【発明の詳細な説明】
交互スプライシングによって生成されるヒトインターロイキン変異体
発明の背景
発明の分野
本発明は、単数又は複数のエキソンの欠失を含み、その発現の結果としてそれ
らの全長対応物の作用を調節するのに有用である切形タンパク質をもたらすよう
なインターロイキンの新しいスプライス突然変異体に関する。
関連技術の説明
インターロイキン−4は、造血細胞及び非造血細胞内の幅広い細胞機能を調節
する、活性化T細胞(Howard et al.(1982)J.Exp.Med.155 :914)、マスト細胞
(Brown et al.(1987)Cell.50:809)及び好塩基球によって分泌される 15kDaの
糖タンパク質である。IL-4の配列は、米国特許第 5017691号に開示されている。
近年になってIL-4の3次元構造が解明された(Powers et al.(1992)Science 2 56
:1673)。このタンパク質は4つの左手αらせんと2つのβシートを含んで
いる。この構造モチーフは、一次配列の相同性を共有しない増々大きくなる成長
因子グループによって共有されている。Powers et al(Powers et al.(1992)Sci
ence 256 :1673)は、成長ホルモン/成長ホルモンレセプタ系に対する類比(De
Vos et al.(1992)Science 255 :306)に基づき、IL-4がそのレセプタのための
2つの結合部位を含んでいることを推測した。第1の部位にはIL-4らせんαA 及
びαC が関与するものと予測され、一
方、第2の部位にはらせんαD 、ストランドBA 及びストランドBA とらせんαB
の間の連結ループが関与するものと予測されている(Powers et al.(1992)Sci
ence 256 :1673)。1つの予測されたIL-4/IL-4レセプタ相互作用部位 Asp31
は、エキソン2のストランドBA 内にある。エキソン2は同様にCys65と分子内
ジスルフィド結合を形成する Cys24をも含んでいる。IL-4δ2 内で発生するこの
ジスルフィド結合の分断は、突然変異体IL-4分子の生物活性にとって重要ではな
い(Kruse et al.(1991)FEBS Letters 286 :58)。
IL-4は、染色体の場所並びに分子の組織及び構造を共有するサイトカインの多
重遺伝子族に属する(Bovlay et al.(1992)J.Biol.Chem.267 :20525)。この遺
伝子族の構成員としては、IL-2,IL-3,IL-4,IL-5及びGM-CSFが含まれる。
IL-4遺伝子と同様に、IL-2遺伝子は4つのエキソンから成り、エキソン2は60
bpで最も短かい(Fujita et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80 :7437)。
IL-2分子がIL-4のものに似た左手アルファらせんとBシートの構成をもつことが
示唆されてきた(Bazan(1992)Science 257 :410)。IL-2のエキソン2(アミノ
酸残基31〜50)は、βシート、短かいαらせん及び、IL-4のエキソン2によって
コードされるものに類似した領域であるらせんαA 及びαB を連結するループ(B
azan(1992)Science 257 :410)をコードする(Powers et al.(1992)Science 2 56
:1673)。IL-2のエキソン2はIL-2分子のうちIL-2レセプタのα鎖(p55)
を結合する部分である(Sauve et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:463
6)。
IL-4は、抗 IgM抗体と休止B細胞との増殖を同時刺激し(Howardet al.(1982)
J.Exp.Med.155 :914)、休止B細胞をアポプトシス(細胞自滅)から救い(Ill
era et al.(1993)J.Immunol.151 :3521)、活性化されたB細胞によるIg産生
を誘発し(Defiance e
t al.(1988)J.Immunol.141 :2000)、そしてマウス内でIgG1及び IgEへのア
イソタイプスイッチ(Coffman et al.(1986)J.Immunol.136 :4538)(Vitetta e
t al.(1985)J.Exp.Med.162 :1726)並びにヒトにおけるIgG4及びIgE(Lundgren
et al.(1989)Eur.J.Immunol.13:131)へのアイソタイプスイッチを調節するも
のであることが立証されてきた。又、IL-4への露呈が、B細胞の表面上でIgM(Sh
ields et al(1989)Immunology 66:224),CD23(10-12)、 MHCクラスII分子(Ro
usset et al.(1988)J.Immunol.140 :2625)(Roehm et al.(1984)J.Exp.Med.16 0
:679)、 LFA-1及びLFA-3(Rousset et al.(1989)J.Immunol.143:1490)及
びIL-4レセプタ(IL-4R)(Renz et al.(1991)J.Immunol.146:3049)分子の数
を増大させることが実証されてきた。T細胞内では、IL-4は、増殖(Fernandez-
Botran et al.(1986)J.Exp.Med.164 :580)(Mosmann et al.(1986)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 83:5654)(Mitchell et al.(1989)J.Immunol.142 :1548)、 T
h2表現型の生成(Fernande z-Botran et al.(1986)J.Exp.Med.164 :580)(Le G
ros et al. (1990)J.Exp.Med.172 :921)及び IL-4Rの発現(Renz et al.(199
1)J.Immunol.146 :3049)を促進することが示されてきた。IL-4は、マスト細
胞の成長を促進する上でIL-3と相乗効果を示す(Mosmann et al.(1986)Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 83:5654)。IL-4はマクロファージを活性化して、殺腫瘍活
性、 MHCクラスII発現及び IgG免疫複合体の結合を増大させる(Crawford et al
.(1987)J.Immunol.139 :135)。赤血球細胞、巨核球及び顆粒球の前駆体…マ
クロファージをIL-4で同時刺激してコロニー形成を増大させることができる(Pes
chell et al.(1987)Blood 70:254)。IL-4は同様に増殖(Feghali et al.(1982)C
lin.Immunol.Immunopathol.63:182)、化学定性(Postlethewaite et al.(199
1)J.Clin.Invest.87
:2147)、細胞外基質の産生(Postlethewaite et al.(1992)J.Clin.Invest
.90:1479)、及び線維芽細胞による細胞間粘着分子−1(ICAM-1)の発現(Pi
ela-Smith et al.(1992)J.Immunol 148 :1375)をも刺激する。
インターロイキン−2(IL-2)は、細胞毒性T細胞の増殖及び分化を刺激する
T細胞(TA)を増幅することによって分泌されるT細胞成長因子である。TC
芽球は、IL-2のための表面レセプタを発現する。IL-2レセプタ(IL-2)は3つの
別々のタンパク質p55(α鎖)、p75(β鎖)、及びp65(δ鎖)から成る、様
々なる組合せの中で、これらの鎖は、異なる親和力及び増殖性シグナルの形質導
入能力をもつさまざまな形の IL-2Rを発生させる(タニグチ et al.(1993)Cell
73:5)。同様にして、 IL-4Rは少なくとも2つの鎖で構成されている。すで
に記述された第1の IL-4R鎖は、 IL-2R及び成長因子レセプタ超科のその他の構
成員に対する著しい相同性を共有している(Idzerda et al.(1990)J.Exp.Med.17 1
:861)。かなり近年になって、 IL-2RのδC 鎖である第2の IL-4R鎖が同定さ
れた(Russell et al.(1993)Science 262 :1877)。 IL-4Rは IL-2Rと同様に
、いくつかの機能的形態を有する可能性がある(Rigley et al.(1991)Int.Immun
ol.3:197)。
IL-4は広範な効果をもつため、IL-4活性の調節が或る種の疾患の結果を決定す
る上での要となると言っても驚くべきことではない。 (Scott et al.(1988)J.Ex
p.Med.168 :1675)(Heinzel et al.(1989)J.Exp.Med.169 :59)(Yamamura et
al.(1991)Science 254 :277)(Zwingenberger et al. (1991)Scand.J.Immunol.3 4
:243)(Wierenga et al.(1990)J.Immunol.144 :465)。マウスリーシュマニア
症(Heinzet et al(1989)J.Exp.Med.169 :59)、ヒトらい病(ヤマムラ et a
l.(1991)Science 254:277)及びヒト住血吸
虫症(Zwingenberger et al.(1991)Scand.J.Immunol. 34:243)においては、IL-4
の産生は、慢性感染と結びつけられる。アレルゲンに応答してのIL-4の産生増加
が、ヒトのアトピー性応答を特徴づけている(Wierenga et al. (1990)J.Immunol
. 144 :465)。IL-4活性の分子調節の研究はこれまで、IL-4遺伝子内でのプロモ
ータ、エンハンサ及び負の調節要素の効果に焦点をあてていた。(Henkel et al
.(1992)J.Immunol.149 :3239)(Li-Weber et al.,(1992)J.Immunol.148 :19
13)(Abe et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:2864)(Li-Weber et al.(
1993)J.Immunol.151 :1371)(Szabo et al.(1993)Mol.Cell.Biol.13:4793)。
発明の要約
従って本発明の主な目的はヒトIL-4のエキソン1,3、及び4を含む単離した
核酸を提供することにある。
本発明のもう1つの目的は、ヒトIL-2のエキソン1,3及び4を含む単離した
核酸を提供することにある。
本発明のもう1つの目的はヒトIL-2及び4のエキソン1,3及び4を含む単離
した核酸についての発現を提供することにある。
本発明のさらにもう1つの目的は、ヒトIL-2及び4のエキソン1,3及び4を
含む単離した核酸の発現の結果としてもたらされるポリペプチドを提供すること
にある。
本発明のさらにもう1つの目的は、ヒトIL-2及び4のエキソン1,3及び4を
含む単離した核酸の発現の結果もたらされるポリペプチドに対する抗体を提供す
ることにある。
本発明のもう1つの目的は、それぞれヒトIL-2及び4のエキソン1,3及び4
を含む単離した核酸の発現の結果としてもたらされるポリペプチドを、それぞれ
ヒトIL-2及び4の生物学的効果を低下さ
せるのに有効な量だけ投与することによって、ヒトIL-2及び4の活性を調節する
方法を提供することにある。
以下で明らかとなる本発明の前述の及びその他の目的利点及び特長に基づき、
本発明の好ましい実施態様の以下の詳細な説明及び添付のクレームを参照するこ
とによって本発明の性質をより明確に理解することができる。
図面の簡単な説明
図1は、2つの IL-4 mRNA種の検出を示す。抗−CD3 MAb 、OKT3で6時間刺激
を受けたヒト末梢血単核細胞(PBMC)から全細胞 RNAを抽出し、次にヒトIL-2の
エキソン1及び4、ヒトIL-4のエキソン1及び4、並びにインターフェロン−δ
(IFN−γ)に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写酵素連鎖反
応(RT-PCR)に付した。同じ反応試験管の中でIL-2,IL-4及び IFN−γのcRNAの
内部標準を同時増幅した。RT-PCR増幅産物を6%のポリアクリルアミドゲル内で
ゲル電気泳動に付した。各対内の5′PCR オリゴヌクレオチドプライマを32Pで
末端標識付けし、増幅産物をオートラジオグラム上で検出できるようにした。レ
ーン1は分子量マーカーを含み、レーン2はIL-2増幅産物を含み、レーン3はIL
-4増幅産物を含み、レーン4は IFN-γ増幅産物を含む。
図2は、HincIIではなく PstIを用いたIL-4δ2 DNA の消化を示す。抗 CD3 M
Ab、OKT3で6時間刺激を受けたヒトPBMCから全細胞 RNAを抽出し、その後、ヒト
IL-4のエキソン1及び4に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-P
CRに付した。5′−PCR オリゴヌクレオチドプライマーを32Pで末端標識付けし
た。RT-PCR混合物のアリコートは不消化であるか(レーン1)又は、それぞれIL
-4エキソン2及び3を消化するHincII(レーン2)又は PstI(レ
ーン3)で消化された。次にRT-PCR増幅産物を6%のポリアクリルアミドゲル中
のゲル電気泳動に付した。ゲルのオートラジオグラムは、HincIIが 362bpの IL-
4 RT-PCT産物を分割するものの 314bpのIL-4δ2 RT-PCR産物を不消化の状態に残
すことを示した。 PstIはIL-4及びIL-4δ2 の両方のRT-PCR産物を分割した。
図3は、IL-4のcDNAとエキソン2が欠如したIL-4のcDNA(IL-4δ2)の配列分析
を示す。IL-4及びIL-4δ2 のRT-PCR増幅産物をPCR(商標)11ベクター内にクロー
ニングしその DNA配列をジデオキシ媒介チェーンターミネーター法(41)を用い
て決定した。IL-4δ2 のcDNAの配列分析は、エキソンIが枠内で直接エキソン3
にスプライシングされた状態でIL-4エキソン1,3及び4の存在を実証した。IL
-4δ2のcDNAと平行して単離、クローニング及び配列決定されたIL4のcDNAの配
列分析は、エキソン1,2,3及び4の予想通りの存在を実証した。IL-4δ2 エ
キソン1−エキソン3スプライス接合部の領域における配列決定ゲルのオートラ
ジオグラムが示されている。
図4は、IL-4及びIL-4δ2 RNA の RNase防御を示す。IL-4エキソン1−エキソ
ン3接合部を含む放射能標識付けされたIL-4δ2 プローブを精製し、活性化され
たPBMC又は酵母tRNAからの未変性合計細胞RNA 15〜20μgに対しハイブリッド形
成させた。ハイブリッド形成しなかった RNAを RNaseIIで消化し、防御された R
NAフラグメントを6%の変性ポリアクリルアミドゲル内でサイズ分離し、オート
ラジオグラフィに付した。
レーン1は分子量マーカーを示し、レーン2は精製されたIL-4δ2 プローブを
示し、レーン3は活性化されたPBMCからの全細胞 RNAの防御を示し、レーン4は
負の対照としてのtRNAの防御を示す。レーン2内の 342bpのバンドは防御された
IL-4δ2 の RNAを表わし、
ぼんやりした 279bpのバンドは防御されたIL-4の RNAを表わす。
図5は異なる健康なドナー中の異なる比率のIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現を
示す。3人の健康な個体からのPBMCを6時間抗−CD3 MAb で刺激した。IL-4及び
IL-4δ2 のmRNAの発現を、IL-4エキソン1及びエキソン4に特異的なオリゴヌク
レオチドプライマーを用いてRT-PCRでテストした。5′−PCR オリゴヌクレオチ
ドプライマーを32Pで末端標識付けし、オートラジオグラムで増幅産物を検出で
きるようにした。次にRT-PCR増幅産物を6%のポリアクリルアミドゲル中でゲル
電気泳動に付した。ゲルのオートラジオグラムは、IL-4対IL-4δ2 mRNAの比率が
、個体1では約2:1(レーン1)、個体2では1:1(レーン2)、個体3で
は1:2(レーン3)であることを示した。レーン4は分子量マーカーを含み、
レーン4は負の対照RT-PCR産物を含む。
図6は、ヒトT細胞クローンによるIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現を示す。γ
/δ T細胞クローン GIL及びα/β CD4+T細胞クローン CASを各々6時間抗
−CD3 mAb で刺激した。各クローンによるIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現につい
て、IL-4エキソン1及びエキソン4に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを
用いてRT-PCRでテストした。RT-PCR産物をアガロースゲルの臭化エチジウム染色
により検出した。クローンGIL(レーン1)及びクローンCAS(レーン2)は両方共、
異なる比率ではあるがIL-4及びIL-4δ2 のmRNAを産生した。
図7は、活性化されたPBMCによるIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現の動態を示す
。PBMCをOKT3 MAbで刺激し、表示の時点で RNAを抽出した。各々のクローンによ
るIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現について、IL-4エキソン1及びエキソン4に特
異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-PCRでテストした。5′−PCR
オリゴヌクレ
オチドプライマーを32Pで末端標識付けした。RT-PCR増幅産物を6%のポリアク
リルアミドゲル中のゲル電気泳動に付した。ゲルのオートラジオグラムが示され
ており、ここでレーン1=0時間、レーン2=3時間、レーン3=6時間、レー
ン4=8時間、レーン5=12時間、及びレーン6=負の対照RT-PCR産物である。
図8は、マウスがIL-4δ2 のmRNAを産生しないことを示す。BALB/cマウスか
らの脾細胞を24時間 PMA及びイオノマイシンで刺激した。 RNAを抽出し、マウス
IL-4エキソン1−及びエキソン4−特異的プライマーを用いてRT-PCRに付した。
ヒトIL-4エキソン1及びエキソン4に特異的なプライマーを用いて抗−CD3 MAb
の刺激を受けたPBMCから並行してヒトIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現を検定した
。RT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動に付し、臭化エチジウム染色により検出
した。IL-4δ2 ではなくIL-4のmRNA発現がマウス脾細胞内で観察され(レーン2
)、一方ヒトPBMCはIL-4とIL-4δ2 のmRNAを両方共発現した(レーン2)。レー
ンMは分子量マーカーを含んでいる。
図9は、2つの IL-2 mRNA種の検出を示す。抗−CD3 MAb 、OKT3の刺激を6時
間受けたヒトPBMCから全細胞 RNAを抽出し、次にヒトIL-2のエキソン1及び4に
特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-PCRに付した。パネルAでは
、5′PCR オリゴヌクレオチドプライマーを32Pで末端標識付けさせており、RT
-PCR増幅産物を6%のポリアクリルアミドゲル中のゲル電気泳動に付した。2つ
のRT-PCR産物が同定された。パネルBでは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よりRT-PCR産物をサイズ分離し、ブロット法によりナイロン膜に移し、IL-2エキ
ソン3特異的プローブ(第1のオートラジオグラム)又はIL-2エキソン2−特異
的プローブ(第2のオートラジオグラム)でハイブリッド形成させた。レーンM
は各ゲル中の
分子量マーカーを含んでいる。レーン1及び3はRT-PCR産物を含み、レーン2及
び4は負の対照RT-PCR産物を含んでいる。2つのバンドはエキソン3に特異的な
プローブでハイブリッド形成し(第1のオートラジオグラム)、一方さらに大き
いバンドのみがエキソン2に特異的なプローブでハイブリッド形成した(第2の
オートラジオグラム)。パネルCに示された類似の実施態様においては、RT-PCR
産物を、IL-2エキソン1/エキソン3接合部特異的プローブでハイブリッド形成
した。レーンMは分子量マーカーを含み、レーン2はRT-PCR産物を含んでいる。
2つのバンドがこのプローブでハイブリッド形成し、より大きいバンド(未変性
IL-2)に比べたより小さなバンド(IL-2δ2)の相対的強度は、パネルA又はBで
見られるものよりもはるかに大きいものであった。
図10は、IL-4遺伝子(配列番号23)の完全な配列を示す(Arai et al,J.Immu
nol.,第 142巻 p0274〜p0282(1989))。本発明のIL-4δ2(配列番号24)は、エキ
ソン1,3及び4によりコードされるがエキソン2にはコードされない配列を含
む。
図11は、IL-2遺伝子の完全な配列を示す(配列番号25)(Fujita et al,Proc.Na
tl.Acad.Sci.第80巻 p7437〜7441(1983))。本発明のIL-2δ2(配列番号26)は、
エキソン1,3及び4によりコードされるもののエキソン2にはコードされない
配列を含む。
発明の好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、交互スプライシングによってIL-4遺伝子から転写される第2のmRNA
イソ型タンパク質であるIL-4δ2 の発現を実証するものである。交互スプライシ
ングは、多数のイソ型タンパク質を単一の遺伝子座から生成できる効率の良いメ
カニズムである。この調節メカニズムにより生成されるイソ型タンパク質は、機
能、細胞局在
化又は発生上の発現パターンに関してさまざまである可能性がある。(Smith et
al.(1989)Annu.Rev.Genet.23:527)。交互スプライシングは、細胞の遺伝的内
容を変えることなくタンパク質の発現を可逆的に修飾するために末端分化した細
胞内で使用される(Smith et al.(1989)Annu.Rev.Genet.23:527)。
IL-4δ2 はまず最初に、サイトカイン遺伝子発現の分析中に付加的なRT-PCR増
幅産物として観察された。cDNAのクローニング及び配列決定により、IL-4δ2 が
IL-4遺伝子のエキソン1,3及び4から成るもののエキソン2では構成されてい
ないことが実証された。エキソン1からエキソン3へのスプライシングは、読取
り枠を変えることなくIL-4δ2 内で起こる:エキソン1及び3は、 IL-4 mRNAに
よって使用されるものとは異なるスプライス供与体又は受容体部位を用いること
なくスプライス接合部において直接相対している。エキソン2が削除されること
以外、IL-4δ2 及びIL-4のmRNAを比較した時点で全タンパク質コーディング領域
内にはその他の変化は全く見られない。今日まで、テストされた全ての人間がIL
-4及びIL-4δ2 のmRNAを両方共発現している。IL-4及びIL-4δ2 のmRNAは両方共
、T細胞活性化と共に増大し、IL-4:IL-4,δ2 のmRNAの比率は増大する。場合
によってはわずかな健康な人間が IL-4 mRNAよりも多くのIL-4δ2(mRNA)を発現
したが、この発見事実はこれらの同じ個体において経時的に維持されなかった。
本発明は同様に、外部事象がIL-4対IL-4δ2 のmRNAの比率を変更しうるというこ
とをも実証している。
本発明のIL-4δ2 は、あらゆるヒト免疫細胞から、好ましくは末梢血単核細胞
(PBMC)及びT細胞から単離され得る。ヒトドナーから得た細胞は、当該技術分
野において既知のあらゆる方法を用いて、つまり好ましくは密度勾配遠心分離法
により、そして好ましくは
Histopagueといった(ただしこれに限られるわけではない)培地を用いて、血液
及びその他の細胞から分離できる。
T細胞サブセット、好ましくはCD4+ α/β T細胞及びγ/δ T細胞を含
む適切な表面マーカーを伴った細胞を、このような細胞サブセットを分離するた
めの当該技術分野における既知の任意の技術を用いて分離することが可能である
。特に好ましい方法は、特異的モノクローナル抗体を介しての正の選択を用いる
ことである。特に好ましいモノクローナル抗体としては、CD4 に特異的な抗−Le
u3a 及びVδ1−Jδ1及びVδ1−Jδ2に特異的なδTCS1がある。
細胞に対する MAbの結合に続いて、分離培地にカップリングされているか又は
ビオチン−アビジンリンケージなどといった特殊なリンケージを介して分離培地
にカップリングされ得る第1の抗体に特異的な第2の抗体を用いて、細胞を処理
することができる。本発明にとって特に好ましいのは、Dynabeads M-450(Dynal
)といった支持体にカップリングされたヒツジ−抗マウス IgGである。
細胞は、ひとたび分離されると、マイトジェン、成長因子及び/又は養育細胞
の存在下でクローニングされる。好ましいマイトジェンとしては、1 −100 μg
/ml好ましくは10μg/mlの濃度のフィトヘマグルチニン(PHA)があるがこれに
限られるわけではない。好ましい成長因子としては、1 −100 U/ml好ましくは
約50U/mlの濃度のIL-2があるが、これに限られるわけではない。好ましい養育
細胞には、好ましくは1000−10,000ラド、好ましくは約3000ラドで照射された同
種異系PBMCがあるが、これに限られるわけではない。細胞は同様に、T細胞の増
殖を刺激しうるハイブリドーマ細胞系統、好ましくはOKT3からの上清で処理する
こともできる。
細胞は任意の適切な培地内で成長させることができるが、RPMIが
好ましい。培地には好ましくは、ヒト血清好ましくはヒト男性AB血清及び/又は
ウシ胎児血清(FCS)といった血清が補足される。血清含有量は3 〜12%、最も好
ましくは全血清の10%である。ヒト男性AB血清及び FCSを最も好ましくは各々5
%ずつの混合で組合せて用いることが、特に好ましい。
その後、細胞を、好ましくはマイトジェン、養育細胞及び成長因子での隔週の
刺激によって拡張させる。表面マーカーの発現は、フローサイトメトリー、螢光
活性化セルソーター (FACS)、免疫組織化学などを用いて確認することができる
。好ましくは、細胞は標準的な技術を用いてFITC接合抗体で処理される。
RNAは当該技術分野において既知のあらゆる手段、好ましくはチオシアン酸グ
アニジニウムを用いて、細胞から抽出され得る。次に既知の方法を用いて好まし
くは M-MLV逆転写酵素及びランダムヘキサマープライマーでcDNAへと RNAを逆転
写することができる。
RNAの逆転写により生成されたcDNAをこのとき、さらなる使用のために増幅さ
せることができる。このような増幅スキームにはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、
リガーゼ連鎖反応(LCR)及びその変形態様が含まれるが、それらに制限されるわ
けではない。このような手順のための条件は、当該技術分野において周知のもの
である。このようにして生成された増幅産物を次に、当該技術分野において周知
のものであるあらゆる技術により分離することができる。特に好ましい方法は、
アガロースゲル上の分離及びDEAE紙上への産物の電気溶出とそれに続くフェノー
ル/クロロホルム抽出によるものである。
このとき、分離され増幅された DNAを配列決定のために適したベクターへと連
結させ、コンピテント細胞へと形質転換させ、そこから DNAを調製することがで
きる。このようなプラスミドの分離は、
当該技術分野において周知の技術によるものである。このとき、 Maxam-Gilbert
配列決定を含む当該技術分野において既知の方法を用いて、又は好ましくはSang
er et alのジデオキシチェーンターミネーション反応によって、 DNAインサート
を配列決定することができる。
問題の RNAは、当該技術分野において既知のあらゆる手段を用いて同定できる
が、特に好ましいのは、 RNA防御検定である。この方法に従うと、問題の RNAに
結合することになる放射能標識付けされたプローブが作られる。放射能標識付け
されたプローブは全細胞 RNAを用いてインキュベートされ、ハイブリッド形成し
なかった RNAは RNaseを用いて消化される。問題の RNAに対する標識づけされた
プローブのハイブリダイゼーションの時点で、問題の RNAは RNaseから防御され
、ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動及びそれに続くオートラジオグラフィに
より同定され得る。
同様にして、問題の DNAをアガロースゲル上で泳動させ、ゲル上の核酸をナイ
ロン又はニトロセルロース膜に移し、 DNAの特徴づけを助けるプローブで膜をハ
イブリッド形成させるサザンブロット法によって、調製されたcDNAを特徴づけす
ることができる。本発明にとって特に好ましいのはインターロイキンのエキソン
/エキソン接合部に広がるプローブである。このようなプローブは、このとき、
交互スプライス突然変異体を同定することができる。
上述の方法は、さまざまなドナー及びそれから得られたさまざまな細胞内の発
現を検出する上で使用するのに適したものである。さらに、スプライス変異体が
細胞の刺激の時点で野生型ポリペプチドと同じ程度まで発現されるか否かを見極
めるため発現の動態を分析することができる。
本発明の交互スプライス変異体は、制限的な意味をもたない例と
して(1)アナフィラキシーショック、ぜん息及び湿疹を含む(ただしこれらに
限られるわけではない)アレルギー反応;(2)リーシュマニア症を含む(ただ
しこれに限られるわけではない)感染症、及び後天性免疫不全症候群(AIDS)に
対するヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗体陽性からの臨床的移行の遅延;(3)全
身性硬化症及び糖尿病を含む(ただしこれらに限られるわけではない)自己免疫
障害;(4)過剰はん痕組織形成、過剰細胞外基質形成、過剰創傷治癒、及び熱
傷治療を含む(ただしこれに限られるわけではない)繊維形成疾患、並びに(5
)内皮細胞が関与する障害(IL-4がこのような細胞の形態を変えることが立証さ
れているため)が挙げられるさまざまな条件を治療するのに使用することができ
る。さらに本発明のスプライス変異体は、全長ポリペプチドの過剰発現から発生
するあらゆる条件の治療においても有用であり得る。
本発明は、IL-4プライマーによるRT-PCRを用いて第2のバンドを増幅するばか
りでなく、独立した1つの方法すなわち RNase防御検定を用いて第2のバンドが
IL-4に関係していることも実証する。本発明は又、分子がエキソン2の削除を除
いてIL-4と同一であることを決定的に示すため、全タンパク質コーディング領域
についての配列データも提供する。
本書に開示された配列データは、IL-4エキソン2がカセットエキソンとして機
能すること(Smith et al.(1989)Annu.Rev.Genet. 23:527)、そしてそれが削除
されたときに読取り枠中でいかなるシフトも起こらないことを示している。 RNa
se防御検定は、防御のためにアンチセンスプローブが用いられたことから、IL-4
δ2 写しがIL-4写しと同じセンス配位で発現されることを実証している。
同様に決定されたのは、エキソン2の交互スプライシングが IL-4 mRNAに独特
のものであるか又はサイトカインにとってのより一般
的な調節メカニズムの一部であるのかということである。テストされたサイトカ
インは、IL-4とタンパク質折りたたみモチーフ、ゲノム組織及びレセプタ細胞外
結合ドメインを共有するIL-2,-3,-5及びGM-CSFであった(Bovlay et al.(1992
)J.Biol.Chem.267 :20525)。本発明は同様に、IL-2もエキソン2の交互スプラ
イシングを使用するもののIL-3,IL-5又はGM-CSFはこれを使用しないことも実証
している。IL-2及びIL-4のスプライス変異体は両方共エキソン2を削除し、これ
らは二次構造の類似の領域をコードし、各々の分子についてのレセプタ結合に参
与する。
交互スプライシングは、人間において、細胞上のレセプタの数及びタイプに応
じて未変性サイトカインのアゴニスト又はアンタゴニストとして機能するIL-4及
びIL-2の変異体を提供するのに使用することができる。規定のアミノ酸置換(57
)を伴うIL-2分子に対する類推によると、IL-2δ2 はなおも中間親和力のIL-2R(
β/δ鎖)に結合し、細胞応答を発生させることになる。α鎖に結合する能力の
喪失が高親和力三分子α/β δ複合体を通して細胞を活性化するIL-2δ2 の能
力を低下させる場合、その原因は、この複合体の構築の無効な開始又は低減のい
ずれかにある。このような場合IL-2δ2 は、高親和力 IL-2Rを通してのIL-2の活
性化の競合的阻害物質である。同様にして、 IL-4Rは、低い方(従来の IL-4R鎖
単独)及び高い方(従来の IL-4R鎖プラスδC)の親和力をもつ少なくとも2つ
の形態を有する(Russell et al.(1993)Science 262 :1877)(Kondo et al.(19
93)Science 262 :1874)。IL-4δ2 は従来の IL-4R鎖に結合し、低い方の親和力
の IL-4Rを通してアゴニストとして役立ち、しかもなお、従来の IL-4R鎖及びδ
Cのヘテロダイマー化を遮断することにより高親和力 IL-4Rを通しての細胞活性
化を拮抗することになる。
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応及び RNase防御検定の両方を用いて、 IL-4
mRNAの第2の種を同定することができる。この新しい IL-4 mRNAは、 IL-4 mRNA
よりも、IL-4エキソン2のサイズである48塩基対だけ小さい。クローニングされ
たcDNAの配列データは、この変異体がIL-4エキソン1,3及び4を含み、エキソ
ン1が1つの読取り枠内でエキソン3に直接スプライシングされていることを実
証している。IL-4δ2 と呼ばれるこの変異体の全タンパク質コーディング領域は
、エキソン2が削除されている点を除いてIL-4と同一である。IL-4δ2 のmRNAは
、テストされた全てのヒトPBMC及びT細胞クローン内で検出されるが、マウス脾
細胞には存在しない。IL-4及びIL-4δ2 のmRNAの両方の量が、T細胞の活性化時
点で増大するが、 IL-4 mRNAはIL-4δ2 mRNAよりも大幅に増大する。同様の実験
は、エキソン2が交互スプライシングによって欠失させられているIL-2のmRNAの
変異体をもヒトが発現するということを示唆している。ヒトIL-3,IL-5及びGM-C
SFはエキソン2を欠失させるのに交互スプライシングを使用しない。かくして、
mRNAの交互スプライシングにより各分子の類似の構造的領域が削除されているよ
うな、ヒトIL-4及びIL-2の両方の変異体が存在する。
発明の好ましい実施態様をさらに詳細に例示する目的で、以下の例を紹介する
。しかしながらこれらの例は、いかなる形であれ、本発明の広い範囲を制限する
ものとしてみなされるべきものではない。
例 1
細胞の分離及びT細胞クローニング
Histopague 1077(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を用いて密度勾配遠心
分離により、健康なドナーからヒトPBMCを分離した。CD4 に特異的な MAb抗Leu3
a(Becton Dickinson,Mountain View,
CA)、及びVδ1−Jδ1−(36)及びVδ1−Jδ2−(Konig et al.(1989)
Eur.J.Immunol.19:2099)でコードされたエピトープを用いて、正の選択を通
してヒトPBMCからCD4 +α/β T細胞クローン CaS、及びγ/δ T細胞クロ
ーン GILを分離した。次に続く、Dynabeads M-450(Dynal Inc.,Great Neck,NY
)にカップリングされたヒツジ抗マウス IgGでの処理及び磁気ビーズ分離をメー
カーの指示に従って実施した。
10μg/mlのPHA(Sigma Chemical Co.)、50U/mlのγヒトIL-2(Hoffman-La R
oche Inc.,Nutley,NJ)及び養育細胞としての照射済み(3000ラド)同種異系PB
MCの存在下で、限界希釈法により、正に選択された細胞を直ちにクローニングし
た。完全組織培地は、5%の熱不活性化されたヒト男性AB血清、5%の熱不活性
化されたFCS、10mMの Hepes、pH 7.4、2 mMのL−グルタミン、1mMのピルビン
酸ナトリウム、 0.1mMの非必須アミノ酸混合物、5 ×10ー5Mの2-ME及び5 μg/
mlの硫酸ゲンタマイシンを含む RPMI-1640であった。T細胞クローンを、 PHA及
び付加的養育細胞での隔週の刺激により2 mlの培養内で拡張させた。同じ濃度の
付加的なγヒトIL-2を4 日に一度添加した。標準的な技術を用いFITC接合された
Leu3a MAb又はFITC接合されたδTC S1 MAb 及びPE接合された抗ヒトLeu-4(CD3
)MAb(Becton Dickinson)での2色フローサイトメトリ分析を用いて、それぞれ
T細胞クローン CAS及び GILによるCD4 及びVδ1の発現を確認した。
例 2
T細胞刺激
抗 CD3 MAb分泌ハイブリドーマOKT3(American Type Culture Collection,Roc
kville,MD)の上清で最終濃度10%となるまで補足された完全組織培地中の2 ml
の培養内で、PBMC(5 ×106)又は5 ×10
6
のクローニングされたT細胞と 2.5×106 の照射(3000ラド)された同種異系P
BMCを刺激した。OKT3上清のこの濃度は、以前に、T細胞増殖を最適に刺激する
ものであることが以前に確認されている。
例 3
RNAの分離とRT-PCR
酸性チオシアン酸グアニジニウム−フェノールクロロホルム抽出により、PBMC
、T細胞クローン及びBALB/c脾細胞から全細胞 RNAを単離した(Chomczynski
et al.(1987)Anal.Biochem.162,156)。65℃で5 分間1μgの RNAを変性さ
せ、次に、 200Uの M-MLV逆転写酵素(Bethesda Research Labs(BRL),Bethe
sda,MD)、50mMのトリス−HCl 、pH 8.3、75mMの KCl、8 mMの DTT、3 mMの Mg
Cl2、各々 0.5mMのdATP,dCTP,dGTP,dTTP(Pharmacia LKB Biotechnology,Pis
cataway,NY)、1U/mMのRNasin(Promege,Madison,WI)及びランダムヘキサ
マープライマー(BRL)を含む15μMの反応混合物を用いて、cDNAへと逆転写させ
た。この反応混合物を1時間37℃でインキュベートした。2.5μlのcDNA混合物
、50mMのトリス−HCl 、pH 8.8、50mMの KCl、4 mMの MgCl2、各々 0.2mMのdATP
,dCTP,dGTP,dTTP、各々 0.4mMの3′及び5′PCRオリゴヌクレオチドプライ
マー、及び0.625Uの Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)を含
む25μlの PCR反応混合物を作った。5′PCR オリゴヌクレオチドプライマーを
、 USBプロトコルに従って、〔γ−32P〕−ATP(Amersham Corporation,Arlin
gton Heights,IL)及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ〔United States Bioche
mical(USB),Cleveland,OH〕で5′末端標識づけをした。 PCR混合物を以下の
通りに増幅させた:すなわち、95℃で30秒間の変性、2 分間60℃でのプライマー
アニーリング及び3分間72℃でのプラ
イマー伸長(15〜30サイクル)とそれに続く最後の7分間の72℃での伸長。10回
の PCR産物を、 2.5%のアガロース又は6%のポリアクリルアミドゲルを通して
ゲル電気泳動に付した。 RNAに代わって H2Oが添加されたモック逆転写酵素反応
の産物を、全ての実験において負の対照増幅として用いた。
これらの実験の中で用いた PCRオリゴヌクレオチドプライマー対は、ヒトIL-2
エキソン1順方向5′−ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT−3′〔配列番号1〕及び
エキソン4逆方向5′GTTAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC−3′〔配列番号2〕;ヒトI
L-3エキソン1順方向5′TCCTGCTCCAACTCCTGG−3′〔配列番号3〕及びエキソ
ン4逆方向5′−GCTCAAAGTCGTCTGTTG−3′〔配列番号4〕;ヒトIL-4対Aエキ
ソン1順方向5′−TCTTCCTGCTAGCATGTGC−3′〔配列番号5〕及びエキソン4
逆方向5′−CGTACTCTGGTTGGCTTTCC−3′〔配列番号6〕−ヒトIL-4対Bエキソ
ン1順方向5′−AAGCTTATGGGTCTCACCTCCCAAC−3′〔配列番号7〕及びエキソ
ン4逆方向5′−GGATCCTCATCAGCTCGAACACTTTGA−3′〔配列番号8〕;マウスI
L-4エキソン1順方向5′−AGCCATATCCACGGATGCGAC−3′〔配列番号9〕及びエ
キソン4逆方向5′−CTCAGTACTACGAGTAATCCAT−3′〔配列番号10〕;ヒトIL-5
エキソン1順方向5′−CTTTTTGCAAAAGCCTTGGCCTCCAAAAAAGC−3′〔配列番号11
〕及びエキソン4逆方向5′−CCATTCTCCGCCCCAAGGCTGACTAATTTTT−3′〔配列
番号12〕;ヒトGM-CSFエキソン1順方向5′−ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTC−3′
〔配列番号13〕及びエキソン4逆方向5′TCACTCCTGGACTGGCTCCCAGCA−3′〔配
列番号14〕;及びヒト IFN−γ順方向5′CAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCT−3′〔配
列番号15〕及び逆方向5′−TGCTCTTCGACCTTGAAACAGCAT−3′〔配列番号16〕で
あった。BamHI及びHindIII制限酵素認識配列は、ヒトIL-4対Bプライマの中で
下線がほどこされている。
IL-2,IL-4及び IFN−γのcRNA内部標準の構築については、本書にその全体が参
考として内含されている Alms,W.J.et al.の中で記述されている。
例 4
RT-PCR産物のクローニング及び DNA配列決定
IL-4及びIL-4δ2 に対する相補的 DNAを生成し、BamHI及びHindIII制限エン
ドヌクレアーゼのための消化部位を含むIL-4エキソン1及び4に特異的なプライ
マを用いてRT-PCRにより増幅した。IL-4及びIL-4δ2 についての増幅産物をDEAE
紙を用いて 2.5%のアガロースゲルから分離した(本書にその全体が参考として
内含されているSambrook,J.et al.(1989)「分子クローニング;実験室マニュ アル
」Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)。2回のフェノール/
クロロホルム抽出の後、cDNA産物を pCRTMIIベクター (Invitrogen Corp,San
Diego,CA)内へ連結させ、次にメーカーの指示に従って INVαF′コンピテン
ト細胞を形質転換するためにこれを用いた。IL-4及びIL-4δ2 のcDNAインサート
を含むプラスミドを従来の技術によって分離し(本書にその全体が参考として内
含されているSambrook,J et al.(1989)「分子クローニング;実験室マニュアル
」Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)、これを配列分析において
使用した。IL-4δ2 cDNAインサートを、M13(−20)順方向プライマ(5′−GT
AAAACGACGGCCAGT−3′〔配列番号17〕及び SequenaseTM(USB)を用いて、ジデオ
キシ媒介のチェーンターミネーション法(本書にその全体が参考として内含され
ているSanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463)によって配列
決定し、7%のLong RangeTM(AT Biochem,Malvern.PA)ゲル内での電気泳動に
より分析した。その後、 RNase防御検定のために、 Taqポリメラーゼにより誘発
された配列エラーの無いIL-4
及びIL-4δ2 cDNAを用いた。
例 5
RNase防御検定
エキソン1−3接合部を伴ってIL-4エキソン1からエキソン4まで広がる 362
bpのIL-4δ2 RT-PCRフラグメントを pCRTMIIベクター内にクローニングした。配
列分析によりインサートの配位を決定した。メーカーのプロトコルに従ってAmbi
on RPAIITM(Ambion Inc.,Austin,TX)を用いて RNase防御検定を行なった。簡
単に言うと、 100ngの SpeI線形化されたIL-4δ2 を含有するプラスミドを、5
ユニットのT7 RNAポリメラーゼ(BRL)、各々 0.5mMのATP,CTP及び GTP、12μM
の UTP及び6μMの 400Ci/mmolの5′〔α=32P〕−UTP(Dupont NEN,Boston
,MA)と45分間37℃でインキュベートすることによって、放射能標識付けされたI
L-4δ2プローブを生成した。IL-4δ2プローブの最終的比活性は、1×109cpm
/μg DNAであった。放射能標識付けされたプローブを6%の変性ポリアクリル
アミドゲルの中でのゲル電気泳動に付し、全長IL-4δ2 プローブをオートラジオ
グラフィによって同定した。プローブを含むバンドをゲルから切除し、2Mの酢
酸アンモニウム、1%の SDS及び25μg/mlの酵母トランスファRNA(tRNA)を含
む 400μlの緩衝液中で37℃でIL-4δ2 プローブを溶出した。80%のホルムアミ
ド、40mMの PIPES、pH 6.4、 400mMのNaCl及び1mMのEDTA緩衝液の中で37℃で16
時間15〜20μgの変性全細胞 RNA又はtRNAを用いて、放射能標識付けされたIL-4
δ2 プローブ (1×106cpm) をハイブリッド形成させた。4000U/ml RNase Tl
(BRL)を含む 200μlの RNase消化緩衝液(Ambion Inc.)を用いて30分間30℃で
、ハイブリッド形成されていない RNAを消化した。 RNaseを不活性化させ、防御
された RNAフラグメントを6%の変性ポリアクリルアミドゲル内でサイズ分離し
、オートラジオグラフィに付した。
ヒトPBMC内のIL-4δ2 mRNAの存在を確認するため RNase防御分析を使用した。
エキソン1−エキソン3スプライス接合部を含むIL-4エキソン1,3及び4を含
む 464bpのIL-4δ2 プローブを放射能標識付けした。このプローブはIL-4δ2 mR
NAの 342bpのフラグメント〔エキソン1のヌクレオチド+136 〜+198 及びエキ
ソン3及び4のヌクレオチド+247 〜+525 〕とハイブリッド形成しこれを防御
すると予想される。さらに、このプローブは、IL-4δ2 及びIL-4がエキソン1,
3及び4を共有することから、 IL-4 mRNAのエキソン1の63bpのフラグメント〔
ヌクレオチド+136 〜+198 〕及び IL-4 mRNAのエキソン3及び4の 279bpのフ
ラグメント(ヌクレオチド+247 〜+525 〕を防御するはずである。抗−CD3刺
激PBMCからの全細胞 RNAの RNase防御により、IL-4δ2(342bp)及びIL-4(279bp
及び63bp)のフラグメントの両方の存在が確認された(図4)。
例 6
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
アガロースゲル電気泳動によりRT-PCR増幅産物をサイズ分離した。30分間、各
々、変性溶液(1.5MのNaCl、 0.5MのNaOH)及び中和溶液(1.5MのNaCl、1Mの
トリス−HCl 、pH 7.4)内で30分間、ゲルを順次浸漬させた。次に20×SSC 緩衝
液内で一晩ブロッティングすることによりナイロン膜にRT-PCR増幅産物を移した
。紫外線照射により膜に対して DNA試料を架橋結合させた。42℃で少なくとも1
時間、6×SSC 、10×Denhardt溶液、 0.1%の SDS及び50μg/mlの精液 DNAの
中で膜を予備ハイブリダイゼーションに付し、次に6×SSC 及び1%のSDS内で4
9℃で 0.2μgの32P 5′末端標識づけされたオリゴヌクレオチドプローブで
一晩ハイブリッド形成させた。10分間室温で6×SSC 及び1%の SDSの中で3回
、膜を洗浄し
、その後最終的に49℃で洗浄した。次に、膜を Phosphor Imager分析(Molecular
Dynamics,Sunnyvale,CA)に付すか又はオートラジオグラフィに付した。サイ
トカイン特異的オリゴヌクレオチドプローブの配列は、ヒトIL-2エキソン2特異
的5′−CTCACCAGGATGCTCACA−3′〔配列番号18〕;ヒトIL-2エキソン3特異的
5′−CCTCTGGAGGAAGTGCTA−3′〔配列番号19〕;ヒトIL-3エキソン1/エキソ
ン3接合部特異的5′−CCTTTGCTGGAAAATAACC−3′〔配列番号20〕;ヒトIL-5
エキソン1/エキソン3接合部特異的5′−GCCAATGAGCACCAACTG−3′〔配列番
号21〕及びヒトGM-CSFエキソン1/エキソン3接合部特異的5′−GCTGAGATGGAG
CCGACC−3′〔配列番号22〕であった。
テストされた全ての供与体から2つの IL-4 mRNA種が検出された(図1)。大
きい方の IL-4 RT-PCR増幅産物は 362bpで、これは IL-4 mRNAの予想されたサイ
ズに対応していた。IL-4δ2 と呼ばれる第2の小さい方のRT-PCR増幅産物は、 3
14bpの見かけのサイズで移動した。 PCR緩衝液のMgCl濃度、プライマーアニーリ
ング温度、及びIL-4エキソン1−及び4−特異的 PCRプライマーの対を変更する
ことで小さい方のRT-PCR産物を削除することはできなかった(データ図示せず)
。全細胞 RNAがRT-PCRに付された時点での小さい方の 314bpのフラグメントの一
貫性ある発現及び IL-4 cRNAが同様にRT-PCRに付された時点の対応する産物の欠
如(図1)は、このフラグメントがIL-4遺伝子写しの交互スプライシングの結果
としての特異的RT-PCR増幅産物であることを示唆していた。IL-4遺伝子は4つの
エキソンと3つのイントロンを内含する(Arai et al.(1989)J.Immunol.142 :
274)。 IL-4 mRNAのRT-PCR産物とIL-4δ2 のRT-PCR産物の間の見かけのサイズ差
は48bpであった。これはIL-4エキソン2のサイズである。 314bpのIL-4δ2 のRT
-PCR産物がIL-4エキソン
2を内含せず一方大きい方の 362bpのIL-4のRT-PCR産物がこれを含んでいたかど
うかをテストするため、それぞれIL-4エキソン2及び3を消化するHincII及び P
stIで両方の産物を消化させた。HincIIはIL-4のRT-PCR産物を分割したが、IL-4
δ2 のRT-PCR産物を未消化のままに残した(図2)。これとは対照的に、 PstI
はIL-4及びIL-4δ2の両方のRT-PCR産物を分割した(図2)。
例 7
IL-4δ2の配列分析
次にIL-4及びIL-4δ2 のRT-PCR増幅産物を pCRTMIIベクター内にクローニング
させ、その DNA配列を決定した(図3)。IL-4δ2 cDNAの配列分析は、エキソン
1が直接エキソン3にスプライシングされた状態で、IL-4エキソン1,3及び4
の存在を実証した。IL-4δ2cDNAと並行して分離、クローニング及び配列決定さ
れたIL-4のcDNAの配列分析は、エキソン2〜エキソン3の枠内スプライス接合部
を伴って、エキソン1,2,3及び4が予想通り存在することを実証した。IL-4
及びIL-4δ2 が両方共、それぞれエキソン2−エキソン3及びエキソン1−エキ
ソン3スプライスにおいて gaa残基5′を含むことに留意されたい。IL-4δ2 の
全タンパク質コーディング領域を通して、その他の配列変更は全く見られなかっ
た。
例 8
健康な人間及びヒトT細胞クローン内のIL-4δ2 のmRNAの発現
25名の健康な人間からのPBMC内で、IL-4及びIL-4δ2 のmRNA発現を分析した。
IL-4及びIL-4δ2 のmRNAは、テストした供与体全ての中で同時発現されたが、相
対比は個体によって異なっていた。この可変性の例が図5に示されている。この
実験においては、3人の個体からのPBMCを6時間抗−CD3 MAb で刺激した。IL-4
対IL-4δ2 のmRNAの相対的発現を、 PCR産物が対数的に増幅された条件を用いて
RT-PCRにより測定した(25サイクル)。IL-4:IL-4δ2 のmRNAの比率は、個体1
における約2:1から個体3における1:2まで変動した。個体2はほぼ等量の
IL-4及びIL-4δ2 のmRNAを発現した。IL-4δ2 mRNAに比べて高いか又は等しいレ
ベルのIL-4の発現が優勢な表現型であり、16:1から1:1の範囲で、テストし
た25人の個体のうち22人に存在した。しかしながら3人の個体が、少なくとも1
回、IL-4のmRNAよりも高いIL-4δ2 のmRNAを発現した。
T細胞がPBMCの中のIL-4δ2 mRNA発現源であったことを確認するため、クロー
ニングしたT細胞をテストした。α/β CD4+T細胞クローン CAS及びα/β
T細胞クローン GILを各々6時間、抗 CD3 MAbで刺激した。クローニングされた
T細胞は両方共IL-4及びIL-4δ2 のmRNAを産生した(図6)。
例 9
IL-4δ2 発現の動態
抗−CD3 MAb によるT細胞の刺激の結果IL-4及びIL-4δ2 のmRNAレベルの両方
がアップレギュレーションを受けるか、並びにIL-4δ2 のmRNAがIL-4のmRNAと独
立して調節されるかを見極めるために実験が行なわれた。PBMCをOKT3 MAbで刺激
し、異なる時点でIL-4δ2 のmRNA対IL-4のmRNAの比率を測定した(図7)。IL-4
δ2 及びIL-4のmRNAは両方共これらのPBMC内で自発的に発現され、この特定の実
験においてIL-4のmRNAはIL-4δ2 のmRNAの 3.5倍であった。IL-4及びIL-4δ2 の
mRNAは両方共PBMC活性化と共に増大したがIL-4のmRNAはIL-4δ2 のmRNAよりもさ
らに増大した。8時間目で、IL-4δ2 のmRNAに比べ7倍のIL-4のmRNAが存在して
いたが、12時間目までに比率はベースラインに戻った。24時間目及び48時間目で
、 IL-4 mRNA対IL-4δ2 mRNAの比率は、約4対1のベースラインにとどまってい
た(データ示さず)。
例 10
マウス内のIL-4δ2 のmRNAの不在。
ヒト及びマウスのIL-4遺伝子は各々、共に48bpのエキソン2を伴って、4つの
エキソンと3つのイントロンで構成されている。マウスが、エキソン2が欠失し
た状態でIL-4の交互スプライシングされた変異体を同様に発現するか否かを決定
するため、BALB/cマウスからの脾細胞を24時間 PMA及びイオノマイシンで刺激
した。 RNAを抽出し、マウスのIL-4エキソン1−及びエキソン4に特異的なプラ
イマを用いてRT-PCRに付した。抗−CD3 MAb で刺激されたPBMCから並行してヒト
IL-4δ2 のmRNAの発現が検定された。刺激を受けたマウス脾細胞内ではIL-4のmR
NAの発現が見られたがIL-4δ2 のmRNAの発現は見られず、一方ヒトPBMCは、IL-4
及びIL-4δ2 の両方がmRNAを発現した(図8)。
例 11
ヒトIL-2のmRNAについてはエキソン2の交互スプライシングが見られるがヒト
IL-3,IL-5及びGM-CSPのmRNAについては見られない。
IL-4はサイトカインの多重遺伝子族に属することから、エキソン2が欠如して
いる変異体を産生するのに交互スプライシングが使用されるか否かを決定するべ
く、IL-2,IL-3,IL-5及びGM-CSFのmRNAを検査した。抗−CD3 MAb OKT3で6時間
刺激したヒトPBMCから分離した全ての RNAを問題のサイトカインのためのエキソ
ン1及びエキソン4特異的 PCRプライマーを用いてRT-PCR増幅に付した。IL-2に
ついて2つのRT-PCR増幅産物が同定された(図9A)。大きい方の増幅産物は 4
58bpでありこれは、未変性 IL-2 mRNAのサイズに対応していた(Fujita et al.
(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:7437)。小さい方の増幅産物は約 398bpで
あり、これはエキソン2を削除したIL-2の交互スプライシングされた変異体と一
貫性あるサイ
ズであった。IL-2についての発見事実とは対照的に、IL-3,IL-5、及びGM-CSFに
ついては各々1つのRT-PCR増幅産物しか同定されなかった(データ図示せず)。
エキソン2が関与する交互スプライス変異体の存在についてさらにテストする
ため、 IL-2 RT-PCR産物をゲル電気泳動により分離し、ナイロン膜に移送し、IL
-2エキソン2又はエキソン3特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブ
リッド形成させた。2つの IL-2 RT-PCR産物がIL-2エキソン3特異的オリゴヌク
レオチドプローブでハイブリッド形成した(図9B)。これとは対照的に、小さ
い方の 398bpの産物はエキソン2特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成せ
ず、一方、より大きな 458bp産物はハイブリッド形成した。このことはすなわち
、小さい方の 398bpの産物がエキソン2の欠如したIL-2の交互スプライス変異体
であることを示唆している。全ての実験においてIL-2δ2 :IL-2のmRNAの比率は
IL-4δ2 :IL-4のmRNAの通常の比率よりはるかに低く、IL-2δ2 のmRNAを検出し
難いものにしていた。IL-2δ2 のmRNAの検出を改善するため、RT-PCR産物をIL-2
エキソン1/エキソン3接合プローブでハイブリッド形成させた(パネルC)。
プローブの各部分はエキソン1又はエキソン3と相同であったことから、オート
ラジオグラム上で大きい方の 458bpバンドとして、未変性 IL-2 cDNAをこのプロ
ーブで検出した。しかしながら、このプローブがエキソン1/エキソン3接合部
を含んでいたことから、IL-2δ2 のmRNAは、小さい方の 398bpのバンドとして容
易に識別された。
類似の研究において、IL-3,IL-5及びGM-CSFについてのRT-PCR産物を電気泳動
によりサイズ分離し、ナイロン膜へ移送し、それぞれIL-3,IL-5及びGM-CSFにつ
いてエキソン1/エキソン3接合配列をコードするオリゴヌクレオチドプローブ
を用いてハイブリッド形成
させた。いかなるRT-PCR産物も、IL-3,IL-5又はGM-CSFエキソン1/エキソン3
特異的プローブでハイブリッド形成しなかった(データ示さず)。
例 12
IL-4δ2 タンパク質に特異的なウサギ抗血清
合成16-merペプチドLNSLTEQKNTTEKETF(配列番号27)を作った。このペプチド
は、IL-4δ2 内のエキソン1−エキソン3接合部に特異的であり、IL-4内には存
在しない。このペプチドを、MAPs樹脂へのカップリングを通して多量体にした。
2匹のウサギを免疫化し追加免疫するのに、精製された多量体ペプチドを用いた
(合計3回の注射)。各々のウサギからの免疫化前血清ではなく免疫化後血清は
、ウェスタンブロット法においてIL-4δ2合成ペプチドを結合するものの、組換
え型ヒトIL-4又はIL-2を結合しない。
例 13
IL-4δ2 タンパク質の存在についての活性化されたヒトT細胞クローンからの 上清の分析
活性化されたヒトT細胞クローンからの上清を獲得し、その中のタンパク質を
SDS-PAGE上に走らせた。SDS-PAGEにより分離されたタンパク質上の例12で得られ
た抗血清を用いて、ウェスタンブロットを実施した。IL-4δ2 −特異的抗血清が
、テストしたすべてとはいわないまでも一部の上清上に見られるIL-4δ2 に結合
した。
本発明についてさまざまな特異的材料、手順及び例を基準にして本書で記述及
び例示してきたが、本発明は、その目的で選択された特定の材料組合せ及び手順
に制限されるものでない。当業者であれば評価できるように、このような詳細の
数多くのバリエーションが関与する可能性もある。
Detailed Description of the Invention
Human interleukin variants produced by alternate splicing
BACKGROUND OF THE INVENTION
Field of the invention
The present invention comprises a deletion of one or more exons, which as a result of its expression.
To provide truncated proteins that are useful in regulating the action of their full-length counterparts
New splice mutant of a novel interleukin.
Description of related technology
Interleukin-4 regulates a wide range of cellular functions in hematopoietic and non-hematopoietic cells
Activated T cells (Howard et al. (1982) J. Exp. Med.155: 914), mast cells
(Brown et al. (1987) Cell.50: 809) and 15 kDa secreted by basophils
It is a glycoprotein. The sequence of IL-4 is disclosed in US Pat. No. 5,017,691.
Recently, the three-dimensional structure of IL-4 has been elucidated (Powers et al. (1992) Science.2 56
: 1673). This protein contains four left-handed α-helices and two β-sheets
I have. This structural motif grows and grows without sharing primary sequence homology.
Shared by factor groups. Powers et al (Powers et al. (1992) Sci
ence256: 1673) is an analogy to the growth hormone / growth hormone receptor system (De
Vos et al. (1992) Science255: 306) based on IL-4 for its receptor
It was speculated that it contains two binding sites. IL-4 helix α at the first siteA Over
And αC Is expected to be involved,
Direction, the second part has a helical αD , Strand BA And Strand BA SpiralB
It is predicted that a connecting loop between the two is involved (Powers et al. (1992) Sci.
ence256: 1673). One predicted IL-4 / IL-4 receptor interaction site Asp31
Is strand B of exon 2A It is inside. Exon 2 is also Cys65And in the molecule
Cys forming a disulfide bondtwenty fourAlso includes. This occurs within IL-4δ2
Disruption of disulfide bonds is not important for the biological activity of mutant IL-4 molecules.
I (Kruse et al. (1991) FEBS Letters286: 58).
IL-4 is a multiplicity of cytokines that share chromosomal location and molecular organization and structure.
Belonging to the heavy gene family (Bovlay et al. (1992) J. Biol. Chem.267: 20525). This remains
Members of the gene family include IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 and GM-CSF.
Like the IL-4 gene, the IL-2 gene consists of four exons, with exon 2 at 60
Shortest in bp (Fujita et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA80 : 7437).
The IL-2 molecule may have a left-handed alpha helix and B-sheet composition similar to that of IL-4.
It has been suggested (Bazan (1992) Science257: 410). Exon 2 of IL-2 (amino
Acid residues 31 to 50) are bound by β-sheet, short α-helix and exon 2 of IL-4.
Helix α, a region similar to that encodedA And αB Loop (B
azan (1992) Science257: 410) (Powers et al. (1992) Science2 56
: 1673). Exon 2 of IL-2 is the α chain of IL-2 receptor (p55) among IL-2 molecules.
(Sauve et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 463
6).
IL-4 co-stimulates proliferation of anti-IgM antibodies and resting B cells (Howard et al. (1982).
J.Exp.Med.155: 914), rescue resting B cells from apoptosis (cell suicide) (Ill
era et al. (1993) J. Immunol. 151: 3521), Ig production by activated B cells
(Defiance e
t al. (1988) J. Immunol.141: 2000), and IgG in the mouse1And IgE
Isotype switch (Coffman et al. (1986) J. Immunol.136: 4538) (Vitetta e
t al. (1985) J. Exp. Med.162: 1726) and IgG in humansFourAnd IgE (Lundgren
et al. (1989) Eur. J. Immunol.13: 131) also adjust the isotype switch to
Has been proven to be. In addition, the exposure to IL-4 caused IgM (Sh
ields et al (1989) Immunology66: 224), CD23 (10-12), MHC class II molecule (Ro
usset et al. (1988) J. Immunol.140: 2625) (Roehm et al. (1984) J. Exp. Med.16 0
: 679), LFA-1 and LFA-3 (Rousset et al. (1989) J. Immunol. 143: 1490) and
And the number of IL-4 receptor (IL-4R) (Renz et al. (1991) J. Immunol. 146: 3049) molecules
Has been demonstrated to increase. In T cells, IL-4 is proliferated (Fernandez-
Botran et al. (1986) J. Exp. Med.164: 580) (Mosmann et al. (1986) Proc. Natl.
Acad.Sci. USA83: 5654) (Mitchell et al. (1989) J. Immunol.142: 1548), T
h2Phenotype generation (Fernande z-Botran et al. (1986) J. Exp. Med.164: 580) (Le G
ros et al. (1990) J. Exp. Med.172: 921) and expression of IL-4R (Renz et al. (199
1) J. Immunol.146: 3049). IL-4 is a mast
Shows a synergistic effect with IL-3 in promoting cell growth (Mosmann et al. (1986) Proc. Na
tl.Acad.Sci. USA83: 5654). IL-4 activates macrophages to kill tumors
Sex, MHC class II expression and IgG immune complex binding (Crawford et al.
. (1987) J. Immunol.139: 135). Precursors of red blood cells, megakaryocytes and granulocytes.
Clophages can be co-stimulated with IL-4 to increase colony formation (Pes
chell et al. (1987) Blood70: 254). IL-4 also proliferates (Feghali et al. (1982) C
lin.Immunol.Immunopathol.63: 182), Chemistry (Postlethewaite et al. (199
1) J. Clin. Invest.87
: 2147), production of extracellular matrix (Postlethewaite et al. (1992) J. Clin. Invest.
.90: 1479), and expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) by fibroblasts (Pi
ela-Smith et al. (1992) J. Immunol148: 1375).
Interleukin-2 (IL-2) stimulates proliferation and differentiation of cytotoxic T cells
T cell (TA) Is a T cell growth factor secreted by amplification. TC
The blasts express the surface receptor for IL-2. There are three IL-2 receptors (IL-2)
Consisting of the separate proteins p55 (α chain), p75 (β chain), and p65 (δ chain),
In different combinations, these chains transduce different affinities and proliferative signals.
Generates various forms of IL-2R that have the ability to enter (Taniguchi et al. (1993) Cell
73: 5). Similarly, IL-4R is composed of at least two chains. Already
The first IL-4R chain described in Section 2 is the IL-2R and other members of the growth factor receptor superfamily.
Shares significant homology to members (Idzerda et al. (1990) J. Exp. Med.17 1
: 861). In recent years, IL-2R deltaC The second IL-4R chain, which is the chain, was identified.
(Russell et al. (1993) Science262: 1877). IL-4R is similar to IL-2R
, May have several functional forms (Rigley et al. (1991) Int. Immun
ol.3: 197).
Since IL-4 has a wide range of effects, regulation of IL-4 activity determines the outcome of certain diseases.
It is not surprising to say that it is the key to success. (Scott et al. (1988) J.Ex.
p.Med.168: 1675) (Heinzel et al. (1989) J. Exp. Med.169: 59) (Yamamura et
al. (1991) Science254: 277) (Zwingenberger et al. (1991) Scand.J.Immunol.Three Four
: 243) (Wierenga et al. (1990) J. Immunol.144: 465). Mouse leishmania
(Heinzet et al (1989) J. Exp. Med.169: 59), human leprosy (Yamamura et a
l. (1991) Science 254: 277) and human schistosomiasis.
Insectosis (Zwingenberger et al. (1991) Scand.J.Immunol.34: 243), IL-4
Is associated with chronic infection. Increased production of IL-4 in response to allergens
Characterize the human atopic response (Wierenga et al. (1990) J. Immunol.
.144: 465). To date, studies on the molecular regulation of IL-4 activity have been carried out in the IL-4 gene.
The focus was on the effects of data, enhancers and negative regulatory elements. (Henkel et al
. (1992) J. Immunol.149: 3239) (Li-Weber et al., (1992) J. Immunol.148: 19
13) (Abe et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 2864) (Li-Weber et al. (
1993) J. Immunol.151: 1371) (Szabo et al. (1993) Mol. Cell. Biol.13: 4793).
SUMMARY OF THE INVENTION
Therefore, the main object of the present invention was to isolate the exons 1, 3 and 4 of human IL-4.
To provide a nucleic acid.
Another object of the present invention is the isolation of exons 1, 3 and 4 of human IL-2.
To provide a nucleic acid.
Another object of the invention is the isolation of exons 1, 3 and 4 of human IL-2 and 4
To provide expression for the selected nucleic acid.
Yet another object of the present invention is to provide exons 1, 3 and 4 of human IL-2 and 4
Providing a polypeptide resulting from expression of an isolated nucleic acid comprising
It is in.
Yet another object of the present invention is to provide exons 1, 3 and 4 of human IL-2 and 4
An antibody to a polypeptide resulting from expression of an isolated nucleic acid comprising
It is to be.
Another object of the present invention is the exons 1, 3 and 4 of human IL-2 and 4, respectively.
A polypeptide resulting from expression of an isolated nucleic acid comprising
Reduced the biological effects of human IL-2 and 4
Regulate human IL-2 and 4 activity by administering an effective amount to induce
To provide a method.
Based on the foregoing and other objective advantages and features of the invention which will become apparent below,
Reference is made to the following detailed description of the preferred embodiments of the invention and the appended claims.
The properties of the present invention can be understood more clearly by and.
Brief description of the drawings
Figure 1 shows the detection of two IL-4 mRNA species. Anti-CD3 MAb stimulated with OKT3 for 6 hours
Total human RNA was extracted from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) that had been subjected to
Exons 1 and 4, exons 1 and 4 of human IL-4, and interferon-δ
Reverse transcriptase chain reaction using an oligonucleotide primer specific for (IFN-γ)
It was subjected to reaction (RT-PCR). IL-2, IL-4 and IFN-γ cRNAs in the same reaction tube
The internal standard was co-amplified. RT-PCR amplification product in 6% polyacrylamide gel
It was subjected to gel electrophoresis. 5'PCR oligonucleotide primers within each pair32At P
The end product was labeled so that the amplification product could be detected on an autoradiogram. Les
Lane 1 contains the molecular weight marker, lane 2 contains the IL-2 amplification product, lane 3 contains the IL.
-4 amplification product, lane 4 contains IFN-γ amplification product.
FIG. 2 shows digestion of IL-4δ2 DNA with PstI rather than HincII. Anti-CD3 M
Total cellular RNA was extracted from human PBMC stimulated with Ab and OKT3 for 6 hours, and then human
RT-P using oligonucleotide primers specific for exons 1 and 4 of IL-4
Attached to CR. 5'-PCR oligonucleotide primer32End labeled with P
Was. Aliquots of RT-PCR mixture are indigestible (lane 1) or IL
-HincII (lane 2) or PstI (residues that digest exons 2 and 3)
3). Next, the RT-PCR amplification product was placed in a 6% polyacrylamide gel.
Gel electrophoresis. The autoradiogram of the gel shows that HincII is 362 bp IL-
4 Split the RT-PCT product but leave the 314 bp IL-4δ2 RT-PCR product undigested
I showed you. PstI cleaved both IL-4 and IL-4δ2 RT-PCR products.
Figure 3 shows the sequence analysis of IL-4 cDNA and IL-4 cDNA lacking exon 2 (IL-4δ2).
Is shown. The RT-PCR amplification products of IL-4 and IL-4δ2 were cloned into the PCR ™ 11 vector.
Using the dideoxy-mediated chain terminator method (41)
Decided. Sequence analysis of the IL-4δ2 cDNA revealed that exon I was directly in-frame with exon 3
The presence of IL-4 exons 1, 3 and 4 in the spliced form was demonstrated. IL
Of the isolated, cloned and sequenced IL4 cDNA in parallel with the -4δ2 cDNA.
Row analysis demonstrated the expected presence of exons 1, 2, 3, and 4. IL-4δ2 d
Sequencing gel otra in the region of the exon 1-exon 3 splice junction
The geogram is shown.
FIG. 4 shows RNase protection of IL-4 and IL-4δ2 RNA. IL-4 exon 1-exo
The radiolabeled IL-4δ2 probe containing the H3N3 junction was purified and activated.
Hybrid form to 15-20 μg of native total cellular RNA from PBMC or yeast tRNA
Was completed. Non-hybridized RNA was digested with RNase II to protect R
NA fragments were size-separated in a 6% denaturing polyacrylamide gel and
Attached to radiography.
Lane 1 shows the molecular weight marker, lane 2 shows the purified IL-4δ2 probe.
Lane 3 shows protection of total cellular RNA from activated PBMC, lane 4 shows
Shows protection of tRNA as a negative control. The 342 bp band in lane 2 was protected
Represents the RNA of IL-4δ2,
The hazy 279 bp band represents protected IL-4 RNA.
Figure 5 shows the expression of different ratios of IL-4 and IL-4δ2 mRNA in different healthy donors.
Show. PBMCs from 3 healthy individuals were stimulated with anti-CD3 MAbs for 6 hours. IL-4 and
The expression of mRNA for IL-4δ2 was expressed by the oligos specific for IL-4 exon 1 and exon 4
Tested by RT-PCR with Rheotide primer. 5'-PCR oligonucleoti
Do primer32The end product is labeled with P and the amplified product can be detected by autoradiogram.
I was able to do it. The RT-PCR amplification product was then gelled in a 6% polyacrylamide gel.
It was subjected to electrophoresis. The gel autoradiogram shows that the ratio of IL-4 to IL-4δ2 mRNA is
Approximately 2: 1 in individual 1 (lane 1), 1: 1 in individual 2 (lane 2), in individual 3
Was 1: 2 (lane 3). Lane 4 contains molecular weight markers,
Lane 4 contains the negative control RT-PCR product.
FIG. 6 shows the expression of IL-4 and IL-4δ2 mRNA by human T cell clones. γ
/ Δ T cell clone GIL and α / β CD4 + T cell clone CAS each for 6 hours
Stimulated with −CD3 mAb. The expression of IL-4 and IL-4δ2 mRNA by each clone was examined.
And the oligonucleotide primers specific for IL-4 exon 1 and exon 4
Used to test by RT-PCR. RT-PCR product is stained with ethidium bromide on agarose gel
Detected by. Both clone GIL (lane 1) and clone CAS (lane 2)
It produced mRNAs for IL-4 and IL-4δ2 at different rates.
FIG. 7 shows the kinetics of IL-4 and IL-4δ2 mRNA expression by activated PBMC.
. PBMCs were stimulated with OKT3 MAb and RNA was extracted at the indicated times. According to each clone
For the expression of IL-4 and IL-4δ2 mRNAs, the expression of IL-4 exon 1 and exon 4
Tested by RT-PCR with different oligonucleotide primers. 5'-PCR
Oligonucleotide
Ochid primer32End labeled with P. RT-PCR amplification product was
It was subjected to gel electrophoresis in a rilamide gel. The autoradiogram of the gel is shown
Where lane 1 = 0 hours, lane 2 = 3 hours, lane 3 = 6 hours,
Lane 4 = 8 hours, lane 5 = 12 hours, and lane 6 = negative control RT-PCR product.
FIG. 8 shows that mice do not produce IL-4δ2 mRNA. BALB / c mouse
Splenocytes were stimulated with PMA and ionomycin for 24 hours. RNA extracted and mouse
RT-PCR was performed using IL-4 exon 1- and exon 4-specific primers.
Anti-CD3 MAbs using primers specific for human IL-4 exon 1 and exon 4
Human IL-4 and IL-4δ2 mRNA expression was assayed in parallel from PBMCs stimulated with
. RT-PCR products are subjected to agarose gel electrophoresis and detected by ethidium bromide staining
did. MRNA expression of IL-4 but not IL-4δ2 was observed in mouse splenocytes (lane 2
On the other hand, human PBMC co-expressed both IL-4 and IL-4δ2 mRNA (lane 2). Leh
M contains a molecular weight marker.
FIG. 9 shows detection of two IL-2 mRNA species. Anti-CD3 MAb, OKT3 stimulation at 6 o'clock
Total cellular RNA was extracted from the interfering human PBMCs and then extracted into human IL-2 exons 1 and 4.
RT-PCR was performed using specific oligonucleotide primers. In Panel A
5'PCR oligonucleotide primer32End labeled with P, RT
-PCR amplification products were subjected to gel electrophoresis in a 6% polyacrylamide gel. Two
RT-PCR products were identified. In panel B, polyacrylamide gel electrophoresis
The RT-PCR product was separated by size, transferred to a nylon membrane by blotting, and the IL-2
Son 3 specific probe (first autoradiogram) or IL-2 exon 2 specific
Hybridization with a static probe (second autoradiogram). Lane M
Is in each gel
Contains molecular weight markers. Lanes 1 and 3 contain RT-PCR products, lanes 2 and 3
And 4 contain the negative control RT-PCR product. The two bands are specific to exon 3
Hybridized with probe (first autoradiogram), while larger
Only the first band hybridized with a probe specific for exon 2 (second
Autoradiogram). In a similar embodiment shown in panel C, RT-PCR
Product hybridized with probe specific for IL-2 exon1 / exon3 junction
did. Lane M contains molecular weight markers and lane 2 contains RT-PCR products.
Two bands hybridized with this probe and a larger band (native
The relative intensity of the smaller band (IL-2δ2) compared to IL-2) is
It was much larger than what you can see.
Figure 10 shows the complete sequence of the IL-4 gene (SEQ ID NO: 23) (Arai et al, J. Immu).
nol., Vol. 142, p0274-p0282 (1989)). IL-4δ2 (SEQ ID NO: 24) of the present invention has an
Contains sequences encoded by Sons 1, 3 and 4 but not by exon 2.
No.
Figure 11 shows the complete sequence of the IL-2 gene (SEQ ID NO: 25) (Fujita et al, Proc. Na
tl.Acad.Sci. 80, p7437-7441 (1983)). IL-2δ2 of the present invention (SEQ ID NO: 26) is
Coded by exons 1, 3 and 4 but not by exon 2
Contains an array.
Detailed Description of the Preferred Embodiments of the Invention
The present invention provides a second mRNA transcribed from the IL-4 gene by alternate splicing.
It demonstrates the expression of the isotype protein IL-4δ2. Alternate splicing
Is an efficient method for producing many isoforms from a single locus.
It is canism. The isoforms produced by this regulatory mechanism are
Noh, cell localization
It may vary with regard to the pattern of expression in development or development. (Smith et
al. (1989) Annu. Rev. Genet.twenty three: 527). Alternating splicing refers to the genetic
Terminally modified cells in order to reversibly modify the expression of the protein without changing the volume.
Intracellular (Smith et al. (1989) Annu. Rev. Genet.twenty three: 527).
IL-4δ2 was the first to add additional RT-PCR during the analysis of cytokine gene expression.
Observed as a width product. By cloning and sequencing the cDNA, IL-4δ2
It consists of exons 1, 3 and 4 of the IL-4 gene but is composed of exon 2.
It was proved that there was not. Splicing from exon 1 to exon 3 is read
Occurring within IL-4δ2 without changing the frame: exons 1 and 3 become IL-4 mRNA
Thus using a splice donor or acceptor site different from that used
Not directly at the splice junction. Exon 2 is deleted
Except IL-4δ2 and IL-4 mRNA, the total protein coding region
There are no other changes within. To date, all tested humans have IL
Both -4 and IL-4δ2 mRNAs are expressed. Both IL-4 and IL-4δ2 mRNAs
, And the ratio of IL-4: IL-4, δ2 mRNA increases with activation of T cells. If
Some healthy humans express more IL-4δ2 (mRNA) than IL-4 mRNA
However, this finding did not persist in these same individuals over time.
The present invention also provides that external events can alter the ratio of IL-4 to IL-4δ2 mRNA.
It also demonstrates.
IL-4δ2 of the present invention is preferably derived from all human immune cells, preferably peripheral blood mononuclear cells.
(PBMC) and T cells. Cells obtained from human donors are
Using any method known in the field, preferably density gradient centrifugation
By, and preferably
Blood using a medium such as (but not limited to) Histopague
And other cells.
T cell subset, preferably CD4+ Includes α / β T cells and γ / δ T cells
Cells with the appropriate surface markers should be isolated from such cell subsets.
Can be separated using any technique known in the art for
. A particularly preferred method uses positive selection via specific monoclonal antibodies
That is. A particularly preferred monoclonal antibody is an anti-Le specific for CD4.
There is δTCS1 specific to u3a and Vδ1-Jδ1 and Vδ1-Jδ2.
Following binding of the MAb to the cells, coupled to a separation medium or
Separation medium via special linkage such as biotin-avidin linkage
The cells with a second antibody specific for the first antibody that can be coupled to
can do. Particularly preferred for the present invention are Dynabeads M-450 (Dynal
And sheep-anti-mouse IgG coupled to a support such as.
The cells, once separated, are mitogens, growth factors and / or nurturing cells.
Cloned in the presence of. The preferred mitogen is 1-100 μg
/ Ml There is phytohemagglutinin (PHA) at a concentration of preferably 10 μg / ml.
It is not limited. Preferred growth factors include 1-100 U / ml, preferably
There is, but is not limited to, a concentration of IL-2 of about 50 U / ml. Favorable parenting
The cells are preferably irradiated at 1000-10,000 rads, preferably about 3000 rads.
There are allogeneic PBMCs, but not limited to this. The cells are similarly enriched for T cells.
Treat with a supernatant from a hybridoma cell line capable of stimulating proliferation, preferably OKT3
You can also.
Cells can be grown in any suitable medium, but RPMI
preferable. The medium is preferably human serum, preferably human male AB serum and / or
Serum such as fetal calf serum (FCS) is supplemented. Serum content is 3-12%, most preferred
It is preferably 10% of total serum. Human male AB serum and FCS most preferably 5 each
It is particularly preferable to use them in combination by mixing each of them with each other.
The cells are then biweekly, preferably with mitogens, feeder cells and growth factors.
Expand by stimulation. Expression of surface markers is determined by flow cytometry, fluorescence
Can be confirmed using activated cell sorter (FACS), immunohistochemistry, etc.
. Preferably, cells are treated with FITC conjugated antibody using standard techniques.
RNA may be prepared by any means known in the art, preferably thiocyanate.
It can be extracted from cells using anidinium. Then use known methods
Reverse RNA into cDNA with M-MLV reverse transcriptase and random hexamer primers
Can be copied.
The cDNA generated by reverse transcription of RNA was then amplified for further use.
Can be made. Such amplification schemes include polymerase chain reaction (PCR),
Ligase chain reaction (LCR) and its variants, including but not limited to
Not only. Conditions for such a procedure are well known in the art.
It is. The amplification product thus generated is then known in the art.
It can be separated by any technique that is A particularly preferred method is
Separation on agarose gel and electroelution of product on DEAE paper followed by pheno
This is due to extraction with chloroform / chloroform.
At this time, the separated and amplified DNA is linked into a vector suitable for sequencing.
It can be ligated and transformed into competent cells from which DNA can be prepared.
Wear. Isolation of such a plasmid
This is based on a technique well known in the art. At this time, Maxam-Gilbert
Using methods known in the art including sequencing, or preferably Sang
DNA inserts by the dideoxy chain termination reaction of er et al.
Can be sequenced.
The RNA in question can be identified using any means known in the art.
However, particularly preferred is an RNA protection assay. If you follow this method,
A radiolabeled probe that will bind will be made. Radioactive labeling
The probe was incubated with total cellular RNA and allowed to hybridize.
The missing RNA is digested with RNase. Labeled for the RNA in question
At the time of probe hybridization, the RNA in question is protected from RNase.
, For electrophoresis on polyacrylamide gel and subsequent autoradiography
More identifiable.
Similarly, run the DNA of interest on an agarose gel and analyze the nucleic acid on the gel.
Ron or nitrocellulose membrane and probe the membrane with a probe to help characterize the DNA.
Characterize the prepared cDNA by Southern blotting with hybrid formation
Can be Particularly preferred for the present invention is the interleukin exon.
/ A probe that spreads to the exon junction. Such a probe would then
Alternating splice mutants can be identified.
The method described above is used for different donors and for different intracellular developments derived from them.
It is suitable for use in detecting the present. In addition, splice variants
Determine whether or not it is expressed to the same extent as the wild-type polypeptide at the time of cell stimulation
Expression dynamics can be analyzed.
The alternative splice variants of the present invention are not limited to non-limiting examples.
(1) Including anaphylactic shock, asthma and eczema
(But not limited to) allergic reactions; (2) including leishmaniasis (only
Infectious diseases and acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)
Delayed clinical transition from positive human immunodeficiency virus (HIV) antibody against (3) all
Autoimmunity including, but not limited to, sclerosis and diabetes
Disorders; (4) excessive scar tissue formation, excessive extracellular matrix formation, excessive wound healing, and fever
Fibrogenic disorders, including (but not limited to) wound healing, and (5)
) Endothelial cell-mediated disorders (demonstrating that IL-4 alters the morphology of these cells
Can be used to treat a variety of conditions, including
You. Furthermore, the splice variants of the present invention arise from overexpression of full-length polypeptide.
It can also be useful in the treatment of any condition
The present invention uses a RT-PCR with IL-4 primer to amplify the second band
The second band using one independent method, the RNase protection assay.
We also demonstrate that it is related to IL-4. The present invention also excludes the deletion of exon 2 in the molecule.
The entire protein coding region to conclusively show that it is identical to IL-4.
Also provides sequence data for.
The sequence data disclosed in this document is based on the IL-4 exon 2 as a cassette exon.
It works (Smith et al. (1989) Annu. Rev. Genet.twenty three: 527), and deleted it
It indicates that no shift occurs in the reading frame when it is done. RNa
The se defense assay uses IL-4 because the antisense probe was used for protection.
We demonstrate that the δ2 transcript is expressed in the same sense configuration as the IL-4 transcript.
Similarly determined that exon 2 alternative splicing is unique to IL-4 mRNA.
Or more commonly for cytokines
Is it part of a dynamic regulatory mechanism? Tested site cards
In, IL-4 and protein folding motifs, genomic organization and receptor extracellular
IL-2, -3, -5 and GM-CSF sharing a binding domain (Bovlay et al. (1992)
) J. Biol. Chem.267: 20525). The present invention also applies to IL-2, which is an alternate splicing of exon 2.
Icing is used but IL-3, IL-5 or GM-CSF is not used
doing. Both IL-2 and IL-4 splice variants deleted exon 2
Et al. Encode similar regions of secondary structure and participate in receptor binding for each molecule.
Give.
Alternating splicing depends on the number and type of receptors on cells in humans.
IL-4 which functions as an agonist or antagonist of native cytokines
And IL-2 can be used to provide variants. Specified amino acid substitution (57
By analogy to the IL-2 molecule with), IL-2δ2 is still of intermediate affinity IL-2R (
(β / δ chain) to generate a cellular response. of its ability to bind to the α chain
The ability of loss to activate cells through the high affinity trimolecular α / βδ complex of IL-2δ2
When reducing the force, the cause is the ineffective initiation or reduction of the assembly of this complex.
There is a gap. In such cases, IL-2δ2 activates IL-2 through the high affinity IL-2R.
It is a competitive inhibitor of sexualization. Similarly, IL-4R is lower (conventional IL-4R chain
At least two with high affinity (single) and higher (conventional IL-4R chain plus δC)
(Russell et al. (1993) Science262: 1877) (Kondo et al. (19
93) Science262: 1874). IL-4δ2 binds to the traditional IL-4R chain and has a lower affinity
Serves as an agonist through the IL-4R of the
Cell activity through high affinity IL-4R by blocking C heterodimerization
Will be antagonized.
IL-4 using both reverse transcriptase polymerase chain reaction and RNase protection assays
A second species of mRNA can be identified. This new IL-4 mRNA is
48 base pairs, which is the size of IL-4 exon 2. Cloned
Sequence data of the cDNA showed that this mutant contains IL-4 exons 1, 3 and 4
It was confirmed that the protein 1 was directly spliced to exon 3 within one reading frame.
Testify. The entire protein coding region of this variant, called IL-4δ2, is
, Is identical to IL-4 except that exon 2 is deleted. IL-4δ2 mRNA is
, Mouse spleen detected in all tested human PBMC and T cell clones
Not present in cells. The amount of both IL-4 and IL-4δ2 mRNA was increased during T cell activation.
IL-4 mRNA is significantly increased over IL-4 δ2 mRNA, although it is increased at the point. Similar experiment
Of the IL-2 mRNA in which exon 2 has been deleted by alternative splicing.
The variants are also suggested to be expressed in humans. Human IL-3, IL-5 and GM-C
SF does not use alternating splicing to delete exon 2. Thus,
Alternate splicing of mRNA deletes similar structural regions in each molecule
There are variants of both human IL-4 and IL-2.
To further illustrate the preferred embodiments of the invention, the following examples are presented.
. However, these examples in any way limit the broad scope of the invention.
It should not be regarded as a thing.
Example 1
Cell isolation and T cell cloning
Density gradient centrifugation using Histopague 1077 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
Isolation separated human PBMC from healthy donors. MAb anti-Leu3 specific for CD4
a (Becton Dickinson, Mountain View,
CA), and Vδ1-Jδ1- (36) and Vδ1-Jδ2- (Konig et al. (1989)
Eur.J.Immunol.19: 2099) and use the epitopes encoded by
From human PBMC to CD4 + α / β T cell clone CaS and γ / δ T cell clones.
GIL was isolated. Next, Dynabeads M-450 (Dynal Inc., Great Neck, NY
) Coupled to sheep anti-mouse IgG and magnetic bead separation.
It was carried out according to the instructions of the car.
10 μg / ml PHA (Sigma Chemical Co.), 50 U / ml γ human IL-2 (Hoffman-La R
oche Inc., Nutley, NJ) and irradiated (3000 rad) allogeneic PB as foster cells
Immediately clone positively selected cells by limiting dilution in the presence of MC.
Was. Complete tissue culture medium is 5% heat inactivated human male AB serum, 5% heat inactivated
FCS, 10 mM Hepes, pH 7.4, 2 mM L-glutamine, 1 mM pyruvin
Sodium acid salt, 0.1 mM non-essential amino acid mixture, 5 x 10-52-ME of M and 5 μg /
RPMI-1640 containing ml gentamicin sulfate. The T cell clone was cloned into PHA and
And expanded in 2 ml cultures by bi-weekly stimulation with additional cultured cells. Of the same concentration
Additional gamma human IL-2 was added every 4 days. FITC bonded using standard techniques
Leu3a MAb or FITC-conjugated δTC S1 MAb and PE-conjugated anti-human Leu-4 (CD3
) MAb (Becton Dickinson) using two-color flow cytometry analysis
The expression of CD4 and Vδ1 by T cell clone CAS and GIL was confirmed.
Example 2
T cell stimulation
Anti-CD3 MAb-secreting hybridoma OKT3 (American Type Culture Collection, Roc
kville, MD) 2 ml in complete tissue medium supplemented to a final concentration of 10%
In culture of PBMC (5 × 106) Or 5 × 10
6
2.5 x 10 with cloned T cells6 Irradiated (3000 rad) with allogeneic P
Stimulated BMC. This concentration of OKT3 supernatant previously optimally stimulated T cell proliferation
It was previously confirmed to be one.
Example 3
RNA isolation and RT-PCR
Acid Guanidinium thiocyanate-phenol Chloroform extraction to obtain PBMC
, Total cell RNA was isolated from T cell clones and BALB / c splenocytes (Chomczynski
et al. (1987) Anal. Biochem. 162, 156). Denature 1 μg RNA for 5 minutes at 65 ° C.
Next, 200 U of M-MLV reverse transcriptase (Bethesda Research Labs (BRL), Bethe
sda, MD), 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 8 mM DTT, 3 mM Mg.
Cl2, 0.5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Pharmacia LKB Biotechnology, Pis
cataway, NY), 1U / mM RNasin (Promege, Madison, WI) and random hexa
Reverse transcription into cDNA using a 15 μM reaction mixture containing Merprimer (BRL)
Was. The reaction mixture was incubated for 1 hour at 37 ° C. 2.5 μl cDNA mix
, 50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0.2 mM dATP each
, DCTP, dGTP, dTTP, 0.4 mM 3'and 5'PCR oligonucleotide ply, respectively.
And 0.625 U of Taq polymerase (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT).
25 μl PCR reaction mix was made. 5'PCR oligonucleotide primer
, According to the USB protocol, [γ-32P] -ATP (Amersham Corporation, Arlin
gton Heights, IL) and T4 polynucleotide kinase [United States Bioche
mical (USB), Cleveland, OH]. PCR mixture below
Amplified as follows: denaturation at 95 ° C for 30 seconds, primer for 2 minutes at 60 ° C.
Annealing and plaque at 72 ° C for 3 minutes
Immer extension (15-30 cycles) followed by a final 7 minute extension at 72 ° C. 10 times
PCR product from 2% agarose or 6% polyacrylamide gel
It was subjected to gel electrophoresis. H instead of RNA2Mock reverse transcriptase reaction with O added
Product was used as a negative control amplification in all experiments.
The PCR oligonucleotide primer pair used in these experiments was human IL-2.
Exon 1 forward 5'-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3 '[SEQ ID NO: 1] and
Exon 4 reverse 5'GTTAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC-3 '[SEQ ID NO: 2]; human I
L-3 exon 1 forward 5'TCCTGCTCCAACTCCTGG-3 '[SEQ ID NO: 3] and exo
4 reverse 5'-GCTCAAAGTCGTCTGTTG-3 '[SEQ ID NO: 4]; human IL-4 vs. A
Son 1 forward 5'-TCTTCCTGCTAGCATGTGC-3 '[SEQ ID NO: 5] and exon 4
Reverse 5'-CGTACTCTGGTTGGCTTTCC-3 '[SEQ ID NO: 6] -human IL-4 vs B exo
1 Forward 5'-AAGCTTATGGGTCTCACCTCCCAAC-3 ′ [SEQ ID NO: 7] and exo
4 Reverse direction 5'-GGATCCTCATCAGCTCGAACACTTTGA-3 '[SEQ ID NO: 8]; mouse I
L-4 exon 1 forward 5'-AGCCATATCCACGGATGCGAC-3 '[SEQ ID NO: 9] and E
Exon 4 reverse 5'-CTCAGTACTACGAGTAATCCAT-3 '[SEQ ID NO: 10]; human IL-5
Exon 1 forward 5'-CTTTTTGCAAAAGCCTTGGCCTCCAAAAAAGC-3 '[SEQ ID NO: 11
] And exon 4 reverse 5′-CCATTCTCCGCCCCAAGGCTGACTAATTTTT-3 ′ [sequence
No. 12]; human GM-CSF exon 1 forward 5'-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTC-3 '
[SEQ ID NO: 13] and exon 4 in the reverse direction 5 ′ TCACTCCTGGACTGGCTCCCAGCA-3 ′ [sequence
Sequence No. 14]; and human IFN-γ forward 5 ′ CAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCT-3 ′ [array
Column No. 15] and the reverse direction 5'-TGCTCTTCGACCTTGAAACAGCAT-3 '[SEQ ID NO: 16]
there were. BamHI and HindIII restriction enzyme recognition sequences were found in human IL-4 vs. B primer.
It is underlined.
The construction of the IL-2, IL-4, and IFN-γ cRNA internal standards is included in this document in its entirety.
Alms, W.J. It is described in et al.
Example 4
Cloning and DNA sequencing of RT-PCR products
It produces DNA complementary to IL-4 and IL-4δ2, and contains BamHI and HindIII restriction enzymes.
A ply specific for IL-4 exons 1 and 4 containing the digestion site for donase
It was amplified by RT-PCR using a mouse. Amplified products for IL-4 and IL-4δ2 were DEAE
It was separated from the 2.5% agarose gel using paper (this document is for reference in its entirety).
Included in Sambrook, J. et al. et al. (1989)Molecular Cloning; Laboratory Manual Al
"Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 2 times phenol /
After extraction with chloroform, the cDNA product is pCRTMII vector (Invitrogen Corp, San
Diego, CA) and then INVαF ′ competent according to the manufacturer's instructions.
It was used to transform G. cell. IL-4 and IL-4δ2 cDNA inserts
Was isolated by conventional techniques (this document is entirely
Included Sambrook, J et al. (1989) "Molecular cloning; laboratory manual
"Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), in sequence analysis
used. The IL-4δ2 cDNA insert was added to the M13 (-20) forward primer (5'-GT
AAAACGACGGCCAGT-3 ′ [SEQ ID NO: 17] and SequenaseTM(USB)
The xy-mediated chain termination method (included in this document in its entirety
Sanger et al. (1977) Proc.Natl.Acad.Sci.USA74: Arrayed by 5463)
Determined, 7% Long RangeTM(AT Biochem, Malvern. PA) For gel electrophoresis
More analyzed. Then induced with Taq polymerase for RNase protection assay.
IL-4 without sequence error
And IL-4δ2 cDNA were used.
Example 5
RNase protection test
Extends from IL-4 exon 1 to exon 4 with exon 1-3 junctions 362
pCR the bp IL-4δ2 RT-PCR fragmentTMIt was cloned into the II vector. Distribution
The orientation of the insert was determined by row analysis. Ambi according to manufacturer's protocol
on RPAIITM(Ambion Inc., Austin, TX) was used for RNase protection assay. Simple
Briefly, 5 ng of plasmid containing 100 ng of SpeI linearized IL-4δ2
Unit of T7 RNA polymerase (BRL), 0.5 mM ATP, CTP and GTP, 12 μM each
UTP and 6 μM 400 Ci / mmol of 5 '[α =32P] -UTP (Dupont NEN, Boston
, MA) by incubating for 45 minutes at 37 ° C.
The L-4δ2 probe was generated. The final specific activity of the IL-4δ2 probe is 1 x 109cpm
/ Μg DNA. Radiolabeled probe with 6% denatured polyacrylic
The gel was subjected to gel electrophoresis in an amide gel, and the full-length IL-4δ2 probe was autoradio
It was identified by graphy. Remove the band containing the probe from the gel and remove 2M vinegar.
Contains ammonium acidate, 1% SDS and 25 μg / ml yeast transfer RNA (tRNA)
The IL-4δ2 probe was eluted at 37 ° C in 400 µl of buffer solution. 80% formami
16 mM at 37 ° C in 40 mM PIPES, pH 6.4, 400 mM NaCl and 1 mM EDTA buffer.
IL-4 radiolabeled with denatured total cellular RNA or tRNA at 15-20 μg time
δ2 probe (1 × 106cpm) was hybridized. 4000 U / ml RNase Tl
(BRL) in 200 μl RNase digestion buffer (Ambion Inc.) for 30 minutes at 30 ° C
, Unhybridized RNA was digested. Inactivates and protects RNase
The separated RNA fragments were size separated in a 6% denaturing polyacrylamide gel.
, Attached to autoradiography.
An RNase protection assay was used to confirm the presence of IL-4δ2 mRNA in human PBMC.
Includes IL-4 exons 1, 3 and 4 including exon 1-exon 3 splice junctions
The 464 bp IL-4δ2 probe was radiolabeled. This probe is IL-4δ2 mR
A 342 bp fragment of NA [nucleotides +136 to +198 of exon 1 and exon 1
And protects against nucleotides of nucleotides 3 and 4 +247 to +525]
Is expected. Furthermore, this probe shows that IL-4δ2 and IL-4 are exons 1,
Since it shares 3 and 4, a 63 bp fragment of exon 1 of IL-4 mRNA [
Nucleotides +136 to +198] and exons 3 and 4 of IL-4 mRNA of 279 bp.
Should protect against ragment (nucleotides +247 to +525).
RNase protection of total cellular RNA from severe PBMCs results in IL-4δ2 (342bp) and IL-4 (279bp
And the presence of both the 63 bp fragment (Fig. 4).
Example 6
Oligonucleotide hybridization
The RT-PCR amplification products were size-separated by agarose gel electrophoresis. 30 minutes each
Denaturing solution (1.5M NaCl, 0.5M NaOH) and neutralizing solution (1.5M NaCl, 1M
The gel was sequentially immersed in Tris-HCl, pH 7.4) for 30 minutes. Then 20 × SSC buffer
The RT-PCR amplification product was transferred to a nylon membrane by blotting in the liquid overnight.
. The DNA sample was cross-linked to the membrane by UV irradiation. At least 1 at 42 ℃
Time, 6 x SSC, 10 x Denhardt's solution, 0.1% SDS and 50 μg / ml semen DNA
Membranes are prehybridized in 4 and then 4 × in 6 × SSC and 1% SDS.
0.2 μg at 9 ° C32P 5'end labeled oligonucleotide probe
Hybridized overnight. 3 times in 6x SSC and 1% SDS for 10 minutes at room temperature
Wash the membrane,
After that, it was finally washed at 49 ° C. Next, the membrane was subjected to Phosphor Imager analysis (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA) or autoradiography. Rhinoceros
The sequence of the tocaine-specific oligonucleotide probe is human IL-2 exon 2 specific
5'-CTCACCAGGATGCTCACA-3 '[SEQ ID NO: 18]; human IL-2 exon 3 specific
5'-CCTCTGGAGGAAGTGCTA-3 '[SEQ ID NO: 19]; human IL-3 exon 1 / exo
3 junction-specific 5'-CCTTTGCTGGAAAATAACC-3 '[SEQ ID NO: 20]; human IL-5
Exon 1 / exon 3 junction-specific 5'-GCCAATGAGCACCAACTG-3 '[SEQ ID NO:
21] and human GM-CSF exon 1 / exon 3 junction-specific 5'-GCTGAGATGGAG
It was CCGACC-3 '[SEQ ID NO: 22].
Two IL-4 mRNA species were detected from all tested donors (Fig. 1). Big
The amplified IL-4 RT-PCR amplification product was 362 bp, which is the expected size of IL-4 mRNA.
It corresponded to The second, smaller RT-PCR amplification product, called IL-4δ2, contains 3
It moved with an apparent size of 14 bp. MgCl concentration in PCR buffer, primer annealing
And the IL-4 exon 1- and 4-specific PCR primer pairs
It was not possible to delete the smaller RT-PCR product (data not shown)
. One of the smaller 314 bp fragments of total cellular RNA subjected to RT-PCR.
Consistent expression and lack of the corresponding product when the IL-4 cRNA was also subjected to RT-PCR.
(Fig. 1) shows that this fragment was the result of alternate splicing of the IL-4 gene transcript.
It was suggested that it was a specific RT-PCR amplification product. There are four IL-4 genes
Includes exons and three introns (Arai et al. (1989) J. Immunol.142:
274). Apparent size difference between RT-PCR product of IL-4 mRNA and RT-PCR product of IL-4δ2
Was 48 bp. This is the size of IL-4 exon 2. 314 bp IL-4δ2 RT
-PCR product is IL-4 exon
Whether the RT-PCR product of IL-4 of 362 bp, which does not include 2 while the larger one, contains this
HincII and P digesting IL-4 exons 2 and 3, respectively, to test
Both products were digested with stI. HincII cleaved the IL-4 RT-PCR product, but IL-4
The δ2 RT-PCR product was left undigested (Figure 2). In contrast, PstI
Cleaved both IL-4 and IL-4δ2 RT-PCR products (Figure 2).
Example 7
Sequence analysis of IL-4δ2
Next, the RT-PCR amplification products of IL-4 and IL-4δ2 were pCRTMCloning into II vector
The DNA sequence was determined (Fig. 3). Sequence analysis of the IL-4δ2 cDNA revealed that exons
IL-4 exons 1, 3 and 4 with 1 spliced directly to exon 3
Demonstrated the existence of. Separated, cloned and sequenced in parallel with IL-4δ2 cDNA
Sequence analysis of the isolated IL-4 cDNA revealed the in-frame splice junction between exon 2 and exon 3
It was demonstrated that exons 1, 2, 3 and 4 are present as expected. IL-4
And IL-4δ2 are both exon 2-exon 3 and exon 1-ex, respectively.
Note that it contains gaa residue 5'in the Son 3 splice. IL-4δ2
No other sequence alterations are found throughout the entire protein coding region
Was.
Example 8
Expression of IL-4δ2 mRNA in healthy human and human T cell clones
IL-4 and IL-4δ2 mRNA expression was analyzed in PBMCs from 25 healthy humans.
IL-4 and IL-4δ2 mRNA were co-expressed in all tested donors, but
The contrast was different for each individual. An example of this variability is shown in FIG. this
In the experiment, PBMCs from 3 individuals were stimulated with anti-CD3 MAbs for 6 hours. IL-4
Relative expression of mRNA for IL-4δ2 was determined using conditions in which the PCR product was logarithmically amplified.
It was measured by RT-PCR (25 cycles). The ratio of IL-4: IL-4δ2 mRNA was individual 1
It varied from about 2: 1 in 1 to 2 in individual 3. Individual 2 is almost equal
It expressed mRNAs for IL-4 and IL-4δ2. A level higher or equal to that of IL-4δ2 mRNA
Bell IL-4 expression is the predominant phenotype, tested in the 16: 1 to 1: 1 range.
It was present in 22 of the 25 individuals. However, 3 individuals have at least 1
Once, it expressed higher mRNA of IL-4δ2 than that of IL-4.
To confirm that T cells were the source of IL-4δ2 mRNA expression in PBMC,
The tested T cells were tested. α / β CD4 + T cell clone CAS and α / β
The T cell clone GIL was stimulated with anti-CD3 MAbs for 6 hours each. Cloned
Both T cells produced IL-4 and IL-4δ2 mRNA (FIG. 6).
Example 9
Kinetics of IL-4δ2 expression
Stimulation of T cells with anti-CD3 MAbs results in both IL-4 and IL-4δ2 mRNA levels
Is upregulated, and the mRNA for IL-4δ2 is independent of the mRNA for IL-4.
Experiments were conducted to see if it was adjusted upright. Stimulate PBMC with OKT3 MAb
Then, the ratio of IL-4δ2 mRNA to IL-4 mRNA was measured at different time points (FIG. 7). IL-4
Both δ2 and IL-4 mRNAs were spontaneously expressed in these PBMCs, and this particular
In the test, the mRNA of IL-4 was 3.5 times that of the mRNA of IL-4δ2. IL-4 and IL-4δ2
Both mRNAs increased with PBMC activation, but IL-4 mRNA was less than IL-4δ2 mRNA.
Increased. At 8 hours, 7 times more IL-4 mRNA was present than IL-4δ2 mRNA.
However, by the 12th hour the ratio had returned to baseline. At 24th and 48th hour
, The ratio of IL-4 mRNA to IL-4δ2 mRNA remained at a baseline of about 4: 1.
(Data not shown).
Example 10
Absence of IL-4δ2 mRNA in mice.
The human and mouse IL-4 genes each have four genes with exon 2 of 48 bp each.
It consists of exons and three introns. The mouse has exon 2 deleted
Whether to similarly express an alternatively spliced variant of IL-4 under
To stimulate splenocytes from BALB / c mice for 24 hours with PMA and ionomycin
did. RNA was extracted and mouse specific IL-4 exon 1- and exon 4-specific
It was subjected to RT-PCR using a marker. Humans in parallel from PBMCs stimulated with anti-CD3 MAbs
The expression of mRNA for IL-4δ2 was assayed. IL-4 mR in stimulated mouse splenocytes
Expression of NA was observed but expression of mRNA for IL-4δ2 was not observed, while human PBMC showed IL-4
And IL-4δ2 both expressed mRNA (Fig. 8).
Example 11
Alternate splicing of exon 2 is observed in human IL-2 mRNA
Not found for IL-3, IL-5 and GM-CSP mRNAs.
Since IL-4 belongs to the multigene family of cytokines, it lacks exon 2
To determine whether alternate splicing is used to produce the
First, the mRNAs of IL-2, IL-3, IL-5 and GM-CSF were examined. 6 hours with anti-CD3 MAb OKT3
Total RNA isolated from stimulated human PBMCs was exogenous for the cytokine of interest.
It was subjected to RT-PCR amplification using PCR primers specific for Xen 1 and exon 4. On IL-2
For that reason, two RT-PCR amplification products were identified (Fig. 9A). 4 for the larger amplification product
58 bp, which corresponded to the size of native IL-2 mRNA (Fujita et al.
(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA80: 7437). The smaller amplification product is approximately 398 bp
Yes, this is consistent with an alternate spliced variant of IL-2 that deleted exon 2.
Persistent rhino
It was. In contrast to the findings about IL-2, IL-3, IL-5, and GM-CSF
For each, only one RT-PCR amplification product was identified (data not shown).
Further testing for the presence of an alternate splice variant involving exon 2
Therefore, the IL-2 RT-PCR products were separated by gel electrophoresis and transferred to a nylon membrane.
-2 using exon 2 or exon 3 specific oligonucleotide probes
Lid formed. The two IL-2 RT-PCR products are IL-2 exon 3-specific oligos
Hybridized with a reotide probe (Figure 9B). In contrast, small
The 398 bp product of the other one should be hybridized to an exon 2 specific oligonucleotide.
No, while the larger 458 bp product hybridized. This means
, The smaller 398 bp product lacks exon 2 and is an alternate splice variant of IL-2
Suggests that. The ratio of IL-2δ2: IL-2 mRNA in all experiments was
IL-4δ2: Detects IL-2δ2 mRNA much less than the normal ratio of IL-4 mRNA
I made it difficult. To improve the detection of IL-2δ2 mRNA, RT-PCR products were added to IL-2
Hybridization with the exon1 / exon3 junction probe (panel C).
Since each part of the probe was homologous to exon 1 or exon 3,
The native IL-2 cDNA was used as the larger 458 bp band on the radiogram for this program.
Detected in the probe. However, this probe shows that the exon1 / exon3 junction
The mRNA for IL-2δ2 was identified as the smaller 398bp band.
Easily identified.
In a similar study, RT-PCR products for IL-3, IL-5 and GM-CSF were electrophoresed.
Size-separated by, transferred to nylon membrane, and attached to IL-3, IL-5 and GM-CSF, respectively.
Oligonucleotide probe encoding the exon 1 / exon 3 junction sequence
Hybridization using
I let it. Any RT-PCR product is IL-3, IL-5 or GM-CSF exon 1 / exon 3
No hybridization with specific probe (data not shown).
Example 12
Rabbit antiserum specific for IL-4δ2 protein
The synthetic 16-mer peptide LNSLTEQKNTTEKETF (SEQ ID NO: 27) was made. This peptide
Is specific for the exon 1-exon 3 junction in IL-4δ2 and is present in IL-4.
Not present. This peptide was multimerized through coupling to MAPs resin.
Purified multimeric peptide was used to immunize and boost two rabbits
(3 total injections). Post-immune serum, but not pre-immune serum from each rabbit
Recombinant, although it binds IL-4δ2 synthetic peptide in Western blotting
Does not bind to human IL-4 or IL-2.
Example 13
From an activated human T cell clone for the presence of the IL-4δ2 protein Supernatant analysis
The supernatant from activated human T cell clones was obtained and the proteins in
I ran it on SDS-PAGE. Protein separated by SDS-PAGE Obtained in Example 12 above
Western blots were performed with different antisera. IL-4δ2-specific antiserum
Bind to IL-4δ2 found on some, if not all, supernatants tested
did.
The present invention is described and described herein in reference to various specific materials, procedures and examples.
However, the invention is not limited to the specific material combinations and procedures selected for that purpose.
Is not limited to. One of ordinary skill in the art would appreciate the details of such details.
Many variations may be involved.
─────────────────────────────────────────────────────
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
A61K 38/00 ADY 9051−4C A61K 37/02 ADY
C07H 21/04 ACD
C07K 14/54 ADD
16/24 ADS
C12N 1/21 ABA
//(C12N 1/21
C12R 1:19)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG),
AM,AT,AU,BB,BG,BR,BY,CA,C
H,CN,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB
,GE,HU,IS,JP,KE,KG,KP,KR,
KZ,LK,LR,LT,LU,LV,MD,MG,M
N,MW,MX,NL,NO,NZ,PL,PT,RO
,RU,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,
TT,UA,UG,UZ,VN
(72)発明者 ホワイト,バーバラ
アメリカ合衆国,メリーランド 21042,
エリコット シティ,ロック ミードウ
ドライブ 9316─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Internal reference number FI A61K 38/00 ADY 9051-4C A61K 37/02 ADY C07H 21/04 ACD C07K 14/54 ADD 16/24 ADS C12N 1/21 ABA // (C12N 1/21 C12R 1:19) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG) , AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, J P, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, MX, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE , SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, UZ, VN (72) Inventor White, Barbara United States, Maryland 21042, Ellicott City, Rockmeadow Drive 9316