JPH09510104A - 形質転換の進行の誘導性阻害剤を同定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、進行抑制遺伝子を同定するための方法であって、ａ）進行遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換細胞の個体群に導入すること、ｂ）ステップ（ａ）で得た導入された形質転換細胞を、少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導し、該細胞の副個体群を特徴的な表現型に復帰すること、ｃ）進行抑制遺伝子を発現し、特徴的な表現型を示す細胞を選別すること、ｄ）ステップ（ｃ）で得られた細胞からｍＲＮＡを単離すること、ｅ）このようにして得られたｍＲＮＡを未導入の形質転換細胞から得たｍＲＮＡと比較し、ステップ（ｃ）で得られた細胞によってのみ発現されるｍＲＮＡを同定すること、及びｆ）このようなｍＲＮＡをコードする遺伝子を単離し、これによって進行抑制遺伝子を同定することを具備した方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 形質転換の進行の誘導性阻害剤を同定する方法 ここで開示される発明は、Department of Health and Human Servicesからの ＮＩＨ補助金第ＣＡ３５６７５及びＣＡ４３２１０による政府補助でなされた。 従って、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。本発明の背景 この出願全体に渡って、種々の参照文献を括弧内で参照する。これらの刊行物 の全体としての開示は、本発明の属する分野の状態をより完全に示すためにこの 出願に参照文献として含まれる。これらの参照文献の完全な引用文献としての記 載は、本明細書の最後であって、請求の範囲の前に示した。 プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、真核生物細胞内のシグナルトランスダク ションの鍵成分であり、特異的なＰＫＣアイソ型が不死の哺乳動物細胞中で過剰 発現された場合に、これらが形質転換関連特性を誘導しうる。本研究では、出願 人は、クローン化されたＰＫＣβ₁遺伝子が、タイプ５アデノウイルス（Ａｄ５ ）で形質転換されたラット胎児（ＲＥ）細胞（クローンＥ１１）において、即ち 形質転換の進行（transformation progression）と呼ばれる過程で、形質転換さ れた表現型の増加された発現を誘導しうることを示す。ＰＫＣβ₁遺伝子、クロ ーンＢ１／ＰＫＣを発現するＥ１１細胞は、ＰＫＣβ₁ｍＲＮＡを産生し、高め られたＰＫＣ酵素活性及び[³Ｈ]−ホルボール−１２，１３−ジブチレート（Ｐ ＤＢｕ）の細胞表面ホルボールエステル受容体への結合を示す。Ｂ１／ＰＫＣ細 胞は、親Ｅ１１細胞と比較して寒天中で増加された効率で成長し、足場非依存性 が、腫瘍増進剤、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール−１３−アセテート （ＴＰＡ）の添加によって両細胞タイプで更に増加される。Ｂ１／ＰＫＣ細胞の ５−アザシチジン（ＡＺＡ）への単一被爆とこれに続くこの脱メチル化剤の非存 在下での成長は、進行表現型（progression phenotype）の非進行性の親Ｅ１１ クローンの表 現型への安定な復帰を示すＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡクローンを生じさせる。進行表 現型の欠如は、ＰＫＣβ₁で誘導される生化学的及び細胞変化の減少と一致する 。対照的に、進行−抑制は、Ａｄ５形質転換遺伝子、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、又は内 因性ＰＫＣε遺伝子の発現に関する変化を含まない。ＴＰＡは、Ｂ１／ＰＫＣ− ＡＺＡ細胞で進行表現型を誘導し得ないが、これは、ＰＫＣβ₁及びｃ−ｊｕｎ の転写速度及び定常状態ｍＲＮＡレベルの増加を誘導することができ、更にこれ はＡＰ−１ＤＮＡ結合を増加する。これらの結果は、ＰＫＣβ₁遺伝子がＡｄ５ によって予め形質転換されたラット胎児細胞内で形質転換進行誘導遺伝子として 提供され得ること、及び進行がＡＺＡ感受性「進行抑制遺伝子(progression sup pressorgene(s)）」のメチル化による不活性化によって媒介されうることを示す 。Ｂ１／ＰＫＣ細胞での抑制過程は、Ａｄ５形質転換遺伝子の発現に独立である が、ＡＺＡ処理されたＢ１／ＰＫＣ細胞における感染されたＰＫＣβ₁遺伝子の 減少された発現に直接に相関する。 発癌過程は、新たな特性の獲得で生じる細胞の表現型での一連の連続した変化 の結果であるか、又は発達した腫瘍細胞による形質転換関連特性の更なる同化の 結果である（Fisher，1984; Nowell，1986; Nicholson，1987; Weinstein，1988 ;Bishop，1991に概説されている。）。腫瘍細胞の進行に潜在するメカニズムを 明確にすることが残されている。形質転換の進行に奇与する可能な因子には、癌 細胞表現型を増進する細胞遺伝子、即ち腫瘍遺伝子の活性化；癌細胞表現型の阻 害剤として機能する細胞遺伝子、即ち腫瘍抑制遺伝子の欠如又は不活性化；及び ／又は同じ腫瘍細胞でのこれらの遺伝子の変化の組合せが含まれる（Weinberg， 1985; Bishop，1987，1991; Sager，1989; Marshall，1991に概説されている。 ）。以前の研究では、Ａｄ５による第二期のラット胎児の形質転換が、しばしば 、形質転換された細胞により特異的な表現型を獲得し、更にこれを同化する一連 の過程となることが示されている（Fisher et al.，1979a,b,c）。Ａｄ５形質転 換モデルでの進行は、進行性細胞によって高められた足場非依存性及び腫瘍形成 の可能性（ヌードマウスでの腫瘍形成の潜伏期の現象によって示される。）の発 生によって特徴づけられる（Babiss et al.，1985）。Ａｄ５で形質転換された ラット胎児細胞での進行表現型は、自発的進行と称される寒天内での成長又はヌ ードマ ウスでの腫瘍形成に対して選別することによって（Fisher et al.，1979a,b,c） 、又は腫瘍遺伝子で媒介される進行と称されるＨａ−ｒａｓ（Ｔ２４）腫瘍遺伝 子での感染によって（Duigou et al.，1989）誘導されうる。 自発的に及び腫瘍遺伝子で媒介される進行は、両方とも、単層培養で＞１００ −継代後でさえもＡｄ５で形質転換されたラット胎児細胞で低下されないままで ある安定な細胞の特徴である。しかし、脱メチル化剤、５−アザシチジン（ＡＺ Ａ）での単一処理は、大多数の処理された細胞クローンで形質転換の進行で復帰 を引き起こす（Babiss et al.，1985; Duigou et al.，1989; Reddy et al.，19 93）。これらの観測、及び追加の遺伝子発現の研究(Duigou et al.,1991;Reddy et al.，1993)で、進行が、推定の進行抑制遺伝子のメチル化の状態によって影 響されうる可逆的過程であることが示唆されている。ＡＺＡはまた、Ｃ３Ｈ １ ０Ｔ １／２及び３Ｔ３細胞の両方を誘導し、筋肉、脂肪及び軟骨に分化する（ Taylor & Jones，1979; Jones 1985）。Ｃ３Ｈ １０ １／２細胞内でのこのＡ ＺＡで誘導される決定過程は、３−メチルコラントレン（3-methylcholanthrene ）による形質転換に対する耐性と相関する（Harrington et al.,1988）。同様に 、３Ｔ３ Ｔ細胞での非末端分化（non-terminal differentiation）が、ＵＶ照 射及び４−ニトロキノリンオキシドの両方に対する耐性を誘導する（Scott et a l.，1989）。非末端分化はまた、ＳＶ４０で形質転換された３Ｔ３細胞を誘導し 、多量のＴ抗原の発現を抑制し、形質転換されていない状態へ復帰させる（Scot t et al.，1989）。マウス細胞がＡＺＡ処理され、非末端で分化されることによ る抗癌活性が、Ａｄ５で形質転換されたＲＥ細胞でＡＺＡにより誘導される進行 抑制表現型と同様であるかどうかは現在知られていない。 腫瘍を増進するジテルペンホルボールエステル、ＴＰＡは、Ａｄ５で形質転換 されたラット胎児細胞で、形質転換された表現型の発現を高める（Fisher et al .，1979 a,b,c）。ＴＰＡに対する主要な細胞受容体はＰＫＣであるので、これ らの結果は、この酵素の発現の変化が、形質転換の進行の過程に寄与しうること を示唆する。ＰＫＣは、哺乳動物細胞でのシグナルトランスダクション過程を調 節するときに中枢的な役割を演じるセリン／スレオニンキナーゼの複数の遺伝子 ファミリーである（Ohno et al.，1991; Nishizuka，1992）。生化学的研究及び 分子 クローニングの研究で、ＰＫＣファミリーがＣａ²⁺依存性の従来のＰＫＣ類（ｃ ＰＫＣ：α、β１、β２、γ）及びＣａ²⁺独立性の新規なＰＫＣ類（ｎＰＫＣ： ことが示される（Coussens，et al.，1986: Knopf，et al.，1986; Ono，et al. ，1986，1987，1988; Parker，et al.，1986; Housey，et al.，1987; Ohno，et al.，1988; Backer，et al.，1991; Osada，et al.，1990; Nishizuka，1992） 。進化の間での異なったＰＫＣアイソ型の維持、ＰＫＣアイソ型の酵素特性での 微妙な差及び基質特異性、及びＰＫＣアイソ型の異なった組織分布は、特定の生 物学的機能の調節において特異的なＰＫＣイソ酵素に対する可能な役割を示唆す る（ohno，et al.，1991; Nishizuka，1992）。広範な研究がなれているが、種 々のＰＫＣサブタイプの特異的機能を確立することがまだ残されている(Ohno,et al.，1991; Nishizuka，1988，1992)。細胞生理学に関する種々のＰＫＣアイソ 型の影響を研究するための１つのアプローチは、発現のレベルが高いのでおそら く多少人工的ではあるが、標的細胞で特異的な酵素サブタイプを過剰発現し、細 胞表現型に関してこれらの影響を分析することである（Housey，et al.，1988;P ersons，et al.，1988; Krauss，et al.，1989; Megidish & Mazurek，1989; Bo rner et al.，1991，1992 a,b; Su et al.，1991，1992; Watanabe，et al.，19 92; Mischak，et al.，1993）。 Ｒａｔ６、ＣＲＥＦ及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２のような特異的な不死細胞系での ＰＫＣβ₁遺伝子の過剰発現は、腫瘍遺伝子で形質転換された細胞でしばしば観 測される形態学的、生物学的及び生化学的変化を誘導しうる（Housey，et al.， 1988;Krauss，et al.，1989，Su，et al.，1992）。加えて、ＰＫＣβ₁を過発現 する細胞は、Ｈａ−ｒａｓ（Hsiao，et al.，1989）及びＡｄ５（Su，et al.，1 991）による形質転換に対してより鋭敏である。本研究で、出願人は、ＰＫＣβ₁ 遺伝子が進行表現型の誘導を起こすＡｄ５形質転換ＲＥ細胞においてＡｄ５で形 質転換された遺伝子と共に作用しうるかどうかを決定した。このような相互作用 が観測され、ＴＰＡが、ＰＫＣβ₁を発現するＡｄ５形質転換ＲＥ細胞で足場独 立性を更に高めた。自発的進行及び腫瘍遺伝子で媒介される進行で見出されてい るように（Babiss，et al.，1985; Duigou，et al.，1989; 1991）、脱メチル化 剤、５− アザシチジン（ＡＺＡ）への単一の２４時間被爆で、形質転換進行表現型の永続 的な死滅を示す復帰突然変異体クローンが生じる。ＰＫＣβ₁を発現するＥ１１細 胞で、ＡＺＡ処理は、ＰＫＣβ₁転写速度及び定常状態ｍＲＮＡの減少及びＰＫ Ｃ酵素活性、細胞表面ホルボールエステル受容体への［³Ｈ］−ＰＤＢｕ結合及 び足場独立性の低下に関係する。これらの観測は、自発的に又はＨａ−ｒａｓ若 しくはＰＫＣβ₁の増加された発現により生じるＡｄ５形質転換ＲＥ細胞での進 行の状態が、細胞の進行−抑制遺伝子であってその発現がＤＮＡメチル化で調節 されうるものによって媒介されることを示している（Babiss，et al.，1985;Red dy，et al.，1993）。本発明の概要 本発明は、進行抑制遺伝子を同定する方法であって、ａ）進行遺伝子を含有す るＤＮＡを形質転換された細胞の個体群に導入すること、ｂ）ステップ（ａ）か ら得た導入された形質転換細胞を少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導 するように処理し、細胞の副個体群（subpopulation）を特徴的な表現型に復帰 させること、ｃ）進行抑制遺伝子を発現し、特徴的な表現型を示す細胞を選別す ること、ｄ）ステップ（ｃ）で得た細胞からｍＲＮＡを単離すること、ｅ）ステ ップ（ｃ）で得た細胞によってのみ発現されるｍＲＮＡを同定するために、この ようにして得られたｍＲＮＡを導入されていない形質転換細胞と比較すること、 及びｆ）進行抑制遺伝子を同定するためにこのようなｍＲＮＡをコードする遺伝 子を単離することを具備する方法を提供する。 本発明は更に、レトロウイルスのロングターミナルリピート（long terminal repeat）の発現を抑制する進行抑制遺伝子を同定するための方法であって、ａ） ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有 するＤＮＡを形質転換された細胞の個体群に導入すること、ｂ）ステップ（ａ） で得た細胞を少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導するように処理し、 細胞の副個体群を、ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼ Ｃβ₁遺伝子の発現を選択的に抑制させること、及びｃ）進行抑制遺伝子を発現 する細胞を選別すること、ｄ）ステップ（ｃ）で得た細胞からｍＲＮＡを単離す る こと、ｅ）ステップ（ｃ）で得られた細胞によってのみ発現されるｍＲＮＡを同 定するために、このようにして得られたｍＲＮＡを未導入の形質転換細胞から得 られたｍＲＮＡと比較すること、及びｆ）進行抑制遺伝子を同定するためにこの ようなｍＲＮＡをコードする遺伝子を単離することを具備した方法を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を阻害すること ができる分子を選別する方法であって、ロングターミナルリピートで調節される プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞の個体 群に導入すること、ｂ）プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を発現するステップａ ）で得た細胞を選別すること、ｃ）ロングターミナルリピートの機能を阻害する のに効果的な所定量の分子で該選択された細胞を処理すること、及びｄ）プロテ インキナーゼＣβ₁遺伝子の発現のレベルを決定し、発現のレベルの減少により 、該分子がロングターミナルリピートの機能を阻害することができることが示さ れることを具備した方法を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化するこ とができる分子を選別すること方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで 調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された 細胞の個体群に導入し、プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を発現する細胞を選択 すること、ｃ）ロングターミナルリピートの機能を活性化するのに効果的な所定 量の分子とステップｂ）で得た選択された細胞を接触すること、ｄ）プロテイン キナーゼＣβ₁遺伝子の発現のレベルを決定し、発現のレベルの増加により、該 分子がロングターミナルリピートの機能を活性化することができることが示され ることを具備した方法を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を阻害する遺伝 子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロテ インキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞の個体群に導 入すること、ｂ）少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導し、ロングター ミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現を抑制する ように、ステップ（ａ）で得た細胞を処理すること、及びｃ）ロングターミナル リピートの機能阻害する遺伝子を単離することを具備した方法を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を阻害すること ができるタンパク質因子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピー トで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換さ れた細胞の個体群に導入し、少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導し、 ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現 を抑制するように、ステップ(ａ)で得た細胞を処理すること、ｃ）ステップ(ｂ) で得た細胞から核を単離し、溶解させ、抽出物を得ること、ｄ）該抽出物をロン グターミナルリピートと接触すること、及びｅ）該ターミナルリピートと結合す るタンパク質因子を単離し、これによってロングターミナルリピートの機能を阻 害することができる因子を単離することを具備した方法を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化する遺 伝子を同定するための方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節され るプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞に導 入すること、ｂ）少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導し、ロングター ミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現を抑制する ように、ステップ（ａ）の細胞を処理すること、ｃ）ロングターミナルリピート を活性化するのに効果的な所定量のプロテインキナーゼ活性化化合物又はセリン 若しくはスレオニンに特異的なタンパク質ホスファターゼの阻害剤でステップｂ ）で得た誘導細胞を処理すること、及びｄ）ロングターミナルリピートを活性化 する遺伝子を単離することを具備した方法を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化するこ とができるタンパク質因子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピ ートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換 された細胞に導入すること、ｂ）少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導 し、ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の 発現を抑制するようにステップ（ａ）で得た細胞を処理すること、ｃ）ロングタ ーミナルリピートを活性化するのに効果的な所定量のプロテインキナーゼＣ活性 化化合物又はセリン若しくはスレオニン特異的タンパクホスファターゼでステッ プｂ）で得られた誘導細胞を処理すること、ｄ）ステップｃ）で得た細胞から核 を 単離し、溶解し、抽出物を得ること、ｅ）ロングターミナルリピートを含有する ＤＮＡを該抽出物と接触すること、及びｆ）該ターミナルリピートと結合するタ ンパク質因子を単離し、これによってロングターミナルリピートの機能を活性化 することができる因子を同定することを具備した方法を提供する。図面の簡単な説明 図１ Ｅ１１及びＥ１１サブクローンでのＰＫＣβ₁、ネオマイシン耐性（ＮＥＯ） 及びＧＡＰＧＨ ｍＲＮＡ発現の定常状態レベルの分析。対数的に成長する細胞 からの全細胞質ｍＲＮＡの１５μｇを使用したノーザン分析を先に開示されたよ うに行った（Babiss，et al.，1983; Su & Fisher，1992）。細胞系には、１０ μＭのＡＺＡ（Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡＩＩｂ、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡＩＩｅ、Ｂ １／ＰＫＣ−ＡＺＡＩＩｇ、Ｂ１／ＰＫＣ／ＡＺＡＩＶａ及びＢ１／ＰＫＣ−Ａ ＺＡＶＩＩａ）で、単離される前に２４時間処理されたＥ１１及びＥ１１−ＮＭ Ｔ(ヌードマウスの腫瘍誘導化Ｅ１１サブクローン)、ＰＫＣβ₁を発現するＥ１ １サブクローンＢ１／ＰＫＣ、Ｂ１／ＰＫＣ（Ｂ１／ＰＫＣ−ｃｌ１、Ｂ１／Ｐ ＫＣ−ｃｌ２、Ｂ１／ＰＫＣ−ｃｌ７及びＢ１／ＰＫＣ−ｃｌ１０）の単一細胞 サブクローン及びＢ１／ＰＫＣ細胞が含まれる。 図２ Ｅ１１及びＥ１１サブクローンでのＡｄ５、Ｅ１Ａ、Ａｄ５ Ｅ１Ｂ及びＧＡ ＤＰＨ ｍＲＮＡ発現の定常状態レベルの分析。対数的に成長する細胞からの全 細胞質ｍＲＮＡの１５μｇを使用したノーザン分析を先に開示されたように行っ た（Babiss，et al.，1983; Su & Fisher，1992）。細胞系の説明は、図１の説 明中に見出されうる。 図３ Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡＩＩｇ細胞でのＰＫＣβ₁、ＰＫＣε、ｃ−ｊｕｎ及び ＧＡＰＤＨの発現に関するＴＰＡの影響。細胞を、ＲＮＡの単離及びノーザンハ イブリダイゼイションによる分析の前に１００ng ml^-1のＴＰＡで１５、３０、 ６０又は１２０分処理した。比較として、未処理のＥ１１−ＮＭＴ、Ｅ１１、Ｂ １ ／ＰＫＣ、Ｂ１／ＰＫＣ−ｃｌ１、Ｂ１／ＰＫＣ−ｃｌ１０及びＢ１／ＰＫＣ− ＡＺＡＩＩｇから得たｍＲＮＡサンプルを分析した。 図４ Ｅ１１及びＥ１１サブクローンでのＰＫＣβ₁及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発 現に関する連続的及び一時的ＴＰＡ処理の影響。ＲＭＡは、未処理のＥ１１及び Ｅ１１サブクローン又は１０ ng/ml^-1のＴＰＡ（ＴＰＡ）の存在下で２４時間成 長させたサブクローン、又は１０ ng ml^-1のＴＰＡ（ＴＰＡ）の存在下で２４時 間成長させ、次いでＴＰＡの非存在下で１週間成長させたサブクローンから単離 した。 図５ ＴＰＡの非存在下又は存在下で成長させたＥ１１、Ｅ１１−ＮＭＴ、Ｂ１／Ｐ ＫＣ及びＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡＩＩｇ細胞における遺伝子転写速度の分析。２× １０⁶細胞から得た核を、示された各細胞系（未処理であるか、又は１００ng ml^-1 のＴＰＡで１時間処理したもの）から単離し、核ＲＮＡをin vitro で標識し 、引き続いてナイロン膜上で変性させたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた 。各ハイブリダイゼーション反応に対して、同じ数の細胞核を表す等しい数のカ ウントを使用し、これにより転写の比較速度を得ることができる。使用した遺伝 子プローブは、四角の枠内で示された順で表される。 図６ Ｅ１１、Ｂ１／ＰＫＣ及びＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡＩＩｇから得た核タンパク質 のＡＰ−１及びＭＥＣＡ ＤＮＡ配列への結合に関するＴＰＡの影響。ＡＰ−１ オリゴヌクレオチドプローブ（５’−ＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴ ＣＡＴＧＣＡＧＴＴＣ−３’）（配列認識番号１）（ａ）又はＭＥＣＡオリゴヌ クレオチドプローブ（５’ＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣ ＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列認識番号２）（ｂ）と、未処理若しくはＴＰＡ（２ ４時間）処理された細胞から調製した核抽出物との間で形成された複合体のゲル シフト分析。ＤＮＡレーンは核抽出物を添加していないオリゴヌクレオチドプロ ーブに関連づけられている。核抽出物と組み合わせて１００倍過剰の相当する競 合ＤＮＡ配列を加えるとＡＰ−１及びＭＥＣＡオリゴヌクレオチドプローブの結 合が遊離された（データは示していない。）。 図７ Ｂ１／ＰＫＣ及びＢ１／ＰＫＣ−ＰＢ５細胞におけるＢ１／ＰＫＣβ₁、Ａｄ５ Ｅ１Ａ、Ａｄ５ Ｅ１Ｂ及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの定常状態レベルに関するＴ ＰＡの影響。細胞を、ＲＮＡの単離及びノーザンハイブリダイゼーションによる 分析前１時間又は４時間５０又は１００ng ml^-1で処理した。Ｂ１／ＰＫＣ−Ｐ Ｂ５は、４mMのフェニルブチレートで４日間処理し、次いで単離の前にＰＢを欠 く培地で２週間成長させたＢ１／ＰＫＣ細胞の単一細胞サブクローンである。本発明の詳細な説明 この出願全体に渡って、以下の標準的な記号を特別なヌクレオチドを示すため に使用した。 Ｃ＝シトシン Ａ＝アデノシン Ｔ＝チミジン Ｇ＝グアノシン 本発明は、進行抑制遺伝子を同定する方法であって、進行遺伝子を含有するＤ ＮＡを形質転換された細胞の個体群に導入すること、ｂ）少なくとも１つの進行 抑制遺伝子の発現を誘導し、該細胞の副個体群を特徴的な表現型に復帰させるよ うにステップ（ａ）で得られた導入された形質転換細胞を処理すること、ｃ）進 行抑制遺伝子を発現し、特徴的な表現型を示す細胞を選別すること、ｄ）ステッ プ（ｃ）で得た細胞からｍＲＮＡを単離すること、ｅ）このようにして得られた ｍＲＮＡを、ステップ（ｃ）から得た細胞によってのみ発現されたｍＲＮＡを同 定するように未導入の形質転換細胞から得られたｍＲＮＡと比較すること、及び ｆ）このようにして進行抑制遺伝子を同定するようにこのようなｍＲＮＡをコー ドする遺伝子を単離することを具備した方法を提供する。 本発明は、形質転換された細胞の進行表現型を抑制する進行抑制遺伝子を同定 する方法であって、ａ）進行遺伝子を形質転換された細胞に導入すること、ｂ） 少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導することによって進行表現型を選 択的に抑制すること、及びｃ）進行抑制遺伝子を単離することを具備した方法を 提供する。 進行抑制遺伝子は、減法ハイブリダイゼイション（subtractive hybridiza-ti on）又は差表示（differential display）によって同定されうる。減法ハイブリ ダイゼイション技術は、当分野で周知である。分化発現クローニング(different ial expression cloning)の差表示も公知である(Sager et al.，1993;Liang & P ardee，1992; Sun，et al.，1994)。 進行表現型はアザシトシン又はフェニルブチレートのような化学物質によって 選択的に抑制されうる。このような処理は、少なくとも１つの進行性抑制遺伝子 の発現を誘導し、結果として進行表現型が抑制される。 本発明は、上記方法で同定される進行抑制遺伝子を提供する。この同定された 遺伝子は、形質転換された表現型の抑制及び進行の調節の更なる研究に有効であ ろう。進行抑制遺伝子は、腫瘍染色の診断への応用及び治療への使用に有効であ ることがわかる。 ここで説明され、特許申請された進行抑制遺伝子は、ポリペプチドのアミノ酸 配列に関連するこれらが提供する情報に有効であり、種々の組換え技術によるポ リペプチドの大スケールの合成のための生成物として有効である。該遺伝子は、 新たなクローニング、発現ベクター、形質転換及び感染された原核生物及び真核 生物ホスト細胞を生じさせるのに有効であり、ポリペプチド及び関連生成物を発 現することができるこのようなホスト細胞の培養成長のための新規で有効な方法 を生じさせるのに有効である。 本発明は更に、ＲＮＡ転写のプロモーターに外科的に結合される進行抑制遺伝 子を提供する。 本発明は、同定された進行抑制遺伝子を含有するベクターを提供する。適切な ベクターはプラスミド又はウイルスを含有するが、これに限定されない。これら のベクターは、適切なホスト細胞に形質導入され、同定された進行抑制遺伝子の ポリペプチドの産生のためのホスト細胞ベクター系を形成する。 本発明は、同定された進行抑制遺伝子を含有するウイルスを提供する。 本発明は、同定された進行抑制遺伝子によってコードされるポリペプチドを提 供する。 本発明は更に、レトロウイルスのロングターミナルリピートの発現を抑制する 進行抑制遺伝子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節 されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞 の個体群に導入すること、ｂ）少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導し 、該細胞の副個体群にロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナー ゼＣβ₁遺伝子の発現を選択的に抑制させるようにステップ（ａ）で得た細胞を 処理すること、及びｃ）進行抑制遺伝子を発現する細胞を選別すること、ｄ）ス テップ（ｃ）で得た細胞からｍＲＮＡを単離すること、ｅ）このようにして得ら れたｍＲＮＡを、ステップ（ｃ）で得た細胞によってのみ発現されるｍＲＮＡを 同定するように未導入の形質転換細胞から得たｍＲＮＡと比較すること、及びｆ ）このようなｍＲＮＡをコードする遺伝子を、これによって進行抑制遺伝子を同 定するように単離することを具備した方法を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの発現を抑制する進行 抑制遺伝子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節され るプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を形質転換された細胞に導入すること、ｂ） 少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導することによってロングターミナ ルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現を選択的に抑制 すること、及びｃ）進行抑制遺伝子を単離することを具備した方法を提供する。 本発明の一態様では、レトロウイルスは、モロニー白血病ウイルスロングター ミナルリピートである。他の態様では、レトロウイルスは、ヒト免疫不全ウイル スである。 本発明の一態様では、少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導すること によるロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子 の発現の選択的抑制は、５−アザシチジン又はフェニルブチレートでの処理によ って達成される。他の態様では、選択的抑制は、ＤＮＡ脱メチル化剤との処理に よって達成される。ＤＮＡ脱メチル化剤は当分野で周知である。 本発明は更に、進行抑制遺伝子が減法ハイブリダイゼイション又は差表示によ って単離されることを規定する。 本発明はまた、上記方法によって同定される進行抑制遺伝子を提供する。本発 明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに外科的に結合された進行抑制遺伝子を提供す る。本発明は、この同定された進行抑制遺伝子を含有するベクターを提供する。 本発明はまた、この同定された進行抑制遺伝子を含有するウイルスを提供する。 本発明は更に、この同定された進行抑制遺伝子によりコードされるポリペプチド を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を阻害すること ができる分子を選別する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節さ れるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞の 個体群に導入すること、ｂ）プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を発現するステッ プａ）で得た細胞を選別すること、ｃ）選別された細胞を、ロングターミナルリ ピートの機能を阻害するのに効果的な所定量の分子で処理すること、及びｃ）プ ロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現のレベルを決定し、発現のレベルの減少に より、該分子がロングターミナルリピートの機能を阻害しうることが示されるこ とを具備した方法を提供する。 本発明はまた、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を阻害する ことができる分子を選別する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調 節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を形質転換された細胞に導入すること 、ｂ）ステップａ）で得た細胞をロングターミナルリピートの機能を阻害するの に効果的な所定量の分子と接触すること、ｃ）プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子 の発現のレベルを決定し、発現のレベルの減少により、該分子がロングターミナ ルリピートの機能を阻害することができることが示されることを具備した方法を 提供する。 上記方法の一態様では、レトロウイルスは、モロニー白血病ウイルスである。 他の態様では、該レトロウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスである。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化するこ とができる分子を選別する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節 されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を形質転換された細胞に導入すること、 ｂ）ステップａ）で得た細胞を、ロングターミナルリピートの機能を活性化する のに効果的な所定量の分子と接触させること、ｃ）プロテインキナーゼＣβ₁遺 伝子の発現のレベルを決定し、発現のレベルの増加により該分子がロングターミ ナ ルリピートの機能を活性化しうることが示されることを具備した方法を提供する 。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を阻害する遺伝 子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロテ インキナーゼＣβ₁遺伝子を形質転換された細胞に導入すること、ｂ）少なくと も１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導することによってステップａ）の導入細胞 内のロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の 発現を選択的に阻害すること、及びｃ）ロングターミナルリピートの機能を阻害 する遺伝子を単離することを具備した方法を提供する。一態様では、該遺伝子は 減法ハイブリダイゼイション又は差表示によって単離される。 本発明は更に、上記方法によって同定される遺伝子を提供する。本発明はまた 、ＲＮＡ転写のプロモーターに外科的に結合された害同定された遺伝子を提供す る。本発明は更に、上記遺伝子を含有するベクターを提供する。本発明はまた、 上記遺伝子によりコードされるポリペプチドを提供する。 本発明は、ロングターミナルリピートの機能を阻害することができるタンパク 質因子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプ ロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を形質転換された細胞に導入すること、ｂ）少な くとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導することによってステップａ）の導入 細胞内でロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝 子の発現を選択的に抑制すること、ｃ）ステップｂで得た細胞から核を単離し、 溶解し、抽出物を得ること、ｄ）該抽出物をロングターミナルリピートと接触さ せること、及びｅ）該ターミナルリピートと結合するタンパク質因子を単離し、 これによってロングターミナルリピートの機能を阻害することができる因子を単 離することを具備した方法を提供する。本発明は、上記方法によって同定される タンパク質因子を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化する遺 伝子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロ テインキナーゼＣβ₁遺伝子を形質転換された細胞に導入すること、ｂ）少なく とも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導することによって、ロングターミナルリ ピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現を選択的に抑制する こ と、ｃ）ステップｂ）で得た誘導細胞を、プロテインキナーゼＣを活性化する化 合物又はセリン若しくはスレオニンに特異的なタンパク質ホスファターゼの阻害 剤で処理し、ロングターミナルリピートを活性化すること、及びｄ）ロングター ミナルリピートを活性化する遺伝子を単離することを具備した方法を提供する。 一態様では、該遺伝子は、減法ハイブリダイゼーション又は差表示によって単離 される。 一態様では、プロテインキナーゼＣ活性化化合物は、腫瘍を増進させるジテル ペンホルボールエステルである。他の態様では、プロテインキナーゼＣ活性化化 合物は、プロテインキナーゼＣの合成活性剤である。この化合物の例は、ＡＤＭ Ｂであり、他の例は、ＤＨＩである。 他の態様では、セリン若しくはスレオニン特異的タンパク質ホスファターゼは プロテインキナーゼＣβ₁を活性化するのに使用される。このセリン若しくはス レオニン特異的タンパク質ホスファターゼは、カリクリン（calyculin）である 。他の例は、オカダ酸（okadaic acid）である。 本発明は更に、上記方法で同定される遺伝子を提供する。本発明はまた、ＲＮ Ａ転写のプロモーターに外科的に結合された該同定遺伝子を提供する。本発明は 更に、上記遺伝子を含有するベクターを提供する。本発明は、上記遺伝子を含有 するウイルスを提供する。本発明はまた、上記遺伝子によってコードされるポリ ペプチドを提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化しうる 分子を選別する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロ テインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞の個体群に 導入すること、ｂ）プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を発現する細胞を選別する こと、ｃ）ステップｂ）で得た選別された細胞をロングターミナルリピートの機 能を活性化するのに効果的な所定量の分子と接触すること、ｃ）プロテインキナ ーゼＣβ₁遺伝子の発現のレベルを決定し、発現のレベルの増加により、該分子 がロングターミナルリピートの機能を活性化できることが示されることを具備し た方法を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を阻害する遺伝 子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロテ インキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞の個体群に導 入すること、ｂ）少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導し、ロングター ミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現を抑制する ようにステップ（ａ）で得られた細胞を処理すること、及びｃ）ロングターミナ ルリピートの機能を阻害する遺伝子を単離することを具備した方法を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を抑制すること ができるタンパク質因子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピー トで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換さ れた細胞の個体群に導入すること、ｂ）少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現 を誘導し、ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝 子の発現を抑制するようにステップ（ａ）で得た細胞を処理すること、ｃ）ステ ップ（ｂ）で得られた細胞から核を単離し、溶解し、抽出物を得ること、ｄ）該 抽出物をロングターミナルリピートと接触すること、及びｅ）該ターミナルリピ ートと結合するタンパク質因子を単離し、これによってロングターミナルリピー トの機能を阻害することができる因子を単離することを具備した方法を提供する 。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化する遺 伝子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロ テインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞に導入する こと、ｂ）少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導し、ロングターミナル リピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現を抑制するように ステップ（ａ）で得た細胞を処理すること、ｃ）ステップｂ）で得た誘導された 細胞を、ロングターミナルリピートを活性化するのに効果的な所定量のプロテイ ンキナーゼＣ活性化化合物又はセリン若しくはスレオニン特異的タンパク質ホス ファターゼの阻害剤で処理すること、及びｄ）ロングターミナルリピートを活性 化する遺伝子を単離することを具備した方法を提供する。 本発明は、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化するこ とができるタンパク質因子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナルリピ ートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換 された細胞の個体群に導入すること、ｂ）少なくとも１つの促進抑制遺伝子の発 現を誘導し、ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁ 遺伝子の発現を抑制するようにステップ（ａ）で得た細胞を処理すること、ｃ） ステップｂ）で得た誘導された細胞を、ロングターミナルリピートを活性化する のに効果的な所定量のプロテインキナーゼＣ活性化化合物又はセリン若しくはス レオニン特異的タンパク質ホスファターゼと処理すること、ｄ）ステップｃで得 た細胞から核を単離し、溶解し、抽出物を得ること、ｅ）該抽出物をロングター ミナルリピートを含有するＤＮＡと接触すること、及びｆ）該ターミナルリピー トと結合するタンパク質因子を単離し、これによってロングターミナルリピート の機能を活性化することができる因子を同定することを具備した方法を提供する 。 本発明はまた、レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化す ることができるタンパク質因子を同定する方法であって、ａ）ロングターミナル リピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を形質転換された細胞に 導入すること、ｂ）少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導することによ ってステップａ）の導入された細胞内のロングターミナルリピートで調節される プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現を選択的に抑制し、ｃ）ステップｂ）で 得た導入細胞を、プロテインキナーゼＣ活性化化合物又はセリン若しくはスレオ ニン特異的タンパク質ホスファターゼの阻害剤と処理し、ロングターミナルリピ ートを活性化すること、ｄ）ステップｃ）で得られた細胞から核を単離し、溶解 し、抽出物を得ること、ｅ）該抽出物をロングターミナルリピートと接触するこ と、及びｆ）該ターミナルリピートと結合するタンパク質因子を単離し、これに よってロングターミナルリピートの機能を活性化することができる因子を同定す ることを具備した方法を提供する。最後に、本発明は上記方法によって説明した 同定されたタンパク質因子を提供する。 本発明は、レトロウイルスのＬＴＲｓの発現を制御する決定的な転写調節物質 、即ち活性剤及び阻害剤の両方を同定するための強力なツールを提供する。一度 適切なＤＮＡ結合タンパク質が同定されると、これらは、ＬＴＲｓ、即ちＡＩＤ Ｓの媒介物であるＨＩＶのようなものによって制御されるウイルスの複製を特異 的に阻害するために使用されうる医薬をデザインするためのモデルとして役立つ 。 加えて、ＬＴＲｓの転写抑制剤として機能するタンパク質をコードする優勢作用 遺伝子を含有する複製レトロウイルスは、未感染Ｔ−細胞に移り、感染後にＨＩ Ｖの引き続きの産生を妨げうる。他のアプローチは、負の優勢突然変異体（domi nant-negative mutants）としてＬＴＲ発現の突然変異した活性化剤をコードす る遺伝子を、未感染のＴ−細胞を感染させるために使用し、感染後のＨＩＶの引 き続きの産生を妨げることであり得る。先に手短に概説したアプローチは、ＨＩ Ｖの複製を阻害するための新たなクラスの化合物をデザインすること、ＨＩＶに 感染したＴ−細胞が新たなウイルスを産生するのを防止するウイルス（これは可 能なワクチンとして機能しうる。）を構築すること、及び未感染のＴ−細胞が新 たな後代ＨＩＶを産生し、更に標的Ｔ−細胞を感染させることができるウイルス を放出するのを防止することができるレトロウイルスを生じさせることに対する 新たな戦略となる。単独で、又は種々の組合せで使用されるこれらのアプローチ は、ＨＩＶに感染した固体の効果的な治療及びＨＩＶ病原を縮小する手段となり うる。 本発明は、以下の実験の詳細によりよりよく理解されるであろう。しかし、当 業者は、特別の方法及び議論された結果が、単に、これ以後の請求の範囲でより 完全に示される本発明の例示であることを容易に理解するであろう。実験の詳細 材料と方法 細胞培養 Ｅ１１は、Ｈ５ｔｓ１２５形質転換スプラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley） ２次ＲＥ細胞（Fisherら、1978）の単細胞クローンである。Ｅ１１−ＮＭＴは、 ヌードマウス腫瘍に由来する細胞のサブクローンである（Babissら、1985）。Ｅ １１／ｐＭＶ７−Ｊ３とＥ１１／ｐＭＶ７−Ｋ２は、ｐＭＶ７で形質転換（Perk insら、1983）した後、Ｇ４１８中での増殖について選択して得られた、２つの 独立のネオマイシン（ｎｅｏ）耐性Ｅ１１培養物である。Ａ１／ＰＫＣ、Ｂ１／ ＰＫＣ、Ｃ１／ＰＫＣ、およびＤ１／ＰＫＣは、ＰＫＣβ₁をコードするＲＰ５ ８の全長ｃＤＮＡ配列でトランスフェクション（Houseyら、1987）し、ｐＭＶ７ にサブクローニング（ｐＭＶ７−ＰＫＣ）（Houseyら、1988）した後、Ｇ４１８ 耐性について選択して得られた、４つの独立のｎｅｏ耐性Ｅ１１培養物である。 Ｂ１／ＰＫＣサブクローンのＢ１／ＰＫＣ−ｃｌ１、Ｂ１／ＰＫＣ−ｃｌ２、Ｂ １／ＰＫＣ−ｃｌ７およびＢ１／ＰＫＣ−ｃｌ１０は、Ｂ１／ＰＫＣ細胞を低密 度で蒔き、金属クローニングシリンダー（Fisherら、1978）を用いて独立の単細 胞由来クローンを単離して得られた。Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴ、Ａ１／ＰＫＣ、 Ｂ１／ＰＫＣ、Ｃ１／ＰＫＣおよびＤ１／ＰＫＣのＡＺＡ処理したサブクローン は、細胞を低密度で蒔き、１０μmＡＺＡを２４時間加え、ＡＺＡを除去して、 ＡＺＡを含まない培地で３週間増殖させ、単細胞由来クローン（Babiss、1985） を単離して得られた。すべての培養物は、５％ＦＢＳを補足したダルベッコー改 変イーグル培地（ＤＭＥＭ−５）で、５％ＣＯ₂／９５％空気の加湿インキュベ ーター中で３７℃で増殖させた。ＤＮＡトランスフェクション Ｅ１１細胞を、１０cmのプレート当たり１×１０⁶細胞で接種した。２４時間 後、既に報告された方法を若干変更（Babissら、1984；Suら、1990）して、１０ μｇのｐＭＶ７またはｐＭＶ７−ＰＫＣでリン酸カルシウム沈殿法を用いて、培 養物をトランスフェクションした。トランスフェクションの約４８時間後、培養 物をＧ４１８（１０００μｇml^-1）含有培地中でプレート当たり１×１０⁵およ び５×１０⁵で接種し、Ｇ４１８含有培地を、ｎｅｏ耐性コロニーが出るまで（ 約２週間）３〜４日毎に交換した。Ｇ４１８耐性Ｅ１１サブクローンを単離し、 ２５０μg/mlのＧ４１８含有培地中で別のクローン集団として維持した。足場非依存性（anchorage-independent）増殖 既に開示されている（Fisherら、1979c）ように、軟寒天に懸濁した時の種々 の細胞株の増殖能力を測定した。細胞をまず、高濃度の５×１０⁴から低濃度の ２×１０³の範囲の異なる細胞濃度で、寒天に接種した。７．５％ＦＢＳと０． ４％ノーブル（noble）寒天を含有するＤＭＥＭ中で４日毎に培地を供給して２ １日間増殖させた後、直径＞０．１mmのコロニーを、オリンパス組織培養顕微鏡 と較正された格子を用いて計測した。ＴＰＡを加えた培養物については、１００ ng ml^-1のＴＰＡを、０．８％ノーブル寒天／ＤＭＥＭ−７．５基底層、０．４ ％ノーブル寒天／ＤＭＥＭ−７．５重層層および０．４％ノーブル寒天／ＤＭＥ Ｍ−７．５重層支持細胞層中に取り込ませた。ＰＫＣ酵素活性 ＤＥＡＥで分画した細胞溶解物を用いて、ＰＫＣ酵素活性レベルを測定した（ O'Brianら、1989）。０．１％トリトンＸ−１００を含有する緩衝液Ａ（２０mM トリス−塩酸ｐＨ７．５、５mM ＥＤＴＡ、１５mM２−メルカプトエタノール、 １０μg/mlロイペプチン、０．２５mM ＰＭＳＦ、２５μg/ml大豆トリプシンイ ンヒビター）で増殖中の対数期の細胞を集め、細胞懸濁物を１時間攪拌し、次に １３，８００ｇで１５分間遠心分離して、溶解物を調製した。緩衝液Ａで平衡化 した０．５mlのＤＥＡＥ−セファロースカラムに、上澄液をのせた。カラムを３ mlの緩衝液Ａで洗浄し、０．２ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａ（ｐＨ７．５） ２mlを用いて、ＰＫＣ活性を溶出させた（O'Brianら、1989）。既に報告されて いる（WardとO'Brian、1992）ように、１mMのＣａ²⁺＋３０μｇＰＳ／mlの存在 下で観察された［γ³²Ｐ］ＡＴＰとヒストンIII−Ｓの間のホスホトランスフェ ラーゼ活性から、１mMのＣａ²⁺の存在下で観察された活性を引いて、ＰＫＣ酵素 活性を測定した。細胞性（³Ｈ）−ＰＤＢｕ結合 Houseyら（1988）とSuら（1992）が開示したように、ＰＤＢｕ結合測定法を 行なった。細胞を３５mm組織培養プレート当たり２×１０³で接種し、接種後２ ４時間目にＤＭＥＭ−５を加え、２０〜２４時間後細胞を測定した。培養物をＤ ＭＥＭ：ＰＢＳ：ＢＳＡ（１．０mg/mlのウシ血清画分Ｖ（シグマ(Ｓｉｇｍａ) ）を含有する２：１vol/volのＤＭＥＭ：ＰＢＳ）で２回洗浄し、５０または２ ５nM［³Ｈ］−ＰＤＢｕ（ニューイングランドニュクレア（New England Nuclear ）；８．３Ｃｉ／ミリモル）を含有する１．０mlのＤＭＥＭ：ＰＢＳ：ＢＳＡの 存在下で３７℃でインキュベートした。４枚の重複したプレートを［³Ｈ］−Ｐ ＤＢｕでインキュベートし、５枚目のプレートは、５０nMの非標識ＰＤＢｕの存 在下で［³Ｈ］−ＰＤＢｕでインキュベートして、非特異結合を求めた。別のプ レート２枚に、短時間のトリプシン／ベルセン（versen）処理により再懸濁し、 Ｚｍ型コールターカウンター（ヒアリー（Hialeah）、フロリダ州）を用いて計 測した。ＰＤＢｕを加えたプレートを３mlの氷冷ＤＭＥＭ：ＰＢＳ：ＢＳＡ中で ３回洗浄し、１．２mlの２．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ、１．０％ トリトン−Ｘ１００を用いて３７℃で２時間可溶化した。溶解物１mlを液体シン チレーションで計測した。核酸解析 既に記載されているように（Dorsch-Haslerら、1908;Fisherら、1982;Babiss ら、1984）種々の細胞から、高分子量ＤＮＡを単離した。細胞性ＤＮＡ（試料当 たり１０μｇ）を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化し、０．６％アガ ロースゲルでサイズ分画し、ニトロセルロースフィルターに移し、既に開示され ているように（Fisherら、1982）³²Ｐ−標識ＰＫＣβ₁ＤＮＡを用いてプローブ 結合させた。ＰＫＣβ₁Ａｄ５Ｅ１Ａ、ｎｅｏ、Ａｄ５Ｅ１Ｂ、ｃ−ｊｕｎ、Ｐ ＫＣεおよびＧＡＰＤＨｍＲＮＡの定常状態レベルは、既に記載されているよう に（Babissら、1983；SuとFisherら、1992）、適当なマルチプライム化³²Ｐ−標 識クローン化ＤＮＡプローブを用いる総細胞性ＲＮＡのノーザン解析により測定 した。ノーザンブロットを、０．１％ＳＤＳ、１×ＳＳＣ緩衝液中で室温で３０ 分間洗浄し、次に同じ緩衝液中で４２℃でさらに３０分間洗浄した。既に開示さ れている方法（Friedmanら、1986；Duigouら、1990；Suら、1993）を若干変更し て（Jiangら、1993）、単離した核内のインビトロトランスフェクションを行 なった。約２×１０⁶細胞から核を単離し、ＲＮＡポリメラーゼIIであらかじめ 開始したＲＮＡ転写体を、［³²Ｐ］ＵＴＰの存在下で伸長させた。［³²Ｐ］標識 ＲＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、取り込まれなかったヌクレオチド は、プローブをＧ−５０セファデックスカラムを通過させて除去した。２μｇの 適当な変性プラスミドＤＮＡ遺伝子挿入体を含有するナイロン膜を、［³²Ｐ］標 識ＲＮＡとハイブリダイズさせた。ナイロン膜は、ＰＫＣα、ＰＫＣβ₁、ＰＫ Ｃγ、ＰＫＣε、ｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎ−Ｂ、ｃ−ｆｏｓ、Ａｄ５Ｅ１Ａ、Ａｄ５ Ｅ１Ｂ、ＧＡＰＤＨ、β−アクチンおよびｐＢＲ３２２ＤＮＡプローブを含有し ていた。ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を洗浄し、オートラジオグラフ ィーに暴露させた。ゲル遅延測定法（Gel-retardation assavs） ＡＰ−１結合配列(5′CCAAACAGGATATATGAGTCATGCAGTTC-3′)(配列番号１)(Ang elら、1988；Mitchell とTijian、1989)、またはＭＥＣＡ結合配列（5′-CCAAAC AGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCC-3′）（配列番号２）（Halazonetis、1992）を含有 するオリゴヌクレオチドプローブを合成した。Ｔ４ＤＮＡキナーゼを用いて［³² Ｐ−γ］−ＡＴＰによりオリゴヌクレオチドを末端標識し、次に室温で３０分間 核抽出物と反応させた。反応混合物は、１０mMヘペス（ｐＨ７．５）、５０mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ₂、０．５mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴおよび１２．５％グ リセロール中の、³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチド（５０００c.p.m.）、２μｇの ポリ（ｄＩ−ｄＣ）および１０μｇの核蛋白抽出物よりなっていた。室温で３０ 分間インキュベーション後、反応混合物を５％ポリアクリルアミドゲルでトリス −ホウ酸緩衝液を循環させて分離（０．３７５×ＴＢＥ、１６０Ｖ）し、ゲルを 乾燥し、オートラジオグラフィーを行なった。核抽出物はまた、１００倍過剰の 非標識競合物質ＤＮＡと、次に³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチドプローブでインキ ュベートした。実験結果 （transformation progression phenotype）の誘導 Ａｄ５で形質転換したスプラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ＲＥ細胞中で 、 寒天中で効率的にコロニーを形成する能力は、ヌードマウス中での腫瘍形成能力 の上昇（すなわち、進行表現型）に比例している（Fisherら、1979a、ｂ、ｃ；B abissら、1985；Duigouら、1989、1991）。Ａｄ５形質転換細胞ＲＥクローンで あるＥ１１は、寒天中で低効率で増殖し、その進行したヌードマウス腫瘍由来サ ブクローンのＥ１１−ＮＭＴよりヌードマウス中の腫瘍形成の潜伏期間が長い（ Babissら、1985）（表１、およびデータは示していない）。ネオマイシン（ｎｅ ｏ）耐性遺伝子（Houseyら、1988）も含有するクローン化ＰＫＣβ₁遺伝子によ るＥ１１細胞のトランスフェクションにより、親Ｅ１１細胞より増強した足場非 依存性を示すＧ４１８耐性クローンが得られる（表１）。これに対して、Ｅ１１ クローンを発現するＰＫＣβ₁の欠如したｐＭＶ７プラスミド作成体でトランス フェクションしたＧ４１８耐性Ｅ１１細胞もまた、ヌードマウスで腫瘍潜伏期間 が短い（データは示していない）。Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴ細胞ですでに観察さ れたように、ＴＰＡはＰＫＣβ₁トランスフェクションＥ１１細胞中の寒天増殖の 効率を上昇させた（表１）。これらの結果は、ＰＫＣβ₁遺伝子はＥ１１細胞中 で進行誘導性遺伝子として機能し、この過程はさらに、ホルボールエステル腫瘍 プロモーターであるＴＰＡにより調節することができる。 Ｅ１１−ＮＭＴ細胞の進行表現型は、脱メチル化剤の単回適用により安定に逆 転することができる（Babissら、1985）。１０μｇのＡＺＡの存在下でクローン 性細胞密度（６cmのプレート当たり１００および２００細胞）でＥ１１−ＮＭＴ とＰＫＣβ₁トランスフェクションＥ１１細胞を２４時間増殖させ、ＡＺＡの非 存在下で２週間連続培養すると、親Ｅ１１細胞より足場非依存性で安定な復帰を 示す一連のＡＺＡサブクローンが得られた（表２）。これに対して、ＡＺＡ処理 は、Ｅ１１細胞またはＰＫＣβ₁遺伝子の欠如したｐＭＶ７作成体で形質転換し たｎｅｏ耐性Ｅ１１細胞の、低足場非依存性を修飾しなかった（表２、およびデ ータは示していない）。これらの観察結果は、ＡＺＡはまた、ＡＺＡで処理した 自発的に進行するＥ１１およびＨａ−ｒａｓで進行するＥ１１細胞で既に観察さ れたように（Babissら、1985；Duigouら、1989）、ＰＫＣβ₁発現Ｅ１１細胞の 進行表現型を逆転することもできることを示している。 Ｂ１／ＰＫＣ細胞およびＡＺＡ復帰突然変異Ｂ１／ＰＫＣ細胞の分子的および生 化学的性質 ＰＫＣβ₁遺伝子が進行状態を誘導し、ＰＫＣβ₁発現細胞中でＡＺＡが進行を 復帰突然変異する機序を研究するために、本出願人は、ＰＫＣβ₁／ｎｅｏ作成 体でトランスフェクションしたＧ４１８耐性Ｅ１１サブクローンであるＢ１／Ｐ ＫＣを使用した（表１と２）。Ｂ１／ＰＫＣ細胞およびその単一細胞由来−未処 理−サブクローンである、Ｂ１／ＰＫＣ−ｃｌ１、Ｂ１／ＰＫＣ−ｃｌ２、Ｂ１ ／ＰＫＣ−ｃｌ７そしてＢ１／ＰＫＣ−ｃｌ１０、および単一細胞由来−ＡＺＡ 処理−サブクローンである、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡ II ｂ、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺ ＡII ｅ、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIVａ、そしてＢ１ ／ＰＫＣ−ＡＺＡVIIａのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーショ ン解析により、新たに挿入されたＰＫＣβ₁遺伝子に対応する２．４ｋｂ断片の 存在が示された（データは示していない）。このＤＮＡ断片は、Ｅ１１またはＥ １１−ＮＭＴ細胞には存在せず、一方、内因性ＰＫＣβ₁遺伝子に対応する約１ １、６．８、４．１、３．１および１．５ｋｂの追加のＤＮＡ断片が、すべての Ｅ１１誘導細胞株に存在していた（データは示していない）。 Ｇ４１８中で増殖することから予測されるように、Ｂ１／ＰＫＣとＢ１／ＰＫ Ｃ−ＡＺＡサブクローンのすべてはｎｅｏ遺伝子を発現し、一方このｍＲＮＡは Ｅ１１またはＥ１１−ＮＭＴ細胞では検出されなかった（図１）。さらに、すべ てのＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡサブクローンは、親Ｂ１／ＰＫＣや多くの未処理Ｂ１ ／ＰＫＣサブクローンより多くのｎｅｏ耐性ＲＮＡを産生した。ノーザンブロッ トをＰＫＣβ₁遺伝子とプローブ結合させると、Ｂ１／ＰＫＣおよびその未処理サ ブクローンから複数のハイブリダイズするｍＲＮＡの存在が証明されたが、大多 数のＡＺＡ−処理Ｂ１／ＰＫＣサブクローンは、これらのｍＲＮＡレベルが低下 していた（図１）。Ｂ１／ＰＫＣ細胞およびそのサブクローン中に見られる複数 のハイブリダイズするＲＮＡは、おそらくＰＫＣβ₁ベクターであるｐＭＶ７− ＰＫＣβ₁中のレトロウイルスプロモーターに由来する、スプライスされていな い転写体または種々にスプライスされた転写体であろう。大多数の転写体は６． ６ｋｂのＲＮＡであり、これは、ｐＭＶ７−ＰＫＣβ₁作成体の５'ＬＴＲで開始し ３' ＬＴＲで停止するｍＲＮＡ転写体の予測されたサイズに一致する。これに対して 、同様のノーザンブロットをＡｄ５−Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ形質転換遺伝子とプロ ーブ結合させると、種々の細胞型においてこれらの遺伝子の発現に一貫した差は なかった（図２）。これらの観察結果は、ＡＺＡ処理により：（ａ）同じトラン スフェクションされたプラスミド作成体上に存在するｎｅｏ耐性遺伝子の発現の 同様の抑制無しに、トランスフェクションされたＰＫＣβ₁遺伝子の発現が選択 的に抑制され；および（ｂ）形質転換進行表現型の発現またはＡＺＡ誘導性抑制 の関数としてのＡｄ５−Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂの発現には変化がないことを示す。 Ｂ１／ＰＫＣ細胞およびその未処理そしてＡＺＡ処理サブクローンの生物学的 および生化学的性質を、表３に示す。親Ｂ１／ＰＫＣ細胞は、Ｅ１１親細胞より 寒天中で効率よく増殖した（表１）。寒天クローニング効率の上昇は、すべての Ｂ１／ＰＫＣ由来未処理サブクローンでも明らかであった（表３）。Ｅ１１、Ｅ １１−ＮＭＴ、Ｂ１／ＰＫＣおよび未処理Ｂ１／ＰＫＣサブクローンは、ＴＰＡ の連続的存在下で増殖させた時、足場非依存性の１．４〜２．３倍のさらなる増 加を示した（表３）。Ｂ１／ＰＫＣおよびＢ１／ＰＫＣ未処理サブクローンは、 Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞より、細胞表面受容体への［³Ｈ］−ＰＤＢｕ 結合のレベルが増加した（表３）。親Ｂ１／ＰＫＣ細胞および特異的未処理Ｂ１ ／ＰＫＣサブクローンでは、細胞表面受容体へのホルボールエステルの結合の増 加は、ＰＫＣ酵素活性の増加と相関する（表３）。しかし必ずしもそうではなく 、Ｂ１／ＰＫＣ−ｃｌ１０細胞は、ＰＫＣ酵素活性の有意な上昇なしに細胞表面 受容体への［³Ｈ］−ＰＤＢｕ結合が上昇していた。ホルボールエステル結合レ ベルで観察された劇的な変化と比較して、ＰＫＣ酵素活性レベルの変化は比較的 小さかった。これはおそらく、細胞溶解物からの活性な酵素の回収の効率（ホル ボールエステル結合測定法は、無傷の細胞で行われる）、および／またはＰＫＣ の不完全な翻訳後の修飾により、触媒的に不活性な酵素が得られることを反映し ているのであろう（Bornerら、1988）。 Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡVII ａを除いて、ＡＺＡ処理したＢ１／ＰＫＣサブクロ ーンはすべて、親Ｂ１／ＰＫＣ細胞に比較して足場非依存性の低下を示した。同 様に、ＡＺＡで処理しなかったＥ１１、Ｅ１１−ＮＭＴ、Ｂ１／ＰＫＣおよびＢ １／ＰＫＣサブクローンと同様の挙動を示したＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡVII ａ細胞 を除いて、ＴＰＡはＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡ細胞で足場非依存性の上昇を示さなか った（表３）。Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡVII ａを除いて、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡク ローンのすべてもまた、細胞表面受容体への［³Ｈ］−ＰＤＢｕ結合の低下とＰ ＫＣ酵素活性の低下を示した（表３）。Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡVII ａ細胞はＢ１ ／ＰＫＣ細胞と同様の性質（β₁ＰＫＣｍＲＮＡ発現の保持を含む）を保持し、 これはこのクローンが、形質転換進行表現型においてＡＺＡにより復帰突然変異 を受けていなかったことを示唆している（表３と図１）。これらの結果は、Ｅ１ １細胞中でのＰＫＣβ₁の発現の増加は、しばしばＰＫＣ酵素活性の上昇とＰＫ Ｃ細胞表面受容体へのホルボールジブチレートの結合の上昇が関係していること を示す。さらに、ＴＰＡはＥ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＢ１／ＰＫＣ細胞中の 足場非依存性を上昇させるが、進行表現型の欠失を示すＢ１／ＡＺＡクローンで はこの効果を誘導することはできない。ＡＺＡ復帰突然変異Ｂ１／ＰＫＣ細胞中の遺伝子発現に及ぼすＴＰＡの作用 ＴＰＡは多くの標的細胞中のＰＫＣの強力なアクチベーターである（Ohnoら、 1991の総説がある：Nishizuka、1992）。ＴＰＡがＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細 胞中の遺伝子発現を変化させるか否かを測定するために、培養物を５０ng/mlの ＴＰＡと１５、３０、６０および１２０分間インキュベートさせた（図３）。Ｔ ＰＡはＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞においてＰＫＣβ₁発現の時間依存性の誘 導を示し、これは３０分目までに明らかになり、６０分目までに最大になった。 ＴＰＡはまた、ＰＫＣβ₁誘導と同様の速度論で、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細 胞中のｃ−ｊｕｎｍＲＮＡレベルを増加させた。これに対して、ＴＰＡはＢ１／ ＰＫＣ−ＡＺＡ II ｇ細胞中の内因性ＰＫＣε遺伝子またはＧＡＰＤＨ遺伝子の 発現を変化させなかった（図３）。ＴＰＡはまた、すでに高レベルのＰＫＣβ₁ ｍＲＮＡを示すＢ１／ＰＫＣ細胞(すなわち、Ｂ１／ＰＫＣ−ｃｌ２およびＢ１ ／ＰＫＣ−ＡＺＡVIIａ細胞)のＰＫＣβ₁ｍＲＮＡレベルを有意に変化させなか った（図４）。Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞より高レベルのＰＫＣβ₁ｍＲＮ Ａの新規（de novo）合成を示すＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｄ細胞では細胞、ＴＰ ＡはＰＫＣβ₁発現をさらに上昇させた（図４）。予備的研究は、別の物質がＢ １／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞中のＰＫＣβ₁ｍＲＮＡ発現を誘導することができ ることを示し、これらにはカリクリン（calyculin）やオカダ酸(高濃度でセリン ／スレオニン特異的蛋白ホスファターゼ１および２Ａそして２Ｂのインヒビター )、理論的に設計された蛋白キナーゼＣアクチベーターＡＤＭＢ（３−（Ｎ−ア セチルアミノ）−５−（Ｎ−デシル−Ｎ−デシル−Ｎ−メチルアミノ）ベンジル アルコール）およびＤＨＩ（６−（Ｎ−デシルイアミノ）−４−ヒドロキシメチ ルインドール）がある（未公表データ）。Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡ処理したサブク ローンでのβ₁ＰＫＣ発現に及ぼすＴＰＡの作用が可逆的であるかまたは非可逆 的であるかを測定するために、ＴＰＡ中で細胞を２４時間増殖させ、培養物を洗 浄し、そしてＴＰＡの非存在下でさらに７日間インキュベートした（図４）。Ｔ ＰＡの非存在下で１週間増殖させたＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ、Ｂ１／ＰＫＣ− ＡＺＡIVｅおよびＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｄ細胞でＰＫＣβ₁ｍＲＮＡレベルの 低下が観察された。この実験は、ＰＫＣβ₁発現に及ぼすＴＰＡの作用は、最初 にＢ１／ＰＫＣサブクローンにより発現されたＰＫＣβ₁のレベルに依存し、Ｔ ＰＡの作用は、この腫瘍促進剤を除去すると可逆的であることを示している。 Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞中でＰＫＣβ₁ＲＮＡの急速な誘導を示すＴＰ Ａの能力は、ＴＰＡが転写的にこの遺伝子を活性化しているかも知れないことを 示唆している。この可能性を検討するために、本出願人は核ラン−オン測定法（ nuclear run-on assays）を使用して、未処理細胞およびＴＰＡ処理Ｂ１／ＰＫ Ｃ−ＡＺＡIIｇ細胞中のＲＮＡ転写速度を測定した（図５）。適当な対照細胞株 として、Ｅ１１細胞、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞およびＢ１／ＰＫＣ細胞中で、５０ng ml^-1のＴＰＡによる１時間処理有りまたは処理無しでＲＮＡ転写速度を測定し た。ＲＮＡ転写の内部対照指標としてＧＡＰＤＨとβ−アクチンを用いると、Ｐ ＫＣα、ＰＫＣγ、ＰＫＣε、Ｊｕｎ−Ｂ、Ａｄ５Ｅ１ＡおよびＡｄ５Ｅ１Ｂ遺 伝子の転写速度は、ＴＰＡの存在下または非存在下で増殖させた４つのすべての 細胞型で同様（２倍以内）であった（図５）。４つのすべての細胞型でのＰＫＣ γ遺伝子の転写とＥ１１とＥ１１−ＮＭＴでのＰＫＣβ₁遺伝子の転写は、ＴＰ Ａの存在下または非存在下で無視できた。これに対して、挿入されたＰＫＣβ₁ 遺伝子はＢ１／ＰＫＣ細胞中で高速で転写され、一方、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡII ｇ細胞中ではこの遺伝子の転写は、１０倍以上低下した（図５）。５０ng ml^-1 のＴＰＡで１時間処理すると、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞中でのＰＫＣβ₁ の転写速度は、５倍上昇した。ＴＰＡ処理したＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞中 のｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓ遺伝子の転写において、同様の上昇（２倍〜３倍 ）が観察された（図５）。 ＴＰＡは、パリンドロームＤＮＡ配列TGACTCAを含有する遺伝子（配列番号３ ）（ＴＰＡ応答性成分（ＴＲＥ）と呼ばれる）の転写活性化を誘導することがで きる（Leeら、1987；Angelら、1988；Mitchell & Tijian、1989）。ｃ−ｊｕｎ 蛋白ホモダイマーまたはｃ−ｊｕｎ／ｃ−ｆｏｓヘテロダイマーよりなるＡＰ− １マルチ蛋白転写因子複合体は、ロイシンジッパー（leucine zipper）ダイマー 化ドメインを介してＴＲＥに結合することができ、遺伝子発現が変化する（Kouz arides & Ziff、1988；Sasson-Corsiら、1988）。ｐＭＶ７プラスミド中のＰＫ Ｃβ₁遺伝子の発現を転写的に制御するモロニー（Moloney）白血病ウイルスの長 い末端反復配列（ＬＴＲ）の配列解析は、２つの縦列のＡＰ−１認識部位の存在 を示した。Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞のＰＫＣβ₁遺伝子の転写増加を誘導 するＴＰＡの能力に、ＡＰ−１転写因子のレベルの変化が関与するか否かを測定 するために、本出願人は対照細胞とＴＰＡ処理細胞から核抽出物を単離してＤＮ Ａ結合（ゲル遅延）測定法を行なった。図６に示すように、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺ ＡIIｇ細胞中のＡＰ−１活性のレベルは、Ｅ１１細胞やＢ１／ＰＫＣ細胞中のレ ベルに比較して低下した。ＴＰＡ処理後、ＡＰ−１活性は、Ｂ１／ＰＫＣ細胞で 観察されるレベルまで上昇した。これに対して、モロニー白血病ウイルスＬＴＲ で見られるエンハンサーコア配列成分（ＭＥＣＡ）（Halazonetis、1992）を認 識するＤＮＡ結合蛋白のレベルは、ＴＰＡの存在下または非存在下で増殖させた Ｅ１１、Ｂ１／ＰＫＣおよびＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞中と同様であった。 ＡＰ−１およびＭＥＣＡ結合活性ともに、核抽出物と組合せて１００倍過剰のそ れぞれの競合ＤＮＡ配列を用いて除去された（データは示していない）。 型の逆転とＰＢ復帰突然変異Ｂ１／ＰＫＣ細胞中の遺伝子発現に及ぼすＴＰＡの 作用 脱メチル化剤ＰＢが、ＰＫＣβ₁発現Ｅ１１細胞中で進行表現型の抑制を誘導す ることができるか否かを測定するための実験も行なった。クローン細胞密度（６ cmのプレート当たり１００、２００および４００細胞）でＢ１／ＰＫＣ細胞を接 種し、４mMＰＢで４日間処理し、次にＰＢを含まない培地中で２週間増殖させた 。次にコロニーを単離し、ＰＢの非存在下で独立の細胞株として増殖させた。Ｂ １／ＰＫＣ−ＰＢ５クローンは、進行表現型の復帰を示した。すなわちこれはＥ １１細胞と同様の効率で寒天中で増殖した。Ｂ１／ＰＫＣ−ＰＢ５細胞中の遺伝 子発現を解析すると、ＰＫＣβ₁またはＡｄ５Ｅ１ＢｍＲＮＡをもう合成しないこ とが示された（図７）。ＡＺＡ処理Ｂ１／ＰＫＣ細胞で観察されたように、ＴＰ Ａで１時間または４時間処理すると、ＰＫＣβ₁ｍＲＮＡ発現が誘導された。さ らにＴＰＡはまた、Ｂ１／ＰＫＣ−ＰＢ５細胞中でＡｄ５Ｅ１ＢｍＲＮＡの発現 を誘導した。これに対して、ＴＰＡの非存在下でまたは存在下で増殖させたＢ１ ／ＰＫＣまたはＢ１／ＰＫＣ−ＰＢ５細胞中で、Ａｄ５Ｅ１ＡまたはＧＡＰＤＨ 発現の変化は観察されなかった。これらの観察結果は、ＡＺＡのようにＰＢは、 ＰＫＣβ₁発現E１１細胞中の進行表現型を逆転させることができ、進行抑制は、 ＰＫＣβ₁およびＡｄ５Ｅ１Ｂ発現におけるＴＰＡ−可逆性阻害に関連している ことを示している。実験的考察 形質転換進行の特異的遺伝子変化と後成的発現の変化の寄与を研究するために 、Ａｄ５形質転換ラット胚細胞培養系が使用されている（Fisher、1984；Babiss ら、1985；Duigouら、1991；Reddyら、1993）。このモデルを使用して、Ａｄ５ 形質転換は、しばしば多くの薬剤（増殖因子、ホルモンおよび腫瘍促進物質を含 む）により強く影響される多段階工程であることが、証明されている(Fisherら 、1984による総説がある)。進行したＨ５ｔｓ１２５形質転換ラット胚クローン であるＥ１１−ＮＭＴを用いて、ＡＺＡによる２４時間の単回処理により、９０ ％以上の効率で形質転換進行が逆転されることが証明されている（Babissら、19 85）。 形質転換進行はまた、Ｅ１１−ＮＭＴと非形質転換ＣＲＥＦ細胞との間に形成さ れる体細胞ハイブリッド中で安定に抑制される（Duigouら、1990）。これらの結 果は、形質転換進行は、ＤＮＡメチル化の変化により制御される未同定の遺伝子 の発現により仲介されるかも知れないという仮説を支持する（Babissら、1985； Duigouら、1991；Reddyら、1993）。本出願人の仮説の基本は、進行サプレッサ ー遺伝子のメチル化により、この遺伝子の発現が喪失し、従って進行表現型の誘 導がなくなり、一方推定される進行サプレッサー遺伝子の脱メチル化により、進 行表現型の活性化と抑制が起きることである(Babissら、1985;Duigouら、1991；R eddyら、1993)。 低レベルで発現された時、Ａｄ５またはＡｄ５Ｅ１Ａ遺伝子によるＣＲＥＦ細 胞の形質転換を増強するＰＫＣβ₁遺伝子（Suら、1991）は、Ｈ５ｔｓ１２５形 質転換ラット胚クローンであるＥ１１中の進行表現型を誘導した。Ｅ１１／ＰＫ Ｃ細胞の形質転換進行は、ＰＫＣβ₁ＮＡの転写速度と定常状態レベルの両方の 上昇、ＰＫＣ酵素活性の上昇、細胞表面受容体への［³Ｈ］−ＰＤＢｕ結合そし て足場非依存性の上昇と相関した。ＡＺＡによる単回の２４時間処理により、進 行表現型の復帰と、Ｂ１／ＰＫＣ細胞の性質の非トランスフェクション親Ｅ１１ 細胞への復帰が起きた（表３）。ヌードマウスにおける腫瘍選択により誘導され る自発性進行で既に証明されている（Duigouら、1991）ように、Ｂ１／ＰＫＣ中 でＡＺＡによるＰＫＣβ₁誘導進行の抑制は、Ａｄ５Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂ形質転 換遺伝子の発現レベルの変化を引き起こさなかった。Ｅ１１／ＰＫＣ細胞中のＡ ＺＡによる進行抑制はまた、ｎｅｏ耐性遺伝子の発現をなくすことがなく、また ＰＫＣεまたはｃ−ｊｕｎ遺伝子の発現を変化させることもなかった。これらの 観察結果は、Ｅ１１細胞の形質転換進行は、特異的ＰＫＣアイソフォーム(すな わち、ＰＫＣβ₁)の発現により安定に誘導され、ＡＺＡによる推定の進行抑制遺 伝子の誘導は、特異的形質転換進行誘導遺伝子の発現を選択的に変更することに より、この表現型を無効にすることができることを示している。 いくつかの研究は、細胞生理に及ぼす特異的ｃＰＫＣの過剰発現の作用に焦点 を当てている（Houseyら、1988；Personsら、1988；Megidish & Mazurek、1989 ；Kraussら、1989；Bornerら、1991、1992a、ｂ；Suら、1991、1992；Watanabe ら、1992）。ＰＫＣβ₁の過剰発現は、発現されるＰＫＣβ₁のレベルや使用され る標的細胞のレベルに依存する細胞表現型の大きな変化を誘導した（Houseyら、 1988；Kraussら、1989；Choiら、1990；Suら、1991、1992）。レトロウイルスに よりＰＫＣβ₁がＣＲＥＦ、ラット６またはＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に挿入された 時、高レベルのＰＫＣβ₁ｍＲＮＡ、［³Ｈ］−ＰＤＢｕ結合およびＰＫＣ酵素活 性を発現する亜株が出現した(Houseyら、1988；Kraussら、1989；およびSuら、1 992)。高レベルＰＫＣβ₁を発現するＣＲＥＦ細胞は、形質転換された形態を示 し、単層培養でより早く増殖し、ＴＰＡの非存在下で寒天中で巨大コロニーを形 成し、そして多くの独立クローン中でＴＰＡはさらに足場非依存性増殖を増強し た（Suら、1992）。これに対して、Ｃａ²⁺介在ＤＮＡトランスフェクションによ るＣＲＥＦ細胞への同じＰＫＣβ₁作成体の挿入により、正常のＣＲＥＦ様形態 を示し、［³Ｈ］−ＰＤＢｕ結合とＰＫＣ酵素活性においてわずかの変化のみを 示し、ＴＰＡの非存在下または存在下で寒天中で巨大コロニーを形成しない培養 物が得られた（Suら、1991、1992）。レトロウイルスＰＫＣβ₁、形質転換され たラット６およびC３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の場合、高レベルのＰＫＣβ₁を発現す るクローンは、ＴＰＡの非存在下でわずかな形態変化を示したのみであるが、Ｔ ＰＡでは大きな形態変化を引き起こした（Houseyら、1988；Kraussら、1989）。 高レベルＰＫＣβ₁を発現するＣ３Ｈ１０Ｔ１／２クローンの増殖速度と飽和密 度は増加し、形質転換した細胞はＴＰＡの非存在下でまたは存在下で寒天中で増 殖し、形質転換した細胞はヌードマウスにおいて腫瘍形成性であった（Houseyら 、1988）。これに対して、高レベルＰＫＣβ₁発現Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２クローン は、対照のレトロウイルスベクター形質転換Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞と同様の増 殖速度を示し、形質転換された細胞は足場非依存性増殖を示さず、ヌードマウス 中で腫瘍形成性ではなかった（Kraussら、1989）。ｃＰＫＣの作用に対する標的 細胞の特異性はさらに、ヒトＨＴ２９大腸直腸癌細胞株のＰＫＣβ₁の過剰発現に より、ヌードマウス中の増殖が抑制され癌原性が阻害されることにより示される （Choiら、1990）。これらの研究は、異なる標的細胞中の種々のｃＰＫＣの過剰 発現の、ＰＫＣアイソフォーム特異的および細胞型特異的作用を証明している。 ラット６細胞中のＰＫＣβ₁の過剰発現は、内因性ＰＫＣ遺伝子（例えば、Ｐ Ｋ ＣδおよびＰＫＣε）の発現やＴＰＡ制御を変化させることが証明されている（ Bornerら、1992a）。個々のＰＫＣアイソフォームの制御の差分的変化は、親ラ ット６（Ｒ６）および、Ｈａ−ｒａｓ、ｓｒｃおよびｆｏｓ(Bornerら、1992b)な どの一連の癌遺伝子で形質転換された高レベルＰＫＣβ₁発現ラット６細胞(Ｒ６ −ＰＫＣ₃)中でも観察されている。活性化ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子でＲ６また はＲ６−ＰＫＣ３細胞を形質転換すると、ＰＫＣαとＰＫＣδのｍＲＮＡと蛋白 レベルの両方が増加し、ＰＫＣεｍＲＮＡと蛋白のレベルが低下し、ＰＫＣζの 発現レベルに変化はなかった（Bornerら、1992b）。ｃ−Ｈａ−ｒａｓ形質転換 ラット６細胞のＰＫＣαの発現増強に関与する機序は、このＰＫＣ遺伝子の転写 速度の上昇が関係していた（Bornerら、1992b）。これに対して、ｍｙｃ、ｎｅ ｕ／ｅｒｂ−Ｂ２またはｍｏｓ癌遺伝子により形質転換されたＲ６細胞では、Ｐ ＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣεおよびＰＫＣζの発現レベルで有意な変化は見られ なかった（Bornerら、1992b）。本研究で本出願人は、種々のｃＰＫＣやｎＰＫ Ｃ遺伝子の転写速度に及ぼすＡＺＡによる、ＰＫＣβ₁の過剰発現やＰＫＣβ₁発 現の抑制の影響を測定した。Ｂ１／ＰＫＣまたはＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞 におけるＰＫＣα、ＰＫＣγまたはＰＫＣεの転写速度に変化はなかった（図５ ）。同様に、Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴまたはＢ１／ＰＫＣ−ＡＺＡ細胞のＰＫＣ εのｍＲＮＡレベルに差は観察されなかった（図３）。これらの結果は、Ａｄ５ により形質転換されたラット胚細胞は、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ形質転換したラット胚 細胞よりも、ｍｙｃ、ｎｅｕ／ｅｒｂ−Ｂ２またはｍｏｓ癌遺伝子形質転換ラッ ト細胞のような挙動を示すことを示唆している。 ＰＫＣβ₁の転写速度やｍＲＮＡ産生、［³Ｈ］−ＰＤＢｕ結合の上昇そして多 くの例でのＰＫＣ酵素活性の上昇に反映されるように、Ｅ１１細胞中で形質転換 進行を誘導するＰＫＣβ₁の能力は、この遺伝子の連続した発現に相関した。Ｂ １／ＰＫＣ−ＡＺＡ II ｇ細胞におけるＡＺＡ処理後の推定の形質転換進行抑制 遺伝子の発現の誘導は、これらのＰＫＣ関連現象のすべての低下に関連していた 。本出願人が検討し始めた重要な問題は、ＡＺＡ処理がＢ１／ＰＫＣ細胞の形質 転換進行の抑制を誘導する機序である。ＡＺＡに誘導される進行抑制は、ＰＫＣ β₁転写と定常状態ＲＮＡのレベルの低下と関連していた（図３と４）。ＰＫＣ β₁ 遺伝子の転写は、その内因性プロモーターではなくモロニー白血病ウイルスＬＴ Ｒからの転写開始に由来する（Perkinsら、1983；Houseyら、1988）ため、上記 の結果は、ＡＺＡによる推定の進行サプレッサー遺伝子の誘導は、モロニー白血 病ウイルスＬＴＲからの転写を、直接または陽性および／または陰性作用性ｃｉ ｓ制御成分を介して間接的に影響するかも知れない可能性を示唆する。ＡＺＡ抑 制に応答性のモロニー白血病ウイルスＬＴＲの領域の詳細な解析を開始するため に、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡ細胞中のＡＺＡ処理後に、配列特異的ＤＮＡ結合ドメ インへの転写因子の結合が変化するか否かを測定した。Ｂ１／ＰＫＣ細胞対Ｂ１ ／ＰＫＣ−ＡＺＡ II ｇ細胞でＡＰ−１マルチ蛋白転写因子複合体のレベルで差 が見られ、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡ II ｇ細胞でＡＰ−１活性が低下していた（図 ６）。これに対して、エンハンサーコア配列成分であるＭＥＣＡ（これもモロニ ー白血病ＬＴＲ中に見いだされる）と相互作用する転写因子の結合に関して、Ａ ＺＡ処理Ｂ１／ＰＫＣでは一貫した変化は起きなかった。ＴＰＡによる処理後、 Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ中のＡＰ−１のレベルは、Ｂ１／ＰＫＣ細胞のレベル に戻った。さらに、ＴＰＡは、転写を上昇させ、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞 中のＰＫＣβ₁とｃ−ｊｕｎ遺伝子の定常状態ＲＮＡレベルを上昇させた。しか しＴＰＡの作用は一過性であり、Ｂ１／ＰＫＣ−ＡＺＡIIｇ細胞において進行表 現型は戻らなかった。これらの結果は、ＡＺＡはＢ１／ＰＫＣ細胞中の遺伝子発 現レベルと転写制御因子を選択的に変更できることを示唆している。進行した細 胞の転写機序の選択的調節は、ＰＫＣβ₁を過剰発現するＥ１１細胞および／また は自発的に進行したＥ１１−ＮＭＴ細胞の停止進行表現型の抑制をＡＺＡが誘導 する、機序の成分である否かを測定するために、さらなる試験が必要である。 要約すると、ここに記載された細胞培養モデル系は、形質転換進行と形質転換 進行抑制を介在する分子的および生化学的事象を規定するのに有用な実験手段で ある。ＡＺＡ処理後のモロニー白血病ウイルスＬＴＲからの転写の見かけの選択 的停止に基づき、本系はまた、ＬＴＲに制御される遺伝子の発現を直接支配する ことができる転写制御因子を同定するのに使用できるであろう。これらの問題を 扱うさらなる研究は、多段階癌原性の分子学的決定基に対する重要な知見を与え るであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スー、ツァオ − ツォン アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10032、 ニューヨーク、アパートメント 56、フォ ート・ワシントン 280

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 進行抑制遺伝子を同定する方法であって、 ａ）進行遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞の個体群に導入する こと、 ｂ）少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を誘導し、該細胞の副個体群を 特徴的な表現型に復帰させること、 ｃ）進行抑制遺伝子を発現し、特徴的な表現型を示す細胞を選別すること、 ｄ）ステップｃ）からの細胞からｍＲＮＡを単離すること、 ｅ）このようにして得られたｍＲＮＡを、未誘導の形質転換細胞から得たｍ ＲＮＡと比較し、これによりステップ（ｃ）からの細胞によってのみ発現される ｍＲＮＡを同定すること、及び ｆ）このようなｍＲＮＡをコードする遺伝子を単離し、これによって進行抑 制遺伝子を同定すること、 を具備した方法。 ２． 請求の範囲第１項に記載の方法であって、ステップｆ）において、該進 行抑制遺伝子が減法ハイブリダイゼーション又は差表示によって単離される方法 。 ３． 請求の範囲第１項に記載の方法によって単離された進行抑制遺伝子。 ４． ＲＮＡ転写のプロモーターに外科的に結合された請求の範囲第３項に記 載の進行抑制遺伝子。 ５． 請求の範囲第３項に記載の進行抑制遺伝子を含有するベクター。 ６． 請求の範囲第３項に記載の進行抑制遺伝子を含有するウイルス。 ７． 請求の範囲第３項に記載の進行抑制遺伝子によってコードされるポリペ プチド。 ８． レトロウイルスのロングターミナルリピートの発現を抑制する進行抑制 遺伝子を同定するための方法であって、 ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝 子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞の個体群に導入すること、 ｂ）ステップ（ａ）からの細胞を、少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現 を誘導し、該細胞の副個体群にロングターミナルリピートで調節されるプロテイ ンキナーゼＣβ₁遺伝子の発現を選択的に抑制させるように処理すること、及び ｃ）進行抑制遺伝子を発現する細胞を選別すること、 ｄ）ステップ（ｃ）からの細胞からｍＲＮＡを単離すること、 ｅ）このようにして得られたｍＲＮＡを未誘導の形質転換細胞から得られた ｍＲＮＡと比較し、ステップ（ｃ）からの細胞によってのみ発現されるｍＲＮＡ を同定すること、及び ｆ）このようなｍＲＮＡをコードする遺伝子を単離し、これによって進行抑 制遺伝子を同定すること、 を具備した方法。 ９． 請求の範囲第８項に記載の方法であって、該レトロウイルスがモロニー 白血病ウイルスである方法。 １０． 請求の範囲第８項に記載の方法であって、該レトロウイルスがヒト免 疫不全ウイルスである方法。 １１． 請求の範囲第８項に記載の方法であって、ステップｂ）において、該 細胞が５−アザシチジン又はフェニルブチレートで処理される方法。 １２． 請求の範囲第８項に記載の方法であって、ステップｂ）において、該 細胞がＤＮＡ脱メチル化剤で処理される方法。 １３． 請求の範囲第８項に記載の方法であって、ステップｆ）において、該 進行抑制遺伝子が減法ハイブリダイゼーション又は差表示によって単離される方 法。 １４． 請求の範囲第８項に記載の方法によって同定される進行抑制遺伝子。 １５． ＲＮＡ転写のプロモーターに外科的に結合された進行抑制遺伝子。 １６． 請求の範囲第１４項に記載の進行抑制遺伝子を含有するベクター。 １７． 請求の範囲第１４項に記載の進行抑制遺伝子を含有するウイルス。 １８． 請求の範囲第１４項に記載の進行抑制遺伝子によってコードされるポ リペプチド。 １９． レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を阻害することが できる分子を選別する方法であって ａ)ロングターミナルリピートによって調節されるプロテインキナーゼＣβ₁ 遺伝子を含有するＤＮＡを形質転換された細胞の個体群に導入すること、 ｂ）プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を発現するステップａ）からの細胞を 選別すること、 ｃ）該選択された細胞を、ロングターミナルリピートの機能を阻害するのに 効果的な所定量の分子で処理すること、 ｃ）プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現のレベル（発現のレベルの低下 は、該分子がロングターミナルリピートの機能を阻害することができることを示 す。）を決定すること、 を具備した方法。 ２０． 請求の範囲第１９項に記載の方法であって、該レトロウイルスがモロ ニー白血病ウイルスである方法。 ２１． 請求の範囲第２０項に記載の方法であって、該レトロウイルスがヒト 免疫不全ウイルスである方法。 ２２． レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化すること ができる分子を選別する方法であって、 ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝 子を形質転換された細胞の個体群に導入すること、 ｂ）プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を発現する細胞を選別すること、 ｃ）ステップｂ）からの選別された細胞を、ロングターミナルリピートの機 能を活性化するのに効果的な所定量の分子と接触すること、 ｃ）プロテインキナーゼＣβ₁遺伝子の発現のレベル（発現のレベルの増加 は、該分子がロングターミナルリピートの機能を活性化することができることを 示す。）を決定すること、 を具備した方法。 ２３． レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を阻害する遺伝子 を同定する方法であって、 ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝 子を形質転換された細胞の個体群に導入すること、 ｂ）ステップ（ａ）からの細胞を、少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現 を誘導し、ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺 伝子の発現を抑制するように処理すること、 ｃ）ロングターミナルリピートの機能を阻害する遺伝子を単離すること、 を具備した方法。 ２４． 請求の範囲第２３項に記載の方法であって、ステップｃ）において、 該遺伝子が減法ハイブリダイゼーション又は差表示によって単離される方法。 ２５． 請求の範囲第２３項に記載の方法によって同定される遺伝子。 ２６． ＲＮＡ転写のプロモーターに外科的に結合された遺伝子。 ２７． 請求の範囲第２５項に記載の遺伝子を含有するベクター。 ２８． 請求の範囲第２７項に記載の遺伝子を含有するウイルス。 ２９． 請求の範囲第２５項に記載の遺伝子によってコードされるポリペプチ ド。 ３０． レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を阻害することが できるタンパク質因子を同定する方法であって、 ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子 を含有するＤＮＡを形質転換された細胞の個体群に導入すること、 ｂ）ステップ（ａ）で得られた細胞を、少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発 現を誘導し、ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁ 遺伝子の発現を抑制するように処理すること、 ｃ）ステップｂからの細胞から核を単離し、溶解し、抽出物を得ること、 ｄ）該抽出物をロングターミナルリピートと接触すること、及び ｅ）該ターミナルリピートと結合するタンパク質因子を単離し、これによって ロングターミナルリビートの機能を阻害することができる因子を単離すること、 を具備した方法。 ３１． 請求の範囲第３０項に記載の方法によって同定されるタンパク質因子。 ３２． レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化する遺伝 子を同定する方法であって、 ａ）ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子 を含有するＤＮＡを形質転換された細胞に導入すること、 ｂ）ステップ（ａ）からの細胞を、少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を 誘導し、ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝 子の発現を抑制するように処理すること、 ｃ）ステップｂ）からの導入された細胞を、ロングターミナルリピートを活性 化するのに効果的な所定量のプロテインキナーゼＣ活性化化合物又はセリン若し くはスレオニン特異的タンパク質ホスファターゼと処理すること、及び ｄ）ロングターミナルリピートを活性化する遺伝子を単離すること、 を具備した方法。 ３３． 請求の範囲第３２項に記載の方法であって、該プロテインキナーゼＣ 活性化化合物が、腫瘍を増進するジテルペンホルボールエステルである方法。 ３４． 請求の範囲第３２項に記載の方法であって、該プロテインキナーゼＣ 活性化化合物が、合成プロテインキナーゼＣ活性化剤である方法。 ３５． 請求の範囲第３４項に記載の方法であって、該活性化剤がＡＤＭＢ又 はＤＨＩである方法。 ３６． 請求の範囲第３２項に記載の方法であって、該阻害剤がカリクリン又 はオカダ酸である方法。 ３７． 請求の範囲第３２項に記載の方法であって、ステップｄ）において、 該遺伝子が減法ハイブリダイゼーション又は差表示によって単離される方法。 ３８． 請求の範囲第３２項に記載の方法によって同定される遺伝子。 ３９． ＲＮＡ転写のプロモーターに外科的に結合された遺伝子。 ４０． 請求の範囲第３８項に記載の遺伝子を含有するベクター。 ４１． 請求の範囲第３８項に記載の遺伝子を含有するウイルス。 ４２． 請求の範囲第３８項に記載の遺伝子によってコードされるポリペプチ ド。 ４３． レトロウイルスのロングターミナルリピートの機能を活性化すること ができるタンパク質因子を同定する方法であって、 ａ)ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝子を 含有するＤＮＡを形質転換された細胞の個体群に導入すること、 ｂ）ステップ（ａ）からの細胞を、少なくとも１つの進行抑制遺伝子の発現を 誘導し、ロングターミナルリピートで調節されるプロテインキナーゼＣβ₁遺伝 子の発現を抑制するように処理すること、 ｃ）ステップｂ）からの導入された細胞を、ロングターミナルリピートを活性 化するのに効果的な所定量のプロテインキナーゼＣ活性化化合物又はセリン若し くはスレオニン特異的タンパク質ホスファターゼで処理すること、 ｄ）ステップｃからの細胞から核を単離し、溶解し、抽出物を得ること、 ｅ）該抽出物をロングターミナルリピートを含有するＤＮＡと接触すること、 及び ｆ）該ターミナルリピートと結合するタンパク質因子を単離し、これによって ロングターミナルリピートの機能を活性化することができる因子を同定すること 、 を具備する方法。 ４４． 請求の範囲第４２項の方法によって同定されるタンパク質因子。