【発明の詳細な説明】
懸濁物または乳化物中に溶解した１種または
それ以上の種の測定方法
本発明は、懸濁物または乳化物を含有する液体サンプル中に溶解した種の測定
方法に関する。
非溶解物、たとえば粒子状懸濁物または液体乳化物も含む液体中に溶解した種
の分析には、通常、所望の種もしくは被検物質の分析を実施する前に純粋な液相
を回収するために不溶物を除去する必要がある。とくに測定すべき種もしくは被
検物質を固相に固定化したリガンドと相互作用させるアッセイでは、懸濁物もし
くは乳化物による被検物質の固相表面への拡散の妨害および／または被検物質／
リガンドの相互作用への直接干渉のため分離は必須である。たとえば、サンプル
中の粒状物を除去する一般的な方法は、遠心分離、沈降またはろ過である。
その例には、血液中の血漿または血清被検物質の分析がある。血液は塩溶液、
血漿であり、それに様々な種類の細胞、血液細胞が懸濁されている。血漿は抗凝
固剤処置した血液から、たとえば遠心分離により血液細胞を分離して得られる。
これに代えて、血液を放置して血餅を形成させ、ついで遠心分離すると血清、す
なわちフィブリン／フィブリノーゲンを含まない血漿が得られる。
いくつかの理由により、分離工程を全く行わずに、全血サンプルの直接分析が
望ましい場合がある。分析操作を単純化し、それにより消費時間を短縮するのみ
でなく、さらに重要と思われる点は感染性もしくは伝染性疾患たとえばＨＩＶ、
肝炎等の伝播の危険の減少がある。しかしながら、血液細胞がアッセイに影響す
るという問題
に加えて、ヘマトクリットと呼ばれる血球容量比が、個体間で変動する。すなわ
ち、正常レベルは35〜55％の範囲内であり、平均は男性で約45％、女性で約40％
である。したがって、全血アッセイで得られた値は、結果を確立された基準値ま
たは標準プレパレーションと比較可能にするためには、ヘマトクリットで補正し
なければならない。
上述の問題は、もちろん、懸濁物または乳化物の割合がサンプル間で変動する
すべての懸濁液または乳化液の場合に同様にいえることである。
本発明の目的は、たとえば全血のような懸濁液および乳化液の液相に溶解して
いる種の分析手段であって、一方では分離工程を必要とせず、他方では懸濁物ま
たは乳化物の割合が変動する場合でも補正を必要としない分析手段を提供するこ
とにある。
本発明の概念によれば、この目的は、測定すべき種に対して特異的な１種もし
くはそれ以上のリガンドを準備し、リガンドはフローチャンネルの壁部に固定化
し、サンプルはサンプル中の懸濁物または乳化物がフローコアを形成してフロー
チャンネルの壁部に近い層には懸濁物または乳化物が実質的に含まれないような
層流速度でフローチャンネルを通して輸送し、検知表面への種の拡散が懸濁物ま
たは乳化物の量に依存しないようにサンプルの液流を制御することによって達成
される。
フローチャンネルの語は広く解釈されるべきであり、その形状およびディメン
ションは、とくにフローセルの壁部への被検物質の結合の測定に使用される検出
原理に依存して、広範囲に変動させることができる。単純な実施態様においては
フローチャンネルはサンプ
ルを輸送する導管系の一部分とする。他の実施態様においては、フローチャンネ
ルは特別に設計されたフローセルとする。このようなフローセルの説明は、たと
えばRuzicka，J.，Hansen，H.E.，Flow InjectionAnalysis; Wiley; New York，
1987; pp 247-256およびStu1ik，K.，Pacakova，V.，Electrochemical Measurem
ents in Flowing Liquids; Ellis Horwood: Chichester，England; 1987に言及
されている。特定の適用おけるフローチャンネルまたはフローセルそれぞれの必
要なディメンションは、本技術分野の熟練者には容易に決定できる。
本発明の概念は、ファーレウス−キンドキウィスト効果と呼ばれる現象に基づ
いている（Fahraeus，R.，Lindqvist，T.，Am．J．Physiol．1931; 96: 562-8）
。これは、抗凝固剤処置した血液のような懸濁液または乳化液を細い毛細管(＜
約0.3mm)を通して輸送する場合に起こり、血液細胞は毛細管の中央を流れて血漿
は周囲のスリーブを形成する現象である。この効果は、血液細胞の上方の流速が
血液細胞の下方の流速と異なる場合、血液細胞に揚力が生じるという事実による
ものである(航空機の翼を参照)。液体の剪断力が最も大きい毛細管表面の最も近
くで、揚力は最大になる。この揚力は、血液細胞の両側での流速が等しい毛細管
の中央部に向けて血液細胞を押しやる傾向があり、その結果として、毛細管の壁
部に隣接して血液細胞を含まない血漿層を生じることになる。
抗凝固剤処置された全血を、血液中の被検物質を結合できるリガンドもしくは
受容体が固定化された検知表面を有する薄層フローセルを通して輸送した場合、
検知表面に隣接する液層は、したがって、血液細胞を含まない血漿である。検知
表面への被検物質の結合によ
り、被検物質が枯渇した検知表面から始まり、固定化された被検物質受容体への
被検物質の結合がその表面への被検物質の拡散によって制御される液層が作り上
げられる（もちろん、被検物質−受容体反応に限界がないとしてであるが）。
上述の細胞を含まない血漿層が被検物質枯渇層よりも厚ければ、検知表面への
被検物質の拡散が血液細胞により妨害されることはなく、この分析的環境は事実
上、血漿サンプルの分析的環境そのものであることになる。以下に説明するよう
に、このアッセイは血液細胞の割合とは無関係になり、すなわちヘマトクリット
による補正を行う必要はない。
本発明は、乳化液型または懸濁液型サンプル中に溶解した被検物質、被検物質
類縁体または他の種を固相に固定化されたリガンドもしくは受容体に結合させ、
固相への結合を直接的または間接的に検出するあらゆる種類の不均一アッセイに
応用することができる。抗凝固剤処置された血液以外のこのような乳化液型また
は懸濁液型サンプルの他の例としては、細菌懸濁液、ミルクのような食品乳化物
等を挙げることができる。
表面への結合が測定される種はもちろん、分析の一次対象である必要はなく、
懸濁液もしくは乳化液中の所望の成分を間接的に測定する手段にすぎなくてもよ
い。たとえば、細菌細胞は、間接的な分析では、細菌細胞に対する抗体の残余を
免疫学的アッセイで測定することによって検出することができる。
検知表面に結合した被検物質もしくは他の種の量を測定する検出原理によって
本発明は限定されるものではない。適当な種類の検知システムには、固相が検知
構造からなり、検知構造の性質の変化を
固定化されたリガンドに対する被検物質の結合の指標として測定するものがある
。これらの方法には、たとえば、ピエゾ電気法、光学的方法、熱光学的方法およ
び表面音響波（ＳＡＷ）法のような質量検出方法、ならびに電位差法、電気伝導
度法、電流法および電気容量法のような電気化学的方法がある。
光学的方法としては、とくに質量表面濃度を検出する方法、たとえば、内部お
よび外部反射法の両者を含む反射光法、たとえば、偏光解析法および消失波分光
法(EWS)が挙げられる。後者には、表面プラズマ共鳴分光法(SPRS)、ブルースタ
ー角屈折測定法、臨界角屈折測定法、全反射減衰分光法(FTR)、消失波偏光解析
法、全内部反射散乱分光法(STIR)、光導波路センサー、消失波に基づく結像法、
たとえば臨界角分解結像法、ブルースター角分解結像法、SPR角分解結像法等、
さらに消失蛍光(TIRF)およびリン光に基づく方法がある。
上述の光学的方法の中でとくに、SPRSが最近、極めて注目をひいている。SPR
の現象はよく知られている。簡単に言えば、SPRは、光学的に透明な材料たとえ
ばガラスと薄い金属フィルム通常銀または金の間の界面から特定の角度で反射さ
れる光の強度における伏角として観察され、とくに金属表面に近接して存在する
媒体（たとえばサンプル溶液）の屈折率に依存する。たとえば金属表面への物質
の吸着または結合によって金属表面の屈折率が変化すると、SPRが起こる角度に
相当するシフトが生じる。SPRが起こるような界面に光を送るには２つの装置配
置を選択使用できる。金属処理回折格子(ウッド効果)または金属処理ガラスプリ
ズムもしくは金属処理ガラス基板と光学的に接触させたプリズム(クレッチマン
効果)のいずれ
かである。SPRに関するさらに詳細については、本発明者らのWO 90／05295に言
及されている。SPRに基づくイムノアッセイでは、リガンドを金属表面に結合さ
せ、ついでそれと表面に接触する液体サンプル中に溶解した被検物質との相互作
用をモニタリングする。
以下に添付の図面を参照しながら、本発明をさらに詳細に説明する。
図１は、薄層フローセルの模式的な断面図である。
図２は、図１のＡ−Ａにおける断面である。
図３は、環状断面を有するフローセル内の全血流の模式的な断面図である。
図４は、方形断面を有するフローセル内の全血流の模式的な断面図である。
図５は、フローセルの縦方向における流れの模式的な断面図である。
図６は、各種血液細胞含量の抗凝固剤処置全血サンプル中におけるIgEの測定
結果を、相対的応答対赤血球容積分画(EVF)のプロットとして示すグラフである
。
図７は、抗凝固剤処置された全血サンプル中におけるIgE濃度の測定結果を相
対的応答対濃度のプロットとして示すグラフである。
図８は、各種血液細胞含量の抗凝固剤処置された全血サンプル中におけるミオ
グロビンの測定結果を相対的応答対赤血球容積分画(EVF)のプロットとして示す
グラフである。
図９は、抗凝固剤処置された全血サンプル中におけるミオグロビン濃度の測定
結果を相対的応答対濃度のプロットとして示すグラフである。
図10は、細菌培養サンプル中におけるプロテインＧの測定結果を相対的応答対
サンプル希釈度のプロットとして示すグラフである。
図11は、細胞培養サンプル中におけるクレアチンキナーゼＭＢに対するモノク
ローナル抗体の測定結果を相対的応答対サンプル希釈度のプロットとして示すグ
ラフである。
とくに図１〜５を参照しながら、以下に本発明のさらに理論的な説明を試みる
こととする。
リガンドまたは被検物質を、固相たとえばマイクロタイタープレートのウエル
内またはセンサー表面上（たとえば電気化学的方法、SPR、TIRF、SAW等）に結合
させる不均一アッセイにおいては、表面上の結合被検物質の増加は通常、表面へ
の分子の拡散を制限する流量によって制御される。この流量は式：
ｄＲ／ｄｔ＝ｋMＣ （１）
（式中、ｄＲ／ｄｔは表面への流量であり、ｋMは集団輸送係数であり、Ｃは被
検物質の濃度である）によって表される。
ここでは図１に例示された薄層フローセルを考えることにする。この長方形の
フローセルは注入口１、排出口２およびフローセルの底壁部に沿って広がる検知
表面３を有する。図２に指示したように、フローセルの幅はｂおよびａ、高さは
ｈである。ＸinからＸoutまでの検知表面３は、フローセルを通して輸送される
液体サンプル中の被検物質と反応できる固定化されたリガンドを支持する。通常
の操作条件では、このようなフローセルの集団輸送係数、ｋMは時間とは無関係
で(Sjolander S.ら、Anal．Chem．63，1991)、式：
ｋM(Ｘ)＝0.98×(Ｄ／ｈ)2/3(ｆ／ｂｘ)1/3 （２）
（式中、ｘはフローセルの注入口１からの距離、Ｄは被検物質の拡
散係数、ｈおよびｂはそれぞれフローセルの高さおよび幅であり(図２)、ｆは容
量流量である）によって表される。式２に必要な条件はもちろん、集団輸送係数
、ｋMが不均一系会合速度定数よりはるかに小さいこと、すなわち、ｋM≪ｋaＲm ax
（この場合Ｒmaxは検知表面３の最大取り込みである）であることである。
図１のフローセルが、測定セルに対してデッドボリュームが極めて低い連続フ
ローシステム中の測定セルであると仮定すると、理想的な平方パルスを検知表面
３にに発射することが可能で、これはまた、
０＞ｔ＞ｔkの場合、Ｃ＝０
０＜ｔ＜ｔkの場合、Ｃ＝Ｃ （３）
（式中、ｔkは被検物質の検知表面３との接触時間である）と表される。
すなわちＣおよびｋMは時間に独立であるから、被検物質の取り込みレベルは
式１を接触時間ｔkについて積分すると得られる。
式４から明らかなように、被検物質の取り込みレベルＲ(ｘ)は注入したサンプ
ルの容量とは独立である。満足すべき要件は、サンプル容量が、流量ｆにおいて
接触時間ｔk時に行われるサンプルの注入容量に対して十分大きいことのみであ
る。この観点から、被検物質は、サンプル中に懸濁または乳化されている固体ま
たは非混和性物質の量とは完全に独立である。したがって、たとえば抗凝固剤処
置された全血の場合には、被検物質はヘマトクリットとは独立である。
しかしながら、サンプル中の懸濁物または乳化物は式４中の拡散
定数Ｄ、したがって被検物質の取り込みＲ(ｘ)に影響する。もちろん、この場合
に興味があるのは層流に直角な（図１におけるＺ方向の）拡散定数である。たと
えば血漿と血液細胞の不均一な懸濁液である抗凝固剤処置された全血を考えるこ
とにする。被検物質の拡散は血液血漿中でも血漿中と同じ拡散定数で起こるが、
輸送は血液細胞の形での固体「粒子」との衝突によって妨害される。したがって
、被検物質の取り込みはヘマトクリットに依存することになる。
上に既に述べたように、ファーレウス−キンドキウィスト効果は、血液が細い
毛細管中を層流として輸送される場合に起こり、流速が血液細胞の上方と下方で
同じ毛細管内の中央のコアに濃縮され、一方、血漿はコアの周囲に血液細胞を含
まない液体スリーブを形成する場合に見られる現象である。これは通常100μm以
下のディメンションを有する薄層フローセル中で実施されるアッセイにおいては
、センサー表面付近に血液細胞は輸送されないことを意味する。全血中に生じる
拡散定数は、換言すれば、ファーレウス−キンドキウィスト効果によってセンサ
ー表面に隣接する層内では血漿中の場合と等しくなる。
これは２種類のフローセルを示す図３および４に例示される。図３のフローセ
ルは円形の断面図を有し、検知表面はシリンダーの内側に設けられる。図４では
フローセルは長方形の断面図を有し、検知表面はフローセルの一つの壁部上に設
けられる。図３および図４のいずれにおいても、血液細胞の中央部コア４は血漿
の層５によって囲まれている。層５の厚さはδである(図３)。センサー表面では
血漿層５から被検物質が枯渇し、センサー表面に最も近い、拡散層と呼ばれるこ
ともある枯渇血漿層を生じる。この枯渇層６の厚さは
ＬDである(図３)。
血液細胞を含まない血漿層５(厚さδ)が被検物質枯渇層６(厚さＬD)よりも厚
いと、アッセイがヘマトクリットのレベルに依存しないことは自明である。
図５は、図４に示したタイプの薄層フローセル内の模式的な縦方向の断面図で
ある。注入口は参照番号７で、排出口は８で、被検物質のサンプルが枯渇した検
知表面は９で指示する。矢印は層流の放物面流動像を示す。被検物質枯渇または
拡散限界層は参照番号10で指示する。図５はこの被検物質枯渇層10の厚さＬDが
注入口７からの距離とともにどのように増加するかを例示している。
被検物質枯渇層の大きさは次のように計算される（Eddows M.J.，Biosensors
，A Practical A pproach，9章，A.E.G．Cass編，Oxford University Press，Ne
w York）：
ＬD＝Ｄ／ｋM （５）
式５からＬDは拡散定数Ｄとともに増加し、輸送係数ｋMとともに減少すること
がわかる。Ｄは分子のサイズに逆比例するから、ＬDは分子量が低下すると増加
する。すなわち、分子量が小さいほど、被検物質枯渇層は広がる。被検物質枯渇
層のサイズは通常、５〜10μmの範囲である。
したがって、ＬDはフローセルのディメンションおよび／または流速の変動に
より増加または減少することが明らかである。したがって、ＬDのこのような変
動により、全血アッセイにおけるＬDは血液細胞を含まない層の厚さより小さく
することが保証される。しかしながら、この点に関しては、被検物質枯渇層の厚
さが薄層フローセルの高さの半分以下の場合にのみ式２が有効であることに留意
す
べきである。また、アッセイが完全に集団輸送限定でないと、被検物質枯渇層は
総輸送限界では０まで薄くなってしまう。さらに、緊密な血液細胞コアは分子の
集団輸送における対流成分に影響する放物面流動像を変形させることに留意すべ
きである。すなわち、式２は、集団輸送係数を完全に適切に表現するものではな
い。流動像に対するこの影響は、中程度ではあるが、被検物質の取り込みの増加
を生じる。
要約すれば、抗凝固剤処置された全血サンプルの血液細胞含量は、フローセル
検知表面への被検物質の取り込みに直接は影響しないが、検知表面への拡散を妨
害する。ファーレウス−キンドキウィスト効果により、検知表面付近に血液細胞
を含まない血漿層と、流速の早い血液細胞が濃縮されたコアが作られる。血液細
胞を含まない血漿層が被検物質枯渇層より厚い場合には、被検物質のセンサー表
面への拡散は影響されない。したがって、少なくとも正常なヘマトクリットレベ
ルの範囲内では、濃厚血液細胞コアによる上述の流動像の変形にもかかわらず、
ヘマトクリットレベルへの依存は極めて低く有意ではないアッセイ法が構築可能
である。
ファーレウス−キンドキウィスト効果はしかしながら、抗凝固剤処置された全
血中の血液細胞に限定されるものではなく、懸濁物または乳化物に一般的に適用
可能である。本発明の目的においては、このような懸濁物または乳化物のサイズ
の限界はフローセルおよび検知領域のディメンションならびに流速に依存する。
すなわち、以上提示した理論的考察は懸濁物または乳化物を含有する任意のサン
プル中に溶解した被検物質のフローセルセンサーに基づくアッセイに同様に適用
される。
本発明を例示する意図で単に例として掲げる以下の実施例においては、測定は
市販のSPRベース(クレッチマン効果)のバイオセンサーシステム、BIAcore(登録
商標)ならびに市販の検知表面、Sensor Chip(登録商標)CM 5によって実施した(
いずれも、Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden製)。Sensor Chip(登録商
標)CM 5は金のフィルム表面にカルボキシル化デキストランが共有結合した層を
有するガラス支持体の形態の検知表面をもつ。フローセルは断面積50μm×500μ
m、幅2.4mmの上方に開口したチャンネルから構成され、これらのチャンネルはそ
れにドッキングさせたSensor Chip(登録商標)CM 5の検知表面によって閉じられ
ている。
実施例１
ヘマトクリットが変動する全血のIgEアッセイ 血液サンプルの調製
ドナーEDTA血液にIgE(Pharmacia Diagnostics AB，Uppsala，Sweden)1000ng／
mlを補充し、混合して2,500rpmで10分間遠心分離した。血漿と血液細胞を互いに
分離し、ついで赤血球容積分画(EVF)がそれぞれ０、20、40および60％の混合物
を与えるように混合して、IgEの濃度は同じであるが、ヒトにおける正常EVF範囲
をカバーする様々な細胞含量を有する血液サンプルを調製した。抗−IgE表面の調製
BIAcore(登録商標)装置にSensor Chip CM5をドッキングし、駆動緩衝液、HES
（10mM Hepes緩衝液、0.15M NaCl、3.4mM EDTA、ならびに0.05％Tween）、pH 7.
4の連続流を検知表面上に５μl／分で維持しながら、カップリング緩衝液、10mM
酢酸ナトリウム、pH 5.0中、100μg／mlのIgE特異的抗体（Pharmacia Diagnosti
cs AB，Uppsala，
Swedenから入手）を装置製造業者の説明書に従い検知表面上にカップリングさせ
た。IgEアッセイ
駆動緩衝液、HBSの連続流を検知表面上に５μl／分で維持した。
上に調製した各血液サンプル35μlを５μl／分で注入した(接触時間420秒)。結
合したIgEをついで、二次試薬として抗−IgE抗体1.0mg／mlを注入して検出した
。血液サンプル注入の間の再生は10mMグリシン塩酸塩、pH 2.25によって実施し
た。
同様の実験を駆動緩衝液の流速を20μl／分に変更して実施し、各血液サンプ
ル35μlを20μl／分で注入し(接触時間105秒)、結合したIgEを上記と同様に二次
試薬で検出した。
調製した全血サンプルをついで遠心分離して血漿を分離した。各血漿サンプル
35μlを上と同様にして５μl／分(接触時間420秒)および20μl／分(接触時間105
秒)で試験した。
結果(血漿の応答に正規化した相対的応答をEVFに対してプロットした形)は図
６に示す。それから明らかなように、流速が遅い５μl／分での応答はEVFに依存
し、全血と血漿の間で有意差があった。しかしながら流速が速い20μl／分では
、期待されたように応答はEVFに依存しなかった。
実施例２
IgE濃度が変動する全血のIgEアッセイ
よく混合したドナーEDTA血液サンプルに、以下の濃度、100、500、1000、2000
および4500ng／mlにIgEを補充した。全サンプルで同一のEVFが得られるように、
IgEの添加は一次標準から行った。サンプルをついで完全に混合し、各サンプル
の半分は遠心分離して血漿サ
ンプルを得た。全血サンプルおよび血漿サンプルをついで、上の実施例１の記載
と同様の抗−IgE抗体固定化表面を流速10μl／分で用い、ついで二次試薬として
抗−IgE抗体を注入して分析した。結果（相対的応答をIgEの濃度に対してプロッ
トした形）は図７に示す。
血液および血漿値の間に良好な一致がみられる。
実施例３
ヘマトクリットが変動する全血のミオグビンのアッセイ 血液サンプルの調製
ドナーEDTA血液に、ミオグロビン（Dako A／S，Copenhagen，Denmark）400ng
／mlを補充し、混合して2,500rpmで10分間遠心分離した。血漿と血液細胞を互い
に分離し、ついで、EVFがそれぞれ０、20、30、35、40、45、50、60および70％
の異なる混合物を与えるように混合して、ミオグロビンの濃度は同じであるがヒ
トにおける正常EVF範囲を広くカバーする様々な細胞含量を有する血液サンプル
を調製した。抗−ミオグロビン表面の調製
BIAcore(登録商標)装置にSensor Chip CM 5をドッキングし、駆動緩衝液、HES
(10mM Hepes緩衝液、0.15Ｍ NaCl、3.4mM EDTA、ならびに0.05％Tween)、pH 7.4
の連続流を検知表面上に５μl／分で維持しながら、カップリング緩衝液、10mM
酢酸ナトリウム、pH 5.0中、50μg／mlのミオグロビン特異的抗体(Pharmacia Bi
osensor AB，Uppsala，Swedenから入手)を装置製造業者の説明書に従い検知表面
上にカップリングさせた。ミオグロビンアッセイ
HESの連続流を検知表面上に10μl／分で維持した。上に調製した
各血液サンプル12μlを10μl／分で注入した(接触時間72秒)。結合したミオグロ
ビンをついで、二次試薬として抗−ミオグロビン抗体(ウサギ抗−ミオグロビン
，Dako A／S，Copenhagen，Denmark)1.0mg／mlを注入して検出した。血液サンプ
ル注入の間の再生は10mMグリシン塩酸塩、pH 2.25によって実施した。
駆動緩衝液の流速を40μl／分に変更した。ついで、各血液サンプル30μlを40
μl／分で注入し（接触時間45秒）、結合したミオグロビンを上記と同様に二次
試薬で検出した。
調製した全血サンプルをついで遠心分離して血漿を分離し、血漿サンプルを上
記と同様にして、10μl／分、40μl／分および２μl／分でそれぞれ試験した。
結果(血漿の応答に正規化した相対的応答のEVFに対するプロットの形で)は図
８に示す。それから明らかなように、流速が遅い２μl／分および10μl／分での
応答はEVFに依存した。しかしながら、流速が速い40μl／分では、応答は実質的
にEVFに依存しなかった。
実施例４
ミオグロビン濃度が変動する全血のミオグロビンのアッセイ
よく混合したドナーEDTA血液サンプルに、以下の濃度、０、20、40、400、800
および1600ng／mlにミオグロビンを補充した。全サンプルで同一のEVFが得られ
るように、ミオグロビンの添加は一次標準から行った。サンプルをついで完全に
混合し、各サンプルの半分は遠心分離して血漿サンプルを得た。全血サンプルお
よび血漿サンプルをついで、上記実施例３の記載と同様の抗−ミオグロビン表面
を流速10μl／分で用い、ついで二次試薬として抗−ミオグロビンにより分析し
た。結果(相対的応答をミオグロビンの濃度に対して
プロットした形)は図９に示す。血液および血漿値の間に良好な一致がみられる
。
実施例５
細菌培養液中のプロテインＧのアッセイ サンプルの調製
プロテインＧ産生大腸菌株を培養し、培養後、細菌を＋80℃に６分間加熱して
溶菌させ、プロテインＧ生成物を放出させた。培養液は約109細胞／mlを含有し
た。分析用に培養液のサンプルを採取した。サンプルの一部は遠心分離して細胞
を除去した。細胞含有サンプルおよび遠心分離サンプルを培養培地中にそれぞれ
１：２、１：４、１：８、１：16および１：12に希釈した。ウサギ抗体検知表面の調製
ウサギ抗体検知表面は抗−IgE表面の調製に関して実施例１に記載したのと同
じ方法で調製した。プロテインＧアッセイ
実施例１に記載と同様の方法で、サンプルをウサギ抗体表面に注入してプロテ
イＧを分析し、表面はサンプルの間に10mMグリシン塩酸塩、pH 2.5によって再生
した。相対的応答(共鳴単位、RU)対サンプル希釈度のプロットの形での結果を図
10に示す。それから明らかなように、同一濃度の粗製および遠心分離サンプルで
は平均応答に差はなく、107〜109／mlの濃度範囲の細胞(溶解)の存在は測定値に
影響しないことを示している。
実施例６
細胞懸濁液中の抗−CKMBモノクローナルのアッセイ 培養サンプルの調製
クレアチンキナーゼMB（CKMB）に対するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ、Conan MB 2580を、完全培養培地、FDMEM＋10％ウシ胎児血清(FCS)中
で細胞濃度が１×108細胞／mlになるまで培養した。ついで細胞懸濁液を２つの
試験管に分割した。一方の試験管は遠心分離して細胞を含まないモノクローナル
の溶液を得、他方は細胞を含むままにした。両溶液をついで培養培地（FCSを含
まないFDMEM）中に希釈した。1/1〜1/32に倍量希釈した。対照としては、同じ操
作を完全培地上で、すなわちFCSを含むFDMEMをFDMEMのみで上述のように希釈し
て実施した。RAMFc表面の調製
ウサギ抗−マウスIgG FcをSensor Chip CM 5に実施例１の記載に相当する方法
で固定化した。モノクローナルのアッセイ
実施例１に記載に相当する方法で、サンプル希釈液を、RAMFc固定化表面に注
入してモノクローナル抗体(Mab)の存在を試験した。
すべての希釈液を次の順序で試験した。
サイクル１〜６：細胞培養培地 1/1〜1/32
サイクル７〜12：Mab（細胞＋）1/1〜1/32
サイクル13〜18：Mab（細胞−）1/1〜1/32
サイクル19〜24：細胞培養培地 1/1〜1/32
サイクル25〜30：Mab（細胞＋）1/1〜1/32
サイクル31〜36：Mab（細胞−）1/1〜1/32
各サイクルは４μlのサンプル（Mab／細胞培養培地）の注入、ついで10μlの1
0mMグリシン塩酸塩、pH 1.5による再生からなる。
相対的応答（共鳴単位、RU）対サンプル希釈度のプロットの形で
の結果を図11に示す。FDMEM＋FCSでは望ましくない結合は認められず、固定化抗
体とサンプル中Mabの間には特異的な結合が認められる。Mabの応答は（ｉ）細胞
を含むMabと（ii）細胞を含まないMabについて同一であり、これはMabの応答は
細胞の存在によって影響されないことを意味する。
本発明はもちろん、上述のまた図面に示した実施態様によって限定されるもの
ではなく、以下の請求の範囲に述べる発明の一般的概念の範囲内において多くの
改変および修飾が可能である。Detailed Description of the Invention
One dissolved in a suspension or emulsion or
How to measure more species
The present invention provides for the determination of dissolved species in liquid samples containing suspensions or emulsions.
Regarding the method.
Species dissolved in a liquid, including non-dissolved material, such as particulate suspensions or liquid emulsions
Is usually performed in a pure liquid phase prior to performing the desired species or analyte analysis.
It is necessary to remove the insoluble matter in order to recover. Especially the species or
In assays where the test substance interacts with a ligand immobilized on a solid phase, suspensions
Interference with the solid phase surface of the test substance and / or the test substance /
Separation is essential because of direct interference with ligand interactions. For example, the sample
Common methods for removing particulate matter are centrifugation, sedimentation or filtration.
Examples are the analysis of plasma or serum analytes in blood. Blood is a salt solution,
It is plasma, in which various types of cells and blood cells are suspended. Plasma is anticoagulant
It is obtained by separating blood cells from the blood treated with the solid medicine, for example, by centrifugation.
Alternatively, leave the blood to form a clot and then centrifuge to remove serum,
That is, plasma free of fibrin / fibrinogen is obtained.
For several reasons, direct analysis of whole blood samples without any separation step is possible.
Sometimes desirable. Only simplify analytical operations, thereby reducing time spent
But more importantly, infectious or contagious diseases such as HIV,
There is a reduced risk of transmission of hepatitis, etc. However, blood cells affect the assay
Problem
In addition, the blood cell volume ratio called hematocrit varies between individuals. Sand
The normal level is within the range of 35-55%, the average is about 45% for men and about 40% for women.
It is. Therefore, the values obtained in the whole blood assay should be comparable to established reference values.
Or hematocrit corrected to make it comparable to standard preparations.
There must be.
The problems mentioned above, of course, vary in the proportion of suspension or emulsion between samples.
The same applies to all suspensions or emulsions.
The purpose of the present invention is to dissolve in the liquid phase of suspensions and emulsions, such as whole blood.
Existing analytical means, which does not require a separation step on the one hand and suspensions on the other hand.
Or provide a means of analysis that does not require correction even when the proportion of the emulsion changes.
And there.
According to the concept of the invention, this purpose is to have one species specific to the species to be measured.
Or more ligands are prepared and immobilized on the walls of the flow channel.
The sample is then allowed to flow with the suspension or emulsion in the sample forming the flow core.
The layer near the wall of the channel should be substantially free of suspensions or emulsions
Transport through the flow channel at laminar flow velocity, and the diffusion of species to the sensing surface is reduced to suspension.
Achieved by controlling the sample flow so that it does not depend on the amount of emulsion or emulsion.
Is done.
The term flow channel should be interpreted broadly and its shape and dimensions
Is a detection method used specifically to measure the binding of analytes to the walls of the flow cell.
It can be varied over a wide range depending on the principle. In a simple embodiment
Flow channel sump
Part of the conduit system that transports In another embodiment, the flow channel
Is a specially designed flow cell. The explanation of such a flow cell is
For example, Ruzicka, J., Hansen, H.E., Flow Injection Analysis; Wiley; New York,
1987; pp 247-256 and Stu1ik, K., Pacakova, V., Electrochemical Measurem
ents in Flowing Liquids; Ellis Horwood: Chichester, England; 1987
Have been. Required for each flow channel or flow cell in a particular application.
The required dimensions can be easily determined by those skilled in the art.
The concept of the present invention is based on a phenomenon called the Phareus-Kindkiwist effect.
(Fahraeus, R., Lindqvist, T., Am. J. Physiol. 1931; 96: 562-8)
. It is a thin capillary (<
(About 0.3 mm), blood cells flow through the center of the capillary into the plasma.
Is the phenomenon of forming the surrounding sleeve. This effect is due to the flow velocity above the blood cells
Due to the fact that blood cells will lift if they differ from the flow velocity below the blood cells
(See Aircraft Wing). The shear force of the liquid is the closest to the capillary surface
The lift is maximized. This lift is due to a capillary with equal flow velocity on both sides of the blood cell.
Tends to push blood cells towards the center of the blood vessel, resulting in a capillary wall
A plasma layer free of blood cells will result adjacent to the part.
Whole blood treated with anticoagulant, a ligand capable of binding a test substance in the blood, or
When transported through a thin-layer flow cell with a receptor on which the receptor is immobilized,
The liquid layer adjacent to the sensing surface is therefore blood cell free plasma. Detection
By binding the analyte to the surface
To the immobilized analyte receptor, starting from the sensing surface depleted in analyte.
A liquid layer is created in which the binding of the analyte is controlled by the diffusion of the analyte to its surface.
(Although, of course, there is no limit to the analyte-receptor reaction).
If the cell-free plasma layer described above is thicker than the analyte depleted layer,
This analytical environment is true, as the diffusion of analytes is not hindered by blood cells.
In addition, it is the analytical environment of the plasma sample itself. As explained below
In addition, this assay is independent of blood cell percentage, ie hematocrit
There is no need to make corrections.
The present invention provides a test substance and a test substance dissolved in an emulsion liquid type or suspension type sample.
Binding an analogue or other species to a solid phase immobilized ligand or receptor,
For all types of heterogeneous assays that directly or indirectly detect solid phase binding
It can be applied. Such emulsion types other than anticoagulated blood
Other examples of suspension-type samples are bacterial suspensions, food emulsions such as milk
Etc. can be mentioned.
The species whose binding to the surface is measured need not be the primary target of the analysis, of course,
It may only be a means of indirectly measuring the desired component in a suspension or emulsion.
Yes. For example, bacterial cells may, in an indirect assay, show residual antibody to the bacterial cells.
It can be detected by measuring with an immunological assay.
By the detection principle, which measures the amount of analyte or other species bound to the sensing surface
The present invention is not limited. Solid phase detection for appropriate types of detection systems
The structure of the detection structure
There is something to measure as an index of the binding of the test substance to the immobilized ligand.
. These methods include, for example, piezoelectric methods, optical methods, thermo-optical methods and
And mass detection methods such as surface acoustic wave (SAW) method, as well as potential difference method, electrical conduction
There are electrochemical methods such as densitometry, amperometry and capacitance.
As an optical method, in particular, a method for detecting the mass surface concentration, for example, an internal method
And reflected light, including both external and external reflection methods, eg ellipsometry and vanishing wave spectroscopy
Law (EWS). The latter includes surface plasma resonance spectroscopy (SPRS), Brewster
-Angular refraction measurement method, critical angle refraction measurement method, attenuated total reflection spectroscopy (FTR), vanishing wave ellipsometry
Method, total internal reflection scattering spectroscopy (STIR), optical waveguide sensor, vanishing wave-based imaging method,
For example, critical angle resolution imaging, Brewster angle resolution imaging, SPR angle resolution imaging, etc.
In addition there are methods based on quenching fluorescence (TIRF) and phosphorescence.
Among the above-mentioned optical methods, SPRS has recently received a great deal of attention. SPR
The phenomenon of is well known. Simply put, SPR is an optically transparent material
For example, glass and thin metal films are usually reflected at a specific angle from the interface between silver or gold.
Observed as a dip in the intensity of the emitted light, especially near the metal surface
It depends on the refractive index of the medium (eg sample solution). For example a substance on a metal surface
If the refractive index of the metal surface changes due to the adsorption or binding of
A corresponding shift occurs. Two devices are needed to send light to the interface where SPR occurs.
You can select and use the device. Metallized diffraction grating (Wood effect) or metallized glass pre
Prism (Kretschmann)
Effect)
It is. For more details on SPR, see our WO 90/05295.
Has been affected. In SPR-based immunoassays, the ligand is attached to a metal surface.
And then interact with the analyte dissolved in the liquid sample that comes into contact with it.
Monitor usage.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.
FIG. 1 is a schematic sectional view of a thin layer flow cell.
FIG. 2 is a cross section taken along line AA of FIG.
FIG. 3 is a schematic cross-sectional view of total blood flow in a flow cell having an annular cross section.
FIG. 4 is a schematic cross-sectional view of total blood flow in a flow cell having a rectangular cross section.
FIG. 5 is a schematic cross-sectional view of the flow in the vertical direction of the flow cell.
FIG. 6 shows the measurement of IgE in anticoagulant-treated whole blood samples with various blood cell contents.
FIG. 7 is a graph showing results as a plot of relative response versus erythrocyte volume fraction (EVF).
.
FIG. 7 shows the measurement results of the IgE concentration in the anticoagulant-treated whole blood sample.
3 is a graph shown as a plot of versus response versus concentration.
FIG. 8 shows myocytosis in anticoagulant-treated whole blood samples with various blood cell contents.
Globin measurement results are shown as a plot of relative response versus erythrocyte volume fraction (EVF)
It is a graph.
Figure 9: Measurement of myoglobin concentration in anticoagulant treated whole blood samples.
3 is a graph showing the results as a plot of relative response versus concentration.
FIG. 10 shows the measurement results of protein G in a bacterial culture sample as a relative response pair.
6 is a graph shown as a plot of sample dilution.
Figure 11 shows the monocquer for creatine kinase MB in cell culture samples.
Ronal antibody measurements are shown as a plot of relative response versus sample dilution.
It's rough.
With particular reference to FIGS. 1-5, a more theoretical explanation of the invention will now be attempted.
I will.
Ligands or analytes can be added to a solid phase, such as the wells of a microtiter plate.
Binding within or on the sensor surface (eg electrochemical methods, SPR, TIRF, SAW, etc.)
In heterogeneous assays, the increase in bound analyte on the surface is usually
It is controlled by a flow rate that limits the diffusion of molecules. This flow rate is given by:
dR / dt = kMC (1)
(Where dR / dt is the flow rate to the surface, kMIs the collective transport coefficient and C is the
It is the concentration of the test substance).
Consider the thin layer flow cell illustrated in FIG. This rectangular
Detection of the flow cell spreading along the inlet 1, outlet 2 and bottom wall of the flow cell
It has a surface 3. As indicated in FIG. 2, the width of the flow cell is b and a, and the height is
h. XinTo XoutThe sensing surface 3 up to is transported through the flow cell
It supports an immobilized ligand capable of reacting with the analyte in a liquid sample. Normal
Under the operating conditions of, the collective transport coefficient of such a flow cell, kMIs independent of time
(Sjolander S. et al., Anal. Chem. 63, 1991), the formula:
kM(X) = 0.98 × (D / h)2/3(f / bx)1/3 (2)
(In the formula, x is the distance from the inlet 1 of the flow cell, and D is the spread of the test substance.
The dispersion coefficient, h and b are the height and width of the flow cell, respectively (Fig. 2), and f is the volume.
Is the flow rate). Not only the conditions necessary for Equation 2 but the collective transport coefficient
, KMIs much smaller than the heterogeneous association rate constant, ie, kM≪ kaRm ax
(In this case RmaxIs the maximum uptake of the sensing surface 3).
The flow cell shown in Fig. 1 has a continuous volume with extremely low dead volume with respect to the measurement cell.
Assuming the measurement cell in a raw system, an ideal square pulse sensing surface
It is possible to fire at 3, which also
0> t> tkThen C = 0
0 <t <tkIn case of, C = C (3)
(In the formula, tkIs the contact time of the test substance with the detection surface 3).
Ie C and kMIs independent of time, the test substance uptake level is
Equation 1 is the contact time tkIs obtained by integrating about.
As is clear from Equation 4, the uptake level R (x) of the test substance is
It is independent of the capacity of the cell. The requirement to be satisfied is that the sample volume is
Contact time tkOnly large enough for the volume of sample injection that is sometimes made.
You. From this point of view, the test substance is either solid or suspended or emulsified in the sample.
Or is completely independent of the amount of immiscible material. Thus, for example, anticoagulant treatment
In the case of whole blood deposited, the test substance is independent of hematocrit.
However, the suspension or emulsion in the sample is
It affects the constant D and thus the uptake R (x) of the analyte. Of course, in this case
Of interest is the diffusion constant (in the Z direction in FIG. 1) perpendicular to the laminar flow. Tato
Consider, for example, anticoagulated whole blood, which is a heterogeneous suspension of plasma and blood cells.
And The diffusion of the test substance occurs in blood plasma with the same diffusion constant as in plasma,
Transport is impeded by collisions with solid "particles" in the form of blood cells. Therefore
However, the uptake of the test substance depends on hematocrit.
As already mentioned above, the Phareus-Kindkiwist effect is
It occurs when it is transported as a laminar flow in a capillary, and the flow velocity is above and below the blood cells.
It concentrates in the central core within the same capillary, while plasma contains blood cells around the core.
This is a phenomenon observed when a liquid sleeve that does not stay is formed. This is usually 100 μm or less
In an assay performed in a thin layer flow cell with the dimensions below
, It means that blood cells are not transported near the sensor surface. Occurs in whole blood
The diffusion constant is, in other words, the sensor by the Phareus-Kindkiwist effect.
-In the layer adjacent to the surface, it is the same as in plasma.
This is illustrated in FIGS. 3 and 4 showing two types of flow cells. Frose of Figure 3
The le has a circular cross-section and the sensing surface is provided inside the cylinder. In FIG.
The flow cell has a rectangular cross section and the sensing surface is mounted on one wall of the flow cell.
Be killed. In both FIGS. 3 and 4, the central core 4 of blood cells is plasma.
Surrounded by layer 5 of The thickness of layer 5 is δ (Fig. 3). On the sensor surface
The analyte is depleted from the plasma layer 5 and is called the diffusion layer, which is the closest to the sensor surface.
It produces a depleted plasma layer. The thickness of this depletion layer 6 is
LD(Fig. 3).
The blood plasma-free plasma layer 5 (thickness δ) is the test substance depletion layer 6 (thickness L).D) Thicker than
However, it is self-evident that the assay does not depend on hematocrit levels.
FIG. 5 is a schematic longitudinal cross-sectional view in a thin-layer flow cell of the type shown in FIG.
is there. The inlet is reference number 7, the outlet is 8 and the test sample depleted of the analyte is
Knowledge surface is indicated by 9. The arrow indicates a laminar flow parabolic flow image. Depletion of test substance or
The diffusion limit layer is designated by reference numeral 10. FIG. 5 shows the thickness L of the test substance depletion layer 10.DBut
It illustrates how it increases with the distance from the inlet 7.
The size of the test substance depleted layer is calculated as follows (Eddows M.J., Biosensors).
, A Practical Ap Proach, Chapter 9, A.E.G. Cass, Oxford University Press, Ne
w York):
LD= D / kM (5)
Formula 5 to LDIncreases with the diffusion constant D and the transport coefficient kMTo decrease with
I understand. Since D is inversely proportional to the size of the molecule, LDIncreases with decreasing molecular weight
I do. That is, the smaller the molecular weight, the wider the test substance depletion layer. Depletion of test substance
The layer size is typically in the range of 5-10 μm.
Therefore, LDChanges in flow cell dimensions and / or flow velocity
It is clear that it will increase or decrease more. Therefore, LDSuch a weird
In the whole blood assayDIs less than the thickness of the blood cell-free layer
Is guaranteed. However, in this regard, the thickness of the analyte depletion layer
Note that Equation 2 is valid only if is less than half the height of the thin-layer flow cell.
You
Should be. Also, if the assay is not entirely mass transport limited, the analyte depletion layer
It becomes as thin as 0 at the total transport limit. In addition, the tight blood cell core
It should be noted that the parabolic flow image that affects the convective component in collective transportation is deformed.
It is. That is, Equation 2 does not perfectly adequately represent the collective transport coefficient.
Yes. This effect on flow image is moderate, but increased uptake of analyte
Is generated.
In summary, the blood cell content of anticoagulated whole blood samples was
It does not directly affect the uptake of analytes on the sensing surface but prevents diffusion to the sensing surface.
Hurt. Phareus-Kindkiwist effect allows blood cells near the sensing surface
A plasma layer free of blood and a core enriched with fast-flowing blood cells is produced. Blood cell
If the plasma layer, which does not contain cells, is thicker than the analyte depletion layer, the sensor
Spread to the surface is not affected. Therefore, at least normal hematocrit
Within the range of the above, despite the deformation of the above-mentioned flow image due to the dense blood cell core,
Allows construction of non-significant assays with very low dependence on hematocrit levels
It is.
Phareus-Kindkiwist effect, however, was
Generally applicable to suspensions or emulsions, not limited to blood cells in blood
It is possible. For the purposes of the present invention, the size of such suspensions or emulsions
The limit of s depends on the dimensions of the flow cell and the sensing area as well as the flow velocity.
That is, the theoretical considerations presented above are for any solution containing suspensions or emulsions.
Also applicable to flow cell sensor-based assays of analyte dissolved in pull
Is done.
In the following examples, which are given solely by way of illustration of the invention, the measurements are
Commercially available SPR-based (Kretschmann effect) biosensor system, BIAcore (registered
Trademark) as well as a commercially available sensing surface, Sensor Chip® CM 5 (
(All manufactured by Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden). Sensor Chip (registered
(Standard) CM 5 has a layer of covalently bonded carboxylated dextran on a gold film surface.
Having a sensing surface in the form of a glass support. Flow cell has a cross-sectional area of 50 μm × 500 μ
m, 2.4 mm wide with upward opening channels, which are
Closed by the sensing surface of the Sensor Chip® CM 5 docked in it
ing.
Example 1
IgE assay of whole blood with variable hematocrit Blood sample preparation
Donor EDTA blood IgE (Pharmacia Diagnostics AB, Uppsala, Sweden) 1000ng /
ml was replenished, mixed and centrifuged at 2,500 rpm for 10 minutes. Plasma and blood cells to each other
Separation and then a mixture of red blood cell volume fraction (EVF) of 0, 20, 40 and 60% respectively
Mixed to give the same concentration of IgE, but the normal EVF range in humans
Blood samples were prepared with various cell contents coveringPreparation of anti-IgE surface
Dock the Sensor Chip CM5 into the BIAcore® device, drive buffer, HES
(10 mM Hepes buffer, 0.15 M NaCl, 3.4 mM EDTA, and 0.05% Tween), pH 7.
Coupling buffer, 10 mM, maintaining a continuous flow of 4 on the sensing surface at 5 μl / min
100 μg / ml IgE-specific antibody (Pharmacia Diagnosti in sodium acetate, pH 5.0)
cs AB, Uppsala,
(From Sweden) according to the device manufacturer's instructions on the sensing surface.
Was.IgE assay
A continuous flow of driving buffer, HBS, was maintained on the sensing surface at 5 μl / min.
35 μl of each blood sample prepared above was infused at 5 μl / min (contact time 420 seconds). Conclusion
The combined IgE was then detected by injecting 1.0 mg / ml of anti-IgE antibody as a secondary reagent.
. Regeneration between blood sample injections was performed with 10 mM glycine hydrochloride, pH 2.25.
Was.
A similar experiment was performed by changing the flow rate of the driving buffer to 20 μl / min.
35 μl was injected at 20 μl / min (contact time 105 seconds) and bound IgE was added to the secondary cells as above.
Detected with reagent.
The prepared whole blood sample was then centrifuged to separate plasma. Each plasma sample
35 μl as above with 5 μl / min (contact time 420 sec) and 20 μl / min (contact time 105
Seconds).
The results (relative response normalized to plasma response plotted against EVF) are shown in the figure.
6 is shown. As is clear, the response at a slow flow rate of 5 μl / min depends on EVF.
However, there was a significant difference between whole blood and plasma. However, at a high flow rate of 20 μl / min,
Responses were not dependent on EVF, as expected.
Example 2
IgE assay of whole blood with varying IgE concentration
A well-mixed donor EDTA blood sample with the following concentrations: 100, 500, 1000, 2000
And 4500 ng / ml were supplemented with IgE. To get the same EVF for all samples,
IgE was added from the primary standard. Samples are then thoroughly mixed and each sample
Half of the
I got a sample. Whole blood and plasma samples are then described in Example 1 above.
The same anti-IgE antibody-immobilized surface as above was used at a flow rate of 10 μl / min.
Anti-IgE antibody was injected and analyzed. Results (relative response vs. concentration of IgE
(Shown in FIG. 7) is shown in FIG.
There is good agreement between blood and plasma levels.
Example 3
Whole blood myogbin assay with variable hematocrit Blood sample preparation
400ng of myoglobin (Dako A / S, Copenhagen, Denmark) on donor EDTA blood
/ Ml was replenished, mixed and centrifuged at 2,500 rpm for 10 minutes. Plasma and blood cells to each other
EVF is 0, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60 and 70% respectively.
Mixed to give different mixtures of myoglobin with the same concentration but
Blood Samples with Various Cellular Contents Widely Covering the Normal EVF Range in Rats
Was prepared.Preparation of anti-myoglobin surface
Dock the Sensor Chip CM 5 into the BIAcore® instrument, drive buffer, HES
(10 mM Hepes buffer, 0.15 M NaCl, 3.4 mM EDTA, and 0.05% Tween), pH 7.4
Coupling buffer, 10 mM, maintaining a continuous flow of 5 μl / min on the sensing surface
50 μg / ml myoglobin-specific antibody in sodium acetate, pH 5.0 (Pharmacia Bi
osensor AB, Uppsala, Sweden) according to the manufacturer's instructions
Coupling on top.Myoglobin assay
A continuous flow of HES was maintained on the sensing surface at 10 μl / min. Prepared above
12 μl of each blood sample was infused at 10 μl / min (contact time 72 seconds). Combined myoguro
The bottle is then used as a secondary reagent for anti-myoglobin antibody (rabbit anti-myoglobin
, Dako A / S, Copenhagen, Denmark) 1.0 mg / ml was injected for detection. Blood sump
Regeneration between injections was performed with 10 mM glycine hydrochloride, pH 2.25.
The flow rate of the driving buffer was changed to 40 μl / min. Then add 30 μl of each blood sample to 40
μl / min (contact time 45 sec) and bound myoglobin as described above.
Detected with reagent.
The prepared whole blood sample is then centrifuged to separate plasma and the plasma sample
In the same manner as described above, 10 μl / min, 40 μl / min and 2 μl / min were tested, respectively.
Results (in the form of a plot of relative response normalized to plasma response against EVF)
FIG. As can be seen, the slow flow rates of 2 μl / min and 10 μl / min
Responses depended on EVF. However, at a high flow rate of 40 μl / min, the response is substantially
Did not depend on EVF.
Example 4
Assay of whole blood myoglobin with varying myoglobin concentrations
Mix well-mixed donor EDTA blood samples with the following concentrations: 0, 20, 40, 400, 800
And 1600 ng / ml were supplemented with myoglobin. The same EVF was obtained for all samples
As such, the addition of myoglobin was done from the primary standard. Then complete the sample
Mixed and half of each sample was centrifuged to obtain a plasma sample. Whole blood sample
And a plasma sample, then an anti-myoglobin surface similar to that described in Example 3 above.
At a flow rate of 10 μl / min and then analyzed with anti-myoglobin as a secondary reagent.
Was. Results (relative response to myoglobin concentration
The plotted form) is shown in FIG. Good agreement between blood and plasma levels
.
Example 5
Assay of protein G in bacterial culture Sample preparation
Incubate a protein G producing E. coli strain and heat the bacteria to + 80 ° C for 6 minutes after culturing
Lysis was performed to release the protein G product. About 109Contains cells / ml
Was. Samples of culture were taken for analysis. Centrifuge a portion of the sample into cells
Was removed. Cell-containing sample and centrifuge sample in culture medium respectively
Diluted 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 and 1:12.Preparation of rabbit antibody detection surface
The rabbit antibody sensing surface was the same as described in Example 1 for the preparation of anti-IgE surface.
It was prepared by the same method.Protein G assay
In the same manner as described in Example 1, the sample was injected onto the surface of the rabbit antibody and then protected.
IG was analyzed and the surface was regenerated between samples with 10 mM glycine hydrochloride, pH 2.5
did. Graphical results in the form of a plot of relative response (resonance units, RU) vs. sample dilution
Shown in 10. As can be seen, with the same concentration of crude and centrifuged samples
Does not differ in average response,7~Ten9The presence of cells (lysed) in the concentration range of / ml
Indicates no effect.
Example 6
Assay of anti-CKMB monoclonal in cell suspension Preparation of culture samples
A hive that produces monoclonal antibodies against creatine kinase MB (CKMB)
Lydoma, Conan MB 2580, in complete culture medium, FDMEM + 10% fetal calf serum (FCS)
And cell concentration is 1 × 108Cultured to cells / ml. Then add two cell suspensions
Divided into test tubes. One test tube is centrifuged to isolate cell-free monoclonal
Solution was obtained while the other remained containing cells. Both solutions were then mixed with the culture medium (containing FCS
FDMEM). The volume was diluted 1/1 to 1/32. As a control, the same exercise
Preparations on complete medium, i.e. FDMEM containing FCS was diluted as above with FDMEM only.
It was carried out.Preparation of RAMFc surface
Rabbit anti-mouse IgG Fc was applied to Sensor Chip CM 5 by a method corresponding to that described in Example 1.
Fixed in.Monoclonal assay
Pour the sample diluent onto the RAMFc-immobilized surface in a manner similar to that described in Example 1.
Input to test for the presence of monoclonal antibody (Mab).
All dilutions were tested in the following order.
Cycles 1 to 6: Cell culture medium 1/1 to 1/32
Cycle 7-12: Mab (cell +) 1 / 1-1 / 32
Cycles 13-18: Mab (cells) 1 / 1-1 / 32
Cycles 19-24: Cell culture medium 1 / 1-1 / 32
Cycle 25-30: Mab (cell +) 1 / 1-1 / 32
Cycles 31-36: Mab (cells) 1 / 1-1 / 32
Each cycle consisted of 4 μl sample (Mab / cell culture medium) injection followed by 10 μl 1
Consists of regeneration with 0 mM glycine hydrochloride, pH 1.5.
In the form of a plot of relative response (resonance units, RU) vs. sample dilution
The results are shown in FIG. No undesired binding was observed with FDMEM + FCS, and immobilized
Specific binding is observed between the body and Mab in the sample. Mab response is (i) cells
Is the same for Mabs with and (ii) without cells, which means that the Mab response is
It is not affected by the presence of cells.
The invention is of course limited by the embodiments described above and shown in the drawings
Not within the general concept of the invention as set forth in the following claims.
Alterations and modifications are possible.