JPH09511908A

JPH09511908A - サイトカインに応答性のｄｎａ調節要素

Info

Publication number: JPH09511908A
Application number: JP7527067A
Authority: JP
Inventors: ラム，アイ・ピーター; セイデル，エイチ・マーティン
Original assignee: リガンド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-04-14
Filing date: 1995-04-10
Publication date: 1997-12-02
Also published as: AU681025B2; EP0755453A1; AU2287695A; WO1995028492A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、サイトカインなどのシグナル伝達分子に応答して活性化された転写調節タンパク質に結合する、Ｌｙ６ＥＧＡＳ要素の点突然変異を含むＤＮＡ調節要素を含むオリゴヌクレオチド配列を提供する。さらに、本発明はまた、該オリゴヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物、該ＤＮＡ構築物でトランスフェクションした細胞、および構造遺伝子の制御された発現、転写調節タンパク質の検出および回収、および遺伝子転写のアゴニストおよびアンタゴニストとして作用する化合物の能力を測定するための、該ＤＮＡ構築物およびトランスフェクションした細胞の使用方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】サイトカインに応答性のＤＮＡ調節要素発明の技術分野本発明は、サイトカインなどの種々の分子に応答して転写に影響を及ぼす調節タンパク質に結合するオリゴヌクレオチド配列、該オリゴヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物、該ＤＮＡ構築物でトランスフェクションした細胞、および異種遺伝子の制御された発現、新たな調節タンパク質の検出および回収、および遺伝子転写のアゴニストおよびアンタゴニストとして作用する化合物の能力の測定のためのその使用方法に関する。発明の背景多くの細胞系において、ポリペプチドリガンドなどの細胞外シグナル伝達分子は、細胞表面にあるレセプターに結合することにより、細胞内での遺伝子転写を最終的に調節することになる細胞内シグナル伝達経路を誘発する。例えば、哺乳動物細胞の成長、分化および機能を制御する可溶性ポリペプチドの大きく多様なファミリーを構成するサイトカインおよび成長因子は、特異的な細胞表面レセプターに結合することにより、特異的な表現型応答を引き起こすシグナルをある種の形で伝達する。ミヤジャマ（Ａ.Ｍiyajama）ら、１０Ａnnu.Ｒev.Ｉmmunol.、２９５（１９９２）；アグエット（Ｍ.Ａguet）ら、５５Ｃell、２７３（１９８８）；キシモト（Ｔ.Ｋishimoto）ら、２５８Ｓcience、５９３（１９９２）およびウルリッヒ（Ａ.Ｕllrich）およびシュレシンガー（Ｊ.Ｓchlessinger）、６１Ｃell、２０３（１９９０）。多数の証拠は、特定の遺伝子における転写速度の変化が該応答の重要な要素であることを示している。これは、特定のＤＮＡ結合タンパク質の量または活性の変化の結果であると考えられている。幾つかの場合において、細胞表面におけるレセプター−リガンド相互作用からかかるＤＮＡ結合タンパク質または他の核タンパク質の活性の変化へと導く経路を規定するうえで進歩がなされてきている。ウルリッヒ、６１Ｃell、２０３。この観点において、表面レセプターシグナル伝達経路における共通の応答にはＲａｓの活性化が含まれる。マルカヒー（Ｌ.Ｓ.Ｍulcahy）ら、３１３Ｎature、２４１（１９８５）。活性化されたＲａｓは、ついでＭＡＰキナーゼを介してセリン／トレオニンリン酸化のカスケードを開始させてＤＮＡ結合タンパク質のリン酸化に導き、それによってその転写制御活性を変化させる。ムーディー（Ｓ. Ａ.Ｍoodie）ら、２６０Ｓcience、１６５８（１９９３）；ラング−カーター（Ｃ.Ａ.Ｌange−Ｃarter）ら、２６０Ｓcience、３１５（１９９３）；ヒル（Ｃ. Ｓ.Ｈill）ら、７３Ｃell、３９５（１９９３）；ジル（Ｈ.Ｇille）ら、３５８Ｎature 、４１４（１９９２）およびチェン（Ｒ.Ｈ.Ｃhen）ら、１２Ｍol.Ｃell .Ｂiol .、９１５（１９９２）。これら進歩にも拘わらず、遺伝子発現を変化させるために多くの成長因子およびサイトカインによって利用されているシグナル伝達経路はいまだ解明されていない。それゆえ、知られた第二メッセンジャーがこれら因子の幾つかに対して応答してシグナル伝達に関与していると考えられているけれども、遺伝子発現を制御するうえでのその役割はいまだ解明されていない。ミヤジャマら、１０Ａnnu. Ｒev.Ｉmmunol .、２９５およびレビー（Ｄ.Ｅ.Ｌevy）およびダーネル（Ｊ.Ｅ. Ｄarnell）、２Ｎew Ｂiol.、９２３（１９９０）。このことが今度は、そのような細胞系においてリガンド特異的応答がいかにして引き起こされるのかという疑問を提起する。ウルリッヒ、６１Ｃell、２０３；チャオ（Ｍ.Ｖ.Ｃhao）、６８Ｃell、９９５（１９９２）およびレビー、２Ｎew Ｂiol.、９２３。これら問題を解決するうえでの進歩が、最近、インターフェロン（ＩＦＮ）系でなされている。ＩＦＮαおよびβ（タイプＩ）は、ウイルス感染に対する主要な非特異的防御として働く。ペツカ（Ｓ.Ｐetska）およびランガー（Ｊ.Ａ.Ｌan ger）、５６Ａnnu.Ｒev.Ｂiochem.、７２７（１９８７）。ＩＦＮγ（タイプII ）は抗ウイルス特性を有するが、免疫応答の制御においても主要な役割を果たしている。上記文献。タイプＩおよびタイプIIのＩＦＮは異なる細胞表面レセプターに結合し、遺伝子発現を速やかに変化させる。アグエット、５５Ｃell、２７３；ウゼ（Ｕze）、６０Ｃell、２２５；およびセン（Ｇ.Ｃ.Ｓen）およびレンギエル（Ｐ.Ｌengyel）、２６７Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、５０１７（１９９２）。インターフェロンα刺激応答要素（interferon−α stimulated response elements ）（ＩＳＲＥｓ）と呼ばれるＩＦＮαに応答する特定の配列要素が遺伝子のプロモーター中で同定されており、これはＩＦＮαによる制御に必要かつ充分なものである。セン、２６７、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.５０１７。詳しくは、ＩＦＮαレセプターの活性化は、ＤＮＡ結合タンパク質として、従ってＩＳＲＥを介した転写調節要素として働くタンパク質ファミリーのチロシンリン酸化を剌激する。シンドラー（Ｃ.Ｓchindler）ら、２５７Ｓcience、８０９（１９９２）；シュアイ（Ｋ. Ｓhuai）ら、２５８Ｓcience、１８０８（１９９２）およびグッチ（Ｍ.Ｊ.Ｇut ch）ら、８９Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、１１４１１（１９９２）。これらＤＮＡ結合タンパク質は一般に「転写のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター（signal transducers and activators of transcription）（ＳＴＡＴｓ）」と呼ばれ、多量体複合体に会合し、核に位置を移し、適当な調節領域中のシス作動性エンハンサー要素（cis−acting enhancer elements）に結合する。レビーら、３Ｇenes Ｄev.、１３６２（１９８９）；およびケスラー（Ｄ. Ｓ.Ｋessler）ら、４Ｇenes Ｄev.、１７５３（１９９０）およびゾン（Ｚ.Ｚho ng）ら、２６４Ｓcience、９５（１９９４）。ＩＦＮαにより誘発されたＩＳＲＥ結合タンパク質複合体の一つの例はＩＳＧＦ３である。デイル（Ｔ.Ｃ.Ｄale）ら、８６Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.、１２０３（１９８９）およびフー（Ｘ−Ｙ.Ｆu）ら、８７Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.、８５５５（１９９０）。ＩＳＧＦ３は、ｐ４８、ｐ８４（ＳＴＡＴ１β）、ｐ９１（ＳＴＡＴ１α）およびｐ１１３（ＳＴＡＴ２）と呼ばれる４つの結合タンパク質の複合体である。最近、ＩＳＧＦ３を構成するタンパク質をコードするｃＤＮＡが単離され特徴付けられた。フーら、８９Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.、７８４０（１９９２）；シンドラーら、８９Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.、７８３６（１９９２）およびビールズ（Ｓ.Ａ.Ｖeals）ら、１２Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、３３１５（１９９２）。ｐ４８はＩＳＧＦ３のＤＮＡ結合成分であり、ｍｙｂと相同である。ビールズ、１２Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、３３１５。ｐ８４およびｐ９１はおそらく同じ遺伝子が別の仕方でスプライスされた産物であり、ｐ１１３と関連している。フー、８９Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.、７８４０およびシンドラー、８９Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.、７８３６。ｐ８４、ｐ９１およびｐ１１３はＳＨ２ドメインおよびＳＨ３ドメインを含有する新規なタンパク質であり、未処理の細胞の細胞質中に認められる。シンドラー、２５７Ｓcience、８０９およびフー、７０Ｃell、３２３〜３３５（１９９２）。それゆえ、細胞をＩＦＮαで処理するとｐ８４、ｐ９１およびｐ１１３が速やかにチロシンリン酸化される結果となり、これらを会合させｐ４８とヘテロマーな複合体を形成してＩＳＧＦ３を形成し、これが核に位置を移してＩＳＲＥに結合し、転写を刺激する。上記文献；デイル、８６Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.、１２０３およびケスラー、４Ｇenes Ｄ ev .、１７５３。ＩＦＮγに応答した調節は、ＩＳＲＥとは異なる配列、すなわちガンマ活性化配列（gamma activated sequence）（ＧＡＳ）により与えられる。デッカー（Ｔ .Ｄecker）ら、１０ＥＭＢＯＪ.、９２７（１９９１）；カン（Ｋ.Ｄ.Ｋhan）ら、９０Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.、６８０６（１９９３）およびルー（Ｄ.Ｊ. Ｌew）ら、１１Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、１８２（１９９１）。ＧＡＳ要素を含むＤＮＡセグメントは、多量体を形成したときに異種プロモーターにＩＦＮγ応答を付与しうる。デッカーら、１１Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、５１４７−５１５３（１９９１）およびカンノ（Ｋannno）ら、１３Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、３９５１−３９６３（１９９３）。細胞をＩＦＮγで処理するとｐ９１（ＳＴＡＴ１α）のチロシンがリン酸化され、ついでこれがダイマーを形成し、核に位置を移しＧＡＳ要素に結合する。デッカー、１０ＥＭＢＯＪ.、９２７；シュアイら、２５８Ｓcien ce 、１８０８（１９９２）およひシュアイら、７６Ｃell、８２１−８２８（１９９４）。それゆえ、ＩＦＮαかまたはＩＦＮγのそれそれのレセプターへの結合の特異性は、潜在的転写因子（latent transcription factors）（すなわち、ＤＮＡ結合タンパク質）の関連ファミリー内での特定のリン酸化パターンに翻訳される。このリン酸化パターンがタンパク質の会合状態を指示し、このことがＩＳＲＥまたはＧＡＳのいずれかへの結合の特異性およびその後の転写応答を決定する。さらに他のサイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）は、肝細胞において急性期応答の誘発に主要な役割を果たしている。急性期応答は、急性期応答遺伝子と呼ばれる独特のセットの遺伝子の劇的な転写の上方調節（upregula tion）を特徴とする。ハインリッヒ（Ｐ.Ｃ.Ｈeinrich）ら、２６５Ｂiochem.Ｊ .、６２１−６３６（１９９０）。これら遺伝子のプロモーター領域を調べたところ、ＩＬ−６によって急性期応答遺伝子が誘発されるのに必要な特定のＤＮＡ配列が同定された。クンツ（Ｄ.Ｒ.Ｋunz）ら、１７Ｎuc．Ａcids Ｒes.、１１２１−１１３８（１９８９）；ハットリ（Ｍ.Ｈattori）ら、８７Ｐroc.Ｎatl. Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、２３６４−２３６８（１９９０）；ウォン（Ｋ.Ａ.Ｗon）およびバウマン（Ｈ.Ｂaumann）、１０Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、３９６５〜３９７８（１９９０）およびウィルソン（Ｄ.Ｒ.Ｗilson）ら、１０Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、６１８１−６１９１（１９９０）。これら配列は、急性期応答要素（acute phas e response elements）（ＡＰＲＥｓ）と呼ばれる。ＡＰＲＥの一つのタイプは、ＩＦＮγによる誘発を与えるＧＡＳ要素と多くの類似点を示す。幾つかの天然のＧＡＳ要素はＩＦＮγおよびエＬ−６の両方により転写誘発を媒体する。ユアン（Ｙuan）ら、１４Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、１６５７−１６６８（１９９４）；ハロッチ（Ｈarroch）ら、１３ＥＭＢＯＪ.、１９４２−１９４９（１９９４）およびハロッチら、２６９Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２６１９１−２６１９５（１９９４）。このＡＰＲＥのクラスに結合するタンパク質は特徴付けられ精製されている。ウェジェンカ（Ｕ.Ｍ.Ｗegenka）ら、１４Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、３１８６−３１９６（１９９４）；ウェジェンカら、１３Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、２７６−２８８（１９９３）；イトー（Ｔ.Ｉto）ら、１７Ｎuc．Ａcids Ｒes.,９４２５−９４３５（１９８９）およびハットリ、８７Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、２３６４〜２３６８。ＩＬ−６によって誘発されるＡＰＲＥ結合タンパク質のｃＤＮＡクローンは単離されており（ゾン、２６４Ｓcience、９５；アキラ（Ａkira ）ら、７７Ｃell、６３−７１（１９９４）：ゾンら、９１Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci. 、４８０６−４８１０（１９９４）；ラズ（Ｒaz）ら、２６９Ｊ.Ｂiol.Ｃ hem .、２４３９１−２４３９５（１９９４））、ｐ９１（ＳＴＡＴ１α）に対してかなりの相同性を示すタンパク質をコードすることがわかった。この理由から、該タンパク質はＳＴＡＴ３と呼ばれている。ＳＴＡＴ１αと同様、ＳＴＡＴ３は活性化されて速やかなチロシンリン酸化によりＤＮＡに結合する潜在的転写因子である。幾つかの細胞においては、ＩＬ−６はまた、ＳＴＡＴ１α を活性化する。これらの細胞においては、ＳＴＡＴ１αのホモダイマーおよびＳＴＡＴ３のホモダイマーに加えてＳＴＡＴ１αとＳＴＡＴ３のヘテロダイマーも生成する。サドウスキ（Ｓadowski）ら、２６１Ｓcience、１７３９−１７４４（１９９３）；ラズら、２６９Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２４３９１−２４３９５（１９９４）およびゾンら、２６４Ｓcience、９５−９８（１９９４）。ＩＦＮγおよびＩＬ−６は類似の配列（ＧＡＳ／ＡＰＲＥ）に結合しうるＳＴＡＴタンパク質を活性化するけれども、これらサイトカインは別々の遺伝子のセットを調節している。このことは、これら遺伝子がこれらサイトカインの一つにのみ応答するように、これら遺伝子の幾つかにおける応答要素に関して特異性が存在することを示唆している。さらに、ＩＦＮγおよびＩＬ−６以外の多くのサイトカインはＧＡＳ−結合タンパク質複合体の速やかな活性化を引き起こす。シルベニオネン（Ｓilvennionen）ら、２６１Ｓcience、１７３６（１９９３）；サドウスキら、２６１Ｓcience、１７３９（１９９３）；ラーナー（Ａ．Ｃ.Ｌa rner）ら、２６１Ｓcience、１７３０（１９９３）；フィンブルーム（Ｄ.Ｆinb loom）ら、１４Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、２１１３−２１１８（１９９４）；メイヤー（Ｄ.Ｍeyer）ら、２６９Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、４７０１−４７０４（１９９４）；ラム（Ｌamb）ら、８３Ｂlood２０６３−２０７１（１９９４）；およびチアン（Ｔian）ら、８４Ｂlood１７６０−１７６４（１９９４）参照。これらの複合体のうちの幾つかはＳＴＡＴ１αおよび／またはＳＴＡＴ３を含み、また幾つかはある種の特徴付けられていないタンパク質を含む。これらのサイトカインはまた、互いにおよびＩＦＮγおよびＩＬ−６によって調節されているものと別個の遺伝子のセットを調節している。それゆえ、種々のサイトカインへ応答する能力において選択性を有する別個のクラスのＧＡＳ様配列が存在することがありうる。従って、ＳＴＡＴタンパク質を含むサイトカイン活性化タンパク質への結合能に関して選択性を示す特異的なＤＮＡ配列は、種々のサイトカインにより活性化されたＤＮＡ結合タンパク質により媒体される応答を選択的にアッセイすることを可能にする有用な手段となるであろう。上記で引用された文献の開示は、参照のためその全体が本明細書中に引用される。発明の要約本発明は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン４（ＩＬ −４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのサイトカインを含むシグナル伝達分子に応答して、活性化された転写調節タンパク質、好ましくはＳＴＡＴタンパク質へ直接的または間接的に結合するＤＮＡ調節要素を含むオリゴヌクレオチド配列に関する。驚くべきことに、Ｌｙ６ＥＧＡＳ調節要素における個々の点突然変異により、種々の活性化された転写調節タンパク質に結合するかおよび／または活性化された転写調節タンパク質の単一のタイプまたはクラスにのみ特異的に結合する別個の調節要素が得られる。従って、本発明の調節要素は、ＩＦＮγなどのシグナル伝達分子およびその同族の転写調節タンパク質、ＳＴＡＴ１αのアゴニストまたはアンタゴニストを検出するための転写アッセイにおいて用いることができる。とりわけ、本発明は、ヌクレオチド配列ＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴ（配列番号：１）、ＴＡＴＴＣＣＧＧＴＡＡＧＴ（配列番号：２）、ＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＴ（配列番号：３）、ＴＡＴＴＣＴＴＧＴＡＡＧＴ（配列番号：４）、ＴＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＧＴ（配列番号：５）、ＴＡＴＴＣＣＣＧＴＡＡＧＴ（配列番号：６）、ＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＡＧＴ（配列番号：７）、ＴＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴ（配列番号：８）、ＴＡＴＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴ（配列番号：９）、ＴＡＴＧＣＣＴＧＴＡＡＧＴ（配列番号：１０）、ＴＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＴ（配列番号：１１）、ＴＡＴＴＣＣＴＣＴＡＡＧＴ（配列番号：１２）、ＴＡＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴ（配列番号：１３）、またはＴＡＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧＴ（配列番号：１４）の調節要素を含むオリゴヌクレオチド配列を提示する。これらオリゴヌクレオチド配列は、相補鎖を含む二本鎖であってよい。本発明はまた、プロモーターに機能的に連結した上記オリゴヌクレオチド配列の調節要素を含むＤＮＡ構築物を提供するものであり、該プロモーターは異種遺伝子に機能的に連結しており、その際、該ＤＮＡ構築物は該異種遺伝子が該オリゴヌクレオチド配列およびプロモーターの転写制御下にあるような仕方で連結している。また、このＤＮＡ構築物でトランスフェクションした宿主細胞も提供する。本発明はまた、適当な転写調節タンパク質を含有するトランスフェクションした宿主細胞をシグナル伝達分子の存在下で培養することを特徴とする、異種遺伝子の制御された発現方法をも提供する。好ましくは、該方法におけるシグナル伝達分子はサイトカインであり、該転写調節タンパク質はＳＴＡＴタンパク質である。本発明はさらに、サンプル中の活性化された転写調節タンパク質（新規なＳＴＡＴタンパク質など）の存在を検出する方法であって、該サンプルを上記オリゴヌクレオチド配列と、該転写調節タンパク質が活性化され該オリゴヌクレオチド配列と結合して複合体を形成するような条件下で接触させ、ついで該サンプル中の該複合体の存在を検出することを特徴とする方法を提供する。その後、該複合体を該サンプルから分離し、転写調節タンパク質を調節要素から単離することができる。さらに、本発明は、遺伝子転写のアゴニストとして働きうる化合物の能力の測定方法であって、（ａ）該化合物を上記トランスフェクションした宿主細胞と、該化合物に応答して異種遺伝子が発現されうるような条件下で接触させ、ついで（ｂ）工程（ａ）での遺伝子発現レベルを該化合物の不在下での該宿主細胞からの遺伝子発現レベルと比較することを特徴とする方法を提供する。別の態様において、本発明はまた、遺伝子転写のアンタゴニストとして働きうる化合物の能力の測定方法であって、（ａ）該化合物を前以て決定した量のシグナル伝達分子の存在下、該シグナル伝達分子に応答して異種遺伝子が発現されるような条件下で上記トランスフェクションした宿主細胞と接触させ、ついで（ｂ）工程（ａ）での遺伝子発現レベルを、シグナル伝達分子の存在下だが、該化合物の不在下での該宿主細胞からの遺伝子発現レベルと比較することを特徴とする方法を提供する。これら両方法において、異種遺伝子は、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protei n）またはβ−ガラクトシダーゼの遺伝子などのいかなる適当なリポーター遺伝子であってもよい。本発明はさらにまた、ＳＴＡＴヘテロダイマーの誘発をアゴナイズ（agonize ）またはアンタゴナイズ（antagonize）する化合物の能力の選択的な測定方法であって、（ａ）該化合物に応答して異種遺伝子が発現され得るような条件下で、該化合物を請求項１９の宿主細胞と接触させ、その際、該宿主細胞は活性化されたＳＴＡＴヘテロダイマーに選択的に結合することができる調節要素を含むオリゴヌクレオチド配列の単一コピーを含むＤＮＡ構築物でトランスフェクションされており、ついで（ｂ）工程（ａ）での遺伝子発現レベルを、該化合物の不在化での該宿主細胞からの遺伝子発現レベルと比較することを特徴とする方法を提供する。本発明を特徴付けるこれらのおよび他の様々な利点および新規性の特徴は添付の請求項において特に示されており、その一部を形成している。しかしながら、本発明、その利点およびその使用によって得られた物質を更によく理解するために、付随の図面および記載内容（本発明の好ましい態様を例示し記載している）が参照されるべきである。定義本発明の目的に関して：「オリゴヌクレオチド」または「ＤＮＡ」分子または配列とは、一本鎖の形態かまたは二本鎖ヘリックスの形態でデオキシリボヌクレオチドアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）および／またはシトシン（Ｃ）からなる分子であって、本明細書において定義する本発明による「調節要素」を包含する。正確なサイズ、鎖の数および方向（すなわち、３'→５'または５'→３'）は多くの因子に依存するであろうし、これら因子はまた本発明のオリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に依存するであろう。それゆえ、「オリゴヌクレオチド」または「ＤＮＡ」なる語は、線状ＤＮＡ分子または断片、ウイルス、プラスミド、ベクター、染色体または合成由来のＤＮＡに認められる二本鎖ＤＮＡを包含する。本明細書において、特定の二本鎖ＤＮＡ配列は、５'から３'方向の配列のみを記載する通常の慣習に従って記載するものとする。「調節要素」とは、オリゴヌクレオチド配列の全体またはその一部であって、該オリゴヌクレオチド配列に活性化された転写調節タンパク質または１または２以上の活性化された転写調節タンパク質を含む複合体が結合した場合に、関連する１または２以上の遺伝子（異種遺伝子を含む）の発現が転写レベルで制御されるものをいう。「シグナル伝達分子」とは、細胞の表面またはその近傍にあるレセプターと相互作用する、遊離または結合のいずれかの形態の細胞外ポリペプチド、オリゴ糖または他の非ペプチド性分子をいう。この相互作用が今度は、調節要素に結合する１または２以上の転写調節タンパク質の活性化を含む細胞内経路を引き起こさせ、それにより関連する１または２以上の遺伝子の発現を転写レベルで制御する。本明細書において「シグナル伝達分子」は、サイトカイン、ペプチド性および非ペプチド性ホルモン、抗体、細胞表面抗原などの天然に存在する分子、またはこれらシグナル伝達分子のいずれかの合成模倣物、またはこれらシグナル伝達分子の作用を模倣した化合物を包含する。「サイトカイン」とは、生物において最終的に表現型応答を引き起こすような仕方で細胞の増殖、分化および機能を制御する可溶性ポリペプチド（成長因子およびホルモンを含む）の多様な群をいう。本発明の調節要素および関連方法に有用な好ましいサイトカインとしては、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ− １２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、ＧＭ−ＣＳＦ、オンコスタチンＭ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＥＧＦ、ＣＮＴＦおよびＰＤＧＦが挙げられる。「転写調節タンパク質」とは、活性化されたときに本発明の調節要素／オリゴヌクレオチド配列に直接、または転写調節タンパク質の複合体または他のアダプタータンパク質を介して間接的に結合して、関連する１または２以上の遺伝子の活性を転写レベルで制御する細胞質または核のタンパク質をいう。それゆえ、転写調節タンパク質は本発明のＤＮＡ調節要素に直接結合することができるし、または他のタンパク質に結合することによって調節要素に間接的に結合し、該他のタンパク質が今度は本発明のＤＮＡ調節要素に結合するかまたは結合しているようにすることができる。例えば、ビールズら、１３Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、１９６ −２０６（１９９３）参照。本明細書において転写調節タンパク質としては、ＳＴＡＴタンパク質（ゾンら、２６４Ｓcience、９５）、ＳＴＦタンパク質（シンドラーら、１３ＥＭＢＯＪ.、１３５０（１９９４））、乳腺特異的核因子（Ｍ ammary Ｇland−Ｓpecific Ｎuclear Ｆactor）（シュミット−ネイ（Ｍ.Ｓchmi dt−Ｎey）ら、６Ｍol.Ｅndochronol.、１９８８（１９９２）；ワカオ（Ｗakao ）ら、１３ＥＭＢＯＪ.、２１８２−２１９１（１９９４）；およびワカオら、２６７Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、１６３６５（１９９２））、ＡＰＲＦ（ウェジェンカ、１３Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、２７６）、ＧＨＩＦ（メイヤー、２６９Ｊ.Ｂiol.Ｃ hem .、４７０１）；ＩＬ−４ＳＴＡＴ（ホウ（Ｈou）ら、２６５Ｓcience１７０１−１７０６（１９９４））、ＧＨＳＦおよびＥＰＯＳＦ（フィンブルーム、１４Ｍol.Ｃell.Ｂio.、２１１３）として当該技術分野で呼ばれているタンパク質、並びにすべての実質的に相同な類似体および対立遺伝子変異体が挙げられるが、これらに限られるものではない。「関連する１または２以上の遺伝子の発現を転写レベルで制御する」とは、かかる１または２以上の遺伝子の転写速度を変化させることを意味する。「ＳＴＡＴタンパク質」とは、ロックフェラー大学のダーネル博士によって「転写のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター」（ＳＴＡＴ）として示された転写調節タンパク質をいう。ゾンら、２６４Ｓcience ９５参照。本明細書においてＳＴＡＴタンパク質は、ｐ９１（ＳＴＡＴ１α）タンパク質、ｐ８４（ＳＴＡＴ１β）タンパク質、ｐ１１３（ＳＴＡＴ２）タンパク質およびＳＴＡＴ関連ｐ４８ファミリーのタンパク質を包含する。ビールズら、１２Ｍol.Ｃe ll.Ｂiol .、３３１５（１９９２）。さらに、ＳＴＡＴタンパク質はまた、ＳＴＡＴ３と呼ばれる結合タンパク質（ゾンら、９１Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.、４８０６−４８１０（１９９４）；ゾン、２６４Ｓcience ９５）、およびＳＴＡＴ４と呼ばれる結合タンパク質（上記文献）をも包含する。加えて、ＭＧＦは現在、ＳＴＡＴ５と呼ばれており（グイヨー（Ｇouilleux）ら、１３ＥＭＢＯＪ.、４３６１−４３６９（１９９４））、ＩＬ−４−ＳＴＡＴは研究者によりＳＴＡＴ６と呼ばれている（イールら、１１Ｔrends in Ｇenetics、６９（１９９５））。以上のＳＴＡＴタンパク質のすべての実質的に相同な類似体および対立遺伝子変異体もまた包含される。「活性化する」、「活性化された」、「活性化」その他類似の表現は、細胞内の１または２以上の転写調節タンパク質が配列特異的な仕方で本発明のＤＮＡ調節要素／オリゴヌクレオチド配列に直接または間接的に結合することができるように、該転写調節タンパク質が翻訳後に修飾されるか、または構成的に活性であることを意味する。この修飾には、一般に、種々のプロテインキナーゼによる活性化を含む（これに限られるものではない）種々の機構による転写調節タンパク質のリン酸化が含まれる［例えば、シュアイ、２５８Ｓcience、１８０８およびコーエン（Ｐ.Ｃohen）、１７ＴＩＢＳ、４０８（１９９２）参照］。「ＤＮＡ構築物」とは、本発明のオリゴヌクレオチド配列を導入させたプラスミド、ベクター、染色体およびウイルスを含む（これらに限られるものではない）あらゆる遺伝子要素をいう。例えば、ＤＮＡ構築物は、プロモーターが本発明のオリゴヌクレオチド配列に機能的に連結しており、該配列が今度はルシフェラーゼリポーター分子の遺伝子などの異種遺伝子に機能的に連結したベクターであってよい。「プロモーター」とは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに直接または間接的に結合することができ、下流域（３'方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域をいう。本発明の目的のためには、プロモーターはその３' 末端が転写開始部位と結合しており、バックグラウンドを越えるレベルの転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基または要素を含むように上流（５'方向）に延びている。プロモーター内には、転写開始部位（Ｓ１ヌクレアーゼを用いたマッピングにより都合よく定められる）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（共通配列）が認められるであろう。真核細胞のプロモーターには、しばしば（常にではないが）、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＣＡＴ」ボックスが含まれるであろう。原核細胞のプロモーターには、− １０共通配列および−３５共通配列に加えてシャイン−ダルガノ配列が含まれるであろう。「遺伝子」とは、核酸分子であって、その配列に特定のタンパク質の正常な制御された産生に必要なすべての情報を含むものをいう。ＤＮＡ構築物の「異種」領域（すなわち、異種遺伝子）とは、天然では構築物中の他の遺伝子成分と関連して認められることがない一層大きなＤＮＡ構築物内の同定しうるＤＮＡセグメントをいう。それゆえ、異種遺伝子が哺乳動物の遺伝子をコードする場合には、該遺伝子は通常、その採取源の生物のゲノム中では構造ゲノムＤＮＡにフランキングしないプロモーターによってフランキングされるであろう。ＤＮＡ構築物（本発明のオリゴヌクレオチド配列を含む）のプロモーターは、該プロモーターの存在が異種遺伝子（ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび分泌型胎盤アルカリホスファターゼなどのリポーター配列の遺伝子を含む）からの転写に影響を及ぼす場合には該プロモーターは該異種遺伝子に「機能的に連結している」。機能的に連結した配列はまた、同じＲＮＡ転写物に転写される２つのセグメントを含む。それゆえ、プロモーターと「リポーター配列」などの２つの配列は、該プロモーターで開始される転写によって該リポーター配列のＲＮＡ転写物が産生される場合には機能的に連結している。「機能的に連結している」ためには、２つの配列が相互に直ちに隣接している必要はない。宿主細胞は、該細胞中に外来ＤＮＡまたは異種ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ構築物）が導入された場合には、そのようなＤＮＡで「トランスフェクションされた」という。トランスフェクションするＤＮＡは、該細胞のゲノムを構成するように染色体ＤＮＡ中に組み込まれても（共有結合により連結しても）よいし組み込まれなくてもよい。例えば原核細胞、酵母および哺乳動物細胞では、トランスフェクションするＤＮＡはプラスミドなどのエピソーム要素上に保持されてよい。真核生物の細胞に関しては、安定にトランスフェクションされた細胞とは、染色体の複製によって娘細胞により遺伝されるようにトランスフェクションするＤＮＡが染色体中に組み込まれたものをいう。この安定性は、該真核生物細胞がトランスフェクションしたＤＮＡを含有する娘細胞の集団から構成される樹立細胞系またはクローンを確立する能力によって示される。「宿主細胞」とは、正常にまたは必要なｃＤＮＡでトランスフェクションした後に、所定のシグナル伝達分子、シグナル伝達（例えば、キナーゼ）タンパク質、転写調節タンパク質および付属因子に対する関連するレセプター成員を発現することにより、該シグナル伝達分子が細胞表面に結合したときに転写調節要素タンパク質によって媒体された遺伝子転写が行われるようにする細胞株をいう。宿主細胞株は、正常にまたは必要なｃＤＮＡでトランスフェクションした後に、関連するサイトカインレセプター成員、ＪＡＫタンパク質、ＳＴＡＴタンパク質および付属因子を発現することにより、サイトカインが細胞表面に結合したときにＳＴＡＴによって媒体された遺伝子転写が行われるように、サイトカイン応答性であるのが好ましい。図面の簡単な記載本発明を添付の図面に基づいてさらに詳しく説明する。図１は、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４によって活性化された転写調節タンパク質を含む複合体のオリゴヌクレオチド競合データの要約である。各オリゴヌクレオチドの名称（その配列が後に続く）を左側に示す。突然変異したヌクレオチドは下線を付し太字にて示してある。ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４によって活性化されている転写調節タンパク質に結合することに関するＬｙ６ＥＧＡＳ要素（「野性型、ＷＴ」配列と示されている）と競合する各配列の能力は、適当な欄に数字によって示す。図２は、オリゴヌクレオチドの競合実験の例である。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦで処理した細胞からの核抽出物を放射標識したＬｙ６ＥＧＡＳ要素ブローブを添加する前にオリゴヌクレオチド８Ｔ（配列番号：１１）の指示された量とともにインキュベートした。ついで、複合体を非変性ポリアクリルアミドゲル上にて分離し、ついでこれをＸ線フィルムにさらした。得られたオートラジオグラムの複写を示す。ＡおよびＢは、それぞれＳＴＡＴ１α およびＳＴＡＴ３に対応する転写調節タンパク質の複合体の位置を示す。図３は、サイトカインに応答して単一のＬｙ６ＥＧＡＳ要素および選択された調節要素を含む本発明のオリゴヌクレオチド配列によって媒体される転写誘発を示しているグラフである。細胞を本発明の調節要素の単一のコピーまたは野性型Ｌｙ６ＥＧＡＳ要素を含むリポータープラスミド（ルシフェラーゼを発現させる）でトランスフェクションさせた。細胞を示されているようにＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＬＩＦまたはＯＳＭで処理し、未処理細胞で割るところの転写の誘発を実施例に記載されているように決定した。ＴＫ lucコントロールリポーターは調節要素を欠如している。図４は、サイトカインに応答して複数の調節要素によって媒体される転写誘発を示しているグラフである。細胞をＬｙ６ＥＧＡＳ要素または本発明の調節要素を含む７Ｃまたは８Ａオリゴヌクレオチドの４つのコピーを含むリポータープラスミドでトランスフェクションし、示されたサイトカインで処理し、ついで実施例にて記載されているように誘発倍数（fold induction）を計算した。図５は、ＳＴＡＴ１αに対するＬｙ６ＥＧＡＳ要素および本発明の調節要素を含む７Ｃ、８Ａ、４Ｇおよび８Ｔオリゴヌクレオチドのイン・ビトロでの結合アフィニティーと、同要素の４つのコピーを含む構築物からのＩＦＮ−γに応答する転写誘発との比較である。最初の欄には、調査された調節要素を挙げている。次の欄は、イン・ビトロでのＳＴＡＴ１αに結合する各要素の能力を示す（データは図１から採用）。最後の欄は、列挙された調節要素の４つのコピーを含むリポータープラスミドでトランスフェクションした細胞におけるＩＦＮ−γに応答するルシフェラーゼ活性の誘発倍数を示す。図６は、サイトカインに応答するＳＴＡＴ１αおよびＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を示す一連のゲルパネルである。細胞を表示した時間、ＩＦＮ−γ、ＬＩＦ、ＩＬ−６またはＯＳＭで処理し、ついで溶解液を調製した。溶解液をＳＴＡＴ１抗血清（上段のパネル）またはＳＴＡＴ３抗血清（下段のパネル）で免疫沈降した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での分離およびブロッティングの後、タンパク質を図６の左側に示すようにホスホチロシン、ＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３に直接的に向けられた抗血清で検出した。発明の態様の詳細な記載本発明者らは、一連のＤＮＡ調節要素（すなわち、応答要素）が、種々のシグナル伝達分子に応答して、活性化された転写調節タンパク質に直接かまたは間接的に結合し、それによってかかる調節要素に機能的に連結した１または２以上の遺伝子の発現を転写レベルで制御することを見いだした。この点に関し、本発明者らは、驚くべきことに、該Ｌｙ６ＥＧＡＳ応答要素における選択された点変異が、サイトカインによって誘発され活性化された種々の転写調節タンパク質に結合するものからサイトカインによって誘発され活性化された転写調節タンパク質の唯一のタイプまたはクラスにのみに選択的に結合するものへ該要素を変換させうることを見いだした。例えば、配列ＴＡＴＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴ（配列番号９）はＳＴＡＴ１α転写調節タンパク質に選択的である調節要素を産生するが、一方、配列ＴＡＴＴＣＣＣＧＴＡＡＧＴ（配列番号：６）はＳＴＡＴ１αおよびＳＴＡＴ３転写調節タンパク質に選択的である調節要素を産生する。他方、ＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴ（配列番号：１）などのヌクレオチド配列は、ＳＴＡＴ１αおよびＳＴＡＴ３タンパク質を含む種々の異なるサイトカイン誘発転写調節タンパク質、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦサイトカインにより活性化される転写調節タンパク質に応答して、転写の誘発を媒体することができる調節要素を産生する。本発明による調節要素は、ヌクレオチド配列から選択される。この点において、配列番号：９〜１４はＳＴＡＴ１αタンパク質に選択的な調節要素を含み、配列番号：１〜５は種々の転写調節タンパク質を結合する調節要素を含み、配列番号：６〜８はＳＴＡＴ１αおよびＳＴＡＴ３転写調節タンパク質を選択的に結合する調節要素を含む。さらに、これらの調節要素は単独またはさらなるフランキングヌクレオチド配列を伴って、本発明による様々なオリゴヌクレオチド配列を形成する。この点において、このようなヌクレオチド配列は、本発明の調節要素を含む１３から２００の間のヌクレオチドを含むのが好ましい。しかしながら、活性化された転写調節要素を結合することができ、１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を転写レベルで制御することができる、本発明の調節要素を含む２００ヌクレオチドを越える配列は、本発明の範囲に含まれる。本発明のオリゴヌクレオチド配列はまた、基本的な調節要素の２またはそれ以上の「ユニット」の多量体を含んでいてよい。この点において、そのような多量体オリゴヌクレオチド配列は、実際問題として本発明による同じまたは異なる調節要素を約２〜１５ユニット含んでいてよい。しかしながら、理論的には、そのような多量体オリゴヌクレオチド配列中の調節要素の数には限度はない。そのような多量体オリゴヌクレオチド配列は、転写調節タンパク質の検出、単離および／または精製のためのプローブとして有用である。さらに、本発明に従ってプロモーターおよび異種遺伝子を含むＤＮＡ構築物中に用いた場合には、調節要素の多量体は、種々のサイトカインまたは他のシグナル伝達分子に応答した該ＤＮＡ構築物からの該遺伝子の発現を増幅することができる。種々のシグナル伝達分子が、本発明の調節要素／オリゴヌクレオチド配列に直接または間接的に結合する転写調節タンパク質を活性化させる。そのようなシグナル伝達分子の例としては、遊離または結合の両形態での、サイトカインや抗体などのポリペプチド、および細胞表面抗原、細胞の表面またはその近傍に一般に認められるオリゴ糖、ＴＵＢａｇ４（コンスタント（Ｐ.Ｃonstant）ら、２６４Ｓcience 、２６７（１９９４））などの非ペプチド性分子およびこれら分子の合成模倣物が挙げられるが、これらに限られるものではない。それゆえ、本発明は、細胞または他の基体の表面またはその近傍に結合したシグナル伝達分子による細胞−細胞または細胞−基体の転写調節タンパク質活性化を包含する。好ましくは、本発明によるシグナル伝達分子は、本発明の調節要素／オリゴヌクレオチド配列に結合する転写調節タンパク質を活性化するサイトカインを含む。そのようなサイトカインの例としては、インターロイキン２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３および１５（ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ− １２、ＩＬ−１３およびＩＬ−１５）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）、インターフェロンアルファ、ベータおよびガンマ（ＩＦＮ α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、成長ホルモンおよびプロラクチンが挙げられるが、これらに限られるものではない。本発明に従って特に好ましいサイトカインとしては、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、オンコスタチンＭ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｅｐｏ、ＴｐｏおよびＣＮＴＦが挙げられるが、これらに限られるものではない。本発明の調節要素および／またはオリゴヌクレオチド配列はまた、本発明の調節要素／オリゴヌクレオチド配列に対する結合特異性を示す新たな転写調節タンパク質を検出、単離および精製するうえで特に有用であることがわかるであろう。さらに、これら調節要素／オリゴヌクレオチド配列は、新たなＳＴＡＴタンパク質またはＳＴＡＴ関連転写調節タンパク質を見いだすうえで有用であることもわかるであろう。この点において、そのような新たな転写調節タンパク質の検出は以下の技術を用いて行うことができる。ＨｅｐＧ２細胞などの細胞を適当なサイトカイン、例えばＩＦＮγで１５分間処理して１または２以上の転写調節タンパク質の活性化を誘発する。ついで、これら細胞の核および細胞質の抽出物を常法に従って調製し、レビー、３Ｇenes Ｄev.、１３６２およびケスラー、４Ｇenes Ｄev .、１７５３に記載されているように（その開示を参照のため本明細書中に引用する）、特異的な結合をほとんどまたは全く示さないであろう未処理細胞と比較して、調節要素／オリゴヌクレオチド配列への結合を電気泳動モービリティーシフトアッセイにより試験する。さらに、ＤＮＡ調節要素結合活性はまた、細胞膜を添加した細胞質抽出物をサイトカインなどのシグナル伝達分子で処理することによりイン・ビトロで刺激することもできる。転写調節要素に特異的な抗体が利用できる場合には、活性化された転写調節タンパク質への本発明の調節要素の結合を特異的に妨害し、それによって転写調節タンパク質の同定を補助するために該抗体を用いることができる。さらに、本発明の調節要素／オリゴヌクレオチドを用いて同定または精製された未知の転写調節タンパク質は、当該技術分野でよく知られた方法を用い、該転写調節タンパク質に特異的な抗体を調製するために動物を免疫するのに用いることができる。例えば、ハーロウ（Ｅ.Ｈarlow）ら、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａntibodies：ＡＬaboratory Ｍanual）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８８）（その開示を参照のため本明細書中に引用する）を参照。それゆえ、本発明の調節要素／ヌクレオチド配列は、当該技術分野でよく知られた種々の核酸検出系に使用するものと同様に「プローブ」として用いることができるが、本発明のプローブでは核酸配列ではなく、本発明の調節要素／オリゴヌクレオチド配列に特異的に結合するタンパク質を検出するのに用いる点が異なる。そのような核酸検出アッセイの感度は、観察者によってシグナルが検出される方法を変えることによって増大させることができる。例えば、アッセイ感度は、酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識および修飾塩基を含む（これらに限られるものではない）広範囲の種々の検出可能な標識を用いた標識オリゴヌクレオチド配列を用いることによって増大させることができる。例えば、米国特許第４, ５８１,３３３号、同第４,３５８,５３５号、同第４,４４６,２３７号、同第４, ５８２,７８９号、および同第４,５６３,４１７号、ならびにヨーロッパ特許出願第ＥＰ１４４９１４号およびＥＰ１１９４４８号（その開示を参照のため本明細書中に引用する）を参照。それゆえ、本発明によるＤＮＡプローブは、放射性同位体、酵素、蛍光標識、化学標識または修飾塩基などの検出可能な標識で標識した、調節要素を単独でまたは本発明の一層長いオリゴヌクレオチド配列の一部として含むのが好ましい。それゆえ、本発明は、サンプル中の新たな転写調節タンパク質の存在を検出する方法を提供する。そのようなサンプルは、細胞、細胞培養上清、細胞または組織抽出物、またはその特定のフラクション、および血液、血清、尿、唾液などの他の生物液体を含む（これらに限られるものではない）生物学的サンプルが好ましい。本発明の調節要素／オリゴヌクレオチド配列のサンプル中の転写調節タンパク質への結合は、当該技術分野で知られた任意の適当な手段により検出することができる。例えば、直接または間接、または競合結合アッセイを用いることができる。そのようなアッセイにおいて、ついで該標識プローブとサンプル中のタンパク質性物質との会合を検出する。好ましい態様において、放射性標識したヌクレオチドを導入することによりオリゴヌクレオチド配列を修飾する。検出されたら、当該新規転写調節タンパク質を当業者によく知られた種々の技術によりプローブ−タンパク質複合体から分離、精製することができる。例えば、そのような単離および精製は、精製しようとするタンパク質と固定化リガンドとの相互作用を利用したアフィニティークロマトグラフィーに基づいて行うことができる。本発明において、支持体上に固定化した本発明の調節要素および／またはオリゴヌクレオチド配列は固定化リガンドとして働き、これを用いて新たな転写調節タンパク質をサンプルから単離および精製することができる。好ましい態様において、本発明の調節要素／オリゴヌクレオチド配列を固相支持体または担体上に固定化させる。本明細書において「固相担体または支持体」とは、本発明のオリゴヌクレオチド配列／ＤＮＡ調節要素の結合を可能とするあらゆる支持体をいう。よく知られた支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然または修飾したセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが挙げられる。核酸を固相に結合させる方法、これら方法に有用な固相物質、および結合リガンドからタンパク質を溶出する手段は当業者によく知られている。上記特定の方法に加え、アフィニティー分離するに先立って行う精製工程として、硫酸アンモニウム沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、分別沈殿などの１または２以上の追加の方法が挙げられ、これらはすべて当該技術分離でよく知られている。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）として知られる方法もまた有用であり、これは溶質と疎水性であるゲルとの相互作用に基づくものである。疎水性相互作用は高イオン強度において最も強いため、この形態の分離法は塩沈殿またはイオン交換法の後に行うのが都合がよい。ＨＩＣ支持体からの溶出は、溶媒、ｐＨ、イオン強度を変えることによって、またはカオトロープ剤またはエチレングリコールなどの有機修飾剤を加えることによって行うことができる。ＨＩＣの一般原理は、米国特許第３,９１７,５２７号および同第４,０００,０９８号に記載されている。ＨＩＣを用いた特定のタンパク質の精製は、米国特許第４,３３２,７１７号、同第４, ７７１,１２８号、同第４,７４３,６８０号、同第４,８９４,４３９号、同第４, ９０８,４３４号および同第４,９２０,１９６号（その開示を参照のため本明細書中に引用する）に記載されている。本発明の調節要素／オリゴヌクレオチド配列は、プロモーターおよび異種遺伝子に機能的に連結した調節要素／オリゴヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ構築物中に含まれていてよい。一般に、異種遺伝子には、ルシフェラーゼの遺伝子などのリポーター遺伝子が含まれる。この点において、本発明のリポータープラスミドなどの組換えＤＮＡ構築物は、当業者によく知られた通常の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ法を用いて構築することができる。そのような方法は、マニアチス（Ｍaniatis）、フリッチュ（Ｆritsch）＆サンブルック（Ｓa mbrook）、「Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual」（１９８２）；「ＤＮＡＣloning：ＡＰractical Ａpproach」Ｖolumes ＩおよびII（グロバー（Ｄ.Ｎ.Ｇlover）編、１９８５）；「Ｏligonucleotide Ｓynthesis」（ゲイト（Ｍ.Ｊ.Ｇait）編、１９８４）；「Ｎucleic Ａcid Ｈybridization」［ヘイムズ（Ｂ.Ｄ.Ｈames）＆ヒギンズ（Ｓ.Ｊ.Ｈiggins）編、（１９８４）］；「Ａ nimal Ｃell Ｃulture」［フレッシュネイ（Ｒ.Ｊ.Ｆreshney）編、（１９８６）］；「Ｉmmobilized Cells and Ｅnzymes」［ＩＲＬプレス（１９８６）］およびパーバル（Ｂ.Ｐerbal）、「ＡＰractical Ｇuide to Ｍolecular Ｃlonin g」（１９８４）（その開示を参照のため本明細書中に引用する）を含む文献に詳細に説明されている。本発明によるＤＮＡ構築物において有用なプロモーターとしては、適当な宿主細胞中にトランスフェクションされた場合に、本発明の調節要素と一緒になって所望の異種遺伝子の転写を駆動させうるすべての原核細胞、真核細胞またはウイルスプロモーターが挙げられる。適当な原核細胞プロモーターとしては、Ｔ４、Ｔ３、Ｓｐ６およびＴ７ポリメラーゼによって認識されるプロモーター、バクテリオファージλのＰ_RおよびＰ_Lプロモーター、大腸菌の転写調節タンパク質、ｒｅｃＡ、熱ショック、およびｌａｃＺプロモーター、バシラス・サチリスのα− アミラーゼおよびσ−２８−特異的プロモーター、バシラス属のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトマイセスプロモーター、バクテリオファージλ のｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターおよびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターが挙げられるが、これらに限られるものではない。例えば、グリック（Ｂ.Ｒ.Ｇlick）、Ｊ.Ｉnd.Ｍicrobiol.、２７７−２８２（１９８７）；セナチエンポ（Ｙ.Ｃenatiempo）、６８Ｂiochimie、５０５−５１６（１９８６）；ワトソン（Ｊ.Ｄ.Ｗatson）ら、Ｍolecular Ｂiology of the Ｇ ene 、第４版、ベンジャミンカミンズ、メンロパーク、カリフォルニア（１９８７）およびゴッテスマン（Ｓ.Ｇottesman）、１８Ａnn.Ｒev.Ｇenet.、４１５− ４４２（１９８４）（その開示を参照のため本明細書中に引用する）を参照。好ましい真核細胞プロモーターとしては、酵母ｃｙｃ−１プロモーター、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、および酵母ｇａｌ−４遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限られるものではない。グアランテ（Ｇua rante）ら、７８Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ、２１９９−２２０３（１９８１）、ハマー（Ｄ.Ｈamer）ら、１Ｊ.Ｍｏｌ.Ａppl.Ｇen.２７３−２８８（１９８２）、マックナイト、３１Ｃell、３５５−３６５（１９８２）、ベノイスト（Ｃ.Ｂenoist）ら、２９０Ｎature（ロンドン）、３０４−３１０（１９８１）、ジョンストン（Ｓ.Ａ．Ｊohnston）ら、７９Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）、６９７１−６９７５（１９８２）およびシルバー（Ｐ.Ａ.Ｓilver）ら、８１Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）、５９５１〜５９５５（１９８４）（その開示を参照のため本明細書中に引用する）を参照。本発明によるＤＮＡ構築物では、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを用いるのが好ましい。本発明の組換えＤＮＡまたは構築物分子の第三の成員は、配列の如何にかかわらずヌクレオチドのセットからなる「異種遺伝子」である。そのような異種遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型胎盤のアルカリホスファターゼ、ヒト成長ホルモン、ｔＰＡおよびインターフェロンの構造遺伝子が挙げられるが、これらに限られるものではない。本発明の構築物および方法に使用可能な異種遺伝子の一層広範なリストを知りたければ、ボーデ（Ｂeaudet）、３７Ａm.Ｊ.Ｈum.Ｇ en .、３８６−４０６（１９８５）を参照。異種遺伝子は、その生成物をプロモーターおよび本発明の調節要素／オリゴヌクレオチド配列による転写の調節を評価するのに用いるリポーター遺伝子を含むのが好ましい。この「リポーター配列」の発現は、容易に検出可能なリポーター産物（例えば、タンパク質）の生成となる。リポーター配列は、当該技術分野で知られた手段による同定または検出を可能とするかまたは容易とする物理的および化学的特性を該リポーター分子が有するように選択するのが好ましいであろう。一つの態様において、リポーター分子の存在は、該リポーター分子に特異的に結合しうる抗体または抗体断片を用いて検出されるであろう。他の態様において、β−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどのリポーターを酵素的または免疫学的にアッセイすることができる。好ましいリポーター分子はＬＵＣであり、当該技術分野でよく知られている。例えば、ドゥーウエット（Ｊ.Ｒ.Ｄe−Ｗet）ら、７Ｍol.Ｃell Ｂiol.、７２５（１９８７）参照。このものは昆虫の遺伝子であるため哺乳動物細胞には存在せず、該酵素産物を細胞抽出物中で直接アッセイすることができる。酵素活性のレベルは生成した酵素の量に対応し、これが今度は発現レベルを明らかにする。加えて、ＬＵＣｍＲＮＡはまた直接測定することもできる。一般に、ＬＵＣ遺伝子を含む本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するプラスミドを哺乳動物細胞中に導入し、ついで該細胞を集密的となるかまたは集密的に近くなるまで増殖させる。この点において、適当なシグナル伝達分子に応答して１または２以上の転写調節タンパク質を活性化しうるあらゆる宿主細胞を、本発明のＤＮＡ構築物でトランスフェクションすることができる。そのような宿主細胞としては、ＨｅｐＧ２細胞およびＵ９３７細胞（ＡＴＣＣ、ロックビル（Ｒockvil le）、メリーランドから利用可能である）などの哺乳動物細胞が好ましい。リポーター細胞を、転写調節タンパク質を誘発もしくは活性化しうるシグナル伝達分子を含有していると思われる化合物またはサンプル、例えばサイトカインなどのシグナル伝達分子を産生すると思われる細胞と接触させ培地で処理する。ＬＵＣ−産生リポーター細胞を抽出し、得られた可溶性抽出物にルシフェリンおよびＡＴＰを加える。これら化合物の存在下でルシフェラーゼの作用が発光を生じ、これをルミノメーターで検出する。発光量は、細胞抽出物中に存在するルシフェラーゼの量に正比例する。宿主細胞中にトランスフェクションした適当なＤＮＡ構築物を用いることにより、本発明は所望の遺伝子の制御された発現方法を提供する。それゆえ、トランスフェクションした宿主細胞にサイトカインなどのシグナル伝達分子を適用することにより、当業者によく知られた種々の細胞培養法および発酵法によって異種遺伝子の発現を駆動させ、ヒト成長ホルモンなどの所望の生成物を定められた量で産生させることができる。別法として、ＤＮＡ構築物にルシフェラーゼ遺伝子などのリポーター遺伝子が含まれている場合には、宿主細胞中への該ＤＮＡ構築物のトランスフェクションにより、シグナル伝達分子、例えばサイトカインや、サイトカインなどのシグナル伝達分子を産生すると思われる細胞と接触させた培地に応答して、リポーター産物の転写活性を測定する都合のよい手段が得られる。重要なことに、アッセイした転写調節タンパク質によってＬＵＣの転写が活性化される場合には、転写調節タンパク質を欠くコントロールに比べてＬＵＣの合成が増大する。それゆえ、生成したＬＵＣ酵素の量は、本発明の調節要素／オリゴヌクレオチド配列（ＬＵＣ遺伝子に機能的に連結している）に結合した活性化された転写調節タンパク質によって誘発された転写の間接的な測定手段である。ＨｅｐＧ２細胞などの好ましい宿主細胞を本発明によるリポーターＤＮＡ構築物でトランスフェクションした場合、これを、活性化された転写調節タンパク質により遺伝子転写を誘発するシグナル伝達分子のアゴニストまたはアンタゴニストを検出するためのアッセイにおいて利用することができる。本明細書において遺伝子転写のアゴニストまたはアンタゴニストとしては、シグナル伝達経路のいずれかの点において、１または２以上の転写調節タンパク質の活性化および該活性化タンパク質のＤＮＡ調節要素への結合によるシグナル伝達分子と細胞表面レセプターとの相互作用に介在する化合物が含まれる（その最終結果は遺伝子転写の制御である）。さらに、本明細書において遺伝子転写のアゴニストまたはアンタゴニストにはまた、そのようなアゴニストまたはアンタゴニスト特性を有する公知化合物の増強剤も含まれる。アゴニストの検出は、トランスフェクションした宿主細胞を化合物または化合物の混合物と接触させ、所定の期間の後、処理細胞内での遺伝子発現のレベル（例えば、生成したルシフェラーゼのレベル）を測定することにより行うことができる。ついで、この発現レベルを、該化合物または該化合物の混合物の不在下での該リポーター遺伝子の発現レベルと比較する。これら遺伝子発現のレベルに差異が存在するなら、それは、該化合物または該化合物の混合物が細胞内転写調節タンパク質の活性化をサイトカインなどの公知のアゴニストシグナル伝達分子と同様の仕方でアゴナイズするかどうかを示すものである。さらに、処理細胞および未処理細胞で発現されたリポーター産物のレベル間の大きさは、転写調節タンパク質経路による遺伝子転写のアゴニストとしての化合物または化合物の混合物の強度の相対的指標を提供する。別法として、そのようなトランスフェクションした宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物でトランスフェクションした宿主細胞を利用した遺伝子転写の公知のアゴニスト（例えば、ＩＦＮγなどのサイトカイン）に対するアンタゴニストを見いだすために用いることができる。そのようなアッセイにおいて、所望の化合物または化合物の混合物を、所定の濃度に保持した１または２以上の公知のアゴニスト（例えば、サイトカイン）とともに宿主細胞と接触させる。該化合物または該化合物の混合物が宿主細胞中での遺伝子発現のレベルを、該化合物の不在下だが該公知アゴニストの存在下で宿主細胞から得られた遺伝子発現のレベルよりも低いレベルに抑制する程度は、そのような化合物または化合物の混合物のアンタゴニスト特性の相対的強度の指標を与える。それゆえ、本発明は、適当なＤＮＡ構築物およびトランスフェクションした宿主細胞において本発明の調節要素／オリゴヌクレオチドを利用した、遺伝子転写のアゴニストおよびアンタゴニストのアッセイ法を提供する。また、本発明はＳＴＡＴ１α／ＳＴＡＴ３ヘテロダイマー経路を含むＳＴＡＴヘテロダイマー経路のアゴニストおよびアンタゴニストの独特の選択的なアッセイを提供する。さらに、これら方法を利用して見いだされたアゴニストおよびアンタゴニスト化合物は、種々のサイトカインによって誘発された疾患状態および条件に介入するため、またはサイトカインの不足によって引き起こされる疾患状態、例えば炎症、感染、貧血、血球減少症および癌性または前癌性状態を改善するための医薬として用いることができる。つぎに、本発明を下記実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。実施例１異なるサイトカイン活性化ＤＮＡ結合タンパク質に対する本発明の調節要素の相対的なアフィニティーを決定するために以下の実験を行った。インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−６、ＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦで処理した細胞からの核抽出物を、該Ｌｙ６ＥＧＡＳ要素からなる放射性標識したＤＮＡを添加する前に、標識していない様々な濃度の競合的ＤＮＡ（すなわち、本発明の潜在的な調節要素／オリゴヌクレオチド配列：「試験」配列）とともにインキュベートした。ついで、サイトカイン誘発ＧＡＳ結合複合体を非変性ポリアルリルアミドゲル上で分離し、ついでこれをオートラジオグラフィーにかけた。特定のサイトカイン誘発複合体の結合に対して「試験」配列が標識Ｌｙ６ＥＧＡＳ要素と競合する能力を、該サイトカイン誘発複合体を示すオートラジオグラフにおいてバンドの強さの減少によって評価した。例えば、図２参照。これらの実験詳細を以下に記す。ＨｅｐＧ２細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerica n Ｔype Ｃulture Ｃollection）、ロックビル、メリーランドから得た）を、２ｍＭのグルタミン、１０％のウシ胎仔血清および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ（Ｄulbecco）改良イーグル培地（バイオ・ウィッタカー（Ｂio Ｗhittaker）、ウォーカーズビル、メリーランド）中、９０ｍｍの組織培養皿で生育した。細胞が７０％の集密性（confluency）に達したとき、細胞を５ｎｇ／ｍｌのヒトインターフェロン−γ（ダーネル（Ｊ. Ｄarnell）、ロックフェラー大学、ニューヨーク、ニューヨーク：ジェンザイム（Ｇenzyme）、ケンブリッジ、マサチューセッツから市販されている）または２０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆ＤＳystems）、ミネアポリス、ミネソタ）で１５分間処理した。Ｕ９３７細胞（ダーネル、ロックフェラー大学、ニューヨーク、ニューヨーク：ＡＴＣＣから市販されている）を、２ｍＭのグルタミン、１０％のウシ胎仔血清および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地（バイオ・ウィッタカー）中、７５ｃｍ²組織培養フラスコで生育した。細胞が２〜５×１０⁵細胞／ｍｌの密度になったとき、細胞を２０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４または１０ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ −ＣＳＦ（両者ともＲ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタから得た）で３０分間処理した。核抽出物を、サドウスキおよびギルマン（Ｍ.Ｚ.Ｇilman）、３６２Ｎature、７９（１９９３）（その開示物を参照のため本明細書に引用する）に記載されているようにＮＰ４０溶菌によって調製した。タンパク質濃度をブラッドフォード（Ｂradford）ダイ結合アッセイ（バイオ・ラド・ラボラトリーズ、ヘルクルス（Ｈercules）、カリフォルニア）を使用して測定した。該Ｌｙ６Ｅ遺伝子プロモーターにおけるＩＦＮ−γ応答要素に基づいたＧＡＳオリゴヌクレオチド（カンら、９０Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.６８０６、（１９９３））を以下の配列を有するオリゴヌクレオチドのアニーリングにより形成した：さらに、電気泳動モービリティーシフトアッセイ（ＥＭＳＡｓ）にて使用される本発明の調節要素を組み入れた二本鎖プローブオリゴヌクレオチドを以下の配列を有するオリゴヌクレオチドのアニーリングにより形成した：ここで、太字で示されるヌクレオチド配列は、本発明の調節要素としての活性を試験されるヌクレオチド配列（その二本鎖相補鎖を含む）に対応する。該アニーリングしたオリゴヌクレオチドを［α³²Ｐ］−ｄＧＴＰまたはｄＡＴＰ（アマーシャム・コーポレーション（Ａmersham Ｃorporation）、アーリントンハイツ（Ａrlington Ｈeights）、イリノイ）の存在下、突出端においてクレノウフラグメント（ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannheim）で充填することにより標識した。オリゴヌクレオチドはナショナル・バイオサイエンスィズ(Ｎational Ｂiosciences)（プリマス(Ｐlymouth)、ミネソタ）またはインテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ（Ｉntegrated ＤＮＡＴechnologi es）、（コラルビル（Ｃoralville）、アイオワ）から購入した。ＥＭＳＡｓは１３ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（シグマ・ケミカル（Ｓigma Ｃhemical）、セント・ルイス、ミズーリ）（ｐＨ７.６）、８０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのフッ化ナトリウム、３ｍＭのモリブデン酸ナトリウム、１ｍＭＤＴＴ、０.１５ｍＭＥＤＴＡ、０.１５ｍＭＥＧＴＡおよび８％のグリセロール（核抽出物からの寄与物も含む）において行い、７５μｇ／ｍｌのポリｄ（Ｉ−Ｃ）ポリｄ（Ｉ−Ｃ）、約０.２ｎｇの放射性標識したＬｙ６ＥＧＡＳ要素、０.５、５.０または５０.０ｎｇの競合配列および１０−１５μｇのタンパク質を含んでいた。放射性標識したＬｙ６ＥＧＡＳ要素を除いた全ての化合物を含む反応液を、１０分間氷上にてインキュベートし、ついで放射性標識したＬｙ６ＥＧＡＳ要素を添加した後、さらに２０分間室温でインキュベートした。ついで、反応液を０.２５ ×ＴＢＥ（１×ＴＢＥは８９ｍＭのトリスホウ酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ［ｐＨ８ .０］）および５％グリセロールを含む５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを４℃で０.２５×ＴＢＥにて２０Ｖ／ｃｍで流し、ついで、乾燥させオートラジオグラフィーにかけた。各「試験」オリゴヌクレオチド（配列番号：１５〜７４）がＩＦＮ−γ、ＩＬ −６、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦによって誘発されるＤＮＡ転写調節タンパク質結合複合体へのＬｙ６ＥＧＡＳ要素の結合と競合する能力を視覚評価し、以下のスケールに従って評価した：０競合の証拠なし。１５０ｎｇの競合剤で特異的な複合体に対応するバンドの強度の５０％未満の減少が認められる。２５０ｎｇの競合剤で特異的な複合体に対応するバンドの強度の５０％を越える減少が認められる。３５ｎｇの競合剤で特異的な複合体に対応するバンドの強度の５０％未満の減少が認められる。４５ｎｇの競合剤で特異的な複合体に対応するバンドの強度の５０％を越える減少が認められる。５０.５ｎｇの競合剤で特異的な複合体に対応するバンドの強度の５０％未満の減少が認められる。６０.５ｎｇの競合剤で特異的な複合体に対応するバンドの強度の５０％を越える減少が認められる。従って、より高い数値は転写調節タンパク質を含む特定の複合体と競合する能力が高いことを示す。２人の別々の科学者によるオートラジオグラムの視覚調査によって数字を割り当て、評価における相違は合意により解決した。所望なら、蛍リン光体イメージャー（phosphoimager）またはデンシトメーター（例えば、バイオーラド研究所から市販されている）の使用により、本明細書で記載する相違を定量的に評価するための方法を提供することができる。オリゴヌクレオチド配列番号１５〜７４の調節要素に関する結合アフィニティーの具体的視覚評価を図１に示す。この点において、図１に示される結果を解釈するときには、該データを特定の数値の値としてではなく傾向として分析すべきである。これはＥＭＳＡアッセイは本来、良好な感度が欠如しているためである。このような変動が生じるのは少なくとも一部は、使用した核抽出物の品質の相違、細胞株の相違、およびタンパク質濃度決定における変動のためである。図１におけるデータを生み出すのに使用したＥＭＳＡのオートラジオグラフの例を図２に示す。とりわけ、図２は、オリゴヌクレオチド配列８Ｔ（配列番号：５３−５４）が特定のサイトカインにより活性化された転写調節タンパク質複合体に競合する能力を示す。これらの図の評価において、ＩＬ−６が３つの特異的ＤＮＡ結合複合体をＨｅｐＧ２細胞にて誘発することを承知していなければならない（ラム（Ｐ.Ｌamb）ら、８３Ｂlood２０６３（１９９４））。従って、ＩＬ −６と記された欄については、評価される該複合体は、最もゆっくり移動するＩＬ−６誘発複合体であり、その位置は図２の「Ｂ」によって示され、ＳＴＡＴ３のホモダイマーからなり（ゾンら、２６４Ｓcience、９５（１９９４）；ラズ（Ｒaz）ら２６９Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２４３９１−２４３９１（１９９４））、従って、ＩＦＮγ複合体において評価されているＳＴＡＴ１α（ｐ９１）を含む複合体を反映しているものではない。図１におけるデータの分析は、Ｌｙ６ＥＧＡＳ要素内の種々の位置における点変異が、その結果得られる配列のサイトカインにより活性化された転写調節タンパク質への結合能力に深く影響を及ぼすことを示している。該変異の幾つかは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４によって活性化された転写調節タンパク質に対する結合を排斥するかまたは劇的に弱くする。他の変異は、例えば配列９Ｇ（配列番号：５９〜６０）のように、天然のＬｙ６ＥＧＡＳ（例えば、ＷＴ）配列よりこれらのタンパク質に一層堅固に結合する配列という結果となる。驚くべきことに、幾つかの変異はその結果得られる配列のサイトカインにより活性化された転写調節タンパク質への結合能力を選択的に変える。これらの配列は、２つのクラスになる；ＩＦＮ−γにより活性化されたタンパク質ＳＴＡＴ１αには結合するがＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４によって活性化されたタンパク質には結合しないもの、およびＩＦＮ−γにより活性化されたタンパク質ＳＴＡＴ１αおよびＩＬ−６により活性化されたタンパク質ＳＴＡＴ３には結合するが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４によって活性化されたタンパク質には結合しないものである。前者のクラスの配列の例は配列８Ｔ（配列番号：５３〜５４）であり、後者のクラスの例は配列７Ｃ（配列番号：４９〜５０）である。配列８Ｔの顕著な選択性は図で証明されている。この配列は、ＩＦＮ−γによって誘発されたＳＴＡＴ１α複合体への結合に対して競合するが（図２で「Ａ」により示されている）、それは反応液に添加する８Ｔの量を増加させたときに、このバンドの強度の減少によって証明されている。しかしながら、ＩＬ−６によって誘発された複合体ＳＴＡＴ３（図２の「Ｂ」表示）およびＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４によって誘発された複合体は、この配列の存在によって影響されない。ＩＬ−６はＨｅｐＧ２細胞において少量のＳＴＡＴ１αを誘発し（ラムら、８３Ｂlood２０６３）、この複合体もまた配列８Ｔの添加によって強度が減少することに注意。該ＩＦＮ−γにより活性化されたタンパク質（ＳＴＡＴ１α）にのみ結合する配列またはＩＦＮ−γおよびＩＬ−６両方により活性化されたタンパク質（ＳＴＡＴ１αおよびＳＴＡＴ３）に結合する配列によって示された選択性は、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１１およびＩＬ−１０などのＳＴＡＴ１および／またはＳＴＡＴ３を活性化する他のシグナル伝達分子についてもあてはまるであろう。実施例２Ｌｙ６ＥＧＡＳ要素および本発明の調節要素が被験サイトカインに応答して転写誘発を媒体する能力を決定するために、リポータープラスミドをシュアイら、２６１Ｓcience、１７４４−１７４６（１９９３）（その開示を参照のため本明細書に引用する）に記載のように−３５〜＋１０までのＨＳＶＴＫプロモーターを含む修飾したｐＺＬＵＣプラスミドへ調節要素をクローニングすることにより構築した。ＨｅｐＧ２細胞をリン酸カルシウム共沈によってトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションの前日に２×１０⁵／ｍｌの割合で播いた。細胞を、１５μｇ／ｍｌの上述のリポーターおよび５μｇ／ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドｐＣＨ１１０を含むリン酸カルシウム沈澱に５時間かけた。含む場合には、ＳＴＡＴ１α（シュアイら、１９９３）、ＳＴＡＴ３（ゾンら、１９９４）または空発現ベクターを１０μｇ／ｍｌにて存在させた。ついで、培地を変え、該細胞を１６時間再増殖させた。ついで組換えサイトカインを該培地に直接添加し（ＩＦＮ−γ、５ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍｌ；ＬＩＦ１０ｎｇ／ｍｌおよびＯＳＭ１０ｎｇ／ｍｌ）、該細胞を５時間後に回収した。細胞を溶解し、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を常套技術により決定した。ルシフェラーゼアッセイから得られた相対的な発光ユニットを、発色基質を用いて測定した同じ溶解度でのβ−ガラクトシダーゼ活性で除することにより、標準化応答を決定した。各ポイントは３つの実験からの平均的な標準化された応答を表している。上記のように構築し、Ｌｙ６ＥＧＡＳ要素または本発明の４Ｇ（配列番号：２９、３０）、８Ｔ（配列番号：５３、５４）、６Ｔ（配列番号：４１、４２）、２Ｃ（配列番号：１９、２０）、９Ｇ（配列番号：５９、６０）および７Ｃ（配列番号：４９、５０）調節要素含有オリゴヌクレオチド配列の単一のコピーを含有するリポータープラスミドをＨｅｐＧ２細胞に導入し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ− ６、ＬＩＦまたはＯＳＭのいずれかに応答してルシフェラーゼ活性を誘発する能力を試験した。コントロールプラスミドであるＴＫｌｕｃ（調節要素を欠如している）も試験した。その結果を図３に示す。全ての場合において、トランスフェクションした細胞のＩＦＮ−γまたはＬＩＦ処理はルシフェラーゼ活性を全く誘発しなかった。驚くべきことに、ＩＬ−６およびＯＳＭの両処理は、リポーター構築物の幾つかについてバックグランドを越えるルシフェラーゼ活性を誘発する結果となった。ＩＬ−６またはＯＳＭによる誘発の程度は、選択されたオリゴヌクレオチドの調節要素がＳＴＡＴタンパク質に結合する能力と相関があった。オリゴヌクレオチド７Ｃ（ＳＴＡＴ１αおよび３によく結合する）を含む構築物は最大の誘発をもたらし、一方、オリゴヌクレオチド２Ｃおよび６ＴのようなＳＴＡＴへの結合の良くない調節要素を含む構築物は誘発が低かった。これらの実験から本発明者らは、ＩＦＮ−γまたはＬＩＦではなくＩＬ−６およびＯＳＭがこれらの細胞において本発明の単一の調節要素からの転写を効果的に活性化することができると結論する。従って、本発明による単一の調節要素を含むリポータプラスミドはサイトカイン応答性において驚くほどの選択性を示している。本発明者らは次に、選択された調節要素の多量体を形成することによる効果を試験した。調節要素４Ｇ、７Ｃ、８Ｔおよび８Ａの４コピーを含むリポーター構築物ならびにＬｙ６ＥＧＡＳ要素の４コピーを含むリポータ構築物を４つの試験サイトカインに対する応答性に関してアッセイした（図４）。４×４Ｇおよび４×８Ｔを除く全ての構築物はＩＬ−６およびＯＳＭに応答性を有し、対応する単一の要素を有する構築物よりはるかに大きな誘発を有した。しかしながら、誘発の程度はイン・ビトロにおいてＳＴＡＴに結合する該要素の能力に常関係があるわけではなかった。従って、イン・ビトロにおいてＳＴＡＴ１αおよびＳＴＡＴ３に一層よく結合するにもかかわらず、４×７Ｃリポーターは野性型の４×Ｌｙ６Ｅリポーターより低い誘発しか与えない。これは、サイトカインの不在下での転写レベルの上昇がサイトカインの存在下での転写レベルの上昇より大きいということによるもので、その結果、誘発倍数はより低くなる。単一の要素での結果とは対照的に、４×Ｌｙ６Ｅ、４×７Ｃおよび４×８Ａ構築物はまたＩＦＮ− γに応答して相当な量の誘発を生じた。本発明者らはまた、ＩＬ−６またはＯＳＭの誘発に対するＩＦＮ−γ誘発の割合に関して、４×８Ａ構築物と他の構築物の間の相違を観察した。該４×８Ａ構築物は、他の試験した構築物とは対照的に、ＩＬ−６またはＯＳＭに対する応答よりＩＦＮ−γに対する応答において再現可能に一層大きな誘発を与えた。これはおそらく、該８Ａ変異体がＳＴＡＴ３含有複合体よりもＳＴＡＴ１α含有複合体に優先的に結合することを反映しており、サイトカインに対する応答を決定するうえでの調節要素の正確な配列の重要性を証明している。４Ｇおよび８Ｔ調節要素含有オリゴヌクレオチド配列の４つのコピーを含む構築物は、試験したいずれのサイトカインに対しても応答を示さなかった。これらの両オリゴヌクレオチドは、野性型Ｌｙ６ＥＧＡＳ要素または７Ｃもしくは８Ａ調節要素含有オリゴヌクレオチド配列に比べて結合は弱かったものの（図１の４また５に対して３のレベル）、イン・ビトロ結合アッセイにおいてＳＴＡＴ１ αに優先的に結合する調節要素を含む。４×７Ｃ、４×８Ａおよび４×Ｌｙ６Ｅ構築物による結果を総合すると、これらのデータは、本発明者らのスケールでＳＴＡＴ１αに対して４またはそれより大きいイン・ビトロ結合アフィニティーを有している調節要素のみが、ＩＦＮ−γのようなＳＴＡＴ１αを活性化するサイトカインに応答して転写誘発を媒介するであろうという予測に導く（図５）。調節要素含有プロモーターからの転写を活性化する能力がＩＦＮ−γ、ＩＬ− ６、ＯＳＭおよびＬＩＦにおいて異なることは、本発明者らにＨｅｐＧ２細胞においてこれらのサイトカインによって誘発されたＳＴＡＴを特徴付けることを促した。細胞をＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＯＳＭまたはＬＩＦのいずれかて処理し、溶解液を抗ＳＴＡＴ１または抗ＳＴＡＴ３抗血清（アップステイト・バイオテクノロジー（Ｕpstate Ｂiotechnology，Inc.）、ニューヨークより入手可能）で免疫沈降した。免疫沈降物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分画し、ブロットし、ホスホチロシン抗体を使用してタンパク質を検出した。コントロールとして、同免疫沈降物のアリコートをブロットし、抗ＳＴＡＴ１または抗ＳＴＡＴ３抗血清のいずれかで検出した。その結果を図６に示す。ＩＦＮ−γはＳＴＡＴ１αの速やかなチロシンリン酸化を誘発するが、ＳＴＡＴ３のリン酸化は検出できない。対照的に、ＬＩＦは主にＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を誘発するが、リン酸化されたＳＴＡＴ１αの量は非常に少ない。ＩＬ −６およびＯＳＭはＳＴＡＴ１αおよびＳＴＡＴ３の両方のチロシンリン酸化を誘発し、ＯＳＭはＩＬ−６よりも両方のＳＴＡＴのリン酸化を僅かに多くリン酸化する。これらのＳＴＡＴ活性化のパターンは、ゲル遅延および抗体スーパーシフト実験によって確証されている（データ示さず）。以前のデータ（サドウスキら（１９９３）；ラズら（１９９４）およびゾンら（１９９４））と一致して、本発明者らはこれらの結果を、ＩＦＮ−γはＳＴＡＴ１αのホモダイマーを活性化し、ＬＩＦは主にＳＴＡＴ３のホモダイマーを誘発し、ＩＬ−６およびＯＳＭはＳＴＡＴ１αおよびＳＴＡＴ３のホモダイマーならびにＳＴＡＴ１αとＳＴＡＴ３のヘテロダイマーを誘発することを示していると解釈している。それゆえ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＯＳＭおよびＬＩＦが調節要素含有リポーターからの転写を活性化する能力の差は、ＳＴＡＴ１α、ＳＴＡＴ３または両者を活性化する能力の差異に伴うものである。これらのデータはオリゴヌクレオチド７Ｃ、９Ｇおよび２Ｃなどの単一の調節要素を含むリポータープラスミドが、ヘテロダイマーを形成するように２つのＳＴＡＴ（この場合、ＳＴＡＴ１αおよびＳＴＡＴ３）を活性化するサイトカインに応答性であるという新たな知見の証拠を提供する。該ヘテロダイマーは単一の調節要素からの転写を活性化することができるのに対し、ＳＴＡＴ１αまたはＳＴＡＴ３のホモダイマーはできない。それゆえ、単一の調節要素（本発明の要素を含む）を含むリポーターは、ＩＬ−６などのサイトカインがＳＴＡＴ１αとＳＴＡＴ３の両方を活性化し、ヘテロダイマーの形成を可能にする能力を模倣するアゴニストの選択的な検出に有用である。さらに、該ＤＮＡ構築物はまた、これらのサイトカインのアンタゴニストの検出にも有用である。該データはまた、本発明による７Ｃおよび８Ａなどの調節要素の多量体を含むＤＮＡリポーター構築物が、ＳＴＡＴ１αホモダイマーまたはＳＴＡＴ１α／ＳＴＡＴ３ヘテロダイマーを活性化するがＳＴＡＴ３ホモダイマーは活性化しないサイトカインに応答性であるという新たな知見の証拠を提供する。それゆえ、これらのＤＮＡ構築物は、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−６などのサイトカインがＳＴＡＴ１αホモダイマーまたはＳＴＡＴ１α／ＳＴＡＴ３ヘテロダイマーを活性化する能力を模倣するアゴニストの選択的な検出に有用である。さらに、該ＤＮＡ構築物はまたこれらのサイトカインのアンタゴニストを検出するのに有用である。特許法に従うために、好ましい重量範囲および製造条件の記載を提供したが、本発明の範囲はそれらに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の範囲および本質から離れることなく、本発明に関する各種の修飾および変更をなしえるであろう。従って、本発明の範囲を理解するためには以下の請求の範囲が参照される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/566 33/566 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者セイデル，エイチ・マーティンアメリカ合衆国92122カリフォルニア州サン・ディエゴ、トスカナ・ウェイ5370番アパートメント・エイチ317

Claims

【特許請求の範囲】１．ヌクレオチド配列：を有し、シグナル伝達分子の存在下で活性化された転写調節タンパク質に結合する調節要素を含むオリゴヌクレオチド配列。２．シグナル伝達分子が、ポリペプチド、オリゴ糖、非ペプチド分子およびその合成模倣物よりなる群から選択される、請求項１のオリゴヌクレオチド配列。３．ポリペプチドが、サイトカイン、ホルモン、抗体、細胞表面抗原およびその合成模倣物よりなる群から選択される、請求項２のオリゴヌクレオチド配列。４．転写調節タンパク質がＳＴＡＴタンパク質を含む、請求項１のオリゴヌクレオチド配列。５．ＳＴＡＴタンパク質が、ＳＴＡＴ１αタンパク質、ＳＴＡＴ１βタンパク質、ＳＴＡＴ２タンパク質、ＳＴＡＴ３タンパク質、ＳＴＡＴ４タンパク質、ＳＴＡＴ５タンパク質およびＳＴＡＴ６タンパク質よりなる群から選択される、請求項４のオリゴヌクレオチド配列。６．調節要素が、ＳＴＡＴ１αタンパク質を活性化するサイトカインに応答してＳＴＡＴ１αタンパク質を含む活性化された転写調節タンパク質に選択的に結合する、請求項１のオリゴヌクレオチド配列。７．ヌクレオチド配列：を有する請求項６のオリゴヌクレオチド配列。８．調節要素が、ＳＴＡＴ１αタンパク質および／またはＳＴＡＴ３タンパク質を活性化するサイトカインに応答してＳＴＡＴ１αタンパク質および／またはＳＴＡＴ３タンパク質を含む活性化された転写調節タンパク質に選択的に結合する、請求項１のオリゴヌクレオチド配列。９．ヌクレオチド配列：を有する請求項８のオリゴヌクレオチド配列。１０．調節要素が、ＳＴＡＴ１αタンパク質、ＳＴＡＴ３タンパク質、ＳＴＡＴ５タンパク質および／またはＳＴＡＴ６タンパク質を活性化するサイトカインに応答してＳＴＡＴ１αタンパク質、ＳＴＡＴ３タンパク質、ＳＴＡＴ５タンパク質およびＳＴＡＴ６タンパク質を含む活性化された転写調節タンパク質に結合する、請求項１のオリゴヌクレオチド配列。１１．ヌクレオチド配列：を有する請求項１０のオリゴヌクレオチド配列。１２．サイトカインがＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ− １３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、オンコスタチンＭ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＮＴＦ、およびＬＩＦよりなる群から選択される、請求項３のオリゴヌクレオチド配列。１３．二本鎖である、請求項１のオリゴヌクレオチド配列。１４．プロモーターに機能的に連結した請求項１のオリゴヌクレオチド配列を含み、該プロモーターが異種遺伝子に機能的に連結したＤＮＡ構築物であって、該遺伝子が該オリゴヌクレオチド配列およびプロモーターの転写制御下にあるような仕方で連結されているＤＮＡ構築物。１５．プロモーターが、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ、アデノウイルスのＥ１ｂおよび酵母菌アルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子プロモーターよりなる群から選択される請求項１４のＤＮＡ構築物。１６．異種遺伝子が、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ、ヒト成長ホルモン、ｔ−ＰＡ、緑色蛍光タンパク質またはインターフェロンの構造遺伝子を含む、請求項１４のＤＮＡ構築物。１７．オリゴヌクレオチド配列が請求項１の調節要素の少なくとも１つの多量体を含む請求項１４のＤＮＡ構築物。１８．プロモーターが、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの遺伝子プロモーターを含み異種遺伝子がルシフェラーゼの遺伝子を含む、請求項１４のＤＮＡ構築物。１９．請求項１４のＤＮＡ構築物でトランスフェクションした宿主細胞。２０．ＨｅｐＧ２細胞またはＵ９３７細胞を含む、請求項１９の宿主細胞。２１．シグナル伝達分子および転写調節タンパク質の存在下で、請求項１９の宿主細胞を培養することを特徴とする、異種遺伝子の制御発現方法。２２．シグナル伝達分子がサイトカインを含み、転写調節タンパク質がＳＴＡＴタンパク質を含む、請求項２１の制御発現方法。２３．試料中の転写調節タンパク質の検出方法であって、該試料と請求項１のオリゴヌクレオチド配列を、転写調節タンパク質が活性化され該オリゴヌクレオチド配列と結合して複合体を形成するような条件下で接触させ、ついで試料中の該複合体の存在を検出することを特徴とする検出方法。２４．転写調節タンパク質を得るために試料から複合体を分離し、複合体からオリゴヌクレオチド配列を分離することをさらに含む、請求項２３の方法。２５．化合物が遺伝子転写のアゴニストとして作用する能力の測定方法であって、 (ａ)該化合物を請求項１９の宿主細胞と、異種遺伝子が該化合物に応答して発現することができる条件下に接触させ、ついで (ｂ)工程(ａ)の遺伝子発現のレベルを、該化合物の不在下での宿主細胞からの遺伝子発現のレベルと比較することを特徴とする方法。２６．異種遺伝子が、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、または分泌型胎盤アルカリホスファターゼの構造遺伝子を含む、請求項２５の方法。２７．化合物が遺伝子転写のアンタゴニストとして作用する能力の測定方法であって、 (ａ)該化合物を請求項１９の宿主細胞と、異種遺伝子がシグナル伝達分子に応答して発現する条件下に、予め定めた量のシグナル伝達分子の存在下で接触させ、ついで (ｂ)工程(ａ)の遺伝子発現のレベルを、サイトカインは存在するが該化合物の不在下での宿主細胞からの遺伝子発現のレベルと比較することを特徴とする方法。２８．異種遺伝子が、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質または分泌型胎盤アルカリホスファターゼの構造遺伝子を含む、請求項２７の方法。２９．ヌクレオチド配列：またはその相補鎖を有する調節要素を含むオリゴヌクレオチド配列。３０．請求項２９の調節要素の少なくとも１つの多量体を含む請求項２９のオリゴヌクレオチド配列。３１．化合物がＳＴＡＴヘテロダイマーの誘発をアゴナイズまたはアンタゴナイズする能力の測定方法であって、 (ａ)該化合物を請求項１９の宿主細胞と、異種遺伝子が該化合物に応答して発現することができる条件下に接触させ、その際、該宿主細胞は、活性化されたＳＴＡＴヘテロダイマーに選択的に結合することができる調節要素を含むオリゴヌクレオチド配列の単一コピーを含むＤＮＡ構築物でトランスフェクションされており、ついで (ｂ)工程(ａ)の遺伝子発現のレベルを、該化合物の不存在での宿主細胞からの遺伝子発現のレベルと比較することを特徴とする方法。３２．ＳＴＡＴヘテロダイマーがＳＴＡＴ１α／ＳＴＡＴ３ヘテロダイマーを含む、請求項３１の方法。