JPH09501324A

JPH09501324A - Flow-through bioreactor with a groove for cell retention

Info

Publication number: JPH09501324A
Application number: JP7523549A
Authority: JP
Inventors: サンドトローム，クレイグ; パプツァキス，イー，ティー; ミラー，ウィリアム，エム; ベンダー，ジェイムス，ジー
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 1994-03-11
Filing date: 1995-03-03
Publication date: 1997-02-10
Also published as: EP0698085A1; EP0698085A4; AU2060195A; AU687531B2; WO1995024464A1; CA2162465A1; IL112944A; IL112944A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、灌流される培地中で細胞を保持及び培養するための、貫流バイオリアクターである。本バイオリアクターは、当該容器の長手軸に沿った培地の流れを許容するために蓋に入口及び出口ポートを備えた、全体として長方形の容器である。底壁の内表面は、長さ、深さ及び幅を有する全体として長方形の溝を有する。該溝は、それらの長さが該容器の長手軸を横切るように底壁に配置されており、該溝の幅を渡る培地の流れを許容する。細胞は、溝内に沈降し、そこにおいてそれらは増殖及び分化し、容器を通る培地の大部分の流れの中に入ることかなく、こうして培地の流れによる細胞の損失が回避される。本発明はまた、非接着性の幹細胞／前駆細胞の損失を伴うことなく造血細胞の灌流培養を行うための方法をも提供する。溝内の細胞がコロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＭ，ＢＦＵ−Ｅ，ＣＦＵ−Ｍｉｘ）、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）、及び顆粒球前駆細胞（芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球）を形成するよう、培養培地へは種々のサイトカインを加えることができる。 (57) [Summary] The present invention is a flow-through bioreactor for retaining and culturing cells in perfused medium. The bioreactor is a generally rectangular vessel with inlet and outlet ports on the lid to allow the flow of medium along the longitudinal axis of the vessel. The inner surface of the bottom wall has a generally rectangular groove having a length, depth and width. The grooves are arranged in the bottom wall such that their length is transverse to the longitudinal axis of the container and allow the flow of medium across the width of the groove. The cells settle in the furrows, where they proliferate and differentiate and do not enter the bulk of the medium flow through the vessel, thus avoiding loss of cells due to medium flow. The present invention also provides a method for performing a perfusion culture of hematopoietic cells without loss of non-adherent stem / progenitor cells. The cells in the groove are colony forming units (CFU-GM, BFU-E, CFU-Mix), long-term culture initiation cells (LTC-IC), and granulocyte progenitor cells (blasts, promyelocytic cells, myelocytic cells, postmyelocytic cells). Various cytokines can be added to the culture medium to form spheres).

Description

【発明の詳細な説明】細胞保持用の溝を備えた貫流バイオリアクター技術分野本発明は、細胞の灌流培養の分野に属する。本発明の装置及び方法は、非接着性細胞並びに接着性細胞を当該バイオリアクターチャンバー内に保持しつつ培地の貫流を許容するものであるバイオリアクターを伴う。本発明は、造血細胞の培養に特に適している。関連技術細胞培養においては、細胞を、長時間in vitroに維持することがしばしば望ましいか、その間に該細胞は老廃物を産生し、培地を酸性化し、培地からの栄養を使い切ってしまう。培地の消耗は、細胞が増殖及び／又は高度に代謝性の細胞タイプへと分化する場合には加速される。こうして、細胞培養における一つの中心的問題は、細胞を攪乱せずに培養培地を新しくするための手段を提供することである。培養フラスコの表面に接着する細胞タイプは、単に使用済み培地を注ぎ出して新鮮な培地を注ぎ込むだけで培地を交換できる。代わりとして、使用済みの培地の一部を穏やかに吸引除去して新鮮な培地と交換することができる。新鮮な培地の灌流又は貫流は、しばしは又は連続的に培地の交換を必要とする接着性細胞タイプの増殖のためには望ましい。しかしながら、接着細胞であっても培地の大部分の流れによって加えられる剪断応力によって有害な影響を受け得る。接着性細胞でも、培地の大部分の流れによって係留位置から強制排除されて培養系から失われ得る。代わりとして、接着性細胞はそれらの基質に接着されたままに止まり得るが、液体の力によって、増殖できない及び／又は分化できない等のような有害な影響を被り得る。灌流培養のこれらの有害な影響の一部は、細胞自身によって産生された因子（それらの因子か細胞の発達に必要な場合）の希釈及び洗浄に帰せられる。表面に接着せず懸濁状態で増殖するタイプの細胞は、培地の交換に特別な問題を提起する。その問題とは、使用済み培地中の細胞の高い割合を失うことなく培地を交換することである。非接着性の細胞は、物理的障壁を用いてバイオリアクター中に保持することができる。物理的障壁は、細胞の通過に対しては障壁を創り出すが栄養及び代謝副産物の拡散を許容するものである膜の形態であってよい。中空繊維バイオリアクターは、物理的障壁の原理に基づいて働く。中空繊維バイオリアクターにおいては、細胞は、半透膜（すなわち、繊維材料）の背後に保持される。典型的な中空繊維ユニットは、数千本の個々の中空繊維を含む。一般に、細胞は該繊維を取り囲む空間中で培養される。培養培地は該空間を通して灌流され、そして代謝副産物は、該半透膜を通して中空繊維内へ、そしてついで系外へと拡散する。中空繊維バイオリアクターの例は、ＷＯ９１／／１８９７２に（Knazek）及びＷＯ９２／１０５４６（Culver）に開示されている。他のタイプのバイオリアクターは、半透膜又は支持体の使用に基づく（米国特許第5,264,344 号（Sneath）及び米国特許第5,223,428 号（Rose））。細胞集団を通しての培地の均一な分布のためにローラー瓶タイプのバイオリアクターが設計されている。伝統的に、細胞は瓶の内表面に接着し、瓶は細胞を浸すために絶えず回転される。ある種のローラー瓶バイオリアクターは、支持ストリップ又は波形によって提供される増大された内表面を有している（米国特許第5,010,013 号（Serkes）；ＥＰ 345 415 (Tyndorf)；米国特許第3, 853,712 号；米国特許第5,270,205 号(Rogalsky)；米国特許第5,256,570 号(Cly de)）。攪拌バイオリアクターとして知られている他のタイプのバイオリアクターは、細胞を保持するためにしばしばスピンフィルター及び沈降チューブの使用を含む（米国特許第4,760,028 号（deBruyne）；米国特許第4,906,577 号 (Armstrong) ）。接着依存性細胞は、一般に攪拌バイオリアクター中において使用される微小担体ビーズ上で増殖させることができる (ＥＰ 046,681 (Tolbert)；米国特許第 5,002,890 号 (Morrison))。幾つかのタイプの静置培養フラスコは、接着依存性細胞の増殖のために表面積の増大を提供するために、内表面上の波形、隆起、剛毛を利用する (米国特許第 5,084,393 号（Rogalsky）；米国特許第5,272,084 号 (O'Connell)；米国特許第 5,151,366 号 (Serkes))。米国特許第4,939,151 号（Bacehowski）は、製造中及び滅菌工程において内表面同士が付着するのを防止するための平滑でない内表面を有する細胞培養バッグを開示している。３次元の固体マトリクスも、接着細胞を増殖させるために提案されている（米国特許第4,514,499 号（Noll）。研究者達は、現在まで、最近、抗体産生ハイブリドーマ、繊維芽細胞、及び真核細胞系を含むある特定のタイプの細胞の培養に大半の経験を得てきた。造血細胞等のような他のタイプの細胞は、適切なバイオリアクターの設計において普通でない問題を提起する。ある種の癌治療のためには、当該培養された細胞を患者へ投与するために、造血細胞を培養することが望ましい。造血細胞は、提供者又は患者の骨髄又は末梢血から得られる。培養すべき出発の細胞懸濁液は、種々の分化段階の種々の造血細胞を含んでおり得る。代わりとして、細胞懸濁液を最初にある選択工程に付し、例えば幹細胞について高度に濃厚化させた出発細胞サンプルを得てもよい。幹細胞は、顆粒球、リンパ球、赤血球、及び巨核球を含むあらゆる造血系列の細胞へと分化する潜在能力を有する原始的な造血細胞である。増殖及び前駆細胞への発達のためには、幹細胞は基質への接着を必要とすると一般に信じられている。しかしながら、前駆細胞の段階まで及びそれを越えて進んだ細胞は、それらのin vivo での微小環境が移動する液体（血液）であることから、一般に非接着性であると考えられており、それらは静止表面への接着に適合させられないであろう。こうして、造血細胞の培養は、接着性及び非接着性細胞を含む種々の異なった細胞タイプを含み得る。この描像を一層込み入らせることに、非接着性細胞のあるものは、他の細胞に接着し得、それが今度は表面に接着する。造血細胞は、それらが剪断に弱いことから、更なる問題を提起する。造血細胞は、回転フラスコ中に懸濁されている場合には十分に増殖しないようである。造血細胞の増殖につながる微小環境を提供する試みにおいて、間質層によって増殖表面が提供された。この間質層は、一般に、骨髄における細胞外マトリクスを模擬するように選択され、コラーゲン及びフィブロネクチンのようなタンパク質よりなる。間質の使用に依存するバイオリアクターは、ＷＯ９０／１５８７７ ( Emerson)、ＷＯ９２／１１３５５ (Emerson)、ＥＰ 0 358 506 (Naughton)、米国特許第5,160,490 号（Naughton）及び米国特許第4,963,489 号に開示されている。間質の使用は、幾つかの理由から不利である。第１に、間質層を細胞培養表面に作り出すのは時間浪費的であり、培養容器内へ汚染物を導入しないように非常な注意が払われなければならない。間質を沈着させるためのある種の技術は、繊維芽細胞のような生きた細胞の使用を要求するが、それらは培養すべきタイプの細胞とは異なる。培養容器内への外来の細胞の導入は、臨床使用に適した造血細胞懸濁液の培養の仕事を複雑化させる。従って、本発明の主たる目的は、過度の攪乱や培養細胞の損失を伴うことなく培地の交換を許容するバイオリアクターを提供することである。本発明の別の一目的は、間質の使用なしに細胞を保持することを許容するバイオリアクターを提供することである。本発明の別の一目的は、培養された細胞を容易且つ効率的に該バイオリアクターから回収することを許容する貫流バイオリアクターを提供することである。本発明の更なる一目的は、ＣＤ34＋について未選択の造血単核球の灌流培養のための方法を提供することである。本発明のこれらの及び他の目的及び利点は、以下の本発明の模範的な好ましい具体例についての詳細な記述を添付の図面（図面を通して同じ参照数字は同じ特徴部に、又は構造若しくは機能において類似の特徴部に言及している。）と関連させて読むことによって明らかとなろう。溝の寸法は、Ｘ，Ｙ，及びＺとして同定される。バイオリアクター全体の長手軸は、Ｌとして同定される。図面の簡単な記述図１は、本発明による細胞保持のための溝を備えた貫流バイオリアクターの部分的に概念的な前方透視図を示す。図２は、本発明のバイオリアクターの長手方向断面図を示す。図３は、入口ポートを通り溝の長さ寸法に沿った断面図を示す。図４は、溝の拡大した部分的断面図を示す。図４ａは、本発明の一具体例の溝を示し、それにおいては各溝は、幅：深さ＝１：１の比率を有する。図４ｂは、本発明の異なった一具体例を示し、それにおいては各溝は幅：深さ＝２：１の比率を有する。本発明の模範的な好ましい具体例の詳細な記述図１を見て、バイオリアクター容器１０が、底壁１６の内表面の詳細を示すために容器１４の図から広げられた蓋１２と共に示されている。操作においては、蓋１２は容器１４に当該分野において既知の仕方でシールされる。例えば、蓋１２は、化学接着により容器１４に永久的にシールされるか又はガスケット及びクランプによってシールされることができる。代わりとして、バイオリアクター容器１０全体が一体に成形されてもよい。好ましくは、バイオリアクター容器１０は、透明なアクリル、又はポリスチレンで作られている。該容器１０の内表面は、テフロンその他のポリマーで被覆されていても良く、又は、培養しようとする特定の細胞タイプの増殖要件に従って負電化を加えてあってもよい。底壁１６の内表面には、細胞培地が容器１４の長手軸Ｌに沿って該溝１８の長さ寸法Ｘを横切る方向に流れる間、中に細胞が保持されるものである複数の長い長方形の溝１８が備えられている。より良い図解のために、溝１８は、この図では不釣り合いに拡大してある。蓋１２は、入口スロット２２を通して液体培地を移送するための入口ポート２０を有する。培地は、入口スロット２２から入り、長軸Ｌに沿ってバイオリアクター容器１０を通り、そして出口スロット２４から流出する。培地の流れは、流れが底壁１６の内表面を均等に横切るよう周知の手段によって管理される。流れを管理する手段の一例は、下の実施例１に示されている。図２は、上述の要素すなわち、入口ポート２０、入口スロット２２、出口スロット２４、出口ポート２６、底壁１６の内表面、溝１８の、長手方向断面図を示す。この図においては、溝１８は、より良い説明のために不釣り合いに拡大してあり、溝の詳細は底壁１６の内表面の部分において省略してある。しかしながら、本発明の該好ましい具体例においては、溝１８は、底壁１６の内表面を横切って連続している。入口ポート２０は、細胞培養の分野において周知の仕方で適当な生理学的ｐＨに維持された、新鮮な培地の貯蔵器に接続されている。出口ポート２６は、廃液容器に繋がっていてよく、又は出口ポートを出た培地は周知の仕方で新鮮にされて入口ポート２０に再循環されてもよい。図３は、寸法Ｘ（図１）における、入口ポート２０及ひ入口スロット２２を通るバイオリアクター１０の断面図である。この断面図は、溝１８に沿っており、溝１８の長手面３０を示している。図４ａは、寸法Ｘ（図１及び３）に垂直の断面図であり、本発明の好ましい一具体例における溝１８の寸法を示している。この具体例においては、幅Ｙの深さＺに対する比率は約１：１である。適切には、幅Ｙ及び深さＺは、各々約50μｍ乃至約5,000 μｍである。好ましくは、幅Ｙは約200 μｍであり、深さＺは約20 0 μｍである。寸法Ｙ：Ｚ＝200 μｍ：200 μｍを用いると、造血細胞３２の単一層（約10μｍの厚さ）（底３４に載っている）は、溝の深さ比率を僅か約５％しか変化させない。溝１８は隅及び縁が鋭い90°を形成しているように描かれてはいるが、本発明の範囲内においては、溝の隅及び／又は縁は、円弧を形成するよう丸味を持たせてよいということが理解される。本開示を与えられれば、同様の結果を達成するために溝の異なったタイプの幾何学形状を考案することができるということが理解できる。図４ｂは、溝１８の寸法を示している。本発明の第２の好ましい具体例における溝の寸法を示している。この具体例においては、幅Ｙの深さＺに対する比率は約２：１である。これらの好ましい溝寸法は、底壁１６の内表面を覆って培地が長手軸Ｌ（図１を参照）に沿って、溝１８（図４）の最上部を横切って流れるとき、接着性及び非接着性の両方の細胞３２を保持するのに適している。下の実験例において明らかにされるように、底壁１６の内表面を覆う長手軸Ｌに沿った培地の大部分の流れは、溝１８内にある細胞３２を攪乱しない。接着性及び非接着性の両方の造血細胞が、本発明のバイオリアクターの溝１８内において増殖及び分化できる。管理された流れ条件の下で、洗い出しによる認める程の細胞の損失はない。細胞が増殖するという事実は、栄養、増殖因子、及び酸素が、溝１８の口を横切る新鮮な培地の大部分の流れから、細胞を維持するために溝内の液体中へ入るということを明らかにしている。更には、培養細胞が健康であることは、ＣＯ₂ 等のような細胞の有害な代謝副産物が、溝１８内の液体から拡散して出て該底壁１６の内表面を横切る培地の大部分の流れの中へと入り、最終的にはバイオリアクターから出ることを示している。更には、本質的に細胞の損失がないことは、細胞それ自体が溝１８の口から出てバイオリアクター容器の長手軸Ｌに沿った大部分の流れに入ることがないということを示している。本発明の該バイオリアクターの成功が理論的な流れパターン（Higdon，J.L.， 1985，J．Fluid Mech 159:195-226; Chilukuri，R.，et al.，1984，J Electroc hem Soc 131:1169:1173；Tighe，S．et al.，1985, Chem Eng Commun 33:149-15 7；Chilukuri，R.，et al.，1983，Chem En gCommun 22:127-138）によって部分的に説明できるのではないかと考えるかも知れない。溝内の細胞の複雑化を伴うことなしには、底壁１６の内部表面を横切る外部の流れは、表面内の小さい溝１８に浸透することができず、従って溝内の培地を排除できないであろう。また、溝内に細胞がなければ、溶解している栄養及び気体が溝内の培地と外部の流れ中の培地との間での拡散によって交換されるような循環流又は「渦巻」が各溝内に誘発され得る。しかしながら、溝内における細胞の存在は、流体力学の現在の技術状態においては流れの理論的な予想を実際的でないものにする。本発明の作業バイオリアクター内における流れパターンは、理論的計算を用いては実際的に記述できない。しかしながら、このことは、非接着性の細胞並びに接着性の細胞の保持、増殖、及び分化を許容する本バイオリアクターの発見の重要性を減ずるものではない。造血細胞の培養への本発明のバイオリアクターの適用は、下の実験例において記述されよう。本発明の方法の特有の利点は、最初にＣＤ34＋幹／前駆細胞のための選択を行うことなしに、造血単核球の懸濁液が成功裏に培養できることである。単核球懸濁液を得るために、提供者又は患者の血液サンプルが周知のアフェレーシス手順を用いて得られる。例えば、アフェレーシス手順は、Baxter CS-3000TMアフェレーシス機器その他を用いて実施できる。場合により、アフェレーシス産物が、更なる処理を伴うことなく直接に使用される。他の場合には、アフェレーシス産物の目視検査が赤血球の大過剰の存在を示しているときには、単核球懸濁液から大部分の赤血球、血小板、及び細胞残滓を除去するために、アフェレーシス産物を密度勾配分離に付す。単核球懸濁液は、溝つきのバイオリアクター内に直接入れられて、灌流される培地中で培養される。ここに術語「単核球」及び「単核球懸濁液」は、大半の赤血球、血小板及び多核顆粒球から分離された造血細胞をいう。単核球懸濁液が、ＣＤ34＋幹／前駆細胞の非常に小さい画分しか含まないということが理解される。本発明の培養方法は、懸濁液中の移しい数の成熟細胞タイプによる不利な培地枯渇を伴うことなく、出発懸濁液内のこの少数の幹／前駆細胞の増殖及び分化を許容する。実施例１間質培養及び静置培養との比較における貫流溝付きバイオリアクター中における末梢血球の培養溝付きバイオリアクター中における灌流培養を、間質層（溝なし）上における灌流培養と比較した。対照の静置培養は、平滑表面のフラスコ（溝なし）又は間質層を有するフラスコ内で実施した。方法：末梢血球を２つの臨床源から得た。これらの細胞は、化学療法剤及びサイトカインによる患者の治療によって、癌患者の「骨髄から彼らの末梢血へと「動員」した。これらの細胞は、５％血清を含んだ氷上又は室温にてのＲＰＭＩ− 1640中における終夜出荷によって受領された。単核球は、Ｆｉｃｏｌ密度勾配（ 1.077 ｇ／ｃｍ³ ）遠心（1200回転／分、20分間）によって得られた。得られた単核球を１×Ｃａ⁺⁺Ｍｇ⁺⁺不含リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で一回洗浄した。このバイオリアクター研究において用いられたこの末梢血単核球は、１乃至３％のＣＤ34＋細胞（幹細胞）を有した。培養培地及び増殖因子：ヒト長期培地（ＨＬＴＭ）は、１％ＭＥＭビタミン類、１％２ｍＭグルタミン、１％１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＭＥＭ必須アミノ酸、１％ＭＥＭアミノ酸、１％１ＭＨＥＰＥＳ、１％ 10ｍＭモノチオグリセロール、0.1 ％ 50ｍｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン (Gibco)、12 .5％の予め選択された熱不活化胎仔牛血清及び12.5％の予め選択された熱不活化ウマ血清を補強したMaCoy の５Ａ培地より構成した。コロニーアッセイ培地は、 50μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン、30％の予め選択された熱不活化胎仔牛血清、２％牛アルブミン (Armour Pharmaceduticals)、150 Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン３（ｒｈＩＬ−３、R&D Systems Inc.）、40ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−６ (ｒｈＩＬ−６、Sandoz又はR&D Systems，Inc.)、15 0 Ｕ／ｍｌの組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子 (ｒｈＧ−ＣＳＦ，Immunex)、 200 Ｕ／ｍｌの組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (ｒｈＧＭ− ＣＳＦ、Immunes)、及び10Ｕ／ｍｌの組換えヒトエリスロポエチン (ｒｈＥｐｏ、Amgen)を補強した、0.8％メチルセルロース含有ＩＭＤＭより構成されている。バイオリアクター試験で用いた増殖因子補強ＨＬＴＭは、150 Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−３、40ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−６、150 Ｕ／ｍｌのｒｈＧ−ＣＳＦ及び50 ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子 (ＳＣＦ、Amgen)を含有した。これらの試薬の全ては、別に特定しない限りSigma より入手した。間質：骨髄培養物は、Koller等（Exp Hematol 20:264-270，1992）によって報告されているようにして確立した。要約すると、２周齢の骨髄培養物から副次培養された間質細胞を、3.75×7.5 ｃｍの長方形のポリカーボネート皿（Cole Par mer，Chicago，イリノイ州）内に５ｍｌのＨＬＴＭ中４×10⁵ 細胞／ｍｌにて播種することによって間質供給層を形成するために使用した。各皿は、培養原質とイリノイ州）を含んだ。空気中５％ＣＯ₂ において37℃にて24時間のインキュベーション後、皿を ¹³⁷Ｃｓ源からの12グレイの線量で照射した。翌日、静置培養実験のために、培養すべき細胞をこの照射した間質上へ播種した。間質バイオリアクター実験のためには、間質で被覆したスライドを濯いで、溝のないバイオリアクター容器の内側底表面上へおいた。バイオリアクター培養。培養チャンバーをポリカーボネートプラスチックで構成し、チューブ及びコネクターはTeflonで構成し、そして蠕動ポンプにおいて使用するチューブはシリコンで作られた。この培養チャンバーは、次の寸法を有した。Ｌ：チャンバー長さ 3.00インチ即ち7.62ｃｍＷ：チャンバー幅 1.50インチ即ち3.81ｃｍＨ：チャンバー高さ 0.21インチ即ち0.53ｃｍＡｆ：流れ断面（H W） 0.32インチ² 即ち2.03cｍ² Ｖ：チャンバー体積（H L W） 0.95インチ³ 即ち15.5ｃｍ³ 本発明の溝付きバイオリアクターはまた次の寸法を有した。Ｙ：溝幅 200 μｍＺ：溝深さ 200 μｍバイオリアクターの全部品を洗浄し、滅菌し、そしてポンプチューブを除いて再使用した。臨床用途のためには、バイオリアクターは一回使用の使い捨てであろうことが理解される。滅菌バイオリアクターを37℃のインキュベーター (Ster icult，Forma Scientific)内において完全に組み立てた。培養チャンバーを、気泡が系外へ出るのを促進するために、水平から均一な10°の確度にしたラック中においた。ｐＨ及びｄＯ₂ プローブの較正を許容するために、次いでＨＬＴＭをバイオリアクターを通して循環させた。これらの較正のために、バイオリアクターを最初に、ｐＨ較正の第１点についてＣＯ₂ と平衡化させた。第２に、バイオリアクターを、ｐＨ較正の第２点及びｄＯ₂ 較正についてについて空気と平衡化させた。バイオリアクターを次いで水抜きし、そして30ｍｌのＨＬＴＭ及び60ｍｌの２×増殖因子補強ＨＬＴＭを注入し、そしてｐＨコントローラーを7.35±0. 05に設定した。培養物の播種に先立ちバイオリアクター当たりこれら３つの培養チャンバーから培養液を殆ど完全に水抜きした。各バイオリアクターにつき３つのチャンバーの各々に10.0ｍｌの２×10⁵ 細胞／ｍｌの単核球懸濁液を注入することにより培養物を播種した。細胞を15分間沈降させ、次いで約0.2 ｍｌ／分にてポンプを始動させ、15分毎に0.5 、1.0 、1.5 、2. 0 、及び最終的には2.5 ｍｌ／分へと増加させた。同時に、静置対照培養を、同じ増殖因子を補強した20ｍｌのＨＬＴＭを含有する100 ｍｍのポリカーボネートペトリ皿中に確立した。培養培地の半分を交換することによってバイオリアクターに週当たり３回補給した。静置培養には、５日毎に補給した。バイオリアクターへの週３回の補給のうちの１回は、静置培養と同じ時間、すなわち培養物の一部分が収穫されるときに行われた。バイオリアクターの流速は、各供給の間に測定し、ｐＨは、外部ｐＨプローブ (Corning)によって測定した。細胞カウントは、培養物から除去された培地について、Coulter Counter（Coulter Electronics）を用いて行われた。バイオリアクター当たり１つのチャンバー及び１つの対応する対照培養物が、第５、10及び 15日に収穫された。内容物を排出させることによってバイオリアクター培養物を収穫し、10ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、１×細胞遊離溶液 (Sigma)で１回濯ぎ、そしてＰＢＳで２回目の濯ぎを行った。これは、洗い出し実験と同じ仕方で達成された。対照培養物を同じ排出及び濯ぎ操作によって収穫した。培養容器中に残っている細胞数を、10ｍｌのセトリミド (cetrimide)で１回濯いでCoulter Counter で核をカウントすることによって推定した。収穫された細胞懸濁液を遠心（1200回転／分にて15分間）により濃縮し、そして約10ｍｌの新鮮なＨＬＴＭ中に再懸濁させた。細胞カウントは、Coulter Co unter 及び血球計数器の両方により行った。生存性は、血球計数器カウント中においてトリパンブルー染料排除によって測定した。コロニーアッセイは、単核球については1,000 、3,000 及び9,000 細胞／ｍｌにて、そしてＣＤ34＋細胞については500 ，1,500 及び3,000 細胞／ｍｌにて確立した。これらのアッセイは、５％ＣＯ₂ 、５％Ｏ₂ 及び釣り合うＮ₂ の雰囲気にて完全に湿らせたインキュベーター中において37℃にて行った。第14日に40× 立体顕微鏡（ニコン）を用いてコロニーを採点した。50個を超える細胞を含んだ白色のコロニーを、コロニー形成ユニット顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）として、50個を超える細胞を含んだ赤色のコロニーをバースト形成ユニットエリスロイド（ＢＦＵ−Ｅ）として、そして50個を超える細胞を含んだ混合した赤色及び白色のコロニーをコロニー形成ユニット混合体（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）として採点した。長期培養開始（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイは、ウェル当たり１×10⁵ 個の照射された（2,000 ｒａｄ）異系同種ヒト骨髄細胞を含有する24ウェル組織培養プレート（Falcon）中に確立した。アッセイされる細胞は、収穫された単核球については５×10⁴ 及び２×10⁵ 細胞／ウェル、又は収穫されたＣＤ34＋細胞については 2.5 ×10⁴ 及び１×10⁵ 細胞／ウェル播種された。各ウェルは2.0 ｍｌのＬＨＴＭを含有した。５％ＣＯ₂ 、５％Ｏ₂ 及び釣り合うＮ₂ の雰囲気にて、完全に湿らせたインキュベーター中において培養物を33℃にてインキュベートした。培養物には、培地の半分を新鮮なＨＬＴＭで置き換えることにより週に１回補給を行った。培養物を５週後に収穫しそしてコロニーアッセイを15,000細胞／ｍｌにて確立した。これらのコロニーアッセイにより採点された全てのコロニーを、ＬＴＣ−ＩＣコロニーと見なした。フローサイトメトリーは、ＣＤ33（Becton Dickinson）／ＣＤ34、ＣＤ11b （Becton Dickinson）／ＣＤ15（Becton Dickinson）、ＣＤ11b （Becton Dicki nson）：及びＧｌｙＡ（Amak，Inc.）染色し、フローサイトメトリー (FACSTA R)によって分析することにより実施した。静置培養物には、５日毎に培養培地の半分の置換によって補給を行った。補給に際して払った注意にも関わらず、これは、細胞の殆ど又は全てが非接着性であったことから、不可避的に幾らかの細胞の損失をもたらした。３つのシリーズの実験の結果を下の表１に示す。表１についての記号説明Ｓｔｒｏｍａ：間質培養のために最初に播種された間質細胞の数。ＰＢＭＮＣｅｌｌｓ：間質培養及び無間質培養の両方において最初に播種した末梢血単核球の数。Ｆｌｏ−Ｇｒｖ：本発明の貫流溝付きバイオリアクター。Ｆｌｏ−Ｓｔｒｏｍ：底の上に間質層スライドを備えた、溝のない貫流バイオリアクター。Ｓｔａｔ／Ｓｍｏｏｔｈ：間質なしの静置対照培養。Ｓｔａｔ／Ｓｔｒｏｍ：間質を備えた静置対照培養。細胞数：静置培養及び貫流培養は、細胞数の比較的少ない期間である第10日までは同様の細胞数及びコロニー数を含んだ。第15日において、細胞数が比較的多くなったとき、静置培養の成績は低下し、貫流培養が卓越していた。第15日における貫流バイオリアクターの両方のタイプからの結果を比較して、溝付きバイオリアクター中の細胞数は、間質を備えたバイオリアクター（溝なし）中の細胞数に匹敵した。これらの結果は、試験した全ての時点において、細胞保持及び増殖について、溝付きバイオリアクターが間質を備えたバイオリアクターと同様に良い成績をあけることを示している。コロニー形成ユニット：溝付きバイオリアクターからの培養物は、全ての時点において、間質層バイオリアクターからの培養物に匹敵する多くの顆粒球マクロファージ／コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＭ）を含んでいた。第５日の後は、培地中のサイトカイン混合物が顆粒球／マクロファージ分化を駆動し赤血球造血を駆動しないように設計されていたため、どの培養物中にもエリスロイド細胞及びＢＦＵ−Ｅは殆ど検出されなかった。長期コロニー開始細胞：両タイプのバイオリアクターからの培養物は、全ての時点において同等数の長期コロニー開始細胞を含んでいた。生存性：両方のタイプのバイオリアクターからの細胞は、全ての時点において同等数の生存細胞を含んでいた。回収された細胞の生存性は非常に良好であり、79〜97％の範囲にあった。培地上澄分析：培地上澄サンプルを、ＩＬ−６，ＧＭ−ＣＳＦ，及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）濃度につき分析した。サイトカイン濃度においては異なった培養の間に最低の差しか観察されなかった。ＩＬ−６及びＴＮＦ− の濃度は、全ての培養物においてそれぞれ、約 35ｎｇ／ｍｌ及び約25ｐｇ／ｍｌ（第０日）から約50ｎｇ／ｍｌ及び約50ｐｇ／ｍｌ（第10〜15日）へと増加した。ＧＭ−ＣＳＦの濃度は、間質含有培養物中においては、投入したよりも低いレベルへと落ちる前に、約20ｐｇ／ｍｌ（第０日）から第５日の最大である約60ｐｇ／ｍｌへと増加した。間質不含培養物中におけるＧＭ−ＣＳＦの濃度は、約20ｐｇ／ｍｌ（第０日）から約５ｐｇ／ｍｌ（第 10〜15日）へと落ちた。全般的に、間質含有培養は、間質不含培養に比して僅かに速いサイトカイン濃度上昇を示した。更には、静置培養は、貫流培養に比してサイトカイン濃度の僅かに速い増加を示した。培地上澄サンプルをまた、グルタミン、アンモニア、グルコース及び乳酸濃度、及び培地ｐＨについ分析した。グルタミン濃度は、濯流培養中に約0.9 ｍＭ（第０日）から約0.7 ｍＭ（第15日）へと低下し、一方静置培養中においては、グルタミン濃度はほぼ投入レベルに止まった。加えて、アンモニア濃度は、全ての培養物中において約300 Ｍ（第０日）から約600 Ｍ（第10〜15日）へと増加した。このことは、少量のグルタミン消費の殆どが、細胞による消費よりも寧ろ37℃ におけるその分解によるものであることを示唆している。しかしながら、間質含有培養物中においては実質量のグルコースが消費され乳酸が産生されたが、間質不含培養物中ではそうではなかった。グルコース濃度は、間質含有灌流培養及び静置培養について、それぞれ約240 ｍｇ／ｄｌ（第０日）から約210 ｍｇ／ｄｌ（第15日）及び約120 ｍｇ／ｄｌ（第10日）へと低下した。対応して、間質含有灌流培養及び静置培養について、それぞれ、乳酸濃度は約20ｍｇ／ｄｌ（第０日）から約100 ｍｇ／ｄｌ（第15日）及び約150 ｍｇ／ｄｌ（第15日）へと増加した。最後に、培地のｐＨは、灌流培養については7.35 ±0.05に管理されたが、静置間質不含培養及び間質含有培養についてはそれぞれ、7.35（第０日）から約7.25（第10日）及び約6.90（第10日）へと低下した。我々の実験室における他の観察が、ＣＦＵ−ＧＭが7.20より低いｐＨにおいて阻害されることを示唆している（Todd McAdamsからの私信）。これらの研究において、7.0 を下回るｐＨの低下は、第10日から第15日にかけて、静置間質含有培養においてＣＦＵ−ＧＭの低下と同時に起こった。溝付きバイオリアクター中での未選択単核球及びＣＤ34＋選択細胞の培養造血細胞培養の技術において、ＣＤ34＋細胞のある割合が、間質又は基質への接着を必要とし得る幹細胞であると一般に信じられている。従って、ＣＤ34＋選択細胞が本発明のバイオリアクターの溝内において増殖し得るか否かを判定することは興味深い。本発明のバイオリアクターには何らの間質も存しない。該バイオリアクターは種々のタイプのプラスチックから形成でき、又は、細胞が接着するように処理したプラスチック表面を有することができる。しかしながら、次の実験において使用されたバイオリアクターは、あるタイプのプラスチック、ポリカーボネート（これは、その表面電荷が中性であることから、細胞接着に寄与しないと考えられている。）で形成されている。末梢血サンプルが得られ、単核球懸濁液が上記実施例１に記述したようにして調製された。フローサイトメトリーによる出発サンプルの表現型解析は、末梢血サンプルが元々２〜12％のＣＤ34＋細胞を含んでいることを示した。ＣＤ34＋細胞は、単核球懸濁液から、先ず該懸濁液をＣＤ34に対するマウスモノクローナル抗体（これは、ＣＤ34＋細胞上のＣＤ34細胞表面抗原に特異的に結合する。）とインキュベートすることによって選択された。次いで、ヤギ抗マウス抗体で被覆した常磁性ビーズを、該細胞懸濁液とインキュベートした。この常磁性ビーズは、それにより、ＣＤ34＋細胞上のマウス抗体に対するヤギ抗マウス抗体の結合を介して、ＣＤ34＋細胞に結合してビーズ／ＣＤ34＋細胞複合体を形成する。このビーズ／ＣＤ34＋細胞複合体を、次いで、全細胞集団から磁気的引力によって選択する。洗浄後、キモパパインによる酵素的分解によってＣＤ34＋細胞が該ビーズから遊離される。ＣＤ34＋選択の結果は、下の表２に示されている。ＣＤ34＋細胞は、培養物の何れも間質層を含まないことを除き、上記実施例１のようにしてバイオリアクター内及び静置培養物に播種された。ＣＤ34＋細胞について未選択の単核球調製物を用いた実験を、ＣＤ34＋実験と平行して実施した。 12.5％の胎仔牛血清及び12.5％のウマ血清を含有するヒト長期培地（ＨＬＴＭ）を、実施例１に記述したようにして調製した。造血培養のためには、ＨＬＴＭには、150 Ｕ／ｍｌのＩＬ−３（R&D Systems，Minneapolis，ミネソタ州）、40 ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６（Sadoz，East Hanover,ニュージャージー州）、50ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（Amgen，Thousand Oaks，カリフォルニア州）、及び150 Ｕ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ (R&D Systems)補強した。別に特記しない限り、全ての試薬はSigm a（St．Louis，ミズリー州）より入手した。静置培養は、Koller et al.，1993, BioTechnol 11:358-363に記述されているようにして実施した。灌流培養は、上記実施例１に記述されているようにして、溝付きバイオリアクターを用いて実施した。灌流培養温度は、37.0±0.5 ℃に維持され、ｐＨ及び溶存酸素（ＤＯ）データ獲得及び制御システムは、ｐＨが空気、Ｎ₂ 及びＣＯ₂ 用の別個のポートを有する気体混合ユニットによって制御されたことを除き、Koller et al.,（上記）に記載されている通りであった。非接着性細胞は、30ｃｍ² の表面積の半分を占める、流れの方向に大して直角に配向された長方形の溝（図１〜３を参照）の使用によって保持された。ｐＨは、培地保持タンク内のヘッドスペースへの気体流中においてＣＯ₂ の空気に対する比率を変化させることによって、7.35±0.05に制御された。チャンバーからの培地出口におけるＤＯは、空気飽和の90％未満には決して低下しなかった。100 ｍｍのポリカーボネートのペトリ皿（表面積が30ｃｍ² であるようスペーサーを備える）中における静置培養は、空気中５％ＣＯ₂ の雰囲気で、完全に湿らせたインキュベーター内において37℃にて実施された。灌流及び静置培養は、始めに、２×10⁶ 個の動員された末梢血単核球か又は２ ×10⁵ 個のＣＤ34＋細胞のいずれかを播種された（上記実施例１を参照）。最初の細胞密度は、第15日にほぼ同じ細胞密度を与えるように選択された。最初の培地量は、灌流培養については120 ｍｌ（３つのチャンバーにつき）、そして静置培養については20ｍｌ（各々）であった。灌流システムにおける培地の循環速度は、０〜2.5 ｍｌ／分／培養チャンバーへと1.5 時間かけて徐々に増大された。どの時点においても、無視できる数の細胞か細胞トラップ中に観察された。灌流培養は、培地の半分を新鮮なＨＬＴＭ及ひサイトカインで置き換えることによって週３回補給された。各チャンバーが収穫された後、培地貯蔵器体積は30ｍｌ減少していた。静置培養は、５日毎に培地の半分を新鮮なＨＬＴＭ及びサイトカインで置き換えることによって補給された。静置培養おける非接着性細胞の関連した数減少は、除去した培地に基づく細胞カウントによって測定したところによれば、19±31％であった。３つの並行した培養の一つを、５日毎に犠牲にして総細胞数、細胞の生存性、ＣＦＵ−ＧＭ及びＬＴＣ−ＩＣ含量、細胞の表現型及び形態を、下に記述したようにして評価した。細胞の又は細胞表面マーカーの酵素的損傷を防止するため、細胞を収穫するのにトリプシンは使用しなかった。灌流及び静置培養物は、細胞懸濁液を培養チャンバー又はペトリ皿から除去し、10ｍｌのＣａ⁺⁺及びＭｇ⁺⁺不含リン酸緩衝食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ，Gibco，Grand Island，ニューヨーク州）で濯ぎ、そして10ｍｌの細胞遊離溶液（Sigma,No．C-5789）で濯ぎ、そして10ｍｌのＣＭＦ−ＰＢＳで２回濯ぐことによって収穫した。細胞を次いで洗浄し、ＨＬＴＭ中に再懸濁させた。トリパンブルー染料排除により血球計数器を用いて細胞カウント及び生存性を測定した。この非酵素的な収穫手順は、回収された培養チャンバー又はペトリ皿を10ｍｌのセトリミドで濯いで遊離された核をCoulter Counter モデルＭＨＲ（ Coulter Electronics，Hialeah，フロリダ州）でカウントすることによって測定したところによれば、総細胞の97％以上を回収した。加えて、収穫後の培養チャンバー及びペトリ皿の顕微鏡検査は、殆ど細胞が残っていないことを明らかにした。形態学：サイトスピン（cytospin）漏斗中において、Shandon Cytospin^TM２（ Pittsburgh，ペンシルバニア州）を用いて1,000 回転／分で５分間、5,000 〜50 ,000個の細胞を遠心することによって、サイトスピンスライドを調製した。これらの細胞を次いでライト・ギムザ染色（Harleco，Gibbstown，ニュージャージー）で30秒間染色し、続いてリン酸緩衝液で１分間濯いだ。次いでスライドを、芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、バンド化した区分された好中球、巨核球、前単球及び単球の存在につき評価した。コロニーアッセイは、上記実施例１に記述されているようにして実施した。0. 8 ％メチルセルロースコロニーアッセイ培地を、150 Ｕ／ｍｌのＩＬ−３、40 ＩＬ−６、200 Ｕ／ｍｌ顆粒球・マクロファージＣＳＦ (ＧＭ−ＣＳＦ，R&D Systems)、150 Ｕ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ及び10／ｍｌのエリスロポエチン (Ｅｐｏ，Amgen)。新鮮な及び培養した単核球を 1,000 乃至9,000 細胞／ｍｌの範囲で播種し、一方新鮮な及び培養したＣＤ34＋細胞を、500 乃至4,500 細胞／ｍｌの範囲で播種した。ＬＴＣ−ＩＣアッセイを、上記実施例１に記述したようにして実施した。第０日に、新鮮な単核球は、2.5 ×10⁴ 乃至2.0 ×10⁵ 細胞／ウェル播かれ、ＣＤ34 ＋細胞は、1.25×10⁴ 乃至1.0 ×10⁵ 細胞／ウェル播かれた。培養された単核球を、5.0 ×10⁴ 乃至2.0 ×10⁵ ／ウェルの範囲で、及び培養されたＣＤ34＋を2. 5 ×10⁴ 乃至１×10⁵ 細胞／ウェルの範囲で、二重に播いた。先に記述した方法（Smith，S.L．et al.，1993，Exp．Hematol．21:870-877）の僅かな修正を用いて、最初の及び培養した単核球及びＣＤ34＋細胞を、ＣＤ33 ／ＣＤ34、ＣＤ11ｂ／ＣＤ15及びＣＤ11ｂ／ＧｌｙＡについて評価した。要約すると、細胞を、モノクローナル抗体の次の組み合わせて標識した：ＰＥ−ＣＤ 33（Becton Dickinson）／ＦＩＴＣ−ＣＤ34 (8G12，Baxter Immunotherapy Div ision)、ＰＥ−ＣＤ11ｂ（Becton Dickinson）／ＦＩＴＣ−ＣＤ15（Becton Dic kinson）及びＰＥ−ＣＤ11ｂ／ＦＩＴＣ−ＧｌｙＡ（Amak，Inc.，Westbrook,メーン州）。細胞を次いでパラホルムアルデヒドで固定し続いてFACScan ^TMフローサイトメーターで定量した。ＣＤ33抗原は、ＣＤ34＋細胞の選択において常磁性ビーズからＣＤ34＋細胞を遊離させるために使用されるキモパパインによって特に分解される。灌流された単核球及びＣＤ34＋培養物の生産性を、それらの結果を各実験について10⁹ 個の単核球を含んだ当初サンプルに対して標準化することによって、比較した。総細胞、ＣＦＵ−ＧＭ及びＬＴＣ−ＩＣの標準化された生産性は、各実験について、単核球（ＭＮＣ）及びＣＤ34＋培養物について得られた結果に次を掛けることによって計算された：ここに、Ｍ_MNC は単核球培養についての乗数であり、Ｍ_CD34はＣＤ34＋細胞培養についての乗数であり、Ｘ_MNC は培養当たりの単核球の最初の数であり、Ｘ_CD34 はＣＤ34＋細胞培養当たりの選択された細胞の最初の数である。％ＣＤ34_MNC は単核球（選択前）中におけるＣＤ34＋細胞の％であり、％ＣＤ34_CD34はＣＤ34＋選択細胞中におけるＣＤ34＋細胞の％であり、そしてＹｓは選択工程の収率である。データ解析：灌流及び静置単核球及びＣＤ34＋培養における総細胞、ＣＦＵ −ＧＭ及びＬＴＣ−ＩＣの比較のための統計解析は、結果の対数をとり次いで p aired Student's t-testを用いることによって実施した。灌流及び静置単核球及びＣＤ34＋培養における細胞表現型の比較のための統計解析は、 paired Studen t's t-testを用いて行った。単核球又はＣＤ34＋細胞として培養された最初の10⁹ 個の単核球サンプルの灌流培養によって生み出された総細胞、ＣＦＵ−ＧＭ及びＬＴＣ−ＩＣの比較のための統計解析は、結果の対数をとり次いで paired Student's t-testを用いることによって実施した。データは、平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として報告してある。結果を下の表３に示す。表３についての記号説明ＰＢＭＮＣｅｌｌｓ：末梢血単核球ＣＤ34＋Ｃｅｌｌｓ：ＣＤ34＋選択細胞バイオリアクターＮｏ．１及びＮｏ．２：本発明の溝付きバイオリアクターを用いた灌流培養。対照Ｎｏ．１及びＮｏ．２：静置培養単核球培養については、有意な増殖が観察される前に５〜10日の範囲の遅延があった。灌流培養及び静止培養において、それぞれ第15日に9.2 倍及び8.2 倍という平均の最大拡張が得られた。灌流培養及び静置培養についての細胞の生存性は、それぞれ95（±５）％及び96（±５）％であった。灌流単核球培養及び静置単核球培養は、15日にわたってＣＦＵ−ＧＭの類似の拡張を与え、最大拡張は第10〜15日に見られた。灌流培養及び静置培養の両方においてＣＦＵ−ＧＭの19倍の拡張が得られた。ＣＦＵ−ＧＭを生じた細胞の平均画分（第０日には0.4 ％）は、灌流培養及び静置培養についてそれぞれ第５日に 4.6 ％及び5.2 ％にてピークとなった。ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｍｉｘは、６つの実験の僅か１つについて灌流培養及び静置培養において観察された。他の５つの実験においては、第10日の前に少数のＢＦＵ−Ｅが観察され、ＣＦＵ−Ｍｉｘは第０日を過ぎては観察されなかった。灌流単核球培養は、原始的ＬＴＣ−ＩＣを15日にわたって静置培養よりも良好に維持した。灌流は、ＬＴＣ−ＩＣの平均数を第15日において投入数の123 ％まで拡張させた（10日において183 ％）。尤も、拡張は実験のうちの２つにおいてしか観察されなかった。対照的に、静置培養は第15日にはＬＴＣ−ＩＴを投入数の74％に維持できたに過ぎず（第10日には89％）、拡張の観察されたのは６つの実験中で僅か１つに過ぎなかった。ＬＴＣ−ＩＣを生む細胞の画分は、両方の培養タイブについて第０日の平均の0.15％から第15日の0.02％又はそれ未満へと連続的に低下した。灌流培養した単核球は、静置培養した細胞に比して一層原始的な表現型を有していた。灌流培養における細胞は、静置培養における細胞よりも長くＣＤ34＋集団を維持した（表４）。加えて、ＣＤ11b ^- ／ＣＤ15^- （未熟細胞）の画分は灌流において一貫して大きく、一方、ＣＤ11b ⁺ ／ＣＤ15⁺ の画分（成熟顆粒球）の画分は静置培養において一貫して大きかった（表５）。灌流及び静置培養において３％未満の細胞がグリコホリン (Glycophorin)Ａ（赤血球マーカー、データは示さず）を発現した。重要なことに、単核球及びＣＤ 34＋細胞の灌流培養中における細胞は、最初の組成が有意に異なっているにも関わらず10日後においては形態学的に類似であった（下の表６）。灌流及び静置ＣＤ34＋細胞培養は、15日にわたって総細胞の連続的拡張を示した（上記表３）。灌流及び静止培養それぞれにおいて、第15日に、113 倍及び84倍という平均最大拡張が得られた。静置培養における低い平均拡張は、部分的には、培養物の一つにおける非常に低い増殖のためである。興味深いことに、このサンプルからの静置単核球培養も低い拡張を与え、一方、両灌流培養は正常な細胞増殖を与えた。灌流培養及び静置培養についての細胞生存性は、それぞれ96（±５）％及び92 （±11）％であった。灌流培養においては、より大きな拡張とＣＦＵ−ＧＭ数のより良好な維持の傾向があった。灌流培養及び静置培養について、それぞれ第15日に18倍及び11倍という最大ＣＦＵ−ＧＭ拡張が得られた。ＣＦＵ−ＧＭを生み出す細胞の画分（第０日においては4.7 ％）は、灌流培養及び静止培養において、第５日にそれぞれ、10％及び11％でピークになった。ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｍｉｘの拡張は、灌流培養及び静置培養において６つの実験のうち僅か１つにおいてしか観察されなかった。他の５つの実験においては、第15日に少数のＢＦＵ−Ｅが観察され、ＣＦＵ−Ｍｉｘは第０日を過ぎては観察されなかった。灌流ＣＤ34＋細胞培養は、ＬＴＣ−ＩＣを、静置培養に比して一層良好に維持した。灌流は、第15日においてＬＴＣ−ＩＣの平均数を投入値の135 ％まで拡張した。但し拡張は２つの実験でしか観察されなかった。対照的に、静置培養は、第15日においてＬＴＣ−ＩＣを投入数の僅か72％しか維持できず、拡張は６つの実験のうち僅か１つにおいてしか観察されなかった。ＬＴＣ−ＩＣを生み出す細胞画分は、両タイプの培養について、第０日の1.6 ％から第15日の0.02％まで、連続的に減少した。灌流におけるＣＤ34＋細胞は、静置培養における細胞と類似の表現型を有した。灌流は、ＣＤ34＋集団を一層長く維持する傾向があったが、ＣＤ33＋、ＣＤ11 b −／ＣＤ15−、及びＣＤ11b ／ＣＤ15＋細胞については近似であった。平均して、何れの培養においても細胞の３％未満がＧｌｙＡを如何なる時点においても発現した。最初、ＣＤ34＋細胞は、主として芽球であった。芽球の画分は、急速に減少し、そして第10日までには、培養物は主として顆粒球的及び単球的細胞を含んだ。興味深いことに、細胞、ＣＦＵ−ＧＭ、及びＬＴＣ−ＩＣの乏しい拡張を示した培養物は、主として単球を含んだ。単核球灌流培養及びＣＤ34＋細胞灌流培養の比較：我々は、単核球及びＣＤ34＋細胞で開始した培養の成績の比較を、灌流培養に限定する。上述のように、良好に増殖したサンプルについては、灌流培養は、全体として静置培養に等しいか又はこれより良好であった。加えて、灌流培養は、静置培養において増殖できなかったサンプルの、少なくとも限定された拡張を提供した。培養を開始するのに用いた単核球及びＣＤ34＋細胞は非常に異なった表現型を有していたが、これら２つの灌流培養系中の細胞は、培養10日後に、類似のレベルのＣＤ34、ＣＤ33、ＣＤ11b ⁺ ／ＣＤ15⁺ 、及びＣＤ11b ^- ／ＣＤ15^- を発現した。単核球及びＣＤ34＋細胞培養中の第15日におけるＣＤ34＋であった細胞の画分は、それぞれ、0.6 ％及び0.4 ％であり、一方ＣＤ33＋であった画分は46％及び45％であった。対照的に、これらの培養に播種するのに用いた集団は、それぞれ6.3 ％及び90.9％ＣＤ34＋であった。単核球及びＣＤ34＋細胞培養における第15日のＣＤ11b ^- ／ＣＤ15^- （未熟細胞）である細胞画分は、それぞれ、19％及び22％であり、一方ＣＤ11b ⁺ ／ＣＤ15⁺ （成熟細胞）である細胞画分は58％及び54％であった。対照的に、これらの培養に播種するのに用いた集団は、それぞれ、27％及び87％ＣＤ11b ^- ／ＣＤ15^- 並びに47％及び４％ＣＤ 11b ⁺ ／ＣＤ15⁺ であった。加えて、単核球及びＣＤ34＋細胞の典型的な灌流培養におけるＣＤ33／ＣＤ34及びＣＤ11b ／ＣＤ15発現の２次元フローサイトメトリー分析は、５日後に顕著に類似した細胞集団を明らかにした。最初、ＣＤ34＋細胞は、幾らかの単球及び非常に僅かの顆粒球的細胞と共に、主として芽球を含んでいたのに対し、単核球は、幾らかの芽球と共に主として顆粒球的及び単球的細胞を含んでいた。しかしながら、灌流10日後においては、両培養共に、単球的細胞の大きな画分と共に、主として顆粒球的細胞を含んでいた。顆粒球系列へ向けての優勢は、表６に示されているよりも大きい。何故ならば、（１）成熟顆粒球は培養中においては、Ｇ−ＣＳＦの存在下でさえも短い半減期を有しており、（２）同定不能の細胞（総細胞のうちの約10％）が単球と共に含まれており、そして（３）ライト・ギムザ染色を用いては未熟な巨核球が単球と区別されないからである。従って、末梢血単核球及びＣＤ34＋細胞の灌流培養は、用いられた増殖因子組み合わせについて、類似の仕方で顆粒球系列に沿って成熟するように見える。単核球及びＣＤ34＋細胞で始められたＣＦＵ−ＧＭ及びＬＩＴ−ＩＣを生ずる細胞画分もまた、10日の灌流培養後は類似であった。ＣＦＵ−ＧＭを生ずる細胞画分は、第10日において単核球及びＣＤ34＋細胞の場合についてそれぞれ、2.9 ％及び2.5 ％であった。これは、第０日のそれぞれ0. 4 ％及び4.7 ％と対照的である。ＬＴＣ−ＩＣを生ずる細胞画分は、第10日において単核球及びＣＤ34＋細胞の場合についてそれぞれ、0.10％及び0.043 ％であった。やはりこれも、第０日のそれぞれ、0.15％及び1.6 ％とは対照的である。単核球として培養された末梢血サンプルの灌流培養から得られた細胞の総数、ＣＦＵ−ＧＭ及びＬＴＣ−ＩＣは、ＣＤ34＋細胞として培養され選択されたサンプルについて得られることのできたものより大きかった（表７）。総細胞、ＣＦＵ−ＧＭ及びＬＴＣ−ＩＣの最大数はそれぞれ、第15、10〜15及び10〜15日に得られた。各実験について得られた培養成績、当初細胞負荷、及びＣＤ34＋細胞選択の収率を用いて決定するところによれば、単核球を播種した灌流培養は、ＣＤ34＋画分を選択して培養するのに比して、第15日においてそれぞれ、1.5 倍、2.6 倍及び2.1 倍の総細胞、ＣＦＵ−ＧＭ及びＬＴＣ−ＩＣを与えるであろう（「データ解析」を参照）。実験の各々について100 ％のＣＤ34＋選択を仮定すると、第15日における単核球（ＭＮＣｓ）からの産生は、ＣＤ34＋細胞からの場合に比して、総細胞については等価、ＣＦＵ−ＧＭ及びＬＴＣ−ＩＣについてはそれぞれ1.5 倍及び1.4 倍であろう。尤も、これらの差は有意ではないであろう。第10日における収穫が最適であろう。何故ならば、第10日と第15日との間では、ＣＦＵ−ＧＭ数（これは、移植の質の指標である。）が、本質的に不変である一方、総細胞のうちのＣＦＵ−ＧＭを生ずる画分が第10日においては３倍を超えて高いからである。加えて、単核球培養におけるＬＴＣ−ＩＣ数は、６つの実験のうちの３つにおいて、第15日に比して第10日において一層大きく、他の２つにおいては等価であった。第10日における収穫については、単核球を播種した灌流培養は、ＣＤ34＋細胞を播種したものに比して、それぞれ、1.8 倍、 2.4 倍及び4.8 倍多い総細胞、ＣＦＵ−ＧＭ及びＬＴＣ−ＩＣを与えるであろう。議論総細胞及びＣＦＵ−ＧＭの拡張は、末梢血単核球又はＣＤ34＋細胞の何れで開始した静置培養及び灌流培養においても得られた。灌流ＣＤ34＋細胞培養及び灌流単核球培養は、15日にわたってＬＴＣ−ＩＣを静置培養よりも良好に支持した。他の研究者達は、組織培養フラスコ内における (McAlister IB，et al.，Exp Hematol 20:626-628，1992；Haylock DN，et al.，Blood 80:1405-1412，1992； Sato，N.，et al., Blood 82:3600-3609，1993；Brugger，W.，et al.，Blood 8 1：2579-2584，1993)、ガス透過性培養バッグ内における (Takaue Y，et al.，A nn Hematol 64：217-220，1992；Lemoli RM，et al.，Exp Hematol 20：259-275 ，1992)、及び灌流システム内における (Koller，MR，et al.，Bio/Technol 11 ：358-363，1993；Palsson，BO.，et al., Bio/Technol 11:368-372，1993；Kol ler，MR.，et al.，Blood 82：378-384，1993)、ＣＦＵ−ＧＭの拡張について、単核球又はＣＤ34＋細胞の大規模培養を試験した。これらの研究の殆どにおいて、最大ＣＦＵ−ＭＧ拡張は第７日と第14日との間に見出された。単核球培養について得られた19倍の最大ＣＦＵ−ＧＭ拡張は、報告されている末梢血単核球（ＰＢＭＮＣｓ）（Takaue et al.，上記；McAlister，et al.，上記）の3.8 倍乃至 16倍の拡張に相当する。対照的に、ＣＤ34＋細胞培養についての11倍及び18倍の最大ＣＦＵ−ＧＭ拡張は、先に報告されている末梢血ＣＤ34＋細胞についての57 倍乃至190 倍拡張（Haylock DN，et al.，上記；Sato N，et al.，上記；Brugge r W．et al.,上記）より低い。しかしながら、これらの大きいＣＦＵ−ＧＭ拡張は、５種又は６種の増殖因子の組み合わせを用いて得られており、一方、単核球培養中のＣＦＵ−ＧＭの拡張は、２種又は３種の増殖因子の組み合わせを用いて得られている。例えば、Haylock 等は、ＩＬ−１β 、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦによる末梢血ＣＤ 34＋細胞培養14日後における、66倍という最大ＣＦＵ−ＧＭ拡張を報告している。彼らは、分析した31通りの異なった増殖因子組み合わせのうちでこの６種の増殖因子の組み合わせが、培養７日後において、最大ＣＦＵ−ＧＭ拡張を与えたと報告している。それらの最適な組み合わせは、McAlister 等によって用いられたＩＬ−３，ＧＭ−ＣＳＦ及びＣＳＦという３因子の組み合わせ（実際にはＰＩＸＹ321 （ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３融合タンパク質）及びＳＣＦ）に比して、約５倍大きいＣＦＵ−ＧＭを与えた。14日の培養についても比率が同一に止まったと仮定して、最大ＣＦＵ−ＧＭ拡張は、66倍から13倍へと減少するであろう（これはMcAlister 等によって報告された16倍の拡張に近い）。同様に、Sato等は、高度に生成された末梢血ＣＤ34＋細胞からの、ＩＬ−３，ＩＬ−６，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦとの培養７日後における、ＣＦＵ−ＧＭの57倍の拡張を報告している。しかしながら、ＩＬ−３，ＩＬ−６，Ｇ−ＣＳＦ及びＳＣＦによっては、拡張は25倍に過ぎず、これは、同じサイトカインを用いて本発明において得られたＣＦＵ−ＧＭの拡張に近似していた。Brugger 等は、ＩＬ−１，ＩＬ−３，ＩＬ−６，Ｅｐｏ及びＳＣＦとの末梢血ＣＤ34＋細胞培養中におけるＣＦＵ−ＧＭの190 倍の拡張を報告しているが、種々の４因子サイトカイン組み合わせ並びにＧ−ＣＳＦも使用した場合には、20倍乃至40倍の拡張しか得られなかった。ＣＤ34＋細胞培養についての種々の研究者による結果の間の相違も、補給プロトコール（例えば、如何にして数減少が対処されるか。）、ＣＤ34＋細胞選択方法及び使用した培養培地、並びにサンプルの源における相違によるものかも知れない。後者の項目に関して、正常の提供者及び化学療法及び／又は増殖因子療法によって動員された癌患者からの末梢血サンプルが用いられた。これらの源からの末梢血は、原始細胞の画分において非常に大きく変動し得る。例えば、Brugge r 等は、化学療法及びＧ−ＳＣＦ動員血液から得られたＣＤ34＋細胞の僅か0.2 ％しか、ＣＦＵ−ＧＭコロニーを形成しなかったことを示している。これは、シクロホスファミド及びＧ−ＳＣＦ動員血液から得られたＣＤ34＋細胞の５％（本研究）及び正常血液からのＣＤ34＋の7.6 ％（Sato et al.,上記）と対照的である。細胞の拡張を変更する多数の因子が与えられているので、同一の細胞源及び同一のプロトコールを用いて、如何なる特定のパラメーターの効果も直接比較することが最善である。興味深いことに、本発明の方法を用いると、単核球又はＣＤ34＋細胞を播種された培養物は、培養10日後に顕著に近似であった。細胞の表現型における観察された変化は、骨髄の培養 (Smith SL，et al.，Exp Hematol 21：870-877，1993) 及び臍帯血の培養（Terstappen LWMM，et al., Leukemia 6：1001-1010，1992）について報告されたミエロイド分化の類似のパターンに従った。ミエロイド分化の初期の段階において、ＣＤ34＋細胞は、ＣＤ33を獲得しそしてＣＤ34を失う。細胞は更に分化でき、好中球へ向けて成熟するそれらはＣＤ15を、続いてＣＤ11 b を獲得し、一方、単球へ向けて成熟するそれらは、ＣＤ11b 及び次いでＣＤ15 を獲得する。このことは、拡張した細胞集団中に存在するＣＦＵ−ＧＭは、未培養の細胞中に存在するそれらに比して一層成熟している可能性があるということを示唆する。多数の成熟前駆細胞の注入は、輸血後の血球減少症の程度及び長さを減らす潜在能力を有する。産生された類似の細胞集団のために、単核球及びＣＤ34＋細胞の灌流培養は、細胞の量、ＣＦＵ−ＧＭ及びＬＴＣ−ＩＣ産生によって直接に比較することができる。灌流培養における15日の後、単核球は、ＣＤ34＋細胞として選択され培養された同じサンプルに比して、それぞれ1.5 倍2.6 倍及び2.1 倍多い総細胞、ＣＦＵ−ＧＭ及ひＬＴＣ−ＩＣを生み出した。仮にＣＤ34の選択工程が100 ％の効率であるとしてさえ、ＣＦＵ−ＧＭの産生は、ＣＤ34＋細胞についてよりも単核球について1.5 倍大きい。この差は選択工程中に起こった損失によるものではないように見える。何故なら、ＣＤ34選択の収率を考慮したとき、100 （±100 ）％のＣＦＵ−ＧＭ及び70（±30）％のＬＴＣ−ＩＣが回収されているからである。最初の細胞集団及び培養条件にもかかわらず、単核球培養からのＣＦＵ−ＧＭの産生は、ＣＤ34＋細胞からのそれを超えないであろうが、我々の結果は、高度のＣＦＵ−ＧＭ拡張を得るためには、ＣＤ34＋細胞の選択は必要ないということを明瞭に実証している。細胞拡張を増大させること以外の理由で、ＣＤ34細胞は依然として望ましいかも知れない。最近、乳房中の腫瘍細胞 (Ross AA，et al．Blood 82：2605-2610 ，1993)及び小細胞肺癌（Brugger W，et al., Blood 83：646-640，1994）が、造血前駆細胞と共に末梢血中へと動員できることが示されている。骨髄細胞培養中における白血病細胞の選択的損失に基づいて（Da WM，et al., Brit J Hemato l 78:42-47，1991；Testa NG，et al.，Hematol Blut Transfus 31:75-78，1987； Barnett MJ，et al.，Bone Marrow Transplant 4:345-351，1989）、ex vivo 培養が非造血腫瘍細胞を枯渇すると予期し得る。しかしながら、更なる追放を提供するためにはＣＤ34＋細胞の選択が依然必要である。本来の部位の幹細胞は、骨髄抑制療法の後での再構成のためには必要とされないが、動員された血液の間のＬＴＣ−ＩＣ数の減少は、骨髄除去療法後の長期の再構成に有害な影響を与え得る。これらの条件下には、（多数の成熟前駆細胞を提供するために）拡張した細胞を未培養の細胞と組み合わせることが最善であろう。この点ＣＤ34の選択は、未培養細胞を用いる移植についての総量を減らし、且つ異系同種の場合におけるＧＶＨ疾患を調節する。最後に、培養されたＣＤ34＋細胞は、遺伝子療法のためのトランスフェクションの効率を高め得る。静置及び濯流培養は、単核球及びＣＤ34＋細胞培養の双方につき同様の平均総細胞及びＣＦＵ−ＧＭ拡張を与えた。実際、補給の際の細胞の数減少を考慮する場合には、静置培養は、両方のタイプについては総細胞の、及び単核球ついてはＣＦＵ−ＧＭの、一層大きな平均拡張を与えるであろう。しかしながら、細胞の数減少の補正は、（１）除去された細胞が均一な細胞サンプリングを代表し、（２）これらの細胞が培養に戻され又は更なる培養に播種され、そして（３）細胞の返還が培養成績に影響を及ぼさない、ということを仮定している。静置及び灌流末梢血単核球培養における近似の総細胞及びＣＦＵ−ＧＭ産生は、照射した間質上の臍帯血単核球（ＣＢＭＮＣｓ）についての結果と対照をなす。後者の場合、総細胞産生は、一層大きくそしてＣＦＵ−ＧＭの拡張は、静置培養（Koller et al.，1993,上記）の場合のそれに比して灌流培養においては２倍大きかった。我々はまた、照射した間質（上記実施例１を参照）上で培養された末梢血単核球の灌流対静置培養における総細胞及びＣＦＵ−ＧＭの産生の増大をも観察した。間質細胞の不存在下における静止培養についてのより良い相対的成績は、間質細胞に比して単核球の低い代謝要求によるものである可能性がある。しかしながら、われわれが、一層大きな細胞拡張を示した末梢血サンプルについて静止培養の成績における相対的減少はなんら認めなかったということに注意しなければならない。灌流培養の主たる利点は、静止培養において非常に乏しい成績を示したそれらのサンプルが、灌流において少なくとも限定された（そして大半の場合正常な）拡張を示したということである。加えて、灌流培養は、ＬＴＣ−ＩＣ数を静置培養（これは、照射された間質上における末梢血単核球及び臍帯血単核球についての結果（Koller，et al.，1993，上記）と一致している。）よりも良好に維持した。移植のための前駆細胞の拡張のためには、灌流したバイオリアクターは、バッグまたはフラスコ培養より優れている。なぜなら、それらが、望ましい培養状態を維持し、補給の間の汚染の機会を最小にし、臨床適用のために規模を拡大するのが一層容易であり、そして現在の及び予期される食品医薬品局（ＦＤＡ）の規制に合致することを容易にするからである。1992年に、ＦＤＡは、一般にＧＭＰとして知られている一群の規則ＣＦＲセクション211 （21 ＣＦＲ 211）は、血液取扱企業にも法的に適用できるということを述べた。ＣＦＲ 211.22 は、品質管理ユニットの設置を命じており、その長は輸血センターの管理者とは別でなければならない。ＦＤＡの高まる規制活動は、自家リンパ球療法帯び骨髄移植等のような細胞療法についても予想されている。造血細胞のEx vivo 拡張は、最も確かには21 ＣＦＲ 211によって管理されるであろう。ＧＭＰ規制に適合するに際し、工程中における材料の代表的サンプルが、品質の管理のために必要であり、一方、同時に、閉じた培養系が非常に望ましい。従って、サイフォンを抜き取る能力を備えて設計された灌流バイオリアクターが、ＧＭＰ規制下における処理のために特に適している。バイオリアクターシステムの最大の利点は、しかしながら、バリデーションの領域に存する。21 ＣＦＲ 211.100に暗示された要求であるバリデーションは、問題の工程が一貫して且つ再現可能に、所定の品質及び規格の製品を製造しているという文書化された証拠を確立することよりなる。総細胞及びＣＦＵ−ＧＭ拡張について得られた結果は、培養造血細胞の治療的適用のために必要な最初の動員される血液サンプル及び培養システムのサイズを見積もるのに用いることができる。末梢血細胞を用いた好中球の迅速な植付けのためには、20×10⁴ のＣＦＵ−ＧＭ／ｋｇ体重の治療投与量が示唆されている（ Bender JG，et al.，J Hematotherapy 1:329-341，1992）。80ｋｇの個人なら、 16×10⁶ 個のＣＦＵ−ＧＭを必要とするであろう。3.8 ×10⁹ 個の未培養の動員血液単核球、又はＩＬ−３，ＩＬ−６，Ｇ−ＣＳＦ及びＳＣＲと共に15日間培養した0.21×10⁹ の単核球が、16×10⁶ 個のＣＦＵ−ＧＭのために必要であろう。この培養システムは、少なくとも２×10⁹ 個の培養された単核球を収容しなければならない。いずれの培養も、細胞密度による細胞増殖を制限する兆候を示さなかったことから、灌流培養及び静置培養について得られる最大細胞密度の推定は、培養当たりに得られた最大細胞数を培養面積で除すことによって見出すことができる。灌流において得られた最大は、細胞が溝内にのみ存在したと仮定して、有効15ｃｍ² 培養面積上の48×10⁶ 個、すなわち3.2 ×10⁶ 個／ｃｍ² であった。静置培養において得られた最大は、30ｃｍ² の培養面積上に45× 10⁶ 個、すなわち1.5 ×10⁶ 個／ｃｍ² であった。これらの条件下において、灌流システムは、625 ｃｍ² を必要とし、一方静置培養は1350ｃｍ² （すなわちＴ −250 培養フラスコ６個に等価）を必要とした。上限を得るために、灌流培養での第15日におけるＣＦＵ−ＧＭ最低画分を示したサンプルについて、類似の計算を実施することができる。これは、灌流培養及び静置培養について、それぞれ15 00ｃｍ² 及び15,000ｃｍ² という推定を与える。実施例３平滑灌流チャンバー対溝と灌流チャンバーチャンバーとの対比における臍帯血単核球臍帯血（ＣＢ）単核球の懸濁液を、実施例１に記述されているようにして調製した。全ての培養についてサイトカイン濃度は実施例１の通りであった。灌流培養及び静置培養は、実施例２の通りとした。培養培地は、実施例１の通りのＨＬＴＭであり、それぞれ胎仔牛血清及びウマ血清の予め選択されたロット12.5％を含んだ。ＩＬ−３，ＩＬ−６，Ｇ−ＣＳＦ，及びＳＣＦを補強した間質不含臍帯血単球培養は、平滑灌流培養チャンバー及び本発明の溝付きバイオリアクター中で実施した。対照静置培養は、ペトリ皿中で実施した。このシリーズの実験では間質は用いなかった。結果を下の表８及び９に示す。表８及び９についての記号説明ＣＤＭＮＣｓ：臍帯血単核球Ｓｍｏｏｔｈ：灌流培養、平滑底チャンバー、間質なし（Koller，et al.， 1993，上記）Ｇｒｏｏｖｅｄ：本発明の溝付きバイオリアクターを用いた灌流培養。Ｃｏｎｔｒｏｌ：ペトリ皿中における静置培養。間質なし。溝付きバイオリアクター中における灌流培養は、静置培養における培養物と類似の細胞拡張を示した。しかしながら、平滑チャンバーにおける灌流培養は、溝付きバイオリアクター中における灌流バイオリアクターの僅か半分しか細胞拡張を示さなかった。あったとしても僅かの細胞しか溝付きチャンバーの（しかし平滑チャンバーのではない）後の細胞トラップ中に見出されなかったことから証拠づけられるように、あったとしても僅かの細胞しか溝付きチャンバーから洗い出されなかった。生存性は、細胞トラップ中に見出された細胞については20％であった。溝付きチャンバー内における灌流培養は、ペトリ皿中における静置培養よりも大きいＣＦＵ−ＧＭ，ＢＦＵ−Ｅ，及びＣＦＵ−Ｍｉｘの拡張を与えた。22倍、 10倍及び13倍という最大ＣＦＵ−ＧＭ拡張が、第10日において、それぞれ溝付きチャンバー、平滑チャンバー、及びペトリ皿中における培養から得られた。更には、6.2 倍、4.9 倍及び6.7 倍という最大ＣＦＵ−Ｍｉｘ拡張が、第５日において、それぞれ溝付きチャンバー、平滑チャンバー、及びペトリ皿中における培養から得られた。これは、３つの培養から、第５日において57％のエリスロイドを含有するコロニー（例えばＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｍｉｘ）、第10日において35 ％のエリスロイドを含有するコロニー、そして第15日においては僅か10％のエリスロイドしか含有しないコロニーを有する、コロニータイプの分布をもたらした。最後に、コロニータイプの似たような分布及び溝付き及び平滑チャンバーによる培養中にＣＦＵ−Ｃを生み出す細胞画分によって証拠付けられるところによれば、平滑チャンバーは特定の細胞を他の細胞よりも優先的に保持することはないように思われた。Detailed Description of the Invention Flow-through bioreactor with a groove for cell retention Technical field The present invention is in the field of perfusion culture of cells. The device and method of the present invention are non-adhesive. Medium holding sex cells and adherent cells in the bioreactor chamber With a bioreactor that allows the flow-through of The present invention relates to the cultivation of hematopoietic cells. Especially suitable for feeding. Related technology In cell culture, it is often desirable to maintain cells in vitro for long periods of time. In the meantime, the cells produce waste products, acidify the medium and nourish the medium. It will be used up. Depletion of medium can mean that cells are proliferating and / or highly metabolic cell types. When it is differentiated into ip, it is accelerated. Thus, one center in cell culture The challenge is to provide a means to refresh the culture medium without disturbing the cells. is there. For cell types that adhere to the surface of the culture flask, simply pour out the spent medium. The medium can be replaced simply by pouring in fresh medium. Used media instead Part of the can be gently aspirated and replaced with fresh medium. Fresh medium Perfusion or flow-through of adherent cell types that require frequent or continuous media changes. It is desirable for the growth of ips. However, most of the medium, even adherent cells It can be detrimentally affected by the shear stress exerted by the flow of minutes. Adhesive thin Cells are also forcibly removed from the mooring position by the majority of the medium flow and lost to the culture system. Can be. Instead, the adherent cells Can stay adhered to their substrate, but cannot grow due to the force of the liquid And / or may be subject to deleterious effects such as inability to differentiate. Perfusion culture these Some of the deleterious effects of are factors produced by the cell itself (these factors (If required for the development of) and the washing. The type of cells that do not adhere to the surface and grow in suspension is a special problem for medium replacement. To raise. The problem is that you can grow without losing a high percentage of cells in the spent medium. It is to exchange the land. Non-adherent cells can be retained in the bioreactor using a physical barrier. it can. Physical barriers create barriers to the passage of cells, but nutritional and metabolic side-effects. It may be in the form of a membrane that allows the diffusion of the product. Hollow fiber bioreactors work on the principle of physical barriers. Hollow fiber bar In the ioreactor, cells are kept behind a semipermeable membrane (ie, fibrous material). Be held. A typical hollow fiber unit contains thousands of individual hollow fibers. General First, the cells are cultured in the space surrounding the fiber. Culture medium is perfused through the space. Effluent and metabolic byproducts pass through the semipermeable membrane into hollow fibers and then into the system. Spread out. An example of a hollow fiber bioreactor is WO 91 // 18972 (Knazek) and WO 92/10546 (Culver). Other types of bioreactors are based on the use of semipermeable membranes or supports (US patent). No. 5,264,344 (Sneath) and US Pat. No. 5,223,428 (Rose)). Roller bottle type for uniform distribution of medium throughout the cell population Bioreactor is designed. Traditionally, cells adhere to the inner surface of the bottle, The bottle is constantly rotated to soak the cells. Some kind of roller bottle bioreactor Has an increased inner surface provided by a support strip or corrugations (US Pat. No. 5,010,013 (Serkes); EP 345 415 (Tyndorf); US Pat. 853,712; US Pat. No. 5,270,205 (Rogalsky); US Pat. No. 5,256,570 (Cly de)). Another type of bioreactor, known as a stirred bioreactor, Often involves the use of spin filters and sedimentation tubes to retain cells (US Pat. No. 4,760,028 (deBruyne); US Pat. No. 4,906,577 (Armstrong) ). Adhesion-dependent cells are microscopic cells commonly used in stirred bioreactors. Can be grown on carrier beads (EP 046,681 (Tolbert); US Patent No. No. 5,002,890 (Morrison)). Some types of static culture flasks have surface areas due to the growth of adhesion-dependent cells. Utilizes corrugations, ridges, and bristles on the inner surface to provide increased build up (US Pat. 5,084,393 (Rogalsky); US Pat. No. 5,272,084 (O'Connell); US Pat. No. 5,151,366 (Serkes)). U.S. Pat. No. 4,939,151 (Bacehowski) describes inner surfaces during manufacturing and during the sterilization process. A cell culture bag with a non-smooth inner surface to prevent mutual adhesion Disclosure. A three-dimensional solid matrix is also proposed for growing adherent cells. (US Pat. No. 4,514,499 (Noll). To date, researchers have recently been working on antibody-producing hybridomas, fibroblasts, and true cells. Mostly for culturing certain types of cells, including nuclear cell lines Have gained experience. Other types of cells, such as hematopoietic cells, etc. It raises unusual issues in the design of Khtar. For the treatment of certain types of cancer, the cultured cells may be administered to a patient. It is desirable to culture blood cells. Hematopoietic cells are the bone marrow or periphery of the donor or patient. Obtained from blood. The starting cell suspension to be cultured contains different hematopoietic cells at different stages of differentiation. Can be Alternatively, the cell suspension is first subjected to some selection step, for example stem cells. A highly enriched starting cell sample may be obtained. Stem cells are granulocytes To differentiate into cells of all hematopoietic lineages, including lymphocytes, lymphocytes, red blood cells, and megakaryocytes. It is a primitive hematopoietic cell with viability. For proliferation and development into progenitor cells , It is generally believed that stem cells require adhesion to a substrate. However, Cells that have advanced to and beyond the progenitor stage are those microvessels in vivo. It is generally considered to be non-adhesive because the environment is a moving liquid (blood). And they will not be adapted for adhesion to stationary surfaces. In this way, Cultures of blood cells contain a variety of different cell types, including adherent and non-adherent cells. I can see. To make this picture more complicated, some non-adherent cells It can adhere to cells, which in turn adhere to the surface. Hematopoietic cells pose a further problem because they are sensitive to shear. Hematopoietic cells Do not appear to grow well when suspended in a rotating flask. Construction Proliferation by the stromal layer in an attempt to provide a microenvironment that leads to blood cell proliferation Surface provided. This stromal layer generally mimics the extracellular matrix in bone marrow. Selected to mimic proteins such as collagen and fibronectin. It becomes. Bioreactors that rely on the use of stroma are described in WO 90/15877 ( Emerson), WO 92/11355 (Emerson), EP 0 358 506 (Naughton), Disclosed in US Pat. No. 5,160,490 (Naughton) and US Pat. No. 4,963,489 I have. The use of stroma is disadvantageous for several reasons. First, the stromal layer is the cell culture surface Is time consuming and it is very important not to introduce contaminants into the culture vessel. Great care must be taken. Certain techniques for depositing stroma include fiber Requires the use of living cells such as fibroblasts, which are of the type Different from cells. The introduction of foreign cells into the culture vessel is suitable for clinical use. Complicates the task of culturing cell suspensions. Therefore, the main object of the present invention is to avoid undue disruption and loss of cultured cells. The purpose of the present invention is to provide a bioreactor that allows exchange of the medium. Another object of the invention is to allow the retention of cells without the use of stroma. It is to provide an odreactor. Another object of the present invention is to easily and efficiently cultivated cells in the bioreactor. To provide a once-through bioreactor that allows recovery from the A further object of the invention is the perfusion culture of hematopoietic mononuclear cells unselected for CD34 +. Is to provide a way for These and other objects and advantages of the present invention will be described in the following exemplary preferred embodiments of the present invention. A detailed description of specific examples is provided in the accompanying drawings (wherein the same reference numerals are used throughout the drawings to identify the same features) References to features or similar features in structure or function. ) And related Let me read and read Let's be light. Groove dimensions are identified as X, Y, and Z. Overall length of bioreactor The axis is identified as L. Brief description of the drawing FIG. 1 shows a part of a flow-through bioreactor with a groove for cell retention according to the present invention. A partially conceptual front perspective view is shown. FIG. 2 shows a longitudinal sectional view of the bioreactor of the present invention. FIG. 3 shows a cross-sectional view through the inlet port and along the length dimension of the groove. FIG. 4 shows an enlarged partial sectional view of the groove. FIG. 4a shows a groove of one embodiment of the present invention. , Where each groove has a ratio of width: depth = 1: 1. Figure 4b shows Figure 3 shows a different embodiment of the invention in which each groove has a width: depth = 2: 1 ratio. Have a rate. Detailed Description of Exemplary Preferred Embodiments of the Invention Referring to FIG. 1, the bioreactor vessel 10 shows details of the inner surface of the bottom wall 16. Is shown with the lid 12 unfolded from the view of the container 14. In operation, The lid 12 is sealed to the container 14 in a manner known in the art. For example, lid 1 2 may be permanently sealed to the container 14 by chemical bonding or may be a gasket and gasket. Can be sealed by a lamp. Alternatively, bioreactor volume The entire container 10 may be integrally molded. Preferably, the bioreactor container 10 Is made of clear acrylic or polystyrene. The inner surface of the container 10 is , May be coated with Teflon or other polymer, or try to culture Negative charge may be applied according to the growth requirements of the particular cell type. On the inner surface of the bottom wall 16, the cell culture medium extends along the longitudinal axis L of the container 14 along the length of the groove 18. A plurality of long cells in which cells are retained while flowing transversely to the dimension X. A rectangular groove 18 is provided. For better illustration, the groove 18 is Is disproportionately expanded. The lid 12 has an inlet port 2 for transferring liquid medium through an inlet slot 22. Has zero. The medium enters through the inlet slot 22 and follows the bioreactor along the long axis L. Through the container 10 and out the exit slot 24. The flow of medium is It is managed by well known means to evenly traverse the inner surface of the bottom wall 16. flow An example of a means for managing the is shown in Example 1 below. FIG. 2 shows the above-mentioned elements: inlet port 20, inlet slot 22, outlet slot. Shows a longitudinal cross-section of the outlet 24, the outlet port 26, the inner surface of the bottom wall 16, the groove 18. You. In this figure, the groove 18 has been disproportionately enlarged for better explanation. The details of the groove are omitted in the inner surface portion of the bottom wall 16. However , In the preferred embodiment of the invention, the groove 18 traverses the inner surface of the bottom wall 16. It is continuous. Inlet port 20 is provided at a suitable physiological pH in a manner well known in the field of cell culture. Connected to a reservoir of fresh medium maintained at. The outlet port 26 is a waste liquid. The medium, which may be connected to the container or exiting the outlet port, is refreshed in a known manner. May be recycled to the inlet port 20. FIG. 3 shows the inlet port 20 and inlet slot 22 through dimension X (FIG. 1). FIG. 3 is a sectional view of the bioreactor 10 according to the present invention. This cross section Is along the groove 18 and shows the longitudinal surface 30 of the groove 18. FIG. 4a is a cross-sectional view perpendicular to the dimension X (FIGS. 1 and 3), which is a preferred embodiment of the invention. The dimensions of the groove 18 in the specific example are shown. In this example, the depth of width Y The ratio to Z is about 1: 1. Suitably, the width Y and the depth Z are each about 50 μm. To about 5,000 μm. Preferably, the width Y is about 200 μm and the depth Z is about 20. It is 0 μm. Using the dimensions Y: Z = 200 μm: 200 μm, the hematopoietic cells 32 are simply One layer (about 10 μm thick) (on the bottom 34) has a groove depth ratio of only about 5%. Only change. Although the groove 18 is depicted as having sharp corners and edges forming 90 °, the present invention Within the range of, the corners and / or edges of the groove are rounded to form an arc. It is understood that it is okay. Achieve similar results given this disclosure In order to do so, it is possible to devise different types of geometric shapes of grooves. I can understand. FIG. 4b shows the dimensions of the groove 18. In the second preferred embodiment of the present invention The dimensions of the groove are shown. In this example, the ratio of width Y to depth Z is It is about 2: 1. These preferred groove dimensions are such that the medium covers the inner surface of the bottom wall 16 and the medium has a longitudinal axis L (see FIG. (See FIG. 4) and across the top of the groove 18 (FIG. 4), the adhesion and It is suitable for holding both non-adherent cells 32. Revealed in the experimental example below As seen, most of the flow of medium along the longitudinal axis L that covers the inner surface of the bottom wall 16 It does not disturb the cells 32 within the groove 18. Both adhesive and non-adhesive hematopoiesis Cells can grow and differentiate within the groove 18 of the bioreactor of the present invention. tube Under controlled flow conditions, the There is no cell loss. The fact that cells grow means that nutrients, growth factors, and oxygen , To maintain cells from most of the flow of fresh medium across the mouth of the groove 18 It reveals that it enters the liquid inside. Furthermore, the cultured cells are healthy What is CO₂ The harmful metabolic by-products of the cells, such as Exits into the bulk of the medium flow across the inner surface of the bottom wall 16, It is shown to exit from the bioreactor. Moreover, the loss of cells The fact that there is no loss is that the cells themselves come out of the mouth of the groove 18 and It shows that most of the flow along the hand axis L is not entered. The success of the bioreactor of the present invention is the theoretical flow pattern (Higdon, J.L., 1985,J. Fluid Mech159: 195-226; Chilukuri, R., et al., 1984,J Electroc hem Soc 131: 1169: 1173; Tighe, S .; et al., 1985,Chem Eng Commun 33: 149-15 7; Chilukuri, R., et al., 1983,Chem En gCommun22: 127-138) by part You may think that you can explain it in a simple way. Accompanied by the complexity of cells in the groove Without exception, the external flow across the inner surface of the bottom wall 16 will result in small grooves 1 in the surface. 8 could not be penetrated and therefore the medium in the groove could not be eliminated. Also, If there are no cells in the groove, the dissolved nutrients and gas are flowing in the medium in the groove and in the external flow. There is a circulating flow or "vortex" in each groove that is exchanged by diffusion with the medium of Can be triggered. However, the presence of cells in the groove is a current practice of fluid dynamics. Makes the theoretical prediction of flow impractical in the operative state. The flow pattern in the working bioreactor of the present invention is theoretical It cannot be practically described using dynamic calculation. However, this is non-adhesive Bioreactor that allows the retention, proliferation, and differentiation of cells of the skin and adherent cells Does not diminish the importance of finding Violet of the present invention for culturing hematopoietic cells The application of the actor will be described in the experimental example below. The unique advantage of the method of the present invention is that it first selects for CD34 + stem / progenitor cells. That is, a suspension of hematopoietic mononuclear cells can be successfully cultured without being disturbed. Mononuclear Apheresis procedure in which a donor or patient blood sample is well known to obtain a suspension. Is obtained by using. For example, the apheresis procedure is based on the Baxter CS-3000TM apheresis. It can be carried out by using an instrument. In some cases, apheresis products It is used directly without any processing. In other cases, apheresis products When a visual inspection of the cells shows the presence of a large excess of red blood cells, the The apheresis product is used to remove some red blood cells, platelets, and cell debris. Subject to density gradient separation. The mononuclear cell suspension was placed directly in the grooved bioreactor. And cultured in a perfused medium. The terms "mononuclear cell" and "mononuclear cell suspension" are used here. "Suspension" refers to hematopoietic cells separated from most red blood cells, platelets and multinucleated granulocytes. . Mononuclear cell suspension contains only a very small fraction of CD34 + stem / progenitor cells Is understood. The culturing method of the present invention is used to transfer a large number of mature cells in suspension. This small number of stem / precursor cells in the starting suspension without adverse media depletion due to Permits cell growth and differentiation. Example 1 Through-grooved bioria in comparison with stromal and static cultures Of peripheral blood cells in a doctor Perfusion culture in a grooved bioreactor on the stromal layer (without grooves) Compared to perfusion culture. Control static cultures were either smooth surface flasks (no groove) or between It was carried out in a flask with a quality layer. Method: Peripheral blood cells were obtained from two clinical sources. These cells are chemotherapeutic agents and Treatment of patients with itocaine "from the bone marrow to their peripheral blood" in cancer patients Mobilized ". These cells were RPMI-containing 5% serum on ice or at room temperature. Received by overnight shipment in 1640. The mononuclear cell has a Ficol density gradient ( 1.077 g / cm^Three ) Obtained by centrifugation (1200 rpm, 20 minutes). Got 1 x Ca for mononuclear cells⁺⁺Mg⁺⁺It was washed once with phosphate-free saline without PBS (PBS). The peripheral blood mononuclear cells used in this bioreactor study were 1 to 3%. Of CD34 + cells (stem cells). Culture medium and growth factors: Human Long Term Medium (HLTM) is 1% MEM vitamin 1% 2 mM glutamine, 1% 1 mM sodium pyruvate, 1% ME M essential amino acid, 1% MEM amino acid, 1% 1M HEPES, 1% 10 mM Monothioglycerol, 0.1% 50 mg / ml gentamicin sulfate (Gibco), 12 .5% preselected heat-inactivated fetal bovine serum and 12.5% preselected heat-inactivated It was composed of MaCoy's 5A medium supplemented with horse serum. The colony assay medium is 50 μg / ml gentamicin sulfate, 30% preselected heat-inactivated fetal bovine serum 2% bovine albumin (Armour Pharmaceduticals), 150 U / ml recombinant human mouse Interleukin 3 (rhIL-3, R & D Systems Inc.), 40 ng / ml recombination Human interleukin-6 (rhIL-6, Sandoz or R & D Systems, Inc.), 15 0 U / ml recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF, Immunex), 200 U / ml recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (rhGM- CSF, Immunes), and 10 U / ml of recombinant human erythropoietin (rhEpo). , Amgen) reinforced with 0.8% methylcellulose containing IMDM . The growth factor supplemented HLTM used in the bioreactor test was 150 U / ml rh IL-3, 40 ng / ml rhIL-6, 150 U / ml rhG-CSF and 50 It contained ng / ml stem cell factor (SCF, Amgen). All of these reagents are Obtained from Sigma unless otherwise specified. Stromal: Bone marrow culture isExp Hematol20: 264-270, 1992). Established as told. In summary, subculture from 2-week old bone marrow cultures. The cultivated stromal cells were transferred to a 3.75 x 7.5 cm rectangular polycarbonate dish (Cole Par 4 × 10 in 5 ml HLTM in mer, Chicago, Illinois)^Five Seed at cells / ml It was used to form the interstitial feed layer by seeding. Each dish has a culture source Illinois). 5% CO in air₂ Incubator at 37 ℃ for 24 hours And then the plate¹³⁷Irradiated with a dose of 12 Gray from a Cs source. The next day, the cells to be cultured were seeded onto this irradiated stroma for static culture experiments. Was. For interstitial bioreactor experiments, rinse the stroma-coated slides and It was placed on the inner bottom surface of the grooveless bioreactor vessel. Bioreactor culture. Place the culture chamber in polycarbonate plastic Made of stick, tubes and connectors made of Teflon, and peristaltic pump The tube used in the pump was made of silicone. This culture chamber is Had dimensions of. L: Chamber length 3.00 inches or 7.62 cm W: Chamber width 1.50 inches or 3.81 cm H: Chamber height 0.21 inches or 0.53 cm Af: Flow cross section (H W) 0.32 inch² That is 2.03 cm² V: Chamber volume (H L W) 0.95 inch^Three That is, 15.5 cm^Three The grooved bioreactor of the present invention also had the following dimensions: Y: Groove width 200 μm Z: Groove depth 200 μm Clean, sterilize all parts of the bioreactor and remove the pump tubing Used again. For clinical use, the bioreactor is a single-use, disposable It is understood that Deaf. Place the sterile bioreactor in a 37 ° C incubator (Ster fully assembled in icult, Forma Scientific). Replace the culture chamber In a rack with a uniform 10 ° accuracy from horizontal to facilitate bubbles exiting the system I put it. pH and dO₂ HLTM is then added to allow probe calibration. Circulated through the bioreactor. For these calibrations, a bioreactor First, CO for the first point of pH calibration₂ Was equilibrated with. Second, bio The reactor was charged with the second point of pH calibration and dO.₂ About calibration Equilibrated with air I let it. The bioreactor was then drained and 30 ml HLTM and 60 m l of 2X growth factor supplemented HLTM is injected and the pH controller is 7.35 ± 0. I set it to 05. Bioreactor prior to seeding of culture The culture fluid was almost completely drained from these three culture chambers per hour. Each bus 10.0 ml of 2 x 10 in each of the three chambers per io reactor^Five Cells / ml Cultures were seeded by injecting the mononuclear cell suspension of. Allow the cells to settle for 15 minutes , Then start the pump at about 0.2 ml / min, 0.5, 1.0, 1.5, 2. every 15 minutes. 0, and finally increased to 2.5 ml / min. At the same time, the static control culture was 100 mm polycarbonate containing 20 ml HLTM reinforced with the same growth factor Established in Petri dish. Bioreactor by replacing half of the culture medium Was replenished three times a week. The static culture was supplemented every 5 days. Bioreactor One of the three weekly supplements to the cultivated animals was performed at the same time as static culture, that is, one time of the culture. Made when the parts are harvested. The flow rate of the bioreactor was measured between each feed and the pH was measured by an external pH probe. (Corning). Cell counts are based on the medium removed from the culture. The Coulter Counter (Coulter Electronics) was used. Biolia One chamber per actor and one corresponding control culture were added to the fifth, tenth and Harvested on the 15th. Bioreactor cultures by draining the contents Harvest, wash once with 10 ml phosphate buffered saline (PBS), 1x cell release solution (Sigma) and a second rinse with PBS. This is washed out It was accomplished in the same way as the experiment. Harvest control culture with the same drain and rinse procedure did. The number of cells remaining in the culture vessel was adjusted to 1 by adding 10 ml of cetrimide. Estimated by rinsing and counting the nuclei with a Coulter Counter. Harvested The concentrated cell suspension was concentrated by centrifugation (1200 rpm for 15 minutes) and concentrated. And resuspended in about 10 ml of fresh HLTM. Cell counts from Coulter Co Performed by both unter and hemocytometer. Viability during hemocytometer counting It was measured by trypan blue dye exclusion. Colony assay is 1,000, 3,000 and 9,000 cells / ml for mononuclear cells , And for CD34 + cells at 500, 1,500 and 3,000 cells / ml. Stood up. These assays use 5% CO₂ 5% O₂ And balanced N₂ The atmosphere of At 37 ° C. in an incubator completely moistened with. 40x on the 14th day Colonies were scored using a stereo microscope (Nikon). Contains more than 50 cells White colonies were designated as colony forming unit granulocyte macrophages (CFU-GM ), A red colony containing more than 50 cells was selected as a burst forming unit. Mixed red as lithroid (BFU-E) and containing more than 50 cells Color and white colonies as colony forming unit mixture (CFU-Mix) Graded. Long term culture initiation (LTC-IC) assay is 1 x 10 per well^Five Illuminated 24-well tissue culture plate containing isolated (2,000 rad) allogeneic human bone marrow cells Established during Falcon. Cells assayed are for harvested mononuclear cells Is 5 × 10^Four And 2 x 10^Five For cells / well or harvested CD34 + cells 2.5 x 10^Four And 1 x 10^Five Cells / well were seeded. Each well has 2.0 ml LHT Contains M. 5% CO₂ 5% O₂ And balanced N₂ Completely wet in an atmosphere Cultures were incubated at 33 ° C in a grated incubator. culture The medium was replenished once a week by replacing half of the medium with fresh HLTM. Was. Collect the culture after 5 weeks Harvested and colony assay established at 15,000 cells / ml. These colonies -All colonies scored by the assay were considered LTC-IC colonies. Was. Flow cytometry is CD33 (Becton Dickinson) / CD34, CD11b (Becton Dickinson) / CD15 (Becton Dickinson), CD11b (Becton Dicki) nson): and Gly A (Amak, Inc.) stained, flow cytometry (FACSTA R). Static cultures were supplemented by replacement of half the culture medium every 5 days. Supply Despite the precautions taken during this, it was found that most or all of the cells were non-adherent. Inevitably resulted in some cell loss. The results of the three series of experiments are shown in Table 1 below. Explanation of symbols for Table 1 Stroma: Number of stromal cells initially seeded for stromal culture. PBMMNCells: seeded first in both stromal and non-stromal cultures Number of peripheral blood mononuclear cells. Flo-Grv: Bioreactor with flow-through groove of the present invention. Flo-Strom: Grooveless flow-through bio with stromal slide on the bottom reactor. Stat / Smooth: static control culture without stroma. Stat / Strom: static control culture with stroma. Cell number: Static culture and flow-through culture are performed until the 10th day, which is the period when the cell number is relatively low. Contained similar numbers of cells and colonies. On day 15, the number of cells was relatively high However, the results of static culture decreased, and flow-through culture was predominant. On the 15th day Comparing the results from both types of flow-through bioreactors, The number of cells in the reactor is the number of cells in the bioreactor with stroma (without groove) Was comparable to These results show that cell retention and proliferation at all time points tested. The grooved bioreactor is as good as the bioreactor with the stroma. It shows that a good grade is made. Colony forming unit: cultures from the grooved bioreactor at all time points In a large number of granulocyte macros comparable to cultures from the stromal layer bioreactor It contained a phage / colony forming unit (CFU-GM). After the fifth day , A cytokine mixture in the medium drives granulocyte / macrophage differentiation and erythropoiesis Designed to not drive blood, so erythroid cells in any culture And BFU-E were hardly detected. Long-term colony-starting cells: cultures from both types of bioreactors At the time points contained an equivalent number of long term colony starting cells. Viability: Cells from both types of bioreactors are scented at all time points. And contained an equal number of viable cells. The viability of the recovered cells is very good , 79-97% range. Media supernatant analysis: Media supernatant samples were tested for IL-6, GM-CSF, and tumor necrosis. Analyzed for factor-α (TNF-α) concentration. Different in cytokine concentration The lowest difference observed during the won. The concentrations of IL-6 and TNF- were about each in all cultures. 35 ng / ml and about 25 pg / ml (day 0) to about 50 ng / ml and about 50 pg / ml ml (day 10-15). The concentration of GM-CSF in the stroma-containing culture was About 20 pg / ml (day 0 before dropping to a lower level than the input) ) To the maximum on day 5 of about 60 pg / ml. In the stroma-free culture The concentration of GM-CSF is about 20 pg / ml (day 0) to about 5 pg / ml (day 0). 10-15 days). Overall, stroma-containing cultures are slightly less than stroma-free cultures. It showed a rapid increase in cytokine concentration. Furthermore, static culture is more effective than flow-through culture. It showed a slightly faster increase in cytokine concentration. Media supernatant samples were also tested for glutamine, ammonia, glucose and lactate concentrations. , And medium pH were analyzed. The glutamine concentration was approximately 0.9 mM ( Day 0) to approximately 0.7 mM (day 15), while in static culture Lutamine concentration almost stopped at the input level. In addition, the ammonia concentration is Increased from about 300 M (day 0) to about 600 M (day 10-15) in culture . This means that most of the small amounts of glutamine consumed are 37 ° C rather than consumed by cells. Suggesting that it is due to its decomposition in. However, including stroma In the culture, a substantial amount of glucose was consumed and lactic acid was produced, but This was not the case in the free culture. Glucose concentrations were About 240 mg / dl (day 0) to about 210 mg / dl for static culture (Day 15) and about 120 mg / dl (day 10). Correspondingly, interstitial inclusion Lactic acid concentration for perfusion culture and static culture About 20 mg / dl (day 0) to about 100 mg / dl (day 15) and about 150 mg / dl It increased to dl (15th day). Finally, the pH of the medium is 7.35 for perfusion culture. It was controlled to ± 0.05, but for static stromal-free culture and stromal-containing culture, , 7.35 (day 0) to about 7.25 (day 10) and 6.90 (day 10). I Other observations in various laboratories show that CFU-GM inhibits at pH below 7.20. Suggesting that (personal communication from Todd McAdams). In these studies , PH drop below 7.0 is due to static interstitial culture from day 10 to day 15. It occurred at the same time as the decrease in CFU-GM. Culturing of unselected mononuclear cells and CD34 + selected cells in a grooved bioreactor In the technique of hematopoietic cell culture, a certain proportion of CD34 + cells are transferred to the stroma or substrate. It is generally believed that they are stem cells that may require adhesion. Therefore, CD34 + selection Determining Whether Selected Cells Can Proliferate in the Groove of the Bioreactor of the Invention That is interesting. There is no stroma in the bioreactor of the present invention. The bike Oreactors can be formed from various types of plastic or allow cells to adhere. Can have a plastic surface treated as such. However, the following The bioreactor used in the experiment was one type of plastic, poly Carbonate (which contributes to cell adhesion because its surface charge is neutral It is believed that there is no. ) Is formed. A peripheral blood sample was obtained and the mononuclear cell suspension was prepared as described in Example 1 above. Was prepared. Departure sump by flow cytometry Phenotypic analysis revealed that peripheral blood samples originally contained 2-12% CD34 + cells That was shown. The CD34 + cells are prepared by first culturing the mononuclear cell suspension from CD34 + cells. Mouse monoclonal antibody (which is a CD34 cell surface antigen on CD34 + cells) Specifically bind to. ). Then Incubate paramagnetic beads coated with goat anti-mouse antibody with the cell suspension did. The paramagnetic beads are thereby directed against mouse antibodies on CD34 + cells. Via beads / CD34 + cells bound to CD34 + cells via binding of goat anti-mouse antibody. Form a vesicle complex. This bead / CD34 + cell complex was then loaded onto the whole cell population. Select by magnetic attraction. After washing, by enzymatic degradation with chymopapain Thus, CD34 + cells are released from the beads. The results of CD34 + selection are shown in Table 2 below. Is shown in. CD34 + cells were prepared as in Example 1 above except that none of the cultures contained a stromal layer. Were seeded in the bioreactor and in static cultures as follows. Experiments with unselected mononuclear cell preparations for CD34 + cells were referred to as CD34 + experiments. It was carried out in parallel. Human long-term medium containing 12.5% fetal bovine serum and 12.5% horse serum (HLTM ) Was prepared as described in Example 1. HLTM for hematopoietic culture Contains 150 U / ml IL-3 (R & D Systems, Minneapolis, Minn.), 40 ng / ml IL-6 (Sadoz, East Hanover, NJ), 50 ng / ml ml SCF (Amgen, Thousand Oaks, CA), and 150 U / ml Reinforced by G-CSF (R & D Systems). All reagents are Sigm unless otherwise noted. a (St. Louis, Missouri). Static culture was performed by Koller et al., 1993,BioTechnol11: 358-363 It was carried out in this way. Perfusion culture was performed as described in Example 1 above. Performed using a grooved bioreactor. The perfusion culture temperature was maintained at 37.0 ± 0.5 ° C. PH and dissolved oxygen (DO) data acquisition and control system , N₂ And CO₂ Controlled by a gas mixing unit with a separate port for Except that, it was as described in Koller et al., (Supra). Non-bonded 30 cm for sex cells² Occupies half of the surface area of Retained by the use of rectangular grooves (see Figures 1-3). The pH is CO in the gas flow to the headspace in the holding tank₂ Of air to air To change Was controlled to 7.35 ± 0.05 by and. DO at the medium outlet from the chamber Never fell below 90% of air saturation. 100 mm polycarbonate Petri dish (with a surface area of 30 cm)² With a spacer so that) Fixed culture is 5% CO in air₂ In a completely moistened incubator At 37 ° C. Perfusion and static culturing were initially performed at 2 x 10⁶ Mobilized peripheral blood mononuclear cells or 2 × 10^Five Any of the CD34 + cells were seeded (see Example 1 above). the first The cell densities of 3 were selected on day 15 to give approximately the same cell densities. First cultivation Volume is 120 ml (per 3 chambers) for perfusion culture and left undisturbed The culture volume was 20 ml (each). Circulation rate of medium in perfusion system Was gradually increased to 0-2.5 ml / min / culture chamber over 1.5 hours. A negligible number of cells or cell traps were observed at any time point. Perfusion The culture was performed by replacing half of the medium with fresh HLTM and cytokines. Was replenished three times a week. After each chamber is harvested, reduce the medium reservoir volume by 30 ml. I was a little. The static culture was carried out by culturing half of the medium every 5 days with fresh HLTM and cytokai. It was replenished by replacing Relationship between non-adherent cells in static culture The decrease in cell count was measured by cell counting based on the removed medium. For example, it was 19 ± 31%. One of three parallel cultures was sacrificed every 5 days for total cell number, cell viability, The CFU-GM and LTC-IC content, cell phenotype and morphology are described below. So evaluated. To prevent enzymatic damage of cells or cell surface markers, Tryp to harvest cells Shin was not used. Perfusion and static cultures can be performed by adding the cell suspension to a culture chamber or Was removed from the Petri dish and 10 ml of Ca⁺⁺And Mg⁺⁺Phosphate-buffered saline without CM (CM Rinse with F-PBS, Gibco, Grand Island, NY) and 10 ml Rinse with cell free solution (Sigma, No. C-5789) and 2 with 10 ml CMF-PBS. Harvested by rinsing twice. The cells were then washed and resuspended in HLTM . Trypan blue dye exclusion for cell counting and viability using a hemocytometer It was measured. This non-enzymatic harvesting procedure is based on the harvested culture chamber or petri dish. The nuclei liberated by rinsing with 10 ml of cetrimide were subjected to Coulter Counter model MHR ( Measured by counting at Coulter Electronics, Hialeah, FL) According to the results, more than 97% of the total cells were recovered. In addition, culture tea after harvest Microscopic examination of the liver and petri dishes revealed almost no cells left. Was. Morphology: Shandon Cytospin in a cytospin funnel^TM2 ( Pittsburgh, PA) at 1,000 rpm for 5 minutes, 5,000-50 Cytospin slides were prepared by centrifuging 1,000 cells. this These cells were then stained with Wright Giemsa (Harleco, Gibbstown, NJ ) For 30 seconds, followed by a 1 minute rinse with phosphate buffer. Then slide the buds Sphere, promyelocyte, myelocyte, posterior myelocyte, banded compartmentalized neutrophil, megakaryocyte, anterior The monocytes and the presence of monocytes were evaluated. The colony assay was performed as described in Example 1 above. 0. 8% methylcellulose colony assay medium, 150 U / ml IL-3,40 IL-6, 200 U / ml Granulocyte / Mc Rophage CSF (GM-CSF, R & D Systems), 150 U / ml G-CSF and And 10 / ml erythropoietin (Epo, Amgen). Fresh and cultured mononuclear cells Fresh and cultured CD34 + seeded in the range of 1,000 to 9,000 cells / ml Cells were seeded in the range of 500-4,500 cells / ml. The LTC-IC assay was performed as described in Example 1 above. 0th On the day, fresh mononuclear cells are 2.5 x 10^Four To 2.0 x 10^Five Cells / well plated, CD34 + Cells are 1.25 x 10^Four To 1.0 x 10^Five Cells / well were seeded. Cultured mononuclear cells To 5.0 x 10^Four To 2.0 x 10^Five / Well range, and cultured CD34 + 2. 5 x 10^Four ~ 1 × 10^Five Cells were plated in duplicate in a range of cells / well. The method described above (Smith, S.L. et al., 1993,Exp. Hematol.21: 870-877) The primary and cultured mononuclear cells and CD34 + cells were treated with CD33 using a slight modification of / CD34, CD11b / CD15 and CD11b / GlyA were evaluated. Summary The cells were then labeled with the following combination of monoclonal antibodies: PE-CD 33 (Becton Dickinson) / FITC-CD34 (8G12, Baxter Immunotherapy Div ision), PE-CD11b (Becton Dickinson) / FITC-CD15 (Becton Dic Kinson) and PE-CD11b / FITC-GlyA (Amak, Inc., Westbrook, Me. Province). Cells are then fixed with paraformaldehyde followed by FACScan^TMflow It quantified with a cytometer. CD33 antigen is paramagnetic in the selection of CD34 + cells Specified by chymopapain used to release CD34 + cells from beads. Is decomposed into. The productivity of perfused mononuclear cells and CD34 + cultures For each experiment 10⁹ Normalizing to an initial sample containing 1 mononuclear cell Compared by Standardized live of total cells, CFU-GM and LTC-IC Productivity was obtained for mononuclear cells (MNC) and CD34 + cultures for each experiment. Calculated by multiplying the result obtained by: Where M_MNC Is a multiplier for mononuclear cell culture, M_CD34Is CD34 + cell culture Is a multiplier for_MNC Is the initial number of mononuclear cells per culture, X_CD34 Is the initial number of selected cells per CD34 + cell culture. % CD34_MNC Is % CD34 + cells in mononuclear cells (before selection)_CD34Is CD34 + % Of CD34 + cells in selected cells and Ys is the yield of the selection step You. Data analysis: Perfused and static mononuclear cells and total cells in CD34 + culture, CFU. -Statistical analysis for the comparison of GM and LTC-IC takes the log of the results and then p It was carried out by using the aired Student's t-test. Perfusion and static mononuclear cells And statistical analysis for comparison of cell phenotypes in CD34 + cultures were performed using paired Studen It was performed using t's t-test. First 10 cultured as mononuclear cells or CD34 + cells⁹ Total cells generated by perfusion culture of individual mononuclear cell samples, CFU-GM and Statistical analysis for the comparison of This was done by taking a number and then using the paired Student's t-test. Day Data are reported as mean ± standard deviation (SD). The results are shown in Table 3 below. Explanation of symbols for Table 3 PBMMNCells: peripheral blood mononuclear cells CD34 + Cells: CD34 + selected cells Bioreactor No. 1 and No. 2: The grooved bioreactor of the present invention Perfusion culture used. Control No. 1 and No. 2: Static culture For mononuclear cells, there is a delay in the range of 5-10 days before significant proliferation is observed. there were. In perfusion culture and static culture, at 9.2x and 8.2x on day 15, respectively. The average maximum expansion was obtained. Cell viability for perfusion and static cultures Were 95 (± 5)% and 96 (± 5)%, respectively. Perfused mononuclear cell cultures and static mononuclear cell cultures were similar to CFU-GM over 15 days. Giving the expansion, the maximum expansion was seen on days 10-15. For both perfusion and static culture A 19-fold expansion of CFU-GM was obtained. Average of cells that gave CFU-GM Fractions (0.4% on day 0) were collected on day 5 for perfusion and static cultures, respectively. It peaked at 4.6% and 5.2%. BFU-E and CFU-Mix are 6 Was observed in perfusion and static cultures for only one of the experiments. The other five , A small number of BFU-E were observed before the 10th day, and CFU-Mix Was not observed beyond day 0. Perfused mononuclear cell culture is better than static culture of primitive LTC-IC for 15 days Maintained at. Perfusion was performed by using the average number of LTC-IC as 123% of the input number on the 15th day. (183% in 10 days). But in two of the experiments, the expansion Only was observed. In contrast, static culture had the same number of LTC-IT as day 15 Was maintained at 74% (89% on day 10) and only 6 of dilation were observed. There was only one in the experiment. The fraction of cells that produce LTC-IC is For typhoons, the average was 0.15% on day 0 to 0.02% on day 15 or less. It continued to decline. Perfusion-cultured mononuclear cells are more primitive than statically-cultured cells. Had a phenotype. Cells in perfusion culture are longer than cells in static culture. CD34 + population was maintained (Table 4). In addition, CD11b^- / CD15^- The (immature cell) fraction was consistently large during perfusion. Kiku, meanwhile, CD11b⁺ / CD15⁺ Fractions of mature granules (maturing granulocytes) And was consistently large (Table 5). Less than 3% of cells in perfusion and static cultures have Glycophorin A ( Erythrocyte marker, data not shown). Importantly, mononuclear cells and CD Cells in perfused cultures of 34+ cells were also associated with significantly different initial composition. Nonetheless, the morphology was similar after 10 days (Table 6 below). Perfused and static CD34 + cell cultures showed continuous expansion of total cells over 15 days (Table 3 above). The average maximum of 113x and 84x on day 15 in perfusion and static culture, respectively. Great expansion was obtained. The low average expansion in static cultures is, in part, part of the culture. This is due to the very low proliferation in one. Interestingly, from this sample Static mononuclear cell cultures also gave low expansion, while both perfusion cultures gave normal cell proliferation. . Cell viability for perfusion and static cultures was 96 (± 5)% and 92, respectively. It was (± 11)%. Greater expansion and better maintenance of CFU-GM counts in perfusion cultures. There was a direction. For perfusion culture and static culture, increase 18-fold and 11-fold on day 15 respectively. The maximum CFU-GM extension was obtained. Fraction of cells producing CFU-GM (No. (4.7% on day 0) was measured on day 5 in perfusion and static cultures, respectively. , Peaked at 10% and 11%. Expansion of BFU-E and CFU-Mix Observed only in 1 out of 6 experiments in flow and static cultures won. In the other five experiments, a small number of BFU-E were observed on day 15 and C FU-Mix was not observed beyond day 0. Perfused CD34 + cell cultures maintain LTC-IC better than static cultures did. Perfusion expanded average number of LTC-ICs to 135% of input on day 15 did. However, expansion was only observed in two experiments. In contrast, static cultures On the 15th day, the LTC-IC could maintain only 72% of the input number and expanded by 6%. It was observed in only one of the experiments. Fine to produce LTC-IC The spore fractions ranged from 1.6% on day 0 to 0.02% on day 15 for both types of culture. It decreased continuously. CD34 + cells in perfusion had a similar phenotype to cells in static culture . Perfusion tended to maintain the CD34 + population longer, whereas CD33 +, CD11 The approximations were for b − / CD15 −, and CD11b / CD15 + cells. Average Thus, in any culture, less than 3% of the cells contained GlyA at any time. Expressed. Initially, CD34 + cells were predominantly blasts. The blast fraction is rapid , And by day 10, the cultures had predominantly granulocytic and monocytic cells. Inclusive. Interestingly, poor expansion of cells, CFU-GM, and LTC-IC Cultures marked with contained mainly monocytes. Comparison of mononuclear cell perfusion culture and CD34 + cell perfusion culture: We compared the performance of cultures initiated with mononuclear cells and CD34 + cells to perfusion cultures. limit. As described above, for well grown samples, perfusion cultures were The body was equal to or better than static culture. In addition, perfusion cultures Providing at least limited expansion of samples that failed to grow in static culture. I served. The mononuclear cells and CD34 + cells used to start the culture have a very different phenotype. However, cells in these two perfusion cultures had similar levels after 10 days in culture. CD34, CD33, CD11b of Le⁺ / CD15⁺ , And CD11b^- / CD15^- Express did. Of CD34 + cells at day 15 in mononuclear cells and CD34 + cell culture Fractions were 0.6% and 0.4%, respectively, whereas CD33 + fractions were 46%. And 45%. In contrast, used to seed these cultures Populations were 6.3% and 90.9% CD34 +, respectively. Mononuclear cells and CD34 + cells CD11b on day 15 in culture^- / CD15^- The cell fraction that is (immature cells) is 19% and 22% respectively, while CD11b⁺ / CD15⁺ (Mature cells) The cell fraction was 58% and 54%. In contrast, used to seed these cultures The populations are 27% and 87% CD11b, respectively.^- / CD15^- And 47% and 4% CD 11b⁺ / CD15⁺ Met. In addition, typical perfusion cultures of mononuclear cells and CD34 + cells Two-dimensional flow cytometry of CD33 / CD34 and CD11b / CD15 expression during feeding Lee analysis revealed a significantly similar cell population after 5 days. Initially, CD34 + cells, with some monocytes and very few granulocytic cells, Whereas it contained predominantly blasts, mononuclear cells were predominantly condylar with some blasts. It contained granulocytic and monocytic cells. However, after 10 days of perfusion, both Both cultures contained predominantly granulocytic cells with a large fraction of monocytic cells . The predominance towards the granulocyte lineage is greater than that shown in Table 6. because , (1) Mature granulocytes have a short half-life in culture even in the presence of G-CSF. (2) unidentifiable cells (about 10% of the total cells) with monocytes And (3) immature megakaryocytes were monocytes using Wright-Giemsa staining Because it is not distinguished from. Therefore, perfusion culture of peripheral blood mononuclear cells and CD34 + cells For the growth factor combinations used, along the granulocyte lineage in a similar fashion. Seems to mature. Generate CFU-GM and LIT-IC initiated in mononuclear cells and CD34 + cells The cell fractions were also similar after 10 days of perfusion culture. CFU-GM-producing cell fractions were detected on day 10 in the field of mononuclear cells and CD34 + cells. 2.9% and 2.5%, respectively. This is 0 for each of the 0th days. Contrast with 4% and 4.7%. The cell fraction producing LTC-IC was For mononuclear cells and CD34 + cells, 0.10% and 0.043%, respectively. Was. Again, this is in contrast to day 0, 0.15% and 1.6%, respectively. Total number of cells obtained from perfusion culture of peripheral blood samples cultured as mononuclear cells, CFU-GM and LTC-IC were cloned into CD34 + cells and selected. It was larger than what could be obtained for the pull (Table 7). The maximum numbers of total cells, CFU-GM and LTC-IC are 15th, 10th and 15th, respectively. And 10 to 15 days. Culture results obtained for each experiment, initial cell load, and The yield of CD34 + cell selection was used to determine the perfusion seeded with mononuclear cells. The flow culture was carried out at day 15 in comparison with the selective culture of the CD34 + fraction. And gave 1.5 times, 2.6 times and 2.1 times total cells, CFU-GM and LTC-IC. (See "Data Analysis"). 100% CD34 + selection for each of the experiments Assuming selection, the production from mononuclear cells (MNCs) at day 15 is CD34 + cells. Equivalent, CFU-GM and LTC-IC for total cells as compared to cells. Are 1.5 times and 1.4 times respectively. However, these differences are not significant Would be. Harvest on day 10 would be optimal. Because 10th and 15th day Between, the CFU-GM number, which is an indicator of transplant quality, is essentially While unchanged, the fraction producing CFU-GM in total cells was This is because it is more than three times higher. In addition, the LTC-IC number in mononuclear cell culture was In 3 out of 6 experiments, larger on day 10 compared to day 15, It was equivalent in the other two. Seed mononuclear cells for harvest on day 10. The seeded perfusion cultures were 1.8 times greater than those seeded with CD34 + cells, respectively. Will give 2.4 and 4.8 times more total cells, CFU-GM and LTC-IC . Discussion Expansion of total cells and CFU-GM was initiated by either peripheral blood mononuclear cells or CD34 + cells. It was also obtained in the static culture and perfusion culture that were started. Perfusion CD34 + cell culture and perfusion Flow mononuclear cultures favored LTC-IC better than static cultures for 15 days . Other researchers have used tissue culture flasks (McAlister IB, et al.,Exp Hematol 20: 626-628, 1992; Haylock DN, et al.,Blood80: 1405-1412, 1992; Sato, N., et al.,Blood 82: 3600-3609, 1993; Brugger, W., et al.,Blood8 1: 2579-2584, 1993), in a gas permeable culture bag (Takaue Y, et al.,A nn Hematol 64: 217-220, 1992; Lemoli RM, et al.,Exp Hematol20: 259-275 , 1992), and in the perfusion system (Koller, MR, et al.,Bio / Technol11 : 358-363, 1993; Palsson, BO., Et al.,Bio / Technol 11: 368-372, 1993; Kol ler, MR., et al.,Blood82: 378-384, 1993), regarding the extension of CFU-GM, Large scale cultures of mononuclear cells or CD34 + cells were tested. In most of these studies , The largest CFU-MG expansion was found between day 7 and day 14. About mononuclear cell culture The 19-fold maximal CFU-GM expansion obtained was reported for peripheral blood mononuclear cells (P BMNCs) (Takaue et al., Supra; McAlister, et al., Supra) 3.8 times or more. This is equivalent to 16 times expansion. In contrast, 11x and 18x for CD34 + cell culture The maximum CFU-GM expansion was 57 for previously reported peripheral blood CD34 + cells. 2-fold to 190-fold expansion (Haylock DN, et al., Supra; Sato N, et al., Supra; Brugge r W. et al., above). However, these large CFU-GM extensions Using a combination of 5 or 6 growth factors On the other hand, expansion of CFU-GM in mononuclear cell culture has been shown to be enriched by two or three species. It has been obtained using a combination of breeding factors. For example, Haylock et al. Blood CD by IL, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF and SCF We report a maximum CFU-GM expansion of 66-fold after 14 days of 34+ cell culture. . They found that six of these 31 different growth factor combinations analyzed That the combination of growth factors gave maximum CFU-GM expansion after 7 days in culture. Reporting. Their optimal combination was used by McAlister et al. A combination of three factors, IL-3, GM-CSF and CSF (actually PIX Y321 (GM-CSF and IL-3 fusion protein) and SCF), Five times larger CFU-GM was given. The ratio remained the same for 14 days of culture Assuming that, the maximum CFU-GM extension will decrease from 66 times to 13 times ( This is close to the 16-fold expansion reported by McAlister et al.). Similarly, Sato et al. IL-3, IL-6, G-CSF from highly generated peripheral blood CD34 + cells , 57-fold expansion of CFU-GM after 7 days of culture with GM-CSF and SCF Has been reported. However, IL-3, IL-6, G-CSF and SCF Therefore, the expansion was only 25-fold, which is the same for the present invention using the same cytokines. It was similar to the CFU-GM extension obtained. Brugger et al. C in peripheral blood CD34 + cell culture with L-3, IL-6, Epo and SCF A 190-fold expansion of FU-GM has been reported, but various 4-factor cytokine combinations have been reported. If Gase and G-CSF are also used, only 20 to 40 times expansion can be obtained. Was. Differences between the results from various investigators on CD34 + cell culture are also noted in the supplementation process. Tokor (eg, how to deal with depletion), how to select CD34 + cells May be due to differences in method and culture medium used, and source of sample Absent. Normal donor and chemotherapy and / or growth factor therapy for the latter item A peripheral blood sample from a cancer patient mobilized by was used. From these sources Peripheral blood can vary greatly in the fraction of primitive cells. For example, Brugge r is only 0.2 of CD34 + cells obtained from chemotherapy and G-SCF mobilized blood. Only% showed that it formed CFU-GM colonies. This is 5% of CD34 + cells obtained from blood mobilized with clophosphamide and G-SCF Study) and 7.6% of CD34 + from normal blood (Sato et al., Supra). You. Given the large number of factors that modify cell expansion, the same cell source and Directly compare the effects of any particular parameter using the same protocol It is best to Interestingly, the method of the present invention was used to seed mononuclear cells or CD34 + cells. The resulting cultures were significantly closer after 10 days in culture. Observed in cell phenotype These changes are due to bone marrow culture (Smith SL, et al.,Exp Hematol21: 870-877, 1993) And cord blood culture (Terstappen LWMM, et al.,Leukemia6: 1001-1010, 1992) Was followed by a similar pattern of myeloid differentiation. Myeloid differentiation In the early stages of, CD34 + cells acquire CD33 and lose CD34. The cells can be further differentiated and they mature towards neutrophils, CD15, followed by CD11. Those who acquire b, while maturing towards monocytes, have CD11b and then CD15 To win. This is CFU-GM present in expanded cell population is that present in uncultured cells. Suggests that it may be more mature than the others. Many before maturity Infusion of carcinogenic cells has the potential to reduce the extent and length of cytopenia after transfusion . Due to the similar cell population produced, perfusion cultures of monocytes and CD34 + cells Direct comparisons can be made by cell mass, CFU-GM and LTC-IC production. Wear. After 15 days in perfusion culture, mononuclear cells were selected and cultured as CD34 + cells. 1.5 times 2.6 times and 2.1 times more total cells, C, respectively, compared to the same sample Produced FU-GM and LTC-IC. If the selection process of CD34 is 100% effective The production of CFU-GM, even at a rate, is more mononuclear than for CD34 + cells. 1.5 times bigger about a sphere. This difference is not due to the losses that occurred during the selection process. It looks like Because, considering the yield of CD34 selection, 100 (± 100) % CFU-GM and 70 (± 30)% LTC-IC are recovered. . CFU-GM from mononuclear cell cultures despite the initial cell population and culture conditions Production will not exceed that from CD34 + cells, but our results show that Selection of CD34 + cells is not required to obtain CFU-GM expansion of Is clearly demonstrated. Is CD34 cells still desirable for reasons other than increasing cell expansion? I don't know. Recently, tumor cells in the breast (Ross AA, et al.Blood82: 2605-2610 , 1993) and small cell lung cancer (Brugger W, et al.,Blood 83: 646-640, 1994), It has been shown to be capable of mobilizing into peripheral blood with hematopoietic progenitor cells. Bone marrow cell culture Based on the selective loss of leukemic cells (Da WM, et al.,Brit J Hemato l 78: 42-47, 1991; Testa NG, et al.,Hematol Blut Transfus31: 75-78, 1987; Barnett MJ, et al.,Bone Marrow Transplant 4: 345-351, 1989), ex vivo culture It can be expected that nourishment will deplete non-hematopoietic tumor cells. However, offers further exile In order to do so, selection of CD34 + cells is still necessary. The stem cells of the original site are bone It is not required for reconstitution after myelination therapy, but during mobilized blood Decreased LTC-IC counts can have a deleterious effect on long-term reconstitution after bone marrow ablation therapy You. Under these conditions, expanded cells (to provide a large number of mature progenitor cells) It would be best to combine the cells with uncultured cells. In this respect, the selection of CD34 is Reduced total dose for transplantation with uncultured cells and in allogeneic cases Regulates GVH disease. Finally, the cultured CD34 + cells are used for gene therapy. Can increase the efficiency of transfection. Static and rinse cultures had similar mean totals for both mononuclear and CD34 + cell cultures. Cells and CFU-GM expansion were given. In fact, consider a reduction in the number of cells during replenishment In some cases static cultures were performed for total cells for both types and for mononuclear cells. It will give a larger average expansion of CFU-GM. However, The correction of the number reduction is (1) representative of uniform cell sampling of the removed cells, 2) these cells are returned to the culture or seeded in a further culture, and (3) the cells It has been postulated that the return of C. does not affect the culture performance. Stationary and irrigation Approximate total cells and CFU-GM production in flowing peripheral blood mononuclear cell cultures during irradiation Contrast with the results for qualitative cord blood mononuclear cells (CB MNCs). Place of the latter In this case, the total cell production was greater and the expansion of CFU-GM was in static culture (Koller et al., 1993, supra) was twice as large in perfusion cultures . We also show that peripheral blood mononuclear cells cultured on irradiated stroma (see Example 1 above) We also observed an increase in total cell and CFU-GM production in perfusion versus static culture of spheres. . A better relative performance for static culture in the absence of stromal cells is It may be due to the low metabolic requirements of mononuclear cells compared to cells. However Et al., In a static culture of a peripheral blood sample that showed greater cell expansion. It should be noted that no relative decrease in No. The main advantage of perfusion culture was very poor performance in static culture Those samples were at least limited in perfusion (and in most cases positive) That is to say that it showed a (normal) extension. In addition, perfusion cultures were performed with LTC-IC numbers Static culture (this is applied to peripheral blood and cord blood mononuclear cells on irradiated stroma) This is in agreement with the results (Koller, et al., 1993, supra). ) Better than Maintained. For expansion of progenitor cells for transplantation, the perfused bioreactor should be Better than cell culture or flask culture. Because they have the desired culture conditions Maintenance, minimizing the chance of contamination during supplementation and scaling up for clinical applications Easier and more current and anticipated Food and Drug Administration (FDA) regulations This makes it easier to meet the regulations. In 1992, the FDA generally A group of rules known as CFR section 211 (21 CFR 211) It was stated that it can be legally applied to liquid handling companies. CFR 211.22 is quality He has ordered the installation of a management unit, whose head must be different from the manager of the transfusion center. I have to. FDA high Maru-regulatory activities also apply to autologous lymphocyte therapy and cell therapy such as bone marrow transplantation. Is expected. Ex vivo expansion of hematopoietic cells is most certainly due to 21 CFR 211. Will be managed. When conforming to GMP regulations, the material Representative samples are needed for quality control, while at the same time closed culture A system is highly desirable. Therefore, an irrigation designed with the ability to remove the siphon. Flow bioreactors are particularly suitable for processing under GMP regulations. Ba The biggest advantage of the Io Reactor system, however, is the area of validation. Exists. Validation, a requirement implied in 21 CFR 211.100, is problematic. Is consistently and reproducibly manufacturing products of specified quality and specifications. It consists of establishing documented evidence. The results obtained for total cells and CFU-GM expansion are therapeutic of cultured hematopoietic cells. Determine the size of the first mobilized blood sample and culture system needed for the application It can be used to make an estimate. Rapid neutrophil implantation using peripheral blood cells 20 x 10 for^Four CFU-GM / kg body weight therapeutic doses have been suggested ( Bender JG, et al.,J Hematotherapy 1: 329-341, 1992). For an 80 kg individual, 16 x 10⁶ CFU-GM will be required. 3.8 x 10⁹ Uncultured mobilization Culture with blood mononuclear cells or IL-3, IL-6, G-CSF and SCR for 15 days 0.21 × 10⁹ 16 × 10 mononuclear cells⁶ Would be needed for one CFU-GM. This culture system should be at least 2 x 10⁹ Must contain one cultured mononuclear cell Must. Neither culture showed any signs of limiting cell growth by cell density. Therefore, the maximum cells obtained for perfusion culture and static culture Density is estimated by dividing the maximum number of cells obtained per culture by the culture area. Can be found. The maximum obtained in perfusion was that cells were only present in the groove 15 cm, assuming² 48 × 10 on culture area⁶ Pieces, i.e. 3.2 x 10⁶ Pieces / c m² Met. The maximum obtained in static culture is 30 cm² 45 × on the culture area of Ten⁶ Pieces, i.e. 1.5 x 10⁶ Pieces / cm² Met. Under these conditions, irrigation Flow system is 625 cm² , While static culture is 1350 cm² (Ie T -Equivalent to 6 250 culture flasks). In perfusion culture to get the upper limit A similar calculation for the sample showing the lowest CFU-GM fraction on day 15 of Can be implemented. This is 15 for perfusion culture and static culture, respectively. 00 cm² And 15,000 cm² Give an estimate. Example 3 Umbilical cord blood alone in a smooth perfusion chamber vs. a groove versus a perfusion chamber chamber Nuclear ball A suspension of cord blood (CB) mononuclear cells was prepared as described in Example 1. did. Cytokine concentrations were as in Example 1 for all cultures. Perfusion culture The nutrient and static culture were as in Example 2. The culture medium was HL as in Example 1. 12.5% of preselected lots of fetal bovine serum and horse serum, respectively. Inclusive. Interstitial-free umbilical cord reinforced with IL-3, IL-6, G-CSF, and SCF Blood monocyte cultures are performed in smooth perfusion culture chambers and grooved bioreactors of the invention. It was carried out in. Control static cultures were performed in Petri dishes. In this series of experiments No stroma was used. The results are shown in Tables 8 and 9 below. Description of symbols for Tables 8 and 9 CD MNCs: cord blood mononuclear cells Smooth: Perfusion culture, smooth-bottomed chamber, no stroma (Koller, et al., 1993, above) Grooved: Perfusion culture using the grooved bioreactor of the present invention. Control: static culture in Petri dishes. There is no stroma. Perfusion culture in a grooved bioreactor is similar to culture in static culture. It showed similar cell expansion. However, perfusion culture in smooth chambers Only half the cell expansion of a perfused bioreactor in an attached bioreactor Did not show. Few cells, if any, in the grooved chamber (but flat Evidence from not found in cell trap after (not in synovial chamber) Wash out few cells, if any, from the grooved chamber Was not done. Viability is 20% for cells found in the cell trap. Was. Perfusion culture in a grooved chamber is better than static culture in Petri dishes Large CFU-GM, BFU-E, and CFU-Mix extensions were given. 22 times, Maximum CFU-GM expansion of 10x and 13x, each grooved on day 10 Obtained from cultures in chambers, smooth chambers, and petri dishes. Further The maximum CFU-Mix extensions of 6.2x, 4.9x and 6.7x are on day 5 Culture in grooved chambers, smooth chambers and petri dishes, respectively. Obtained from This gave 57% erythroid on day 5 from 3 cultures. Containing colonies (eg BFU-E and CFU-Mix), 35 at day 10 Colonies containing% erythroid, and at day 15 only 10% Resulted in a colony type distribution with colonies containing only sroids . Finally, a similar distribution of colony types and grooved and smooth chambers As evidenced by the cell fraction that produces CFU-C in culture For example, smooth chambers do not retain certain cells preferentially over others Seemed like.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者パプツァキス，イー，ティーアメリカ合衆国60025イリノイ、グレンビュー、ウォーキーガンロード 705、ナンバー404 (72)発明者ミラー，ウィリアム，エムアメリカ合衆国60201イリノイ、エバンストン、アスベリーアベニュー 2204 (72)発明者ベンダー，ジェイムス，ジーアメリカ合衆国60046イリノイ、リンデンハースト、ホワイトバーチ 565────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), AU, CA, JP (72) Inventor Paptzakis, Yi, Tee United States 60025 Glenbi, Illinois Ew, walkie gun road 705, nan Bar 404 (72) Inventor Miller, William, M United States 60201 Evans, Illinois Ton, Asbury Avenue 2204 (72) Inventor Bender, James, Gee United States 60046 Linden, Illinois Hearst, white birch 565

Claims

[Claims] 1. Flow-through bioreak for cell retention and culture in perfused medium And A whole having a longitudinal axis, having a lid and a bottom wall connected to the side wall and the end wall; And include a rectangular container, The lid was connected to an inlet port connected to the inlet slot and an outlet port An inlet slot having an outlet slot to allow the flow of medium along the longitudinal axis of the container And an outlet slot is located at the opposite end of the lid, The bottom wall has an inner surface, the inner surface having a plurality of widths, depths and lengths; As rectangular grooves, the grooves having their lengths relative to the longitudinal axis of the container. It is arranged so that it is in the transverse direction, Bioreactor. 2. The flow-through bypass of claim 1, wherein the groove has a width: depth ratio of about 1: 1. Oreactor. 3. The groove has a width of about 50 μm to about 5,000 μm and a depth of about 50 μm to about 5,000 μm. The flow-through bioreactor according to claim 2, wherein the flow-through bioreactor comprises: 4. The groove has a width of about 200 μm and a depth of about 200 μm. The once-through bioreactor of paragraph 3. 5. The flow-through bypass of claim 1, wherein the groove has a width: depth ratio of about 2: 1. Oreactor. 6. A method for culturing hematopoietic cells, the method comprising: 6. Place in the bioreactor of any of claims 1-5 and place the cells in the bag. A method comprising culturing in a medium that is perfused through an ioreactor. 7. The cell suspension contains hematopoietic mononuclear cells that are unselected for CD34 + cells 7. The method of claim 6, which is 8. The cell suspension comprises selected hematopoietic stem / progenitor cells selected for CD34 + cells. 7. The method of claim 6, comprising.