【発明の詳細な説明】
免疫検定法のための口腔採取
本発明は、免疫学的検定に関するものである。特に、免疫グロブリン及びその
他の粘膜浸出液中の物質を分析するシステムに関するものである。
血液と唾液の免疫グロブリン(immunoglobulins)の間には関連があり、唾液特
有のＩｇＡ分泌物が存在するため、抗原抗体検定が唾液について行われ、種々の
疾病のスクリーニング手段としてのこの種の検定の価値が評価されてきた。
唾液腺からの唾液の採取は、分泌量が少量であること、唾液腺が解剖学的にい
くつかに分散していること、液体粘度が比較的高いこと等のために、面倒である
。大抵の採取技術の場合、細管を用いるか、マイクロピペットに吸入するか、パ
ラフィンを噛むか、シリンジで吸い出す等の方法が用いられる。だが、これらの
方法には、唾液の粘度のため、気泡を含まない唾液を回収することが難しい点で
、限界がある。別の採取方法では、検体内の気泡を除去すること、又は少なくと
も低減することが、提案されている。それらの方法のなかには、スポンジ又は柔
軟な浸透膜パッドを用いて、口腔内で直接に唾液を吸着採取する方法が含まれて
いる。吸着採取後、唾液は、吸着媒体から遠心分離又は圧縮によって分離される
。しかし、吸着に用いられる媒体は、通常、綿、ナイロン、ポリエステルのいず
れかである。これらの媒体は、非特異的にタンパク質を結合することがあり、そ
の結果、免疫グロブリンの回収が不都合に低率となることがある。
唾液検体の検定は、十分には開発されてはこなかった。採取の問題に加えて、
公知の方法で採取された検体には、通常、血清中の免疫グロブリンの約０．０１
〜０．１％が含有されているに過ぎない。唾液の免疫グロブリン含有率が極めて
低率であるため、患者の疾患をスクリーニングするには、より精密な抗原抗体検
定法を用いる必要が生じた。これらの方法は、パリィほかによる論文『旅行者の
Ａ型肝炎ヴィルス抗体をスクリーニングする合理的プログラム』（「ランセット
」誌、１９８８年６月２５日号）で論じられ、より感度の低い方法の場合に生じ
得る誤った徴候を防止するには、より精密なＩｇＧ捕獲放射線免疫検定（ＧＡＣ
Ｒ
ＩＡ）が好ましいことが、明らかにされている。だが、言うまでもなく、より感
度の高い試験の場合、通常、試験成績を得るには、より多くの時間と費用とを必
要とする。
口腔の免疫系は、生体全体の免疫系との相互作用を有するのみでなく、抗原抗
体反応のための口腔自体の集中的な中枢をも有している。口腔内には、口腔外リ
ンパ腺と口腔内リンパ様密集部が存在する。口腔外リンパ腺は、口腔粘膜のドレ
ーン、歯肉、歯に含まれている。しかし、口腔内リンパ様組織の機能は、ほとん
ど理解されていない。
口腔外リンパ腺は、リンパ毛細管の、細かな網状組織を有し、これらリンパ毛
細管が、口腔、口蓋、頬、口唇、歯肉、歯髄などの表面近くに分布している。こ
れらの毛細管は、舌筋肉やその他の組織内の深部の網状組織に発するより太いリ
ンパ管に接続されている。抗原は、口腔内リンパ系内へ、毛細管から直接に侵入
するか、又は食細胞によって搬入される。網状組織内へ入ると、抗原は、往々に
して免疫反応を誘起させる。
口腔内リンパ様組織には、通常、４種の異なる組織密集部が含まれている：す
なわち、（ａ）扁桃、（ｂ）散在する粘膜下リンパ様密集部、（ｃ）唾液腺リン
パ様組織、（ｄ）歯肉リンパ様組織である。
扁桃（口蓋扁桃及び舌扁桃）は、主としてＢ細胞とＴ細胞を産生する。これら
の細胞は、通常、リンパ球と形質細胞のキャップ内に含まれている。抗原は、通
常、上皮区域から扁桃内へ侵入し、そこでＴ細胞とＢ細胞とに接触し、免疫反応
を誘起することがある。扁桃内に形成される主な種類の抗体は、ＩｇＧに続いて
、ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥの順であることが分かっている。
散在する粘膜下リンパ様細胞については、十分には研究されていない。これら
の細胞群は、組織学的には扁桃組織に類似している。
大きな唾液腺（耳下腺、下顎腺、舌下腺）と小さな唾液腺との双方が、リンパ
球と形質細胞とを含んでいる。形質細胞の大部分は、ＩｇＡを分泌し、かついく
らかのＩｇＧ又はＩｇＭを分泌する。唾液腺内で合成されるＩｇＡは、２量体構
造を有している。この種のＩｇＡは、分泌ＩｇＡと呼ばれ、唾液成分の大部分を
占めている。Ｔ細胞、Ｂ細胞のいずれもが、歯肉リンパ様組織内に見出される。
臨床的に正常な歯肉組織を有する被験者の場合には、Ｔ細胞が優位を占める。感
染期、例えば歯肉炎発症時には、Ｂ細胞が優位を占めることが判明している。
また、形質細胞も、歯肉リンパ様組織内に見出される。これらの細胞群は、通
常、血管近くに所在し、主としてＩｇＧを産生する。よりわずかな程度、ＩｇＡ
とＩｇＭをも産生する。より重要な点は、ジョーマ・Ｏ・テノヴオ編『ヒトの唾
液：臨床化学と微生物学』なかで、ブランゼッグほかが明らかにしている点であ
る。すなわち、歯肉組織区域の分泌物から得られた免疫グロブリンは、血液中に
見出される免疫グロブリンと直接に関係があるという点である。
唾液の抗原抗体分析に伴う障害を除去又は低減するために、本出願人は、リン
ス液として高張液を用いて口腔内から免疫グロブリンを採取する方法を、以前、
提案した。これについては、ヨーロッパ特許公開第０４１８７３９号明細書参照
のこと。本出願人は、また、高張液で処理した採取パッドを用いて、免疫学的検
定用の免疫グロブリンを口腔内で採取することを、以前、提案した。これについ
ては、世界知的所有権機構第９１／１３３５５号明細書参照のこと。
本発明により、今回、明らかになった点は、処理されていないパッドを用いて
、免疫学的検定用の十分な量の口腔内免疫グロブリンを採取できるという点であ
る。この種のパッドを使用した結果、予期以上に多量の免疫グロブリンを採取で
き、疾病のスクリーニング手段として、基礎的な抗原抗体検定技術を実現できた
。更に、本発明は、検定用の免疫グロブリン以外の物質の採取にも利用できるこ
とが明らかになった。事実、本発明は、約１７６（コチニン）〜約９５０，００
０（ＩｇＭ）の分子量の物質を効果的に採取することができた。本発明を用いて
採取できる分子の大きさに、制限はない。分子が、毛細管壁及びその他の口腔内
組織壁を通過可能であれば、本発明を利用できる。パッドは、噛まずに口腔粘膜
に接触させる。
第１図は、パッド保存容器の一実施例の縦断面図である。
第２図は、パッドとホールダを有する、第１図の実施例の縦断面図である。
第３図は、本発明に用いる容器の別の実施例を、キャップを外して示した側面
図である。
第４図は、第３図の容器の平面図である。
第５図は、第４図の５−５線に沿った容器の縦断面図である。
第６図は、第３図に示した容器に用いるキャップの側面図である。
第７図は、第６図のキャップの平面図である。
第８図は、第７図の８−８線に沿った縦断面図である。
本発明は、免疫学的検定用の口腔内免疫グロブリンその他の物質の採取に関す
るものである。パッドは、高濃度の免疫グロブリンその他の物質を含む検体を採
取するのに用いる。口腔内から採取された高レベルの免疫グロブリンは、ｍｌ当
たりの総Ｉｇが５０μｇを超える濃度と考えられる。検体は、基本検定技術によ
り検定される。この技術は、患者の疾患、又は一定の他の物質の所在をスクリー
ニングする手段として用いられる。
本発明を適用して効果的に採取された代表的な分子は、下記のとおりである：
分析物 分子量
コチニン(Cotinine) １７６
ブドウ糖(Glucose) １８０
テオフィリン(Theophylline) １８０
コカイン(Cocaine) ３０３
ベータ２−マイクログロブリン(Beta2-microglobulin) １１，８１８
Ｂ型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigens) ２４，０００
ベータ- ヒト絨毛ゴナドトロピン(Beta-human ３７，９００
chorionic gonadotropin)
ＩｇＧ--ヒトの抗体(human antibody) １５０，０００
総ＩｇＧ（抗原は不特定）
ＨＩＶ- １
Ａ型肝炎(Hepatitis A)
Ｂ型肝炎(Hepatitis B)
麻疹(measles)
梅毒非トレポネーマ抗原(Syphilis non-treponemal antigen)
ＩｇＡ--ヒトの抗体 １６０，０００
総ＩｇＡ（抗原は不特定）
ＩｇＭ--ヒトの抗体 ９５０，０００
総ＩｇＭ（抗原は不特定）
Ａ型肝炎
Ｂ型肝炎
採取した検体の劣化を最低減に抑えるために、本発明の高張液を用いた後にパ
ッドを保存する容器には、防腐剤を加えておく。この防腐剤によって、抗体分子
を破壊する原因になり得る蛋白質分解酵素の活性が阻害される。防腐剤として考
えられる化合物には、抗菌剤、抗真菌剤、制菌剤、制真菌剤、酵素阻害剤等が含
まれる。一好適実施例によれば、抗真菌剤として、安息香酸(benzoic acid)、ソ
ルビン酸(sorbic acid)、これらの塩のいずれかが用いられる。また、制菌剤と
しては、高濃度の塩や、高張液を低ｐＨ値に維持し得る化合物が考えられる。そ
れらの塩には、チメロサル(thimerosal)（又はマーシオレート(merthiolate)）
、酢酸フェニル水銀(phenylmercuric acetate)、硝酸フェニル水銀(phenylmercu
ric nitrate)、アジ化ナトリウム(sodium azide)が含まれる。更に別の好ましい
防腐剤としては、通常、医療やうがいに用いられる防腐剤が挙げられる。例えば
、エチルアルコール、クロルヘキシジン・グルコネート(chlorhexidine glucona
te)である。別種の好ましい殺菌剤は、局所殺菌剤として用いたり、うがいに用
いたりされる洗浄剤である。一例を挙げれば、塩化ベンザルコニウム(benzalkon
ium chloride)である。これらの防腐剤は、約０．０１〜約０．２重量％の範囲
で用いるのが好ましい。
本発明によれば、口腔内から粘膜分泌液を吸着するために、パッドが用いられ
る。このパッドは、口腔内で効果的に吸着の可能な材料製である。この吸着材料
としては、プラスチック、又はセルローズ等の炭水化物を使用できるが、好まし
い材料は、厚手の脱脂綿紙である。厚手の脱脂綿紙の一例は、ニューハンプシャ
ー州キーン市のシュライカー・アンド・シュエル社製の製品＃３００である。こ
のパッドは、発泡体又はスポンジの形式でないのが好ましい。但し、それらの形
式のものも使用できない訳ではない。
このパッドの大部分の材料は、非特異的に蛋白質を結合することができる。し
たがって、なかには不必要にパッドに免疫グロブリンが結合することがあるため
、
阻害剤を用いて結合を阻害するのが望ましい。非特異的な結合は、血液検体の採
取時には、通常は問題にならない。なぜなら、血液自体が阻害剤（例えばヒト血
清アルブミン(human serum albumin)など）を含んでいるからである。
口腔内での検体採取時に非特異的な結合を低減するためには、阻害剤を高張液
に添加して、パッドに含浸させておくことができる。阻害剤は、通常、可溶性蛋
白質であり、ほかの蛋白質が固化表面に非特異的に結合するのを防止する。阻害
剤として添加できる化合物は、アルブミンやゼラチンだが、無毒の水溶性蛋白質
(water soluble non-toxic protein)も使用できる。但し、その蛋白質が抗体分
子に有害な影響を与えないことが条件である。好ましいのは、牛のゼラチンであ
る。通常、阻害剤は、約０．０１〜約０．２重量％の濃度の溶液にする。溶液は
、浸漬又は噴霧によってパッドに含浸させた後、乾燥させる。
口腔内で検体を採取するには、ホールダを用いてパッドを口内へ入れればよい
。パッドとホールダは、図に示されている。ホールダ１は、一端に溝２を有する
中空のプラスチック製の棒でよい。パッド３は溝内へ挿入し、ホールダ１は、口
腔内へパッドを差込み、好ましくは下の歯ぐきと頬の間に挟むように操作できる
。下の歯ぐきと頬との間にパッドを挟むことにより、歯肉リンパ様組織からの分
泌物や、粘膜下リンパ様組織及び唾液腺リンパ様組織からの分泌物を容易に吸着
できる。検体の採取は、約１０秒ほどパッドを歯肉と頬とにこすりつけながら前
後に往復させた後、そのまま約２分ほど適当な位置にパッドを保持するようにし
て行うのが好ましい。パッドは、噛まないのがよい。噛むと不必要に唾液分泌が
刺激されるからである。
検体採取後、パッドは、免疫学的検定が行われるまで、容器内に保存する。容
器の１つの型式が第１図と第２図とに示してある。容器は、その外側に遠心分離
管を、また内側には、遠心分離管内に挿入される内側管を有するようにするのが
望ましい。パッドは、内側管内へ挿入し、そのなかに内側管のキャップで固定す
る。
第１図には、本発明に使用されるように変更された組立体が示されている。容
器２は、遠心分離管４と、上部管又は容器７と、栓又はストッパ１１とを備えて
いる。遠心分離管４は、下方へ向かって先細にされた凹所６を有する先細の下端
部又は基部５を有している。凹所６には、遠心分離時に固体が累積される。上部
管又は容器７は、半径方向外方へ突出する環状フランジ８と、上端の円筒形上部
９とを有している。円筒形上部９とストッパ１１とは、遠心分離管４の上部と等
しい寸法及び形状を有しているので、遠心分離管４の外表面と同一曲面をなし、
組立体は、一様の外観を有している。しかし、この特徴は、本発明にとって重要
なものではない。容器７の底部１３には、組立体全体を遠心分離にかけた場合に
、液体が容器７から遠心分離管４内へ流入するように、穴１７が設けられている
。容器７は、ポリエチレン、ガラス、その他の適当な材料で造られている。同じ
ように、ストッパー１１も、技術上周知のように、ポリエチレン等の適当な材料
で造られている。
穴１７には、取外し可能な栓１９がかわれている。栓１９は、ワックス、プラ
スチック等の適当な材料で造られている。容器７内には、防腐剤液２１が入れら
れる。
防腐剤液２１は、パッドを内側管に入れて、添加する。この防腐剤液は、抗体
分子を破壊する酵素の活性を阻害する機能、又は殺菌剤の機能を有している。
防腐剤として内側管に入れる化合物は、抗菌剤、抗真菌剤、制菌剤、制真菌剤
、酵素阻害剤などである。抗菌剤としては、クロルヘキシジン・グルコネート(c
hlorhexidine gluconate)又はチメロサル(thimerosal)を用いるのが好ましい。
内側管内に入れる防腐剤液には、１種類だけの防腐剤を用いても、複数種類の
防腐剤を組合わせて用いてもよい。通常、防腐剤濃度は、細菌汚染が制限され、
パッドに吸着された免疫グロブリンに悪影響を与えない濃度とする。
内側管に入れる防腐剤液は、また、遠心分離時にパッドからの抗体の分離を促
進させる洗浄剤を添加することができる。好ましい洗浄剤としては、固化表面へ
の抗体の非特異的結合を防止する働きをも有するツイーン２０（ポリオキシエチ
レン・ソルビタン・モノオレエート(polyoxyethylene sorbitan monooleate)）
が挙げられる。好ましい組合わせは、約０．０１〜０．２％のクロルヘキシジン
・グルコネートと、約０．２〜０．７％のツイーン２０を含む組合わせである。
最も好ましい組合わせは、クロルヘキシジン・グルコネート約０．１％と、ツイ
ーン２０約０．５％との組合わせである。
防腐剤液を内側管内へ加えた後、内側管のキャップを挿入し、内容物を密閉す
る。パッドは、このようにして、免疫学的検定が行われるまで、数日間保存でき
る。
この実施例の場合、ホールダ１上のパッド３は、既述のように使用される。パ
ッド３は、被験者の口内から取り出された後、ストッパー１１を容器７から外し
て、容器７内へパッドを入れる。ホールダ１は、容器７の口の外のところで折り
、容器から上方へ突出するようにする。次いで、再びストッパー１１で閉じる。
ストッパー１１は中空なので、折られたホールダ１の端部はストッパー内へ延び
、容器７は確実に密封される。ホールダ１は、適当な箇所に切り込みを設けてお
き、折りやすいようにしておくのが好ましい。パッド３は、容器７内へ挿入され
ると、防腐剤液２１の少なくとも一部を吸着する。
パッド３は、検定が行われるまで、容器７内に保存される。実験室では、スト
ッパー１１を所定位置に固定して、容器７が、逆さにされ、ワックスその他の適
当な材料製のシール１９を除去され、遠心分離管４内へ挿入される。次いで、組
立体２全体が遠心分離にかけられ、防腐剤液、唾液その他を含むすべての液体が
、穴１７から遠心分離管４内へ流入する。検定は、公知の技術を用いて行なう。
パッドによる採取システムを用いて口腔の検体を採取、分析する作業を簡単化
するために、キットを用意することができる。このキットは、パッドと、分析の
ための口腔検体の採取と準備に用いられる器具とを組合わせたものである。この
キットの好ましい一実施例は、処理済みのパッド３とホールダ１、容器７とスト
ッパー１１、保存用の防腐剤２１から成っている。これに、任意に遠心分離管４
を加えることもできる。
後に続く検定のため、採取検体を保存する、本発明による別の容器は、取外し
可能のストッパーにより密閉するようにされた開放上端部と、容器内部を外部と
連通させる開口を有する下端部とを有している。この開口は、検体保存中は容易
に折り取れるニップルで密閉され、続く検定のため採取検体を取り出すさいには
、開放される。使用者の用い易さと安全のために、ニップルの遠位端部は、拡大
され、好ましくは球形にされている。開放上端部は、好ましくはねじはめ式の“
プラグシール”キャップで密閉される。加えて、中央の開口へ向かって傾斜して
い
る容器底部には、複数の直立ウエブが設けられ、前記出願番号第６４１７３９号
明細書に開示されたパッドが、容器底部に付着して、底部の開口をふさぐことが
ないようにされている。
この容器は、円錐形の標準的な１５ｍｌ遠心分離管内へ挿入できるように寸法
付けされている。これによって、ニップルの折り取り後、遠心分離にかけ、容器
の内容物を遠心分離管内へ移すことができる。
容器内へは一定量の防腐剤液（約０．５〜約２．０ｍｌ）を入れるようになっ
ている。パッドを容器に挿入すると、防腐剤液はパッドに吸収される。防腐剤液
を入れた容器は、液量の著しい損失なしに最大１年間保存されるので、水分透過
率は低い値でなければならない。容器は、適当なプラスチック、例えばポリエチ
レン、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレン・テレフタレート）、ポリプロ
ピレン、ＥＰＣ（エチレン・プロピレン共重合体）、その他で製造される。ポリ
カーボネートは、“通気性”が過剰なため、つまり水分を逃がすため、最も望ま
しくない。好適材料はポリプロピレンである。
第３図と第４図には、細長いボディ部分１２を有するこの実施例の容器が、全
体を符号１０で示されている。ボディ部分１２は、ほぼ円筒形だが、上端部から
底部１５へ向かって僅かに先細にするのが好ましい。上端部１６は開放されてお
り、キャップをねじ付けるためのねじ山１８を有している。
底部１５からは、ニップル２０が下方へ延びている。底部１５は、外方から中
心へ向かって、角度αで僅かに傾斜するようにするのが好ましい。角度αは、好
ましくは約２０°である。底部１５の内側中央には、好ましくはＶ字形に、約８
８．５０°の角度で凹所２２が形成されている。凹所２２は、ニップル２０の基
端部を弱くするために設けられたもので、これによって、十分に圧力を加えれば
、ニップルは、折り取ることができる。ニップル２０の遠位端部に形成された球
形部２４によって、折りやすいニップル２０を容易かつ安全に折り取ることがで
きる。容器１０に挿入されるパッドが、ニップル２０の折り取りによって生じる
底部の流出箇所に付着することのないように、複数の直立ウエブ２６が設けられ
てる。ウエブ２６は４個設けるのが好ましい。
第５図、第６図、第７図には、キャップが全体を符号２８で示されている。キ
ャップ２８は、容器１０の開放上端部１６を密閉する。キャップ２８は、また“
プラグシール”として広く知られている型式のものである。キャップ２８には、
容器のねじ山１８と協働する内ねじ山３０が設けられている。環状凹所３２によ
って、環状スペース３４が形成されている。環状スペース３４は、環状凹所３２
と外壁３６の内側とによって仕切られている。容器壁部は、したがって、環状ス
ペース３４内へはめ合わされ、完璧に密封される。キャップ２８の外面は、図示
のように、刻み付きであり、着脱が容易にされている。
容器１０は、第１図及び第２図の実施例と同様の形式で使用される。以下の例
は、本発明のパッドの効果を示すものである。
例１
唾液と粘膜浸出液とのＩｇＧの比較
この実験の目的は、唾液と粘膜浸出液とのＩｇＧレベルを比較することである
。
口腔検体は、１０名の被験者から採取した。被験者の唾液は、サーステット・
サリヴェットTM・キットの一部として市販されている“吸着体”、すなわち綿プ
ラグを、唾液で飽和するまで噛ませることにより、採取した。次いで、約４時間
後、世界知的所有権機構第９１／１３３５５号に記載の処理済みパッドを用いて
口腔液を採取することにより、被験者から粘膜浸出液を採取した。唾液と浸出液
との採取後、綿プラグとパッドとから前記液体を遠心分離によって分離した。こ
の口腔検体を、酵素免疫検定法を用いて分析し、ＩｇＧ抗体の有無を調べた。
表１は、綿プラグと処理済みパッドとにより採取されたＩｇＧレベルを示した
ものである。
世界知的所有権機構第９１／１３３５５号の処理済みパッドによって採取され
た検体には、サーステット・サリヴェットTM・キットの“吸着体”を噛むことで
得られた唾液検体より、約２５倍多いＩｇＧ抗体が含まれていた。
例２
世界知的所有権機構第９１／１３３５５号の処理済みパッドと本発明の
非処理パッドとの比較実験
処理済みパッド２個と非処理パッド２個の、４個のパッドすべてを、各志願被
験者からの口腔検体採取に用いた。各採取（２個の同種パッドを同時に採取）は
、２分間続けた。被験者には、初めの採取後、水道水で口腔洗浄させ、次の採取
ま
で、少なくとも１時間半待機させた。被験者は、実験中、２群に分けた。被験者
の半数からは、初めに２個の非処理パッドで、次に２個の処理済みパッドで、口
腔検体を採取し、他の半数からは、最初に２個の処理済みパッドで、次に２個の
非処理パッドで、採取を行なった。
採取後、被験者は、パッドを、検体番号と、採取に用いたパッドの種類（処理
済み又は非処理）とを記載したラベルを貼られた小瓶に入れるようにした。棒は
折り取り、小瓶は密閉した。検体は、遠心分離の間、４℃に維持した。遠心分離
後、各被験者から２個の同種パッドで採取された口腔検体を一緒に保存した。検
体は、４℃で保存した。
各保存検体は、エピトープ社のＥＩＡを用いて総ＩｇＧを検定され、各検体内
のＩｇＧを定量した。
当社のＩｇＧ特異性酵素免疫検定法（ＥＩＡ）により分析したところ、処理済
みパッドで採取した検体には、非処理パッドで採取した検体より高レベルの免疫
グロブリンＧ（ＩｇＧ）が含まれていた。
世界知的所有権機構第９１／１３３５５号のパッドと、サーステットの“吸着
体”とにより採取された検体の分析から結論付けられることは、パッドに採取さ
れたＩｇＧは、粘膜浸出液からで、唾液からではなく、その差は、有意であると
いうことである。
また、世界知的所有権機構第９１／１３３５５号の処理済みパッドと、本発明
の非処理パッドとによって採取した検体の分析から結論付けられることは、非処
理パッドで採取されたＩｇＧ値は、処理済みパッドによる値より低い値ではある
が、それでも非処理パッドでは、唾液から採取されると予想された値より、有意
に高い値のＩｇＧが採取されるということである（５．３μｇ／ｍｌ対２．４μ
ｇ／ｍｌ）。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Oral Harvesting for Immunoassays The present invention relates to immunoassays. In particular, it relates to systems for analyzing substances in immunoglobulins and other mucosal exudates. Because there is a relationship between blood and salivary immunoglobulins and the presence of salivary IgA secretions, an antigen-antibody assay is performed on saliva, and this type of assay as a screening tool for various diseases is performed. The value has been evaluated. Collecting saliva from the salivary glands is troublesome because of the small amount of secretion, the anatomically dispersed salivary glands, and the relatively high liquid viscosity. In the case of most collection techniques, methods such as using a thin tube, inhaling into a micropipette, chewing paraffin, or sucking out with a syringe are used. However, these methods are limited in that it is difficult to collect saliva that does not contain bubbles due to the viscosity of saliva. Another collection method has been proposed to remove, or at least reduce, air bubbles within the specimen. Among these methods, there is included a method of directly adsorbing and collecting saliva in the oral cavity using a sponge or a flexible osmotic membrane pad. After adsorption collection, saliva is separated from the adsorption medium by centrifugation or compression. However, the medium used for adsorption is usually either cotton, nylon or polyester. These media may bind proteins non-specifically, resulting in inconveniently low immunoglobulin recovery. Assays for saliva samples have not been fully developed. In addition to collection problems, samples collected by known methods usually contain only about 0.01-0.1% of immunoglobulin in serum. The extremely low immunoglobulin content of saliva has necessitated the use of more precise antigen-antibody assays to screen patients for disease. These methods are discussed in the paper "A Rational Program for Screening Travelers' Hepatitis A Virth Antibodies" by Parry et al. ("Lancet", June 25, 1988), and in the case of less sensitive methods. It has been shown that a more precise IgG capture radioimmunoassay (GAC RI A) is preferred to prevent false indications that may occur in the. However, it goes without saying that more sensitive tests usually require more time and money to obtain test results. The immune system of the oral cavity not only has an interaction with the immune system of the whole body, but also has a concentrated center of the oral cavity for antigen-antibody reaction. In the oral cavity, there are extraoral lymph glands and intraoral lymphoid-like clusters. Extraoral lymph glands are contained in the drainage of the oral mucosa, gingiva, and teeth. However, the function of oral lymphoid tissue is poorly understood. Extraoral lymph glands have a fine network of lymphatic capillaries, and these lymphatic capillaries are distributed near the surface of the oral cavity, palate, cheeks, lips, gingiva, pulp and the like. These capillaries connect to the thicker lymphatic vessels that originate in the deeper reticulum within the tongue muscle and other tissues. Antigens either enter the lymphatic system of the oral cavity directly through capillaries or are carried by phagocytes. Once in the network, the antigen often elicits an immune response. Oral lymphoid tissue usually contains four different tissue clusters: (a) tonsils, (b) scattered submucosal lymphoid clusters, (c) salivary lymphoid tissue, (D) Gingival lymphoid tissue. The tonsils (palatine and tonsil) mainly produce B cells and T cells. These cells are usually contained within the caps of lymphocytes and plasma cells. Antigens normally enter the epithelial area into the tonsils where they may contact T and B cells and elicit an immune response. The major types of antibodies formed in the tonsil have been found to be IgG, followed by IgA, IgM, IgD, IgE, in that order. Scattered submucosal lymphoid cells have not been well studied. These cell groups are histologically similar to tonsil tissue. Both large salivary glands (parotid, submandibular, sublingual) and small salivary glands contain lymphocytes and plasma cells. The majority of plasma cells secrete IgA and some IgG or IgM. IgA synthesized in the salivary gland has a dimeric structure. This type of IgA is called secretory IgA and accounts for the majority of saliva components. Both T cells and B cells are found in gingival lymphoid tissue. For subjects with clinically normal gingival tissue, T cells dominate. It has been found that B cells dominate during the infection stage, for example, when gingivitis develops. Plasma cells are also found within the gingival lymphoid tissue. These cell populations are usually located near blood vessels and mainly produce IgG. It also produces IgA and IgM to a lesser extent. More importantly, it is clarified by Blanchegg and others in "Human Saliva: Clinical Chemistry and Microbiology" edited by Joma O. Tenovo. That is, the immunoglobulins obtained from the secretions of the gingival tissue area are directly related to the immunoglobulins found in the blood. In order to eliminate or reduce the disorders associated with saliva antigen-antibody analysis, the applicant has previously proposed a method of collecting immunoglobulins from the oral cavity using a hypertonic solution as a rinse. See European Patent Publication No. 0418739 for this. The Applicant has also previously proposed using the collection pad treated with hypertonic solution to collect immunoglobulins in the oral cavity for immunoassays. See World Organization for Intellectual Property 91/13355. According to the present invention, it has become clear that the untreated pad can be used to collect a sufficient amount of the oral immunoglobulin in the immunoassay. As a result of using this type of pad, an unexpectedly large amount of immunoglobulin could be collected, and a basic antigen-antibody assay technique could be realized as a disease screening means. Further, it was revealed that the present invention can be used for collecting substances other than immunoglobulin for assay. In fact, the present invention was able to effectively harvest material with a molecular weight of about 176 (cotinine) to about 950,000 (IgM). There is no limit to the size of molecules that can be harvested using the present invention. The present invention can be used if the molecule can pass through the capillary wall and other oral tissue walls. The pad is brought into contact with the oral mucosa without chewing. FIG. 1 is a vertical sectional view of an embodiment of a pad storage container. FIG. 2 is a longitudinal sectional view of the embodiment of FIG. 1 having pads and holders. FIG. 3 is a side view showing another embodiment of the container used in the present invention with the cap removed. FIG. 4 is a plan view of the container of FIG. FIG. 5 is a vertical cross-sectional view of the container taken along the line 5-5 in FIG. FIG. 6 is a side view of the cap used in the container shown in FIG. FIG. 7 is a plan view of the cap of FIG. FIG. 8 is a longitudinal sectional view taken along line 8-8 of FIG. The present invention relates to the collection of oral immunoglobulins and other substances for immunoassays. The pad is used to collect a sample containing a high concentration of immunoglobulin and other substances. High levels of immunoglobulins taken from the oral cavity are considered to be at concentrations of greater than 50 μg total Ig per ml. The sample is assayed by the basic assay technique. This technique is used as a means of screening a patient for the presence of disease or certain other substances. Exemplary molecules effectively collected by applying the present invention are as follows: analyte molecular weight cotinine (cotinine) 176 Glucose (Glucose) 180 theophylline (-theophylline) 180 Cocaine (Cocaine) 303 beta 2- Beta2-microglobulin 11,818 Hepatitis B surface antigens 24,000 beta-Human chorionic gonadotropin IgG -- human antibody 150 000 Total IgG (antigen unspecified) HIV-1 Hepatitis A Hepatitis B Hepatitis B measles mesyles Syphilis non-treponemal antigen IgA--human antibody 160, 000 Total IgA (antigen not specified) IgM--human antibody 950,000 Total IgM (antigen not specified) Hepatitis A Hepatitis B Deterioration of collected samples In order to suppress the lowest decrease in container for storing the pad after using hypertonic solution of the present invention, previously added preservative. This preservative inhibits the activity of proteolytic enzymes that can cause the destruction of antibody molecules. Compounds considered as preservatives include antibacterial agents, antifungal agents, antibacterial agents, antifungal agents, enzyme inhibitors and the like. According to one preferred embodiment, the antifungal agent is benzoic acid, sorbic acid, or a salt thereof. Further, as the bacteriostatic agent, a high-concentration salt or a compound capable of maintaining the hypertonic solution at a low pH value is considered. Those salts include thimerosal (or merthiolate), phenylmercuric acetate, phenylmercuric nitrate, and sodium azide. Still other preferable preservatives include preservatives usually used for medical treatment and gargle. For example, ethyl alcohol, chlorhexidine gluconate. Another type of preferred germicide is a detergent that is used as a topical germicide or is used for gargling. An example is benzalkonium chloride. These preservatives are preferably used in the range of about 0.01 to about 0.2% by weight. According to the present invention, a pad is used to adsorb mucosal secretions from the oral cavity. The pad is made of a material that can be effectively absorbed in the oral cavity. The adsorbent material may be plastic or a carbohydrate such as cellulose, but a preferred material is thick absorbent cotton paper. An example of a thick absorbent cotton paper is product # 300 manufactured by Schliker & Schuell, Inc. of Keene, NH. The pad is preferably not in the form of foam or sponge. However, it is not impossible to use those formats. Most materials for this pad are capable of non-specifically binding proteins. Therefore, it is desirable to use an inhibitor to inhibit the binding, as some may unnecessarily bind immunoglobulin to the pad. Non-specific binding is usually not a problem when collecting blood samples. This is because blood itself contains an inhibitor (eg, human serum albumin). In order to reduce non-specific binding when collecting a sample in the oral cavity, an inhibitor can be added to the hypertonic solution and impregnated in the pad. The inhibitor is usually a soluble protein and prevents other proteins from non-specifically binding to the solidified surface. Compounds that can be added as inhibitors are albumin and gelatin, but non-toxic water soluble non-toxic proteins can also be used. However, the condition is that the protein does not adversely affect the antibody molecule. Preferred is bovine gelatin. Usually, the inhibitor is a solution with a concentration of about 0.01 to about 0.2% by weight. The solution is impregnated into the pad by dipping or spraying and then dried. In order to collect a sample in the oral cavity, a pad may be put into the mouth using a holder. The pads and holders are shown in the figure. The holder 1 may be a hollow plastic rod having a groove 2 at one end. The pad 3 is inserted into the groove, and the holder 1 is operable to insert the pad into the oral cavity, preferably sandwiched between the lower gum and cheek. By sandwiching the pad between the lower gum and cheek, secretions from gingival lymphoid tissue, submucosal lymphoid tissue and salivary lymphoid tissue can be easily adsorbed. The specimen is preferably collected by rubbing the pad on the gums and cheeks for about 10 seconds and then reciprocating back and forth, and then holding the pad at an appropriate position for about 2 minutes. Pads should not be chewed. This is because saliva secretion is unnecessarily stimulated when chewing. After collecting the sample, the pad is stored in the container until immunoassay is performed. One type of container is shown in FIGS. 1 and 2. The container preferably has a centrifuge tube on the outside and an inner tube inside which is inserted into the centrifuge tube. The pad is inserted into the inner tube and secured therein with the inner tube cap. FIG. 1 shows an assembly modified for use with the present invention. The container 2 comprises a centrifuge tube 4, an upper tube or container 7 and a stopper or stopper 11. The centrifuge tube 4 has a tapered lower end or base 5 with a recess 6 tapering downwards. Solids are accumulated in the recess 6 during centrifugation. The upper tube or container 7 has an annular flange 8 projecting radially outward and a cylindrical upper part 9 at the upper end. Since the cylindrical upper part 9 and the stopper 11 have the same size and shape as the upper part of the centrifugal separation tube 4, they form the same curved surface as the outer surface of the centrifugal separation tube 4, and the assembly has a uniform appearance. Have However, this feature is not important to the invention. The bottom 13 of the container 7 is provided with holes 17 so that liquid can flow from the container 7 into the centrifuge tube 4 when the entire assembly is subjected to centrifugation. The container 7 is made of polyethylene, glass or other suitable material. Similarly, stopper 11 is made of a suitable material such as polyethylene, as is well known in the art. The hole 17 is provided with a removable plug 19. The stopper 19 is made of a suitable material such as wax or plastic. A preservative liquid 21 is placed in the container 7. The preservative liquid 21 is added by putting the pad in the inner tube. This preservative solution has a function of inhibiting the activity of an enzyme that destroys antibody molecules, or a function of a bactericide. Compounds to be placed in the inner tube as antiseptics include antibacterial agents, antifungal agents, bacteriostatic agents, antifungal agents, enzyme inhibitors and the like. As the antibacterial agent, it is preferable to use chlorhexidine gluconate or thimerosal. As the preservative liquid to be put in the inner pipe, only one kind of preservative may be used, or a plurality of kinds of preservatives may be used in combination. Generally, the concentration of preservatives is such that bacterial contamination is limited and does not adversely affect the immunoglobulin adsorbed on the pad. The preservative solution contained in the inner tube may also contain a detergent that promotes separation of the antibody from the pad during centrifugation. A preferred detergent is Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monooleate), which also has the function of preventing non-specific binding of antibodies to the solidified surface. A preferred combination is about 0.01 to 0.2% chlorhexidine gluconate and about 0.2 to 0.7% Tween 20. The most preferred combination is about 0.1% chlorhexidine gluconate with about 0.5% Tween 20. After adding the preservative solution into the inner tube, insert the cap of the inner tube and seal the contents. The pad can thus be stored for several days before the immunoassay is performed. In the case of this embodiment, the pads 3 on the holder 1 are used as described above. After the pad 3 is taken out of the subject's mouth, the stopper 11 is removed from the container 7 and the pad is put into the container 7. The holder 1 is folded outside the mouth of the container 7 so as to project upward from the container. Then, the stopper 11 is closed again. Since the stopper 11 is hollow, the end of the folded holder 1 extends into the stopper and the container 7 is reliably sealed. It is preferable that the holder 1 is provided with a notch at an appropriate position so that it can be easily folded. When the pad 3 is inserted into the container 7, it absorbs at least a part of the preservative liquid 21. The pad 3 is stored in the container 7 until the assay is performed. In the laboratory, the stopper 11 is fixed in place, the container 7 is inverted, the seal 19 made of wax or other suitable material is removed and inserted into the centrifuge tube 4. Then, the whole assembly 2 is subjected to centrifugation, and all the liquids including the antiseptic solution, saliva and the like flow into the centrifuge tube 4 through the hole 17. The assay is performed using a known technique. A kit can be prepared in order to simplify the work of collecting and analyzing a sample of the oral cavity using a pad-based collection system. This kit is a combination of a pad and the instruments used to collect and prepare oral specimens for analysis. One preferred embodiment of this kit consists of treated pad 3, holder 1, container 7 and stopper 11, preservative 21 for storage. A centrifuge tube 4 can be optionally added to this. Another container according to the invention for storing the collected sample for subsequent assay has an open upper end adapted to be sealed by a removable stopper and a lower end having an opening communicating the interior of the container with the outside. Have This opening is closed by a nipple that can be easily broken off during storage of the sample, and is opened when the collected sample is taken out for the subsequent assay. For ease of use and safety for the user, the distal end of the nipple is enlarged and preferably spherical. The open upper end is sealed with a preferably "screw""plugseal" cap. In addition, the container bottom, which is inclined toward the central opening, is provided with a plurality of upright webs, and the pad disclosed in the above-mentioned application number 641739 is attached to the container bottom to It is designed not to block the opening. The container is sized for insertion into a standard 15 ml conical centrifuge tube. This allows the nipple to be broken off and then centrifuged to transfer the contents of the container into the centrifuge tube. A predetermined amount of preservative liquid (about 0.5 to about 2.0 ml) is put in the container. When the pad is inserted into the container, the preservative liquid is absorbed by the pad. The container containing the preservative solution must be kept at a low water vapor transmission rate, since it can be stored for up to one year without significant loss of the solution volume. The container is made of a suitable plastic such as polyethylene, polycarbonate, PET (polyethylene terephthalate), polypropylene, EPC (ethylene propylene copolymer), or the like. Polycarbonates are the least desirable because they are too "breathable", that is, they allow moisture to escape. The preferred material is polypropylene. The container of this embodiment having an elongated body portion 12 is shown generally at 10 in FIGS. The body portion 12 is generally cylindrical, but preferably tapers slightly from the top to the bottom 15. The upper end 16 is open and has threads 18 for screwing the cap. A nipple 20 extends downward from the bottom portion 15. The bottom 15 is preferably slightly inclined at an angle α from the outside to the center. The angle α is preferably about 20 °. A recess 22 is formed in the center of the inside of the bottom portion 15, preferably in a V shape, at an angle of about 88.50 °. The recess 22 is provided to weaken the base end portion of the nipple 20 so that the nipple can be broken off if sufficient pressure is applied. The spherical portion 24 formed at the distal end of the nipple 20 allows the foldable nipple 20 to be easily and safely broken off. A plurality of upstanding webs 26 are provided so that the pad inserted into the container 10 does not stick to the outflow location at the bottom created by breaking off the nipple 20. It is preferable to provide four webs 26. The cap is shown generally at 28 in FIGS. 5, 6 and 7. The cap 28 seals the open upper end 16 of the container 10. The cap 28 is of the type also commonly known as a "plug seal". The cap 28 is provided with internal threads 30 which cooperate with the threads 18 of the container. An annular space 34 is formed by the annular recess 32. The annular space 34 is partitioned by the annular recess 32 and the inside of the outer wall 36. The container wall is therefore fitted into the annular space 34 and is perfectly sealed. The outer surface of the cap 28 is knurled as shown in the drawing, and is easily attached and detached. The container 10 is used in the same manner as the embodiment of FIGS. 1 and 2. The following example illustrates the effect of the pad of the present invention. Example 1 Comparison of IgG between saliva and mucosal exudates The purpose of this experiment is to compare IgG levels between saliva and mucosal exudates. Buccal samples were collected from 10 subjects. The subject's saliva was collected by chewing an "adsorbent," a cotton plug, commercially available as part of the Sarstedt Salivet ™ kit, until saturated with saliva. Then, about 4 hours later, a mucosal exudate was collected from the subject by collecting oral fluid using a treated pad described in World Intellectual Property Organization No. 91/13355. After collecting saliva and exudate, the liquid was separated from the cotton plug and pad by centrifugation. This oral sample was analyzed using an enzyme immunoassay to examine the presence or absence of IgG antibody. Table 1 shows IgG levels collected by cotton plugs and treated pads. The sample collected by the treated pads of the World Intellectual Property Organization. No. 91/13355, from saliva specimens obtained by chewing "adsorbent" of Sasutetto-Sarivetto TM-kit, about 25-fold more IgG The antibody was included. Example 2 Comparative Experiment of Treated Pads of World Intellectual Property Organization No. 91/13355 and Untreated Pads of the Present Invention All four pads, two treated pads and two untreated pads, were applied to each volunteer. It was used to collect oral specimens from test subjects. Each collection (two homologous pads taken simultaneously) lasted 2 minutes. After the first collection, the subjects were rinsed with tap water for at least one and a half hours before the next collection. Subjects were divided into two groups during the experiment. From half of the subjects, oral samples were taken first with two untreated pads, then with two treated pads, and from the other half, first with two treated pads, then Harvesting was performed on two untreated pads. After collection, the subject placed the pad in a vial labeled with the sample number and the type of pad used for collection (treated or untreated). The stick was broken off and the vial was sealed. Specimens were kept at 4 ° C during centrifugation. After centrifugation, oral specimens collected from each subject with two homologous pads were stored together. The sample was stored at 4 ° C. Each stored sample was assayed for total IgG using EIA of Epitope Co., and IgG in each sample was quantified. Analysis by our IgG-specific enzyme immunoassay (EIA) revealed that the sample collected with the treated pad contained higher levels of immunoglobulin G (IgG) than the sample collected with the untreated pad. It can be concluded from the analysis of specimens collected by the pad of World Intellectual Property Organization No. 91/13355 and Sarstedt's "adsorbent" that IgG collected on the pad is from mucosal exudate and saliva. The difference, not from, is that it is significant. Further, it can be concluded from the analysis of the samples collected by the treated pad of World Intellectual Property Organization No. 91/13355 and the untreated pad of the present invention that the IgG value collected by the untreated pad is Although lower than that of the treated pad, the untreated pad still yields significantly higher levels of IgG than expected to be taken from saliva (5.3 μg / ml). 2.4 μg / ml).
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フロントページの続き
(72)発明者 ガボジュデア，ステファン
アメリカ合衆国 97223 オレゴン州ティ
ーガード，エス．ダブリュ．ミルビュー
クレスセント 12154
(72)発明者 ゾッグ，デビッド エフ.
アメリカ合衆国 97223 オレゴン州ティ
ガード，エス．ダブリュ．フェアービュー
コート 13775────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(72) Inventor Gabojudea, Stefan
United States 97223 Tee, Oregon
-Guard, S. W. Mill view
Cress cent 12154
(72) Inventor Zog, David F.
United States 97223 Tee, Oregon
Guard, S. W. Fair view
Coat 13775