JPH09512704A - Products and methods for modulating signal transduction pathways - Google Patents

Products and methods for modulating signal transduction pathways

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JPH09512704A
JPH09512704A JP7524210A JP52421095A JPH09512704A JP H09512704 A JPH09512704 A JP H09512704A JP 7524210 A JP7524210 A JP 7524210A JP 52421095 A JP52421095 A JP 52421095A JP H09512704 A JPH09512704 A JP H09512704A
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ジヨン・シー キヤンビア，
クリストフアー・エム プレイマン，
マーカス・アール クラーク，
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ナシヨナル・ジユーイツシユ・センター・フオー・イミユノロジー・アンド・レスピラトリー・メデイシン
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Abstract

(57)【要約】 細胞内のシグナル変換経路を調節するための産物および方法が開示される。本発明のある態様は、チロシンキナーゼ、脂質キナーゼ、およびアダプター分子の活性を調節するのに有用な、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨアミノ酸モチーフを有するペプチドに関する。本発明の別の態様は、チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、そのことによりチロシンキナーゼによるエフェクターの結合および活性化を遮断しうるペプチドに関与する、細胞内のシグナル変換経路を阻害するための産物および方法に関する。先の化合物およびペプチド組成物の両方共が、一例ではアレルギー応答、自己免疫性疾患、炎症性応答、癌、免疫不全性疾患、免疫増殖性疾患、ならびに例えばＥＢＶおよびＢＬＶのようなウイルスにより生じる疾患などの医学的障害の治療に有用であり得る。   (57) [Summary] Disclosed are products and methods for modulating signal transduction pathways within cells. One aspect of the invention relates to peptides having a YXXLXXXXXXXXXXXXXXX amino acid motif useful for modulating the activity of tyrosine kinases, lipid kinases, and adapter molecules. Another aspect of the invention is a product for inhibiting an intracellular signal transduction pathway involving a peptide that binds to the SH3 domain of a tyrosine kinase, and thereby blocks effector binding and activation by a tyrosine kinase. And about the method. Both of the above compounds and peptide compositions are in one example allergic, autoimmune, inflammatory, cancer, immunodeficient, immunoproliferative, and diseases caused by viruses such as EBV and BLV. May be useful in the treatment of medical disorders such as.

Description

【発明の詳細な説明】 シグナル変換経路を調節するための産物および方法 本発明の一部分は、全てｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（米国国立衛生研究所）により与えられたＵＳＰＨＳ Ｇｒ ａｎｔｓ ＡＩ２１７６８、ＡＩ２０５１９、ＡＩ２９９０３、およびＤＫ４７ １２１による米国政府の援助を得て成された。 米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。 関連出願の相互参照 本出願は、１９９４年３月１７日に出願された「Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ Ｐ ｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕ ｃｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ」についての米国特許第０８／２１５，１１６号 の一部継続出願であり、この特許は引用によりその全てが本明細書に取り込まれ る。 発明の分野 本発明は、チロシンキナーゼ、脂質キナーゼ、およびアダプター分子の活性を 調節することが可能なペプチドを用いる、細胞内でのシグナル変換経路を調節す るための産物および方法に関する。 発明の背景 全ての多細胞生物では、細胞から細胞へのコミュニケーションは生物体内に含 まれる多数のタイプの細胞の増殖、分化、および代謝と同調している。長距離に わたる細胞間のコミュニケーションはシグナル分子として作用する細胞外産物（ リガンド）により促進される。シグナル分子 はその生物体を通って特異的細胞へと移動して行き、その細胞内ではそのシグナ ルはそれらのシグナル分子と結合することが可能なレセプターを有する標的細胞 にのみ特異的応答を誘導する。レセプターへのシグナル分子の結合はレセプター を保持する細胞内での複雑な細胞内反応を開始させ、その細胞内に存在する分子 の改変を開始するか、もしくは遺伝子発現のパターンを変化させることとなり、 そのことによりその細胞の生物学的機能の変化がもたらされる。この過程がシグ ナル変換と称される。 細胞内でのシグナル変換ネットワークを調節するための方法を理解および発見 することの必要性が長年論じられてきていたにも拘わらず、このようなネットワ ークが複雑であるがために、疾患に関与するシグナル変換ネットワークを調節す るための産物および方法の開発が阻まれてきた。ある蛋白質が標的分子に結合す ることにより多様な生理学的現象がもたらされることが可能である。蛋白質は標 的分子を、例えば：その標的分子のアロステリック変化；その標的分子のリン酸 化；もしくは細胞の他の領域へのその標的分子の転移により改変することが可能 である。思わぬ発見により得られたことであるが、蛋白質と標的分子との間の結 合は例えば、標的分子の活性化の原因であったり、阻害活性の原因であったりす る可能性があるため、シグナル変換ネットワークの内のどの特定の段階が特定の 生物学的機能を生じる究極的原因となっているのかを予測することが困難となっ ている。 特定の細胞経路がどのように作用し、かつどの分子および／またはそのような 分子の機能因子がそのような細胞経路を開始および／または調節する原因となっ ているのかを解明する必要性自体が残されたままになっ ている。特に、シグナル変換ネットワークの特異的段階の有効な調節を可能にす る産物および方法についての必要性が存在する。シグナル変換ネットワークの特 異的段階の調節により細胞内でのシグナル変換の予想可能な制御の実施が可能と なり、このことにより細胞のシグナル変換経路に対する異常により生じる様々な 疾患の治療が可能となる。 発明の要約 本発明は一般的にはシグナル変換経路の調節に関し、そしてより具体的には細 胞の変換経路の２つの特定の部分に関する。シグナル変換経路内の特定の分子間 のこれまで認められてはおらずかつ気づかれていなかった相互作用により、我々 は細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、および多分化能 性幹細胞）の調節を可能にする産物および方法を解明した。その上、本発明によ り、アレルギー性応答、自己免疫疾患、炎症性応答、癌、免疫不全性疾患、免疫 増殖性疾患、ならびびにウイルス性疾患（これにはエプスタイン−バール（Ｅｐ ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）感染（例えば、慢性疲労症候群もし くは感染性単核細胞症）およびウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）感染（例えば、Ｂ リンパ球の形質転換）が含まれるが、これらには限定されない）を初めとする様 々な医学的障害の調節および治療が可能となる。 本発明の一つの態様はシグナル変換を調節する方法を含み、その方法は細胞を 、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨというアミノ酸モチーフを有するペプチドも しくはそのミメトープを含む化合物の有効量に接触させることを含む。本発明は 更にそのような化合物を含む治療用組成物、ならびにチロシンキナーゼおよびチ ロシンキナーゼの活性を測定するための方法と組合わせてそのような化合物を利 用するキットに関する。 本発明の他の態様はシグナル変換を調節するための方法を含み、その細胞を、 チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、そのことによりチロシンキナーゼ へのエフェクターの結合を遮断することが可能なペプチドもしくはそのミメトー プを含む化合物の有効量に接触させることを含む。本発明は更にそのような化合 物を含む治療用組成物、ならびにチロシンキナーゼおよびチロシンキナーゼの活 性を測定するための手段をそのような化合物と共に含むキットをも含む。 本発明の他の特徴および態様は、以下に提供される図面および詳細な説明の考 慮の後には当業者には明白になるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、細胞のシグナル変換経路の概略図である。 図２は、レセプター結合の前および後の細胞内反応の概略図である。 図３は、Ｉｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフスイッチ突然変異体の図 面表示である。 図４は、野生型もしくはＩｇ−α／Ｉｇ−βスイッチ突然変異体への蛋白質結 合を表す。 図５は、ＡＲＨ１ペプチドへの蛋白質結合を表す。 図６は、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフの点突然変異体の結合活性を表す。 図７は、野生型、および３つのチロシンがフェニルアラニンに変化させられた Ｉｇ−α ＡＲＨ１融合蛋白質への蛋白質結合を表す。 図８は、野生型およびＩｇ−αチロシン突然変異化融合蛋白質へのＦｙｎ蛋白 質の結合を表す。 図９は、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフのチロシンリン酸化に対するＦｙｎ結合 性を説明する。 図１０は、非リン酸化およびリン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドへの蛋白質 結合を表す。 図１１は、Ｉｇ−αおよびＩｇ−βペプチドのリン酸化に対するＦｙｎの結合 性を表す。 図１２は、二重にリン酸化されたＩｇ−αおよびＩｇ−βへのＦｙｎ結合を表 す。 図１３は、リン酸化Ｉｇ−α蛋白質による結合を受けた際のＦｙｎ蛋白質の活 性を説明する。 図１４は、リン酸化Ｉｇ−αペプチドに結合したＦｙｎ蛋白質の比活性を説明 する。 図１５は、ＬｙｎおよびＦｙｎ蛋白質による２つの高プロリン領域のリン酸化 の刺激化を表す。 図１６は、ｐ８５ペプチドへのＦｙｎおよびＬｙｎ蛋白質の結合性を表す。 図１７は、ｐ８５ペプチドへのＳＨ３ドメイン融合蛋白質の結合性を表す。 図１８は、ＳＨ３ドメイン融合蛋白質によるＰＩ−３Ｋの活性の刺激化を説明 する。 図１９は、ｐ８５ペプチドによるＰＩ−３Ｋ活性の刺激化を説明する。 図２０は、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフを用いるＳｈｃ蛋白質の免疫沈降法を 説明する。 図２１は、様々なリン酸化および非リン酸化ＡＲＨ１モチーフを用い るＳｈｃ蛋白質の免疫沈降法を説明する。 図２２は、リン酸化Ｉｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフならびに非リ ン酸化Ｉｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフを用いるＳｈｃ蛋白質の免疫 沈降法を説明する。 図２３は、様々な二重リン酸化ＩＴＡＭペプチドへの、ＰＩ−３Ｋ、Ｓｙｋ、 Ｌｙｎ、およびＳｈｃ蛋白質の確認的(differential)結合を説明する。 詳細な説明 本発明は、細胞内のシグナル変換経路を調節するための新規の産物および方法 に関する。本明細書内に用いられる際には「シグナル変換」は、細胞の外側の環 境に基づき、その細胞がその生物学的機能を改変することが可能になる細胞内の 化学反応を意味する。本発明は細胞内のシグナル変換経路を調節することが可能 な２つの新規の化合物を含む。本発明の最初の新規の化合物は、ｓｒｃ−ファミ リーのチロシンキナーゼ、ｓｙｋ−ファミリーのキナーゼ、Ｓｈｃ分子、および ／またはＰＩ−３Ｋの活性を調節することが可能なペプチドを含み、そのような ペプチドはＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨというアミノ酸モチーフ［このモチ ーフ中、Ｘはいずれかのアミノ酸であることが可能であり、そしてΨはロイシン もしくはイソロイシンのいずれかであることが可能である］、またはそのミメト ープにより表されるアミノ酸配列を含む。本発明の第二の新規の化合物は高プロ リンペプチド（高Ｐｒｏペプチド）もしくはそのミメトープであり、これはチロ シンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、そのことによりキナーゼのそのキナー ゼのエフェクターへの結合を阻害することが可能である。本発明に従うと、本明 細書に特定されるよ うなペプチドを含むいずれかのアミノ酸配列もしくはそのようなペプチドをコー ドする核酸配列は、そのような配列のミメトープを含む。 本発明は特に、細胞内でのシグナル変換の様々な段階を調節することにより多 種多様な細胞機能を調節するための新規の化合物を提供し、かつ細胞内でのシグ ナル変換を調節することが可能なさらなる化合物を同定するための方法を提供す るという点で特に有利である。 シグナル変換経路は細胞をその環境に適合させることを可能にするために、細 胞によって用いられる。シグナル変換経路は細胞の外界から受信されるシグナル を、その細胞の原型質膜を横断させ、細胞の細胞質を通して核内に伝達する。こ の様式で伝達されるシグナルにより典型的には細胞内での遺伝子発現の変化がも たされる。複数の細胞性因子が細胞内でのシグナル伝達の調節の原因となること があり得る。このような因子には、イニシエーター分子、トランスデューサー分 子、増幅因子分子、初期標的分子、および第二メッセンジャー分子が含まれる。 本明細書に用いられる際には「分子」は蛋白質もしくは脂質を意味することが可 能である。提案されているシグナル伝達経路の概略図が図１に示される。 イニシエーター分子は細胞内でのシグナル変換を開始することが可能である。 イニシエーター分子の一例は、細胞表面に膜結合型レセプターを含むトランスデ ューサー分子に結合することが可能な細胞外リガンドである。本明細書に用いら れる際には「リガンド」は、ある分子が第二分子と結合した際に電子を供与する 分子を意味する。細胞外リガンドには例えば、ホルモン、成長因子、抗原、他の 分化作用因子、および他の細胞タイプ特異的マイトジェンが含まれることが可能 である。イニシエーター分子への結合後には、トランスデューサー分子が細胞の 原型質膜 を横切ってシグナルを細胞内増幅因子分子に伝達する。トランスデューサー分子 は、シグナル変換に関与する細胞内蛋白質と相互作用することが可能な細胞質領 域を有するいずれかの表面レセプターを含むことができる。トランスデューサー 分子はキナーゼドメインを含むか、あるいは細胞内キナーゼと結合することが可 能である。トランスデューサー分子の例には、例えばチロシンキナーゼレセプタ ー、アルファーおよびベータアドレナリン作動性神経薬、Ｇ−蛋白質結合型レセ プター、ならびに免疫応答に関与する他のレセプターが含まれる。 レセプターはサブユニットとして引用される複数の蛋白質を含んでいてもよく 、レセプターの内の一つの部類は多重サブユニットレセプターとして称され、そ の例は多重サブユニット免疫認識レセプター（ＭＩＲＲ）である。ＭＩＲＲは非 共有結合的に結合する複数のサブユニットを有するレセプターを含み、かつｓｒ ｃ −ファミリーチロシンキナーゼとの相互作用を行うことができる。ＭＩＲＲは Ｂ細胞抗原レセプター、Ｔ細胞抗原レセプター、Ｆｃレセプター、およびＣＤ２ ２を含むことが可能であるが、それらには限定されない。ＭＩＲＲの一つの例は Ｂ細胞表面上の抗原レセプターである。Ｂ細胞表面上のＭＩＲＲは、サブユニッ ト Ｉｇ−αおよびＩｇ−βもしくはＩｇ−γと結合する膜結合型免疫グロブリ ン（ｍＩｇ）を含み、それらのサブユニットは抗原による結合を受けた際にはＢ 細胞機能を調節することが可能な複合体を形成する。抗原レセプターは、増幅因 子分子が遺伝子転写を調節することが可能にする様式で機能的に増幅因子分子と 結合することができる。 トランスデューサー分子は増幅因子分子と相互作用を行って、細胞表面で受信 されるシグナルの、細胞の原型質内への伝達を更に拡張するこ とが可能である。増幅因子分子は典型的には、細胞内の生理学的変化が生じ、そ れにより遺伝子転写の変化がもたらされる様式で初期標的分子を改変することが 可能な酵素である。増幅因子分子は初期標的分子を、例えば：初期標的分子のア ロステリック変化；初期標的分子のリン酸化；もしくは初期標的分子の細胞の他 の領域への転移により改変することが可能である。初期標的分子は標的分子もし くはエフェクターを含むことが可能であるが、これらには限定されない。本明細 書において用いられる際には「標的分子」は、特定の酵素によるリン酸化により 改変される分子である。本明細書に用いられる際には「エフェクター」は、特定 の酵素によるアロステリック変化により改変される分子である。シグナル変換に 関与する増幅因子分子の例には、キナーゼレセプターおよび非レセプターキナー ゼ（例えばｓｒｃ−ファミリーのキナーゼもしくはｓｙｋ−ファミリーのキナー ゼ）が含まれるが、それらには限定されない。 ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼは標的分子のチロシン残基をリン酸化 することが可能な酵素である。典型的にはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナー ゼは一つもしくは複数の結合性ドメインおよびキナーゼドメインを含む。ｓｒｃ −ファミリーのチロシンキナーゼの結合性ドメインは標的分子に結合することが 可能であり、かつキナーゼドメインはキナーゼに結合する標的分子をリン酸化す ることが可能である。ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼのメンバーは、Ｎ− 末端の独特な領域およびその後に続く３つの領域を特徴とするが、後記３つの領 域はそのファミリーの全メンバーの中で様々な程度の相同性を示す。それら３つ の領域はｓｒｃ相同性領域１（ＳＨ１）、ｓｒｃ相同性領域２（ＳＨ２）、およ びｓｒｃ相同性領域３（ＳＨ３）として引用される。ＳＨ２およ びＳＨ３の両ドメイン共が、シグナル変換複合体の形成にとって重要な蛋白質結 合機能を有すると考えられている。Ｎ−末端の独特な領域のアミノ酸配列は各ｓ ｒｃ −ファミリーチロシンキナーゼ間で変化する。Ｎ−末端の独特な領域は、ｓ ｒｃ −ファミリーチロシンキナーゼのＮ−末端の内の少なくとも最初の約４０ア ミノ酸残基であることができる。 ｓｙｋ−ファミリーキナーゼは標的分子のチロシン残基をリン酸化することが できる酵素である。典型的にはｓｙｋ−ファミリーキナーゼは一つもしくは複数 の結合性ドメインおよび一つのキナーゼドメインを含む。ｓｙｋ−ファミリーキ ナーゼの結合性ドメインは標的分子に結合することが可能であり、そしてキナー ゼドメインはそのキナーゼに結合する標的分子をリン酸化することが可能である 。ｓｙｋ−ファミリーのチロシンキナーゼのメンバーは、蛋白質結合機能のため の２つのＳＨ２ドメインおよび一つのチロシンキナーゼドメインを特徴とする。 初期標的分子は、第二メッセンジャー分子を改変することによりシグナル変換 経路を更に拡張することが可能である。初期標的分子には、ホスファチジルイノ シトール ３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）、Ｐ２１rasＧＡＰａｓｅ−活性化蛋白 質、ならびに結合したＰ１９０とＰ６２蛋白質、ホスホリパーゼ（例えば、ＰＬ Ｃγ１およびＰＬＣγ２）、ＭＡＰキナーゼ、Ｓｈｃ、およびＶＡＶが含まれる が、それらには限定されない。初期標的分子は第二メッセンジャー分子を産生す ることが可能であり、これは、ジアシルグリセロールおよび１，４，５−三リン 酸イノシトール（ＩｎｓＰ３）を初めとする（しかし、これらには限定されない ）分子を拡張することが可能である。第二メッセンジャー分子は遺伝子転写にお ける変化をもたらすことが可能である生理学的現象を開始するこ とが可能である。例えば、ＩｎＰ３の産生により細胞内カルシウムの放出がもた らされることが可能であり、その後にはそのことによりカルモジュリンキナーゼ ＩＩの活性化がもたらされることが可能であり、その後にはそのことによりｅｔ ｓ −１癌原蛋白質として引用されるＤＮＡ結合性蛋白質のセリンリン酸化がもた らされることが可能である。ジアシルグリセロールはシグナル変換蛋白質である プロテインキナーゼＣを活性化することが可能であり、このことによりＡＰ１ ＤＮＡ結合性蛋白質複合体の活性が影響を受ける。シグナル変換経路は、例えばｃ −ｆｏｓ、ｅｇｒ−１、およびｃ−ｍｙｃのような遺伝子の転写の活性化をも たらすことが可能である。 本発明に従うと、Ｓｈｃはアダプター分子である。アダプター分子は他の２つ の蛋白質が複合体（例えば、３分子複合体）を形成することを可能にする蛋白質 を含む。Ｓｈｃ蛋白質はＧｒｂ２およびＳＯＳを含む複合体形成を可能にする。 ＳｈｃはＧｒｂ２のＳＨ２ドメインと結合することが可能なＳＨ２ドメインを含 む。 シグナル変換経路の分子は認識配列を用いて互いに結合することが可能である 。本発明に従うと、認識配列により２分子間の特異的結合が可能となる。認識配 列は、互いに結合し合う分子の構造に依存して変化することが可能である。ある 分子は一つもしくは複数の認識配列を有することが可能であり、そしてそれ自体 が一つもしくは複数の異なる分子と結合することが可能である。 シグナル変換経路は細胞の生物学的機能を調節することが可能である。そのよ うな機能には、細胞が増殖する、分化する、そして細胞性産物を分泌する能力が 含まれるが、それらには限定されない。シグナル変換経 路は動物による特別な応答に関与する特異的タイプの細胞の生物学的機能（例え ば、免疫応答、炎症性応答、およびアレルギー応答）を調節することが可能であ る。免疫応答に関与する細胞は例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状 細胞、ナチュラルキラー細胞、およびプラズマ細胞を含むことが可能である。炎 症性応答に関与する細胞は例えば、好塩基球、肥満細胞、好酸球、好中球、およ びマクロファージを含むことが可能である。アレルギー応答に関与する細胞は例 えば、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージを含むこと が可能である。それに加えて、動物によるこのような応答は多分化能幹細胞のシ グナル変換経路により調節されることが可能であり、この多分化能幹細胞は既述 の応答および動物の他の機能に関与する成熟細胞へと発達することが可能である 。細胞の異常な生物学的機能が疾患をもたらすことが可能である。そのような異 常性を矯正するためのシグナル変換経路の調節自体が疾患の治療に有効であり得 る。それに加えて、様々な医療的方法（例えば、臓器および皮膚の移植術）は特 異的なタイプの細胞の生物学的機能の調節を必要とする。そのような細胞内での シグナル変換機能自体が特別な医療的方法に有用であり得る。 蛋白質と標的分子の間の結合により様々な生物学的現象がもたらされ得ること が当業者により知られている。例えば、蛋白質と標的分子との間の結合により標 的分子の立体配座の改変がもたらされ、そのことによりその標的分子が第二蛋白 質による結合を受けることが可能となるか、あるいは別法ではその標的分子が典 型的な結合を生じることが妨げられ、そのことによりそのような分子が関与する 系の調節を変化することが可能となる。他の実施例では、蛋白質と標的分子との 間の結合によりその 標的分子の転移がもたらされて、その標的分子と結合することが可能な他の蛋白 質の近傍内にその標的分子が移動してくることが可能となる。更に別の実施例で は、蛋白質と標的分子との間の結合により、その標的分子の活性が活性化、刺激 化、もしくは阻害される様式でのその標的分子の改変がもたらされることが可能 である。その標的分子の活性は例えば、酵素活性もしくは結合性活性を含むこと が可能である。蛋白質と標的分子との間の結合は、その蛋白質上およびその標的 分子上の特異的認識配列に依存することが可能であり得ることも当業者に知られ ている。本発明に従うと、認識配列は、ある蛋白質が特異的様式で標的分子に結 合することを可能にさせる配列である。単一の蛋白質はその蛋白質の配列内に含 まれる様々な認識配列を使用して異なる標的分子に結合することが可能である。 それとは対照的に、単一の標的分子は標的分子の配列内に含まれる様々な認識配 列を用いて様々な蛋白質による結合を受けることが可能である。蛋白質と標的分 子との間の分子相互作用の複雑性により当業者が特別な相互作用を理解および予 想することが制限されている。 ある態様では本発明の化合物は、チロシンキナーゼの活性、好ましくはチロシ ンキナーゼ Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃ ｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０の活性を調節することにより細胞内のシグナル変 換を調節することができる。他の態様では、本発明の化合物は、アダプター分子 、好ましくはＳｈｃの活性を調節することができる。更に他の態様では、本発明 の化合物は脂質キナーゼ、好ましくはＰＩ−３Ｋの活性を調節することができる 。更に他の態様では、本発明の化合物は、ＧＡＰ、ＣＤ２２、およびＭＡＰＫを 初めとす る蛋白質の活性を調節することができる。 他の態様では、本発明の化合物は、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨというア ミノ酸モチーフを有する単離されたペプチド（もしくはそのミメトープ）を含む 。本発明に従うと、単離された、もしくは生物学的に純粋なペプチドは、その天 然の環境から取り出されたペプチドである。「単離された」および「生物学的に 純粋な」はそれ自体、蛋白質が精製されている程度を反映させる必要はない。本 発明の単離された化合物は天然の源から取得するか、あるいは組換えＤＮＡ技術 もしくは化学的合成を用いて産生することが可能である。本明細書に用いられる 際には、単離されたペプチドは全長蛋白質もしくはそのような蛋白質のいずれか の同族体であることが可能であり、そのような同族体ではアミノ酸の欠失（例え ば、その蛋白質の切断型）、挿入、反転、置換、および／または誘導化（例えば 、アセチル化、グリコシル化、カルボキシメチル化されてミリスチル化、プレニ ル化、もしくはパルミトイル化されたアミノ酸に連結されている）が生じており 、その結果そのペプチドはチロシンキナーゼ、アダプター分子、および／または 脂質キナーゼの活性を調節することが可能となる。 本発明に従うと「ミメトープ」は、本発明の単離された化合物の能力を模倣す ることが可能ないずれかの化合物を意味する。ミメトープは分解に対する感受性 を減少するように改変させてあるが、依然として調節活性を保持するペプチドで あることが可能である。ミメトープの他の例には、蛋白質を基にする化合物、炭 水化物を基にする化合物、脂質を基にする化合物、核酸を基にする化合物、天然 の有機化合物、合成により得られる有機化合物、抗−イディオタイプ抗体、およ び／または触媒的 抗体、あるいはそれらの断片が含まれるが、それらには限定されない。ミメトー プは例えば、本明細書中に記載されるチロシンキナーゼの活性を調節することが 可能な化合物についての、天然および合成化合物のライブラリーのスクリーニン グにより取得することが可能である。ミメトープは更に、例えば天然および合成 化合物のライブラリー、特に化学的もしくは組合わせライブラリー（すなわち、 配列もしくはサイズが異なるが、同一の構築ブロックを有する化合物のライブラ リー）から取得することが可能である。ミメトープは例えば合理的な薬剤設計に より取得することも可能である。合理的薬剤設計方法では、本発明の化合物の３ 次元構造を例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）もしくはｘ−線結晶回折により分析す ることが可能である。その後にその３次元構造を用いて例えば、コンピューター モデル化により有望なミメトープの構造を予想することが可能である。その後に 予想されたミメトープ構造を例えば、化学合成、組換えＤＮＡ技術によるか、あ るいは天然の源（例えば、植物、動物、細菌、および真菌類）からミメトープを 単離することにより産生することが可能である。 ある態様では、本発明の化合物は、そのペプチドがｓｒｃ−ファミリーのチロ シンキナーゼの活性を調節することが可能な様式でそのペプチドがｓｒｃ−ファ ミリーのチロシンキナーゼによる結合を受けることを可能にするアミノ酸配列を 有する単離されたＡＲＨ１ペプチドを含む。本発明のＡＲＨ１ペプチドは、その ペプチドがｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの少なくとも一つの結合部位 による結合を受けることを可能にするサイズおよび性質のものである。特に本発 明のＡＲＨ１ペプチドはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼのＮ−末端の独 特な領域 およびＳＨ２ドメインによる結合を受けることが可能である。本発明のＡＲＨ１ ペプチドがｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼのＮ−末端の独特な領域、Ｓ Ｈ２ドメイン、およびＳＨ３ドメインによる結合を受けることが可能であること が好ましい。 他の態様では、本発明の化合物は、そのペプチドが標的分子（例えば、ＭＩＲ Ｒ）へのｓｙｋ−ファミリーのチロシンキナーゼの結合を調節することが可能な 様式でそのペプチドがｓｙｋ−ファミリーのキナーゼによる結合を受けることを 可能にするアミノ酸配列を有する単離されたＡＲＨ１ペプチドを含む。本発明の ＡＲＨ１ペプチドはｓｙｋ−ファミリーのチロシンキナーゼの少なくとも一つの 結合部位との会合による結合をそのペプチドが受けることを可能にさせるサイズ および性質のものである。特に本発明のＡＲＨ１ペプチドは、ｓｙｋ−ファミリ ーキナーゼの一つのＳＨ２ドメイン、好ましくはｓｙｋ−ファミリーキナーゼの 両方のＳＨ２ドメインによる結合を受けることが可能である。 更に他の態様では、本発明の化合物は、そのペプチドが標的分子（例えば、Ｇ ｒｂ２もしくはＳＯＳ）へのＳｈｃ分子の結合を調節することが可能な様式でそ のペプチドがＳｈｃによる結合を受けることを可能にさせるアミノ酸配列を有す る単離されたＡＲＨ１ペプチドを含む。本発明のＡＲＨ１ペプチドはＳｈｃ分子 の少なくとも一つの結合部位による結合をそのペプチドが受けることを可能にさ せるサイズおよび性質のものである。特に、本発明のＡＲＨ１ペプチドはＳｈｃ 分子のＳＨ２ドメインによる結合を受けることがある。 更に別の態様では、本発明の化合物は、そのペプチドがＳＰ−６キナーゼの活 性化を調節することが可能な様式でそのペプチドがＰＩ−３Ｋ による結合を受けることを可能にさせるアミノ酸配列を有する単離されたＡＲＨ １ペプチドを含む。本発明のＡＲＨ１ペプチドはＰＩ−３Ｋ分子の少なくとも一 つの結合部位による結合をそのペプチドが受けることを可能にさせるサイズおよ び性質のものである。特に本発明のＡＲＨ１ペプチドは、ＰＩ−Ｋ３分子のＳＨ ２ドメインによる結合を受けることが可能である。 本発明の化合物は、少なくとも４つのアミノ酸残基、好ましくは約１５のアミ ノ酸残基、より好ましくは約１７のアミノ酸残基を含むＡＲＨ１ペプチドを含む が、そのペプチドは少なくとも約２６のアミノ酸残基であることができる。ある 態様では本発明のＡＲＨ１ペプチドは約３ｋＤのサイズを有し、そして約２６の アミノ酸残基を有する。 ある態様では、本発明のＡＲＨ１ペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも２つ のチロシン残基ならびに少なくとも２つのロイシンおよび／またはイソロイシン 残基を有するＡＲＨ１モチーフを含む。本明細書において用いられる際には「モ チーフ」は、特別な機能を有する蛋白質内に含まれる一連のアミノ酸残基を意味 する。本発明のＡＲＨ１モチーフが、標準的一文字アミノ酸コードを用いるＹＸ ＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨアミノ酸モチーフにより表される空間配置を有する チロシン、ロイシン、および／またはイソロイシン残基を含むことが好ましく、 そしてそのモチーフ中、Ｘはいずれかのアミノ酸であることができ、「Ψ」はロ イシンもしくはイソロイシンのいずれかであることができる。 ある態様では、ＡＲＨ１ペプチドはＢ細胞中のｓｒｃ−ファミリーのチロシン キナーゼの活性を調節することが可能な配列を含むことができる。ｓｒｃ−ファ ミリーキナーゼ特異的ＡＲＨ１ペプチドがＹＸＸＬＸ ＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳ ＰＩＹＸＸΨ、もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨを含むことが好ましく 、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＦｃεＲＩβ、もしくはＦｃεＲＩγ蛋白質のＡＲＨ１ モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてＹＸＸＬ ＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨが更に一層好ましい。本発明の特に好ましいＡＲＨ１ペ プチドはアミノ酸配列ＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩを含み、アミノ酸配列Ｎ ＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩであることが更に一層好ましい。 他の態様では、ＡＲＨ１ペプチドはｓｙｋ−ファミリーのチロシンキナーゼの 活性を調節することが可能な配列を含むことが可能である。ｓｙｋ−ファミリー キナーゼ−選択的ＡＲＨ１ペプチドには、アミノ酸モチーフＹＸＸＬＸＸＸＴＫ ＤＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸ ＸΨ、もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨが含まれ、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ ε、ＦｃεＲＩγ、もしくはＦｃεＲＩβ蛋白質のＡＲＩ１モチーフに実質的に 類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてアミノ酸モチーフＹＸＸＬＸ ＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨもしくはＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨが更に一層好ま しい。本発明の特に好ましいｓｙｋ−ファミリーキナーゼ一選択的ＡＲＨ１ペプ チドは、アミノ酸モチーフＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬもしくはＹＥＰＩＲ ＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬを含み、アミノ酸モチーフＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴ ＹＤＡＬもしくはＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬであることが更に一層 好ましい。 本発明のｓｙｋ−ファミリーキナーゼ−選択的ペプチドはリン酸化されている かもしくはリン酸化されていないかのいずれかであることが可 能である。非チロシンリン酸化ｓｙｋ−ファミリーキナーゼ−選択的ペプチドが 、アミノ酸モチーフＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨを含むＡＲＨ１モチーフを 含むことが好ましく、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１ モチーフがより好ましく、そしてアミノ酸モチーフＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭ ＹＥＤＩを含むＡＲＨ１モチーフが更に一層好ましい。チロシンリン酸化ｓｙｋ −ファミリーキナーゼ−選択的ペプチドが、アミノ酸モチーフｐＹＸＸＬＸＸＸ ＴＫＤＴｐＹＸＸΨ、ｐＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬｐＹＸＸΨ、ｐＹＸＸＬＸＸＸ ＹＳＰＩｐＹＸＸΨ、もしくはｐＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴｐＹＸＸΨを含むＡＲ Ｈ１モチーフを含むことが好ましく、ペプチドがリン酸化されているＴＣＲζｃ 、ＣＤ３ε、Ｆｃ６ＲＩγ、もしくはＦｃεＲＩβ蛋白質のＡＲＨ１モチーフに 実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてアミノ酸モチーフｐ ＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴｐＹＸＸΨもしくはｐＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬｐＹＸＸ Ψが更に一層好ましい。 更に別の態様では、ＡＲＨ１ペプチドがＳｈｃアダプター分子に結合すること が可能な配列を含むことが可能である。Ｓｈｃ−選択的ＡＲＨ１ペプチドはＹＸ ＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸ ＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨを含むことが好 ましく、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＦｃεＲＩγ、もしくはＦｃＥＲＩβ蛋白質のＡ ＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてＹ ＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ ＡＲＨ１モチーフが更に一層好ましい。本発明 の特に好ましいＡＲＨ１ペプチドはアミノ酸モチーフＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹ ＥＤＩを含み、アミノ酸モチーフＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ であることが一層好ましい。 本発明のＳｈｃ−選択的ペプチドはチロシンリン酸化かもしくは非チロシンリ ン酸化のいずれかであることが可能である。非チロシンリン酸化Ｓｈｃ−選択的 ペプチドはＡＲＨ１モチーフＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨを含むことが好ま しく、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより 好ましく、そしてアミノ酸配列ＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩを含むＡＲ Ｈ１モチーフが更に一層好ましい。チロシンリン酸化Ｓｈｃ−選択的ペプチドは ｐＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴｐＹＸＸΨ、ｐＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩｐＹＸＸΨ、 もしくはｐＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴｐＹＸＸΨ ＡＲＨ１モチーフを含むことが 好ましく、Ｉｇ−β、ＦｃεＲＩγ、もしくはＦｃεＲＩβ蛋白質に実質的に類 似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてペプチドがリン酸化されている アミノ酸モチーフＤＨＴＹＥＧＬＮＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩ、ＤＲＬＹＥＥＬＮＨ ＶＹＳＰＩＹＳＥＬ、もしくはＤＡＶＹＴＧＬＮＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬを含むＡ ＲＨ１モチーフが更に一層好ましい。 更に別の態様では、ＡＲＨ１ペプチドはＰＩ−３Ｋに結合することが可能な配 列を含むことが可能である。ＰＩ−３Ｋ−選択的ＡＲＨ１ペプチドはアミノ酸モ チーフＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸΨ、Ｙ ＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、もしくはＹ ＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨを含むことが好ましく、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、Ｃ Ｄ３ε、ＦｃεＲＩβ、もしくはＦｃεＲＩγ蛋白質のＡＲＨ１モチーフに実質 的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴ ＹＸＸΨ ＡＲＨ１モチーフが更に一層好ましい。本発明の特に好ましいＡＲＨ １ペプチドは配列ＤＡＶＹＴＧＬＮＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬを含む。ある好ましい 態様では、本発明のＰＩ−３Ｋ−選択的ペプチドはチロシンがリン酸化されてい る。 本発明のＡＲＨ１ペプチドの特に好ましいミメトープは表１に示されるアミノ 酸配列を含むことが可能であるが、それらには限定されない。 他の態様では、本発明のＡＲＨ１ペプチドはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキ ナーゼの比活性を刺激化することができる。本明細書で用いられる際には用語「 比活性」は、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼが初期標的分子を改変する ことが可能な速度を意味する。比活性の速度は例えば、ｓｒｃ−ファミリーのチ ロシンキナーゼが初期標的分子をリン酸化する速度により測定することができる 。比活性は更に、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの自己リン酸化の速度 をも意味することが可能である。本発明のＡＲＨ１ペプチドは少なくとも約２倍 、そして最高で約７０倍、そして一層好ましくは約３倍〜約６０倍にｓｒｃ−フ ァミリーのチロシンキナーゼの比活性を刺激化できることが好ましい。比活性の 刺激化は、そのペプチドをｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの免疫沈降物 と共にインキュベートした際に観察される。 ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの活性を刺激化できる本発明のＡＲＨ １ペプチドは少なくとも２つのリン酸化チロシン残基を含む。刺激性ＡＲＨ１ペ プチドが、本明細書内に記載される様式で空間的に配置される少なくとも２つの リン酸化チロシン残基を有するＡＲＨ１モチーフを含むことが好ましい。本発明 の刺激性ＡＲＨ１ペプチドはアミノ酸モチーフｐＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭｐＹＸ ＸΨ、ｐＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴｐＹＸＸΨ、ｐＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩｐＹＸ ＸΨ、もしくはｐＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴｐＹＸＸΨ［これらのモチーフ中、ｐ Ｙはリン酸化チロシン残基を意味する］を含むことが好ましく、チロシン残基が リン酸化されているＩｇ−α、Ｉｇ−β、ＦｃεＲＩβ、もしくはＦｃεＲＩγ 蛋白質のＡＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく 、そしてｐＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭｐＹＸＸΨ ＡＲ Ｈ１モチーフが更に一層好ましい。本発明の特に好ましいＡＲＨ１ペプチドは配 列ｐＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭｐＹＥＤＩを含み、配列ＮＬｐＹＥＧＬＮＬＤＤＣ ＳＭｐＹＥＤＩであることがより好ましい。 論理に拘束されるものでないが、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼは膜 結合型レセプターのＡＲＨ１モチーフと非共有結合的に結合することが可能であ ると考えられる。第一に、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼのＮ−末端の 独特な領域はレセプターのＡＲＨ１モチーフと結合し、そしてリガンドがそのレ セプターの細胞外ドメインに結合するまで刺激化されない状態のままになる。リ ガンドの結合の際にはそのレセプターは立体配座の変化を受け、それによりその ＡＲＨ１モチーフ内に含まれるチロシン残基のリン酸化が開始する（例えば、そ れらのチロシンは結合したキナーゼによりリン酸化される）。その後に結合化キ ナーゼのＳＨ２ドメインがリン酸化されたＡＲＨ１モチーフに結合する。この第 二結合現象は、結合したキナーゼのキナーゼドメインがそのキナーゼの初期標的 を改変するに利用可能になるような様式でＣ−末端リン酸化チロシンの位置を改 変することにより結合したキナーゼの活性の抑制解除を行うと考えられる。従っ て、リン酸化されたＡＲＨ１モチーフは、そのキナーゼの活性を積極的に阻害す る因子の除去により結合したキナーゼの抑制解除を行うことが可能である。理論 に拘束されるものでないが、図２は、レセプター複合体（Ｉｇ−α）の一部分と 細胞内分子との間に生じることが可能な相互作用を表す。特に図２は、リガンド によるレセプターの結合の後に生じることが可能であるチロシンキナーゼ（ｋｉ ｎ．）の立体配座変化を詳細に説明する。 既述のメカニズムによると、ＡＲＨ１モチーフを含むＡＲＨ１ペプチ ドは酵素ではない。むしろそのペプチドはシグナル変換分子と結合し、そしてそ のシグナル変換分子の立体配座の変化を誘導する。ＡＲＨ１モチーフの、リン酸 化されていないかもしくは部分的にリン酸化されたチロシン残基はｓｒｃ−ファ ミリーのチロシンキナーゼのＮ−末端の独特な領域の、ＡＲＨ１ペプチドへの結 合を阻害できるものと考えられる。 本発明の阻害的ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼＡＲＨ１ペプチドは２ つのチロシン残基を含むＡＲＨ１モチーフを含むことが可能であり、この場合そ れらのチロシン残基の内の一つのみがリン酸化されるかもしくは両方のチロシン 残基共がリン酸化されていない。ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの阻害 的ＡＲＨ１ペプチドのチロシン残基はリン酸化されていないことが好ましい。本 発明の好ましいｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの阻害的ＡＲＨ１ペプチ ドはアミノ酸モチーフＦＸＸＬＸＸＸＸＸＸＦＸＸＩ、より好ましくはモチーフ ＦＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＦＸＸΨ、ＦＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＦＸＸΨ、ＦＸＸＬ ＸＸＸＹＳＰＩＦＸＸΨ、もしくはＦＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＦＸＸΨ、そして更 に一層好ましくはモチーフＦＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＦＸＸΨを含む。本発明の特 に好ましいｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの阻害的ＡＲＨ１ペプチドは アミノ酸モチーフＦＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＦＥＤＩを含み、アミノ酸モチーフＤ ＭＰＤＤＹＥＤＥＮＬＦＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＦＥＤＩであることがより好まし い。 本発明に従うと、本発明のシグナル変換調節性化合物は、本発明の一つもしく は複数のＡＲＨ１モチーフを含むアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ｓ ｙｋ −ファミリーキナーゼの活性を調節することが可能な本発明の化合物は、ア ミノ酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨ、 ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨと 共有結合により結合しているアミノ酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨを含 むことができる。別法ではアミノ酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨは、そ れ自体がＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、 もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨに共有結合により結合しているアミノ 酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨに共有結合により結合することができる 。本発明の化合物を含む多重ＡＲＨ１モチーフが、アミノ酸配列ＹＥＰＩＲＫＧ ＱＲＤＬＹＳＧＬと共有結合により結合しているアミノ酸配列ＹＱＧＬＳＴＡＴ ＫＤＴＹＤＡＬを含むことが好ましく、そしてより好ましくはアミノ酸配列ＮＰ ＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬと共有結合により結合しているアミノ酸配列 ＤＨＴＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬを含むことがより好ましい。 本発明の別の態様は、特定の酵素の活性を調節できるとの認識に関するが、そ れはそのような酵素の高プロリン領域が標的となって正常な結合パターンを妨害 することが可能であり、そのことによりシグナル変換経路における酵素活性を改 変することが可能となるということの認識に基づいている。 これまでの研究者らにより、酵素ＰＩ−３Ｋは最高で５つの酵素（例えば、血 小板由来の成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）、ｐｐ６０v-src、ｐｐ６０c-src 、インスリンレセプター、ＩＬ−４レセプター、およびＣＳＦ−１レセプター） についての標的分子として作用する可能性があることが示されている（Ｏｔｓｕ ｅｔ ａｌ．、ｐｐ．９１−１０４、１９９１、Ｃｅｌｌ．、Ｖｏｌ．６５） 。ＰＤＧＦＲは、ＹＸＸＭ アミノ酸モチーフ［このモチーフ中、Ｘはいずれかのアミノ酸であり、そしてＹ 残基はリン酸化されている］を有するホスホペプチドを含む認識配列を用いてＰ Ｉ−３ＫのＳＨ２ドメインに結合することが示されている（既述）。このような 結合がＰＩ−３Ｋ機能を活性化させることが示されている。従って当業者はＰＩ −３Ｋを活性化させるためのメカニズムは、ＰＩ−３Ｋの結合を介して蛋白質の ＹＸＸＭモチーフに至るものであるという考えに至るであろう。それに加え、ｐ ｐ６０v-secおよびｐｐ６０c-secはそれらのＳＨ３ドメインによりＰＩ−３Ｋに 結合することが示されている（既述）。このような結合がＰＩ−３Ｋの活性化を もたらすことは示されてはいない。従ってＰＩ−３Ｋへの酵素結合が、様々な認 識配列を用いることで生じることが可能であり、そしてＰＩ−３Ｋの限定的活性 化がホスホペプチド配列ＹＸＸＭの結合の際に達成され得る。 ある態様では本発明の化合物は初期標的分子へのチロシンキナーゼのＳＨ３ド メインの結合を阻害し、そのことによりその標的分子の活性化を阻害することが できる。本発明の適切な標的分子には、チロシンキナーゼによる結合を受けうる 高プロリン配列を有する蛋白質が含まれる。本発明の標的分子が、例えばＰＩ− ３Ｋ、ｒａｓ−ＧＡＰ、３ＢＰ１、および３ＢＰ２のようなエフェクター分子を 含むことが好ましいが、これらには限定されない。 本発明に従うと、本発明の化合物はシグナル変換経路内で増幅因子として作用 しうるレセプターおよび／または非レセプターチロシンキナーゼの活性を調節し うる単離された高Ｐｒｏペプチドを含む。本明細書において用いられる際には「 高Ｐｒｏペプチド」は更に単離された高ｐｒ ｏペプチドをも意味する。本発明の高Ｐｒｏペプチドは特に、ｓｒｃ−ファミリ ーのチロシンキナーゼの活性を調節することによりｓｒｃ−ファミリーのチロシ ンキナーゼと結合しうるレセプターに結合するリガンドから生じるシグナル変換 経路を調節することができる。本発明の適切なレセプターにはＢ細胞抗原レセプ ター、Ｔ細胞抗原レセプター、Ｆｃレセプター、ＭＨＣクラスＩＩ、ＩＬ−４レ セプター、およびＣＤ４が含まれるが、これらには限定されない。本発明の適切 なｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼにはＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ 、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｚａｐ７０、およびＳｒｃが含まれるが、 これらには限定されない。 本発明の高Ｐｒｏペプチドは、初期標的分子とのキナーゼの結合を妨害するこ とによりチロシンキナーゼを調節することができる。本発明の高Ｐｒｏペプチド は、そのペプチドが初期標的分子とキナーゼの結合とを妨害する様式でそのペプ チドがチロシンキナーゼに結合することを可能にさせるに十分なサイズを含む。 本発明の高Ｐｒｏペプチドが少なくとも約５アミノ酸残基、より好ましくは約７ アミノ酸残基〜約４０残基、そして更に一層好ましくは約１０アミノ酸残基〜約 ３０アミノ酸残基を有する。本発明の高Ｐｒｏペプチドは大きければ約８５ｋＤ の、そして小さければ約１ｋＤのサイズのものであり得る。 本発明の高Ｐｒｏペプチドは、そのペプチドが初期標的分子とのそのキナーゼ の結合を妨害する様式でそのペプチドのチロシンキナーゼへの結合を可能にさせ るアミノ酸配列を含む。本発明の高ＰｒｏペプチドがチロシンキナーゼのＳＨ３ ドメイン、より好ましくはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼのＳＨ３ドメ イン、そして更に一層好ましくはｓ ｒｃ −ファミリーのチロシンキナーゼのＳＨ３ドメイン内に含まれる高プロリン 配列結合部位に結合することが可能なアミノ酸配列を含む。 ある態様では本発明の高Ｐｒｏペプチドのアミノ酸配列は、約２０％のプロリ ン残基〜約１００％のプロリン残基、より好ましくは約３０％のプロリン残基〜 約９０％のプロリン残基、および更に一層好ましくは約４０％のプロリン残基〜 約８０％のプロリン残基を有する高プロリンモチーフを含む。これらのプロリン 残基は、本発明の高Ｐｒｏペプチドがチロシンキナーゼ上の高プロリン結合部位 による結合を受けうるのに適切な様式での空間的配置をとることができる。この ような空間的配置は、ＰＰＸＰＸＰＸＰＰＸＰＸＰアミノ酸モチーフもしくはＰ ＸＰＸＸＰＰＸＰＰＸＰアミノ酸モチーフ［このモチーフ中、Ｘはいずれかのア ミノ酸残基を表す］により表すことができる。プロリン残基はＰにより省記され る。 好ましい態様では、本発明の高ＰｒｏペプチドはＰＩ−３Ｋの高プロリンドメ インを含む。ＰＩ−３Ｋは非触媒的ｐ８５サブユニット（８５ｋＤ）および触媒 的ｐ１１０サブユニット（１１０ｋＤ）から成る。ＰＩ−３ＫはＤ−３ヒドロキ シルの位置でイノシトール脂質をリン酸化することができる。２つの高プロリン ドメインがｐ８５サブユニット内に含まれる。ＰＩ−３Ｋの最初の高プロリンド メインはおおよそ残基８０からおおよそ残基１０４までに広がり、そしてアミノ 酸モチーフＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴを含むことが 可能である。ＰＩ−３Ｋの第二高プロリンドメインはおおよそ残基２９９からお およそ残基３１８までに広がり、そしてアミノ酸モチーフＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰ ＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡを含むことができる。本発明の高Ｐｒｏ ペプチドは、ＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴもしくはＮ ＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡを含む少なくとも一つのアミノ酸モチ ーフを含むことが好ましい。本発明に従うと、Ｋ＝リシン、Ｒ＝アルギニン、Ｖ ＝バリン、およびＱ＝グルタミンである。 本発明の高Ｐｒｏペプチドもしくはそのミメトープはチロシンキナーゼによる 標的分子の活性化を阻害することができ、それはその高Ｐｒｏペプチドが事前に チロシンキナーゼに結合し、そのことにより標的分子の結合が、次いでそのため 標的分子の活性化が阻害されるためである。本発明の高Ｐｒｏペプチドは、約７ ０％、より好ましくは約８０％、そして更に一層好ましくは約９０％、標的分子 へのチロシンキナーゼの結合を阻害しうるものであることが好ましい。それに加 え本発明の高Ｐｒｏペプチドは、そのペプチドがキナーゼに対するペプチドの２ ００：１の比率で、より好ましくはキナーゼに対するペプチドの１００：１の比 率で、そして更に一層好ましくはキナーゼに対する２０：１の比率で存在する場 合に、チロシンキナーゼと標的分子との間の結合を実質的に阻害する（９０％と １００％との間）ことができる。 好ましい態様では本発明の高Ｐｒｏペプチドは、そのペプチドがＰＩ−３Ｋを 含む細胞内に組込まれた際にＰＩ−３Ｋの活性化を阻害することができる。その ようなＰＩ−３Ｋの活性化は少なくとも８０％およびより好ましくは少なくとも ９０％阻害されることが好ましい。 本発明に従うと、本明細書に詳細が記載される本発明の化合物のミメトープは 脂質二重層（例えば、細胞の原型質膜）を横切ることが可能である。脂質二重層 を横切ることが可能なミメトープは有機分子、特に炭水化物を基にする分子であ ることができる。更に本発明に従うと、本発 明の化合物はコンカテマーを含むことができ、この際、一つもしくは複数のＡＲ Ｈ１ペプチドあるいは一つもしくは複数の高Ｐｒｏペプチドが互いに結合してい る。 本発明の他の態様は、本明細書に開示される本発明の化合物をコードする単離 された核酸分子に関する。本発明に従うと、核酸についての引用事項は核酸分子 をも意味する。本発明に従うと、単離された核酸分子は、その天然の環境から予 め取り出されている核酸分子である（すなわち、予めヒトによる操作に供されて いる）。「単離された」自体は、その核酸分子が精製された度合いを反映する必 要はない。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡもしくはＲ ＮＡのいずれかのハイブリッドもしくは誘導体を含むことができる。本発明の核 酸は、核酸分子の発現を制御する調節領域（例えば、転写もしくは翻訳制御領域 ）、全長もしくは部分的なコーディング領域、およびそれらの組み合わせ物を含 むことができる。本発明の核酸分子のいずれかの部分は、（１）その天然の環境 からのその分子の単離；（２）組換えＤＮＡ技術（例えば、ＰＣＲ増幅、クロー ニング）を用いること；もしくは（３）化学的合成法を用いること、により産生 することが可能である。本発明の核酸分子は、天然の対立遺伝子変異体（しかし 、それらには限定されない）を含む本発明の化合物をコードする天然の核酸分子 、ならびに改変化核酸分子（これらの分子においてはヌクレオチドに、そのよう な改変がシグナル変換を調節しうる本発明の化合物をコードするその核酸分子の 能力を実質的に妨害することのない様式で挿入、欠失、置換、および／または逆 位を予め生じさせてある）の機能的等価物を含むことができる。好ましい機能的 等価物には、緊縮条件下で：Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＴＣ Ｒζｃ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ、もしくはＦｃεＲＩβ蛋白質に由来するＡＲ Ｈ１ペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部分；あるいはＰＩ−３Ｋ蛋 白質に由来する高Ｐｒｏペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部分にハ イブリダイズすることが可能な核酸配列が含まれる。緊縮ハイブリダイゼーショ ン条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ、１９８９（これは引用によりその全体が本 明細書に取り込まれる）に記載されている。いずれかの特定の核酸分子にどのよ うな特定の改変を行うことが可能であるかを決定する際の手引きとして、当業者 は不適切な実験についての必要性を伴うことなく、当業者が本発明の実行可能な 態様を認識することを可能にさせる幾つかの因子を考慮すべきである。例えばそ れらの因子は本発明のコード化化合物の特別な機能的領域を維持するような様式 で実施される核酸分子に対する改変を含み、それらのコード化化合物には：その モチーフがそのキナーゼもしくはアダプター分子の活性を調節しうる様式でチロ シンキナーゼ、アダプター分子、もしくは脂質キナーゼによる結合を受けること が可能なＡＲＨ１モチーフ；あるいはチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインへの結 合が可能であり、そのことによりそのキナーゼの活性化もしくは結合能を変化さ せることが可能である高プロリンモチーフが含まれる。これらの様々な特性の機 能的検査（例えば、結合性検査、キナーゼアッセイ、脂質リン酸化アッセイ）に より当業者は、その核酸分子に対してはどのような改変が適切であるか、もしく はどのような改変が適切でないかを決定することが可能となる。 ある態様では本発明の単離された核酸分子は本発明のＡＲＨ１ペプチドをコー ドする核酸配列を含み、そのようなペプチドの例が本明細書内に開示される。本 発明のＡＲＨ１ペプチド核酸分子は、アミノ酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸ ＸΨを有するＡＲＨ１モチーフをコードする核酸配列もしくはそのミメトープを 含むことが可能である。ＡＲＨ１ペプチドをコードする好ましい核酸分子には、 ペプチド配列ＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸ Ψ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨ、ＹＸ ＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨをコードする核 酸配列、あるいはそれらのミメトープが含まれる。ＡＲＨ１ペプチドをコードす るより好ましい核酸分子には、ペプチド配列 をコードする核酸配列、あるいはそれらのミメトープが含まれる。更に一層好ま しい核酸分子は、配列： もしくは を含む。 一つのＡＲＨ１ペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部分を、異なる 構成成分（例えば、制御因子）の少なくとも一部分をコードする他のいずれかの 配列に共有結合により（標準的組換え技術を用いて）結合させて本発明のＡＲＨ １ペプチドを産生することができる。これらの配列を、それらの配列がインフレ ームで転写され、そのことによりｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼ、ｓｙ ｋ −ファミリーのキナーゼ、Ｓｈｃ分子、およびＰＩ−３Ｋの活性を調節するこ とが可能な機能的ＡＲＨ１ペプチドを産生する様式で連結させることができる。 本発明の別の特徴および態様では単離された核酸分子は、本発明の少なくとも 一つの高Ｐｒｏペプチドをコードする核酸配列を含み、そのようなペプチドの例 が本明細書に開示される。本発明の高Ｐｒｏペプチド核酸分子には、チロシンキ ナーゼのＳＨ３ドメインに結合しうるアミノ酸配列を有する高プロリンモチーフ をコードする核酸配列が含まれる。高Ｐｒｏペプチドをコードする好ましい核酸 分子には、ペプチド配列ＰＰＸＰＸＰＸＰＰＸＰＸＰもしくはＰＸＰＸＸＰＰＸ ＰＰＸＰをコードする核酸配列が含まれる。高Ｐｒｏペプチドをコードする核酸 分子の少なくとも一部分を、異なる構成成分（例えば、制御因子）の少なくとも 一部分をコードする他のいずれかの配列に共有結合的に（標準的組換えＤＮＡ法 を用いて）結合させて、本発明の高Ｐｒｏペプチドを産生することができる。こ の配列を、その配列がインフレームで転写させ、そのことによりチロシンキナー ゼの活性を調節しうる機能的高Ｐｒｏペプチドを産生することを可能にする様式 で結合させることができる。 他の態様では、本発明の化合物の、その化合物を産生する細胞からの 分泌を亢進させうるシグナルもしくはリーダーセグメントをコードする核酸配列 が用いられる。リーダーもしくはシグナルセグメントをコードする核酸配列は、 核酸分子の５’末端（アミノ末端）に共有結合（塩基対結合）により連結される 。そのリーダーもしくはシグナルセグメントは本発明の一部分に天然の状態で連 結するセグメントであってもよく、あるいは異種セグメントであってもよい。膜 結合型の態様を取得するためには、本発明の化合物を脂質含有性標的分子に連結 することが可能な少なくとも一つの貫膜セグメントを含む核酸配列が用いられ、 そのようなセグメントには貫膜ドメインの少なくとも一部分および細胞質ドメイ ンの少なくとも一部分が含まれる。貫膜セグメントをコードする核酸配列は、本 発明の化合物をコードする核酸分子の３’末端（カルボキシル末端）に共有結合 的に（塩基対結合により）結合する。膜結合型であることが可能である本発明の 化合物をコードする核酸分子は、貫膜コード化配列がインフレームで転写される 様式で細胞外ドメインをコードする核酸配列の３’末端に連結されるセグメント をコードする少なくとも一つの核酸配列を含む。好ましいシグナルもしくはリー ダーセグメントは、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ 、もしくはＦｃεＲＩβ蛋白質、あるいはＰＩ−３Ｋ蛋白質と天然の状態で結合 するセグメントである。好ましい貫膜セグメントには、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、Ｔ ＣＲζｃ、ＣＤ３ε、ＦｃＥＲＩγ、もしくはＦｃ６ＲＩβ蛋白質、あるいはＰ Ｉ−３Ｋ蛋白質と天然の状態で結合するセグメントが含まれる。 本発明の他の態様は、融合セグメントに連結される本発明の化合物を含むドメ インを含む融合蛋白質に関する。本発明の化合物の部分として の融合セグメントの組込みは、産生、保存、および／または使用中の化合物の安 定性を亢進させることが可能である。それに加えて融合セグメントは本発明の化 合物の精製を単純化させるための道具として機能することが可能であり、その例 は、親和性クロマトグラフィーを用いて得られる融合蛋白質の精製を可能にする ことなどである。適切な融合セグメントは所望される機能（例えば、安定性の増 加および／または精製）を有するいずれかのサイズのドメインであることが可能 である。一つもしくは複数の融合セグメントを特許請求される化合物のアミノお よび／またはカルボキシル末端に結合させることが可能であり、そして融合セグ メントと化合物との間の結合を、その化合物の簡便な回収を可能にさせるために 開裂に対して感受性を示すように作製することが可能である。融合蛋白質が、そ の化合物のカルボキシルおよび／またはアミノ末端のいずれかに連結される融合 セグメントを含む蛋白質をコードする融合核酸配列で形質転換させた組換え細胞 を培養することにより産生されることが好ましい。 本発明の融合蛋白質には、因子Ｘもしくはトロンビン、好ましくは因子Ｘによ る開裂を受けることが可能であるグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合セグメ ントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）本発明の化合物を コードする核酸分子が含まれる。ある態様では、本発明のＡＲＨ１融合蛋白質は 、因子Ｘによる開裂を受けることが可能なグルタチオンＳトランスフェラーゼ融 合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）アミノ酸 配列ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨをコードする核酸分子を含む。ＡＲＨ１融 合蛋白質がＩｇ−α、Ｉｇ−β、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩβ、Ｆｃε ＲＩγ蛋白質の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むことが好ましく、 そしてNLYEGLNLDDCSMYEDI，DHTYEGLNIDQTATYEDI，DRLYEELNHVYSPIYSELもしくはD AVYTGLNTRNQETYETL、因子Ｘによる開裂を受けることが可能なグルタチオンＳト ランスフェラーゼ融合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結 合により）アミノ酸配列DGLYQGLSTATKDTYDALもしくはNPDYEPIRKGQRDLYSGLを含む ことがより好ましい。本発明の特に好ましいＡＲＨ１融合蛋白質は、アミノ酸配 列DMPDDYEDENLYEGLNLDDCSMYEDI，DHTYEGLNIDQTATYEDI，DRLYEELNHVYSPIYSEL，DA VYTGLNTRNQETYETL，DGLYQGLSTATKDTYDALもしくはNPDYEPIRKGQRDLYSGLをコードす る核酸分子を含む。 本発明の別の特徴および態様は、因子Ｘによる開裂を受けることが可能なグル タチオンＳトランスフェラーゼ融合セグメントをコードする核酸分子に連結され る（塩基対結合により）アミノ酸配列ＰＰＸＰＸＰＸＰＰＸＰＸＰもしくはＰＸ ＰＸＸＰＰＸＰＰＸＰを含む高Ｐｒｏ融合蛋白質に関する。高Ｐｒｏ融合蛋白質 がＰＩ−３Ｋ蛋白質の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むことが好ま しく、そしてアミノ酸配列ＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫ Ｔ、もしくは因子Ｘによる開裂を受けうるグルタチオンＳトランスフェラーゼ融 合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）アミノ酸 配列ＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡを含むことがより好ましい。 更に他の態様では本発明のＳＨ３融合蛋白質は、因子Ｘによる開裂を受けるこ とが可能なグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合セグメントをコードする核酸 分子に連結される（塩基対結合により）チロシンキナ ーゼのＳＨ３ドメインの少なくとも一部分をコードする核酸分子を含む。ＳＨ３ 融合蛋白質が、因子Ｘによる開裂を受けうるグルタチオンＳトランスフェラーゼ 融合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）Ｆｙｎ 、Ｌｙｎ、Ｂｔｋ、Ｌｃｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、もしくはＺａｐ ７０、より好ましくはＬｙｎを初めとするｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナー ゼに由来するＳＨ３ドメインの少なくとも一部分をコードする核酸分子を含むこ とが好ましい。 本発明は更に、宿主細胞内で発現しうるベクターに操作可能に連結される本発 明の化合物をコードする核酸分子を含む組換え分子をも含む。本明細書において 用いられる際には「操作可能に連結される」は、その配列が細胞内に形質転換さ れた場合に発現しうる様式での発現ベクター内への核酸配列の挿入を意味する。 本明細書において用いられる際には「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換し かつ適切な核酸分子の発現をもたらし、好ましくは宿主細胞内で複製することが 可能なＲＮＡもしくはＤＮＡベクターである。発現ベクターは原核生物もしくは 真核生物のいずれかであることが可能であり、そして典型的にはウイルスもしく はプラスミドである。 所望の発現ベクターの構築は当業者に知られる方法により実施することが可能 であり、そして発現を真核生物もしくは原核生物の系内で実施することができる 。適切な原核生物系は細菌株であり、これにはバチルス属（ｂａｃｉｌｌｉ）の 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の様々な株もしくはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ ）の様々な種が含まれるが、これらには限定されない。原核生物系で は、宿主細胞に適合する種に由来する複製起点および制御配列を含むプラスミド が用いられる。制 御配列は、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボゾーム結合性部位 、およびシャイン−ルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を含むこと が可能であるが、これらには限定されない。真核生物宿主細胞に有用な発現系は 適切な真核生物性遺伝子に由来するプロモーターを含む。有用な哺乳類プロモー ターにはＳＶ４０らの初期および後期プロモーター、あるいは他のウイルス性プ ロモーター（例えば、バキュロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス 、ウシのパピローマウイルス、もしくは鳥類の肉腫ウイルスに由来するもの）が 含まれる。本発明の発現ベクターには本発明の組換え細胞内で機能する（すなわ ち、遺伝子発現を指令する）いずれかのベクターが含まれ、それらには細菌、イ ースト、他の真菌類、昆虫、植物、哺乳類の細胞が含まれる。発現系は当業者に 知られる方法を用いて本発明の核酸分子に操作的に連結される既述の制御因子の 内のいずれかから構築することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ ａｌ．、前述、を参照されたい）。 本発明の宿主細胞は：本発明の化合物を産生することが天然の状態で可能な細 胞；もしくは本発明の化合物をコードする核酸分子で形質転換させた際に本発明 の化合物を産生しうる細胞であることができる。本発明の宿主細胞には細菌、真 菌類、昆虫、植物、および哺乳類の細胞が含まれるが、これらには限定されない 。より好ましい宿主細胞には、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチ ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、 ＳＦ９、およびドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）が含まれる。 組換え細胞は一つもしくは複数の組換え分子で宿主細胞を形質転換す ることにより産生することが好ましく、各々の組換え分子は一つもしくは複数の 転写制御配列を含む発現ベクターに操作的に連結される本発明の一つもしくは複 数の核酸分子を含む。本発明の組換え分子は、形質転換予定の細胞内で核酸分子 （一つもしくは複数）の発現を効果的に調節しうるいずれかの転写制御配列の内 の少なくとも一つに操作可能に連結される、これまでに記載された核酸分子の内 の少なくとも一つを含みうる分子である。 組換えＤＮＡ技術の使用により、例えば宿主細胞内の核酸分子のコピー数を操 作することにより形質転換化核酸分子の発現、それらの核酸分子が転写される効 率、および得られる転写物が翻訳される効率、ならびに翻訳後修飾の効率が改善 され得ることが当業者により認識される。本発明の核酸分子の発現を増加させる のに有用な組換え技術には、多コピー数プラスミドへの核酸分子の操作可能に連 結、一つもしくは複数の宿主細胞染色体内への核酸分子の組込み、プラスミドへ のベクター安定化配列の添加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペ レーター、エンハンサー）の置換もしくは改変、翻訳制御シグナルの置換もしく は改変、宿主細胞に利用されるコードに対応させるための本発明の核酸分子のへ の改変、転写物を不安定化させる配列の削除、ならびに発酵中の組換え酵素産物 から増殖する組換え細胞を一次的に分離する制御シグナルの使用が含まれるが、 これらには限定されない。本発明の発現化組換えペプチドの活性は、そのような ペプチドをコードする核酸分子を断片化、改変、もしくは誘導化することにより 改善することができる。 本発明に従うと、本発明の組換え細胞を用いて、そのような細胞をそのような 化合物を産生させるのに有効な条件下で培養し、そしてその化 合物を回収することにより本発明の化合物を産生することが可能である。本発明 の化合物を産生するのに有効な条件には、ペプチド産生を可能にさせる適切な培 地、生物反応装置、温度、ｐＨ、および酸素条件が含まれるが、これらには限定 されない。適切な培地は、培養した際に本発明の細胞が本発明の化合物を産生す ることが可能となるいずれかの培地を意味する。有効な培地は典型的には、同化 性炭水化物、窒素、およびリン酸源、ならびに適切な塩、無機物、金属、および 他の栄養素（例えば、ビタミン）を含む水性培地である。この培地は複合栄養物 を含むことができるか、もしくは特定された最少培地であることができる。この 培地は更に、特定の組換え分子の発現についての選択を行う化学性試薬も含むこ ともできる。このような試薬にはネオマイシン、アンピリシン、テトラサイクリ ン、クロラムフェニコール、およびミコフェノール酸が含まれるが、これらには 限定されない。 産生用に用いられるベクターおよび宿主系に依存して本発明の得られる化合物 は、組換え細胞内に滞在するか；発酵培地中に分泌されるか；２枚の細胞膜間の 空間内（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内のペリプラズム空間）に分泌され るか；あるいは細胞もしくはウイルスの膜の外側表面上に保持されるかのいずれ かとなることができる。成句「化合物の回収」は単にその化合物を含む全発酵培 地を回収することを意味し、そして分離もしくは精製の追加的段階を意味する必 要はない。本発明の化合物は様々な標準的蛋白質精製技術を用いて精製すること が可能であり、そのような技術とは例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン 交換クロマトグラフィー、濾過、電気穿孔法、疎水性相互作用クロマトグラフィ ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コ ンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、鑑別可溶化法、 および免疫沈降法であるが、これらには限定されない。本発明の化合物は「実質 的に純粋な」形態で回収されることが好ましい。本明細書で用いられる場合には 「実質的に純粋な」は、治療用化合物としてか、もしくはアッセイ系におけるそ の化合物の効果的な使用を考慮する純度を意味する。本発明の実質的に純粋な化 合物は例えば、そのような細胞に対して実質的な毒性を呈することなく細胞内で チロシンキナーゼ、Ｓｈｃ分子、脂質キナーゼ、ＰＩ−３Ｋ、もしくはチロシン キナーゼエフェクターの活性を調節することができるはずである。 本発明のある態様は、有効な様式で動物に投与した際にその動物の細胞内での シグナル変換を調節しうる治療用組成物である。本発明の治療用組成物は細胞内 での異常なシグナル変換により部分的に生じるいずれかの疾患の治療に有用であ る。このような疾患には、癌、自己免疫疾患、免疫不全性疾患、免疫増殖性疾患 、アレルギー応答、および炎症性疾患が含まれる。本発明の治療用組成物は更に 医療的治療（例えば、臓器および皮膚の移植）中の免疫応答の調節にも有用であ る。自己免疫疾患は例えば、全身性狼瘡、重症筋無力症、リューマチ性関節炎、 インシュリン依存性糖尿病、および実験的アレルギー性脳髄膜炎を含むことがで きる。免疫不全性疾患は例えば、ヒトＡＩＤＳ、重症複合性免疫不全症、および 低ガンマー−グロブリン血症を含むことができる。免疫増殖性疾患は例えばリン パ腫および白血病を含むことができる。それに加えて本発明の治療用組成物は腫 瘍形成を初めとする癌の全形態の治療に有用である。 本発明の治療用組成物はウイルス性疾患（例えば、エプスタイン−バ ール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）を一例とするヘルペスウ イルスにより生じるもの）の治療にも有用である。このような疾患には例えば、 感染性単球細胞症、慢性疲労症候群、および免疫無防備状態宿主におけるＢ−リ ンパ球増殖性障害が含まれる。Ｂリンパ球はＥＢＶによる潜伏的な感染を受ける ことが可能である。Ｂ細胞における潜伏期中にはＥＢＶは宿主の免疫系による攻 撃に対する感受性を示さない。ＥＢＶはＢ細胞が休止期（例えば、分泌されるべ き抗体の産生を行わない）である場合には潜伏状態をとり続けるが、それはＥＢ Ｖ遺伝子複製が宿主細胞遺伝子複製に関わる蛋白質を必要とし、かつ休止期のＢ 細胞転写が最少限となるためである。休止期Ｂ細胞の活性化の際にはＥＢＶが増 殖するが、それは宿主細胞遺伝子転写機構が増加するためである。本発明の治療 用組成物は、休止期Ｂ細胞内のシグナル変換の活性化を刺激化し、そしてそのこ とによりそのＥＢＶウイルスの複製およびそのような細胞内での潜伏期からの脱 離を生じることによりＥＢＶ−由来の疾患から動物を防御することができる。そ の後に増加性ＥＢＶは宿主免疫系による攻撃に対する感受性を示す。 ＬＭＰ２Ａは潜伏期からの再活性化を調節する膜内在性蛋白質である。ＬＭＰ Ａ２はそのＡＲＨ１モチーフを介してＬｙｎおよびＳｋｙと相互作用を行い、そ のことによりＬｙｎもしくはＳｋｙの酵素活性を刺激化し、それを受けて潜伏期 からのＥＢＶの再活性化の増加がもたらされる。従ってＬＭＰ２Ａに由来するＡ ＲＨ１ペプチドはＥＢＶ由来の疾患から動物を防御するのに有用であり得る。 ＥＢＶは更に免抑制剤治療により悪化する可能性のある移植後のリンパ球増殖 性障害（ＰＬＰＤ）にも関連している。ＥＢＶ核蛋白質ＥＢＮ Ａ２の発現の欠失は充実性腫瘍形成の病因に関連している。従って、ＥＢＮＡ２ に由来するＡＲＨ１ペプチドはＥＢＶの発現を刺激化し、そしてそのことにより 宿主の免疫系による攻撃に対するＥＢＶの感受性を増加させることにより腫瘍形 成から動物を防御するのに有用であり得る。 本発明の治療用組成物は更に、ウイルス（例えばウシの白血病ウイルス（ＢＬ Ｖ）感染化細胞の形質転換により生じる腫瘍の治療にも有用である。ＢＬＶ感染 化宿主細胞はＢＶＬ蛋白質ｇｐ３０に対する抗体を産生する。ＢＬＶ感染化Ｂリ ンパ球の表面上でのｇｐ３０の発現の際には、そのような抗体は表面に結合して いるｇｐ３０に結合および架橋形成を行い、そのことによりＢリンパ球を活性化 することが可能である。Ｂリンパ球の活性化は悪性細胞へのリンパ球の形質転換 をもたらすことが可能である。本発明の治療用組成物はｇｐ３０の架橋結合によ り休止期のＢ細胞の活性化を阻害し、そのことによりＢ細胞の形質転換を阻害し うる。 治療用組成物は適切な担体と組み合わせた本発明の化合物を含む。本明細書で 用いられる際には「担体」は、インビトロもしくはインビボでの適切な作用部位 に本発明の化合物を輸送するための賦形剤として適するいずれかの物質を意味す る。担体それ自体が本発明の化合物を含む治療用組成物の添加剤もしくは製剤と して作用することが可能である。好ましい担体はチロシンキナーゼと結合しうる 形態で本発明の化合物を維持することができる。そのような担体の例には、水、 リン酸緩衝化食塩水、リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）溶液、デキストローズ溶液 、血清含有性溶液、ハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）溶液、および他の生理学的平衡化 水溶液を含むが、それらには限定されない。水性担体は例えば、化学的 安定性および浸透圧性を亢進させることによりレシピエントの生理学条件に近づ けるのに必要な適切な補助物質も含むこともできる。適切な補助物質には例えば 、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カル シウム、ならびにリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、および重炭酸塩緩衝液を生じ るのに用いられる他の物質が含まれる。補助物質は更に例えば、チメロサール、 ｍ−およびｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンゾジルアルコールのような 保存料を含むことが可能である。エアロゾル輸送にとって好ましい補助物質には レシピエントにとって無毒性の界面活性剤物質が含まれ、その例はエステル、あ るいは約６〜約２２の炭素原子を含む脂肪酸の部分的エステルである。エステル の例には例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステア リン酸、リノール酸、リノレン酸、オレオステアリン酸、およびオレイン酸が含 まれる。本発明の治療用組成物は通常の方法および／または凍結乾燥により滅菌 することができる。 本発明の担体は更にアジュバントをも含んでいてもよく、それらのアジュバン トにはフロインド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）のアジュバント；他の細菌性細胞壁構成 成分；アルミニウムを基にする塩；カルシウムを基にする塩；ポリヌクレオチド ；トキソイド；血清蛋白質；ウイルスコート蛋白質；および他の細菌由来の調製 物が含まれるがこれらには限定されない。 本発明の化合物に有用な担体には、いずれかの人工もしくは天然の脂質含有性 標的分子、好ましくは細胞、細胞膜、リポソーム、およびミセルが含まれる。貫 膜セグメントが本発明の化合物に結合する場合には、本発明の治療用組成物をリ ポソームもしくはミセルの形態で投与するこ とが好ましい。本発明のリポソームおよびミセルは細胞の細胞外空間から細胞の 細胞内空間へと化合物を輸送することができる。リポソームもしくはミセルと組 合わせられる本発明の化合物の濃度には、その化合物の十分量を細胞へ輸送し、 その結果そのような細胞内でのシグナル変換が調節されるのに有効な量が含まれ る。 本発明の治療用組成物は既述の本発明の化合物の内の少なくとも一つを含み、 そして更にシグナル変換を調節することが可能な少なくとも一つの追加的治療用 組成物をも含むことができる。先に一層詳細に記載されるように、本発明のＡＲ Ｈ１ペプチドはシグナル変換経路における初期現象を調節することが可能である 。本発明のＡＲＨ１ペプチドはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼもしくはｓｙｋ −ファミリーのチロシンキナーゼの活性を調節することができ、そのチロ シンキナーゼが膜結合化分子の活性を調節する。先にも記載したように、本発明 のＡＲＨ１ペプチド（Ｓｈｃ−選択的ペプチドもしくはＰＩ−３Ｋ−選択的ペプ チド）あるいは本発明の高Ｐｒｏペプチドは膜結合化レセプターとの相互作用に は直接関わることのないシグナル変換経路内の複数の段階を調節することができ る。ＡＲＨ１ペプチドもしくは高Ｐｒｏペプチド自体はその経路内の後期にシグ ナル変換現象を調節する。従って当業者は、本発明の化合物を細胞内のシグナル 変換の二重調節を可能にするためにいずれかの組み合わせで用いてもよいことを 認識している。例えば、本発明の治療用組成物は、本発明の少なくとも一つのＡ ＲＨ１ペプチドおよび本発明の少なくとも一つの高Ｐｒｏペプチドを含むことが できる。本発明の治療用組成物が細胞内のシグナル変換を刺激しうる少なくとも 一つのリン酸化ＡＲＨ１ペプチドおよび細胞内のシグナル変換を阻害し うる高Ｐｒｏペプチド、あるいは細胞内のシグナル変換を阻害しうる少なくとも 一つの非リン酸化ＡＲＨ１ペプチドおよび細胞内のシグナル変換を阻害しうる少 なくとも一つの高Ｐｒｏペプチドを含むことが好ましい。 本発明の治療用組成物をいずれかの動物、好ましくは哺乳類、および更に一層 好ましくはヒトに投与することができる。有効な様式での本発明の治療用組成物 を投与するための許容されるプロトコールには、個々の投与剤サイズ、投与剤数 、投与剤投与の頻度、および投与の様式が含まれる。輸送の方法は、疾患の予防 および治療に適合するいずれかの方法を含むことができる。輸送の方法には非経 口投与、経口投与、静脈内投与、局所投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）すなわち局 所（ｌｏｃａｌ）投与（例えばエアロゾルによる）、あるいは経皮投与が含まれ るが、これらには限定されない。 本発明は更に、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの活性化の刺激を阻害 しうる化合物を同定するためのキットも含む。そのようなキットには：（１）チ ロシンキナーゼ；（２）チロシンキナーゼの活性を刺激化しうる本発明の化合物 ；および（３）チロシンキナーゼの活性を測定するための方法が含まれる。例え ばそのキットにｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼによる改変を受けること が可能な初期標的分子およびそのような改変を検出するための手段を添加するこ とにより、阻害的化合物を同定するために本発明のキットを改変することは当業 者の技術範囲内に含まれる。チロシンキナーゼの活性を、例えばキナーゼによる 初期標的分子の自己リン酸化もしくは改変を測定することにより測定することが 可能である。 ある態様では本発明のキットは：本発明の（１）ｓｒｃ−ファミリーのチロシ ンキナーゼおよび（２）刺激性ＡＲＨ１ペプチド；ならびに（３）所望されるリ ン酸化を施すに十分な量のγ−32Ｐ−ＡＴＰを含む。本発明のキットは、ｓｒｃ −ファミリーのチロシンキナーゼＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙ ｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａｐ７０、あるいはそれらのいずれかの組み 合わせ物、より好ましくはＦｙｎもしくはＬｙｎ、あるいはそれらのいずれかの 組み合わせ物、および更に一層好ましくはＦｙｎを含んでいてもよいが、それら には限定されない。本発明の適切な刺激性ＡＲＨ１ペプチドは、本明細書に開示 されるリン酸化ＡＲＨ１ペプチドを含む。本発明のキットは配列ＹＥＧＬＮＬＤ ＤＣＳＭＹＥＤＩを有するリン酸化ＡＲＨ１ペプチドを含むことが好ましく、配 列ＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩであることが一層好ましい。ｓｒｃ−フ ァミリーのチロシンキナーゼ内へのγ−32Ｐ−ＡＴＰの取り込みを検出するため のいずれかの手段がそのキット内に含まれていてもよく、そのような手段は例え ばホスホセルロースブロット用の手段である。他の態様では本発明のキットはチ ロシン残基を有するいずれかのペプチドを更に含むことができる。そのようなペ プチドはアミノ酸配列ＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬを含むことが好ましい。 他の態様では本発明のキットは、初期標的分子の自己リン酸化もしくはリン酸 化を検出するための手段として使用されるべきホスホチロシン残基に特異的な抗 体を含むことができる。リン酸化もしくは非リン酸化標的分子は、抗−ホスホチ ロシン抗体の添加前もしくは後に表面（例えばニトロセルロースもしくはＥＬＩ ＳＡプレート）に結合することができる。例えば抗体結合が蛍光表示式細胞分取 器（ＦＡＣＳ）分析により 分析予定である場合には抗体の添加後にも標的分子が未結合のままであることが 可能である。本発明のキットは更にその標的分子への抗体の結合を検出するため の「顕色用構成成分」を含むことができる。この顕色用構成成分は抗体に結合す る化合物を含んでいてもよく、その化合物は検出用標識に連結している。結合性 化合物は、第一抗体が標的分子に結合する際にその第一抗体に結合しうる第二抗 体；抗体に結合する細菌表面蛋白質（例えば、プロテインＡもしくはプロテイン Ｇ）；ビオチン−ストレプトアビジンもしくはビオチン−アビジン連結化検出系 ；抗体と相互作用する細胞（例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞、あるいはマクロフ ァージ）；抗体に結合する真核生物細胞表面蛋白質（例えば、ＦＣレセプター） ；ならびに補体蛋白質、を含むことができるが、これらには限定されない。検出 用標識の変異体を用いることができ、それらには放射活性ラベル、酵素性ラベル 、および蛍光ラベルが含まれるがそれらには限定されない。標識の検出はアッセ イに依存して様々な熟知された技術を用いて達成することができる。酵素アッセ イ（例えば、アルカリ性ホスファターゼもしくはセイヨウカラシパーオキシダー ゼの使用）では、肉眼的か、あるいは例えばデンシトメーターもしくは分光光度 計のような装置により検出することが可能である比色分析用産物を生じさせるこ とがよくある。本発明のキットは更に、免疫沈降法および免疫ブロット分析を実 施するための試薬を含むことが可能である。 本発明の別の特徴および態様では、キットは：（１）チロシンキナーゼ（２） 高プロリン蛋白質；および（３）初期標的分子を含む。本発明のキットはｓｒｃ −ファミリーのチロシンキナーゼＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙ ｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａｐ７０、 もしくはそれらのいずれかの組み合わせ物を含むことが好ましく、より好ましく はＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、もしくはそれら のいずれかの組み合わせ物、および更に一層好ましくはＬｙｎもしくはＦｙｎ、 あるいはそれらの組み合わせ物を含むが、それらには限定されない。適切な高プ ロリン蛋白質はＰＩ−３Ｋおよびｐ８５［８０〜１０４］を含むがそれらには限 定されない。初期標的分子はリン酸化を受けることが可能な蛋白質もしくは脂質 の分子を含むことが好ましく、より好ましくは脂質分子、そして更に一層好まし くはホスファチジルイノシトール、４−リン酸ホスファチジルイノシトール、４ ，５−二リン酸ホスファチジルイノシトール、あるいはそれらの組み合わせ物を 含む。標的分子のリン酸化を検出するためのいずれかの手段がキット内に含まれ ていてもよく、その手段の例は薄層クロマトグラフィー分析のための手段などで ある。このようなキットはチロシンキナーゼ／標的分子結合の活性を競合的に阻 害しうる本発明の適切な化合物を発見するのに用いられる。 本発明のキットを、各段階を研究用技術により実施することを必要とする自動 システムもしくは手動システム内で用いることができる。この検査用キットは更 にチロシンキナーゼの酵素活性を維持するのに必要とされる全ての適切な反応緩 衝液を含むこともできる。 本発明のキットは免疫応答、特にＢ細胞およびＴ細胞におけるものに関与する 細胞内のシグナル変換を調節しうる治療用組成物の同定に特に有用である。特に 有用な化合物はチロシンキナーゼ、アダプター分子、もしくは脂質キナーゼに結 合するおよび／またはそれらを活性化する化合物を含み、かつそれらの化合物は 高い特異性を有するためそれらを低 用量で投与することが可能となる。 本発明の他の態様は、細胞内のシグナル変換を阻害しうる化合物を同定するた めの方法である。本発明のある態様では、阻害性化合物を；（ａ）チロシンキナ ーゼを仮想的阻害性化合物と接触させて反応混合物を形成させる段階；（ｂ）そ の反応混合物を本発明の刺激性ＡＲＨ１ペプチドと接触させる段階；および（ｃ ）その仮想的阻害性化合物がチロシンキナーゼの自己リン酸化を阻害する能力を 決定する段階、を含む方法により同定することができる。本発明で用いられるチ ロシンキナーゼはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃ ｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａｐ７０、もしくは それらのいずれかの組み合わせ物を含むことが好ましく、より好ましくはＦｙｎ 、Ｌｙｎ、もしくはＢｌｋ、あるいはそれらのいずれかの組み合わせ物、および 更に一層好ましくはＢｔｋもしくはＦｙｎ、あるいはそれらの組み合わせ物を含 むが、それらには限定されない。適切な刺激性ＡＲＨ１ペプチドには本明細書に 開示されるリン酸化ＡＲＨ１ペプチドが含まれる。 他の態様では阻害性化合物は、キナーゼによるリン酸化を受けうる標的分子と チロシンキナーゼとを接触させて反応混合物を形成することにより同定すること ができる。その後にこの反応混合物を仮想的阻害性化合物と接触させてアッセイ 混合物を形成させる。その後に本発明の刺激性ＡＲＨ１ペプチドをそのアッセイ 混合物に添加し、そしてその仮想的阻害性化合物がそのチロシンキナーゼにより その標的分子のリン酸化を阻害する能力を測定する。 本発明の別の特徴および態様に関しては、阻害性化合物を：（ａ）チ ロシンキナーゼを仮想的阻害性化合物と接触させて反応混合物を形成させる段階 ；（ｂ）その反応混合物を高プロリン蛋白質と接触させてアッセイ混合物を形成 させる段階；（ｃ）そのアッセイ混合物をそのチロシンキナーゼによる改変を受 けることが可能な初期標的配列と接触させる段階；および（ｄ）その仮想的阻害 性化合物がそのチロシンキナーゼによる標的分子の改変を阻害する能力を決定す る段階、を含む方法により同定することが可能である。適切なチロシンキナーゼ にはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼが含まれ、好ましくはキナーゼＦｙ ｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａ ｐ７０、あるいはそれらのいずれかの組み合わせ物、より好ましくはＦｙｎ、Ｌ ｙｎ、もしくはＢｔｋ、あるいはそれらのいずれかの混合物、および更に一層好 ましくはＢｔｋもしくはＦｙｎが含まれるが、それらには限定されない。本発明 の方法において有用な高プロリン蛋白質にはＰＩ−３Ｋが含まれることが好まし いが、これには限定されない。初期標的分子がリン酸化を受けうる蛋白質もしく は脂質の分子を含むことが好ましく、脂質分子を含むことがより好ましく、そし てホスファチジルイノシトール、４−リン酸ホスファチジルイノシトール、４， ５−二リン酸ホスファチジルイノシトールあるいはそれらの組み合わせ物を含む ことが更に一層好ましい。初期標的分子の改変を検出するための方法には例えば 、ホスホセルロースブロットもしくは薄層クロマトグラフィーが含まれ得る。 本発明の他の態様には、シグナル変換を調節しうる化合物を同定するための細 胞を基にするアッセイを用いる方法が含まれる。ある態様ではシグナル変換を刺 激しうる化合物の同定に有用な本発明の細胞を基にす るアッセイは：（ａ）細胞を、その化合物がその細胞内に侵入することが可能な 様式で仮想的刺激性化合物と接触させる段階；（ｂ）その化合物と細胞を、その 化合物と適切な細胞内分子との会合が可能になるようにインキュベートする段階 ；（ｃ）細胞を溶解する段階；および（ｄ）その化合物に結合した細胞内分子の リン酸化の段階を決定する段階、を含む。適切な細胞には哺乳類細胞が含まれる が、これには限定されない。適切な細胞内分子にはｓｒｃ−ファミリーのチロシ ンキナーゼ、特にＬｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、 Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０が含まれるがこれらには限定されない。細胞 内分子のリン酸化の状態を決定するための方法にはＥＬＩＳＡアッセイもしくは ＦＡＣＳ分析が含まれる。溶解した細胞をＥＬＩＳＡプレートに結合させた細胞 内分子に特異的な抗体と接触させることが可能であることが好ましい。そのプレ ートを洗浄し、そしてその後に先に詳細が記述されている標識を結合させてある 抗−ホスホトリプシン抗体と接触させてもよい。ＥＬＩＳＡプレートに結合した 抗−ホスホトリプシン抗体の量を測定して、その仮想的刺激性化合物による細胞 内分子のリン酸化およびそのことによる刺激化の程度を決定することができる。 細胞内分子のリン酸化の状態を決定するための他の方法には、細胞内分子に特異 的な抗体を溶解させた細胞と溶液中で接触させることが含まれる。抗−ホスホト リプシン抗体をその溶液に添加し、そしてＦＡＣＳ分析により分析することがで きる。抗−ホスホトリプシン抗体は蛍光標識を有していてもよいが、あるいは標 識を有する第二抗体をその溶液に添加してもよい。 他の態様では、本発明の細胞を基にするアッセイは、シグナル変換を 阻害しうる化合物の同定に有用である。本発明の細胞を基にするアッセイは：（ ａ）細胞を仮想的阻害性化合物と接触させる段階；（ｂ）その化合物を細胞と共 に、その化合物が細胞内分子に結合しうるようにインキュベートする段階；（ｃ ）その細胞表面上の膜結合化レセプターを連結させる段階；（ｄ）その細胞を溶 解する段階；および（ｅ）その仮想的阻害性分子へ結合した細胞内蛋白質のリン 酸化の状態を決定する段階、を含むことができる。適切な細胞には哺乳類細胞が 含まれるが、これには限定されない。適切な細胞内分子はＬｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃ ｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０を含 んでいてもよいが、これらには限定されない。細胞内蛋白質のリン酸化の状態は 直ぐ上に詳細に記載される方法を用いて決定することができる。 更に他の態様では、本発明の細胞を基にするアッセイは：（ａ）細胞を仮想的 阻害性化合物と接触させる段階；（ｂ）その化合物とその細胞とを、その化合物 が細胞内分子に結合しうるようにインキュベートする段階；（ｃ）細胞表面上の 膜結合化レセプターを連結させる段階；および（ｄ）仮想的阻害性分子が細胞内 のカルシウム流動化を阻害する能力を決定する段階、を含むことができる。適切 な細胞には哺乳類細胞が含まれるが、これには限定されない。適切な仮想的調節 分子には、本発明のＳｙｋ−選択的、Ｓｈｃ−選択的、もしくはＰＩ−３Ｋ選択 的ペプチドのミメトープが含まれる。カルシウム流動性は、Ｊｕｓｔｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：８８１−８８６、１９８６、に おいて一般的に記載される方法を用いて測定することが可能である。 更に他の態様では、本発明の細胞を基にするアッセイは：（ａ）細胞 を仮想的阻害性化合物と接触させる段階；（ｂ）その化合物とその細胞とを、そ の化合物が細胞内分子に結合しうるようにインキュベートする段階；（ｃ）細胞 表面上の膜結合化レセプターを連結させる段階；および（ｄ）仮想的阻害性分子 が細胞内のリン酸化ホスホイノシチド形成を阻害する能力を決定する段階、を含 むことができる。適切な細胞には哺乳類細胞が含まれるが、これには限定されな い。リン酸化ホスホイノシチドの形成は、Ｒａｎｓｏｍ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ． １３７：７０８−７１５、１９８６）に一般的に記載される方 法を用いて測定することができる。 好ましい態様では、本発明の細胞を基にするアッセイにおいて用いられる細胞 には、その細胞を仮想的阻害性化合物と接触させる以前に透過性処理が施される 。本発明のアッセイにおける使用のために細胞に透過性処理を施すための技術は 以下の実施例に記載される。 以下の実施例は説明の目的で提供され、かつ本発明の範囲を制限することを意 図するのではない。 実施例 実施例１ この実施例は、Ｉｇ−αおよびＩｇ−βの結合特異性をＡＲＨ１モチーフの保 存化チロシン間に存在する４つのアミノ酸により決定することができることを説 明する。 多様性配列の領域が交換されている一連のＩｇ−αおよびＩｇ−βスイッチ突 然変異体を構築した（図３、太文字により示されている）。Ｉｇ−αおよびＩｇ −βの細胞質側テイルの突然変異誘発もしくは切断は、Ｉｇ−αおよびＩｇ−β のｃＤＮＡ鋳型を用いるポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）増幅を用いて達成された。各突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチ ドプライマーを、１．５ｍＭ Ｍｇ2+を含む標準的ＰＣＲ反応混合物中で用い、 そして２５〜３０回の周期に付した（９４°、５５°、７２℃、各１分間）。内 部ヌクレオチドの交換突然変異誘発もしくは点突然変異誘発は、その突然変異が 重複配列の５’もしくは３’配列内に含まれるＤＮＡ断片の産生を必要とした。 これらの断片を互いにつなぎあわせ、そしてその後に相補的フランクプライマー で増幅させた。Ｉｇ−αHTおよびＩｇ−βQTATスイッチ突然変異体、ならびにＹ １８２ΔＦおよびＹ１９３ΔＦチロシン突然変異体を、製造業者（Ｂｉｏｒａｄ 社）により推奨されるキットを用いる部位特異的突然変異誘発により作製した。 以下に列挙されるオリゴヌクレオチドを突然変異誘発用に用いた。突然変異も しくは切断を施したｃＤＮＡの最終増幅については、制限部位（下線を施してあ る）を含むプライマーを用いてクローニングを容易にさせた。切断突然変異体は 以下のプライマーを用いて作製した： スイッチ突然変異体は以下のプライマーを用いて作製した： チロシン突然変異体は先に列挙されるＩｇ−α ＡＲＨ１プライマーを以下のプ ライマーと組み合わせて用いて作製した： 点突然変異体は先に列挙されるＩｇ−α ＡＲＨ１プライマーを以下のプライマ ーと組み合わせて用いて作製した： 先に列挙されるＩｇ−αおよびＩｇ−βの突然変異体をコードするＰＣＲ産物を 一晩、２５℃下で、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化させ、そして３％のＮｕ Ｓｉｅｖｅ アガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社）を通す電気泳動 により分離させ、そしてＭＥＲｍａｉｄ（ＢＩＯ １０１）で単離した。Ｉｇ− αおよびＩｇ−βの各突然変異体の融合蛋白質は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ 消化させたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化させたｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ社）内に連結させ、そして得られる組換え分子を細菌ＤＨ５α 内にトランスフォームさせることにより産生させた。アンピリシン（１００μｇ ／ｍｌ）上で選択されたトランスフォーム体をＰＣＲを用いてスクリーニングし 、そしてプラスミドＤＮＡをｔｉｐ−１００カラム（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて 精製した。二本鎖ＤＮＡについては、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２ ．０（ＵＳＢ社）、ならびにｐＧＥＸ−３Ｘ（５’−ＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＧ ＣＡＧＧＧ−３’）に対するプライマーを用いて直接配列決定を行った。 適切なＩｇ−αおよびＩｇ−β融合蛋白質を産生するトランスフォーム化細胞 を用いて、１リットルの対数期細胞（Ｏ．Ｄ． ５９５＝０．３７５）を０．２ ｍＭのイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３時間誘 導させることにより融合蛋白質を調製した。培養物を回収し、そして細胞を遠心 分離によりペレット化させた。この 細胞ペレットを、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５ｍｌのリン酸緩衝化 食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、超音波処理により溶解させ、そしてその溶解 物を遠心分離により清澄化させた。清澄化させた溶解物を５００μｌのグルタチ オン−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズの５０：５０スラリーと共に 一晩４℃でインキュベートし、そしてその後に１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ および０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで完全に洗浄した。ビーズ体 積当たりに結合した融合蛋白質の相対量を還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマ シーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）での染色により定量化した。幾つ かの融合蛋白質をその後に、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＣａＣｌ2中 の３０μｇの因子Ｘａ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で一晩４ ℃下で開裂した。この開裂化ペプチドを４ｍｌの総容積中でビーズから洗浄し出 し、濃縮し、そして全ての開裂化ペプチドについて同等のペプチドモル数対ビー ズ容積比を維持させて臭化シアン活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビ ーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の４００μｌの５０：５０スラリーに直接連結さ せた（室温で２時間）。残存性反応基は、更に２時間室温で０．２Ｍのグリシン 中でそのビーズをインキュベートすることにより遮断した。このビーズを徹底的 に洗浄して非結合化ペプチドを除去し、そして０．０２％のアジ化ナトリウムを 含む溶解用緩衝液中に保存した。 様々なＩｇ−αおよびＩｇ−β突然変異体融合蛋白質がｓｒｃ−ファミリーの チロシンキナーゼに結合する能力を、結合性アッセイおよびインビトロキナーゼ アッセイを用いて検査した。Ｂリンパ腫細胞 Ｋ４６、もしくは繊維芽細胞 Ｆ ｙｎ+ＮＩＨ−３Ｔ３を遠心分離により回収し ［試料当たり、２×１０7（Ｋ４６）もしくは１〜３×１０6（Ｆｙｎ+ＮＩＨ− ３Ｔ３）の細胞］、そして１ ｍｌの溶解用緩衝液［０．５％ ＮＰ−４０、１ ５０ｍｌ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム 、１０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、０．４ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＦ 、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ならびに各２μｇ／ ｍｌのアプロチニン、ロイペプシン、およびα−１−アンチトリプシン］中で溶 解した。清澄化溶解物を完全な融合蛋白質もしくはペプチドでコートしたビーズ （５〜１０μｌの５０：５０スラリー）と共に４時間２５℃もしくは一晩４℃で インキュベートした。吸着後にはそのビーズを１ｍｌの溶解用緩衝液で３度洗浄 し、そして様々な方法により分析した。 Ｉｇ−αおよびＩｇ−β突然変異体融合蛋白質がチロシンキナーゼ活性を有す る蛋白質に結合する能力、すなわちインビトロキナーゼアッセイを実施した。こ のインビトロキナーゼアッセイでは吸着物（既述の要領で調製される）を２度、 １ｍｌのキナーゼ用緩衝液［１０ｍｌ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐ Ｈ７．０）、２ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、および１ｍＭ ＰＭＳＦ］ 中で洗浄し、ペレット化させ、１０μＣｉのγ−32Ｐ ＡＴＰ、３０００Ｃｉ／ ｍｍを含む２０μｌのキナーゼ用緩衝液中に再懸濁させ、そして１０分間３０℃ でインキュベートした。その後にこの試料を溶解用緩衝液中で洗浄し、そして３ ０μｌの還元的試料用緩衝液中に再懸濁させた。等量の蛋白質を１０％ ＳＤＳ −ＰＡＧＥにより分離し、そして−７０℃で１〜２時間のオートラジオグラフィ ーによる検出を行った。この結果が図４に示される。各スイッチ突然変異体はそ の親鎖（Ｉｇ−αもしくはＩｇ−β）およびそ の突然変異体が含む他の鎖からのアミノ酸により命名される。第一の保存化チロ シンへの非保存化アミノ酸残基アミノ末端の交換が生じた場合（Ｉｇ−α：ＨＴ ／Ｉｇ−β：ＮＬ）、いずれの鎖の結合性特性にも全く効果は観察されなかった （図４）。ＡＲＨ１チロシンの間の４つの非保存化残基が交換を生じた場合には （Ｉｇ−βのＱＴＡＴに代わるＩｇ−αのＤＣＳＭ）、Ｉｇ−αは野生型Ｉｇ− αに結合する５０〜６０ｋＤ能力範囲の蛋白質のクラスターと結合しなくなる。 同様に、Ｉｇ−αの４つのアミノ酸（ＤＣＳＭ）を含むＩｇ−βスィッチ突然変 異体が今度は蛋白質のこのクラスターに結合する。 Ｉｇ−αおよびＩｇ−βに結合するｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの 特異性を更に調査するために、野生型、Ｉｇ−α（ＱＴＡＴ）もしくはＩｇ−β （ＤＣＳＭ）スイッチ突然変異体のいずれかに相当する合成ペプチドを用いてＦ ｙｎを過剰発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（Ｆｙｎ+ＮＩＨ−３Ｔ３）の溶解物を 探索した。 Ｆｙｎ免疫ブロット分析を以下の要領で実施した。既述の要領で調製される吸 着物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液で溶出させ、そして還元的ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより分離させ、そしてニトロセルロースに転移させた。転移物を、Ｔｒｉｓ 緩衝化食塩水（ＴＢＳ）［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１５０ｍＭ ＮａＣｌ］中の３％無脂肪乾燥乳で４時間、２５℃で遮断させ、そして乳−Ｔ ＢＳ中で１：５００〜１：１０００に希釈したウサギ抗−Ｆｙｎ抗体に２時間、 ２５℃下でハイブリダイズさせた。インキュベーション後、膜を、ＴＢＳ、もし くは０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＴＢＳで交互に数回洗浄し、125 −Ｉラベル化プロテインＡと共に２５℃で１時間インキュベートし、 再度洗浄し、そして免疫反応性をオートラジオグラフィーにより可視化させた。 別法では放射活性を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈ ｏｒｌｍａｇｅｒをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ｖｅｒｓｉｏｎ３．２２と共に用い て定量化した。免疫ブロットはモノクローナルのα−ホスホチロシン抗体 Ａｂ −２（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いても実施した。これらの事 例ではＴＢＳ中の３％の低リン酸塩のウシアルブミン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉ ｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社）を無脂肪乾燥乳の代わりに利用した。幾つかの免疫ブロ ットではアルカリ性ホスファターゼ複合化ヤギ抗−ウサギ抗体を用いた。これら のブロットを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）中で、ＶｅｃｔｏｒＩＩキッ ト（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．社）を用いて発色させ た。 図５に示されるように、様々なペプチドに結合する免疫反応性Ｆｙｎを検出す るための能力は、インビトロキナーゼラベルにより検出可能な５０および５９ｋ Ｄａの蛋白質に結合する各モチーフの能力と平行していた（図４）。小さい方の 免疫反応性バンドはＦｙｎの分解産物を表す。Ｉｇ−αのアスパラギン酸、シス テイン、セリン、およびメチオニンが個別にアラニンに変化している融合蛋白質 も作製し（既述の要領で）、そしてそれらの結合性活性を評定した。ＤＣＳＭ点 突然変異体のＧＳＴ融合蛋白質を因子Ｘａで開裂し、セファロース（Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ）に連結させ、そしてそれを用いて実施例１に記載されるＦｙｎ+ＮＩ Ｈ３Ｔ３細胞溶解物を吸着させた。吸着物を以前の要領で画化させ、そして電気 泳動的転移物を抗−Ｆｙｎで探索した。図６に示されるようにこれらの単一アミ ノ酸変化の内のいずれのものも結合性には何の影響も 及ぼさなかった。 まとめると、これらの結果により、ＦｙｎへのＡＲＨ１モチーフの結合および Ｆｙｎの活性化に寄与するのはＡＲＨ１領域の全体的構造であって、個々のアミ ノ酸ではないことが示される。２つもしくは複数のアミノ酸の変化もしくは欠失 に関与する突然変異が機能の破壊には必要であるはずである。それに加え、Ｉｇ −αのＡＲＨ１モチーフはＬｙｎおよびＦｙｎについての結合特異性を決定する ４つのアミノ酸からなる配列を含む。実施例２ この実施例は、Ｉｇ−αのＡＲＨ１ドメインのチロシンはＦｙｎに対する結合 には必須ではないことを示す。 既述の要領で、Ｉｇ−αの２つの保存的ＡＲＨ１チロシン（位置１８２および １９３）ならびに第三の非保存的チロシン（位置１７６）を実施例１に記載され る方法を用いてフェニルアラニンに突然変異させた。 チロシンの位置は以下のとうりである： これらの突然変異体がＦｙｎ蛋白質に結合する能力を、実施例１に記載されるイ ンビトロキナーゼアッセイを用いてアッセイした。吸着物を実施例１に記載され る要領で調製し、そしてキナーゼ用緩衝液中で［γ−32Ｐ］−ＡＴＰと共にイン キュベートし、洗浄し、そして１０％の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、 そしてオートラジオグラフィーにかけた。 典型的な実験の結果を図７に示す。これら全ての位置のチロシンに代 わるフェニルアラニンの置換はＩｇ−αの細胞質ドメインが安定にＦｙｎに結合 する能力には影響を及ぼさなかった。野生型蛋白質とＩｇ−αチロシン突然変異 化融合蛋白質がＦｙｎ+ＮＩＨ３Ｔ３細胞の溶解物から免疫沈降させたＦｙｎに 結合する能力の間の比較を行った。野生型Ｉｇ−α ＡＲＨ１融合蛋白質、もし くは３つ全てのチロシンがフェニルアラニンに突然変異させてある融合蛋白質に 結合した免疫反応性Ｆｙｎの量には全く差異が見いだされなかった（図８）。こ れらのデータにより、Ｉｇ−αのＡＲＨ１モチーフへのＦｙｎの根本的結合はこ れらのチロシンには非依存的であり、かつそのためそれらのリン酸化に依存する 可能性がないことが示される。実施例３ この実施例は、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフのチロシンリン酸化がＦｙｎに対 するその結合性を特異的に増加させることを示す。 リン酸化されたＩｇ−α ＡＲＨ１モチーフを作製するために、チロシンキナ ーゼＥｌｋの触媒性ドメインを、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターおよびクロラム フェニコール耐性標識を利用する発現ベクターｐＢＣ内にクローン化した。この 構築物を、ｌａｃプロモーターの制御下にＴ７ポリメラーゼをコードするｃＤＮ Ａを含む細菌株ＢＬ２１／ＤＥ３内にトランスフェクトさせた。その後にＩｇ− α ＡＲＨ１野生型、ならびに融合蛋白質を含むＩｇ−α ＡＲＨ１チロシン突 然変異体を、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドでの誘導化によりこれら の細菌内で発現およびリン酸化させた。 チロシンキナーゼＥｌｋの触媒性ドメインは、Ｔｏｎｙ Ｐａｗｓｏｎ博士（ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｏｎｔｏ）により供与され たｃＤＮＡから、以下のオリゴヌクレオチドプライマー： 5′-AAGAGGATCCGGTGGCCATGGAAGCTGTCCGGGAGTTTGC-3′および5′-AAGAGAATTCGAGT TCTCATGCCATTACCGACGG-3′を用いるＰＣＲ増幅を用いて増幅させた。このＰＣＲ 産物を実施例１に記載される要領で精製し、ｐＢＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社） に連結させ、そして細菌ＢＬ２１／ＤＥ３内にトランスフォームさせた。クロラ ムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）上で選択され、かつ０．２ｍＭのＩＰＴＧで 誘導化させた（既述の要領で）トランスフォーム体を、総細菌溶菌物を還元的Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ、ニトロセルロースに転移させ、そしてα−ホス ホチロシン抗体 Ａｂ−２（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）での免疫ブ ロット（実施例１に記載される要領）を実施することにより細菌蛋白質をリン酸 化させるそれらの能力についてのスクリーニングを行った。陽性クローンを選択 し、そしてその後に電気穿孔法によりＩｇ−α ＡＲＨ１（切断化野生型）もし くはＩｇ−α ＡＲＨ１チロシン突然変異体をコードするプラスミドで形質転換 させた。二重形質転換体をクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）およびアン ピリシン（１００μｇ／ｍｌ）上で同時に選択し、そしてその後に誘導化を施し てＥｌｋにより２〜５％がインビボでリン酸化されるＧＳＴ−融合蛋白質を発現 させた。非リン酸化産物からリン酸化産物を分離させる目的で、この混合化融合 蛋白質の約４０ｍｇをα−ホスホチロシン親和性カラム（１４ｍｇ／ｍｌセファ ロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）でのＩＧ２、Ｒａｙ Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎ博士 、Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、から供与された）に通した。その後にこ のカラムをリン酸緩衝化食塩水［１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、 ４．３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、および１．４ｍ Ｍ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．４）］で洗浄し、そしてリン酸化融合蛋白質を０．１ Ｎ 酢酸で溶出させた。リン酸化融合蛋白質溶出物を１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９． ０）で中和させ、リン酸緩衝化食塩水に対して透析し、そしてグルタチオンセフ ァロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と共に４℃で一晩インキュベートした。その後 にビーズ容積当たりに結合したリン酸化融合蛋白質の相対量を実施例１に記載さ れる要領で定量化した。 因子ＸａでのＩｇ−α ＡＲＨ１リン酸化融合蛋白質の開裂およびその後のＳ ＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗−ホスホチロシン免疫ブロットにより、ＧＳＴ融合相手 ではなくＡＲＨ１テイルがチロシンのリン酸化を受けることが示された。先の要 領で発現されたＡＲＨ１野生型融合蛋白質のチロシンリン酸化分画を抗−ホスホ チロシン親和性カラムを用いて更に精製し、そしてその後にグルタチオンセファ ロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズに結合させた。この分画は総融合蛋白質の 僅か約２〜５パーセントのみを占めるに過ぎなかった。その後に等量のリン酸化 および非リン酸化融合蛋白質を、それらがＦｙｎ+ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＮＰ４０ 溶菌物からのＦｙｎに結合する能力についてのアッセイを行った（実施例１に記 載される要領で）。抗−Ｆｙｎ抗体を用いてＦｙｎ+ＮＩＨ３Ｔ３細胞からＦｙ ｎを免疫沈降させた。この免疫沈降化Ｆｙｎを非リン酸化もしくはリン酸化ＡＲ Ｈ１ Ｉｇ−α融合蛋白質と共にインキュベートした。洗浄した吸着物を１０％ の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてニトロセルロースに転移させた 。その後にこのブロットをウサギ抗−Ｆｙｎ抗血清および125Ｉ−プロテインＡ で探索した。図９に示されるように、非リン酸化モチーフと比較すると約１０倍 多い免疫反応性Ｆｙｎがリン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフと結合した。 Ｆｙｎ結合性の亢進における反応性ホスホチロシンの相対的役割を決定するた めに、チロシン残基１８２もしくは１９３あるいはその両方が非リン酸化もしく はリン酸化のいずれかを受けているＩｇ−α ＡＲＨ１モチーフ（残基：１７１ 〜１９６）に対応するペプチドを合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅ ｍｓ社 モデル ４３０Ａを用いて）。ペプチド配列および純度をアミノ酸加水 分解分析により確認した（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社 Ｐｉｃｏ− Ｔａｇ システム）。合成ホスホペプチドの使用により特異的残基での化学量論 的リン酸化が確実に実施された。これらのペプチドはセファロース（Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ）ビーズに共有結合的に連結し（融合蛋白質由来ペプチドについて先に 記載した要領で）、そしてこれをＦｙｎ+ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物の吸着に用い た。抗−Ｆｙｎ免疫沈降物を陽性対照として分析した（図１０、「抗−Ｆｙｎ」 ラベル）。洗浄した吸着物を１０％の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ、 そしてニトロセルロースに転移させた。その後にそのブロットをＦｙｎに対する 抗体および125Ｉ−プロテインＡとで逐次的に探索した。洗浄したブロットをオ ートラジオグラフィーに供した。図１０に示される結果は、Ｉｇ−αのペプチド の全てに対するＦｙｎ結合が免疫ブロットにより検出されたことを示す。単一の リン酸化を受けたペプチドと結合したＦｙｎの量は非リン酸化ペプチドと比較す ると２．０倍（Ｙ１８２）および１．６倍（１９３）増加した（Ｐｈｏｓｐｈｏ ｒＩｍａｇｅｒを用いて測定した）。二重のリン酸化を受けたペプチドと結合し たＦｙｎの量は２４倍増加した。 新規の蛋白質がリン酸化されたＩｇ−αに結合するという可能性を更に詳しく 説明するために、Ｋ４６溶解物からの吸着物をインビトロキナ ーゼ反応およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。吸着物をインビトロリン酸化 に供し、そして実施例１に記載される方法に従って１０％の還元的ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。図１１に示されるように、 リン酸化されたＩｇ−αペプチドと結合するリン酸化が可能な新規の蛋白質の明 白な証拠は全く存在しなかった。実施例４ この実施例は、両方のチロシンリン酸化Ｉｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１モ チーフが亢進化Ｆｙｎ結合性活性を呈することを示す。 ＡＲＨ１チロシンの両方がリン酸化を受けているＩｇ−βおよびＩｇ−α Ａ ＲＨ１モチーフペプチドを実施例１に記載される要領で合成した。これらのリン 酸化ペプチドおよび追加的非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドをセファロー ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に連結させ、そしてＦｙｎの結合性の分析に用いた。 合成の二重リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフペプチド、ならびに非リン酸化 Ｉｇ−αおよびＩｇ−βＡＲＨ１モチーフペプチドを用いてＦｙｎ+ＮＩＨ３Ｔ ３細胞溶解物を吸着させた。吸着物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画化し、転移さ せ、そしてウサギ抗−ＦｙｎおよびＩ125プロテインＡでのブロットを作製した 。図１２に示されるように、リン酸化されたＩｇ−αは非リン酸化Ｉｇ−αと比 較すると一層効果的にＦｙｎに結合した。Ｉｇ−βはリン酸化されたＩｇ−αと 同定度の効率でＦｙｎに結合した。これらの結果により、ホスホチロシン依存的 相互作用の特異性はＱＴＡＴもしくはＤＣＳＭモチーフにより決定されるのでは ないことが示唆される。実施例５ この実施例は、Ｆｙｎの特異的酵素活性がリン酸化されたＩｇ−αへ の結合の際に増加することを示す。 Ｉｇ−αペプチドに結合する免疫反応性Ｆｙｎの触媒活性を決定するために、 ペプチドを基にするインビトロキナーゼアッセイを用いてＦｙｎ+ＮＩＨ３Ｔ３ 溶解物（実施例１に記載の要領で調製された）のＩｇ−α ＡＲＨ１吸着物にお ける活性を測定した。ペプチドのチロシン１８２もしくはチロシン１９３、ある いは１８２プラス１９３がリン酸化されている非リン酸化Ｉｇ−αもしくはＩｇ −βをこの実験に用いた。Ｆｙｎを、ウサギ抗−Ｆｙｎ抗体（５μｇ抗体／試料 ）およびプロテインＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ社）と共に行う２５℃下での逐次的な１時間のインキュベーションによりＦｙ ｎ+ＮＩＨ３Ｔ３（約２×１０6細胞等量／試料）細胞の溶解物から免疫沈降化さ せた。等量のビーズ結合化吸着物（既述の要領で調製した）もしくはＦｙｎ免疫 沈降物（１μＭ〜１ｍＭの濃度でのリン酸化Ｉｇ−αペプチドと共に１時間予備 インキュベートした後）を２度キナーゼ用緩衝液で洗浄し、ペレット化させ、チ ロシン１４２を取り囲むＴＣＲ−ζ鎖の一部分に相当する２ｍＭの外因性標的分 子（ＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬ）、１０μＭ ＡＴＰ、および１０μＣｉの［ γ−32Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍＭ）を含む５０μｌのキナーゼ用緩衝液中 に再懸濁させ、そして１０分間３０℃でインキュベートした。その後に各反応混 合物を１２μｌの２５％トリクロロ酢酸でクエンチングさせ、そしてＷｈａｔｍ ａｎ Ｐ８１ ホスホセルロース上にブロットさせた。その後にブロットを７５ ｍＭのリン酸中で数回洗浄し、そしてアセトンで乾燥させた。乾燥させたブロッ トをＢｅｃｋｍａｎ（モデル ＬＳ５８０１）ベータシンチレーションカウンタ ー上での液体シンチレーションにより 計数した。 免疫反応性Ｆｙｎについて既に検査してある等量の試料をキナーゼ活性につい てアッセイする際には、酵素活性の曲線は一つを例外として免疫反応性Ｆｙｎの レベルに相関していた（図１３を参照されたい）。免疫反応性Ｆｙｎの相対的増 加量（２４倍）と二重リン酸化されたＩｇ−αに結合したＦｙｎ酵素活性の相対 的増加量（＞６０倍）との間には矛盾が存在し、このことによりこのペプチドに 結合したＦｙｎは非リン酸化Ｉｇ−αに結合したものと比較すると一層触媒活性 が強いことが示唆される。 リン酸化されたＩｇ−αによるＦｙｎ活性のこの顕著な亢進を定量化するため に、Ｉｇ−αホスホロ−ＡＲＨ１ペプチドがインビトロでＦｙｎを活性化する能 力を分析した。Ｆｙｎ+ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物からの免疫精製化Ｆｙｎ（実施 例１に記載される要領で調製される）を定常量で、増加濃度の二重リン酸化Ｉｇ −αか、あるいはリン酸化を回避する目的でＡＲＨ１チロシン１８２もしくは１ ９３が予めフェニルアラニンに変化させてあるＩｇ−αに添加した。Ｆｙｎ+Ｎ ＩＨ３Ｔ３細胞（２×１０6細胞等量／試料）から調製されたＦｙｎを含む抗− Ｆｙｎビーズに、増加量のリン酸化Ｉｇ−αペプチド、あるいはチロシン１８２ および１９３が予めフェニルアラニンに変化させてある等価ペプチドを添加し、 その後に２５℃で１時間インキュベートした。その後にキナーゼ活性をアッセイ した。図１４に示されるように、Ｆｙｎの比活性はリン酸化Ｉｇ−αとのインキ ュベーションによりほぼ３倍増加したが、対応するＩｇ−αとのインキュベーシ ョンでは増加は見られなかった。Ｆｙｎ活性の増加は用量依存的かつ可飽和的で あり、そして低濃度（５μＭ） のペプチドで検出可能であった。 まとめると、実施例１〜５に記載される結果により、Ｆｙｎは配列ＤＣＳＭを 含むＡＲＨ１モチーフに結合することが可能であることが示される。それに加え 、そのＤＣＳＭ配列をフランクするチロシン残基のリン酸化はＦｙｎの刺激化に とって重要である。実施例６ この実施例はペプチドが、ＬｙｎとＦｙｎとのＰＩ−３Ｋへの結合を阻害する 能力がＰＩ−３Ｋ内に含まれる２つの高プロリン領域を反映することを示す。 高プロリン配列ＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴ（ｐ８ ５ α−サブユニット［８０−１０４］およびＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫ ＰＴＴＶＡ（ｐ８５ α−サブユニット［２２９−３１８］を有する２本のペプ チドを合成した。これらのペプチドはＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社 のモデル ４３０Ａ上で合成した。ペプチド配列および純度はアミノ酸加水分解 分析により確認した（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社 Ｐｉｃｏ−Ｔａ ｇシステム、一文字アミノ酸コード記号：Ｋ、リシン；Ｉ、イソロイシン；Ｓ、 セリン；Ｐ、プロリン；Ｔ、スレオニン；Ｒ、アルギニン；Ｖ、バリン；Ｇ、グ リシン；Ｎ、アスパラギン；Ｅ、グルタミン酸；Ｑ、グルタミン）。ｐ５６lyn （［Ｌｙｎ １−１３１］）およびｐ８９fyn（［Ｆｙｎ １−１４４］）ペプ チドはそれらのキナーゼの各々のＳＨ３ドメインを含み、これらを臭化シアン活 性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に連 結させ、そしてこれらを用いて、ｐ８５［８０−１０４］およびｐ８５［２９９ −３１８］の存在もしくは非存 在下でＰＩ−３Ｋを含むＫ４６ Ｂリンパ腫細胞の洗剤溶解物を探索した。これ らの直接連結化させたビーズは以下の要領で作製した。ｐ８９fynおよびｐ５６l yn のＳＨ３ドメインをコードするＤＮＡ断片を、以下のプライマーを用いてＫ４ ６ ｃＤＮＡ鋳型からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた： 各プライマーは後続のクローニングを容易にさせる非反復の制限部位（下線を施 してある、ＢａｍＨＩ：ＧＧＡＴＣＣ；ＥｃｏＲＩ：ＧＡＡＴＴＣ）をコードす る。その後にこのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩもしくはＥｃｏＲＩのいずれかで消化 させ、そしてｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）内に連結させた。ＤＮＡ 配列分析を実施してそのＰＣＲ生成産物の精度を確認した（Ｓｅｑｕａｎａｓｅ ２．０、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．社）。このｐＧＥＸ− ３Ｘ構築物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａ（ＢＲＬ −Ｇｉｂｃｏ社）内にトランスフェクトさせ、そして融合蛋白質を、１リットル の対数期の細胞（Ｏ．Ｄ． ５９５＝０．３７５）を０．２ｍＭのイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３時間誘導することにより調 製した。培養物を回収し、そして細胞を遠心分離によりペレット化させた。この 細胞ペレットを、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．０２％のアジ化ナ トリウムを含む５ｍｌのリン酸緩衝化 食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、そして融合蛋白質をその細胞から単離した。 その後に融合蛋白質をビーズ（２ｍｌの５０：５０スラリー）に結合させ、そ して１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ2中、３０μＭの因子Ｘａ（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で一晩３０℃下で開裂させた。そ の後に開裂化ペプチドを４ｍｌの総容積中でビーズから洗いだし、Ｓｐｅｅｄ− Ｖａｃにより２ｍｌに濃縮し、そしてその後に全融合蛋白質について同等の融合 蛋白質数対ビーズ容積比を維持させて４００μｌの５０：５０スラリーの臭化シ アン活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に直 接連結させた（室温で２時間）。その後に残りの反応性基を更に２時間室温で０ ．２Ｍグリシン中でそのビーズをインキュベートすることにより遮断した。その 後にそのビーズを徹底的に洗浄して非結合化ペプチドを除去し、そして０．０２ ％のアジ化ナトリウムを含む溶解用緩衝液中に保存した。 結合性実験およびペプチド阻害実験は以下の要領で実施した。Ｋ４６細胞（試 料当たり１×１０7細胞等量）の清澄化溶解物［１％ ＮＰ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２．０ｍＭ オルト バナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、０．４ｍＭ ＥＤＴ Ａ、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、アプロチニ ン（２ｍｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（２ｍｇ／ｍｌ）、およびα−１−アンチト リプシン（２ｍｇ／ｍｌ）］を調製し、そしてＦｙｎ［１−１４４］もしくはＬ ｙｎ［１−１３１］（１０ｍｌの５０：５０スラリー）のいずれかの融合蛋白質 でコートしたビーズと共にインキュベートした。ｐ８５の高プロリンペプ チドをビーズ上のＬｙｂおよびＦｙｎ融合蛋白質のものの２００、２０、および ２倍の濃度で吸着物に添加し、そして一晩インキュベートした。直接的に連結さ せたグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ペプチドビーズ吸着物を対照 として用いた。その後にこれらのビーズを溶解用緩衝液中で５回洗浄し、同一緩 衝液中に再懸濁させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）により溶出分離させた 。その後に蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転移させ、 そしてｐ８５に対する抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉ ｎｃ．社）での探索を行った。可溶化細胞（１×１０6細胞等量）からの清澄化 溶解物を対照（ＷＣＬ）として参入させた。膜を、０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ）中で完全に洗浄し、そしてそ の後にアルカリ性ホスファターゼ（Ｆｉｓｈｅｒ社）と複合体形成させたウサギ ＩｇＧに対するヤギ抗体と共にインキュベートした。この膜を再度洗浄し、そし てアルカリ性ホスファターゼ標的分子（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ社）で顕色させ た。図１５ＡはＦｙｎ［１２−１４４］へのｐ８５ペプチド結合を説明し、そし て図１５ＢはＬｙｎ［２７−１３１］へのｐ８５ペプチド結合を説明する。融合 蛋白質が２倍濃度で存在する際には、ｐ８５［８０−１０４］はＰＩ−３ＫのＦ ｙｎへの結合を約９０％阻害した（走査型デンシトメトリーにより測定した）。 ｐ８５［８０−１０４］とｐ８５［２９９−３１８］との両ペプチドは、それら のペプチドがＬｙｎもしくはＦｙｎ融合蛋白質のものの２０および２００倍の濃 度で存在する場合にＰＩ−３Ｋとの結合を完全に遮断した。Ｐ８５［２９９−３ １８］ペプチドは、そのペプチドの濃度がＦｙｎ融合蛋白質のものの２００倍で ある際にＦｙｎとのＰＩ−３ Ｋの結合を阻害するが、低濃度では検出可能な結合の阻害は全く示さなかった（ 図１５Ａ）。類似の結果がＬｙｎのＳＨ３に連結させたビーズを用いても観察さ れたが、例外は、ｐ８５［８０−１０４］とｐ８５［２９９−３１８］との両方 による阻害が弱めであったことであり（図１５Ｂ）、このことによりＦｙｎがＬ ｙｎと比較するとｐ８５については低めの親和性を有することがあることが示唆 される。これらの所見により、ｐ８５内での８０−１０４配列の認識はＰＩ−３ ＫへのＳＨ３結合にとって必須であることが示される。 ＬｙｎおよびＦｙｎのＳＨ３ドメインとのＰＩ−３Ｋの結合を媒介する際の高 プロリンｐ８５配列の十分性を決定するためには、ｐ８５［８０−１０４］とｐ ８５［２９９−３１８］とのペプチトをＣｎＢｒ−活性化セファロース（Ｓｅｐ ｈａｒｏｓｅ）４Ｂ ビーズに連結させ、そしてこれを用いてＫ４６細胞の溶解 物を探索した（先に記載の要領で）。そのビーズ上のそのペプチドによる結合を 受けた蛋白質を試料用緩衝液中で沸騰させることにより溶出させ、ＳＤＳ−ポリ アクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）に供し、ナイロン膜に転移させ、そして抗 −Ｆｙｎ抗体および抗−Ｌｙｎ抗体での免疫ブロットを実施した。図１６Ａはｐ ８５［８０−１０４］およびｐ８５［２９９−３１８］に対するＦｙｎの結合性 を示す。図１６Ｂはｐ８５［８０−１０４］およびｐ８５［２９９−３１８］に 対するＬｙｎの結合性を示す。ＬｙｎとＦｙｎとに対するｐ８５［８０−１０４ ］の結合性は検出が容易であった。ｐ８５［２９９−３１８］ペプチドは検出可 能な結合性活性を全く示さなかった。免疫反応性ＬｙｎもしくはＦｙｎはマウス Ｃｓｋ蛋白質の残基１〜１８を含む対照ペプチドには結合しなかった。従ってＰ Ｉ−３Ｋの残基８０ 〜１０４に広がる高プロリン領域はｐ８５へのＳｒｃ−ファミリーキナーゼＳＨ ３の結合を媒介するに十分な情報を含む。 ＬｙｎおよびＦｙｎのＳＨ３ドメインへのｐ８５［８０−１０４］の結合が直 接的相互作用であるかどうかを決定するために、切断されたＬｙｎ−およびＦｙ ｎ−ＧＳＴ融合蛋白質を発現する細菌の洗剤溶菌物をｐ８５［８０−１０４］お よびｐ８５［２９９−３１８］に連結させたビーズで探索した。ＧＳＴとのＬｙ ｎ［１−２７］、Ｌｙｎ［２７−１３１］、Ｌｙｎ［１３１−２４３］、および Ｆｙｎ［１−２７］融合物は、Ｌｙｎ［１−１３１］およびＦｙｎ［１−１４４ ］について既述されるものと類似の様式で調製した。ｐ５９fynおよびｐ５６lyn ペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を、以下のプライマー対を用いるＫ４６ｃ ＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた： 各プライマーは、ｐＧＥＸ−３Ｘ内への後続クローニングを容易にさせ る非反復の制限部位（下線を施してある、ＢａｍＨＩ：ＧＧＡＴＣＣ；ＥｃｏＲ Ｉ：ＧＡＡＴＴＣ；Ｓｍａ Ｉ：ＣＣＣＧＧＧ）をコードする。各々のＧＳＴ− 融合蛋白質を発現する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細 胞を２ｍｌの培養物から回収した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇ ＳＴ）融合蛋白質（Ｌｙｎ［１−２７］、Ｌｙｎ［２７−１３１］、Ｌｙｎ［１ ３１−２４３］、Ｆｙｎ［１−２７］、およびＦｙｎ［１−１４４］）を含む細 菌溶菌物をｐ８５［８０−１０４］で吸着させ（１０μｌの５０：５０スラリー ）、そしてｐ８５［２９９−３１８］ペプチドを製造業者により提供された説明 事項に従ってｍｌの活性化ビーズ当たり２ｍｇの比率でセファロース（Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ）４Ｂビーズに連結させた。吸着物を溶菌用緩衝液で完全に洗浄し、 同一緩衝液中に再懸濁させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）により分画化さ せた。蛋白質をクーマシーブルー染色により可視化させた。ｐ８５［８０−１０ ４］ペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルのクーマシー染色により決定したと ころ、ＳＨ３ドメインを含むＬｙｎおよびＦｙｎ融合蛋白質のみと結合した（Ｌ ｙｎ［２７−１３１］、Ｌｙｎ［１−１３３］、およびＦｙｎ［１−１４４］； 図１７Ｃ）。ｐ８５［２９９−３１８］ペプチドはｐ８５［８０−１０４］と同 一の蛋白質と結合した（図１７Ｄ）。グルタチオン−Ｓ−セファロース（Ｓｅｐ ｈａｒｏｓｅ）ビーズでの吸着を実施して、各細菌溶菌物が等量のＧＳＴ融合蛋 白質を含むことを確認した（図１７Ｂ）。グリシン−セファロース（Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ）ビーズでの対照吸着により、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビ ーズへの非特異的結合は生じなかったことが確認された（図１７Ａ）。これらの データにより、ＰＩ−３Ｋのｐ８ ５サブユニット内の高プロリン領域は、ＬｙｎおよびＦｙｎのＳＨ３ドメインと の選択的かつ直接的結合を介在することが可能であることが示される。実施例７ この実施例はＰＩ−３Ｋ活性におけるＳＨ３結合性の効果を示す。 ｐ８５サブユニットに対する抗体（１μｌの全抗血清、ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社）を清澄化させたＫ４６細胞（試料当たり １×１０7細胞）の溶解物に添加した。その後に免疫複合体を４０μｌの（５０ ：５０スラリー）プロティンＡビーズ（Ｐａｒｍａｃｉａ社）で沈殿させた。吸 着物を洗浄し、そして等量部に分割し、そしてこれを実施例６に記載される要領 で因子ＸａでのＧＳＴ−融合蛋白質の開裂により調製される様々な濃度のＬｙｎ ［２７−１３１］、Ｆｙｎ［１−１４４］、もしくはＢｌｋ［１−１０８］ペプ チドを含む溶解用緩衝液に添加した。４℃で一晩のインキュベーションの後、吸 着物をＰＡＮ緩衝液［１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ７、 および２ｍｇ／ｍｌのアプロチニン］中で完全に洗浄した。その後に５μｌの洗 浄化ビーズの５０：５０スラリーを、０．２ｍｇ／ｍｌの超音波処理化ホスファ チジルイノシトール（Ｓｉｇｉｎａ社もしくはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉ ｐｉｄｓ社）、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、５μＣｉの［γ−32Ｐ］ ＡＴＰ、および１０μＭＡＴＰを含む１０μｌ中、３０℃で１５分間インキュベ ートした。この反応を１００μｌの１Ｍ ＨＣｌの添加により停止させ、そのリ ン脂質を２００μｌのＣＨＣｌ3−メタノール（１：１）で抽出し、有機相を８ ０μｌのＨＣｌ−メタノール（１：１）で洗浄し、そして凍結乾燥させ た。その後にこのリン脂質を２×５μｌのＣＨＣｌ3−メタノール（１：１）中 に溶解し、１％のシュウ酸カリウムに予め浸してあるシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ）６０プレート（Ｓｉｇｍａ社）上にスポットし、そしてＣＨＣｌ3− メタノール−４Ｍ ＮＨ4ＯＨ（９：７：２）を含む緩衝液中の上昇薄層クロマ トグラフィーにより分離させた。リン脂質標準（Ｓｉｇｍａ社）を同一プレート 上での分離にかけた。放射ラベル化脂質はオートラジオグラフィーにより検出し 、そしてＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒスキャナーおよびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ソフトウエアー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）で定量化した。 結果が図１８に示される。ＬｙｎおよびＦｙｎの両方に由来するポリペプチド を含むＳＨ３は各々約７倍および５倍ＰＩ−３Ｋの活性を増加させる一方で、Ｐ Ｉ−３Ｋとは結合しないＢｌｋは全く効果を示さなかった。この活性化は約１０ μＭのペプチドの存在下では最大限度の半分であり、そして１００μＭ ｐ８５ ［８０−１０４］の添加により遮断された。対照実験ではＬｙｎおよびＦｙｎの Ｎ−末端の独特な領域の断片はＰＩ−３Ｋ活性を刺激しなかった。これらのデー タにより、ＬｙｎおよびＦｙｎのＳＨ３ドメインは直接的にＰＩ−３Ｋ活性を刺 激することが可能であることが示されるが、これは恐らくｐ８５サブユニット内 の高プロリン領域への結合によるものと思われる。この活性化はｐ８５のサブユ ニットのリン酸化およびｐ８５へのホスホチロシン−含有性ペプチドの結合性の 両方には無関係である。このデータにより、抗−ホスホチロシンに対する抗体で のｐ８５の沈降性の増加を誘導したと報告される抗原レセプター刺激は、ＰＩ− ３Ｋのリン酸化自体よりもむしろＰＩ−３Ｋとリン酸化されたｓｒｃ−ファミリ ーキナーゼおよび／またはＣ Ｄ１９との結合の増加を反映することがあることが示唆される。実施例８ この実施例は、Ｂ細胞抗原レセプターが媒介するＰＩ−３Ｋの活性化の際のＳ Ｈ３−ｐ８５［８０−１０４］の相互作用の重要性を記載する。ＰＩ−３Ｋは、 Ｂ細胞抗原レセプターに特異的な抗体で刺激していない、もしくは刺激した精製 された非活性化Ｂ細胞（非活性化マウスＢ細胞（ｐ＞１．０６２）はパーコール （Ｐｅｒｃｏｌｌ）密度勾配沈降法により単離された）から免疫沈降化させた。 その後に免疫沈降化させたＰＩ−３Ｋの活性を評定した。抗原レセプターの連結 により約７倍のＰＩ−３Ｋの活性の増加がもたらされ、この増加は１分目で最大 値に達した（図１９）。非活性化Ｂ細胞に透過性処理を施してｐ８５［８０−１ ０４］およびｐ８５［２９９−３１８］ペプチドが細胞内に侵入するのを可能に させ、そしてその後に抗原レセプターに特異的な抗体（抗−ＩｇＭおよび抗−Ｉ ｇＤ）を用いて１分間刺激化させた。細胞（試料あたり５×１０7細胞）に、マ イアー（Ｍｉｒｅ’ｓ）緩衝液［１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、２ｍＭ ＥＧＴＡ、お よび２０ｍＭ ＣａＣｌ2（３０ｎＭにまでＣａ+2で緩衝化させた）、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、および２８ ５μｇ／ｍｌ α−リソホスファチジルコリン、パルミトイル］単独でか、もし くは１．４ｍＭｐ８５［８０−１０４］およびｐ８５［２９９−３１８］を含む マイアー（Ｍｉｒｅ’ｓ）緩衝液中、氷上で１分間の透過性処理を施した。細胞 を３７℃で２分間暖めた後に、リン酸緩衝化食塩水単独（白抜き棒）、もしくは ５０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗−ＩｇＤ（ＪＡ１２）および抗−ＩｇＭ（ｂ −７−６）（黒塗り棒）を含むそのリン酸食塩水の存 在下、３７℃で５分間インキュベートした。その後に細胞を遠心分離により回収 し、緩衝液（０．５ｍｌ）を含む１％ ＮＰ−４０中で溶解し、そして氷上で３ ０分間インキュベートした。核を遠心分離（１４，０００ｇ、１５分間）により 除去した。各試料に５μｌ（５０：５０スラリー）のプロテインＡ−セファロー ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）およびｐ８５に対する４μ ｌの抗血清（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．社）を添加 し、そして４℃で一晩インキュベートした。吸着物を１％ ＮＰ−４０溶解用緩 衝液で５回洗浄し、次いでＰＡＮ緩衝液で２回洗浄した。その後に各沈降物の部 分（５μｌの５０：５０スラリー）を除去し、そしてＰＩ−３Ｋ酵素活性につい てのアッセイを実施した。 ｐ８５［８０−１０４］の存在下では、抗−ＩｇによるＰＩ−３Ｋ活性の刺激 化は完全に遮断された（図１９）。ｐ８５［２９９−３１８］ペプチドはＰＩ− ３Ｋ活性のレセプター媒介性活性化には検出可能な効果を全く示さなかった。Ｂ 細胞リンパ腫株 Ｋ４８μｍ１７を用いた際には本質的に同一な結果が取得され た。免疫ブロットにより、等量のｐ８５が各沈殿物中に存在することが確認され た。ホスホチロシンに対する抗体（Ａｂ−２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃ ｅ社）での二重ブロットの探索によってはｐ８５の検出可能なリン酸化は全く示 されなかった。このことにより、観察されたＰＩ−３Ｋ活性の増加およびその後 のＢＣＲ刺激化はｐ８５のチロシンリン酸化とは独立したものであることが示唆 される。抗−ＣＤ３刺激化により誘導されるＰＩ−３Ｋの活性化もやはりチロシ ンのリン酸化とは独立したものである。これらの所見により、ＰＩ−３Ｋの活性 化は直接的なＳｒｃ−ファミリーキナーゼのＳ Ｈ３ドメイン結合およびその後の抗原レセプターの連結を介して生じることが示 唆される。実施例９ この実施例は、ＳｈｃがＩｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフに結合す ることを示す。 Ａ． リン酸化されたＩｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１、ならびに非リン酸化 Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフに結合するＳｈｃ 完全な細胞質ドメインおよびＡＲＨ１モチーフペプチドを、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１９１１−１９１９、１９９４）に記載される 要領で細菌により発現されるＧＳＴ融合蛋白質からの開裂により取得した。幾つ かの事例ではペプチドを、インシュリンレセプターキナーゼ（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｋｉｎａｓｅ）のＢサブユニット（ＢＩＲＫ）（Ｈｅｒｒｅ ｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：５５６０−５５６８ 、１９８８、に記載される）の切断された組換え体形態を用いてリン酸化させた 。ＧＳＴペプチドをグルタチオンセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズに 吸着させ、それをキナーゼ用緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ［ｐＨ７．４］、５ ｍＭ ＭｎＣｌ2、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4）中で洗浄し、そし て０．５ｍＭ ＡＴＰ（トレーサーとしての１μＣｉ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ）およ び０．１単位のＢＩＲＫ（１単位は、ＰＬＣγ１を基にするペプチド ＲＲＮＰ ＧＦＹＶＥＡＮＰＭＰ内に１ｎモルリン酸／分を取り込ませるのに必要なキナー ゼの量として特定される）を含むキナーゼ用緩衝液（０．５ｍｌ）中でインキュ ベートした。この反応を３０℃で１２〜１６時間進行させた。その後にペプチド を因子Ｘ ａ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＧ ＳＴから開裂させ、そしてセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ社、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）に等モル量で直接連結さ せた。リン酸化の化学量論は典型的には２０〜２５％であった。別法では合成の リン酸化および非リン酸化合成ペプチドをＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅ ｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｃ．社（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）から購入した 。用いたＡＲＨ１ペプチドの配列は； であった。リン酸化チロシンは（ｐ）により示される。 Ｂリンパ腫 Ｋ４６Ｊ、Ｊ５５８Ｌμｍ３ 形質細胞腫、野生型ＮＩＨ−３Ｔ ３、およびＦｙｎ+ＮＩＨ−３Ｔ３繊維芽細胞株を、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン 、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および５％の非働化ウシ胎仔血清（Ｆ ＣＳ）を補足してあるＩＭＤＭ中で培養した。ＩｇＭ抗−Ｈ２ｋkを発現するＫ ４６Ｊを１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で増殖させた。ニトロフェニル（ＮＰ ）−特異的レセプターを発現するＪ５５８Ｌμｍ３を、１μｇ／ｍｌのミコ安息 香酸、１５μｇ／ｍｌのヒポキサンチン、２５０μｇ／ｍｌのキサンチンの存在 下で培養した。 刺激化細胞は以下の要領で調製した。Ｋ４６Ｊ細胞（５０×１０6／ｍｌ）を 抗−μ（ｂ−７−６）ｍＡｂ（５０μｇ／ｍｌ）で１時間、３ ７℃で刺激した。対数期のＪ５５８Ｌμｍ３ 形質細胞腫細胞（５０×１０6／ ｍｌ）をＮＰ12−ＢＳＡ（５０μｇ／ｍｌ）で３７℃下１分間刺激化させ、そし て即座に溶解した。刺激化および非刺激化のＫ４６ＪおよびＪ５５８Ｌμｍ３、 ならびにＮＩＨ−３Ｔ３細胞を１％ ＮＰ−４０溶解用緩衝液：１％ ＮＰ−４ ０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、各２μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプシン、α−１ アンチトリ プシン、１０ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、中で溶解し、そして氷上で１ ５分間インキュベートした。溶解物（０．５ｍｌ）をエッペンドルフ管中、×１ ４０００ｒｐｍで５分間遠心した。 Ｉｇ−α蛋白質を既述の清澄化溶解物から、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（５０％ ｖ／ｖで２０μｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社、Ｓｗｅｄｅｎ）に直接連結させてある抗−Ｉｇ−α抗体（１０μｇ）を用い て免疫沈降させた。この免疫沈降混合物を４℃で３０分間インキュベートした。 同時に免疫沈降させた蛋白質を最初に２０ｍＭ ｐ−ＮＰＰ（０．１ｍｌ）で３ ０分間、氷上で溶出させ、そしてその後にＩｇ−αをＬａｅｍｍｌｉ試料用緩衝 液で溶出させた。 吸収は更に、清澄化溶解物を：ペプチドを保持しないセファロース（Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ）ビーズ（Ｃｏｎ）、Ｉｇ−αもしくはＩｇ−βの全細胞質ドメイン （ＦＣＤ）、ＣＤ３−ε、ＴＣＲ−ζ、あるいは非リン酸化およびリン酸化（ｐ Ｉｇ−α）ＡＲＨ１モチーフペプチド、と共にインキュベートすることにより実 施した。細胞溶解物（０．５ｍｌ中の２０×１０6細胞）を４℃で２時間、グル タチオンセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（５０％ ｖ／ｖの２０μ ｌ）（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ社）に連結させたＧＳＴもしくはＧＳＴ／Ｇｒｂ２の全長融合蛋白質（ １０μｇ）か、あるいはＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビ ーズ（５０％ ｖ／ｖの２０μｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に直接連結させた 様々な合成ペプチドおよび細菌により発現されるペプチド（２０μｇ）を用いて 沈殿させた。吸収物を溶解用緩衝液で迅速に洗浄し、そしてＬａｅｍｍｌｉ試料 用緩衝液で溶出させた。ＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２融合蛋白質の沈降化は、非リン 酸化およびリン酸化されたＡＲＨ１ペプチド（１０μｇ）を連結させてあるセフ ァロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（５０％ ｖ／ｖの６μｌ）を用い、こ れをＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２ドメイン融合蛋白質を含む細菌溶菌物（０．５ｍｌ ）と共に４℃で１時間インキュベートして実施した。 この免疫沈降物および吸着物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画化した。分 画化した蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）上に転移 し、そして５％のウシ血清アルブミンを含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水を用いて２時 間遮断した。その後にこのブロットを以下の抗体と共にインキュベートした：モ ノクローナル抗−ホスホチロシン（Ａｂ２；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ 社）、抗−ｐ８５、ウサギ抗−ＳＨＣ（ＵＢＩ社）、およびウサギ抗−Ｉｇ−α 。抗−ＳＨＣおよび抗−Ｉｇ−α抗体を用いる免疫複合体形成は、アルカリ性ホ スファターゼ ヤギ抗−ウサギ−Ｉｇ（ＳＢＡ社）を用いて検出した。抗−ｐＴ ｙｒ抗体を用いる免疫複合体形成は、セイヨウカラシパーオキシダーゼヤギ抗− マウス−Ｉｇ（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＡ）を用いて検出した。 図２０に示される結果は、ｐ−ＮＰＰ溶出物を等量で分画化し、そして抗−Ｓ ＣＨでの免疫ブロットを行ったことを示している。図２１に示 される結果は、Ｓｈｃがチロシンリン酸化Ｉｇ−α細胞質ドメイン（Ｉｇ−αＦ ＣＤおよびｐＩｇ−αＦＣＤ）に、そしてＡＲＨ１モチーフ（Ｉｇ−αＡＲＨ１ およびｐＩｇ−αＡＲＨ１）に結合することを示す。Ｓｈｃはチロシンリン酸化 Ｉｇ−αおよびＩｇ−βに、そして非リン酸化Ｉｇ−αに結合した。結合は特異 的であることが見いだされ、それは非リン酸化Ｉｇ−β、ＣＤ３ε、およびＴＣ Ｒ−ζ ＡＲＨ１ペプチドへの結合が全く検出されなかったためである。それに 加え、ＰＩ−３Ｋのｐ８５サブユニットの非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１への結 合は検出されなかった。従ってこのデータにより、Ｓｈｃはリン酸化されたＩｇ −αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１ペプチドには結合するが、非リン酸化Ｉｇ−β、 ＣＤ３ε、およびＴＣＲ−ζ ＡＲＨ１ペプチドには結合しないことが示される 。 Ｓｈｃが非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドに結合する能力は、チロシン 残基がフェニルアラニン残基に置換されている突然変異化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペ プチドを用いてＳｈｃを吸着させ（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．、前述、に記載さ れる）、そして抗−Ｓｈｃ抗体での免疫ブロットを行うことにより確認した。こ れらの結果により、野生型ペプチドと比較する際に等量のＳｈｃが突然変異化ペ プチドと結合したことが示される。 Ｂ． ２つの個別のメカニズムによりＩｇ−α ＡＲＨ１モチーフに結合するＳ ｈｃ 細胞溶解物をセクションＡに記載される要領で調製した。吸着は、得られる清 澄化溶解物を用い、その溶解物をチロシンリン酸化（ｐ）および非リン酸化Ｉｇ −αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１ペプチドセファロース （Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズと共に、５０ｍＭ ｐ−ＮＮＰの非存在下（−） もしくは存在下（＋）でインキュベートすることにより、ＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ ２ドメイン融合蛋白質を含むＫ４６Ｊ細胞からの溶解物もしくは細菌溶菌物につ いて実施した。ＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２ドメインの融合物はグルタチオンセファ ロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ上で吸着させた（Ｇｌｕｔ）。この吸着化 蛋白質を溶出し、分画化し、そしてセクションＡに記載される要領で抗−ＳＨＣ （図２２ａ）もしくは抗−ホスホチロシン（抗−ｐＴｙｒ、図２２ｂ）抗体を用 いて免疫ブロットを行うか、あるいはクーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍ ａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）（図２２ｃ）で染色した。 図２２に示される結果は、非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドへのＳｈｃ 結合性はｐ−ＮＰＰによっては遮断されなかったことを示し（図２２ａ）、この ことによりホスホチロシンはその相互作用の際には独立していることが示される 。それとは逆に、ｐ−ＮＰＰはホスホ−Ｉｇ−β ＡＲＨ１ペプチドへのＳｈｃ の結合性を阻害した（図２２ａ）。図２２ｂを参照にすると、等量のＳｈｃが刺 激化および非刺激化細胞（右側パネル）の溶解物中のホスホ−Ｉｇ−α ＡＲＨ １ペプチドと結合することが見いだされたが、チロシンリン酸化Ｓｈｃと結合す るホスホ−Ｉｇ−α ＡＲＨ１は刺激化細胞の溶解物内にのみ検出された（左側 パネル）。従ってＳｈｃチロシンリン酸化はホスホ−Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチ ドに結合する能力については検出可能な影響を全く有さない。図２２ｃを参照に すると、チロシンリン酸化Ｉｇ−αおよびＩｇ−βは両者ともｐ−ＮＰＰ感受性 様式でＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２に結合したが、それらはＧＳＴ単独では結合しな かった。ＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２を含 むレーンにおいて追加的クーマシーブルー（Ｃｏｏｍｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色 化バンドが存在しないことにより、この結合が直接的なものであることが示され る。 Ｃ． ＡＲＨ１モチーフ内のアミノ酸配列ＤＣＳＭにより指令され、かつＡＲＨ １モチーフチロシンリン酸化およびｓｒｃ−ファミリーキナーゼの結合を必要と はしない非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフとのＳｈｃの結合 Ｉｇ−αのＤＣＳＭがＩｇ−βのＱＴＡＴで置換されており、そしてその逆も 生じているＩｇ−αとＩｇ−βとのスイッチ突然変異体は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．、前述、に開示される方法を用いて調製した。それに加え、アミノ酸配列 ＡＣＳＭ、ＤＡＳＭ、ＤＣＡＭ、およびＤＣＳＡを含む突然変異体を、Ｃｌａｒ ｋ ｅｔ ａｌ．、前述、に開示される方法に従って作製した。この結果により 、４つのアミノ酸配列ＤＣＳＭがＳｈｃに対する非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ ペプチド結合についての特異性を付与することが示された。それに加え、ＤＣＳ Ｍ配列への単一アミノ酸配列改変はＳｈｃへのそのペプチドの結合性を破壊する ことがなかった。従って、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフ内のＤＣＳＭ配列はＳｈ ｃに結合する。 まとめると、これまでのデータにより、ＳｈｃはＤＣＳＭ配列を介してＩｇ− α ＡＲＨ１モチーフと結合することが示される。このデータは更に、Ｉｇ−α およびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフのリン酸化状態がそのペプチドに結合するＳ ｈｃの能力に影響を及ぼしうることを示す。実施例１０ この実施例は、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼ、ｓｙｋ−ファ ミリーのチロシンキナーゼ、アダプター分子、および脂質キナーゼの特異的ＩＴ ＡＭ結合を示す。 Ａ． 透過性処理を施したＢ細胞内でのチロシンリン酸化を誘導する二リン酸化 ＩＴＡＭ モチーフのチロシンがフェニルアラニンに変化させててある非リン酸化ＩＴＡ Ｍもしくは二リン酸化ＩＴＡＭに対応する合成ペプチドを、ＨＢＴＵ活性エステ ル（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ社、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）でのｆ−ｍｏｃ化学法を用いて作製した 。野生型ＩＴＡＭに対応するペプチド配列は： 、である。リン酸化ペプチドを構築するために、ホスホチロシン（Ｎｏｖａ Ｂ ｉｏｃｈｅｍ社）を各位置でチロシンに置換した。ペプチドを９０分間の、９０ ％ ＴＦＡ、２．５％ アミノール（ａｍｉｎｏｌ）、および２．５％ エタン ジチオール中でのインキュベーションにより脱保護化し、Ｃ１８カラム上での高 速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、そして質量分析法により 分析して予想質量を確認した。必要に応じてペプチドを、充填化ビーズのミリリ ットル当たりに２ｍｇのペプチドで、製造業者の指示事項に従って臭化シアン活 性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に連 結させた。連結させたゲル溶出液のＨＰＬＣ分析に基づくと連結化効率は全事例 において＞９０％であった。 ５％ ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、ストレプトマイシン、ペニシリン 、２−メルカプトエタノール、およびＬ−グルタミンを補足してあるイスコフ（ Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）の改変化ダルベッコー（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）培地（ＩＭ ＤＭ）中、３７℃下、７．５％ＣＯ2中で継代したＪ５５８Ｌμｍ３細胞を遠心 分離により回収し、補足成分なしのＩＭＤＭ培地中で洗浄し、そしてＣａｍｐｂ ｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８８：３９８２−３９８６、１９９１）により以前に記載される要領での透過性 処理を施した。簡潔に記載すると、細胞（試料当たり２×１０7細胞）を、５０ ０μｌのマイアー（Ｍｉｒｅ’ｓ）緩衝液（１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＯＡｃ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、および２９６μＭ ＣａＣｌ2［Ｃａ+2を３０ ｎＭに緩衝化させてある］、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、４０ｍＭ Ｈ ＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、および２８５μ／ｍｌ α−リソホスファチジルコリ ン、パルミトイル）（単独もしくは様々な濃度のＩＴＡＭペプチド（１μＭ〜１ ｍＭ）を含む）中、３７℃で５分間インキュベートした。その後に細胞を遠心分 離により回収し、１％ ＮＰ−４０溶解用緩衝液（０．５ｍｌ）中で溶解し、そ して遠心分離（１２，０００×ｇで１０分間）により核を除去した。 増加濃度の二リン酸化ｐＩＴＡＭペプチドおよび非リン酸化ＩＴＡＭを透過性 処理を施した細胞に添加した。その濃度液には、０、１μＭ、１０μＭ、１００ μＭ、および１ｍＭのペプチドが含まれる。細胞をそのペプチドと共に様々な時 間（０、１５秒、３０秒、４５秒、１分、２分、および５分を含む）インキュベ ートした。蛋白質チロシンリン酸化の誘導を免疫ブロットにより、実施例９に記 載される方法を用いて分析 した。 これらの結果により、全てのｐＩＴＡＭは透過性処理を施したＪ５５８Ｌμｍ ３細胞内の蛋白質チロシンリン酸化を誘導することが可能であることが示された 。誘導化は溶解させた細胞では観察されなかった。測定可能な誘導性リン酸化は １００μＭもしくはそれを上回る濃度のｐＩＴＡＭで観察され、かつ１５秒目に 観察可能となった。非リン酸化ＩＴＡＭは全細胞性蛋白質チロシンリン酸化に検 出可能な影響を及ぼすことがなかった。まとめると、これらの結果により、リン 酸化された全てのＩＴＡＭは細胞性蛋白質チロシンリン酸化を開始することが可 能である一方で、非リン酸化ペプチドはそうではないことが示される。 Ｂ． 透過性処理を施したＢ細胞中でＬｙｎを活性化するがＳｙｋは活性化しな い二リン酸化ＩＴＡＭ 透過性処理を施したＪ５５８Ｌμｍ３細胞をセクションＡに記載される方法を 用いて調製した。その後にそのような細胞を、１ｍＭのＣＤε ｐＩＴＡＭペプ チドで５分間刺激化させた。刺激化細胞の溶解物は遠心分離により細胞を回収し 、それらを補足物を含まないＩＭＤＭ培地中で洗浄し、そしてそれらを溶解用緩 衝液（１％ ＮＰ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７ ．５］、２ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチル スルホニル（ＰＭＳＦ）、０．４ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＦ、ならびに 各１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン、およびα−１ アンチトリプシ ン）中に再懸濁させた。この溶解物を氷上で１０分間インキュベートし、そして １２，０００×ｇで１０分間の遠心分離により粒子状核／細胞骨格構成成分を除 去した。 その後にＬｙｎおよびＳｋｙ蛋白質を、２×１０7細胞からの溶解物を５０μ ｇの抗−Ｌｙｎ抗体もしくは５０μｇの抗−Ｓｋｙ抗体と共に０℃下で１時間イ ンキュベートして免疫複合体を形成させ、そしてその後にその溶解物を、５μｌ の抗血清で予備吸着させた５μｌのプロテインＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏ ｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）と共に４℃下で２時間、反転による定常的な混 合を行いながらインキュベートすることによりその免疫複合体を回収した。その 後に吸着物を１ｍｌの氷冷溶解物緩衝液で３度洗浄し、そして５０μｌの還元的 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液中に再懸濁させることにより溶出した。試料を５ 分間沸騰させ、その後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８もしくは１０％ゲル）にかけた。 その後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、製造業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）により推 奨される条件に従い半乾燥式ブロット装置を用いてＰＶＤＦ膜に転移させた。 電気泳動的に転移させた蛋白質を含む膜を、５％の無脂肪乾燥乳もしくは無リ ン酸塩ウシ血清アルブミンのいずれかを含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ）を 用いて４℃で一晩遮断させ、そしてその後に最初にマウスＩｇＧ1モノクローナ ル α−ホスホチロシン（１：１０００；ＡＢ２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅ ｎｃｅ社）抗体での探索を行った。その後に膜をＴＢＳもしくは０．０５％ Ｔ ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＴＢＳで交互に数回洗浄し、セイヨウカラシパー オキシダーゼに複合体形成させた希釈化プロテインＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）も しくはラット抗−マウスＩｇＧ1（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ｓ社）と共にインキュベートし、そして再度洗浄した。免疫反応性蛋白質を強化 ケミルミネセンス（ＥＣＬ）検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）によ り可視化させた。その後に膜を、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２％ ＳＤＳ、および６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．７）を含む緩衝液中、５６ ℃下で３０分間かけてはぎとり、その後にα−Ｌｙｎ（１：５００）もしくはα −Ｓｋｙ（１：５００）抗体での再探索を行った。 これらの結果は、ＬｙｎおよびＳｋｙ免疫沈降物の抗−ホスホチロシン免疫ブ ロットによりＬｙｎの誘導性リン酸化は示されるがＳｋｙについてはそうではな いことを示している。抗−Ｌｙｎおよび抗−Ｓｋｙ抗体を用いる後続の免疫ブロ ットにより、抗−ホスホチロシンブロット化試料中に存在するＬｙｎもしくはＳ ｋｙの量が等価であることが示された。 免疫沈降化させたＬｙｎもしくはＳｋｙのキナーゼ活性をその後に、以下のキ ナーゼアッセイを用いて検査した。免疫沈降化させたＬｙｎおよびＳｋｙをイン ビトロキナーゼ緩衝液（１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ［ｐＨ７ ．０］、２ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、および１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で ２度洗浄し、そしてＬｃｋキナーゼ自己リン酸化部位 ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡ ＲＧの一部分に相当する２ｍＭの外因性基質、１０μＭ ＡＴＰ、および１０μ Ｃｉの［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ−Ｄｕｐ ｏｎｔ社）を含む２５μｌのキナーゼ用緩衝液中に再懸濁させ、そして３０℃で １０分間インキュベートした。別法では５μｌのＳＦ９−Ｌｙｎ溶解物を、親和 性精製したＬｙｎの代わりに用いた。必要に応じてＳｆ９−Ｌｙｎ溶解物をＩＴ ＡＭペプチド（濃度は１μＭ〜１ｍＭに変化する）と共に４℃で１時間予備イン キュベートし、その後に基質／ＡＴＰを含む反応 ミックスの添加を行った。各反応をトリクロロ酢酸（５％の最終濃度）でクエン チングさせ、そしてＷｈａｔｍａｎ ｐ８１ホスホセルロース上にブロットした 。ブロットを過剰量の７５ｍＭのリン酸で４回洗浄し、アセトンで脱水し、そし て液体シンチレーション分光測光法により定量化した。Ｓｆ９−Ｌｙｎ Ｋmお よびＶmaxの決定は、基質濃度（その反応ミックス内に存在する）が１００μＭ 〜１０ｍＭに変化することを必要とする。 これらの結果により、免疫沈降化させたＬｙｎの酵素活性は、ＣＤ３ε ｐＩ ＴＡＭペプチドで刺激化させた浸透性処理を施した細胞内では３倍上昇した一方 で、非リン酸化ＣＤ３ε ＩＴＡＭペプチドは何の効果も有さなかったことが示 される。浸透性処理単独では、非活性化Ｊ５５８Ｌμｍ３細胞溶解物から免疫沈 降させたＬｙｎと比較した場合にＬｙｎの活性には検出可能な効果は全く示され なかった。Ｓｙｋ活性化はＣＤ３ε ＩＴＡＭペプチドの存在下では検出されな かった。この結果により、ｐＩＴＡＭはｓｒｃ−ファミリーのキナーゼを刺激化 しうることが示される。 Ｃ． 二リン酸化ＩＴＡＭによるＬｙｎの直接的活性化 ｐＩＴＡＭを、ｐＩＴＡＭペプチドをバキュロウイルスＳＦ９細胞により発現 されるＬｙｎ蛋白質に添加することにより、ｓｒｃ−ファミリーのキナーゼ活性 を直接調節する能力について検査した。マウスｐ５６lynの全コーディング領域 に広がるＤＮＡを、以下のプライマーを用いるＫ４６ ｃＤＮＡからのポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた： 第一鎖ｃＤＮＡの産生およびＰＣＲ反応は既述の要領で実施した（Ｐｌｅｉｍａ ｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ４２６８−４２７２、１９９４）。その後にこのＰＣＲ産物をＢａｍ ＨＩおよ びＮｏｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで開裂し、ｐＳＫ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）内にクローン化させ、そし てＤＮＡ配列分析により配列を確認した。その後にＬｙｎをコードするＢａｍ ＨＩ／Ｎｏｔ Ｉ断片をバキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＧＰ６７Ｂ（Ｐｈ ａｒｍｉｎｇｅｎ社）内にサブクローン化させた。この構築物を、製造業者の説 明事項（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）に従ってＢａｃｕｌｏｇｏｌｄトランスフェ クションキットを用いてＳｆ９細胞内にトランスフェクトさせた。細胞をＳｆ９ ００ ＩＩ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で維持し、そしてウイルスを製造業者 のプロトコール（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）に従って継代した。Ｌｙｎ蛋白質（ Ｓｆ９−Ｌｙｎ）を作製するためには６×１０6のＳｆ９細胞を５の感染多重度 での組換えウイルスで感染させた。感染化Ｓｆ９細胞を７２時間増殖させ、その 後に１％ ＮＰ−４０溶解用緩衝液中で溶解させた。 Ｌｙｎ（１×１０6細胞／ｍｌの全細胞溶解物の５μｌ）をｐＩＴＡＭと共に 予備インキュベートし、そしてＬｙｎがＬｃｋの自己リン酸化部位 ＲＲＬＩＥ ＤＡＥＹＡＡＲＧをリン酸化する能力を、先のセクションＢに記載されるキナー ゼを用いてアッセイした。これらの結果により、Ｉｇ−α ｐＩＴＡＭによるＬ ｙｎの活性化は用量依存的かつ可飽和性の両方であった一方で、非リン酸化Ｉｇ −αの飽和用量はＬｙｎ活性に殆ど影響を及ぼすことがなかったことが示される 。６．７μＭ Ｉｇ− α ｐＩＴＡＭを用いると有意な活性化が観察された。ＬｙｎのＶmaxは０．０ ７４２ｐモル／分／μｌ（溶解物）から０．１３７ｐモル／分／μｌ（溶解物） への２倍の増加を示した一方で、Ｋmは無変化のままに留まった。 その後にｐＩＴＡＭ Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲ Ｉγ、およびＦｃεＲＩβを、各３００μＭのペプチドを用いて検査した。ｐＩ ＴＡＭがＬｙｎを活性化する能力は様々であった。各々の非リン酸化相対物と比 較すると、Ｉｇ−α ｐＩＴＡＭはＬｙｎ活性を５．１倍増加させ、ＦｃεＲＩ β ｐＩＴＡＭはＬｙｎ活性を３．９倍増加させ、Ｉｇ−β ｐＩＴＡＭはＬｙ ｎ活性を３．４倍増加させ、そしてＦｃεＲＩγ ｐＩＴＡＭはＬｙｎ活性を３ ．１倍増加させた。 Ｄ． 特異的エフェクター結合性活性を示すニリン酸化ＩＴＡＭ 様々なｐＩＴＡＭのＰＩ−３Ｋ ｐ８５サブユニット、Ｓｋｙ、Ｌｙｎ、およ びＳｈｃへの結合特異性を、２ｍｇ（ペプチド）／ｍｌ （ｐＩＴＡＭペプチド 連結化ビーズ）を２×１０7のＫ４６ Ｂリンパ腫細胞から調製されたＮＰ−４ ０溶解物をセクションＡに記載される要領でインキュベートすることにより検査 した。溶解用緩衝液中で徹底的に洗浄した後にｐＩＴＡＭ結合性蛋白質を還元的 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液を用いてそのビーズから溶出させ、電気泳動によ り分画化させ、ＰＶＤＦ膜に転移させ、そして全ウサギ抗血清 α−Ｌｙｎ（１ ：５００）、α−Ｓｙｋ（１：５００）、およびα−ＰＩ−３Ｋ（ｐ８５サブユ ニット、１：１０００、ＵＢＩ社）を用いて免疫ブロットを行い、そしてウサギ 抗血清 α−Ｓｈｃ（１：５００、ＵＢＩ社）抗体を親和性精製した。 図２３に示される結果により、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、およびＦｃＥＲ１β ｐ ＩＴＡＭは優先的にＬｙｎに結合する一方で、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、およびＦ ｃεＲＩγは優先的にＳｙｋに結合することが示される。ｐＩＴＡＭ−Ｓｈｃ結 合性パターンはＬｙｎのものに類似していた一方で、ＰＩ−３ＫはＦｃ６ＲＩγ およびＩｇ−α ｐＩＴＡＭの両方に強い結合性を示した。この比較分析により 、様々なｐＩＴＡＭ配列とエフェクター分子間の相互作用の特異性が示される。 本発明の様々な態様が詳細に記載されていると同時に、これらの態様の改変物 および適用法が当業者に思い浮かぶであろうことは明白である。しかしながらそ のような改変物および適用法は、以下の請求の範囲に記載される本発明の範囲内 に含まれることが特に理解されるべきである。Detailed Description of the Invention           Products and methods for modulating signal transduction pathways   All parts of the present invention are the National Institutes. USPHS Gr given by of Health (National Institutes of Health) ants AI21768, AI20519, AI29903, and DK47 It was made with the support of the US government by 121. The US Government has certain rights in this invention.                           Cross-reference of related applications   This application is filed on March 17, 1994, in "Product and P process for Regulating Signal Transu US Pat. No. 08 / 215,116 for "action Pathways" , Which is a continuation-in-part application of this patent, which is incorporated herein by reference in its entirety. You.                               Field of the invention   The present invention determines the activity of tyrosine kinases, lipid kinases, and adapter molecules. Modulate intracellular signal transduction pathways using regulatable peptides Products and methods for                               BACKGROUND OF THE INVENTION   In all multicellular organisms, cell-to-cell communication is contained within the organism. It is coordinated with the proliferation, differentiation, and metabolism of many types of cells involved. Long distance Communication between cells spans extracellular products that act as signaling molecules ( Ligand). Signal molecule Move through the organism to specific cells, and within that cell the signal Target cells with receptors capable of binding their signal molecules Induces a specific response only to. The binding of the signal molecule to the receptor is the receptor Molecules that initiate complex intracellular reactions within cells that retain Or to alter the pattern of gene expression, This results in a change in the biological function of the cell. This process is sig This is called null conversion.   Understand and discover methods for regulating signal transduction networks within cells Despite the long-standing need to do so, such networks Regulates signal transduction networks involved in disease due to its complexity Development of products and methods for doing so has been hampered. A protein binds to a target molecule By doing so, various physiological phenomena can be brought about. Protein is the standard Molecules, eg: allosteric changes of the target molecule; phosphates of the target molecule Can be modified by transfer of its target molecule to other regions of the cell It is. It was discovered through an unexpected discovery that the binding between the protein and the target molecule is For example, it may be the cause of activation of the target molecule or the cause of inhibitory activity. Because any particular stage in the signal transduction network can It becomes difficult to predict whether it is the ultimate cause of biological function ing.   How a particular cellular pathway works and which molecule and / or such Causes molecular functional factors to initiate and / or regulate such cellular pathways The need to elucidate ing. In particular, it enables effective regulation of specific steps in the signal transduction network. There is a need for different products and methods. Characteristics of signal conversion network Modulation of aberrant steps allows predictable regulation of intracellular signal transduction This leads to various abnormalities caused by abnormalities in cell signal transduction pathways. The disease can be treated.                               SUMMARY OF THE INVENTION   The present invention relates generally to the regulation of signal transduction pathways, and more specifically It concerns two specific parts of the cell's conversion pathway. Between specific molecules in the signal transduction pathway Of previously unrecognized and unnoticed interactions of Are cells (eg, B cells, T cells, macrophages, dendritic cells, and pluripotent cells). Elucidated products and methods that allow regulation of sex stem cells). Moreover, according to the invention , Allergic response, autoimmune disease, inflammatory response, cancer, immunodeficiency disease, immunity Proliferative diseases and viral diseases (this includes Epstein-Barr (Ep Stein-Barr) virus (EBV) infection (eg, chronic fatigue syndrome Infectious mononucleosis or bovine leukemia virus (BLV) infection (eg B Transformation of lymphocytes), but is not limited to). It allows the regulation and treatment of various medical disorders.   One embodiment of the invention includes a method of modulating signal transduction, the method comprising , A peptide having an amino acid motif of YXXLXXXXXXXXXXYXXΨ Or contacting with an effective amount of the compound containing the mimetope. The present invention Furthermore, therapeutic compositions containing such compounds, as well as tyrosine kinases and chitins. Such compounds are used in combination with methods for measuring the activity of rosin kinase. Kit to be used.   Another aspect of the invention includes a method for modulating signal transduction, the cell comprising: Binds to the SH3 domain of tyrosine kinases, thereby Peptide capable of blocking the binding of effector to Contacting with an effective amount of a compound containing The present invention further provides such a compound. Therapeutic composition containing a substance, and tyrosine kinase and activity of tyrosine kinase Also included are kits that include means for determining sex with such compounds.   Other features and aspects of the present invention will be considered in view of the drawings and detailed description provided below. It will be apparent to those skilled in the art after consideration.                             Brief description of the drawings   FIG. 1 is a schematic diagram of a signal transduction pathway of cells.   FIG. 2 is a schematic representation of intracellular reactions before and after receptor binding.   FIG. 3 is a diagram of Ig-α and Ig-β ARH1 motif switch mutants. It is a surface display.   FIG. 4 shows protein binding to wild type or Ig-α / Ig-β switch mutants. Represents a match.   FIG. 5 represents protein binding to the ARH1 peptide.   FIG. 6 shows the binding activity of point mutants of the Ig-α ARH1 motif.   FIG. 7 shows that wild type and three tyrosine were converted to phenylalanine. FIG. 7 shows protein binding to Ig-α ARH1 fusion protein.   FIG. 8 shows Fyn protein into wild type and Ig-α tyrosine mutated fusion proteins. Represents a combination of qualities.   FIG. 9: Fyn binding to tyrosine phosphorylation of Ig-α ARH1 motif Explain the sex.   FIG. 10: Proteins to unphosphorylated and phosphorylated Ig-α ARH1 peptides Represents a bond.   FIG. 11: Binding of Fyn to phosphorylation of Ig-α and Ig-β peptides Represents sex.   FIG. 12 depicts Fyn binding to doubly phosphorylated Ig-α and Ig-β. You.   FIG. 13 shows the activity of Fyn protein upon binding with phosphorylated Ig-α protein. Explain the sex.   FIG. 14 illustrates specific activity of Fyn protein bound to phosphorylated Ig-α peptide. I do.   Figure 15: Phosphorylation of two high proline regions by the Lyn and Fyn proteins. Represents the stimulation of.   FIG. 16 shows the binding properties of Fyn and Lyn proteins to p85 peptide.   FIG. 17 shows the binding properties of SH3 domain fusion protein to p85 peptide.   FIG. 18 illustrates stimulation of PI-3K activity by SH3 domain fusion protein. I do.   FIG. 19 illustrates stimulation of PI-3K activity by p85 peptide.   FIG. 20 shows immunoprecipitation of Shc protein using Ig-α ARH1 motif. explain.   FIG. 21 shows the use of various phosphorylated and non-phosphorylated ARH1 motifs. The immunoprecipitation method of the Shc protein will be described.   FIG. 22 shows phosphorylated Ig-α and Ig-β ARH1 motifs and non-ligands. Immunization of Shc proteins with phosphorylated Ig-α and Ig-β ARH1 motifs The sedimentation method will be described.   FIG. 23 shows PI-3K, Syk, to various doubly phosphorylated ITAM peptides. The differential binding of Lyn and Shc proteins is explained.                               Detailed description   The present invention provides novel products and methods for modulating intracellular signal transduction pathways. About. As used herein, "signal transduction" refers to the outer ring of a cell. A boundary allows the cell to modify its biological function within the cell. Means a chemical reaction. The present invention can regulate intracellular signal transduction pathways Including two novel compounds. The first novel compound of the present invention issrc-Fami Lee's tyrosine kinase,syk-Family kinases, Shc molecules, and And / or a peptide capable of modulating the activity of PI-3K, such as Peptides have the amino acid motif YXXLXXXXXXXXXXYXXΨ [this motif , X can be any amino acid, and Ψ is leucine. Or isoleucine], or mimet thereof. Containing the amino acid sequence represented by the group. The second novel compound of the present invention is Phosphopeptide (high Pro peptide) or its mimetope, which is Binds to the SH3 domain of synkinase and thereby its kinase It is possible to inhibit the binding of the enzyme to the effector. According to the present invention, It will be specified in the detailed book Any amino acid sequence containing such a peptide or The nucleic acid sequences to be included include mimetopes of such sequences.   The present invention specifically enhances by regulating various stages of signal transduction in cells. Providing novel compounds for regulating diverse cell functions and intracellular sig Provide a method for identifying additional compounds capable of modulating null conversion It is particularly advantageous in that it   Signal transduction pathways are defined in order to allow cells to adapt to their environment. Used by the cell. Signal transduction pathway is a signal received from the outside of the cell Are translocated across the prototypical membrane of the cell and into the nucleus through the cytoplasm of the cell. This Signals that are transmitted in this manner also typically cause changes in gene expression in cells. Be beaten Multiple cellular factors are responsible for regulating intracellular signal transduction There can be. Such factors include initiator molecules and transducer components. Include offspring, amplification factor molecules, early targeting molecules, and second messenger molecules. As used herein, "molecule" can mean a protein or lipid. Noh. A schematic of the proposed signaling pathway is shown in Figure 1.   Initiator molecules are able to initiate signal transduction in cells. An example of an initiator molecule is a transdeter that contains a membrane-bound receptor on the cell surface. It is an extracellular ligand capable of binding to a mouse molecule. Used herein "Ligand", when charged, donates an electron when one molecule binds to a second molecule Means a molecule. Extracellular ligands include, for example, hormones, growth factors, antigens, other Can include differentiation agents, and other cell type-specific mitogens It is. After binding to the initiator molecule, the transducer molecule Prototype membrane Transduces a signal to an intracellular amplification factor molecule. Transducer molecule Is a cytoplasmic region capable of interacting with intracellular proteins involved in signal transduction. It can include any surface receptor having a region. Transducer The molecule may contain a kinase domain or may bind to an intracellular kinase. Noh. Examples of transducer molecules include, for example, tyrosine kinase receptors. , Alpha and beta adrenergic nerve agents, G-protein coupled receptors Pter, as well as other receptors involved in the immune response.   Receptors may contain multiple proteins, referred to as subunits , One of the receptors is called the multi-subunit receptor, An example of is a multi-subunit immunorecognition receptor (MIRR). MIRR is non Comprising a receptor having a plurality of covalently bound subunits, andsr c -Can interact with family tyrosine kinases. MIRR is B cell antigen receptor, T cell antigen receptor, Fc receptor, and CD2 It can include, but is not limited to. One example of MIRR is It is an antigen receptor on the surface of B cells. MIRR on the surface of B cells is Membrane-bound immunoglobulin that binds to Ig-α and Ig-β or Ig-γ (MIg), whose subunits are bound to B upon binding by the antigen. It forms a complex capable of regulating cell function. Antigen receptor is an amplification factor The child molecule functions as an amplification factor molecule in a manner that allows it to regulate gene transcription. Can be combined.   Transducer molecules interact with amplification factor molecules and receive them at the cell surface The transmission of the signal to the protoplasm of the cell. And it is possible. Amplifier molecules typically undergo intracellular physiological changes that cause To modify early target molecules in a manner that results in altered gene transcription A possible enzyme. The amplification factor molecule may be an early target molecule, for example: Losteric changes; phosphorylation of early target molecules; or other cells of early target molecules Can be modified by transfer to the region. If the initial target molecule is the target molecule However, it is not limited thereto. This specification "Target molecule" when used in the text refers to phosphorylation by a specific enzyme. A molecule that is modified. As used herein, an "effector" is a specific It is a molecule that is modified by an allosteric change by the enzyme. For signal conversion Examples of amplification factor molecules involved include kinase receptors and non-receptor kiners. Ze (egsrc-Family kinases orsyk− Family Kinners ZE), but is not limited thereto.   src-Family tyrosine kinases phosphorylate tyrosine residues on target molecules It is an enzyme that can. Typicallysrc-Family tyrosine kiners Zes contains one or more binding domains and a kinase domain.src -Binding domains of family tyrosine kinases can bind to target molecules Possible and the kinase domain phosphorylates target molecules that bind to the kinase It is possible tosrc-A member of the family tyrosine kinase is N- It is characterized by a unique region at the end and three regions following it. The region shows varying degrees of homology among all members of the family. Those three Area ofsrcHomology region 1 (SH1),srcHomology region 2 (SH2), and AndsrcIt is referred to as the region of homology 3 (SH3). SH2 and Both SH3 and SH3 domains bind proteins that are important for the formation of signal transduction complexes. It is considered to have a combined function. The amino acid sequence of the unique region at the N-terminus iss rc -Varies among family tyrosine kinases. The unique region at the N-terminus iss rc -At least the first 40 amino acids of the N-termini of family tyrosine kinases It can be a mino acid residue.   syk-Family kinases can phosphorylate tyrosine residues on target molecules It is an enzyme that can. Typicallysyk-One or more family kinases And a kinase domain.syk-Family The binding domain of the nase is capable of binding the target molecule and Zedomain is capable of phosphorylating target molecules that bind its kinase .sykMembers of the family tyrosine kinases for protein binding function Are characterized by two SH2 domains and one tyrosine kinase domain.   The initial target molecule transduces a signal by modifying the second messenger molecule It is possible to further expand the route. The initial target molecule is phosphatidylino Citol 3-kinase (PI-3K), P21rasGAPase-activating protein Quality, as well as bound P190 and P62 proteins, phospholipases (eg PL Cγ1 and PLCγ2), MAP kinase, Shc, and VAV are included. However, it is not limited thereto. Early target molecules produce second messenger molecules Which can be diacylglycerol and 1,4,5-triphosphorus. Inositol acid (InsP3) and others (but not limited to these) ) It is possible to extend the molecule. The second messenger molecule is responsible for gene transcription. Can initiate a physiological phenomenon that can result in changes in And it is possible. For example, the production of InP3 causes intracellular calcium release. The calmodulin kinase. II activation can be brought about, after whichet s -1 Serine phosphorylation of DNA-binding protein quoted as protooncoprotein Can be done. Diacylglycerol is a signal transduction protein It is possible to activate protein kinase C, which leads to AP1 The activity of the DNA-binding protein complex is affected. The signal transduction pathway is, for example,c −fos,egr−1,andc−mycAlso activates transcription of genes such as It is possible to bring it down.   According to the invention Shc is an adapter molecule. Two other adapter molecules Which allows the proteins of the above to form a complex (for example, a three-molecule complex) including. The Shc protein allows complex formation involving Grb2 and SOS. Shc contains an SH2 domain capable of binding to the SH2 domain of Grb2. No.   Molecules in the signal transduction pathway can bind to each other using recognition sequences . According to the invention, the recognition sequence allows specific binding between two molecules. Recognition The rows can vary depending on the structure of the molecules bound to each other. is there A molecule can have one or more recognition sequences, and itself Can bind to one or more different molecules.   Signal transduction pathways can regulate the biological function of cells. That's it Such functions include the ability of cells to proliferate, differentiate, and secrete cellular products. Included, but not limited to. Signal conversion The tract is the biological function of a specific type of cell involved in a particular response by the animal (eg, Immune response, inflammatory response, and allergic response) You. Cells involved in the immune response include, for example, B cells, T cells, macrophages, dendritic cells. It can include cells, natural killer cells, and plasma cells. flame Cells involved in the inflammatory response include, for example, basophils, mast cells, eosinophils, neutrophils, and And macrophages. Examples of cells involved in allergic response Including mast cells, basophils, B cells, T cells, and macrophages Is possible. In addition, such a response by animals is associated with pluripotent stem cell This pluripotent stem cell can be regulated by Can develop into mature cells that are involved in the response of the animal and other functions of the animal . Abnormal biological functions of cells can lead to disease. Such a different Regulation of signal transduction pathways to correct homeostasis may itself be effective in treating disease You. In addition, various medical procedures (eg organ and skin transplantation) are notable. It requires regulation of the biological function of different types of cells. In such cells The signal transduction function itself may be useful for special medical procedures.   That binding between proteins and target molecules can lead to various biological phenomena Are known to those skilled in the art. For example, the binding between the protein and the target molecule can Changes in the conformation of the target molecule, so that the target molecule is Quality, or otherwise the target molecule is Prevents type binding from occurring, thereby involving such molecules It is possible to change the regulation of the system. In another embodiment, the protein and target molecule Due to the coupling between Other proteins capable of causing transfer of the target molecule and binding to the target molecule It allows the target molecule to move into the vicinity of the quality. In yet another embodiment Binds between a protein and a target molecule to activate or stimulate the activity of that target molecule. Can result in modification or modification of its target molecule in a manner that is inhibited It is. The activity of the target molecule should include, for example, an enzymatic activity or a binding activity. Is possible. The binding between the protein and the target molecule is on the protein and on the target. It is also known to those skilled in the art that it may be possible to rely on specific recognition sequences on the molecule. ing. According to the present invention, a recognition sequence is a protein that binds a protein to a target molecule in a specific manner. It is an array that makes it possible to combine. A single protein is contained within the sequence of that protein. It is possible to bind different target molecules using various recognition sequences. In contrast, a single target molecule contains various recognition sequences contained within the sequence of the target molecule. Rows can be used to undergo binding by various proteins. Protein and target The complexity of the molecular interactions with the offspring will allow one of ordinary skill in the art to understand and predict special interactions. Thoughts are limited.   In one aspect, the compounds of the present invention provide tyrosine kinase activity, preferably tyrosin kinase. Kinase Fyn, Lyn, Blk, Syk, Yes, Lck, Btk, Hc Modulation of intracellular signal levels by regulating the activities of k, Src, and Zap70. The exchange can be adjusted. In another aspect, the compound of the invention is an adapter molecule. , Preferably the activity of Shc can be regulated. In yet another aspect, the invention Can modulate the activity of lipid kinases, preferably PI-3K . In yet another aspect, the compounds of the invention include GAP, CD22, and MAPK. The beginning Can regulate the activity of the protein.   In another aspect, the compound of the invention is a compound of the formula YXXLXXXXXXXXXXXXXXX. Includes an isolated peptide (or its mimetope) with a mino acid motif . According to the present invention, an isolated or biologically pure peptide is It is a peptide extracted from the natural environment. "Isolated" and "biologically" "Pure" in itself need not reflect the extent to which the protein has been purified. Book The isolated compounds of the invention may be obtained from natural sources or may be recombinant DNA technology. Alternatively, it can be produced using chemical synthesis. Used herein In some cases, the isolated peptides are either full-length proteins or such proteins. Can be a homologue of an amino acid deletion in such a homologue (eg For example, truncated forms, insertions, inversions, substitutions, and / or derivatizations of the protein (eg, Acetylated, glycosylated, carboxymethylated and myristylated, preniated Is linked to amino acids that have been derivatized or palmitoylated) , So that the peptide is a tyrosine kinase, an adapter molecule, and / or It becomes possible to regulate the activity of lipid kinases.   According to the invention, a "mimetope" mimics the potency of an isolated compound of the invention. Means any compound capable of Mimetope is susceptible to degradation With a peptide that has been modified to reduce It is possible. Other examples of mimetopes include protein-based compounds, charcoal. Hydrate-based compounds, lipid-based compounds, nucleic acid-based compounds, natural , Organic compounds obtained by synthesis, anti-idiotype antibodies, and And / or catalytic Antibodies, or fragments thereof, are included, but are not limited to. Mimeto Can regulate the activity of the tyrosine kinases described herein, for example. Screening of libraries of natural and synthetic compounds for possible compounds It is possible to obtain it. Mimetopes may also be, for example, natural and synthetic. Compound libraries, especially chemical or combinatorial libraries (ie, Library of compounds with different sequences or sizes but identical building blocks Lee). Mimetope can be used for rational drug design, for example. It is also possible to obtain more. In the rational drug design method, 3 of the compounds of the present invention are used. The dimensional structure is analyzed by, for example, nuclear magnetic resonance (NMR) or x-ray crystal diffraction. It is possible to After that, using the three-dimensional structure, for example, a computer It is possible to predict the promising mimetope structure by modeling. Then The predicted mimetope structure was constructed, for example, by chemical synthesis, recombinant DNA technology, or Or mimetope from natural sources (eg, plants, animals, bacteria, and fungi) It can be produced by isolation.   In one aspect, a compound of the invention comprises a peptidesrc-Chiro of the family The peptide in a manner capable of modulating the activity of synkinasesrc-Fa An amino acid sequence that allows it to be bound by Millie's tyrosine kinase Having an isolated ARH1 peptide having. The ARH1 peptide of the present invention is PeptidesrcAt least one binding site of a family of tyrosine kinases It is of a size and nature that allows it to undergo binding by. Especially Ming ARH1 peptidesrc-N-terminal of family tyrosine kinases Special area And is capable of undergoing binding by the SH2 domain. ARH1 of the present invention PeptidesrcA unique region at the N-terminus of the family tyrosine kinases, S Can be bound by H2 domain and SH3 domain Is preferred.   In another aspect, the compounds of the invention have the peptide as a target molecule (eg, MIR). To R)syk-Can regulate the binding of family tyrosine kinases In a fashionsyk-To be bound by a family of kinases It includes an isolated ARH1 peptide having an amino acid sequence that enables it. Of the present invention ARH1 peptide issyk-At least one of the tyrosine kinases of the family Size that allows the peptide to undergo binding by association with the binding site And of nature. Particularly, the ARH1 peptide of the present invention issyk− Family -One SH2 domain of the kinase, preferablysyk-Of family kinases It is possible to undergo binding by both SH2 domains.   In yet another aspect, the compounds of the invention have the peptide as a targeting molecule (eg, G rb2 or SOS) in a manner that can regulate the binding of Shc molecules. Has an amino acid sequence that allows it to undergo binding by Shc Isolated ARH1 peptide. The ARH1 peptide of the present invention is a Shc molecule Allows the peptide to undergo binding by at least one binding site of Size and nature. Particularly, the ARH1 peptide of the present invention is Shc It may undergo binding by the SH2 domain of the molecule.   In yet another aspect, the compound of the invention is such that the peptide has an activity of SP-6 kinase. The peptide is PI-3K in a manner capable of regulating sexualization Isolated ARH having an amino acid sequence that allows it to undergo binding by Contains 1 peptide. The ARH1 peptide of the present invention comprises at least one PI-3K molecule. The size and size that allow the peptide to undergo binding by one binding site. And of nature. In particular, the ARH1 peptide of the present invention is the SH of PI-K3 molecule. It is possible to undergo binding by two domains.   The compounds of the present invention have at least 4 amino acid residues, preferably about 15 amino acids. Noh acid residues, more preferably including ARH1 peptides containing about 17 amino acid residues However, the peptide can be at least about 26 amino acid residues. is there In an embodiment, the ARH1 peptide of the invention has a size of about 3 kD, and about 26 It has amino acid residues.   In one aspect, the ARH1 peptide of the invention has at least two amino acid sequences. Tyrosine residue and at least two leucines and / or isoleucines It contains an ARH1 motif with residues. As used herein, "mode “Chief” means a series of amino acid residues contained within a protein that has a special function. I do. The ARH1 motif of the invention is YX using the standard one-letter amino acid code. Has a spatial arrangement represented by the XLXXXXXXXXXXXXXXX amino acid motif Preferably it contains tyrosine, leucine, and / or isoleucine residues, And in the motif, X can be any amino acid and “Ψ” is a It can be either isine or isoleucine.   In some embodiments, the ARH1 peptide is in B cellssrc-Family tyrosine Sequences capable of modulating the activity of the kinase can be included.src-Fa Milly kinase-specific ARH1 peptide is YXXLX XXDCSMYXXΨ, YXXLXXXQTATYXXΨ, YXXLXXXXYS It is preferable to include PIYXXΨ or YXXLXXXNQETYXXΨ , Ig-α, Ig-β, FcεRIβ or FcεRIγ protein ARH1 More preferred are ARH1 motifs that are substantially similar to the motif, and YXXL Even more preferred is XXXDCSMYXXΨ. A particularly preferred ARH1 peptide of the invention The peptide contains the amino acid sequence YEGLNLDDCSMYEDI and has the amino acid sequence N Even more preferred is LYEGLNLDDCSMYEDI.   In another aspect, the ARH1 peptide issyk-Of the family tyrosine kinases It is possible to include sequences capable of modulating activity.syk-Family The kinase-selective ARH1 peptide contains the amino acid motif YXXLXXXTK DTYXXΨ, YXXLXXXQRDLYXXΨ, YXXLXXXYSPIYX XΨ or YXXLXXXNQETYXXΨ is included, and TCRζc, CD3 Substantially in the ARI1 motif of ε, FcεRIγ, or FcεRIβ protein Similar ARH1 motifs are more preferred, and the amino acid motif YXXLX Even more preferable is XXTKDTYXXΨ or YXXLXXXXXRDLYXXΨ. New Particularly preferred of the present inventionsyk-Family kinase monoselective ARH1 pep Tide is the amino acid motif YQGLSTATKDTYDAL or YEPIR. KGQRDLYSGL containing the amino acid motif DGLYQGLSTATKDT Even more preferably YDAL or NPDYEPIRKGQRDLYSGL preferable.   Of the present inventionsyk-Family kinase-Selective peptides are phosphorylated Can be either unphosphorylated or Noh. Non-tyrosine phosphorylationsyk-Family kinases-selective peptides , An ARH1 motif containing the amino acid motif YXXLXXXDCSMYXXΨ ARH1 which preferably comprises and is substantially similar to the Ig-α ARH1 motif More preferred is the motif, and the amino acid motif NLYEGLNLDDCSM Even more preferred is the ARH1 motif containing YEDI. Tyrosine phosphorylationsyk -Family Kinase-Selective peptides have the amino acid motif pYXXLXXX TKDTpYXXΨ, pYXXLXXXXXQRDLpYXXΨ, pYXXLXXX AR containing YSPIpYXXΨ or pYXXLXXXNQETpYXXΨ TCRζc in which the H1 motif is preferable and the peptide is phosphorylated In the ARH1 motif of the CD3ε, Fc6RIγ, or FcεRIβ proteins Substantially similar ARH1 motifs are more preferred, and the amino acid motif p YXXLXXXXTKDTpYXXΨ or pYXXLXXXQRDLpYXX Ψ is even more preferred.   In yet another aspect, the ARH1 peptide binds to a Shc adapter molecule. It is possible to include a sequence capable of Shc-selective ARH1 peptide is YX XXXXXDCSMYXXΨ, YXXXLXXXQTATYXXΨ, YXXLXX It is preferable to include XYSPIYXXΨ or YXXLXXXNQETYXXΨ. More preferably, A of Ig-α, Ig-β, FcεRIγ, or FcERIβ protein More preferred are ARH1 motifs substantially similar to the RH1 motif, and Y Even more preferred is the XXLXXXDCSMYXXΨ ARH1 motif. The present invention A particularly preferred ARH1 peptide of the amino acid motif YEGLNLDDCSMY Contains EDI, amino acid motif NLYEGLNLDDCSMYEDI Is more preferable.   The Shc-selective peptides of the invention are either tyrosine phosphorylated or non-tyrosine phosphorylated. It can be any of the following: Non-tyrosine phosphorylated Shc-selective The peptide preferably contains the ARH1 motif YXXLXXXDCSMYXXΨ. , The ARH1 motif that is substantially similar to the Ig-α ARH1 motif is more AR which is preferred and comprises the amino acid sequence NLYEGLNLDDCSMYEDI The H1 motif is even more preferred. The tyrosine phosphorylated Shc-selective peptide is pYXXLXXXQTATpYXXΨ, pYXXLXXXYSPIpYXXΨ, Alternatively, it may contain the pYXXLXXXNQET pYXXΨ ARH1 motif. Preferably, it is substantially similar to Ig-β, FcεRIγ, or FcεRIβ protein. Similar ARH1 motifs are more preferred and peptides are phosphorylated Amino acid motif DHTYEGLNIDQTATYEDI, DRLYEELNH A including VYSPIYSEL or DAVYTGLNTRNQETYETL Even more preferred is the RH1 motif.   In yet another aspect, the ARH1 peptide is a peptide capable of binding PI-3K. It can include columns. The PI-3K-selective ARH1 peptide is an amino acid Chief YXXLXXXDCSMYXXΨ, YXXLXXXQTATYXXΨ, Y XXLXXXXQRDLYXXΨ, YXXLXXXXYSPIYXXΨ, or Y It is preferable to contain XXLXXXXNQETYXXΨ, and Ig-α, Ig-β, C Substantially in the ARH1 motif of D3ε, FcεRIβ, or FcεRIγ protein More similar ARH1 motifs are more preferred, and YXXLXXXNQET Even more preferred is the YXXΨ ARH1 motif. Particularly preferred ARH of the present invention One peptide comprises the sequence DAVYTGLNTRNQETYETL. Some preferred In an aspect, the PI-3K-selective peptides of the invention have tyrosine phosphorylated. You.   Particularly preferred mimetopes of the ARH1 peptides of the invention are the amino acids shown in Table 1. It is possible to include, but is not limited to, acid sequences.   In another aspect, the ARH1 peptide of the invention issrc-Family tyrosine It is possible to stimulate the specific activity of the nase. As used herein, the term " "Specific activity" issrc-Family tyrosine kinases modify early target molecules Means the possible speed. The rate of specific activity is, for example,src− Family Chi Can be measured by the rate at which rosin kinase phosphorylates early target molecules . Specific activity is alsosrc-The rate of autophosphorylation of family tyrosine kinases Can also mean. The ARH1 peptide of the present invention is at least about 2-fold , And up to about 70 times, and more preferably about 3 times to about 60 timessrc− It is preferred to be able to stimulate the specific activity of the Amily tyrosine kinase. Specific activity Stimulation stimulates the peptidesrc-Immunoprecipitates of the family tyrosine kinases Observed when incubated with.   srcAn ARH of the invention capable of stimulating the activity of a family of tyrosine kinases One peptide contains at least two phosphorylated tyrosine residues. Stimulating ARH1 The peptide is spatially arranged in at least two ways in the manner described herein. It is preferable to include an ARH1 motif having a phosphorylated tyrosine residue. The present invention Of the stimulatory ARH1 peptide of Escherichia coli XΨ, pYXXXLXXXQTATpYXXΨ, pYXXLXXXYSPIpYX XΨ, or pYXXLXXXXNQET pYXXΨ [in these motifs, p Y means a phosphorylated tyrosine residue], and the tyrosine residue is Phosphorylated Ig-α, Ig-β, FcεRIβ, or FcεRIγ More preferred is an ARH1 motif that is substantially similar to the ARH1 motif of the protein. , And pYXXLXXXDCSMpYXXΨ AR The H1 motif is even more preferred. Particularly preferred ARH1 peptides of the present invention are Includes the column pYEGLNLDDCSMpYEDI and the sequence NLpYEGLNLDDC More preferably SMpYEDI.   It's not bound by logic,src-Family tyrosine kinases are membranes Can bind non-covalently to the ARH1 motif of bound receptors It is thought to be. Primarily,srcOf the N-terminal of the family tyrosine kinases The unique region binds to the ARH1 motif of the receptor and the ligand It remains unstimulated until it binds to the extracellular domain of the sceptor. Re Upon binding of Gand, the receptor undergoes a conformational change, which Phosphorylation of tyrosine residues contained within the ARH1 motif is initiated (eg, These tyrosines are phosphorylated by bound kinases). Then combine The SH2 domain of Nase binds to the phosphorylated ARH1 motif. This first The two-binding phenomenon is that the kinase domain of the bound kinase is the early target of that kinase. The position of the C-terminal phosphorylated tyrosine in a manner that makes it available for modification. It is thought that the change suppresses the inhibition of the activity of the bound kinase. Follow And the phosphorylated ARH1 motif actively inhibits the activity of that kinase It is possible to release the inhibition of the bound kinase by removing the factor. theory 2 is not restricted to the above, but FIG. 2 shows a part of the receptor complex (Ig-α). Represents interactions that can occur with intracellular molecules. In particular, FIG. 2 shows the ligand Tyrosine kinase (ki) that can occur after receptor binding by n. The conformational change of) will be described in detail.   According to the mechanism described above, ARH1 pepti containing the ARH1 motif Do is not an enzyme. Rather, the peptide binds to the signal transducing molecule, and its Induces a conformational change in the signal transduction molecule of. Phosphate of ARH1 motif Unmodified or partially phosphorylated tyrosine residuessrc-Fa Binding of a unique region at the N-terminus of Milly's tyrosine kinase to the ARH1 peptide. It is thought that it can prevent   Inhibitory of the present inventionsrc-Two tyrosine kinase ARH1 peptides of the family It is possible to include an ARH1 motif containing one tyrosine residue, in which case Only one of these tyrosine residues is phosphorylated or both tyrosine residues The residues are not phosphorylated.src-Inhibition of family tyrosine kinases It is preferable that the tyrosine residue of the selective ARH1 peptide is not phosphorylated. Book Invention preferredsrc-Inhibitory ARH1 Peptides of Family Tyrosine Kinases De is the amino acid motif FXXLXXXXXXXXXXI, more preferably the motif FXXLXXXDCSMFXXXΨ, FXXLXXXQTATFXXΨ, FXXL XXXXYSPIFXXXΨ, or FXXLXXXNQETFXXXΨ, and More preferably contains the motif FXXLXXXDCSMFXXXΨ. Features of the invention Preferred tosrc-The inhibitory ARH1 peptides of the family tyrosine kinases Contains the amino acid motif FEGLNLDDCSMFEDI, and the amino acid motif D More preferred to be MPDDYEDENLFEGLNLDDCSMFEDI Yes.   According to the present invention, the signal transduction-modulating compound of the present invention is a compound of the present invention. Can include an amino acid sequence containing multiple ARH1 motifs. For example,s yk -Compounds of the invention capable of modulating the activity of family kinases are The mino acid sequence YXXLXXXQRDLYXXΨ, YXXLXXXYSPIYXXΨ or YXXLXXXNQETYXXΨ It contains the amino acid sequence YXXLXXXXXTDTYXXΨ that is covalently linked. Can be removed. Alternatively, the amino acid sequence YXXLXXXXTKDTYXXΨ is Itself is YXXLXXXQRDLYXXΨ, YXXLXXXYSPIYXXΨ, Alternatively, an amino covalently bonded to YXXLXXXNQETYXXΨ. Can be covalently linked to the acid sequence YXXLXXXQRDLYXXΨ . Multiple ARH1 motifs containing compounds of the invention have the amino acid sequence YEPIRKG Amino acid sequence YQGLSTAT covalently linked to QRDLYSGL It is preferred to include KDTYDAL, and more preferably the amino acid sequence NP Amino acid sequence covalently linked to DYEPIRKGQRDLYSGL More preferably, it comprises DHTYQGLSTATKDTYDAL.   Another aspect of the invention relates to the recognition that the activity of certain enzymes can be regulated. They target the high proline region of such enzymes and interfere with normal binding patterns It is possible to improve the enzymatic activity in the signal transduction pathway. It is based on the recognition that it is possible to change.   According to researchers so far, the enzyme PI-3K has a maximum of 5 enzymes (eg, blood). Platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), pp60v-src, Pp60c-src , Insulin receptor, IL-4 receptor, and CSF-1 receptor) Has been shown to act as a target molecule for (Otsu   et al. , Pp. 91-104, 1991, Cell. , Vol. 65) . PDGFR is YXXM Amino acid motif [where X is any amino acid and Y Residue is phosphorylated] with a recognition sequence containing a phosphopeptide It has been shown to bind to the SH2 domain of I-3K (described above). like this Binding has been shown to activate PI-3K function. Therefore, those skilled in the art The mechanism for activating -3K is the mechanism of protein activation through PI-3K binding. It will lead to the idea that it is the YXXM motif. In addition, p p60v-secAnd pp60c-secBecome PI-3K due to their SH3 domain It has been shown to bind (described above). Such binding leads to activation of PI-3K It has not been shown to bring. Therefore, the enzyme binding to PI-3K has various recognitions. It can occur with the use of a sequence and the limited activity of PI-3K. Oxygenation can be achieved upon attachment of the phosphopeptide sequence YXXM.   In one aspect, the compounds of the invention are directed toward the SH3 domain of tyrosine kinase to early target molecules. Can inhibit the binding of the main and thereby inhibit the activation of its target molecule it can. Suitable target molecules of the invention may undergo binding by tyrosine kinase A protein having a high proline sequence is included. The target molecule of the present invention is, for example, PI- Effector molecules such as 3K, ras-GAP, 3BP1 and 3BP2 However, it is not limited thereto.   According to the invention, the compounds of the invention act as amplification factors in the signal transduction pathway. Regulates the activity of potential receptor and / or non-receptor tyrosine kinases Including isolated high Pro peptides. As used herein, " “High Pro peptide” is a highly isolated high pr It also means o peptide. The high Pro peptides of the present invention include, in particular:src− Family By regulating the activity of the tyrosine kinasesrc-Family Tiroshi Signal transduction resulting from a ligand that binds to a receptor that can bind to a kinase The pathway can be regulated. Suitable receptors of the present invention include B cell antigen receptors. , T cell antigen receptor, Fc receptor, MHC class II, IL-4 receptor Include, but are not limited to, Scepter, and CD4. Suitable for the present invention Whatsrc-Fyn, Lyn, Lck, Blk for family tyrosine kinases , Syk, Yes, Btk, Hck, Zap70, and Src, It is not limited to these.   The high Pro peptides of the present invention may interfere with the binding of kinases to early target molecules. And can regulate tyrosine kinases. High Pro peptide of the present invention The peptide in a manner that the peptide interferes with the binding of the initial target molecule to the kinase. It contains a size sufficient to allow the tide to bind to the tyrosine kinase. The high Pro peptides of the invention have at least about 5 amino acid residues, more preferably about 7 amino acid residues. Amino acid residues to about 40 residues, and even more preferably about 10 amino acid residues to about It has 30 amino acid residues. The high Pro peptide of the present invention has a size of about 85 kD And of at most about 1 kD in size.   The high Pro peptide of the present invention is characterized by the fact that the peptide is a kinase with an early target molecule. To allow the peptide to bind to tyrosine kinase in a manner that interferes with Containing the amino acid sequence The high Pro peptide of the present invention is a tyrosine kinase SH3. Domain, more preferablysrc-SH3 domain of family tyrosine kinases In, and even more preferablys rc -High proline contained within the SH3 domain of the family tyrosine kinases It contains an amino acid sequence capable of binding to a sequence binding site.   In one aspect, the amino acid sequence of the high Pro peptides of the invention has about 20% proline. Residues to about 100% proline residues, more preferably about 30% proline residues About 90% proline residues, and even more preferably about 40% proline residues. It contains a high proline motif with about 80% proline residues. These prolines The residue is a high proline binding site on the tyrosine kinase of the high Pro peptide of the present invention. The spatial arrangement can be in any suitable manner so that it can undergo binding by this Such a spatial arrangement is similar to the PPPXPXPXPPXPXPP amino acid motif or P XPXXPPXPPXP amino acid motif [where X is any Represents a mino acid residue]. Proline residues are omitted by P You.   In a preferred embodiment, the high Pro peptide of the present invention is a high PI-3K proline domain. Including in. PI-3K is a non-catalytic p85 subunit (85 kD) and catalytic It consists of a specific p110 subunit (110 kD). PI-3K is D-3 hydroxy Inositol lipids can be phosphorylated at the sill position. Two high prolines The domain is contained within the p85 subunit. First high proline of PI-3K Maine extends from approximately residue 80 to approximately residue 104, and amino It may include the acid motif KKISPPTPKPRPPRPTPVAPGSSKT It is possible. The second proline-rich domain of PI-3K begins at approximately residue 299. Extends to approximately residue 318, and the amino acid motif NERQPAPATP It can include PKPPKPTTVA. High Pro of the present invention The peptide is KKISPPTPKPRPPRPTPVAPGSSKT or N At least one amino acid mochi comprising ERQPAPATPPKPPKPTTVA It is preferable to include erf. According to the invention, K = lysine, R = arginine, V = Valine, and Q = glutamine.   The high Pro peptide of the present invention or its mimetope depends on tyrosine kinase It can inhibit the activation of the target molecule, which its high Pro peptide Binds to tyrosine kinases, thereby binding the target molecule, which in turn This is because activation of the target molecule is inhibited. The high Pro peptide of the present invention has about 7 0%, more preferably about 80%, and even more preferably about 90% target molecule It is preferably capable of inhibiting the binding of tyrosine kinase to Plus The high Pro peptide of the present invention is a peptide which is a peptide for a kinase. 00: 1 ratio, more preferably 100: 1 ratio of peptide to kinase. Ratio, and even more preferably at a 20: 1 ratio to the kinase. Which substantially inhibits the binding between the tyrosine kinase and the target molecule (90% and Between 100%).   In a preferred embodiment, the high Pro peptide of the present invention is a peptide which comprises PI-3K. It is possible to inhibit the activation of PI-3K when it is incorporated into the containing cell. That Such PI-3K activation is at least 80% and more preferably at least 90% inhibition is preferred.   According to the present invention, the mimetope of a compound of the invention as described in detail herein is It is possible to cross lipid bilayers (eg, the prototypical membrane of cells). Lipid bilayer Mimetopes that can traverse are organic molecules, especially carbohydrate-based molecules. Can be Further in accordance with the present invention, The compound of the invention may include concatemers, where one or more AR H1 peptide or one or more high Pro peptides bound to each other You.   Another aspect of the invention is an isolation encoding a compound of the invention disclosed herein. Nucleic acid molecule. According to the invention, reference to nucleic acid refers to nucleic acid molecules. Also means In accordance with the present invention, an isolated nucleic acid molecule is isolated from its natural environment. Is a nucleic acid molecule that has been removed (ie, has been previously subjected to human manipulation). Exist). "Isolated" by itself is required to reflect the degree to which the nucleic acid molecule has been purified. It doesn't matter. The isolated nucleic acid molecule may be DNA, RNA, or DNA or R. Any hybrid or derivative of NA can be included. The core of the present invention Acids are regulatory regions that control the expression of nucleic acid molecules (eg, transcriptional or translational control regions). ), Full-length or partial coding regions, and combinations thereof. Can be removed. Any part of the nucleic acid molecule of the present invention may be (1) in its natural environment. Isolation of the molecule from (2) recombinant DNA technology (eg PCR amplification, cloning) Ing); or (3) using chemical synthetic methods It is possible to The nucleic acid molecule of the present invention contains natural allelic variants (but Nucleic acid molecules encoding compounds of the invention, including, but not limited to, , As well as modified nucleic acid molecules (in these molecules to nucleotides, such Of a nucleic acid molecule encoding a compound of the invention, where various modifications can regulate signal transduction Insertions, deletions, substitutions, and / or reverses in a manner that does not substantially interfere with ability Pre-generated) functional equivalents. Preferred functional Equivalents include: under stringent conditions: Ig-α, Ig-β, TC AR derived from Rζc, CD3ε, FcεRIγ, or FcεRIβ protein At least part of a nucleic acid molecule encoding the H1 peptide; or PI-3K protein At least a portion of the nucleic acid molecule encoding the high Pro peptide derived from white matter Nucleic acid sequences capable of hybridizing are included. Stringent hybridization The conditions are described in Sambrook et al. ,Molecular Cloni ng: A Laboratory Manual , Cold Spring H Arbor Labs Press, 1989 (This is a book in its entirety Incorporated in the specification). How to any particular nucleic acid molecule Those skilled in the art can use this as a guide in determining whether it is possible to make such specific modifications. Can be carried out by a person of ordinary skill in the art without the need for undue experimentation. Several factors should be considered which allow the aspects to be recognized. For example, These factors are designed to maintain a particular functional region of the encoded compounds of the invention. Those modifications that include modifications to the nucleic acid molecule carried out in those encoding compounds include: The tyrosine is in a manner that allows the motif to regulate the activity of its kinase or adapter molecule. To be bound by synkinase, adapter molecule, or lipid kinase ARH1 motif capable of binding to the SH3 domain of tyrosine kinase Binding, which alters the activation or binding capacity of the kinase. Includes a high proline motif that can be turned on. Machines with these various characteristics For functional tests (eg, binding test, kinase assay, lipid phosphorylation assay) A person skilled in the art would like to know what kind of modification is appropriate for the nucleic acid molecule, or Will be able to determine what modifications are not appropriate.   In one aspect, the isolated nucleic acid molecule of the invention encodes the ARH1 peptide of the invention. Examples of such peptides are disclosed herein, including nucleic acid sequences. Book The ARH1 peptide nucleic acid molecule of the invention has the amino acid sequence YXXLXXXXXXXXXXXX. A nucleic acid sequence encoding the ARH1 motif having XΨ or its mimetope Can be included. Preferred nucleic acid molecules encoding the ARH1 peptide include: Peptide sequences YXXLXXXDCSMYXXΨ, YXXLXXXQTATYXX Ψ, YXXLXXXYSPIYXXΨ, YXXLXXXNQETYXXΨ, YX Kernel encoding XLXLXXTKDTYXXΨ, YXXLXXXQRDLYXXΨ Acid sequences, or their mimetopes are included. Encodes the ARH1 peptide More preferred nucleic acid molecules include peptide sequences Nucleic acid sequences encoding, or their mimetopes are included. Even more preferred The desired nucleic acid molecule has the sequence: Or including.   Differ by at least a portion of a nucleic acid molecule encoding one ARH1 peptide Any other component that encodes at least a portion of a component (eg, regulatory factor) ARH of the invention linked covalently (using standard recombinant techniques) to a sequence. One peptide can be produced. Inflate these arrays Be transferred bysrc-A family of tyrosine kinases,sy k Regulates the activity of family kinases, Shc molecules, and PI-3K Can be linked in a manner to produce a functional ARH1 peptide capable of   In another aspect and aspect of the invention, the isolated nucleic acid molecule comprises at least the present invention. An example of such a peptide comprising a nucleic acid sequence encoding one high-Pro peptide Are disclosed herein. The high Pro peptide nucleic acid molecules of the present invention include tyrosine High proline motif having an amino acid sequence capable of binding to SH3 domain of Nase A nucleic acid sequence that encodes Preferred nucleic acids encoding high Pro peptides The molecule includes the peptide sequence PPPXPXPXPPXPPXP or PXPXXPPX. Nucleic acid sequences encoding PPXP are included. Nucleic acid encoding high Pro peptide At least a portion of the molecule is labeled with at least different components (eg, regulatory factors). Covalently linked to any other sequence encoding a portion (standard recombinant DNA methods Can be used to produce high Pro peptides of the invention. This Sequence is transcribed in frame, which results in a tyrosine kinase. Mode that allows to produce functionally high Pro peptides that can regulate the activity of Can be combined with.   In another aspect, the compound of the invention is derived from a cell that produces the compound. Nucleic acid sequence encoding a signal or leader segment capable of enhancing secretion Is used. The nucleic acid sequence encoding the leader or signal segment is Covalently linked (base pair bond) to the 5'end (amino terminus) of the nucleic acid molecule . The leader or signal segment is naturally linked to part of the invention. It may be a connected segment or may be a heterogeneous segment. film To obtain the bound embodiment, the compound of the invention is linked to a lipid-containing target molecule. A nucleic acid sequence comprising at least one transmembrane segment capable of Such segments include at least a portion of the transmembrane domain and a cytoplasmic domain. At least a portion of the The nucleic acid sequence encoding the transmembrane segment is Covalent attachment to the 3'end (carboxyl terminus) of a nucleic acid molecule encoding a compound of the invention Binding (by base pair binding). Of the invention, which can be membrane-bound Nucleic acid molecules that encode compounds have transmembrane coding sequences transcribed in frame Segment linked to the 3'end of the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain in a fashion At least one nucleic acid sequence encoding Preferred signal or Lee Dur segments are Ig-α, Ig-β, TCRζc, CD3ε, FcεRIγ. , Or FcεRIβ protein or PI-3K protein in a natural state Is the segment to Preferred transmembrane segments include Ig-α, Ig-β, T CRζc, CD3ε, FcERIγ, or Fc6RIβ protein, or P It includes a segment that naturally binds to the I-3K protein.   Another aspect of the invention is a domain comprising a compound of the invention linked to a fusion segment. To a fusion protein containing an inn. As part of a compound of the invention Incorporation of the fusion segment of the It is possible to enhance qualitative. In addition, the fusion segment is It can act as a tool to simplify the purification of compounds, examples Allows purification of the fusion protein obtained using affinity chromatography And so on. Appropriate fusion segments provide the desired function (eg, increased stability). Can be any size domain with addition and / or purification) It is. One or more fusion segments may be linked to the amino compound of the claimed compound. And / or can be attached to the carboxyl terminus, and the fusion segment The bond between the compound and the compound to allow convenient recovery of the compound. It can be made to be sensitive to cleavage. The fusion protein Fused to either the carboxyl and / or amino termini of the compounds of Recombinant cells transformed with a fusion nucleic acid sequence encoding a protein containing a segment It is preferably produced by culturing   The fusion protein of the present invention includes factor X or thrombin, preferably factor X. Glutathione S-transferase fusion segme capable of undergoing cleavage A compound of the invention linked (by a base pair bond) to a nucleic acid molecule encoding the Encoding nucleic acid molecules are included. In one aspect, the ARH1 fusion protein of the invention is , A glutathione S-transferase fusion capable of undergoing cleavage by factor X Amino acids linked (by base pair binding) to the nucleic acid molecule encoding the combined segment It comprises a nucleic acid molecule which encodes the sequence YXXLXXXXXXXXXXYXXΨ. ARH1 fusion The combined proteins are Ig-α, Ig-β, TCRζc, CD3ε, FcεRIβ, Fcε It preferably comprises a nucleic acid sequence encoding at least part of a RIγ protein, And NLYEGLNLDDCSMYEDI, DHTYEGLNIDQTATYEDI, DRLYEELNHVYSPIYSEL or D AVYTGLNTRNQETYETL, glutathione S that can undergo cleavage by factor X Is linked to a nucleic acid molecule encoding a lancerase fusion segment (base pairing (Depending on the combination) contains the amino acid sequence DGLYQGLSTATKDTYDAL or NPDYEPIRKGQRDLYSGL Is more preferable. Particularly preferred ARH1 fusion proteins of the present invention include amino acid sequence Column DMPDDYEDENLYEGLNLDDCSMYEDI, DHTYEGLNIDQTATYEDI, DRLYEELNHVYSPIYSEL, DA Code VYTGLNTRNQETYETL, DGLYQGLSTATKDTYDAL or NPDYEPIRKGQRDLYSGL Nucleic acid molecule.   Another feature and aspect of the invention is a glue capable of undergoing cleavage by factor X. Tathion S transferase linked to a nucleic acid molecule encoding a fusion segment Amino acid sequence PPPXPXPXPPXPPXP or PX (by base pairing) It relates to a high Pro fusion protein containing PXXPPXPPXP. High Pro fusion protein Preferably comprises a nucleic acid sequence encoding at least part of a PI-3K protein. And the amino acid sequence KKISPPTPKPRPPRPTPVAPGSK Glutathione S transferase fusion that can be cleaved by T or factor X Amino acids linked (by base pair binding) to the nucleic acid molecule encoding the combined segment More preferably it comprises the sequence NERQPAPATPPKPPKPTTVA.   In yet another aspect, the SH3 fusion protein of the invention is subject to cleavage by factor X. Nucleic acid encoding a glutathione S-transferase fusion segment capable of Tyrosine quina linked to the molecule (by base pair binding) Nucleic acid molecule encoding at least a portion of the SH3 domain of the enzyme. SH3 Glutathione S transferase whose fusion protein can be cleaved by factor X Fyn linked (by base pair binding) to a nucleic acid molecule encoding a fusion segment , Lyn, Btk, Lck, Syk, Yes, Hck, Src, or Zap 70, more preferably starting with Lynsrc-Family tyrosine kiners A nucleic acid molecule encoding at least a portion of the SH3 domain derived from And are preferred.   The invention further provides that the present invention is operably linked to a vector that can be expressed in a host cell. Also included are recombinant molecules that include a nucleic acid molecule that encodes a compound of the invention. In this specification When used, "operably linked" means that the sequence is transformed into a cell. Means insertion of a nucleic acid sequence into an expression vector in such a way that it can be expressed. As used herein, an "expression vector" transforms a host cell. And bring about the expression of the appropriate nucleic acid molecule, preferably replicating in the host cell. Possible RNA or DNA vectors. The expression vector can be prokaryotic or Can be either eukaryotic, and typically viral or Is a plasmid.   Construction of the desired expression vector can be performed by methods known to those skilled in the art And expression can be performed in eukaryotic or prokaryotic systems . A suitable prokaryotic system is a bacterial strain, which includes Bacillus (bacilli)of E. coli (E.coli) Various strains or Pseudomonas spp.Pseudo monas ) Various species, including but not limited to. In prokaryotic systems Is a plasmid containing an origin of replication and regulatory sequences derived from a species compatible with the host cell. Is used. System Sequence is a promoter, operator, enhancer, ribosome binding site , And a Shine-Dalgarno sequence However, the present invention is not limited to these. Expression systems useful for eukaryotic host cells are It contains a promoter derived from the appropriate eukaryotic gene. Useful mammal promotion The SV40 and other early and late promoters, or other viral promoters. Lomotor (eg, baculovirus, polyoma virus, adenovirus , Derived from bovine papillomavirus or avian sarcoma virus) included. The expression vector of the present invention functions in the recombinant cell of the present invention (ie, Vector, which directs gene expression), including bacteria, East, other fungal, insect, plant, and mammalian cells. Expression system to those skilled in the art Of the aforementioned regulatory elements operably linked to the nucleic acid molecule of the present invention using known methods. Can be constructed from any of (eg, Sambrook, et.   al. , Above,).   The host cells of the invention are: cells that are naturally capable of producing the compounds of the invention. Cell; or the present invention when transformed with a nucleic acid molecule encoding a compound of the invention. Can be a cell capable of producing the compound of The host cells of the present invention include bacteria, Includes but is not limited to fungal, insect, plant, and mammalian cells . More preferred host cells include Escherichia (Escherichia),Mallet Ruth (Bacillus), Saccharomyces (Saccharomyces), SF9, and Drosophila (Drosophila) Is included.   Recombinant cells transform host cells with one or more recombinant molecules Preferably, each recombinant molecule comprises one or more One or more of the invention operably linked to an expression vector containing a transcriptional control sequence. It contains a number of nucleic acid molecules. The recombinant molecule of the present invention is a nucleic acid molecule in a cell to be transformed. Of any of the transcription control sequences that can effectively regulate the expression (s) Of the nucleic acid molecules previously described that are operably linked to at least one of A molecule that can include at least one of   The use of recombinant DNA technology, for example, to control the copy number of nucleic acid molecules within a host cell. Expression of transformed nucleic acid molecules and the effect of transcribing those nucleic acid molecules. Improved rate and efficiency of translation of the resulting transcript, as well as efficiency of post-translational modification It will be appreciated by those skilled in the art that this can be done. Increase expression of nucleic acid molecules of the invention Recombinant techniques useful for constructing high copy number plasmids include operably linked nucleic acid molecules. Binding, integration of nucleic acid molecules into the chromosome of one or more host cells, into plasmids Addition of vector stabilizing sequences, transcription control signals (eg, promoter, Or enhancer) or translation control signals. Is a modification of the nucleic acid molecule of the invention to accommodate the code utilized by the host cell. Of Escherichia coli, deletion of sequences that destabilize transcripts, and recombinant enzyme products during fermentation Including the use of control signals to primarily separate recombinant cells growing from It is not limited to these. The activity of the expressed recombinant peptide of the present invention is such that By fragmenting, modifying, or derivatizing a nucleic acid molecule that encodes a peptide Can be improved.   According to the present invention, recombinant cells of the present invention are used to Culturing under conditions effective to produce the compound and converting The compound of the present invention can be produced by collecting the compound. The present invention Effective conditions for producing the compound of Geological, bioreactor, temperature, pH, and oxygen conditions, including but not limited to Not done. A suitable medium is one in which the cells of the invention produce the compounds of the invention when cultured. Means any medium that is capable of Effective media is typically assimilated Sources of natural carbohydrates, nitrogen and phosphate, and suitable salts, minerals, metals, and It is an aqueous medium containing other nutrients (for example, vitamins). This medium is a complex nutrient Can be included or can be the specified minimal medium. this The medium also contains chemical reagents that effect selection for expression of the particular recombinant molecule. Can also be. Such reagents include neomycin, ampicillin, and tetracycline. , Chloramphenicol, and mycophenolic acid, which include Not limited.   The resulting compounds of the invention depending on the vector and host system used for production Stays in recombinant cells; is secreted into the fermentation medium; between the two cell membranes In space (eg E. coli (E.coli) In the periplasmic space)) Either retained on the outer surface of the cell or viral membrane Can be The phrase "recovery of the compound" is simply the whole fermentation culture containing the compound. It means that the land is recovered, and that it means an additional step of separation or purification. It doesn't matter. The compounds of this invention may be purified using a variety of standard protein purification techniques. Such techniques include, for example, affinity chromatography, ion Exchange chromatography, filtration, electroporation, hydrophobic interaction chromatography , Gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, Ncanavalin A chromatography, chromatofocusing, differential solubilization method, And immunoprecipitation methods, but not limited thereto. The compounds of the present invention are It is preferably recovered in "pure" form. When used herein “Substantially pure” means as a therapeutic compound or in an assay system. The purity means the effective use of the compound. Substantially pure version of the invention Compounds are, for example, intracellularly without substantial toxicity to such cells. Tyrosine kinase, Shc molecule, lipid kinase, PI-3K, or tyrosine It should be possible to regulate the activity of kinase effectors.   One aspect of the invention is the intracellular release of an animal when administered to the animal in an effective manner. A therapeutic composition capable of modulating signal transduction. The therapeutic composition of the present invention is intracellular Useful for the treatment of any disease caused in part by abnormal signal transduction in You. Such diseases include cancer, autoimmune diseases, immunodeficiency diseases, immunoproliferative diseases. , Allergic responses, and inflammatory diseases. The therapeutic composition of the present invention further comprises Also useful in modulating the immune response during medical treatment (eg, organ and skin transplants) You. Autoimmune diseases include, for example, systemic lupus, myasthenia gravis, rheumatoid arthritis, It can include insulin-dependent diabetes mellitus, and experimental allergic meningitis. Wear. Immunodeficiency disorders include, for example, human AIDS, severe combined immunodeficiency disease, and Hypogamma-globulinemia can be included. Immunoproliferative disorders include, for example, phosphorus. Pamas and leukemias can be included. In addition, the therapeutic composition of the present invention It is useful in the treatment of all forms of cancer, including ulceration.   Therapeutic compositions of the present invention include viral diseases (eg, Epstein-Barr. Herpes exemplifying the Epstein-Barr virus (EBV) (Caused by illus). Examples of such diseases include: B-li in infectious monocytosis, chronic fatigue syndrome, and immunocompromised hosts Includes hyperproliferative disorders. B lymphocytes are latently infected by EBV It is possible. During the latent period in B cells, EBV is attacked by the host immune system. Not sensitive to fire. EBV indicates that B cells should be quiescent (eg, secreted). Antibody is not produced), it remains in a latent state, but it is EB V gene replication requires proteins involved in host cell gene replication, and quiescent B This is because cell transcription is minimized. EBV increases during resting B cell activation However, the host cell gene transcription machinery is increased. Treatment of the present invention The composition stimulates the activation of signal transduction in resting B cells, and And the replication of the EBV virus and its exit from latency in such cells. The separation can protect the animal from EBV-derived diseases. So After the increase EBV shows susceptibility to attack by the host immune system.   LMP2A is an integral membrane protein that regulates reactivation from latency. LMP A2 interacts with Lyn and Sky through its ARH1 motif, By stimulating the enzymatic activity of Lyn or Sky, and receiving it, the latent period Resulting in an increase in EBV reactivation. Therefore, A derived from LMP2A The RH1 peptide may be useful in protecting animals from EBV-derived diseases.   EBV may be further exacerbated by treatment with immunosuppressive agents Lymphocyte proliferation after transplantation It is also associated with sexual dysfunction (PLPD). EBV nuclear protein EBN Loss of A2 expression is associated with the pathogenesis of solid tumor formation. Therefore, EBNA2 ARH1 peptide derived from S. mori stimulates the expression of EBV, and thereby Tumor shape by increasing the susceptibility of EBV to attack by the host's immune system It may be useful in protecting animals from adulthood.   The therapeutic compositions of the present invention further include viruses (eg, bovine leukemia virus (BL). V) It is also useful in the treatment of tumors resulting from the transformation of infected cells. BLV infection The modified host cells produce antibodies to the BVL protein gp30. BLV infected B Upon expression of gp30 on the surface of the lymphocyte, such an antibody bound to the surface Activates B lymphocytes by binding and cross-linking to gp30 It is possible to B lymphocyte activation transforms lymphocytes into malignant cells It is possible to bring The therapeutic composition of the present invention is based on the cross-linking of gp30. Inhibit the activation of resting B cells and thereby inhibit B cell transformation. sell.   Therapeutic compositions include a compound of the invention in combination with a suitable carrier. In this specification When used, "carrier" refers to a suitable site of action in vitro or in vivo. Means any substance suitable as an excipient for delivering the compounds of the present invention You. An additive or formulation of a therapeutic composition in which the carrier itself comprises a compound of the invention; It is possible to act by. Preferred carriers may bind tyrosine kinase The compounds of the invention can be maintained in form. Examples of such carriers include water, Phosphate buffered saline, Ringer's solution, dextrose solution , Serum-containing solutions, Hank's solutions, and other physiological equilibrations Includes, but is not limited to, aqueous solutions. Aqueous carriers are, for example, chemically By approaching the physiological condition of the recipient by enhancing stability and osmolarity It may also include suitable auxiliary substances necessary for cooling. Suitable auxiliary substances include, for example , Sodium acetate, sodium chloride, sodium lactate, potassium chloride, calcium chloride Yields sium, and phosphate, Tris, and bicarbonate buffers Includes other substances used to Auxiliary substances are furthermore, for example, thimerosal, such as m- and o-cresol, formalin, and benzodyl alcohol Preservatives can be included. Preferred Auxiliary Materials for Aerosol Transport Includes surfactant materials that are non-toxic to the recipient, examples of which include esters and Rui is a partial ester of a fatty acid containing from about 6 to about 22 carbon atoms. ester Examples of include, for example, caproic acid, octanoic acid, lauric acid, palmitic acid, stearic acid. Contains phosphoric acid, linoleic acid, linolenic acid, oleostearic acid, and oleic acid I will. The therapeutic composition of the present invention is sterilized by conventional methods and / or lyophilization. can do.   The carrier of the present invention may further include an adjuvant, and those adjuvants Freund's Adjuvant; other bacterial cell wall composition Ingredients: Aluminum-based salts; Calcium-based salts; Polynucleotides Toxoids; serum proteins; viral coat proteins; and preparations from other bacteria Include, but are not limited to.   Carriers useful for the compounds of the invention include any artificial or natural lipid-containing Target molecules, preferably cells, cell membranes, liposomes, and micelles are included. Perseverance When the membrane segment binds to the compound of the invention, the therapeutic composition of the invention is reconstituted. Administered in the form of posomes or micelles And are preferred. The liposomes and micelles of the invention can be used to remove cells from the extracellular space of cells. The compound can be transported into the intracellular space. Combined with liposome or micelle The concentration of the compound of the invention combined is such that it delivers a sufficient amount of the compound to the cells, As a result, an amount effective to regulate signal transduction in such cells is included. You.   The therapeutic composition of the invention comprises at least one of the compounds of the invention described above, And at least one additional therapeutic agent capable of further modulating signal transduction Compositions can also be included. As described in greater detail above, the AR of the present invention H1 peptide can regulate early events in signal transduction pathway . The ARH1 peptide of the present invention issrc-Family tyrosine kinases orsyk -Can regulate the activity of tyrosine kinases of the family Synkinase regulates the activity of membrane-bound molecules. As described above, the present invention ARH1 peptide (Shc-selective peptide or PI-3K-selective peptide Or the high Pro peptide of the present invention is involved in the interaction with the membrane-bound receptor. Can regulate multiple steps in the signal transduction pathway that are not directly involved You. The ARH1 peptide or the high Pro peptide itself is sig Adjust the null conversion phenomenon. Therefore, a person skilled in the art can use the compounds of the present invention to That it may be used in any combination to allow double regulation of conversion. It has recognized. For example, the therapeutic composition of the present invention comprises at least one A of the present invention. It may comprise an RH1 peptide and at least one high Pro peptide of the invention. it can. At least the therapeutic composition of the present invention can stimulate intracellular signal transduction Inhibits one phosphorylated ARH1 peptide and intracellular signal transduction High Pro peptide, or at least capable of inhibiting intracellular signal transduction One non-phosphorylated ARH1 peptide and a small amount that can inhibit intracellular signal transduction It is preferred to include at least one high Pro peptide.   The therapeutic composition of the present invention may be used in any animal, preferably a mammal, and even further Preferably it can be administered to humans. Therapeutic compositions of the invention in an effective manner Acceptable protocols for the administration of , The frequency of administration of the agent, and the mode of administration. The method of transportation is disease prevention And any method compatible with the treatment. The method of transportation is Buccal, Oral, Intravenous, Topical, Topical or Local Includes local administration (eg by aerosol) or transdermal administration But is not limited to these.   The invention further provides:src-Inhibits stimulation of activation of family tyrosine kinases Also included is a kit for identifying potential compounds. Such kits include: (1) Rosin kinase; (2) the compound of the present invention capable of stimulating the activity of tyrosine kinase And (3) a method for measuring the activity of a tyrosine kinase. example In the kitsrcTo be modified by a family tyrosine kinase Possible initial target molecules and means for detecting such modifications. By modifying the kits of the present invention to identify inhibitory compounds by Within the technical scope of the person. Tyrosine kinase activity Can be measured by measuring autophosphorylation or modification of the initial target molecule It is possible.   In one aspect, the kit of the invention comprises: (1) of the inventionsrc-Family Tiroshi Kinase and (2) stimulatory ARH1 peptide; and (3) desired Sufficient γ-32Includes P-ATP. The kit of the present invention comprises:src -Family tyrosine kinases Fyn, Lyn, Lck, Blk, Syk, Y es, Btk, Hck, Src, Zap70, or any combination thereof A combination, more preferably Fyn or Lyn, or any of them Combinations, and even more preferably Fyn, although they may be included It is not limited to Suitable stimulatory ARH1 peptides of the invention are disclosed herein. Phosphorylated ARH1 peptide. The kit of the invention comprises the sequence YEGLNLD It is preferable to include a phosphorylated ARH1 peptide having DCSMYEDI, More preferably in the column NLYEGLNLDDCSMYEDI.src− Γ-into the tyrosine kinase of Amilly32To detect uptake of P-ATP Any of the means may be included in the kit, such means being For example, a means for phosphocellulose blotting. In another aspect, the kit of the invention comprises It can further include any peptide having a rosin residue. Such a bae The peptide preferably comprises the amino acid sequence RRGKGHDGLYQGL.   In another aspect, the kit of the invention comprises autophosphorylation or phosphate of an early target molecule. Specificity to phosphotyrosine residues to be used as a means to detect activation Can include the body. Phosphorylated or non-phosphorylated target molecules are anti-phosphotidies. Surfaces (eg nitrocellulose or ELI) before or after addition of rosin antibody SA plate). For example, antibody binding is fluorescent display cell sorting By FACS analysis If you plan to analyze, the target molecule may remain unbound after adding the antibody. It is possible. The kit of the present invention is further for detecting the binding of an antibody to its target molecule. Can be included. This developing component binds to the antibody May be included, which is linked to a detectable label. Connectivity The compound is a second anti-body that can bind to the first antibody when the first antibody binds to the target molecule. Body; bacterial surface proteins that bind to antibodies (eg, protein A or protein) G); Biotin-streptavidin or biotin-avidin linked detection system Cells that interact with the antibody (eg, T cells or B cells, or macrophages); Eukaryotic cell surface proteins that bind to antibodies (eg FC receptors) As well as, but not limited to, complement proteins. detection Mutants of labels for use can be used, including radioactive labels and enzymatic labels. , And fluorescent labels. Label detection It can be achieved by using various well-known techniques depending on a. Enzyme Asse B (for example, alkaline phosphatase or Caliciper oxidase Use), either visually or, for example, with a densitometer or spectrophotometer. To produce a colorimetric product that can be detected by a device such as a meter. And often. The kit of the present invention further performs immunoprecipitation and immunoblot analysis. It is possible to include reagents for applying.   In another feature and aspect of the invention, the kit comprises: (1) tyrosine kinase (2) A high proline protein; and (3) an initial target molecule. The kit of the present inventionsrc -Family tyrosine kinases Fyn, Lyn, Lck, Blk, Syk, Y es, Btk, Hck, Src, Zap70, Or, it is preferable to include a combination thereof, and more preferable Is Fyn, Lyn, Blk, Lck, Hck, Src, Yes, or those A combination of any of, and even more preferably Lyn or Fyn, Alternatively, it includes, but is not limited to, a combination thereof. Suitable high power Lorin proteins include but are not limited to PI-3K and p85 [80-104]. Not determined. The initial target molecule is a protein or lipid capable of undergoing phosphorylation And more preferably lipid molecules, and even more preferably lipid molecules. Kuha phosphatidylinositol, 4-phosphate phosphatidylinositol, 4 , 5-phosphatidylinositol diphosphate, or a combination thereof Including. Any means for detecting phosphorylation of the target molecule is included in the kit. Examples of such means include those for thin layer chromatography analysis. is there. Such kits competitively block the activity of tyrosine kinase / target molecule binding. It is used to discover suitable compounds of the invention which can be harmful.   The kit of the present invention is an automated system that requires each step to be performed by research techniques. It can be used in the system or in a manual system. This test kit is In addition, all appropriate reaction relaxations required to maintain the enzymatic activity of tyrosine kinase It may also contain an impulsive liquid.   The kit of the invention is involved in the immune response, especially in B and T cells It is particularly useful for identifying therapeutic compositions that can modulate intracellular signal transduction. Especially Useful compounds bind to tyrosine kinases, adapter molecules, or lipid kinases. Compounds which combine and / or activate them, and which compounds are They have low specificity due to their high specificity It becomes possible to administer in a dose.   Another aspect of the invention is to identify compounds that can inhibit intracellular signal transduction. It is a method of In one embodiment of the present invention, the inhibitory compound is: (a) tyrosine quina Contacting the enzyme with a hypothetical inhibitory compound to form a reaction mixture; (b) Contacting the reaction mixture of claim 1 with a stimulatory ARH1 peptide of the invention; and (c ) The ability of the hypothetical inhibitory compound to inhibit tyrosine kinase autophosphorylation Can be identified by a method including a determining step. Chi used in the present invention Rosin kinasesrc-Family tyrosine kinases Fyn, Lyn, Lc k, Blk, Syk, Yes, Btk, Hck, Src, Zap70, or It is preferred to include a combination of any of them, more preferably Fyn , Lyn, or Blk, or any combination thereof, and Even more preferably it contains Btk or Fyn, or a combination thereof. However, it is not limited to them. Suitable stimulatory ARH1 peptides are described herein Included are the disclosed phosphorylated ARH1 peptides.   In another aspect, the inhibitory compound is a target molecule capable of undergoing phosphorylation by a kinase. To identify by contacting with a tyrosine kinase to form a reaction mixture Can be. The reaction mixture is then contacted with a hypothetical inhibitory compound and assayed. A mixture is formed. The stimulatory ARH1 peptide of the invention is then assayed in Is added to the mixture, and the hypothetical inhibitory compound is The ability to inhibit phosphorylation of its target molecule is measured.   For another feature and aspect of the invention, the inhibitory compound is: (a) Contacting rosin kinase with a hypothetical inhibitory compound to form a reaction mixture (B) contacting the reaction mixture with a proline-rich protein to form an assay mixture (C) subjecting the assay mixture to modification by its tyrosine kinase. Contacting with an initial target sequence capable of severing; and (d) its hypothetical inhibition. Determines the ability of a sex compound to inhibit its modification of target molecules by tyrosine kinases Can be identified by a method including the step of Suitable tyrosine kinase TosrcA family of tyrosine kinases, preferably the kinase Fy n, Lyn, Lck, Blk, Syk, Yes, Btk, Hck, Src, Za p70, or any combination thereof, more preferably Fyn, L yn, or Btk, or any mixture thereof, and even more preferred Preferably it includes Btk or Fyn, but is not limited thereto. The present invention It is preferred that the high proline protein useful in the method of However, it is not limited to this. A protein or a protein that can undergo phosphorylation of an early target molecule Preferably comprises a lipid molecule, more preferably a lipid molecule, and Phosphatidylinositol, 4-phosphate phosphatidylinositol, 4, Includes phosphatidylinositol 5-diphosphate or a combination thereof It is even more preferable. Methods for detecting alteration of the initial target molecule include, for example: , Phosphocellulose blots or thin layer chromatography.   Another aspect of the invention is the identification of compounds capable of modulating signal transduction. Methods using cell-based assays are included. In some embodiments, signal transduction is stimulated. Based on the cells of the present invention useful for identification of potential compounds The assay is: (a) allows the compound to enter the cell Contacting the compound with a virtual stimulatory compound in a manner Incubating to allow the compound to associate with the appropriate intracellular molecule (C) lysing the cell; and (d) the intracellular molecule bound to the compound. Determining the stage of phosphorylation. Suitable cells include mammalian cells However, it is not limited to this. Suitable intracellular moleculessrc-Family Tiroshi Kinases, especially Lyn, Fyn, Lck, Blk, Syk, Yes, Btk, Includes, but is not limited to, Hck, Src, and Zap70. cell A method for determining the phosphorylation status of the inner molecule is an ELISA assay or FACS analysis is included. Lysed cells bound to an ELISA plate It is preferable to be able to contact with an antibody specific to the inner molecule. That pre The label was washed and then attached with a label as detailed above. It may be contacted with an anti-phosphotrypsin antibody. Bound to an ELISA plate The amount of anti-phosphotrypsin antibody was measured and the cells were stimulated by the hypothetical stimulatory compound. The degree of phosphorylation of the inner molecule and thus the stimulation can be determined. Other methods for determining the phosphorylation status of intracellular molecules are specific to intracellular molecules. Contacting the soluble antibody with the lysed cells in solution. Anti-phosphot Lipsin antibody can be added to the solution and analyzed by FACS analysis. Wear. The anti-phosphotrypsin antibody may have a fluorescent label, or A sensible second antibody may be added to the solution.   In another aspect, the cell-based assay of the invention comprises signal transduction. It is useful for identifying compounds that can inhibit. The cell-based assay of the invention is: ( a) contacting the cell with a hypothetical inhibitory compound; (b) co-administering the compound with the cell Incubating the compound so that it can bind to an intracellular molecule; (c ) Linking membrane-bound receptors on the cell surface; (d) lysing the cell And (e) the intracellular protein phosphorus bound to its hypothetical inhibitory molecule. Determining the state of oxidation. Suitable cells include mammalian cells Including but not limited to. Suitable intracellular molecules are Lyn, Fyn, Lc Includes k, Blk, Syk, Yes, Btk, Hck, Src, and Zap70. However, the present invention is not limited to these. The state of phosphorylation of intracellular proteins It can be determined using the method described in detail immediately above.   In yet another aspect, the cell-based assay of the present invention comprises: Contacting with an inhibitory compound; (b) combining the compound and the cell with the compound Incubating so as to bind to intracellular molecules; (c) on the cell surface Connecting the membrane-bound receptor; and (d) the hypothetical inhibitory molecule is intracellular Determining the ability of the to inhibit calcium mobilization. Appropriate Such cells include, but are not limited to, mammalian cells. Appropriate virtual adjustment The molecule can be Syk-selective, Shc-selective, or PI-3K selected according to the invention. Included are mimetics of specific peptides. Calcium fluidity is Justment et al. J. Immunol. 143: 881-886, 1986. It is possible to measure using the method generally described in.   In yet another aspect, the cell-based assay of the invention comprises: (a) cells Contacting the compound with a hypothetical inhibitory compound; (b) the compound and the cell Incubating the compound of claim 1 to bind to an intracellular molecule; (c) a cell Linking membrane-bound receptors on the surface; and (d) a hypothetical inhibitory molecule. Determining the ability of the cell to inhibit phosphorylated phosphoinositide formation in the cell. Can be removed. Suitable cells include, but are not limited to, mammalian cells. Yes. Formation of phosphorylated phosphoinositides is described by Ransom et al. (J.I mmunol. 137: 708-715, 1986). It can be measured using a method.   In a preferred embodiment, cells used in the cell-based assay of the invention Are permeabilized prior to contacting the cells with a hypothetical inhibitory compound . Techniques for permeabilizing cells for use in the assays of the invention are The examples are described below.   The following examples are provided for purposes of illustration and are intended to limit the scope of the invention. Not illustrated.                                 Example Example 1   This example demonstrates that the binding specificity of Ig-α and Ig-β is preserved in the ARH1 motif. Explain that it can be determined by the four amino acids that exist between the retained tyrosine I will tell.   A series of Ig-α and Ig-β switch stacks with exchanged regions of diversity sequence. Natural mutants were constructed (Fig. 3, shown in bold). Ig-α and Ig Mutagenesis or cleavage of the cytoplasmic tail of -β is associated with Ig-α and Ig-β Chain reaction using other cDNA templates Achieved using (PCR) amplification. Oligonucleotide specific for each mutant Doprimer, 1.5 mM Mg2+Used in a standard PCR reaction mixture containing Then, it was subjected to a cycle of 25 to 30 times (94 °, 55 °, 72 ° C, 1 minute each). Inside Subnucleotide exchange mutagenesis or point mutagenesis The production of DNA fragments contained within the 5'or 3'sequences of the overlapping sequences was required. These fragments are joined together and then followed by complementary flanking primers. Amplified. Ig-αHTAnd Ig-βQTATSwitch mutant, and Y 182ΔF and Y193ΔF tyrosine mutants were prepared by the manufacturer (Biorad). Site-directed mutagenesis using a kit recommended by the same company.   The oligonucleotides listed below were used for mutagenesis. Mutation Restriction sites (underlined , Which facilitated cloning. The truncation mutant Prepared using the following primers: Switch mutants were made using the following primers: Tyrosine mutants were constructed using the Ig-α ARH1 primer listed above with the following Made using in combination with Limer: Point mutants were prepared using the Ig-α ARH1 primer listed above with the following primer: Was used in combination with: PCR products encoding the Ig-α and Ig-β mutants listed above were Overnight at 25 ° C,BamHI andEcoRI digested and 3% Nu Electrophoresis through Sieve agarose (FMC BioProducts) And separated by MERmaid (BIO 101). Ig- The fusion proteins of the α and Ig-β mutants areBamHI andEcoRI The digested PCR productBamHI /EcoRI digested pGEX-3X (P (Harmcia), and the resulting recombinant molecule is bacterium DH5α. It was produced by transforming in. Ampicillin (100 μg / Ml) and the selected transformants are screened using PCR , And the plasmid DNA using a tip-100 column (QIAGEN) Purified. For double-stranded DNA, Sequenase Version 2 . 0 (USB company), and pGEX-3X (5'-GCATGGCCTTTG) Direct sequencing was performed using the primers for CAGGG-3 ').   Transformed cells producing the appropriate Ig-α and Ig-β fusion proteins 1 liter of log phase cells (OD 595 = 0.375) was added to 0.2 Induction with mM isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) for 3 hours The fusion protein was prepared by introducing. Harvest the culture and centrifuge the cells Pelletized by separation. this Cell pellet was 5 ml phosphate buffered with 1% Triton X-100. Resuspend in saline (PBS), dissolve by sonication, and dissolve The material was clarified by centrifugation. The clarified lysate was added to 500 μl of Glutathi. With a 50:50 slurry of on-Sepharose beads Incubate overnight at 4 ° C and then 1% Triton X-100. And thoroughly washed with PBS containing 0.02% sodium azide. Bead body The relative amount of fusion protein bound per product was determined by reducing SDS-PAGE and Cooma. It was quantified by staining with Sea blue (Coomassie blue). how many Of the fusion protein, followed by 150 mM NaCl and 1 mM CaCl2During ~ 30 μg of Factor Xa (Boehringer Mannheim) for 4 nights It was cleaved at ℃. The cleaved peptide was washed out from the beads in a total volume of 4 ml. , Concentrated, and equivalent peptide moles vs. bead for all cleaved peptides. Cyanogen Bromide-Activated Sepharose Bi (Pharmacia) 400 μl of 50:50 slurry. (2 hours at room temperature). The remaining reactive group is 0.2 M glycine for an additional 2 hours at room temperature. Blocked by incubating the beads in. Thoroughly these beads To remove unbound peptide and wash with 0.02% sodium azide. Stored in lysis buffer containing.   Various Ig-α and Ig-β mutant fusion proteinssrc-Of the family The ability to bind tyrosine kinase, binding assay and in vitro kinase Tested using the assay. B lymphoma cell K46 or fibroblast F yn+NIH-3T3 was recovered by centrifugation [2 x 10 per sample7(K46) or 1-3 × 106(Fyn+NIH- 3T3) cells], and 1 ml of lysis buffer [0.5% NP-40, 1, 50 ml NaCl, 10 mM Tris, 2 mM sodium orthovanadate 10 mM sodium pyrophosphate, 0.4 mM EDTA, 10 mM NaF 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and 2 μg / each ml aprotinin, leupepsin, and α-1-antitrypsin]. I understand. Beads coated with clarified lysate with complete fusion protein or peptide With (5-10 μl of 50:50 slurry) for 4 hours at 25 ° C. or overnight at 4 ° C. Incubated. After adsorption, wash the beads 3 times with 1 ml of lysis buffer And analyzed by various methods.   Ig-α and Ig-β mutant fusion proteins have tyrosine kinase activity The ability to bind to proteins, i.e., an in vitro kinase assay was performed. This The in vitro kinase assay of 2 times the adsorbate (prepared as described above), 1 ml of kinase buffer [10 ml MgCl 2210 mM HEPES (p H7.0), 2 mM sodium orthovanadate, and 1 mM PMSF] Washed in, pelletized and 10 μCi γ-32P ATP, 3000 Ci / resuspended in 20 μl of kinase buffer containing 30 mm and 10 min at 30 ° C. Incubated at. The sample is then washed in lysis buffer and 3 Resuspended in 0 μl of reducing sample buffer. Equal amount of protein at 10% SDS -Autoradiography separated by PAGE and 1-2 hours at -70 ° C Detection was performed. The result is shown in FIG. Each switch mutant The parent chain (Ig-α or Ig-β) of Is designated by an amino acid from the other chain that the mutant of. The first preserved Chiro When a non-conserved amino acid residue amino-terminal exchange to syn occurs (Ig-α: HT / Ig-β: NL), no effect was observed on the binding properties of either chain. (FIG. 4). If four non-conserved residues between ARH1 tyrosine resulted in an exchange (DCSM of Ig-α instead of QTAT of Ig-β), Ig-α is wild-type Ig- It no longer binds to clusters of proteins in the 50-60 kD capacity range that bind α. Similarly, a sudden change in Ig-β switch containing the four amino acids of Ig-α (DCSM). The variant in turn binds to this cluster of proteins.   Binds to Ig-α and Ig-βsrc-Of the family tyrosine kinases To further investigate specificity, wild type, Ig-α (QTAT) or Ig-β Using a synthetic peptide corresponding to any of the (DCSM) switch mutants, F NIH-3T3 cells overexpressing yn (Fyn+NIH-3T3) lysate I searched.   Fyn immunoblot analysis was performed as follows. Inhalation prepared as described above The kimono was eluted with SDS-PAGE sample buffer and reductive SDS-PAGE. Separated by E and transferred to nitrocellulose. The metastases, Tris Buffered saline (TBS) [10 mM Tris (pH 8.0) and 150 mM   NaCI] 3% nonfat dry milk for 4 hours, blocked at 25 ° C, and milk-T Rabbit anti-Fyn antibody diluted 1: 500 to 1: 1000 in BS for 2 hours, Hybridized at 25 ° C. After the incubation, the membrane was washed with TBS, if Or alternately with TBS containing 0.05% Triton X-100 several times,125 Incubate with -I labeled Protein A for 1 hour at 25 ° C, Washed again and immunoreactivity visualized by autoradiography. Alternatively, the radioactivity can be measured by the Molecular Dynamic's Phosph. Using orlmager with ImageQuant version 3.22 And quantified. Immunoblot is a monoclonal α-phosphotyrosine antibody Ab -2 (Oncogene Science) was also used. These things An example is 3% low phosphate bovine albumin in TBS (ICN Biomedi cals, Inc. Company) was used instead of non-fat dry milk. Some immune bro In the experiment, goat anti-rabbit antibody conjugated with alkaline phosphatase was used. these Blots in 100 mM Tris, pH 9.5, Vector II kit. Color (Vector Laboratories Inc.) Was.   As shown in FIG. 5, immunoreactive Fyn binding to various peptides was detected. Ability to detect is 50 and 59k detectable by in vitro kinase label It paralleled the ability of each motif to bind to the Da protein (Fig. 4). The smaller one The immunoreactive band represents the degradation product of Fyn. Ig-α aspartic acid, cis Fusion protein in which thein, serine, and methionine are individually changed to alanine Were also made (as described above) and their binding activity assessed. DCSM point The mutant GST fusion protein was cleaved with Factor Xa to give Sepharose (Sepha rose) and used therewith to produce Fyn as described in Example 1.+NI H3T3 cell lysate was adsorbed. Image the adsorbate as before, and Electrophoretic metastases were probed with anti-Fyn. As shown in FIG. Any of the acid changes have no effect on binding. It didn't reach.   Taken together, these results indicate that binding of the ARH1 motif to Fyn and It is the overall structure of the ARH1 region that contributes to the activation of Fyn, No acid is shown. Changes or deletions of two or more amino acids The mutations involved in must be necessary for functional disruption. In addition, Ig -Α ARH1 motif determines binding specificity for Lyn and Fyn It contains a sequence of 4 amino acids.Example 2   This example demonstrates that tyrosine in the ARH1 domain of Ig-α binds to Fyn. Indicates that it is not mandatory for.   As previously described, the two conserved ARH1 tyrosine of Ig-α (position 182 and 193) as well as a third non-conservative tyrosine (position 176) is described in Example 1. Was mutated to phenylalanine using the method described below. The position of tyrosine is as follows: The ability of these mutants to bind the Fyn protein was demonstrated in Example 1 It was assayed using the Nvitrokinase assay. The adsorbate is described in Example 1. And then [γ-32P] -in with ATP Incubated, washed and analyzed by 10% reductive SDS-PAGE, Then I went to autoradiography.   The results of a typical experiment are shown in FIG. Substitute for tyrosine in all these positions The substitution of phenylalanine for the stable binding of Ig-α cytoplasmic domain to Fyn It did not affect his ability to play. Wild-type protein and Ig-α tyrosine mutation Chemical fusion protein is Fyn+Fyn immunoprecipitated from lysates of NIH3T3 cells A comparison was made between the ability to bind. Wild-type Ig-α ARH1 fusion protein, if Or a fusion protein in which all three tyrosines are mutated to phenylalanine. No difference was found in the amount of immunoreactive Fyn bound (Fig. 8). This These data indicate that Fyn is fundamentally bound to the ARH1 motif of Ig-α. They are independent of their tyrosine and therefore depend on their phosphorylation It shows that there is no possibility.Example 3   In this example, tyrosine phosphorylation of the Ig-α ARH1 motif is linked to Fyn. Is shown to specifically increase its binding properties.   To create a phosphorylated Ig-α ARH1 motif, tyrosine The catalytic domain of the enzyme Elk to the T7 polymerase promoter and chloram It was cloned into the expression vector pBC utilizing a phenicol resistance marker. this The construct was labeled with cDNA encoding T7 polymerase under the control of the lac promoter. A was transfected into the bacterial strain BL21 / DE3. Then Ig- α-ARH1 wild type as well as Ig-α ARH1 tyrosine bumps containing fusion protein Natural mutants were isolated by derivatization with isopropylthio-β-D-galactoside. Was expressed and phosphorylated in the bacterium.   The catalytic domain of the tyrosine kinase Elk is represented by Dr. Tony Pawson ( Provided by the University of Toronto The following oligonucleotide primers from the cDNA: 5'-AAGAGGATCCGGTGGCCATGGAAGCTGTCCGGGAGTTTGC-3 ′ and 5′-AAGAGAATTCGAGT It was amplified using PCR amplification with TCTCATGCCATTACCGACGG-3 '. This PCR The product was purified as described in Example 1, pBC (Stratagene). And transformed into the bacterium BL21 / DE3. Chlora Selected on Mufenicol (20 μg / ml) and at 0.2 mM IPTG Derivatized transformants (as described above) were used to reduce total bacterial lysates with reducing S Separation by DS-PAGE, transfer to nitrocellulose, and α-phosphine Immunization with phototyrosine antibody Ab-2 (Oncogene Science) Bacterial proteins were phosphated by performing lots (as described in Example 1). Screening was performed for their ability to metabolize. Select positive clones And then by electroporation Ig-α ARH1 (truncated wild type) Or transformed with a plasmid encoding an Ig-α ARH1 tyrosine mutant. I let it. The double transformants were treated with chloramphenicol (20 μg / ml) and Simultaneous selection on pyricin (100 μg / ml) and subsequent derivatization Express a GST-fusion protein that is phosphorylated by Elk in vivo at 2-5% I let it. This mixed fusion is used to separate phosphorylated products from unphosphorylated products. About 40 mg of the protein was loaded onto an α-phosphotyrosine affinity column (14 mg / ml Sepha- IG2 on Sepharose, Dr. Ray Frackelton , Brown University). After that The column of phosphate buffered saline [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPOFour, And 1.4m M KH2POFour(PH 7.4)], and the phosphorylated fusion protein is added to 0.1 Elute with N acetic acid. The phosphorylated fusion protein eluate was treated with 1 M Tris (pH 9. 0), dialyzed against phosphate-buffered saline, and glutathione sef Incubate with Sepharose at 4 ° C. overnight. afterwards The relative amount of phosphorylated fusion protein bound per bead volume was described in Example 1. It was quantified according to the procedure described below.   Cleavage of the Ig-α ARH1 phosphorylated fusion protein with factor Xa and subsequent S GST fusion partner by DS-PAGE and anti-phosphotyrosine immunoblot It was shown that the ARH1 tail but not the tyrosine phosphorylation. The point -Phosphorylation of the tyrosine phosphorylated fraction of ARH1 wild-type fusion protein expressed in Escherichia coli Further purification using a tyrosine affinity column and subsequent glutathione sepha It was bound to Sepharose beads. This fraction is the total fusion protein It accounted for only about 2 to 5 percent. Then equal amount of phosphorylation And non-phosphorylated fusion proteins, they are Fyn+NP40 of NIH3T3 cells Assays for the ability to bind Fyn from the lysate were performed (see Example 1). (As posted). Fyn with anti-Fyn antibody+Fy from NIH3T3 cells n was immunoprecipitated. This immunoprecipitated Fyn is unphosphorylated or phosphorylated AR Incubated with H1 Ig-α fusion protein. 10% of washed adsorbate Separated by reducing SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose . The blot was then subjected to rabbit anti-Fyn antiserum and125I-Protein A I searched in. As shown in FIG. 9, it is about 10 times higher than that of non-phosphorylated motif. Most immunoreactive Fyn bound to the phosphorylated Ig-α ARH1 motif.   To determine the relative role of reactive phosphotyrosines in enhancing Fyn binding Therefore, tyrosine residues 182 or 193 or both may be non-phosphorylated. Is an Ig-α ARH1 motif (residue: 171) that has undergone either phosphorylation. ~ 196) corresponding peptide (Applied BioSystem) was synthesized. (using ms model 430A). Amino acid hydrolysis of peptide sequence and purity Confirmed by decomposition analysis (Waters Associates Pico- Tag system). Stoichiometry at specific residues through the use of synthetic phosphopeptides Phosphorylation was reliably performed. These peptides are Sepharose (Sepha) rose) covalently linked to beads (for peptides derived from fusion proteins (As described), and Fyn+Used for adsorption of NIH3T3 cell lysate Was. Anti-Fyn immunoprecipitates were analyzed as a positive control (Figure 10, "anti-Fyn"). label). The washed adsorbate was separated by 10% reductive SDS-PAGE, Then it was transferred to nitrocellulose. After that, the blot against Fyn Antibody and125Sequential searches with I-Protein A were performed. Wash the blot Were subjected to autoradiography. The results shown in FIG. 10 show that Ig-α peptide Shows that Fyn binding to all of the was detected by immunoblot. single The amount of Fyn bound to the phosphorylated peptide is compared to the unphosphorylated peptide It increased 2.0 times (Y182) and 1.6 times (193) (Phospho (measured using rImager). Binds to the double phosphorylated peptide The amount of Fyn increased 24 times.   Further details of the possibility that the novel protein binds to phosphorylated Ig-α To illustrate, the adsorbate from K46 lysate was analyzed in vitro. It was analyzed by the enzyme reaction and SDS-PAGE. In vitro phosphorylation of adsorbate And 10% reductive SDS-PA according to the method described in Example 1. Analyzed by GE and autoradiography. As shown in FIG. Identification of a novel protein capable of phosphorylation that binds to phosphorylated Ig-α peptide There was no white evidence.Example 4   This example demonstrates that both tyrosine phosphorylated Ig-α and Ig-β ARH1 models. It is shown that the chief exhibits hyperevolving Fyn binding activity.   Ig-β and Ig-α A in which both ARH1 tyrosine are phosphorylated The RH1 motif peptide was synthesized as described in Example 1. These phosphorus The oxidized peptide and additional non-phosphorylated Ig-α ARH1 peptide were separated by Sephalow. It was ligated to Sepharose and used to analyze the binding properties of Fyn. Synthetic double-phosphorylated Ig-α ARH1 motif peptide, as well as non-phosphorylated Fyn with Ig-α and Ig-β ARH1 motif peptides+NIH3T 3 cell lysates were adsorbed. The adsorbate was fractionated by SDS-PAGE and transferred. And rabbit anti-Fyn and I125Blots made with protein A . As shown in FIG. 12, phosphorylated Ig-α was compared to unphosphorylated Ig-α. By comparison, it bound to Fyn more effectively. Ig-β is phosphorylated Ig-α It bound to Fyn with efficiency of identification. These results show that phosphotyrosine-dependent The specificity of the interaction may be determined by the QTAT or DCSM motifs. Suggested not.Example 5   In this example, the specific enzymatic activity of Fyn was converted to phosphorylated Ig-α. It is shown to increase upon binding of.   To determine the catalytic activity of immunoreactive Fyn binding to Ig-α peptide, Fyn using a peptide-based in vitro kinase assay+NIH3T3 Lysates (prepared as described in Example 1) were added to Ig-α ARH1 adsorbate. Activity was measured. The peptide tyrosine 182 or tyrosine 193, is Or non-phosphorylated Ig-α or Ig in which 182 plus 193 is phosphorylated -Β was used in this experiment. Fyn is a rabbit anti-Fyn antibody (5 μg antibody / sample ) And protein A Sepharose (Pharmaci) Fy) by sequential 1 hour incubation at 25 ° C. n+NIH3T3 (about 2 × 106Cell equivalent / sample) immunoprecipitated from cell lysate I let you. Equal amount of bead-bound adsorbate (prepared as described above) or Fyn immunization Precipitate (preliminary with phosphorylated Ig-α peptide at a concentration of 1 μM to 1 mM for 1 hour (After incubation), washed twice with kinase buffer, pelleted, and 2 mM exogenous targeting moiety corresponding to a portion of the TCR-ζ chain surrounding rosin 142 Offspring (RRGKGHDGLYQGL), 10 μM ATP, and 10 μCi [ γ-3250 μl of kinase buffer containing P] ATP (3000 Ci / mM) Resuspended in and incubated at 30 ° C. for 10 minutes. After that, each reaction mixture The mixture was quenched with 12 μl of 25% trichloroacetic acid, and Whatm blotted onto an P81 phosphocellulose. Then blot 75 It was washed several times in mM phosphoric acid and dried with acetone. Dried broth Beckman (model LS5801) beta scintillation counter -By liquid scintillation on Counted.   An equal volume of sample previously tested for immunoreactive Fyn was tested for kinase activity. The enzyme activity curve was one It was correlated with the level (see Figure 13). Relative increase in immunoreactive Fyn Relative addition (24-fold) and Fyn enzyme activity bound to double-phosphorylated Ig-α There is a contradiction between the increased amount (> 60 fold) and this Bound Fyn is more catalytically active than that bound to non-phosphorylated Ig-α Is suggested to be strong.   To quantify this marked enhancement of Fyn activity by phosphorylated Ig-α And the ability of Ig-α phosphoro-ARH1 peptide to activate Fyn in vitro. The power was analyzed. Fyn+Immunopurified Fyn from NIH3T3 cell lysates (Prepared as described in Example 1) in a constant amount at increasing concentrations of dual phosphorylated Ig -Α, or ARH1 tyrosine 182 or 1 for the purpose of avoiding phosphorylation 93 was added to Ig-α which had previously been converted to phenylalanine. Fyn+N IH3T3 cells (2 x 106Anti-containing Fyn prepared from cell equivalent / sample) Increased amount of phosphorylated Ig-α peptide or tyrosine 182 on Fyn beads And 193 added an equivalent peptide previously converted to phenylalanine, Then, it was incubated at 25 ° C. for 1 hour. Then assay for kinase activity did. As shown in FIG. 14, the specific activity of Fyn is the ink with phosphorylated Ig-α. Incubation with the corresponding Ig-α No increase was seen in the region. The increase in Fyn activity was dose-dependent and saturable Yes, and low concentration (5 μM) It was detectable by the peptide of.   In summary, according to the results described in Examples 1-5, Fyn has the sequence DCSM It is shown that it is possible to bind to the containing ARH1 motif. In addition to that , Phosphorylation of tyrosine residues flanking its DCSM sequence stimulates Fyn Very important.Example 6   This example demonstrates that the peptide inhibits the binding of Lyn and Fyn to PI-3K. It is shown that potency reflects two high proline regions contained within PI-3K.   High proline sequence KKISPPTPKPRPPRPTPVAPGSSKT (p8 5 α-subunit [80-104] and NERQPAPATPPKPPK PPTVA (two pep having p85 α-subunit [229-318] Cide was synthesized. These peptides are from Applied BioSystems. Synthesized on model 430A. Amino acid hydrolysis for peptide sequence and purity Confirmed by analysis (Pico-Ta, Waters Associates) g system, single letter amino acid code: K, lysine; I, isoleucine; S, Serine; P, Proline; T, Threonine; R, Arginine; V, Valine; G, Gu Lysine; N, asparagine; E, glutamic acid; Q, glutamine). p56lyn ([Lyn 1-131]) and p89fyn([Fyn 1-144]) Pep Tide contains the SH3 domain of each of these kinases and renders them cyanogen bromide active. Link to activated Sepharose beads (Pharmacia) Ligation, and using these, p85 [80-104] and p85 [299 -318] present or absent In the presence of PI-3K, detergent lysates of K46 B lymphoma cells were searched. this The directly linked beads were prepared in the following manner. p89fynAnd p56l yn The DNA fragment encoding the SH3 domain of K. Amplified by polymerase chain reaction (PCR) from 6 cDNA templates: Each primer is a unique restriction site (underlined) that facilitates subsequent cloning. Yes,BamHI: GGATCC;EcoRI: GAATTC) You. And then this PCR productBamHI orEcoDigested with either RI And ligated into pGEX-3X (Pharmacia). DNA Sequence analysis was performed to confirm the accuracy of the PCR product (Sequanase).   2.0, U.S.S. S. Biochemical Corp. Company). This pGEX- The 3X construct was transformed into E. coli (Escherichia  coli) Stock DH5a (BRL -Gibco) and added 1 liter of fusion protein. Cells in the logarithmic phase (OD 595 = 0.375) with 0.2 mM isopropyl   It was prepared by induction with β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) for 3 hours. Made. Cultures were harvested and cells were pelleted by centrifugation. this Cell pellets were loaded with 1% Triton X-100 and 0.02% sodium azide. 5 ml phosphate buffer containing thorium Resuspended in saline (PBS) and the fusion protein isolated from the cells.   Then the fusion protein was bound to beads (2 ml of 50:50 slurry) and 150 mM NaCl and 1 mM CaCl2Medium, 30 μM factor Xa ( Cleavage was carried out overnight at 30 ° C. with Boehringer Mannheim. So After cleavage, the cleaved peptide was washed out of the beads in a total volume of 4 ml and the Speed- Concentrated to 2 ml by Vac and then equivalent fusion for all fusion proteins Maintaining the protein number to bead volume ratio, 400 μl of a 50:50 slurry of brominated silica Directly applied to unactivated Sepharose (Pharmacia) It was ligated (2 hours at room temperature). After that, the remaining reactive groups are allowed to react for another 2 hours at room temperature. . Blocked by incubating the beads in 2M glycine. That Later the beads were washed extensively to remove unbound peptide and 0.02 Stored in lysis buffer with% sodium azide.   The binding experiment and the peptide inhibition experiment were performed as follows. K46 cells (trial 1 x 10 per fee7Cell equivalent) clarified lysate [1% NP-40, 150 mM   NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 2.0 mM ortho Sodium vanadate, 10 mM sodium pyrophosphate, 0.4 mM EDT A, 10 mM NaF, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, aprotini (2 mg / ml), leupeptin (2 mg / ml), and α-1-antito Lipsin (2 mg / ml)] and prepared with Fyn [1-144] or L Any fusion protein of yn [1-131] (10 ml of 50:50 slurry) Incubated with beads coated with. High proline pep of p85 Tides were 200, 20, and those of the Lyb and Fyn fusion proteins on beads. Double concentration was added to the adsorbate and incubated overnight. Directly connected Glutathione S transferase (GST) peptide beads adsorbed on Used as. Afterwards, wash these beads 5 times in lysis buffer and Resuspend in buffer and elute by SDS-PAGE (10%). . After that, the protein is transferred to Immobilon (Millipore), And an antibody against p85 (Upstate Biotechnology, I nc. Company). Solubilized cells (1 x 106Clarification from cell equivalent) The lysate was entered as a control (WCL). Membrane, 0.02% Triton Wash thoroughly in Tris buffered saline (TBS) containing X-100, and Rabbit complexed with alkaline phosphatase (Fisher) after incubation Incubated with goat antibody to IgG. Clean the membrane again and With alkaline phosphatase target molecule (Vector Labs) Was. FIG. 15A illustrates p85 peptide binding to Fyn [12-144], and Figure 15B illustrates p85 peptide binding to Lyn [27-131]. fusion When the protein is present at twice the concentration, p85 [80-104] is a PI-3K F It inhibited the binding to yn by about 90% (measured by scanning densitometry). Both p85 [80-104] and p85 [299-318] peptides are Peptides are 20 and 200 times more concentrated than those of the Lyn or Fyn fusion protein. The binding to PI-3K was completely blocked when present in degrees. P85 [299-3 18] The concentration of the peptide is 200 times higher than that of the Fyn fusion protein. PI-3 with Fyn It inhibited the binding of K but showed no detectable inhibition of binding at low concentrations ( FIG. 15A). Similar results were observed using beads linked to SH3 of Lyn. However, the exceptions are both p85 [80-104] and p85 [299-318]. The inhibition was weaker (Fig. 15B), which caused Fyn to be L It is suggested that p85 may have a lower affinity than yn Is done. These findings indicate that recognition of the 80-104 sequence within p85 is PI-3. It is shown to be essential for SH3 binding to K.   High in mediating PI-3K binding to SH3 domains of Lyn and Fyn To determine the sufficiency of the proline p85 sequence, p85 [80-104] and p85 Peptide with 85 [299-318] was labeled with CnBr-activated Sepharose (Sep). Harose) 4B beads and used to lyse K46 cells I searched for things (as described above). Binding by the peptide on the beads The received protein is eluted by boiling in a sample buffer, and SDS-poly Subject to acrylamide electrophoresis (PAGE), transfer to nylon membrane, and Immunoblots with -Fyn and anti-Lyn antibodies were performed. 16A is p Binding of Fyn to 85 [80-104] and p85 [299-318] Is shown. FIG. 16B shows p85 [80-104] and p85 [299-318]. The binding property of Lyn to Ln is shown. P85 [80-104 for Lyn and Fyn ] Was easy to detect. p85 [299-318] peptide is detectable It showed no effective binding activity. Immunoreactive Lyn or Fyn is a mouse It did not bind to a control peptide containing residues 1-18 of the Csk protein. Therefore P Residue 80 of I-3K The high proline region extending to ~ 104 is the Src-family kinase SH to p85. Contains sufficient information to mediate binding of 3.   Direct binding of p85 [80-104] to SH3 domains of Lyn and Fyn. Cleaved Lyn- and Fy to determine if it is a tangential interaction. A bacterial detergent lysate expressing the n-GST fusion protein was added to p85 [80-104]. And with beads linked to p85 [299-318]. Ly with GST n [1-27], Lyn [27-131], Lyn [131-243], and The Fyn [1-27] fusions are Lyn [1-131] and Fyn [1-144]. Was prepared in a similar manner to that described above. p59fynAnd p56lyn A DNA fragment encoding the peptide fragment was prepared using the following primer pair K46c Amplified by polymerase chain reaction (PCR) from DNA: Each primer facilitated subsequent cloning into pGEX-3X. Non-repetitive restriction site (underlined,BamHI: GGATCC;EcoR I: GAATTC;Sma  I: CCCGGG). Each GST- E. coli expressing the fusion protein (Escherichia  coli) DH5α fine Vesicles were recovered from 2 ml of culture. Glutathione-S-transferase (G ST) fusion protein (Lyn [1-27], Lyn [27-131], Lyn [1] 31-243], Fyn [1-27], and Fyn [1-144]). The bacterial lysate was adsorbed with p85 [80-104] (10 μl of 50:50 slurry). ), And the description provided by the manufacturer for the p85 [299-318] peptide. Sepharose (Seph) at a ratio of 2 mg per ml of activated beads according to the requirements. arose) 4B beads. Thoroughly wash the adsorbate with lysis buffer, Resuspend in the same buffer and fractionate by SDS-PAGE (10%). I let you. Proteins were visualized by Coomassie blue staining. p85 [80-10 4] The peptides were determined by Coomassie staining of the gel after SDS-PAGE. Approximately, it bound only to Lyn and Fyn fusion proteins containing SH3 domain (L yn [27-131], Lyn [1-133], and Fyn [1-144]; FIG. 17C). The p85 [299-318] peptide is identical to p85 [80-104]. It bound to one protein (Fig. 17D). Glutathione-S-Sepharose (Sep Harose) beads were adsorbed and each bacterial lysate contained an equal amount of GST fusion protein. It was confirmed to contain white matter (FIG. 17B). Glycine-Sepharose (Sepha Rose) beads for control adsorption on Sepharose beads. It was confirmed that non-specific binding to the antibody did not occur (FIG. 17A). these Depending on the data, p-3 of PI-3K The proline-rich region within the 5 subunit is associated with SH3 domains of Lyn and Fyn. It is shown that it is possible to mediate the selective and direct binding ofExample 7   This example demonstrates the effect of SH3 binding on PI-3K activity.   Antibodies to p85 subunit (1 μl total antiserum, upstate Bi otechnology, Inc. Clarified K46 cells (per sample) 1 × 107Cells). Then 40 μl of immune complex (50 : 50 slurry) Protein A beads (Parmcia) were used for precipitation. Sucking The kimono is washed and divided into equal parts and this is carried out as described in Example 6. Varying concentrations of Lyn prepared by cleavage of the GST-fusion protein with Factor Xa [27-131], Fyn [1-144], or Blk [1-108] Pep Added to lysis buffer containing Tide. After overnight incubation at 4 ° C, The kimono was washed with PAN buffer [100 mM NaCl, 20 mM PIPES pH7, And 2 mg / ml aprotinin]. Then wash 5 μl A 50:50 slurry of clarified beads was treated with 0.2 mg / ml sonicated phosphor. Tidyl inositol (Sigina or Avanti Polar Li pids), 20 mM Hepes (pH 7.2), 5 μCi [γ-32P] Incubate in 10 μl containing ATP and 10 μM ATP for 15 minutes at 30 ° C. I started. The reaction was stopped by the addition of 100 μl 1M HCl and the reaction 200 μl of CHClThree-Extract with methanol (1: 1) and extract the organic phase by 8 Wash with 0 μl HCl-methanol (1: 1) and lyophilize Was. Then add this phospholipid to 2 × 5 μl of CHCl 3.Three-In methanol (1: 1) Silica gel (Silica) pre-soaked in 1% potassium oxalate.   Gel) 60 plate (Sigma) and CHClThree− Methanol-4M NHFourAscending thin layer chroma in a buffer containing OH (9: 7: 2) Separated by topography. Phospholipid standard (Sigma) on the same plate Subjected to the above separation. Radiolabeled lipid was detected by autoradiography. , And Phosphorlmager Scanner and ImageQuant It quantified with software (Molecular Dynamics).   The results are shown in Figure 18. Polypeptides from both Lyn and Fyn SH3, which contains P, increases the activity of PI-3K about 7-fold and 5-fold, respectively, while P3 Blk, which does not bind to I-3K, showed no effect. This activation is about 10 Half maximal limit in the presence of μM peptide and 100 μM p85 Blocked by addition of [80-104]. In the control experiment of Lyn and Fyn A fragment of the N-terminal unique region did not stimulate PI-3K activity. These days The L3 and Fyn SH3 domains directly stimulate PI-3K activity. It has been shown that it can be intense, probably within the p85 subunit. It is thought that this is due to the binding to the high-proline region of. This activation of p85 Knit phosphorylation and binding of phosphotyrosine-containing peptides to p85 It has nothing to do with both. This data shows that antibodies against anti-phosphotyrosine Stimulation of the antigen receptor reported to induce an increase in the p85 sedimentation of P. Phosphorylated with PI-3K rather than with 3K phosphorylation itselfsrc− Family -Kinase and / or C It is suggested that it may reflect increased binding to D19.Example 8   This example demonstrates that S during the activation of PI-3K mediated by the B cell antigen receptor. The significance of the H3-p85 [80-104] interaction is described. PI-3K is Purification unstimulated or stimulated by antibodies specific to B cell antigen receptors Peractivated non-activated B cells (non-activated mouse B cells (p> 1.062) Immunoprecipitated from (Percoll) (isolated by density gradient sedimentation). The activity of the immunoprecipitated PI-3K was then assessed. Linkage of antigen receptors Resulted in an approximately 7-fold increase in PI-3K activity, the increase being maximal at 1 min. The value was reached (Fig. 19). Non-activated B cells were permeabilized to obtain p85 [80-1 04] and p85 [299-318] peptides allow entry into cells And subsequently to antibodies specific for the antigen receptor (anti-IgM and anti-I). It was stimulated with gD) for 1 minute. Cells (5 x 10 per sample7Cells) Mire's buffer [10 mM MnCl22 mM EGTA, And 20 mM CaCl2(Ca up to 30 nM+2Buffered with 1 mM 2-mercaptoethanol, 40 mM HEPES (pH 7.4), and 28 5 μg / ml α-lysophosphatidylcholine, palmitoyl] alone or if Contains 1.4 mM p85 [80-104] and p85 [299-318]. Permeabilization was performed for 1 minute on ice in Mire's buffer. cell Warmed at 37 ° C for 2 minutes and then phosphate buffered saline alone (open bar), or 50 μg / ml of monoclonal anti-IgD (JA12) and anti-IgM (b -7-6) (black-painted bar) containing the phosphate salt solution Incubation was performed at 37 ° C. for 5 minutes in the presence. Then collect cells by centrifugation Solution, dissolved in 1% NP-40 containing buffer (0.5 ml) and 3 on ice. Incubated for 0 minutes. By centrifuging the nuclei (14,000 g, 15 minutes) Removed. 5 μl (50:50 slurry) of protein A-sephalow for each sample 4μ against Sepharose (Pharmacia) and p85 1 antiserum (Upstate Biochemicals Inc.) was added. And incubated overnight at 4 ° C. Remove the adsorbate for dissolving 1% NP-40 It was washed 5 times with a buffer solution and then 2 times with a PAN buffer solution. Then each sediment part Removed minutes (5 μl of 50:50 slurry) and analyzed for PI-3K enzyme activity. All assays were performed.   Stimulation of PI-3K activity by anti-Ig in the presence of p85 [80-104] Incubation was completely blocked (Fig. 19). The p85 [299-318] peptide is PI- There was no detectable effect on receptor-mediated activation of 3K activity. B Essentially identical results were obtained when using the cell lymphoma line K48μm17. Was. Immunoblotting confirmed that equal amounts of p85 were present in each precipitate. Was. Antibodies against phosphotyrosine (Ab-2, Oncogene Science) e) showed no detectable phosphorylation of p85. Was not done. This led to the observed increase in PI-3K activity and subsequent Suggests that the BCR stimulation of Escherichia coli is independent of p85 tyrosine phosphorylation Is done. The activation of PI-3K induced by anti-CD3 stimulation is also tyrosy. It is independent of phosphorylation. Based on these findings, the activity of PI-3K Sulfation is a direct Src-family kinase S Shown via H3 domain binding and subsequent ligation of antigen receptors Be inspired.Example 9   This example demonstrates that Shc binds to Ig-α and Ig-β ARH1 motifs. Indicates that A.Phosphorylated Ig-α and Ig-β ARH1, and non-phosphorylated Shc binding to Ig-α ARH1 motif   The complete cytoplasmic domain and ARH1 motif peptide have been described by Clark et.   al. (EMBO J. 13: 1911-1919, 1994). It was obtained by cleavage from the GST fusion protein expressed by bacteria in the same manner. how many In some cases, the peptide was used as an insulin receptor kinase (Insulin Receptor Kinase) B subunit (BIRK) (Herre ra et al. J. Biol. Chem. 263: 5560-5568 , 1988) and phosphorylated using a truncated recombinant form of . GST peptide on glutathione Sepharose beads Adsorb, and use it for the kinase buffer (50 mM Hepes [pH 7.4], 5 mM MnCl22 mM MgCl22 mM NaThreeVOFour) Wash in 0.5 mM ATP (1 μCi [γ- as a tracer32P] ATP) and And 0.1 units of BIRK (1 unit is a PLCγ1-based peptide RRNP Kiner required to incorporate 1 nmol phosphate / min into GFYVEAN PMP Incubation buffer (0.5 ml) containing I got it. The reaction was allowed to proceed for 12-16 hours at 30 ° C. Then the peptide Factor X G using a (Boehringer Mannheim, Germany) Cleavage from ST and Sepharose beads (Pha Rmacia, Stockholm, Sweden) in direct equimolar amounts. I let you. The phosphorylation stoichiometry was typically 20-25%. Alternatively synthetic Synthesize phosphorylated and non-phosphorylated synthetic peptides from Macromolecular Re sources Inc. (Fort Collins, CO) . The sequence of the ARH1 peptide used is: Met. Phosphorylated tyrosine is indicated by (p).   B lymphoma K46J, J558Lμm3 plasmacytoma, wild type NIH-3T 3, and Fyn+NIH-3T3 fibroblast cell line was treated with 50 U / ml penicillin , 50 μg / ml streptomycin, and 5% inactivated fetal bovine serum (F Cultured in IMDM supplemented with CS). IgM anti-H2kkExpressing K 46J was grown in the presence of 1 mg / ml G418. Nitrophenyl (NP ) -J558Lμm3 expressing a specific receptor was treated with 1 μg / ml of Micorest Presence of perfume, 15 μg / ml hypoxanthine, 250 μg / ml xanthine Cultured under.   Stimulated cells were prepared as follows. K46J cells (50 × 106/ Ml) Anti-μ (b-7-6) mAb (50 μg / ml) for 1 hour, 3 Stimulated at 7 ° C. Logarithmic phase J558Lμm3 plasmacytoma cells (50 x 106/ ml) to NP12-Stimulate with BSA (50 μg / ml) at 37 ° C. for 1 minute, and then Dissolved immediately. Stimulated and unstimulated K46J and J558Lμm3, And NIH-3T3 cells with 1% NP-40 lysis buffer: 1% NP-4 0, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2 μg / ml each of aprotinin, leupepsin, α-1 antitri Pusin, 10 mM NaF, 2 mM NaThreeVOFour, Melt in, and on ice 1 Incubated for 5 minutes. Lysate (0.5 ml) in an Eppendorf tube, x1 It was centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes.   The Ig-α protein was purified from the clarified lysate described above using CNBr-activated Sepharose (S epharose) beads (20 μl at 50% v / v) (Pharmacia Anti-Ig-α antibody (10 μg) directly linked to For immunoprecipitation. The immunoprecipitation mixture was incubated at 4 ° C for 30 minutes. Co-immunoprecipitated protein was first treated with 20 mM p-NPP (0.1 ml) for 3 Elute on ice for 0 min and then add Ig-α to Laemmli sample buffer. Elute with liquid.   Absorption further clarified lysates: peptide-free Sepharose (Seph arose) beads (Con), whole cytoplasmic domain of Ig-α or Ig-β (FCD), CD3-ε, TCR-ζ, or unphosphorylated and phosphorylated (p Ig-α) ARH1 motif peptide, gave. Cell lysate (20 x 10 in 0.5 ml6Cells) for 2 hours at 4 ° C Tathion Sepharose beads (50% v / v 20μ l) (Pharm GST or GST / Grb2 full-length fusion protein (Asia) 10 μg) or CNBr activated Sepharose (Sepharose) (20 μl of 50% v / v) (Pharmacia) With various synthetic peptides and peptides expressed by bacteria (20 μg) Settled. Absorbate was washed rapidly with lysis buffer, and Laemmli sample Elution with buffer for use. Precipitation of GST / SHC-SH2 fusion protein Cef linked with oxidized and phosphorylated ARH1 peptide (10 μg) Using Sepharose beads (6 μl of 50% v / v), Bacterial lysate containing the GST / SHC-SH2 domain fusion protein (0.5 ml ) Was incubated at 4 ° C. for 1 hour.   The immunoprecipitate and adsorbate were fractionated by 10% SDS-PAGE. Minute Transferring the imaged protein onto Immobilon-P membrane (Millipore) And using Tris buffered saline containing 5% bovine serum albumin for 2 hours Shut off for a while. The blot was then incubated with the following antibodies: Noclonal anti-phosphotyrosine (Ab2; Oncogene Science) , Anti-p85, rabbit anti-SHC (UBI), and rabbit anti-Ig-α. . Immune complex formation with anti-SHC and anti-Ig-α antibodies has been demonstrated by alkaline phosphatase. Sphatase was detected using goat anti-rabbit-Ig (SBA). Anti-pT Immune complex formation using the yr antibody was carried out using the horseradish peroxidase goat anti- Detection was performed using mouse-Ig (Biorad, CA).   The results shown in Figure 20 show that the p-NPP eluate was fractionated in equal amounts and anti-S. It shows that an immunoblot with CH was performed. Shown in Figure 21 The result is that Shc is tyrosine phosphorylated Ig-α cytoplasmic domain (Ig-αF CD and pIg-αFCD) and to the ARH1 motif (Ig-αARH1 And pIg-αARH1). Shc phosphorylates tyrosine It bound to Ig-α and Ig-β and to non-phosphorylated Ig-α. Binding is specific Were found to be non-phosphorylated Ig-β, CD3ε, and TC. This is because the binding to the R-ζ ARH1 peptide was not detected at all. in addition In addition, binding of the p85 subunit of PI-3K to non-phosphorylated Ig-α ARH1 Case was not detected. Therefore, this data indicates that Shc is a phosphorylated Ig. -[Alpha] and Ig- [beta] ARH1 peptides, but non-phosphorylated Ig- [beta], Shown to not bind to CD3ε and TCR-ζ ARH1 peptides .   The ability of Shc to bind to non-phosphorylated Ig-α ARH1 peptide is Mutated Ig-α ARH1 peptide in which a residue is replaced by a phenylalanine residue Adsorbing Shc with a peptide (see Clark et al., Supra). ), And immunoblotting with anti-Shc antibody. This These results show that an equal amount of Shc was mutated when compared to the wild type peptide. It is shown that it bound to the peptide. B.S binding to the Ig-α ARH1 motif by two distinct mechanisms hc   Cell lysates were prepared as described in Section A. Adsorption is obtained Clarified lysate was used, which was lysed with tyrosine phosphorylated (p) and unphosphorylated Ig. -Α and Ig-β ARH1 peptide sepharose (Sepharose) beads in the absence of 50 mM p-NNP (-) Alternatively, by incubating in the presence (+), GST / SHC-SH For lysates or bacterial lysates from K46J cells containing the two-domain fusion protein It was carried out. The GST / SHC-SH2 domain fusion is glutathione sepha Adsorbed on Sepharose beads (Glut). This adsorption Proteins were eluted, fractionated, and treated with anti-SHC as described in Section A. (Figure 22a) or anti-phosphotyrosine (anti-pTyr, Figure 22b) antibody Immunoblotting, or Coomassie Brilliant Blue (Coom It was stained with assie brilliant Blue (FIG. 22c).   The results shown in FIG. 22 show that Shc on non-phosphorylated Ig-α ARH1 peptide The binding was shown not to be blocked by p-NPP (Fig. 22a), Show that phosphotyrosine is independent in its interaction . In contrast, p-NPP is Shc to phospho-Ig-β ARH1 peptide. (Fig. 22a). Referring to Figure 22b, an equal amount of Shc Phospho-Ig-α ARH in lysates of stimulated and unstimulated cells (right panel). Was found to bind to 1 peptide, but not to tyrosine phosphorylated Shc. Phospho-Ig-α ARH1 was detected only in the lysate of stimulated cells (left side). panel). Therefore, Shc tyrosine phosphorylation is associated with phospho-Ig-α ARH1 peptides. It has no detectable effect on its ability to bind to the cord. See Figure 22c Then, both tyrosine phosphorylated Ig-α and Ig-β were sensitive to p-NPP. Bound to GST / SHC-SH2 in a manner that they did not bind to GST alone. won. Including GST / SHC-SH2 Additional Coomassie Blue staining in Mulane The absence of the activation band indicates that this binding is direct. You. C.Directed by the amino acid sequence DCSM within the ARH1 motif, and ARH Requires 1-motif tyrosine phosphorylation and binding of src-family kinases Binding of Shc to non-phosphorylated Ig-α ARH1 motif   The DCSM of Ig-α has been replaced by QTAT of Ig-β, and vice versa. The resulting Ig-α and Ig-β switch mutants are described by Clark et. al. , Prepared using the method disclosed in, supra. In addition, the amino acid sequence Mutants containing ACSM, DASM, DCAM, and DCSA were cloned into Clar. k et al. , According to the method disclosed in the above. This result Four amino acid sequences DCSM show non-phosphorylated Ig-α ARH1 on Shc It has been shown to confer specificity for peptide binding. In addition to that, DCS Single amino acid sequence modification to the M sequence destroys the binding of the peptide to Shc Never happened. Therefore, the DCSM sequence within the Ig-α ARH1 motif is Sh bind to c.   In summary, the data so far indicate that Shc is Ig-mediated through the DCSM sequence. It is shown to bind to the α ARH1 motif. This data is further analyzed by Ig-α And the phosphorylation state of the Ig-β ARH1 motif binds to the peptide S It shows that it can affect the ability of hc.Example 10   This example issrc-A family of tyrosine kinases,syk-Fa Specific IT of Millie's tyrosine kinases, adapter molecules, and lipid kinases Shows AM binding. A.Diphosphorylation induces tyrosine phosphorylation in permeabilized B cells ITAM   Non-phosphorylated ITA with motif tyrosine changed to phenylalanine Synthetic peptide corresponding to M or diphosphorylated ITAM was added to HBTU active ester. (Macromolecular Resources Inc., Colorado   State University) using the f-moc chemistry method. . The peptide sequence corresponding to wild type ITAM is: ,. To construct a phosphorylated peptide, phosphotyrosine (Nova B (iochem) was replaced with tyrosine at each position. Peptide for 90 minutes, 90 % TFA, 2.5% aminol, and 2.5% ethane Deprotected by incubation in dithiol, and Purified by high performance liquid chromatography (HPLC) and by mass spectrometry Analysis confirmed the expected mass. If necessary, add peptides to the Cyanogen bromide activity at 2 mg peptide per toll according to the manufacturer's instructions. Activated Sepharose 4B (Pharmacia) Tied. Based on the HPLC analysis of the coupled gel eluate, the coupling efficiency is all cases Was> 90%.   5% fetal bovine serum (Hyclone), streptomycin, penicillin , 2-mercaptoethanol, and Iskoff (with L-glutamine supplemented ( Modified Dulbecco's medium (IMC) DM) at 37 ° C. under 7.5% CO2Centrifuge J558Lμm3 cells passaged in Recovered by separation, washed in IMDM medium without supplement, and Campb ell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 3982-3986, 1991), permeation as described previously. Treated. Briefly, cells (2 x 10 per sample7Cells), 50 0 μl of Mire's buffer (10 mM MnCl 2210 mM MgOAc, 2 mM EGTA, and 296 μM CaCl2[Ca+230 buffered to nM] 1 mM 2-mercaptoethanol, 40 mM H EPES [pH 7.4], and 285 μ / ml α-lysophosphatidylcholine , Palmitoyl) (ITAM peptide alone or in various concentrations (1 μM to 1 mM))) and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Then centrifuge the cells It was recovered by separation and dissolved in 1% NP-40 lysis buffer (0.5 ml). Then, the nuclei were removed by centrifugation (10 minutes at 12,000 × g).   Permeability of increasing concentrations of diphosphorylated pITAM peptide and non-phosphorylated ITAM Added to treated cells. The concentration solution contains 0, 1 μM, 10 μM, 100 μM and 1 mM peptide are included. Cells at different times with their peptides Incubate (including 0, 15 seconds, 30 seconds, 45 seconds, 1 minute, 2 minutes, and 5 minutes) I started. The induction of protein tyrosine phosphorylation was described in Example 9 by immunoblotting. Analyze using the methods listed did.   These results indicate that all pITAMs are J558Lμm, which has been treated with permeability. It was shown that it is possible to induce protein tyrosine phosphorylation in 3 cells . No derivatization was observed in the lysed cells. Measurable induced phosphorylation Observed at 100 μM or higher concentrations of pITAM and at 15 seconds It became observable. Non-phosphorylated ITAM was assayed for total cellular protein tyrosine phosphorylation It had no effect on what was possible. Taken together, these results show that phosphorus All oxidized ITAMs can initiate cellular protein tyrosine phosphorylation. It is shown that the non-phosphorylated peptide is not, while the non-phosphorylated peptide is. B.Activates Lyn but not Syk in permeabilized B cells. I-diphosphorylated ITAM   The method described in Section A was applied to the permeabilized J558Lμm3 cells. Prepared. Thereafter, such cells were treated with 1 mM CDε pITAM pep It was stimulated with tide for 5 minutes. Lysates of stimulated cells were harvested by centrifugation. , Wash them in IMDM medium without supplements, and Buffer solution (1% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris [pH 7 . 5] 2 mM sodium orthovanadate, 1 mM phenylmethyl fluoride Sulfonyl (PMSF), 0.4 mM EDTA, 10 mM NaF, and 1 μg / ml each of aprotinin, leupeptin, and α-1 antitrypsin ). Incubate the lysate on ice for 10 minutes, and Remove particulate nuclei / cytoskeleton components by centrifugation at 12,000 xg for 10 minutes. I left.   After that, Lyn and Sky proteins were added to 2 × 10750μ of lysate from cells g anti-Lyn antibody or 50 μg anti-Sky antibody at 0 ° C. for 1 hour. Incubate to form immune complexes, and then add 5 μl of the lysate. 5 μl Protein A Sepharose (Sepharo) pre-adsorbed with se) (Pharmacia) at 4 ° C. for 2 hours with constant mixing by inversion. The immune complex was recovered by incubating while performing the combination. That The adsorbate was later washed 3 times with 1 ml of ice-cold lysate buffer and 50 μl of reductive solution. Elution was achieved by resuspending in SDS-PAGE sample buffer. 5 samples Boil for 1 min and then run on SDS-PAGE (8 or 10% gel). Then, the SDS-PAGE gel was recommended by the manufacturer (Millipore). Transferred to PVDF membrane using a semi-dry blot apparatus according to the recommended conditions.   A membrane containing the electrophoretically transferred protein was treated with 5% non-fat dry milk or non-lip Tris buffered saline (TBS) containing either bovine bovine serum albumin Blocked overnight at 4 ° C and then first with mouse IgG1Monocrona Le α-phosphotyrosine (1: 1000; AB2, Oncogene Scie nc) antibody. After that, the membrane is TBS or 0.05% T Alternately wash several times with TBS containing Ritton X-100 and Diluted protein A complexed with oxidase (Amersham) Or rat anti-mouse IgG1(Jackson Research Lab s company) and washed again. Enhances immunoreactive protein Chemiluminescence (ECL) detection system (Amersham) Visualized. Then, the membrane was replaced with 100 mM 2-mercaptoethanol, 2%.   56 in a buffer containing SDS and 62.5 mM Tris, pH 6.7 Strip at 30 ° C for 30 minutes, then α-Lyn (1: 500) or α A rediscovery with -Sky (1: 500) antibody was performed.   These results show that the Lyn and Sky immunoprecipitates were treated with anti-phosphotyrosine immunoblot. Lot shows inducible phosphorylation of Lyn but not Sky. It shows that Subsequent immunoblotting with anti-Lyn and anti-Sky antibodies Lyn or S present in the anti-phosphotyrosine blotted sample It was shown that the amount of ky was equivalent.   The immunoprecipitated Lyn or Sky kinase activity was then assayed as follows. Tested using the Nase assay. Immunoprecipitated Lyn and Sky were Vitrokinase buffer (10 mM MgCl210 mM Hepes [pH 7 . 0] in 2 mM sodium orthovanadate, and 1 mM PMSF) Wash twice and Lck kinase autophosphorylation site RRLIEDAEYAA 2 mM exogenous substrate corresponding to a portion of RG, 10 μM ATP, and 10 μ Ci [γ-32P] ATP (New England Nuclear-Dup ont) in 25 μl of Kinase Buffer and resuspend at 30 ° C. Incubated for 10 minutes. Alternatively, 5 μl of SF9-Lyn lysate was used for affinity Used in place of sex-purified Lyn. If necessary, Sf9-Lyn lysate was Pre-incubated with AM peptide (concentration varies from 1 μM to 1 mM) for 1 hour at 4 ° C. Reactions with incubation / substrate / ATP The mix was added. Quench each reaction with trichloroacetic acid (5% final concentration). And blotted onto Whatman p81 phosphocellulose. . The blot was washed 4 times with excess 75 mM phosphoric acid, dried with acetone and And quantified by liquid scintillation spectrophotometry. Sf9-Lyn KmOh And VmaxDetermination of substrate concentration (present in the reaction mix) was 100 μM It is necessary to change to -10 mM.   These results show that the enzyme activity of immunoprecipitated Lyn is CD3ε pI In the cells subjected to osmotic treatment stimulated with TAM peptide, the value was increased 3-fold Showed that the non-phosphorylated CD3ε ITAM peptide had no effect. Is done. Permeabilization alone immunoprecipitated from non-activated J558L μm3 cell lysates. There was no detectable effect on the activity of Lyn when compared to declining Lyn. Did not. Syk activation is not detected in the presence of CD3ε ITAM peptide won. From this result, pITAMsrc-Stimulate family kinases It is shown that it is possible. C.Direct activation of Lyn by diphosphorylated ITAM   Expression of pITAM and pITAM peptide by baculovirus SF9 cells By adding to the Lyn proteinsrc-Family kinase activity Were tested for their ability to regulate directly. Mouse p56lynAll coding areas of DNA from K46 cDNA using the following primers: Amplified by polymerase chain reaction (PCR): The production of the first strand cDNA and the PCR reaction were carried out as described above (Pleima). net et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4268-4272, 1994). And then this PCR productBam  HI and AndNot  Cleavage with I restriction endonuclease, pSK Bluescript (Stratagene, LaJolla, CA) and cloned into The sequence was confirmed by DNA sequence analysis. Then code LynBam   HI /Not  The I fragment was baculovirus expression vector pAcGP67B (Ph armingen). This construct was tested by the manufacturer. Baculogold transfection according to the specifications (Pharmingen) Transfection kit was used to transfect Sf9 cells. Sf9 the cells 00 II maintained in serum-free medium (Gibco) and virus was produced by the manufacturer Subculture was performed according to the protocol (Pharmingen). Lyn protein ( 6 × 10 to prepare Sf9-Lyn)6Sf9 cells with a multiplicity of infection of 5 And infected with the recombinant virus. Infected Sf9 cells were grown for 72 hours, It was later dissolved in 1% NP-40 lysis buffer.   Lyn (1 x 1065 μl of cells / ml whole cell lysate) with pITAM Preincubated, and Lyn was the autophosphorylation site of Lck RRLIE The ability to phosphorylate DAEYAARG was determined by the Kiner described in Section B above. It was assayed using a zease. From these results, L by Ig-α pITAM Activation of yn was both dose-dependent and saturable, while non-phosphorylated Ig It is shown that saturating doses of -α had little effect on Lyn activity. . 6.7 μM Ig- Significant activation was observed with α pITAM. Lyn's VmaxIs 0.0 742 pmol / min / μl (lysate) to 0.137 pmol / min / μl (lysate) While showing a two-fold increase inmRemained unchanged.   Then pITAM Ig-α, Ig-β, TCRζc, CD3ε, FcεR Iγ and FcεRIβ were tested with 300 μM of each peptide. pI The ability of TAM to activate Lyn varied. Ratio of each non-phosphorylated counterpart By comparison, Ig-α pITAM increased Lyn activity 5.1-fold and FcεRI. β-pITAM increases Lyn activity by 3.9-fold, and Ig-β-pITAM increases Ly-activity. n activity increased 3.4-fold, and FcεRIγ pITAM increased Lyn activity by 3 fold. . It was increased by a factor of 1. D.Niphosphorylated ITAM showing specific effector binding activity   PI-3K p85 subunit of various pITAMs, Sky, Lyn, and And Shc binding specificity of 2 mg (peptide) / ml (pITAM peptide 2 × 10 (connecting beads)7Of NP-4 prepared from K46 B lymphoma cells Test by incubating 0 lysates as described in Section A did. After thorough washing in lysis buffer, the pITAM-binding protein is reduced Elute from the beads with SDS-PAGE sample buffer and electrophorese. Subfractionated, transferred to PVDF membrane, and whole rabbit antiserum α-Lyn (1 : 500), α-Syk (1: 500), and α-PI-3K (p85 subunit. Immunoblot using Knit, 1: 1000, UBI), and rabbit The antiserum α-Shc (1: 500, UBI) antibody was affinity purified.   The results shown in FIG. 23 show that Ig-α, Ig-β, and FcER1β p ITAM preferentially binds to Lyn while TCRζ c, CD3ε, and F It is shown that cεRIγ preferentially binds to Syk. pITAM-Shc conclusion The compatibility pattern was similar to that of Lyn, while PI-3K is Fc6RIγ. And showed strong binding to both Ig-α pITAM. This comparative analysis , The specificity of interactions between various pITAM sequences and effector molecules is demonstrated.   While the various aspects of the invention have been described in detail, modifications of these aspects have been published. And it is clear that the applicable method will come to mind to the person skilled in the art. However Such modifications and applications are within the scope of the invention as claimed in the following claims. Should be particularly understood to be included in.

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年６月２０日 【補正内容】 請求の範囲 １． 細胞を、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨのアミノ酸モチーフを有する ペプチドもしくはそのミメトープを含み、かつそのペプチドのサイズが１５〜２ ６アミノ酸残基の範囲にわたる化合物の有効量と接触させることを含む、シグナ ル変換を調節するための方法。 ２． 前記アミノ酸モチーフが、ＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬ ＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱ ＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹ ＸＸΨ、もしくはそれらのミメトープからなる群より選択される配列を含む、請 求の範囲１に記載の方法。 ３． 前記アミノ酸モチーフが、ＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ、ＤＨ ＴＹＥＧＬＮＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩ、ＤＲＬＹＥＥＬＮＨＶＹＳＰＩＹＳＥＬ、 ＤＡＶＹＴＧＬＮＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬ、ＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡ Ｌ、ＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬ、もしくはそれらのミメトープから なる群より選択される配列を含む、請求の範囲１に記載の方法。 ４． アミノ酸モチーフが両方のＹ残基でリン酸化される、請求の範囲１、２ 、もしくは３の内のいずれか一つの方法。 ５． アミノ酸モチーフが、ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼ、脂質キナ ーゼ、およびシグナル変換アダプター分子からなる群より選択される細胞性構成 成分に結合する、請求の範囲１、２、３、もしくは４の内のいずれか一つの方法 。 ６． アミノ酸モチーフが、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅ ｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０からなる群から選択さ れる細胞性構成成分に結合する、請求の範囲１、２、３、４、もしくは５の内の いずれか一つの方法。 ７． 前記方法が： ａ）自己リン酸化が可能なｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼを仮想的疎外 性化合物と接触させて反応混合物を形成させること； ｂ）前記反応混合物を、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨアミノ酸モチーフ もしくはそのミメトープからなり、かつ前記モチーフ中のチロシン残基がリン酸 化されている刺激性化合物と接触させること；および ｃ）前記仮想的疎外性化合物が前記ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼの 前記刺激性化合物による活性化を阻害する能力を、前記ｓｒｃ−ファミーチロシ ンキナーゼの自己リン酸化を決定することにより評定すること、 を含む、ｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼの活性化の刺激化を阻害することが 可能な化合物を同定するための方法。 ８． 前記ｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼが、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、 Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０からなる 群より選択される、請求の範囲７の方法。 ９． 細胞を、チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、そのことにより 前記チロシンキナーゼへのエフェクターの結合を遮断することが可能なペプチド もしくはそのミメトープを含む化合物の有効量と接触させることを含む、シグナ ル変換を調節するための方法。 １０． 前記高プロリンドメインが、ＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡ ＰＧＳＳＫＴおよびＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＲＫＰＴＴＶ Ａからなる群より選択される、請求の範囲９の内の一つに記載れる方法。 １１． 細胞を、一般式（ｐＹ）ＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸ（ｐＹ）ＸＸΨ［式中、 各ｐＹはホスホチロシンもしくはそのミメトープを表し、各Ｘは独立にいずれか のアミノ酸もしくはそれらのミメトープを表し、そしてΨはロイシンもしくはイ ソロイシン、あるいはそれらのミメトープを表す］で表されるＡＲＨ１モチーフ を有するペプチドを含む化合物の有効量と接触させることを含む、シグナル変換 を調節するための方法。 １２． 化合物をインビボで、ある動物の細胞と、その化合物をその動物に投与 することにより接触させる、請求の範囲１もしくは１１の内のいずれかの方法。 １３． （ｉ）一般式 Ｙ1ＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹ2ＸＸΨ ［式中、 Ｙ1およびＹ2の各々は独立にチロシンもしくはホスホチロシン、あるいはそれら のミメトープを表し、 各Ｘは独立にいずれかのアミノ酸もしくはそれらのミメトープを表し、そして Ψはロイシンもしくはイソロイシン、あるいはそれらのミメトープを表す］ で表されるＡＲＨ１モチーフを有するペプチド；ならびに （ｉｉ）動物への輸送に薬剤学的に適する担体（この担体と共にそのペ プチドが製剤される）、 を含む薬剤学的調製物。 １４． ＡＲＨ１モチーフが、一般式Ｙ1ＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹ2ＸＸ Ψ、Ｙ1ＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹ2ＸＸΨ、Ｙ1ＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹ2ＸＸΨ、 Ｙ1ＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹ2ＸＸΨ、Ｙ1ＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹ2ＸＸΨ、Ｙ1 ＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹ2ＸＸΨの内の一つで表される、請求の範囲１３の調製 物。 １５． ＡＲＨ１モチーフがＮＬＹ1ＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹ2ＥＤＩ、ＤＨＹ1 ＥＧＬＮＩＤＱＴＡＴＹ2ＤＥＩ、ＤＲＬＹ1ＥＥＬＮＨＶＹＳＰＩＹ2ＳＥＬ、 ＤＡＶＹ1ＴＧＬＮＴＲＮＱＥＴＹ2ＥＴＬ、ＤＧＬＹ1ＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹ2 ＤＡＬ、ＮＰＤＹ1ＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹ2ＳＧＬ、もしくはそれらのミメトー プの内の一つで表される、請求の範囲１３の調製物。 １６． Ｙ1およびＹ2の両方がホスホチロシンもしくはそのミメトープを表す、 請求の範囲１３〜１５の内のいずれかの調製物。 １７． ペプチドが３キロダルトンもしくはそれを下回る分子量を有する、請求 の範囲１３〜１５の内のいずれかの調製物。 １８． ペプチドが１５〜２６アミノ酸残基の長さである、請求の範囲１３〜１ ５の内のいずれかの調製物。 １９． ペプチドがｓｒｃ−ファミリーキナーゼのキナーゼ活性を刺激化する、 請求の範囲１３もしくは１６の内のいずれかの調製物。 ２０． ペプチドが、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔ ｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａｐ７０、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ 、およびＳｈｃアダプターからなる群より選択される蛋白質と特異的に結合する 、請求の範囲１３の調製物。 ２１． ペプチドがミリスチル化および／またはプレニル化される、請求の範囲 １３の調製物。 ２２． 薬剤学的に適する担体がリポソームを含む、請求の範囲１３の調製物。 ２３． 一つのＡＲＨ１モチーフを含むペプチドが、有効量ではレセプター（一 つもしくは複数）による細胞内シグナル伝達を通して少なくとも部分的に媒介さ れる障害の症状を軽減するのに薬剤学的に適する状態で製剤され、そしてその障 害が、癌、自己免疫性疾患、免疫不全性疾患、免疫増殖性疾患、アレルギー性応 答、および炎症性応答からなる群より選択される、請求の範囲１３の調製物。 ２４． （ｉ）一般式 Ｙ1ＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹ2ＸＸΨ、Ｙ1ＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹ2ＸＸΨ、Ｙ1 ＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹ2ＸＸΨ、Ｙ1ＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹ2ＸＸΨ、Ｙ1ＸＸ ＬＸＸＸＹＳＰＩＹ2ＸＸΨ、もしくはＹ1ＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹ2ＸＸΨ ［式中、Ｙ1およびＹ2の各々は独立にホスホチロシンもしくはそれらのミメトー プを表し、 各Ｘは独立にいずれかのアミノ酸もしくはそれらのミメトープを表し、 Ψはロイシンもしくはイソロイシン、あるいはそれらのミメトープを表し、そし て 各Ｄ、Ｃ、Ｓ、Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｙ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ａ、Ｒ、Ｎ、およびＥは対応 するアミノ酸残基もしくはそれらのミメトープを表す］ の内の一つで表されるＡＲＨ１モチーフを有するペプチドの実質的に純粋な調製 物；ならびに （ｉｉ）動物への輸送に薬剤学的に適する担体（この担体と共にそのペ プチドが製剤される）、 を含む薬剤学的調製物。 ２５． （ｉ）ＳＨ３結合性ドメインに特異的に結合する高プロリン（ＰＲ）モ チーフを含むペプチド、および （ｉｉ）薬剤学的に適する担体（この担体と共にそのペプチドが製剤さ れる）、 を含む薬剤学的調製物。 ２６． ＰＲモチーフが一般式ＰＰＸＰＸＰＸＰＰＸＰＸＰもしくはＰＸＰＸＸ ＰＰＸＰＰＸＰ［式中、各Ｘは独立にいずれかのアミノ酸もしくはそれらのミメ トープを表し、そして各Ｐはプロリン残基もしくはそれらのミメトープを表す］ の内の一つで表される、請求の範囲２５の調製物。 ２７． ＰＲモチーフがＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴ およびＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡからなる群より選択される、 請求の範囲２５の調製物。 ２８． ペプチドが１２〜４０アミノ酸残基の長さである、請求の範囲２５もし くは２６の内のいずれかの調製物。 ２９． ペプチドがＳＨ３ドメインに特異的に結合する、請求の範囲２５の調製 物。 ３０． ペプチドがｓｒｃ−ファミリーキナーゼのＳＨ３ドメインに特異的に結 合する、請求の範囲２９の調製物。 ３１． 薬剤学的に適する担体がリポソームを含む、請求の範囲２５の調製物。 ３２． ペプチドが、有効量ではＳＨ３ドメインを有する蛋白質による細胞内シ グナル伝達を通して少なくとも部分的に媒介される障害の症状 を軽減するのに薬剤学的に適する状態で製剤される、請求の範囲２５の調製物。 ３３． ペプチドがホスファチジルイノシトール−３−キナーゼの活性化を特異 的に阻害する、請求の範囲２５もしくは３２のいずれかの調製物。 ３４ （ｉ）一般式 ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨ で表されるＡＲＨ１モチーフ、もしくは ＳＨ３結合性ドメインに特異的に結合する高プロリン（ＰＲ）モチーフを含むペ プチドをコードする発現性コーディング配列を含む発現ベクター；ならびに （ｉｉ）薬剤学的に適する担体（この担体と共にそのペプチドが製剤さ れる）、 を含む薬剤学的調製物。[Procedure of Amendment] Article 184-8 of the Patent Act [Submission date] June 20, 1996 [Correction contents]                           The scope of the claims   1. The cell has an amino acid motif of YXXLXXXXXXXXXXXXXXX The peptide or its mimetope is included, and the size of the peptide is 15 to 2 SIGNA, comprising contacting with an effective amount of a compound over a range of 6 amino acid residues A method for adjusting the Leule transformation.   2. The amino acid motif is YXXLXXXDCSMYXXΨ, YXXL XXXQTATYXXΨ, YXXLXXXTTKDTYXXΨ, YXXLXXXQ RDLYXXΨ, YXXLXXXXXYSPIYXXΨ, YXXLXXXNQETY XXΨ, or a sequence comprising a sequence selected from the group consisting of mimetopes thereof. The method of claim 1.   3. The amino acid motif is NLYEGLNLDDCSMYEDI, DH TYEGLNIDQTATYEDI, DRLYEELNHVYSPIYSEL, DAVYTGLNTRNQETYETL, DGLYQGLSTATKDTYDA L, NPDYEPIRKGQRDLYSGL, or their mimetopes The method of claim 1 comprising a sequence selected from the group consisting of:   4. Claims 1, 2 wherein the amino acid motif is phosphorylated on both Y residues. , Or any one of the three.   5. Amino acid motifsrc-Family tyrosine kinases, lipid quinas And a cellular constituent selected from the group consisting of signal transduction adapter molecules A method according to any one of claims 1, 2, 3 or 4 for binding to a component .   6. Amino acid motif is Fyn, Lyn, Blk, Syk, Ye selected from the group consisting of s, Lck, Btk, Hck, Src, and Zap70. Binding to a cellular component that is present within claims 1, 2, 3, 4, or 5 Any one method.   7. The method is:     a) Autophosphorylation is possiblesrc− Virtual exclusion of famy tyrosine kinase Contacting with a polar compound to form a reaction mixture;     b) adding the reaction mixture to the YXXLXXXXXXXXXXYXXΨ amino acid motif Alternatively, it consists of its mimetope and the tyrosine residue in the motif is phosphate. Contacting a stimulating compound that has been activated; and     c) the virtual alienation compound issrcOf the family tyrosine kinases The ability to inhibit activation by the stimulatory compound issrc-Fami Chiroshi Scoring by determining autophosphorylation of kinases, including,src-Inhibiting stimulation of activation of famy tyrosine kinase Methods for identifying possible compounds.   8. Saidsrc-Fami tyrosine kinase is Fyn, Lyn, Blk, Consists of Syk, Yes, Lck, Btk, Hck, Src, and Zap70 8. The method of claim 7 selected from the group.   9. Bind cells to the SH3 domain of tyrosine kinases, thereby Peptide capable of blocking effector binding to the tyrosine kinase Alternatively, the CIGNA comprising contacting with an effective amount of a compound containing the mimetope A method for adjusting the Leule transformation. 10. The high proline domain is KKISPPTPKPRPPRPTPVA PGSSKT and NERQPAPATPPKPRKPTTV 10. A method according to one of claims 9 selected from the group consisting of A. 11. The cell is expressed by the general formula (pY) XXLXXXXXXXXX (pY) XXΨ [wherein Each pY represents phosphotyrosine or its mimetope, and each X independently represents either Of amino acids or their mimetopes, and Ψ is leucine or Representing soleucine or their mimetopes] Transduction comprising contacting with an effective amount of a compound comprising a peptide having To adjust the. 12. Administration of a compound in vivo to a cell of an animal and the compound to the animal The method according to claim 1 or 11, wherein the contact is performed by 13. (I) General formula                     Y1XXLXXXXXXXXX2XXΨ [Where, Y1And Y2Each independently of tyrosine or phosphotyrosine, or Represents the mimetope of Each X independently represents any amino acid or their mimetopes, and Ψ represents leucine or isoleucine, or their mimetopes.] A peptide having an ARH1 motif represented by:         (Ii) a carrier that is pharmaceutically suitable for delivery to an animal (with this carrier Peptide is formulated), A pharmaceutical preparation comprising: 14． ARH1 motif is the general formula Y1XXLXXXXDCSMY2XX Ψ, Y1XXLXXXQTATY2XXΨ, Y1XXLXXXXTKDTY2XXΨ, Y1XXLXXXXQRDLY2XXΨ, Y1XXXLXYSPIY2XXΨ, Y1 XXLXXXNQETY2Preparation of claim 13 represented by one of XXΨ Stuff. 15. ARH1 motif is NLY1EGLNLDDCSMY2EDI, DHY1 EGLNIDQTATY2DEI, DRLY1EELNHVYSPIY2SEL, DAVY1TGLNTRNQETY2ETL, DGLY1QGLSTATKDTY2 DAL, NPDY1EPIRKGQRDLY2SGL or their mimetos The preparation of claim 13, which is represented by one of the formulas: 16. Y1And Y2Both represent phosphotyrosine or its mimetope, A preparation according to any of claims 13 to 15. 17． Claims, wherein the peptide has a molecular weight of 3 kilodaltons or less Preparations in any of the ranges 13 to 15 of. 18. Claims 13-1 wherein the peptide is 15-26 amino acid residues in length. A preparation of any of 5. 19. Peptidesrc-Stimulates the kinase activity of family kinases, A preparation according to any of claims 13 or 16. 20. Peptides are Fyn, Lyn, Blk, Syk, Yes, Lck, Bt k, Hck, Src, Zap70, phosphatidylinositol-3-kinase , And specifically binds to a protein selected from the group consisting of Shc adapters The preparation of claim 13. 21. Claims, wherein the peptide is myristylated and / or prenylated 13 preparations. 22. 14. The preparation of claim 13, wherein the pharmaceutically suitable carrier comprises liposomes. 23. Peptides containing one ARH1 motif are associated with receptor (mono- Mediated at least in part through intracellular signaling by one or more) Formulated in a state that is pharmaceutically suitable to reduce the symptoms of the disorder Harm causes cancer, autoimmune diseases, immunodeficiency diseases, immunoproliferative diseases, allergic reactions The preparation of claim 13, which is selected from the group consisting of an answer and an inflammatory response. 24. (I) General formula Y1XXLXXXXDCSMY2XXΨ, Y1XXLXXXQTATY2XXΨ, Y1 XXLXXXXTKDTY2XXΨ, Y1XXXLXXXQRDLY2XXΨ, Y1XX LXXXYSPIY2XXΨ or Y1XXLXXXNQETY2XXΨ [Where Y1And Y2Each independently of phosphotyrosine or their mimetoto Represents the Each X independently represents any amino acid or their mimetopes, Ψ represents leucine or isoleucine, or their mimetopes, and hand Each D, C, S, M, T, K, Y, P, I, L, Q, A, R, N, and E correspond Amino acid residues or their mimetopes Substantially pure preparation of a peptide having an ARH1 motif represented by one of the Thing; and         (Ii) a carrier that is pharmaceutically suitable for delivery to an animal (with this carrier Peptide is formulated), A pharmaceutical preparation comprising: 25. (I) High proline (PR) model that specifically binds to SH3 binding domain Peptides containing chief, and         (Ii) a pharmaceutically suitable carrier (with which the peptide is formulated) ), A pharmaceutical preparation comprising: 26. The PR motif has the general formula PPPXPXPXPPXPPX or PXPXX. PPXPPXP [wherein each X is independently any amino acid or their mime Represents a taupe, and each P represents a proline residue or their mimetopes] 26. The preparation of claim 25, represented by one of: 27. PR motif is KKISPPPTPKPRPPRPTPVAPGSSKT And NERQPAPATPPKPPKPTTVA, A preparation according to claim 25. 28. 25. If the peptide is 12-40 amino acid residues long, A preparation of any of 26. 29. Preparation of claim 25, wherein the peptide specifically binds to the SH3 domain Stuff. 30. Peptidesrc-Specifically binds to SH3 domain of family kinases 30. The formulation of claim 29, which combines. 31. 26. The preparation of claim 25, wherein the pharmaceutically suitable carrier comprises liposomes. 32. The peptide is an effective amount of intracellular peptide produced by a protein having an SH3 domain. Symptoms of disorders mediated at least in part through gnaru transmission 26. The preparation of claim 25 formulated in a pharmaceutically suitable condition for alleviating. 33. Peptide specific for activation of phosphatidylinositol-3-kinase 33. A preparation according to any of claims 25 or 32, which inhibits selectively. 34 (i) General formula YXXLXXXXXXXXXYYXXΨ ARH1 motif represented by, or PE containing a high proline (PR) motif that specifically binds to the SH3 binding domain An expression vector comprising an expressible coding sequence encoding a peptide; and         (Ii) a pharmaceutically suitable carrier (with which the peptide is formulated) ), A pharmaceutical preparation comprising:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/74 ＡＤＹ 9283−4Ｃ Ａ６１Ｋ 35/74 ＡＤＹＡ 35/78 9159−4Ｃ 35/78 Ｘ 38/00 ＡＤＵ 9051−4Ｃ 48/00 ＡＢＡ 38/45 ＡＢＣ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 38/55 ＡＢＥ 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/705 48/00 ＡＢＡ 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ // Ｃ０７Ｋ 14/705 9051−4Ｃ 37/64 ＡＢＥ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9051−4Ｃ 37/52 ＡＢＣ Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 クラーク， マーカス・アール アメリカ合衆国イリノイ州60611シカゴ・ ノースマツクラーグコート400・アパート メント2007─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI A61K 35/74 ADY 9283-4C A61K 35/74 ADYA 35/78 9159-4C 35/78 X 38/00 ADU 9051 -4C 48/00 ABA 38/45 ABC 8615-4C C07H 21/04 B 38/55 ABE 9356-4H C07K 14/705 48/00 ABA 9637-4B C12P 21/02 C C07H 21/04 9051-4C A61K 37 / 02 ADU // C07K 14/705 9051-4C 37/64 ABE C12N 15/09 ZNA 9051-4C 37/52 ABC C12P 21/02 9282-4B C12N 15/00 ZNAA (72) Inventor Clark, Marcus Earl United States Illinois 60611 Chicago North Matcrag Court 400 Apartments 2007

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 細胞を、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨのアミノ酸モチーフを有する ペプチドもしくはそのミメトープを含む化合物の有効量と接触させることを含む 、シグナル変換を調節するための方法。 ２． 前記アミノ酸モチーフが、ＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬ ＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱ ＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹ ＸＸΨ、もしくはそれらのミメトープからなる群より選択される配列を含む、請 求の範囲１に記載の方法。 ３． 前記アミノ酸モチーフが、ＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ、ＤＨ ＴＹＥＧＬＮＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩ、ＤＲＬＹＥＥＬＮＨＶＹＳＰＩＹＳＥＬ、 ＤＡＶＹＴＧＬＮＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬ、ＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡ Ｌ、ＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬ、もしくはそれらのミメトープから なる群より選択される配列を含む、請求の範囲１に記載の方法。 ４． アミノ酸モチーフが両方のＹ残基でリン酸化されている、請求の範囲１ 、２、もしくは３の内のいずれか一つの方法。 ５． アミノ酸モチーフが、ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼ、脂質キナ ーゼ、およびシグナル変換アダプター分子からなる群より選択される細胞性構成 成分に結合する、請求の範囲１、２、３、もしくは４の内のいずれか一つの方法 。 ６． アミノ酸モチーフが、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃ ｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０からなる群か ら選択される細胞性構成成分に結合する、請求の範囲１、２、３、４、もしくは ５の内のいずれか一つの方法。 ７． 前記方法が： （ａ）自己リン酸化が可能なｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼを仮想的疎外性 化合物と接触させて反応混合物を形成させること； （ｂ）前記反応混合物を、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨアミノ酸モチーフも しくはそのミメトープからなり、かつ前記モチーフ中のチロシン残基がリン酸化 されている刺激性化合物と接触させること；および （ｄ）前記仮想的疎外性化合物が前記ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼの前 記刺激性化合物による活性化を阻害する能力を、前記ｓｒｃ−ファミーチロシン キナーゼの自己リン酸化を決定することにより評定すること、 を含む、ｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼの活性化の刺激化を阻害しうる化合 物を同定するための方法。 ８． 前記ｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼが、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、 Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０からなる 群から選択される、請求の範囲７の方法。 ９． 細胞を、チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合することが可能なペ プチドもしくはそのミメトープを含む化合物の有効量と接触させ、そのことによ り前記チロシンキナーゼへのエフェクターの結合を遮断することを含む、シグナ ル変換を調節するための方法。 １０． 前記高プロリンドメインが、ＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡ ＰＧＳＳＫＴおよびＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡからなる群より 選択される、請求の範囲９の内の一つに記載れる方法。 １１． 細胞内のシグナル変換を調節するための治療用組成物であって、前記組 成物が、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨアミノ酸モチーフを有するペプチドも しくはそのミメトープ、および薬剤学的に許容される賦形剤を含む治療用組成物 。 １２． 細胞内のシグナル変換を調節するための治療用組成物であって、前記組 成物がチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、そのことにより前記チロシ ンキナーゼへのエフェクターの結合を遮断しうるペプチドもしくはそのミメトー プを含む治療用組成物。[Claims] 1. A method for modulating signal transduction, which comprises contacting a cell with an effective amount of a compound comprising a peptide having the amino acid motif of YXXLXXXXXXXXXYYXXXΨ or a mimetope thereof. 2. The above-mentioned amino acid motif includes YXXXLXXDCSMYXXΨ, YXXL XXXQTATYXXΨ, YXXLXXXTKDTYXXΨ, YXXLXXQQ RDLYXXΨ, YXXLXXXYSPIYXXΨ, YXXLXXXNSPITYXXΨ, YXXLXXNSPIETYXXΨ, YXXLXXXNQETY. 3. Wherein the amino acid motif is NLYEGLNLDDCSMYEDI, DH TYEGLNIDQTATYEDI, DRLYEELNHVYSPIYSEL, DAVYTGLNTRNQETYETL, a sequence selected from the group of methods selected from the method of claim 1 or NPDYEPIRKGDTYDAL, which is included in the group of NPDYEPIRKGQRDLYSGL, which is included in the claim sequence selected from the group consisting of NLDYEPIRKGQRDLYSGL. 4. The method of any one of claims 1, 2 or 3 wherein the amino acid motif is phosphorylated on both Y residues. 5. Any one of claims 1, 2, 3 or 4 wherein the amino acid motif binds to a cellular component selected from the group consisting of src -family tyrosine kinases, lipid kinases and signal transduction adapter molecules. One way. 6. The amino acid motif binds to a cellular component selected from the group consisting of Fyn, Lyn, Blk, Syk, Yes, Lck, Btk, Hck, Src, and Zap70, Claims 1, 2, 3, 4 , Or any one of 5 methods. 7. Said method comprises: (a) contacting an autophosphorylatable src -famity tyrosine kinase with a hypothetical sparse compound to form a reaction mixture; (b) said reaction mixture from the YXXLXXXXXXXXXXXXXXX amino acid motif or its mimetope. And (d) the hypothetical alienating compound causes activation of the src -family tyrosine kinase by the stimulatory compound. Assessing the ability to inhibit by determining autophosphorylation of said src -famy tyrosine kinase, a method for identifying compounds capable of inhibiting the stimulation of activation of src -famy tyrosine kinase. 8. 8. The method of claim 7, wherein the src -famy tyrosine kinase is selected from the group consisting of Fyn, Lyn, Blk, Syk, Yes, Lck, Btk, Hck, Src, and Zap70. 9. A signal transduction comprising contacting the cell with an effective amount of a compound comprising a peptide or its mimetope capable of binding to the SH3 domain of a tyrosine kinase, thereby blocking the binding of an effector to said tyrosine kinase. Ways to adjust. 10. 10. The method according to claim 9, wherein the high proline domain is selected from the group consisting of KKISPPTPKPRPPRPTPVA PGSSKT and NERQPAPATPPKPPKPTTVA. 11. A therapeutic composition for modulating intracellular signal transduction, the composition comprising a peptide having a YXXLXXXXXXXXXYYXXΨ amino acid motif or a mimetope thereof, and a pharmaceutically acceptable excipient. . 12. A therapeutic composition for modulating intracellular signal transduction, said composition being capable of binding to the SH3 domain of tyrosine kinase and thereby blocking effector binding to said tyrosine kinase or a mimetope thereof. A therapeutic composition comprising:
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