JPH09507025A

JPH09507025A - HEV orf-2 monoclonal antibodies and methods of using them

Info

Publication number: JPH09507025A
Application number: JP7517515A
Authority: JP
Inventors: ポール，デボラ・エイ; ニツジ，マーク・エフ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-12-22
Filing date: 1994-12-16
Publication date: 1997-07-15
Also published as: AU1437695A; CA2179609A1; WO1995017501A1; EP0736087A1

Abstract

(57)【要約】Ｅ型感染ウイルス（ＨＥＶ）、特にはＨＥＶｏｒｆ−２抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体が記述される。また、これらのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系、これらのモノクローナル抗体を使用する方法、及びこれらのモノクローナル抗体を含む検定キットが提供される。 (57) [Summary] Monoclonal antibodies that specifically bind to type E infectious virus (HEV), particularly the HEV orf-2 antigen, are described. Also provided are hybridoma cell lines that secrete these monoclonal antibodies, methods of using these monoclonal antibodies, and assay kits containing these monoclonal antibodies.

Description

【発明の詳細な説明】ＨＥＶｏｒｆ−２に対するモノクローナル抗体及びそれらを使用する方法発明の背景本発明は、一般に、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に特異的に結合する抗体に関し、具体的には、ＨＥＶｏｒｆ−２抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系、及びこれらのモノクローナル抗体を用いる方法に関する。水系感染性、感染性又は腸伝染性非Ａ非Ｂ肝炎（ＥＴ−ＮＡＮＢＨ）等と様々に呼ばれるＨＥＶは、世界的に分布し、発展途上国におけるウイルス性肝炎の主要な地域流行の原因として注目されている。Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４４２−４６１（１９９０）。発展国においても、入国した旅行者から以外にも、ＥＴ−ＮＡＮＢＨの突発的な事例が報告されている。Ｓ．Ｊ．Ｓｋｉｄｍｏｒｅら，Ｌａｎｃｅｔ３３７：１５４１（１９９１）。糞便−口経路の感染が主体ではあるが、幾つかの疫学的研究においては、少数ながらヒト−ヒト経路の被曝が示唆されている。Ｏ．Ｖｅｌａｓｑｕｅｚら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．３６３：３２８１−３２８５（１９９０）。これらの疾患は、妊娠の第３の３ヶ月期間の間に感染すると、妊娠女性の約２０％という高い致死率を示すものとして文献に記載されている。前述のＤ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙらを参照のこと。ＨＥＶの推定物質の分子クローニングは、ウイルス増殖の組織培養システムがないことにより妨げられている。しかしながら、利用可能な動物モデルと新規に開発された非特異的増幅手順を用いることにより、ＨＥＶのＢｕｒｍｅｓｅ株に感染したｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍａａｑｕｅｓの胆汁から得られた、独特のｃＤＮＡクローン（“ＥＴ１．１”と称する）の同定が可能となっている。Ａ．Ｇ．Ａｎｄｊａｐａｒｉｄｚｅら，Ｖｏｐｒ．Ｖｉｒｕｓｏｌ．１：７３−８０（１９８６）、Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６２７７−６２８１（１９８７）及びＧ．Ｗ．Ｒｅｙｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３３５−１３３９（１９９０）。このクローンのウイルス起源の確認に成功したことが、ソマリア、タシュケント、ボルネオ、パキスタン及びメキシコのＥＴ−ＮＡＮＢＨ感染者から採集した糞便検体中の類似配列の同定に繋がった。前出のＧ．Ｒ．Ｒｅｙｅｓらを参照のこと。また、ｃＤＮＡライブラリーも、メキシコでのＥＴ−ＮＡＮＢＨ流行の間に得られたヒト便試料から作製されている。Ｇ．Ｒ．Ｒｅｙｅｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊａｐｏｎ．２６：１４２−１４７（１９９１）。これらのｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニングが、ＨＥＶに特異的なエピトープをコードする２つのｃＤＮＡクローンの同定に結び付いた。Ｐ．Ｏ．Ｙａｒｂｏｕｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５７９０−５７９７（１９９１）。一組の重複するｃＤＮＡの単離及び配列決定は、この型の肝炎が、他の分子解析ずみ作用因子である肝炎ウイルスのいかなるものとも似ていない、新規のウイルスによって引き起こされるという認識に結び付いた。Ａ．Ｗ．Ｔａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８５：１２−１３１（１９９１）。ＨＥＶゲノムの様々な領域がクローン化されており、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として大腸菌内で発現されている。例えば、前出のＳ．Ｊ．Ｓｋｉｄｍｏｒｅらを参照のこと。これらの組換え抗体のうちの４つ、ＨＥＶのバーメス（Ｂ）株から誘導された２つとＨＥＶのメキシコ（Ｍ）株から誘導された２つは、明らかにＨＥＶに被爆している個体に由来する抗体によって認識される抗原性部位を有していることが示されている。前出のＰ．Ｏ．Ｙａｒｂｏｕｇｈらを参照のこと。Ｍ３− ２及びＭ４−２と命名されたメキシコ株由来の２つの抗原は、それぞれ、第２開放読み枠（ＯＲＦ−２）及び第３開放読み枠（ｏｒｆ−２）のカルボキシ末端のアミノ酸配列に対応する。Ｂ３−２及びＢ４−２と命名されたバーメス株由来の２つの抗原は、それぞれ、ｏｒｆ−２及びｏｒｆ−２のカルボキシ末端のアミノ酸配列に対応する。Ｍ３−２及びＢ３−２組換え抗原は、両者とも、ＯＲＦ−２のカルボキシ末端由来の４２アミノ酸を有している。これらの４２アミノ酸の配列のアミノ酸相同性の程度は９０．５％である。同文献。Ｍ４−２及びＢ４−２組換え抗原は、各々、ｏｒｆ−２のカルボキシ末端に由来する３３アミノ酸を有しており、これら３３アミノ酸の２つの配列の相同性の程度は７３．５％である。同文献。ＨＥＶの検出のために開発される試験は、被験試料におけるウイルスの特異的な存在の検出に有用な試薬を含まなければならない。したがって、モノクローナル抗体のような、ＨＥＶとのみ反応することが可能な試薬に対する必要性が存在する。加えて、純粋な、特定の単一特異的抗原が生成できれば、明らかに、ＨＥＶ抗原の正確な同定、解析、及び精製に大変重要である。ＨＩＶのような作用因子に対するスクリーニング検定結果の存在の確認に様々な方法を利用することが可能であるが、これらの技法はいまだＨＥＶの存在の確認に利用することはできない。生体外でのＨＥＶの培養及びウイルスベースのウェスタン・ブロット試験のような方法を利用することはできない。ＨＥＶ核酸の検出はＰＣＲを実施することにより行うことはできるが、この技法は冗長で高価なものであり、サーモサイクラーのような特別な装置を必要とし、一回の時間が２４時間までかかる。免疫電子顕微鏡（ＩＥＭ）が抗−ＨＥＶ抗体の存在の確認に用いられているが、ＩＥＭの使用は日常的な確認手段としては高価である。したがって、被験試料中のＨＥＶ抗原又はＨＥＶ抗体をスクリーニングするための、正確、迅速で、かつコスト的に有効な方法に用いることが可能なモノクローナル抗体を提供することには利点があろう。発明の要約本発明は、ＨＥＶｏｒｆ−２抗原の検出に用いることが可能な、非常に特異的な新規モノクローナル抗体及びそれらの断片を提供する。このモノクローナル抗体はＨＥＶｏｒｆ−２タンパク質に特異的に結合する。このモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、モノクローナル抗体（Ｈ１Ｃ１１９）を分泌するハイブリドーマ細胞系Ｈ１Ｃ１１９（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１１５２１）と命名されている。このモノクローナル抗体の特異性は、ＨＥＶ−ｏｒｆ −２抗原を有利に同定することを可能とし、この同定は、ＨＥＶ感染の診断及び評価の他に、ウイルス分化の研究に有用であり得る。本発明のモノクローナル抗体は、ＨＥＶ抗原または抗体を検出するための免疫検定において用いることができる。そのような免疫検定の多くの様式は当該技術分野において周知であり、既知量のＨＥＶｏｒｆ−２抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を加えるように改変することができる。特に好ましい検定様式は、被験試料中に存在し得るＨＥＶ抗体の存在及び量を決定する競合検定である。この検定は、ＨＥＶ抗体を含む疑いのある被験試料を、ＨＥＶ抗原を固定化した固相及び信号発生化合物を含む指示試薬及びＨＥＶｏｒｆ−２抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体と、被験試料及び固相及び／又は指示試薬及び固相の抗原／抗体複合体を形成するに十分な時間及び条件下で接触させ：かつ、被験試料中のＨＥＶ抗体の存在を示す、陰性被験試料から発生する信号との比較による指示試薬の固相への結合の減少を検出することにより、被験試料中に存在するＨＥＶ抗体の存在を決定することを包含する。本発明のモノクローナル抗体を含む検定キットも記述される。図面の簡単な説明図１は、プラスミドｐＪＯ２０１及びｐＧＥＸ−ＨＥＶ−ＯＲＦ２−ＳＧ−３由来の、ｏｒｆ−２ＣＫＳ／ＨＥＶＳＧ−２抗原の生成に用いられるプラスミドの模式図である。発明の詳細な説明本発明のモノクローナル抗体は、被験試料中にＨＥＶ抗原又は抗体がもしあれば、それを検出する様々な検定システムにおいて用いることができる。提供されるモノクローナル抗体の断片もまた使用することができる。本発明のモノクローナル抗体は、以下のようにしてスクリーニングすることができる。組換えもしくは合成ＨＥＶｏｒｆ−２抗原を固相（好ましくは、ポリスチレンビーズ）上に用いる。例えば、下記実施例１に記載されるようにして得られるＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）ＨＥＶ組換えｏｒｆ−２（ＳＧ−３）を、固相上に非精製（抽出及び可溶化）形態で固定化する。あるいは、固相上に（共に係属中の１９９３年７月９日付の米国出願０８／０８９，８７７号に記載される通りに得られる）合成ペプチドｓｐＢ３−２を用いる免疫検定（ＥＩＡ）を利用する。非特異的結合の検出は、固相にＣＫＳのみを、又は非ＨＥＶ−ＣＫＳ組換えタンパク質を固定化することにより達成される。被験試料（マウス血清、組織培養上清、またはマウス腹水）を検体希釈液中に段階的に希釈し、一部を各固相と共に４０℃で１〜２時間インキュベートする。その後、ビーズをバッファーで洗浄し、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−標識二次抗体を用いて結合抗体を検出する。ビーズを結合体と共に４０ ℃で十分な時間インキュベートし、前と同様に洗浄する。暗所にて、室温で３０分間、適切な基質溶液を添加する。硫酸を加えて反応を停止させ、硫酸添加から２時間以内に、４９２ｎｍでの基質の吸光度を測定することにより発色量を決定する。この方法の詳細は、下記実施例部分に記載されている。例えば、好ましい検定様式において、本発明のモノクローナル抗体をＨＥＶ抗原に対する抗体を検出するための競合プローブとして用いることができる。例えば、固相上に固定化されたＨＥＶ抗原をＨＥＶに対する抗体を含むと思われる被験試料と接触させ、本発明のモノクローナル抗体に結合されていて、測定可能な信号を発生する信号発生化合物を含む指示試薬と共に、被験試料と固相との、又は指示試薬と固相との抗原／抗体複合体を形成するに十分な時間及び条件下でインキュベートする。発生する信号の減少によって示される、本発明のモノクローナル抗体の固相への結合の減少を、定量的に測定することができる。ＨＥＶ陰性と確認ずみの被験試料から発生する信号と比較して、信号が測定可能な程度減少することは、被験試料における抗−ＨＥＶ抗体の存在を示している。ＨＥＶ抗原を検出する代替検定法においては、固相上に固定化されているポリクローナルもしくはモノクローナル抗−ＨＥＶ抗体又はそれらの断片を、ＨＥＶ抗原を含む可能性のある被験試料と接触させて混合物を形成する。この混合物を、抗原／抗体複合体を形成するに十分な時間及び条件下でインキュベートする。その後、測定可能な信号を発生する信号発生化合物が結合している、ＨＥＶ抗原に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体又はそれらの断片を含む指示試薬を、抗原／抗体複合体と接触させて第二混合物を形成する。次いで、この第二混合物を、抗体／抗原／指示試薬複合体を形成するに十分な時間及び条件下でインキュベートする。被験試料中に存在し、かつ固相上に捕捉されたＨＥＶ抗原の存在を、信号発生化合物によって発生される測定可能な信号を検出することにより決定する。被験試料中に存在するＨＥＶ抗原の量は、発生する信号に比例する。あるいは、固体支持体に結合しているポリクローナルもしくはモノクローナル抗−ＨＥＶ抗体又はそれらの断片、被験試料、及び測定可能な信号を発生する信号発生化合物が結合している、ＨＥＶ抗原に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体又はそれらの断片を含む指示試薬を同時に接触させて混合物を形成する。この混合物を、抗体／抗原／指示試薬複合体を形成するに十分な時間及び条件下でインキュベートする。被験試料中にＨＥＶがもしあり、これが固相に捕捉されていたら、信号発生化合物によって発生される測定可能な信号を検出することにより決定する。被験試料中に存在するＨＥＶ抗原の量は、発生する信号に比例する。この検定様式、または上述のものにおいては、本発明のモノクローナル抗体を、捕捉相として、又は指示試薬の一部として用いることができる。さらに別の検出方法においては、本発明のモノクローナル抗体を、免疫組織化学分析による固定化細胞としてのほか、当業者に周知の標準法により固定化された組織切片におけるＨＥＶ抗原の検出に用いることができる。加えて、このモノクローナル抗体をＣＮＢｒ−活性化セファロースに類似のマトリックスに結合させ、細胞培養物、又は血液及び肝臓のような生物学的組織からの特定のＨＥＶ抗原のアフィニティ精製に用いることができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、治療もしくは他の類似の用途に用いられるキメラ抗体の生成に用いることもできる。このモノクローナル抗体又はそれらの断片は、個別に、ＨＥＶ抗原の検出に供することができる。また、ここに提供される本発明のモノクローナル抗体（及びそれらの断片）の組合せは、ＨＥＶに対して異なる特異性を有する他のモノクローナル抗体と組み合わせて、各々異なる結合特異性を有するＨＥＶ抗体の混合物、即ち“カクテル”の成分として用いることもできる。したがって、このカクテルは、ＨＥＶゲノムに由来するｏｒｆ−２タンパク質を指向する本発明のモノクローナル抗体を、ｏｒｆ−３ＨＥＶタンパク質もしくはｏｒｆ−２ＨＥＶタンパク質上の他の結合部位のような他のＨＥＶ領域を指向する異なるモノクローナル抗体と共に含むことができる。このモノクローナル抗体のカクテルは、次いで本明細書の検定様式に記述されている単一のモノクローナル抗体の代わりに用いられる。該検定様式において用いることができるポリクローナル抗体又はそれらの断片は、ＨＥＶ抗原に特異的に結合するものでなければならない。好ましく用いられるポリクローナル抗体は哺乳動物起源のものであり、ヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジ抗−ＨＥＶポリクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。検定に用いられるポリクローナル抗体は、単独で、またはポリクローナル抗体のカクテルとしてのいずれかで用いることが可能である。該検定様式において用いられるカクテルは、異なるＨＥＶ特異性を有するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体のいずれかを含んでなるため、ＨＥＶタンパク質分化及び特異性の研究の他に、ＨＥＶ感染の診断、評価及び予後に有用である。ここに記載される本発明の方法によって試験することができる試料には、全血、血清、血漿、脳髄液、尿のようなヒト及び動物体液、細胞培養上清のような生物学的液体、固定組織検体及び固定細胞検体が含まれる。 “固相”は重要なものではなく、当業者により選択され得るものである。したがって、ラテックス粒子、微粒子、磁性もしくは非磁性ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁面、ガラスもしくはシリコン片及びタンニン酸処理ヒツジ赤血球は、全て適切な例である。固相にペプチドを固定化する適切な方法には、イオン、疎水性、共有相互作用等が含まれる。ここで用いられる“固相”は、不溶性であるか、または後に反応によって不溶性にし得るような、あらゆる物質を指す。この固相は、捕捉試薬を引き付けて固定化するそれ固有の能力について選択することができる。あるいは、固相は、捕捉試薬を引き付けて固定化する能力を有するさらなる受容体を保持していてもよい。このさらなる受容体には、捕獲試薬自体、または捕獲試薬に結合する荷電物質と反対の荷電を有する荷電物質が含まれ得る。さらに別の代替物として、受容体分子が、固相に固定化され（結合し）、特異的な結合反応によって捕捉試薬を固定化する能力を有するあらゆる特異的結合部材であってもよい。この受容体分子は、検定の実施前、もしくは検定の実施中における、捕捉試薬の固相部材への間接結合を可能にする。このように、固相は、プラスチック、誘導化プラスチック、磁性もしくは非磁性金属、試験管のガラスもしくはシリコン表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、及び当業者に周知の他の形態であり得る。固相が、検出抗体の接近を十分可能にする空隙率、及び抗原の結合に適した表面親和性を有する適切な多孔性材料をも含み得ることが意図されており、本発明の範囲内にある。一般には、微細孔構造が好ましいが、水和状態にあるゲル構造を有する材料も同様に用いることができる。このような有用な固体支持体には：天然ポリマー性炭水化物及びそれらの合成修飾、架橋もしくは置換誘導体、例えば、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋グアーゴム、特に硝酸及びカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステル、及びセルロースエーテル；窒素含有天然ポリマー、例えば、架橋もしくは修飾ゼラチンを含むタンパク質及び誘導体；天然炭化水素ポリマー、例えば、ラテックス及びゴム；適切な多孔性構造を備えるよう調製することができる合成ポリマー、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル及びその部分的加水分解誘導体を含むビニルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリエステル、ポリアミドのような上記縮合体のコポリマー及びターポリマー、及びポリウレタンもしくはポリエポキシドのような他のポリマー；多孔性無機材料、例えば、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムを含むアルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩もしくは炭酸塩、アルカリ及びアルカリ土類金属、アルミニウム及びマグネシウムのケイ酸塩；並びに、アルミニウムもしくはケイ素の酸化物もしくは水和物、例えば、粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、又はガラス（これらの材料は、上記ポリマー材料と共にフィルターとして用いることができる）；並びに上記種類の混合物もしくはコポリマー、例えば、予め存在する天然ポリマー上に合成ポリマーの重合を開始することにより得られるグラフトコポリマーが含まれる。これらの材料の全ては、フィルム、シートもしくは板のような適切な形で用いることができ、あるいは紙、ガラス、プラスチックフィルム、もしくは織物のような適切な不活性担体に被覆し、又は接着し、又は積層することができる。多孔性構造のニトロセルロースは、モノクローナル抗体を含む多彩な試薬に対する優れた吸収及び吸着性を有している。また、ナイロンも類似の特性を有しており、適切なものである。上述の多孔性固体支持体は、好ましくは、約０．０１ないし０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍの厚さのシートの形態にあることが意図されている。細孔のサイズは広い範囲内で変化でき、好ましくは約０．０２５ないし１５ミクロン、特には０．１５ないし１５ミクロンである。固相の固有電荷を変化させ、もしくは増強するために、材料又は、固相支持材によって保持される微粒子に、荷電物質を直接塗布することができる。あるいは、カラム内に保持し、または可溶性試薬及び被験試料の混合物中に懸濁させることにより、微粒子自体を固相として役立てることが可能であり、あるいは粒子自身を固相支持材に保持して固相化することができる。 “保持して固定化する”は、支持材上もしくは支持材中の粒子が支持材内の他の位置に実質的に移動できないことを意味する。この粒子は、当業者が適切な型の粒状物質から選択することができ、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、または類似の物質からなるものが含まれる。粒子の平均径は用いられる支持材の平均細孔サイズよりも小さいことが好ましいが、粒子のサイズは重要なものではない。したがって、様々な他の固相を用いる態様も意図されるものであり、本発明の範囲内にある。例えば、ＥＰ公開０３２６１００号に対応する共に係属する米国特許出願１５０，２７８号及び米国特許出願３７５，０２９号（ＥＰ公開０４０６４３２号）に記載される、マイナス荷電ポリマーを用いる固定可能な反応複合体を固定化するためのイオン捕捉法を本発明に従って使用し、迅速な溶液相免疫化学反応を行うことが可能である。固定可能な免疫複合体は、マイナス荷電ポリアニオン／免疫複合体と予め処理されたプラス荷電多孔性マトリックスとの間のイオン相互作用により反応混合物の残りから分離され、ＥＰＯ公開０２７３，１１５号に対応する共に係属する米国特許出願９２１，９７９号に記載の化学発光信号測定を含む、上述の様々な信号発生システムを用いて検出される。また、本発明の方法を、固相が微粒子よりなる自動及び半自動システムを含む微粒子技術を利用するシステムにおいて使用するよう適応させることもできる。このようなシステムには、それぞれＥＰＯ出願公開ＥＰ０４２５６３３号及びＥＰ０４２４６３４号に対応する係属中の米国特許出願４２５，６５１号及び米国特許５，０８９，４２４号、及び米国特許５，００６，３０９号に記載されるものが含まれる。指示試薬は、外部手段によって検出可能な測定可能信号を発生することができ、ＨＥＶに対する特異的結合要素に結合（付着）する信号発生化合物（標識）を含む。ここで用いられる“特異的結合要素”は、特異的結合対の構成要素を意味する。すなわち、分子の一方が化学的もしくは物理的手段により他方の分子に結合する２つの異なる分子である。ＨＥＶに対する特異的結合対の抗体要素に加えて、指示試薬はまた、ビオチンもしくは抗−ビオチン、アビジンもしくはビオチン、炭化水素もしくはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、作動体もしくは受容体分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害剤もしくは酵素等の、ハプテン−抗−ハプテンシステムのいずれかを含む、あらゆる特異的結合対の構成要素でもあり得る。免疫反応性特異的結合要素は、抗体、抗原、又はサンドイッチ検定においてはＨＥＶ、競合検定においては捕捉試薬、もしくは間接検定においては補助特定的結合要素のいずれかに結合することが可能な抗体／抗原複合体であり得る。意図される様々な信号発生化合物（標識）には、発色原、酵素のような触媒、フルオレセン及びローダミンのような発光化合物、化学発光化合物、放射性元素、及び直接視認標識が含まれる。酵素の例には、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が含まれる。特定の標識の選択は重要なものではないが、それ自体もしくは１以上のさらなる物質との結合によるいずれかで信号を生成することが可能なものである。様々な他の固相を用いる別の態様もまた意図されたものであり、本発明の範囲内にある。例えば、ＥＰ公開０３２６１００号に対応する共に係属中の米国特許出願１５０，２７８号、及び米国特許出願３７５，０２９号（ＥＰ公開０４０６４７３号）（いずれも本出願人によるもので、参照することによりここに組込まれる）に記載された、マイナス荷電ポリマーを用いて固定可能な反応複合体を固定化するイオン捕獲法を本発明に従って用いて、迅速な溶液相免疫化学反応を行うことが可能である。固定可能な免疫複合体は、マイナス荷電ポリアニオン／免疫複合体と予め処理されたプラス荷電多孔性マトリックスとの間のイオン相互作用により反応混合物の残りから分離され、ＥＰＯ公開０２７３，１１５号に対応する共に係属する米国特許出願９２１，９７９号（本出願人によるもので、参照することによりここに組込まれる）に記載された化学発光信号測定を含む、上述の様々な信号発生システムを用いて検出される。また、本発明の方法を、固相が微粒子を含有する自動及び半自動システムを含む微粒子技術を利用するシステムにおいて使用するよう適応させることもできる。このようなシステムには、それぞれＥＰＯ出願公開ＥＰ０４２５６３３号及びＥＰ０４２４６３４号に対応する係属中の米国特許出願４２５，６５１号及び米国特許４２５，６４３号（これらは、参照することによりここに組込まれる）に記載されたものが含まれる。免疫検定への走査型プローブ顕微鏡法（ＳＰＭ）の使用もまた、本発明のモノクローナル抗体を容易に適合させ得る技術である。走査型プローブ顕微鏡法、特に原子間力顕微鏡法においては、捕捉相、例えば、少なくとも１つの本発明のモノクローナル抗体を固相に付着させ、走査型プローブ顕微鏡を用いて固相の表面上に存在し得る抗原／抗体複合体を検出する。走査型トンネル顕微鏡を用いると、抗原／抗体複合体を検出するために多くの免疫検定システムでは通常必ず用いられる標識の必要性がなくなる。このようなシステムは、係属中の米国特許出願６６２，１４７号に記載されている。この特許出願は本出願人によるもので、参照することによりここに組込まれる。特異的結合反応の監視には、多くの方式でＳＰＭを用いることができる。一態様においては、特異的結合パートナーの１要素（本発明のモノクローナル抗体であるアナライト特異的物質）を走査に適切な表面に付着させる。このアナライト特異的物質の付着は、当業者に周知の方法に従ってプラスチックもしくは金属表面の固相を含む試験片に吸着させることによるものであってもよい。または、誘導化プラスチック、金属、シリコン、もしくはガラスの固相を含む試験片への特異的結合パートナー（アナライト特異的物質）の共有結合を用いることもできる。共有結合法は当業者に周知であり、試験片に特異的結合パートナーを不可逆的に結合させる様々な手段が含まれる。試験片がシリコンもしくはガラスである場合には、特異的結合パートナーを付着させる前に、その表面を活性化しなければならない。トリエトキシアミノプロピルシラン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）、トリエトキシビニルシラン（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、及び（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍａ）のような活性化シラン化合物を、それぞれ、アミノ−、ビニル及びチオールのような反応基の導入に用いることができる。このような活性化表面を結合パートナーの結合に直接用いることができ（アミノもしくはチオールの場合）、あるいはグルタルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）スベレート、ＳＰＰＤ９（スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）、及びＳＭＰＢ（スクシンイミジル４− ［１−マレイミドフェニル］ブチレート）のようなリンカーとさらに反応させて、結合パートナーを表面から分離することができる。ビニル基を酸化して共有結合の手段を供することが可能である。また、これは、特異的結合パートナーに複数の付着点を提供し得る、ポリアクリル酸のような様々なポリマーを重合するためのアンカーとして用いることもできる。アミノ表面を様々な分子量の酸化デキストランと反応させて、異なるサイズ及び受容能力を有する親水性リンカーを提供することができる。酸化可能なデキストランの例には、デキストランＴ−４０（分子量４０，０００ダルトン）、デキストランＴ−１１０（分子量１１０，０００ダルトン）、デキストランＴ−５００（分子量５００，０００ダルトン）、デキストランＴ−２Ｍ（分子量２，０００，０００ダルトン）（これらは全てＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能である）またはＦｉｃｏｌｌ（分子量７０，０００ダルトン）（Ｓｉｇｍａから入手可能）が含まれる。また、１９８８年１月２９日出願の係属中の米国特許出願１５０，２７８号、及び１９８９年７月７日出願の係属中の米国特許出願３７５，０２９号（いずれも本出願人によるもので、参照することによりここに組込まれる）に記載された技術及び化学を用いることにより、試験片表面上への特異的結合パートナーの固定化に高分子電解質相互作用を用いることができる。付着の好ましい方法は共有的手段によるものである。特異的結合要素の付着に続いて、非特異的結合を最小限に止めるために、血清、タンパク質、または他のブロッキング剤で表面をさらに処理することができる。また、検定目的の適正性を確かめるために、表面の作製部位もしくは使用点のいずれかを走査することもできる。この走査の過程が試験片の特異的結合特性を変化させることは予期されない。本発明では固相の使用を主として開示しているが、本発明のモノクローナル抗体が非固相検定システムにおいても利用可能であることも意図されている。これらの検定システムは当業者には周知であり、本発明の範囲内にあるものと考えられる。本発明のモノクローナル抗体は、ＨＥＶ抗体の存在を検出するように設計された検定において、陽性対照として使用することが可能である。被験試料中にＨＥＶ抗体の存在を検出する検定において、ＨＥＶ抗原を捕捉相として用いることができる。これらのＨＥＶ抗原は、ウイルス溶解物、ＨＥＶゲノムの様々な免疫原性領域の合成ペプチド、及び／又は合成もしくは天然抗原又は抗原のエピトープを用いて作製された組換えタンパク質から、様々な手段により調製することができる。これらの型のＨＥＶ抗原が、ここに記述されているものを含む様々な検定様式において捕捉相又は検出相として使用可能であることも意図されたことである。当業者に周知の手順に従い、検定の実施において試験血清の代わりに本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、ＨＥＶ抗体を検出するために提供された試薬が適切に機能したかを確認可能である。検定に用いられる試薬を、１以上のバイアルもしくはボトルのような容器を備え、各容器にモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体のカクテルのような検定に用いられる個別の試薬を収容したキットの形態で提供し得ることは意図されたことである。また、これらのキットには、洗浄、処理及び指示試薬のような検定の実施に必要な他の試薬のバイアルもしくは容器を含めることも可能である。以下の実施例は、本発明のＨ１Ｃ１１９モノクローナル抗体の利点及び有用性を、このモノクローナル抗体の開発、解析、エピトープ・マッピング及び臨床的有用性を記述することにより示す。モノクローナル抗体の開発に用いられる方法は、当該技術分野において周知であり、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９４（１９７５）に詳述され、かつＪ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＨｙｂｒｉｄｏｍａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＢｏｃｏＲａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）に総説されている手順に従う。本発明を実施するために、ＨＥＶの完全長のｏｒｆ−２をＣＫＳとの融合タンパク質としてコードする遺伝子を含むように組換えＤＮＡクローンを構築した。このクローンによって発現されるこの抗原（ＳＧ−３タンパク質と称する）をマウスの免疫に用い、このマウスからの免疫脾臓細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させて、ＨＥＶｏｒｆ−２と反応する免疫グロブリン（Ｉｇ）クラスＧ₁（ＩｇＧ₁）のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を作製した。この免疫グロブリンはマウス腹水中に産生され、これをアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。以下に示される実施例は、本発明の真意及び範囲を説明すること意味するものであり、これらを限定することを意味するものではない。実施例１ハイブリドーマ細胞系の生成及び解析Ａ．組換えＨＥＶタンパク質の生成プラスミドｐＧＥＸ−ＨＥＶ−ＯＲＦ−ＳＧ−３（図１）をＧｅｎｅｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ＲｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手した。これは、ｐＧＥＸ発現系において、ＨＥＶのｏｒｆ−２抗原のカルボキシ末端３２７アミノ酸をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合してコードする。当該技術分野において周知の方法に従い、大腸菌内のプラスミドｐＪ０２０１に、ＳＧ−３タンパク質と命名されたｏｒｆ−２をコードする遺伝子（前出のＰ．Ｏ．Ｙａｒｂｏｕｇｈらを参照）をクローン化し、ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）とのキメラ融合タンパク質として発現させた。このＣＫＳ／ＨＥＶ−ＳＧ−３タンパク質は、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）と共にインキュベートすると、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株において、全細胞タンパク質の２０％を超えて発現した。このクローンを１０リットル発酵器内で増殖させることにより、発酵当り１７０−２６０ｇの湿った細胞ペーストが生じた。Ｂ．ＣＫＳ−ＨＥＶタンパク質可溶化ＳＧ−３タンパク質を発現する大腸菌細胞を、ｐＨ１０で、様々なプロテアーゼ阻害剤の存在下において溶解した。ＣＫＳ融合タンパク質は不溶性であり、遠心後にペレット中に残存した。ペレットを様々な洗浄剤で洗浄して非特異的タンパク質を除去した。０．５％ＳＤＳを含有するトリス、ｐＨ８．５への可溶化の後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル濃度測定による評価でＣＫＳ融合タンパク質が全タンパク質の５０ないし６０％を示すことが見出された。この可溶化タンパク質をＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００ＨＲカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、プールし、ゲル濃度測定により純度について評価した。最終精製タンパク質は、９０％を超える純度であった。Ｃ．マウスの免疫免疫計画（マウス４匹）は、最初の免疫と６及び９週目の追加免疫とで構成された。最初の免疫においては、上述の通りに調製された、１０μｇのＣＫＳ−ＨＥＶｏｒｆ−２ＳＧ− ３抽出、可溶化及び精製組換えタンパク質を完全フロイントアジュバント中に乳化した。このエマルジョンを４匹のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の腹腔内に接種した。免疫後３週間目に、マウスの血清を以下のように酵素免疫検定（ＥＩＡ）免疫反応性についてスクリーニングした。ＨＥＶＳＧ−３を塗布したビーズに対する被験血清抗−ＨＥＶ力価は、大腸菌及びＣＫＳ溶解物を含有する検体希釈液中で２×１０⁴であり、ＣＫＳのみを塗布したビーズに対しては１０³であった。１９９３年７月９日出願の共に係属中の米国特許出願０７／０８９，８７７号に記載される通りに調製されたＨＥＶｏｒｆ−２合成ペプチドｓｐＢ３−２を塗布したビーズに対するこのマウス血清抗体の力価は２×１０²であった。第１の免疫の４週間後に、不完全フロイントアジュバント中１０μｇの免疫タンパク質で３匹のマウスの腹腔内に追加抗原投与を行った。９週目に、上記ＨＥＶＳＧ−３を塗布したビーズに対する追加抗原投与マウス４番からの免疫後抗 −ＨＥＶ力価は、不所望の反応性を妨げる添加物を含有しない検体希釈液中で１．５×１０⁶、添加物を含有する検体希釈液中で２×１０⁵、並びにｓｐＢ３−２に対して５．０×１０³であった。次いで、このマウスに、免疫タンパク質３０μｇを静脈内（尾静脈を介して）に追加抗原投与し、３日後に融合に用いた。Ｄ．ハイブリドーマの確立非免疫マウスから脾臓を無菌的に取り出し、注射器のプランジャーを用いてそれを破砕して少量のダルベッコ最小必須（ＤＭＥ）培地を入れた６０×１５ｍｍペトリ皿内に設けられた篩を通すことにより正常マウス脾臓細胞を調製した。この脾臓細胞溶液をＤＭＥ培地で洗浄し、細胞ペレットに１０ｍＭトリス中０．８３％ＮＨ₄Ｃｌの溶液１ｍｌを１分間添加することにより赤血球細胞を溶解した。この細胞を再び洗浄し、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥ培地４０ｍｌ中に再懸濁した。融合の当日に免疫マウスを殺して脾臓を取り出し、脾臓細胞を１０ｍｌのＤＭＥ培地に再懸濁して計数することを除いて正常脾臓細胞の調製について前記の通りに処理した。常法を変形（前出のＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ）して、脾臓細胞を１：１の比でＳＰ２／０ミエローマ細胞系と融合させた。２０％ＦＢＳ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ）を含有する１．５ｍｌのＤＭＥ培地の存在下、２４−マルチ・ウェル組織培養トレイのウェル当り１×１０⁶個の脾臓細胞を塗布した。２４時間後、２４マルチ・ウェル（０．５ｍｌ）当り２００，０００個の正常脾臓細胞を添加した。第５日にＨＡＴ培地を添加し、第７日に置き換えた。融合から得られた２９の最初のハイブリドーマのうちの２つがＨＥＶに対する抗体について陽性であった。ハイブリッド＃１（Ｈ１）は、１：１０希釈で試験した場合に、ＳＧ−３抗原を塗布したビーズに対して１．１５５の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を有し、ＣＫＳのみを塗布したビーズ及びＨＥＶｓｐＢ３−２ビーズに対しては陰性であった。次いで、Ｇｏｄｉｎｇ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｓ，２ｎｄｅｄ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８６）に記載される限界希釈技術により、Ｈ１をウェル当り１細胞でクローン化した。Ｅ．限界希釈によるクローンの確立抗体陽性ウェルにおける生育可能細胞の数を数え、９６マルチウェル組織培養トレイの各々について、１００細胞を含有するアリコートを、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び５× １０⁶個正常マウス脾臓細胞を含有するＤＭＥ培地に添加した。０．２ｍｌに調整された８チャネル・ピペットマン（ｐｉｐｅｔｍａｎ）を細胞懸濁液の植付けに用いた。このトレイを加湿された５％ＣＯ₂インキュベーターにおいて３７℃ でインキュベートし、蒸発分補充のため、第５日及び第７日もしくは必要に応じて再供給した。成長体を有するウェルが３０−５０％集密となったとき（通常１０−２１日）、１コロニーのみを有するウェルを試料とし、抗体活性について試験した。各ハイブリッドに由来する幾つかの陽性ウェルを選択し、細胞を拡大させた。ＨＥＶｏｒｆ−２（ＳＧ−３）に対する反応性を有する、Ｈ１Ｃ１１９と命名されたクローンが得られた。Ｆ．Ｈ１Ｃ１１９モノクローナル抗体の生成及び精製さらなる評価のために選択されたクローンを組織培養Ｔ−フラスコにおいてスケールアップし、１０⁶個の細胞を予めプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（前出のＨｕｒｒｅｌｌを参照）の腹腔内に注射した。注射の７−１０日後に腹水を採取し、遠心して凍結した。ＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＣｌ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で、抗体をアフィニティ精製した。結合したモノクローナル抗体をｐＨ５．５でカラムから溶出した。これは、そのサブタイプがＩｇＧ₁であることを示している。Ｇ．Ｈ１Ｃ１１９モノクローナル抗体のスクリーニング及び解析抗体をスクリーニングし、解析するため、異なる抗原を固相（ポリスチレンビーズ）上に有する酵素免疫検定（ＥＩＡ）を用いた：ＣＫＳ−ＨＥＶ組換えｏｒｆ−２（ＳＧ−３）（実施例１に記述される通りに調製）を非精製（抽出及び可溶化）形態（純度約５０−６０％のＨＥＶタンパク質）又は精製タンパク質（純度＞９０％）のいずれかの形態で固相に塗布し、別のＥＩＡでは固相上に合成ペプチドｓｐＢ３−２を用い、さらに非特異的結合を検出するために、固相にＣＫＳ単独又は非ＨＥＶＣＫＳ組換えタンパク質を塗布した。全ての検定に対して、マウス血清、組織培養上清、マウス腹水試料又は上で得られたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｈ１Ｃ１１９を、リン酸緩衝生理食塩水／トリス／ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８を２０％ヤギ血清、１０％ウシ胎児血清、１％ウシ血清アルブミン、０．２％トリトン−Ｘ１００、０．１％ナトリウムアジドと共に含有し、さらに１％大腸菌溶解物及び０．０１％ＣＫＳを添加し、もしくは添加しない検体希釈液で５ないし１０倍に段階的に希釈し、次いで２００μｌを各固相と共に４０ ℃で１−２時間インキュベートした。その後、ビーズを５ｍｌ蒸留水で３回洗浄した。２００μｌのＨＲＰＯ−標識二次抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧＨ＋Ｌ）（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｓより入手）を、トリス緩衝生理食塩水を１０％ヤギ血清、１０％ウシ胎児血清及び０．１５％トリトン −Ｘ１００と共に含有する結合希釈液中０．３μｇ／ｍｌで用いて、結合抗体を検出した。ビーズを結合体と共に４０℃で１時間インキュベートし、前と同様に洗浄した。Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質を、ＯＰＤ希釈液（本出願人）５ｍｌ当り１つのＯＰＤタブレット（本出願人）を添加することにより新たに調製し、ＯＰＤ基質溶液３００μｌを洗浄したビーズの各々に加え、暗所にて、室温で３０分間インキュベートした。硫酸１ｍｌを加えて反応を停止させ、硫酸添加の２時間後に４９２ｎｍの基質の吸光度を測定することにより、生じた色の量を決定した。下記表Ｉに示す結果は、抗体がＨＥＶのｏｒｆ−２領域に対して特異的であったことを示している。実施例２ＨＥＶに対する抗体の競合検定固相にＨＥＶｏｒｆ−２（ＳＧ−３）又はｏｒｆ−２及びｏｒｆ−３領域をコードするタンパク質を塗布した。これらの固相を、ＨＥＶ陰性ヒト血漿（陰性対照）又はＨＥＶＡｂを含むことが既知のヒト血漿（試料）の検体希釈液中１：２希釈液と共に、室温で一晩予備インキュベートした。次に、ビーズを洗浄し、阻害剤が存在しない状態で１．０００−２．０００のＯ．Ｄ．を示すように希釈したＨＥＶｏｒｆ−２に対する本発明のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を適切なビーズに加えて４０℃で１時間インキュベートした。その後、ビーズを洗浄し、ＨＲＰＯ−ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加えて４０℃で２時間インキュベートした。このビーズを洗浄し、上述の通りにＯＰＤ基質を用いて標識の検出を行った。理論的には、陽性ＨＥＶＡｂ含有試料は信号が５０％減少するはずである。提示された実施例においては、ＨＥＶＡｂ陽性試料は、ＳＧ−３ビーズが用いられた場合にはＭＡｂＨ１Ｃ１１９の２０％の阻害を、ＨＥＶｏｒｆ−２／ｏｒｆ−３組合せビーズを用いた場合には５４．２％の阻害を示した。これらの結果を下記表IIに示す。実施例３ＨＥＶに対するｏｒｆ−２抗原の競合検定固相にＨＥＶｏｒｆ−２（ＳＧ−３）タンパク質を塗布する。この検定様式において１．０００−２．０００のＯ．Ｄ．を示すことが測定ずみの濃度のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｈ１Ｃ１１９を、試料と共に、試料中のＨＥＶ抗原がＭＡｂに結合することを可能とするに十分な長さの時間及び温度（３０−１２０分間、室温ないし４０℃）で、予備インキュベートする。次いで固相を加え、混合液及び固相を、残余のあらゆるＭＡｂが固相に結合することを可能とするに十分な長さの時間及び温度（温度範囲：室温ないし４０℃、時間範囲：１−１６時間）でインキュベートする。その後、標識第二抗体（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ）及び４０℃での１−２時間のインキュベーション、又はそれ自身標識可能であってそれ故に検定を一工程で実施可能とするようなＭＡｂを用いて、ＭＡｂの固相への結合を検出する。次に、標識の検出を行う（すなわち、ＨＲＰＯ標識Ａｂを用いる場合には、ＯＰＤ基質を添加し、３０分間インキュベートし、硫酸を添加して反応を停止させ、４９２ｎｍで読み取る）。陽性ＨＥＶ抗原含有試料は、ＭＡｂの固相への結合を妨げ、信号を少なくとも５０％減少させる。Detailed Description of the Invention A monoclonal antibody against HEV orf-2 and How to use them Background of the Invention The present invention relates generally to antibodies that specifically bind to hepatitis E virus (HEV). And specifically secretes a monoclonal antibody against the HEV orf-2 antigen Hybridoma cell line, and methods using these monoclonal antibodies. You. A variety of non-A non-B hepatitis (ET-NANBH), etc. HEV, which is distributed worldwide, is the leading cause of viral hepatitis in developing countries. It is attracting attention as an important cause of regional epidemics. D. W. Bradley et al.Br. Med. Bull . 46: 442-461 (1990). Even in developing countries, Besides the national tourists, there have been reports of sudden cases of ET-NANBH. . S. J. Skidmore et al.,Lancet 337: 1541 (1991) . Although predominantly faecal-oral route of infection, in some epidemiological studies, a small number However, exposure of the human-human pathway has been suggested. O. Velasquez et al.,J . Amer. Med. Assoc . 363: 3281-3285 (1990). These diseases are associated with the third three-month period of pregnancy. If infected during the period, it will be reported in the literature as showing a high fatality rate of about 20% of pregnant women. Have been described. The above-mentioned D. W. See Bradley et al. Molecular cloning of putative substances of HEV was carried out using a tissue culture system for viral propagation. Being hindered by the absence. However, with available animal models and new By using the developed non-specific amplification procedure, the Burmese strain of HEV Unique c obtained from the bile of infected cynomorgus maaques It is possible to identify a DNA clone (referred to as "ET1.1"). A. G . Andjaparidze et al.,Vopr. Virusol. 1: 73-80 ( 1986), D.I. W. Bradley et al.Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 84: 6277-6281 (1987) and G.W. W. Reyes et al. ,Science 247: 1335-1339 (1990). Of this clone Somalia, Tashkent, Borneo, Pa Similarity in fecal samples collected from ET-NANBH-infected persons in Pakistan and Mexico It led to the identification of the sequence. G. R. Reye s et al. In addition, the cDNA library is also ET-NAN in Mexico. Made from human stool samples obtained during the BH epidemic. G. FIG. R. Reyes et al. ,Gastroenterol. Japan. 26: 142-147 (1991). ). Immunoscreening of these cDNA libraries showed specific HEV It has led to the identification of two cDNA clones encoding the epitope. P. O. Yarbough et al.,J. Virol. 65: 5790-5797 (1991). . Isolation and sequencing of a set of overlapping cDNAs has shown that this type of hepatitis has A new virus that does not resemble any of the slaughtering agents hepatitis virus. It was linked to the perception that it was caused by Ruth. A. W. Tam et al.,Vi rology 185: 12-131 (1991). Various regions of the HEV genome have been cloned and glutathione-S-tra Expressed in E. coli as a fusion protein with luciferase (GST) . For example, the S. J. See Skidmore et al. These recombinant anti Four of the bodies, two derived from the Burmese (B) strain of HEV and the HEV protein The two derived from Shiko (M) strain were clearly HEV Have an antigenic site that is recognized by an antibody from an individual exposed to Is shown. P. O. See Yarbough et al. M3- Two antigens from the Mexican strains designated 2 and M4-2 were isolated from the second At the carboxy terminus of the open reading frame (ORF-2) and the third open reading frame (orf-2) Corresponds to the amino acid sequence. Derived from the Birmes strains designated B3-2 and B4-2 The two antigens are orf-2 and the carboxy-terminal amino acid of orf-2, respectively. Corresponds to the acid sequence. Both M3-2 and B3-2 recombinant antigens were ORF-2. It has 42 amino acids from the carboxy terminus of. The distribution of these 42 amino acids The degree of amino acid homology in the string is 90.5%. Ibid. M4-2 and B4-2 The recombinant antigens each have 33 amino acids derived from the carboxy terminus of orf-2. The degree of homology between these two sequences of 33 amino acids is 73.5% . Ibid. The test developed for the detection of HEV is specific for the virus in the test sample. Must include reagents useful for the detection of the presence of Therefore, Monoclona There is a need for reagents that can only react with HEV, such as antibody I do. Addition Therefore, if a pure, specific monospecific antigen can be produced, it is obvious that the HEV antigen Very important for accurate identification, analysis and purification. Various to confirm the existence of screening test results for agents such as HIV Although it is possible to use various methods, these techniques still confirm the existence of HEV. It cannot be used for approval. In vitro culture of HEV and virus-based Methods such as the Westin blot test are not available. HEV nucleic acid Although detection can be done by performing PCR, this technique is tedious and expensive. It requires a special device such as a thermocycler, It takes up to 24 hours. Immunoelectron microscopy (IEM) confirms the presence of anti-HEV antibody However, the use of IEM is expensive as a daily confirmation means. Therefore, it was possible to screen for HEV antigens or HEV antibodies in test samples. Monochrome for accurate, fast, and cost-effective methods It would be advantageous to provide an internal antibody.Summary of the Invention The present invention is highly specific and can be used for the detection of HEV orf-2 antigen. Novel monoclonal antibodies and fragments thereof. This monoclonal The antibody specifically binds to the HEV orf-2 protein. This monoclonal The hybridoma that secretes the antibody secretes the monoclonal antibody (H1C119). Hybridoma cell line H1C119 (ATCC Accession No. HB115 21). The specificity of this monoclonal antibody is HEV-orf -2 antigens can be advantageously identified, which identification and diagnosis of HEV infection and In addition to evaluation, it may be useful in studies of viral differentiation. The monoclonal antibody of the present invention is used to detect an HEV antigen or antibody. It can be used in assays. Many formats of such immunoassays are known in the art. Well known in the art and specifically binds to a known amount of HEV orf-2 antigen It can be modified to add monoclonal antibodies. A particularly preferred assay format determines the presence and amount of HEV antibody that may be present in the test sample. This is a competitive test to be determined. This assay uses test samples suspected of containing HEV antibodies. Immobilize HEV antigen Specific to an indicator reagent containing a solid phase and a signal generating compound and HEVorf-2 antigen To the test sample and solid phase and / or indicator reagent and solid phase Contacting for a time and under conditions sufficient to form a phase antigen / antibody complex: and For comparison with the signal generated from a negative test sample indicating the presence of HEV antibody in the test sample Presence in the test sample by detecting a decrease in binding of the indicator reagent to the solid phase by Determining the presence of the HEV antibody. Assay kits containing the monoclonal antibodies of the invention are also described.Brief description of the drawings FIG. 1 shows the plasmids pJO201 and pGEX-HEV-ORF2-SG-3. Derived from the plasmid used in the generation of orf-2 CKS / HEVSG-2 antigen FIG.Detailed description of the invention The monoclonal antibody of the present invention may be the HEV antigen or antibody in the test sample. For example, it can be used in various assay systems for detecting it. Provided Fragments of monoclonal antibodies can also be used. The monoclonal antibody of the present invention is screened as follows. Can be done. Recombinant or synthetic HEV orf-2 antigen It is preferably used on polystyrene beads). For example, as described in Example 1 below. CMP-KDO synthetase (CKS) HEV recombinant o Immobilize rf-2 (SG-3) in a non-purified (extracted and solubilized) form on a solid phase. . Alternatively, on a solid phase (US application 08/0 dated Jul. 9, 1993, both pending) 89,877) and the synthetic peptide spB3-2). Immunoassay (EIA) is used. Non-specific binding can be detected only by CKS on the solid phase. , Or by immobilizing a non-HEV-CKS recombinant protein. Add the test sample (mouse serum, tissue culture supernatant, or mouse ascites) to the sample diluent. Dilute stepwise and incubate a portion with each solid phase at 40 ° C for 1-2 hours. So After that, the beads are washed with a buffer and horseradish peroxidase (HR Bound antibody is detected using a PO) -labeled secondary antibody. 40 beads with conjugate Incubate at 0 ° C for sufficient time and wash as before. 30 at room temperature in the dark Add appropriate substrate solution for minutes. Stop the reaction by adding sulfuric acid, Within 2 hours, to measure the absorbance of the substrate at 492 nm Determine the amount of color development. Details of this method are described in the Examples section below. For example, in a preferred assay format, the monoclonal antibody of the present invention is tested against HEV antibodies. It can be used as a competitive probe to detect antibodies to the stock. example For example, the HEV antigen immobilized on the solid phase may be used as a target for containing an antibody against HEV. Measurable by contacting with a test sample and binding to the monoclonal antibody of the present invention A test sample and a solid phase, together with an indicator reagent containing a signal-generating compound that generates a signal, Is for a time and under conditions sufficient to form an antigen / antibody complex of the indicator reagent and the solid phase. Incubate. Monochrome of the present invention, as indicated by the reduction in signal generated The decrease in binding of null antibody to the solid phase can be measured quantitatively. HEV negative Signal is measurably reduced compared to the signal generated from the tested sample Doing indicates the presence of anti-HEV antibody in the test sample. In an alternative assay for detecting HEV antigen, polyimmobilized on a solid phase The clonal or monoclonal anti-HEV antibody or a fragment thereof is A mixture is formed by contacting with a test sample that may contain antigen. This mixture , Anti Incubate for a time and under conditions sufficient to form the stock / antibody complex. That The HEV antigen is subsequently bound to a signal-generating compound that produces a measurable signal. A monoclonal or polyclonal antibody or a fragment thereof that binds differentially An indicator reagent comprising is contacted with the antigen / antibody complex to form a second mixture. Then The second mixture for a time sufficient to form an antibody / antigen / indicator reagent complex and Incubate under conditions. H present in the test sample and captured on the solid phase The presence of EV antigen is detected by a measurable signal generated by a signal generating compound. Determined by The amount of HEV antigen present in the test sample depends on the signal generated. Proportional to. Alternatively, polyclonal or monoclonal bound to a solid support Anti-HEV antibodies or fragments thereof, test samples, and signals that produce measurable signals. The monoclonal compound which specifically binds to the HEV antigen, to which the signal generating compound is bound, Or contact the indicator reagents containing polyclonal antibodies or their fragments at the same time. A mixture is formed. This mixture is sufficient to form the antibody / antigen / indicator reagent complex. Incubate for minutes and conditions. If HEV is present in the test sample, This is captured by the solid phase By detecting the measurable signal generated by the signal-generating compound. To decide. The amount of HEV antigen present in the test sample is proportional to the signal generated . In this assay format, or above, the monoclonal antibody of the invention is used. , As a capture phase or as part of an indicator reagent. In yet another method of detection, the monoclonal antibody of the present invention is immuno-organized. In addition to fixed cells by biological analysis, they are fixed by standard methods well known to those skilled in the art. It can be used to detect HEV antigen in tissue sections. In addition, this monoclonal antibody was labeled with a CNBr-activated sepharose-like macromolecule. Trix binding to cell cultures or biological tissues such as blood and liver Can be used for affinity purification of these particular HEV antigens. The monoclonal antibodies of the invention may also be used for therapeutic or other similar applications. It can also be used to generate chimeric antibodies. This monoclonal antibody or fragments thereof are individually used for HEV antigen detection. can do. In addition, the monoclonal antibody of the present invention provided herein (and Combinations of these fragments) to other monochromes with different specificities for HEV. Anna Mixture of HEV antibodies each having a different binding specificity in combination with It can also be used as a component of a "cocktail". Therefore, this cocktail Of the present invention directed to the orf-2 protein derived from the HEV genome Null antibody to orf-3 HEV protein or orf-2 HEV protein Different monoclonal antibodies directed to other HEV regions, such as other binding sites on the quality Can be included with the body. This monoclonal antibody cocktail is the next Used in place of the single monoclonal antibody described in the detailed assay format You. Polyclonal antibodies or fragments thereof that can be used in the assay format Must be one that specifically binds to the HEV antigen. Preferably used The polyclonal antibody of mammalian origin is human, goat, rabbit or Include, but are not limited to, sheep anti-HEV polyclonal antibodies. There is no. The polyclonal antibodies used in the assay can be used alone or in polycloner. It can be used either as a cocktail of antibodies. In the test format The cocktails used in this study also include monoclonal antibodies with different HEV specificities. Or HEV protein differentiation because it comprises either polyclonal antibody. Besides, and specificity studies, it is useful for diagnosis, assessment and prognosis of HEV infection. Samples that can be tested by the methods of the invention described herein include whole blood. , Human and animal body fluids such as serum, plasma, cerebrospinal fluid, urine, live cells such as cell culture supernatant Includes physical fluids, fixed tissue specimens and fixed cell specimens. The "solid phase" is not critical and can be selected by a person skilled in the art. did Therefore, latex particles, fine particles, magnetic or non-magnetic beads, membranes, plastic Tube, wall of microtiter well, glass or silicon piece and tag Phosphonate treated sheep red blood cells are all suitable examples. Immobilize peptide on solid phase Suitable methods include ionic, hydrophobic, covalent interactions and the like. Used here The "solid phase" that is rendered insoluble or may later become insoluble by the reaction. It refers to any substance. This solid phase is the solid phase that attracts and immobilizes the capture reagent. You can choose for your ability. Alternatively, the solid phase attracts the capture reagent It may carry an additional receptor which has the ability to immobilize only once. This sara The capture reagent The body, or charged substances that have an opposite charge to the charged substances that bind to the capture reagents, are included. obtain. As yet another alternative, the receptor molecule is immobilized (bound) to a solid phase, Any specific binding that has the ability to immobilize capture reagents by specific binding reactions. It may be a composite member. This receptor molecule can be used before or after performing an assay. To allow indirect binding of the capture reagent to the solid phase member. Thus, the solid phase Is plastic, derivatized plastic, magnetic or non-magnetic metal, test tube Lath or silicon surface, microtiter well, sheet, beads, fine particles , Chips, and other forms known to those skilled in the art. The solid phase is a porosity that allows sufficient access for the detection antibody, and a table suitable for antigen binding. It is contemplated that suitable porous materials having surface-affinity may also be included, and the present invention Is within the range of. Generally, micropore structure is preferable, but gel structure in hydrated state Materials having a can be used as well. Such useful solid supports include: Natural polymeric carbohydrates and their synthetically modified, cross-linked or substituted derivatives, eg For example, agar, agarose, cross-linked alginic acid, substituted and cross-linked guar gum, especially nitric acid. And cellulosic with carboxylic acid Esters, mixed cellulose esters, and cellulose ethers; nitrogen-containing heavens Natural polymers such as proteins and derivatives, including cross-linked or modified gelatin; Natural hydrocarbon polymers such as latex and rubber; with suitable porous structure Synthetic polymers, such as polyethylene, polypropylene, which can be prepared to Len, polystyrene, polyvinyl chloride, polyvinyl acetate and its partial hydrolysis Vinyl polymers including derivatives, polyacrylamide, polymethacrylate, poly Copolymers and terpolymers of the above condensates such as esters, polyamides, and Other polymers such as polyurethane or polyepoxide; porous inorganic materials, For example, alkaline earth gold containing barium sulfate, calcium sulfate, calcium carbonate Genus and magnesium sulfate or carbonate, alkali and alkaline earth metals, Aluminum and magnesium silicates; and aluminum or silica Elementary oxides or hydrates such as clay, alumina, talc, kaolin, zeo Light, silica gel, or glass (these materials should be used with the polymeric materials listed above). As a filter); and mixtures or copoly of the above types Mer, eg, the weight of a synthetic polymer over a preexisting natural polymer. Included are graft copolymers obtained by initiating merging. These materials Can be used in any suitable form such as a film, sheet or board, Or a suitable inert material such as paper, glass, plastic film, or fabric It can be coated on, adhered to, or laminated to a carrier. Porous nitrocellulose is compatible with a wide variety of reagents, including monoclonal antibodies. It has excellent absorption and adsorption properties. Nylon also has similar properties Yes, it is appropriate. The porous solid support described above is preferably about 0.01 to 0.5 mm, preferably Preferably, it is intended to be in the form of a sheet having a thickness of about 0.1 mm. Pore The size can vary within wide limits, preferably about 0.025 to 15 microns, In particular, it is 0.15 to 15 microns. Material or solid phase support to change or enhance the intrinsic charge of the solid phase The charged substance can be applied directly to the microparticles retained by. Or , Retained in the column or suspended in a mixture of soluble reagent and test sample. By using, it is possible to use the fine particles themselves as the solid phase, or The body can be immobilized on a solid support by holding it on a solid support. “Hold and immobilize” means that particles on or in the support material are This means that you cannot move to a position. The particles are of the type suitable for those skilled in the art. It can be selected from granular materials such as polystyrene, polymethyl acrylate, Lipropylene, latex, polytetrafluoroethylene, polyacrylonitri Including polycarbonate, polycarbonate, or similar materials. Average of particles The diameter is preferably smaller than the average pore size of the support material used, but Size is not important. Therefore, embodiments using various other solid phases are also contemplated. It is within the scope of the present invention. For example, EP publication 0326100 Co-pending US Patent Application Nos. 150,278 and 375 , 029 (EP Publication 0406432), negatively charged polymer An ion trapping method for immobilizing an immobilizable reaction complex using It is possible to carry out rapid solution phase immunochemical reactions. Immunity that can be fixed The complex consists of a negatively charged polyanion / immune complex and a pre-charged positive charge. Separated from the rest of the reaction mixture by ionic interactions with the porous matrix. Corresponding to EPO Publication 0273,115 As described above, including chemiluminescent signal measurements as described in US Patent Application No. 921,979 It is detected using various signal generation systems. The method of the present invention also includes automated and semi-automated systems in which the solid phase comprises microparticles. It can also be adapted for use in systems that utilize particulate technology. Such systems include EPO application publication EP 0 425 633, respectively. And pending US patent application 425,65 corresponding to EP 0 424 634. 1 and US Pat. No. 5,089,424 and US Pat. No. 5,006,309. Included are those mentioned. The indicator reagent is capable of producing a measurable signal detectable by external means. , A signal-generating compound (label) that binds (attaches) to a specific binding member for HEV Including. As used herein, "specific binding member" means a member of a specific binding pair. I do. That is, one of the molecules is linked to the other by chemical or physical means. Two different molecules that combine. In addition to the antibody component of the specific binding pair for HEV Therefore, the indicator reagent may also be biotin or anti-biotin, avidin or biotin. , Hydrocarbons or lectins, complementary nucleotide sequences, agonists or receptors Body molecules, enzyme cofactors and enzymes, enzyme inhibitors or enzymes, The structure of any specific binding pair, including any of the hapten-anti-hapten systems. It can also be a component. The immunoreactive specific binding member can be an antibody, an antigen, or a sandwich. For HEV, for capture assay for competitive assay, or for indirect assay Antibody / antigen complex capable of binding to any of the auxiliary specific binding members Can be the body. Various intended signal-generating compounds (labels) include chromogens, catalysts such as enzymes, Luminescent compounds such as fluorescein and rhodamine, chemiluminescent compounds, radioactive elements , And direct visual indicators are included. Examples of enzymes are alkaline phosphatase and Horseradish peroxidase, β-galactosidase and the like are included. Specific sign The choice of is not critical, but can be associated with itself or with one or more additional substances. It is possible to generate a signal by either of the two. Alternative embodiments using various other solid phases are also contemplated and within the scope of the invention. It is inside. For example, co-pending US patent corresponding to EP publication 0326100 Application 150,278 and US Patent Application 375,029 (EP Publication 0406). No. 473) (both by the applicant, here by reference Reaction complex that can be immobilized using a negatively charged polymer described in The ion-capture method of immobilizing the body is used in accordance with the present invention to provide rapid solution-phase immunochemical reaction. It is possible to respond. The immobilizable immune complex is a negatively charged polyanion. Between the immuno / immunocomplex and the pre-treated positively charged porous matrix Separated from the rest of the reaction mixture by interaction, EPO Publication 0273,115 Co-pending US patent application No. 921,979 (by the applicant , Incorporated herein by reference). , Detected using the various signal generation systems described above. The method of the present invention also includes automated and semi-automated systems in which the solid phase contains microparticles. It can also be adapted for use in systems that utilize microparticle technology. . Such systems include EPO application publication EP 0 425 633, respectively. And pending US patent application 425,6 corresponding to EP 0 424 634. 51 and US Pat. No. 425,643, which are hereby incorporated by reference. Included). Use of scanning probe microscopy (SPM) for immunoassays It is also a technique by which the monoclonal antibody of the present invention can be easily adapted. Scanning professional Probe microscopy, in particular atomic force microscopy, the capture phase, for example at least One of the monoclonal antibodies of the present invention is attached to a solid phase, and a scanning probe microscope is used. It is used to detect antigen / antibody complexes that may be present on the surface of the solid phase. Scanning tunnel Many immunoassay systems for detecting antigen / antibody complexes using a microscope Eliminates the need for commonly used signs. Such a system is pending , U.S. Patent Application 662,147. This patent application is the applicant And is hereby incorporated by reference. SPM can be used in many ways to monitor the specific binding reaction. State In one embodiment, one element of the specific binding partner (with the monoclonal antibody of the invention An analyte-specific substance) is attached to a surface suitable for scanning. This analyte Adhesion of specific substances can be achieved with plastic or metal surfaces according to methods well known to those skilled in the Alternatively, it may be adsorbed on a test piece containing a solid phase on the surface. Or invitation Specific to test specimens containing solid phases of conductive plastic, metal, silicon, or glass. Use of covalent bond of different binding partner (analyte specific substance) You can also Covalent attachment methods are well known to those of skill in the art and include specific binding partners on the test strip. Various means for irreversibly binding are included. Silicon or glass test piece If it is, activate its surface before attaching the specific binding partner. There must be. Triethoxyaminopropylsilane (Sigma Chem ical Co. , St. (Available from Louis, MO), triethoxyvinyl Lusilane (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), and (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane (Sigma) Activated silane compounds such as amino-, vinyl and thiol, respectively. It can be used to introduce various reactive groups. Binding partners such as activated surfaces Can be used directly for coupling (in the case of amino or thiol) or Lutaraldehyde, bis (succinimidyl) suberate, SPPD9 (succi Nimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate, SMCC (succinyl Midyl-4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate ), SIAB (succinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate) , And SMPB (succinimidyl 4- Further reaction with a linker such as [1-maleimidophenyl] butyrate) , The binding partner can be separated from the surface. Oxidation of vinyl groups for covalent bonding It is possible to provide a means of combination. It also binds to specific binding partners. Polymerize various polymers, such as polyacrylic acid, that can provide a number of attachment points. It can also be used as an anchor. Oxidation of various molecular weights on the amino surface Providing hydrophilic linkers with different sizes and capacity to react with strans. Can be offered. An example of an oxidizable dextran is Dextran T-40. (Molecular weight 40,000 Dalton), Dextran T-110 (Molecular weight 110,0 00 Dalton), Dextran T-500 (molecular weight 500,000 Dalton), Dextran T-2M (Molecular weight 2,000,000 Dalton) (all of these are P Harmacia, Piscataway, NJ) or F Contains icoll (molecular weight 70,000 Daltons) (available from Sigma) It is. Also, pending US patent application 150,278 filed January 29, 1988. And pending US patent application 375,029 filed July 7, 1989 The deviation is also due to the applicant, so refer to it. By using the techniques and chemistries described therein, Using polyelectrolyte interactions to immobilize specific binding partners on the surface of test pieces Can be The preferred method of attachment is by covalent means. Specific conclusion Subsequent to the attachment of the conjugation element, serum, protein should be added to minimize non-specific binding. The surface can be further treated with quality or other blocking agents. Also, the inspection In order to confirm the suitability of a fixed purpose, either the surface preparation site or the point of use It can also be scanned. The process of this scanning changes the specific binding properties of the test piece. That is not expected. Although the present invention primarily discloses the use of solid phases, the monoclonal antibodies of the present invention It is also contemplated that the body will be available in non-solid phase assay systems. this These assay systems are well known to those of skill in the art and are considered to be within the scope of the present invention. It is. The monoclonal antibodies of the invention are designed to detect the presence of HEV antibodies. Can be used as a positive control in the assay. HE in the test sample Using the HEV antigen as a capture phase in an assay to detect the presence of V antibody it can. These HEV antigens are found in viral lysates, HEV genome variants. Synthetic peptides of different immunogenic regions, and / or synthetic or natural antigens or antigenic Prepared by various means from recombinant proteins produced using pitopes be able to. These types of HEV antigens include those described herein. Also intended to be usable as a capture or detection phase in various assay formats That is. Substitute test serum for performing the assay according to procedures well known to those skilled in the art. To detect HEV antibody by using the monoclonal antibody of the present invention for It is possible to confirm that the reagents provided in the above have functioned properly. Provide reagents used for the assay in one or more vials or containers such as bottles. Well, like a monoclonal antibody or a cocktail of monoclonal antibodies in each container It is not intended that it can be provided in the form of a kit containing the individual reagents used in the assay. It was done. Also, these kits include cleaning, processing and indicator reagents such as It is possible to include vials or containers of other reagents needed to perform the assay . The following examples demonstrate the advantages and usefulness of the H1C119 monoclonal antibodies of the invention. The development, analysis, epitope mapping and clinical By describing the usefulness Shown. Methods used to develop monoclonal antibodies are well known in the art. Well-known, Kohler and Milstein,Nature 256 : 494 (1975) and in J. G. FIG. R. Hurrel,Mono colonial Hybridoma Antibodies: Techniqu es and Application , CRC Press, Inc. , Bo Follow the procedure reviewed in Co Raton, FL (1982). In order to carry out the present invention, HEV full-length orf-2 is fused to CKS. Recombinant DNA clones were constructed to contain the gene encoding the protein. This antigen expressed by this clone, called the SG-3 protein, was cloned into The mouse was used to immunize mice with immune spleen cells from this mouse. Immunoglobulin (Ig that reacts with HEV orf-2 when fused with Roman cells ) Class G₁(IgG₁) A hybridoma cell line secreting a monoclonal antibody Was prepared. This immunoglobulin is produced in mouse ascites and is Purification by chromatography. The examples presented below illustrate the true spirit and scope of the present invention. This is meant to mean that it is not meant to limit these.Example 1 Generation and analysis of hybridoma cell lines A. Production of recombinant HEV protein The plasmid pGEX-HEV-ORF-SG-3 (Fig. 1) was genelabed. , Inc. , Redwood City, California. This is the carboxy terminal 3 of the HEV orf-2 antigen in the pGEX expression system. Coupling 27 amino acids with glutathione S-transferase (GST) To Plasmid pJ0 in E. coli according to methods well known in the art. 201, a gene encoding orf-2 named SG-3 protein (previously P. O. Yarbough et al.) And cloned CMP-KDO It was expressed as a chimeric fusion protein with cetase (CKS). This CKS / HEV-SG-3 protein is isopropyl β-D thiogalactoside (IPT G) when incubated with whole cells in E. coli XL1-Blue strain Over 20% of the protein was expressed. 10 liters of this clone 170-260 g of wet cell pellet per fermentation by growing in a fermenter. The worst happened. B. CKS-HEV protein solubilization E. coli cells expressing SG-3 protein were treated with various proteases at pH 10. Dissolved in the presence of the zease inhibitor. CKS fusion protein is insoluble and Afterwards, it remained in the pellet. Wash pellets with various detergents to remove nonspecific The puffiness was removed. Of solubilization to Tris, pH 8.5 containing 0.5% SDS Later, the CKS fusion protein was evaluated by SDS-PAGE and gel densitometry. It was found to represent 50-60% of the total protein. This solubilized protein The quality was further analyzed by Sephacryl S-300HR column chromatography. Was purified. Fractions were analyzed by SDS-PAGE, pooled and by gel densitometry The purity was evaluated. The final purified protein was> 90% pure. C. Mouse immunity The immunization regimen (4 mice) consisted of a first immunization and 6 and 9 week boosts. Was. In the first immunization, 10 μg of CKS-H prepared as described above EV orf-2 SG- 3 Extract, solubilize, and purify recombinant protein in complete Freund's adjuvant It has become. This emulsion was inoculated intraperitoneally into 4 mice (Balb / c) . Three weeks after immunization, mouse sera were subjected to enzyme immunoassay (EIA) immunization as follows. Screened for reactivity. For beads coated with HEV SG-3 The test serum anti-HEV titer was measured in a sample diluent containing E. coli and CKS lysate. 2 × 10^FourAnd 10 for beads coated with CKS only.^ThreeMet. 1 Documented in co-pending US patent application 07 / 089,877 filed Jul. 9, 993 Apply HEV orf-2 synthetic peptide spB3-2 prepared as described The titer of this mouse serum antibody against the prepared beads is 2 × 10.²Met. Four weeks after the first immunization, 10 μg of immunity in incomplete Freund's adjuvant was used. Three mice were boosted intraperitoneally with a protein. At the 9th week, HE Post-immune anti-immunization from mouse No. 4 boosted with VSG-3 coated beads -HEV titer is 1 in analyte diluent containing no additives that interfere with undesired reactivity. . 5 × 10⁶, 2 x 10 in a sample diluent containing additives^Five, And spB3-2 Against 5.0 × 10^ThreeMet. The mice were then given 30 μg of immune protein intravenously (via the tail vein). Booster doses were given and used 3 days later for fusion. D. Establishment of hybridoma Aseptically remove the spleen from the non-immunized mouse and use the syringe plunger to remove it. 60 × 15mm with a small amount of Dulbecco's minimum essential (DME) medium crushed Normal mouse spleen cells were prepared by passing through a sieve provided in a Petri dish. This Spleen cell solution was washed with DME medium and the cell pellet was added to 0.8 mM in 10 mM Tris. 3% NH_FourRed blood cells were lysed by adding 1 ml of a solution of Cl for 1 minute . The cells were washed again, and DME medium containing 20% fetal bovine serum (FBS) Resuspended in 40 ml. On the day of the fusion, the immunized mouse was killed, the spleen was removed, and the spleen cells were diluted with 10 ml of DM. The procedure described above for the preparation of normal spleen cells was repeated except for resuspension in E medium and counting. Processed. Transform the conventional method (Kohler and Milstein, mentioned above) The spleen cells were then fused at a 1: 1 ratio with the SP2 / 0 myeloma cell line. 20 Contains% FBS, hypoxanthine, aminopterin, and thymidine (HAT) In the presence of 1.5 ml of DME medium, 24-1 x 10 per well in a multi-well tissue culture tray⁶Smear the spleen cells Clothed After 24 hours, 200,000 per 24 multi-well (0.5 ml) Normal spleen cells were added. HAT medium was added on the 5th day and replaced on the 7th day . Two of the 29 first hybridomas obtained from the fusion were directed against HEV Positive for antibody. Hybrid # 1 (H1) tested at 1:10 dilution The optical density (O of 1.155) with respect to the beads coated with SG-3 antigen. . D. And beads coated with only CKS and HEV spB3-2 beads Was negative for. Then, Goding,Monoclonal An tibodies: Principles and Practices , 2 nd ed, Academic Press, New York (1986) H1 was cloned at 1 cell per well by the limiting dilution technique described. E. FIG. Establishing clones by limiting dilution Count the number of viable cells in antibody-positive wells and perform 96 multiwell tissue culture An aliquot containing 100 cells was added to each of the trays in 20% fetal bovine blood. Kiyoshi (FBS) and 5x 10⁶The cells were added to DME medium containing individual normal mouse spleen cells. Adjust to 0.2 ml Implanted 8-channel pipetman with cell suspension Used for. This tray is humidified with 5% CO₂37 ° C in an incubator Incubate at 5 days and 7 days to supplement evaporation, or as needed Re-supplied. Wells with growth are 30-50% confluent (typically 1 0-21 days), using a well having only one colony as a sample, test for antibody activity. I tried Expand the cells by selecting a few positive wells from each hybrid. I let you. H1C119 with reactivity to HEV orf-2 (SG-3) A clone named was obtained. F. Production and purification of H1C119 monoclonal antibody The clones selected for further evaluation were screened in tissue culture T-flasks. Kale up, 10⁶BALB / c mouse in which individual cells were previously treated with pristane (Charles River Biotechnical Services , Inc. , Wilmington, MA) (see Hurrell, supra). It was injected intraperitoneally. Ascites fluid was collected 7-10 days after injection, centrifuged and frozen. P rotein A Seph arose Cl-4B (Pharmacia-LKB Biotechnol) Antibodies were affinity purified by Ogies, Piscataway, NJ). Bound monoclonal antibody was eluted from the column at pH 5.5. This is that Subtype is IgG₁Is shown. G. FIG. Screening and analysis of H1C119 monoclonal antibody Different antigens were immobilized on a solid phase (polystyrene beads) to screen and analyze antibodies. Enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) having the above: CKS-HEV recombinant or f-2 (SG-3) (prepared as described in Example 1) was unpurified (extracted and filtered). Solubilized) form (HEV protein with a purity of about 50-60%) or purified protein (pure) > 90%), and in another EIA, the synthetic coating is applied on the solid phase. Using the peptide spB3-2, CK was added to the solid phase to detect non-specific binding. S alone or non-HEV CKS recombinant protein was applied. Obtained from mouse serum, tissue culture supernatant, mouse ascites sample or above for all assays The obtained monoclonal antibody (MAb) H1C119 was added to phosphate buffered saline / Tris / EDTA, pH 7.8 is 20% goat serum, 10% fetal bovine serum, 1% bovine serum albumin, 0.2% Triton-X 100, containing with 0.1% sodium azide, Sample with or without addition of 1% E. coli lysate and 0.01% CKS Dilute 5-10 times serially with aliquots, then 200 μl with each solid phase Incubated for 1-2 hours at ° C. Then, wash the beads 3 times with 5 ml distilled water. did. 200 μl HRPO-labeled secondary antibody (goat anti-mouse IgG H + L) (Obtained from Kirkegaard and Perry Labs) Buffered saline with 10% goat serum, 10% fetal bovine serum and 0.15% Triton -Bound antibody was used at 0.3 μg / ml in binding diluent containing with -X100. Detected. Incubate the beads with the conjugate for 1 hour at 40 ° C. and repeat as before Washed. The O-phenylenediamine (OPD) substrate was added to the OPD diluent (Applicant's ) Freshly by adding 1 OPD tablet (Applicant) per 5 ml Prepare and add 300 μl of OPD substrate solution to each washed bead and in the dark, Incubated for 30 minutes at room temperature. Stop the reaction by adding 1 ml of sulfuric acid and add sulfuric acid. Measure the absorbance of the substrate at 492 nm 2 hours after addition. Was used to determine the amount of color produced. The results shown in Table I below show that the antibody is HEV o It was shown to be specific for the rf-2 region. Example 2 Competitive assay of antibodies against HEV HEV orf-2 (SG-3) or orf-2 and orf-3 regions are added to the solid phase. The encoded protein was applied. these The solid phase is known to contain HEV negative human plasma (negative control) or HEV Ab Pre-incubate overnight at room temperature with a 1: 2 dilution of human plasma (sample) in sample diluent. I got it. The beads are then washed and 1.000-2 in the absence of inhibitor. . 000 O.I. D. Of HEV orf-2 diluted as shown Add monoclonal antibody (MAb) to appropriate beads and incubate at 40 ° C for 1 hour. I got it. Then the beads were washed and HRPO-goat anti-mouse IgG (H + L) was added and the mixture was incubated at 40 ° C. for 2 hours. Wash the beads and then Label detection was performed using the OPD substrate as usual. Theoretically, a positive HEV Ab containing sample should reduce the signal by 50%. In the example presented, HEV Ab positive samples were used with SG-3 beads. 20% inhibition of MAb H1C119 when applied to HEV orf-2 / There was 54.2% inhibition with the orf-3 combination beads. these The results are shown in Table II below. Example 3 Competitive assay of orf-2 antigen for HEV HEV orf-2 (SG-3) protein is applied to the solid phase. This test form At an O.I. of 1.000-2,000. D. Can show the measured concentration of mono The clonal antibody (MAb) H1C119 was added to the sample together with the HEV antigen in the sample. A sufficient time and temperature (30-120) to allow binding to the MAb. Preincubate for 1 min at room temperature to 40 ° C). Then add the solid phase and mix. Mix the mixture and solid phase with any remaining A sufficient amount of time and temperature (temperature range) to allow the MAb to bind to the solid phase. (Environment: room temperature to 40 ° C., time range: 1-16 hours). That Then, a labeled second antibody (eg, horseradish peroxidase (HRPO) -labeled) And goat anti-mouse IgG) and incubation at 40 ° C. for 1-2 hours, or MA is capable of labeling itself and therefore allows the assay to be performed in one step. b is used to detect the binding of MAbs to the solid phase. Next, the detection of the label is performed. In other words, when using HRPO-labeled Ab, add OPD substrate and incubate for 30 minutes. Quenched, quenched with sulfuric acid and read at 492 nm). Positive HEV antigen-containing samples prevent MAb binding to the solid phase and give a signal of at least 50%. Reduce.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/02 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI // C12N 15/02 9282-4B C12N 15/00 C (C12N 5/10 C12R 1:91)

Claims

[Claims] 1. Hybridoma cell line A. T. C. C. By accession number HB11521 Secreted monoc that specifically binds to the HEV orf-2 encoded protein Ronal antibodies or fragments thereof. 2. A. T. C. C. Monochrome secreted by accession number HB11521 Null antibody or a fragment thereof. 3. Monocloner specifically binding to HEV orf-2 encoding protein Of the hybridoma cell line A. T. C. C. Entrustment A hybridoma cell line having the identifying characteristics of No. HB11521. 4. Hybridoma cell line A. T. C. C. Accession number HB11521. 5. Specific for HEVorf-2 antigen in HEV antigen or antibody immunoassay Adding a known amount of monoclonal antibody or fragment thereof that binds to Improved immunoassay. 6. In a competitive assay to determine the presence of HEV antibodies that may be present in the test sample So, a. A test sample suspected of containing HEV antibodies is treated with at least one HEV antigen. A solid phase to which is applied and a finger containing a signal-generating compound that produces a measurable signal. An indicator reagent and a monoclonal antibody that specifically binds to HEVorf-2 antigen, To form a test sample and solid phase and / or indicator reagent and solid phase antigen / antibody complex Contact for sufficient time and conditions, and b. Signal generated from a negative test sample indicating the presence of HEV antibody in the test sample Is detected in the test sample by detecting a decrease in the binding of the indicator reagent to the solid phase by comparison with Determining the presence of HEV antibodies, Competitive assay including 7. The monoclonal antibody is a hybridoma cell line A. T. C. C. Accession number The method according to claim 6, which is secreted by No. HB11521. 8. The signal generating compound is a luminescent compound, a chemiluminescent compound, an enzyme or a radioactive source. 7. The method of claim 6 selected from the group consisting of primes. 9. An assay kit for determining the presence of HEV in a test sample, comprising: Less specifically bound to the orf-2 region Assay kit containing a container containing both one monoclonal antibody or a fragment thereof. G. 10. The monoclonal antibody is a cell line A. T. C. C. Accession number HB11 Claim 521 having the binding specificity of a monoclonal antibody secreted by 521 The assay kit according to claim 9.