【発明の詳細な説明】
細胞の分離、同定および／または分析のための生存性プローブ技術分野
本発明が提供する生存性プローブは、充実性腫瘍または非付着性の腫瘍を分析
するために、独立して使用することができ、またはモノクローナル抗体パネル中
に含有させるのに有用である。背景技術
生存していない、透過性が亢進された細胞は、フローサイトメトリー分析に際
して、顕著な阻害の原因となっている。この阻害を一次的にもたらしているのは
、分化抗原形質発現（１３）、生化学的変化（例えば、自発蛍光の増大）（２４
）、および細胞死を伴う膜の透過亢進に起因するプローブの非特異的な摂取およ
び結合（６、１５、２０、２２）である。従って、生存細胞の精密な分析のため
には、生存していない細胞の排除が必要である（２０）。
細胞死の二種類の最も特徴的な過程は、壊死およびアポトーシスである（１、
３、５、９、１３、１９）。壊死は、典型的には、酸素圧低下または細胞毒性因
子のような細胞外の条件によって引き起こされ、代謝系の崩壊、細胞膨潤化、溶
菌および周囲の組織の炎症という順序によって特徴付けられる（１、５、７、９
、２３）。一層一般的な現象であるアポトーシス（１、１０）は、プログラムさ
れた細胞死に関連しており、細胞の収縮、クロマチン濃縮および開裂、および最
終的には膜の透過性の亢進という順序によって特徴付けられる（１、３、５、７
、９、１０、１３）。染色中の細胞が透過亢進するのにつれて、これらの細胞の
形態と屈折率との変化によって、これらの細胞の光散乱特性が著しく変化し、膜
の一体性が失われることによって、通常は不透過性のプローブの摂取が可能にな
る。
最も一般的に使用されているフローサイトメトリー法による細胞死の識別技術
は、三種類の主要なカテゴリーに分けることができる：（１）物理的分離法、（
２）微分光散乱法および（３）蛍光プローブによる分染法である。これらの技術
は大きくは膜の透過亢進の測定方法であり、この現象が細胞死に等しいことに基
づいている（６、１３）。
従って、明らかに、試料を透過亢進剤によって処理すると、試料の貯蔵、細胞
内標識、またはバイオハザードの制御のためにしばしば必要なことであるが、自
然に透過亢進した死亡細胞を、人工的な透過亢進の前には生存していた細胞から
識別するという、著しい挑戦がもたらされる。これらの薬剤は、細胞の形態およ
び屈折率を劇的に変化させ、生存している細胞と死亡した細胞、更には相異なる
型の細胞の光散乱特性に同一性をもたらす。更に、透過亢進剤によって、透過亢
進の前には生存していた細胞を含むすべての細胞に、この溶液中に過剰に存在し
ているあらゆるプローブや、前に染色された死亡細胞から外部へと漏れだしたあ
らゆるプローブを摂取させる。この結果、一般的に、固定化および透過亢進によ
って、死亡細胞を識別するための二種類の最も一般的な新鮮調製技術、即ち、光
散乱に基づいた電子的ゲート制御と膜不透過性プローブの摂取との使用が、排除
される。
このように、透過亢進に先立って死亡していた細胞を識別する必要性があり、
またこれを実施するのに適した技術が欠如していた。パーコールおよびフィコー
ル密度勾配分離法のような物理的分離技術によって、浮遊密度が相異なることに
基づいて、生存細胞を死亡細胞から分離することができるが（５）、しかし純度
および回収率に幅広いバラツキが見られること、選択的な細胞損失があること（
１１）、およびある環境下においては細胞毒性が見られること（２１）という不
利益を有している。光散乱に基づいた死亡細胞の識別は、しばしば、充実性腫瘍
のような異種細胞の混合物に対しては適用できない。これはある種の死亡細胞が
、異なる種類の生存細胞の光散乱特性に類似した光散乱特性を有しうるからであ
る（１５、２０）。最後に、既知の蛍光生存性プローブ（例えば、ヨウ化プロピ
ジウム、フルオレセイン ジアセテート等）のほとんどは、透過亢進剤の使用と
和合性であるとは考えられておらず、これは基本的に結合が弱いかまたは可逆的
であるために、プローブが、染色細胞から、人工的に透過亢進された非染色細胞
中へと漏れだしうるからである（１５、２０）。
ポラック等は、エタノールで固定化された試料中で、ＰＩを使用して、死亡細
胞を識別することに成功したことを報告した（１４）。
本発明は、次の基準を確立するような、充実性腫瘍モノクローナル抗体パネル
中に含有させるための生存性プローブを提供するものである：広範な細胞型特異
性；生存細胞の非特異的な染色が少ないこと；死亡細胞の染色について信号／ノ
イズ比率が高いこと；透過亢進手順に耐えるのに十分なほど高い親和性をもって
、死亡細胞中で結合すること；および、励起および発光スペクトルが、充実性腫
瘍パネル中で他の染料と和合性であること。発明の開示
従って、本発明の課題は、充実性腫瘍、好ましくは胸部腫瘍を分析するために
、モノクローナル抗体パネル中に含有させるのに有用な、生存性プローブを提供
することである。
本発明の更に他の課題は、相対的に安定な細胞内抗原を対象とする生存性プロ
ーブを提供することである。
本発明の更なる課題は、劣化したクロマチンを含有する後期アポトーシスおよ
び壊死細胞（タイプＩＩＩ）についての情報を提供するような、生存性プローブ
を提供することである。
本発明の更なる課題は、天然のクロマチンを含有する透過亢進細胞（タイプＩ
）についての情報を提供するような、生存性プローブを提供することである。
本発明の他の課題は、試料の貯蔵、バイオハザードの制御、または細胞内標識
に対してしばしば必要とされるような固定化および透過亢進手順に対して耐性で
あるという、顕著な利点を有する生存性プローブを提供することである。
本発明の他の課題は、あらゆる広範な系列の入手可能な蛍光団に対して接合し
うる抗体プローブを提供することである。
本発明の生存性プローブは、本出願と同時に提出された、「多重パラメーター
フローサイトメトリーによる充実性腫瘍の分析」と題された、１３９，６４６号
のドケットナンバーを有する出願の方法において採用しうる。この出願を、ここ
で参照することによって、本明細書中に包含する。
本発明の更なる目的、利点および新規な特徴は、部分的には続く明細書の中で
説明し、部分的には、以下を審査する際に本分野の当業者にとって明確となるで
あろうし、または本発明の実施に際して学びうる。本発明の目的および利点は、
添付した特許請求の範囲において特に指摘した装置および組み合わせによって、
認識でき、達成できる。図面の簡単な発明
ここで、本発明の好適な実施形態を実施例によって、本明細書に添付した図面
を参照しながら説明する。ここで、
図１は、試料の処理のフローチャートを示し；
図２は、処理していない細胞の光の散乱（ＬＴ散乱）およびＰＩ染色と、実験
的な生存性プローブであるアクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ（アクチン−ＳＦ）、サ
イトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ（ＣＫ−ＳＦ）、７−ＡＡＤ、およびＴＯ−Ｐ
ＲＯ−３による処理細胞の染色との対比を示し；
図３は、処理していない（ＰＩ固定化されていない）細胞の光の散乱（ＬＴ散
乱）およびＰＩ染色と、実験的な生存性プローブであるＬＤＳ−７５１（ＬＤＳ
）、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ（チューブリン−ＳＦ）、ＥＭＡ、および
ＰＩ（ＰＩ固定化）による処理細胞の染色との対比を示す。本発明の実施形態
充実性腫瘍には共通にしばしば大規模なアポトーシス集団と壊死集団とが発生
し、腫瘍細胞の精密なフローサイトメトリー分析に対して顕著な障害となってい
る。実際のところ、特に大きな腫瘍や貯蔵試料においては、生存中の腫瘍細胞が
、全細胞集団のうちのほんの僅かな小部分であることは、まったく起こり得るこ
とである。これらの生存腫瘍細胞を同定し、分離できるようになるまでは、誤っ
た免疫表現型およびＤＮＡ分析の可能性があるために役にたたず、これは相異な
る細胞型および死亡細胞の自発蛍光のバックグラウンドが幅広く変化すること、
非特異的な細胞表面への抗体の結合、非特異的な抗体の摂取、および死亡した細
胞中におけるクロマチンの劣化に起因している。
本発明で提供する生存性プローブは、充実性腫瘍、好ましくは胸部腫瘍を分析
するために、モノクローナル抗体パネル中に含有させるのに有用である。
本発明者が見いだしたところでは、本発明の生存性プローブは、充実性腫瘍中
に見いだされる幅広い細胞に対して情報を与えるという点で十分に広範囲の細胞
型特異性を示し（４）；非特異的な結合が少なく；染色および透過亢進手順に耐
えるのに十分なほど強固に特異的に結合し；死亡細胞が崩壊する前（光の散乱に
基づいて残滓を識別できるか、またはゲートから出せる時点）に充実性腫瘍中で
耐えうる時間の間、情報が得られるようにするために、高くかつ安定な蛍光強度
を示し；および、腫瘍抗体パネルを構成する四種類の他の蛍光プローブに対して
親和性を有している。
本発明者が発見したところでは、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣが、前記の
基準のすべてを満足するようである。すべての真核細胞中にチューブリンが存在
することによって（１８）、腫瘍異質性の問題が回避され；このプローブは、生
菌に対する非特異的な結合性を、僅かしか示さないか、まったく示さず、透過亢
進された細胞中におけるプローブの結合は、染色および透過亢進手順に耐えるの
には十分に強固であり；その信号／ノイズ比率は、細胞の回収後１５日間にわた
ってさえも、自発蛍光からこの蛍光を明瞭に識別するのに十分なほど高く、その
蛍光強度は、この時間経過の間に比較的にゆっくりと消失し；かつこのプローブ
は、腫瘍抗体パネルを構成する他のプローブと和合性である。サイトケラチン−
ＳＡＭ−ＦＩＴＣは、上皮細胞のみに対して特異的であることを除けば、すべて
の点で満足できた。アクチン、ＥＭＡ、および７−ＡＤＤは、全時間経過の間に
わたって、十分に高い信号／ノイズ比率を示さなかった。ＴＯ−ＰＲＯ−３、Ｌ
ＤＳ−７５１、およびＰＩ（処理された細胞）は、生存している細胞と死亡した
細胞との双方を同じように染色するので、本出願における生存に関しては情報を
与えない。
膜の透過亢進が、壊死の際にはクロマチン劣化よりも先行し、アポトーシスの
際にはクロマチン劣化に続くという、最近の報告は（１、５、７、１３）、表１
に示すように、死亡細胞に少なくとも三種類のはっきりとした型が発生すること
を意味している。
本発明は、こうしたカテゴリー分類を支持している。ＤＮＡ−特異的プローブ
による染色が、細胞死の開始時に最も強く、集菌後の細胞齢が増加するのにつれ
て、減少するという事実から、Ｉ型およびＩＩＩ型の死亡細胞の存在が示唆され
ている。ＩＩ型の死亡細胞の存在を、生膜および劣化したクロマチンと共に、予
期させるのは、低い前方散乱を有する（アポトーシスに際して、細胞容積の減少
がクロマチンの劣化に先行することを示唆している）（７）細胞の百分率が、生
存性プローブ（処理された細胞中のＴＯ−ＰＲＯ−３、ＬＤＳ−７５１、および
ＰＩを除く。これらのすべては生存細胞と死亡した細胞とを区別することなく染
色した）に対して陽性の細胞の百分率よりも定常的に高い（表２および表３）こ
とである。
更に、本発明の生存性プローブが対象としている相対的に安定な細胞内抗原は
、劣化したクロマチンを含有するアポトーシス後期および壊死後期の細胞（ＩＩ
Ｉ型）に対して、更には天然のクロマチンを含有する透過亢進された細胞（Ｉ型
）に対して、伝統的なＤＮＡ特異的な生存性染料（例えば、ヨウ化プロピジウム
）よりも一層有用な情報を与えることが証明されている。本発明は、試料の貯蔵
、バイオハザードの制御または細胞内標識のためにしばしば必要とされるように
、固定化および透過亢進手順に対して耐性であるという、顕著な利点を有してい
る。最後に、本発明は、広範な系列のあらゆる入手可能な蛍光団に対して結合し
うる
抗体プローブの使用を教示しており、これは固定された、しばしば広範囲の発光
スペクトルを有するもっと伝統的な染料プローブよりも、広い適用の可能性を有
している。
本発明の好適な実施形態においては、生存性プローブがサイトケラチンである
。本発明の最も好適な実施形態においては、この生存性プローブがチューブリン
である。
本発明は、下記のような二種類の時間系列の研究を提供しており、ここで、腫
瘍細胞系を誘起させて細胞の酸素圧低下の条件に入り、充実性腫瘍の内部の酸素
圧低下環境を刺激することを意図しており、ここで多数の生存性プローブによる
これらの染色の度合いを比較する。最初の研究が関連しているのは、標準として
、透過亢進なしの、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によるＭＤＡ（胸部腫瘍）細胞
系の染色であり、および、透過亢進を伴う、抗−アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、
抗−サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−
ＡＡＤ；高親和性のＤＮＡインターカレーターであり、約６５０ｎｍに発光最大
値を有する）（１６、１７）およびＴＯ−ＰＲＯ−３（膜不透過性の、高親和性
のＤＮＡインターカレーターであり、６６１ｎｍに発光最大値を有しており、核
酸に結合されたときを除いて、最小の蛍光を有する）によるＭＤＡ（胸部腫瘍）
細胞系の染色である。第二の研究に含まれるのは、標準としての、透過亢進なし
のＰＩによるＭＤＡ細胞の染色であり、および、透過亢進を伴う、抗−チューブ
リン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、臭化エチジウム モノアジド（ＥＭＡ、光活性化され
た、共有結合しているＤＮＡインターカレーターであり、約６００ｎｍに発光最
大値を有している）（１５）、ＬＤＳ−７５１（生体核酸染料であり、６７０ｎ
ｍに発光最大値を有している）（２０）およびＰＩによるＭＤＡ細胞の染色であ
る。
材 料
ＰＢＳ、リゾホスファチジル コリン、「ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）
」、トリパン ブルー、抗−α−平滑筋アクチン モノクローナル抗体、および
７−アミノアクチノマイシン Ｄ（７−ＡＡＤ）を、シグマケミカル コーポレ
ーション（ミズーリ州、セントルイス）から入手した。ＦＢＳおよび純メタノー
ルを、
ハイクローン社（ユタ州、ローガン）およびＪＴベーカー インコーポレーテッ
ド（ニュージャージー州、フィリップスバーグ）からそれぞれ入手した。ヨウ化
プロピジウム（ＰＩ）染料（ＤＮＡ調製キットから；５０μｇ／ｍｌのＰＩ、４
ＫＵ／ｍｌのウシ膵臓ＩＩＩ型ＲＮＡｓｅ、０．１％のＮａＮ3、生理的食塩水
および安定化剤）および抗−サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣモノクローナル
抗体は、クールターコーポレーション（フロリダ州、マイアミ）から入手した。
抗−α−チューブリンは、ザイムド ラボラトリーズ インコーポレーテッド（
カリフォルニア州、サンフランシスコ）から入手した。ＦＩＴＣ−結合ヒツジ０
抗−マウスＦ（ａｂ’）フラグメント（ＳＡＭ−ＦＩＴＣ）は、サイレナス ラ
ボラトリーズ（オーストラリア、ビクトリア）から入手した。臭化エチジウム
モノアジド（ＥＭＡ）およびＴＯ−ＰＲＯ−３を、モルキュラー プローブス
インコーポレーテッド（オレゴン州、ユージーン）から入手した。ＬＤＳ−７５
１をエクサイトン社（オハイオ州、デイトン）から入手した。
細胞培養物
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ乳癌腫瘍細胞系（アメリカン タイプ カルチ
ャー コレクション、メリーランド州ロックビル）の単層培養物を、１０％ウシ
胎児血清（ハイクローン社、ユタ州ローガン）を補充した高グルコースＤＭＥＭ
（バイオホイットテイカー社、メリーランド州、ウオーカーズビル）中で、３７
℃で、加湿雰囲気中で５％ＣＯ2で成長させた。この培養物を、回収に先立って
対数成長条件の下に維持した。本明細書で示した時間系列研究のそれぞれについ
て、細胞を毎日回収し（週末を除く）、次いで、固く封をした状態で、３７℃で
、加湿雰囲気中で５％ＣＯ2で保持し、腫瘍内の酸素圧低下を刺激した。各研究
において、１２回の連日の細胞の回収に際して、各バッチからの試料を、フロー
サイトメトリー分析のために処理した。
細胞の染色
本発明者等の充実性腫瘍のモノクロナール抗体パネル中に含有させるための生
存性プローブを評価するために、充実性腫瘍の表面及び核内を同時に染色するた
めに、本発明者等の実験室で採用されている手順に従って、試料を処理した。
それぞれの時間経過研究において、１２個の毎日（週末を除く）の細胞のバッ
チの最後のものを回収した後に、トリパンブルーによる生存性染色および顕微鏡
的評価のために、各バッチから分割試料（アリコート）を採取した。次いで、各
バッチからの細胞を、１試験当り１×１０6個の細胞の割合で、１２×７５ｍｍ
のシリコン化されたガラス製の試験管内に分割した。各実験において、試料を２
つの集団に分けた：標準として、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によって染色すべ
き非処理（即ち、下記の充実性腫瘍染色処理によって処理されていない）系列、
および、他の生存性染料によって染色され、下記の充実性腫瘍染色処理（図１）
によって処理されるべき系列とである。このようにして、研究１においては、Ｍ
ＤＡ細胞の毎日の回収物（０日の最も若い細胞から、１５日の最も古い細胞にわ
たる）について、７種類の試料（非処理の非染色の対照例；非処理のＰＩ染色し
た標準；処理された、非染色の対照例；及び、アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、サ
イトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、７−ＡＡＤ、又はＴＯ−ＰＲＯ−３のいずれ
かによって染色された４種類の処理された試料）が存在していた。研究２におい
ては、ＭＤＡ細胞の毎日の回収物についてやはり７種類の試料（非処理の非染色
の対照例；非処理のＰＩ染色された標準；処理された非染色の対照例；およびチ
ューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、ＥＭＡ、ＬＤＳ−７５１又はＰＩによって染色
された、４種類の処理された試料）が存在していた。銘記すべきことに、むしろ
イソタイプの対照例よりも、染色されていない細胞をここでは使用し、抗体標識
細胞に対する蛍光のバックグラウンドを確立した。細胞の内側での抗体染色の強
度は、標的抗原に対する特異的な結合、非特異的な抗体の結合、抗体の捕捉、お
よび染料それ自体の非特異的な結合を含む、複数の因子が組み合わされた結果で
ある。明らかに、標的抗原に対する特異的結合の測定が目的である場合には、イ
ソタイプの対照例を使用して、非特異的な蛍光の水準を評価しなければならない
。しかし、この場合におけるように、目的が、単に蛍光抗体の摂取によって生存
細胞から透過性が亢進された細胞を識別することである場合には、抗体が摂取さ
れればされるほど（特異的であろうと、非特異的であろうと）、識別が良好とな
る。本出願における識別因子は、特異的であるよりも、むしろ全体的であるので
、蛍
光性のイソタイプの対照例は不要である。
細胞を分割した後には、ＰＩによって染色されるべき処理されていない系列と
、これらの染色されていない対照例とを、５００×ｇで５分間、室温で遠心分離
し、デカンテーションした。染色されていない対照例を、２．５％ＦＢＳ（ＰＢ
ＳＦ）を補充したＰＢＳに再懸濁し、このＰＩ染色された試料を、１ｍｌ中に再
懸濁し、フローサイトメトリー分析に先立って、暗中で室温で２０分間インキュ
ベートした。この残りの試料を上記のように遠心分離し、デカンテーションした
。染色されていない対照例と、７−ＡＤＤ、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＬＤＳ−７５１
、ＥＭＡまたはＰＩによって染色されるべき細胞とを、２００μｌのＰＢＳＦ中
に再懸濁させ、１５分間室温でインキュベートした。この残りの試料を、ＰＢＳ
Ｆ（蛋白質の濃度は不明）中のアクチンの１：２００の希釈液、ＰＢＳＦ（蛋白
質の濃度は不明）中のチューブリンの１：２００の希釈液、またはＰＢＳＦ中の
２５μｇ／ｍｌのサイトケラチン（３種類の抗体に対する最適用量は、先に滴定
によって決定したが、データは示していない）のいずれかの各２００μｌの中に
再懸濁し、１５分間室温でインキュベートした。次いで、すべての試料を、それ
ぞれ２ｍｌのＰＢＳによって洗浄し、上記のように遠心分離し、デカンテーショ
ンした。次いで、染色されていない対照例を、２００μｌのＰＢＳＦ中に再懸濁
させ、１５分間室温でインキュベートした。アクチン、チューブリンまたはサイ
トケラチンによって染色された試料を、ＰＢＳＦ中の４８．８μｇ／ｍｌのＳＡ
Ｍ−ＦＩＴＣを２００μｌ中に再懸濁させ、室温で１５分間、暗中でインキュベ
ートした。７−ＡＤＤで染色された細胞を、試験当たり１ｍｌの２５μｇ／ｍｌ
の７−ＡＤＤ（４９．７５ｍｌのＰＢＳＦ中の２５０μｌの貯蔵溶液：貯蔵溶液
は、メタノール中に５ｍｇ／ｍｌである）中に再懸濁させ、暗中で、１５分間、
室温でインキュベートした。ＴＯ−ＰＲＯ−３で染色された細胞を、１ｍｌ／試
験のＰＢＳＦ中の５μＭのＴＯ−ＰＲＯ中に再懸濁させ、暗中で、１５分間、室
温でインキュベートした。ＬＤＳ−７５１で染色された細胞を、１０μｌの２μ
ｇ／ｍｌのＬＤＳ−７５１を含有する試験当たり１ｍｌのＰＢＳＦ（４．９５ｍ
ｌのＰＢＳＦ中の５０μｌの貯蔵溶液：貯蔵溶液は、メタノール中に１ｍｌ当た
り０．２ｍｇのＬＤＳ−７５１である）中に再懸濁させ、暗中で、１５分間、室
温でインキ
ュベートした。ＥＭＡで染色された細胞を、５μｇ／ｍｌのＥＭＡを１０μｌ／
試験（４．８７５ｍｌのＰＢＳＦ中の１２５μｌの貯蔵溶液：貯蔵溶液は、メタ
ノール中に１ｍｌ当たり０．２ｍｇのＥＭＡである）中に再懸濁させ、１５分間
、室温で、蛍光ライトバルブから２０ｃｍ離れた位置でインキュベートした。Ｐ
Ｉで染色された細胞を、処理されていない細胞に使用したのと同じＰＩ溶液を１
ｍｇ／試験の中に再懸濁し、暗中で、１５分間、室温でインキュベートした。次
いで、すべての試料を上記のように洗浄し、次いで２００μｌ／試験のＰＢＳＦ
中に再懸濁させ、１５分間、暗中で室温で（腫瘍試料の表面の抗原染色を刺激す
るために）インキュベートした。次いで、すべての試料を上記のようにして２回
以上洗浄した。この上澄み液をデカンテーションした後、各試料を、１％パラホ
ルムアルデヒド中の２０μｇ／ｍｌの２５℃のリゾホスファチジル コリン１ｍ
ｌ中に再懸濁させ、２分間、室温でインキュベートし、５００×ｇで５分間室温
で遠心分離し、デカンテーションした。次いで、これらの試料を、１ｍｌ／試験
の−２０℃の純メタノール中に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートし、次
いで、上記したように遠心分離した。デカンテーションの後、試料を、１ｍｌ／
試験の４℃の０．１％ＮＰ４０中に再懸濁させ、氷上で５分間インキュベートし
、次いで上記のように遠心分離した。デカンテーションの後、試料を、２００μ
ｇ／試験のＰＢＳＦ中に再懸濁させ、暗中で１５分間室温で（腫瘍試料の細胞内
の抗原染色を刺激するために）インキュベートし、次いで上記のように洗浄した
。最後に、試料を、フローサイトメトリーに先立って、１ｍｌ／試験のＰＢＳＦ
中に再懸濁させた。
フローサイトメトリー
５個のフォトマルチプライヤーチューブおよび３個のレーザー（水冷の５Ｗの
アルゴンレーザー、１５ｍＷで作動する空冷の４８８ｎｍのアルゴンレーザー、
および１０ｍＷの空冷式の６３３ｎｍのヘリウム−ネオンレーザー）を備えてい
る「ＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ」フローサイトメーター（コールター コーポレー
ション、フロリダ州、マイアミ）で、試料を分析した。ＴＯ−ＰＲＯ−３で染色
された試料を、６３３ｎｍの励起で分析し；他のすべての試料を、空冷されたア
ルゴンレーザーによって、４８８ｎｍの励起で分析した。アクチン−、サイトケ
ラチン−、およびチューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣの蛍光発光を、５５０ｎｍの
ダイクロイックロングパスフィルターによって反射させ、５２５ｎｍのバンドパ
スフィルターを通した。ＰＩおよびＥＭＡ蛍光を、６５０ｎｍのダイクロイック
ロングパスフィルターによって反射させ、６１０ｎｍのバンドパスフィルターを
通した。７−ＡＡＤ、ＴＯ−ＰＲＯ−３、およびＬＤＳ−７５１蛍光は、６５０
ｎｍのダイクロイックロングパスフィルターを通過し、６７５ｎｍのバンドパス
フィルターを通過した。染色されていない対照例の自発発光を、染色された試料
と適合したフィルター装置と同じフィルター装置によって測定した。
各試料についてリストされたフォーマットの中に、５０００個の結果を、前方
および側方散乱の直線的増幅および蛍光の４０の対数的増幅と共に、収集した。
情報の入手と分析とは、「ELITE」ソフトウエアによって実行し；カラーグラフ
ィックスは、「WinList」ソフトウエア（メイン州、トップシャム、ベリティ
ソフトウエアハウス）および「ＥＸＣＥＬ」ソフトウエア（ワイオミング州、レ
ッドモンド、マイクロソフト コーポレーション）によって実行した。
最初の時間経過研究の結果を、図２および表２に示してある。図２において、
最も右側の欄は、対応する列の細胞のバッチを回収後に保持した日数を示してい
る（５、６、１２、１３日目は週末に対応しており、この間は細胞は回収されて
いない）。この次の欄は、各バッチから得られた処理されていない細胞の光散乱
の結果を示している（これらのヒストグラムの各々においては、前方散乱がＹ軸
上にあり、側方散乱はＸ軸上にある）。この残りの欄は、染色されていない細胞
の蛍光ヒストグラムを（緑色で）示し、各欄の頂部上に示されたプローブによっ
て染色された細胞のヒストグラムによって（緑色以外の色で）電子的に重ね合わ
されている。すべての機器のセッティングは、この実験が続く間、変更しないで
保持した。蛍光ヒストグラムは、４０の対数目盛り上にある。すべてのヒストグ
ラムは、５，０００個の自動目盛りの結果を含んでいる。
一般的には、死亡細胞は、前方角度の光散乱の減少を示し、９０℃の光散乱に
増大を示し、（人工的な透過亢進に先立って、または人工的な透過亢進をしない
で）蛍光プローブ（１７）によって染色されたときには、蛍光に増大を示す。従
って、我々の基準を満足するためには、生存性プローブは、図２および図３にお
いて、３つの特性を示さなければならない。（１）生存細胞の染色を示さないか
、ほとんど示さないこと（即ち、図２および図３の第一列中の試験試料の緑色で
ないピークが、染色されていない対照例の緑色のピークに適合していなければな
らず、これらは可能な限り接近して重なっている）；（２）図２および図３にお
いて光散乱によって示されているように、試料中の生存細胞および死亡細胞の割
合に対応する蛍光の二峰性があること（即ち、試験試料中の緑色でないピークが
、光散乱ヒストグラムが生存細胞および死亡細胞の双方の存在を示している列中
（基本的には１〜４日）で二峰性でなけれぱならず、光散乱ヒストグラムが、生
存細胞のみまたは死亡細胞のみの存在を示している列中（基本的には０日および
７〜１５日）では単峰性でなければならない）；および（３）死亡細胞の蛍光染
色が、染色されていない対照例の自発蛍光よりも顕著に明るいこと（即ち、試験
試料の陽性の緑色ではないピークが、これらに重なっている染色されていない対
照例の緑色のピークから、可能な限り遠く離れていなければならない）。強調す
べきことは、各蛍光ヒストグラム中の緑色のピークが、陰性に染色された細胞で
はなく、（緑色以外の色で、染色された試料と電子的に重なっている）染色され
ていない対照例に対応していることである。
図２において、生存細胞の非特異的な染色は、アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣお
よびサイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣに対して最適であり、７−ＡＤＤについ
はてぼやけており、ＰＩについては比較的に明るく、ＴＯ−ＰＲＯ−３について
は非常に明るい。ＰＩ、アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、サイトケラチン−ＳＡＭ
−ＦＩＴＣおよび７−ＡＤＤの蛍光分布は、これらの陰性（生存細胞）および陽
性（死亡細胞）のピークの相対的比率について、光散乱およびトリパンブルーの
摂取（データは示していない）に対応している；ＴＯ−ＰＲＯ−３の蛍光の分布
は、この時間経過の間中、単峰性に止まっていた。本出願に適している３種類の
プローブ（アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣお
よび７−ＡＤＤ）のうち、サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣは、最も高い信号
／ノイズ比率を示し、１５日間にわたって自発蛍光から識別可能であり続ける。
４日目には、アクチン染色も、７−ＡＤＤ染色も、自発蛍光とは顕著に異なって
いた。ＰＩは、その可逆性の結合のために、ＴＯ−ＰＲＯ−３は、生存細胞と死
亡細胞との双方を実質的に区別することなく強く染色することのために、本出願
の生存性プローブとしては受け入れられない。
表２において、研究１で採用した種々の生存性プローブによって陽性に染色さ
れた細胞の百分率は、死亡細胞の低い前方散乱特性および高い側方散乱特性を示
す細胞の百分率に匹敵する。特定のプローブが生存細胞を非特異的に染色したの
で、染色の陽性の百分率は、染色されていない細胞に対してよりも、双峰性の分
布における陰性のピークに対して計算した。双峰性が完全に失われた各欄中の点
では、この表中にダッシュが現れている。興味深いことに、光散乱に基づいた百
分率は、蛍光に基づいた百分率よりも、定常的にかつ顕著に高い。ＰＩ、アクチ
ン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣおよび７−ＡＤＤは
、７−ＡＤＤの分布の双峰性が失われたときに，４日間を通してかなりの陽性を
もたらした。ＰＩ、アクチン、およびサイトケラチンの陽性は、回収の後１５日
を通して、かなりのものであり続けた。この発見が重要である。なぜなら、これ
が示唆するところでは、ＤＮＡ特異性の染料に対して、より大きな寸法の抗体サ
ンドイッチ複合体は、染色を阻害しないからである。この研究の間のＴＯ−ＰＲ
Ｏ−３の単峰性の分布と、その生存細胞の強い染色によって、ここでは染色依存
性についての情報が得られなくなった。蛍光強度の平均チャンネル値も報告され
ている。一般的には、０日後には、生存細胞が優勢であることのために染色が最
小である場合には（ＴＯ−ＰＲＯ−３についてを除く）、すべてのプローブの蛍
光強度が、相異なる速度で減少する。ＰＩおよびＴＯ−ＰＲＯ−３の蛍光強度は
極端な減少を示し、サイトケラチンがこれに続き、アクチンと７−ＡＤＤとが並
んでこれに続く。逆に、自発蛍光（緑色のヒストグラム）は、回収後の細胞齢と
共に、特にスペクトルの緑色の領域においては、定常的に増大する。
第二の時間経過研究の結果を、図３および表３に示す。双方の形式は、図２お
よび表２の形式とそれぞれ同じである。処理されていない細胞の光散乱、自発蛍
光およびＰＩ染色は、図２のものと同様である。図３において、生存細胞の非特
異的な染色は、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣについて最適であり、ＰＩ（処
理された細胞と処理されていない細胞との双方において）、ＬＤＳ−７５１、お
よびＥＭＡについて比較的に高い。処理されていない細胞中のＰＩ、チューブリ
ン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、およびＥＭＡの蛍光分布は、これらの陰性および陽性の
ピークの相対的比率中の光散乱およびトリパンブルーの摂取に対応していた：処
理細胞中のＰＩおよびＬＤＳ−７５１の蛍光分布は、この時間経過の間、実質的
に単峰性に留まっていた。本出願に適している二つのプローブ（チューブリン−
ＳＡＭ−ＦＩＴＣおよびＥＭＡ）のうち、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣは、
最も高い信号／ノイズ比率を示し、１５日間を通して染色されていない細胞から
非常に異なったままであった。７日目には、ＥＭＡの染色と自発蛍光との差が、
０日目における生存細胞中の非特異的染色の水準とほぼ同じであった。ＰＩはそ
の可逆的な結合のために、ＬＤＳ−７５１は、定常的に単峰性の蛍光分布である
ために、本出願の生存性プローブとしては許容できない。
表２におけるように、表３における死亡細胞の光散乱に基づいた百分率は、定
常的にかつ顕著に、蛍光に基づいた百分率よりも高い。処理されていない細胞中
のＰＩ、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣおよびＥＭＡは、この時間経過の間に
わたって、比較的に陽性をもたらした。処理された細胞中のＬＤＳ−７５１およ
びＰＩの分布が定常的に単峰性であるために、ここではこれらは生存性プローブ
依存性については情報を与えない。処理された試料中と、処理されていない試料
中との双方における、ＰＩの平均蛍光強度は、この時間経過の間に急激に減少し
、一方、ＥＭＡおよびチューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣの平均蛍光強度は、ゆっ
くりと減少した。興味深いことには、ＬＤＳ−７５１の蛍光強度は、この時間経
過の間に周期的であるように見え、一方、他のすべてのプローブは、蛍光強度の
直線的な減少を示している。
本明細書中に引用されているすべての引用文献は、本出願が属する技術分野に
おいて、当業者の習熟水準を示す。各引用文献を、本明細書中で各引用文献が引
用された位置で、参照によってそれぞれ本明細書中に包含する。
本技術分野に習熟した者であれば理解できるであろうように、上記の手順およ
び方法においては、特定の試薬および条件を概説したけれども、本発明の思想お
よび範囲によって包含されることを意図する変更を加えることができる。従って
、この手順および方法は、本発明を説明するために与えられたものである。こう
した他の手段は、続く請求の範囲において規定される本発明の意図および思想の
範囲内に包含されるであろう。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Viability probes for cell separation, identification and / or analysis Technical field The viability probes provided by the invention can be used independently or are useful for inclusion in a panel of monoclonal antibodies to analyze solid or non-adherent tumors. Background technology Non-viable, hyperpermeabilized cells are responsible for significant inhibition during flow cytometric analysis. The primary contributor to this inhibition is the differentiation of antigenic phenotype (13), biochemical changes (eg, increased autofluorescence) (24), and probe permeabilization due to cell death associated with cell death. Non-specific uptake and binding (6, 15, 20, 22). Therefore, exclusion of non-viable cells is required for precise analysis of viable cells (20). The two most characteristic processes of cell death are necrosis and apoptosis (1, 3, 5, 9, 13, 19). Necrosis is typically caused by extracellular conditions such as hypoxia or cytotoxic factors and is characterized by the order of metabolic breakdown, cell swelling, lysis and inflammation of surrounding tissues (1 5, 7, 9, 23). The more common phenomenon, apoptosis (1, 10), is associated with programmed cell death and is characterized by the order of cell contraction, chromatin enrichment and cleavage, and ultimately membrane permeabilization. (1, 3, 5, 7, 9, 10, 13). As permeabilized cells become permeabilized, changes in the morphology and refractive index of these cells significantly alter the light-scattering properties of these cells, resulting in loss of membrane integrity and usually impermeability. Allows ingestion of sex probes. The most commonly used techniques for cell death discrimination by flow cytometry can be divided into three major categories: (1) physical separation, (2) differential light scattering and (3). ) It is a method of dyeing with fluorescent probe. These techniques are largely methods of measuring membrane permeabilization and are based on the fact that this phenomenon is equivalent to cell death (6, 13). Thus, apparently, treating a sample with a permeabilizing agent will naturally eliminate permeabilized dead cells, which is often necessary for storage of the sample, intracellular labeling, or control of biohazard. It presents the significant challenge of distinguishing from cells that have survived prior to permeabilization. These agents dramatically change the morphology and refractive index of cells, bringing identity to the light-scattering properties of living and dead cells, as well as different types of cells. In addition, the permeabilizing agent allows all cells, including those that were alive prior to permeabilization, to escape from any probe that was present in excess in this solution or from previously stained dead cells. Ingest any leaked probe. This results in two of the most common fresh preparation techniques for distinguishing dead cells, generally by immobilization and permeabilization: light-scattering-based electronic gating and membrane-impermeable probes. Ingestion and use are excluded. Thus, there was a need to identify cells that had died prior to permeabilization, and there was a lack of suitable technique to do this. Physical separation techniques such as Percoll and Ficoll density gradient separations can separate viable cells from dead cells on the basis of different buoyant densities (5), but with wide variations in purity and recovery. Are present, there is selective cell loss (11), and in some circumstances cytotoxicity is seen (21). Discrimination of dead cells based on light scattering is often not applicable to heterogeneous cell mixtures such as solid tumors. This is because some dead cells may have light scattering properties similar to those of different types of viable cells (15, 20). Finally, most of the known fluorescent viability probes (eg propidium iodide, fluorescein diacetate, etc.) are not believed to be compatible with the use of permeation enhancers, which essentially bind Because they are weak or reversible, the probe can leak from stained cells into artificially permeabilized non-stained cells (15, 20). Polak et al. Reported successful use of PI to identify dead cells in ethanol-immobilized samples (14). The present invention provides viability probes for inclusion in solid tumor monoclonal antibody panels that establish the following criteria: broad cell type specificity; non-specific staining of viable cells. Low; high signal / noise ratio for staining dead cells; binding in dead cells with affinity high enough to withstand the permeabilization procedure; and complete excitation and emission spectra Must be compatible with other dyes in the tumor panel. Disclosure of the invention Accordingly, it is an object of the present invention to provide viability probes useful for inclusion in a panel of monoclonal antibodies for the analysis of solid tumors, preferably breast tumors. Yet another object of the present invention is to provide a viability probe directed to a relatively stable intracellular antigen. A further object of the invention is to provide a viability probe, such as to provide information on late apoptotic and necrotic cells (type III) containing degraded chromatin. A further object of the present invention is to provide a viability probe, which provides information on permeabilized cells (type I) containing natural chromatin. Another object of the present invention has the significant advantage of being resistant to immobilization and permeabilization procedures such as those often required for sample storage, biohazard control, or intracellular labeling. It is to provide a viability probe. Another object of the invention is to provide antibody probes that can be conjugated to any of a wide range of available fluorophores. The viability probe of the present invention was employed in the method of the application, filed at the same time as the present application, entitled "Analysis of Solid Tumors by Multi-Parameter Flow Cytometry", having a Docket Number of 139,646. sell. This application is incorporated herein by reference. Further objects, advantages and novel features of the present invention will be set forth in part in the description which follows and will be apparent, in part, to one skilled in the art upon examination of the following. , Or may be learned in practicing the present invention. The objects and advantages of the invention may be realized and attained by means of the instruments and combinations particularly pointed out in the appended claims. Simple invention of the drawings Preferred embodiments of the present invention will now be described, by way of example, with reference to the accompanying drawings in this specification. Here, Figure 1 shows a flow chart of sample treatment; Figure 2 shows light scatter (LT scatter) and PI staining of untreated cells and the experimental viability probe actin-SAM-FITC. (Actin-SF), Cytokeratin-SAM-FITC (CK-SF), 7-AAD, and TO-PRO-3 in contrast to staining of treated cells; FIG. 3 shows untreated (PI. Light scatter (LT scatter) and PI staining of non-immobilized cells and experimental viability probes LDS-751 (LDS), tubulin-SAM-FITC (tubulin-SF), EMA, And contrast with staining of treated cells with PI (PI immobilized). Embodiment of the present invention Solid tumors commonly develop large apoptotic and necrotic populations in common, a significant obstacle to precise flow cytometric analysis of tumor cells. In fact, it is quite possible that living tumor cells represent only a small fraction of the total cell population, especially in large tumor and storage samples. Until these viable tumor cells can be identified and isolated, they are useless because of the potential for false immunophenotypes and DNA analysis, which results in different cell types and autofluorescence of dead cells. Has a wide background, non-specific binding of antibodies to the cell surface, non-specific uptake of antibodies, and degradation of chromatin in dead cells. The viability probes provided by the invention are useful for inclusion in a panel of monoclonal antibodies for the analysis of solid tumors, preferably breast tumors. The present inventors have discovered that the viability probes of the present invention exhibit a sufficiently broad range of cell type specificities in that they inform a wide range of cells found in solid tumors (4); Low specific binding; strong enough specific binding to withstand staining and permeabilization procedures; before dead cell disruption (discrimination based on light scattering or gated out) Time point) shows a high and stable fluorescence intensity in order to be informative during the time tolerable in solid tumors; and against four other fluorescent probes that make up the tumor antibody panel Have an affinity. Tubulin-SAM-FITC appears to meet all of the above criteria, as discovered by the inventor. The presence of tubulin in all eukaryotic cells (18) avoids the problem of tumor heterogeneity; this probe shows little or no non-specific binding to live bacteria. However, the binding of the probe in permeabilized cells was strong enough to withstand the staining and permeabilization procedure; its signal / noise ratio was much higher than that of autofluorescence even for 15 days after harvest of cells. High enough to clearly distinguish this fluorescence, its fluorescence intensity diminishes relatively slowly during this time course; and the probe is compatible with other probes that make up the tumor antibody panel. Is. Cytokeratin-SAM-FITC was satisfactory in all respects except that it was specific for epithelial cells only. Actin, EMA, and 7-ADD did not show a sufficiently high signal / noise ratio over the entire time course. TO-PRO-3, LDS-751, and PI (treated cells) stain both living and dead cells in the same way, thus providing information regarding survival in the present application. Absent. Recent reports that membrane permeabilization precedes chromatin degradation during necrosis and chromatin degradation during apoptosis (1, 5, 7, 13), as shown in Table 1, It means that at least three distinct types of dead cells occur. The present invention supports such categorization. The fact that staining with a DNA-specific probe is strongest at the onset of cell death and decreases with increasing cell age after harvest suggests the presence of type I and type III dead cells. . Predicting the presence of type II dead cells, with biofilm and degraded chromatin, has low forward scatter (suggesting that upon apoptosis, reduced cell volume precedes chromatin degradation) ( 7) Percentage of cells, excluding viability probes (TO-PRO-3, LDS-751, and PI in treated cells, all of which stained indistinguishable cells from viable and dead cells). ) Is constantly higher than the percentage of cells positive for () (Tables 2 and 3). In addition, the relatively stable intracellular antigens targeted by the viability probe of the present invention can be used to bind native chromatin to late-apoptotic and late-necrotic cells containing degraded chromatin (type II I). It has been shown to provide more useful information to containing permeabilized cells (type I) than traditional DNA-specific viability dyes such as propidium iodide. The present invention has the significant advantage of being resistant to immobilization and permeabilization procedures, as often required for sample storage, biohazard control or intracellular labeling. Finally, the present invention teaches the use of antibody probes capable of binding to a wide range of available fluorophores, which are more traditional with fixed, often broad emission spectra. It has wider applicability than dye probes. In a preferred embodiment of the invention, the viability probe is cytokeratin. In the most preferred embodiment of the invention, the viability probe is tubulin. The present invention provides the following two time-series studies, in which a tumor cell line is induced to enter the condition of lowering oxygen tension of cells, resulting in lowering of oxygen tension inside solid tumors. It is intended to stimulate the environment, where the extent of their staining with multiple viability probes is compared. Relevant to the first study is the staining of MDA (breast tumor) cell lines with propidium iodide (PI), without hyperpermeability as standard, and anti-actin-SAM with hyperpermeability. -FITC, anti-cytokeratin-SAM-FITC, 7-aminoactinomycin D (7-AAD; a high-affinity DNA intercalator with an emission maximum at about 650 nm) (16, 17) and TO- MDA by PRO-3 (a membrane-impermeable, high-affinity DNA intercalator with an emission maximum at 661 nm and minimal fluorescence except when bound to nucleic acids) Breast tumor) Staining of cell lines. Included in a second study was staining of MDA cells with PI without permeabilization as a standard and with permeabilization anti-tubulin-SAM-FITC, ethidium bromide monoazide (EMA, It is a photoactivated, covalently bound DNA intercalator with an emission maximum at about 600 nm) (15), LDS-751 (a biological nucleic acid dye, with an emission maximum at 670 nm). Yes (20) and staining of MDA cells with PI. Materials PBS, lysophosphatidyl choline, "Nonidet P-40 (NP-40)", trypan blue, anti-α-smooth muscle actin monoclonal antibody, and 7-aminoactinomycin D (7-AAD) were added to Sigma Chemical Corporation. (St. Louis, Missouri). FBS and pure methanol were obtained from Hyclone (Logan, Utah) and JT Baker Inc. (Philippsburg, NJ), respectively. Propidium iodide (PI) dye (from DNA preparation kit; 50 μg / ml PI, 4 KU / ml bovine pancreatic type III RNAse, 0.1% NaN Three , Saline and stabilizer) and anti-cytokeratin-SAM-FITC monoclonal antibodies were obtained from Coulter Corporation (Miami, FL). Anti-α-tubulin was obtained from Zym Laboratories, Inc. (San Francisco, Calif.). FITC-conjugated sheep 0 anti-mouse F (ab ') fragment (SAM-FITC) was obtained from Cylenus Laboratories (Victoria, Australia). Ethidium bromide monoazide (EMA) and TO-PRO-3 were obtained from Molecular Probes Inc. (Eugene, Oreg.). LDS-751 was obtained from Excite (Dayton, OH). Cell Culture Monolayer cultures of the MDA-MB-175-VII breast cancer tumor cell line (American Type Culture Collection, Rockville, MD) were supplemented with 10% fetal calf serum (Hyclone, Logan, UT). 5% CO in high glucose DMEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) at 37 ° C in a humidified atmosphere. 2 Grown in. The culture was maintained under logarithmic growth conditions prior to harvest. For each of the time series studies presented herein, cells were harvested daily (except weekends) and then, tightly sealed, at 37 ° C. in a humidified atmosphere at 5% CO 2. 2 And stimulated hypoxia in the tumor. Samples from each batch were processed for flow cytometric analysis on 12 consecutive day cell harvests in each study. Cell Staining To assess viability probes for inclusion in our monoclonal antibody panel for solid tumors, to stain the surface and nucleus of solid tumors simultaneously, we Samples were processed according to the procedures adopted in the laboratory. In each time course study, after collecting the last of the batches of 12 daily (excluding weekends) cells, aliquots (aliquots) from each batch for viability staining with trypan blue and microscopic evaluation. ) Was collected. Cells from each batch were then added to 1 x 10 cells per test. 6 Individual cells were split into 12 × 75 mm 2 siliconized glass test tubes. In each experiment, samples were divided into two populations: as a standard, an untreated (ie, not treated by the solid tumor staining treatment below) line to be stained with propidium iodide (PI), and the other. A series that is to be stained with viability dye and to be treated with the solid tumor staining procedure below (FIG. 1). Thus, in Study 1, daily samples of MDA cells (ranging from the youngest cells on day 0 to the oldest cells on day 15) were run in 7 samples (untreated unstained control). Untreated PI-stained standard; treated, unstained control; and stained with either actin-SAM-FITC, cytokeratin-SAM-FITC, 7-AAD, or TO-PRO-3. 4 treated samples) were present. In Study 2, there were also seven samples of daily collections of MDA cells (untreated unstained control; untreated PI stained standard; treated unstained control; and tubulin-. There were 4 treated samples stained with SAM-FITC, EMA, LDS-751 or PI). Notably, unstained cells were used here, rather than the isotype control, to establish a background of fluorescence for antibody labeled cells. The intensity of antibody staining inside cells is a combination of multiple factors, including specific binding to target antigens, nonspecific antibody binding, antibody capture, and nonspecific binding of the dye itself. It is the result. Clearly, where the goal is to measure specific binding to the target antigen, isotype controls should be used to assess the level of non-specific fluorescence. However, as in this case, if the purpose is simply to identify cells whose permeation has been enhanced from viable cells by uptake of fluorescent antibody, the more uptake the antibody (specific Good discrimination, be it non-specific). The discriminator in this application is global rather than specific, so fluorescent isotype controls are unnecessary. After dividing the cells, the untreated line to be stained with PI and these unstained controls were centrifuged and decanted at 500 xg for 5 minutes at room temperature. Unstained controls were resuspended in PBS supplemented with 2.5% FBS (PB SF) and the PI stained samples were resuspended in 1 ml and prior to flow cytometric analysis in the dark. Incubated at room temperature for 20 minutes. This remaining sample was centrifuged and decanted as above. Unstained control and cells to be stained with 7-ADD, TO-PRO-3, LDS-751, EMA or PI were resuspended in 200 μl PBSF and incubated for 15 minutes at room temperature. . This remaining sample was diluted with actin in PBS F (protein concentration unknown) at a 1: 200 dilution, tubulin in PBSF (protein concentration unknown) at a 1: 200 dilution, or in PBSF. Resuspend in 200 μl each of 25 μg / ml cytokeratin (optimal doses for the three antibodies were previously determined by titration, data not shown) and incubate for 15 minutes at room temperature. All samples were then washed with 2 ml each of PBS, centrifuged and decanted as above. The unstained control was then resuspended in 200 μl PBSF and incubated for 15 minutes at room temperature. Samples stained with actin, tubulin or cytokeratin were resuspended in 200 μl of 48.8 μg / ml SAM-FITC in PBSF and incubated at room temperature for 15 minutes in the dark. Cells stained with 7-ADD were resuspended in 1 ml of 25 μg / ml 7-ADD per test (250 μl stock solution in 49.75 ml PBSF: stock solution is 5 mg / ml in methanol). Suspended and incubated in the dark for 15 minutes at room temperature. Cells stained with TO-PRO-3 were resuspended in 5 ml of TO-PRO in 1 ml / test PBSF and incubated in the dark for 15 minutes at room temperature. Cells stained with LDS-751 were treated with 1 ml of PBSF per test containing 10 μl of 2 μg / ml LDS-751 (50 μl stock solution in 4.95 ml PBSF: stock solution was 1 ml in methanol). 0.2 mg per LDS-751) and incubated in the dark for 15 minutes at room temperature. Cells stained with EMA were resuspended in 10 μl / test of 5 μg / ml EMA (125 μl stock solution in 4.875 ml PBSF: stock solution is 0.2 mg EMA / ml in methanol). The suspension was incubated for 15 minutes at room temperature, 20 cm away from the fluorescent light valve. PI stained cells were resuspended in 1 mg / test of the same PI solution used for untreated cells and incubated in the dark for 15 minutes at room temperature. All samples were then washed as above and then resuspended in 200 μl / test PBSF and incubated for 15 minutes at room temperature in the dark (to stimulate antigen staining of the surface of tumor samples). All samples were then washed twice more as above. After decanting the supernatant, each sample was resuspended in 1 ml 20 μg / ml lysophosphatidylcholine at 25 ° C. in 1% paraformaldehyde, incubated for 2 minutes at room temperature and at 500 × g. It was centrifuged at room temperature for 5 minutes and decanted. The samples were then resuspended in 1 ml / test of pure methanol at -20 ° C, incubated on ice for 10 minutes, then centrifuged as above. After decantation, samples were resuspended in 1 ml / test 4 ° C. 0.1% NP40, incubated for 5 minutes on ice, then centrifuged as above. After decantation, the samples are resuspended in 200 μg / test PBSF and incubated for 15 minutes at room temperature in the dark (to stimulate intracellular antigen staining of tumor samples), then as above. Washed. Finally, the sample was resuspended in 1 ml / test PBSF prior to flow cytometry. Flow cytometry with 5 photomultiplier tubes and 3 lasers (water-cooled 5W argon laser, air-cooled 488nm argon laser operating at 15mW, and 10mW air-cooled 633nm helium-neon laser) Samples were analyzed on an "EPICS ELITE" flow cytometer (Coulter Corporation, Miami, FL). Samples stained with TO-PRO-3 were analyzed at 633 nm excitation; all other samples were analyzed at 488 nm excitation with an air-cooled argon laser. The actin-, cytokeratin-, and tubulin-SAM-FITC fluorescence emission was reflected by a 550 nm dichroic longpass filter and passed through a 525 nm bandpass filter. PI and EMA fluorescence was reflected by a 650 nm dichroic longpass filter and passed through a 610 nm bandpass filter. 7-AAD, TO-PRO-3, and LDS-751 fluorescence passed a 650 nm dichroic longpass filter and a 675 nm bandpass filter. The spontaneous emission of the unstained control was measured by the same filter device fitted with the stained sample. In the format listed for each sample, 5000 results were collected, with linear amplification of forward and side scatter and 40 logarithmic amplification of fluorescence. Information gathering and analysis is performed by "ELITE"software; color graphics are "WinList" software (Verity Software House, Topsham, Maine) and "EXCEL" software (Red, Wyoming). Mondo, Microsoft Corporation). The results of the first time course study are shown in Figure 2 and Table 2. In FIG. 2, the rightmost column shows the number of days that the batch of cells in the corresponding column was retained after harvesting (days 5, 6, 12, and 13 correspond to weekends, during which cells were harvested). It has not been). This next column shows the light scatter results of untreated cells from each batch (in each of these histograms, forward scatter is on the Y axis and side scatter is on the X axis). It is above). This remaining column shows the fluorescence histogram of unstained cells (in green) and electronically superimposed (in colors other than green) by the histogram of cells stained by the probe shown on the top of each column. Has been done. All instrument settings were kept unchanged for the duration of this experiment. The fluorescence histogram is on a logarithmic scale of 40. All histograms contain results for 5,000 autoscales. In general, dead cells show a decrease in forward angle light scatter, an increase in 90 ° C. light scatter, and fluorescence (prior to or without artificial permeabilization). When stained with probe (17) it shows an increase in fluorescence. Therefore, in order to meet our criteria, the viability probe must exhibit three characteristics in Figures 2 and 3. (1) Show little or no staining of viable cells (ie the non-green peak of the test sample in the first row of FIGS. 2 and 3 matches the green peak of the unstained control). (They should be overlapped as closely as possible); (2) the percentage of viable and dead cells in the sample, as shown by light scattering in FIGS. 2 and 3. There is a corresponding bimodal fluorescence (ie, the non-green peak in the test sample is in the column where the light scatter histogram shows the presence of both live and dead cells (basically 1-4 days). ) Must be bimodal, and the light scatter histogram must be unimodal in the columns that show the presence of only live or dead cells (basically 0 and 7-15 days). Must be); and (3) death The fluorescent staining of the cells is significantly brighter than the unstained control's autofluorescence (i.e., the positive non-green peak of the test sample overlaps with the unstained control's green peak). From, as far as possible). It should be emphasized that the green peak in each fluorescence histogram is not a negatively stained cell, but an unstained control (in a color other than green that electronically overlaps the stained sample). It corresponds to. In Figure 2, non-specific staining of viable cells is optimal for actin-SAM-FITC and cytokeratin-SAM-FITC, blurred for 7-ADD and relatively bright for PI. , TO-PRO-3 is very bright. Fluorescence distributions of PI, actin-SAM-FITC, cytokeratin-SAM-FITC and 7-ADD show light scatter and trypan blue for the relative proportions of these negative (viable cells) and positive (dead cells) peaks. Corresponding to ingestion (data not shown); TO-PRO-3 fluorescence distribution remained monomodal throughout this time course. Of the three types of probes suitable for this application (actin-SAM-FITC, cytokeratin-SAM-FITC and 7-ADD), cytokeratin-SAM-FITC shows the highest signal / noise ratio for 15 days. Remain distinguishable from autofluorescence. On day 4, both actin staining and 7-ADD staining were significantly different from autofluorescence. PI is a viability probe of the present application because of its reversible binding, TO-PRO-3 strongly stains both live and dead cells without substantial discrimination. Is not acceptable. In Table 2, the percentage of cells positively stained by the various viability probes employed in Study 1 is comparable to the percentage of dead cells with low forward and high side scatter properties. The percentage of positive staining was calculated for the negative peak in the bimodal distribution than for the unstained cells, as the particular probe stained non-specifically viable cells. Dashes appear in this table at points in each column where bimodality is completely lost. Interestingly, the percentage based on light scattering is steady and significantly higher than the percentage based on fluorescence. PI, actin-SAM-FITC, cytokeratin-SAM-FITC and 7-ADD produced significant positives over 4 days when the bimodal distribution of 7-ADD was lost. PI, actin, and cytokeratin positivity remained significant throughout the 15 days following recovery. This discovery is important. This is because this suggests that for DNA-specific dyes, larger size antibody sandwich complexes do not inhibit staining. The unimodal distribution of TO-PRO-3 during this study and the intense staining of its viable cells rendered information here on staining dependence. The average channel value of fluorescence intensity is also reported. Generally, at day 0, the fluorescence intensities of all probes differed at different rates when staining was minimal due to the predominance of viable cells (except for TO-PRO-3). Will decrease. The fluorescence intensity of PI and TO-PRO-3 shows an extreme decrease, followed by cytokeratin, followed by actin and 7-ADD side by side. Conversely, autofluorescence (green histogram) increases steadily with post-harvest cell age, especially in the green region of the spectrum. The results of the second time course study are shown in Figure 3 and Table 3. Both formats are the same as the formats in FIG. 2 and Table 2, respectively. Light scatter, autofluorescence and PI staining of untreated cells are similar to those in FIG. In Figure 3, non-specific staining of viable cells is optimal for tubulin-SAM-FITC, for PI (in both treated and untreated cells), LDS-751, and EMA. Relatively high. Fluorescence distributions of PI, tubulin-SAM-FITC, and EMA in untreated cells corresponded to light scatter and trypan blue uptake in the relative proportions of these negative and positive peaks: Treatment The fluorescence distribution of PI and LDS-751 in the cells remained essentially monomodal during this time course. Of the two probes suitable for the present application (Tubulin-SAM-FITC and EMA), Tubulin-SAM-FITC showed the highest signal / noise ratio, which was very high from unstained cells over 15 days. It remained different. On day 7, the difference between EMA staining and autofluorescence was about the same as the level of non-specific staining in viable cells on day 0. PI is unacceptable as a viability probe of the present application due to its reversible binding and LDS-751 with a steady unimodal fluorescence distribution. As in Table 2, the light scatter based percentages of dead cells in Table 3 are consistently and significantly higher than the fluorescence based percentages. PI, tubulin-SAM-FITC and EMA in untreated cells resulted in relative positivity over this time course. Due to the constitutively unimodal distribution of LDS-751 and PI in the treated cells, they do not inform about the viability probe dependence here. The average fluorescence intensity of PI, both in the treated and in the untreated sample, decreased sharply during this time course, while the average fluorescence intensity of EMA and tubulin-SAM-FITC. Slowly decreased. Interestingly, the fluorescence intensity of LDS-751 appears to be periodic during this time course, while all other probes show a linear decrease in fluorescence intensity. All references cited herein indicate the level of skill of those skilled in the art to which this application belongs. Each reference is hereby incorporated herein by reference, in the location in which each reference is cited. As will be appreciated by one of skill in the art, the above procedures and methods have outlined specific reagents and conditions, but are intended to be encompassed by the spirit and scope of the invention. You can make changes. Therefore, this procedure and method are provided to illustrate the present invention. Such other means will fall within the spirit and spirit of the invention as defined in the following claims.
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９５年１２月２９日
【補正内容】
請求の範囲
１．透過亢進剤によって処理された異種の生物試料中の死亡細胞を識別する方法
であって、
（ａ）生存性プローブによって前記試料を染色し、このプローブが、固定化お
よび透過亢進に対して耐性であり；
（ｂ）蛍光測定機器によって分析し；
（ｃ）蛍光測定機器の結果からヒストグラムを得；および
（ｄ）このヒストグラムを分析することを特徴とする方法。
２．前記生存性プローブが核酸特異的な染料であることによって更に特徴付けら
れる、請求項１記載の方法。
３．前記生存性プローブが、細胞内抗原であることによって更に特徴付けられる
、請求項１記載の方法。
４．前記生存性プローブがチューブリンであることによって更に特徴付けられる
、請求項３記載の方法。
５．前記生存性プローブが細胞骨格抗原であることによって更に特徴付けられる
、請求項１記載の方法。
６．前記細胞骨格抗原がサイトケラチンであることによって更に特徴付けられる
、請求項５記載の方法。
７．前記細胞が悪性細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載
の方法。
８．前記悪性細胞が充実性腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請
求項７記載の方法。
９．前記悪性細胞が胸部腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請求
項７記載の方法。
１０．前記細胞が非付着性の腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、
請求項１記載の方法。
１１．前記非付着性の腫瘍細胞が、造血系の腫瘍形成細胞であることによって更
に特徴付けられる、請求項１０記載の方法。
１２．前記細胞が、劣化したクロマチン（ＩＩＩ型）細胞を含有する後期アポト
ーシス細胞および後期壊死細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項
１記載の方法。
１３．前記細胞が天然のクロマチンを含有している（Ｉ型）ことによって更に特
徴付けられる、請求項１記載の方法。
１４．前記細胞を抗体プローブによって染色することによって更に特徴付けられ
る、請求項１記載の方法。[Procedure of Amendment] Article 184-8 of the Patent Act
[Submission date] December 29, 1995
[Correction contents]
The scope of the claims
1. A method for identifying dead cells in a heterogeneous biological sample treated with a permeation enhancer
And
(A) The sample was stained with a viability probe, which probe was immobilized and
And resistant to permeabilization;
(B) analyzed by fluorescence measuring instrument;
(C) Obtaining a histogram from the results of the fluorometric instrument; and
(D) A method characterized by analyzing this histogram.
2. Further characterized by the viability probe being a nucleic acid specific dye.
The method of claim 1, wherein the method comprises:
3. Further characterized in that the viability probe is an intracellular antigen
The method according to claim 1.
4. Further characterized by the viability probe being tubulin
The method according to claim 3.
5. Further characterized by the viability probe being a cytoskeletal antigen
The method according to claim 1.
6. Further characterized by the cytoskeletal antigen being cytokeratin
The method according to claim 5.
7. The method of claim 1, further characterized by the cell being a malignant cell.
the method of.
8. A further characterized in that the malignant cells are solid tumor cells,
The method according to claim 7.
9. The method further characterized by the malignant cells being breast tumor cells.
Item 7. The method according to Item 7.
10. Further characterized by the cells being non-adherent tumor cells,
The method of claim 1.
11. Further, the non-adherent tumor cells are hematopoietic tumorigenic cells.
The method according to claim 10, characterized by:
12. Late apoptotic cells, wherein the cells contain degraded chromatin (type III) cells
Further characterized by being a cis cell and a late necrotic cell.
The method described in 1.
13. It is further characterized by the fact that the cells contain natural chromatin (type I).
The method of claim 1, wherein the method is elicited.
14． Further characterized by staining the cells with an antibody probe
The method according to claim 1, wherein