JPH09297135A - Immunologic detection of gene - Google Patents
Immunologic detection of geneInfo
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- JPH09297135A JPH09297135A JP11342396A JP11342396A JPH09297135A JP H09297135 A JPH09297135 A JP H09297135A JP 11342396 A JP11342396 A JP 11342396A JP 11342396 A JP11342396 A JP 11342396A JP H09297135 A JPH09297135 A JP H09297135A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、抗体を利用した遺
伝子の検出方法に関するものであり、免疫学、分子生物
学、診断学などの広い分野での利用が可能である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting a gene using an antibody, and can be used in a wide variety of fields such as immunology, molecular biology and diagnostics.
【0002】[0002]
【従来の技術】近年の遺伝子工学の進歩に伴い、遺伝子
そのものに基づく診断(遺伝子診断)が可能となってく
るとともに、微量の遺伝子を大幅に増幅する方法が数多
く考案されてきた。これらの方法を使用することにより
試料中の微量な遺伝子を増やすことが可能になった。遺
伝子増幅法として最も良く知られているのはPCR(ポ
リメラーゼ・チェイン・リアクション)法である。この
方法は目的遺伝子を含む領域の3’側と5’側の遺伝子
配列に相補的な遺伝子断片(プライマー)を調製し、そ
れを遺伝子の材料である塩基とともに試料と混合し、D
NAポリメラーゼと言う遺伝子合成酵素を働かせて目的
遺伝子を合成する方法である。この方法は、(1)熱変
性によるDNA2本鎖の解離、(2)プライマーとのア
ニーリング、および(3)DNAポリメラーゼによる相
補鎖合成、の3反応の繰り返し(通常20〜30サイク
ル)からなる。このとき2本鎖の遺伝子を熱をかけて1
本鎖に解離するのであるが、使用するDNAポリメラー
ゼを耐熱菌由来のものとすることによって、1サイクル
ごとに新たにDNAポリメラーゼを補給することなく、
温度変化のみによる反応の繰り返しによって遺伝子増幅
を行うことが可能となった。この方法を用いることによ
り目的遺伝子を何十万倍、何百万倍にも増幅することが
できる。2. Description of the Related Art With recent advances in genetic engineering, it has become possible to make a diagnosis based on the gene itself (gene diagnosis), and many methods for greatly amplifying a small amount of gene have been devised. By using these methods, it became possible to increase the trace amount of genes in the sample. The best known gene amplification method is the PCR (polymerase chain reaction) method. This method prepares a gene fragment (primer) complementary to the gene sequences on the 3'side and 5'side of the region containing the target gene, mixes it with a base as a material of the gene, and mixes it with a sample.
This is a method of synthesizing a target gene by activating a gene synthesizing enzyme called NA polymerase. This method consists of repeating three reactions (usually 20 to 30 cycles) of (1) dissociation of a DNA double strand by heat denaturation, (2) annealing with a primer, and (3) synthesis of a complementary strand by a DNA polymerase. At this time, heat the double-stranded gene to 1
Although it dissociates into single strands, by using a DNA polymerase derived from thermostable bacteria, it is possible to supply DNA polymerase without replenishing it every cycle.
It became possible to carry out gene amplification by repeating the reaction only by the temperature change. By using this method, the target gene can be amplified hundreds of thousands times and millions of times.
【0003】現在ではこの増幅法を自動的に行うサーマ
ルサイクラーという機器も数多く販売されており、医
学、診断学、分子生物学等の分野で広く使われている。At present, a large number of devices called thermal cyclers for automatically performing this amplification method are on the market, and are widely used in the fields of medicine, diagnostics, molecular biology and the like.
【0004】[0004]
【発明が解決すべき課題】上述したように、簡便に遺伝
子を増幅する方法は確立しているが、増幅した遺伝子を
検出する方法としてはいまだに電気泳動法がその主流と
なっている。これはポリアクリルアミドなどのゲルに試
料を添加し電気泳動を行いその後染色して遺伝子の有無
を確認する方法であり、手間も時間もかかる方法であ
る。その為遺伝子の増幅は数時間で終了するにも拘わら
ず、遺伝子の検出工程に時間がかかるため全体的な遺伝
子検出にかかる時間は2、3日になってしまっている。
また多検体の処理には向いておらず、臨床診断の分野で
の遺伝子診断法が普及しない理由の1つとしてこの遺伝
子検出法が手間がかかると言うことがある。近年HPL
C(高速液体クロマトグラフィー)やキャピラリー電気
泳動で増幅した遺伝子を検出することが試みられている
が、多検体を処理しようとするときこれらの方法は有効
ではない。As described above, a method for easily amplifying a gene has been established, but as a method for detecting the amplified gene, the electrophoresis method is still the mainstream. This is a method in which a sample is added to a gel such as polyacrylamide, electrophoresed, and then stained to confirm the presence or absence of a gene, which is time-consuming and time-consuming. Therefore, although the amplification of the gene is completed in several hours, the gene detection process takes a long time, so that the overall gene detection time is a few days.
In addition, it is not suitable for processing a large number of samples, and one of the reasons why the gene diagnosis method in the field of clinical diagnosis is not popular is that this gene detection method is troublesome. HPL in recent years
Attempts have been made to detect genes amplified by C (high performance liquid chromatography) or capillary electrophoresis, but these methods are not effective when trying to process multiple samples.
【0005】また、増幅しない遺伝子の検出方法につい
ても同様の問題があると同時に、微量の遺伝子を検出す
るための高感度な遺伝子検出方法が望まれている。Further, there is a similar problem in the method of detecting a gene that is not amplified, and at the same time, a highly sensitive gene detecting method for detecting a trace amount of gene is desired.
【0006】一方、遺伝子の検出法としては、特表昭6
3−502875号で示された目的遺伝子と相補的な遺
伝子を固定化した粒子を使用して粒子の凝集から目的遺
伝子の存在を確認しようとする方法がある。また特開平
3−264863号ではこの方法を改良して粒子の相補
的な遺伝子断片と目的遺伝子との結合を2本鎖を認識す
る抗体を用いて増強する方法が開示されている。しかし
ながら、これらの発明では目的遺伝子は1本鎖でなくて
はならない。遺伝子、特にDNAは通常2本鎖の状態で
存在しており、遺伝子増幅を行った後の目的遺伝子も2
本鎖の状態で存在する。この試料を使用してこれらのア
ッセイを行おうとすると、一度高温で試料を処理して遺
伝子を1本鎖にする必要がある。しかし、その後にこれ
らの処理を行おうとしても試料中には目的遺伝子と相補
的な関係にある遺伝子が同量存在しており、粒子上の遺
伝子断片と競合反応を起こし、その多くはもとの2本鎖
に戻ってしまうという欠点がある。そこに抗体を添加し
ても何ら効果のないことは明らかである。[0006] On the other hand, as a method for detecting a gene, Japanese Patent Publication No.
There is a method of confirming the presence of a target gene from particle aggregation by using particles having a gene complementary to the target gene shown in No. 3-502875 immobilized. Further, JP-A-3-264863 discloses a method improved on this method to enhance the binding between a complementary gene fragment of a particle and a target gene by using an antibody recognizing a double chain. However, in these inventions, the target gene must be single-stranded. Genes, especially DNA, usually exist in a double-stranded state, and the target gene after gene amplification is also 2
It exists in a single-stranded state. Attempts to perform these assays using this sample require treatment of the sample once at elevated temperature to render the gene single stranded. However, even if these treatments are to be performed thereafter, the same amount of the gene that is complementary to the target gene is present in the sample, and it causes a competitive reaction with the gene fragment on the particle. There is a drawback that it returns to the double strand of. It is clear that adding an antibody there has no effect.
【0007】また、特開平4−286957号では、2
本鎖遺伝子を認識する抗体を使用した遺伝子検出法の技
術が開示されている。この方法を用いても粒子凝集によ
る遺伝子の検出は可能ではあるが、その実施はかなり困
難なものになると予想される。遺伝子は4種類の塩基の
配列によってその情報が保存されている。つまり遺伝子
の構成成分としては4種類の塩基しかないので、特定の
塩基配列にしか反応しない抗体を作成するのは困難であ
り、ある遺伝子配列を認識する抗体はそれと良く似た別
の遺伝子配列の部分とも反応してしまう。この現象を交
差反応といい、遺伝子を認識する抗体の大きな問題とな
っている。Further, in Japanese Patent Laid-Open No. 4-286957, 2
A technique of a gene detection method using an antibody that recognizes a single-stranded gene has been disclosed. Although it is possible to detect genes by particle aggregation using this method, it is expected to be quite difficult to carry out. Information on a gene is stored by the sequences of four types of bases. In other words, since there are only four types of bases as a component of a gene, it is difficult to make an antibody that reacts only with a specific base sequence, and an antibody that recognizes a certain gene sequence has a similar gene sequence to that of another gene sequence. It also reacts with the part. This phenomenon is called cross-reaction, and it is a major problem of antibodies that recognize genes.
【0008】本発明は、簡便で迅速な遺伝子を検出する
方法を提供することを目的とする。また、安全で高感度
な検出系を提供することを目的とする。The object of the present invention is to provide a simple and rapid method for detecting a gene. Moreover, it aims at providing a safe and highly sensitive detection system.
【0009】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記事情に
鑑み、鋭意研究の結果、2本鎖の遺伝子を検出すること
ができ、なおかつ特定の遺伝子に対して特異性の高い抗
体を得る方法を見いだした。In view of the above circumstances, the present inventors have earnestly studied, and as a result, obtain an antibody that can detect a double-stranded gene and that is highly specific to a specific gene. I found a way.
【0010】ある蛍光色素は2本鎖遺伝子の塩基対の中
に入り込み、非共有結合ながら強固に結合することが知
られている。これらの物質は一般的にインターカレート
試薬と呼ばれている。インターカレート試薬は遺伝子内
部に入り込んで結合するときに自身の高次構造を変化さ
せ、そのために蛍光色素であれば蛍光強度の変化や蛍光
波長の変化を生じる場合がある。本発明者は、このよう
なインターカレート試薬と結合した遺伝子を免疫源に用
いることによって、それまで特異性の低かった遺伝子を
高い特異性で認識できる抗体を得ることに成功した。[0010] It is known that a certain fluorescent dye penetrates into the base pair of a double-stranded gene and strongly binds while non-covalently binding. These substances are generally called intercalating reagents. The intercalating reagent changes its higher-order structure when it enters inside the gene and binds to it, and therefore, if it is a fluorescent dye, it may cause a change in fluorescence intensity or a change in fluorescence wavelength. The present inventor has succeeded in obtaining an antibody capable of recognizing a gene having low specificity with high specificity by using a gene bound with such an intercalating reagent as an immunogen.
【0011】すなわち、本発明は、2本鎖遺伝子とイン
ターカレート試薬との複合体を認識する抗体を使用する
ことを特徴とする遺伝子の免疫学的検出法を提供する。That is, the present invention provides an immunological detection method for a gene, which comprises using an antibody that recognizes a complex of a double-stranded gene and an intercalating reagent.
【0012】本発明の遺伝子検出法は、免疫源として、
目的の2本鎖遺伝子の異なる部分にインターカレート試
薬を結合したものを用いて抗体を得る。得られた抗体を
固相に結合し、目的とする遺伝子あるいは増幅後の目的
遺伝子にインターカレート試薬を反応させた後、抗原抗
体反応させることにより、2本鎖遺伝子に特異性が高
く、かつ目的遺伝子に特異性の高い反応を生じさせるこ
とのできる試薬を供給することができる。The gene detection method of the present invention uses, as an immunogen,
An antibody is obtained by using an intercalating reagent bound to a different portion of the target double-stranded gene. By binding the obtained antibody to a solid phase, reacting the target gene or the target gene after amplification with an intercalating reagent, and reacting with an antigen-antibody, the double-stranded gene has high specificity, and It is possible to supply a reagent capable of causing a highly specific reaction to a target gene.
【0013】本発明で使用する2本鎖遺伝子とインター
カレート試薬との複合体を認識する抗体はポリクローナ
ル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよ
い。反応の特異性を高めるためには、モノクローナル抗
体の方が好ましい。ポリクローナル抗体の作製にあたっ
ては、常法(例えば、新生化学実験講座1、タンパク質
I、p389〜397、1992参照)に従い、抗原
(2本鎖遺伝子とインターカレート試薬との複合体)を
ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、マウスなどの動物に免
役し、生体内に産生される抗体を採取することにより得
ることができる。得られた抗体の力価は当業界で公知の
方法により測定できる。モノクローナル抗体の作製も常
法(例えば、Kohler et al., Nature 256:496, 1975; K
ohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511, 1976)に従っ
て行うことができる。すなわち、上述したように動物を
免疫して抗体分泌体細胞を得て、これを骨髄腫細胞系と
融合し、抗体を産生するハイブリドーマを選択すること
により行う。The antibody that recognizes the complex of the double-stranded gene and the intercalating reagent used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies are preferred to increase the specificity of the reaction. For the production of polyclonal antibodies, a conventional method (for example, Shinsei Chemistry Experiment Course 1, Protein
I, p389-397, 1992), immunization with an antigen (complex of a double-stranded gene and an intercalating reagent) in animals such as rabbits, rats, goats, sheep, mice, etc. It can be obtained by collecting the antibody. The titer of the obtained antibody can be measured by a method known in the art. Preparation of monoclonal antibodies is also conventional (eg, Kohler et al., Nature 256: 496, 1975; K
ohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976). That is, it is carried out by immunizing an animal as described above to obtain antibody secretor cells, fusing this with a myeloma cell line, and selecting a hybridoma that produces an antibody.
【0014】得られた抗体はそのままでも、また抗体活
性を有する一部分であっても使用可能である。The obtained antibody can be used as it is or as a part having antibody activity.
【0015】固相としては、試験管、マイクロタイター
プレートなど当分野で公知のものが使用できるが、粒子
を用いて凝集反応を行えばB/F分離を行う必要がない
ので有利である。粒子としては様々なものが使用可能で
あるが、フロー中で分析を行う場合、粒径が均一である
ことが重要であり、その目的のためには粒径の揃ったラ
テックス粒子が最も有用だと考えられる。As the solid phase, those known in the art such as a test tube and a microtiter plate can be used, but if the agglutination reaction is carried out using particles, it is advantageous that B / F separation is not necessary. Although various types of particles can be used, it is important to have uniform particle size when performing analysis in a flow, and latex particles of uniform size are most useful for that purpose. it is conceivable that.
【0016】抗原抗体反応で生じた凝集は目視、あるい
は濁度、吸光度などでも測定は可能であるが、フロー中
に流し個々の粒子にレーザー光を照射して生じる前方散
乱光強度を測定することによっても凝集の程度を知るこ
とができる。この方法を用いることにより、遺伝子をよ
り高感度で検出することができる。The agglutination generated by the antigen-antibody reaction can be measured visually or by turbidity, absorbance, etc., but the forward scattered light intensity generated by irradiating each particle with laser light while flowing in the flow is measured. The degree of aggregation can also be known by. By using this method, the gene can be detected with higher sensitivity.
【0017】したがって、本発明の方法の好ましい態様
においては、前記複合体の第1の部分を認識する抗体を
結合した第1の粒子と、前記複合体の第2の部分を認識
する抗体を結合した第1の粒子とほぼ同じ粒径を有する
第2の粒子とを使用して、目的遺伝子の存在を粒子の凝
集反応によって検出する。Therefore, in a preferred embodiment of the method of the present invention, the first particles to which the antibody recognizing the first part of the complex is bound and the antibody to recognize the second part of the complex are bound. The presence of the gene of interest is detected by the agglutination reaction of the particles using the above-mentioned first particles and the second particles having substantially the same particle size.
【0018】固相として粒子以外の反応容器などを用い
る場合において、インターカレート試薬が蛍光色素の場
合には、抗原抗体反応後B/F分離を行い、蛍光強度を
測定することによって固相に結合した遺伝子複合体を検
出することができる。通常、ヘテロジニアスな系で必要
な標識抗体は不要である。インターカレート試薬が蛍光
色素でない場合には、サンドイッチ法により測定を行う
ことができる。その際、標識抗体が必要であるが、標識
物質として従来より公知のもの、例えば、酵素、蛍光色
素、発光物質などが挙げられる。また、標識物質の抗体
への標識方法についても、従来より当分野で公知の方法
により行うことができる。When a reaction container other than particles is used as the solid phase and the intercalating reagent is a fluorescent dye, B / F separation is performed after the antigen-antibody reaction, and the fluorescence intensity is measured to obtain the solid phase. The bound gene complex can be detected. Usually, the labeled antibody required in a heterogeneous system is unnecessary. When the intercalating reagent is not a fluorescent dye, it can be measured by the sandwich method. At that time, a labeled antibody is required, and examples of conventionally known labeling substances include enzymes, fluorescent dyes, and luminescent substances. Further, the method of labeling the antibody with the labeling substance can also be performed by a method conventionally known in the art.
【0019】また、固相として粒子を用いる場合、イン
ターカレート試薬として蛍光色素を用いれば、抗原抗体
反応後の粒子上には多くの蛍光色素が結合することにな
る。この蛍光色素を励起できる波長の光を照射すれば強
い蛍光を発するので、その蛍光強度を測定すれば遺伝子
の存在を検出することができる。When particles are used as the solid phase, if fluorescent dyes are used as the intercalating reagent, many fluorescent dyes will be bound to the particles after the antigen-antibody reaction. Since strong fluorescence is emitted when irradiated with light having a wavelength capable of exciting this fluorescent dye, the presence of a gene can be detected by measuring the fluorescence intensity.
【0020】インターカレート試薬としては、2本鎖遺
伝子に親和性が高くできるだけ強固に結合するものがよ
い。最も良く知られている試薬としてエチジウムブロマ
イドがあり、その他チアゾールオレンジ、アクリジンオ
レンジ、テキサスレッドなどが以前から遺伝子の蛍光検
出用試薬として広く使用されている。近年、遺伝子の検
出法として蛍光検出が盛んになってきたことを受けて、
新しいインターカレート試薬の開発が行われている。例
えば、「ぶんせき」(12:1002-1004, 1995)には新しく
合成されたインターカレート試薬が報告されており、E
thD(エチジウムブロマイドの陽イオン性ダイマ
ー)、TOTO(チアゾールオレンジダイマー)、YO
YO(オキサゾールイエローダイマー)などが使用でき
る。The intercalating reagent preferably has a high affinity to the double-stranded gene and binds as strongly as possible. The most well-known reagent is ethidium bromide, and thiazole orange, acridine orange, Texas red, etc. have been widely used as a gene fluorescence detection reagent for many years. In recent years, in response to the increasing popularity of fluorescence detection as a gene detection method,
New intercalating reagents are being developed. For example, “Bunseki” (12: 1002-1004, 1995) reported a newly synthesized intercalating reagent.
thD (ethidium bromide cationic dimer), TOTO (thiazole orange dimer), YO
YO (oxazole yellow dimer) and the like can be used.
【0021】[0021]
【発明の効果】本発明によれば、簡便で迅速な2本鎖遺
伝子の検出が実現でき、特に自動化に好適である。ま
た、目的遺伝子とインターカレート試薬の結合物を免疫
源として得られた抗体は従来の遺伝子認識抗体よりも高
い特異性を有しており、この抗体を粒子表面に結合した
粒子を用いた凝集反応は従来のものより高い特異性を実
現できる。EFFECTS OF THE INVENTION According to the present invention, simple and rapid detection of a double-stranded gene can be realized, which is particularly suitable for automation. In addition, the antibody obtained by using the conjugate of the target gene and the intercalating reagent as an immunogen has higher specificity than the conventional gene recognition antibody, and aggregation using particles in which this antibody is bound to the particle surface is used. The reaction can achieve higher specificity than the conventional one.
【0022】また、インターカレート試薬として蛍光色
素を用いれば、標識抗体を使用せずに測定を行うことが
できる。If a fluorescent dye is used as the intercalating reagent, the measurement can be performed without using the labeled antibody.
【0023】[0023]
実施例1:免疫源の調製 本実施例ではモデルとしてヒト遺伝子の検出系を構築し
た。Example 1: Preparation of immunogen In this example, a human gene detection system was constructed as a model.
【0024】宝酒造(株)より販売されているβ−グロ
ビンプライマーセットは、ヒト遺伝子のβ−グロビン領
域の遺伝子(Saiki, R.K. et al., Science 239:487-49
1, 1988参照)を増幅するためのプライマーであり、6
種のプライマーを組み合わせることにより長さの異なる
9種類の遺伝子断片を増幅することができる。ここでは
最も短い断片の得られるPC03とPC04を組み合わ
せて免疫源を得ることにした。このプライマーの配列は
以下の通りであり、このプライマーを用いることにより
110bpの遺伝子断片がPCRによって増幅される。The β-globin primer set sold by Takara Shuzo Co., Ltd. is a gene in the β-globin region of the human gene (Saiki, RK et al., Science 239: 487-49).
1, 1988), and 6
By combining different kinds of primers, 9 kinds of gene fragments having different lengths can be amplified. Here, we decided to obtain the immunogen by combining PC03 and PC04, which give the shortest fragments. The sequence of this primer is as follows, and a 110 bp gene fragment is amplified by PCR by using this primer.
【0025】 PC03:ACACAACTGTGTTCACTAGC PC04:CAACTTCATCCACGTTCACCPC03: ACACAACTGTGTTCACTAGC PC04: CAACTTCATCCACGTTCACC
【0026】試料としてはヒト血液を用いた。抗凝固剤
としてクエン酸3ナトリウムを使用して採血した血液を
遠心分離(3000rpm、15分)し、バッフィコー
ト(buffy coat)を採取した。採取したバッフィコート
を生理食塩水で希釈して、ここからグアニジウムチオシ
アネート法(分子細胞生物学基礎実験法、南江堂)を使
用してPCRに用いるDNAサンプルを調製した。Human blood was used as a sample. Blood collected using trisodium citrate as an anticoagulant was centrifuged (3000 rpm, 15 minutes) to collect a buffy coat. The collected buffy coat was diluted with physiological saline, and from there, a guanidinium thiocyanate method (molecular cell biology basic experiment method, Nankodo) was used to prepare a DNA sample for PCR.
【0027】PCRはパーキンエルマー社のサーマルサ
イクラーを使用して行った。PCR was performed using a thermal cycler manufactured by Perkin Elmer.
【0028】PCR反応に用いた液組成は以下の通りで
ある: 緩衝液 : 5μl (200mM Tris buffer,pH8.4, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA) 精製水 :39.5μl 10mM dNTP混液 : 1μl プライマー(PC03、PC04各10μM) :各1μl TaqDNAポリメラーゼ(AmpliTaqTM、宝酒造(株)): 0.5μl 抽出DNA溶液 : 2μlThe liquid composition used in the PCR reaction is as follows: Buffer: 5 μl (200 mM Tris buffer, pH8.4, 15 mM MgCl 2 , 1 mg / ml BSA) Purified water: 39.5 μl 10 mM dNTP mixture: 1 μl Primer (PC03, PC04 10 μM each): 1 μl each Taq DNA polymerase (AmpliTaq ™ , Takara Shuzo Co., Ltd.): 0.5 μl Extracted DNA solution: 2 μl
【0029】PCR反応は、94℃45秒、55℃25
秒、72℃3分で20サイクル行った。増幅した遺伝子
断片は液体クロマトグラフィーを用いて精製を行い、そ
こにインターカレーション色素としてチアゾールオレン
ジを添加して遺伝子と色素を結合させた。増幅した遺伝
子の量は吸光度で測定し、遺伝子1分子当たり1000
分子のチアゾールオレンジを添加して4℃で1日反応さ
せた。反応後のサンプルはPD−10(ファルマシア社
製)によってゲル濾過し、結合しなかったチアゾールオ
レンジを除去した。The PCR reaction is 94 ° C. for 45 seconds, 55 ° C. for 25 seconds
20 cycles at 72 ° C. for 3 minutes. The amplified gene fragment was purified using liquid chromatography, and thiazole orange was added thereto as an intercalation dye to bind the gene to the dye. The amount of the amplified gene was measured by absorbance, and it was 1000 per molecule of the gene.
Molecular thiazole orange was added and reacted at 4 ° C. for 1 day. The sample after the reaction was subjected to gel filtration with PD-10 (Pharmacia) to remove unbound thiazole orange.
【0030】実施例2:免疫と抗体のスクリーニング 実施例1で調製した色素結合遺伝子をマウスに免疫し、
抗体を得た。マウスにはBalb/cを用い、完全フロ
イントアジュバントと共に1匹当たり50μgを皮下に
免疫した。2週間ごとに同様の免疫を3回行い、4回目
はアジュバントなしに腹腔内に免疫した。Example 2: Immunization and screening of antibodies Immunize mice with the dye-binding gene prepared in Example 1,
Antibodies were obtained. Balb / c was used for mice, and 50 μg / mouse was subcutaneously immunized with complete Freund's adjuvant. The same immunization was performed three times every two weeks, and the fourth immunization was performed intraperitoneally without adjuvant.
【0031】最終免疫の4日後に脾臓を取り出し、定法
に従いミエローマ細胞との融合を行った。融合にはPE
Gを用いた。Four days after the final immunization, the spleen was taken out and fused with myeloma cells according to a standard method. PE for fusion
G was used.
【0032】得られたハイブリドーマは免疫源として用
いた遺伝子断片(PCR産物)のみに対する反応、色素
のみに対する反応、ならびに色素結合遺伝子に対する反
応を調べ、色素結合遺伝子とは良く反応するが単独の遺
伝子や色素とは反応しないようなクローンを選別した。
スクリーニングにはマイクロプレートに色素結合遺伝
子、遺伝子あるいは色素を固相化し、そこにハイブリド
ーマの培養液を添加した。洗浄後、ALP(アルカリフ
ォスファターゼ)標識の抗マウスIgGヤギ抗体を添加
し、洗浄後ALPの酵素活性を測定するというELIS
A法を用いた(基質としては、10mM p−ニトロフ
ェニルリン酸pH9.6、50mMクエン酸緩衝溶液を
使用した)。色素だけのプレートや遺伝子だけのプレー
トにはほとんど反応せず、色素結合遺伝子にのみ比較的
強く反応したハイブリドーマを選択して複合体特異的ク
ローンとした。The obtained hybridoma was examined for the reaction to only the gene fragment (PCR product) used as the immunogen, the reaction to only the dye, and the reaction to the dye-binding gene. Clones that did not react with the dye were selected.
For the screening, a dye-binding gene, a gene or a dye was immobilized on a microplate, and a hybridoma culture solution was added thereto. After washing, an ALP (alkaline phosphatase) -labeled anti-mouse IgG goat antibody is added, and after washing, the enzyme activity of ALP is measured.
Method A was used (10 mM p-nitrophenyl phosphate pH 9.6, 50 mM citrate buffer solution was used as a substrate). Hybridomas that did not react to the plate containing only the dye or the plate containing only the gene and reacted relatively strongly to the dye-binding gene were selected as complex-specific clones.
【0033】このクローンの中で凝集反応に最適な組み
合わせを調べるために、各々の抗体を培養して定法によ
って精製を行った。精製抗体の一部はマイクロプレート
に固相化し、他の一部はビオチンを標識した(標識には
NHSビオチンを使用し、定法によって反応させた後ゲ
ル濾過を行い、ビオチン標識抗体を得た)。In order to examine the optimum combination for agglutination reaction in this clone, each antibody was cultured and purified by a standard method. A part of the purified antibody was immobilized on a microplate and the other part was labeled with biotin (NHS biotin was used as a label, and after reacting by a standard method, gel filtration was performed to obtain a biotin-labeled antibody). .
【0034】各固相とビオチン標識抗体とで色素結合遺
伝子断片をサンドイッチし、ストレプトアビジン標識A
LPを用いて検出した。各々の抗体が色素結合遺伝子の
どの位置を認識しているかにより、サンドイッチの形成
しやすさを判断した。2つの抗体の認識部位が離れてい
るほどサンドイッチ法での検出感度は高くなり、またそ
の抗体を組み合わせて使用することにより凝集法での高
感度化が期待できると考えた。A dye-binding gene fragment is sandwiched between each solid phase and a biotin-labeled antibody, and streptavidin-labeled A
It was detected using LP. The ease with which a sandwich was formed was judged depending on which position of the dye-binding gene each antibody recognizes. It was considered that the detection sensitivity of the sandwich method becomes higher as the recognition sites of the two antibodies are more distant, and that the higher sensitivity of the agglutination method can be expected by using the antibodies in combination.
【0035】スクリーニングの結果、B−52とC−4
3というクローンが色素結合遺伝子に対して比較的高い
特異性を示したので、この抗体を用いて遺伝子の検出系
を検討した。As a result of the screening, B-52 and C-4
Since the clone 3 showed a relatively high specificity for the dye-binding gene, a gene detection system was examined using this antibody.
【0036】また、対照としては単独の遺伝子と色素結
合遺伝子の両方に同程度反応する抗体を選び、このクロ
ーンとしてはC−88とE−09を使用した。As a control, an antibody which reacts to both a single gene and a dye-binding gene to the same degree was selected, and C-88 and E-09 were used as this clone.
【0037】実施例3:検体試料の調製 実施例1と同様にヒト血液からDNAをグアニジウムイ
ソチオシアネート法を用いて分離した。このDNAに対
して実施例1に記載の2種のプライマーPC03とPC
04を用いて実施例1と同じ条件でPCRを行い産物を
得た。Example 3 Preparation of Specimen Sample As in Example 1, DNA was separated from human blood by the guanidinium isothiocyanate method. Two primers, PC03 and PC, described in Example 1 for this DNA
PCR was performed using 04 under the same conditions as in Example 1 to obtain a product.
【0038】PCR産物には1.5μgのチアゾールオ
レンジを添加したものと、添加しないものを用意して実
験に用いた。The PCR products were prepared with and without addition of 1.5 μg of thiazole orange and used for the experiments.
【0039】実施例4:抗体結合ラテックス粒子 0.78μmのポリスチレンラテックス粒子(積水化学
工業(株)から購入の特注品)を10mM PBS、p
H7.0中に5%(w/v)の濃度に調製し、各抗体を
50μg/ml加え、4℃で24時間反応した。その
後、12000rpmの遠心処理を行い、上清を除去し
た後、1mg/ml BSAを含む0.1M PBSを
最初と同量添加して粒子を分散させた。その後もう1度
同じ処理を行い最終的に同緩衝液に分散してラテックス
試薬とした。Example 4 Antibody-Bound Latex Particles 0.78 μm polystyrene latex particles (custom-made product purchased from Sekisui Chemical Co., Ltd.) were added to 10 mM PBS, p.
The concentration was adjusted to 5% (w / v) in H7.0, 50 μg / ml of each antibody was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 24 hours. After that, centrifugation was performed at 12000 rpm, the supernatant was removed, and then 0.1 M PBS containing 1 mg / ml BSA was added in the same amount as the initial amount to disperse the particles. After that, the same treatment was performed once more and finally dispersed in the same buffer to obtain a latex reagent.
【0040】4種類の抗体結合ラテックス試薬を調製
し、B−52とC−43、C−88とE−09を各々
1:1で混合して実験に用いた。Four kinds of antibody-bound latex reagents were prepared, and B-52 and C-43 and C-88 and E-09 were mixed at a ratio of 1: 1 and used in the experiment.
【0041】実施例5:凝集の測定 凝集率の測定には、全自動免疫測定装置PAMIA−3
0TM(東亜医用電子株式会社)を使用した。Example 5: Measurement of aggregation To measure the aggregation rate, a fully automatic immunoassay device PAMIA-3 was used.
0 ™ (Toa Medical Electronics Co., Ltd.) was used.
【0042】この装置はシースフロー中を流れる粒子に
半導体レーザー光を照射し、その前方散乱光強度を測定
することによって、粒子の凝集の程度を測定することが
できる装置である。This apparatus is an apparatus capable of measuring the degree of particle aggregation by irradiating particles flowing in a sheath flow with a semiconductor laser beam and measuring the forward scattered light intensity thereof.
【0043】抗体結合ラテックス粒子(5%w/v)と
試料10μl、それに反応緩衝液として1mg/mlの
BSAを含む0.1M PBSを80μl添加し、45
℃で15分間反応させた後、凝集率を測定した。凝集の
程度はトータルの粒子カウント数に対する凝集した粒子
のカウント数(P/T%)で求めた。Antibody-bound latex particles (5% w / v), 10 μl of sample, and 80 μl of 0.1 M PBS containing 1 mg / ml BSA as a reaction buffer were added thereto, and 45
After reacting at 15 ° C. for 15 minutes, the aggregation rate was measured. The degree of aggregation was determined by the number of aggregated particles (P / T%) relative to the total number of particles.
【0044】試料としては、PCRを行う前の試料(試
料Aとする)、これに色素を添加したものを対照とし、
PCR後の試料(試料Bとする)、これに色素を添加し
た試料の凝集率と比較した。As a sample, a sample before carrying out PCR (referred to as sample A), which was prepared by adding a dye thereto, was used as a control.
The agglutination rate of the sample after PCR (referred to as sample B) and the sample to which the dye was added was compared.
【0045】結果を表1に示す。B−52とC−43の
組み合わせではPCR産物と色素を含む試料でのみ凝集
が確認され、PCRのプライマーや色素のみを含む試料
では凝集は確認されなかった。The results are shown in Table 1. In the combination of B-52 and C-43, aggregation was confirmed only in the sample containing the PCR product and the dye, and no aggregation was confirmed in the sample containing only the PCR primer and the dye.
【0046】一方、C−88とE−09を組み合わせた
ラテックス試薬ではPCR産物を含まない試料において
も若干の凝集が見られた。このことは、遺伝子のみを免
疫して得られた抗体では特定の遺伝子に対する特異性が
低く、他の遺伝子に対しても弱いながら反応を生じると
いうことを示している。2本鎖遺伝子にインターカレー
ト試薬を結合したものを免疫源として得られた抗体は、
目的の2本鎖遺伝子を特異性に捕らえることができるこ
とが確認された。On the other hand, in the latex reagent in which C-88 and E-09 were combined, some aggregation was observed even in the sample containing no PCR product. This indicates that an antibody obtained by immunizing only a gene has low specificity for a particular gene and produces a reaction against other genes, although it is weak. An antibody obtained by using an intercalating reagent bound to a double-stranded gene as an immunogen,
It was confirmed that the target double-stranded gene could be specifically captured.
【0047】[0047]
【表1】 [Table 1]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/58 G01N 33/58 A ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI technical display location G01N 33/58 G01N 33/58 A
Claims (4)
の複合体を認識する抗体を使用することを特徴とする遺
伝子の免疫学的検出法。1. A method for immunologically detecting a gene, which comprises using an antibody that recognizes a complex of a double-stranded gene and an intercalating reagent.
を結合した第1の粒子と、前記複合体の第2の部分を認
識する抗体を結合した第1の粒子とほぼ同じ粒径を有す
る第2の粒子とを使用して、目的遺伝子の存在を粒子の
凝集反応によって検出することを特徴とする請求項1記
載の遺伝子の免疫学的検出法。2. Particles having substantially the same particle size as the first particles bound with an antibody recognizing the first portion of the complex and the first particles bound with an antibody recognizing the second portion of the complex. The method for immunological detection of a gene according to claim 1, wherein the presence of the target gene is detected by agglutination reaction of the particles using the second particles having
って測定することを特徴とする請求項2記載の遺伝子の
免疫学的検出法。3. The immunological detection method for a gene according to claim 2, wherein the aggregation of particles is measured by detecting light scattering.
請求項1〜3のいずれかに記載の遺伝子の免疫学的検出
法。4. The immunological detection method for a gene according to claim 1, wherein the intercalating reagent is a fluorescent dye.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11342396A JPH09297135A (en) | 1996-05-08 | 1996-05-08 | Immunologic detection of gene |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11342396A JPH09297135A (en) | 1996-05-08 | 1996-05-08 | Immunologic detection of gene |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09297135A true JPH09297135A (en) | 1997-11-18 |
Family
ID=14611869
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP11342396A Pending JPH09297135A (en) | 1996-05-08 | 1996-05-08 | Immunologic detection of gene |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH09297135A (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008092041A3 (en) * | 2007-01-24 | 2009-02-12 | Univ Carnegie Mellon | Optical biosensors |
US8426153B2 (en) | 2007-12-03 | 2013-04-23 | Carnegie Mellon University | Linked peptides fluorogenic biosensors |
-
1996
- 1996-05-08 JP JP11342396A patent/JPH09297135A/en active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2008092041A3 (en) * | 2007-01-24 | 2009-02-12 | Univ Carnegie Mellon | Optical biosensors |
US20110159519A1 (en) * | 2007-01-24 | 2011-06-30 | Carnegie Mellon University | Optical biosensors |
US8664364B2 (en) | 2007-01-24 | 2014-03-04 | Carnegie Mellon University | Optical biosensors |
US9688743B2 (en) | 2007-01-24 | 2017-06-27 | Carnegie Mellon University | Optical biosensors |
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US10202466B2 (en) | 2007-12-03 | 2019-02-12 | Carnegie Mellon University | Linked peptide fluorogenic biosensors |
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