JPH09505726A - Recombinant infectious laryngotracheitis virus and their use - Google Patents

Recombinant infectious laryngotracheitis virus and their use

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JPH09505726A
JPH09505726A JP7509884A JP50988494A JPH09505726A JP H09505726 A JPH09505726 A JP H09505726A JP 7509884 A JP7509884 A JP 7509884A JP 50988494 A JP50988494 A JP 50988494A JP H09505726 A JPH09505726 A JP H09505726A
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laryngotracheitis virus
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Abstract

(57)【要約】 この発明は、ニワトリもしくは他の家禽を感染性喉頭気管炎ウイルスから保護するためのワクチンとして有用な組換え感染性喉頭気管炎ウイルス（ILTV）を提供する。さらに、この発明は、この発明のワクチンを接種された動物を、天然の感染性喉頭気管炎ウイルスに感染した動物から分別する方法を提供する。   (57) [Summary] This invention provides a recombinant infectious laryngotracheitis virus (ILTV) useful as a vaccine to protect chickens or other poultry from infectious laryngotracheitis virus. Furthermore, the invention provides a method of separating an animal vaccinated with the vaccine of the invention from an animal infected with a natural infectious laryngotracheitis virus.

Description

【発明の詳細な説明】 組換え感染性喉頭気管炎ウイルス及びそれらの使用 本願において、幾つかの刊行物が括弧内のアラビア数字によって参照されてい る。これらの刊行物の完全な引用は、明細書の最後、請求の範囲の直前に見出す ことができる。これらの刊行物の開示は、この発明が属する技術分野の状態をよ り完壁に記述するために、参照することにより本願に組込まれる。 発明の分野 この発明は、天然の感染性喉頭気管炎ウイルスおよび他の家禽病から家禽を保 護するワクチンにおいて有用な組換え感染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）ウイルスに関 する。 発明の背景 ウイルスＤＮＡを単離し、この単離されたＤＮＡを細菌プラスミドにクローニ ングする能力により、ウイルスワクチンの調製に利用可能なアプローチを大きく 広げている。この発明をなすために用いられる方法は、挿入、欠失及び単一もし くは多重塩基変化によるクローン化ウイルスＤＮＡ配列の変性に関与している。 次いで、この変性ＤＮＡをウイルスゲノムに再挿入してウイルスを非病原性にす る。これにより得られた生きているウイルスは、ワクチン中で、宿主動物におけ る免疫応答の誘発と疾患に対するこの動物の保護に用いることができる。 動物ウイルスの１つの群であるヘルペスウイルスまたはヘルペトウイルス科は 、このアプローチに馴染むウイルスの種類の例である。これらのウイルスは、そ れらの遺伝物質として100,000ないし200,000塩基対のＤＮＡを有している。重要 な ことには、このゲノムの幾つかの領域がウイルスの複製には必須ではないことが 、細胞培養物中においてイン・ビトロで、確認されている。ＤＮＡのこれらの領 域における変性は、ウイルスの病原性を低下させ、すなわち、ウイルスを弱毒化 させる。例えば、チミジンキナーゼ遺伝子を不活性化させることにより、ヒト単 純ヘルペスウイルスが非病原性となり（1）、ブタの仮性狂犬病ウイルスが非病 原性となる（2）。 繰返し領域の一部を除去することにより、ヒト単純ヘルペスウイルスは非病原 性となる（3、4）。繰返し領域はウイルス催腫瘍性に関連することが、マレック 病［Ｍarek's disease］ウイルスにおいて確認されている（5）。ヘルペスウイ ルス・サイミリ［saimiri］のある領域も同様に催腫瘍性と相互に関連付けられ ている（6）。繰返し領域の一部を除去することにより、仮性狂犬病ウイルスが 非病原性となる（米国特許Ｎo.4,877,737、1989年10月31日発行）。仮性狂犬病 ウイルスのある領域は、天然のワクチン株においては欠失していることが示され ており（7、8）、これらの欠失が、少なくとも部分的には、これらの株の病原性 欠如の原因であることが示されている。 ヘルペスウイルスがゲノムの様々な部分に必須ではない領域のＤＮＡを含むこ とは、一般に認められるところである。これらの領域の幾つかはウイルスの毒性 に関連付けられており、それらを変性することはより病原性の少ないウイルスに 繋がり、そこからワクチンを誘導することができる。 アルファヘルペスウイルスである感染性喉頭気管炎ウイル ス（ＩＬＴＶ）は、米国、欧州及びオーストラリアにおいて、卵生産上の損失や 死亡の原因となる家禽の重要な病原である（10）。これは、呼吸器抑制、喘ぎ及 び血混じりの分泌物の吐出によって特徴付けられる、ニワトリの急性疾患を引き 起こす。ウイルスの複製は呼吸管の細胞に限定され、気管への感染は組織のびら ん及び出血を引き起こす。 ニワトリにおいては、病変形成の程度の軽減及び臨床的徴候の減少に有効な薬 剤は見出されていない。細胞継代によって誘導された様々な変性形態のＩＬＴウ イルス及び／又は飽き飽きするような投薬計画を使う鳥類のワクチン接種が、感 受性の高いニワトリに許容可能な保護を授けるために用いられている。現在のＩ ＬＴＶワクチンの弱毒化の程度が限られているため、適正レベルのウイルス(保 護を与えるには十分であるが、群れの中に疾患を引き起こすには不十分)の維持 が保証されるように注意を払わなければならない（11−12）。さらに、これらの ウイルスは毒性を示すものに戻る可能性があり、これは疾患に対する保護を与え るというよりも疾患を引き起こしてしまう。 ＩＬＴＶは分子レベルで分析されている。ＩＬＴＶゲノムの制限マップが報告 されている（22−26）。幾つかの遺伝子、すなわち、チミジンキナーゼ（27、28 ）、糖蛋白gＢ（27、29、30）、リボヌクレオチド・リダクターゼ（27、31）、 カプシドp40（31、32）、のＤＮＡ配列が同定されている。 さらに、Ｓhepard et al.（53）は、感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムＤＮＡ のユニーク長領域［unique long region］に位置する幾つかの遺伝子がウイルス 複製に必須ではないことを 開示した。 出願人らは、ＩＬＴウイルスゲノムＤＮＡのユニーク短領域［unique short r egion］に、ＩＬＴＶの毒性に関連付けられる遺伝子であって、それらの遺伝子 における欠失がＩＬＴＶの弱毒化に繋がる遺伝子が含まれることを予期せず見出 した。特に、ＩＬＴウイルスの糖蛋白gＧ遺伝子における欠失が、ＩＬＴＶ毒性 株による引き続く攻撃に対するワクチンとして有用な弱毒化されたウイルスを生 じる結果となることが見出された。 また、出願人らは、ユニーク短領域の糖蛋白gＩ遺伝子における欠失もまたＩ ＬＴＶを弱毒化することを見出した。さらに、ＵＬ-47様の遺伝子であるＵＳ２ 遺伝子およびユニーク短領域の糖蛋白g60遺伝子における欠失もまたＩＬＴＶを 弱毒化するであろうことが期待されている。 ＩＬＴＶは健常動物では潜伏することが可能であり、それによりそれらの動物 をウイルスのキャリアとする。このため、非毒性ウイルスをワクチン接種された 動物と病気を引き起こす野生型もしくは天然ウイルスに感染した動物との区別が 可能であることは明らかに有利である。分別ワクチン及びそれに伴う診断試験の 開発は、仮性狂犬病の管理に有意義であることが実証済みである（55）。同様の 分別マーカーワクチンは、ＩＬＴＶが引き起こす疾患の管理に非常に大きな価値 があるであろう。分別診断の構築は、糖蛋白類の欠失に焦点が当てられている。 理論的には、診断マーカーとして選択される糖蛋白には次の特徴がある：（1） その糖蛋白およびその遺伝子は、組織培養物における感染性ウイルスの生成に必 須のものであるべきでは ない；（2）その糖蛋白は、動物体内で主要な生理学的応答を誘発するべきであ る；及び（3）その糖蛋白は、保護免疫性に重要な貢献をするものであるべきで はない。 ＩＬＴウイルスは、モノクローナル抗体によって同定されるように、少なくと も４つの主要糖蛋白を指定することが示されている（Ｍr＝205Ｋ、115Ｋ、90Ｋ 及び60Ｋ）。３つの糖蛋白は、抗原的に関連しているように思われる（Ｍr＝205 Ｋ、115Ｋ及び90Ｋ）（34-36）。 ３つの主要ＩＬＴウイルス糖蛋白、gＢ（29、30）、gＣ（27、51）及びg60（3 4、53）は文献に記述されている。これら３つの遺伝子は配列が決定されており 、ＩＬＴＶ遺伝子うちの２つはＨＳＶ糖蛋白gＢ及びgＣと相同であることが示さ れている。 これらのうち、ＩＬＴＶ gＢ遺伝子は必須遺伝子であり、欠失マーカー遺伝子 としては適していないであろう。さらに、ヘルペスウイルスのgＣ遺伝子は、中 和抗体の標的として（56）並びに細胞介在免疫の標的として（57）、保護免疫に 重要な貢献をなすことが示されている。したがって、gＣ遺伝子は欠失マーカー 遺伝子としては望ましくない。 上記糖蛋白をコードする他の遺伝子に関しては、それらが、診断ワクチンとし て用いることができる組換えＩＬＴウイルスを構築するための欠失の適切な候補 かどうかはわからない。 出願人らは、診断ワクチンとして用いることができる組換えＩＬＴウイルスを 構築するために安全に欠失させることが可能な、ＩＬＴウイルスゲノムのユニー ク短領域に位置する糖蛋白コーディング遺伝子が２つあることを予期せず見出し ている。そ れは糖蛋白gＧ遺伝子及び糖蛋白gＩ遺伝子である。糖蛋白gＧ遺伝子又は糖蛋白g Ｉ遺伝子での欠失という手法でＩＬＴウイルスを遺伝子工学処理することにより 、糖蛋白gＧ又は糖蛋白gＩを発現しないＩＬＴウイルスが産生される。ウイルス のユニーク短領域におけるこれら２つの遺伝子が、診断用ＩＬＴウイルスワクチ ンを創出するための欠失の適切な候補であることを教示もしくは示唆する先行技 術はない。 幾種類かのヘルペスウイルスに対して遺伝子工学処理がなされているが、組換 えＩＬＴＶの例は報告されていない。 巨大ゲノムを有するＤＮＡウイルス、例えばワクシニアウイルス及びヘルペス ウイルスを加工する能力が、これらの組換えウイルスを、動物にワクチン抗原及 び治療剤を送達するベクターとして用いることが可能であるという発見を導いた 。ヘルペスウイルスは、ベクターとしての開発に魅力的な候補である。これは、 それらの宿主範囲が本来は単一の標的種に限定されており（37）、しかも外来遺 伝子の安定なイン・ビボ発現を提供することが可能な潜伏感染を確立する能力を 有している（38）ためである。外来遺伝子産生物を発現させるために幾種類かの ヘルペスウイルス種が加工されているが、外来遺伝子産生物を発現する組換え感 染性喉頭気管炎ウイルスは構築されていない。上記感染性喉頭気管炎ウイルスは 、重大な家禽病を引き起こす微生物に由来するワクチン抗原を送達するためのベ クターとして用いることができる。ＩＬＴＶベクターを用いる多価ワクチンに含 まれる得る他のウイルス性抗原には、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニュ ーキャッスル病ウイルス （ＮＤＶ）、感染性嚢疾患［bursal disease］ウイルス（ＩＢＤＶ）及びマレッ ク病ウイルス（ＭＤＶ）が含まれる。このような多価組換えウイルスは、他の疾 患と同様に、ＩＬＴ疾患から保護する。同様に、この感染性喉頭気管炎ウイルス は、治療剤を送達するためのベクターとしても用いることができる。この発明に よるウイルスベクターによって送達されるこの治療剤は、ＩＬＴＶ複製の副生物 である生物学的分子でなければならない。これは、最初の分析における治療剤を ＤＮＡ、ＲＮＡもしくは蛋白質のいずれかに限定してしまう。これらのクラスの 化合物の各々から天然アヘンまでの治療剤の例があり、上記化合物には、アンチ センスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（39）、リボザイム（40）、サプレッサーt ＲＮＡ（41）、インターフェロン誘発二本鎖ＲＮＡ並びにホルモン（例えばイン シュリン）からリンホカイン（例えばインターフェロン及びインターロイキン） までの多くの蛋白治療剤の形態がある。しかしながら、これらの治療剤の発見並 びにそれらの構造及び機能の解明が、必然的にそれらをウイルスベクター送達系 に使用させるものではない。これは、適切な挿入部位が存在するかどうかを決定 するために実験が必要なためである。 発明の要約 この発明は、糖蛋白gＧ遺伝子中に欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルスを 包含する、組換え弱毒化感染性喉頭気管炎ウイルスを提供する。この弱毒化ウイ ルスは、感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチンとして有用である。 また、この発明は、組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであっ て、複製の際にこの組換えウイルスが糖蛋白gＧを産生しないように糖蛋白gＧ遺 伝子中に欠失もしくは他の改変を含む感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを有する ウイルスを提供する。 また、この発明は、糖蛋白gＧを産生しない組換え感染性喉頭気管炎ウイルス をワクチン接種されたニワトリもしくは他の家禽を天然の感染性喉頭気管炎ウイ ルスに感染したものから区別する方法を提供する。 また、この発明は、ＵＳ２遺伝子、ＵＬ47様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子又は糖蛋 白g60遺伝子中に欠失を含む感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを有する組換え弱 毒化感染性喉頭気管炎ウイルスを提供する。 また、この発明は、感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムの４つの必須ではない領 域を開示する：ヒトサイトメガロウイルス隣接早期［immediately early］（Ｈ ＣＭＶ ＩＥ）プロモータ、仮性狂犬病ウイルス糖蛋白gＸ（ＰＲＶ gＸ）プロモ ータ、及び感染性ウシヘルペスウイルスのウイルス1.1ＶＢ（ＢＨＶ-1.1、ＶＰ Ｂ）。これらの領域は、組換え感染性喉頭気管炎ウイルスベクターの構築におい て、外来遺伝子の挿入部位として用いることができる。 図面の簡単な説明 図１． ＩＬＴウイルスのユニーク短領域に由来する13,473塩基対の連続ＤＮＡ のヌクレオチド配列。この配列は、13,098塩基対の全ユニーク短領域に加えて、 その一端に273塩基対の繰返し領域を、他端に102塩基対の繰返し領域を有する。 図１のヌクレオチド配列は、内部繰返し配列と共に始まり、末端繰返 し配列内で終了する。ユニーク短領域はこの図の塩基対274から始まる。 図２． 感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ＵＳＤＡ83-2ゲノムのＡsp718 Ｉ制限酵素マップ。上図は、ＩＬＴＶゲノムにおいて見出されたユニーク長（ＵL ）、内部繰返し（ＩＲ）、ユニーク短（Ｕs）、及び末端繰返し（ＴＲ）区画を 示す。ＩＬＴＶゲノムにおけるＡsp718Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位のマップ は下に示されている。ＡないしＯの文字は、最大断片を“Ａ”で表してＡsp718 Ｉ制限エンドヌクレアーゼ断片を示す。断片“Ｌ”は2.5ｋｂ Ａsp718Ｉ断片、 断片“Ｈ”は5164ｂｐ Ａsp718Ｉ断片、並びに断片“Ｇ”は8.0ｋｂ Ａsp718Ｉ 断片である。アステリスクで印を付けた断片は、１ないし12回繰返される約900 ｂｐの超可変領域を含む。サイズ優性のものがないので、これらの断片は、エチ ジウムブロマイド染色ゲル上ではうまく分解できないサブモルの合計［submolar amounts］に見える。これらの繰返しの位置を図に屈曲した破線で示す。 図３． 感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ＵＳＤＡ83-2のユニーク短領域 内のオープンリーディングフレーム。ＩＬＴＶの13,473塩基対の短領域は、13,0 98塩基対の全ユニーク短領域に加えて、一端に273塩基対の繰返し領域を、他端 に102塩基対の繰返し領域を有する。このユニーク短領域は、13メチオニンで開 始される、110アミノ酸以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含ん でいる（より小さい入れ子式ＯＲＦを除く）。13 ＯＲＦの全ては、ＩＢＩマッ クベクター蛋白−ＤＮＡ整列オプション[ＩＢＩ ＭacＶector Ｐrotein to ＤＮ Ａ alignment option]（デフォルト設定）を用いて、ジーンバンク［Ｇenbank］ＤＮＡデータ ベースのエントレツ・リリース6.0ウイルス部門［Ｅntrez release 6.0 virus d ivision］に対して並べた。これらのＯＲＦの８つは１以上の他のウイルス遺伝 子と有意の相同を示した：ユニーク短（ＵＳ2）、プロテインキナーゼ（Ｐk）、 ユニーク長47様（ＵＬ47様）、並びに糖蛋白gＧ、g60、gＤ、gＩ及びgＥ 図４： 相同ベクター472-73.27におけるＤＮＡ挿入の詳細な描写。プラスミド4 72-73.27中に組立てられたＤＮＡ断片の方向を示す図。各々断片の起源は表中に 示されている。また、断片間のジャンクションの各々に位置する配列も示されて いる（配列番号20、21、22及び23）。各ジャンクションには、各断片を生成させ るために用いられた制限部位に加えて、これらの断片を結合するために用いられ た合成リンカー配列が記されている。また、幾つかの遺伝子コーディング領域及 び調節要素も与えられている。括弧［］内の制限部位は、構築中に破壊された部 位の残査を示す。以下の略語が用いられている：感染性喉頭気管炎ウイルス（Ｉ ＬＴＶ）、ヒトサイトメガロウイルス隣接早期（ＨＣＭＶ ＩＥ）、仮性狂犬病 ウイルス（ＰＲＶ）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（lacＺ）、大腸菌（Ｅ.coli ）、ポリアデニル化シグナル（poly Ａ）及び塩基対（ｂｐ）。 図５． 相同ベクター501-94におけるＤＮＡ挿入の詳細な描写。プラスミド501- 94中に組立てられたＤＮＡ断片の方向を示す図。各断片の起源は表中に示されて いる。また、断片間のジャンクションの各々に位置する配列も示されている（配 列番号 24、25、26及び27）。各ジャンクションには、各断片の生成に用いられた制限部 位に加えて、これらの断片の結合に用いられた合成リンカー配列が記されている 。また、幾つかの遺伝子コーディング領域及び調節要素の位置も与えられている 。括弧［］内の制限部位は、構築中に破壊された部位の残査を示す。以下の略語 が用いられている：感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ヒトサイトメガロ ウイルス隣接早期（ＨＣＭＶ ＩＥ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ラクト ースオペロンＺ遺伝子（lacＺ）、大腸菌（Ｅ.coli）、ポリアデニル化シグナル （poly Ａ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）及び塩基対（ｂｐ）。 図６． 相同ベクター544-55.12におけるＤＮＡ挿入の詳細な描写。プラスミド5 44-55.12中に組立てられたＤＮＡ断片の方向を示す図。各断片の起源は表中に示 されている。また、断片間のジャンクションの各々に位置する配列も示されてい る（配列番号28、29、30及び31）。各ジャンクションには、各断片の生成に用い られた制限部位に加えて、これらの断片の結合に用いられた合成リンカー配列が 記されている。また、幾つかの遺伝子コーディング領域及び調節要素の位置も与 えられている。括弧［］内の制限部位は、構築中に破壊された部位の残査を示す 。以下の略語が用いられている：感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、１型 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ-1）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、β−グル クロニダーゼ遺伝子(uidＡ)、大腸菌（Ｅ.coli）、ポリアデニル化シグナル（po ly Ａ）及び塩基対（ｂｐ）。 図７． 相同ベクター562-61.1FにおけるＤＮＡ挿入の詳細な 描写。プラスミド562-61.1Ｆ中に組立てられたＤＮＡ断片の方向を示す図。各断 片の起源は表中に示されている。また、断片間のジャンクションの各々に位置す る配列も示されている（配列番号32、33、34、35、36及び37）。各ジャンクショ ンには、各断片の生成に用いられた制限部位に加えて、これらの断片の結合に用 いられた合成リンカー配列が記されている。また、幾つかの遺伝子コーディング 領域及び調節要素の位置も与えられている。括弧［］内の制限部位は、構築中に 破壊された部位の残査を示す。以下の略語が用いられている：感染性喉頭気管炎 ウイルス（ＩＬＴＶ）、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ-1）、仮性狂犬病ウ イルス（ＰＲＶ）、β−グルクロニダーゼ遺伝子（uidＡ）、大腸菌（Ｅ.coli） 、ポリアデニル化シグナル（polyＡ）及び塩基対（ｂｐ）。 図８． 相同ベクター560-52.Ｆ1におけるＤＮＡ挿入の詳細な描写。プラスミド 560-52.Ｆ1中に組立てられたＤＮＡ断片の方向を示す図。各断片の起源は表中に 示されている。また、断片間のジャンクションの各々に位置する配列も示されて いる（配列番号38、39、40、41及び42）。各ジャンクションには、各断片の生成 に用いられた制限部位に加えて、これらの断片の結合に用いられた合成リンカー 配列が記されている。また、幾つかの遺伝子コーディング領域及び調節要素の位 置も与えられている。括弧［］内の制限部位は、構築中に破壊された部位の残査 を示す。以下の略語が用いられている:感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ） 、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ-1、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、β− グルクロニダーゼ遺伝子 （uidＡ）、大腸菌（Ｅ.coli）、ポリアデニル化シグナル（polyＡ）、ユニーク 長47（ＵＬ47様）、オープンリーディングフレーム４（ＯＲＦ４）、糖蛋白Ｇ（ gＧ）及び塩基対（ｂｐ）。 図９． 相同ベクター579-14.Ｇ2におけるＤＮＡ挿入の詳細な描写。プラスミド 579-14.Ｇ2中に組立てられたＤＮＡ断片の方向を示す図。各断片の起源は表中に 示されている。また、断片間のジャンクションの各々に位置する配列も示されて いる（配列番号43、44、45及び46）。各ジャンクションには、各断片の生成に用 いられた制限部位に加えて、これらの断片の結合に用いられた合成リンカー配列 が記されている。また、幾つかの遺伝子コーディング領域及び調節要素の位置も 与えられている。括弧［］内の制限部位は、構築中に破壊された部位の残査を示 す。以下の略語が用いられている：感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、１ 型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ-1）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、β−グ ルクロニダーゼ遺伝子（uidＡ）、大腸菌（Ｅ.coli）、ポリアデニル化シグナル （poly Ａ）及び塩基対（ｂｐ）。 図10． プラスミドベクター544-39.13におけるＤＮＡ挿入の詳細な描写。プラ スミド544-39.13中に組立てられたＤＮＡ断片の方向を示す図。各断片の起源は 表中に示されている。また、断片間のジャンクションの各々に位置する配列も示 されている（配列番号47、48、49及び50）。各ジャンクションには、各断片の生 成に用いられた制限部位に加えて、これらの断片の結合に用いられた合成リンカ ー配列が記されている。合成リンカー配列には、黒塗りのバーで下線が付されて いる。また、幾 つかの遺伝子コーディング領域及び調節要素の位置も与えられている。括弧［］ 内の制限部位は、構築中に破壊された部位の残査を示す。以下の略語が用いられ ている：仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、β−グルクロニダーゼ遺伝子（uidＡ ）、大腸菌（Ｅ.coli）、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ-1）、ポリアデニ ル化シグナル（poly Ａ）及び塩基対（ｂｐ）。 図11． プラスミドベクター388-65.2におけるＤＮＡ挿入の詳細な描写。プラス ミド388-65.2中に組立てられたＤＮＡ断片の方向を示す図。各断片の起源は表中 に示されている。また、断片間のジャンクションの各々に位置する配列も示され ている（配列番号51、52、53及び54）。各ジャンクションには、各断片の生成に 用いられた制限部位に加えて、これらの断片の結合に用いられた合成リンカー配 列が記されている。合成リンカー配列には黒塗りのバーで下線が付されている。 また、幾つかの遺伝子コーディング領域及び調節要素の位置も与えられている。 括弧［］内の制限部位は、構築中に破壊された部位の残査を示す。以下の略語が 用いられている：ヒトメガロサイトウイルス隣接早期（ＨＣＭＶ ＩＥ）、ラク トースオペロンＺ遺伝子（lacＺ）、大腸菌（Ｅ.coli）、仮性狂犬病ウイルス（ ＰＲＶ）、ポリアデニル化シグナル（poly Ａ）及び塩基対（ｂｐ）。 発明の詳細な説明 この発明は、ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失を有する感染性喉頭気管 炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであって、前記欠失が 糖蛋白gＧ遺伝子中にあるウイルスを提供する。この欠失はウイルスを弱毒化し 、感染 性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチンとしての使用に適したものとする。この 発明の好ましい態様は、Ｓ-ＩＬＴ-014と命名された組換え感染性喉頭気管炎で ある（ＡＴＣＣ受付番号ＸＸＸＸ。Ｓ-ＩＬＴ-014ウイルスは、特許手続上の微 生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に準じて、アメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクション［Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection］、1230 1 Ｐarklawn Ｄrive，Ｒockville，Ｍaryland 20852 Ｕ.Ｓ.Ａ.に、1993年９月2 2日に、ＡＴＣＣ受付番号 で寄託されている。）。この発明の他の 好ましい態様は、Ｓ-ＩＬＴ-002と命名されている組換え感染性喉頭気管炎ウイ ルスである。 この発明の目的のためには、“組換え感染性喉頭気管炎ウイルス”は、この技 術分野の熟練者に周知の組換え方法、例えば、材料及び方法の「組換えＩＬＴＶ の生成のための相同組換え手順」に説明されている方法、によって生成された、 生きている感染性喉頭気管炎ウイルスである。このウイルスは、感染性喉頭気管 炎ウイルスの複製に必須の遺伝学的物質は欠失してはいない。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧ遺伝子及びＵＳ２遺伝子に欠失を有する感染 性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイルスを提供する 。この発明の好ましい一態様は、Ｓ-ＩＬＴ-009と命名された組換え感染性喉頭 気管炎ウイルスである。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧ遺伝子及びＯＲＦ４遺伝子に欠失を有する感 染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え喉頭気管炎ウイルスを提供する。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧ遺伝子及びＵＬ47様遺伝子に欠失を有する感 染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイルスを提供す る。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧ遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、及びＵＬ47様遺伝 子に欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管 炎ウイルスを提供する。この発明の好ましい態様は、Ｓ-ＩＬＴ-015と命名され た組換え感染性喉頭気管炎ウイルスである。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧ遺伝子及び糖蛋白g60遺伝子に欠失を有する感 染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイルスを提供す る。この発明の好ましい態様は、Ｓ-ＩＬＴ-017と命名された組換え感染性喉頭 気管炎ウイルスである。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧ遺伝子及び糖蛋白gＩ遺伝子に欠失を有する感 染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイルスを提供す る。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧ遺伝子及びチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子 に欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎 ウイルスを提供する。 さらに、この発明は、ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失を有する感染性 喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであって、前 記欠失が糖蛋白gＧ遺伝子中にあり、かつ外来遺伝子の挿入をも有する組換え感 染性喉頭気管炎ウイルスを提供する。この外来遺伝子は、この組換え感染性喉頭 気管炎に感染した宿主細胞中において発現可能で あるように、感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムの非必須部位に挿入されている。 この発明の目的のためには、感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムの“非必須領域 ”とは、ウイルスゲノムのウイルス感染及び複製には必要ではない領域である。 感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムの以下の非必須部位が、ウイルスへの外来遺 伝子の挿入に好ましい部位である:チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ＵＳ２遺 伝予、ＵＬ47様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、糖蛋白gＧ遺伝子、糖蛋白g60遺伝子、 及び糖蛋白gＩ遺伝子。 感染性喉頭気管炎ウイルスゲノム中の非必須部位に挿入される外来遺伝子は、 スクリーニング可能なマーカー、例えば、大腸菌β−ガラクトシダーゼもしくは 大腸菌β−グルクロニダーゼをコードしてもよい。 感染性喉頭気管炎ウイルスゲノム中の非必須部位に挿入される外来遺伝子は抗 原性ポリペプチドをコードしてもよい。この抗原性ポリペプチドは、宿主細胞に 導入されたときに、鳥類の疾患を引き起こす因子（この因子から抗原が誘導され 、もしくは誘導可能である）に対する保護抗体の産生を誘発する。このような抗 原性ポリペプチドは、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、 感染性嚢疾患ウイルス、及びマレック病ウイルスから誘導してもよく、又は誘導 することが可能であってもよい。また、このような抗原性ポリペプチドは、鳥類 脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフル エンザウイルス、鳥類アデノウイルス、フ ォウルポックス（鶏痘）ウイルス［fowl pox virus］、鳥類コロナウイルス、鳥 類ロータウイルス、幼鳥貧血因子、サルモネラ種［Ｓalmonella spp.］、大腸菌 ［Ｅ.coli.］、パスツレラ種［Ｐasteurella spp.］、ボルデテラ種［Ｂordetel la spp.］、アイメリア種［Ｅiｍeria spp.］、ヒストモナス種［Ｈistomonas s pp.］、 トリコモナス種［Ｔrichomonas spp.］、家禽線虫類、条虫類、吸虫類 、家禽ダニ類／ノミ類、家禽プロトゾアから誘導してもよく、又は誘導可能であ ってもよい。 外来遺伝子は、内在性の感染性喉頭気管炎ウイルス上流側プロモータの制御の 下にあってもよく、あるいは非相同上流側プロモータの制御の下にあってもよい 。この非相同上流側プロモータは、ＨＣＭＶ ＩＥプロモータ、ＰＲＶ gxプロモ ータ、及びＢＨＶ-1.1ＶＰ８プロモータから誘導することができる。 さらに、この発明は、ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失もしくは他の改 変を有する感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイ ルスであって、複製の際にこの組換えウイルスが糖蛋白gＧを産生しないように 、前記欠失もしくは改変が糖蛋白gＧ遺伝子中にあるウイルスを提供する。以下 の組換えウイルスがこの発明の好ましい態様である：Ｓ-ＩＬＴ-002、Ｓ-ＩＬＴ -014、Ｓ-ＩＬＴ-009、Ｓ-ＩＬＴ-015、及びＳ-ＩＬＴ-017と命名された組換え 感染性喉頭気管炎ウイルス。 さらに、この発明は、ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失もしくは他の改 変を含む感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを有する組換え感染性喉頭気管炎ウイ ルスであって、複製の際にこの組換えウイルスが糖蛋白gＩを産生しないように 、前記 欠失もしくは改変が糖蛋白gＩ遺伝子中にあるウイルスを提供する。 さらに、この発明は、ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失もしくは他の改 変を有する感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイ ルスであって、複製の際にこの組換えウイルスが糖蛋白gＧ及び糖蛋白gＩを産生 しないように、前記欠失もしくは改変が糖蛋白gＧ遺伝子及び糖蛋白gＩ遺伝子中 にあるウイルスを提供する。 さらに、この発明は、ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失を含む感染性喉 頭気管炎ウイルスゲノムを有する組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであって、前 記欠失がＵＳ２遺伝子、ＵＬ47様遺伝子、又は糖蛋白g60遺伝子中にあるウイル スを提供する。これらの遺伝子のいずれにおける欠失もウイルスを弱毒化し、そ れを感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチンとしての使用に適したものにす るものと期待される。 さらに、この発明は、感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムのユニーク短領域内に 挿入された外来遺伝子を有する組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであって、ただ し、前記挿入がプロテインキナーゼ遺伝子、糖蛋白gＤ遺伝子、糖蛋白gＥ遺伝子 及びＯＲＦ10遺伝子中にはないウイルスを提供する。好ましい挿入部位は、ＵＳ ２遺伝子、ＵＬ47様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子及び糖蛋白g60遺伝子である。 外来遺伝子は、これらの部位のいずれにも、この発明の組換え感染性喉頭気管 炎ウイルスに感染している宿主細胞において発現し得るように挿入することがで きる。 このように挿入された外来遺伝子は、スクリーニング可能なマーカー、例えば 、大腸菌β−ガラクトシダーゼ又は大腸菌β−グルクロニダーゼをコードしても よい。 このように挿入された外来遺伝子は抗原性ポリペプチドをコードしてもよい。 この抗原性ポリペプチドは、宿主細胞に導入されたときに、鳥類の疾患を引き起 こす因子（この因子から抗原が誘導され、もしくは誘導可能である）に対する保 護抗体の産生を誘発する。このような抗原性ポリペプチドは、感染性気管支炎ウ イルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性嚢疾患ウイルス、及びマレック病 ウイルスから誘導してもよく、又は誘導することが可能であってもよい。また、 このような抗原性ポリペプチドは、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、 鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、 フォウルポックスウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロータウイルス、幼鳥貧 血因子、サルモネラ種、大腸菌、パスツレラ種、ボルデテラ種、アイメリア種、 ヒストモナス種、トリコモナス種、家禽線虫類、条虫類、吸虫類、家禽ダニ類／ ノミ類、家禽プロトゾアから誘導してもよく、又は誘導可能であってもよい。 このように挿入された外来遺伝子は、内在性の感染性喉頭気管炎ウイルス上流 側プロモータの制御の下にあってもよく、あるいは非相同上流側プロモータの制 御の下にあってもよい。この非相同上流側プロモータは、ＨＣＭＶ ＩＥプロモ ータ、ＰＲＶ gxプロモータ、及びＢＨＶ-1.1ＶＰ８プロモータから誘導するこ とができる。 さらに、この発明は、適切な担体と、有効免疫量のこの発明の組換え感染性喉 頭気管炎ウイルスのいずれかとを包含する感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワ クチンを提供する。このワクチンは、不活性化された、もしくは生きている組換 えウイルスのいずれかを含むことができる。 組換えウイルスに適切な担体はこの技術分野において周知であり、蛋白質類、 糖類等が含まれる。そのような適切な担体の一例は、加水分解された蛋白質、ラ クトース等の１以上の安定化剤を含有する生理学的にバランスをとった培養培地 である。好ましくは、組織倍溶液を取り、安定化剤、例えば安定化され、加水分 解された蛋白質を添加することにより、生ワクチンを作製する。好ましくは、不 活性化ワクチンは、ウイルスを不活性化した後、組織培養液を直接用いる。 さらに、この発明は、適切な担体と有効免疫量の組換え感染性喉頭気管炎ウイ ルスとを含有するワクチンであって、前記組換え感染性喉頭気管炎ウイルスが、 ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルスゲノ ムを含み、この欠失が糖蛋白gＧ遺伝子中にあるワクチンを提供する。 この発明の好ましい態様は、適切な担体と、有効免疫量の下記ウイルスのいずれ か１つとを含有するワクチンである：Ｓ-ＩＬＴ-014、Ｓ-ＩＬＴ-002、Ｓ-ＩＬ Ｔ-009、Ｓ-ＩＬＴ-015、及びＳ-ＩＬＴ-017と命名された組換え感染性喉頭気管 炎ウイルス。 さらに、この発明は、感染性喉頭気管炎ウイルス及び１以上の他の鳥類疾患の ための多価ワクチンであって、ユニーク短領域に欠失を有する感染性喉頭気管炎 ウイルスゲノムを含み、こ の欠失は糖蛋白gＧ遺伝子中にあり、かつウイルスゲノムの非必須部位に外来遺 伝子の挿入を含む組換えウイルスの有効免疫量を含有する多価ワクチンを提供す る。 この外来遺伝子は抗原性ポリペプチドをコードする。この抗原性ポリペプチド は、鳥類に疾患を引き起こす因子（この因子から前記抗体が誘発され、あるいは 誘導可能である）に対する宿主細胞の保護抗体産生を誘発する。 外来遺伝子は、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染 性嚢疾患ウイルス、及びマレック病ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオ ウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノ ウイルス、フォウルポックスウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロータウイル ス、幼鳥貧血因子、サルモネラ種、大腸菌、パスツレラ種、ボルデテラ種、アイ メリア種、ヒストモナス種、トリコモナス種、家禽線虫類、条虫類、吸虫類、家 禽ダニ類／ノミ類、家禽プロトゾアから誘導してもよく、又は誘導可能であって もよい。 さらに、この発明は、適切な担体と有効免疫量の組換え感染性喉頭気管炎ウイ ルスとを含有するワクチンであって、前記組換え感染性喉頭気管炎ウイルスがウ イルスゲノムのユニーク短領域に欠失もしくは他の改変を有する感染性喉頭気管 ウイルスゲノムを含み、この欠失もしくは改変が、複製の際にこの組換えウイル スが糖蛋白gＧを産生しないように糖蛋白gＧ遺伝子中にあるワクチンを提供する 。この発明の好ましい態様は、適切な担体と、有効免疫量の下記ウイルスのいず れか１つとを 含有するワクチンである：Ｓ-ＩＬＴ-014、Ｓ-ＩＬＴ-002、Ｓ-ＩＬＴ-009、Ｓ- ＩＬＴ-015及びＳ-ＩＬＴ-017と命名された組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 さらに、この発明は、適切な担体と有効免疫量の組換え感染性喉頭気管炎ウイ ルスとを含有するワクチンであって、前記組換え感染性喉頭気管炎ウイルスがウ イルスゲノムのユニーク短領域に欠失もしくは他の改変を有する感染性喉頭気管 炎ウイルスゲノムを含み、この欠失もしくは改変が、複製の際にこの組換えウイ ルスが糖蛋白gＩを産生しないように糖蛋白gＩ遺伝子中にあるワクチンを提供す る。 さらに、この発明は、適切な担体と有効免疫量の組換え感染性喉頭気管炎ウイ ルスとを含有するワクチンであって、この組換え感染性喉頭気管炎ウイルスがウ イルスゲノムのユニーク短領域に欠失もしくは他の改変を有する感染性喉頭気管 炎ウイルスゲノムを含み、この欠失もしくは改変が、複製の際にこの組換えウイ ルスが糖蛋白gＧ及び糖蛋白gＩを産生しないように糖蛋白gＧ遺伝子及び糖蛋白g Ｉ遺伝子中にあるワクチンを提供する。 さらに、この発明は、適切な担体と有効免疫量の組換え感染性喉頭気管炎ウイ ルスとを含有するワクチンであって、この組換え感染性喉頭気管炎ウイルスがウ イルスゲノムのユニーク短領域に欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルスゲノム を含み、この欠失がＵＳ２遺伝子、ＵＬ47様遺伝子又は糖蛋白g60遺伝子中にあ るワクチンを提供する。 さらに、この発明は、適切な担体と有効免疫量の組換え感染 性喉頭気管炎ウイルスとを含有するワクチンであって、この組換え感染性喉頭気 管炎ウイルスがウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失を有する感染性喉頭気管 炎ウイルスゲノム及びウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来遺伝子を含 み、この欠失がＵＳ２遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、ＵＬ47様遺伝子又は糖蛋白g60 遺伝子中にあるワクチンを提供する。 この外来遺伝子は、鳥類の疾患を引き起こす因子（この因子から抗原が誘導さ れ、もしくは誘導可能である）に対する宿主細胞の保護抗体産生を誘発する抗原 性ポリペプチドをコードする。 外来遺伝子は、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染 性嚢疾患ウイルス、及びマレック病ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオ ウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノ ウイルス、フォウルボックスウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロータウイル ス、幼鳥貧血因子、サルモネラ種、大腸菌、パスツレラ種、ボルデテラ種、アイ メリア種、ヒストモナス種、トリコモナス種、家禽線虫類、条虫類、吸虫類、家 禽ダニ類／ノミ類、家禽プロトゾアから誘導してもよく、又は誘導可能であって もよい。 さらに、この発明は、適切な担体と有効免疫量の組換え感染性喉頭気管炎ウイ ルスとを含有するワクチンであって、この組換え感染性喉頭気管炎ウイルスがウ イルスゲノムの非必須部位に挿入された外来遺伝子を有する感染性喉頭気管炎ウ イルスゲノムを含むワクチンを提供する。この外来遺伝子は、鳥類 の疾患を引き起こす因子(この因予から抗原が誘導され、もしくは誘導可能であ る)に対する宿主細胞の保護抗体産生を誘発する抗原性ポリペプチドをコードす る。 外来遺伝子は、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染 性嚢疾患ウイルス、及びマレック病ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオ ウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノ ウイルス、フォウルポックスウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロータウイル ス、幼鳥貧血因子、サルモネラ種、大腸菌、パスツレラ種、ボルデテラ種、アイ メリア種、ヒストモナス種、トリコモナス種、家禽線虫類、条虫類、吸虫類、家 禽ダニ類／ノミ類、家禽プロトゾアから誘導してもよく、又は誘導可能であって もよい。 さらに、この発明は、感染性喉頭気管炎ウイルスに対する動物の免疫方法であ って、有効免疫用量のこの発明のいずれかのワクチンをニワトリもしくは他の家 禽に投与することを包含する方法を提供する。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧを産生しない組換えウイルスを有効免疫量ワ クチン接種されたニワトリもしくは他の家禽を、天然感染性喉頭気管炎ウイルス に感染したものから分別する方法を提供する。この方法は、ニワトリもしくは他 の家禽に由来する体液のサンプルを、感染性喉頭気管炎ウイルスの糖蛋白gＧ及 び天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリもしくは他の家禽において 通常発現する他の抗原の少なくとも１種の存在について分析することを包含する 。この体液中 に、天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリもしくは他の家禽におい て通常発現する抗原が存在し、かつ糖蛋白gＧが存在しないことは、組換えワク チンをワクチン接種され、天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染していないこと を示している。体液中の糖蛋白gＧ及び抗原の存在は、体液中で抗原及び糖蛋白g Ｇに特異的な抗体を検出することによって決定することができる。 さらに、この発明は、糖蛋白gＩを産生しない組換え感染性喉頭気管炎ウイル スを有効免疫量ワクチン接種されたニワトリもしくは他の家禽を、天然感染性喉 頭気管炎ウイルスに感染したものから分別する方法を提供する。この方法は、ニ ワトリもしくは他の家禽に由来する体液のサンプルを、感染性喉頭気管炎ウイル スの糖蛋白gＩ及び天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリもしくは 他の家禽において通常発現する他の抗原の少なくとも１種の存在について分析す ることを包含する。この体液中に、天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニ ワトリもしくは他の家禽において通常発現する抗原が存在し、かつ糖蛋白gＩが 存在しないことは、組換えワクチンをワクチン接種され、天然感染性喉頭気管炎 ウイルスに感染していないことを示している。体液中の糖蛋白gＧ及び抗原の存 在は、体液中で抗原及び糖蛋白gＩに特異的な抗体を検出することによって決定 することができる。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧ及び糖蛋白gＩを産生しない組換えウイルスを 有効免疫量ワクチン接種されたニワトリもしくは他の家禽を、天然感染性喉頭気 管炎ウイルスに感染した ものから分別する方法を提供する。この方法は、ニワトリもしくは他の家禽に由 来する体液のサンプルを、感染性喉頭気管炎ウイルスの糖蛋白gＧ及びgＩ、並び に天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染した動物において通常発現する他の抗原 の少なくとも１種の存在について分析することを包含する。この体液中に、天然 感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリもしくは他の家禽において通常発 現する抗原が存在し、かつ糖蛋白gＧ及びgＩが存在しないことは、ワクチンをワ クチン接種され、天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染していないことを示して いる。体液中の抗原並びに糖蛋白gＧ及びgＩの存在は、体液中で抗原並びに糖蛋 白gＧ及びgＩに特異的な抗体を検出することによって決定することができる。 さらに、この発明は、感染性喉頭気管炎ゲノムＤＮＡのユニーク短領域に外来 ＤＮＡを挿入することによって組換え感染性喉頭気管炎ウイルスを生成させるた めの相同ベクターであって、二本鎖外来遺伝子から本質的になる二本鎖ＤＮＡ分 子を含み、この二本鎖外来遺伝子のいずれかの側には、ゲノムＤＮＡのユニーク 短領域に位置するＤＮＡに相同の二本鎖ＤＮＡが隣接しているが、このフランキ ング配列は糖蛋白gＤ遺伝子、糖蛋白gＥ遺伝子、プロテインキナーゼ遺伝子、及 びＯＲＦ10遺伝子と相同ではない相同ベクターを提供する。この外来遺伝子は、 スクリーニング可能なマーカー、例えば、大腸菌β−ガラクトシダーゼ又は大腸 菌β−グルクロニダーゼをコードすればよい。 さらに、この発明は、感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムＤＮＡ に挿入されている、スクリーニング可能なマーカーをコードするＤＮＡを欠失さ せることによって組換え感染性喉頭気管炎ウイルスを生成させるための相同ベク ターであって、欠失させようとする二本鎖ＤＮＡから本質的になる二本鎖ＤＮＡ 分子を含み、この欠失させようとする二本鎖ＤＮＡの各々の側部に、感染性喉頭 気管炎ウイルス糖蛋白gＧ遺伝子、糖蛋白gＩ遺伝子、ＵＳ２遺伝子、又はＵＬ-4 7様遺伝子に相同の二本鎖ＤＮＡが隣接している相同ベクターを提供する。この 発明の好ましい態様は、ホモロジー・ベクター［Ｈomology Ｖector］544-55.12 、ホモロジー・ベクター562-61.1F、ホモロジー・ベクター472.73.27、ホモロジ ー・ベクター560-52.F1及びホモロジー・ベクター579-14.Ｇ２と命名された相同 ベクターである。 材料及び方法 伝染性喉頭気管炎ウイルスストックサンプルの調製 伝染性喉頭気管炎ウイルスストックのサンプルは、225cm2のフラスコにあるニ ワトリの一次胚腎臓細胞（ＣＥＫ；Ｓpafas,Ｉnc.から得た）またはニワトリの 一次腎臓細胞（ＣＫ；Ｈyvacから供給された受精卵から孵ったヒヨコから得た） （50）を、ハンクス塩（ＢＭＥ）、10％のブロモエチルアミン（ＢＥＩ）で処理 したウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のグルタミン、２％のペニシリン／ストレプ トマイシン（Ｐ／Ｓ）ストック及び１％の重炭酸ナトリウムストック（これらの 化合物はＩrvine Ｓcientific又は同等の供給者から得た。今後、成長培地は完 全ＢＭＥ培地と呼ぶ）を含む１xイーグル基礎培地（変性）に105−106pfuを 含むウイルスストック0.5mlで感染し調製した。ウイルスストックはその後、４ −５日後に収穫した。感染した培地と細胞は殺菌した全乳を20％含む完全培地に 再懸濁し、−70℃で凍結保存した。 感染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡの調製 ウイルスで感染後４日から５日、細胞と培地をそれぞれのフラスコから15mlの 円錐遠心管にこすりとって1700xgで５分間、４℃で沈殿させてペレットとした。 50％程度のウイルスが培地中にいるかもしれないので、上清は保存し以下に述べ るように処理した。細胞ペレットは一管につき１mlのＰＢＳに再懸濁し、一つに して再び1700xgで５分間遠心した。ペレットはフラスコあたり１mlの、10mＭト リス塩酸溶液pＨ7.5、１mＭＥＤＴＡ、1.5mＭ ＭgＣl2を含む緩衝液に再懸濁し 、15分間４℃で培養した。１フラスコあたり25μlの20％ＮＰ40を加え、その後 その混合物をＡ乳棒を使ったダウンス・ホモジナイザー[dounce homogenizer]で ホモジネートした。調製物を1700xgで10分間４℃で遠心し、上清を保持した。10 μlの0.5ＭＥＤＴＡ、50μlの20％ＳＤＳ及び25μlの10mg/mlプロテイナーゼＫ を（元のフラスコごとに）上清に加えた。幾つかの場合には、これをその後、細 胞培地上清から得たウイルスと一緒にした（上記参照）。この混合物はその後65 ℃で１−16時間処理し、100mＭトリス塩酸溶液、pＨ８で飽和したフェノールで ２回抽出した。水層のＤＮＡは、その後、３Ｍ酢酸ナトリウム（１／10量）と2. 5倍の100％エタノールを加えることによって沈殿さ せた。 培地からウイルスを得るために、細胞培地上清を23,500xgで30分間遠心分離し て、よく水を切った。このペレットを上記のプロテイナーゼ Ｋを含む混合物に 上述したように再懸濁した。ＤＮＡペレットをフラスコごとに20μlのＴＥに再 懸濁した。この時点でさらに実験に使うこともできたし、あるいは、さらに膵臓 のＲＮアーゼＡで処理してＲＮＡを除去し、その後フェノール抽出してエタノー ル沈殿してＤＮＡを得ることもできた。ウイルスのＤＮＡミニプレップ［minipr ep］を調製するために、感染した10cm皿をこすりとって、円錐遠心管にいれ、５ 分間1000xgで遠心分離した。細胞培地上清は保存し、上記のように処理した。細 胞のペレットをそれぞれ、0.5mlの10mＭトリス塩酸溶液、pＨ7.5、１mＭ ＥＤＴ Ａ、0.5％ＮＰ40に再懸濁し、室温で10分間培養した。10μlの10mg/ml ＲＮアー ゼＡを加え、この調製液を５分間1000xgで遠心した。25μlの20％ＳＤＳと25μl の10mg/mlプロテイナーゼＫを上清に加え、それが用いられる場合には、すべて の調製液を細胞培地からのウイルスペレットに加えた。混合物を55−65℃で１時 間培養し、緩衝液で飽和したフェノールで抽出し、１mlのエタノールを加えて沈 殿させた。ＤＮＡペレットを20μlのＴＥに懸濁させ、４℃で保存した。 ポリメラーゼ・フィルイン反応 ＤＮＡを、50mＭトリス、pＨ7.4、50mＭ ＫＣl、 5mＭ ＭgＣl2と400μＭの４ つのデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ含 む緩衝液に再懸濁した。10単位のクレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｇibco ＢＲＬ ）を加え、反応を室温で15分間進ませた。ＤＮＡを上記のようにフェノールで抽 出し、エタノールで沈殿させた。 ＤＮＡ配列決定 配列決定はシクエナーゼキット［Ｓequenase Ｋit］（ＵＳ Ｂiochemicals） とα33Ｓ-ｄＡＴＰ（Ｎew Ｅngland Ｎuclear）を使って行った。ｄＧＴＰ混合 物とｄＩＴＰ混合物の両方を使って反応を行い、圧縮領域を明らかにした。ある いは、圧縮された領域をホルムアミドゲル上で分析した。鋳型は二本鎖のプラス ミドサブクローンまたは一本鎖のＭ13サブクローンであり、プライマーは配列決 定する挿入部位の外側のベクターか、あるいは以前得た配列に対して作製した。 得られた配列をを集めて、Ｄnastarソフトウェアを使って比較した。得られた配 列の操作と比較はＩＢＩ ＭacＶector、コーラルソフトウェア［Ｃoral Ｓortwa re］のＳuperclone and Ｓupersee Ａlignプログラムで行った。 分子生物学的技術 制限エンドヌクレアーゼによる切断、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡ抽出、 連結反応、キナーゼによるリン酸化、ホスファターゼによる処理、バクテリア培 養物の増殖、ＤＮＡによるバクテリアの形質転換のような方法を含むバクテリア とＤＮＡの操作の技術と他の分子生物学的方法は説明してある（42、43）。ポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って、様々なＤＮＡ を操作するのに都合の良い制限部位を導入した（44）。一般的に、増幅したフラ グメントの大きさは500塩基対より小さく、増幅したフラグメントの重要な領域 はＤＮＡ配列決定で確認した。注記した以外では、これらの技術をほとんど変化 させずに利用した。 ＤＮＡのサザンブロッティング サザンブロッティングの一般的な方法は、Ｍaniatis et al.（1982）と、Ｓam brook et al.（1989）（42、43）からとった。ＤＮＡを0.4Ｍ ＮaＯＨの中のナ イロン膜（Ｂiorad Ｚeraprobe）にブロットし、0.25Ｍ Ｎa2ＨＰＯ4、pＨ7.2、 １mＭ ＥＤＴＡ、7％ＳＤＳを含む溶液中で、５分間、65℃でプレハイブリダイ ゼーションする。ラベルしたプローブを加えたが、これはＢoehringer-Ｍannhei mのＧeniusTM非放射性ラベルキットを用いて、ランダムプライミングによってラ ベルした。ハイブリッド形成は65℃で一晩行つた。膜を２回、40mＭ Ｎa2ＨＰＯ4 、pＨ7.2、１mＭＥＤＴＡ、５％ＳＤＳで洗浄し、その後２回、40mＭ Ｎa2ＨＰ Ｏ4、pＨ7.2、１mＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳで30分間、それぞれ65℃で洗浄した 。結合したプローブの検出はＢoehringer-ＭannheimのＧeniusTM非放射性検出キ ットを用いて行った。 組換えＩＬＴウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移入 この方法はＣhenとＯkayama（1987）（45）のＣaＣl2法に基づいて、次のよう に変更した。組換えＩＬＴウイルスの生成は、相同的組換えが、ＩＬＴウイルス ＤＮＡと、適当なヘルペス ウイルスをクローニングした配列が隣にある所望の外来性のＤＮＡを含んだプラ スミド相同性ベクターの間で起こることによる。プラスミドＤＮＡ(10-40mg)を 、最終濃度が0.25Ｍ ＣaＣl2の溶液250mlに加えた。50mＭ ＭＯＰＳ(pＨ6.95)、 280mＭ ＮaＣlと1.5mＭ Ｎa2ＨＰＯ4を含んだ等量の緩衝液を、ＤＮＡ／ＣaＣl2 溶液に加えた。室温で10分後、混合物を一滴ずつ6cm皿の維持培地上のＣＥＫ細 胞に加え、39℃で４から５時間おいた。細胞をＰＢＳで一回、20％グリセロール ＰＢＳ溶液で１回２分間洗浄し、再びＰＢＳで洗浄した後、維持培地を加えた。 1.5mlのＩＬＴウイルスストックを培地に加え、細胞を一晩培養した。次の日、 新鮮な維持培地を加え、細胞をさらに２日培養した。形質移入ストックを収穫し てアリコートし、−70℃で凍結した。 ＩＬＴＶのサブゲノムＤＮＡフラグメントを生成する方法 クローニングされた重複サブゲノムフラグメントの共形質移入によるヘルペス ウイルス生成の可能性が仮性狂犬病ウイルスで示された（46）。もし欠失と挿入 またはそのどちらかが、直接サブゲノムフラグメントに、共トランスフェクショ ンに先立って行われると、この方法はゲノムが変化したウイルスを高頻度に生み 出し、組換えウイルスを精製するために必要なスクリーニングの量を大幅に減少 することができる。我々は重複コスミドの方法を用いて制限酵素部位の地図を作 った。 重複ＩＬＴＶサブゲノムフラグメントを含むサブクローンのライブラリーは次 のように作製した。ＵＳＤＡ ＩＬＴＶ株83-2をＳ-ＩＬＴ-001と命名した。10m Ｍトリス塩酸溶液、pＨ8.0、１mＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）0.5ml中に、およそ20μgの（Ｓ-ＩＬＴ-001から得た）ＩＬＴ Ｖ ＤＮＡを、以前記述されたように（46）25ゲージニードルに２回通すことに よってはぎ取った。このＤＮＡを、50mＭトリス塩酸溶液、pＨ8.0、１mＭＥＤＴ Ａと0.3Ｍ ＮaＣl中の15−40％グリセロール勾配で、5.5時間、274,000xgで遠心 した。フラクションを0.3％アガロースゲル上で分析し、35-50kbのＤＮＡを含む ものを集めて、ＴＥで２倍に希釈し、10分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムと2.5倍 量のエタノールで沈殿させた。この管を１時間、109,000xg、10℃で遠心した。 ペレットを再懸濁し、微小遠心管［microfuge tubu］に移して、10分の１量の３ Ｍ酢酸ナトリウムと、2.5倍量のエタノールで沈殿させた。このＤＮＡをＴＥに 再懸濁した。ＤＮＡ末端はポリメラーゼ・フィルイン反応［ＰＯＬＹＭＥＲＡＳ Ｅ ＦＩＬＬ−ＩＮＲＥＡＣＴＩＯＮ］によって平滑末端になった。このＤＮＡ をフェノールとエーテルで飽和した両方の緩衝液で抽出して精製し、上記のよう に酢酸ナトリウムとエタノールで沈殿させ、ＴＥに再懸濁した。この材料の半分 は3mgのベクター、pＳＹ1626と、ＤＮＡ連結反応によって連結した。使用したベ クターはpＳＹ1626で、次のように作製した。コスミドpＨＣ79（ＧibcoＢＲＬ） をＨind IIIとＡvaＩで切断してテトラサイクリン遺伝子を除去し、末端をクレ ノウポリメラーゼによって埋めた（補充反応）。pＷＥ15からのポリリンカー（s tratagene）をこのベクターに連結した。このポリリンカーをＥcoＲＩの切断に よって単離し、末端をクレノウポリメラーゼによって埋め（フィルイン反応）、 このフラグメントをＬＭＰ−アガロースゲル上で 精製した。ＤＮＡ連結は溶融アガロースの存在下で行われた。その結果できたコ スミドpＳＹ1005をＥcoＲＩ部位でネオマイシン抵抗性遺伝子を含むpＮeo（Ｐ- Ｌ Ｂiochemicals）からとった1.5kbのＨindIII−ＢamＨＩフラグメントを平滑 末端に挿入して修飾し、pＳＹ1626を作った。このpＳＹ1626をＢamＨＩ部位で切 断し平滑末端にして、上述の通り削りとったＩＬＴＶフラグメントと連結した。 連結する混合物は、Ｇifapack ＸＬ（Stratagene）を用いて、製造者の指示にし たがってパッケージングした。パッケージングした混合物をマルトース存在下で 増殖しているＡＧＩ細胞（Ｓtratagene）に加え、コロニーをカナマイシンを含 むＬＢプレートで選択した。ＩＬＴＶＤＮＡを含むコスミドサブクローンを、そ れぞれのコスミドクローンの制限酵素地図を互いに、そしてＩＬＴＶゲノムＤＮ Ａと比較して同定し、ＩＬＴＶゲノムＤＮＡの連続配列を得た。 酵素のマーカー遺伝子を発現する組換えＩＬＴＶのスクリーニング Ｅ.coli β−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼ（uidＡ）マーカ ー遺伝子を組換えウイルスに組み込むと、組換え体を含むプラークは簡単なアッ セイで視覚化することができる。酵素の基質は、プラークアッセイ中に上層のア ガロースに取り込まれる（300μg／ml）。lacＺマーカー遺伝子のために、基質 ＢluogalTM（ハロゲン化インドリル-β-D-ガラクトシダーゼ、Ｇibco ＢＲＬ） を使用した。uidＡマーカー遺伝子のために、基質Ｘ-グルクロＣhx（5-ブロモ-4 -クロロ-3-インドリ ル-β-Ｄ−グルクロン酸 シクロヘキシルアンモニウム塩、Ｂiosynth ＡＧ）を 使用した。活性のあるマーカー酵素を発現するプラークは青になった。青いプラ ークを新鮮な細胞にのせ、さらに青いプラークを単離して精製した。酵素のマー カー遺伝子を除去した組換えウイルス戦略では、このアッセイは、白いプラーク を親株の青いプラークのバックグラウンドから精製することに関与する。典型的 には、プラーク精製を５から10回繰り返してウイルスを精製した。 ブラックプラークアッセイを用いた組換えＩＬＴＶにおける外来遺伝子発現のス クリーニング 組換えＩＬＴウイルスによって発現した外来性の抗原の発現を分析するために 、単層のＣＥＫ細胞を組換えＩＬＴウイルスに感染させ、栄養アガロース培地で 覆い、39℃で３−５日間培養した。いったんプラークが発達したら、覆ったアガ ロースを皿から除去し、単層をＰＢＳで一度洗浄し、100％メタノールで10分間 室温で固定し、細胞を空気乾燥させた。プレートをＰＢＳで再び水和した後、一 次抗体を適当な濃度にＰＢＳとＢlottoで希釈し、細胞の単層と２時間から一晩 室温で培養した。結合していない抗体は、室温でＰＢＳで４回洗浄して細胞から 除去した。適当な二次抗体複合体をＰＢＳで500分の１に希釈し、細胞と２時間 室温で培養した。結合していない二次抗体を室温でＰＢＳで３回細胞を洗浄して 除去した。この単層を発色緩衝液（100mＭトリス、pＨ9.5／100mＭ ＮaＣl/5mＭ ＭgＣl2）で洗浄し、10分間から一晩室温で、新しく用意した基質溶液（発 色緩衝液中に、0.3mg／mlニトロブルー・テトラゾリウムと0.15mg／ml 5-ブロモ -4-クロロ-3-インドリルホスファターゼ）と培養した。この反応を、基質溶液を ＴＥ（10mＭトリス、pＨ7.5／１mＭ ＥＤＴＡ）と置き換えることによって止め た。正しい抗原を発現しているプラークは黒に染色された。 ＩＬＴウイルスまたはＩＬＴＶ gＧを発現する組換えウイルスからのＩＬＴＶ g Ｇの精製 ＩＬＴＶ gＧを、野生型ＩＬＴＶ、またはＩＬＴＶ gＧを発現しているＦＰＶ もしくはＳＰＶベクターによって感染した細胞の培地から精製した。細胞に完全 な細胞変性効果（ＣＰＥ）を施し、培地を流し、細胞破片を卓上遠心機で沈殿し た。培地はＡmicon濃縮機で、ＹＭ30限外濾過膜を用いて15psiで濃縮した。濃縮 液は20mＭトリス塩酸溶液、pＨ7.0で透析し、同じ緩衝液で平衡にしたＥＤＡＥ- Ｓephacel（Ｐharmacia）カラムにのせた。材料は20mＭトリス塩酸溶液、pＨ7.0 中の０から1.5Ｍ ＮaＣlの塩勾配を用いて溶出した。３mlのフラクションを集め 、ウエスタンブロットで分析した。ＩＬＴＶ gＧに対するペプチド抗体を使って 、ＩＬＴＶgＧを含むフラクションを同定した。フラクションを集め、さらにＣe ntricon-10微小濃縮機（Amicon）で濃縮した。 相同性ベクター501-94 プラスミド501-94は、ＩＬＴウイルスからチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を コードしている領域の一部を削除する目的で 作られた（28）。これには、ＩＬＴウイルスＤＮＡに隣接しているＨＣＭＶ Ｉ ＥプロモーターとスクリーニングできるマーカーのＥ.coli lacＺ遺伝子が組込 まれている。ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター−Ｅ.coli lacＺ遺伝子は、ＩＬＴＶ ＴＫ遺伝子と反対の転写方向に挿入されている。マーカー遺伝子の上流は、ＩＬ ＴＶ ＤＮＡのおよそ1087塩基対のフラグメントで、これはＩＬＴＶ ＴＫ遺伝子 の初めの77アミノ酸コドンを含んでいる。lacＺ遺伝子の下流は、ＩＬＴＶ ＤＮ Ａのおよそ675の塩基対フラグメントで、これはＩＬＴＶ ＴＫ遺伝子の3‘末端 に80アミノ酸コドンを含んでいる。このプラスミドを、「組換えヘルペスウイル スを生成するための相同的組換え法」にしたがって使うと、ＩＬＴＶ ＴＫ遺伝 子の78から285のアミノ酸をコードしているＤＮＡを、lacＺ遺伝子をコードして いるＤＮＡと入れ替えることになるだろう。lacＺマーカー遺伝子はヒトサイト メガロウイルス（ＨＣＭＶ）直接早期［immediate early］（ＩＥ）遺伝子プロ モーターに制御されていて、また仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）gＸ遺伝子のポ リアデニル化シグナルを遺伝子の3'末端にもっている。このプラスミドの詳細な 描写は図５に示されている。これは示されたＤＮＡソースから構成され、標準的 な組換えＤＮＡ技術を用いて構成された（42、43）。このプラスミドベクターは pＳＰ64／65（Ｐromega）のおよそ3002塩基対のＨindIIIフラグメントに由来し ている。フラグメント１は、ＩＬＴＶ 2.4kb ＨindIIIフラグメントのおよそ108 7塩基対のＨindIIIからＢclＩのサブフラグメントである。フラグメント２はお よそ5017塩基対のＳalＩからＳalＩのフラグメントで、ＨＣＭＶ ＩＥプロモー ター、β−ガ ラクトシダーゼ（lacＺ）マーカー遺伝子とＰＲＶ gＸポリアデニル化シグナル を含んでいる（図５参照）。フラグメント３は、ＩＬＴＶ 2.4kbのＨindIIIフラ グメントのおよそ675塩基対のＢclＩからＨindIIIのサブフラグメントである。 相同性ベクター544-55.12 プラスミド544-55-12はＩＬＴウイルスからＵＳ２遺伝子をコードしている領 域の一部を削除し、外来性のＤＮＡを挿入する目的で作られた。これには、ＩＬ ＴウイルスＤＮＡに隣接しているスクリーニングできるマーカーのＥ.coli uid Ａ遺伝子が組込まれている。ＰＲＶ gＸプロモーター−Ｅ.coli uidＡ遺伝子は ＩＬＴＶ ＵＳ２遺伝子と反対の転写方向に挿入されている。uidＡ遺伝子の上流 はＩＬＴＶ ＤＮＡのおよそ2300塩基対のフラグメントで、これはＵＳ２遺伝子 の3‘末端に41アミノ酸コドンを含んでいる（配列番号２:aa．188-229）。uidＡ 遺伝子の下流は、ＩＬＴＶＤＮＡのおよそ809塩基対のフラグメントで、これは ＵＳ２遺伝子の5'末端の22個のアミノ酸コドンを含んでいる（配列番号22：aa． 1−22）。このプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを生成するための相同 的組換え法」に基づいて使うと、23から187のアミノ酸をコードしているＩＬＴ Ｖ ＵＳ２ ＤＮＡをＥ.coli uidＡ遺伝子をコードしているＤＮＡに置き換える だろう。uidＡマーカー遺伝子は仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）gＸプロモーター に制御されていて、また、１型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ -1 ＴＫ）遺伝子ポリアデニル化シグナルを遺伝子の3‘末端に含んでいる。この プラスミドの詳細な描写 は図６に示されている。これは示されたＤＮＡソースから標準的な組換えＤＮＡ 技術を用いて作った（42、43）。このプラスミドベクターは、pＳＰ18／pＳＰ19 結合体のおよそ2958塩基対のＡsp718I制限フラグメントに由来していて、多重ク ローニング部位はＥcoＲＩ／ＳacＩ／Ａsp718Ｉ／ＳacＩ／ＥcoＲＩである。フ ラグメント１は、ＩＬＴＶ 2.5kb Ａsp7181フラグメントのおよそ2300塩基対の Ａsp718ＩからＤraＩサブフラグメント（配列番号１：Ｎucl．1−405）である。 フラグメント２はおよそ3039塩基対のＸbaＩフラグメントでＰＲＶ gＸプロモー ター、Ｅ.coli uldＡ遺伝子とＨＳＶ-1ＴＫポリアデニル化部位を含んでいる（ 図６参照）。フラグメント３は、ＩＬＴＶ1097塩基対のＡsp718Ｉフラグメント のおよそ809塩基対のＸbaＩからＡsp718Ｉサブフラグメントである（配列番号１ ：Ｎucl．905−1714）。 相同性ベクター562-61.1Ｆ プラスミド562-61.1ＦはＩＬＴウイルスからgＩ遺伝子の一部を削除し、外来 性のＤＮＡを挿入する目的で作られた。これには、ＩＬＴウイルスＤＮＡが隣接 するスクリーニング可能なマーカーのＥ.coli uidＡ遺伝子が組込まれている。P ＲＶ gＸプロモーター−Ｅ.coli uidＡ遺伝子はＩＬＴＶ gＩ遺伝子プロモータ ーと反対の方向に転写される。983塩基対の欠失は翻訳開始コドンの12塩基対上 流から始まり、ＩＬＴＶ gＩ遺伝子の5‘末端の363アミノ酸コドンの324を欠失 している（配列番号11:aa．325−363）。このプラスミドを「組換えヘルペスウ イルスを生成するための相同的組換え法」に基づいて使用すれば、ＩＬＴＶ gＩ 遺伝子をコードしているＤＮＡがＥ.coli uldＡ遺伝子をコードしているＤＮＡ に置き換わるだろう。このプラスミドの詳細な描写を図７に示した。これは示さ れているＤＮＡソースから、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作られた（42、 43）。このプラスミドベクターはpＵＣ19のおよそ2647塩基対のＡsp718ＩからＨ indIIIのフラグメントである。フラグメント１は、ＩＬＴＶ8.0kb Ａsp718Ｉフ ラグメントのおよそ1619塩基対のＡsp718ＩからＸbaＩのサブフラグメントであ る（配列番号１：Ｎucl.7556−9175）。フラグメント２はおよそ691塩基対のＸb aＩからＸhoＩフラグメント（配列番号１：Ｎucl．9175−9861）でポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成した。この鋳型はＩＬＴＶ8.0kbのＡsp718Ｉフ ラグメントである。上流のプライマー92.09（5'-ＣＣＴＡＧＣＡＣＣＣＴＴＧＴ ＡＴＣＧＣＧ-3‘；配列番号55）は、ＩＬＴＶgＩ遺伝子の821塩基対上流の部位 について、遺伝子の3'末端に向かってＤＮＡを合成する。下流のプライマー92.1 1（5‘-ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＡＡＴＧＡＡＴＡＧＧＣＡＴＴＧＧ-3‘； 配列番号56）はＩＬＴＶ gＩ遺伝子の翻訳開始部位の12塩基対上流の部位につい て、gＤ遺伝子の5'末端に向かってＤＮＡを合成する。ＰＣＲ反応の生成物は818 塩基対である。このＤＮＡフラグメントを、ＸbaＩで5‘末端（ＩＬＴＶ ＤＮＡ にある制限酵素部位）を、ＸhoＩで3'末端（ＰＣＲプライマーの中に作られた制 限酵素部位−下線を付した配列を参照）を切断し、およそ619塩基対のＸbaＩか らＸhoＩフラグメントを作った。フラグメント３はおよそ3051塩基対のSalＩフ ラグメントでＰＲＶ gＸプロモーター、uidＡ遺伝子とＨＳＶ-1ＴＫポリアデニ ル化部位を含んでいる（図 ６参照）。フラグメント４はおよそ624塩基対のＸhoＩからＨindIIIのフラグメ ントで、ＰＣＲによって生成した(配列番号1:Ｎucl.10,847-11,461)。この鋳型 は、ＩＬＴＶ8.0kbのＡsp718Ｉフラグメントであった。上流のプライマー92.10 （5‘-ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＡＣＣＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＴＧＣＧ-3‘；配列番 号57）は、ＩＬＴＶ gＩ遺伝子内の翻訳末端コドンから117塩基対上流の部位に つく。下流のプライマー92.08 （5‘-ＣＴＣＧＴＣＣＧＡＡＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧ-3'；配列番号58）はＩＬＴ ＶgＩ遺伝子とＩＬＴＶ gＥ遺伝子内の翻訳末端部位から604塩基対下流の部位に つく。ＰＣＲ生成物（729塩基対）を、上流のＰＣＲプライマー（アンダーライ ン）によって生成したユニーク部位であるＸhoＩ、及びＨindIIIで、ＩＬＴＶ g Ｅ遺伝子内の部位を切断した。ＸhoＩとＨindIIIによる制限エンドヌクレアーゼ 切断によって、およそ624塩基対のフラグメント４ができた。フラグメント５は 、ＩＬＴＶ 8.0kb Ａsp718Ｉフラグメントのおよそ2700塩基対のＨindIIIサブフ ラグメントである（配列番号１：Ｎucl．11,461−13,473及び配列未決定のＤＮ Ａ）。 相同性ベクター472-73.27 プラスミド472-73.27は、ＩＬＴウイルスから糖蛋白Ｇ（gＧ）遺伝子コード領 域の一部を除去し、外来性のＤＮＡを挿入する目的で作られた。これには、ＩＬ ＴウイルスＤＮＡが隣接するスクリーニング可能なマーカーのＥ.coli lacＺ遺 伝子が組込まれている。ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター−Ｅ.coli lacＺ遺伝子は、 ＩＬＴＶ gＧ遺伝子のプロモーターと同じ方向に転写される。ＩＬＴＶ gＧ 遺伝子の874塩基対の欠失は、翻訳開始部位の60ヌクレオチド上流からアミノ酸 をコードしている配列内の814ヌクレオチドまで広がり、gＧ蛋白質（配列番号７ ）の292のアミノ酸のうち271をコードする能力を失った。このプラスミドを、「 組換えヘルペスウイルスを生成するための相同的組換え法」にしたがって使用す ると、ＩＬＴＶ gＧ遺伝子の１から271のアミノ酸をコードしているＤＮＡが、 Ｅ.coli lacＺ遺伝子をコードしているＤＮＡと置き換えられるだろう。このプ ラスミドの詳しい描写は図４に示した。これは示されたＤＮＡソースから標準的 な組換えＤＮＡ技術を用いて作られた（42、43）。プラスミドベクターはpＵＣ1 9（Ｇibco ＢＲＬ）のおよそ2686塩基対のＡsp718Ｉ制限フラグメントに由来す る。フラグメント１は、ＩＬＴＶ5146塩基対Ａsp718Ｉフラグメントのおよそ283 0塩基対のＡsp718ＩからＮheＩのサブフラグメントである（配列番号１：Ｎucl ．1714-4544）。フラグメント２はおよそ5017塩基対のＳalＩからSalＩラグメン トで、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター、Ｅ.coli β−ガラクトシダーゼ(lacＺ)マー カー遺伝子とＰＲＶ gＸポリアデニル化シグナルを含んでいる（図４参照）。フ ラグメント３は、ＩＬＴＶ5164塩基対Ａsp718Ｉフラグメントのおよそ1709塩基 対のＳalＩからＡsp718Ｉのサブフラグメントである（配列番号１：Ｎucl．5419 -6878）。 相同性ベクター560-52.Ｆ１ プラスミド560-52.Ｆ１は、ＵＬ47様遺伝子の一部、ＯＲＦ４の全部、ＩＬＴ Ｖ gＧ遺伝子の一部をＩＬＴウイルスから除去し、外 来性のＤＮＡを挿入する目的で作られた。これには、ＩＬＴウイルスＤＮＡが隣 接するスクリーニング可能なマーカーのＥ.coli uidＡ遺伝子が組込まれている 。ＰＲＶ gＸプロモーター−Ｅ.coli uidＡ遺伝子は、ＩＬＴＶ ＵＬ47様、ＯＲ Ｆ４及びgＧ遺伝子プロモーターと反対の方向に転写される。2640塩基対の欠失 は、ＵＬ47様遺伝子（配列番号４）の3‘末端の511のアミノ酸コドンのうち442 を、ＯＲＦ遺伝子（配列番号５）のすべてのコーデイング配列、及びＩＬＴＶ g Ｇ遺伝子（配列番号７）の5'末端の293のアミノ酸コドンのうちの271を除去した 。このプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスの生成のための相同的組換え法 」にしたがって使用すると、ＩＬＴＶ ＵＬ47様、ＯＲＦ４及びgＧ遺伝子をコー ドするＤＮＡが、ＰＲＶ gＸプロモーター−Ｅ.coli uidＡ遺伝子をコードする ＤＮＡに置き換えられるだろう。このプラスミドの詳しい描写は図８に示される 。これは示されているＤＮＡソースから標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製 した（42、43）。このプラスミドベクターは、pＳＰ18／pＳＰ19のおよそ2958塩 基対のＡsp718Ｉ制限フラグメントに由来し、多重クローニング部位はＥcoＲＩ ／ＳacＩ／Ａsp718Ｉ／ＳacＩ／ＥcoＲＩである。フラグメント１は、ＩＬＴＶ5 164塩基対Ａsp718Ｉフラグメントのおよそ1066塩基対のＡsp718ＩからＢssＨII のサブフラグメントである（配列番号１：Ｎucl．1714−2777）。フラグメント ２は、ＩＬＴＶ5164塩基対のＡsp718Iフラグメントのおよそ123塩基対のＳalＩ からBclＩのサブフラグメントである。フラグメント３は、およそ3027塩基対の ＢamＩフラグメントで、ＰＲＶ gＸプロモーター、uidＡ遺伝子及びＨＳＶ-1Ｔ Ｋ ポリアデニル化部位を含んでいる（図５参照）。フラグメント４は、ＩＬＴＶ51 64塩基対のＡsp718Ｉフラグメントのおよそ1334塩基対のＢclＩらＡsp718Ｉのサ ブフラグメントである（配列番号１：Ｎucl．5544-6878）。 相同性ベクター579-14.Ｇ２ プラスミド579-14.Ｇ２は、ＩＬＴウイルスからすべてのgＧ遺伝子とg60遺伝 子の一部を除去し、外来性のＤＮＡを挿入する目的で組み立てられた。これには 、ＩＬＴウイルスＤＮＡが隣接するＰＲＶ gＸプロモーターと、スクリーニング 可能なマーカーのＥ.coli uidＡ遺伝子が組込まれている。ＰＲＶ gＸプロモー ター−Ｅ.coli uidＡ遺伝子は、ＩＬＴＶ gＧ及びg60遺伝子プロモーターと同じ 方向に転写される。3351塩基対の欠失には、ＩＬＴＶ gＧ遺伝子の全てのコーデ ィング配列（配列番号７）とg60遺伝子の5‘末端からの986アミノ酸コドンのう ちの733（配列番号８）が含まれている。このプラスミドを、「組換えヘルペス ウイルスを生成するための相同的組換え法」にしたがって使用すると、ＩＬＴＶ gＧ遺伝子及びＩＬＴＶ g60遺伝子のアミノ酸１から733をコードするＤＮＡが 、Ｅ.coli uidA遺伝子をコードするＤＮＡに置き換わるだろう。このプラスミド の詳細な描写は図９に示されている。これは示されたＤＮＡソースから標準的な 組換えＤＮＡ技術（42、43）を使って作製した。このプラスミドベクターpＵＣ1 9（Ｇibco,ＢＲＬ）は、およそ2677塩基対のＡsp718ＩからＢamＨＩのフラグメ ントに由来している。フラグメント１は、ＩＬＴＶ5164塩基対のＡsp718Ｉフラ グメントのお よそ2830塩基対のＡsp718ＩからＮheＩのサブフラグメントである（配列番号１ ：Ｎucl．1714−4544）。フラグメント２はおよそ3015塩基対のＳalＩフラグメ ントでＰＶＲ gＸプロモータ一、Ｅ.coli β−グルクロニダーゼ（uidＡ）マー カー遺伝子及びＨＳＶ-ＩＴＫポリアデニル化部位を含んでいる（図９）。フラ グメント３は、ＩＬＴＶ4545塩基対のＢamＨＩフラグメントのおよそ1709塩基対 のＳalＩからＢamＨＩのサブフラグメントである（配列番号１：Ｎucl．7895-96 04）。 プラスミド544-39.13 プラスミド544-39.13は、ＰＲＶ gＸプロモーター、Ｅ.coli β−グルクロニ ダーゼ（uidＡ）マーカー遺伝子及びＨＳＶ-1 ＴＫポリアデニル化部位からなる β−グルクロニダーゼ発現カセットを含んでいる。マーカー遺伝子の詳細な描写 を図10に示す。これは、標準的な組換えＤＮＡ技術（42、43）を用いて、以下の ソースからの制限フラグメントを図10に示した合成ＤＮＡ配列と繋げて作製した 。プラスミドベクターpＳＰ71（Ｐromega）はおよそ3066塩基対のＸmaＩからＳm aＩのフラグメントに由来する。フラグメント１は、ＰＲＶ ＢamＨＩ制限フラグ メント＃10のおよそ422塩基対のＳalＩからＥcoＲＩ制限サブフラグメントであ る（47）。ＥcoＲＩ部位は図12で示される場所にＰＣＲクローニングによって導 入されたことに注目せよ。フラグメント２はプラスミドpＲＡＪ260（Ｃlonetech ）のおよそ1826塩基対のＥcoＲＩからＳmaＩフラグメントである。ＥcoＲＩ及び ＸmaＩ部位は図10に示される場所にＰＣＲクローニングに よって導入されたことに注目せよ。フラグメント３は、ＨＳＶ-１ ＢamＨＩ制限 フラグメントＱのおよそ784塩基対のＸmaＩサブフラグメントである（48）。こ のフラグメントは、ポリアデニル化シークエンス（ＡＡＴＡＡＡ）がＥ.coli ui dＡ遺伝子との接合部位の最も近くに位置するように方向付けられることに注目 せよ。 プラスミド388-65.2 プラスミド388-65.2は、直接初期（ＩＥ）プロモーター、Ｅ.coli lacＺマー カー遺伝子及びＰＲＶ gＸ遺伝子ポリアデニル化部位からなるβ−ガラクトシダ ーゼ発現カセットを含んでいる。β−ガラクトシダーゼ発現カセットの詳細な描 写は図11に示されている。これは標準的な組換えＤＮＡ技術（42、43）を用いて 、以下のソースからの制限フラグメントを図11に示した合成ＤＮＡ配列と繋げる ことによって作製した。プラスミドベクターpＳＰ72（Ｐromega）は、およそ307 6塩基対のＰstＩからＰstＩのフラグメントに由来する。フラグメント１は、Ｈ ＣＭＶ ＩＥプロモーターを含むＨＣＭＶ2.1kbのＰstＩフラグメントに由来する 、1154塩基対のＰstＩからＡvaIIのフラグメントである。フラグメント２は、Ｅ .colilacＺ遺伝子を含むプラスミドpＪＦ751（49）に由来する3010塩基対のＢam ＨＩからＰvuIIフラグメントである。フラグメント３は、カルボキシ末端の19ア ミノ酸とＰＲＶ gＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルを含むＰＲＶ ＢamＨＩ＃ ７に由来する、およそ750塩基対のＮdeＩからSalＩフラグメントである。 例 例１感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）のユニーク短領域の完全塩基配列 われわれは、ＩＬＴウイルス（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）の短領域から隣接Ｄ ＮＡの１３，４７３塩基対の配列を決定した。この配列は、全１３，０９８塩基 対のユニーク短領域、並びに一端に２７３塩基対の繰り返し領域および他端に１ ０２塩基対の繰り返し領域を含むものである。ユニーク短領域は、１１０アミノ 酸よりも大きいか等しい１３のメチオニン開始オープンリーディングフレーム（ ＯＲＦ）を含むものである（より小さいネステッドＯＲＦを除く）。すべての１ ３のＯＲＦは、ＩＢＩマックベクタータンパク−ＤＮＡアラインメントオプショ ン（デフォールト設定）を利用するジェンバンクＤＮＡデータベースのエントレ スリリース６．０ウイルスディビジョン（Ｅntrez release 6.0 virus division of the Genbank DNA database utilizing the IBI MacVector Protein to DNA alignment option）に配列していた。ＯＲＦのうち８個は、１またはそれ以上の 他のウイルス遺伝子に有意の相同性を示した（表参照）。以下に言及するヌクレ オチド配列数は、内部繰り返し配列内で始まり、末端繰り返し配列内で終わる。 ユニーク短領域は、配列ＩＤ ＮＯ．１の塩基対２７４で始まる。 ＵＳ２遺伝子 ＵＳ２遺伝子は、６９０塩基対からなり、長さ２２９アミノ酸、分子量約２５ ，２７２ダルトンのタンパクをコードする（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２、１３） 。ＩＬＴＶ ＵＳ２は、ウマ疱疹ウイルス（ＥＨＶ）−１およびＥＨＶ−４ Ｕ Ｓ２タンパクと相同である。ＵＳ２遺伝子は、ＩＬＴＶのユニーク短領域の逆補 体鎖上のヌクレオチド９７０から２８１までから転写される（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ Ｏ．１）。ＵＳ２遺伝子生成物の機能は未知である。タンパクキナーゼ遺伝子 タンパクキナーゼ遺伝子は、ヌクレオチド１０５９から２４８９までの１４３ １塩基対からなり、長さ４７６アミノ酸、分子量約５４，３１６ダルトンのタン パクをコードする（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）。ＩＬＴＶタンパクキナーゼは、 マレク病ウイルス（ＭＤＶ）、ウマ疱疹ウイルス（ＥＨＶ）−１および−４、仮 性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サル水痘ウ イルス（ＳＶＶ）、および単純性疱疹ウイルス（ＨＳＶ）−１および−２由来の タンパクキナーゼと相同である。ＵＬ４７様遺伝子 ＵＬ４７様遺伝子は、ＩＬＴウイルスのユニーク短領域内における位置におい てユニークである。すべての他の既知の疱疹ウイルスにおけるＵＬ４７様遺伝子 は、ユニーク長配列 内に位置する。ＵＬ４７様遺伝子は、ヌクレオチド２５７５から４１０７までの １５３３塩基対からなり、長さ５１０アミノ酸、分子量約５７，６１５ダルトン のタンパクをコードする（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）。ＯＲＦ４ ＯＲＦ４は、未知の機能のタンパクをコードする。ＯＲＦ４は、ヌクレオチド ４１１３から４４４５までの３３３塩基対からなり、長さ１１０アミノ酸、分子 量約１２，０１５ダルトンのオープンリーディングフレームをコードする（ＳＥ Ｑ．ＩＤ．ＮＯ．４）。ＯＲＦ４逆補体 ＯＲＦ４逆補体（ＲＣ）は、未知の機能のタンパクをコードする。ＯＲＦ４ ＲＣは、ヌクレオチド４５１９から４１３９までの３８０塩基対からなり、長さ １２６アミノ酸、分子量約１３，８６０ダルトンのオープンリーディングフレー ムをコードする（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４、１５）。ｇＧ遺伝子 ｇＧ遺伝子は、ヌクレオチド４６０９から５４８７までの８７９塩基対からな り、長さ２９２アミノ酸、分子量約３１，６９９ダルトンの糖タンパクをコード する（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５）。ＩＬＴＶ ｇＧ糖タンパクは、ＰＲＶ ｇＸ 、ウシ疱疹ウイルス（ＢＨＶ）−１．３ ｇＧ、ＥＨＶ−１ｇＧおよびＥＨＶ− ４ ｇＧと相同である。豚痘ウイルスベクターまたは鶏痘ウイルスベクター中に 生産された組換体ＩＬＴＶ ｇＧタンパクは、精製することができ（「材料およ び方法」を参照）、ＩＬＴＶ ｇＧに対するペプチド抗血清に反応する。ペプチ ド抗血清は、野性型ウイルス由来のＩＬＴＶ ｇＧに反応するが、ＩＬＴＶ ｇ Ｇ遺伝子に欠失のあるウイルスには反応しない。ｇＧ遺伝子の欠失は、チキンに おけるＩＬＴ病に対するワクチンとして有用である弱毒化ＩＬＴウイルスをもた らし（例６の表参照）、ワクチン化動物を感染動物から区別するためのネガティ ブマーカーとしても作用する。ｇ６０遺伝子 ｇ６０遺伝子は、糖タンパク６０として同定された（３３、５３）。ｇ６０遺 伝子は、ヌクレオチド５６９７から８６５４までの２９５８塩基対からなり、長 さ９８５アミノ酸、分子量約１０６，５０５ダルトンの糖タンパクをコードする （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６）。ＯＲＦ６逆補体 ＯＲＦ６ ＲＣは、ヌクレオチド７８２６から６９４８までの８７８塩基対か らなり、長さ２９２アミノ酸、分子量約３２，１２０ダルトンのオープンリーデ ィングフレームをコードする（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６、１７）。ＩＬＴＶ ＯＲＦ６ ＲＣは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２リボヌクレオチドリダクターゼ 大サブユニット（ＵＬ３９）のタンパクと制限された相同性を有する。ｇＤ遺伝子 運ばれた（vectored）鶏痘ウイルスまたは七面鳥の疱疹ウイルス（３３）にお けるｇＤ糖タンパクの発現は、チキン における保護的免疫応答を高めるために十分である。ｇＤ遺伝子は、ヌクレオチ ド８４６２から９７６６までの１３０５塩基対からなり、長さ４３４アミノ酸、 分子量約４８，４７７ダルトンの糖タンパクをコードする（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ ．１０、１１）。ＩＬＴＶ ｇＤ糖タンパクは、ＨＳＶ−１、ＭＤＶ、ＩＰＶ、 およびＢＨＶ−１．１由来のＰＲＶ ｇ５０およびｇＤと相同である。ＩＬＴウ イルスに対して産生された単一クローン抗体は、ＩＬＴＶ由来のｇＤタンパクと 特異的に反応し、また七面鳥の疱疹ウイルス（ＨＴＶ）ウイルスベクター中に発 現されたＩＬＴＶ ｇＤタンパクに反応する。ＨＶＴベクター中に発現されたＩ ＬＴＶ ｇＤは、サブユニットワクチンとして有用である。ｇＩ遺伝子 ｇＩ遺伝子は、ヌクレオチド９８７４から１０，９６２までの１０８９塩基対 からなり、長さ３６２アミノ酸、分子量３９，７５３ダルトンの糖タンパクをコ ードする（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７）。ＩＬＴＶ ｇＩ糖タンパクは、ＶＺＶ ｇＩと相同である。豚痘ウイルスベクター中に発現された組替体ＩＬＴＶ ｇＩ タンパクは、ＩＬＴＶ感染チキン由来の回復期血清に反応する。ｇＩ遺伝子の欠 失は、チキンにおけるＩＬＴ病に対するワクチンとして有用である弱毒化ＩＬＴ ウイルスをもたらす。ｇＩに欠失のある組替体ウイルスは、自然のルートにより 直接呼吸器官中にワクチン化されたとき動物実験で安全であるが、親ウイルスは 同じルートで接種された鳥の９０％において病変を引き起こす。ｇＩ遺伝子の欠 失は、ワクチン化動物を感染動物から区別するネガティブマーカーとして作用す る。ＯＲＦ８逆補体 ＯＲＦ８逆補体は、未知の機能のタンパクをコードする。ＯＲＦ８ ＲＣは、 ヌクレオチド１１，１５０から１０，６１７までの５３３塩基対からなり、長さ １７７アミノ酸、分子量約１９，４７０ダルトンのオープンリーディングフレー ムをコードする（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８、１９）。ｇＥ遺伝子 ｇＥ遺伝子は、ヌクレオチド１１，１５９から１２，６５８までの１５００塩 基対からなり、長さ４９９アミノ酸、分子量約５５，３９７ダルトンの糖タンパ クをコードする（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８）。ＩＬＴＶ ｇＥ糖タンパクは、Ｖ ＺＶ、サル疱疹ウイルス（ＳＨＶ）、ＥＨＶ−１、ＨＳＶ−１、およびＰＲＶ由 来のｇＥ糖タンパクと相同である。ＩＬＴＶ ｇＥは、サブユニットワクチンと して有用な中和抗原である。ＯＲＦ１０ ＯＲＦ１０は、ヌクレオチド１２，６６５から１３，４４７までの７８３塩基 対からなり、長さ２６１アミノ酸、分子量約２７，８９８ダルトンのタンパクを コードする（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９）。 例 ２Ｓ−ＩＬＴ−００４ Ｓ−ＩＬＴ−００４は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子 の約６２０塩基対の欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である （２８）。Ｅ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子 をＴＫ遺伝子の場所に挿入して、ＨＣＭＶ即時早期（immedlate early）（ＩＥ ）プロモーターの制御下にある。ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター−ｌａｃＺ遺伝子 の転写は、ＴＫプロモーターと反対方向にある。 Ｓ−ＩＬＴ−００４は、「組替体ウイルスを生産するための相同的組換え手法 （HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT VIRUS） 」において相同ベクター５０１−９４（「材料および方法」を参照）およびＳ− ＩＬＴ−００１（ＵＳＤＡ ＩＬＴＶ株８３−２）を用いて構築した。形質移入 株は、ブルオガルTM（Bluogal）の「酵素的マーカー遺伝子を発現する組替体疱 疹ウイルスのためのスクリーン（SCREEN FOR RECOMBINANT HERPESVIRUS EXPRESS ING ENZYMATIC MARKER GENES）」によりスクリーニングした。ブループラーク精 製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ−００４を得た。このウイルスは、制限マ ッピングおよびＤＮＡのサザンブロッティング（SOUTHERN BLOTTING OF DNA）手 法により特性決定した。この分析により、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マ ーカー遺伝子の存在、およびＴＫ遺伝子の約６１９塩基対の欠失が確認された。 残りのＴＫ遺伝子配列は、アミノ酸１ないし７７、およびアミノ酸２８６ないし ３６３を含むタンパクをコードする。ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター −ｌａｃＺ遺伝子は、ＴＫ遺伝子の転写と反対方向である。Ｓ−ＩＬＴ−００４ は、ＩＬＴＶ ＴＫ遺伝子の欠失により弱毒化されるが、チキン中のＩＬＴウイ ルスに対する免疫応答に関与することが知られている他の遺伝子を保持する。従 って、Ｓ−ＩＬＴ−００４は、ＩＬＴ病からチキンを保護するための死菌ワクチ ンとして有用であり得る。 例 ３Ｓ−ＩＬＴ−００９ Ｓ−ＩＬＴ−００９は、ＩＬＴＶ ＵＳ２遺伝子の約４９８塩基対の欠失とＩ ＬＴＶ ｇＧ遺伝子の約８７４塩基対の欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルス （ＩＬＴＶ）である。Ｅ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコード する遺伝子をＵＳ２遺伝子の場所に挿入して、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）の 制御下にある。 Ｓ−ＩＬＴ−００９は、「組替体ウイルスを生産するための相同的組換え手法 」において相同ベクター５４４−５５．１２（「材料および方法」を参照）およ びＳ−ＩＬＴ−００２を用いて構築した。Ｓ−ＩＬＴ−００２は、例５（Ｓ−Ｉ ＬＴ−０１４）に記載したように構築した。形質移入株は、Ｘ−Ｇｌｕｃの「酵 素的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルスのためのスクリーン」により スクリーニングした。ブループラーク精製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ− ００９を得た。このウイルスは、制限マッピングおよびＤＮＡのサザンブロッテ ィング手法により特性決定した。この分析により、ＰＲＶ ｇＸプロモーター− β−グルクロニダーゼ （ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子の存在、およびＩＬＴＶ ＵＳ２遺伝子の約４９８ 塩基対の欠失と、ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の約８７４塩基対の欠失が確認された。 しかしながら、ブルオガルTMの「酵素的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウ イルスのためのスクリーン」中に、存在するＩＬＴＶ ｇＧ欠失内にＨＣＭＶ ＩＥプロモーター−ｌａｃＺ遺伝子の欠失が検出された。残りのＩＬＴＶ ｇＧ 欠失中への挿入物は、約２０００塩基対のＤＮＡを含有し、このＤＮＡにはすべ てのｌａｃＺ遺伝子および一部のＰＲＶ ｇＸポリアデニル化部位が欠落してい る。この欠失は、詳細な制限マッピングにより特性決定し、Ｓ−ＩＬＴ−０１４ 欠失と若干異なることが決定された（例５参照）。 Ｓ−ＩＬＴ−００９は、ＩＬＴＶ ＵＳ２およびｇＧ遺伝子の欠失により弱毒 化されるが、チキン中のＩＬＴウイルスに対する免疫応答に関与することが知ら れている他の遺伝子を保持する。従って、Ｓ−ＩＬＴ−００９は、弱毒化生ワク チンとしてまたは表に示されているようにＩＬＴ病からチキンを保護するための 死菌ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ−００９はＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子を 発現しないので、先に述べたように、ワクチン化動物を感染動物から区別するた めのネガティブマーカーとして利用される。 例 ４Ｓ−ＩＬＴ−０１１ Ｓ−ＩＬＴ−０１１は、ＩＬＴＶ ｇＩ遺伝子の約９８３塩基対の欠失を有す る感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ Ｖ）である。Ｅ．ｃｏｌｉβ−グルクロ ニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコードする遺伝子をｇＩ遺伝子の場所に挿入して、仮性 狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロモーターの制御下にある。ＰＲＶ ｇＸ−ｕ ｉｄＡ遺伝子は、ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの転写方向と反対方向にある。 Ｓ−ＩＬＴ−０１１は、「組替体ウイルスを生産するための相同的組換え手法 」において相同ベクター５６２−６１．１Ｆ（「材料および方法」を参照）およ びＳ−ＩＬＴ−００ １を用いて構築した。形質移入株は、Ｘ−Ｇｌｕｃの「酵素的マーカー遺伝子を 発現する組替体疱疹ウイルスのためのスクリーン」によりスクリーニングした。 ブループラーク精製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ−０１１を得た。このウ イルスは、制限マッピングおよびＤＮＡのサザンブロッティング手法により特性 決定した。この分析により、β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子 の存在、およびｇＩ遺伝子の５’末端から３６３アミノ酸コドンのうち３２５を 欠失するＩＬＴＶ ｇＩの約９８３塩基対の欠失が確認された。 Ｓ−ＩＬＴ−０１１は、弱毒化され、ＩＬＴ病からチキンを保護するための死 菌ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ−０１１は、組織培養において小さな プラーク表現型を示し、これは遅いウイルスの成長と弱毒化を指示している。Ｓ −ＩＬＴ−０１１はＩＬＴＶ ｇＩ遺伝子を発現しないので、ワクチン化動物を 感染動物から区別するためのネガティブマーカーとして利用し得る。例１に示し たように、ＩＬＴＶ感染チキンは、ＩＬＴＶ ｇＩタンパクに対する抗体を作る 。 例 ５Ｓ−ＩＬＴ−０１３ Ｓ−ＩＬＴ−０１３は、ＩＬＴＶ ｇＩ遺伝子の約９８３塩基対の欠失と、Ｉ ＬＴＶ ｇＧ遺伝子の約８７４塩基対の欠失（およびｌａｃＺ遺伝子を非機能性 にするＨＣＭＶ ＩＥプロモータ−ｌａｃＺマーカー遺伝子の欠失）を有する感 染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコードする遺伝子をｇＩ遺伝子の場所に挿 入して、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロモーターの制御下にある。 Ｓ−ＩＬＴ−０１３は、「組替体ウイルスを生産するための相同的組換え手法 」において相同ベクター５６２−６１．１Ｆ（「材料および方法」を参照）およ びＳ−ＩＬＴ−０１４を用いて構築した。形質移入株は、Ｘ−Ｇｌｕｃの「酵素 的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルスのためのスクリーン」によりス クリーニングした。ブループラーク精製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ−０ １３を得た。このウイルスは、制限マッピングおよびＤＮＡのサザンブロッティ ング手法により特性決定した。この分析により、β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄ Ａ）マーカー遺伝子の存在、およびｇＩ遺伝子の５’末端から３６３アミノ酸コ ドンのうち３２５を欠失するＩＬＴＶ ｇＩの約９８３塩基対の欠失が確認され た。また、この分析により、ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の約８７４塩基対の欠失、お よび部分的ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター−ｌａｃＺマーカー遺伝子ＤＮＡの約１ ９０６塩基対の挿入が確認され、当該ＤＮＡについては、ＨＣＭＶ ＩＥプロモ ーターの一部が残存し、ｌａｃＺ遺伝子のほとんどすべてが残存していない。 Ｓ−ＩＬＴ−０１３は、弱毒化され、ＩＬＴ病からチキンを保護するための死 菌ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ−０１３は、組織培養において小さな プラーク表現型を示し、これは遅いウイルスの成長と弱毒化を指示している。Ｓ −ＩＬＴ−０１３はＩＬＴＶ ｇＩもしくはｇＧ遺伝子を発現しないので、ワク チン化動物を感染動物から区別するためのネガティブマーカーとして利用し得る 。 例 ６Ｓ−ＩＬＴ−０１４ Ｓ−ＩＬＴ−０１４は、ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の約８７４塩基対の欠失と、ｌ ａｃＺ遺伝子を非機能性にする挿入ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターｌａｃＺマーカ ー遺伝子の欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。Ｓ−Ｉ ＬＴ−０１４は、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターｌａｃＺマーカー遺伝子の欠失が 生じた精製Ｓ−ＩＬＴ−００２ウイルス株から誘導した。 Ｓ−ＩＬＴ−００２は、「組替体ウイルスを生産するための相同的組換え手法 」において相同ベクター４７２−７３．２７（「材料および方法」を参照）およ びＳ−ＩＬＴ−００１を用いて構築した。ウイルスＳ−ＩＬＴ−００２は、ＩＬ ＴＶ ｇＧ遺伝子内の８７４塩基対の欠失と、ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の代りのＥ ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子の挿入とを有する。しかし ながら、ブルオガルの「酵素的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルスの ためのスクリーン」中に、ホワイトプラークを採取したところ、ＩＬＴＶ ｇＧ 欠失内にｌａｃＺの欠失を含んでいた。 このウイルスＳ−ＩＬＴ−０１４は、制限マッピング、ＤＮＡ塩基配列決定お よびＤＮＡのサザンブロッティング手法により特性決定した。この分析により、 ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝 子の約８７４塩基対の欠失と、部分的ＨＣＭＶ ＩＥプロモータ−ｌａｃＺマー カー遺伝子ＤＮＡ（２９５８塩基対欠失）の約１９５６塩基対の挿入が確認され た。残りのＨＣＭＶ ＩＥプロモーターｌａｃＺマーカー遺伝子ＤＮＡは、約１ １５４塩基対ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの約６８６塩基対フラグメント、およ び３０１０塩基対β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子の約５２０ 塩基対と約７５０塩基対ＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナルのすべてとを含有 する約１２７０塩基対ＤＮＡフラグメントからなる。 Ｓ−ＩＬＴ−０１４は、弱毒化生ワクチンとして、または以下の表に示すよう にＩＬＴ病からチキンを保護するための死菌ワクチンとして有用である。例１に 示されるように、Ｓ−ＩＬＴ−０１４はＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子を発現せず、ＩＬ ＴＶ感染チキンはｇＧに対する抗体を作るので、ＩＬＴＶｇＧは、ワクチン化動 物を感染動物から区別するためのネガティブマーカーとして利用し得る。 例 ７Ｓ−ＩＬＴ−０１５ Ｓ−ＩＬＴ−０１５は、ＵＬ４７様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、およびＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の約２４６０塩基対の欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルス（Ｉ ＬＴＶ）である。Ｅ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコードする 遺伝子をＵＬ４７様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、およびｇＧ遺伝子の場所に挿入し て、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロモーターの制御下にある。ＰＲＶ ｇＸプロモーター−ｕｉｄＡ遺伝子は、ＩＬＴＶ ＵＬ４７様、ＯＲＦ４、およ びｇＧプロモーターの転写の方向と反対方向にある。 Ｓ−ＩＬＴ−０１５は、「組替体ウイルスを生産するための相同的組換え手法 」において相同ベクター５６０−５２．Ｆ１（「材料および方法」を参照）およ びＳ−ＩＬＴ−００１を用いて構築した。形質移入株は、Ｘ−Ｇｌｕｃの「酵素 的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルスのためのスクリーン」によりス クリーニングした。ブループラーク精製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ−０ １５を得た。このウイルスは、制限マッピングおよびＤＮＡのサザンブロッティ ング手法により特性決定した。これらの結果により、ＵＬ４７様遺伝子の３’末 端での合計５１１アミノ酸コドンのうちの４４２、すべてのＯＲＦ４遺伝子、お よびｇＧ遺伝子の５’末端の２９３アミノ酸コドンのうち２７１を含む２６４０ 塩基対の欠失の存在が確認された。 Ｓ−ＩＬＴ−０１５は、弱毒化生ワクチンとしてまたは下記表に示すようにＩ ＬＴ病からチキンを保護するための死菌ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ −０１５はＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子を発現しないので、ワクチン化動物を感染動物 から区別するためのネガテイブマーカーとして利用される。 例 ８Ｓ−ＩＬＴ−０１７ Ｓ−ＩＬＴ−０１７は、ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子およびｇ６０遺伝子の約３３５ １塩基対の欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。Ｅ．ｃ ｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコードする遺伝子をＩＬＴＶ ｇＧ およびｇ６０遺伝子の場所に挿入して、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロ モーターの制御下にある。 Ｓ−ＩＬＴ−０１７は、「組替体ウイルスを生産するための相同的組換え手法 」において相同ベクター５７９−１４．Ｇ２（「材料および方法」を参照）およ びＳ−ＩＬＴ−００１を用いて構築した。形質移入株は、Ｘ−Ｇｌｕｃの「酵素 的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルスのためのスクリーン」によりス クリーニングした。ブループラーク精製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ−０ １７を得た。 Ｓ−ＩＬＴ−０１７は、ＩＬＴＶ ｇ６０およびｇＧ遺伝子の欠失により弱毒 化されるが、チキン中のＩＬＴウイルスに対する免疫応答に関与することが知ら れている他の遺伝子を保持する。従って、Ｓ−ＩＬＴ−０１７は、ＩＬＴ病から チキンを保護するための死菌ワクチンとして使用し得る。Ｓ−ＩＬＴ−０１７は ＩＬＴＶ ｇＧまたはｇ６０遺伝子を発現しないので、ワクチン化動物を感染動 物から区別するためのネガティブマーカーとして使用される。 例 ９感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）スパイクおよびマトリッ クスタンパク遺伝子を発現する組換体感染性喉頭気管炎ウイルス ＩＢＶアーカンサススパイクタンパク遺伝子を含有するＩＬＴウイルスを生産 するために相同ベクターを使用する。組換体ＩＬＴウイルスは、ｇＧ、ＵＳ２、 ＵＬ４７様およびＯＲＦ４を含む１またはそれ以上のＩＬＴＶ遺伝子の欠失、お よび２つの外来遺伝子Ｅ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ｕｉｄＡ）お よびＩＢＶアーカンサススパイクタンパク遺伝子の挿入を含む。ｕｉｄＡ遺伝子 は、ＰＲＶ ｇＸプロモーターの制御下にあり、ＩＢＶアーカンサススパイクタ ンパク遺伝子は、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下にある。 ＩＬＴウイルスに挿入された外来遺伝子を含有する相同ベクターを構築するた めに、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモーター、ＩＢＶアーカンサススパイクタンパクおよ びＨＳＶ−１ ＴＫポリアデニル化シグナルを含有するＤＮＡフラグメントをＩ ＬＴＶ相同ベクター中のＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の欠失位置の制限酵素部位に挿入 する。ＰＲＶ ｇＸプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ｕ ｉｄＡ）遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントをＩＬＴＶ相同ベクター内のユニ ーク制限酵素部位に挿入する。組換体ウイルスは、「組替体ウイルスを生産する ための相同的組換え手法」においてＩＢＶアーカンサススパイク遺伝子およびＥ ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）遺伝子を含有する最終相同ベクタ ーとＳ−ＩＬＴ−００１を結合させることによって構築する。 形質移入株は、ｕｉｄＡ遺伝子の存在を検出するためにＸ−Ｇｌｕｃの「酵素的 マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルスのためのスクリーン」により、お よびＩＢＶアーカンサススパイクタンパクの存在を検出するために「外来遺伝子 発現のためのブラックプラークアッセイ（BLACK PLAQUE ASSAY FOR FOREIGN GEN E EXPRESSION）」によりスクリーニングした。 ＩＢＶ Ｓ１タンパクを担持する組換体ＩＬＴウイルスをアーカンサス、マサ チューセッツまたはコネクチカット血清型から、ＩＢＶマトリックスタンパクを 担持する組換体ＩＬＴウイルスをアーカンサス、マサチューセッツまたはコネク チカット血清型から、およびＩＢＶヌクレオカプシドを担持する組換体ＩＬＴウ イルスをアーカンサス、マサチューセッツまたはコネクチカット血清型から構築 するために同様の手法を使用する。この手法は、また、ニューカッスル病ウイル ス（ＮＤＶ）ＨＮおよびＦ遺伝子、および包性病ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリタン パクまたはその部分を担持する組換体ＩＬＴウイルスを構築するために使用する 。この手法は、また、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子 を担持する組換体ＩＬＴウイルスを構築するために使用する。 これら抗原を担持する組換体ＩＬＴウイルスは、ＩＬＴＶおよびウイルスＩＢ Ｖ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶまたはＭＤＶの１またはそれ以上により引き起こされる病 気からチキンを保護するための多価ワクチンとして価値がある。ここに記載した ＩＬＴＶワクチンはＩＬＴＶ ｇＧを発現しないので、ワク チン化動物を感染動物から区別するためのネガティブマーカーとして有用である 。 例 １０種々の疾病誘起微生物から抗原を発現させるためにＩＬＴＶを利用するワクチン 家きんワクチンを開発するために、以下の微生物からの抗体を利用する。すな わち、ヒヨコ貧血因子、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミ クソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、鶏痘ウイル ス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロタウイルス、サルモネラｓｐｐ．、Ｅ ｃｏｌ ｉ、パスツレラｓｐｐ．、ヘモフイルスｓｐｐ．、クラミジアｓｐｐ．、マイコ プラズマｓｐｐ．、カンピロバクターｓｐｐ．、ボルデテラｓｐｐ．、家きん線 虫、条虫、吸虫、家きんダニ／シラミ、家きん原生動物（アイメリアｓｐｐ．、 ヒストモナスｓｐｐ．、トリコモナスｓｐｐ．）である。 Detailed Description of the Invention              Recombinant infectious laryngotracheitis virus and their use   In this application, some publications are referenced by Arabic numerals in parentheses. You. Full citations for these publications can be found at the end of the specification, immediately before the claims. be able to. The disclosure of these publications reflects the state of the art to which this invention belongs. For complete description, it is incorporated herein by reference.                                Field of the invention   This invention protects poultry from the natural infectious laryngotracheitis virus and other poultry diseases. Recombinant infectious laryngotracheitis (ILT) virus useful in a protective vaccine I do.                                Background of the Invention   Viral DNA was isolated and the isolated DNA was cloned into a bacterial plasmid. Ability to expand the approaches available for the preparation of viral vaccines Spreading. The methods used to make this invention include insertions, deletions and single It is also involved in the denaturation of cloned viral DNA sequences due to multiple base changes. This denatured DNA is then reinserted into the viral genome to render the virus avirulent You. The live virus thus obtained is stored in the host animal in the vaccine. Can be used to elicit an immune response and protect the animal against disease.   One group of animal viruses, the herpesviruses or herpesviridae, , Is an example of the types of viruses that are familiar with this approach. These viruses are It has DNA of 100,000 to 200,000 base pairs as their genetic material. important What In particular, some regions of this genome are not essential for viral replication. , Has been confirmed in vitro in cell culture. These areas of DNA Degeneration in the area reduces the pathogenicity of the virus, ie attenuates it Let it. For example, by inactivating the thymidine kinase gene, human single Pure herpesvirus becomes nonpathogenic (1), and porcine pseudorabies virus is nonpathogenic It becomes prototypical (2).   Human herpes simplex virus is nonpathogenic by removing part of the repeat region Sexuality (3, 4). Repeat regions may be associated with viral tumorigenicity. It has been confirmed in the disease [Marek's disease] virus (5). Herpesui Some areas of Rus Saimiri also correlate with tumorigenicity. (6). By removing a part of the repeat region, the pseudorabies virus It becomes non-pathogenic (US Patent No. 4,877,737, issued October 31, 1989). Pseudorabies Certain regions of the virus have been shown to be deleted in native vaccine strains. (7,8) and these deletions, at least in part, cause the pathogenicity of these strains. It has been shown to be the cause of the lack.   The herpesvirus may contain DNA for non-essential regions in various parts of the genome. Is generally accepted. Virulence of some of these areas Associated with and denatured them into less pathogenic viruses It can be connected and the vaccine can be derived from it.   Infectious laryngotracheitis virus, an alphaherpesvirus (ILTV) is responsible for the loss of egg production in the United States, Europe and Australia. It is an important pathogen in poultry that causes death (10). This is respiratory depression, panting Acute chicken illness characterized by exudation of bloody secretions Wake up. Viral replication is restricted to cells of the respiratory tract and infection of the trachea causes tissue lobes. Causes cancer and bleeding.   In chickens, a drug effective in reducing the degree of lesion formation and clinical signs No drug has been found. Various denatured forms of ILT cells induced by cell passage Vaccination of birds using illus and / or boring regimens can It is used to confer acceptable protection on highly receptive chickens. Present I Due to the limited extent of LTV vaccine attenuation, appropriate levels of virus Sufficient to provide protection but insufficient to cause disease in the herd) Care must be taken to ensure that (11-12). In addition, these The virus can return to virulence, which provides protection against disease. It causes disease rather than damage.   ILTV has been analyzed at the molecular level. ILTV Genome Restriction Map Reported (22-26). Several genes, namely thymidine kinase (27, 28 ), Glycoprotein gB (27, 29, 30), ribonucleotide reductase (27, 31), The DNA sequence of capsid p40 (31, 32) has been identified.   Furthermore, Shepard et al. (53) reported that infectious laryngotracheitis virus genomic DNA. Some genes located in the unique long region of That it is not essential for replication Disclosed.   Applicants have identified a unique short region of the ILT virus genomic DNA. egion], which are genes associated with the toxicity of ILTV. Unexpectedly found that a deletion in Escherichia coli contains a gene that leads to attenuation of ILTV did. In particular, a deletion in the glycoprotein gG gene of ILT virus results in ILTV toxicity. Live attenuated virus useful as a vaccine against subsequent attack by strains It has been found that the results are twisting.   Applicants also noted that a deletion in the unique short region glycoprotein gI gene is also It has been found to attenuate LTV. Furthermore, US2, which is a UL-47-like gene Deletions in the gene and the unique short region glycoprotein g60 gene also cause ILTV It is expected to be attenuated.   ILTV can be latent in healthy animals, thereby As a virus carrier. Because of this, they were vaccinated with a non-virulent virus The distinction between animals and those infected with disease-causing wild-type or natural viruses What is possible is clearly an advantage. Of differential vaccines and associated diagnostic tests Development has proven to be meaningful in the management of pseudorabies (55). similar Fractionated marker vaccines are of great value in the management of diseases caused by ILTV There will be. The construction of differential diagnostics has focused on the deletion of glycoproteins. Theoretically, glycoproteins selected as diagnostic markers have the following characteristics: (1) The glycoprotein and its gene are essential for the production of infectious virus in tissue culture. Should be the one No; (2) the glycoprotein should elicit a major physiological response in the animal body And (3) the glycoprotein should make an important contribution to protective immunity. There is no.   The ILT virus is at least as identified by a monoclonal antibody. Has also been shown to specify four major glycoproteins (Mr= 205K, 115K, 90K And 60K). The three glycoproteins appear to be antigenically related (Mr= 205 K, 115K and 90K) (34-36).   The three major ILT virus glycoproteins, gB (29,30), gC (27,51) and g60 (3 4, 53) are described in the literature. These three genes have been sequenced , Two of the ILTV genes were shown to be homologous to the HSV glycoproteins gB and gC. Have been.   Among these, the ILTV gB gene is an essential gene, and the deletion marker gene Would not be suitable as In addition, the herpesvirus gC gene As a target for Japanese antibodies (56) and as a target for cell-mediated immunity (57), for protective immunity It has been shown to make a significant contribution. Therefore, the gC gene is a deletion marker Not desirable as a gene.   Regarding the other genes encoding the above glycoproteins, they are Suitable candidates for deletion to construct a recombinant ILT virus that can be used as I don't know if.   Applicants have proposed a recombinant ILT virus that can be used as a diagnostic vaccine. A unit of the ILT virus genome that can be safely deleted for construction Unexpectedly found two glycoprotein-coding genes located in the short region ing. So These are the glycoprotein gG gene and the glycoprotein gI gene. Glycoprotein g G gene or glycoprotein g By genetically engineering the ILT virus by the method of deletion in the I gene , An ILT virus that does not express glycoprotein gG or glycoprotein gI is produced. Virus Of these two genes in the unique short region of Prior art that teaches or suggests that it is a suitable candidate for deletion to create There is no art.   Genetically engineered against several herpesviruses, but recombinant No example of ILTV has been reported.   DNA viruses with large genomes, such as vaccinia virus and herpes The ability to process the virus allows these recombinant viruses to vaccinate animals with vaccine antigens. Led to the discovery that it could be used as a vector to deliver therapeutic agents . Herpesviruses are attractive candidates for development as vectors. this is, Their host range is inherently limited to a single target species (37), yet they are exotic sites. The ability to establish a latent infection capable of providing stable in vivo expression of the gene This is because they have (38). To express foreign gene products Although the herpesvirus species have been processed, a recombinant sensation expressing a foreign gene product No laryngotracheitis virus has been constructed. The infectious laryngotracheitis virus , To deliver vaccine antigens derived from microorganisms that cause significant poultry disease. It can be used as an actor. Included in multivalent vaccine using ILTV vector Other viral antigens that may be included include infectious bronchitis virus (IBV), -Castle disease virus (NDV), infectious bursal disease virus (IBDV) and Maret The disease virus (MDV) is included. Such multivalent recombinant viruses are Protects against ILT disease as well as disease. Similarly, this infectious laryngotracheitis virus Can also be used as a vector to deliver therapeutic agents. To this invention This therapeutic agent delivered by a viral vector according to Must be a biological molecule that is This is the therapeutic agent in the first analysis It is limited to either DNA, RNA or protein. Of these classes There are examples of therapeutic agents from each of the compounds to natural opium, and the compounds include Sense DNA, antisense RNA (39), ribozyme (40), suppressor t RNA (41), interferon-induced double-stranded RNA and hormones (eg Shrin) to lymphokines (eg interferons and interleukins) There are up to many protein therapeutic forms. However, the discovery of these therapeutic agents And their elucidation of structure and function inevitably make them viral vector delivery systems. It is not intended to be used by. This determines if there is a suitable insertion site This is because an experiment is required to do this.                                Summary of the Invention   This invention provides an infectious laryngotracheitis virus having a deletion in the glycoprotein gG gene. Provided is a recombinant attenuated infectious laryngotracheitis virus. This attenuated ui Ruth is useful as a vaccine against infectious laryngotracheitis virus.   The present invention also relates to a recombinant infectious laryngotracheitis virus. In order to prevent this recombinant virus from producing glycoprotein gG during replication, glycoprotein gG Have an infectious laryngotracheitis virus genome with a deletion or other modification in the gene Provide the virus.   The present invention also provides a recombinant infectious laryngotracheitis virus that does not produce glycoprotein gG. Vaccinated chickens or other poultry with natural infectious laryngotracheitis It provides a way to distinguish Rus from infected.   The present invention also provides a US2 gene, UL47-like gene, ORF4 gene or glycoprotein. Recombinant weak with infectious laryngotracheitis virus genome containing a deletion in the white g60 gene To provide a toxic infectious laryngotracheitis virus.   The present invention also provides four non-essential regions of the infectious laryngotracheitis virus genome. Disclose the region: human cytomegalovirus immediately early (H CMV IE) promoter, pseudorabies virus glycoprotein gX (PRV gX) promoter And infectious bovine herpesvirus virus 1.1VB (BHV-1.1, VP B). These regions contribute to the construction of recombinant infectious laryngotracheitis virus vectors. And can be used as an insertion site for a foreign gene.                             Brief description of the drawings FIG. 13,473 base pairs of continuous DNA derived from a unique short region of ILT virus Nucleotide sequence of. This sequence, in addition to the total unique short region of 13,098 base pairs, It has a repeat region of 273 base pairs at one end and a repeat region of 102 base pairs at the other end. The nucleotide sequence in Figure 1 begins with an internal repeat sequence and ends with Then end in the array. The unique short region begins at base pair 274 in this figure. FIG. Infectious laryngotracheitis virus (ILTV) USDA83-2 genomic Asp718 I restriction map. Above is the unique length found in the ILTV genome (UL ), Internal repetition (IR), unique short (Us), And terminal repeat (TR) compartments Show. Map of Asp718I restriction endonuclease sites in the ILTV genome Are shown below. The letters A to O represent the maximum fragment as "A", Asp718 The I restriction endonuclease fragment is shown. Fragment "L" is a 2.5 kb Asp718I fragment, The fragment "H" is the 5164 bp Asp718I fragment, and the fragment "G" is the 8.0 kb Asp718I fragment. It is a fragment. Fragments marked with an asterisk are repeated 1 to 12 times, about 900 It contains the hypervariable region of bp. Since there is no size dominant one, these fragments are Sum of submoles that cannot be decomposed well on a bromide stained gel [submolar  amount]. The position of these repetitions is indicated by a broken broken line in the figure. FIG. Unique short region of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) USDA83-2 Open reading frame inside. The short region of 13,473 base pairs in ILTV is 13,0 All unique short regions of 98 base pairs plus a repeat region of 273 base pairs at one end and Has a repeat region of 102 base pairs. This unique short region opens at 13 methionine. Contains an open reading frame (ORF) of 110 amino acids or more Out (except for smaller nested ORFs). All 13 ORFs are based on the IBI Vector-DNA alignment option [IBI MacVector Protein to DN A alignment option] (default setting) using the GenBank DNA data Entrez release 6.0 virus d ivision]. Eight of these ORFs are inherited by one or more other viral Showed significant homology with offspring: unique short (US2), protein kinase (Pk), Unique length 47-like (UL47-like) and glycoproteins gG, g60, gD, gI and gE Figure 4: Detailed depiction of DNA insertions in homology vector 472-73.27. Plasmid 4 The figure which shows the direction of the DNA fragment assembled in 72-73.27. The origin of each fragment is shown in the table It is shown. Also shown are the sequences located at each of the junctions between the fragments. (SEQ ID NOs: 20, 21, 22 and 23). Let each junction generate each fragment In addition to the restriction sites used to The synthetic linker sequences are listed. Also, some gene coding regions and And regulatory elements are also provided. Restriction sites in brackets [] are parts destroyed during construction Shows the remnant of rank. The following abbreviations are used: Infectious laryngotracheitis virus (I LTV), human cytomegalovirus adjacent early stage (HCMV IE), pseudorabies Virus (PRV), lactose operon Z gene (lacZ), E. coli (E. coli ), Polyadenylation signal (poly A) and base pair (bp). FIG. Detailed depiction of DNA insertions in homology vector 501-94. Plasmid 501- The figure which shows the direction of the DNA fragment assembled in 94. The origin of each fragment is shown in the table I have. Also shown are the sequences located at each of the junctions between the fragments. Column index 24, 25, 26 and 27). At each junction, the restriction used to generate each fragment In addition to the position, the synthetic linker sequence used to join these fragments is noted. . The locations of some gene coding regions and regulatory elements are also given. . Restriction sites in brackets [] indicate remnants of sites destroyed during construction. The following abbreviations Is used: infectious laryngotracheitis virus (ILTV), human cytomegalo Virus adjacent early (HCMV IE), pseudorabies virus (PRV), lacto Suoperon Z gene (lacZ), E. coli, polyadenylation signal (Poly A), thymidine kinase (TK) and base pairs (bp). FIG. Detailed depiction of DNA insertions in homology vector 544-55.12. Plasmid 5 44-55.12 shows the orientation of the assembled DNA fragments in FIG. The origin of each fragment is shown in the table. Have been. Also shown are the sequences located at each of the junctions between the fragments. (SEQ ID NOs: 28, 29, 30 and 31). Used to generate each fragment for each junction In addition to the restriction sites created, the synthetic linker sequence used to join these fragments It is noted. It also gives the location of some gene coding regions and regulatory elements. Has been obtained. Restriction sites in brackets [] indicate remnants of sites destroyed during construction . The following abbreviations are used: infectious laryngotracheitis virus (ILTV), type 1 Herpes simplex virus (HSV-1), pseudorabies virus (PRV), β-glue Clonidase gene (uidA), E. coli, polyadenylation signal (po ly A) and base pairs (bp). FIG. Detailed description of DNA insertion in homology vector 562-61.1F Portrayal. The figure which shows the direction of the DNA fragment assembled in the plasmid 562-61.1F. Each disconnect The origin of the pieces is shown in the table. Also located at each of the junctions between the fragments Sequences are also shown (SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36 and 37). Each junction In addition to the restriction sites used to generate each fragment, the The synthetic linker sequence provided is marked. Also some gene coding The location of regions and control elements are also given. Restriction sites in brackets [] are Shows the remnants of the destroyed site. The following abbreviations are used: Infectious laryngotracheitis Virus (ILTV), herpes simplex virus type 1 (HSV-1), pseudorabies Irus (PRV), β-glucuronidase gene (uidA), E. coli , Polyadenylation signal (polyA) and base pair (bp). FIG. Detailed depiction of DNA insertions in homology vector 560-52.F1. Plasmid 560-52. Diagram showing the orientation of the DNA fragments assembled in F1. The origin of each fragment is shown in the table It is shown. Also shown are the sequences located at each of the junctions between the fragments. (SEQ ID NOs: 38, 39, 40, 41 and 42). Each Junction Generates Each Fragment In addition to the restriction sites used in, the synthetic linker used to join these fragments The sequence is marked. Also, several gene coding regions and regulatory element positions The location is also given. Restriction sites in brackets [] are residuals of sites destroyed during construction. Is shown. The following abbreviations are used: Infectious laryngotracheitis virus (ILTV) Type 1 herpes simplex virus (HSV-1, pseudorabies virus (PRV), β- Glucuronidase gene (UidA), E. coli, polyadenylation signal (polyA), unique Long 47 (UL47-like), open reading frame 4 (ORF4), glycoprotein G ( gG) and base pairs (bp). FIG. Detailed depiction of DNA insertions in homology vector 579-14.G2. Plasmid 579-14. Diagram showing the orientation of the DNA fragments assembled in G2. The origin of each fragment is shown in the table It is shown. Also shown are the sequences located at each of the junctions between the fragments. (SEQ ID NOs: 43, 44, 45 and 46). Each junction is used to generate each fragment In addition to the restriction sites given, synthetic linker sequences used to join these fragments Is written. Also, the location of some gene coding regions and regulatory elements Has been given. Restriction sites in brackets [] indicate residual sites destroyed during construction. You. The following abbreviations are used: infectious laryngotracheitis virus (ILTV), 1 Herpes simplex virus (HSV-1), pseudorabies virus (PRV), β-g Lucronidase gene (uidA), E. coli, polyadenylation signal (Poly A) and base pairs (bp). FIG. Detailed depiction of DNA insertions in plasmid vector 544-39.13. Plastic The figure which shows the direction of the DNA fragment assembled in Smid 544-39.13. The origin of each fragment It is shown in the table. Also shown are the sequences located at each of the junctions between the fragments. (SEQ ID NOS: 47, 48, 49 and 50). Each junction has a raw piece In addition to the restriction sites used for synthesis, the synthetic linker used for ligation of these fragments. -The sequence is written. Synthetic linker sequences are underlined with black bars I have. Also, how many The locations of several gene coding regions and regulatory elements are also given. brackets[] The restriction sites within represent the remnants of sites that were destroyed during construction. The following abbreviations are used : Pseudorabies virus (PRV), β-glucuronidase gene (uidA ), E. coli, herpes simplex virus type 1 (HSV-1), polyadeni Signal (poly A) and base pair (bp). Figure 11. Detailed depiction of the DNA insertion in plasmid vector 388-65.2. plus Diagram showing the orientation of the DNA fragments assembled in mid 388-65.2. The origin of each fragment is in the table Is shown in. Also shown are the sequences located at each of the junctions between the fragments. (SEQ ID NOs: 51, 52, 53 and 54). For each junction, to generate each fragment In addition to the restriction sites used, the synthetic linker sequences used to join these fragments were The columns are marked. Synthetic linker sequences are underlined with black bars. Also provided are the locations of some gene coding regions and regulatory elements. Restriction sites in brackets [] indicate remnants of sites destroyed during construction. The following abbreviations are Used in: Human Megalocytovirus Adjacent Early (HCMV IE), Rac Tose operon Z gene (lacZ), E. coli, pseudorabies virus ( PRV), polyadenylation signal (poly A) and base pair (bp).                             Detailed description of the invention   This invention describes infectious laryngotrachea with a deletion in a unique short region of the viral genome. A recombinant infectious laryngotracheitis virus comprising an inflammatory virus genome, wherein said deletion is Provide a virus in the glycoprotein gG gene. This deletion attenuates the virus ,infection It should be suitable for use as a vaccine against the sex laryngeal tracheitis virus. this A preferred embodiment of the invention is a recombinant infectious laryngotracheitis designated S-ILT-014. Yes (ATCC Accession No. XXX. S-ILT-014 virus is a American Type in accordance with the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Organisms ・ Culture Collection [American Type Culture Collection], 1230 1 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA, Sept. 1993 2 It was deposited with the ATCC reception number on the 2nd. ). Other of this invention A preferred embodiment is a recombinant infectious laryngotracheitis virus designated S-ILT-002. It's Ruth.   For purposes of this invention, "recombinant infectious laryngotracheitis virus" is Recombinant methods well known to those skilled in the art, such asMaterials and methodsOf "Recombinant ILTV Produced by the method described in "Homologous Recombination Procedures for the Production of It is a live infectious laryngotracheitis virus. The virus is an infectious laryngotracheal The genetic material essential for the replication of the inflammatory virus has not been deleted.   Furthermore, the present invention provides an infection having a deletion in the glycoprotein gG gene and the US2 gene. A recombinant infectious laryngotracheitis virus containing the infectious laryngotracheitis virus genome . One preferred embodiment of this invention is a recombinant infectious larynx designated S-ILT-009 It is a tracheitis virus.   Further, the present invention provides a gene having a deletion in the glycoprotein gG gene and the ORF4 gene. Provided is a recombinant laryngotracheitis virus containing a chromophoric laryngotracheitis virus genome.   Further, the present invention provides a gene having a deletion in the glycoprotein gG gene and UL47-like gene. To provide a recombinant infectious laryngotracheitis virus containing the laryngotracheitis virus genome You.   Further, the present invention provides a glycoprotein gG gene, an ORF4 gene, and a UL47-like gene. Recombinant infectious laryngotrachea containing an infectious laryngotracheitis virus genome with a deletion in the offspring Provide the flame virus. A preferred embodiment of this invention is designated S-ILT-015. It is a recombinant infectious laryngotracheitis virus.   Further, the present invention provides a gene having a deletion in the glycoprotein gG gene and the glycoprotein g60 gene. To provide a recombinant infectious laryngotracheitis virus containing the laryngotracheitis virus genome You. A preferred embodiment of this invention is a recombinant infectious larynx designated S-ILT-017. It is a tracheitis virus.   In addition, the present invention provides a gene having a deletion in the glycoprotein gG gene and the glycoprotein gI gene. To provide a recombinant infectious laryngotracheitis virus containing the laryngotracheitis virus genome You.   Furthermore, the present invention provides a glycoprotein gG gene and a thymidine kinase (TK) gene. Infectious laryngotracheitis containing an infectious laryngotracheitis virus genome with a deletion in Provide the virus.   Furthermore, the present invention provides infectious agents having a deletion in a unique short region of the viral genome. A recombinant infectious laryngotracheitis virus comprising a laryngotracheitis virus genome, comprising: A deletion in the glycoprotein gG gene and also the insertion of a foreign gene Provide the laryngotracheitis virus. The foreign gene is the recombinant infectious larynx Can be expressed in host cells infected with tracheitis As such, it is inserted at a nonessential site in the infectious laryngotracheitis virus genome.   For the purposes of this invention, a “non-essential region” of the infectious laryngotracheitis virus genome "Is a region of the viral genome that is not required for viral infection and replication.   The following non-essential sites in the infectious laryngotracheitis virus genome are Preferred site for gene insertion: thymidine kinase (TK) gene, US2 Transmission, UL47-like gene, ORF4 gene, glycoprotein gG gene, glycoprotein g60 gene, And the glycoprotein gI gene.   The foreign gene inserted into a nonessential site in the infectious laryngotracheitis virus genome is Screenable markers such as E. coli β-galactosidase or It may encode E. coli β-glucuronidase.   A foreign gene inserted at a nonessential site in the infectious laryngotracheitis virus genome is It may encode a native polypeptide. This antigenic polypeptide is When introduced, a factor that causes avian disease (from which the antigen is derived , Or is inducible). Such anti The original polypeptide is infectious bronchitis virus, Newcastle disease virus, May be derived from, or derived from, infectious bursal disease virus, and Marek's disease virus It may be possible to do so. In addition, such an antigenic polypeptide is Encephalomyelitis virus, avian reovirus, avian paramyxovirus, avian influenza Enza virus, avian adenovirus, f Fowl pox virus, avian coronavirus, birds Rotavirus, juvenile anemia factor, Salmonella sp. [Salmonella spp.], Escherichia coli [E.coli.], Pasteurella spp., Bordetella sp. la spp.], Eimeria sp. [Eimeria spp.], Histomonas sp. pp.], Trichomonas spp., Trichomonas spp., Poultry nematodes, tapeworms, trematodes , May or may be derived from poultry mites / fleas, poultry protozoa You may.   A foreign gene regulates the endogenous infectious laryngotracheitis virus upstream promoter. May be under or under the control of a heterologous upstream promoter . This non-homologous upstream promoter is the HCMV IE promoter, PRV gx promoter. And the BHV-1.1VP8 promoter.   In addition, the present invention provides for deletions or other modifications in unique short regions of the viral genome. Recombinant infectious laryngotracheitis virus containing an infectious laryngotracheitis virus genome That the recombinant virus does not produce glycoprotein gG during replication. , A virus in which said deletion or modification is in the glycoprotein gG gene. Less than Is a preferred embodiment of this invention: S-ILT-002, S-ILT -014, S-ILT-009, S-ILT-015, and S-ILT-017 Infectious laryngotracheitis virus.   In addition, the present invention provides for deletions or other modifications in unique short regions of the viral genome. Recombinant infectious laryngotracheitis virus with infectious laryngotracheitis virus genome That the recombinant virus does not produce glycoprotein gI during replication. , The above Provide a virus in which the deletion or modification is in the glycoprotein gI gene.   In addition, the present invention provides for deletions or other modifications in unique short regions of the viral genome. Recombinant infectious laryngotracheitis virus containing an infectious laryngotracheitis virus genome This recombinant virus produces glycoprotein gG and glycoprotein gI during replication. In order to prevent the deletion or modification in the glycoprotein gG gene and glycoprotein gI gene, To provide the virus.   Furthermore, the present invention provides an infectious throat containing a deletion in a unique short region of the viral genome. A recombinant infectious laryngotracheitis virus having a head tracheitis virus genome, comprising: A virus having the above deletion in the US2 gene, UL47-like gene, or glycoprotein g60 gene Provide the service. Deletions in any of these genes attenuate the virus and Make it suitable for use as a vaccine against infectious laryngotracheitis virus Expected.   In addition, the present invention is within a unique short region of the infectious laryngotracheitis virus genome. A recombinant infectious laryngotracheitis virus with an inserted foreign gene, And the insertion is a protein kinase gene, glycoprotein gD gene, glycoprotein gE gene And a virus not in the ORF10 gene. Preferred insertion site is US 2 genes, UL47-like gene, ORF4 gene and glycoprotein g60 gene.   The foreign gene is introduced into the recombinant infectious larynx trachea of the present invention at any of these sites. It can be inserted so that it can be expressed in host cells infected with an inflammatory virus. Wear.   The foreign gene inserted in this way is a screenable marker, for example , E. coli β-galactosidase or E. coli β-glucuronidase Good.   The foreign gene thus inserted may encode an antigenic polypeptide. This antigenic polypeptide causes avian disease when introduced into host cells. Protect against a rubbing factor (an antigen derived or inducible by this factor) Induces the production of protective antibodies. Such an antigenic polypeptide can be used as an infectious bronchitis virus. Irus, Newcastle disease virus, infectious bursal disease virus, and Marek's disease It may be derived from or may be capable of being derived from a virus. Also, Such antigenic polypeptides include avian encephalomyelitis virus, avian reovirus, Avian paramyxovirus, avian influenza virus, avian adenovirus, Fowlpox virus, avian coronavirus, avian rotavirus, juvenile poverty Blood factor, Salmonella, E. coli, Pasteurella, Bordetella, Eimeria, Histomonas species, Trichomonas species, poultry nematodes, tapeworms, trematodes, poultry mites / It may be derived or feasible from fleas, poultry protozoa.   The foreign gene inserted in this way is the endogenous upstream of the infectious laryngotracheitis virus. May be under the control of a side promoter or may be controlled by a heterologous upstream promoter. May be under you. This non-homologous upstream promoter is the HCMV IE promoter. Data, the PRV gx promoter, and the BHV-1.1VP8 promoter. Can be.   Further, this invention provides a suitable carrier and an effective immunizing amount of the recombinant infectious throat of this invention. For infectious laryngotracheitis virus, including any of the tracheitis viruses Provides Kuching. This vaccine is either inactivated or live recombinant Any virus can be included.   Suitable carriers for recombinant viruses are well known in the art and include proteins, Includes sugars and the like. An example of such a suitable carrier is the hydrolyzed protein, LA. Physiologically balanced culture medium containing one or more stabilizers such as lactose It is. Preferably, the tissue doubling solution is taken and a stabilizer, eg stabilized, hydrolyzed. A live vaccine is made by adding the unraveled protein. Preferably, The activated vaccine uses the tissue culture medium directly after inactivating the virus.   In addition, the present invention provides a recombinant carrier for infectious laryngotracheitis virus with a suitable carrier and an effective immunizing amount. A vaccine containing Ruth, wherein the recombinant infectious laryngotracheitis virus is Infectious laryngotracheitis virus geno with a deletion in a unique short region of the viral genome Vaccine, the deletion of which is in the glycoprotein gG gene. A preferred embodiment of this invention is one of a suitable carrier and an effective immunizing amount of Vaccine containing one or more: S-ILT-014, S-ILT-002, S-IL Recombinant infectious laryngotrachea designated as T-009, S-ILT-015, and S-ILT-017 Flame virus.   In addition, the present invention is directed to infectious laryngotracheitis virus and one or more other avian diseases. Multivalent vaccine for infectious laryngotracheitis with a deletion in a unique short region Contains the viral genome, Is present in the glycoprotein gG gene and is a foreign gene at a nonessential site in the viral genome. To provide a multivalent vaccine containing an effective immunizing amount of recombinant virus including gene insertion You.   This foreign gene encodes an antigenic polypeptide. This antigenic polypeptide Is a factor that causes disease in birds (from which the antibody is induced, or Induces protective antibody production of the host cell against (inducible).   Foreign genes are infectious bronchitis virus, Newcastle disease virus, infection Saccharomyces disease virus, Marek's disease virus, avian encephalomyelitis virus, avian leo Virus, avian paramyxovirus, avian influenza virus, avian adeno Virus, fowlpox virus, avian coronavirus, avian rotavirus Squirrel, juvenile anemia factor, Salmonella spp., Escherichia coli, Pasteurella spp., Bordetella spp., Eye Melia, Histomonas, Trichomonas, poultry nematodes, tapeworms, trematodes, homes May or may be derived from fowl mites / fleas, poultry protozoa Good.   In addition, the present invention provides a recombinant carrier for infectious laryngotracheitis virus with a suitable carrier and an effective immunizing amount. And a recombinant infectious laryngotracheitis virus, Infectious laryngotrachea with a deletion or other modification in a unique short region of the Ils genome It contains the viral genome and this deletion or modification prevents the recombinant virus from replicating during replication. To provide a vaccine in the glycoprotein gG gene so that it does not produce glycoprotein gG . A preferred embodiment of this invention comprises a suitable carrier and an effective immunizing amount of any of the following viruses: With one Contains vaccines: S-ILT-014, S-ILT-002, S-ILT-009, S- Recombinant infectious laryngotracheitis viruses designated ILT-015 and S-ILT-017.   In addition, the present invention provides a recombinant carrier for infectious laryngotracheitis virus with a suitable carrier and an effective immunizing amount. And a recombinant infectious laryngotracheitis virus, Infectious laryngotrachea with a deletion or other modification in a unique short region of the Ils genome Inflammation virus genome, and this deletion or modification prevents this recombination virus during replication. To provide a vaccine in the glycoprotein gI gene so that Ruth does not produce glycoprotein gI You.   In addition, the present invention provides a recombinant carrier for infectious laryngotracheitis virus with a suitable carrier and effective immunizing amount. And a recombinant infectious laryngotracheitis virus Infectious laryngotrachea with a deletion or other modification in a unique short region of the Ils genome Inflammation virus genome, and this deletion or modification prevents this recombination virus during replication. So that Ruth does not produce glycoprotein gG and glycoprotein gI. Provide a vaccine that is in the I gene.   In addition, the present invention provides a recombinant carrier for infectious laryngotracheitis virus with a suitable carrier and an effective immunizing amount. And a recombinant infectious laryngotracheitis virus Infectious laryngotracheitis virus genome with a deletion in a unique short region of the irs genome And this deletion is present in the US2 gene, UL47-like gene or glycoprotein g60 gene. To provide a vaccine.   In addition, the present invention provides a recombinant carrier with an appropriate carrier and effective immunizing amount. A vaccine containing the laryngotracheitis virus, which comprises: Infectious laryngotrachea has a deletion in a unique short region of the viral genome Inflammatory virus genome and foreign genes inserted in nonessential sites of the viral genome However, this deletion was caused by US2 gene, ORF4 gene, UL47-like gene or glycoprotein g60. Provide a vaccine that is in the gene.   This foreign gene is a factor that causes disease in birds (from which the antigen is derived). Antigens that induce protective antibody production of host cells against Encodes a sex polypeptide.   Foreign genes are infectious bronchitis virus, Newcastle disease virus, infection Saccharomyces disease virus, Marek's disease virus, avian encephalomyelitis virus, avian leo Virus, avian paramyxovirus, avian influenza virus, avian adeno Virus, foulbox virus, avian coronavirus, avian rotavirus Squirrel, juvenile anemia factor, Salmonella spp., Escherichia coli, Pasteurella spp., Bordetella spp., Eye Melia, Histomonas, Trichomonas, poultry nematodes, tapeworms, trematodes, homes May or may be derived from fowl mites / fleas, poultry protozoa Good.   In addition, the present invention provides a recombinant carrier for infectious laryngotracheitis virus with a suitable carrier and an effective immunizing amount. And a recombinant infectious laryngotracheitis virus Infectious laryngotracheitis with a foreign gene inserted at a nonessential site of the Ils genome A vaccine containing the Ils genome is provided. This foreign gene is a bird Factors that cause diseases of (the antigen is induced or can be induced from this cause) Encoding an antigenic polypeptide that induces protective antibody production of host cells against You.   Foreign genes are infectious bronchitis virus, Newcastle disease virus, infection Saccharomyces disease virus, Marek's disease virus, avian encephalomyelitis virus, avian leo Virus, avian paramyxovirus, avian influenza virus, avian adeno Virus, fowlpox virus, avian coronavirus, avian rotavirus Squirrel, juvenile anemia factor, Salmonella spp., Escherichia coli, Pasteurella spp., Bordetella spp., Eye Melia, Histomonas, Trichomonas, poultry nematodes, tapeworms, trematodes, homes May or may be derived from fowl mites / fleas, poultry protozoa Good.   Further, the present invention is a method of immunizing an animal against infectious laryngotracheitis virus. Therefore, an effective immunizing dose of either vaccine of this invention should be applied to chickens or other homes. Methods are provided that include administering to poultry.   Furthermore, the present invention provides a recombinant virus that does not produce glycoprotein gG with an effective immunization dose. Chickens or other poultry inoculated with cutin are infected with the natural infectious laryngotracheitis virus. Provide a method to separate from infected with. This method can be used for chickens or other A sample of body fluid from poultry in Japan was analyzed for glycoprotein gG and infectious laryngotracheitis virus. And chickens or other poultry infected with wild-type infectious laryngotracheitis virus Analyzing for the presence of at least one other normally expressed antigen . In this body fluid In chickens or other poultry infected with the natural infectious laryngotracheitis virus That the normally expressed antigen is present and the glycoprotein gG is not present, the recombinant vaccine Being vaccinated with Chin and not being infected with the natural infectious laryngotracheitis virus Is shown. The presence of glycoprotein gG and antigen in body fluid indicates that antigen and glycoprotein g It can be determined by detecting an antibody specific for G.   Further, the present invention provides a recombinant infectious laryngotracheitis virus that does not produce glycoprotein gI. Chickens or other poultry vaccinated with an effective immunizing dose Provided is a method for separating from those infected with the head tracheitis virus. This method is A sample of bodily fluids derived from chickens or other poultry is used to infect the laryngotracheitis virus. Chickens infected with glycoprotein gI of sucrose and natural infectious laryngotracheitis virus, or Analyze for the presence of at least one of the other antigens normally expressed in other poultry Including that. In this bodily fluid, the nymphal tracheitis virus-infected There are antigens normally expressed in chickens or other poultry and the glycoprotein gI Not present, vaccinated with recombinant vaccine, natural infectious laryngotracheitis It indicates that the virus is not infected. Presence of glycoprotein gG and antigen in body fluids Is determined by detecting antibodies specific for antigen and glycoprotein gI in body fluids can do.   Furthermore, the present invention provides a recombinant virus that does not produce glycoprotein gG and glycoprotein gI. An effective immunizing dose of vaccinated chickens or other poultry should be treated with natural infectious larynx. Infected with tuberculosis virus Provide a way to separate from things. This method is based on chickens or other poultry. A sample of the incoming bodily fluid is used, along with glycoproteins gG and gI of the infectious laryngotracheitis virus. Antigens normally expressed in animals infected with naturally infectious laryngotracheitis virus Analyzing for the presence of at least one of Natural in this body fluid It usually occurs in chickens or other poultry infected with the infectious laryngotracheitis virus. The presence of the expressed antigen and the absence of glycoproteins gG and gI impairs the vaccine. Shown to have been vaccinated with Kuching and not infected with the natural infectious laryngotracheitis virus I have. The presence of antigens and glycoproteins gG and gI in body fluids indicates that antigens and glycoproteins are present in body fluids. It can be determined by detecting antibodies specific for white gG and gI.   Furthermore, the present invention provides a unique short region of infectious laryngotracheitis genomic DNA To generate recombinant infectious laryngotracheitis virus by inserting DNA And a double-stranded DNA component consisting essentially of a double-stranded foreign gene. The unique DNA of the genomic DNA on either side of this double-stranded foreign gene The homologous double-stranded DNA is adjacent to the DNA located in the short region. Encoding sequences are glycoprotein gD gene, glycoprotein gE gene, protein kinase gene, and And a homologous vector that is not homologous to the ORF10 gene. This foreign gene Screenable markers such as E. coli β-galactosidase or colon The bacterial β-glucuronidase may be encoded.   Furthermore, the present invention provides infectious laryngotracheitis virus genomic DNA. The DNA encoding the screenable marker inserted in Homologous vector for generating recombinant infectious laryngotracheitis virus by letting A double-stranded DNA consisting essentially of the double-stranded DNA to be deleted. The infectious larynx is flanked on each side of the double-stranded DNA that contains the molecule and is to be deleted. Tracheitis virus glycoprotein gG gene, glycoprotein gI gene, US2 gene, or UL-4 Provided is a homology vector in which a double-stranded DNA homologous to a 7-like gene is flanked. this A preferred embodiment of the invention is the homology vector [Homology Vector] 544-55.12. , Homology Vector 562-61.1F, Homology Vector 472.73.27, Homology Homology designated as vector 560-52.F1 and homology vector 579-14.G2 Vector. Materials and methods Preparation of infectious laryngotracheitis virus stock sample   225 cm sample of infectious laryngotracheitis virus stock2In the flask Chicken primary embryonic kidney cells (CEK; obtained from Spafas, Inc.) or chicken Primary kidney cells (CK; obtained from chicks hatched from fertilized eggs supplied by Hyvac) Treatment of (50) with Hank's salt (BME), 10% bromoethylamine (BEI) Fetal bovine serum (FBS), 1% glutamine, 2% penicillin / strep Tomycin (P / S) stock and 1% sodium bicarbonate stock (these Compounds were obtained from Irvine Scientific or equivalent supplier. The growth medium will be completed in the future. 105-10 in 1x Eagle basal medium (denatured) containing total BME medium)6pfu It was prepared by infecting with 0.5 ml of virus stock containing. Virus stocks then 4 Harvested after -5 days. Infected medium and cells should be in complete medium containing 20% sterile whole milk It was resuspended and stored frozen at -70 ° C. Preparation of infectious laryngotracheitis virus DNA   Four to five days after infection with virus, add 15 ml of cells and medium from each flask. Scrape into a conical centrifuge tube and pellet at 1700 xg for 5 minutes at 4 ° C to pellet. Since 50% of the virus may be in the medium, save the supernatant and Was processed as follows. Resuspend the cell pellet in 1 ml PBS per tube and combine Then, it was centrifuged again at 1700 xg for 5 minutes. Pellets are 1 ml per flask, 10 mM Squirrel hydrochloric acid solution pH 7.5, 1mM EDTA, 1.5mM MgCl2Resuspend in a buffer containing Incubated for 15 minutes at 4 ° C. Add 25 μl of 20% NP40 per flask, then Use a dounce homogenizer with the A pestle to mix the mixture. Homogenized. The preparation was centrifuged at 1700xg for 10 minutes at 4 ° C and the supernatant retained. Ten μl 0.5 M EDTA, 50 μl 20% SDS and 25 μl 10 mg / ml proteinase K Was added to the supernatant (per original flask). In some cases this can then be Combined with virus obtained from cell culture supernatant (see above). This mixture is then 65 Treated at 100 ° C for 1-16 hours with 100 mM Tris-HCl solution, phenol saturated with pH8 Extracted twice. The DNA in the aqueous layer was then mixed with 3M sodium acetate (1/10 volume) and 2. Precipitated by adding 5x 100% ethanol I let you.   To obtain the virus from the medium, centrifuge the cell medium supernatant for 30 minutes at 23,500 xg. And drained well. The pellet was added to the mixture containing proteinase K described above. Resuspend as above. Resuspend the DNA pellet in 20 μl TE per flask. Suspended. It could be used for further experiments at this point, or more pancreas RNA is removed by treatment with RNase A of It was also possible to obtain DNA by precipitation. Virus DNA miniprep [minipr ep], scrape the infected 10 cm dish into a conical centrifuge tube, and Centrifuged at 1000 xg for min. Cell culture supernatant was saved and processed as described above. Fine Cell pellets, 0.5 ml each of 10 mM Tris-HCl solution, pH 7.5, 1 mM EDT A, resuspended in 0.5% NP40 and incubated at room temperature for 10 minutes. 10 μl of 10 mg / ml RN ZeA was added and the preparation was centrifuged for 5 minutes at 1000xg. 25 μl of 20% SDS and 25 μl Of 10 mg / ml proteinase K was added to the supernatant and if it was used, all Was added to the virus pellet from the cell culture medium. Mix for 1 hour at 55-65 ° C Incubate for 1 hour, extract with phenol saturated with buffer, add 1 ml of ethanol and precipitate. I let you. The DNA pellet was suspended in 20 μl TE and stored at 4 ° C. Polymerase fill-in reaction   DNA was added to 50 mM Tris, pH 7.4, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2And 400 μM of 4 Each containing two deoxyribonucleotides Resuspended in saline buffer. 10 units of Klenow DNA Polymerase (Gibco BRL ) Was added and the reaction was allowed to proceed for 15 minutes at room temperature. Extract the DNA with phenol as above. It was taken out and precipitated with ethanol. DNA sequencing   Sequenase Kit [Sequenase Kit] (US Biochemicals) And α33S-dATP (New England Nuclear) was used. dGTP mixed The reaction was carried out with both the product and the dITP mixture to reveal the compression zone. is there Alternatively, the compressed areas were analyzed on a formamide gel. Template is double-stranded plus A mid-subclone or a single-stranded M13 subclone with primers sequenced It was constructed either on a vector outside the defined insertion site or on previously obtained sequences. The resulting sequences were assembled and compared using Dnastar software. Obtained distribution For column manipulation and comparison, see IBI MacVector, Coral Software [Coral Sortwa [Re] Super clone and Super see Align program. Molecular biological technology   Digestion with restriction endonucleases, gel electrophoresis, DNA extraction from gels, Ligation reaction, phosphorylation by kinase, treatment with phosphatase, bacterial culture Bacteria including methods such as growth of nutrients, transformation of bacteria with DNA Techniques for manipulating DNA and other molecular biology methods have been described (42, 43). Poly Various DNA using merase chain reaction (PCR) We introduced a convenient restriction site for manipulating (44). In general, amplified fla Fragment size less than 500 base pairs and important region of amplified fragment Was confirmed by DNA sequencing. Most of these technologies have changed, except as noted I used it without doing it. Southern blotting of DNA   General methods of Southern blotting are described by Maniatis et al. (1982) and Sam. brook et al. (1989) (42, 43). DNA in 0.4M NaOH Blotted on iron membrane (Biorad Zeraprobe) and 0.25M Na2HPOFour, PH7.2, Prehybridization in a solution containing 1 mM EDTA and 7% SDS for 5 minutes at 65 ° C. Make a zation. Labeled probe was added, which is Boehringer-Mannhei Genius of mTMLabeled by random priming using a non-radioactive labeling kit. I bell. Hybridization was performed overnight at 65 ° C. Membrane twice, 40 mM Na2HPOFour , PH 7.2, 1mM EDTA, 5% SDS, then twice, 40mM Na2HP OFour, PH 7.2, 1 mM EDTA, 1% SDS for 30 minutes each at 65 ° C . The bound probe was detected by Boehringer-Mannheim GeniusTMNon-radioactive detection key It was carried out using DNA transfection to produce recombinant ILT virus   This method is described by Chen and Okayama (1987) (45) in CaCl.2Based on the law as follows Changed to Recombinant ILT virus is produced by homologous recombination DNA and suitable herpes A plasmid containing the desired foreign DNA flanked by the cloned sequences of the virus. Due to what happens between the Sumi homology vectors. Plasmid DNA (10-40mg) , Final concentration is 0.25M CaCl2Was added to 250 ml of the solution. 50 mM MOPS (pH6.95), 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPOFourDNA / CaCl with an equal volume of buffer containing2 Added to the solution. After 10 minutes at room temperature, the mixture was added drop by drop to the CEK cells on a 6 cm dish of maintenance medium. Incubate at 39 ° C for 4 to 5 hours. Cells in PBS once, 20% glycerol After washing once with a PBS solution for 2 minutes and again with PBS, a maintenance medium was added. 1.5 ml of ILT virus stock was added to the medium and the cells were cultured overnight. Next day, Fresh maintenance medium was added and the cells were cultured for an additional 2 days. Harvest the transfection stock Aliquots and frozen at -70 ° C. Method for producing a subgenomic DNA fragment of ILTV   Herpes by cotransfection of cloned overlapping subgenomic fragments Potential virus production has been demonstrated with pseudorabies virus (46). If deletion and insertion Either or both cotransfect directly into the subgenomic fragment. If done prior to the procedure, this method frequently produces viruses with altered genomes. Significantly reduces the amount of screening required to generate and purify recombinant virus can do. We used the overlapping cosmid method to map restriction enzyme sites. Was.   A library of subclones containing overlapping ILTV subgenomic fragments is Was prepared as follows. USDA ILTV strain 83-2 was named S-ILT-001. 10m M Tris-HCl solution, pH 8.0, 1 mM Approximately 20 μg of ILT (obtained from S-ILT-001) in 0.5 ml of EDTA (TE) Passing V DNA through a (46) 25 gauge needle twice as previously described So I stripped it off. This DNA was added to 50mM Tris-HCl solution, pH8.0, 1mMEDT Centrifuge for 5.5 hours at 274,000 xg with a 15-40% glycerol gradient in A and 0.3M NaCl. did. Fractions were analyzed on a 0.3% agarose gel and contained 35-50 kb of DNA Collect and dilute 2 times with TE and 2.5 times with 1/10 volume of 3M sodium acetate Precipitated with an amount of ethanol. The tube was centrifuged for 1 hour at 109,000 xg and 10 ° C. Resuspend the pellet, transfer to a microcentrifuge tube, and add 1/10 volume of 3 It was precipitated with M sodium acetate and 2.5 volumes of ethanol. This DNA to TE Resuspended. Polymerase fill-in reaction [POLYMERAS] E FILL-INREATION]. This DNA Is purified by extraction with both buffer saturated with phenol and ether and then purified as described above. Was precipitated with sodium acetate and ethanol and resuspended in TE. Half of this material Was ligated with 3 mg of vector, pSY1626, by DNA ligation reaction. Used The vector was pSY1626 and was prepared as follows. Cosmid pH 79 (GibcoBRL) Was digested with Hind III and Ava I to remove the tetracycline gene and the ends cleaved. Filled with Know Polymerase (replenishment reaction). Polylinker (s from pWE15 tratagene) was ligated into this vector. Use this polylinker to cut EcoRI Therefore, it is isolated and the ends are filled with Klenow polymerase (fill-in reaction), This fragment on an LMP-agarose gel Purified. DNA ligation was performed in the presence of molten agarose. The result was The sumid pSY1005 contains pNeo (P- containing the neomycin resistance gene at the EcoRI site. Blunted a 1.5 kb HindIII-BamHI fragment from L Biochemicals). It was inserted into the end and modified to create pSY1626. Cut this pSY1626 at the BamHI site It was cut to blunt ends and ligated with the ILTV fragment that had been cut off as described above. The mixture to be ligated was made using Gifapack XL (Stratagene) according to the manufacturer's instructions. I packaged it accordingly. Packaged mixture in the presence of maltose In addition to proliferating AGI cells (Stratagene), colonies containing kanamycin were included. LB plate. A cosmid subclone containing ILTV DNA was cloned into The restriction enzyme maps of the respective cosmid clones are compared with each other, and the ILTV genomic DN Identification was made by comparison with A to obtain a continuous sequence of ILTV genomic DNA. Screening for recombinant ILTV expressing an enzyme marker gene   E. coli β-galactosidase or β-glucuronidase (uidA) marker When the gene is integrated into the recombinant virus, plaques containing the recombinant are easily cloned. It can be visualized with a sey. The substrate for the enzyme is the upper layer during plaque assay. Incorporated into galose (300 μg / ml). Substrate for lacZ marker gene BluogalTM(Halogenated indolyl-β-D-galactosidase, Gibco BRL) It was used. For the uidA marker gene, the substrate X-glucuro Chx (5-bromo-4 -Chloro-3-indori L-β-D-glucuronic acid cyclohexyl ammonium salt, Biosynth AG) used. Plaques expressing active marker enzyme turned blue. Blue plastic The plaques were plated on fresh cells and blue plaques were isolated and purified. Enzyme Mar In the recombinant viral strategy with the Kerr gene removed, this assay was performed with white plaques. Is purified from the parental blue plaque background. Typical The virus was purified by repeating plaque purification 5 to 10 times. Expression of foreign genes in recombinant ILTV using black plaque assay cleaning   To analyze the expression of foreign antigens expressed by recombinant ILT virus , Monolayer CEK cells were infected with recombinant ILT virus in nutrient agarose medium Cover and incubate at 39 ° C for 3-5 days. Once the plaque developed, the covered aga Remove the loin from the dish, wash the monolayer once with PBS, and 100% methanol for 10 minutes. Fixed at room temperature and cells were air dried. After rehydrating the plate with PBS, Dilute the following antibody to an appropriate concentration with PBS and Blotto and incubate with the cell monolayer for 2 hours to overnight. Cultured at room temperature. Unbound antibody was removed from cells by washing 4 times with PBS at room temperature. Removed. Dilute the appropriate secondary antibody complex 1/500 with PBS and incubate with the cells for 2 hours. Cultured at room temperature. Unbound secondary antibody was washed 3 times with PBS at room temperature Removed. This monolayer is used as a color development buffer (100 mM Tris, pH 9.5 / 100 mM NaCl / 5 mM).  MgCl2) For 10 minutes to overnight at room temperature. 0.3 mg / ml nitroblue tetrazolium and 0.15 mg / ml 5-bromo in color buffer 4-chloro-3-indolyl phosphatase). This reaction was performed using the substrate solution Stop by replacing with TE (10 mM Tris, pH 7.5 / 1 mM EDTA) Was. Plaques expressing the correct antigen were stained black. ILTV g from ILT virus or recombinant virus expressing ILTV gG Purification of G   ILTV gG, wild-type ILTV, or FPV expressing ILTV gG Alternatively, it was purified from the medium of cells infected with the SPV vector. Perfect for cells Cell depleting effect (CPE), flush the medium and pellet the cell debris with a tabletop centrifuge. Was. The medium was concentrated on an Amicon concentrator at 15 psi using a YM30 ultrafiltration membrane. concentrated The solution was dialyzed against 20 mM Tris-HCl solution, pH 7.0 and equilibrated with the same buffer solution. It was applied to a Sephacel (Pharmacia) column. The material is 20 mM Tris-HCl solution, pH 7.0 Elution was performed with a salt gradient of 0 to 1.5M NaCl in. Collect 3 ml fractions , Western blot analysis. Using peptide antibody against ILTV gG , A fraction containing ILTVgG was identified. Collect the fractions and then Ce Concentrated with ntricon-10 microconcentrator (Amicon). Homology vector 501-94   Plasmid 501-94 contains the thymidine kinase (TK) gene from the ILT virus. For the purpose of deleting part of the coded area Made (28). This includes HCMV I flanking the ILT virus DNA. E. coli lacZ gene as a marker that can be screened with E promoter is integrated It is rare. HCMV IE promoter-E. Coli lacZ gene It is inserted in the opposite transcriptional direction from the TK gene. Upstream of the marker gene is IL An approximately 1087 base pair fragment of TV DNA, which is the ILTV TK gene. It contains the first 77 amino acid codons of. Downstream of the lacZ gene is ILTV DN It is an approximately 675 base pair fragment of A, which is the 3'end of the ILTV TK gene. Contains 80 amino acid codons. This plasmid was designated as "Recombinant Herpesvirus. When used according to the "homologous recombination method for producing DNA encoding the 78 to 285 amino acids of the offspring, encoding the lacZ gene It will be replaced with existing DNA. The lacZ marker gene is a human site Megalovirus (HCMV) immediate early (IE) gene pro It is controlled by a motor, and the pseudorabies virus (PRV) gX gene It has a readenylation signal at the 3'end of the gene. Detailed description of this plasmid A depiction is shown in FIG. It consists of the indicated DNA source and is standard It was constructed using various recombinant DNA techniques (42, 43). This plasmid vector derived from an approximately 3002 base pair HindIII fragment of pSP64 / 65 (Promega) ing. Fragment 1 is approximately 108 of the ILTV 2.4 kb HindIII fragment. It is a 7 base pair HindIII to BclI subfragment. Fragment 2 is An HCMV IE promoter with a SalI to SalI fragment of approximately 5017 base pairs. Tar, β-mo Lactosidase (lacZ) marker gene and PRV gX polyadenylation signal (See FIG. 5). Fragment 3 is the ILTV 2.4 kb HindIII fragment. Is a sub-fragment of BclI to HindIII of approximately 675 base pairs. Homology vector 544-55.12   Plasmid 544-55-12 is a region encoding the US2 gene from the ILT virus. It was created for the purpose of deleting a part of the region and inserting exogenous DNA. For this, IL E. coli uid of screenable marker flanking T virus DNA The A gene is integrated. The PRV gX promoter-E. Coli uidA gene is It is inserted in the transcriptional direction opposite to the ILTV US2 gene. Upstream of uidA gene Is an approximately 2300 base pair fragment of ILTV DNA, which is the US2 gene. Contains a 41 amino acid codon at the 3'end (SEQ ID NO: 2: aa.188-229). uidA Downstream of the gene is an approximately 809 base pair fragment of ILTV DNA, which It contains the 22 amino acid codons at the 5'end of the US2 gene (SEQ ID NO: 22: aa. 1-22). This plasmid was designated as "homologous for producing recombinant herpesvirus. ILT, which encodes amino acids 23 to 187 Replace V US2 DNA with DNA encoding E. coli uidA gene right. The uidA marker gene is the pseudorabies virus (PRV) gX promoter Regulated by the thymidine type 1 herpes simplex virus thymidine kinase (HSV -1 TK) gene contains a polyadenylation signal at the 3'end of the gene. this Detailed description of the plasmid Is shown in FIG. This is standard recombinant DNA from the indicated DNA source Made using technology (42, 43). This plasmid vector is pSP18 / pSP19 Derived from the Asp718I restriction fragment of approximately 2958 base pairs of the conjugate, The rolling site is EcoRI / SacI / Asp718I / SacI / EcoRI. H Lagment 1 is an approximately 2300 base pair fragment of the ILTV 2.5 kb Asp7181 fragment. The Asp718I to DraI subfragment (SEQ ID NO: 1: Nucl. 1-405). Fragment 2 is an XbaI fragment of approximately 3039 base pairs and is PRV gX promoted. Containing the E. coli uldA gene and the HSV-1TK polyadenylation site ( (See FIG. 6). Fragment 3 is an Asp718I fragment of ILTV1097 base pairs. Is an XbaI to Asp718I subfragment of approximately 809 base pairs of SEQ ID NO: 1 : Nucl. 905-1714). Homology vector 562-61.1F   Plasmid 562-61.1F deletes part of the gI gene from ILT virus It was created for the purpose of inserting sex DNA. Flanked by ILT virus DNA The E. coli uidA gene, which is a screenable marker, is incorporated. P RV gX promoter-E. Coli uidA gene is the ILTV gI gene promoter It is transcribed in the opposite direction. The 983 base pair deletion is 12 base pairs above the translation initiation codon. Starting from the flow, deletion of 324 of the 5'terminal 363 amino acid codon of ILTV gI gene (SEQ ID NO: 11: aa.325-363). This plasmid was designated as "Recombinant Herpes ILTV gI when used on the basis of the “homologous recombination method for producing virus”. The DNA encoding the gene is the DNA encoding the E. coli uldA gene Will be replaced. A detailed depiction of this plasmid is shown in Figure 7. This is shown Made from standard DNA sources using standard recombinant DNA techniques (42, 43). This plasmid vector contains approximately 2647 base pairs of Asp718I to H of pUC19. It is a fragment of indIII. Fragment 1 is the ILTV 8.0 kb Asp718I fragment Approximately 1619 base pairs of Asp718I to XbaI subfragment (SEQ ID NO: 1 Nucl. 7556-9175). Fragment 2 is approximately 691 base pairs of Xb aI to XhoI fragment (SEQ ID NO: 1 Nucl.9175-9861) Generated by chain reaction (PCR). This template is ILTV 8.0kb Asp718I It is a ragment. Upstream primer 92.09 (5'-CCTAGCACCCTTGT ATCGCG-3 '; SEQ ID NO: 55) is a site 821 base pairs upstream of the ILTVgI gene. For, synthesize DNA towards the 3'end of the gene. Downstream primer 92.1 1 (5'-CGCCTCGAGTCCCAATGAATAGGGCATTGG-3 '; SEQ ID NO: 56) shows a sequence 12 base pairs upstream of the translation initiation site of the ILTV gI gene. To synthesize DNA toward the 5'end of the gD gene. The product of the PCR reaction is 818 Base pairs. This DNA fragment was digested with XbaI at the 5'end (ILTV DNA The restriction enzyme site at 3'end with XhoI (the restriction site created in the PCR primer). Restriction enzyme site-see underlined sequence) and cut XbaI to approximately 619 base pairs. XhoI fragment was prepared. Fragment 3 is a SalI fragment of approximately 3051 base pairs. PRV gX promoter, uidA gene and HSV-1TK polyadene Contains the 6). Fragment 4 is an approximately 624 base pair XhoI to HindIII fragment. Generated by PCR (SEQ ID NO: 1 Nucl.10,847-11,461). This mold Was the ILTV 8.0 kb Asp718I fragment. Upstream primer 92.10 (5'-CGCCTCCGAGGACCATGGGTTGCGTGCG-3 '; sequence number No. 57) is located 117 base pairs upstream from the translation terminal codon in the ILTV gI gene. Get on. Downstream primer 92.08 (5'-CTCGTCCGAACGAGTTACAG-3 '; SEQ ID NO: 58) is ILT 604 base pairs downstream from the translation end in the VgI and ILTV gE genes Get on. The PCR product (729 base pairs) was used as an upstream PCR primer (underlay). The unique sites XhoI and HindIII generated by A site within the E gene was cut. Restriction endonucleases by XhoI and HindIII The cleavage produced a fragment 4 of approximately 624 base pairs. Fragment 5 , An approximately 2700 base pair HindIII subunit of the ILTV 8.0 kb Asp718I fragment. (SEQ ID NO: 1, Nucl. 11, 461-13, 473 and undecided DN) A). Homology vector 472-73.27   Plasmid 472-73.27 is the ILT virus-derived glycoprotein G (gG) gene coding region. It was created for the purpose of removing part of the region and inserting exogenous DNA. For this, IL E. coli lacZ, a screenable marker flanked by T virus DNA A gene is incorporated. The HCMV IE promoter-E. Coli lacZ gene is It is transcribed in the same direction as the promoter of the ILTV gG gene. ILTV gG The deletion of 874 base pairs in the gene is due to the It extends to 814 nucleotides within the sequence encoding gG protein (SEQ ID NO: 7 Of the 292 amino acids of) lost the ability to encode 271. This plasmid Homologous recombination method for producing recombinant herpesvirus " Then, the DNA encoding amino acids 1-271 of the ILTV gG gene was It will be replaced by the DNA encoding the E. coli lacZ gene. This program A detailed depiction of the rasmid is shown in Figure 4. This is standard from the indicated DNA source Made using various recombinant DNA techniques (42, 43). The plasmid vector is pUC1 9 (Gibco BRL) derived from an Asp718I restriction fragment of approximately 2686 base pairs. You. Fragment 1 is approximately 283 of the ILTV5146 base pair Asp718I fragment. It is a 0 base pair sub-fragment from Asp718I to NheI (SEQ ID NO: 1: Nucl . 1714-4544). Fragment 2 is an approximately 5017 base pair SalI to SalI lagmen. The HCMV IE promoter, E. coli β-galactosidase (lacZ) mer It contains the Kerr gene and the PRV gX polyadenylation signal (see Figure 4). H Lagment 3 is approximately 1709 bases of the ILTV5164 base pair Asp718I fragment. A pair of SalI to Asp718I subfragments (SEQ ID NO: 1 Nucl. -6878). Homology vector 560-52.F1   Plasmid 560-52.F1 contains part of the UL47-like gene, all of ORF4, ILT A part of the V gG gene was removed from the ILT virus and It was created for the purpose of inserting native DNA. This is next to the ILT virus DNA The E. coli uidA gene, which is a screenable marker to which it contacts, is integrated . PRV gX promoter-E. Coli uidA gene is ILTV UL47-like, OR Transcribed in the opposite direction of the F4 and gG gene promoters. 2640 base pair deletion Is 442 of the 3'terminal 511 amino acid codons of the UL47-like gene (SEQ ID NO: 4). With all the coding sequences of the ORF gene (SEQ ID NO: 5) and ILTV g 271 of the 293 amino acid codons at the 5'end of the G gene (SEQ ID NO: 7) were removed . This plasmid was designated as "a homologous recombination method for the production of recombinant herpesvirus. , ILTV UL47-like, ORF4 and gG genes. DNA encoding the PRV gX promoter-E. Coli uidA gene Will be replaced by DNA. A detailed depiction of this plasmid is shown in Figure 8. . It was made from the indicated DNA source using standard recombinant DNA techniques. Yes (42, 43). This plasmid vector contains approximately 2958 salts of pSP18 / pSP19. Derived from the base pair Asp718I restriction fragment, the multiple cloning site was EcoRI / SacI / Asp718I / SacI / EcoRI. Fragment 1 is ILTV5 Approximately 1066 base pairs of the 164 base pair Asp718I fragment from Asp718I to BssHII (SEQ ID NO: 1 Nucl. 1714-2777). Fragment 2 is an approximately 123 base pair SalI fragment of the ILTV5164 base pair Asp718I fragment. To BclI subfragments. Fragment 3 is approximately 3027 base pairs BamI fragment, PRV gX promoter, uidA gene and HSV-1T K It contains a polyadenylation site (see Figure 5). Fragment 4 is ILTV51 Approximately 1334 base pairs of the Asp718I fragment of 64 base pairs BclI et al. It is a fragment (SEQ ID NO: 1 Nucl. 5544-6878). Homology vector 579-14.G2   Plasmid 579-14.G2 contains all gG and g60 genes from the ILT virus. It was constructed for the purpose of removing part of the offspring and inserting foreign DNA. This includes Screening for PRV gX promoter flanked by ILT virus DNA A possible marker, the E. coli uidA gene, has been integrated. PRV gX Promo The ter-E. Coli uidA gene is the same as the ILTV gG and g60 gene promoters. Is transferred in the direction. Deletion of 3351 base pairs includes all the coding sequences of the ILTV gG gene. Ringing sequence (SEQ ID NO: 7) and the 986 amino acid codon from the 5'end of the g60 gene. 733 (SEQ ID NO: 8) is included. This plasmid was designated as "recombinant herpes ILTV when used according to the "homologous recombination method for producing viruses".  DNA encoding amino acids 1 to 733 of gG gene and ILTV g60 gene , Will replace the DNA encoding the E. coli uidA gene. This plasmid A detailed depiction of is shown in FIG. This is standard from the indicated DNA source Made using recombinant DNA technology (42, 43). This plasmid vector pUC1 9 (Gibco, BRL) is an approximately 2677 base pair Asp718I to BamHI fragment. Is derived from the Fragment 1 is the Asp718I fragment of ILTV5164 base pairs. Gumento It is a sub-fragment of Asp718I to NheI of approximately 2830 base pairs (SEQ ID NO: 1). : Nucl. 1714-4544). Fragment 2 is a SalI fragment of approximately 3015 base pairs. PVR gX promoter, E. coli β-glucuronidase (uidA) mer It contains the Kerr gene and the HSV-ITK polyadenylation site (Figure 9). Hula Segment 3 is approximately 1709 base pairs of the ILTV4545 base pair BamHI fragment. Of SalI to BamHI (SEQ ID NO: 1 Nucl. 7895-96). 04). Plasmid 544-39.13   Plasmid 544-39.13 contains the PRV gX promoter, E. coli β-glucuroni. Consists of a dase (uidA) marker gene and the HSV-1 TK polyadenylation site It contains the β-glucuronidase expression cassette. Detailed description of marker genes Is shown in FIG. This is done using standard recombinant DNA techniques (42, 43) A restriction fragment from the source was constructed by ligating to the synthetic DNA sequence shown in Figure 10. . The plasmid vector pSP71 (Promega) contains approximately 3066 base pairs of XmaI to Sm. Derived from aI fragment. Fragment 1 is the PRV BamHI restriction flag Is an approximately 422 base pair SalI to EcoRI restriction subfragment of mention # 10. (47). The EcoRI site was introduced by PCR cloning into the location shown in Figure 12. Notice that it was included. Fragment 2 is plasmid pRAJ260 (Clonetech ) Is an EcoRI to SmaI fragment of approximately 1826 base pairs. EcoRI and The XmaI site was used for PCR cloning in the location shown in Figure 10. So notice that it was introduced. Fragment 3 is HSV-1 BamHI restricted It is an approximately 784 base pair XmaI subfragment of fragment Q (48). This The fragment of E. coli has a polyadenylation sequence (AATAAA). Note that it is oriented to be closest to the junction with the dA gene Get it. Plasmid 388-65.2   Plasmid 388-65.2 is a direct early (IE) promoter, E. coli lacZ mer. Β-galactosida consisting of Kerr gene and PRV gX gene polyadenylation site It contains an enzyme expression cassette. Detailed drawing of the β-galactosidase expression cassette The transcript is shown in Figure 11. This is done using standard recombinant DNA technology (42,43) Ligate restriction fragments from the following sources with the synthetic DNA sequence shown in FIG. It was produced by The plasmid vector pSP72 (Promega) contains approximately 307 Derived from a 6 base pair PstI to PstI fragment. Fragment 1 is H Derived from the HCMV 2.1 kb PstI fragment containing the CMV IE promoter , A 1154 base pair PstI to AvaII fragment. Fragment 2 is E Bam of 3010 base pairs derived from the plasmid pJF751 (49) containing the .colilacZ gene HI to PvuII fragment. Fragment 3 contains the 19-terminal carboxy terminus. PRV BamHI # containing the polyadenylation signal of the mino acid and the PRV gX gene Approximately 750 base pairs of NdeI to SalI fragment from 7. An example Example 1Complete nucleotide sequence of unique short region of infectious laryngotracheitis virus (ILTV)   We conclude from the short region of the ILT virus (SEQ.ID.NO.1) to the adjacent D The 13,473 base pair sequence of NA was determined. This sequence has a total of 13,098 bases A unique short region of the pair, with a 273 base pair repeat region at one end and 1 at the other end It contains a repeat region of 02 base pairs. The unique short region is 110 amino acids. 13 methionine-initiated open reading frames (greater than or equal to acid ORF) (excluding smaller nested ORFs). All 1 The ORF of 3 is the IBI Mac vector protein-DNA alignment option. Of the GenBank DNA database using the default (default setting) Entrez release 6.0 virus division  of the Genbank DNA database utilizing the IBI MacVector Protein to DNA alignment option). 8 of the ORFs are 1 or more It showed significant homology to other viral genes (see table). Nukure referred to below The number of octido sequences begins within the internal repeat and ends within the terminal repeat. The unique short region has a sequence ID NO. Begins with 1 base pair 274. US2 gene   The US2 gene consists of 690 base pairs, has a length of 229 amino acids and a molecular weight of about 25. , 272 Dalton protein is encoded (SEQ. ID. NO. 12, 13) . ILTV US2 is equine herpes virus (EHV) -1 and EHV-4 U It is homologous to S2 protein. The US2 gene is a reverse complement of the unique short region of ILTV. It is transcribed from nucleotides 970 to 281 on the body chain (SEQ.ID.N. O. 1). The function of the US2 gene product is unknown.Protein kinase gene   The protein kinase gene has 143 nucleotides 1059 to 2489. Tans consisting of 1 base pair, 476 amino acids in length, and molecular weight of about 54,316 daltons. Code the Park (SEQ.ID.NO.2). ILTV protein kinase Marek's disease virus (MDV), equine herpes virus (EHV) -1 and -4, tentative Sexual Rabies Virus (PRV), Varicella-Zoster Virus (VZV), Monkey Varicella From Ils (SVV), and Herpes Simplex Virus (HSV) -1 and -2 It is homologous to protein kinases.UL47-like gene   The UL47-like gene is located in a unique short region of the ILT virus. And unique. UL47-like genes in all other known herpes viruses Is a unique length array Located inside. The UL47-like gene has nucleotides 2575 to 4107 Consisting of 1,533 base pairs, length of 510 amino acids, molecular weight of about 57,615 daltons Encoding the protein (SEQ.ID.NO.3).ORF4   ORF4 encodes a protein of unknown function. ORF4 is a nucleotide Consists of 333 base pairs from 4113 to 4445, 110 amino acids in length, molecule Code an open reading frame of approximately 12,015 Daltons (SE Q. ID. NO. 4).ORF4 reverse complement   ORF4 reverse complement (RC) encodes a protein of unknown function. ORF4 RC consists of 380 base pairs from nucleotides 4519 to 4139 and has a length of An open reading frame with 126 amino acids and a molecular weight of approximately 13,860 daltons Code (SEQ.ID.NO.14, 15).gG gene   The gG gene consists of 879 base pairs from nucleotides 4609 to 5487. Code for a glycoprotein with a length of 292 amino acids and a molecular weight of approximately 31,699 daltons Yes (SEQ. ID. NO. 5). ILTV gG glycoprotein is PRV gX , Bovine herpes virus (BHV) -1.3 gG, EHV-1 gG and EHV- It is homologous to 4 gG. In swinepox virus vector or fowlpox virus vector The recombinant ILTV gG protein produced can be purified (see And methods)), and to peptide antisera against ILTV gG. Pepti The anti-serum reacts with ILTV gG derived from wild type virus, but ILTV g It does not react with viruses that have a deletion in the G gene. Deletion of the gG gene in chicken With attenuated ILT virus useful as a vaccine against ILT disease in (See table in Example 6), negatives for distinguishing vaccinated animals from infected animals Also acts as a blinker.g60 gene   The g60 gene was identified as glycoprotein 60 (33,53). g60 remains The gene consists of 2958 base pairs from nucleotides 5697 to 8654 and has a long length. Encodes a glycoprotein of 985 amino acids and a molecular weight of about 106,505 daltons (SEQ.ID.NO.6).ORF6 reverse complement   ORF6 RC is 878 base pairs from nucleotides 7826 to 6948? An open reading machine with a length of 292 amino acids and a molecular weight of approximately 32,120 daltons. Code the ing frame (SEQ.ID.NO.16, 17). ILTV ORF6 RC is an HSV-1 and HSV-2 ribonucleotide reductase It has limited homology with the large subunit (UL39) protein.gD gene   To the vectored fowlpox virus or turkey herpes virus (33) Expression of gD glycoprotein in chicken Is sufficient to enhance the protective immune response in. gD gene is nucleoti Consisting of 1305 base pairs from 8462 to 9766 with a length of 434 amino acids, It encodes a glycoprotein with a molecular weight of approximately 48,477 daltons (SEQ.ID.NO. . 10, 11). ILTV gD glycoproteins include HSV-1, MDV, IPV, And PRV g50 and gD from BHV-1.1. ILT Monoclonal antibodies raised against Ils were derived from the ILTV-derived gD protein. Reacts specifically and is expressed in the turkey herpesvirus (HTV) virus vector. Reacts with the expressed ILTV gD protein. I expressed in HVT vector LTV gD is useful as a subunit vaccine.gI gene   The gI gene has 1089 base pairs from nucleotides 9874 to 10,962. Consists of a glycoprotein of 362 amino acids in length and a molecular weight of 39,753 daltons. (SEQ.ID.NO.7). ILTV gI glycoprotein is VZV It is homologous to gI. Recombinant ILTV gI expressed in swinepox virus vector The protein reacts with convalescent sera from ILTV-infected chicken. Missing gI gene Loss is useful as a vaccine against ILT disease in chicken Attenuated ILT Bring the virus. Recombinant virus with a deletion in gI is Safe in animal studies when vaccinated directly into the respiratory tract, but the parental virus Causes lesions in 90% of birds inoculated by the same route. Missing gI gene Loss acts as a negative marker that distinguishes vaccinated animals from infected animals You.ORF8 reverse complement   ORF8 reverse complement encodes a protein of unknown function. ORF8 RC is It consists of 533 base pairs from nucleotides 11,150 to 10,617 and has a length Open reading frame with 177 amino acids and a molecular weight of approximately 19,470 daltons Code (SEQ.ID.NO.18, 19).gE gene   The gE gene is a 1500 salt of nucleotides 11,159 to 12,658. A sugar tamper consisting of a base pair with a length of 499 amino acids and a molecular weight of approximately 55,397 daltons. Code (SEQ.ID.NO.8). ILTV gE glycoprotein is V ZV, Herpes Simplex Virus (SHV), EHV-1, HSV-1, and PRV It is homologous to the conventional gE glycoprotein. ILTV gE with a subunit vaccine It is a useful neutralizing antigen.ORF10   ORF10 is 783 bases from nucleotide 12,665 to 13,447 It consists of a pair of proteins with a length of 261 amino acids and a molecular weight of about 27,898 daltons. Code (SEQ.ID.NO.9). Example 2S-ILT-004   S-ILT-004 is a thymidine kinase (TK) gene Is an infectious laryngotracheitis virus (ILTV) having a deletion of about 620 base pairs of (28). E. FIG. gene encoding E. coli β-galactosidase (lacZ) At the location of the TK gene to give HCMV immedlate early (IE ) Under the control of a promoter. HCMV IE promoter-lacZ gene Transcription is in the opposite direction from the TK promoter.   S-ILT-004 is a "homologous recombination procedure for producing recombinant viruses. (HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT VIRUS) , Homology vectors 501-94 (see "Materials and Methods") and S- It was constructed using ILT-001 (USDA ILTV strain 83-2). Transfection Stocks are bull ogallTM(Bluogal) "Recombinant blisters expressing enzymatic marker genes. SCREEN FOR RECOMBINANT HERPESVIRUS EXPRESS ING ENZYMATIC MARKER GENES) ". Blue plaque spirit As a result of the production, recombinant virus S-ILT-004 was obtained. This virus is restricted SINGING AND SOUTHERN BLOTTING OF DNA Characterized by the method. This analysis revealed that β-galactosidase (lacZ) The presence of the marker gene and the deletion of about 619 base pairs of the TK gene were confirmed. The remaining TK gene sequences include amino acids 1-77 and amino acids 286-286. It encodes a protein containing 363. HCMV IE promoter -The lacZ gene is in the opposite direction to the transcription of the TK gene. S-ILT-004 Is attenuated by a deletion of the ILTV TK gene but It carries other genes known to be involved in the immune response to Ruth. Obedience Thus, S-ILT-004 is a killed bacterial vaccine for protecting chickens from ILT disease. Can be useful as an interface. Example 3S-ILT-009   S-ILT-009 contains an approximately 498 base pair deletion and I of the ILTV US2 gene. Infectious laryngotracheitis virus with a deletion of approximately 874 base pairs in the LTV gG gene (ILTV). E. FIG. code for E. coli β-glucuronidase (uidA) To insert the gene to the US2 gene to generate pseudorabies virus (PRV) Under control.   S-ILT-009 is a "homologous recombination procedure for producing recombinant viruses. In homology vector 544-55.12 (see "Materials and Methods") and And S-ILT-002. S-ILT-002 is an example 5 (S-I It was constructed as described in LT-014). The transfectant strain is an X-Gluc "yeast". Screen for Recombinant Herpes Virus Expressing a Predominant Marker Gene " Screened. As a result of blue plaque purification, recombinant virus S-ILT- 009 was obtained. This virus is used for restriction mapping and Southern blotting of DNA. Characterization was performed by the ing method. This analysis shows that the PRV gX promoter- β-glucuronidase Presence of the (uidA) marker gene and about 498 of the ILTV US2 gene A base pair deletion and a deletion of about 874 base pairs of the ILTV gG gene were confirmed. However, BullogarTM"Recombinant herpes simplex expressing an enzymatic marker gene. HCMV in the ILTV gG deletion present in the "Screen for Ils" A deletion of the IE promoter-lacZ gene was detected. The rest of ILTV gG The insert into the deletion contains approximately 2000 base pairs of DNA, which should be Lacking all lacZ genes and some PRV gX polyadenylation sites You. This deletion was characterized by detailed restriction mapping, and S-ILT-014 It was determined to be slightly different from the deletion (see Example 5).   S-ILT-009 is attenuated by deletion of ILTV US2 and gG gene Known to be involved in the immune response to ILT virus in chicken Retain other genes that are Therefore, S-ILT-009 is a live attenuated vaccine. To protect chickens from ILT disease as chin or as shown in the table It is useful as a killed vaccine. S-ILT-009 is the ILTV gG gene Since it does not express, it is necessary to distinguish vaccinated animals from infected animals as described above. Used as a negative marker for Example 4S-ILT-011   S-ILT-011 has an approximately 983 base pair deletion of the ILTV gI gene. Infectious laryngotracheitis virus (ILTV). E. FIG. coli β-glucuro A gene encoding nidase (uidA) was inserted at the place of the gI gene to It is under the control of the rabies virus (PRV) gX promoter. PRV gX-u The idA gene is in the opposite direction to the ILTV gI promoter transcription direction.   S-ILT-011 is a "homologous recombination technique for producing recombinant viruses. , Homology vector 562-61.1F (see Materials and Methods) and And S-ILT-00 1 was used. The transfectant strain contains the "enzymatic marker gene of X-Gluc. Screening for recombinant herpes simplex virus expressing ". As a result of blue plaque purification, recombinant virus S-ILT-011 was obtained. This c Ils was characterized by restriction mapping and Southern blotting techniques for DNA. Decided. This analysis revealed that the β-glucuronidase (uidA) marker gene And 325 out of 363 amino acid codons from the 5'end of the gI gene. A deletion of approximately 983 base pairs of the deleted ILTV gI was confirmed.   S-ILT-011 is attenuated and kills to protect chickens from ILT disease It is useful as a bacterial vaccine. S-ILT-011 is small in tissue culture It exhibits a plaque phenotype, which directs slow virus growth and attenuation. S -ILT-011 does not express the ILTV gI gene, so vaccinated animals It can be used as a negative marker to distinguish from infected animals. Shown in Example 1 As such, ILTV-infected chickens make antibodies to the ILTV gI protein. . Example 5S-ILT-013   S-ILT-013 contains a deletion of about 983 base pairs in the ILTV gI gene and I Approximately 874 base pairs deletion of LTV gG gene (and non-functional lacZ gene Having the HCMV IE promoter-lacZ marker gene) It is an infectious laryngotracheitis virus (ILTV). E. FIG. coli The gene encoding β-glucuronidase (uidA) was inserted in place of the gI gene. In addition, it is under the control of the pseudorabies virus (PRV) gX promoter.   S-ILT-013 is a "homologous recombination technique for producing recombinant viruses. , Homology vector 562-61.1F (see Materials and Methods) and And S-ILT-014. The transfectant strain is the "enzyme of X-Gluc. For recombinant herpes simplex virus expressing a genetic marker gene " Cleaned. As a result of blue plaque purification, recombinant virus S-ILT-0 I got 13. This virus uses restriction mapping and Southern blotting of DNA. Characterization was performed by the probing method. By this analysis, β-glucuronidase (uid A) Presence of a marker gene and 363 amino acid codons from the 5'end of the gI gene. A deletion of approximately 983 base pairs of ILTV gI was confirmed, which deleted 325 of the donors. Was. This analysis also revealed that the deletion of approximately 874 base pairs in the ILTV gG gene, And partial HCMV IE promoter-about 1 of lacZ marker gene DNA The insertion of 906 base pairs was confirmed, and for the DNA, HCMV IE promoter was used. Part of the lacZ gene remains and almost none of the lacZ gene remains.   S-ILT-013 is attenuated and kills to protect chickens from ILT disease It is useful as a bacterial vaccine. S-ILT-013 is small in tissue culture It exhibits a plaque phenotype, which directs slow virus growth and attenuation. S -ILT-013 does not express ILTV gI or gG genes, so Can be used as a negative marker to distinguish tinted animals from infected animals . Example 6S-ILT-014   S-ILT-014 contains a deletion of approximately 874 base pairs in the ILTV gG gene, and Inserted HCMV IE promoter lacZ marker that renders the acZ gene non-functional -Infectious laryngotracheitis virus (ILTV) with a gene deletion. S-I LT-014 has a deletion of the HCMV IE promoter lacZ marker gene. Derived from the resulting purified S-ILT-002 virus strain.   S-ILT-002 is a "homologous recombination procedure for producing recombinant viruses. , Homology vector 472-73.27 (see Materials and Methods) and And S-ILT-001. The virus S-ILT-002 is IL Deletion of 874 base pairs in the TV gG gene and E in place of the ILTV gG gene . E. coli β-galactosidase (lacZ) gene insertion. However Of the recombinant herpes simplex virus expressing the enzymatic marker gene Plaques were collected in the "Screen for Included a lacZ deletion within the deletion.   This virus S-ILT-014 is used for restriction mapping, DNA sequencing and And DNA were characterized by Southern blotting techniques. By this analysis, ILTV gG inheritance Deletion of approximately 874 base pairs in the offspring and partial HCMV IE promoter-lacZ mer Approximately 1956 bp insertion of Kerr gene DNA (2958 bp deleted) was confirmed Was. The remaining HCMV IE promoter lacZ marker gene DNA is approximately 1 An approximately 686 base pair fragment of the 154 base pair HCMV IE promoter, and And about 520 of the 3010 base pair β-galactosidase (lacZ) marker gene. Contains base pairs and all of about 750 base pairs of PRV gX polyadenylation signals Consisting of approximately 1270 base pair DNA fragments.   S-ILT-014 can be used as a live attenuated vaccine or as shown in the table below. Moreover, it is useful as a killed vaccine for protecting chicken from ILT disease. In Example 1 As shown, S-ILT-014 does not express the ILTV gG gene and Since TV-infected chickens make antibodies against gG, ILTVgG is used as a vaccine vaccine. It can be used as a negative marker for distinguishing ones from infected animals. Example 7S-ILT-015   S-ILT-015 is a UL47-like gene, ORF4 gene, and ILTV.   Infectious laryngotracheitis virus (I with a deletion of approximately 2460 base pairs of the gG gene) LTV). E. FIG. E. coli β-glucuronidase (uidA) Insert the gene at the location of the UL47-like gene, the ORF4 gene, and the gG gene And is under the control of the pseudorabies virus (PRV) gX promoter. PRV The gX promoter-uidA gene contains ILTV UL47-like, ORF4, and And in the direction opposite to the transcription of the gG promoter.   S-ILT-015 is a "homologous recombination procedure for producing recombinant viruses. , Homology vector 560-52. F1 (see Materials and Methods) and And S-ILT-001. The transfectant strain is the "enzyme of X-Gluc. For recombinant herpes simplex virus expressing a genetic marker gene " Cleaned. As a result of blue plaque purification, recombinant virus S-ILT-0 I got 15. This virus uses restriction mapping and Southern blotting of DNA. Characterization was performed by the probing method. These results show that the 3'end of the UL47-like gene 442 out of a total of 511 amino acid codons at the end, all ORF4 genes, and And 2640 containing 271 of the 293 amino acid codons at the 5'end of the gG gene The presence of the base pair deletion was confirmed.   S-ILT-015 was used as a live attenuated vaccine or as shown in the table below. It is useful as a killed vaccine to protect chickens from LT disease. S-ILT -015 does not express the ILTV gG gene, so vaccinated animals should not be infected. It is used as a negative marker to distinguish from. Example 8S-ILT-017   S-ILT-017 is about 335 of the ILTV gG and g60 genes. Infectious laryngotracheitis virus (ILTV) with a single base pair deletion. E. FIG. c The gene encoding oliβ-glucuronidase (uidA) was expressed by ILTV gG And the pseudo-rabies virus (PRV) gX pro Under control of motor.   S-ILT-017 is a "homologous recombination procedure for producing recombinant viruses. , Homology vector 579-14. G2 (see Materials and Methods) and And S-ILT-001. The transfectant strain is the "enzyme of X-Gluc. For recombinant herpes simplex virus expressing a genetic marker gene " Cleaned. As a result of blue plaque purification, recombinant virus S-ILT-0 I got 17.   S-ILT-017 is attenuated by deletion of ILTV g60 and gG genes Known to be involved in the immune response to ILT virus in chicken Retain other genes that are Therefore, S-ILT-017 was identified in ILT disease. It can be used as a killed vaccine to protect chickens. S-ILT-017 It does not express ILTV gG or g60 genes, so It is used as a negative marker to distinguish from other things. Example 9Infectious Bronchitis Virus (IBV) Spike and Matrices Recombinant Infectious Laryngotracheitis Virus Expressing the Cus Protein Gene   Production of ILT virus containing the IBV Arkansas spike protein gene The homology vector is used to The recombinant ILT virus is gG, US2, Deletion of one or more ILTV genes, including UL47-like and ORF4, And two foreign genes E. coli β-glucuronidase gene (uidA) And IBV Arkansas spike protein gene insertion. uidA gene Is under the control of the PRV gX promoter and is associated with the IBV Arkansas spiker The nucleic acid gene is under the control of the HCMV IE promoter.   To construct a homologous vector containing the foreign gene inserted in the ILT virus For this purpose, the HCMV-IE promoter, IBV arcanthus spike protein and And a DNA fragment containing the HSV-1 TK polyadenylation signal. Insertion into the restriction enzyme site of the deletion position of the ILTV gG gene in the LTV homology vector I do. PRV gX promoter and E. coli coli β-glucuronidase (u The DNA fragment containing the idA) gene was cloned into the ILTV homology vector. Insert into the restriction enzyme site. Recombinant virus "produces recombinant virus IBV Arkansas spike gene and E. . final homologous vector containing the E. coli β-glucuronidase (uidA) gene And S-ILT-001. Transfected strains were "enzymatic" of X-Gluc to detect the presence of the uidA gene. Screen for recombinant herpes simplex virus expressing a marker gene, To detect the presence of IBV and Arkansas spike proteins BLACK PLAQUE ASSAY FOR FOREIGN GEN E EXPRESSION) ”.   The recombinant ILT virus carrying the IBV S1 protein was transferred to Arkansas and Masa. IBV matrix protein from Chusetsu or Connecticut serotypes Carrying recombinant ILT virus carrying Arkansas, Massachusetts or Conek Recombinant ILT from the Chikat serotype and carrying an IBV nucleocapsid Ils constructed from Arkansas, Massachusetts or Connecticut serotypes Use a similar approach to This technique is also used for Newcastle disease (NDV) HN and F genes, and Bursal disease virus (IBDV) polytan Used to construct recombinant ILT virus carrying Pak or part thereof . This approach also uses the Marek's disease virus (MDV) gA, gD and gB genes. Used to construct a recombinant ILT virus carrying   Recombinant ILT viruses carrying these antigens are ILTV and viral IB Diseases caused by one or more of V, NDV, IBDV or MDV Valuable as a multivalent vaccine to protect chickens from the air. Listed here ILTV vaccine does not express ILTV gG, so Useful as a negative marker to distinguish tinted animals from infected animals . Example 10Vaccine using ILTV to express antigen from various disease-causing microorganisms   Antibodies from the following microorganisms are used to develop poultry vaccines. sand Wachi, chick anemia factor, avian encephalomyelitis virus, avian reovirus, avian paramy Fucking virus, avian influenza virus, avian adenovirus, fowlpox virus , Avian coronavirus, avian rotavirus, Salmonella spp. , E col i, Pasteurella spp. , Haemophilus spp. , Chlamydia spp. , Maiko Plasma spp. , Campylobacter spp. , Bordetella spp. , Poultry line Insects, tapeworms, trematodes, poultry mite / lice, poultry protozoa (Eimeria spp., Histomonas spp. , Trichomonas spp. ).

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年８月７日 【補正内容】 性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチンとしての使用に適したものとする。この 発明の好ましい態様は、Ｓ-ＩＬＴ-014と命名された組換え感染性喉頭気管炎で ある（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2427。Ｓ-ＩＬＴ-014ウイルスは、特許手続上の微 生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に準じて、アメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクション［Ａmerlcan Ｔype Ｃulture Ｃollection］、1230 1 Ｐarklawn Ｄrive,Ｒockville,Ｍaryland20852Ｕ.Ｓ.Ａ.に、1993年９月22日 に、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2427で寄託されている。）。この発明の他の好ましい 態様は、Ｓ-ＩＬＴ-002と命名されている組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであ る。 この発明の目的のためには、“組換え感染性喉頭気管炎ウイルス”は、この技 術分野の熟練者に周知の組換え方法、例えば、材料及び方法の「組換えＩＬＴＶ ウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移入」に説明されている方法、によって生 成された、生きている感染性喉頭気管炎ウイルスである。このウイルスは、感染 性喉頭気管炎ウイルスの複製に必須の遺伝学的物質は欠失してはいない。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧ遺伝子及びＵＳ２遺伝子に欠失を有する感染 性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイルスを提供する 。この発明の好ましい一態様は、Ｓ-ＩＬＴ-009と命名された組換え感染性喉頭 気管炎ウイルスである。 さらに、この発明は、糖蛋白gＧ遺伝子及びＯＲＦ４遺伝子に欠失を有する感 染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え 喉頭気管炎ウイルスを提供する。 精製した。ＤＮＡ連結は溶融アガロースの存在下で行われた。その結果できたコ スミドpＳＹ1005をＥcoＲＩ部位でネオマイシン抵抗性遺伝子を含むpＮeo（Ｐ- Ｌ Ｂiochemicals）からとった1.5kbのＨindIII−ＢamＨＩフラグメントを平滑 末端に挿入して修飾し、pＳＹ1626を作った。このpＳＹ1626をＢamＨＩ部位で切 断し平滑末端にして、上述の通り削りとったＩＬＴＶフラグメントと連結した。 連結する混合物は、Ｇlfapack ＸＬ（Ｓtratagene）を用いて、製造者の指示に したがってパッケージングした。パッケージングした混合物をマルトース存在下 で増殖しているＡＧＩ細胞（Ｓtratagene）に加え、コロニーをカナマイシンを 含むＬＢプレートで選択した。ＩＬＴＶ ＤＮＡを含むコスミドサブクローンを 、それぞれのコスミドクローンの制限酵素地図を互いに、そしてＩＬＴＶゲノム ＤＮＡと比較して同定し、ＩＬＴＶゲノムＤＮＡの連続配列を得た。 酵素のマーカー遺伝子を発現する組換えＩＬＴＶのスクリーニング Ｅ.coli β−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼ（uidＡ）マーカ ー遺伝子を組換えウイルスに組み込むと、組換え体を含むプラークは簡単なアッ セイで視覚化することができる。酵素の基質は、プラークアッセイ中に上層のア ガロースに取り込まれる（300μg／ml）。lacＺマーカー遺伝子のために、基質 ＢluogalTM（ハロゲン化インドリル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ、Ｇibco ＢＲＬ） を使用した。uidＡマーカー遺伝子のために、基質Ｘ-グルクロＣhx（5-ブロモ-4 -クロロ-3-インドリ 作られた（28）。これには、ＩＬＴウイルスＤＮＡに隣接しているＨＣＭＶ Ｉ ＥプロモーターとスクリーニングできるマーカーのＥ.colilacＺ遺伝子が組込ま れている。ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター−Ｅ.coli lacＺ遺伝子は、ＩＬＴＶ Ｔ Ｋ遺伝子と反対の転写方向に挿入されている。マーカー遺伝子の上流は、ＩＬＴ Ｖ ＤＮＡのおよそ1087塩基対のフラグメントで、これはＩＬＴＶ ＴＫ遺伝子の 初めの77アミノ酸コドンを含んでいる。lacＺ遺伝子の下流は、ＩＬＴＶ ＤＮＡ のおよそ675の塩基対フラグメントで、これはＩＬＴＶ ＴＫ遺伝子の3‘末端に8 0アミノ酸コドンを含んでいる。このプラスミドを、「組換えＩＬＴウイルスを 生成するためのＤＮＡ形質移入」にしたがって使うと、ＩＬＴＶＴＫ遺伝子の78 から285のアミノ酸をコードしているＤＮＡを、lacＺ遺伝子をコードしているＤ ＮＡと入れ替えることになるだろう。lacＺマーカー遺伝子はヒトサイトメガロ ウイルス（ＨＣＭＶ）直接早期［immediate early］（ＩＥ）遺伝子プロモータ ーに制御されていて、また仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）gＸ遺伝子のポリアデ ニル化シグナルを遺伝子の3'末端にもっている。このプラスミドの詳細な描写は 図５に示されている。これは示されたＤＮＡソースから構成され、標準的な組換 えＤＮＡ技術を用いて構成された（42、43）。このプラスミドベクターはpＳＰ6 4／65（Ｐromega）のおよそ3002塩基対のＨindIIIフラグメントに由来している 。フラグメント１は、ＩＬＴＶ2.4kb ＨindIIIフラグメントのおよそ1087塩基対 のＨindIIIからＢclＩサブフラグメントである。フラグメント２はおよそ5017塩 基対のＳalＩからＳalＩのフラグメントで、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター、β− ガ ラクトシダーゼ（lacＺ）マーカー遺伝子とＰＲＶ gＸポリアデニル化シグナル を含んでいる（図５参照）。フラグメント３は、ＩＬＴＶ2.4kbのＨindIIIフラ グメントのおよそ675塩基対のBclＩからＨindIIIのサブフラグメントである。 相同性ベクター544-55.12 プラスミド544-55-12はＩＬＴウイルスからＵＳ２遺伝子をコードしている領 域の一部を削除し、外来性のＤＮＡを挿入する目的で作られた。これには、ＩＬ ＴウイルスＤＮＡに隣接しているスクリーニングできるマーカーのＥ.coli uid Ａ遺伝子が組込まれている。ＰＲＶ gＸプロモーター−Ｅ.coliuidＡ遺伝子はＩ ＬＴＶ ＵＳ２遺伝子と反対の転写方向に挿入されている。uidＡ遺伝子の上流は ＩＬＴＶ ＤＮＡのおよそ2300塩基対のフラグメントで、これはＵＳ２遺伝子の3 ‘末端に41アミノ酸コドンを含んでいる（配列番号２:aa．188-229）。uidＡ遺 伝子の下流は、ＩＬＴＶＤＮＡのおよそ809塩基対のフラグメントで、これはＵ Ｓ２遺伝子の5'末端の22個のアミノ酸コドンを含んでいる（配列番号22：aa．1 −22）。このプラスミドを、「組換えＩＬＴウイルスを生成するためのＤＮＡ形 質移入」に基づいて使うと、23から187のアミノ酸をコードしているＩＬＴＶ Ｕ Ｓ２ ＤＮＡをＥ.coli uidＡ遺伝子をコードしているＤＮＡに置き換えるだろう ・uidＡマーカー遺伝子は仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）gＸプロモーターに制御 されていて、また、１型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ-1ＴＫ ）遺伝子ポリアデニル化シグナルを遺伝子の3‘末端に含んでいる。このプラス ミドの詳細な描写 は図６に示されている。これは示されたＤＮＡソースから標準的な組換えＤＮＡ 技術を用いて作った（42、43）。このプラスミドベクターは、pＳＰ18／pＳＰ19 結合体のおよそ2958塩基対のＡsp718Ｉ制限フラグメントに由来していて、多重 クローニング部位はＥcoＲＩ／ＳacＩ／Ａsp718Ｉ／ＳacＩ／ＥcoＲＩである。 フラグメント１は、ＩＬＴＶ 2.5kb Ａsp718Ｉフラグメントのおよそ2300塩基対 のＡsp718ＩからＤraＩサブフラグメント（配列番号１：Ｎucl．1−405）である 。フラグメント２はおよそ3039塩基対のＸbaＩフラグメントでＰＲＶ gＸプロモ ーター、Ｅ.coli uidＡ遺伝子とＨＳＶ-1ＴＫポリアデニル化部位を含んでいる （図６参照）。フラグメント３は、ＩＬＴＶ1097塩基対のＡsp718Ｉフラグメン トのおよそ809塩基対のＸbaＩからＡsp718Ｉサブフラグメントである（配列番号 １：Ｎucl．905−1714）。 相同性ベクター562-61.1Ｆ プラスミド562-61.1ＦはＩＬＴウイルスからgＩ遺伝子の一部を削除し、外来 性のＤＮＡを挿入する目的で作られた。これには、ＩＬＴウイルスＤＮＡが隣接 するスクリーニング可能なマーカーのＥ.coli uidＡ遺伝子が組込まれている。 ＰＲＶ gＸプロモーター−Ｅ.coli uidA遺伝子はＩＬＴＶ gＩ遺伝子プロモータ ーと反対の方向に転写される。983塩基対の欠失は翻訳開始コドンの12塩基対上 流から始まり、ＩＬＴＶ gＩ遺伝子の5‘末端の363アミノ酸コドンの324を欠失 している（配列番号11:aa.325−363）。このプラスミドを「組換えＩＬＴウイル スを生成するためのＤＮＡ形質移入」に基づいて使用すれば、ＩＬＴＶ gＩ 遺伝子の874塩基対の欠失は、翻訳開始部位の60ヌクレオチド上流からアミノ酸 をコードしている配列内の814ヌクレオチドまで広がり、gＧ蛋白質（配列番号７ ）の292のアミノ酸のうち271をコードする能力を失った。このプラスミドを、「 組換えＩＬＴウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移入」にしたがって使用する と、ＩＬＴＶ gＧ遺伝子の１から271のアミノ酸をコードしているＤＮＡが、Ｅ. coli lacＺ遺伝子をコードしているＤＮＡと置き換えられるだろう。このプラス ミドの詳しい描写は図４に示した。これは示されたＤＮＡソースから標準的な組 換えＤＮＡ技術を用いて作られた（42、43）。プラスミドベクターはpＵＣ19（ Ｇibco ＢＲＬ）のおよそ2686塩基対のＡsp718Ｉ制限フラグメントに由来する。 フラグメント１は、ＩＬＴＶ5146塩基対Ａsp718Ｉフラグメントのおよそ2830塩 基対のＡsp718ＩからＮheＩのサブフラグメントである（配列番号１：Ｎucl．17 14-4544）。フラグメント２はおよそ5017塩基対のＳalＩからＳalＩフラグメン トで、ＨＣＭＶＩＥプロモータ、Ｅ.coliβ−ガラクトシダーゼ（lacＺ）マーカ ー遺伝子とＰＲＶ gＸポリアデニル化シグナルを含んでいる（図４参照）。フラ グメント３は、ＩＬＴＶ5164塩基対Ａsp718Ｉフラグメントのおよそ1709塩基対 のSalＩからＡsp718Iのサブフラグメントである（配列番号１：Ｎucl．5419-687 8）。 相同性ベクター560-52.Ｆ1 プラスミド560-52.F1は、UL47様遺伝子の一部、ＯＲＦ４の全部、ＩＬＴＶ g Ｇ遺伝子の一部をＩＬＴウイルスから除去し、外 来性のＤＮＡを挿入する目的で作られた。これには、ＩＬＴウイルスＤＮＡが隣 接するスクリーニング可能なマーカーのＥ.coli uidＡ遺伝子が組込まれている 。ＰＲＶ gＸプロモーター−Ｅ.coli uidＡ遺伝子は、ＩＬＴＶ ＵＬ47様、ＯＲ Ｆ４及びgＧ遺伝子プロモーターと反対の方向に転写される。2640塩基対の欠失 は、ＵＬ47様遺伝子（配列番号４）の3‘末端の511のアミノ酸コドンのうち442 を、ＯＲＦ遺伝子（配列番号５）のすべてのコーディング配列、及びＩＬＴＶ g Ｇ遺伝子（配列番号７）の5'末端の293のアミノ酸コドンのうちの271を除去した 。このプラスミドを、「組換えＩＬＴウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移入 」にしたがって使用すると、ＩＬＴＶ ＵＬ47様、ＯＲＦ４及びgＧ遺伝子をコー ドするＤＮＡが、ＰＲＶ gＸプロモーター−Ｅ.coli uidＡ遺伝子をコードする ＤＮＡに置き換えられるだろう。このプラスミドの詳しい描写は図８に示される 。これは示されているＤＮＡソースから標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製 した（42、43）。このプラスミドベクターは、pＳＰ18／pＳＰ19のおよそ2958塩 基対のＡsp718Ｉ制限フラグメントに由来し、多重クローニング部位はＥcoＲＩ ／ＳacＩ／Ａsp718Ｉ／ＳacＩ／ＥcoＲＩである。フラグメント１は、ＩＬＴＶ5 164塩基対Ａsp718Ｉフラグメントのおよそ1066塩基対のＡsp718ＩからＢssＨII のサブフラグメントである（配列番号１：Ｎucl．1714−2777）。フラグメント ２は、ＩＬＴＶ5164塩基対のＡsp718Ｉフラグメントのおよそ123塩基対のＳalＩ からＢclＩのサブフラグメントである。フラグメント３は、およそ3027塩基対の ＢamＩフラグメントで、ＰＲＶ gＸプロモーター、uidＡ遺伝子及びＨＳＶ-1Ｔ Ｋ ポリアデニル化部位を含んでいる（図５参照）。フラグメント４は、ＩＬＴＶ51 64塩基対のＡsp718Ｉフラグメントのおよそ1334塩基対のＢclＩからＡsp718Ｉの サブフラグメントである（配列番号１：Ｎucl．5544-6878）。 相同性ベクター579-14.Ｇ2 プラスミド579-14.Ｇ2は、ＩＬＴウイルスからすべてのgＧ遺伝子とg60遺伝子 の一部を除去し、外来性のＤＮＡを挿入する目的で組み立てられた。これには、 ＩＬＴウイルスＤＮＡが隣接するＰＲＶ gＸプロモーターと、スクリーニング可 能なマーカーのＥ.coli uldＡ遺伝子が組込まれている。ＰＲＶ gＸプロモータ ー−Ｅ.coli uidA遺伝予は、ＩＬＴＶ gＧ及びg60遺伝子プロモーターと同じ方 向に転写される。3351塩基対の欠失には、IＬＴＶ gＧ遺伝子の全てのコーディ ング配列（配列番号７）とg60遺伝子の5‘末端からの986アミノ酸コドンのうち の733（配列番号８）が含まれている。このプラスミドを、「組換えＩＬＴウイ ルスを生成するためのＤＮＡ形質移入」にしたがって使用すると、ＩＬＴＶ gＧ 遺伝子及びＩＬＴＶ g60遺伝子のアミノ酸１から733をコードするＤＮＡが、Ｅ. coli uidA遺伝子をコードするＤＮＡに置き換わるだろう。このプラスミドの詳 細な描写は図９に示されている。これは示されたＤＮＡソースから標準的な組換 えＤＮＡ技術（42、43）を使って作製した。このプラスミドベクターpＵＣ19（ Ｇibco,ＢＲＬ）は、およそ2677塩基対のＡsp718ＩからＢamＨＩのフラグメント に由来している。フラグメント１は、ＩＬＴＶ5164塩基対のＡsp718Ｉフラグメ ントのお の約６２０塩基対の欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である （２８）。Ｅ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子 をＴＫ遺伝子の場所に挿入して、ＨＣＭＶ即時早期（immediate early）（ＩＥ ）プロモーターの制御下にある。ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター−ｌａｃＺ遺伝子 の転写は、ＴＫプロモーターと反対方向にある。 Ｓ−ＩＬＴ−００４は、「組替えＩＬＴウイルスを生成するためのＤＮＡ形質 移入」において相同ベクター５０１−９４（「材料および方法」を参照）および Ｓ−ＩＬＴ−００１（ＵＳＤＡ ＩＬＴＶ株８３−２）を用いて構築した。形質 移入株は、ブルオガルTM（Bluogal）の「酵素的マーカー遺伝子を発現する組替 体疱疹ウイルスのためのスクリーン（SCREEN FOR RECOMBINANT HERPESVIRUS EXP RESSING ENZYMATIC MARKER GENES）」によりスクリーニングした。ブループラー ク精製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ−００４を得た。このウイルスは、制 限マッピングおよびＤＮＡのサザンブロッティング（SOUTHERN BLOTTING OF DNA ）手法により特性決定した。この分析により、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ ）マーカー遺伝子の存在、およびＴＫ遺伝子の約６１９塩基対の欠失が確認され た。残りのＴＫ遺伝子配列は、アミノ酸１ないし７７、およびアミノ酸２８６な いし３６３を含むタンパクをコードする。ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター −ｌａｃＺ遺伝子は、ＴＫ遺伝子の転写と反対方向である。Ｓ−ＩＬＴ−００４ は、ＩＬＴＶ ＴＫ遺伝子の欠失により弱毒化されるが、チキン中のＩＬＴウイ ルスに対する免疫応答に関与することが知られている他の遺伝子を保持する。従 って、Ｓ−ＩＬＴ−００４は、ＩＬＴ病からチキンを保護するための死菌ワクチ ンとして有用であり得る。 例 ３Ｓ−ＩＬＴ−００９ Ｓ−ＩＬＴ−００９は、ＩＬＴＶ ＵＳ２遺伝子の約４９８塩基対の欠失とＩ ＬＴＶ ｇＧ遺伝子の約８７４塩基対の欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルス （ＩＬＴＶ）である。Ｅ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコード する遺伝子をＵＳ２遺伝子の場所に挿入して、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）の 制御下にある。 Ｓ−ＩＬＴ−００９は、「組替えILTウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移 入」において相同ベクター５４４−５５．１２（「材料および方法」を参照）お よびＳ−ＩＬＴ−００２を用いて構築した。Ｓ−ＩＬＴ−００２は、例５（Ｓ− ＩＬＴ−０１４）に記載したように構築した。形質移入株は、Ｘ−Ｇｌｕｃの「 酵素的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルスのためのスクリーン」によ りスクリーニングした。ブループラーク精製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ −００９を得た。このウイルスは、制限マッピングおよびＤＮＡのサザンブロッ ティング手法により特性決定した。この分析により、ＰＲＶ ｇＸプロモーター −β−グルクロニダーゼ 例 ４Ｓ−ＩＬＴ−０１１ Ｓ−ＩＬＴ−０１１は、ＩＬＴＶ ｇＩ遺伝子の約９８３塩基対の欠失を有す る感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。Ｅ．ｃｏｌｉβ−グルクロニ ダーゼ（ｕｉｄＡ）をコードする遺伝子をｇＩ遺伝子の場所に挿入して、仮性狂 犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロモーターの制御下にある。ＰＲＶ ｇＸ−ｕｉ ｄＡ遺伝子は、ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの転写方向と反対方向にある。 Ｓ−ＩＬＴ−０１１は、「組替えILTウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移 入」において相同ベクター５６２−６１．１Ｆ（「材料および方法」を参照）お よびＳ−ＩＬＴ−００ β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコードする遺伝子をｇＩ遺伝子の場所に挿 入して、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロモーターの制御下にある。 Ｓ−ＩＬＴ−０１３は、「組替えILTウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移 入」において相同ベクター５６２−６１．ＩＦ（「材料および方法」を参照）お よびＳ−ＩＬＴ−０１４を用いて構築した。形質移入株は、Ｘ−Ｇｌｕｃの「酵 素的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルスのためのスクリーン」により スクリーニングした。ブループラーク精製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ− ０１３を得た。このウイルスは、制限マッピングおよびＤＮＡのサザンブロッテ ィング手法により特性決定した。この分析により、β−グルクロニダーゼ（ｕｉ ｄＡ）マーカー遺伝子の存在、およびｇＩ遺伝子の５’末端から３６３アミノ酸 コドンのうち３２５を欠失するＩＬＴＶ ｇＩの約９８３塩基対の欠失が確認さ れた。また、この分析により、ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の約８７４塩基対の欠失、 および部分的ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター−ｌａｃＺマーカー遺伝子ＤＮＡの約 １９０６塩基対の挿入が確認され、当該ＤＮＡについては、ＨＣＭＶ ＩＥプロ モーターの一部が残存し、ｌａｃＺ遺伝子のほとんどすべてが残存していない。 Ｓ−ＩＬＴ−０１３は、弱毒化され、ＩＬＴ病からチキンを保護するための死 菌ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ−０１３は、組織培養において小さな プラーク表現型を示し、これは遅いウイルスの成長と弱毒化を指示している。Ｓ −ＩＬＴ−０１３はＩＬＴＶ ｇＩもしくはｇＧ遺伝子を発現しないので、ワク チン化動物を感染動物から区別するためのネガティブマーカーとして利用し得る 。 例 ６Ｓ−ＩＬＴ−０１４ Ｓ−ＩＬＴ−０１４は、ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の約８７４塩基対の欠失と、ｌ ａｃＺ遺伝子を非機能性にする挿入ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターｌａｃＺマーカ ー遺伝子の欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。Ｓ−Ｉ ＬＴ−０１４は、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターｌａｃＺマーカー遺伝子の欠失が 生じた精製Ｓ−ＩＬＴ−００２ウイルス株から誘導した。 Ｓ−ＩＬＴ−００２は、「組替えILTウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移 入」において相同ベクター４７２−７３．２７（「材料および方法」を参照）お よびＳ−ＩＬＴ−００１を用いて構築した。ウイルスＳ−ＩＬＴ−００２は、Ｉ ＬＴＶ ｇＧ遺伝子内の８７４塩基対の欠失と、ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の代りの Ｅ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子の挿入とを有する。しか しながら、ブルオガルの「酵素的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルス のためのスクリーン」中に、ホワイトプラークを採取したところ、ＩＬＴＶ ｇ Ｇ欠失内にｌａｃＺの欠失を含んでいた。 このウイルスＳ−ＩＬＴ−０１４は、制限マッピング、ＤＮＡ塩基配列決定お よびＤＮＡのサザンブロッティング手法により特性決定した。この分析により、 ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝 １４日齢ヒヨコ ａ：ＵＳＤＡチャレンジウイルス＝１．０×１０4.5ｐｆｕ ｂ：保護＝健康鳥数／合計（％） ｃ：眼内 ｄ：眼窩 例 ７Ｓ−ＩＬＴ−０１５ Ｓ−ＩＬＴ−０１５は、ＵＬ４７様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、およびＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の約２４６０塩基対の欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルス（Ｉ ＬＴＶ）である。Ｅ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコードする 遺伝子をＵＬ４７様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、およびｇＧ遺伝子の場所に挿入し て、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ） ｇＸプロモーターの制御下にある。ＰＲＶ ｇＸプロモーター−ｕｉｄＡ遺伝子は、ＩＬＴＶ ＵＬ４７様、ＯＲＦ４、お よびｇＧプロモーターの転写の方向と反対方向にある。 Ｓ−ＩＬＴ−０１５は、「組替えILTウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移 入」において相同ベクター５６０−５２．Ｆ１（「材料および方法」を参照）お よびＳ−ＩＬＴ−００１を用いて構築した。形質移入株は、Ｘ−Ｇｌｕｃの「酵 素的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルスのためのスクリーン」により スクリーニングした。ブループラーク精製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ− ０１５を得た。このウイルスは、制限マッピングおよびＤＮＡのサザンブロッテ ィ ング手法により特性決定した。これらの結果により、ＵＬ４７様遺伝子の３’末 端での合計５１１アミノ酸コドンのうちの４４２、すべてのＯＲＦ４遺伝子、お よびｇＧ遺伝子の５’末端の２９３アミノ酸コドンのうち２７１を含む２６４０ 塩基対の欠失の存在が確認された。 Ｓ−ＩＬＴ−０１５は、弱毒化生ワクチンとしてまたは下記表に示すようにＩ ＬＴ病からチキンを保護するための死菌ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ −０１５はＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子を発現しないので、ワクチン化動物を感染動物 から区別するためのネガティブマーカーとして利用される。 例 ８Ｓ−ＩＬＴ−０１７ Ｓ−ＩＬＴ−０１７は、ＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子およびｇ６０遺伝子の約３３５ １塩基対の欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。Ｅ．ｃ ｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコードする遺伝子をＩＬＴＶ ｇＧ およびｇ６０遺伝子の場所に挿入して、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロ モーターの制御下にある。 Ｓ−ＩＬＴ−０１７は、「組替えILTウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移 入」において相同ベクター５７９−１４．Ｇ２（「材料および方法」を参照）お よびＳ−ＩＬＴ−００１を用いて構築した。形質移入株は、Ｘ−Ｇｌｕｃの「酵 素的マーカー遺伝子を発現する組替体疱疹ウイルスのためのスクリーン」により スクリーニングした。ブループラーク精製の結果、組替体ウイルスＳ−ＩＬＴ− ０１７を得た。 Ｓ−ＩＬＴ−０１７は、ＩＬＴＶ ｇ６０およびｇＧ遺伝子の欠失により弱毒 化されるが、チキン中のＩＬＴウイルスに対する免疫応答に関与することが知ら れている他の遺伝子を保持する。従って、Ｓ−ＩＬＴ−０１７は、ＩＬＴ病から チキンを保護するための死菌ワクチンとして使用し得る。Ｓ−ＩＬＴ−０１７は ＩＬＴＶ ｇＧまたはｇ６０遺伝子を発現しないので、ワクチン化動物を感染動 物から区別するためのネガティブマーカーとして使用される。 例 ９感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）スパイクおよびマトリッ クスタンパク遺伝子を発現する組換体感染性喉頭気管炎ウイルス ＩＢＶアーカンサススパイクタンパク遺伝子を含有するＩＬＴウイルスを生産 するために相同ベクターを使用する。組換体ＩＬＴウイルスは、ｇＧ、ＵＳ２、 ＵＬ４７様およびＯＲＦ４を含む１またはそれ以上のＩＬＴＶ遺伝子の欠失、お よび２つの外来遺伝子Ｅ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ｕｉｄＡ）お よびＩＢＶアーカンサススパイクタンパク遺伝子の挿入を含む。ｕｉｄＡ遺伝子 は、ＰＲＶ ｇＸプロモーターの制御下にあり、ＩＢＶアーカンサススパイクタ ンパク遺伝子は、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下にある。 ＩＬＴウイルスに挿入された外来遺伝子を含有する相同ベクターを構築するた めに、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモーター、ＩＢＶアーカンサススパイクタンパクおよ びＨＳＶ−１ ＴＫポリアデニル化シグナルを含有するＤＮＡフラグメントをＩ ＬＴＶ相同ベクター中のＩＬＴＶ ｇＧ遺伝子の欠失位置の制限酵素部位に挿入 する。ＰＲＶ ｇＸプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ｕ ｉｄＡ）遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントをＩＬＴＶ相同ベクター内のユニ ーク制限酵素部位に挿入する。組換体ウイルスは、「組替えILTウイルスを生成 するためのDNA形質移入」においてＩＢＶアーカンサススパイク遺伝子およびＥ ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）遺伝子を含有する最終相同べクタ ーとＳ−ＩＬＴ−００１を結合させることによって構築する。[Procedure amendment] Patent Law Article 184-8 [Submission date] August 7, 1995 [Amendment content] It shall be suitable for use as a vaccine against the sex laryngeal tracheitis virus. A preferred embodiment of this invention is a recombinant infectious laryngotracheitis designated S-ILT-014 (ATCC Accession No. VR2427. S-ILT-014 virus is an international approval of microbial deposit for patent proceedings). In accordance with the Budapest Treaty on Budapest, American Type Culture Collection [Amerlcan Type Culture Collection], 1230 1 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852U.S.A., On September 22, 1993, with ATCC acceptance number VR2427. Has been done.). Another preferred embodiment of this invention is a recombinant infectious laryngotracheitis virus designated S-ILT-002. For purposes of this invention, "recombinant infectious laryngotracheitis virus" refers to recombinant methods well known to those skilled in the art, such as materials and methods for producing "recombinant ILTV virus." Live infectious laryngotracheitis virus produced by the method described in "DNA Transfection". This virus does not lack the genetic material essential for replication of the infectious laryngotracheitis virus. The invention further provides a recombinant infectious laryngotracheitis virus comprising an infectious laryngotracheitis virus genome having a deletion in the glycoprotein gG gene and the US2 gene. One preferred embodiment of this invention is a recombinant infectious laryngotracheitis virus designated S-ILT-009. Furthermore, the present invention provides a recombinant laryngotracheitis virus containing an infectious laryngotracheitis virus genome having a deletion in the glycoprotein gG gene and the ORF4 gene. Purified. DNA ligation was performed in the presence of molten agarose. The resulting cosmid pSY1005 was modified by inserting a 1.5 kb HindIII-BamHI fragment taken from pNeo (PL Biochemicals) containing a neomycin resistance gene at the EcoRI site into the blunt end to create pSY1626. This pSY1626 was cut at the BamHI site to make it blunt-ended and ligated with the ILTV fragment excised as described above. The ligation mixture was packaged using Glfapack XL (Stratagene) according to the manufacturer's instructions. The packaged mixture was added to AGI cells (Stratagene) growing in the presence of maltose and colonies were selected on LB plates containing kanamycin. Cosmid subclones containing ILTV DNA were identified by comparing the restriction map of each cosmid clone to each other and to ILTV genomic DNA to obtain a contiguous sequence of ILTV genomic DNA. Screening Recombinant ILTV Expressing Enzyme Marker Genes Incorporation of E. coli β-Galactosidase or β-Glucuronidase (uidA) Marker Genes into Recombinant Viruses Allows Plaques Containing Recombinant to be Visualized in a Simple Assay. You can The enzyme substrate is incorporated into the upper layer of agarose during plaque assay (300 μg / ml). The substrate Bluogal ™ (halogenated indolyl-β-D-galactosidase, Gibco BRL) was used for the lacZ marker gene. Because of the uidA marker gene, the substrate X-glucuro Chx (5-bromo-4-chloro-3-indori) was made (28), which can be screened for the HCMV IE promoter flanking the ILT virus DNA. The marker E. coli lacZ gene is integrated in. The HCMV IE promoter-the E. coli lacZ gene is inserted in the opposite transcriptional direction to the ILTV TK gene, the upstream of the marker gene is approximately 1087 of the ILT V DNA. A base pair fragment that contains the first 77 amino acid codons of the ILTV TK gene, and downstream of the lacZ gene is an approximately 675 base pair fragment of ILTV DNA, which is 8 at the 3'end of the ILTV TK gene. It contains the 0 amino acid codon, and this plasmid is "DNA transfectant for the production of recombinant ILT virus". Thus, when used, it would replace the DNA encoding amino acids 78 to 285 of the ILTVTK gene with the DNA encoding the lacZ gene, which is a direct early human cytomegalovirus (HCMV) gene. It is under the control of an [immediate early] (IE) gene promoter and carries the polyadenylation signal of the pseudorabies virus (PRV) gX gene at the 3'end of the gene, a detailed depiction of this plasmid is shown in Figure 5. It was constructed from the indicated DNA sources and constructed using standard recombinant DNA techniques (42, 43) This plasmid vector contains approximately 3002 base pairs of pSP64 / 65 (Promega). It is derived from the HindIII fragment, which is approximately 1087 base pairs of the ILTV2.4 kb HindIII fragment. IndIII to BclI subfragment Fragment 2 is a SalI to SalI fragment of approximately 5017 base pairs containing the HCMV IE promoter, the β-galactosidase (lacZ) marker gene and the PRV gX polyadenylation signal (see Figure 5). Fragment 3 is a BclI to HindIII subfragment of approximately 675 base pairs of the HindIII fragment of ILTV 2.4 kb Homology vector 544-55.12 Plasmid 544-55-12 is the region encoding the US2 gene from the ILT virus. It was created for the purpose of deleting a part of DNA and inserting exogenous DNA. It incorporates the screenable marker E. coli uid A gene flanked by ILT viral DNA. The PRV gX promoter-E. ColiuidA gene is inserted in the transcriptional direction opposite to the ILTV US2 gene. Upstream of the uidA gene is an approximately 2300 base pair fragment of ILTV DNA which contains a 41 amino acid codon at the 3'end of the US2 gene (SEQ ID NO: 2: aa.188-229). Downstream of the uidA gene is an approximately 809 base pair fragment of ILTV DNA that contains the 22 amino acid codons at the 5'end of the Us2 gene (SEQ ID NO: 22: aa.1-22). Using this plasmid based on "DNA transfection to produce recombinant ILT virus", ILTV U S2 DNA encoding amino acids 23 to 187 was replaced with DNA encoding the E. coli uidA gene. The uidA marker gene is under the control of the pseudorabies virus (PRV) gX promoter and contains the type 1 herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-1TK) gene polyadenylation signal at the 3'end of the gene. There is. A detailed depiction of this plasmid is shown in FIG. It was made from the indicated DNA sources using standard recombinant DNA techniques (42,43). This plasmid vector is derived from the approximately 2958 base pair Asp718I restriction fragment of the pSP18 / pSP19 conjugate and the multiple cloning site is EcoRI / SacI / Asp718I / SacI / EcoRI. Fragment 1 is an approximately 2300 base pair Asp718I to DraI subfragment of the ILTV 2.5 kb Asp718I fragment (SEQ ID NO: 1: Nucl. 1-405). Fragment 2 is an XbaI fragment of approximately 3039 base pairs containing the PRV gX promoter, the E. coli uidA gene and the HSV-1TK polyadenylation site (see Figure 6). Fragment 3 is an approximately 809 base pair XbaI to Asp718I subfragment of the ILTV1097 base pair Asp718I fragment (SEQ ID NO: 1: Nucl. 905-1714). Homology vector 562-61.1F Plasmid 562-61.1F was created for the purpose of deleting a part of the gI gene from ILT virus and inserting exogenous DNA. It incorporates the E. coli uidA gene, a screenable marker flanked by ILT virus DNA. PRV gX promoter-E. Coli uidA gene is transcribed in the opposite direction to the ILTV gI gene promoter. The 983 base pair deletion begins 12 base pairs upstream of the translation initiation codon and deletes 324 of the 363 amino acid codon at the 5'end of the ILTV gI gene (SEQ ID NO: 11: aa.325-363). Using this plasmid based on "DNA transfection to generate recombinant ILT virus", a 874 base pair deletion of the ILTV gI gene encodes an amino acid 60 nucleotides upstream of the translation start site. It extended to 814 nucleotides within the sequence and lost the ability to encode 271 of the 292 amino acids of the gG protein (SEQ ID NO: 7). Using this plasmid according to "DNA Transfection to Generate Recombinant ILT Virus", the DNA encoding amino acids 1-271 of the ILTV gG gene encodes the E. coli lacZ gene. Will be replaced by DNA. A detailed depiction of this plasmid is shown in FIG. It was made from the indicated DNA sources using standard recombinant DNA techniques (42,43). The plasmid vector is derived from the approximately 2686 base pair Asp718I restriction fragment of pUC19 (Gibco BRL). Fragment 1 is an approximately 2830 base pair Asp718I to NheI subfragment of the ILTV5146 base pair Asp718I fragment (SEQ ID NO: 1: Nucl. 17 14-4544). Fragment 2 is a SalI to SalI fragment of approximately 5017 base pairs and contains the HCMVIE promoter, the E. coli β-galactosidase (lacZ) marker gene and the PRV gX polyadenylation signal (see Figure 4). Fragment 3 is a SalI to Asp718I subfragment of approximately 1709 base pairs of the ILTV5164 base pair Asp718I fragment (SEQ ID NO: 1: Nucl. 5419-687 8). Homology vector 560-52.F1 Plasmid 560-52.F1 is for the purpose of removing a part of the UL47-like gene, the entire ORF4 and a part of the ILTV g G gene from the ILT virus and inserting an exogenous DNA. made. It incorporates the E. coli uidA gene, a screenable marker flanked by ILT virus DNA. The PRV gX promoter-E. Coli uidA gene is transcribed in the opposite direction to the ILTV UL47-like, OR F4 and gG gene promoters. The deletion of 2640 base pairs resulted in 442 of the 511 amino acid codons at the 3'end of the UL47-like gene (SEQ ID NO: 4), the entire coding sequence of the ORF gene (SEQ ID NO: 5), and the ILTV g G gene (sequence 271 of the 293 amino acid codons at the 5'end of No. 7) was removed. When this plasmid is used according to "DNA transfection to produce recombinant ILT virus", the DNA encoding the ILTV UL47-like, ORF4 and gG genes is the DNA encoding the PRV gX promoter-E. Coli uidA gene. Will be replaced by A detailed depiction of this plasmid is shown in Figure 8. It was generated from the indicated DNA source using standard recombinant DNA techniques (42,43). This plasmid vector is derived from an Asp718I restriction fragment of pSP18 / pSP19 of approximately 2958 base pairs and the multiple cloning site is EcoRI / SacI / Asp718I / SacI / EcoRI. Fragment 1 is an approximately 1066 base pair Asp718I to BssHII subfragment of the ILTV5 164 base pair Asp718I fragment (SEQ ID NO: 1: Nucl. 1714-2777). Fragment 2 is a SalI to BclI subfragment of approximately 123 base pairs of the ILTV51 64 base pair Asp718I fragment. Fragment 3 is a BamI fragment of approximately 3027 base pairs containing the PRV gX promoter, the uidA gene and the HSV-1T K polyadenylation site (see Figure 5). Fragment 4 is a BclI to Asp718I subfragment of approximately 1334 base pairs of the ILTV51 64 base pair Asp718I fragment (SEQ ID NO: 1: Nucl. 5544-6878). Homology vector 579-14.G2 Plasmid 579-14.G2 was constructed for the purpose of removing all gG and part of the g60 gene from ILT virus and inserting exogenous DNA. It incorporates the PRV gX promoter flanked by ILT virus DNA and the E. coli uldA gene, a screenable marker. The PRV gX promoter-E. Coli uidA gene is transcribed in the same orientation as the ILTV gG and g60 gene promoters. The 3351 base pair deletion includes the entire coding sequence of the ILTV gG gene (SEQ ID NO: 7) and 733 of the 986 amino acid codons from the 5'end of the g60 gene (SEQ ID NO: 8). When this plasmid is used according to "DNA transfection for producing recombinant ILT virus", the DNA encoding amino acids 1 to 733 of the ILTV gG gene and the ILTV g60 gene is the DNA encoding the E. coli uidA gene. Will be replaced. A detailed depiction of this plasmid is shown in FIG. It was made from the indicated DNA sources using standard recombinant DNA techniques (42,43). The plasmid vector pUC19 (Gibco, BRL) is derived from the Asp718I to BamHI fragment of approximately 2677 base pairs. Fragment 1 is an infectious laryngotracheitis virus (ILTV) with a deletion of approximately 620 base pairs of the Asp718I fragment of ILTV5164 base pairs (28). E. FIG. The gene encoding E. coli β-galactosidase (lacZ) is inserted in place of the TK gene and is under the control of the HCMV immediate early (IE) promoter. Transcription of the HCMV IE promoter-lacZ gene is in the opposite direction as the TK promoter. S-ILT-004 contains homologous vectors 501-94 (see "Materials and Methods") and S-ILT-001 (USDA ILTV strain 83-2) in "DNA transfection to produce recombinant ILT virus". Constructed using. Transfectants were screened by the Bluogal ™ "SCREEN FOR RECOMBINANT HERPESVIRUS EXP RESSING ENZYMATIC MARKER GENES". As a result of blue plaque purification, recombinant virus S-ILT-004 was obtained. The virus was characterized by restriction mapping and the SOUTHERN BLOTTING OF DNA technique. This analysis confirmed the presence of the β-galactosidase (lacZ) marker gene and the deletion of approximately 619 base pairs of the TK gene. The remaining TK gene sequence encodes a protein containing amino acids 1-77 and amino acids 286-363. The HCMV IE promoter-lacZ gene is in the opposite direction of transcription of the TK gene. S-ILT-004 is attenuated by a deletion of the ILTV TK gene but carries other genes known to be involved in the immune response to ILT virus in chicken. Therefore, S-ILT-004 may be useful as a killed vaccine to protect chickens from ILT disease. Example 3 S-ILT-009 S-ILT-009 is an infectious laryngotracheitis virus (ILTV) having a deletion of about 498 base pairs of the ILTV US2 gene and a deletion of about 874 base pairs of the ILTV gG gene. is there. E. FIG. A gene encoding E. coli β-glucuronidase (uidA) has been inserted in the place of the US2 gene and is under the control of pseudorabies virus (PRV). S-ILT-009 was constructed using homologous vectors 544-55.12 (see Materials and Methods) and S-ILT-002 in "DNA Transfection to Generate Recombinant ILT Virus". S-ILT-002 was constructed as described in Example 5 (S-ILT-014). Transfectants were screened by X-Gluc "Screen for recombinant herpes virus expressing an enzymatic marker gene". As a result of blue plaque purification, recombinant virus S-ILT-009 was obtained. The virus was characterized by restriction mapping and DNA Southern blotting techniques. This analysis revealed that PRV gX promoter-β-glucuronidase Example 4 S-ILT-011 S-ILT-011 is an infectious laryngotracheitis virus (ILTV) with a deletion of about 983 base pairs of the ILTV gI gene. E. FIG. The gene encoding E. coli β-glucuronidase (uidA) is inserted at the location of the gI gene and is under the control of the pseudorabies virus (PRV) gX promoter. The PRV gX-ui dA gene is in the opposite direction of transcription of the ILTV gI promoter. S-ILT-011 was prepared by homologous vector 562-61.1F (see “Materials and Methods”) and S-ILT-00 β-glucuronidase (uidA) in “DNA transfection to produce recombinant ILT virus”. The encoding gene is inserted in place of the gI gene and is under the control of the pseudorabies virus (PRV) gX promoter. S-ILT-013 was homologous to homologous vectors 562-61. In "DNA transfection to produce recombinant ILT virus". Constructed with IF (see Materials and Methods) and S-ILT-014. Transfectants were screened by X-Gluc "Screen for recombinant herpes virus expressing an enzymatic marker gene". As a result of blue plaque purification, recombinant virus S-ILT-013 was obtained. The virus was characterized by restriction mapping and DNA Southern blotting techniques. This analysis confirmed the presence of the β-glucuronidase (uidA) marker gene and the deletion of approximately 983 base pairs of ILTV gI which deletes 325 of the 363 amino acid codons from the 5'end of the gI gene. This analysis also confirmed the deletion of about 874 base pairs of the ILTV gG gene and the insertion of about 1906 base pairs of the partial HCMV IE promoter-lacZ marker gene DNA. Part remains and almost all of the lacZ gene remains. S-ILT-013 is attenuated and useful as a killed vaccine to protect chickens from ILT disease. S-ILT-013 exhibits a small plaque phenotype in tissue culture, indicating slow viral growth and attenuation. Since S-ILT-013 does not express the ILTV gI or gG gene, it can be used as a negative marker for distinguishing vaccinated animals from infected animals. Example 6 S-ILT-014 S-ILT-014 is infectious with a deletion of approximately 874 base pairs of the ILTV gG gene and a deletion of the inserted HCMV IE promoter lacZ marker gene that renders the lacZ gene non-functional. Laryngotracheitis virus (ILTV). S-ILT-014 was derived from a purified S-ILT-002 virus strain that had a deletion of the HCMV IE promoter lacZ marker gene. S-ILT-002 was constructed using homology vector 472-73.27 (see Materials and Methods) and S-ILT-001 in "DNA Transfection to Generate Recombinant ILT Virus". The virus S-ILT-002 has a deletion of 874 base pairs in the ILTV gG gene and E. coli in place of the ILTV gG gene. E. coli β-galactosidase (lacZ) gene insertion. However, white plaques were collected in Bruogal's “Screen for recombinant herpes simplex virus expressing an enzymatic marker gene” and contained a deletion of lacZ within the ILTV gg deletion. The virus S-ILT-014 was characterized by restriction mapping, DNA sequencing and Southern blotting techniques of DNA. By this analysis, ILTV gG inherited 14-day-old chick a: USDA challenge virus = 1.0 × 10 4.5 pfu b: protection = healthy birds / total (%) c: intraocular d: orbital case 7 S-ILT-015 S-ILT-015 is an infectious laryngotracheitis virus (ILTV) with a deletion of approximately 2460 base pairs of the UL47-like gene, the ORF4 gene, and the ILTV gG gene. E. FIG. The gene encoding E. coli β-glucuronidase (uidA) has been inserted in the place of the UL47-like gene, the ORF4 gene and the gG gene and is under the control of the pseudorabies virus (PRV) gX promoter. The PRV gX promoter-uidA gene is in the opposite direction of transcription of the ILTV UL47-like, ORF4, and gG promoters. S-ILT-015 is a homologous vector 560-52. In "DNA transfection to produce recombinant ILT virus". Constructed with F1 (see Materials and Methods) and S-ILT-001. Transfectants were screened by X-Gluc "Screen for recombinant herpes virus expressing an enzymatic marker gene". As a result of blue plaque purification, recombinant virus S-ILT-015 was obtained. The virus was characterized by restriction mapping and DNA Southern blotting techniques. These results show that a deletion of 2640 base pairs including 442 of the total 511 amino acid codons at the 3'end of the UL47-like gene, all ORF4 genes, and 271 of the 293 amino acid codon at the 5'end of the gG gene. Was confirmed. S-ILT-015 is useful as a live attenuated vaccine or as a killed vaccine to protect chickens from ILT disease as shown in the table below. Since S-ILT-015 does not express the ILTV gG gene, it is used as a negative marker to distinguish vaccinated animals from infected animals. Example 8 S-ILT-017 S-ILT-017 is an infectious laryngotracheitis virus (ILTV) that has a deletion of approximately 3351 base pairs of the ILTV gG gene and the g60 gene. E. FIG. The gene encoding coliβ-glucuronidase (uidA) is inserted in place of the ILTV gG and g60 genes and is under the control of the pseudorabies virus (PRV) gX promoter. S-ILT-017 is a homologous vector 579-14. In "DNA transfection to produce recombinant ILT virus". Constructed with G2 (see Materials and Methods) and S-ILT-001. Transfectants were screened by X-Gluc "Screen for recombinant herpes virus expressing an enzymatic marker gene". As a result of blue plaque purification, recombinant virus S-ILT-017 was obtained. S-ILT-017 is attenuated by a deletion of the ILTV g60 and gG genes, but carries other genes known to be involved in the immune response to ILT virus in chicken. Therefore, S-ILT-017 can be used as a killed vaccine to protect chickens from ILT disease. Since S-ILT-017 does not express the ILTV gG or g60 gene, it is used as a negative marker to distinguish vaccinated animals from infected animals. Using homologous vector to produce ILT virus containing Example 9 Infectious Bronchitis Virus (IBV) spike and Matrix protein gene recombinant infectious laryngotracheitis virus IBV Ah Kansas spike protein gene expressing. Recombinant ILT virus contains deletions of one or more ILTV genes including gG, US2, UL47-like and ORF4, and two foreign genes E. coli. It contains the E. coli β-glucuronidase gene (uidA) and the IBV arcanthus spike protein gene insertion. The uidA gene is under the control of the PRV gX promoter and the IBV arcanthus spike protein gene is under the control of the HCMV IE promoter. To construct a homologous vector containing the foreign gene inserted into the ILT virus, the DNA fragment containing the HCMV-IE promoter, the IBV arcanthus spike protein and the HSV-1 TK polyadenylation signal was added to ILTV gG in the ILTV homology vector. Insert into the restriction enzyme site at the deletion position of the gene. PRV gX promoter and E. coli A DNA fragment containing the E. coli β-glucuronidase (uidA) gene is inserted into a unique restriction enzyme site within the ILTV homology vector. Recombinant viruses are described in "DNA Transfection to Produce Recombinant ILT Virus" with the IBV arcanthus spike gene and E. It is constructed by linking S-ILT-001 with the final homologous vector containing the E. coli β-glucuronidase (uidA) gene.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/22 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 38/45 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/24 48/00 ＡＤＹ 9051−4Ｃ 37/66 Ｇ Ｃ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ 37/02 Ｃ１２Ｎ 7/00 9051−4Ｃ 37/52 //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Office reference number FI A61K 38/22 8931-4B C12N 7/00 38/45 9051-4C A61K 37/24 48/00 ADY 9051-4C 37/66 G C07H 21/04 9051-4C 37/02 C12N 7/00 9051-4C 37/52 // (C12N 7/00 C12R 1:92) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE) , DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE) , SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, GE, HU, JP, K , KG, KP, KR, KZ, LK, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, TJ, TT, UA, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイル スゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであって、前記欠失が糖蛋白g Ｇ遺伝子中にある組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 ２． Ｓ-ＩＬＴ-014と命名されている請求の範囲第１項に記載の組換え感染性 喉頭気管炎ウイルス。 ３． Ｓ-ＩＬＴ-002と命名されている請求の範囲第１項に記載の組換え感染性 喉頭気管炎ウイルス。 ４． ＵＳ２遺伝子中の欠失によってさらに特徴付けられる請求の範囲第１項記 載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 ５． Ｓ-ＩＬＴ-009と命名されている請求の範囲第４項に記載の組換え感染性 喉頭気管炎ウイルス。 ６． ＯＲＦ４遺伝子及びＵＬ47様遺伝子中の欠失によってさらに特徴付けられ る請求の範囲第１項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 ７． Ｓ-ＩＬＴ-015と命名されている請求の範囲第６項記載の組換え感染性喉 頭気管炎ウイルス。 ８． 糖蛋白g60遺伝子中の欠失によってさらに特徴付けられる請求の範囲第１ 項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 ９． Ｓ-ＩＬＴ-017と命名されている請求の範囲第８項記載の組換え感染性喉 頭気管炎ウイルス。 10． 糖蛋白gＩ遺伝子中の欠失によってさらに特徴付けられる請求の範囲第１ 項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 11． チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子中の欠失によってさら に特徴付けられる請求の範囲第１項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 12． 感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来遺伝子を さらに含む請求の範囲第１項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであって、 該外来遺伝子が、組換え感染性喉頭気管炎ウイルスが感染した宿主細胞中で発現 可能である組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 13． 外来遺伝子が、糖蛋白gＤ遺伝子、糖蛋白gＩ遺伝子、プロテインキナーゼ 遺伝子及びＯＲＦ10遺伝子に挿入されないという条件の下でウイルスゲノムのユ ニーク短領域に挿入されている、請求の範囲第12項記載の組換え感染性喉頭気管 炎ウイルス。 14． 前記外来遺伝子が、ＵＳ２遺伝子、ＵＬ47様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、糖 蛋白gＧ遺伝子、糖蛋白g60遺伝子、及び糖蛋白gＩ遺伝子からなる群より選択さ れる遺伝子中に挿入されている請求の範囲第13項記載の組換え感染性喉頭気管炎 ウイルス。 15． 前記外来遺伝子がスクリーニング可能なマーカーをコードする請求の範囲 第12項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 16． 前記スクリーニング可能なマーカーが大腸菌β−ガラクトシダーセである 請求の範囲第15項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 17． 前記スクリーニング可能なマーカーが大腸菌β−グルクロニダーゼである 請求の範囲第15項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 18． 前記外来遺伝子が抗原性ポリペプチドをコードする請求の範囲第12項記載 の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 19． 宿主細胞に導入されたときに、前記抗原性ポリペプチドが鳥類疾患を引き 起こす因子に対する保護抗体の産生を誘発し、該因子から抗原が誘導され、もし くは誘導可能である請求の範囲第１８項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス 。 20． 前記抗原性ポリペプチドが、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル 病ウイルス、感染性嚢疾患ウイルス、およびマレック病ウイルスからなる群より 誘導され、もしくは誘導可能である請求の範囲第19項記載の組換え感染性喉頭気 管炎ウイルス。 21． 前記抗原性ポリペプチドが、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、 鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、 鶏痘ウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロータウイルス、幼鳥貧血因子、サル モネラ種、大腸菌、パスツレラ種、ボルデテラ種、アイメリア種、ヒストモナス 種、トリコモナス種、家禽線虫類、条虫類、吸虫類、家禽ダニ類／ノミ類、家禽 プロトゾアからなる群より誘導され、もしくは誘導可能である請求の範囲第19項 記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 22． 前記外来遺伝子が、内在性の感染性喉頭気管炎ウイルス上流側プロモータ の制御の下にある請求の範囲第12項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 23． 前記外来遺伝子が、非相同上流側プロモータの制御の下にある請求の範囲 第12項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウ イルス。 24． 前記プロモータが、ＨＣＭＶ ＩＥプロモータ、ＰＲＶ gＸプロモータ、 及びＢＨＶ-1.1ＶＰ８プロモータからなる群より選択される請求の範囲第23項記 載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 25． ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイル スゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであって、複製の際にこの組換 えウイルスが糖蛋白gＧを産生しないように、前記欠失が糖蛋白gＧ遺伝子中にあ る組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 26． ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失を含む感染性喉頭気管炎ウイルス ゲノムを有する組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであって、複製の際にこの組換 えウイルスが糖蛋白gＩを産生しないように、前記欠失が糖蛋白gＩ遺伝子中にあ る組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 27． 組換えウイルスが糖蛋白gＧを産生しないように、さらに糖蛋白gＧ遺伝子 中に欠失を含む請求の範囲第26項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 28． ウイルスゲノムのユニーク短領域に欠失を有する感染性喉頭気管炎ウイル スゲノムを含む組換え感染性喉頭気管炎ウイルスであって、前記欠失がＵＳ２遺 伝子、ＵＬ47様遺伝子、及び糖蛋白g60遺伝子からなる群より選択される遺伝子 中に存在する組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 29． 欠失がＵＳ２遺伝子中に存在する請求の範囲第28項記載の組換え感染性喉 頭気管炎ウイルス。 30． 欠失がＵＬ47様遺伝子中に存在する請求の範囲第28項記載の組換え感染性 喉頭気管炎ウイルス。 31． 欠失が糖蛋白g60遺伝子中に存在する請求の範囲第28項記載の組換え感染 性喉頭気管炎ウイルス。 32． 感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムのユニーク短領域内に挿入された外来遺 伝子を有するが、該挿入がプロテインキナーゼ遺伝子、糖蛋白gＤ遺伝子、糖蛋 白gＥ遺伝子及びＯＲＦ10遺伝子中にはない組換え感染性喉頭気管炎ウイルスで あって、該外来遺伝子が、該組換え感染性喉頭気管炎ウイルスに感染した宿主細 胞中で発現可能である組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 33． 前記外来遺伝子が、ＵＳ２遺伝子、ＵＬ47様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子及び 糖蛋白g60遺伝子からなる群より選択される遺伝子中に挿入されている請求の範 囲第32項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 34． 前記外来遺伝子がスクリーニング可能なマーカーをコードする請求の範囲 第32項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 35． 前記スクリーニング可能なマーカーが大腸菌β−ガラクトシダーゼである 請求の範囲第34項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 36． 前記スクリーニング可能なマーカーが大腸菌β−グルクロニダーゼである 請求の範囲第34項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 37． 前記外来遺伝子が抗原性ポリペプチドをコードする請 求の範囲第32項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 38． 宿主細胞に導入されたときに、前記抗原性ポリペプチドが鳥類疾患を引き 起こす因子に対する保護抗体の産生を誘発し、該因子から抗原が誘導され、もし くは誘導可能である請求の範囲第37項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 39． 前記抗原性ポリペプチドが、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル 病ウイルス、感染性嚢疾患ウイルス、およびマレック病ウイルスからなる群より 誘導され、もしくは誘導可能である請求の範囲第38項記載の組換え感染性喉頭気 管炎ウイルス。 40． 前記抗原性ポリペプチドが、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、 鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、 鶏痘ウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロータウイルス、幼鳥貧血因子、サル モネラ種、大腸菌、パスツレラ種、ボルデテラ種、アイメリア種、ヒストモナス 種、トリコモナス種、家禽線虫類、条虫類、吸虫類、家禽ダニ類／ノミ類、家禽 プロトゾアからなる群より誘導され、もしくは誘導可能である請求の範囲第38項 記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 41． 前記外来遺伝子が、内在性の感染性喉頭気管炎ウイルス上流側プロモータ の制御の下にある請求の範囲第32項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 42． 前記外来遺伝子が、非相同上流側プロモータの制御の下にある請求の範囲 第32項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 43． 前記プロモータが、ＨＣＭＶ ＩＥプロモータ、ＰＲＶ gＸプロモータ、 及びＢＨＶ-1.1ＶＰ８プロモータからなる群より選択される請求の範囲第４２項 記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルス。 44． 請求の範囲第１項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルスの有効免疫量、 及び適切な担体を含有する感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチン。 45． 請求の範囲第２項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルスの有効免疫量、 及び適切な担体を含有する感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチン。 46． 請求の範囲第３項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルスの有効免疫量、 及び適切な担体を含有する感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチン。 47． 請求の範囲第５項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルスの有効免疫量、 及び適切な担体を含有する感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチン。 48． 請求の範囲第７項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルスの有効免疫量、 及び適切な担体を含有する感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチン。 49． 請求の範囲第９項記載の組換え感染性喉頭気管炎ウイルスの有効免疫量、 及び適切な担体を含有する感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチン。 50． 請求の範囲第３項、第４項、第６項、第８項、第10項又は第11項記載の組 換え感染性喉頭気管炎ウイルスの有効免疫量、及び適切な担体を含有する感染性 喉頭気管炎ウイルスに 対するワクチン。 51． 請求の範囲第25項記載のウイルスの有効免疫量、及び適切な担体を含有す る感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチン。 52． 請求の範囲第26項記載のウイルスの有効免疫量、及び適切な担体を含有す る感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチン。 53． 請求の範囲第27項記載のウイルスの有効免疫量、及び適切な担体を含有す る感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチン。 54． 請求の範囲第29項、第30項又は第31項に記載のウイルスの有効免疫量、及 び適切な担体を含有する感染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチン。 55． 請求の範囲第19項、第20項又は第21項記載の組換えウイルスの有効免疫量 、及び適切な担体を含有する感染性喉頭気管炎ウイルス及び１以上の他の鳥類の 疾患に対する多価ワクチン。 56． 感染性喉頭気管炎に対してニワトリもしくは他の家禽を免疫する方法であ って、請求の範囲第44項記載のワクチンの有効免疫量を該ニワトリもしくは他の 家禽に投与することを包含する方法。 57． 感染性喉頭気管炎に対してニワトリもしくは他の家禽を免疫する方法であ って、請求の範囲第45項記載のワクチンの有効免疫量を該ニワトリもしくは他の 家禽に投与することを包含する方法。 58． 感染性喉頭気管炎に対してニワトリもしくは他の家禽を免疫する方法であ って、請求の範囲第46項記載のワクチンの有効免疫量を該ニワトリもしくは他の 家禽に投与することを包含する方法。 59． 感染性喉頭気管炎に対してニワトリもしくは他の家禽を免疫する方法であ って、請求の範囲第47項記載のワクチンの有効免疫量を該ニワトリもしくは他の 家禽に投与することを包含する方法。 60． 感染性喉頭気管炎に対してニワトリもしくは他の家禽を免疫する方法であ って、請求の範囲第48項記載のワクチンの有効免疫量を該ニワトリもしくは他の 家禽に投与することを包含する方法。 61． 感染性喉頭気管炎に対してニワトリもしくは他の家禽を免疫する方法であ って、請求の範囲第49項記載のワクチンの有効免疫量を該ニワトリもしくは他の 家禽に投与することを包含する方法。 62． 感染性喉頭気管炎に対してニワトリもしくは他の家禽を免疫する方法であ って、請求の範囲第50項記載のワクチンの有効免疫量を該ニワトリもしくは他の 家禽に投与することを包含する方法。 63． 感染性喉頭気管炎に対してニワトリもしくは他の家禽を免疫する方法であ って、請求の範囲第51項記載のワクチンの有効免疫量を該ニワトリもしくは他の 家禽に投与することを包含する方法。 64． 感染性喉頭気管炎に対してニワトリもしくは他の家禽 を免疫する方法であって、請求の範囲第52項記載のワクチンの有効免疫量を該ニ ワトリもしくは他の家禽に投与することを包含する方法。 65． 感染性喉頭気管炎に対してニワトリもしくは他の家禽を免疫する方法であ って、請求の範囲第53項記載のワクチンの有効免疫量を該ニワトリもしくは他の 家禽に投与することを包含する方法。 66． 感染性喉頭気管炎及び１以上の他の鳥類の疾患に対してニワトリもしくは 他の家禽を免疫する方法であって、請求の範囲第55項記載のワクチンの有効免疫 量を該ニワトリもしくは他の家禽に投与することを包含する方法。 67． 請求の範囲第26項記載のウイルスをワクチン接種されたニワトリもしくは 他の家禽を、天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したものから分別する方法で あって、ニワトリもしくは他の家禽に由来する体液のサンプルを、糖蛋白gＧ及 び天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリもしくは他の家禽において 通常発現する他の抗原の少なくとも１種の存在について分析することを包含し、 感染したニワトリにおいて通常発現する抗原が存在し、かつ糖蛋白gＧが存在し ないことが、請求の範囲第25項に記載のワクチンをワクチン接種され、天然感染 性喉頭気管炎ウイルスに感染していないことを示す方法。 68． 請求の範囲第２項、第３項、第５項、第７項又は第９項記載のウイルスを ワクチン接種されたニワトリもしくは他の家禽を、天然感染性喉頭気管炎ウイル スに感染したものから 分別する方法であって、ニワトリもしくは他の家禽に由来する体液のサンプルを 、糖蛋白gＧ及び天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリもしくは他 の家禽において通常発現する他の抗原の少なくとも１種の存在について分析する ことを包含し、感染したニワトリにおいて通常発現する抗原が存在し、かつ糖蛋 白gＧが存在しないことが、請求の範囲第２項、第３項、第５項、第７項又は第 ９項に記載のワクチンをワクチン接種され、天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感 染していないことを示す方法。 63． 請求の範囲第27項記載のウイルスをワクチン接種されたニワトリもしくは 他の家禽を、天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したものから分別する方法で あって、ニワトリもしくは他の家禽に由来する体液のサンプルを、糖蛋白gＩ、 糖蛋白gＧ及び天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリもしくは他の 家禽において通常発現する他の抗原の少なくとも１種の存在について分析するこ とを包含し、感染したニワトリにおいて通常発現する抗原が存在し、かつ糖蛋白 gＧ及び糖蛋白gＩが存在しないことが、請求の範囲第27項に記載のワクチンをワ クチン接種され、天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染していないことを示す方 法。 70． 請求の範囲第26項記載のウイルスをワクチン接種されたニワトリもしくは 他の家禽を、天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したものから分別する方法で あって、ニワトリもしくは他の家禽に由来する体液のサンプルを、糖蛋白gＩ及 び天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリもしくは他の 家禽において通常発現する他の抗原の少なくとも１種の存在について分析するこ とを包含し、感染したニワトリにおいて通常発現する抗原が存在し、かつ糖蛋白 gＩが存在しないことが、請求の範囲第26項に記載のワクチンをワクチン接種さ れ、天然感染性喉頭気管炎ウイルスに感染していないことを示す方法。 71． 感染性喉頭気管炎ゲノムＤＮＡのユニーク短領域に外来ＤＮＡを挿入する ことによって組換え感染性喉頭気管炎ウイルスを生成させるための相同ベクター であって、二本鎖外来遺伝子から本質的になる二本鎖ＤＮＡ分子を含み、該二本 鎖外来遺伝子のいずれかの側にはゲノムＤＮＡのユニーク短領域に位置するＤＮ Ａに相同の二本鎖ＤＮＡが隣接しており、ただし該フランキング配列は糖蛋白g Ｄ遺伝子、糖蛋白gＥ遺伝子、プロテインキナーゼ遺伝子、及びＯＲＦ10遺伝子 と相同ではない相同ベクター。 72． 前記外来遺伝子がスクリーニング可能なマーカーである請求の範囲第71項 記載の相同ベクター。 73． 前記スクリーニング可能なマーカーが大腸菌β−ガラクトシダーゼ又はβ −グルクロニダーゼである請求の範囲第72項記載の相同ベクター。 74． 感染性喉頭気管炎ウイルスゲノムＤＮＡに挿入されている、スクリーニン グ可能なマーカーをコードするＤＮＡを欠失させることによって組換え感染性喉 頭気管炎ウイルスを生成させるための相同ベクターであって、欠失させようとす る二本鎖ＤＮＡから本質的になる二本鎖ＤＮＡ分子を含み、この欠失 させようとする二本鎖ＤＮＡの各々の側部に、感染性喉頭気管炎ウイルス糖蛋白 gＧ遺伝子、糖蛋白gＩ遺伝子、ＵＳ２遺伝子、又はＵＬ-47様遺伝子に相同の二 本鎖ＤＮＡが隣接している相同ベクター。 75． 相同ベクター544-55.12と命名されている請求の範囲第74項記載の相同ベ クター。 76． 相同ベクター562-61.1Ｆと命名されている請求の範囲第74項記載の相同ベ クター。 77． 相同ベクター427-73.27と命名されている請求の範囲第74項記載の相同ベ クター。 78． 相同ベクター560-52.Ｆ1と命名されている請求の範囲第74項記載の相同ベ クター。 79． 相同ベクター579-14.Ｇ2と命名されている請求の範囲第74項記載の相同ベ クター。[Claims] 1. Infectious laryngotracheitis virus with a deletion in a unique short region of the viral genome A recombinant infectious laryngotracheitis virus containing a genomic DNA, wherein said deletion is glycoprotein g Recombinant infectious laryngotracheitis virus in the G gene. 2. The recombinant infectivity according to claim 1, which is named S-ILT-014. Laryngotracheitis virus. 3. The recombinant infectivity according to claim 1, which is named S-ILT-002. Laryngotracheitis virus. 4. Claim 1 further characterized by a deletion in the US2 gene. The recombinant infectious laryngotracheitis virus listed above. 5. The recombinant infectivity according to claim 4, which is named S-ILT-009. Laryngotracheitis virus. 6. Further characterized by deletions in the ORF4 and UL47-like genes The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 1. 7. The recombinant infectious throat according to claim 6, which is named S-ILT-015. Head tracheitis virus. 8. Claim 1 further characterized by a deletion in the glycoprotein g60 gene Recombinant infectious laryngotracheitis virus according to item. 9. The recombinant infectious throat according to claim 8, which is named S-ILT-017. Head tracheitis virus. Ten. Claim 1 further characterized by a deletion in the glycoprotein gI gene. Recombinant infectious laryngotracheitis virus according to item. 11. Further by a deletion in the thymidine kinase (TK) gene The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 1, characterized in that 12． A foreign gene inserted into a nonessential site of the infectious laryngotracheitis virus genome The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 1, further comprising: Expression of the foreign gene in host cells infected with recombinant infectious laryngotracheitis virus Possible recombinant infectious laryngotracheitis virus. 13. Foreign genes are glycoprotein gD gene, glycoprotein gI gene, protein kinase Of the viral genome under the condition that it is not inserted into the gene and ORF10 gene. 13. The recombinant infectious laryngotrachea according to claim 12, which is inserted into the Neek short region. Flame virus. 14. The foreign gene is US2 gene, UL47-like gene, ORF4 gene, sugar Selected from the group consisting of protein gG gene, glycoprotein g60 gene, and glycoprotein gI gene 14. The recombinant infectious laryngotracheitis according to claim 13, which is inserted in a gene Virus. 15． Claims wherein said foreign gene encodes a screenable marker The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to item 12. 16. The screenable marker is E. coli β-galactosidase The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 15. 17． The screenable marker is E. coli β-glucuronidase. The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 15. 18． 13. The method according to claim 12, wherein the foreign gene encodes an antigenic polypeptide. Recombinant infectious laryngotracheitis virus. 19. When introduced into a host cell, the antigenic polypeptide causes avian disease. Induces the production of protective antibodies against the factor that causes the antigen to be derived from the factor, 19. The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 18, which is inducible. . 20. The antigenic polypeptide is infectious bronchitis virus, Newcastle Disease virus, infectious bursal disease virus, and Marek's disease virus The recombinant infectious laryngeal air according to claim 19, which is induced or inducible. Tuberculosis virus. twenty one. The antigenic polypeptide is avian encephalomyelitis virus, avian reovirus, Avian paramyxovirus, avian influenza virus, avian adenovirus, Fowlpox virus, avian coronavirus, avian rotavirus, juvenile anemia factor, monkey Monella, E. coli, Pasteurella, Bordetella, Eimeria, Histomonas Species, Trichomonas species, poultry nematodes, tapeworms, trematodes, poultry mites / fleas, poultry Claim 19 which is induced or is inducible from the group consisting of protozoa The recombinant infectious laryngotracheitis virus described. twenty two. The foreign gene is an endogenous infectious laryngotracheitis virus upstream promoter 13. The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 12, which is under the control of. twenty three. The foreign gene is under the control of a heterologous upstream promoter. Recombinant infectious laryngotracheitis c according to paragraph 12 Ils. twenty four. The promoter is HCMV IE promoter, PRV gX promoter, 24. The method according to claim 23, which is selected from the group consisting of the BHV-1.1VP8 promoter and The recombinant infectious laryngotracheitis virus listed above. twenty five. Infectious laryngotracheitis virus with a deletion in a unique short region of the viral genome Recombinant infectious laryngotracheitis virus containing a genome, which recombines during replication. In order to prevent the virus from producing glycoprotein gG, the above deletion is present in the glycoprotein gG gene. Recombinant infectious laryngotracheitis virus. 26. Infectious laryngotracheitis virus containing a deletion in a unique short region of the viral genome A recombinant infectious laryngotracheitis virus having a genome, which recombines during replication. So that the virus does not produce glycoprotein gI, the deletion is in the glycoprotein gI gene. Recombinant infectious laryngotracheitis virus. 27. To prevent the recombinant virus from producing glycoprotein gG, 27. The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 26, which contains a deletion therein. 28. Infectious laryngotracheitis virus with a deletion in a unique short region of the viral genome A recombinant infectious laryngotracheitis virus comprising a genome, wherein said deletion is US2 Genes selected from the group consisting of genes, UL47-like genes, and glycoprotein g60 genes Recombinant infectious laryngotracheitis virus present in. 29. 29. The recombinant infectious throat according to claim 28, wherein the deletion is in the US2 gene. Head tracheitis virus. 30. 29. The recombinant infectivity of claim 28, wherein the deletion is in a UL47-like gene. Laryngotracheitis virus. 31. The recombinant infection according to claim 28, wherein the deletion is present in the glycoprotein g60 gene. Laryngotracheitis virus. 32. An exotic site inserted within a unique short region of the infectious laryngotracheitis virus genome. It has a gene, but the insertion has a protein kinase gene, glycoprotein gD gene, glycoprotein Recombinant infectious laryngotracheitis virus not present in the white gE and ORF10 genes The foreign gene is associated with the host cell infected with the recombinant infectious laryngotracheitis virus. Recombinant infectious laryngotracheitis virus that can be expressed in cells. 33. The foreign gene is US2 gene, UL47-like gene, ORF4 gene, and Claims inserted into a gene selected from the group consisting of glycoprotein g60 gene A recombinant infectious laryngotracheitis virus according to item 32. 34. Claims wherein said foreign gene encodes a screenable marker The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to Item 32. 35. The screenable marker is E. coli β-galactosidase The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 34. 36. The screenable marker is E. coli β-glucuronidase. The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 34. 37. The foreign gene encodes an antigenic polypeptide. A recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 32. 38. When introduced into a host cell, the antigenic polypeptide causes avian disease. Induces the production of protective antibodies against the factor that causes the antigen to be derived from the factor, 38. The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 37, which is inducible. 39. The antigenic polypeptide is infectious bronchitis virus, Newcastle Disease virus, infectious bursal disease virus, and Marek's disease virus 39. Recombinant infectious larynx according to claim 38, which is induced or inducible Tuberculosis virus. 40. The antigenic polypeptide is avian encephalomyelitis virus, avian reovirus, Avian paramyxovirus, avian influenza virus, avian adenovirus, Fowlpox virus, avian coronavirus, avian rotavirus, juvenile anemia factor, monkey Monella, E. coli, Pasteurella, Bordetella, Eimeria, Histomonas Species, Trichomonas species, poultry nematodes, tapeworms, trematodes, poultry mites / fleas, poultry Claim 38, which is derived from or is inducible from the group consisting of protozoa The recombinant infectious laryngotracheitis virus described. 41. The foreign gene is an endogenous infectious laryngotracheitis virus upstream promoter 33. A recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 32 under the control of. 42. The foreign gene is under the control of a heterologous upstream promoter. The recombinant infectious laryngotracheitis virus according to Item 32. 43. The promoter is HCMV IE promoter, PRV gX promoter, 43. and the BHV-1.1VP8 promoter. The recombinant infectious laryngotracheitis virus described. 44. An effective immunizing amount of the recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 1, And a vaccine against infectious laryngotracheitis virus containing a suitable carrier. 45. An effective immunizing amount of the recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 2, And a vaccine against infectious laryngotracheitis virus containing a suitable carrier. 46. An effective immunizing amount of the recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 3, And a vaccine against infectious laryngotracheitis virus containing a suitable carrier. 47. An effective immunizing amount of the recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 5, And a vaccine against infectious laryngotracheitis virus containing a suitable carrier. 48. An effective immunizing amount of the recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 7, And a vaccine against infectious laryngotracheitis virus containing a suitable carrier. 49. An effective immunizing amount of the recombinant infectious laryngotracheitis virus according to claim 9, And a vaccine against infectious laryngotracheitis virus containing a suitable carrier. 50. Claim 3rd, 4th, 6th, 8th, 10th or 11th set Effective immunity of recombinant infectious laryngotracheitis virus and infectivity containing a suitable carrier Laryngotracheitis virus Against the vaccine. 51. An effective immunizing amount of the virus according to claim 25 and a suitable carrier are contained. Vaccine against infectious laryngotracheitis virus. 52. An effective immunizing amount of the virus according to claim 26 and a suitable carrier are contained. Vaccine against infectious laryngotracheitis virus. 53. An effective immunizing amount of the virus according to claim 27 and a suitable carrier are contained. Vaccine against infectious laryngotracheitis virus. 54. The effective immunizing amount of the virus according to claim 29, 30 or 31, and And a vaccine against the infectious laryngotracheitis virus containing a suitable carrier. 55. An effective immunizing amount of the recombinant virus according to claim 19, 20 or 21. And of an infectious laryngotracheitis virus and one or more other birds containing a suitable carrier. Multivalent vaccine against disease. 56. A method of immunizing chickens or other poultry against infectious laryngotracheitis. Therefore, the effective immunizing amount of the vaccine according to claim 44 is the chicken or other A method comprising administering to poultry. 57. A method of immunizing chickens or other poultry against infectious laryngotracheitis. Therefore, the effective immunizing amount of the vaccine according to claim 45 is the chicken or other A method comprising administering to poultry. 58. A method of immunizing chickens or other poultry against infectious laryngotracheitis. Therefore, the effective immunizing amount of the vaccine according to claim 46 is the chicken or other A method comprising administering to poultry. 59. A method of immunizing chickens or other poultry against infectious laryngotracheitis. Therefore, the effective immunizing amount of the vaccine according to claim 47 is the chicken or other A method comprising administering to poultry. 60. A method of immunizing chickens or other poultry against infectious laryngotracheitis. Therefore, the effective immunizing amount of the vaccine according to claim 48 is the chicken or other A method comprising administering to poultry. 61. A method of immunizing chickens or other poultry against infectious laryngotracheitis. Therefore, the effective immunizing amount of the vaccine according to claim 49 is the chicken or other A method comprising administering to poultry. 62. A method of immunizing chickens or other poultry against infectious laryngotracheitis. Therefore, the effective immunizing amount of the vaccine according to claim 50 is the chicken or other A method comprising administering to poultry. 63. A method of immunizing chickens or other poultry against infectious laryngotracheitis. Therefore, the effective immunizing amount of the vaccine according to claim 51 is the chicken or other A method comprising administering to poultry. 64. Chicken or other poultry for infectious laryngotracheitis A method of immunizing a subject according to claim 52, wherein the effective immunizing amount of the vaccine is A method comprising administering to a chicken or other poultry. 65. A method of immunizing chickens or other poultry against infectious laryngotracheitis. Therefore, the effective immunizing amount of the vaccine according to claim 53 is the chicken or other A method comprising administering to poultry. 66. Chickens for infectious laryngotracheitis and one or more other avian diseases A method for immunizing other poultry, the effective immunization of the vaccine according to claim 55. A method comprising administering an amount to the chicken or other poultry. 67. A chicken vaccinated with the virus according to claim 26 or A method of separating other poultry from those infected with the natural infectious laryngotracheitis virus. Therefore, a sample of body fluid derived from chickens or other poultry is used for glycoprotein gG and And chickens or other poultry infected with wild-type infectious laryngotracheitis virus Analyzing for the presence of at least one other normally expressed antigen, There is an antigen normally expressed in infected chickens and glycoprotein gG is present. Not having been vaccinated with the vaccine according to claim 25 and having a natural infection How to show that you are not infected with the sex laryngeal tracheitis virus. 68. The virus according to claim 2, claim 3, claim 5, claim 7, or claim 9 Vaccinated chickens or other poultry were infected with the natural infectious laryngotracheitis virus. From those infected with A method of fractionation, in which a sample of body fluid from chickens or other poultry is sampled Or other chickens infected with Glycoprotein gG and natural infectious laryngotracheitis virus For the presence of at least one other antigen normally expressed in poultry That there is an antigen that is normally expressed in infected chickens, and The absence of white gG means that there is no claim in claim 2, claim 3, claim 5, claim 7, or claim 7. Vaccinated with the vaccine according to paragraph 9 and exposed to the natural infectious laryngotracheitis virus. How to indicate that you have not dyed. 63. A chicken vaccinated with the virus according to claim 27 or A method of separating other poultry from those infected with the natural infectious laryngotracheitis virus. So, a sample of body fluid from chickens or other poultry Chickens or other infected with glycoprotein gG and naturally infectious laryngotracheitis virus Analyzing for the presence of at least one other antigen normally expressed in poultry. , An antigen that is normally expressed in infected chickens is present, and The absence of gG and glycoprotein gI allows the vaccine according to claim 27 to Those who have been vaccinated against cutin and have not been infected with the natural infectious laryngotracheitis virus. Law. 70. A chicken vaccinated with the virus according to claim 26 or A method of separating other poultry from those infected with the natural infectious laryngotracheitis virus. Therefore, a sample of body fluid derived from chickens or other poultry was used as glycoprotein gI and And other chickens infected with the natural infectious laryngotracheitis virus Analyzing for the presence of at least one other antigen normally expressed in poultry. , An antigen that is normally expressed in infected chickens is present, and The absence of gI vaccinates the vaccine of claim 26. The method of demonstrating that it is not infected with the natural infectious laryngotracheitis virus. 71. Insert foreign DNA into unique short region of infectious laryngotracheitis genomic DNA Homologous vector for generating recombinant infectious laryngotracheitis virus by A double-stranded DNA molecule consisting essentially of a double-stranded foreign gene, DN located in a unique short region of genomic DNA on either side of the chain foreign gene A double-stranded DNA homologous to A is adjacent, except that the flanking sequence is glycoprotein g D gene, glycoprotein gE gene, protein kinase gene, and ORF10 gene A homology vector that is not homologous to. 72. Item 71. The foreign gene is a screenable marker The homology vector described. 73. The screenable marker is Escherichia coli β-galactosidase or β -The homology vector according to claim 72, which is a glucuronidase. 74. Screening in the infectious laryngotracheitis virus genomic DNA Recombinant infectious throat by deleting the DNA encoding the A homologous vector for the production of head tracheitis virus, which is to be deleted A double-stranded DNA molecule consisting essentially of a double-stranded DNA The infectious laryngotracheitis virus glycoprotein is attached to each side of the double-stranded DNA to be induced. two homologous to the gG gene, glycoprotein gI gene, US2 gene, or UL-47-like gene. A homology vector flanked by double-stranded DNA. 75. The homology vector according to claim 74, which is named homology vector 544-55.12. Kuta. 76. The homology vector according to claim 74, which is named homology vector 562-61.1F. Kuta. 77. The homology vector according to claim 74, which is named homology vector 427-73.27. Kuta. 78. A homologous vector according to claim 74, which is designated as homologous vector 560-52.F1. Kuta. 79. A homologous vector according to claim 74, which is named homologous vector 579-14.G2. Kuta.
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