンチオニン含有抗菌ペプチド又は医薬として許容されるその酸付加塩の医薬とし
ての有効量をその哺乳類に投与することを含む哺乳類における乳房炎の治療又は
防止方法を企
図する。
本発明の好ましい態様においては、本発明に係る抗菌ペプチドは、
(a)そのペプチドを生産するのに適当な培地中で、そして時間にわたりバク
テリア株スタフィロコッカス・ハイカス株664 のカルチャーを増殖させ、
(b)タンパク質精製の慣用技術を適用してその培養基からそのペプチドを精
製し、そして
(c)その活性画分を乾燥させる、
ことにより調製される。
バクテリアは、第1段階において、そのバクテリアを熱失活させるのに十分な
時間にわたり、50℃と80℃の間であるが、好ましくは、60℃と70℃の間の温度に
そのカルチャーを晒すことにより、熱失活される。例えば、65℃の場合には、30
〜40分間の暴露で十分であろう。熱失活の後、バクテリアを濾過又は遠心分離を
用いてその培養基から除去し、そして清澄化した上清を、第1クロマトグラフィ
ー・カラムに適用する。あるいは、カラム材料を、そのバクテリアの事前除去に
よらずにそのバクテリアカルチャーに直接的に添加することができる。クロマト
グラフィー材料へのそのペプチドの吸着を許容するのに十分な時間の後、その樹
脂を、濾別し、洗浄し、そしてカラムに充填する。本発明の好ましい態様におい
ては、Amberlite XAD-7(Sigma)が使用される。この場合、1〜3時間にわたる
その樹脂の存在中でのそのカルチャーの撹拌が、その樹脂へのそのペプチドの効
率的な吸着を保証し、これを、濾過後、水及び、20%〜30%イソプロパノールを
含むクエン酸Naの溶液で洗浄する。カラム内へのその樹脂の充填後、そのペプチ
ドを、例えば、Amberlite XAD-7 樹脂の場合には40%〜50%イソプロパノールを
含むクエン酸
Naの溶液を使用してその樹脂から溶離される。活性画分をプールし、そしてさら
にクロマトグラフィー材料、例えば、SP Sepharose Fast Flow(Pharmacia)を使
用して同様のやり方で精製する。保存目的のために、本抗菌ペプチドを含む画分
をプールし、そして凍結乾燥させることが好ましい。
本ペプチドが分析目的のために使用される場合、それは、例えば、HPLCを使用
してさらに精製されることができる。本発明の好ましい態様においては、RP-HPL
C が、UV検出により本タンパク質をモニタリングしながらVydac C18 カラム上で
行われる。Vydac C18 カラム上でのRP-HPLC の場合には、本発明に係るペプチド
は、0.1%TFA 中のアセトニトリルの線形グラジエントを適用してそのカラムか
ら溶離されることができ、その溶離の後に、真空遠心分離を適用しての活性画分
の乾燥が続く。
精製されたハイシンM51は、バクテリア、特に、哺乳類のそして好ましくはウ
シの乳房炎に一般に関係するバクテリアに対して、強い抗菌活性を示す。このよ
うなバクテリアは、非限定的に、スタフィロコッカス・アウレウス V557(Stap
hylococcus aureus V557)、スタフィロコッカス・アウレウス・ニューボールド
305(Staphylococcus aureus Newbould 305)、ストレプトコッカス・ウベリス
(Strepyococcus uberis)、ストレプトコッカス・ファエカリス(Streptococcu
s faecalis)、パスツーレラ.ハエモリティカ(Pasteurella haemolytica)、リ
ステリア・イノキュア(Listeria innocua)、バチルス・セレウス(Bacillus ce
reus)、マイクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、及びリューコノ
ストック・メセンテロイド(Leuconostoc mesenteroides)を含み、そしてこれら
のバクテリアについての最小阻害濃度(Minimal Inhibitory Concentrations(MI
Cs)は、0.01g/ml〜 100g/ml、好ましくは、0.05
g/ml〜50g/ml、そして最も好ましくは、0.1g/ml〜10g/mlのレンジ内に
ある。
ハイシンM51のアミノ酸配列分析は、そのN−末端Ile 後の第2アミノ酸が、
そのN−末端の端からのさらなる配列分析を遮断する異常なアミノ酸であるとい
う事実により複雑になる。それ故、そのアミノ酸配列は、質量分析、NMR スペク
トル、及びDNA 配列決定から得られた実験データの組合せにより決定されなけれ
ばならない。決定された配列は、ランチオニン−含有ペプチド・ガリデルミン(g
allidermin)(EP-342486-A1)に高い相同性をもち、それは、約2164±2ダルトン
の分子量をもつ。以下のハイシンM51のペプチド構造が、アミノ酸配列分析によ
り明らかにされる:
{配列中、Xaa1,Xaa2,とXaa3は、いずれかのアミノ酸であることができる。但
し、そのペプチド全体の分子量は、2119±2ダルトンである。}。本発明の好ま
しい態様においては、Xaa1とXaa3は、2,3−ジデヒドロブチリン(2,3−Didehy
drobutyrin(Dhb))であり、そしてXaa2は、2,3−ジデヒドロアラニン(2,3−Di
dehydroalanine(Dha))である。
ハイシンM51の他の構造は:
{構造中、Xaa1,Xaa2、及びXaa3は、いずれかのアミノ酸であることができる。
但し、Xaa1,Xaa2、とXaa3は、同一ペプチド内で、それぞれ、Ala,Lys、とα,
β−ジデヒドロブチル酸であってはならない。}である。
本発明は、好適な担体に加えて、抗菌有効量において本発明に係るランチオニ
ン含有抗菌ペプチドを含んで成る抗菌組成物にも関する。より特に、本発明は、
好適な担体に加えて、医薬として有効な量の、本発明に係るランチオニン含有抗
菌ペプチド又は医薬として許容されるその酸付加塩を含んで成る医薬組成物に関
する。本発明の好ましい態様においては、好ましくはウシである哺乳類における
乳房炎の治療及び防止のために、医薬組成物であって、好適な担体に加えて、医
薬として有効な量の本発明に係る抗菌化合物又は医薬として許容されるそれらの
酸付加塩の中の1を含んで成るものが、提供される。
スタフィロコッカス・ハイカス株664 内で、本発明に係るランチオニン含有抗
菌ペプチドのプレペプチド形態は、核酸分子によりコードされている。このプレ
ペプチドの構造遺伝子は、バクテリアの
DNA によりコードされており、一方、そのプレペプチドの翻訳のための鋳型は、
RNA から成る。それ故、本ランチオニン含有抗菌ペプチド又はその対応プレペプ
チドをコーディングする核酸分子は、本発明の他の態様を構成する。好ましくは
、この核酸分子は、以下のヌクレオチド配列:
又は以下のヌクレオチド配列:
を含んで成る。
本発明に係る核酸分子は、以下の:
(a)ある微生物内で、スタフィロコッカス・ハイカス株664 のゲノム・ライ
ブラリーを構築し;
(b)ガリデルミンの構造遺伝子に相同性をもつ配列について上記ライブラリ
ーをスクリーニングし;
(c)ハイシンM51の構造遺伝子を含んで成るクローンを同定し;そして
(d)その同定されたクローンからその核酸分子を精製する、
を含む方法により得られることができる。
そのゲノム・ライブラリーの構築のために、スタフィロコッカス・ハイカス株
664 の染色体DNA を、制限酵素により部分的に又は完全に消化する。完全制限消
化の場合、好適な制限酵素は、好ましくは、ハイシンM51遺伝子のコーディング
領域内を切断しない。得られた制限断片を、制限消化直後か又は任意的サイズ分
別段階の後の
いずれかにおいて、プラスミド・ベクターにライゲートする。プラスミド・ベク
ター内にクローン化されたさまざまなDNA 断片の得られたコレクションを、その
後に、微生物内に形質転換する。好ましくは、使用される微生物は、大腸菌(E.
coli)又はバクテリオファージ感染大腸菌(E.coli)である。
得られたゲノム・ライブラリーを、ガリデルミンの構造遺伝子に相同性をもつ
配列についてスクリーニングするために使用することができる。好適な核酸プロ
ーブとのハイブリダイゼーションを使用するスクリーニング手順は、Maniatis e
t al.中に記載されている。好適なプローブを、ガリデルミン遺伝子の制限消化
により又はポリメラーゼ連鎖反応を使用したガリデルミン遺伝子の規定領域の増
幅により、得ることができる。放射標識されたヌクレオチドの代わりに、非放射
性標識、例えば、ジゴキシゲニン(digoxigenin(DIG))標識付けされたヌクレオチ
ドを、このプローブのラベリングのために使用することができる。
上記ゲノム・ライブラリーの102〜106、そして好ましくは、103〜105クローン
を、上記ガリデルミン・プローブを用いてスクリーニングする。陽性クローン、
すなわち、使用したクローンとのハイブリダイゼーションを示すクローンを、そ
のクローンに含まれるクローン化されたDNA の精製及び配列決定によりさらに特
徴付けて、ハイシンM51ペプチドの構造遺伝子を同定する。
ハイシンM51の構造遺伝子を、微生物宿主内でハイシンM51を生産するために
バイオテクノロジーにおいて使用することができる。この目的のために、その宿
は、ハイシンM51内に見られる翻訳後修飾を行う酵素的からくりを備えていなけ
ればならない。いくつかのランチバイオティクス(lantibiotics)については、
多数の遺伝子がそれらの生産に関係することが示されている。それらの対応遺伝
子産物の正確な役割は全てのケースにおいて知られていないが、それらが、それ
らのタンパク質のプレ−形態のプロセッシングのために、ランチバイオティクス
内に典型的にある修飾の導入、並びにその膜を横切ってのそのタンパク質の輸送
のために、そして免疫のために、必要であるという証拠が在る。今日まで研究さ
れた全てのケースにおいて、これらの遺伝子は、そのランチバイオティクスのた
めの構造遺伝子の周囲にクラスターとして発見された。エピデルミン(epidermin
)オペロンの遺伝子組織化を含むその被験体についての包括的な概観を、“Nisin
and Novel Lantibiotics”(Jung,G.and Sahl,H-G.,1991)中に見ることがで
きる。
エピデルミンとハイシンM51は、構造的にひじょうに類似しているので、ハイ
シンM51の生産に必要な遺伝子も、ランチバイオティクスについて示されたよう
な構造遺伝子に近いオペロンにおいて組織化されると推定することは妥当である
。ハイシンM51のための構造遺伝子のDNA 配列は、本発明の好ましい態様を構成
する。フランキング配列は、その断片がハイシンM51のための構造遺伝子を含ん
で成るスタフィロコッカス・ハイカスのゲノム・ライブラリーから単離された6.
5kb DNA 断片の全配列分析により、容易に得られることができる。その6.5kb 断
片に隣接するスタフィロコッカス・ハイカス・ゲノムDNA を含んで成る追加のク
ローン及びその全オペロンのクローンを、本分野の技術水準においてよく知られ
た手順により容易に得られることができる。次にその単離されたオペロンを含ん
で成るDNA 分子を、バクテリア株、例えば、グラム陽性バクテリアの他の株及び
スタフィロコッカス(Staphylococci)内で複製され、そして発現されることがで
きるプラスミド内にクローン化することができる。例えば、Augustin et al(19
91)は、S.epidermidisからS.carnosus へのエピデルミン遺伝子のクローニン
グ及び転移に
ついて記載している。ランチバイオティクスの生産のために必要な遺伝子の転移
は、関連する遺伝子の全ての詳細な知識なしでも達成されることができる。例え
ば、McKay et al(1984)とEP-137869 は、接合的転移(conjugative transfer)
によるニジン生産の伝達について記載している。Hansen et al(1991)は、組み
込み形質転換による、2つの株抑圧(ob)B.subtilis 間のズブチリン(subtil
in)生産の伝達を達成した。
従って、ハイシンM51を生産するための酵素のからくりを欠く微生物宿主は、
必要とされる翻訳後修飾を行うことができるような方法において遺伝子修飾され
ることができるであろう。これは、その微生物宿主における翻訳後修飾に責任を
負う酵素をコーディングする遺伝子を発現させることにより達成されることがで
きるであろう。関連遺伝子は、形質転換又は接合的転移によりその微生物宿主内
に導入されることができるであろう。
乳房炎を治療するための抗生物質の適用は、一般に、重大な問題、すなわち、
チーズ及びヨーグルト製造の問題を含む。これらのプロセスは、乳のバクテリア
発酵、そしてそれ故、抗菌特性をもつ残りの剤が、それらを危険にさらす。
これらの剤によるウシにおける乳房炎処置の減少された有効性を引き起こす、
乳の存在中でのこれらの剤の抗菌効果におけるかなりの減少が存在するというこ
とも確立されている(Jnng et al.,1992)。
それ故、一方において、ウシ乳房炎を十分に防除し、かつ、温血動物に非毒性
であり、そして他方において、チーズ及びヨーグルト製造において役割を演じる
乳中のバクテリアに対してほんの僅かな効果を発揮する、抗生物質ペプチド、例
えば、本発明に係るペプチドを発見することが必要であると長い間感じられてき
た。
本発明の他の態様は、哺乳類における乳房炎の治療又は防止方法であって、好
ましくは、ウシ(cow)、ヤギ(goat)、又はヒツジ(ewe)である哺乳類に、医薬と
して有効な量の、本発明に係るランチオニン含有抗菌ペプチド又は医薬として許
容されるその酸付加塩の中の1を、投与することを含む方法に関する。この投与
は、乳房炎を引き起こす病原体による感染が生じる前か又は後のいずれかに行わ
れることができ、そしてそれは、分娩前又は分娩後に行われることができる。
上述のように、本発明は、乳房炎の治療又は防止に関する。“治療”とは、乳
房炎にかかった動物を治癒し、又は改善させることを意味する。乳房炎を“防止
する”とは、その感染の発生を防ぎ、又はそれにその後にかかった場合にその感
染の重度を和らげることを意味する。
驚ろくべきことに、本発明に係るランチオニン含有抗菌ペプチド及び医薬とし
て許容されるその酸付加塩が、ウシ乳房炎を引き起こす病原体に対して高く活性
であり、さらに驚ろくべきことに、それらが、乳の存在中、それらの抗病原作用
における阻害をほとんど全く示さないことが、発見された。最も重要なことは、
チーズ及びヨーグルト製造における処置されたウシからの乳の利用がかなり改善
されるように、乳の存在中での阻害の欠如が、治療的投与量、そしてこれ故の乳
中の残存ランチオニン含有ペプチドの量の減少を許容することである。
従って、本発明の1の重要な局面は、被験哺乳類に、本発明に係るランチオニ
ン含有抗菌ペプチド又は医薬として許容されるその酸付加塩の投与により、哺乳
類における乳房炎の治療又は防止である。本発明の好ましい態様は、ウシにおけ
るウシ(cattle)における乳房炎の治療又は防止である。この目的のために、本
発明は、単独
又は組合せにおいて、本発明のペプチド又は医薬として許容されるその酸付加塩
のいずれかの形態を使用することを企図する。本発明は、本活性剤の生来の形態
を使用することを包含する。しかしながら、組換えペプチドの製造が、生来のペ
プチドの精製に対して実質的な利点をもつので、組換えペプチドは、好ましい態
様である。本発明に係る抗菌ペプチドの合成形態及び同一の生物学的活性を示す
生来の産物に対して僅かな構造的相違を示すムテインも、本発明の範囲内にある
。
本発明に係る活性剤は、通常、すぐに使用できる液体配合品として調製され、
そして保存される。水性溶液を、一般に、適用することができるが、上記配合品
は、特定のタイプの投与に適したものであることもできる。従って、この配合品
は、水性培地に溶解されるとき明確な電荷を担持しない非イオン界面活性剤を含
むことができ、そして脂肪酸とトリグリセリドのエトキシル化エステルから選ば
れる。ハイシンM51配合品は、その抗菌スペクトルを改善するためのEDTA及び安
定剤、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、並びに保存料、例えば、プロピレ
ン・グリコールを含むこともできる。
典型的には、本発明に係る活性剤は、乳内注射により投与される;しかしなが
ら、有効な投与量は、非経口、経皮、インプラントにより、そしてまた浸漬によ
り投与されることができる。本発明の好ましい態様においては、その投与は、筋
中、皮下、又は静脈内注射を介して行われる。注射可能なものとして調製される
とき、本発明に係る活性剤は、一般に、医薬として許容される賦形剤(rehicleo
r excipient)を使用して投与される。好適な賦形剤は、例えば、さまざまな組
合せにおける、水、生理食塩水、マンニトール、デキストラン、アミノ酸、グリ
セロール、その他である。さらに、所望により、その賦形剤は、補助的物質、例
えば、水和剤又は乳化剤、
保存料及びpH緩衝液化剤を含むことができる。この活性成分は、典型的には、投
与された組成物の約 0.001%〜約95%(w/w)、又は適宜さらに高いか又は低
い、レンジにあるであろう。
非経口投与は、慣用には、皮下、皮膚中、筋中、そしてさらに静脈内注射によ
り行われることができる。針なし風気噴射(Need1e-less air blast)注射デバイ
スも、等しく有用であることができる。非経口投与は、本分野におにおいてよく
知られており、そして動物獣医又はヒト医療分野における通常の方法で行われる
ことができる。
遅延放出(いわゆる“遅い放出(slow release)”)を達成するための本活性剤
の持続作用は、速い溶解を物理的に阻止するであろうマトリックス中に本タンパ
ク質を配合することにより得られることができる。この配合マトリックスが動物
の体内に注射され、そこで、それは、それからそのタンパク質がゆっくりと放出
される貯蔵庫(depot)として残る。有用なアジュバントは、ポリマー及びラクチ
ドとグリコシドのコポリマーである。さらに、アルミニウム、カルシウム又はマ
グネシウム・モノステアレート、又は炭水化物(セルロース、ペクチン、デキス
トラン誘導体)、ポリシロキサン又はタンパク質(ゼラチン、コラーゲン)のよ
うなゲル化剤は、非経口適用の後の本発明に係る活性剤の放出時間を延長するこ
とができるであろう。経皮投与は、例えば、シリコーン又はワックスから作られ
た制御放出デバイスの移植を含むことをも意味され、そしてポリマー材料からの
他の移植可能なマトリックスも、所定の時間にわたり本化合物を皮下にデリバリ
ーするために使用されることができる。これは、本タンパク質の水性溶液を含む
ミニポンプ(mini pumps)の移植により達成されることもできる。
ポリシロキサン担体は、さまざまなホルモン・デリバリー形態の
ために本分野において記載されており、そして本発明に係る活性剤の放出のため
に適したものであることができる。抗生物質の放出のためのコラーゲン・デリバ
リー・システムが、ドイツ国公開公報(German Offenlegungsschrift)第DE-3,4
29,038号中に記載されている。このシステムも、本発明に係るランチオニン含有
抗菌ペプチド及び医薬として許容されるそれらの酸付加塩のために適したもので
あることができる。
本発明に係るペプチド及びその医薬として許容されるその酸付加塩の遅延放出
配合品及び他の医薬又は獣医配合品を、例えば、本分野において既に記載されて
いるランチオニン含有ペプチドの配合品又は他のタンパク質配合品を改作するこ
とにより、調製することができる。
本発明の活性剤の“治療的に有効な量”は、その活性剤が投与される被験体内
で乳房炎を防止するか又は治療するかのいずれかを行うために十分な投与量であ
る。乳房炎を治療又は防止することができる本発明の活性剤の投与量は、適当な
対照による日常的なトライアルにより当業者により、上記開示を考慮して容易に
決定されることができる。それらの対照に対するその適当な処置群の比較は、特
定の投与量が、制御された負荷において使用された疾患の防止し又は治療におい
て有効であるかどうかを、示すであろう。一般に、有効投与量は、投与方法に依
存するであろう。ハイシンM51を用いた乳房内注射の場合には、乳房区当り 0.1
mg〜10mgの投与が、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)
による乳房炎を防除するために十分である。
筋中、皮下、又は静脈内に投与される場合、有効投与量は、その動物の体重に
依存するであろうし、そして典型的には、約2g/kg〜約 800g/kg、好ましく
は、20g/kg〜約 200g/kgのレンジ内
で行われるであろう。より典型的には、その投与量は、少なくとも約50g/kgで
あるが、150g/kg未満であろう。
投与量以上に、本発明に係る活性剤の有効な投与は、部分的に、その投薬の数
及びタイミングに依存するであろう。例えば、一定投与量の多数の投与は、典型
的には、少なくとも約12時間離れて、動物に与えられることができる。ほとんど
の状況において、少なくとも3回において本活性剤を投与することが望ましいで
あろう。等しい日数に又はそれより長くにわたり、例えば、6,7,8、又はさ
らに9又はそれ以上、その動物にさらに多量くの投与量を投与することが、さら
に望ましくあることができる。投与量とタイミングの正確な組合せは、広いレン
ジのバリエーションに供されるであろうし、そして、疾患の治療又は防止におい
て有効な多くの組合せは、本開示を見て当業者により容易に確立されることがで
きると信じられている。
これから、別段の定めなき場合、限定的な性質を有さず説明の目的をもって本
説明に取り込まれる特定の実施例を、参照することができるであろう。実施例
A)ハイシンM51の調製
バクテリオシン生産体スタフィロコッカス・ハイカス664(Staphylococcus hy
icus 664)を、Czechoslovak National Collection of Type Cultures(CNCTC)
から得、そしてスタフィロコッカス・ハイカス株664 のサンプルは、受託番号第
DSM9547 号の下、1994年11月17日に、DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganis
men und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig に寄
託されている。
0.05%アンチフォームPolywax Polyol PPG2025(BP Chemicals)
を含むBHI 培地(Dlfco)4リッターを含むISF200発酵槽(Infors AG,Bottmingen
,CH)を、BHI 培地中で増殖させた一夜カルチャーを用いて、10%において接種
した。このカルチャーを37℃及び0.5bar背圧において培養した。pO2を、5−7
lt/分の間で通気速度を、そして200−400rpmの間で撹拌速度を変化させるこ
とにより飽和の>60%に維持した。(抗菌活性を、実施例F中に記載するような
指標バクテリアにより接種された寒天プレート上にそれらのサンプルのアリコー
トをスポットすることにより検出した。)。6時間後、35分間65℃まで加熱して
そのバクテリアを失活させた。37℃に冷却した後、そのpHを、3M HClを用いて
4.9 に調整した。
150gのAmberlite XAD-7(Sigma)を、上記発酵槽に直接添加し、そして撹拌
を、100rpm及び7lt/分の通気速度において2時間続けた。この樹脂を濾別し
、そして500ml のH2O で洗浄した。次にこれを250ml のクエン酸Na(20mM,pH4.0
)で洗浄し、その後、20%イソプロパノールを含む同一バッファー250ml による
2回の洗浄、そして30%イソプロパノールを含む上記バッファーによる2回の洗
浄を行った。
次にこの樹脂をクロマトグラフィー・カラム(Pharmacia XK50)に移し、そし
て30%のイソプロパノールを含む200mM クエン酸NapH4の他の1000mlで洗浄した
。活性を、30%のイソプロパノールを含む20mMクエン酸Na pH4で溶出し、活性
画分をプールし(750ml)、そして水で事前洗浄してある11mlのSP Sepharose Fast
Flow(Pharmacia)をそのプールに添加した。室温において30分間撹拌した後、そ
の樹脂を濾別し、0.01M HCl中に再懸濁し、そしてPharmacia XK 2.6カラム内に
充填した。このカラムを、30%メタノールを含む0.01M HCl 100mlで洗浄した。
この活性を、0.3M NaClを含む同一バッファーで溶出した。活性画分をプール
し(120ml)、そして11
gのAmberlite XAD-7(H2Oで事前洗浄されたもの)を、そのプールに添加した。
45分間撹拌した後、その樹脂を濾別し、そしてPharmacia XK 2.6カラム内に充填
した。このカラムを、100ml の0.01M HClで洗浄し、そして50%イソプロパノー
ルを含む0.01M HClで溶出した。活性を含む画分を、プールし、そして凍結乾燥
した。
分析目的のために、上記材料を、Vydac C18 カラム(4.6mm×250mm)上のRP-HPL
C によりさらに精製した。活性を、75%溶媒A,25%溶媒Bから60%,40%Bま
で走らせる線形グラジエントを用いて溶出させた。溶媒Aは、90% H2O,10%ア
セトニトリル、0.1% TFAであり、溶媒Bは、10% H2O,90%アセトニトリル、0
.1% TFAであった。タンパク質を、213nm におけるUV検出によるモニターした。
典型的には、1mlの画分(複数)を集め、そして活性について分析した。活性画
分を真空遠心分離により乾燥させた。
B)ハイシンM51の配列分析及びアミノ酸特性
アミノ酸配列情報を、製造者により供給されたプロトコールを使用して、気相
配列決定装置(Applied Biosystems,Foster City,California)を用いて得た。
これらの結果は、そのN−末端Ile 後、そのペプチドをもはや配列決定のため
に利用することができず、そのペプチド鎖の2位における異常アミノ酸の存在を
示すことを、示している。
C)ハイシンM51の質量分析及びそのトリプチック断片
質量スペクトルを、フライト質量分析装置(flight mass spectrometer)(BIO I
ON KB,Uppsala,Sweden)のBio Ion 20252 CFプラズマ脱着時間に対して、記載
した。この装置を、15kVの加速電圧において操作する。1n秒の時間分解能を使
用する。
2gのサンプルを、10lの水・酸性酸(1:1 v/v)中に溶解し、そして
ニトロセルロースの薄いフィルムにより覆われたアル
ミニウム・ホイル上に添加した。非吸着タンパク質を水で洗い落とした。
トリプシン(Sigma,St.Louis,Mo)による上記ペプチドの酵素的解裂を、15
時間、0.1M重炭酸塩バッファー、pH8.5 中で行う。酵素対基質比は、1:10で
ある。トリプチック断片を、質量分析の前にRP-HPLC により精製する。結果を、
表1中に表す。ガリデルミン−他のランチオニン含有バクテリオシン−の構造と
の強い関係が、注目される。
D)ハイシンM51のNMR スペクトル
a)実験の詳細
NMR計測を、1H-500MHz周波数を用いてVarian Unity 500スペクトロメーター上
で行った。CD3OH を溶媒として使用した。1H-NMRスペクトルを、水を抑制する事
前飽和をもって17.5℃と40℃の間の温度において記録する。2次元スペクトルを
25℃において記録し、この温度において、そのアミド領域内のシグナルの重複は
、最小である。換算目的のために、溶媒CD3OH の CD3−マルチプレット・シグナ
ルを、3.30ppm に設定する。1次元1H-NMRスペクトルに加えて、以下の計測を行
う:1次元13C-NMR 並びに2次元DQF-H,H-COSY ;TOCSY ; NOESY ; ROESY ;
H,C-COSY(HSQC);及びH,C-COSY- 長-レンジ(HMBC)。
b)個々のアミノ酸残基の同定
個々のアミノ酸の同定は、NMR スペクトルを用いたハイシンM51のペプチド構
造の解明における第1段階を構成する。1−及び2−次元NMR 実験から得られた1
H-NMRシグナルを、プロトン・スピン−パターンとして同定し、これを、特定の
アミノ酸残基に指定することができる。DQF H,H-COSY実験は、2又は3の化学結
合の距離を超えるカップリングによるプロトン・シグナルを提供し;TOCSY 実験
は、さらに、3化学結合を超える距離にわたるカップリングによるプロトン・シ
グナルを提供し;ROESY スペクトルは、双極子カップリングから生じるプロトン
・シグナルを提供し、そして個々のスピン・システムの同定のための追加の情報
を提供し;H,C-COSY実験は、最終的に、炭素原子に直接結合するプロトンと相関
する。
以下の天然アミノ酸残基が、ハイシンM51内で同定される:
Ile,Leu,2×Gly,Ala,Pro,及びLys。
ハイシンM51の以下の非天然アミノ酸残基が、それらのH,H−カップリング
・パターン及び化学シフトにより同定される:
2×Dhb(2,3−ジデヒドロブチリン)、Dha(2,3−ジデヒドロアラニン)、
Abu(3−メチルランチオニンの一部としてのアミノブチル酸)、及びAvi(2−ア
ミノビニル)。
ROESY 及びH,C-COSYスペクトルを使用して、以下の追加のアミノ酸残基が同定
される:
Asn,2×Phe,Tyr,並びにランチオニン、3−メチルランチオニン、及び2−
アミノ−ビニルシステインの一部としての6×Ala。
これらのプロトンの化学シフトを、表2中に要約する。
c)アミノ酸配列(1次構造)
個々のアミノ酸残基の配列の推定は、そのi番目のアミノ酸のNH−,アルファ
ー及びベータープロトンと、その隣りのi+1番目の
アミノ酸のNHプロトンとの間の長−レンジROESY クロス・シグナルの翻訳に基づ
く。
得られたデータの翻訳から、ハイシンM51の以下の1次構造が確立される:
d)ランチオニン、メチル−ランチオニン、及び2−アミノ−ビニル−システ インのチオ−エーテル橋の指定
このチオ−エーテル橋の特徴付けは、ハイシンM51の構造の解明における最終
段階を構成する。異なるチオ−エーテル橋に対するさまざまなAla 構造の指定は
、長−レンジROESY シグナルの翻訳により達成される。以下のチオ−エーテル橋
が同定される:
* アミノ酸位置3と7及び16と21の間の2つのランチオニン
* アミノ酸位置8と11の間のメチル−ランチオニン
* アミノ酸位置19と21の間の2−アミノビニルを含むチオ−エーテル橋
E)ハイシンM51のための構造遺伝子のクローニング
a)スタフィロコッカス・ハイカス664 のゲノム・ライブラリーの構築
染色体DNA を、M17-G培地(Terzaghi et al,1975)中で37℃において一夜
増殖させたS.ハイカス664 のカルチャーから単離する。細胞を、遠心分離によ
り収穫し、そして4mg/mlリゾチーム及び40mg/lムタノリシン(mutanolysin)
を含む、25mM Tris-HCl pH8,10mM EDTA,50mM グルコース中で37℃において30
分間のインキュベーションにより溶解させる。
次にプロテイナーゼK(100mg/l)とSDS(0.5%)を上記サンプルに添加し、
それを次に56℃において2時間インキュベートする。1容量のフェノール/クロ
ロホルム(1容量のフェノール:1容量のクロロホルム)による抽出後、そのDN
A を、CsCl勾配遠心分離により精製する。得られた染色体DNA を、制限酵素Sau3
A により部分消化し、そして得られた断片を、Maniatis et al,1982中に記載さ
れるようにスクロース勾配上でサイズ分画する。5K塩基対〜10K塩基対間のDN
A 断片を集め、そして子ウシ腸ホスファターゼ(CIP)によりさらに処理されてい
る、BamHI線状化プラスミドpUC 18にライゲートする。このライゲーション生成
物を含むライゲーション混合物を、大腸菌(E.coli)株TG1をアンピシリン耐性
に形質転換するために使用する。
b)ハイシンM51をコーディングする配列についての上記ゲノム・ライブラリ ーのスクリーニング
ガリデルミン(Schnell et al,1989)をコーディングする構造遺伝子の配列に
相補的な以下の2つのオリゴヌクレオチドを標準的な技術に従って合成する:
上記オリゴヌクレオチドを、ガリデルミン遺伝子の151 塩基対のDNA 断片を増
幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において使用する。ポリメラーゼ連
鎖反応のためには、Perkin Elmer Cetus(Gene AmpTM)からの熱安定性Taq ポリ
メラーゼを、製造者の指示に従って使用する。ガリデルミンを生産することが知
られているスタフィロコッカス・サプロフィティカス(Staphylococcus saproph
yticus)の株のゲノムDNA を、増幅のための鋳型DNA として使用する。ハイブリ
ダイゼーションのためのプローブとして増幅された断
片が使用されることができるために、ポリメラーゼ連鎖反応を、Boehringer Man
nheim から購入したDIG-11-UTPの存在中で行う。セクションa)において得られ
たゲノム・ライブラリーの約10000 コロニーを、DIG −標識増幅生成物を用いて
スクリーニングした。ハイブリダイゼーション及び洗浄段階を、DIG-11-UTPヌク
レオチドの製造者により推奨されるように行う。DIG −標識プローブとハイブリ
ダイズするいくつかのクローンが同定される。これらのクローンの中の1をさら
に特徴付ける。それは、6.5K塩基対のDNA 挿入物を含むpUC 18から成る。制限
酵素Xbalによる上記プラスミドの解裂及びその後の再ライゲーションの後、その
挿入物のサイズを約1K塩基対に減少させる。この挿入物の配列は、United Sta
tes Biochemicals(USB)から購入したSequenaseTM Version 2 kit及び適当なオリ
ゴヌクレオチドを使用して決定される。このDNA 配列は、ガリデルミン構造遺伝
子gdmAに対するかなりのホモロジーをもつ144 塩基対のオープン・リーディング
・フレーム(配列番号:1)を現した。演繹されたアミノ酸配列(配列番号:4
)は、ハイシンM51ペプチドのNMR 分析から得られた結果を確立する。翻訳後修
飾の後、成熟ハイシンM51は、3つのアミノ酸残基においてガリデルミンと異な
る。2つのペプチドのリーダー・ペプチドは、かなり低いホモロジーを来す。
F)MIC プレート・アッセイ
ストレプトコッカス・アウレウス(Streptococcus aureus)及びストレプトコ
ッカス・ジアセチラクチス(Streptococcus diacetylactis)に対するニジン(nisi
n)及びハイシンM51(hyicin M51)のMICs(最小阻害濃度Minimal Inhibitory C
oncentrations)を、測定した。S.aureus Newbould 305は、乳房炎の原因病原
体であり、S.diacetylactisは、ヨーグルト及びチーズの製造において使用され
る。
ニジン及びハイシンM51の適当な希釈(300,100,30,10,3,1,0.3,0.1
g/ml)を、乳中及びM17ブロス(Merck)中で調製し、そして30分間室温におい
て放置した。
次に、上記溶液の10mlアリコートを、0.5%のグルコースを含むM17寒天プレ
ート上にスポットした。これらのプレートを、S.aureus 又はS.diacetylactis
のいずれかのA600 =1カルチャーの1%により接種された軟寒天(0.5%アガロ
ース)により重層した。これらのスポットを乾燥させ、次に、これらのプレート
を30℃において一夜インキュベートした。
MICsを、バクテリアの芝の中に透明な輪の形成を生じさせる抗菌タンパク質の
最低濃度として決定した。表3中に表す結果は、ナジン及びハイシンM51が、乳
及びブロスの両方の中で、ストレプトコッカス・ジアセチラクチスに対してかな
りの活性をもつことを示している。しかしながら、乳中でS.aureus に対するナ
ジン活性の明らかな阻害が在り、一方、ハイシンM51は、これらの条件下での完
全な活性を保持している。
G)乳中のスタフィロコッカス・アウレウスに対するナジン及びハイシンM51の 効果
スタフィロコッカス・アウレウスNewbould 305を、1.0の600nmにおける吸光度
まで37℃においてM17ブロス(Merck)中で培養した。細胞を遠心分離により集め
、そして20mM Tris-HCl pH8.0 中で洗浄した。バクテリア・ペレットを、約107
細胞/mlの密度において乳中に再懸濁させた。
この懸濁液の1mlアリコートを、各種量のナジン及びハイシンM51と共にエッ
ペンドルフ管内でインキュベートした。インキュベーションを、30分間37℃であ
った。抗菌薬を添加しない対照を並行して走らせた。
インキュベーション後、これらのサンプルを遠心分離してその細胞ペレットを
得て、これを20mM Tris-HCl pH8.0,1mlで2回洗浄し、そして1mlの上記バッ
ファー中に再懸濁させた。100lの適当な希釈を、0.5%グルコースを含むM17寒
天プレート上にプレーティングし、そして37℃において一夜インキュベートした
。コロニー形成単位(Cfu)を、決定し、そしてパーセント生存を、その対照に対
して計算した。
これらの結果を、表4中に示す。これらのデータから、乳中、ハイシンM51が
ナジンよりもスタフィロコッカス・アウレウスに対してより高い比活性をもつこ
とが、明らかである。
ナジンが乳の存在中で阻害されることは、よく記載されている(Jung et al.,
1992)。明らかに、かつ、驚ろくべきことに、ハイシンM51は、乳の存在中で同
様の阻害を示さない。この特定の特性は、それを、ウシ乳房炎における使用のた
めの予防及び治療剤としての使用のためにかなりよく適したものにする。なぜな
ら、その治療投与量が上記のように低下されることができるからである。
スタフィロコッカス・アウレウスにより引き起こされる亜臨床的なウシ乳房炎
におけるハイシンM51又はその医薬として許容される酸付加塩の効力を評価する
ために、以下に記載する感染モデルを使用することができる。
H)ハイシンM51の抗菌スペクトル
テスト生物のパネルに対するハイシンM51の最小阻害濃度(MIC)を、寒天ウェ
ル拡散法を使用して測定した。寒天プレートを、上記テスト生物により接種され
た軟寒天により重層した。その寒天が固化したとき、4mm直径のウェルを、その
寒天内に作った(plugged)
。クエン酸バッファーpH4中の上記ペプチドの一連の2倍希釈物50lをそれらの
ウェルに適用し、そしてそれらのプレートを、37℃における一夜のインキュベー
ションの前2時間にわたり4℃に保った。MIC を、そのウェルの周囲に溶解の透
明ゾーンを与えるペプチドの最低濃度として測定した。指標株を、Tryptoseブロ
ス(Difco)中で培養した。M17培地(Merck)を、プレート及び軟寒天のために使用
した。但し、パスツーレラ・ハエモリティカ(Pasteurella haemolytica)(5%の
胎児子ウシ血清を補ったトリプトース)、ロイコノストック・メセンテロイド(Le
uconostoc mesenteroides)(プレート・カウント寒天−Merck −,+15%サッカ
ロース)、そしてバチルス・セレウス(Bacillus cereus)(プレート・カウント寒
天+ 0.2%ポテト・デンプン−Sigma 2004−)。結果を表5中に示す。
I)亜臨床的ウシ乳房炎におけるハイシンM51又はその医薬として許容される酸 付加塩の効力の評価のための実験
乳牛群を、試験における登録(enrollment)のための候補ウシを供給するため
に飼養する。ウシを、地域のウシ取扱者から入手する。これらのウシは、15l/
日の最小乳生産をもたなければならない。2つの乳サンプルを、微生物検査のた
めに全乳房区から隔日に採取する。乳房炎病原体がそれから全く回収されること
ができないウシを、上記テストに編入する。非感染ウシ又はヤギを、全乳房区か
ら隔日に採取された2つの乳サンプルからスタフィロコッカス・アウレウスの回
収の欠如に基づいて選択する。次に、3つの乳房区を
、スタフィロコッカス・アウレウスの懸濁液を使用して乳房内経路を介して接種
する。第4乳房区は、対照として役立つ。ヤギにおいては、2つの乳房の中の1
、半分を接種する。接種後2〜4週間にわたり、乳サンプルを少なくとも3回全
乳房区から採取して、スタフィロコッカス・アウレウスが回収されることができ
るかどうか、そしてそれ故、その乳房区が感染されるようになったかどうかを観
察する。スタフィロコッカス・アウレウスが上記乳サンプルの中の少なくとも2
から回収される場合に、乳房区は感染されていると定義される。処置は、感染し
た乳房区にランダムに指定され、そして乳房経路を介して注射される。乳サンプ
ルを、最後の処置後最小で14日間まで、毎日採取する。最後の処置後7日間以内
に、その乳房区からの乳サンプルが陰性になり(すなわち、スタフィロコッカス
・アウレウスが全く回収されず)、かつ、そのサンプリング期間の全体にわたり
陰性である場合に、乳房区は、治癒されていると定義される。
上記実験モデルを、処置を評価するために、その上に固定された枠組をもつよ
うに使用した。スタフィロコッカス・アウレウスを用いて研究することは、それ
が、治療するのに最も困難なグラム陽性バクテリアであり、そしてウシ乳房炎を
引き起こす最も重要なバクテリアの中の1であるという利点をもつ。それ故、そ
の治癒速度は、他グラム陽性バクテリア、例えば、ストレプトコッカス、及びコ
アグラーゼ(coagulase)−陰性スタフィロコッカスについてよりも低いものであ
ると予想される。
このモデルは、満足できることが証明された。なぜなら、乳房区内の感染率が
平均60%であるからである。さらに、この感染は、亜臨床的な乳房炎のために必
要とされるように緩やかである。
マン・パワーに関して作業負荷を最適化するために、8〜16匹の
ウシ又はヤギを、各試験に編入する。試験は通常5週間続く。
分析方法
1)データ管理及び分析
よく知られた統計分析コンピューター・プログラムSAS を使用して作製された
データ入力/管理システムを使用する。
2)治癒速度の定義
しばしば、乳房区は、独立した統計単位として取り扱われ、そして治癒速度は
、個々の乳房区からの結果に基づく。これは正しくない。なぜなら、同一のウシ
において、乳房区は、独立に振る舞わないからである。文献中、ウシにおける乳
房区間の相関は、0.25であると推定される。我々のデータから、我々は、この疾
患モデルにおける相関が、0.15と0.35の間にあると推定する。
我々は、ウシにおいて感染され、そしてその後処置された乳房区
の全数(1,2又は3)、そのウシにおいて治癒した乳房区の数、及び乳房区間
の相関を考慮するして、与えられた処置についてのウシ治癒速度を計算する方法
を使用する。このような方法を使用した1の結果は、それについて1の乳房区の
中からの1が治癒した3つのウシに比較して、それについて3つの乳房区からの
中の3が治癒した1のウシに対して、より大きなウエイトが与えられるものであ
る。この結果は、より多くの乳房区が感染すると、それらがより少なく治癒する
であろうという観察に一致する。この問題は、ヤギにおいては生じない。なぜな
ら、我々は、各ヤギの乳房の1/2だけを感染させるからである。
3)治癒に影響を及ぼす他の要因
他の要因が知られており、又は治癒に影響を及ぼすと疑われている。なぜなら
、自然の治癒が20%までのケースにおいて生じることができるからである。これ
らの要因のいくつかは、“牛(cow)”要因(例えば、品種又は泌乳数)であり、
他は、“乳房区(quarter)”要因(例えば、乳房上の乳房区の位置)である。
我々は、本分析において以下のウシ要因(cowfactors)を考慮し、そして必要
により調整する:品種、泌乳数、泌乳段階、処置前の毎日の乳生産量及び試験の
ために使用される時間数。適当な調整は、ヤギについても行われる。
考慮されなければならない乳房区要因(Quaterfactors)は以下のものである
:処置前に存在するバクテリア数、処置時に存在するバクテリア数、処置におけ
るSCC、位置(前又は後)、感染歴、及び処置歴。
ウシと乳房区要因を同時に調べることを我々に許容する統計分析は、存在しな
い。それ故、我々は、いくつかの乳房区要因をウシ要因に変形する。我々は、そ
の感染乳房区の全てにおける感染レベル
に基づき、ウシについてのメジアンの感染レベルを定義し、そして我々は、その
感染乳房区の全てのSCC に基づき、ウシについてのメジアンSCC を定義する。
我々は、このようなデータ・プーリングが、我々が乳房区要因の効果を検出を
することを妨害することができるであろうことを知っているが、現在のところ、
我々は、別法をもっていない。しかしながら、我々は、結果の最終的な翻訳がで
きないであろうとは考えていない。なぜなら、これらの要因が、一般的に、処置
群間で均衡しているからである。例えば、後ろの乳房区は、前の乳房区よりも少
なく治癒する(30%対45%)であるが、全ての処置群における後の乳房区の割合
は、30と40%の間で変化する。
4)処置間の効果の比較
上述の要因について調整して、処置間の効果を比較するために、その不平等比
(odds ratio)を計算する。これらの調整された不平等比は、すべての他の混乱
要因を一定に保って、2つの処置間の治癒の機会を比較する。例えば、処置Aと
Bの間の不平等比が3である場合、Aにより処置されたウシは、Bにより処置さ
れたものよりも3倍、より治癒される傾向がある。この不平等比についての95%
信頼区間を計算する。95%信頼区間が1を含まないとき、処置は統計的に異なる
。
5)乳房浸漬及び乳房炎予防
乳房浸漬は、乳牛における乳房炎を防止するために、最も頻煩に使用され、そ
して採られる最も有効な手段の中の1である。この広く行われる手順は、抗菌溶
液中に、各乳絞り後に、各ウシの4つの乳房を浸漬することを含む。この手順は
、乳房表面上に抗菌物質のコーティングを残し、そしてこの物質の滴を、乳房オ
リフィスを超える乳房の垂れ下った部分において集める。乳絞り後、乳の滴は、
乳房オリフィスをしばしば覆い、そしてバクテリア増殖のための良好な培地であ
る。この位置から、バクテリアは、その線条管(streak canal)を容易に通過す
ることができる。乳房浸漬は、これらの可能性に対する保護を提供する。
いくつかの群においては、乳房は、乳絞り装置が適用される前に、乳房表面上
にあるいずれの病原体をも殺生するために乳絞り前に浸漬される。乳絞り前乳房
浸漬として有用であるために、剤は、チーズ及びヨーグルト製造に対し非毒性で
あり、かつ、非破壊的である必要がある。
乳房浸漬のために最近使用される製品は、多様な異なる活性成分、例えば、ヨ
ードフォア(iodophors)、クロルヘキシジエン(chlorhexidiene)及びランチオ
ニン含有ペプチド、ニジンを含む。ハイシンM51及びその医薬として許容される
酸付加塩は、主な乳房炎病原体に対するそれらの速い殺生効果及び優先的な活性
のために、乳房浸漬物中の使用のためにひじょうに好適である。速い殺生は、事
前浸漬のための剤としての特殊な適用を与える。
6)乳房浸漬プロトコール
ウシ乳房炎における予防剤として、ハイシンM51及びその医薬として許容され
る酸付加塩を評価するために、以下の実験プロトコールを使用することができる
。
実験動物:50のウシを、亜臨床的スタフィロコッカスの乳房炎の治療における
ハイシンM51の試験のために既に記載されたプロトコールに従ってリクルートす
る。次に、この試験を、実験的暴露の間の乳房殺菌剤の効力をテストするために
、US National Mastitis Council(NMC)(Hogan et al.1990)により認められた
プロトコールに従って進行させる。
この試験期間の全体にわたり、全ての乳房を、平日の夕方の乳絞
りの後に、15×107ストレプトコッカス・アウレウス(Streptococcus aureus)
及び5×107ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)
を含む感染バクテリア懸濁液中に浸漬する。感染懸濁液を、1週間毎に調製され
る保存溶液から毎日調製する。感染溶液のアリコートを、毎日プレートして、感
染時に存在する真のバクテリアの濃度を測定する。
各乳絞りの後、左前及び右後乳房区を、殺菌剤のテスト調製物中に浸漬し、他
の2つの乳房を、ネガティブ・コントロールとして残し、そして浸漬しない。全
乳房区の定例、搾り始めサンプルを、微生物検査のために、本試験の全体にわた
り1週間に2回採取する。いずれかの感染生物がそれから単離されるいずれかの
乳房区を、48時間以内に、その元のサンプルから再サンプリングする。同一生物
が、単離される場合、その乳房区は感染していると考えられる。いずれかの感染
生物により引き起こされる臨床的乳房炎のエピソードは、あらたな乳房内感染(i
ntramammary infection(IMI))として考えられる。
その試験期間の終わりに、処置群の間の新たな乳房内感染の数を、比較する。
7)チーズ及びヨーグルト中のハイシンM51
チーズ及びヨーグルト製造において使用されるバクテリアの株に対するハイシ
ンM51又はその医薬として許容される酸付加塩の潜在的効果を評価するために、
以下の実験を行うことができる。
7.1 ハイシンM51又はその医薬として許容される酸付加塩により処置された乳 房区からの乳中のDelvotest P の反応速度の評価
背景情報: Delvotest P は、乳中の抗菌剤の検出のための商業的に入手可能
な、広く使用されるキットである。それは、バチルス・ステアロサーモフィラス
(Bacillus stearothermophilus)の成長
の阻害に頼る。この指標バクテリアは、pH指示薬と一緒にプラスチック試験管内
の寒天プラグ中に懸濁されている。バクテリアの成長は、酸の生成及び色の変化
をもたらす。阻害物質の存在中、このバクテリアは、成長せず、そして色の変化
はない。バチルス・ステアロサーモフィラスは、チーズ及びヨーグルト製造にお
いて使用されるバクテリアのよい代表であり、そしてこれ故、抗生物質残渣検出
における指標株として広く使用されている。
実験方法: 本実験を、上記効力試験と、同一時間及び同一動物において行う
。各種処置の投与後の期間にわたり、朝と夕方の乳搾りにおいてサンプルを摂取
する。これらのサンプルを、製造者の指示書中に指示されるようにDelvotest P
を使用して評価する。この1日当り2回のサンプリングを、全ての処置された乳
房区が、陰性応答を示すまで続ける。この方法で、抗菌剤の除去の経過時間を確
立することができる。
7.2 チーズ開始バクテリアによる乳の酸性化に対するハイシンM51又はその医 薬として許容される酸付加塩の各種濃度の効果の評価
チーズ及びヨーグルト製造において、異なる株のバクテリアが乳中で発酵され
、そしてこの発酵から生じる最も重要で、かつ、迅速な変化の中の1は、酸の生
成である。この酸は、その製品の損傷又はいっそう悪いこと、その消費者におけ
る病気を引き起こすことができるであろう2次的なバクテリアの成長の防除の原
因である。さらに、乳酸生成バクテリア集団の発酵は、使用されるバクテリアの
株及びその製造方法に伴って変化するチーズにおける変化を作り出す。これらの
要因は、異なるチーズの物理特性及び香りの原因である。
酸性化は、乳が発酵されるとき、その製造工程における最初の、かつ、最も重
要な段階である。酸性化が正常に進行する場合、全て
の他の段階が正常であろうようである。それ故、ある者は、これらの製造工程に
おいて使用される異なるバクテリア株による乳の酸性化の速度に対する異なる濃
度のハイシンM51又はその医薬として許容される酸付加塩の能力を調べることが
できる。
プロトコール: 実験を、以下の3つのバクテリア株の中の1を使用して定例
的に行う:
ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)
ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)
ラクトバチルス・ラクチス−ジアセチラクチス(Lactobacillus lactis-diace
tylactis)
保存カルチャーの調製: 商業的な条件において使用されるような凍結乾燥さ
れたカルチャーを、Rudolf Wittwer,CH-5002 Rombach,Aarau,Switzerland か
ら得る。これらのカルチャーを、製造者の指示に従い再構築し、そして滅菌スキ
ム・ミルク中の3回通過により再活性化する。各通過を、各バクテリア株のため
の適温度において16−18時間インキュベートする。
第3通過後に得られたカルチャーを、全滅菌(UHT)乳により2%に希釈し、10m
l管内にアリコートに分け、そして実験における使用のために−20℃において冷
凍する。
実験カルチャーの調製:
先に調製した保存カルチャーを40℃において解凍し、次に37℃において一夜イ
ンキュベートし、そして全滅菌(UHT)乳中、2%の濃度においてテスト・サンプ
ルを接種するために使用する。
テスト・サンプルの調製: テスト下の抗菌剤(ハイシンM51又はその医薬と
して許容される酸付加塩の中の1)を、要求される希釈レンジにわたり滅菌(UHT
)全乳中で希釈する。これらのサンプル
を次に、テストされるバクテリアの株の実験カルチャーの2容量%を用いて接種
する。次にこれらのサンプルを、混合し、そして、評価の下上記バクテリア株の
ための最適温度においてインキュベートする。このpHを、接種後、8時間の期間
にわたり2時間毎に、そして次に18時間目に、計測する。異なる濃度の活性成分
を含む乳の酸性化の速度を次に、いずれの活性成分を伴わない速度と比較するこ
とができる。
本発明をこれまで十分に説明してきたが、多くの変更や修正を本発明の本質又
は添付の請求の範囲から逸脱せずに行うことができることは、当業者にとって自
明なことであろう。
寄託
分献
Detailed Description of the Invention
Lanthionine-containing antibacterial compound
The present invention generally relates to the bacterial strain Staphylococcus hicus (Staphyloco
cth. hyicus) strain 664 containing lanthionine-containing medium
Antimicrobial peptides, pharmaceutically acceptable acid addition salts thereof, and
The present invention relates to a method for producing a peptide. The present invention further includes a lanthionine-containing compound according to the present invention.
The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an antimicrobial peptide and a method for producing the composition.
The lanthionine-containing peptide or acid addition salt thereof according to the present invention is used as a pharmaceutical agent.
However, in particular, in the treatment or prevention of bovine mastitis, a therapeutic agent (anti-
Mastitis drug). Teat dipping agents are also included.
Numerous antibacterial peptides with a broad spectrum of activity have been described in the literature.
Among these, lanthionine-containing peptides represent a class of antimicrobial agents of interest. What
If so, they show a broad spectrum of activity against bacterial pathogens.
is there. Typical representatives include subtilin, cinamycin,
Nisin, duramycin, ancovenin, Ro 0
9-0198, pep5, gallidermin and epidermin
. Some of these peptides are found in many peptides, including those that cause bovine mastitis.
Highly active against cteria. For example, nisin is used in the food industry and cosmetic formulations.
It is already used as a preservative. Peptide antibacterial agents make them
It has the advantage of being more digested, and this makes them less susceptible to warm-blooded animals.
It's poisonous. Thus, these peptide antibacterial compounds
Some of them have already been proposed for use in the treatment of mastitis, and
Any residue left in the milk should pose no risk to human health.
Yes.
Mastitis is an inflammatory disease of the mammary glands of mammals. Most important in veterinary medicine
And, the most frequently encountered mastitis is that of dairy cows. Dairy cow
Is highly specialized for milk production. They are needed to feed calves
Produces significantly more milk than there is. Super production and twice in 24 hours or
The practice of milking cows at most three times is to protect their mammary glands against bacterial infection.
Make it sensitive. In addition, they are milked by mechanical devices that are passed from cow to cow.
It is squeezed and the infection is transmitted from animal to animal.
The mammary gland has many natural defenses against bacterial pathogens (Cullo
r et al., 1990). These are high levels of bacterial load, and also protection
It can be defeated by a mechanical compromise. This compromise is due to poor management
, Or through physiological changes at specific times in the lactation cycle
(Cullor et al., 1990). No milk (drying off) and near delivery
The period is associated with a relatively high incidence of mastitis.
Mastitis can be caused by bacteria of many species. Bovine milk
The most commonly implicated in tufts are divided into two categories, I and II.
Category I is a host pathogen, eg Staphylococcus aureus
(Staphylococcus aureus) and Streptococcus agalactiae (Streptococcus
agalactiae). These live on or in the skin of the udder,
And individual cows are the source of infection for others in the herd. Category II is an environmental disease
Drug substance, eg Streptococcus uberis (St
reptococcus uberis) and Escherichia coli. Their name
Suggest that these category II bacteria are found in the immediate environment of dairy cows.
Found and, therefore, presents a certain risk (Cullor et al., 1990).
Mastitis caused by the above-characterized bacteria is clinical or sub-clinical.
Can be manifested as any clinical disease (Cullor et al., 1990)
. The clinical illness is from mildly affected quarters due to infections in the milk,
May die through a highly infected breast area with upcoming loss of that breast area
It can vary up to the whole affected cow. A more gradual presentation,
Is more common.
Subclinical mastitis, as the name suggests, is not overtly present. However
While it is very widespread in many milk groups. Subclinically affected breast area
Is present, and its cellular content in milk is greater than normal. this
Symptoms are associated with lower production. In fact, 70 of the farmer's economic loss from mastitis
It is estimated that more than% can be attributed to reduced production from subclinical disease
(Philpot, W.N., 1984).
In recent years, mastitis has become a common cause of inertial subsidence through extensive hygiene experience in milking.
Detection of bed-fed infected cows and milking them after uninfected cows or
Are managed by either eliminating them from the flock. Clinical case
Sources are generally treated with antibiotics as they occur. This is milk
Have to be salvaged from the sale and result in financial losses to the farmer.
It means to let them work together. Subclinical antibacterial mastitis therapy should be given during the dry period.
Must be broken. As a result, over the period between establishment of infection and lactation
, The infected cow, against the one next to her
Threatens.
Therefore, the object of the present invention is not particularly in cattle, and more particularly in the dry period.
Antibacterial that can be advantageously used in the treatment or prevention of mastitis in cattle
Is to provide a compound.
This purpose, surprisingly, can be used as a medicinal agent,
Lanthionine, which can prove to be particularly useful in the treatment of chemastitis
Further providing an antimicrobial peptide containing or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof
Fell within the scope of the present invention. It was also ordered with hyicin M51
The lanthionine-containing antimicrobial peptide according to the present invention is, for example, a conventional column chroma
Bacterial strain Staphylococcus hika using a series of topographies
It can be obtained from the culture medium of Staphylococcus hyicus strain 664. that is
, Having a molecular weight of about 2119 ± 2 daltons and being cleaved by trypsin
And two molecular weights of about 1256 ± 2 daltons and 881 ± 2 daltons, respectively.
Fragments are obtained.
Therefore, the present invention relates to the bacterial strain Staphylococcus hicus.
cus hyicus) strain 664, a lanthionine-containing antibacterial pepti obtained from the culture medium
Or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof; a peptide in addition to a suitable carrier
Antibacterial or pharmaceutical composition comprising, and its peptide and method for producing the composition
Concerning the law. The present invention further provides for treating or preventing mastitis in a mammal.
For the manufacture of a drug for treating or preventing mastitis in mammals or in mammals
Including the use of peptides and compositions according to the invention. Finally, the present invention relates to
Antithionine-containing antimicrobial peptide or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof as a medicine
Treatment of mastitis in a mammal, including administering to said mammal an effective amount of
Plan a prevention method
Figure.
In a preferred embodiment of the present invention, the antimicrobial peptide according to the present invention is
(A) In a medium suitable for producing the peptide, and for a period of time
Grow the culture of terrier strain Staphylococcus hicas strain 664,
(B) Apply the conventional technique of protein purification to purify the peptide from the culture medium.
Made and
(C) drying the active fraction,
It is prepared by
The bacterium is sufficient to heat inactivate it in the first step
Over a period of time between 50 and 80 ° C, but preferably between 60 and 70 ° C
By exposing the culture, heat is deactivated. For example, at 65 ° C, 30
An exposure of ~ 40 minutes will be sufficient. After heat inactivation, filter or centrifuge the bacteria.
The supernatant, which has been removed from the culture medium and clarified using the first chromatography
-Column. Alternatively, the column material can be used for pre-removal of the bacteria.
It can be directly added to the bacterial culture without depending. Chromat
After sufficient time to allow adsorption of the peptide on the graphic material, the tree
The fat is filtered off, washed and packed in a column. In a preferred embodiment of the present invention
For example, Amberlite XAD-7 (Sigma) is used. In this case, it takes 1-3 hours
Agitation of the culture in the presence of the resin affects the effect of the peptide on the resin.
Guarantees efficient adsorption, which is filtered off with water and 20% to 30% isopropanol.
Wash with a solution of Na citrate containing. After packing the resin in the column,
For example, 40% -50% isopropanol for Amberlite XAD-7 resin.
Including citric acid
The resin is eluted using a solution of Na. Pool the active fractions and
Chromatographic material, e.g. SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia)
And purify in a similar manner. Fraction containing this antimicrobial peptide for storage purposes
Are preferably pooled and lyophilized.
When the peptide is used for analytical purposes, it uses, for example, HPLC.
And can be further purified. In a preferred embodiment of the present invention, RP-HPL
C on the Vydac C18 column while monitoring the protein by UV detection.
Done. In the case of RP-HPLC on a Vydac C18 column, the peptides according to the invention
Was applied to the column by applying a linear gradient of acetonitrile in 0.1% TFA.
Can be eluted from the active fraction after application of vacuum centrifugation.
Continues to dry.
Purified hysin M51 is a bacterial, especially mammalian and preferably murine product.
It exhibits strong antibacterial activity against bacteria commonly associated with mastitis of weevil. This
Such bacteria include, but are not limited to, Staphylococcus aureus V557 (Stap
hylococcus aureus V557), Staphylococcus aureus newbold
305 (Staphylococcus aureus Newbould 305), Streptococcus uberis
(Strepyococcus uberis), Streptococcu
s faecalis), Pasteurella. Pasteurella haemolytica, Re
Listeria innocua, Bacillus ceus
reus), Micrococcus luteus, and Ryucono
Stock Mesenteroides (Leuconostoc mesenteroides), and
Minimal Inhibitory Concentrations (MI
Cs) is 0.01 g / ml to 100 g / ml, preferably 0.05
g / ml to 50 g / ml, and most preferably in the range of 0.1 g / ml to 10 g / ml
is there.
Amino acid sequence analysis of hysin M51 revealed that the second amino acid after its N-terminal Ile was
Said to be an unusual amino acid that blocks further sequence analysis from its N-terminal end
Is complicated by the fact that Therefore, its amino acid sequence is determined by mass spectrometry, NMR spectroscopy.
Toll, and a combination of experimental data obtained from DNA sequencing.
Must. The sequence determined is the lanthionine-containing peptide gallidermin (g
allidermin) (EP-342486-A1) has a high homology with about 2164 ± 2 daltons.
With a molecular weight of. The following peptide structure of Hysin M51 was analyzed by amino acid sequence analysis.
Will be revealed:
{In the array, Xaa1, Xaa2, And XaaThreeCan be any amino acid. However
However, the molecular weight of the entire peptide is 2119 ± 2 daltons. }. Preferred of the present invention
In a preferred embodiment, Xaa1And XaaThreeIs 2,3-didehydrobutyrin (2,3-Didehy
drobutyrin (Dhb)) and Xaa2Is 2,3-didehydroalanine (2,3-Di
dehydroalanine (Dha)).
Other structures of Hysin M51 are:
{In the structure, Xaa1, Xaa2, And XaaThreeCan be any amino acid.
However, Xaa1, Xaa2, And XaaThreeWithin the same peptide are Ala, Lys, and α,
It must not be β-didehydrobutyric acid. }.
The present invention provides, in addition to a suitable carrier, an antibacterial effective amount
An antimicrobial composition comprising an antimicrobial peptide containing a peptide. More particularly, the present invention
In addition to a suitable carrier, a pharmaceutically effective amount of the lanthionine-containing anti-antibody according to the invention is
A pharmaceutical composition comprising a bacterial peptide or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof.
I do. In a preferred embodiment of the invention in a mammal, which is preferably bovine
A pharmaceutical composition for the treatment and prevention of mastitis, which comprises, in addition to a suitable carrier, a medical composition
A pharmaceutically effective amount of the antibacterial compounds according to the invention or their pharmaceutically acceptable
Provided is one that comprises one of the acid addition salts.
In a Staphylococcus hicus strain 664, a lanthionine-containing anti-bacterial agent according to the present invention
The pre-peptide form of the bacterial peptide is encoded by the nucleic acid molecule. This pre
The structural gene of the peptide is bacterial
It is encoded by DNA, while the template for translation of its prepeptide is
Composed of RNA. Therefore, the present lanthionine-containing antimicrobial peptide or its corresponding prepep
Nucleic acid molecules encoding tides form another aspect of the invention. Preferably
The nucleic acid molecule has the following nucleotide sequence:
Or the following nucleotide sequence:
Comprising.
The nucleic acid molecule according to the present invention has the following:
(A) In a certain microorganism, a genomic copy of Staphylococcus hycas strain 664
Build a braly;
(B) The above library for sequences having homology with the structural gene of galidermin
Screened;
(C) identifying a clone comprising the structural gene for hysin M51; and
(D) purifying the nucleic acid molecule from the identified clone,
Can be obtained by a method including.
For the construction of its genomic library, Staphylococcus hycas strain
The 664 chromosomal DNA is partially or completely digested with restriction enzymes. Complete restriction erase
In the case of modification, a suitable restriction enzyme is preferably the coding for the hysin M51 gene.
Do not cut inside the area. The resulting restriction fragment can be digested immediately after restriction digestion or for any size.
After another stage
In either case, ligate to a plasmid vector. Plasmid vector
The resulting collection of various DNA fragments cloned into the
Later, it is transformed into a microorganism. Preferably, the microorganism used is E. coli (E.
coli) or bacteriophage-infected E. coli.
The obtained genomic library has homology with the structural gene of galidermin
It can be used to screen for sequences. Preferred nucleic acid pro
Screening procedure using hybridization with a probe
t al. It is described in. Restriction digestion of the Galidermin gene with a suitable probe
Or using the polymerase chain reaction to increase the defined region of the galidermin gene.
It can be obtained by the width. Non-radioactive instead of radio-labeled nucleotide
Nucleotide labeled with a sex label, for example, digoxigenin (DIG)
Can be used for labeling this probe.
10 of the above genome library2~Ten6, And, preferably, 10Three~TenFiveclone
Are screened using the Galidermin probe described above. Positive clone,
That is, clones showing hybridization with the used clones were
Further characterized by purification and sequencing of the cloned DNA contained in
To identify the structural gene for the hysin M51 peptide.
In order to produce the hysin M51 structural gene in the microbial host,
It can be used in biotechnology. For this purpose, the inn
Must have the enzymatic contraption that makes the post-translational modifications found in hysin M51.
I have to. For some lantibiotics,
Many genes have been shown to be involved in their production. Their corresponding inheritance
The exact role of the offspring is not known in all cases, but they do
Lantibiotics for pre-form processing of these proteins
Introducing modifications that are typically within, as well as transporting the protein across its membrane
There is evidence that it is necessary for, and for immunity. Researched to date
In all cases, these genes are responsible for the lantibiotics.
It was discovered as a cluster around the structural gene. Epidermin
) For a comprehensive overview of the subject, including the gene organization of the operon, see “Nisin
and Novel Lantibiotics ”(Jung, G. and Sahl, H-G., 1991).
Wear.
Epidermin and Hysin M51 are structurally very similar, so
Genes required for the production of syn-M51 are also shown for lantibiotics.
It is reasonable to assume that it is organized in an operon close to the various structural genes
. The DNA sequence of the structural gene for hysin M51 constitutes a preferred embodiment of the invention.
I do. The flanking sequence contains a structural gene whose fragment is for hysin M51.
Isolated from the genomic library of Staphylococcus hycas consisting of 6.
It can be easily obtained by whole sequence analysis of a 5 kb DNA fragment. 6.5kb cut
An additional clone comprising Staphylococcus hycus genomic DNA flanking the piece.
Clones of the loan and all its operons are well known in the state of the art.
It can be easily obtained by the procedure described above. Then containing the isolated operon
A DNA molecule consisting of a bacterial strain, such as another strain of Gram-positive bacteria, and
It can be replicated and expressed in Staphylococci.
Can be cloned into a plasmid. For example, Augustin et al (19
91) is an S. epidermidis to S. Clonin of the epidermin gene to carnosus
For migration and transition
I have written about it. Gene transfer required for the production of lantibiotics
Can be achieved without any detailed knowledge of the genes involved. example
For example, McKay et al (1984) and EP-137869 show a conjugative transfer.
Describes the transmission of the production of nisin. Hansen et al (1991)
Two strain repressions (ob) B. subtilis between subtilis (subtil
achieved the transmission of production.
Therefore, a microbial host lacking the mechanism of the enzyme to produce hysin M51 is
Genetically modified in such a way that the required post-translational modifications can be made
Could be It is responsible for post-translational modifications in its microbial host
It can be achieved by expressing the gene encoding the enzyme responsible.
It will be possible. The relevant gene is found in the microbial host by transformation or zygotic transfer.
Could be introduced in.
The application of antibiotics to treat mastitis generally presents a serious problem:
Includes cheese and yogurt manufacturing issues. These processes produce milk bacteria
Fermentation, and therefore the remaining agents with antibacterial properties, endanger them.
Causes reduced efficacy of mastitis treatment in cattle with these agents,
There is a considerable reduction in the antibacterial effect of these agents in the presence of milk.
Has also been established (Jnng et al., 1992).
Therefore, on the one hand, it is well control of bovine mastitis and non-toxic to warm-blooded animals.
And, on the other hand, play a role in cheese and yogurt production
Antibiotic peptides, e.g. exerting only a slight effect on bacteria in milk
For example, it has long been felt that it is necessary to discover the peptides of the present invention.
Was.
Another aspect of the invention is a method of treating or preventing mastitis in a mammal, the method comprising:
More preferably, a mammal such as a cow, a goat, or an ewe is treated with a medicine.
And an effective amount of the lanthionine-containing antimicrobial peptide of the present invention or as a pharmaceutical
To one of the acid addition salts contained therein. This administration
Performed either before or after infection by the mastitis-causing pathogen
Can be done and it can be done before or after delivery.
As mentioned above, the present invention relates to the treatment or prevention of mastitis. "Treatment" means milk
It means to cure or ameliorate animals with tufts. Preventing mastitis
"To prevent" the occurrence of the infection, or if it occurs later,
It means softening the severity of dyeing.
Surprisingly, the lanthionine-containing antibacterial peptide and drug according to the present invention
Acid-acceptable acid addition salt is highly active against pathogens that cause bovine mastitis
And, even more surprisingly, they have their anti-pathogenic effect in the presence of milk.
It has been discovered that it shows almost no inhibition at. Most importantly,
Significantly improved utilization of milk from treated cattle in cheese and yogurt production
As described above, the lack of inhibition in the presence of milk results in therapeutic doses and hence milk
To allow a reduction in the amount of residual lanthionine-containing peptide in the.
Therefore, one important aspect of the present invention is to provide a test mammal with a lanthionide according to the present invention.
Administration of an antimicrobial peptide containing a peptide or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof
Treatment or prevention of mastitis in the family. A preferred embodiment of the present invention is
Treatment or prevention of mastitis in cattle. Books for this purpose
Invention is independent
Or in combination, a peptide of the present invention or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof
It is contemplated that any form of The present invention relates to the native form of the active agent
Using. However, the production of recombinant peptides is
Recombinant peptides are preferred because they have substantial advantages for peptide purification.
It is like. Synthetic forms of the antimicrobial peptides according to the invention and exhibiting the same biological activity
Muteins that exhibit slight structural differences to the native product are also within the scope of the invention.
.
The activators according to the invention are usually prepared as ready-to-use liquid formulations,
And saved. Aqueous solutions can generally be applied, but the above formulations
Can also be suitable for a particular type of administration. Therefore, this compound
Contains a nonionic surfactant that does not carry a well-defined charge when dissolved in an aqueous medium.
Selected from ethoxylated esters of fatty acids and triglycerides
It is. Hysin M51 compound is a combination of EDTA and anthracite to improve its antibacterial spectrum.
Preservatives such as methionine, ascorbic acid, and preservatives such as propylene
And glycol.
Typically, the active agents according to the invention are administered by intramammary injection;
, Effective doses are parenteral, transdermal, by implant, and also by immersion.
Can be administered. In a preferred aspect of the invention, the administration is intramuscular.
It is given via intramuscular, subcutaneous or intravenous injection. Prepared as injectable
At this time, the active agent according to the present invention is generally a pharmaceutically acceptable excipient (rehicleo).
r capsule) is administered. Suitable excipients are, for example, different sets of
Water, saline, mannitol, dextran, amino acids, gly
Cerrole and others. In addition, if desired, the excipient may be an auxiliary substance, eg
For example, a wettable powder or an emulsifier,
Preservatives and pH buffering agents can be included. The active ingredient is typically
About 0.001% to about 95% (w / w) of the composition given, or even higher or lower as appropriate.
Yes, it will be in range.
Parenteral administration is customarily by subcutaneous, intradermal, intramuscular, and even intravenous injection.
Can be performed. Needle e-less air blast injection device
Can be equally useful. Parenteral administration is a common practice in this field.
Known and performed in the usual way in the veterinary or human medicine field
be able to.
The active agent for achieving a delayed release (so-called “slow release”)
The long-acting action of the tampering with the tamper in the matrix will physically block the fast dissolution.
It can be obtained by blending the quality of the clay. This formulation matrix is animal
Injected into the body of the body, where it then slowly releases its protein
Remains as a depot to be used. Useful adjuvants are polymers and lactides.
It is a copolymer of glycoside and glycoside. In addition, aluminum, calcium or ma
Gnesium monostearate or carbohydrates (cellulose, pectin, dex
Tolan derivative), polysiloxane or protein (gelatin, collagen)
Such gelling agents prolong the release time of the active agents according to the invention after parenteral application.
And will be able to. Transdermal administration is made, for example, from silicone or wax
It is also meant to include implantation of controlled release devices, and from polymeric materials.
Other implantable matrices also deliver the compound subcutaneously over time.
Can be used to It contains an aqueous solution of the protein
It can also be achieved by implanting mini pumps.
Polysiloxane carriers are available in a variety of hormone delivery forms.
For the release of the active agents according to the invention and described in the art for
Can be suitable for. Collagen delivery for antibiotic release
The Lee system is published in German Offenlegungsschrift, DE-3,4.
No. 29,038. This system also contains lanthionine according to the present invention
Suitable for antimicrobial peptides and pharmaceutically acceptable acid addition salts thereof
There can be.
Delayed release of the peptides according to the invention and their pharmaceutically acceptable acid addition salts
Formulations and other pharmaceutical or veterinary formulations have been previously described in the art, for example.
Modified lanthionine-containing peptide compounds or other protein compounds.
And can be prepared.
A "therapeutically effective amount" of an active agent of the present invention refers to the amount in the subject to which the active agent is administered.
At a dose sufficient to either prevent or treat mastitis in
You. The dose of the active agent of the present invention that can treat or prevent mastitis is appropriate.
Routine trials with controls facilitated by one of ordinary skill in the art in view of the above disclosure.
Can be determined. The comparison of the appropriate treatment groups to their controls is specifically
A fixed dose is used in the prevention or treatment of diseases used under controlled load.
Will be shown to be effective. Generally, the effective dose depends on the method of administration.
Will exist. In the case of intramammary injection using Hysin M51, 0.1
Administration of mg to 10 mg is Staphylococcus aureus
Sufficient to control mastitis due to.
When administered intramuscularly, subcutaneously, or intravenously, the effective dose will be based on the weight of the animal.
Will depend on, and typically, from about 2 g / kg to about 800 g / kg, preferably
Is within the range of 20g / kg to about 200g / kg
Will be done in. More typically, the dose is at least about 50 g / kg.
Yes, but less than 150 g / kg.
More than the dose, effective administration of the active agent according to the present invention depends, in part, on the number of doses.
And will depend on timing. For example, multiple doses of a fixed dose are typically
More specifically, the animals can be fed at least about 12 hours apart. Almost
In this situation, it may be desirable to administer the active agent at least three times.
There will be. Over an equal number of days or longer, eg 6, 7, 8 or
It is even more desirable to administer higher doses to the animal, such as 9 or more.
Can be desirable. The precise combination of dose and timing is
Will be subject to variations in the treatment and prevention of diseases.
Many effective combinations are readily established by one of ordinary skill in the art in view of the present disclosure.
It is believed that you can.
From now on, unless otherwise specified, this book has no limiting property and is for the purpose of explanation.
Reference may be made to the particular examples incorporated in the description.Example
A)Preparation of Hysin M51
Bacteriocin producer Staphylococcus hy 664 (Staphylococcus hy
icus 664), Czechoslovak National Collection of Type Cultures (CNCTC)
And a sample of Staphylococcus hicus strain 664 obtained from
DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganis, 17 November 1994, under DSM9547.
Close to Men und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig
It is entrusted.
0.05% Antifoam Polywax Polyol PPG2025 (BP Chemicals)
ISF200 fermentor containing 4 liters of BHI medium (Dlfco) containing (Infors AG, Bottmingen
, CH) at 10% using an overnight culture grown in BHI medium.
did. This culture was cultivated at 37 ° C. and 0.5 bar back pressure. pO2To 5-7
Varying the aeration rate between lt / min and the agitation rate between 200-400 rpm.
And maintained> 60% of saturation. (Antibacterial activity as described in Example F
Aliquot those samples onto agar plates inoculated with the indicator bacteria.
It was detected by spotting. ). 6 hours later, heat to 65 ° C for 35 minutes
I killed the bacterium. After cooling to 37 ° C, the pH was adjusted with 3M HCl.
Adjusted to 4.9.
Add 150 g of Amberlite XAD-7 (Sigma) directly to the fermentor and stir
Was continued for 2 hours at 100 rpm and aeration rate of 7 lt / min. This resin is filtered off
, And 500 ml H2Washed with O 2. Then add 250 ml of Na citrate (20 mM, pH4.0
) And then with 250 ml of the same buffer containing 20% isopropanol
2 washes and 2 washes with the above buffer containing 30% isopropanol
Purified.
Then transfer the resin to a chromatography column (Pharmacia XK50) and
Washed with another 1000 ml of 200 mM Na citrate pH 4 containing 30% isopropanol
. The activity was eluted with 20 mM Na citrate pH 4 containing 30% isopropanol.
Fractions were pooled (750 ml) and 11 ml SP Sepharose Fast pre-washed with water.
Flow (Pharmacia) was added to the pool. After stirring for 30 minutes at room temperature,
Resin was filtered off, resuspended in 0.01M HCl, and placed in a Pharmacia XK 2.6 column.
Filled. The column was washed with 100 ml of 0.01 M HCl containing 30% methanol.
This activity was eluted with the same buffer containing 0.3M NaCl. Pool active fractions
Sushi (120 ml), and 11
g of Amberlite XAD-7 (H2(Pre-washed with O) was added to the pool.
After stirring for 45 minutes, the resin was filtered off and packed in a Pharmacia XK 2.6 column.
did. The column was washed with 100 ml of 0.01M HCl and 50% isopropanol.
Elution with 0.01 M HCl containing sodium chloride. Fractions containing activity are pooled and lyophilized
did.
For analytical purposes, the above material was loaded onto RP-HPL on a Vydac C18 column (4.6 mm x 250 mm).
Further purified by C. The activity varies from 75% solvent A, 25% solvent B to 60%, 40% B.
Elution was performed with a linear gradient run at. Solvent A is 90% H2O, 10%
Cetonitrile, 0.1% TFA, solvent B is 10% H2O, 90% acetonitrile, 0
It was .1% TFA. The protein was monitored by UV detection at 213 nm.
Typically, 1 ml fractions were collected and analyzed for activity. Active image
The minutes were dried by vacuum centrifugation.
B)Sequence analysis and amino acid characteristics of hysin M51
Amino acid sequence information can be obtained in the gas phase using the protocol supplied by the manufacturer.
Obtained using a sequencer (Applied Biosystems, Foster City, California).
These results indicate that after its N-terminal Ile, the peptide is no longer available for sequencing.
The presence of an abnormal amino acid at the 2-position of the peptide chain.
It shows that it shows.
C)Mass spectrometry of hysin M51 and its tryptic fragments
The mass spectrum is analyzed by the flight mass spectrometer (BIO I
ON KB, Uppsala, Sweden) for Bio Ion 20252 CF plasma desorption time
did. The device is operated at an acceleration voltage of 15 kV. Uses 1 nsec time resolution
To use.
2 g of sample was dissolved in 10 l of water / acidic acid (1: 1 v / v), and
Al covered with a thin film of nitrocellulose
Added on minium foil. Non-adsorbed protein was washed off with water.
Enzymatic cleavage of the above peptides by trypsin (Sigma, St. Louis, Mo)
Time in 0.1 M bicarbonate buffer, pH 8.5. Enzyme to substrate ratio is 1:10
is there. The tryptic fragment is purified by RP-HPLC before mass spectrometry. The result
It is shown in Table 1. Structure and structure of gallidermin-another lanthionine-containing bacteriocin-
The strong relationship of is noted.
D)Hysin M51 NMR spectrum
a)Experiment details
NMR measurement,1On a Varian Unity 500 spectrometer using the H-500MHz frequency
I went there. CDThreeOH was used as solvent.1Suppressing water in the H-NMR spectrum
Record with presaturation at temperatures between 17.5 ° C and 40 ° C. 2D spectrum
Recorded at 25 ° C, at which temperature the signal overlap in the amide region
, The smallest. Solvent CD for conversion purposesThreeOH CDThree− Multiplet Cigna
Set to 3.30 ppm. One-dimensional1In addition to the H-NMR spectrum, the following measurements are performed.
U: One-dimensional13C-NMR and two-dimensional DQF-H, H-COSY; TOCSY; NOESY; ROESY;
H, C-COSY (HSQC); and H, C-COSY-long-range (HMBC).
b)Identification of individual amino acid residues
The identification of individual amino acids was performed using the peptide structure of hysin M51 using NMR spectrum.
It constitutes the first step in the elucidation of structure. Obtained from 1- and 2-dimensional NMR experiments1
The H-NMR signal was identified as a proton spin-pattern and this was identified as
It can be assigned to an amino acid residue. DQF H, H-COSY experiment has 2 or 3 chemical compounds.
Providing a proton signal by coupling beyond the coupling distance; TOCSY experiment
Is a proton-shrinkage due to coupling over a distance of more than three chemical bonds.
Provides the flu; ROESY spectrum shows protons resulting from dipole coupling
· Signals and additional information for identification of individual spin systems
H, C-COSY experiments finally correlate with protons bound directly to carbon atoms
I do.
The following natural amino acid residues are identified within Hysin M51:
Ile, Leu, 2 × Gly, Ala, Pro, and Lys.
The following unnatural amino acid residues of hysin M51 are their H, H-coupling
Identified by pattern and chemical shift:
2 × Dhb (2,3-didehydrobutyrin), Dha (2,3-didehydroalanine),
Abu (aminobutyric acid as part of 3-methyllanthionine), and Avi (2-
Mino vinyl).
The following additional amino acid residues were identified using ROESY and H, C-COSY spectra
Will be:
Asn, 2 × Phe, Tyr, and lanthionine, 3-methyllanthionine, and 2-
6 × Ala as part of amino-vinyl cysteine.
The chemical shifts of these protons are summarized in Table 2.
c)Amino acid sequence (primary structure)
The deduced sequence of an individual amino acid residue is the NH-, alpha of its i-th amino acid
-And beta-protons and the i + 1th
Based on translation of the long-range ROESY cross signal between the NH protons of amino acids.
Good.
From translation of the data obtained, the following primary structure of hysin M51 is established:
d)Lanthionine, methyl-lanthionine, and 2-amino-vinyl-system Designation of in-thio-ether bridge
The characterization of this thio-ether bridge is the final step in the elucidation of the structure of hysin M51.
Configure stages. The designation of various Ala structures for different thio-ether bridges is
, Long-range translation of the ROESY signal. The following thio-ether bridge
Is identified:
* Two lanthionines between amino acid positions 3 and 7 and 16 and 21
* Methyl-lanthionine between amino acid positions 8 and 11
* Thio-ether bridge containing 2-aminovinyl between amino acid positions 19 and 21
E)Cloning of structural gene for hysin M51
a)Construction of genomic library of Staphylococcus hicus 664
Chromosomal DNA was incubated overnight in M17-G medium (Terzaghi et al, 1975) at 37 ° C.
The propagated S. Isolate from the culture of Hicas 664. Centrifuge the cells
Harvested and 4 mg / ml lysozyme and 40 mg / l mutanolysin
30 mM in 25 mM Tris-HCl pH8, 10 mM EDTA, 50 mM glucose at 37 ° C.
Lyse by incubation for minutes.
Then proteinase K (100 mg / l) and SDS (0.5%) were added to the above sample,
It is then incubated at 56 ° C for 2 hours. 1 volume of phenol / black
The DN after extraction with loform (1 volume of phenol: 1 volume of chloroform)
A is purified by CsCl gradient centrifugation. The chromosomal DNA obtained was used for the restriction enzyme Sau3.
Partial digestion with A and the resulting fragment was described in Maniatis et al, 1982.
Size fraction on a sucrose gradient as described. DN between 5K and 10K base pairs
The A fragment was collected and further processed by calf intestinal phosphatase (CIP).
Ligated into the BamHI linearized plasmid pUC 18. This ligation generation
The ligation mixture containing E.coli strain TG1 was ampicillin resistant
Used to transform into.
b)The above genomic library for sequences encoding hysin M51 Screening
To the sequence of the structural gene coding for galidermin (Schnell et al, 1989)
The following two complementary oligonucleotides are synthesized according to standard techniques:
The above oligonucleotide was used to increase the 151 base pair DNA fragment of the galidermin gene.
Used in the polymerase chain reaction (PCR) to broaden. Polymerase ream
For chain reaction, Perkin Elmer Cetus (Gene AmpTM) From Thermostable Taq Poly
Melase is used according to the manufacturer's instructions. Known to produce gallidermin
Known as Staphylococcus saproph
yticus) genomic DNA is used as template DNA for amplification. Hybrid
Amplification was amplified as a probe for dization.
The polymerase chain reaction, Boehringer Man, for the piece can be used.
Performed in the presence of DIG-11-UTP purchased from nheim. Obtained in section a)
Approximately 10,000 colonies of the genomic library were digested with the DIG-labeled amplification product.
Screened. Hybridization and washing steps can be performed with the DIG-11-UTP
Do as recommended by the manufacturer of Leotide. Hybrid with DIG-labeled probe
Several soybean clones have been identified. One more of these clones
Characterize. It consists of pUC 18 containing a 6.5 K base pair DNA insert. Restriction
After cleavage of the above plasmid with the enzyme Xbal and subsequent religation, the
Reduce the insert size to approximately 1K base pairs. The sequence of this insert is United Sta
Sequenase purchased from tes Biochemicals (USB)TM Version 2 kit and suitable orientation
Determined using gonucleotides. This DNA sequence is a Galidermin structural genetic
Open reading of 144 base pairs with considerable homology to the offspring gdmA
-Frame (SEQ ID NO: 1) is revealed. Deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 4
) Establishes the results obtained from the NMR analysis of the hysin M51 peptide. After translation
After decoration, mature hycine M51 differs from galidermin in three amino acid residues.
You. The leader peptide of the two peptides results in much lower homology.
F)MIC plate assay
Streptococcus aureus and Streptococcus
Nisin (nisi against Streptococcus diacetylactis)
n) and MICs of hyicin M51 (Minimal Inhibitory C
oncentrations) was measured. S. aureus Newbould 305 is the causative agent of mastitis
The body, S. diacetylactis is used in the production of yogurt and cheese
You.
Appropriate dilution of Nisin and Hysin M51 (300,100,30,10,3,1,0.3,0.1
g / ml) in milk and in M17 broth (Merck) and stored at room temperature for 30 minutes.
I left it.
Next, a 10 ml aliquot of the above solution was added to a M17 agar plate containing 0.5% glucose.
Spotted on the table. These plates were aureus or S. diacetylactis
Soft agar (0.5% agar
Layer). Dry these spots, then these plates
Were incubated overnight at 30 ° C.
MICs are antibacterial proteins that cause the formation of transparent rings in bacterial grass.
Determined as the lowest concentration. The results shown in Table 3 show that Nadine and Hysin M51 are milk
And Streptococcus diacetilactis in both broth and broth
It shows that it has the activity of However, S. na against aureus
There is a clear inhibition of gin activity, while hysin M51 is not completely competent under these conditions.
Retains full activity.
G)Of Nadine and Hysin M51 against Staphylococcus aureus in milk effect
Staphylococcus aureus Newbould 305 with 1.0 absorbance at 600 nm
Cultures in M17 broth (Merck) at 37 ° C. Collect cells by centrifugation
, And washed in 20 mM Tris-HCl pH 8.0. Approximately 10 bacterial pellets7
Resuspended in milk at a density of cells / ml.
1 ml aliquots of this suspension were mixed with various amounts of Nadine and Hysin M51.
Incubated in Pendorf tubes. Incubate for 30 minutes at 37 ° C.
Was. A control with no antimicrobial added was run in parallel.
After incubation, centrifuge these samples to remove the cell pellet.
Obtained, this was washed twice with 1 ml of 20 mM Tris-HCl pH8.0, and 1 ml of the above batch.
Resuspended in fur. An appropriate dilution of 100 liters was added to M17 cold containing 0.5% glucose.
Plated on heaven plates and incubated at 37 ° C overnight
. Colony forming units (Cfu) were determined and percent survival was compared to that control.
And calculated.
The results are shown in Table 4. From these data, in milk, Hysin M51
It has a higher specific activity against Staphylococcus aureus than Nazine.
Is clear.
It has been well documented that nadin is inhibited in the presence of milk (Jung et al.,
1992). Clearly and surprisingly, Hysin M51 is similar in the presence of milk.
Does not show similar inhibition. This particular property makes it suitable for use in bovine mastitis.
Reasonably well suited for use as a prophylactic and therapeutic agent for Why
The therapeutic dose can be reduced as described above.
Subclinical bovine mastitis caused by Staphylococcus aureus
The efficacy of hysin M51 or its pharmaceutically acceptable acid addition salts in
For this, the infection model described below can be used.
H)Antibacterial spectrum of Hysin M51
The minimum inhibitory concentration (MIC) of hysin M51 against a panel of test organisms was determined by
Le diffusion method. Agar plates were inoculated with the above test organisms
Layered with soft agar. When the agar solidified, place a 4 mm diameter well
Made in agar (plugged)
. 50 liters of a series of 2-fold dilutions of the above peptides in citrate buffer pH 4 were added to them.
Wells are then applied and the plates are incubated overnight at 37 ° C.
The temperature was kept at 4 ° C for 2 hours before the treatment. Attach the MIC to the permeation wells around the well.
It was measured as the lowest concentration of peptide that gave a bright zone. Try the indicator strain Tryptose Brochure
Cultured in Difco. M17 medium (Merck) used for plates and soft agar
did. However, Pasteurella haemolytica (5%
Tryptose supplemented with fetal calf serum), Leuconostoc mesenteroids (Le
uconostoc mesenteroides) (plate count agar-Merck-, + 15% sucker)
), And Bacillus cereus (plate count cold
Heaven + 0.2% potato starch-Sigma 2004-). The results are shown in Table 5.
I)Hysin M51 or its pharmaceutically acceptable acid in subclinical bovine mastitis Experiments to assess the efficacy of addition salts
To supply a herd of cows with candidate cows for enrollment in the trial
To feed. Cattle are obtained from local cattle handlers. These cows are 15 l /
Must have a minimum daily milk production. Two milk samples were tested for microbes.
Every other day from every breast area. That the mastitis pathogen is totally recovered from it
Cattle that cannot survive are included in the above test. Uninfected cattle or goats in whole udder
From two milk samples taken every other day from Staphylococcus aureus
Choose based on lack of income. Next, the three breast areas
, Inoculated via the intramammary route using a suspension of Staphylococcus aureus
I do. The fourth quadrant serves as a control. In goats, one of the two breasts
, Inoculate half. Milk samples at least 3 times at least 3 times over 2-4 weeks after inoculation
Staphylococcus aureus can be recovered by collecting from the breast area
To see if and, therefore, the mammary region became infected.
Sympathize. Staphylococcus aureus has at least 2 of the above milk samples
A mammary block is defined as infected if recovered from the. Treatment is infected
Randomly assigned to the breast compartment and injected via the mammary route. Milk sump
Samples are collected daily for a minimum of 14 days after the last treatment. Within 7 days after last treatment
, The milk sample from that area becomes negative (ie, Staphylococcus
・ Aureus was not collected at all), and throughout the sampling period
A breast segment is defined as cured if it is negative.
The above experimental model has a fixed framework on it to evaluate the treatment.
I used it like this. Studying with Staphylococcus aureus
Is the most difficult Gram-positive bacterium to treat, and bovine mastitis
It has the advantage of being one of the most important bacteria to cause. Therefore, that
The healing rate of other Gram-positive bacteria, such as Streptococcus and
Coagulase-lower than for negative Staphylococcus
Is expected.
This model has proved satisfactory. Because the infection rate in the breast area
This is because the average is 60%. In addition, this infection is essential for subclinical mastitis.
It is loose as required.
To optimize the workload with respect to man power, 8-16
Cattle or goats will be included in each trial. The test usually lasts 5 weeks.
Analysis method
1)Data management and analysis
Created using the well-known statistical analysis computer program SAS
Use a data entry / management system.
2)Definition of healing rate
Often, the udder is treated as an independent statistical unit, and the rate of healing is
, Based on results from individual breast blocks. This is incorrect. Because the same cow
In, the breast division does not behave independently. Milk in cows in the literature
The correlation of the tuft segment is estimated to be 0.25. From our data, we can
The correlation in the patient model is estimated to be between 0.15 and 0.35.
We show that the udder that was infected in the cow and then treated
(1, 2 or 3), the number of udders healed in the cow, and the udder segment
To calculate the bovine healing rate for a given treatment, taking into account the correlation of
To use. One result using such a method is
From 3 dairy plots about it, compared to 3 cows with 1 cured from
3 out of which healed 1 cow is given greater weight
You. The result is that the more breast areas are infected, the less they heal
Consistent with the observation that would be. This problem does not occur in goats. Why
, We infect only one-half of each goat's udder.
3) Other factors affecting healing
Other factors are known or suspected to affect healing. Because
, Because natural healing can occur in up to 20% of cases. this
Some of these factors are “cow” factors (eg breed or milk yield),
The other is a "quarter" factor (eg, the location of the breast area on the breast).
We used the following bovine factors (cowfactors), And need
Adjusted according to: Breed, Lactation Stage, Lactation Stage, Pretreatment Daily Milk Production and Test
The number of hours used for. Appropriate adjustments are also made to goats.
Breast division factors that must be considered (Quaterfactors) Is the following
: Number of bacteria present before treatment, number of bacteria present during treatment, in treatment
SCC, location (before or after), infection history, and treatment history.
There is no statistical analysis that allows us to study bovine and mammary factors simultaneously.
Yes. Therefore, we transform some mammary factors into bovine factors. We are
Infection levels in all infected breast areas
And defined the median infection level for cattle, and we
Define a median SCC for cattle based on all SCCs in the infected udder.
We find that such data pooling allows us to detect the effects of breast factor.
I know I could be able to prevent
We have no alternative law. However, we do not have a final translation of the results.
I don't think it will come. Because these factors are generally
This is because the groups are in equilibrium. For example, the back breast area is smaller than the front breast area.
Non-curing (30% vs. 45%), but the proportion of later breast segments in all treatment groups
Varies between 30 and 40%.
4)Comparison of effects between treatments
Adjust for the above factors and compare the inequality ratios to compare the effects between treatments.
Calculate (odds ratio). These adjusted inequalities are confusing to all other
The factors are kept constant to compare the chance of healing between the two treatments. For example, with treatment A
If the inequality ratio between B is 3, cows treated with A are treated with B.
Tends to be healed three times more than what was given. 95% about this inequality ratio
Compute the confidence interval. Treatments are statistically different when 95% confidence intervals do not include 1.
.
5)Breast soaking and mastitis prevention
Breast steeping is most often used to prevent mastitis in dairy cows, and
It is one of the most effective means taken. This widely practiced procedure is
Immersing the four udders of each cow in the liquid after each milking. This procedure
, Leaving a coating of antibacterial substance on the breast surface, and a drop of this substance
Collect in the sagging part of the breast beyond Liffith. After squeezing the milk, the milk drops
It often covers the breast orifice and is a good medium for bacterial growth.
You. From this position, the bacteria can easily pass through its streak canal
Can be Breast soaking provides protection against these possibilities.
In some groups, the breast is placed on the surface of the breast before the milking device is applied.
It is soaked before milking to kill any of the pathogens in. Breast before squeezing
Being useful as a dip, the agent is non-toxic to cheese and yogurt production.
Must be and non-destructive.
Recently used products for breast dipping include a wide variety of different active ingredients such as yogurt.
Iodophors, chlorhexidiene and lanthio
It contains a nin-containing peptide, nidin. Hysin M51 and its pharmaceutically acceptable
Acid addition salts have their fast killing effect and preferential activity against major mastitis pathogens.
Because of, it is very suitable for use in breast dips. Fast killing is a thing
It gives a special application as an agent for presoaking.
6)Breast immersion protocol
Hysin M51 and its pharmaceutically acceptable as preventive agent for bovine mastitis
The following experimental protocol can be used to evaluate acid addition salts
.
Experimental animals: 50 cows in the treatment of subclinical Staphylococcus mastitis
Recruit according to the protocol previously described for the Hysin M51 test
You. This test is then used to test the efficacy of breast fungicides during experimental exposure.
, US National Mastitis Council (NMC) (Hogan et al. 1990)
Proceed according to the protocol.
All breasts were squeezed on weekday evenings throughout the test period.
15 x 10 after7Streptococcus aureus
And 5 × 107Streptococcus agalactiae
Immersion in an infectious bacterial suspension containing Infectious suspensions are prepared weekly
Prepare daily from stock solution. Plate an aliquot of infection solution daily to
The concentration of true bacteria present at the time of dyeing is measured.
After each milking, soak the front left and right rear mammary sections in the test preparation of fungicide, etc.
2 breasts are left as negative controls and not soaked. all
A regular mammary block, a sample from the beginning of milking, was distributed throughout the study for microbiological testing.
Sampling twice a week. Any infectious organism from which it is isolated
The breast area is resampled from its original sample within 48 hours. Same organism
However, if isolated, the mammary area is considered infected. Any infection
An episode of clinical mastitis caused by an organism involves a new intramammary infection (i
ntramammary infection (IMI)).
At the end of the study period, the number of new intramammary infections between treatment groups is compared.
7)Hysin M51 in cheese and yogurt
High strains against strains of bacteria used in cheese and yogurt production
In order to evaluate the potential effects of M51 or its pharmaceutically acceptable acid addition salts,
The following experiments can be performed.
7.1Milk treated with Hysin M51 or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof Evaluation of the reaction rate of Delvotest P in milk from the bunches
Background information: Delvotest P is commercially available for the detection of antibacterial agents in milk
It is a widely used kit. It is Bacillus stearothermophilus
(Bacillus stearothermophilus) growth
Rely on the inhibition of. This indicator bacterium was placed in a plastic test tube along with a pH indicator.
Suspended in an agar plug. Bacterial growth is due to acid production and color change
Bring In the presence of inhibitors, the bacterium does not grow and changes color
There is no. Bacillus stearothermophilus is used for cheese and yogurt production.
Is a good representative of the bacteria used, and hence the detection of antibiotic residues.
Widely used as an index stock in.
experimental method: This experiment is conducted at the same time and in the same animal as the above efficacy test.
. Samples taken in milking in the morning and evening over the post-dose period of various treatments
I do. Take these samples with the Delvotest P as instructed in the manufacturer's instructions.
Use to evaluate. This twice daily sampling was performed on all treated milk.
Continue until the tuft shows a negative response. This method allows you to determine the elapsed time for removal of the antibacterial agent.
You can stand.
7.2Hysin M51 or its medicine for acidification of milk by cheese-initiating bacteria Evaluation of the effect of various concentrations of pharmaceutically acceptable acid addition salts
In cheese and yogurt production, different strains of bacteria are fermented in milk
, And one of the most important and rapid changes resulting from this fermentation is the production of acid.
It is good. This acid is harmful to the product, or worse, to its consumers.
Source of secondary bacterial growth control that could cause disease
Is the cause. In addition, fermentation of the lactic acid-producing bacterial population is dependent on the bacteria used.
Creates changes in cheese that vary with the strain and its method of manufacture. these
Factors are responsible for the different cheese physical properties and aromas.
Acidification is the first and most important part of the manufacturing process when milk is fermented.
This is an important stage. If acidification proceeds normally, everything
It seems that the other stages of will be normal. Therefore, some people are involved in these manufacturing processes.
Different concentrations for the rate of milk acidification by different bacterial strains used in
To determine the ability of Hysin M51 or its pharmaceutically acceptable acid addition salts
it can.
Protocol: The experiment was routinely performed using one of the following three bacterial strains:
To do:
Streptococcus thermophilus
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus lactis-diace
tylactis)
Preparation of preservation culture: Lyophilized as used in commercial conditions
Whether the culture was Rudolf Wittwer, CH-5002 Rombach, Aarau, Switzerland
Get from These cultures were reconstituted according to the manufacturer's instructions and sterilized
Reactivates after 3 passes in milk. Each passage for each bacterial strain
Incubate at appropriate temperature for 16-18 hours.
The culture obtained after the 3rd passage was diluted to 2% with whole sterilized (UHT) milk and
l Aliquot into tubes and cool at -20 ° C for use in experiments.
Freeze.
Experimental culture preparation:
Thaw previously stored cultures at 40 ° C and then incubate overnight at 37 ° C.
Incubate and test sample in fully sterilized (UHT) milk at a concentration of 2%.
Used to inoculate le.
Test sample preparation: Antibacterial agent under test (hysin M51 or its drug
Of the acid addition salts that are allowed to be sterilized (UHT
) Dilute in whole milk. These samples
Then inoculated with 2% by volume of the experimental culture of the strain of bacteria to be tested
I do. These samples are then mixed and, under evaluation, of the above bacterial strains.
Incubate at optimal temperature for 8 hours after inoculation at this pH
Every 2 hours and then at 18 hours. Different concentrations of active ingredients
The rate of acidification of milk containing is then compared to the rate without any active ingredient.
Can be.
While the invention has been fully described above, many changes and modifications may be made to the nature of the invention.
It is obvious to a person skilled in the art that what can be done without departing from the scope of the attached claims.
It will be obvious.
Deposit
Dedication
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
// C07H 21/04 A61K 37/02 AEZ
(C12N 15/09 ZNA
C12R 1:44)
(C12P 21/02
C12R 1:19)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG),
AM,AU,BB,BG,BR,BY,CA,CN,C
Z,EE,FI,GE,HU,IS,JP,KG,KP
,KR,KZ,LK,LR,LT,LV,MD,MG,
MN,MX,NO,NZ,PL,RO,RU,SG,S
I,SK,TJ,TM,TT,UA,US,UZ,VN
(72)発明者 ラシュドルフ,フリッツ
スイス国,ツェーハー−4058 バーゼル,
クラインリーヘンシュトラーセ 101
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ビファングベク 24─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI // C07H 21/04 A61K 37/02 AEZ (C12N 15/09 ZNA C12R 1:44) (C12P 21/02 C12R 1:19) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AU, BB, BG, BR, BY , CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, IS, JP, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MN, MX, NO, Z, PL, RO, RU, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Raschdorf, Fritz Switzerland, Zecher-4058 Basel, Kleinrichhenstraße 101 ( 72) Inventor Schneider, Joseph Germany, Day-79664 Behr, Bifangbek 24