JPH09248186A - Polypeptide chain lengthening factor gene tu of microorganism of lactobacillus and its use - Google Patents
Polypeptide chain lengthening factor gene tu of microorganism of lactobacillus and its useInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ラクトバチルス属
微生物のポリペプチド鎖延長因子遺伝子Ｔｕ（Elongati
on Factor−Tu、以下、ＥＦ−Ｔｕと称する）およびそ
の利用、特に、該遺伝子と特異的にハイブリダイズする
ポリヌクレオチドを用いるポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション（ＰＣＲ）法による清酒の火落菌の検出法に
関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a polypeptide chain elongation factor gene Tu (Elongati) of a Lactobacillus microorganism.
on Factor-Tu, hereinafter referred to as EF-Tu) and its use, and in particular to a method for detecting the downfall bacterium of sake by the polymerase chain reaction (PCR) method using a polynucleotide that specifically hybridizes with the gene. .
【０００２】[0002]
【従来の技術】清酒の火落ちを起こす微生物（火落菌）
に関する研究は、北原（ジャーナル・オブ・ゼネラル・
マイクロバイオロジー、第３卷、１０２〜１２０頁、１
９５７年）、野白および百瀬（日本醸造協会雑誌、第６
５卷、７１５〜８０３頁、１９７０年）、新留（生物工
学会誌、第７３卷、２７〜３１頁、１９９５年）によっ
て分類学的研究が行われている。火落菌はラクトバチル
ス属に属し、中性ｐＨでの生育の有無や生育に及ぼすア
ルコールの影響から真性火落菌と火落性乳酸菌に、ま
た、その乳酸発酵の形態によりそれぞれホモ発酵型およ
びヘテロ発酵型の合計４グループに分類される。ホモ発
酵型真性火落菌としては、ラクトバチルス・ホモヒオチ
(Lactobacillus homohiochii)、ヘテロ発酵型真性火落
菌としては、ラクトバチルス・フルクチボランス(Lacto
bacillus fructivorans)、ホモ発酵型火落性乳酸菌とし
ては、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシズ・
パラカゼイ(Lactobacillus paracaseisubsp. paracase
i、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ヘテロ発酵型火落
性乳酸菌としては、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｒｇａｒｉｉ）が挙げ
られる。また、中村は、火落性乳酸菌には、その他のラ
クトバチルス属の菌株が含まれる可能性があると報告し
ている（生物工学会誌、第７４卷、８３〜９０頁、１９
９６年）。2. Description of the Related Art Microorganisms that cause the burning of sake (flame-dropping bacteria)
Kitahara (Journal of General
Microbiology, Volume 3, pages 102-120, 1
957), Noshiro and Momose (Journal of the Brewing Society of Japan, No. 6)
5), 715-803, 1970) and Shindome (Journal of Biotechnology, 73rd edition, 27-31, 1995). Hakuhochi bacteria belong to the genus Lactobacillus, and are classified into true fire-fall bacteria and fire-fall lactic acid bacteria due to the presence or absence of growth at neutral pH and the effect of alcohol on growth, and homofermentation type and heterofermentation depending on the form of lactic acid fermentation. There are a total of 4 groups of types. Lactobacillus homohiotia as a homofermentative true Hakuhochi bacterium
(Lactobacillus homohiochii), a heterofermentative eubacterial fungus, is Lactobacillus fructibolans (Lacto
bacillus fructivorans), a homofermentative pyroclastic lactic acid bacterium, such as Lactobacillus paracasei subspecies
Paracasei (Lactobacillus paracaseisubsp.paracase
i, Lactobacillus plantarum
illus plantarum), as a heterofermentative type pyrolytic lactic acid bacterium, Lactobacillus hilgardi (L
Actobacillus hirgarii). Nakamura also reports that the lactobacillus of the genus Lactobacillus may include other strains of the genus Lactobacillus (Journal of Biotechnology, Vol. 74, pp. 83-90, 19).
1996).
【０００３】従来、これら火落菌の検出には、火落菌検
出培地ＳＩ培地（日本醸造協会）が市販されており、こ
の培地を用いた培養法により検出が行われている。しか
し、この検出には８日以上の日数を要する。したがっ
て、火落菌の迅速かつ高感度な検出法の開発が望まれて
いる。近年、微生物を迅速かつ高感度に検出する方法と
して、免疫化学的手法を用いた方法や分子生物学的手法
を用いた方法が開発されている。特に、分子生物学的手
法を用いた方法においては、ＰＣＲ法［メッソズ・イン
・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、第１５
５卷、３３５〜３５０頁、１９８７年］が挙げられる。
ＰＣＲ法は、任意の遺伝子の配列を生体外で指数的に増
幅させる方法である。しかし、ＰＣＲ法を用いるには、
増幅させる遺伝子の情報が必要である。一方、火落菌が
属するラクトバチルス属微生物をＰＣＲ法で検出するの
に必要な、ＥＦ−Ｔｕタンパク遺伝子の情報については
報告がない。[0003] Conventionally, for the detection of these drop bacilli, a drop bacillus detection medium SI medium (Japan Brewery Association) has been commercially available, and detection is carried out by a culture method using this medium. However, this detection requires more than 8 days. Therefore, it is desired to develop a rapid and highly sensitive detection method for fire bacterium. In recent years, methods using immunochemical methods and molecular biological methods have been developed as methods for detecting microorganisms rapidly and with high sensitivity. In particular, in the method using the molecular biological method, the PCR method [Methods in Enzymology, No. 15
5), pages 335-350, 1987].
The PCR method is a method for exponentially amplifying an arbitrary gene sequence in vitro. However, to use the PCR method,
Information on the gene to be amplified is required. On the other hand, there is no report on the information on the EF-Tu protein gene, which is necessary for detecting the Lactobacillus microorganism to which the Hakutogi bacterium belongs by PCR.
【０００４】ラクトバチルス属の微生物の迅速検出法に
ついては中村ら（バイオサイエンス・バイオテクノロジ
ー・バイオケミストリー、第５９巻、２０３９〜２０４
３頁、１９９５年）の火落菌に特異的なモノクローナル
抗体を用いた方法がある。また、ＰＣＲ法によるラクト
バチルス属の微生物検出について、土屋らの、ラクトバ
チルス・ブレビスの５ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をも
とにプライマーを作製し、ＰＣＲ法を用いたビール中の
ラクトバチルス ブレビスの検出方法の報告［日本醸造
協会雑誌、第８６巻、７２０頁（１９９１年）］や、中
川らの、ラクトバチルス属微生物の１６ＳＲＮＡ遺伝子
と２３ＳＲＮＡ遺伝子の間に構成されているスペサー領
域の遺伝子の塩基配列をもとにプライマーを作製し、Ｐ
ＣＲ法を用いた清酒中の火落菌の検出方法の報告［アプ
ライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイ
オロジー、第６０巻 ６３７〜６４０頁（１９９４
年）］がある。[0004] For rapid detection of microorganisms of the genus Lactobacillus, see Nakamura et al. (Bioscience / Biotechnology / Biochemistry, Vol. 59, 2039-204.
(3, 1995) using a monoclonal antibody specific to Hachinohe bacteria. Regarding the detection of Lactobacillus microorganisms by the PCR method, a method for detecting Lactobacillus brevis in beer using the PCR method, in which a primer was prepared based on the nucleotide sequence of the 5S rRNA gene of Lactobacillus brevis by Tsuchiya et al. [The Journal of the Brewing Society of Japan, Vol. 86, p. 720 (1991)] and Nakagawa et al.'S nucleotide sequence of the gene of the spessor region constituted between the 16S RNA gene and the 23S RNA gene of Lactobacillus microorganisms. Create a primer based on P
Report of a method for detecting fire bacterium in sake using CR method [Applied and Environmental Microbiology, Vol. 60, pp. 637-640 (1994).
Year)].
【０００５】中村らの方法は、酒造蔵に広く分布する火
落菌を特異的に検出する方法であるが、検出感度が１０
3セル以下であり十分でない。土屋らの方法は、５Ｓｒ
ＲＮＡの塩基配列を用いるが、この配列は微生物の属を
越えて極めて類似しているため、ラクトバチルス・ブレ
ビス以外の微生物をも誤って検出してしまう可能性があ
る。また、１６ＳＲＮＡについても同様に、微生物の属
を越えて極めて類似しているため、ラクトバチルス属細
菌を特異的に検出する目的には不適当である。中川らの
方法は、１６ＳＲＮＡ遺伝子と２３ＳＲＮＡ遺伝子の間
に構成されているスペーサー領域の遺伝子を用いてお
り、この遺伝子の領域は、微生物種に特異的とされてい
るが、同じ種内でも配列が異なっており、清酒中の火落
菌をカバーするためには、何種類ものプライマーを設定
し、それを混合して用いるしかない。したがって、それ
によりＰＣＲで合成されるバンドには、何本ものバンド
が現れ、特定し難い。しかも、センス側のプライマー
は、広く微生物で保存されている１６ＳＲＮＡ遺伝子の
配列を用いている。The method of Nakamura et al. Is a method for specifically detecting fire bacterium which is widely distributed in sake brewing, but the detection sensitivity is 10
Not more than 3 cells, which is not enough. Tsuchiya's method is 5 Sr.
The base sequence of RNA is used, but since the sequences are extremely similar across genera of microorganisms, microorganisms other than Lactobacillus brevis may be erroneously detected. Similarly, 16S RNA is also extremely similar across genus of microorganisms and is not suitable for the purpose of specifically detecting Lactobacillus bacteria. The method of Nakagawa et al. Uses a gene in the spacer region composed between the 16S RNA gene and the 23S RNA gene. The region of this gene is said to be specific to the microbial species. It is different, and in order to cover the fire bacterium in sake, there is no choice but to set several kinds of primers and mix them. Therefore, as a result, many bands appear in the band synthesized by PCR and are difficult to identify. Moreover, the primer on the sense side uses the sequence of the 16S RNA gene which is widely conserved in microorganisms.
【０００６】一方、ＥＦ−Ｔｕは生物に広く存在し、安
定に保存されているタンパク質である。本発明者らは、
ラクトバチルス属微生物のＥＦ−Ｔｕに対する特異的モ
ノクローナル抗体（ＭＡb Ｊe３）を得ることに成功
し、そのＭＡb Ｊe３の特異性が高いことを見いだし、
そのモノクローナル抗体の認識する領域の遺伝子配列の
特異性が高いと考えた。そこで、ラクトバチルス属微生
物のＥＦ−Ｔｕ遺伝子の塩基配列を決定し、特異的なプ
ライマーの設定を行い、ＰＣＲ法でその領域を増幅する
ことにより、広範囲のラクトバチルス属の微生物を高感
度にしかも特異的に検出することができるという知見を
得、本発明を完成するに至った。On the other hand, EF-Tu is a protein widely existing in living organisms and stably preserved. We have
Succeeded in obtaining a specific monoclonal antibody (MAb Je3) against EF-Tu of a Lactobacillus microorganism, and found that the MAb Je3 has high specificity,
It was considered that the gene sequence in the region recognized by the monoclonal antibody had high specificity. Therefore, by determining the base sequence of the EF-Tu gene of Lactobacillus microorganisms, setting a specific primer, and amplifying the region by the PCR method, a wide range of Lactobacillus microorganisms can be detected with high sensitivity. The present inventors completed the present invention by finding that they can be specifically detected.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ラクトバチ
ルス属に属する微生物のＥＦ−Ｔｕタンパク質をコード
するＤＮＡの塩基配列の全塩基配列の遺伝子を提供する
ことを目的とするものである。また、本発明は、該ＤＮ
Ａを特異的に認識するオリゴヌクレオチドプローブとこ
れを特異的に増幅するためのプライマーを提供すること
を目的とするものである。さらに、本発明は、これらの
プローブとプライマーを用いたラクトバチルス属に属す
る微生物、特に、火落菌を共通にかつ高感度に検出する
ための方法を提供することを目的とするものである。The object of the present invention is to provide a gene having the entire base sequence of the base sequence of the DNA encoding the EF-Tu protein of the microorganism belonging to the genus Lactobacillus. The present invention also provides the DN
It is intended to provide an oligonucleotide probe that specifically recognizes A and a primer for specifically amplifying it. It is another object of the present invention to provide a method for commonly and highly sensitively detecting microorganisms belonging to the genus Lactobacillus, in particular fire-fall bacterium, using these probes and primers.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明の第１の態様は、
ラクトバチルス属に属する微生物のタンパク質生合成に
おけるポリペプチド鎖延長反応に関与し、アミノアシル
−tＲＮＡのリボソームＡ部位への転移を触媒する能力
を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される分子量が約
４５,０００であることを特徴とするＥＦ−Ｔｕを提供
するものである。また、本発明の第２の態様は、かかる
ＥＦ−Ｔｕの機能を有する、配列表の配列番号１に示す
アミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそれと同等の
機能を有する、該ポリペプチドのいずれかのアミノ酸配
列の付加、挿入、削除、欠失または置換による変異体を
提供するものである。According to a first aspect of the present invention, there is provided:
It is involved in a polypeptide chain elongation reaction in protein biosynthesis of a microorganism belonging to the genus Lactobacillus, has the ability to catalyze the transfer of aminoacyl-tRNA to the ribosome A site, and has a molecular weight of about 45 measured by SDS-PAGE. EF-Tu is provided. A second aspect of the present invention is a polypeptide having the function of EF-Tu, having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, or any amino acid of the polypeptide having the same function. It provides variants by the addition, insertion, deletion, deletion or substitution of sequences.
【０００９】本発明の第３の態様は、上記の第２の態様
のポリペプチドまたはその変異体をコードするＤＮＡ塩
基配列からなることを特徴とするＥＦ−Ｔｕ遺伝子を提
供するものである。本発明の第４の態様は、上記第３の
態様のＥＦ−Ｔｕ遺伝子のポリヌクレオチドのいずれか
と特異的にハイブリダイズすることができる、該ポリヌ
クレオチドの一部を含む、塩基数１００未満のオリゴヌ
クレオチド、特に、上記第３の態様のＥＦ−Ｔｕ遺伝子
のポリヌクレオチド検出のためのＰＣＲ用のオリゴヌク
レオチド、例えば、配列表の配列番号２および３に示す
オリゴヌクレオチドや、それらの配列の、それぞれ少な
くとも連続した１６塩基以上を一部に有する１６〜３６
個の塩基からなるオリゴヌクレオチドフラグメントを提
供するものである。A third aspect of the present invention provides an EF-Tu gene characterized by comprising a DNA base sequence encoding the polypeptide of the second aspect or a variant thereof. A fourth aspect of the present invention is an oligo-nucleotide having a number of bases of less than 100, which is capable of specifically hybridizing with any of the polynucleotides of the EF-Tu gene of the third aspect, and which contains a part of the polynucleotide. Nucleotides, particularly oligonucleotides for PCR for detecting the polynucleotide of the EF-Tu gene of the third aspect, for example, oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 in the sequence listing, or at least one of those sequences, respectively. 16 to 36 partially having continuous 16 bases or more
It provides an oligonucleotide fragment consisting of one base.
【００１０】本発明の第５の態様は、本発明の第４の態
様の、２個のオリゴヌクレオチドであって、一方が本発
明の第３の態様のＥＦ−Ｔｕ遺伝子のポリヌクレオチド
とハイブリダイズし、他方がそれと相補なポリヌクレオ
チドとハイブリダイズするものであり、これら両者をそ
れぞれプライマーとし、かつ各ポリヌクレオチドを鋳型
として、耐熱性ポリメラーゼによる鎖長反応、鎖長反応
生成物の鋳型からの分離操作を繰り返すことにより、Ｅ
Ｆ−ＴＵ遺伝子フラグメントを増幅蓄積せしめ、ついで
蓄積した該ＥＦ−Ｔｕ遺伝子フラグメントを検出するこ
とを特徴とするラクトバチルス属に属する微生物のＥＦ
−Ｔｕ遺伝子の検出法を提供するものである。特に、こ
の第５の態様は、鋳型となるＥＦ−Ｔｕ遺伝子としてラ
クトバチルス属に属する微生物から抽出された遺伝子を
使用したラクトバチルス属に属する微生物の微量検出法
に好適である。The fifth aspect of the present invention is the two oligonucleotides of the fourth aspect of the present invention, one of which hybridizes with the polynucleotide of the EF-Tu gene of the third aspect of the present invention. However, the other one hybridizes with a polynucleotide complementary thereto, and both of these are used as primers, and each polynucleotide is used as a template to separate the chain length reaction by a thermostable polymerase and the chain length reaction product from the template. By repeating the operation, E
EF of a microorganism belonging to the genus Lactobacillus, characterized in that an F-TU gene fragment is amplified and accumulated, and then the accumulated EF-Tu gene fragment is detected.
-Provides a method for detecting the Tu gene. In particular, the fifth aspect is suitable for a method for detecting a trace amount of a microorganism belonging to the genus Lactobacillus using a gene extracted from a microorganism belonging to the genus Lactobacillus as an EF-Tu gene serving as a template.
【００１１】[0011]
【発明の実施の態様】本発明のＥＦ−Ｔｕを得るには、
まず、ラクトバチルス属微生物、例えば、ラクトバチル
ス・ホモヒオチ、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブス
ピーシーズ・パラカゼイ、ラクトバチルス・フルクチボ
ランス、ラクトバチルス・ヒルガルディ、特に、ラクト
バチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ
Ｈ７株のような火落菌を用い、自体公知の細胞融合方
法、例えば、ケラーら［Koehlerら、Nature、２５６
巻、４９５〜４９７頁（１９７５年）］の方法により、
ラクトバチルス属微生物に共通して存在するＥＦ−Ｔｕ
タンパク質を認識するモノクローナル抗体を調製する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION To obtain the EF-Tu of the present invention,
First, microorganisms of the genus Lactobacillus, for example, Lactobacillus homohochi, Lactobacillus paracasei subspecies paracasei, Lactobacillus fructiborans, Lactobacillus hirgardi, particularly Lactobacillus paracasei subspecies paracasei H7 strain. A cell fusion method known per se using Hakutogi, for example, Keller et al. [Koehler et al. Nature 256.
Vol. 495-497 (1975)],
EF-Tu commonly present in Lactobacillus microorganisms
A monoclonal antibody that recognizes the protein is prepared.
【００１２】得られるＥＦ−Ｔｕタンパク質を認識する
モノクローナル抗体は、ラクトバチルス属に属する微生
物に共通に存在するＥＦ−Ｔｕタンパク質を特異的に認
識するもので、例えば、以下の表１に示す火落菌の標準
株である１０種類のラクトバチルス属に属する微生物を
認識した。The obtained monoclonal antibody that recognizes the EF-Tu protein specifically recognizes the EF-Tu protein that is commonly present in microorganisms belonging to the genus Lactobacillus. Recognizing 10 kinds of microorganisms belonging to the genus Lactobacillus, which are standard strains of
【表１】 ラクトバチルス・ホモヒオチ Ｓ２４ ＳＩ ３０℃ ラクトバチルス・スピーシーズ ＯＷ１ ＳＩ ３０℃ ラクトバチルス・スピーシーズ ４９Ｂ ＳＩ ３０℃ ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・ パラカゼイＨ７ ＳＩ ３０℃ ラクトバチルス・スピーシーズ Ｄ１ ＳＩ ３０℃ ラクトバチルス・フルクチボランス Ｈ１ ＳＩ ３０℃ ラクトバチルス・ヒルガルデイ Ｈ３４ ＳＩ ３０℃ ラクトバチルス・スピーシーズ ＡＥ５ ＳＩ ３０℃ ラクトバチルス・スピーシーズ ５０Ｋ ＳＩ ３０℃ ラクトバチルス・スピーシーズ ６４Ｌ ＳＩ ３０℃ ＳＩ：ＳＩ培地（日本醸造協会、５g、エタノール１０ml、蒸留水９０ml） さらに、酒造蔵より分離された火落菌についてもモノク
ローナル抗体の反応性を調べた結果、すべての火落菌に
反応性を示した。[Table 1] Lactobacillus homohochi S24 SI 30 ° C. Lactobacillus species OW1 SI 30 ° C. Lactobacillus species 49B SI 30 ° C. Lactobacillus paracasei subspecies paracasei H7 SI 30 ° C. Lactobacillus D spices 1 ° C. Bacillus fructivorans H1 SI 30 ° C. Lactobacillus hilgardei H34 SI 30 ° C. Lactobacillus species AE5 SI 30 ° C. Lactobacillus species 50K SI 30 ° C. Lactobacillus species 64L SI 30 ° C. SI: SI medium, Japanese brewing medium. In addition, 10 ml of ethanol and 90 ml of distilled water) In addition, the reactivity of the monoclonal antibody was also examined for the hard-to-harvest bacteria isolated from the sake brewery. It showed the refractory.
【００１３】ついで、ラクトバチルス属に属する微生物
に存在する、ＥＦ−Ｔｕに特異的に反応するモノクロー
ナル抗体を用いてＥＦ−Ｔｕ遺伝子の塩基配列を決定す
る。例えば、λファージでラクトバチルス属に属する微
生物の遺伝子ライブラリーを構築し、該モノクローナル
抗体を用いてＥＦ−Ｔｕ遺伝子のクローニングを行った
後、サンガー法［Sanger et al.，Proc．Natl．Acad．S
ci．USA.、７４巻、５４６３〜５４６７頁（１９７７
年）］により決定することができる。このようにして決
定したラクトバチルス属に属する微生物のＥＦ−Ｔｕ遺
伝子の全塩基配列または部分配列は、例えば、ＤＮＡＳ
ＩＳシステム（日立エンジニアリング）を用いて解析す
ることができ、ラクトバチルス属に属する微生物に共通
な領域を検索することができる。本発明者らは、この共
通領域が、ラクトバチルス属微生物のタンパク質生合成
におけるポリペプチド鎖延長反応に関与し、アミノアシ
ル−tＲＮＡのリボソームＡ部位への転移を触媒する能
力を有する、例えば、後の実施例３に示す条件下でのド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量が、約４５,００
０のタンパク抗原であることを見いだした。Then, the nucleotide sequence of the EF-Tu gene is determined using a monoclonal antibody which is present in a microorganism belonging to the genus Lactobacillus and which specifically reacts with EF-Tu. For example, after constructing a gene library of a microorganism belonging to the genus Lactobacillus with λ phage and cloning the EF-Tu gene using the monoclonal antibody, the Sanger method [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA., 74, 5463-5467 (1977).
Year)]. The whole base sequence or partial sequence of the EF-Tu gene of the microorganism belonging to the genus Lactobacillus thus determined is, for example, DNAS.
It can be analyzed using an IS system (Hitachi Engineering), and a region common to microorganisms belonging to the genus Lactobacillus can be searched. The present inventors have found that this common region has the ability to participate in a polypeptide chain elongation reaction in protein biosynthesis in Lactobacillus microorganisms and catalyze the transfer of aminoacyl-tRNA to the ribosome A site, for example, The molecular weight by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under the conditions shown in Example 3 was about 45,000.
It was found to be 0 protein antigen.
【００１４】また、本発明者らは、５種類のラクトバチ
ルス属に属する微生物のＥＦ−Ｔｕ遺伝子の全塩基配列
または部分配列を明らかにした。例えば、配列表の配列
番号１は、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシ
ーズ・パラカゼイＨ７株のＥＦ−Ｔｕの全塩基配列であ
る。かくして、本発明のＥＦ−Ｔｕは、自体公知の遺伝
子組み換え手法を用い、配列表の配列番号１のようなＥ
Ｆ−Ｔｕをコードする塩基配列を有するＤＮＡフラグメ
ントを公知の方法により、ベクター、例えば、pＵＣ１
１８、１１９（ストラトジーン社製）等に組み込み、イ
ー・コリ（Ｅ．coli）ＪＭ１０９（東洋紡社製）等に形
質転換し、適宜、発現させることにより容易に調製する
ことができる。配列番号１に示すアミノ酸配列を有する
ポリペプチドは、ＥＦ−Ｔｕ機能を有する本発明のＥＦ
−Ｔｕの１つであり、また、本発明のＥＦ−Ｔｕには、
これと同等の機能を有し、そのいずれかのアミノ酸配列
の付加、挿入、削除、欠失または置換に変異体が包含さ
れる。Further, the present inventors have clarified the whole base sequence or partial sequence of the EF-Tu gene of the microorganisms belonging to five types of Lactobacillus. For example, SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is the entire base sequence of EF-Tu of Lactobacillus paracasei subspecies paracasei H7 strain. Thus, the EF-Tu of the present invention can be transformed into E-like SEQ ID NO: 1 in the sequence listing using a gene recombination technique known per se.
A DNA fragment having a base sequence encoding F-Tu is prepared by a known method into a vector such as pUC1.
18, 119 (manufactured by Stratogene) and the like, and transformed into E. coli JM109 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and the like, and appropriately expressed to facilitate preparation. The polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the EF of the present invention having the EF-Tu function.
-Tu, and EF-Tu of the present invention,
It has a function equivalent to this, and variants are included in addition, insertion, deletion, deletion or substitution of any amino acid sequence thereof.
【００１５】これらアミノ酸配列の付加、挿入、削除、
欠失、置換は、自体公知の方法、例えば、クンケルら
［Kunkel et al.，Methods in Enzymol.、１５４巻、３
６７〜３８２頁（１９８７年）］のような方法により行
え、その所望の機能を維持した範囲のアミノ酸を付加、
挿入、削除、欠失、置換したものが挙げられる。Addition, insertion, deletion of these amino acid sequences,
Deletion and substitution can be carried out by a method known per se, for example, Kunkel et al., Methods in Enzymol., 154, 3
67-382 (1987)], and adding an amino acid in a range that maintains its desired function,
Examples include insertion, deletion, deletion, and substitution.
【００１６】本発明のＥＦ−Ｔｕ遺伝子、すなわち、Ｅ
Ｆ−ＴｕをコードするＤＮＡ塩基配列を有するポリヌク
レオチドは、通常の宿主ベクター系を用いてＥＦ−Ｔｕ
活性を有するポリペプチドが発現されるようなすべての
ポリヌクレオチドを包含するものである。例えば、配列
番号１に示されるポリヌクレオチドが挙げられるが、１
つのアミノ酸は多くの場合、複数の３塩基により表され
るから、本発明のポリヌクレオチドは同一のポリペプチ
ドに対応するポリヌクレオチドをすべて含んでいる。ま
た、上記のポリペプチドの変異体をコードするポリヌク
レオチドも包含する。The EF-Tu gene of the present invention, namely E
A polynucleotide having a DNA base sequence encoding F-Tu can be prepared by using a conventional host vector system.
It includes all polynucleotides in which the active polypeptide is expressed. Examples include the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1,
Since one amino acid is often represented by multiple 3 bases, the polynucleotide of the present invention includes all the polynucleotides corresponding to the same polypeptide. Also included are polynucleotides encoding variants of the above polypeptides.
【００１７】ＥＦ−Ｔｕ遺伝子をコードするポリヌクレ
オチド（例、配列番号１）またはこれと相補なポリヌク
レオチドのいずれかとハイブリダイズすることができる
オリゴヌクレオチドであって、ＥＦ−Ｔｕ遺伝子をコー
ドする塩基配列またはこれと相補な塩基配列を有するポ
リヌクレオチドの一部を含む塩基数１００未満のオリゴ
ヌクレオチドは、ＰＣＲ法によりＥＦ−Ｔｕ遺伝子を増
幅するためのプライマーとして有用である。An oligonucleotide capable of hybridizing with either a polynucleotide encoding the EF-Tu gene (eg, SEQ ID NO: 1) or a polynucleotide complementary thereto, which is a nucleotide sequence encoding the EF-Tu gene. Alternatively, an oligonucleotide having a base number of less than 100 containing a part of a polynucleotide having a base sequence complementary thereto is useful as a primer for amplifying the EF-Tu gene by the PCR method.
【００１８】ＥＦ−Ｔｕ遺伝子をコードする塩基配列ま
たはこれと相補な塩基配列からなるポリヌクレオチドの
一部からなるオリゴヌクレオチドは、それと相補的なポ
リヌクレオチドとハイブリダイズするが、このオリゴヌ
クレオチドにさらに任意のオリゴヌクレオチドが結合し
たものもＥＦ−ＴＵ遺伝子をコードする遺伝子とハイブ
リダイズする。したがって、かかる任意のオリゴヌクレ
オチドが結合したハイブリダイズが可能なものも本発明
に包含される。また塩基数は１００を越えるとオリゴヌ
クレオチドの合成効率が低下するため、１００を越える
オリゴヌクレオチドは実用的には不要である。特異的反
応を得るためには少なくとも１６以上であり、３６以下
で十分な特異反応が得られるので通常１６〜３６が好ま
しい。An oligonucleotide consisting of a part of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding the EF-Tu gene or a nucleotide sequence complementary thereto hybridizes with a polynucleotide complementary thereto, but is further optional to this oligonucleotide. The oligonucleotide to which the above-mentioned oligonucleotide is bound also hybridizes with the gene encoding the EF-TU gene. Therefore, those capable of hybridizing with any such oligonucleotides are also included in the present invention. Further, when the number of bases exceeds 100, the efficiency of synthesizing oligonucleotides decreases, so oligonucleotides exceeding 100 are practically unnecessary. In order to obtain a specific reaction, it is at least 16 or more, and if 36 or less, a sufficient specific reaction can be obtained.
【００１９】ＰＣＲ法は、鋳型とプライマーの存在を必
須とするＤＮＡ依存性ポリメラーゼであって、ＤＮＡの
メルティング温度でも失活しないような耐熱性ポリメラ
ーゼと、鋳型となるＤＮＡと、それぞれの鋳型に結合す
るプライマーとを使用して、高温（例、９０℃以上）で
ＤＮＡをメルトさせ、ついで、低温（例、２５〜７０
℃）でプライマーとアニーリングさせて合成反応を行わ
せ、このサイクルを繰り返すことにより一定長のＤＮＡ
断片を増幅、蓄積させる方法である。この方法を用いて
微生物の検出を行う場合、検出する微生物の遺伝子情報
が必要となるが、得られた本発明のオリゴヌクレオチド
は、ラクトバチルス属微生物のＥＦ−Ｔｕ遺伝子増幅の
ためのＰＣＲ法に好適である。The PCR method is a DNA-dependent polymerase that requires the presence of a template and a primer, and is a thermostable polymerase that does not inactivate even at the melting temperature of DNA, a DNA serving as a template, and a template for each template. The DNA is melted at a high temperature (eg, 90 ° C. or higher) using a binding primer, and then at a low temperature (eg, 25-70).
DNA) of a fixed length by repeating the cycle by annealing with a primer at
This is a method of amplifying and accumulating fragments. When a microorganism is detected using this method, the genetic information of the microorganism to be detected is required, and the obtained oligonucleotide of the present invention is used in a PCR method for amplifying the EF-Tu gene of a Lactobacillus microorganism. It is suitable.
【００２０】すなわち、これらの得られた塩基配列を基
に、ラクトバチルス属に属する微生物、特に、火落菌の
ＥＦ−Ｔｕ遺伝子を共通に増幅するためのプライマーが
選択できる。これらの配列をプライマーとして用いれ
ば、ラクトバチルス属に属する微生物。特に、全ての火
落菌の遺伝子を増幅でき、特異的なバンド、例えば、６
７０bpのシングルバンドを検出することができる。具体
的には、例えば、ＥＦ−Ｔｕ遺伝子に対して設定した、
配列表、配列番号２および３のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして利用してＰＣＲ法を適用すると、後の実
施例に示すように６７０ｂｐのバンドとしてＥＦ−Ｔｕ
遺伝子が検出される。ただし、上記プライマーはＥＦ−
Ｔｕ遺伝子とハイブリダイズする機能を失わない限り、
その塩基が一部削除され、または新たな塩基がそれに付
加されても十分プライマーとして機能し、ＰＣＲ法に利
用してＥＦ−Ｔｕ遺伝子の増幅に利用することができ
る。例えば、配列番号２および３の塩基配列は、各々、
２０個の塩基からなるが、これらがプライマーとして機
能を保持するためには、これらの配列のうちに、それぞ
れ少なくとも連続した１６塩基配列以上を有すれば足
り、これらの配列にほかの塩基が付加された場合、総塩
基数が３６以内のものが望ましい。That is, a primer for commonly amplifying the EF-Tu gene of a microorganism belonging to the genus Lactobacillus, particularly a fire-fall bacterium, can be selected based on these obtained nucleotide sequences. A microorganism belonging to the genus Lactobacillus can be obtained by using these sequences as primers. In particular, it is capable of amplifying all the genes of Hakutobacillus and has a specific band such as 6
A single band of 70 bp can be detected. Specifically, for example, it is set for the EF-Tu gene,
When the PCR method was applied using the oligonucleotides of SEQ ID Nos. 2 and 3 as primers, EF-Tu was obtained as a 670 bp band as shown in the Examples below.
The gene is detected. However, the above primer is EF-
As long as the function of hybridizing with the Tu gene is not lost,
Even if a part of the base is deleted or a new base is added to the base, it sufficiently functions as a primer and can be used for PCR method to amplify the EF-Tu gene. For example, the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2 and 3 are, respectively,
It consists of 20 bases, but in order for these to retain the function as a primer, it is sufficient that each of these sequences has at least 16 consecutive base sequences or more, and other bases are added to these sequences. In this case, the total number of bases is preferably 36 or less.
【００２１】ここに、本発明のポリヌクレオチドはＤＮ
Ａの鋳型として用いることができる。具体的には、ラク
トバチルス属に属する微生物から抽出されたＤＮＡがそ
のために用いられる。ＰＣＲの操作と条件は、通常の方
法から任意に選択でき、特に限定されるものではない。The polynucleotide of the present invention is DN
It can be used as a template for A. Specifically, DNA extracted from a microorganism belonging to the genus Lactobacillus is used for that purpose. The PCR operation and conditions can be arbitrarily selected from ordinary methods and are not particularly limited.
【００２２】上記のＥＦ−Ｔｕ遺伝子の検出法を用い
て、ラクトバチルス属に属する微生物、特に、火落菌の
ＥＦ−Ｔｕ遺伝子を増幅し、そのプライマーの組み合わ
せにより増幅される火落菌を調べた結果、少なくとも酒
蔵より分離した火落菌すべてを増幅し、火落菌の微量検
出が可能である。上記のプライマーを用いるＰＣＲ法を
利用し、３５サイクル程度の繰り返しによりＥＦ−Ｔｕ
遺伝子の対応部分のみが数億倍に増幅され、これによ
り、僅かな細胞数を対象にＥＦ−Ｔｕ遺伝子の検出が可
能となる。このように増幅され、蓄積されたＤＮＡの検
出は、例えば、アガロースゲル電気泳動、エチジウムブ
ロミド染色等の常法により行うことができる。Using the above-mentioned method for detecting the EF-Tu gene, the EF-Tu gene of a microorganism belonging to the genus Lactobacillus, in particular, the Hakutachi bacteria was amplified, and the result of examination of the Hakuto bacteria amplified by the combination of the primers It is possible to detect at least a trace amount of H. niger by amplifying at least all the H. niger that are separated from the sake brewery. Using the PCR method using the above primers, EF-Tu was repeated by repeating about 35 cycles.
Only the corresponding part of the gene is amplified several hundred million times, which makes it possible to detect the EF-Tu gene in a small number of cells. Detection of the DNA thus amplified and accumulated can be carried out by a conventional method such as agarose gel electrophoresis or ethidium bromide staining.
【００２３】[0023]
【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらによって限定されるもので
はない。 実施例１ ラクトバチルス属に属する微生物に対するモノクローナ
ル抗体の調製法 ３週齢の雌のＢalb／c マウス（日本ＳＬＣ)の腹腔内に
フロイントのコンプリートアジュバント（和光純薬）を
混合した１０8セルのラクトバチルス・パラカゼイ・サ
ブスピーシーズ・パラカゼイＨ７株を免疫した。その
後、１週間間隔で２回尾静脈中に追加免疫した。最終免
疫の３日後に、マウスの脾臓を無菌的に取り出し、組織
から脾臓細胞を分離した。モノクローナル抗体の調製法
は、上記ケラーらの方法で行った。マウス脾臓細胞とマ
ウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１、Yelton et al.，Curre
nt Topics in Microbiology and Immunology、８１巻、
１〜７頁、１９７８年）を混合し、４００×ｇ、５分間
低速遠心分離する。ついで、血清の入っていないＲＰＭ
Ｉ１６４０培地（日水製薬）で１回洗浄した後、上清を
除去し、１mlのポリエチレングリコール１５００（ＰＥ
Ｇ１５００、ベーリンガー）を緩やかに攪拌しながら1
滴ずつ、1分間かけて添加した。その後、９mlの、血清
の入っていないＲＰＭＩ１６４０培地を緩やかに攪拌し
ながら４〜５分間かけて添加した。この操作によりＰＥ
Ｇ１５００を希釈した。４００×ｇ、５分間低速遠心分
離した後、上清を除去し、１００mlの１０％ウシ胎児血
清（ＦＣＳ、Hyclone)を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸
濁し、４８ウェルの組織培養用プレートに分注し、５％
炭酸ガスに調整した炭酸ガスインキュベーター内におい
て、３７℃で培養した。２４時間培養した後、ＨＡＴ選
択培地（１×１０-7Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍア
ミノプテリン、１.６×１０-5チミジン）を加えた。融
合していないミエローマ細胞やマウス脾臓細胞は、この
培地中で生育できないために融合したハイブリドーマの
みが生育する。３〜４日おきに培地を入れ替え、１０〜
１４日培養した。培養上清中のモノクローナル抗体の活
性測定はＥＬＩＳＡ法で行った。サブクローニングは限
外希釈法で最低４回行った。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto. Example 1 Method for Preparing Monoclonal Antibody Against Microorganisms belonging to Lactobacillus 3 10-week-old female Balb / c mice (Japan SLC) were intraperitoneally mixed with Freund's complete adjuvant (Wako Pure Chemical Industries) to give 10 8 cells of lacto. The Bacillus paracasei subspecies paracasei H7 strain was immunized. After that, booster immunization into the tail vein was performed twice at 1-week intervals. Three days after the final immunization, the spleen of the mouse was aseptically removed, and spleen cells were separated from the tissue. The monoclonal antibody was prepared by the method of Keller et al. Mouse spleen cells and mouse myeloma cells (P3U1, Yelton et al., Curre
nt Topics in Microbiology and Immunology, Volume 81,
Pages 1-7, 1978) and centrifuged at 400 × g for 5 minutes at low speed. Then, RPM without serum
After washing once with I1640 medium (Nissui Pharmaceutical), the supernatant was removed, and 1 ml of polyethylene glycol 1500 (PE
G1500, Boehringer) with gentle stirring 1
Add drop wise over 1 minute. Then 9 ml of RPMI 1640 medium without serum was added over 4-5 minutes with gentle stirring. By this operation PE
G1500 was diluted. After low-speed centrifugation at 400 xg for 5 minutes, the supernatant was removed, suspended in 100 ml of RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum (FCS, Hyclone), and dispensed into a 48-well tissue culture plate, 5%
The cells were cultured at 37 ° C in a carbon dioxide incubator adjusted to carbon dioxide. After culturing for 24 hours, HAT selection medium (1 × 10 −7 M hypoxanthine, 4 × 10 −7 M aminopterin, 1.6 × 10 −5 thymidine) was added. Since unfused myeloma cells and mouse spleen cells cannot grow in this medium, only fused hybridomas grow. Replace the medium every 3-4 days for 10-
It was cultured for 14 days. The activity of the monoclonal antibody in the culture supernatant was measured by the ELISA method. Subcloning was performed at least 4 times by the ultradilution method.
【００２４】実施例２ ＥＬＩＳＡ ９６ウェルポリビニルクロライドプレート（住友ベーク
ライト）を０.２５％グルタルアルデヒドで２０分間処
理した。１０6セルのラクトバチルス・パラカゼイ・サ
ブスピーシーズ・パラカゼイＨ７株を各ウェルに分注
し、８００×ｇで１０分間遠心分離した。このラクトバ
チルス属微生物を固定したプレートに１％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ、シグマ）を含むリン酸緩衝性生理食塩
水（pＨ７.０）を加え、室温で２時間放置することによ
り、非特異的結合サイトをブロッキングした。プレート
を洗浄緩衝液（０.０５％ツィーン２０を含む１０mＭト
リス−ＨＣl緩衝液 pＨ８.０）で３回洗浄した。５０μ
lのモノクローナル抗体を加え、室温で１時間放置し
た。ついで、洗浄操作を行い、５０μlの西洋わさびパ
ーオキシダーゼ標識抗マウスＩgＧ＋ＩgＭ（タゴ社、
０.１％ＢＳＡ、０.０２％ツィーン２０を含む１０mＭ
トリス緩衝性生理食塩水で５００倍に希釈)を加えた。
室温で１時間放置した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。
ついで、５０μlの西洋わさびパーオキシダーゼの基質
溶液［０.０５％２,２'−アジノ−ジ−（３−エチルベ
ンゾチアゾリン）スルホン酸ジアンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ）、０.０３％過酸化水素水を含む１０mＭクエン酸ナ
トリウム緩衝液 pＨ４.２］を各ウェルに加えた。室温
で３０分間反応させた後、２mＭのアジ化ナトリウム５
０μlで酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダ
ー（コロナ電気）で４１５nm（対照波長４９０nm）の吸
光度を測定した。Example 2 ELISA A 96-well polyvinyl chloride plate (Sumitomo Bakelite) was treated with 0.25% glutaraldehyde for 20 minutes. 10 6 cells of Lactobacillus paracasei subspecies paracasei H7 strain were dispensed into each well and centrifuged at 800 xg for 10 minutes. Non-specific binding was achieved by adding phosphate-buffered saline (pH 7.0) containing 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma) to the plate on which the microorganism of the genus Lactobacillus was immobilized, and allowing it to stand at room temperature for 2 hours. Blocked the site. The plate was washed 3 times with wash buffer (10 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 containing 0.05% Tween 20). 50μ
Monoclonal antibody (1) was added, and the mixture was left at room temperature for 1 hour. Then, a washing operation was performed to obtain 50 μl of horseradish peroxidase-labeled anti-mouse IgG + IgM (Tago,
10 mM containing 0.1% BSA and 0.02% Tween 20
(Diluted 500 times with Tris buffered saline) was added.
After leaving it at room temperature for 1 hour, it was washed three times with a washing buffer.
Then, 50 μl of a horseradish peroxidase substrate solution [0.05% 2,2′-azino-di- (3-ethylbenzothiazoline) sulfonic acid diammonium salt (ABT
S), 10 mM sodium citrate buffer pH 4.2 containing 0.03% hydrogen peroxide was added to each well. After reacting at room temperature for 30 minutes, 2 mM sodium azide 5
The enzyme reaction was stopped with 0 μl, and the absorbance at 415 nm (control wavelength 490 nm) was measured with a microplate reader (Corona Electric).
【００２５】実施例３ モノクローナル抗体のラクトバチルス属に属する微生物
イムノブロットアッセイ ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラ
カゼイＨ７株から、中村ら（バイオサイエンス・バイオ
テクノロジー・バイオケミストリー、５９巻、２０３９
〜２０４３頁、１９９５年）の方法に準じてＳＤＳ抽出
タンパクを調製し、抗原とした。ウエスタンブロット
は、トウビンら［Towbin et al.，Proc．Natl．Acad．S
ci．USA.、７６巻、４３５０〜４３５４頁（１９７９
年）］の方法に準じて行った。ラクトバチルス・パラカ
ゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＨ７株のＳＤＳ抽
出サンプルを１０％ポリアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分画し、ニトロセルロースフィルターにエレクトロ
ブロット（ファルマシア−ＬＫＢ）(２５mＭトリス、２
００mＭグリシン、２０％メタノール）した。そのフィ
ルターを風乾後、室温で２時間 ０.５％スキムミルク溶
液（リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ））でブロッキン
グし、 ＰＢＳで洗浄した。 その後、精製したモノクロ
ーナル抗体溶液（０.１μg／ml）に浸し、室温で１時間
反応後、ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。西洋わさびパ
ーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウス２次抗体を室温
で１時間反応後、洗浄操作を繰り返した。フィルターを
ＨＲＰ発色剤［ＤＡＢ、３,３−ジアミノベンジジン、D
ojin）（ＰＢＳ中、ＤＡＢ０.０５％、Ｈ2Ｏ2 ０.００
５％ ］浸し、反応終了後、蒸留水で洗浄し風乾した。
かくして得られたモノクローナル抗体ＭＡb ho-Ｈ Ｊe
３は、上記の表１に示す１０株のラクトバチルス属に属
する微生物全てに存在する約４５kＤaのタンパク抗原を
認識していることが明らかとなった。さらに、酒造蔵よ
り分離した火落菌７６０株の分布を調べた結果、このモ
ノクローナル抗体はすべての火落菌に反応した。Example 3 Immunoblot Assay of Monoclonal Antibody Microorganisms belonging to the Genus Lactobacillus From Lactobacillus paracasei subspecies paracasei H7 strain, Nakamura et al. (Bioscience / Biotechnology / Biochemistry, Volume 59, 2039)
~ 2043, 1995), SDS extracted protein was prepared and used as an antigen. Western blots have been described by Towbin et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA., 76, 4350-4354 (1979).
Year)]. Lactobacillus paracasei subspecies paracasei H7 strain SDS extraction sample is 10% polyacrylamide SDS-PAG
Fractionation with E and electroblotting (Pharmacia-LKB) (25 mM Tris, 2
(00 mM glycine, 20% methanol). The filter was air dried, blocked at room temperature for 2 hours with 0.5% skim milk solution (phosphate buffered saline (PBS)), and washed with PBS. Then, it was immersed in a purified monoclonal antibody solution (0.1 μg / ml), reacted at room temperature for 1 hour, and washed with PBS for 5 minutes 3 times. After reacting with horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse secondary antibody at room temperature for 1 hour, the washing operation was repeated. Filter with HRP color developer [DAB, 3,3-diaminobenzidine, D
ojin) (DAB 0.05% in PBS, H 2 O 2 0.00
5%], and after completion of the reaction, it was washed with distilled water and air-dried.
The monoclonal antibody MAb ho-H Je thus obtained
It was revealed that 3 recognizes a protein antigen of about 45 kDa present in all 10 strains of microorganisms belonging to the genus Lactobacillus shown in Table 1 above. Furthermore, as a result of investigating the distribution of 760 strains of Hokuto bacteria isolated from the brewery, this monoclonal antibody reacted with all of the Hoshi bacteria.
【００２６】実施例４ ラクトバチルス属に属する微生物のＥＦ−Ｔｕ遺伝子の
クローニングおよび塩基配列の決定 （１）ラクトバチルス属に属する微生物からのＤＮＡの
抽出 ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラ
カゼイＨ７株を、３００mlのＳＩ培地（１０％エタノー
ル、寒天なし）で、対数増殖後期まで３０℃で培養し、
遠心分離（１０,０００×ｇ、１０分間、４℃）で集菌
した。ＴＭ緩衝液（１mＭ ＭgＣl2、１０mＭトリス−リ
ンゴ酸塩、pＨ６.８）で洗浄した後、１０mlの２０mＭ
ＥＤＴＡを含むＴＭ緩衝液に懸濁させた。ラクトバチル
ス属微生物細胞壁の溶解は、大淵ら(醗酵工学会誌、６
７巻、４９１〜４９８頁、１９８９年)の方法により行
った。上記のラクトバチルス属微生物の懸濁液に、３０
０μgのリゾチーム（シグマ）、６００μgのＮ-アセチ
ルムラミダーゼＳＧ（生化学工業）、１０００μgのア
クロモペプチダーゼ（和光純薬）を添加し、３７℃で２
時間インキュベートした。ついで、０.１mlの１０％Ｓ
ＤＳを添加し、６５℃、１５分間インキュベートした。
それをフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコー
ル（２４：２４：１）で２回、その後に、クロロホルム
で１回抽出した後、エタノール沈殿によりＤＮＡ画分を
得た。そのＤＮＡ画分を、1mＭ ＥＤＴＡを含む１０mＭ
トリス−ＨＣl緩衝液（pＨ８.０）に溶解した。Example 4 Cloning of EF-Tu gene of microorganism belonging to Lactobacillus genus and determination of nucleotide sequence (1) Extraction of DNA from microorganism belonging to Lactobacillus genus Lactobacillus paracasei subspecies paracasei H7 strain , 300 ml of SI medium (10% ethanol, no agar), cultured at 30 ° C until late logarithmic growth,
The cells were collected by centrifugation (10,000 xg, 10 minutes, 4 ° C). After washing with TM buffer (1 mM MgCl 2 , 10 mM Tris-malate, pH 6.8), 10 ml of 20 mM
The cells were suspended in TM buffer containing EDTA. Lysis of the cell wall of Lactobacillus is described by Ohbuchi et al. (Journal of Fermentation Engineering, 6
7, 491-498, 1989). To the suspension of the above Lactobacillus microorganism, 30
Add 0 μg of lysozyme (Sigma), 600 μg of N-acetylmuramidase SG (Seikagaku Corporation), 1000 μg of achromopeptidase (Wako Pure Chemical Industries), and add 2 at 37 ° C.
Incubated for hours. Then 0.1 ml of 10% S
DS was added and incubated at 65 ° C for 15 minutes.
It was extracted twice with phenol-chloroform-isoamyl alcohol (24: 24: 1) and then once with chloroform, followed by ethanol precipitation to obtain a DNA fraction. The DNA fraction was added to 10 mM containing 1 mM EDTA.
It was dissolved in Tris-HCl buffer (pH 8.0).
【００２７】（２）ライブラリーの構築 得られたＤＮＡ画分をＥcoＲＩで部分分解した後、０.
８％アガロースゲルで分画し、２〜９kbpのＤＮＡ画分
を回収した。回収したＤＮＡ２０００ngと１ngのλＺＡ
ＰＩＩ（ＥcoＲＩカット、ストラトジーン)をライゲー
ションし、ＧＩＧＡパックＩＩ・ゴールド・パッケージ
ング・エキストラクト（pack ＩＩ goldpackaging extr
act、ストラトジーン）でパッケージングを行った。(2) Construction of library The obtained DNA fraction was partially digested with EcoRI and
Fractionation was performed on an 8% agarose gel, and a DNA fraction of 2 to 9 kbp was collected. 2000 ng of recovered DNA and 1 ng of λZA
PII (EcoRI cut, Stratogene) is ligated, and GIGA pack II gold packaging extract (pack II goldpackaging extr
act, Stratogene) was packaged.
【００２８】（３）モノクローナル抗体によるライブラ
リーのスクリーニング モノクローナル抗体を用いたライブラリーのスクリーニ
ングは、サンブルークら［Ｓambrook et al.，Molecula
r cloning．A laboratory manual 2nd．ed．(１９８９
年）］の方法により行った。λＺＡＰＩＩで構築したラ
イブラリーをホストＸＬ−１Ｂlueに感染させ、５０μg
／mlアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にまき、４２℃
で、３.５時間インキュベートした。プラークを形成し
た寒天培地に、１０mＭのイソプロピル−１−チオ−β
−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）溶液を滲みこませ、乾
燥させたニトロセルロースフィルターを載せ、３７℃で
３.５時間インキュベートした後、フィルターを取り除
いた。ついで、ＴＢＳ−Ｔ（０.０５％ツィーン２０お
よび１５０mＭ塩化ナトリウムを含む５０mＭトリス−Ｈ
Ｃl緩衝液pＨ７.５）で洗浄した後、３％スキムミルク
（雪印）を含むＴＢＳ−Ｔ緩衝液中で一晩ブロッキング
した。つぎに、ブロッキング緩衝液中に精製したモノロ
ーナル抗体（１μg／ml）を加え、室温で２時間反応さ
せた。ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、西洋わさびパー
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウス２次抗体（タゴ社）をブ
ロッキング緩衝液に加え（１：５００）、室温で１時間
反応させた。ＴＢＳ緩衝液で３回洗浄し、パーオキシダ
ーゼ発色剤（０.０５％ＤＡＢ、０.０１５％過酸化水素
水を含むＰＢＳ緩衝液、pＨ７.０）で発色させた後、蒸
留水で洗浄した後、風乾した。(3) Screening of library with monoclonal antibody Screening of library with monoclonal antibody was carried out by the method of Sambrook et al., Molecula.
r cloning. A laboratory manual 2nd. ed. (1989
Year)] method. The library constructed with λZAPII was infected with host XL-1Blue, and 50 μg
/ LB agar medium containing ampicillin / 42 ℃
Incubated for 3.5 hours. Add 10 mM isopropyl-1-thio-β to the plaque-formed agar medium.
The solution was infiltrated with a -D-galactoside (IPTG) solution, mounted with a dried nitrocellulose filter, and incubated at 37 ° C for 3.5 hours, and then the filter was removed. Then TBS-T (50 mM Tris-H containing 0.05% Tween 20 and 150 mM sodium chloride).
After washing with Cl buffer pH 7.5), blocking was performed overnight in TBS-T buffer containing 3% skim milk (snowmark). Next, purified monolonal antibody (1 μg / ml) was added to the blocking buffer, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours. After washing twice with TBS-T buffer, horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse secondary antibody (Tago) was added to the blocking buffer (1: 500), and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with TBS buffer, developing with peroxidase coloring agent (PBS buffer containing 0.05% DAB, 0.015% hydrogen peroxide solution, pH 7.0), and then washing with distilled water , Air dried.
【００２９】（４）サザンハイブリダイゼーション ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラ
カゼイＨ７株のゲノムＤＮＡをＥcoＲＩで部分分解後、
０.８％アガロースゲルで分画し、Hybond−Ｎ−ナイロ
ンメンブレンフィルター（アマシャム）にブロッティン
グした。プローブの標識にはＥＣＬランダムプライムラ
ベリング検出システム（アマシャム）を用いた。ハイブ
リダイゼーションは、５×ＳＳＣ溶液［５×ＳＳＣ
（０.７５Ｍ塩化ナトリウム、０.０７５Ｍクエン酸ナト
リウム）、０.５％ブロッキング試薬、０.１％ＳＤＳ、
５％硫酸デキストリン）中で６０℃にて、一晩行った。
ハイブリダイゼーションの後、メンブレンフィルターを
０.１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃にて２回洗浄
した。ハイブリダイゼーションパターンの検出は、ＥＣ
Ｌランダムプライムラベリング検出システム（アマシャ
ム）で行った。(4) Southern Hybridization Genomic DNA of Lactobacillus paracasei subspecies paracasei H7 strain was partially digested with EcoRI,
Fractionation was carried out on a 0.8% agarose gel and blotted on a Hybond-N-nylon membrane filter (Amersham). An ECL random prime labeling detection system (Amersham) was used for labeling the probe. Hybridization is performed with 5xSSC solution [5xSSC
(0.75M sodium chloride, 0.075M sodium citrate), 0.5% blocking reagent, 0.1% SDS,
5% dextrin sulfate) at 60 ° C. overnight.
After the hybridization, the membrane filter was washed twice with 1 × SSC containing 0.1% SDS at 60 ° C. Hybridization pattern is detected by EC
L random prime labeling detection system (Amersham) was used.
【００３０】（５）塩基配列の決定 塩基配列の決定は、サンガーら［Sanger et al.，Pro
c．Natl．Acad．Sci．USA.、７４巻、５４６３〜５４６
７頁（１９７７年）］の蛍光標識プライマーを用いたダ
イデオキシターミネーター法により、３７７オートメー
トシーケンシングシステム（パーキンエルマー）で行っ
た。得られた塩基配列の解析は、ＤＮＡＳＩＳシステム
ソフトウェアー(日立ソフトウェアーエンジニアリング)
で行った。かくして、配列表の配列番号１で表される、
ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・ パ
ラカゼイＨ７の遺伝子配列の全塩基配列を決定した。(5) Determination of nucleotide sequence The nucleotide sequence was determined by Sanger et al., Pro.
c. Natl. Acad. Sci. USA., Volume 74, 5463-546
7 (1977)] by the dideoxy terminator method using the fluorescent-labeled primer, using a 377 automated sequencing system (Perkin Elmer). The obtained base sequence is analyzed by DNASIS system software (Hitachi Software Engineering)
I went in. Thus, represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
The entire nucleotide sequence of the gene sequence of Lactobacillus paracasei subspecies paracasei H7 was determined.
【００３１】実施例５ プライマーの合成 配列表の配列番号２で表される２０塩基のオリゴヌクレ
オチド、配列表の配列番号３で表される２０塩基のオリ
ゴヌクレオチドを、それぞれのＤＮＡ合成装置（アプラ
イドバイオシステムズ社）により、トリチル−オンの条
件下で合成した。２７％アンモニア水溶液でカラムから
切り出し、５５℃で一晩加熱した。得られた溶液２mlを
イオン交換水１mlで希釈し、希釈液をＯＰＣ（oligonuc
leotidepurification column）カートリッジ（アプライ
ドバイオシステムズ社）に１〜２滴／秒の速度で加え
た。溶出液を希釈アンモニア水溶液５mlで２回、２％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液５mlで２回、そしてさら
にイオン交換水５mlで２回洗浄した。吸着したヌクレオ
チドを２０％アセトニトリル溶液１mlで３回溶出して、
精製オリゴヌクレオチドを得た。こうして得られたプラ
イマーを用いて以下の実施例で使用した。Example 5 Synthesis of Primer A 20-base oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and a 20-base oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing were each synthesized by a DNA synthesizer (Applied Biotechnology). Systems) under the conditions of trityl-one. The column was cut with a 27% aqueous ammonia solution and heated at 55 ° C. overnight. 2 ml of the obtained solution was diluted with 1 ml of ion-exchanged water, and the diluted solution was diluted with OPC (oligonuc
leotidepurification column) cartridge (Applied Biosystems) was added at a rate of 1 to 2 drops / second. The eluate was washed twice with 5 ml of dilute aqueous ammonia solution, twice with 5 ml of 2% trifluoroacetic acid (TFA) solution, and further twice with 5 ml of deionized water. The adsorbed nucleotide was eluted 3 times with 1 ml of 20% acetonitrile solution,
A purified oligonucleotide was obtained. The primer thus obtained was used in the following examples.
【００３２】実施例６ ＰＣＲによるＥＦ−Ｔｕ遺伝子の増幅 １.５mlのポリプロピレンチューブ（アシスト）に、Ｐ
ＣＲ溶液（５０mＭ ＫＣl、２０mＭトリス−ＨＣl、pＨ
８.４、１.５mＭ ＭgＣl2、２００mＭ dＮＴＰs、０.２
μＭプライマー、１.２５Ｕ Ｔaq ＤＮＡポリメラー
ゼ、火落菌ＤＮＡ）を加え、蒸留水で５０μlに調整し
た。それに３５μlのミネラルオイル（シグマ）を添加
し、プログラムテンプコントローラー（アステック）に
セットした。ディネーチャー：９４℃、０.５分−アニ
ーリング５５℃、１分−エクステンション７２℃、１分
のＰＣＲ反応サイクルを３５回行った。Example 6 Amplification of EF-Tu Gene by PCR Into a 1.5 ml polypropylene tube (assist), P
CR solution (50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH
8.4, 1.5 mM MgCl 2 , 200 mM dNTPs, 0.2
A μM primer, 1.25 U Taq DNA polymerase, and Hakuhochi DNA) was added, and the volume was adjusted to 50 μl with distilled water. 35 μl of mineral oil (Sigma) was added to it, and it was set in the program temp controller (Astec). Denature: 94 ° C., 0.5 min-annealing 55 ° C., 1 min-extension 72 ° C., 1 min PCR reaction cycle was performed 35 times.
【００３３】実施例７ ＰＣＲ合成産物の検出 ＰＣＲ合成産物の分析は、１.５％アガロースゲル電気
泳動で行った。１０μlの反応液を電気泳動にかけ、エ
チジウムブロミドで染色し、紫外線下で観察した。分子
量マーカーはφＸ１７４／ＨaeＩＩＩダイジェスト(東
洋紡)を用いた。上記表１に示したラクトバチルス属に
属する微生物１０株およびイー・コリ（Ｅ．coli）、バ
チルス・サブチリス（Ｂacillus subtilis）、清酒酵母
菌（Ｓaccharomyces cerevisiae）、清酒麹菌（Ａsperg
illus oryzae）のゲノムＤＮＡとλＤＮＡを用いてＰＣ
Ｒ反応を行った。１０ngのゲノムＤＮＡをテンプレート
として用いた。 その結果、ラクトバチルス属微生物の
火落菌標準株である上記１０株はすべて特異的な約６７
０bpのシングルバンドが増幅された。しかし、それ以外
のＤＮＡは全く増幅されなかった。また、酒造蔵より分
離された火落菌の中からランダムに９７株選択し、ＰＣ
Ｒ反応で増幅を行った。１０2セルの菌体を用いて反応
を行った結果、このプライマーの組み合わせは試験した
すべての火落菌を増幅した。ラクトバチルス・フルクチ
ボランスＨ１株のゲノムＤＮＡの１ng〜１０fgの希釈系
列を作製し、ＰＣＲ反応を行い、検出感度を調べた。そ
の結果、乳酸桿菌のシングルセル（Spiranganathan et
al.，Dairy Sci.、６８巻、１０７７〜１０８６頁、１
９８５年； Le Bourgeois et al.，ＦＥＭＳ Microbio
l．Lett.、５９巻、６５〜６９頁、１９８９年）のＤＮ
Ａ量に相当する１０fgのゲノムＤＮＡを検出することが
できた。また、清酒中にラクトバチルス・フルクチボラ
ンスＨ１株を接種（１０0〜１０3セル)し、集積濾過で
回収後、ＰＣＲ反応を行い検出した。その結果、１０3
〜１０1セルの火落菌を接種したサンプルにおいて、Ｐ
ＣＲ法により火落菌を検出できた。Example 7 Detection of PCR synthesis product The analysis of the PCR synthesis product was performed by 1.5% agarose gel electrophoresis. 10 μl of the reaction solution was subjected to electrophoresis, stained with ethidium bromide, and observed under ultraviolet light. As the molecular weight marker, φX174 / HaeIII digest (Toyobo) was used. 10 strains of microorganism belonging to the genus Lactobacillus shown in Table 1 above, E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, and Asperg.
illus oryzae) genomic DNA and λDNA
An R reaction was performed. 10 ng of genomic DNA was used as template. As a result, the above-mentioned 10 strains, which are the standard strains of Lactobacillus microorganisms, were found to be about 67
A single band of 0 bp was amplified. However, no other DNA was amplified. In addition, 97 strains were randomly selected from among the scabs isolated from the sake brewery, and PC
Amplification was performed by R reaction. As a result of carrying out the reaction using 10 2 cells, this primer combination amplified all of the tested downstrains. A dilution series of 1 ng to 10 fg of the genomic DNA of Lactobacillus fructivorans H1 strain was prepared, PCR reaction was performed, and the detection sensitivity was examined. As a result, Lactobacillus single cell (Spiranganathan et al.
al., Dairy Sci., 68, 1077-1086, 1
985; Le Bourgeois et al., FEMS Microbio
l. Lett., 59, 65-69, 1989)
It was possible to detect 10 fg of genomic DNA corresponding to the amount of A. Further, inoculated Lactobacillus Furukuchiboransu an H1 strain in sake and (10 0 - 10 3 cells) was recovered in an integrated filtration and detection PCR was performed. As a result, 10 3
In samples inoculated with ˜10 1 cells of Hichirushi, P
It was possible to detect Hakuhochi bacteria by the CR method.
【００３４】[0034]
【発明の効果】以上記載したように、本発明によれば、
ラクトバチルス属に属する微生物のＥＦ−Ｔｕ遺伝子の
塩基配列およびアミノ酸配列が明らかとなり、それらの
塩基配列を基にして各菌種を特異的に認識するオリゴヌ
クレオチドプローブを作成し、これらのオリゴヌクレオ
チドプローブを用いることによって、高感度で、しかも
迅速にラクトバチルス属に属する微生物、特に火落菌を
特異的に検出できるようになった。As described above, according to the present invention,
The nucleotide sequence and amino acid sequence of the EF-Tu gene of a microorganism belonging to the genus Lactobacillus have been clarified, and oligonucleotide probes specifically recognizing each bacterial species have been prepared based on these nucleotide sequences. By using, it has become possible to specifically detect a microorganism belonging to the genus Lactobacillus, particularly a fire-fall bacterium, with high sensitivity and quickly.
【００３５】[0035]
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１３５１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ラクトバチルル・パラカゼイ・サブスピーシス・
パラカゼイ （Lactobacillus paracasei subsp. paracasei） 株名：Ｈ７ 配列の特徴 １３０−１３１７ ＥＦ−Ｔｕ遺伝子 配列 GAATTCATTT CCAGCGTAGA TATTTGTTTT GGTATTTACG CTCAAATGTA GTACACTTAA 60 ACGTAAGGAT TATCAGGGTA CACAAGGTAT CCTGTATTCT TACGAAAAAT ACAGGAGGTT 120 CGTTTTTTC ATG GCT GAA AAA GAA CAC TAT GAA CGC ACA AAG CCC CAC GTA 171 Met Ala Glu Lys Glu His Tyr Glu Arg Thr Lys Pro His Val 1 5 10 AAC ATT GGT ACG ATC GGG CAC GTT GAC CAC GGT AAG ACT ACT TTG ACC 219 Asn Ile Gly Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr 15 20 25 30 GCG GCT ATC ACT AAG GTA TTG TCA GAA AAG GGC CTT GCC AAA GCG CAA 267 Ala Ala Ile Thr Lys Val Leu Ser Glu Lys Gly Leu Ala Lys Ala Gln 35 40 45 GAC TAC GCT TCT ATC GAT GCT GCT CCA GAA GAA AAG GAA CGT GGC ATC 315 Asp Tyr Ala Ser Ile Asp Ala Ala Pro Glu Glu Lys Glu Arg Gly Ile 50 55 60 ACA ATC AAC ACC GCC CAC GTT GAA TAT GAA ACC GAA AAG CGC CAC TAG 363 Thr Ile Asn Thr Ala His Val Glu Tyr Glu Thr Glu Lys Arg His Tyr 65 70 75 GCA CAT ATT GAT GCG CCA GGG CAT GCT GAC TAC GTT AAG AAC ATG ATC 411 Ala His Ile Asp Ala Pro Gly His Ala Asp Tyr Val Lys Asn Met Ile 80 85 90 ACC GGT GCT GCA CAG ATG GAT GGT GCG ATC TTG GTT GTT GCG GCA ACT 459 Thr Gly Ala Ala Gln Met Asp Gly Ala Ile Leu Val Val Ala Ala Thr 95 100 105 110 GAT GGC CCA ATG CCA CAG ACC CGT GAG CAT ATC TTG TTG GCT CGT CAG 507 Asp Gly Pro Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Ala Arg Gln 115 120 125 GTC GGC GTT GAT TAT ATC GTT GTT TTC CTG AAC AAG ACA GAC TTG GTT 555 Val Gly Val Asp Tyr Ile Val Val Phe Leu Asn Lys Thr Asp Leu Val 130 135 140 GAC GAT CCA GAA TTG ATC GAC TTG GTT GAA ATG GAA GTC CGG GAA CTG 603 Asp Asp Pro Glu Leu Ile Asp Leu Val Glu Met Glu Val Arg Glu Leu 145 150 155 CTC AGC GAA TAC GAT TAT CCT GGT GAT GAT ATT CCT GTT ATC CGT GGT 651 Leu Ser Glu Tyr Asp Tyr Pro Gly Asp Asp Ile Pro Val Ile Asp Gly 160 165 170 TCT GCT CTG AAG GCC CTT GAA GGC GAT CCA GAA CAG GAA AAG GTT ATC 699 Ser Ala Leu Lys Ala Leu Glu Gly Asp Pro Glu Gln Glu Lys Val Ile 175 180 185 190 ATG GAA TTG ATG GAT ACC ATC GAT GAA TAT ATC CCA ACA CCT GTT CGT 747 Met Glu Leu Met Asp Thr Ile Asp Glu Tyr Ile Pro Thr Pro Val Arg 195 200 205 GAA ACA GAC AAG CCT TTC TTG ATG CCT GTT GAA GAT GTC TTC ACC ATC 795 Glu Thr Asp Lys Pro Phe Leu Met Pro Val Glu Asp Val Phe Thr Ile 210 215 220 ACT GGT CGT GGT ACA GTT GCT TCT GGC CGT ATC GAT CGT GGG ACG GTT 843 Thr Gly Arg Gly Thr Val Ala Ser Gly Arg Ile Asp Arg Gly Thr Val 225 230 235 AAG ATT GGT GAC GAA GTT GAA ATC ATC GGC TTG AAG CCA GAT GTT ATC 891 Lys Ile Gly Asp Glu Val Glu Ile Ile Gly Leu Lys Pro Asp Val Ile 240 245 250 AAG TCT ACC GTT ACT GGT CTT GAA ATG TTC CGT AAG ACC TTG GAT CTT 939 Lys Ser Thr Val Thr Gly Leu Glu Met Phe Arg Lys Thr Leu Asp Leu 255 260 265 270 GGT GAA GCC GGC GAT AAC GTT GGT GTC TTG CTT CGT GGT GTT AAC CGC 987 Gly Glu Ala Gly Asp Asn Val Gly Val Leu Leu Arg Gly Val Asn Arg 275 280 285 GAA CAA GTT GAA CGT GGC CAA GTT TTG GCA AAG CCA GGT TCA ATC CAA 1035 Glu Gln Val Glu Arg Gly Gln Val Leu Ala Lys Pro Gly Ser Ile Gln 290 295 300 TTG CAC AAC AAG TTC AAG GGT GAA GTT TAT ATC TTG ACA AAA GAA GAA 1083 Leu His Asn Lys Phe Lys Gly Glu Val Tyr Ile Leu Thr Lys Glu Glu 305 310 315 GGT GGC CGT CAT ACG CCA TTC TTC TCA AAC TAT CGT CCG CAG TTC TAC 1131 Gly Gly Arg His Thr Pro Phe Phe Ser Asn Tyr Arg Pro Gln Phe Tyr 320 325 330 TTC CAC ACC ACT GAT GTT ACC GGT GTG ATT GAA TTG CCA GAT GGC GTT 1179 Phe His Thr Thr Asp Val Thr Gly Val Ile Glu Leu Pro Asp Gly Val 335 340 345 350 GAA ATG GTT ATG CCT GGC GAT AAC GTT ACT TTC GAA GTT GAC CTG ATT 1227 Glu Met Val Met Pro Gly Asp Asn Val Thr Phe Glu Val Asp Leu Ile 355 360 365 GCT CCG GTT GCT ATC GAA AAA GGT ACC AAG TTC ACC GTC CGT GAA GGC 1275 Ala Pro Val Ala Ile Glu Lys Gly Thr Lys Phe Thr Val Arg Glu Gly 370 375 380 GGC CGT ACT GTT GGT GCC GGC GTT GTT TCC GAA ATC CTT GAC 1317 Gly Arg Thr Val Gly Ala Gly Val Val Ser Glu Ile Leu Asp 385 390 395 TAATTTCTGA ATATACGCAT GAACCCGCAA GCTT 1351[Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 1351 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: genomic DNA Origin organism name: Lactobacillus paracasei subsp.
Paracasei (Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei) Strain name: Features of H7 sequence 130-1317 EF-Tu gene sequence GAATTCATTT CCAGCGTAGA TATTTGTTTT GGTATTTACG CTCAAATGTA GTACACTCCA GATCATCATCAGACGAAGACATGATCAGACATGATCAGACATGATCAGACATGATCAGACATACGAAGACATGAGACAAGAA CAC GTA 171 Met Ala Glu Lys Glu His Tyr Glu Arg Thr Lys Pro His Val 1 5 10 AAC ATT GGT ACG ATC GGG CAC GTT GAC CAC GGT AAG ACT ACT TTG ACC 219 Asn Ile Gly Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr 15 20 25 30 GCG GCT ATC ACT AAG GTA TTG TCA GAA AAG GGC CTT GCC AAA GCG CAA 267 Ala Ala Ile Thr Lys Val Leu Ser Glu Lys Gly Leu Ala Lys Ala Gln 35 40 45 GAC TAC GCT TCT ATC GAT GCT GCT CCA GAA GAA AAG GAA CGT GGC ATC 315 Asp Tyr Ala Ser Ile Asp Ala Ala Pro Glu Glu Lys Glu Arg Gly Ile 50 55 60 ACA ATC AAC ACC GCC CAC GTT GAA TAT GAA ACC GAA AAG CGC CAC TAG 363 Thr Ile Asn Thr Ala His Val Glu Tyr Glu Thr Glu Lys Arg His Tyr 65 70 75 GCA CAT A TT GAT GCG CCA GGG CAT GCT GAC TAC GTT AAG AAC ATG ATC 411 Ala His Ile Asp Ala Pro Gly His Ala Asp Tyr Val Lys Asn Met Ile 80 85 90 ACC GGT GCT GCA CAG ATG GAT GGT GCG ATC TTG GTT GTT GCG GCA ACT 459 Thr Gly Ala Ala Gln Met Asp Gly Ala Ile Leu Val Val Ala Ala Thr 95 100 105 110 GAT GGC CCA ATG CCA CAG ACC CGT GAG CAT ATC TTG TTG GCT CGT CAG 507 Asp Gly Pro Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Ala Arg Gln 115 120 125 GTC GGC GTT GAT TAT ATC GTT GTT TTC CTG AAC AAG ACA GAC TTG GTT 555 Val Gly Val Asp Tyr Ile Val Val Phe Leu Asn Lys Thr Asp Leu Val 130 135 140 GAC GAT CCA GAA TTG ATC GAC TTG GTT GAA ATG GAA GTC CGG GAA CTG 603 Asp Asp Pro Glu Leu Ile Asp Leu Val Glu Met Glu Val Arg Glu Leu 145 150 155 CTC AGC GAA TAC GAT TAT CCT GGT GAT GAT ATT CCT GTT ATC CGT GGT 651 Leu Ser Glu Tyr Asp Tyr Pro Gly Asp Asp Ile Pro Val Ile Asp Gly 160 165 170 TCT GCT CTG AAG GCC CTT GAA GGC GAT CCA GAA CAG GAA AAG GTT ATC 699 Ser Ala Leu Lys Ala Leu Glu Gly Asp Pro Glu Gln Glu Lys Val Ile 175 180 185 1 90 ATG GAA TTG ATG GAT ACC ATC GAT GAA TAT ATC CCA ACA CCT GTT CGT 747 Met Glu Leu Met Asp Thr Ile Asp Glu Tyr Ile Pro Thr Pro Val Arg 195 200 205 GAA ACA GAC AAG CCT TTC TTG ATG CCT GTT GAA GAT GTC TTC ACC ATC 795 Glu Thr Asp Lys Pro Phe Leu Met Pro Val Glu Asp Val Phe Thr Ile 210 215 220 ACT GGT CGT GGT ACA GTT GCT TCT GGC CGT ATC GAT CGT GGG ACG GTT 843 Thr Gly Arg Gly Thr Val Ala Ser Gly Arg Ile Asp Arg Gly Thr Val 225 230 235 AAG ATT GGT GAC GAA GTT GAA ATC ATC GGC TTG AAG CCA GAT GTT ATC 891 Lys Ile Gly Asp Glu Val Glu Ile Ile Gly Leu Lys Pro Asp Val Ile 240 245 250 AAG TCT ACC GTT ACT GGT CTT GAA ATG TTC CGT AAG ACC TTG GAT CTT 939 Lys Ser Thr Val Thr Gly Leu Glu Met Phe Arg Lys Thr Leu Asp Leu 255 260 265 270 GGT GAA GCC GGC GAT AAC GTT GGT GTC TTG CTT CGT GGT GTT AAC CGC 987 Gly Glu Ala Gly Asp Asn Val Gly Val Leu Leu Arg Gly Val Asn Arg 275 280 285 GAA CAA GTT GAA CGT GGC CAA GTT TTG GCA AAG CCA GGT TCA ATC CAA 1035 Glu Gln Val Glu Arg Gly Gln Val Leu Ala Lys Pro Gly Ser Ile Gln 290 295 300 TTG CAC AAC AAG TTC AAG GGT GAA GTT TAT ATC TTG ACA AAA GAA GAA 1083 Leu His Asn Lys Phe Lys Gly Glu Val Tyr Ile Leu Thr Lys Glu Glu 305 310 315 GGT GGC CGT CAT ACG CCA TTC TTC TCA AAC TAT CGT CCG CAG TTC TAC 1131 Gly Gly Arg His Thr Pro Phe Phe Ser Asn Tyr Arg Pro Gln Phe Tyr 320 325 330 TTC CAC ACC ACT GAT GTT ACC GGT GTG ATT GAA TTG CCA GAT GGC GTT 1179 Phe His Thr Thr Asp Val Thr Gly Val Ile Glu Leu Pro Asp Gly Val 335 340 345 350 GAA ATG GTT ATG CCT GGC GAT AAC GTT ACT TTC GAA GTT GAC CTG ATT 1227 Glu Met Val Met Pro Gly Asp Asn Val Thr Phe Glu Val Asp Leu Ile 355 360 365 GCT CCG GTT GCT ATC GAA AAA GGT ACC AAG TTC ACC GTC CGT GAA GGC 1275 Ala Pro Val Ala Ile Glu Lys Gly Thr Lys Phe Thr Val Arg Glu Gly 370 375 380 GGC CGT ACT GTT GGT GCC GGC GTT GTT TCC GAA ATC CTT GAC 1317 Gly Arg Thr Val Gly Ala Gly Val Val Ser Glu Ile Leu Asp 385 390 395 TAATTTCTGA ATATACGCAT GAACCCGCAA GCTT 1351
【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGGTTGTTG CGGCAACTGA 20SEQ ID NO: 2 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear sequence TTGGTTGTTG CGGCAACTGA 20
【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ＣＧＡＴＡＧＴＴＴＧ ＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧ
２０SEQ ID NO: 3 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear sequence CGATAGTTTG AGAAGAATGG
20
フロントページの続き (72)発明者 梅原 康夫 兵庫県西宮市今津出在家町４番９号 大関 株式会社総合研究所内 (72)発明者 濱地 正昭 兵庫県西宮市今津出在家町４番９号 大関 株式会社総合研究所内 (72)発明者 熊谷 知栄子 兵庫県西宮市今津出在家町４番９号 大関 株式会社総合研究所内Front page continuation (72) Inventor Yasuo Umehara 4-9 Imazu Izaike, Nishinomiya-shi, Hyogo Ozeki Research Institute (72) Inventor Masaaki Hamachi 4-9 Imazu-Iemachi, Nishinomiya-shi, Hyogo Ozeki Inside Research Institute Co., Ltd. (72) Inventor Chieko Kumagai 4-9 Imazu Ikemachi, Nishinomiya-shi, Hyogo Ozeki Research Institute
Claims (12)
パク質生合成におけるポリペプチド鎖延長反応に関与
し、アミノアシル−tＲＮＡのリボソームＡ部位への転
移を触媒する能力を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定
される分子量が約４５,０００であることを特徴とする
ポリペプチド鎖延長因子Ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ）。1. A method involved in a polypeptide chain elongation reaction in protein biosynthesis of a microorganism belonging to the genus Lactobacillus, having the ability to catalyze the transfer of aminoacyl-tRNA to the ribosome A site, and measured by SDS-PAGE. A polypeptide chain elongation factor Tu (EF-Tu) having a molecular weight of about 45,000.
１）を有する請求項１記載のＥＦ−Ｔｕ機能を有するポ
リペプチド： GAATTCATTT CCAGCGTAGA TATTTGTTTT GGTATTTACG CTCAAATGTA GTACACTTAA 60 ACGTAAGGAT TATCAGGGTA CACAAGGTAT CCTGTATTCT TACGAAAAAT ACAGGAGGTT 120 CGTTTTTTC ATG GCT GAA AAA GAA CAC TAT GAA CGC ACA AAG CCC CAC GTA 171 Met Ala Glu Lys Glu His Tyr Glu Arg Thr Lys Pro His Val 1 5 10 AAC ATT GGT ACG ATC GGG CAC GTT GAC CAC GGT AAG ACT ACT TTG ACC 219 Asn Ile Gly Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr 15 20 25 30 GCG GCT ATC ACT AAG GTA TTG TCA GAA AAG GGC CTT GCC AAA GCG CAA 267 Ala Ala Ile Thr Lys Val Leu Ser Glu Lys Gly Leu Ala Lys Ala Gln 35 40 45 GAC TAC GCT TCT ATC GAT GCT GCT CCA GAA GAA AAG GAA CGT GGC ATC 315 Asp Tyr Ala Ser Ile Asp Ala Ala Pro Glu Glu Lys Glu Arg Gly Ile 50 55 60 ACA ATC AAC ACC GCC CAC GTT GAA TAT GAA ACC GAA AAG CGC CAC TAG 363 Thr Ile Asn Thr Ala His Val Glu Tyr Glu Thr Glu Lys Arg His Tyr 65 70 75 GCA CAT ATT GAT GCG CCA GGG CAT GCT GAC TAC GTT AAG AAC ATG ATC 411 Ala His Ile Asp Ala Pro Gly His Ala Asp Tyr Val Lys Asn Met Ile 80 85 90 ACC GGT GCT GCA CAG ATG GAT GGT GCG ATC TTG GTT GTT GCG GCA ACT 459 Thr Gly Ala Ala Gln Met Asp Gly Ala Ile Leu Val Val Ala Ala Thr 95 100 105 110 GAT GGC CCA ATG CCA CAG ACC CGT GAG CAT ATC TTG TTG GCT CGT CAG 507 Asp Gly Pro Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Ala Arg Gln 115 120 125 GTC GGC GTT GAT TAT ATC GTT GTT TTC CTG AAC AAG ACA GAC TTG GTT 555 Val Gly Val Asp Tyr Ile Val Val Phe Leu Asn Lys Thr Asp Leu Val 130 135 140 GAC GAT CCA GAA TTG ATC GAC TTG GTT GAA ATG GAA GTC CGG GAA CTG 603 Asp Asp Pro Glu Leu Ile Asp Leu Val Glu Met Glu Val Arg Glu Leu 145 150 155 CTC AGC GAA TAC GAT TAT CCT GGT GAT GAT ATT CCT GTT ATC CGT GGT 651 Leu Ser Glu Tyr Asp Tyr Pro Gly Asp Asp Ile Pro Val Ile Asp Gly 160 165 170 TCT GCT CTG AAG GCC CTT GAA GGC GAT CCA GAA CAG GAA AAG GTT ATC 699 Ser Ala Leu Lys Ala Leu Glu Gly Asp Pro Glu Gln Glu Lys Val Ile 175 180 185 190 ATG GAA TTG ATG GAT ACC ATC GAT GAA TAT ATC CCA ACA CCT GTT CGT 747 Met Glu Leu Met Asp Thr Ile Asp Glu Tyr Ile Pro Thr Pro Val Arg 195 200 205 GAA ACA GAC AAG CCT TTC TTG ATG CCT GTT GAA GAT GTC TTC ACC ATC 795 Glu Thr Asp Lys Pro Phe Leu Met Pro Val Glu Asp Val Phe Thr Ile 210 215 220 ACT GGT CGT GGT ACA GTT GCT TCT GGC CGT ATC GAT CGT GGG ACG GTT 843 Thr Gly Arg Gly Thr Val Ala Ser Gly Arg Ile Asp Arg Gly Thr Val 225 230 235 AAG ATT GGT GAC GAA GTT GAA ATC ATC GGC TTG AAG CCA GAT GTT ATC 891 Lys Ile Gly Asp Glu Val Glu Ile Ile Gly Leu Lys Pro Asp Val Ile 240 245 250 AAG TCT ACC GTT ACT GGT CTT GAA ATG TTC CGT AAG ACC TTG GAT CTT 939 Lys Ser Thr Val Thr Gly Leu Glu Met Phe Arg Lys Thr Leu Asp Leu 255 260 265 270 GGT GAA GCC GGC GAT AAC GTT GGT GTC TTG CTT CGT GGT GTT AAC CGC 987 Gly Glu Ala Gly Asp Asn Val Gly Val Leu Leu Arg Gly Val Asn Arg 275 280 285 GAA CAA GTT GAA CGT GGC CAA GTT TTG GCA AAG CCA GGT TCA ATC CAA 1035 Glu Gln Val Glu Arg Gly Gln Val Leu Ala Lys Pro Gly Ser Ile Gln 290 295 300 TTG CAC AAC AAG TTC AAG GGT GAA GTT TAT ATC TTG ACA AAA GAA GAA 1083 Leu His Asn Lys Phe Lys Gly Glu Val Tyr Ile Leu Thr Lys Glu Glu 305 310 315 GGT GGC CGT CAT ACG CCA TTC TTC TCA AAC TAT CGT CCG CAG TTC TAC 1131 Gly Gly Arg His Thr Pro Phe Phe Ser Asn Tyr Arg Pro Gln Phe Tyr 320 325 330 TTC CAC ACC ACT GAT GTT ACC GGT GTG ATT GAA TTG CCA GAT GGC GTT 1179 Phe His Thr Thr Asp Val Thr Gly Val Ile Glu Leu Pro Asp Gly Val 335 340 345 350 GAA ATG GTT ATG CCT GGC GAT AAC GTT ACT TTC GAA GTT GAC CTG ATT 1227 Glu Met Val Met Pro Gly Asp Asn Val Thr Phe Glu Val Asp Leu Ile 355 360 365 GCT CCG GTT GCT ATC GAA AAA GGT ACC AAG TTC ACC GTC CGT GAA GGC 1275 Ala Pro Val Ala Ile Glu Lys Gly Thr Lys Phe Thr Val Arg Glu Gly 370 375 380 GGC CGT ACT GTT GGT GCC GGC GTT GTT TCC GAA ATC CTT GAC 1317 Gly Arg Thr Val Gly Ala Gly Val Val Ser Glu Ile Leu Asp 385 390 395 TAATTTCTGA ATATACGCAT GAACCCGCAA GCTT 1351 または同等の機能を有する該アミノ酸配列の付加、挿
入、削除、欠失または置換による変異体。2. A polypeptide having the EF-Tu function according to claim 1, which has the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1): GAATTCATTT CCAGCGTAGA TATTTGTTTT GGTATTTACG CTCAAATGTA GTACACTTAA 60 ACGTAAGGAT TATCAGGGTA CACAAGGTAT CCTGTATTCT TACGAAAAAT ACGTGATT A 120 CGTGATT. GAA AAA GAA CAC TAT GAA CGC ACA AAG CCC CAC GTA 171 Met Ala Glu Lys Glu His Tyr Glu Arg Thr Lys Pro His Val 1 5 10 AAC ATT GGT ACG ATC GGG CAC GTT GAC CAC GGT AAG ACT ACT TTG ACC 219 Asn Ile Gly Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr 15 20 25 30 GCG GCT ATC ACT AAG GTA TTG TCA GAA AAG GGC CTT GCC AAA GCG CAA 267 Ala Ala Ile Thr Lys Val Leu Ser Glu Lys Gly Leu Ala Lys Ala Gln 35 40 45 GAC TAC GCT TCT ATC GAT GCT GCT CCA GAA GAA AAG GAA CGT GGC ATC 315 Asp Tyr Ala Ser Ile Asp Ala Ala Pro Glu Glu Lys Glu Arg Gly Ile 50 55 60 ACA ATC AAC ACC GCC CAC GTT GAA TAT GAA ACC GAA AAG CGC CAC TAG 363 Thr Ile Asn Thr Ala His Val Glu Tyr Glu Thr Glu Lys Arg His Tyr 65 70 75 GCA CAT ATT GAT GCG CCA GGG CAT GCT GAC TAC GTT AAG AAC ATG ATC 411 Ala His Ile Asp Ala Pro Gly His Ala Asp Tyr Val Lys Asn Met Ile 80 85 90 ACC GGT GCT GCA CAG ATG GAT GGT GCG ATC TTG GTT GTT GCG GCA ACT 459 Thr Gly Ala Ala Gln Met Asp Gly Ala Ile Leu Val Val Ala Ala Thr 95 100 105 110 GAT GGC CCA ATG CCA CAG ACC CGT GAG CAT ATC TTG TTG GCT CGT CAG 507 Asp Gly Pro Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Ala Arg Gln 115 120 125 GTC GGC GTT GAT TAT ATC GTT GTT TTC CTG AAC AAG ACA GAC TTG GTT 555 Val Gly Val Asp Tyr Ile Val Val Phe Leu Asn Lys Thr Asp Leu Val 130 135 140 GAC GAT CCA GAA TTG ATC GAC TTG GTT GAA ATG GAA GTC CGG GAA CTG 603 Asp Asp Pro Glu Leu Ile Asp Leu Val Glu Met Glu Val Arg Glu Leu 145 150 155 CTC AGC GAA TAC GAT TAT CCT GGT GAT GAT ATT CCT GTT ATC CGT GGT 651 Leu Ser Glu Tyr Asp Tyr Pro Gly Asp Asp Ile Pro Val Ile Asp Gly 160 165 170 TCT GCT CTG AAG GCC CTT GAA GGC GAT CCA GAA CAG GAA AAG GTT ATC 699 Ser Ala Leu Lys Ala Leu Glu Gly Asp Pro Glu Gln Glu Lys Val Il e 175 180 185 190 ATG GAA TTG ATG GAT ACC ATC GAT GAA TAT ATC CCA ACA CCT GTT CGT 747 Met Glu Leu Met Asp Thr Ile Asp Glu Tyr Ile Pro Thr Pro Val Arg 195 200 205 GAA ACA GAC AAG CCT TTC TTG ATG CCT GTT GAA GAT GTC TTC ACC ATC 795 Glu Thr Asp Lys Pro Phe Leu Met Pro Val Glu Asp Val Phe Thr Ile 210 215 220 ACT GGT CGT GGT ACA GTT GCT TCT GGC CGT ATC GAT CGT GGG ACG GTT 843 Thr Gly Arg Gly Thr Val Ala Ser Gly Arg Ile Asp Arg Gly Thr Val 225 230 235 AAG ATT GGT GAC GAA GTT GAA ATC ATC GGC TTG AAG CCA GAT GTT ATC 891 Lys Ile Gly Asp Glu Val Glu Ile Ile Gly Leu Lys Pro Asp Val Ile 240 245 250 AAG TCT ACC GTT ACT GGT CTT GAA ATG TTC CGT AAG ACC TTG GAT CTT 939 Lys Ser Thr Val Thr Gly Leu Glu Met Phe Arg Lys Thr Leu Asp Leu 255 260 265 270 GGT GAA GCC GGC GAT AAC GTT GGT GTC TTG CTT CGT GGT GTT AAC CGC 987 Gly Glu Ala Gly Asp Asn Val Gly Val Leu Leu Arg Gly Val Asn Arg 275 280 285 GAA CAA GTT GAA CGT GGC CAA GTT TTG GCA AAG CCA GGT TCA ATC CAA 1035 Glu Gln Val Glu Arg Gly Gln Val Leu Ala Lys P ro Gly Ser Ile Gln 290 295 300 TTG CAC AAC AAG TTC AAG GGT GAA GTT TAT ATC TTG ACA AAA GAA GAA 1083 Leu His Asn Lys Phe Lys Gly Glu Val Tyr Ile Leu Thr Lys Glu Glu 305 310 315 GGT GGC CGT CAT ACG CCA TTC TTC TCA AAC TAT CGT CCG CAG TTC TAC 1131 Gly Gly Arg His Thr Pro Phe Phe Ser Asn Tyr Arg Pro Gln Phe Tyr 320 325 330 TTC CAC ACC ACT GAT GTT ACC GGT GTG ATT GAA TTG CCA GAT GGC GTT 1179 Phe His Thr Thr Asp Val Thr Gly Val Ile Glu Leu Pro Asp Gly Val 335 340 345 350 GAA ATG GTT ATG CCT GGC GAT AAC GTT ACT TTC GAA GTT GAC CTG ATT 1227 Glu Met Val Met Pro Gly Asp Asn Val Thr Phe Glu Val Asp Leu Ile 355 360 365 GCT CCG GTT GCT ATC GAA AAA GGT ACC AAG TTC ACC GTC CGT GAA GGC 1275 Ala Pro Val Ala Ile Glu Lys Gly Thr Lys Phe Thr Val Arg Glu Gly 370 375 380 GGC CGT ACT GTT GGT GCC GGC GTT GTT TCC GAA ATC CTT GAC 1317 Gly Arg Thr Val Gly Ala Gly Val Val Ser Glu Ile Leu Asp 385 390 395 TAATTTCTGA ATATACGCAT GAACCCGCAA GCTT 1351 or addition of the amino acid sequence having equivalent function Insert, delete, deletion or mutant by substitution.
変異体をコードするＥＦ−Ｔｕ遺伝子。3. An EF-Tu gene encoding the polypeptide according to claim 2 or a variant thereof.
ヌクレオチドのいずれかと特異的にハイブリダイズする
ことができる、請求項３記載のポリヌクレオチドの一部
を含む塩基数１００未満のオリゴヌクレオチド。4. An oligonucleotide having a base number of less than 100, which comprises a part of the polynucleotide of claim 3 and can hybridize specifically with any of the polynucleotides of the EF-Tu gene of claim 3.
ヌクレオチド検出のためのポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション（ＰＣＲ）法に使用するオリゴヌクレオチド
である請求項４記載のオリゴヌクレオチド。5. The oligonucleotide according to claim 4, which is an oligonucleotide used in a polymerase chain reaction (PCR) method for detecting a polynucleotide of the EF-Tu gene according to claim 3.
る請求項４または５記載のオリゴヌクレオチド。 （ａ）５’−ＴＴＧＧＴＴＧＴＴＧＣＧＧＣＡＡＣＴＧ
Ａ−３’ （ｂ）５’−ＣＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧ
Ｇ−３’6. The oligonucleotide according to claim 4 or 5, which has the following sequence (a) or (b). (A) 5'-TTGGTTGTTTGCGGCAACTG
A-3 '(b) 5'-CGATAGTTTTGAGAAGAATG
G-3 '
中の、少なくとも連続した１６塩基以上を、その一部に
有する１６〜３６個の塩基からなるオリゴヌクレオチド
フラグメントである請求項４記載のオリゴヌクレオチ
ド。7. The sequence (a) or (b) according to claim 6.
The oligonucleotide according to claim 4, which is an oligonucleotide fragment consisting of 16 to 36 bases having at least 16 consecutive bases or more in a part thereof.
イブリダイズし、他方がそれと相補なポリヌクレオチド
とハイブリダイズする、２個の請求項５記載のオリゴヌ
クレオチドを用い、これら両者をそれぞれプライマーと
し、かつ各ポリヌクレオチドを鋳型として耐熱性ポリメ
ラーゼによる鎖長反応と、鎖長反応生成物の鋳型からの
分離操作とを繰り返すことにより、ＥＦ−ＴＵ遺伝子フ
ラグメントを増幅蓄積せしめ、ついで蓄積した該ＥＦ−
Ｔｕ遺伝子フラグメントを検出することを特徴とするラ
クトバチルス属に属する微生物のＥＦ−Ｔｕ遺伝子の検
出法。8. Use of two oligonucleotides according to claim 5, one of which hybridizes with the polynucleotide of claim 3 and the other of which hybridizes with a polynucleotide complementary thereto, and these oligonucleotides are used as primers, respectively. The EF-TU gene fragment is amplified and accumulated by repeating the chain length reaction with a thermostable polymerase using each polynucleotide as a template and the operation of separating the chain length reaction product from the template, and then the accumulated EF-TU gene fragment.
A method for detecting an EF-Tu gene of a microorganism belonging to the genus Lactobacillus, which comprises detecting a Tu gene fragment.
はそのオリゴヌクレオチドフラグメントを一方のプライ
マーとし、かつ請求項６または７記載の配列（ｂ）また
はそのオリゴヌクレオチドフラグメントを他方のプライ
マーとすることを特徴とする請求項８記載の検出法。9. The sequence (a) according to claim 6 or 7 or an oligonucleotide fragment thereof is used as one primer, and the sequence (b) according to claim 6 or 7 or an oligonucleotide fragment thereof is used as the other primer. 9. The detection method according to claim 8, wherein
バチルス属に属する微生物から抽出された遺伝子である
請求項９記載の検出法。10. The detection method according to claim 9, wherein the EF-Tu gene serving as a template is a gene extracted from a microorganism belonging to the genus Lactobacillus.
量検出に用いる請求項１０記載の検出法。11. The detection method according to claim 10, which is used for detecting a trace amount of a microorganism belonging to the genus Lactobacillus.
の検出法。12. The detection method according to claim 11, which is used for detection of a pyrophyllic bacterium.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8059056A JPH09248186A (en) | 1996-03-15 | 1996-03-15 | Polypeptide chain lengthening factor gene tu of microorganism of lactobacillus and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8059056A JPH09248186A (en) | 1996-03-15 | 1996-03-15 | Polypeptide chain lengthening factor gene tu of microorganism of lactobacillus and its use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09248186A true JPH09248186A (en) | 1997-09-22 |
Family
ID=13102305
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8059056A Pending JPH09248186A (en) | 1996-03-15 | 1996-03-15 | Polypeptide chain lengthening factor gene tu of microorganism of lactobacillus and its use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09248186A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998018958A1 (en) * | 1996-10-28 | 1998-05-07 | Compagnie Gervais Danone | Method for detecting live microbiological contaminants in a food product sample |
| JP2002500893A (en) * | 1998-01-23 | 2002-01-15 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | EF-TumRNA as a marker for bacterial viability |
| US6451556B1 (en) | 1998-12-21 | 2002-09-17 | Smithkline Beecham Corporation | EF-Tu |
| JP2003511015A (en) * | 1999-09-28 | 2003-03-25 | インフェクティオ ダイアグノスティク（アイ．ディー．アイ．）インコーポレイティド | Generating highly conserved genes, as well as species-specific, genus-specific, family-specific, group-specific and universal nucleic acid probes and amplification primers, algae, archaea, bacteria, fungi from diagnostic clinical specimens And their use for rapid detection and identification of parasite microorganisms |
| CN113817810A (en) * | 2021-08-09 | 2021-12-21 | 宁波大学 | Novel qPCR (quantitative polymerase chain reaction) method for detecting lactic acid bacteria in fermented milk |
-
1996
- 1996-03-15 JP JP8059056A patent/JPH09248186A/en active Pending
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| CN113817810A (en) * | 2021-08-09 | 2021-12-21 | 宁波大学 | Novel qPCR (quantitative polymerase chain reaction) method for detecting lactic acid bacteria in fermented milk |
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