JPH09151136A - Production of protein sustained release microsphere - Google Patents

Production of protein sustained release microsphere

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JPH09151136A
JPH09151136A JP7337982A JP33798295A JPH09151136A JP H09151136 A JPH09151136 A JP H09151136A JP 7337982 A JP7337982 A JP 7337982A JP 33798295 A JP33798295 A JP 33798295A JP H09151136 A JPH09151136 A JP H09151136A
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microspheres
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Inventor
Katsuhiko Fukada
Yoichi Nakada
Kouichi Shiosaki
Yukio Tokiyoshi
Takahiro Uchida
洋一 中田
享弘 内田
巧一 塩先
幸男 時吉
勝彦 深田
Original Assignee
Chemo Sero Therapeut Res Inst
財団法人化学及血清療法研究所
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To realize a method for obtaining the subject microspheres having an excellent sustained release property by adding a specific protecting agent to the solution of a protein used as a physiologically active substance or an antigen used for vaccines, and further using a polymer capable of being orally administered or injected.
SOLUTION: This method for producing the protein sustained release microspheres comprises preliminarily adding gelatin to a protein-containing solution, mixing and emulsifying the mixture with an organic solvent containing a biodegradable polymer, reemulsifying the emulsion in an aqueous phase containing a dispersant, and subsequently recovering the produced microspheres. The gelatin is desirably added to the protein solution in a concentration of ≥4%. The addition of the gelatin to the preparation of the protein-containing microspheres in this method enables to encapsule the protein in the micropheres without denaturalizing or inactivating the protein with the organic solvent. When the microspheres are prepared at a freezing temperature, the protecting effect on the protein from the organic solvent is further improved. In addition to the above method, a method wherein the gelatin is added to the dispersant-containing aqueous phase (outer aqueous phase) at room temperature may be performed.
COPYRIGHT: (C)1997,JPO

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ワクチンに用いる抗原や生理活性物質などの有用な蛋白質溶液を徐放するための経口または注射可能な生物分解性および生物適合性のあるポリマーまたはコポリマーからなる微小球体(micr BACKGROUND OF THE INVENTION This invention consists of oral or injectable biodegradable and polymers or copolymers of biocompatible for sustained release of useful protein solution such as an antigen or biologically active substances used in the vaccine microspheres (micr
ospheres)及びその製造方法に関するものである。 Ospheres) and a manufacturing method thereof relate.

【0002】 [0002]

【発明の背景及び従来技術】本発明における微小球体(microspheres)とは、ポリマーマトリックス内に薬剤成分等の有用な物質を包含できる中空粒子を意味する。 BACKGROUND AND PRIOR ART OF THE INVENTION The microspheres (microspheres) in the present invention means the hollow particles can include materials useful for such pharmaceutical ingredient in a polymer matrix.
このような微小球体の材料となるポリマーとして通常良く用いられている代表的な例として、ポリ(ラクチド− Representative examples are usually often used as a polymer to be such microspheres materials, poly (lactide -
グリコライド)[以下、PLGA]などが知られている。 Glycolide) [hereinafter, PLGA] and the like are known. この微小球体を形成しているポリマーは生物分解性があり、手術用の縫糸としてすでに広く用いられており、生体に対しては無毒である。 Polymers forming the microspheres is biodegradable, has been used already widely as suture for surgery, non-toxic to living organisms. 従って、このポリマーより形成される微小球体は、蛋白質等の有効成分を封入後、適当な液体に懸濁して動物や人間に投与することが可能となる。 Thus, microspheres which are formed from this polymer, it is possible to administer the active ingredients such as proteins after encapsulation, and suspended in a suitable liquid to animals and humans.

【0003】ワクチンに用いる抗原または生理活性物質などの有用な蛋白質をこのような微小球体に封入することにより経口投与が可能になり、安全性や投与法の簡便性の面における改善が期待できる。 [0003] becomes a useful protein such as an antigen or biologically active substance used in vaccine orally administered by filling in such microspheres, it can be expected improvement in terms of convenience of safety and administration. さらに、抗原または生理活性物質などの有用な蛋白質を封入した微小球体を生体に経口投与、または注射により皮下または筋肉内に投与すると、微小球体より有用な蛋白が徐々に放出される。 Furthermore, administration of microspheres encapsulating a useful protein such as an antigen or biologically active agent orally administered to a living body, or subcutaneously or intramuscularly by injection, useful proteins from microspheres is gradually released. 蛋白質が抗原の場合には、免疫担当細胞を連続的に抗原刺激することにより好ましい免疫応答が得られる[Eldridge et al., Mol. Immunol., 28, 287-294(199 If protein antigen, preferably the immune response is obtained by continuously challenge the immunocompetent cells [Eldridge et al., Mol. Immunol., 28, 287-294 (199
1)]。 1)]. 微小球体の大きさはその調製過程で任意に調節できるが、経口投与の場合その大きさによって、血中のIg The size of the microspheres can be adjusted arbitrarily in the preparation process, by its size in the case of oral administration, Ig in the blood
Gクラスの抗体応答や局所のIgAクラスの抗体応答を選択することができるとの報告がある[Eldridge et al., It has been reported that it is possible to select an antibody response of IgA class antibody responses and local G class [Eldridge et al.,
J. Controlled Release, 11, 205-214(1990)]。 J. Controlled Release, 11, 205-214 (1990)]. 一方、 on the other hand,
生理活性物質などの場合には、その血中濃度を維持するのに必要な投与回数を少なくすることが可能となる。 If such biologically active agent, it is possible to reduce the number of administrations necessary to maintain its blood concentration. このように、生物分解性と生物適合性のあるポリマーをマトリックスとする微小球体は、ワクチンに用いる抗原または生理活性物質などの有用な蛋白質の新しいデリバリーシステムとして注目されている。 Thus, the microspheres and matrix polymer that is biodegradable and biocompatible, has attracted attention as a new delivery systems useful proteins such as antigen or biologically active substance used in vaccines.

【0004】 [0004]

【発明の解決すべき課題】ワクチンに用いる抗原または生理活性物質などの有用な蛋白質を生物分解性高分子を用いて微小球体内に封入する方法は、大きく3つに大別される。 How useful protein such as an antigen or biologically active substance used to the problem to be solved of the Invention Vaccine encapsulated within microspheres using biodegradable polymer is roughly divided into three large. それらの方法は、コアセルベーションまたはエマルジョン/相分離法、スプレードライングによるカプセル化法、有機相または水相での溶媒蒸発法である。 These methods, coacervation or emulsion / phase separation method, the encapsulation method by spray drying, a solvent evaporation method in an organic phase or aqueous phase. しかしながら、いずれの調製方法においても微小球体を形成する過程で、当該高分子を溶解するために塩化メチレンや酢酸エチルなどの有機溶媒の使用が必須となる。 However, in the process of forming the microspheres in any method of preparation, the use of organic solvents such as methylene chloride or ethyl acetate for dissolving the polymer is essential. その結果、有機溶媒により、封入される有用な蛋白質が変性して不溶化したり、蛋白質の高次構造が不自然に変化することによってその抗原性または生理活性が失活するという問題が生じる。 As a result, an organic solvent, or insolubilized useful protein, which is encapsulated by modification, a problem that an antigenic or physiological activity by higher-order structure of the protein changes unnaturally is deactivated occur. このため、微小球体のドラッグデリバリーシステムとしての利用範囲が著しく制限されていた。 Therefore, utilization range as a drug delivery system of the microspheres has been severely limited.

【0005】 [0005]

【解決するための手段】このような状況において、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、蛋白質含有溶液と生物分解性高分子を溶解させた有機溶媒と混和して乳化させ、これを分散剤を含む水相中に再乳化させ、生成した微小球体を回収することによって得られる、当該蛋白質が封入された徐放性微小球体の製造方法において、蛋白質含有溶液にゼラチンを添加することによって、微小球体形成時の有機溶媒による変性から封入されべき蛋白質を保護することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 A for In such circumstances, the present inventors have conducted extensive studies, and emulsified by mixing with an organic solvent to dissolve the protein-containing solution and a biodegradable polymer, dispersed this agent is redispersible in an aqueous phase containing the generated microspheres obtained by recovering, in the method of manufacturing the protein sustained release microspheres are encapsulated, by adding gelatin to a protein-containing solution, It found that it is possible to protect the protein to be encapsulated from degradation by the organic solvent during microsphere formation, and completed the present invention. すなわち、本発明は、ワクチンに用いる抗原や生理活性物質などの有用な蛋白質溶液を有機溶媒により失活させることなく、生物分解性高分子からなる微小球体中に封入させる方法並びに当該方法により得られる蛋白質徐放性微小球体を提供するものである。 That is, the present invention is not to be deactivated by organic solvents useful protein solution such as an antigen or biologically active substance used in vaccines, obtained by the method and the method is encapsulated in micro in spheres consisting biodegradable polymer it is intended to provide a protein sustained-release microspheres.

【0006】 [0006]

【発明の構成】有機溶媒の変性から有用な蛋白質を保護する保護剤について種々検討を行った結果、ゼラチンが最も優れた保護効果を有することを見出した。 As a result of various studies of a modified organic solvents for protective agents which protect useful proteins SUMMARY OF THE INVENTION, it was found to have the best protective effect gelatin. ゼラチンは、生物分解性高分子を溶解した有機溶媒と蛋白質とを混合する前に、蛋白質溶液に添加される。 Gelatin, prior to mixing the organic solvent and protein dissolving the biodegradable polymer is added to the protein solution. 蛋白質溶液中に添加するゼラチンの濃度は、4%以上であることが好ましい。 The concentration of gelatin to be added to a protein solution is preferably 4% or more.

【0007】また、当該微小球体の調製時、氷冷下で行うことにより、さらに有効な有機溶媒に対する蛋白質保護効果が得られる。 Further, the preparation of the microspheres, by performing under ice-cooling, the protein protective effect is obtained for the more effective organic solvents. また、室温下で、分散剤を含む水相(外水相)中にゼラチンを含有させてもよい。 Further, at room temperature, it may be contained gelatin in the aqueous phase containing a dispersant (external water phase).

【0008】本発明において使用される微小球体を構成する材料である生物分解性高分子が、ポリ(ラクチド− [0008] Biodegradable polymer is a material constituting the microspheres used in the present invention, poly (lactide -
グリコライド)、ポリラクチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ(乳酸−グリコール酸)、ポリ(エチルグリコール−ラクチド)、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ(グリコール酸−カプロラクトン)、ポリ(ラクチド−カプロラクトン)、ポリバレロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシブチレート、ポリ(ヒドロキシブチレート− Glycolide), polylactide, polylactic acid, polyglycolic acid, poly (lactic acid - glycolic acid), poly (ethyl glycol - lactide), poly lactic acid - polyethylene glycol copolymer, polycaprolactone, poly (glycolic acid - caprolactone), poly (lactide - caprolactone), poly-valerolactone, poly-hydroxybutyrate, poly-hydroxybutyrate, poly (hydroxybutyrate -
ヒドロキシバレレート)、ポリイソブチルシアノアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ(エチレンオキサイド−ブチレンテレフタレート)、または、 Hydroxyvalerate), poly isobutyl cyanoacrylate, polyalkyl cyanoacrylates, poly (ethylene oxide - butylene terephthalate), or,
セルロース−アセテート−テレフタレートのような腸溶剤、またはこれらの混合物を使用することが好ましい。 Cellulose - Acetate - it is preferred to use enteric coatings or mixtures thereof, such as terephthalate.

【0009】本発明において使用される有機溶媒は、上記生物分解性高分子を溶解するために使用されるものである。 The organic solvent used in the [0009] present invention is intended to be used to dissolve the biodegradable polymer. その例として、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、酢酸エステルなどが挙げられる。 As an example, methylene chloride, chloroform, benzene, acetic acid esters.

【0010】本発明において微小球体に封入される蛋白質は、ワクチンとして用いられる抗原または生理活性物質などのような蛋白質である。 [0010] Proteins encapsulated in the microspheres in the present invention is a protein such as an antigen or biologically active substance used as vaccines. 本発明に従えば、蛋白質含有微小球体調製時に、ゼラチンを添加させることにより、当該蛋白質は有機溶媒により変性(失活)されることなく、微小球体中に封入させることが可能である。 According to the present invention, when the protein-containing microspheres prepared, by addition of gelatin, the protein is without being modified (inactivated) by the organic solvent, it is possible to encapsulated micro during spheres.

【0011】また、本発明により得られた蛋白質含有微小球体は、蛋白質を徐々に放出することができ、ドラッグデリバリーシステムとして使用可能である。 Further, protein-containing microspheres obtained according to the invention, can be gradually released proteins can be used as a drug delivery system. 以下、実施例にそって本発明の実施態様を詳細に説明する。 Hereinafter, the embodiments of the present invention will be described in detail along the embodiment.

【0012】 [0012]

【実施例】 【Example】

《参考例1:HBc抗原》本発明のゼラチンの蛋白質保護効果を検討するために、封入する蛋白のモデルとしてB型肝炎ウイルスのコア抗原(HBc抗原)粒子を選択した。 "Reference Example 1: HBc antigen" To study the protein protective effect of the gelatin of the present invention, was selected core antigen (HBc antigen) particles of hepatitis B virus as a model protein to be encapsulated. HBc抗原は183個のアミノ酸で構成される単純蛋白であるが、この抗原をコードする遺伝子を酵母で発現させ、180個のHBc抗原が会合したウイルス状の粒子(HBc粒子)を形成したものを使用した[Mol. Imm HBc Although antigen is simple protein composed of 183 amino acids, those antigen genes encoding is expressed in yeast, to form a 180 HBc antigens associated with virus-like particles (HBc particles) It was used [Mol. Imm
unol., 30, 221-231(1993)]。 unol., 30, 221-231 (1993)]. この構成蛋白であるHB This configuration is a protein HB
c抗原がほんの少しでも変性すれば、HBc粒子の安定性は急速に低下し、やがて粒子は崩壊する。 If modified c antigen even little, stability of HBc particles decreases rapidly, eventually the particles disintegrate. 従って、変性によるHBc抗原の構造変化を粒子性の崩壊というかたちで感度良く検出することができる。 Thus, structural changes in HBc antigen by denaturing can be sensitively detected in the form of particles of decay.

【0013】《参考例2:ELISAによるHBc抗原検出系》また、検出系としては、マウスモノクローナル抗体(Yc−3)を用いたELISA系を用いた。 [0013] "Reference Example 2: HBc antigen detection system according to the ELISA" Further, as the detection system, using a ELISA system using mouse monoclonal antibody (Yc-3). 当該マウスモノクローナル抗体は、粒子状のHBc抗原の80 The mouse monoclonal antibody, 80 of particulate HBc antigen
番目付近の立体構造を認識して結合するが、モノマー状態のHBc抗原のそれには結合しない特性を有するものである。 Although recognizes and binds to a three-dimensional structure in the vicinity of th, that of HBc antigen monomers state has a property that does not bind. そこで、このモノクローナル抗体のHBc粒子への結合性をELISAを用いて調べることにより、変性を受けていない粒子状態のHBc抗原の量を簡単に測定することができる。 Therefore, the binding to the HBc particles of monoclonal antibodies by examining using ELISA, the amount of HBc antigen particle state not receiving modified can be easily measured. まず、96穴のマイクロテストプレート(ヌンク社製マキシソープTM )に200倍希釈した抗H First, anti-H diluted 200-fold in 96-well microtest plates (Nunc Maxisorp TM)
Bcウサギ抗血清(バイオメーダ社製)を50μl/穴で加え、4℃で一晩インキュベートすることにより固相化した。 Bc rabbit antiserum (Baiomeda Co.) was added at 50 [mu] l / well, and immobilized by incubation overnight at 4 ° C.. さらに、2%BSA(ウシ血清アルブミン)溶液10 Further, 2% BSA (bovine serum albumin) solution 10
0μlを加え、同様にインキュベートしてマスキングを行った。 0μl were added thereto to carry out a masking similarly and incubated. このようにして作製した抗体固相化プレートにH H Thus in antibody-immobilized plate was prepared
Bc粒子を加えて、37℃で30分間インキュベート後、0. Adding Bc particles, after incubation at 37 ° C. 30 min, 0.
1%Tween20/PBSで3回洗浄した。 It washed 3 times with 1% Tween20 / PBS. これに、0.2μg/m To this, 0.2μg / m
lのYc−3モノクローナル抗体を50μl/穴で加えて、 The l Yc-3 monoclonal antibody was added at 50 [mu] l / well,
37℃で30分インキュベートした。 And incubated for 30 minutes at 37 ° C.. 上記と同様3回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液(ケミコン社製、5000倍希釈)を50μl/穴加えた。 After washing the same 3 times above, peroxidase labeled anti-mouse immunoglobulin antibody solution (Chemicon, 5000-fold dilution) was added 50 [mu] l / well. 37℃で30分間インキュベート後、0.1%Tween20/P After incubation 37 ° C. for 30 minutes, 0.1% Tween20 / P
BSで5回洗浄し、その後TMBZ基質溶液を加え、常法により発色させ、その吸光度を波長450nmにて測定した。 Washed 5 times with BS, then TMBZ substrate solution was added, color was developed by a conventional method, and measured the absorbance at a wavelength of 450nm. 以下、HBc粒子をモデルとしてゼラチンの添加効果を実施例により説明する。 Hereinafter, it will be explained by examples the effect of adding gelatin HBc particles as a model.

【0014】《実施例1:HBc粒子の粒子安定性》H [0014] "Example 1: particle stability of HBc particles" H
Bc粒子の微小球体への封入条件を考慮して、pH・塩濃度・超音波処理・凍結融解に対するHBc粒子の安定性を調べた。 Taking into account the encapsulation conditions of the microspheres Bc particles were examined the stability of the HBc particles to pH-salt concentration, sonication, freeze-thawing. その結果、pH6の蒸留水に4℃、室温、37℃ As a result, 4 ° C. in distilled water at pH 6, room temperature, 37 ° C.
で3日間放置しても、通常の微小球体の調製に用いている60秒間の超音波処理をおこなっても、さらに凍結融解を3回繰り返してもHBcの抗原性の低下は観察されなかった。 Even when left in 3 days, be subjected to ultrasonic treatment for 60 seconds is used in the preparation of conventional microspheres, the reduction in antigenicity of HBc be repeated freeze-thawing three times was observed. これらの結果は、HBc粒子が微小球体への封入に耐え得る物理的安定性を有していることを示している。 These results indicate that it has a physical stability HBc particles can withstand encapsulation in microspheres.

【0015】そこで、HBc粒子をモデル抗原として微小球体への封入を試みた。 [0015] Therefore, attempts to encapsulation in microspheres the HBc particles as a model antigen. 547μg/mlのHBc粒子184μ 547μg / ml of HBc particles 184μ
lを500mgのPLGAを含む10mlの塩化メチレンに加え、 l was added to the methylene chloride 10ml containing PLGA of 500mg,
超音波で乳化した。 And emulsified with an ultrasonic. この乳化液を0.5%ポリビニルアルコール(PVA)及び5%塩化ナトリウムを含む200ml 200ml The emulsion containing 0.5% polyvinyl alcohol (PVA) and 5% sodium chloride
の外水相に分散させ、さらに5時間攪拌した。 Dispersed in an external aqueous phase, and stirred for an additional 5 hours. 得られた微小球体を遠心により回収し、凍結乾燥した。 The resulting microspheres were collected by centrifugation and lyophilized. この微小球体から塩化メチレン、アセトン、アセトニトリルを用いてHBc粒子を再抽出し、その回収率をELISAを用いて定量した。 Methylene chloride from the microspheres, acetone, using acetonitrile and re-extracted HBc particles were quantified using an ELISA its recovery. しかし、抽出液中にHBc粒子を回収することはできなかった。 However, it was not possible to recover the HBc particles in the extract.

【0016】この原因を追求するために、HBc粒子と有機溶媒(塩化メチレン)を等量混和し、1分間の超音波処理を行った後、水相を分離してHBcの抗原量を定量した。 [0016] In pursuit of this reason, an equal amount admixed HBc particles and an organic solvent (methylene chloride), subjected to ultrasonic treatment for 1 min to determine the amount of the antigen HBc aqueous phase was separated . その結果、水相中にHBcの抗原性を検出することはできなかった。 As a result, it was not possible to detect the antigenicity of HBc in the aqueous phase. HBc抗原の検出を行ったELIS ELIS it makes a detection of HBc antigen
Aでは、粒子状態のHBc抗原を特異的に検出するマウスモノクローナル抗体(Yc−3)を用いた。 In A, using mouse monoclonal antibodies that specifically detect HBc antigen particle state (Yc-3). 従って、 Therefore,
HBc粒子の抗原性の失活は、HBc粒子を構成するH Antigenic deactivation of HBc particles comprise HBc particles H
Bc蛋白の変性によりその構造が変化し、それによってHBc粒子が微小球体に封入される以前にその調製に用いた有機溶媒(塩化メチレン)により崩壊した結果によるものと推察される。 Its structure is changed by modification of Bc protein, thereby HBc particles are presumed to be due to the result of collapsed by organic solvent used in its preparation prior to being encapsulated in microspheres (methylene chloride).

【0017】《実施例2:有機溶媒による変性からHB [0017] "Example 2: HB from degradation by the organic solvent
c粒子を保護する添加剤の選択》HBc粒子をモデル蛋白として、一般的な抗原蛋白の安定剤であるポリエチレングリコール(PEG:#2000〜#6000)2%及び20 Additives selected "HBc particles to protect c particles as a model protein, a typical polyethylene glycol is a stabilizer for an antigen protein (PEG: # 2000~ # 6000) 2% and 20
%、カルボキシメチルセルロース2%、シクロデキストリン2%、糖および糖アルコール(マンニトール、ラクトース)2%、アミノ酸(グリシン、リジン)2%及び %, Carboxymethyl cellulose 2%, cyclodextrin 2%, sugars and sugar alcohols (mannitol, lactose) 2%, amino acids (glycine, lysine) 2% and
20%、ゼラチン(ナカライ社製)4%を用いて有機溶媒(塩化メチレン)による変性からHBc粒子を保護する効果を調べた。 20% (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) gelatin was investigated the effect of protecting the HBc particles from degradation by the organic solvent (methylene chloride) using 4%. HBc粒子と保護剤を含む内水相0.1ml Internal aqueous phase 0.1ml containing HBc particles and the protective agent
と塩化メチレン 5.0mlを混和後、これを1分間超音波処理して乳化させ、室温または氷冷下で4時間振とうした。 And after the mixing of methylene chloride 5.0 ml, which was emulsified by sonication for 1 min, and shaken for 4 hours at room temperature or under ice-cooling. その後、リン酸緩衝液4.9mlを加え、撹拌した後、 Thereafter, a phosphate buffer 4.9ml was added and after stirring,
遠心して上清中のHBcの抗原量をELISAで定量した。 The amount of antigen HBc in the supernatant was quantified by ELISA and centrifuged. その結果、唯一ゼラチンのみがHBc抗原の失活を As a result, only the only gelatin is the deactivation of the HBc antigen
20%程度に止める保護効果を示したが、それ以外のものはいずれも保護効果を示さなかった。 It showed a protective effect to stop about 20%, but not Any other things shown a protective effect.

【0018】そこで、さらに詳細に内水相に添加したゼラチン濃度とその保護効果との関係を調べた。 [0018] Therefore, we investigated in more detail in relation gelatin concentration added to the inner aqueous phase and its protective effect. 最終濃度で0〜4%のゼラチンと2.5μgのHBc粒子を含むpH7. pH7 containing HBc particles 0-4% gelatin and 2.5μg final concentration.
4のリン酸緩衝液0.1ml中に、塩化メチレン5mlを加え、 In phosphate buffer 0.1ml of 4, methylene chloride 5ml was added,
1分間の超音波処理をして乳化させ、室温または氷冷下で、2時間または4時間振とうした。 It was emulsified by sonication for 1 minute, at room temperature or under ice-cooling, and the mixture was shaken for 2 hours or 4 hours. 振とう後、これに After shaking, to this
4.9mlのリン酸緩衝液を加え、撹拌した後、3000rpmで5 Added phosphate buffer 4.9 ml, after stirring, 5 at 3000rpm
分間遠心を行い、水相中のHBc抗原量をELISAで定量した(表1)。 Min centrifugation was carried out to quantify the HBc antigen amount in the aqueous phase by ELISA (Table 1). 表中の数値は内水相と塩化メチレンとを乳化・振とう後残存したHBcの抗原量をパーセントで表したものである。 Numerical values ​​in the table is a representation of the amount of antigen HBc remaining after shaking emulsification and vibration the inner aqueous phase and a methylene chloride as a percentage. その結果、4%以上の濃度のゼラチンの添加において顕著な保護効果が観察され、その保護効果はゼラチンの濃度の減少とともに低下した。 As a result, the remarkable protective effect was observed in the addition of more than 4% concentration of gelatin, the protective effect decreased with decreasing concentrations of gelatin.

【0019】 [0019]

【表1】 [Table 1] N.D.は not done を意味する。 N.D. means not done.

【0020】《実施例3:種々の有機溶媒に対するゼラチンの保護効果》8%のゼラチンと25μg/mlのHBc粒子を含む内水相0.1mlを5mlの有機溶媒に加え、1分間の超音波により乳化させた後、室温で規定時間まで振とうした。 [0020]: addition "Example 3 Various protection of gelatin to organic solvents effects" of 8% internal aqueous phase 0.1ml containing HBc particles of gelatin and 25 [mu] g / ml in an organic solvent 5 ml, by ultrasound for 1 minute after emulsification was shaken until the specified time at room temperature. これに4.9mlのリン酸緩衝液を加え、良く攪拌した後、3,000rpmで10分間遠心し、水相のHBcの抗原量をELISAを用いて測定した(表2)。 To this was added phosphate buffer 4.9 ml, well stirred, and centrifuged for 10 minutes at 3,000 rpm, the amount of the antigen HBc water phase was measured using ELISA (Table 2).

【0021】 [0021]

【表2】 [Table 2] +:ゼラチン添加、−:ゼラチン未添加 +: Gelatin addition, -: gelatin not added

【0022】ゼラチンを添加しない場合、有機溶媒(酢酸エチル、ベンゼン、クロロフォルム、塩化メチレン) [0022] Without the addition of gelatin, organic solvent (ethyl acetate, benzene, chloroform, methylene chloride)
による変性によりHBc粒子の抗原性は瞬時(0時間) Antigenic HBc particles by modification with the instant (0 hours)
に失活するのに対し、ゼラチンを添加することにより4 Whereas the deactivated, 4 by the addition of gelatin
時間振とう後も約50%以上の抗原性が保持されていた。 About 50% or more of the antigenicity was also retained after shaking time.
この結果は、内水相に予めゼラチンを添加することにより、塩化メチレンのみならず、酢酸エチル、ベンゼン、 This result, by the addition of pre-gelatinized internal aqueous phase, not methylene chloride alone, ethyl acetate, benzene,
クロロフォルムなどの他の有機溶媒によるHBc粒子の変性が防止され、HBcの抗原性が保護されたことを示している。 Is prevented denaturation of HBc particles by other organic solvents such as chloroform, it shows that the antigenicity of the HBc is protected.

【0023】《実施例4:HBc粒子の微小球体への封入の確認》HBc粒子25μgと最終濃度で4%のゼラチンを含む91μlの内水相を200mgのPLGAを溶解した5 [0023]: 5 the internal aqueous phase of 91μl containing 4% gelatin in HBc particles 25μg and final concentration "Example 4 HBc confirmation of encapsulation in microspheres particles" were dissolved PLGA of 200mg
mlの塩化メチレン溶液と混和した後、1分間の超音波処理を行い乳化液を作製した。 After admixture with ml of methylene chloride solution, to prepare an emulsion subjected to ultrasonic treatment for 1 minute. この乳化液を5%のポリビニルアルコール(PVA)と塩化ナトリウムを含む200ml 200ml The emulsion containing 5% polyvinyl alcohol (PVA) and sodium chloride
の外水相に加え、6,000rpmで1分間攪拌した後、ゆっくり5〜6時間攪拌した。 In addition to the external aqueous phase, the mixture was stirred for 1 minute at 6,000 rpm, and stirred slowly for 5-6 hours. 遠心により微小球体を回収し、 The microspheres were harvested by centrifugation,
凍結乾燥によりHBc粒子を封入した微小球体を作製した。 To prepare microspheres encapsulating HBc particles by freeze drying. 微小球体内にHBc粒子が取り込まれたことを確認するために、塩化メチレン、アセトン及びアセトニトリルを用いて、得られた微小球体中に封入されたHBc粒子の抽出を試みた。 To confirm that the HBc particles were incorporated into the microspheres, methylene chloride, using acetone and acetonitrile to attempt to extract HBc particles encapsulated in microspheres obtained. 回収時におけるHBc粒子の変性を避けるために、抽出時に4%のゼラチンを添加して行った(表3)。 To avoid denaturation of the HBc particles during recovery was done with the addition of 4% gelatin during extraction (Table 3). 表中の数値は、封入から抽出をとおして回収されたHBcの抗原量をパーセントで表示した。 Values ​​in the table is displayed the amount of antigen HBc recovered through extraction from inclusion in percent.

【0024】 [0024]

【表3】 [Table 3] +:ゼラチン添加、−:ゼラチン未添加 +: Gelatin addition, -: gelatin not added

【0025】その結果、得られた微小球体中に粒子性を保持したHBc抗原が封入されていることが確認された。 [0025] As a result, the HBc antigen which holds the particulate into microspheres obtained is sealed was confirmed. 本実施例におけるHBc粒子の抽出効率を考慮すると、HBc粒子の実際の封入率は上記の回収率以上であると推察される。 Considering the extraction efficiency of HBc particles in the present embodiment, the actual encapsulation ratio of HBc particles are presumed to be the above-mentioned recovery rate higher. また、本実施例の結果、抽出時にゼラチンを添加した方が高いHBc抗原の回収率を示したことから、ゼラチンは塩化メチレンのみならず、アセトン並びにアセトニトリルによるHBc粒子の変性に対しても保護効果を有することが明らかとなった。 As a result of this embodiment, since the person who has added the gelatin showed a recovery of high HBc antigen during extraction, gelatin not methylene chloride but also protection against degeneration of HBc particles with acetone and acetonitrile It was revealed to have.

【0026】《実施例5:HBc粒子含有微小球体の調製における各種条件検討》HBc粒子0.5mgと最終濃度で4%又は8%のゼラチンを含む91μlの内水相を200mg [0026]: 4% at HBc particles 0.5mg and final concentration "Example 5 HBc particles various conditions considered in the preparation of containing microspheres" or 8% of the internal aqueous phase of 91μl containing gelatin 200mg
のPLGAを溶解した5mlの塩化メチレン溶液と混和した後、1分間の超音波処理を行い乳化液を作製した。 Methylene chloride solution of the dissolved PLGA 5 ml and was mixed to prepare an emulsion subjected to ultrasonic treatment for 1 minute. この乳化液を5%PVAと5%塩化ナトリウムを含む200m 200m The emulsion containing 5% PVA and 5% sodium chloride
lの外水相に加え、6000rpmで1分間攪拌した後、ゆっくり5時間攪拌した。 In addition to the external aqueous phase of l, After stirring for 1 min at 6000 rpm, and stirred slowly for 5 hours. 8000rpmで10分間の遠心により微小球体を回収し、凍結乾燥してHBc粒子を封入した微小球体を作製した。 The microspheres were collected by 10 minutes centrifugation at 8000 rpm, to prepare microspheres encapsulating HBc particles were freeze dried. この時に外水相を氷冷した場合としない場合4%のゼラチンを添加した場合としない場合の条件検討を行った。 The time was conditions investigated with and without the outer aqueous phase was added 4% gelatin, with and without ice-cooled. 微小球体からのHBc粒子の回収には、アセトンを用い、4%のゼラチンを添加して行った。 The recovery of the HBc particles from microspheres, using acetone, were done with the addition of 4% gelatin. 表中の数値は、封入から抽出をとおして回収されたHBcの抗原量をパーセントで表示した(表4)。 Values ​​in the table is displayed the amount of antigen HBc recovered through extraction from inclusion in percent (Table 4).

【0027】 [0027]

【表4】 [Table 4]

【0028】この結果から微小球体調製時のHBc粒子の変性を避けるためには、内水相のゼラチン濃度は4% [0028] In order to avoid denaturation of the HBc particles at microspheres prepared from this result, the gelatin concentration of the internal aqueous phase is 4%
より8%が好ましい。 More 8% is preferred. また、攪拌時に外水相を氷冷することはHBc粒子の変性を避けた封入に効果的であった。 Further, by cooling with ice external water phase during agitation was effective in sealed avoiding the denaturation of the HBc particles. また、Eの調製方法において、封入から抽出までの回収率は約60%であったが、抽出効率が100%ではないことを考慮すると、実際の封入効率は60%を上回っていると予想される。 Further, in the process for the preparation of E, although the recovery rate to the extraction from inclusion was approximately 60%, the extraction efficiency is taken into account that it is not 100%, the actual encapsulation efficiency is expected to exceed 60% that.

【0029】《実施例6:微小球体から抽出されたHB [0029] "Example 6: HB, which is extracted from the microspheres
c抗原の粒子性の確認》本発明を導く過程で使用したE Confirmation of the particles of c antigen "E used in the process leading to the present invention
LISAは、粒子状のHBc抗原のみを検出するようにデザインされている。 LISA is designed to detect only particulate HBc antigen. しかしこの反応性が、必ずしもH However, this reactivity is, necessarily H
Bc抗原が粒子性を保持していることの直接的な証明にはならない。 Bc antigen not a direct proof of holding the particulate. そこで、微小球体より抽出されたHBc抗原が粒子であることを証明するためにシュークロース濃度勾配遠心を行った。 Therefore, HBc antigen extracted from microspheres was sucrose density gradient centrifugation in order to prove that the particle.

【0030】実施例5の条件Cに従い調製された微小球体よりアセトンを用いて抽出したHBc抗原を含む溶液 The solution containing HBc antigen was extracted with acetone from the microspheres prepared in accordance with the conditions C of Example 5
1.5mlを、11mlの20%から60%のシュクロース濃度勾配溶液に重層し、日立社製のRPS40Tローターを用いて30,000rpmで16時間遠心を行った。 The 1.5 ml, layered on 60% sucrose density gradient solution from 20% 11 ml, was subjected to 16 hours centrifuged at 30,000rpm using a RPS40T rotor Hitachi. 遠心終了後、シュクロース濃度の高い順に0.7mlずつ17本に分画し、各フラクションのHBc抗原量をグラフにプロットした(図1)。 After the end of the centrifugation, fractionated into 0.7ml portions 17 present in the descending order of sucrose concentration minute were plotted HBc antigen amounts of each fraction on a graph (Fig. 1). コントロールとして酵母発現型HBc粒子標品を用い、同様の方法でシュクロース濃度勾配遠心を行った(図2)。 Using yeast expression type HBc particles preparation as a control, it was sucrose density gradient centrifugation in the same manner (Fig. 2). その結果、微小球体から抽出したHBc抗原は、コントロールのHBc粒子とほぼ同じシュクロース濃度(約43%)の位置にELISAによるピークを形成した。 As a result, HBc antigen extracted from microspheres formed a peak by ELISA to the position of approximately the same sucrose concentration as the HBc particles of control (about 43%). 従って、微小球体より抽出されたHBc抗原は、 Therefore, HBc antigen extracted from microspheres,
コントロールのHBc粒子と同じ沈降係数を持つこと、 To have the same sedimentation coefficient and HBc particles of control,
すなわち粒子状態で存在していることが確認された。 That to be present in a particle state was confirmed. この結果は、ゼラチン添加によりHBc抗原が有機溶媒による変性を受けることなく微小球体中に封入されたことを示すものである。 This result indicates that the HBc antigen is enclosed in the minute in the sphere without being modified with an organic solvent by gelatin addition.

【0031】《実施例7:HBc抗原含有微小球体の徐放性検討》微小球体中に封入されたHBc抗原が徐放されることを確認するために、実施例5の条件Eにより調製された微小球体3mgを0.02%Tween80を含むリン酸緩衝溶液5mlに懸濁し、37℃で振とうした。 [0031]: HBc antigen encapsulated in micro during spheres "Example 7 sustained release study of HBc antigen-containing microspheres" in order to confirm that the sustained release were prepared according to the conditions E of Example 5 microspheres 3mg were suspended in phosphate buffered saline 5ml containing 0.02% Tween 80, and shaken at 37 ° C.. 振とう後、経時的に上清をサンプリングし、溶液中に放出されたHB After shaking samples over time supernatants were released into solution HB
c抗原量をELISAで測定した(図3)。 c amount of antigen was measured by ELISA (Fig. 3). その結果、 as a result,
24時間後に封入された量の約25%のHBc抗原がリン酸緩衝溶液中に放出され、50時間後にプラトーに達した。 About 25% of the HBc antigen amounts encapsulated after 24 hours is released in a phosphate buffer solution, reaching a plateau after 50 hours.
その時のHBc抗原の放出量は約80%であった。 Release of HBc antigen at that time was about 80%. これらの結果から本発明の微小球体は蛋白質を徐々に放出することが確認された。 Microspheres of the present invention from these results it was confirmed that slowly release the proteins. また、ゼラチンがHBc抗原の徐放性に悪影響は及ぼさないことがわかった。 Further, it was found that gelatin is not adversely adverse effect on the sustained release of the HBc antigen. なお、蛋白質の徐放時間は、微小球体の調製条件等により容易に調節可能である。 Note that the sustained release time of the protein, it is easily adjustable by the preparation conditions of the microspheres.

【00】 [00]

【発明の効果】このように、本発明の蛋白質含有微小球体の製造方法に従えば、ゼラチンを保護剤として添加することにより、微小球体調製に使用される有機溶媒により蛋白が失活することなく、微小球体中に封入することが可能となる。 [Effect of the Invention] Thus, according to the manufacturing method of protein-containing microspheres of the present invention, by adding gelatin as protective agent, without protein is inactivated by organic solvent used in the microspheres prepared , it is possible to encapsulate the minute in the sphere. 本発明により得られる蛋白質含有微小球体において、蛋白質としてワクチンに用いられる抗原または生理活性物質等が含有する製剤は、生体への経口または注射による投与後、生体内で当該有用蛋白を徐放可能な製剤として極めて有用である。 In protein-containing microspheres obtained according to the present invention, the antigen or biologically active formulation substances contains used vaccines, after administration orally or by injection to a living body, such the useful protein in vivo sustained release can as a protein it is extremely useful as a preparation.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】 PLGA微小球体より抽出されたHBc抗原のシュクロース濃度勾配遠心の結果を示す。 1 shows a sucrose density gradient centrifugation of the resulting PLGA HBc antigen extracted from microspheres.

【図2】 HBc粒子標品のシュクロース濃度勾配遠心の結果を示す。 2 shows a sucrose density gradient centrifugation results HBc particles preparation.

【図3】 HBc抗原封入PLGA微小球体の徐放性検討結果を示す。 3 shows a sustained release study results of HBc antigen loaded PLGA microspheres.

フロントページの続き (72)発明者 深田 勝彦 熊本県菊池郡合志町豊岡2000−38 すずか けハイツ203号 (72)発明者 時吉 幸男 熊本県熊本市若葉3丁目14−19 Of the front page Continued (72) inventor, Kumamoto Prefecture Kikuchi-gun, Katsuhiko Fukada Koshi-cho, Toyooka 2000-38 Suzuka only Heights No. 203 (72) inventor Tokiyoshi Yukio Kumamoto, Kumamoto Prefecture Wakaba 3-chome, 14-19

Claims (9)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 蛋白質含有溶液と生物分解性高分子を溶解させた有機溶媒とを混和して乳化させ、これを分散剤を含む水相中に再乳化させ、生成した微小球体を回収することによって得られる、当該蛋白質徐放性微小球体の製造方法において、蛋白質含有溶液にゼラチンを含有させることを特徴とする製造方法。 1. A protein-containing solution and emulsified by mixing with an organic solvent dissolving the biodegradable polymer, which was re-emulsified in an aqueous phase containing a dispersing agent, and recovering the resulting microspheres the resulting, in the method of manufacturing the protein sustained release microspheres, the manufacturing method is characterized in that the inclusion of gelatin protein-containing solution.
  2. 【請求項2】 氷温下で当該微小球体を調製することを特徴とする請求項1に記載の製造方法。 2. A process according to claim 1, under ice temperature at which comprises preparing the microspheres.
  3. 【請求項3】 分散剤を含む水相中にゼラチンを含有させることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。 3. A process according to claim 1, characterized in that the inclusion of gelatin in the aqueous phase containing a dispersant.
  4. 【請求項4】 当該生物分解性高分子が、ポリ(ラクチド−グリコライド)、ポリラクチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ(乳酸−グリコール酸)、ポリ(エチルグリコール−ラクチド)、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ(グリコール酸−カプロラクトン)、ポリ(ラクチド−カプロラクトン)、ポリバレロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、 Wherein said biodegradable polymer is poly (lactide - glycolide), polylactide, polylactic acid, polyglycolic acid, poly (lactic acid - glycolic acid), poly (ethyl glycol - lactide), poly lactic acid - polyethylene glycol copolymer, polycaprolactone, poly (glycolic acid - caprolactone), poly (lactide - caprolactone), poly-valerolactone, poly-hydroxybutyrate,
    ポリヒドロキシブチレート、ポリ(ヒドロキシブチレート−ヒドロキシバレレート)、ポリイソブチルシアノアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ(エチレンオキサイド−ブチレンテレフタレート)、または、セルロース−アセテート−テレフタレートのような腸溶剤、またはこれらの混合物から選択されるものである請求項1から3のいずれかに記載の製造方法。 Polyhydroxybutyrate, poly (hydroxybutyrate - hydroxyvalerate), poly isobutyl cyanoacrylate, polyalkyl cyanoacrylates, poly (ethylene oxide - butylene terephthalate), or cellulose - acetate - enteric such as terephthalate or their, the process according to any one of claims 1 mixtures are those selected 3.
  5. 【請求項5】 当該有機溶媒が塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、酢酸エステルから選択されるものである請求項1から4のいずれかに記載の製造方法。 Wherein the organic solvent is methylene chloride, chloroform, benzene, the production method according to claims 1 is selected from ethyl acetate to any one of 4.
  6. 【請求項6】 当該蛋白質がワクチンとして用いられる抗原である請求項1から5のいずれかに記載の製造方法。 6. The method according to any one of claims 1 is the antigen used the protein as a vaccine 5.
  7. 【請求項7】 当該蛋白質が生理活性物質である請求項1から5のいずれかに記載の製造方法。 7. The method for producing the protein according to any of claims 1 a bioactive agent 5.
  8. 【請求項8】 請求項1から7のいずれかに記載の製造方法により得られるゼラチン添加蛋白質溶液を含有する徐放性微小球体。 8. claims 1 to 7 or the gelatin added protein solution sustained release microspheres containing obtainable by the method according to.
  9. 【請求項9】 請求項8に記載の徐放性微小球体を含むことを特徴とする製剤。 Formulation comprising a sustained release microspheres as claimed in claim 9 to claim 8.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US6204308B1 (en) 1999-03-01 2001-03-20 Novartis Ag Organic compounds
WO2008139804A1 (en) 2007-05-14 2008-11-20 Ltt Bio-Pharma Co., Ltd. Low-molecule drug-containing nanoparticle having sustained release negatively charged group
US8916206B2 (en) 2005-12-26 2014-12-23 Ltt Bio-Pharma Co., Ltd. Nanoparticles containing water-soluble non-peptide low-molecular weight drug

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