JPH08511935A - Selective cell growth - Google Patents

Selective cell growth

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JPH08511935A
JPH08511935A JP6517354A JP51735494A JPH08511935A JP H08511935 A JPH08511935 A JP H08511935A JP 6517354 A JP6517354 A JP 6517354A JP 51735494 A JP51735494 A JP 51735494A JP H08511935 A JPH08511935 A JP H08511935A
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JP
Japan
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cells
cell
cell population
target
hematopoietic
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JP6517354A
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Japanese (ja)
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ダヴリュ． ランスタッドラー，ピーター
エッチ．エル． パング，ロイ
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ヘモソル インコーポレーテッド
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者例えばヒトのほとんどあらゆる生体細胞から原始幹細胞、始祖細胞、前駆細胞、分化の中間段階にある細胞、及び最終的に分化した細胞を含む標的細胞群を生産する方法を提供する。これらの標的細胞群は、骨髄移植、末梢血移植などの細胞移植療法、並びにあらゆる器官ないし造血系のような器官系の再形成もしくは補完に使用することができる。さらに、標的細胞群は、遺伝子及びその発現産物を系統的ないし特定的に患者に導入する遺伝子療法にも有用である。   (57) [Summary] The present invention provides a method of producing a target cell population including primitive stem cells, progenitor cells, progenitor cells, cells in an intermediate stage of differentiation, and finally differentiated cells from almost any living cell of a patient such as a human. These target cell groups can be used for cell transplantation therapy such as bone marrow transplantation and peripheral blood transplantation, as well as remodeling or complementation of any organ or organ system such as hematopoietic system. Furthermore, the target cell population is also useful for gene therapy in which a gene and its expression product are systematically or specifically introduced into a patient.

Description

【発明の詳細な説明】 選択的細胞増殖関連出願の引照 この出願は1993年１月27日出願の米国出願08/009,593の一部継続出願である。発明の背景 １．発明の分野 本発明は、所望の、または標的とする細胞群を産生及び使用する方法及び組成 物に関する。標的細胞群には、リンパ性細胞及び骨髄細胞を生じる造血系、及び 種々の器官系、組織、及び支持する細胞基質のような系の幹細胞の群及び分化し た子孫(progeny)の群がある。本発明の標的細胞群は、細胞移植に、疾患または 感染症に対する治療または予防剤として、不足したまたは欠損した細胞群の再構 成に、遺伝情報を患者に導入する手段として、先天性または後天性遺伝欠損及び 異常に対する治療剤として有用である。 ２．関連技術の説明 造血系は形態学的に及び機能的に認識できる、人の血液系の細胞の全てを供給 する能力がある。血液循環系の、完全に成熟した細胞は、赤血球、血小板、好中 性顆粒球、単球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球、Ｂ−リンパ球およびＴ−リン パ球を含む。血球のめだつ特徴は寿命が比較的短いということである。従って一 生を通して全体の血液プールの再生が一定でなければならない。 多くの別個の血液細胞形態を絶え間なく生成するために身体によって用いらる 生理的システムの現在の容認されているモデルは造血系の幹細胞モデルである。 このモデルでは、完全に成熟した細胞は、要求があり次第、形態で認識できる分 裂する前駆細胞に置き換わる。前駆細胞は、赤血球系統では赤芽球、前骨髄球系 統では骨髄芽球、及び血小板では巨大核細胞のようにそれぞれの成熟細胞につい て別個の系統がある。前駆細胞は、祖(progenitor)細胞及び幹細胞に分類される もっと初期的な細胞から派生する。この定義は細胞がもっと分化した細胞系統を 産生する能力があるという機能的な特性に基づいてなされたものである。これら の細胞は、ある場合には、例えば、バースト形成ユニット―赤血球(BFU-E)及び バースト形成ユニット―巨大核細胞(BFU-MK)と呼ばれる赤血球祖細胞のような、 一つの別個の系統の前駆細胞である。他の細胞は、顆粒球及び組織球（マクロフ ァージ）系統細胞の元となるコロニー形成ユニット―顆粒球／組織球(CFU-GM)や T-及びB-リンパ球系統細胞の両方の元となるコロニー形成ユニット―リンパ球(C FU-L)のような多機能性細胞である。造血系の系統地図を図１に示す。 最近考察されたように、造血は、結局の処、幹細胞と呼ばれる未分化の細胞の プールに由来する。最も初期的な幹細胞は、二つの機能的な特徴によって定義さ れる。それは、幹細胞プールを自己再生し、そして維持する能力、及び全ての単 一の及び複合的な造血系統に分化するよう方向付けられた前駆体である子孫(pro geny)を生ずる能力とである。最も初期的な幹細胞は極めて稀なものであると考 えられる。骨髄細胞中では、104のうち１以下で、大抵の場合106のうち１より稀 である。従って、最も初期的な分化多能幹細胞の全体のプールは、大抵の場合、 １〜２×106細胞以下である。未分化幹細胞のこのプールは分裂と分化によって 分化の進んだ骨髄幹細胞と祖細胞及び前駆細胞を生ずる。形態学的には幹細胞と 区別がつかない祖細胞は、一つのまたはそれ以上の特定の細胞系統に分化し前駆 細胞は特定の細胞系統に分化する。結局は、増殖と分化の連鎖的な配列によって 、これら稀な幹細胞は、全体的な造血系を再生する。この過程は絶え間なく寿命 のある限り進行するもので、人の成人の場合、一日当たり1011より多い細胞を産 生する。 幹細胞及び祖細胞は、共に、骨髄、脾臓、及び血液中の全有核細胞のうち非常 に小さな割合を構成する。これらの細胞は骨髄中におけるよりも、脾臓における 方が約10倍少ない頻度であり、血液においてはさらに頻度が少ない。血液中の単 核細胞(MNC)、いわゆる白血球の大部分は、ＭＮＣの約92％より多くからなる好 中球（大多数）及びリンパ球とである。１リットルの血液には約7.5×109の白血 球及び約240×109の血小板が含まれている。 造血系の細胞の膜は、形態学的及び機能的表現型の点で別異の細胞型を区分し 、同定するのに用いられる異なるレセプター蛋白を含んでいる。これら多くの膜 レセプターは特定のモノクロナール抗体に対する抗原として同定され使用されて き た。これら抗原の多くは唯一の特定の系統の細胞に見いだされるのみである。特 に、抗原の特定の組み合わせが特定の細胞及び特定の系統の細胞を、細胞形態学 及び／または機能との相関において同定するのに有用であることがわかった。一 つの抗原、ＣＤ３４が、骨髄及び血液中の両方に見いだされる最も初期的な祖細 胞及び幹細胞上に見いだされた（米国特許番号4,714,680）。この抗原は発生段 階に特異的で、系統に依存しない。その抗原は、正常な人の骨髄及び血液細胞上 に現れ、顆粒球―組織球−コロニー形成細胞(CFU-GM)上に、赤血球−コロニー形 成細胞(BFU-E)上に、好酸球−コロニー形成細胞(CFU-Eo)上に、顆粒球―組織球 ―巨大核細胞−多機能コロニー形成細胞(CFU-GEMM)上に、及び未成熟リンパ性前 駆細胞上に現れる。人の骨髄では、この抗原は約1.8％の正常な骨髄細胞及び約0 .2％の正常な末梢血細胞上に現れる。ＣＤ３４は正常な、成熟した人のリンパ性 細胞または骨髄細胞上に現れない。従って、ＣＤ３４抗原は人の造血系の初期の 祖細胞及び幹細胞の同定に有用である。造血系の診断及び分類に有用な抗原のい くつかについて以下に示す。 造血祖細胞群及び幹細胞群がＣＤ３４抗原を発現することから、抗ＣＤ３４抗 原抗体が造血細胞の副次群を、研究及び治療目的で選択するのに用いられた。Ｃ Ｄ３４抗原の欠損した（ＣＤ−）骨髄細胞を含有する移植体は定着できない一方 、少量のＣＤ３４＋細胞の移植は定着することがわかった。骨髄及びリンパ性系 統に、抗原特異性抗体と分化に向かった細胞上に発現した他の抗原を用いて、３ ４＋のみならず系統ネガテイブ（lin―）である細胞の群をした。骨髄中の３４ ＋／lin―細胞群は単核細胞群全体の0.5％より少ない量を占め、末梢血中では更 に少ない。染料ローダミン１２３（Rho dull）に染まらずＨＬＡ―ＤＲ（ＤＲ― ）、ＣＤ３８（３８―）及びＣＤ４５（４５―）を発現していない細胞を単離す ることによって、３４＋細胞のさらに小さい部分を選択すると、最も原始的な幹 細胞が得られる。これらの細胞は約0.01％〜0.1％の骨髄単核細胞を意味し、お そらく末梢血中の割合さらに低いと思われる。形態学的には小さい低顆粒リンパ 球として現れる。これらの属性をもった細胞は、一般的には、細胞周期のGo期に あり、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスモデル及びその他の動物系でのイン ビトロ培養で認識できる骨髄及びリンパ性系統の細胞に分化する能力を発揮する 。 いくつかの技術が臨床および研究実験室において細胞の種を同定し、造血系の 細胞の部分集団を選択するのに用いられている。一つの技術は蛍光活性化細胞分 類（FACS）である。この技術では、多色フローサイトメーターが、蛍光をつけた 抗体が発生段階または系統段階の造血系の細胞を同定できる特定の抗原に結合し た細胞を検出し、分離するのに用いられる（図１参照）。簡潔には、検出可能な 蛍光信号を、細胞がフローシースを通過する際に細胞にレーザービームを当てる ことによって発生させる。非蛍光前進散乱信号は体積を示すのに用いられ、側面 散乱信号は細胞質組織及び粒度を検知する。抗体と結合させるのに用いた蛍光色 素のカラー信号は細胞特異性抗原を検知する。FACS分析は一般には二つまたは三 つの色彩を同時に分析することができ、このデータから、コンピュータプログラ ムが輪郭プロット、ドットプロット、ヒストグラムを発生し、統計分析等を行う 。いくつかのフローサイトメーターは、９５％より高い純度をもって分析された 試料から物理的に、細胞の副次群を単離しゲートで制御する能力がある。大抵の フローサイトメーターは0.5μｍと小さい粒子を分析でき、１細胞当たり約２０ ００ 分子の濃度の細胞膜レセプターを検知できる。かかる手段により、３４＋である 細胞群及び３４＋／ＤＲ―／３３―／１９―／３―／３８―のような副次群を検 知し分析することができ、これにより長期間の定着及び短期間の造血回復の両者 を確保するために最も有効な細胞に富んだ幹／祖細胞移植体の同定が可能となる 。 そのほかの技術も、免疫分離の物理的分離技術を用いて細胞の３４＋及び３４ ＋副次群を単離するのに用いられる。特定のレセプター分子に対する抗体を免疫 親和性カラムまたは培養容器に固定して特定の標的レセプターを有する細胞を結 合させるのに用いらる。その際理論的には標的レセプターを持たない細胞は結合 されないままである。細胞は抗体複合体から、物理的流体せん断力を用いること により物理的に分離される。親和性カラムでは細胞をカラムから分離容器中へ洗 い落とし、一方培養装置の場合には、非結合細胞はまず装置から洗い落とした後 結合した細胞を流体せん断力により分離装置中へ物理的に洗い落とす。かかる手 段により、３４＋／lin―のような幹細胞移植に特に望ましい特定の細胞群を選 択し濃度を高めることができる。しかし、細胞のアフィニティ抗体への非特異性 結合は望ましくない細胞型の細胞群による汚染を引き起こし、細胞選択の効率を 減少してしまう。 幹細胞移植は、造血性悪性腫瘍、非造血性起源の悪性固体腫瘍、免疫疾患及び 正常血液細胞の生産／成熟の機能不全／機能異常から生じる疾病からなる群の多 数の疾患や疾病を治療するのに使用される。これらの中には、重症複合免疫不全 （ＳＣＩＤ）、ウイスコット―アルドリッヒ症候群、ファンコニル貧血症、先天 性赤血球無形成症、リンゾーム性蓄積症、軟骨毛髪形成不全、重症サラセミア、 再生不良性貧血、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ） 、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び他の血液学的黒色腫、多発性骨髄腫、ヘア リーセル白血病、悪性組織球症、骨髄形成異常症、胸部癌腫のような固体腫瘍、 及び神経芽種を含む先天性疾患がある。 造血細胞の３つの源が、治療用の幹細胞移植のために使用される。骨髄、末梢 血及び臍帯血である。最も普通に使用される移植体は、高投与量化学治療及び／ 又は除去用放射線治療を受ける癌患者又は血液形成に欠陥のある患者における造 血の回復のための骨髄移植である。末梢血移植は、骨髄移植に代わるものとして 、 コストが少なく、侵襲の少ない技術として、現在進歩しつつある。 臍帯血も、また、致死的な造血不全を有する幼児の造血系の再構築のために、 最近使用されて成功をおさめている。臍帯血は、新生児の、普通は捨てられてし まうへその緒及び胎盤血から得られる。臍帯血は、単核細胞の単位数当たり成人 骨髄が含む数と約同数の祖細胞数を含む（米国特許第５００４６８１号）。 幹／祖細胞移植の３つのタイプとして、同系（１卵性双子）移植、同種移植、 及び受容者自身の細胞を使用する自家移植が使用されいる。同系移植は、拒否反 応が示されず、また対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を引き起こさない。通常ヒト 白血球抗原（ＨＬＡ）が同一であるドナーからとられる同種移植は、適正なドナ ーを有する患者の約３０〜４０％に使用される移植の最も普通のものである。表 現型が整合した同一な親のまたは関連したドナーであって、ＨＬＡ―Ａ、―Ｂ又 は―Ｄ座だけが不整合なものからの移植を受けた患者は、ＨＬＡが同一の兄弟姉 妹からの移植を受けた患者に匹敵する移植結果を有する。移植は、２以上のＨＬ Ａ座に不整合な受容者に対して成功するのは少ない。少数の患者は、血縁のない ＨＬＡ―同一ドナーからの移植を受ける。北米では、ＨＬＡが整合した兄弟姉妹 を見つけることができる患者は３０％より少なく、１つの座が不整合な親戚がい るのは３〜５％の患者だけである。そのため、同種移植を使用する多くの患者は 、ＨＬＡ―非血縁の志願者を見つけなければならない。非血縁ドナー移植の最近 の研究は、ＨＬＡ座に対するＤＮＡコーデングにおける単一塩基対不整合でさえ も臨床医学的合併症を招くことを示している。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）検 定方法は、真の適切なＨＬＡ―整合を決定することができる手段として現在調査 されている。自家骨髄移植は、ＨＬＡが同一な兄弟姉妹を有しないか又は適切な ＨＬＡ―整合ドナーを見つけることができない患者を治療するのに時々使用され る。 従来の骨髄移植（ＢＭＴ）は、白血病や再生不良性貧血を含む骨髄の疾患の治 療として、最初は発展した。一時、骨髄は、多能性幹細胞が存在する唯一の組織 であると考えられ、そのために骨髄移植は、放射線治療及び／又は高投与量化学 治療により骨髄が致死的に除去される場合に、これら細胞を置き換えるために必 要と考えられていた。現在は、これら幹細胞は末梢血中にも存在することが知ら れている。 骨髄は、全身麻酔が必要とされる侵襲的な外科的手法により集められる。約１ から２リットルの骨髄は、大きな骨、大抵は骨盤の腸骨稜から離れた位置に挿入 された大きい穴を有する注射針を使用して取り出される。通常１００回以上独立 に吸引することが必要である。純粋化した後、骨髄は冷凍され、将来のＢＭＴ再 注入のために貯蔵される。 悪性腫瘍の治療のための骨髄移植の場合、抽出操作腫瘍細胞を全部除去するた め、患者は除去の化学治療及び／又は除去の放射線治療を受ける。細胞は、しば しば腫瘍細胞を特異的に殺すように選ばれた細胞毒性薬剤で処理される。この操 作において、患者の骨髄細胞は根本的に殺され、患者を造血不全の状態にする。 患者自身の骨髄は、次に解凍され、再注入される。同種移植の場合、ドナー自身 の骨髄が使用され、注入される。骨髄は、次に通常３〜４週間内に定着し、造血 を確立する。この期間中に、血小板減少により生じる出血疾患の再現を防止する ため血小板輸血が繰り返し必要なので、集中的かつ高価な病院看護が患者に必要 となる。加えて、この期間中に、患者は、好中球減少症による重大なかつ時々致 命的な感染症を受けやすい。 重大な合併症が、副作用に加えて、移植治療からしばしば生じ、罹病率や死亡 率につながる。骨髄移植の場合、全骨髄の約２００ｍｌが患者の循環系に注入さ れる。この大容量が、血色素尿、赤色尿、吐き気、高血圧、発熱、寒気、嘔吐及 び頻脈を含む副作用を患者に引き起こす。骨髄移植の初期の合併症は、化学治療 や放射線の毒性、移植片拒絶、ＧＶＨＤ、免疫減少症、感染及び間質性肺炎を含 む。間質性肺炎も、また、移植後の免疫減少から生ずる日和見感染によると同様 に、薬剤及び放射線の毒性により生ずる。細菌や真菌による日和見感染もまた合 併症である。自家移植における大きな懸念は、低温保存された骨髄と一緒に悪性 腫瘍細胞の再導入される可能性である。密度遠心分離、モノクーロン抗体及び薬 理学的技術を含む異なる方法を使用して、注入の前に骨髄から腫瘍細胞を取り除 くことが試みられている。 ＧＶＨＤからの罹病率及び死亡率は大きな問題である。同種移植において、ド ナーのＴ細胞が受容者の細胞を外敵として認識し、それらを攻撃したときに、Ｇ ＶＨＤが起きる。薬剤（メトトレキサート、シクロスポリンＡ）を使用する移植 後の免疫抑制処置が施され、ＧＶＨＤを抑制し又は最小限にする。移植前にＴ細 胞をエクスビボで除くことは、ＧＶＨＤを防止するためときどき使用される。こ のアプローチはＧＶＨＤの危険を減少させるが、移植片の機能不全や白血病の再 発増加と関連する。 全骨髄を注入する代わりに抽出した骨髄から幹／祖細胞を分離する治療的アプ ローチが最近開発された。この場合、幹／祖細胞の非常に少ない群数だけが約１ ０ｍｌの容量中に注入される。この技術を使用して、再注入される細胞の量を１ ００倍ほど減少させ、全骨髄移植と関連する罹病率を大きく減少させることがで きる。 末梢血移植においても、移植物中の幹／祖細胞を多くするため幹細胞分離が使 用されている。末梢血幹細胞移植は、骨髄吸引よりも患者に対する侵襲度が少な い。細胞は、白血球搬出により患者から集められるが、その間患者は使用される 遠心分離器に接続され白血球細胞を分離し、赤血球細胞及び血小板は連続的に患 者に戻される。末梢血もまた、抽出前にＧ―ＣＳＦやＧＭ―ＣＳＦのようなサイ トカインを使用しての患者の血中の祖細胞を活発にすることにより、幹／祖細胞 を増加させることがある。これら手段により、骨髄中に見られるレベルとほぼ等 しい末梢血中の祖幹細胞レベルを供給することは可能である。祖幹細胞の分離／ 増強を用いて調製された末梢血幹細胞の利点の１つは、同種移植における抑制Ｔ 細胞を選別して除きＧＶＨＤを減少させることができることである。加えて、全 部又はほとんどの腫瘍細胞は幹／祖細胞の群の一部ではないと信じられているの で、祖細胞の積極的選択により腫瘍細胞の除去が改善されるという利点も存在す る。 医療環境において、祖／幹細胞のレベルは、通常、系統の祖細胞用のコロニー 形成検定を使用して検定される。最も普通の検定は、コロニー形成ユニット顆粒 性白血球マクロファージ（ＣＦＵ―ＧＭ）及びバースト形成ユニット赤血球（Ｂ ＦＵ―Ｅ）である。ＣＦＵ―ＧＭ及びＢＦＵ―Ｅ検定を使用して、定着が成功す る移植体を得るのに必要な祖幹細胞の数を求める。文献の再検討は、成功する移 植はＣＦＵ―ＧＭと相関することを示している（米国特許第５００４６８１号） 。移植当たりの、ＣＦＵ―ＧＭの範囲は、２〜４２５×１０4／Ｋｇ体重である 。許 容できる最小限度レベルは、移植物当たり、１０×１０4ＣＦＵ―ＧＭ／Ｋｇ体 重より大きい。 精力的な研究が造血幹及び祖細胞、ＣＤ３４＋細胞の増殖について行われ、種 々の程度の成功をおさめている。これらの研究のほとんどにおける基礎的アプロ ーチは、（ａ）正及び／又は負の吸収を用いた８０％を越える純度でＣＤ３４＋ 細胞を富化させる、（ｂ）基礎培地、例えば、子牛血清を含むＲＰＭＩ―１６４ ０又はＩｓｃｏｖｅの修正ＤＭＥＭ中でかつ供給細胞として間質層上での細胞培 養、及び（ｃ）ＩＬ―１、ＩＬ―３、ＩＬ―６コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、 赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）を含むサイトカイン 混合物の供給が包まれている。 これら研究を基礎にして、多数の観察がなされた。最初に、ＣＤ３４＋及び祖 細胞の増殖がある。１２−１４日で１００倍までの細胞増殖がおこることが報告 されている。細胞増殖における変動はドナーに依存する。第二に、培養中に骨髄 の系統に向かう細胞分化が示され、長期において主に単球及びマクロファージ群 になる。最後に、総細胞群数中にＣＤ３４＋細胞の割合は、培養の約１４〜２１ 日間中に、急に１パーセント未満にまで降下した。これらの結果は、現行の培養 条件下では、骨髄の系統に向かって分化するＣＤ３４＋細胞が増殖する能力はい まのところ限られていることを示している。発明の概要 本願発明は、現行の戦略や設計に関連した問題および欠点を克服し、所望の、 または標的とする細胞群を、迅速に生産する新しい方法を提供するものである。 本願発明の方法を使用すれば、細胞または組織の非常に少ない試料から、標的 細胞の多くの群を、簡単に、安く、そして迅速に生産することができる。標的細 胞は培地中で維持し、あるいは後に使用するために保存し、また、必要に応じて 、さらに分化させるため刺激することができる。ここで説明する手順は短く、簡 単で、多くの異なる細胞のタイプに応用できる。標的細胞群は、移植治療に有用 であり、また、現行の手順に対して多くの利点を有する。ドナー細胞を多数回プ ールする必要はなく、また、接種物中の幹／祖細胞群を富化するため現在必要と さ れている多くの分離手順も必要ではない。さらに、ほとんどの特別な組織のため の、多くの幹細胞、祖細胞および前駆細胞が生産できる。これらの細胞は移植治 療に最も有用である。 ここで概略を説明すると、本願発明は、所望の細胞群の増えた分画を含む増殖 した細胞培養物を生産する方法に関し、さらにはその方法によって生産された増 殖した標的細胞群に関する。細胞培養物は、標的細胞分画中で、平衡化選択因子 混合物（ＢＳＦＭ）の存在下で培養することにより増やせる。ＢＳＦＭは、標的 細胞群の増殖を促す、バランスのとれた刺激および抑制作用をもたらすものであ る。標的とする群は、原始的な幹細胞、祖細胞、前駆細胞、分化の中間段階の細 胞、最終的に分化した細胞、またはこれらの混合物を含む。これら標的細胞は、 結果的に移植治療に有用である。 また、本願発明は、所望の細胞群の増殖を促す、バランスのとれた刺激および 抑制作用を有する細胞因子の混合物を含むＢＳＦＭ組成物に関する。この組成物 は、好ましくはマイトジェンを含む誘導剤で細胞群を処理することによって生産 される。有用なマイトジェンには、フィトヘマグルチン（ＰＨＡ）またはコンカ ナバリンＡ（ＣｏｎＡ）等の植物レクチン、ＴＰＡまたはメゼレイン等のＴ細胞 マイトジェン、およびＯＫＴ３等のＴ細胞モノクローナル抗体が含まれる。一方 、ＢＳＦＭは、多くの異なる出発細胞群から生産でき、これらはＢＳＦＭ−１， ＢＳＦＭ−２等となり、それぞれ異なる標的細胞群に対し特異性を有する。 他の態様として、本願発明は移植治療方法に関する。そこでは、原始的な哺乳 類の細胞（たとえば、血液、他の体液や組織から）をＢＳＦＭとともにインビト ロで、前述の方法により培養する。得られた増殖した標的細胞群は、後に使用す るため、そのまま保存、または冷凍保存するか、または移植治療、あるいは、他 の治療や予防に使用するため患者にただちに移入される。標的細胞は、移植され る器官系や新しい器官を、治療もしくは創造するために使用することができ、ま た、現存する、病気にかかった、または損傷した器官、組織および細胞系を補填 するために使用することができる。一方、標的細胞は、赤血球からのヘモグロビ ンのような有用な細胞生産物を生産するために使用することができる。 さらに、他の態様においては、本願発明は遺伝子治療方法を提供する。標的細 胞を本願発明の方法により生産し、遺伝子配列を直接移入するか、または、遺伝 子配列を含む組換え型ウイルスのベクターを感染させる。調整し、適当に配列を 発現した細胞を選択し、分離し、そしてインビトロで培養する。その後、これら 組換え細胞を患者に移入する。遺伝子治療に有用な遺伝子には、患者の中で発現 生成物が欠けているか、または欠陥がある遺伝子、および発現が患者に対し、有 利な効果を有する遺伝子および他の遺伝子配列が含まれる。 さらに本願発明の態様の一つは、移植治療方法または予防方法を提供するもの である。そこでは、患者をインビボでＢＳＦＭで処理し、体の特別な標的群を選 択的に増殖させる。病気にかかったか、かかる可能性のある、または損傷を受け たか、受ける可能性のある器官または細胞系を創造あるいは修復するのに、ＢＳ ＦＭ治療をインビボで採用することができる。この治療の形態は相対的に非侵襲 性であるが、そのような広い範囲の細胞には現在利用できていない。図面の簡単な説明 図１ 造血系連鎖および発達上の特異な抗原を表す図 図２ 標的細胞の多様な群をＢＳＦＭで生産するために使用する方法を表した図 図３ ＢＳＦＭ処理ＰＢＭＮＣ培養物のコロニー形成ユニットを示す代表的な顕 微鏡写真 図４ ＢＳＦＭ処理ＰＢＭＮＣ培養物のバースト形成ユニットを示す代表的な顕 微鏡写真 図５ ＢＳＦＭ処理１日後の未分画細胞の代表的な顕微鏡写真（１０ｘ） 図６ ＢＳＦＭ処理３日後の未分画細胞の代表的な顕微鏡写真（１０ｘ） 図７ ＢＳＦＭ処理１日後の分画細胞の代表的な顕微鏡写真である（１０ｘ） 図８ ＢＳＦＭ処理３日後の分画細胞の代表的な顕微鏡写真である（１０ｘ） 図９ インキュベーション６日後の未分画ＰＢＭＮＣ培養物からの、ＣＤ３４＋ ＣＤ３８ＤＲの代表的なＦＡＣＳ分析 図10 インキュベーション５日後の未分画ＰＢＭＮＣ培養物からの、ＣＤ３＋Ｃ Ｄ３３ＣＤ３４の代表的なＦＡＣＳ分析発明の記述 幹細胞移植の現行の技術は、患者の消耗した若しくは欠けた細胞系を十分に再 構成するための幹／祖細胞の充分な量を提供するために侵襲的で高価な方法を必 要としている。本発明の方法を用いることで、非常に短期間且つ低コストで、多 数の細胞を作成することができる。これは消耗した若しくは欠けた細胞系の完全 な再構成を可能にするのみならずもし１回で足りなければ複数回の若しくは周期 的な処置を可能にするのに充分な細胞を有するという融通性を可能にする。又、 現行の技術は通常生物体液の非常に大きなプールからの細胞の精製を必要とする 。本発明の方法を用いて、生物体液の非常に小さな試料から多数の細胞を製造す ることが出来る。これは標的の細胞を富化する為の能率の悪い分離技術を用いる ことの費用と時間を節約し、プールを創造するために用いられた多くの試料の一 つに汚染が存在し相対的にそこからは幹細胞が殆ど集まらないという危険を解消 し、そしてより重要なことに、所期の生産を最も高いレベルで得るために当業者 が変更できる堅実な源を供給するものである。 １．標的細胞選択 本発明の方法は非常に多様な細胞型群の選択的増殖に対し幅広く適用できる。 従って、本方法における第一段階は求められる標的細胞若しくは標的細胞の混合 物の選択から成る。ここで述べられる方法の実施において、一つ以上の細胞型は 増殖された細胞群において標的細胞の分画を豊富にするように優先的に増殖され ることができる。斯様に、通常の細胞試料における非常に低いレベルで存在する １つの細胞型は、該増殖された群におけるその分画を増加するように、選択的に 増殖させられることができる。この選択的増殖と富化の間に、群中の非標的細胞 は死に絶えるに任せることができ、増殖されない侭でいるか或いは増殖された培 養物中の数及び／又は割合において下落する。本発明の方法の重要な臨床の優位 点の一つは、選択された標的細胞の割合の高い細胞群が単純にそして分離若しく は精製工程の必要無しの若しくは分離したそして高価なサイトカインの添加無し の多くのケースにおいて製造され得る、ということである。幾つかの場合では、 生理的サンプルに比べて標的細胞の割合が多くなるか、標的細胞の比が特定の有 用性を持つように変えられた所期の増殖細胞群が多くの細胞の型を含むこともあ る。例えば造血再構成が目的であり、長期間の定着を提供するために実質的に幹 細胞及び祖細胞が豊富である細胞群はまた、短期間のプラスの効果を与えるため に前駆細胞の特別に調整された分画や、最終的に分化した細胞を含んでいてもよ い。 本発明の方法を用いて出発細胞群に存在しない細胞型の実質的な分画を含む細 胞群を製造することもまた可能である。これはそれらの既知の分化の道筋に沿っ て細胞の分化若しくは脱分化を有利に運ぶ条件を提供することによって起こるこ とができる。 標的細胞はどんな哺乳類細胞からも選択することができそして好ましくは初代 培養の哺乳類細胞、さらに好ましくは初代培養のヒト細胞から選択することがで きる。標的細胞群若しくはそれが選択される哺乳類細胞群は、全細胞系統、器官 、若しくはその系の幹、祖及び前駆細胞を含む器官系から成る。それからそのよ うな細胞群が選択され得る組織及び器官の例は、造血細胞、肝細胞、膵臓細胞、 腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、心臓細胞、リンパ腺細胞、胸腺細胞、脾臓細胞、 骨髄細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、内皮細胞、上皮細胞等である。好まし い標的細胞は造血細胞である。増殖された細胞群の使用の目的が組織修復若しく は再生である場合には、そのような組織において通常見いだされる細胞の混合物 が標的細胞混合物であることができ、或いは別々に調製してインビボ若しくはイ ンビトロでそのような目的を達成するように合わせてもよい。好ましいアプロー チにおいて、標的細胞群は、増殖細胞群の調製の間若しくはその使用の間に幹／ 祖細胞系統の経路にそって分化する細胞を供給できる幹細胞及び／又は祖細胞を 含む。 造血系において、要求された標的細胞は、祖細胞、前駆細胞、分化の中間段階 の細胞そして最終的に分化した細胞若しくはそれらの混合物の他に最も原始的な 型の分化多能幹細胞を含むことが出来る。これらの細胞は、ＣＦＵ−Ｇ（顆粒細 胞）、ＣＦＵ−ＧＭ（顆粒細胞／マクロファージ）、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（顆粒細 胞／赤血球／マクロファージ／単球）、ＣＦＵ−Ｅ（赤血球）、ＣＦＵ−ＭＫ（ 単核細胞）、ＣＦＵ−Ｍ（マクロファージ）、ＣＦＵ−Ｅｏ（好酸球）、ＣＦＵ −Ｂａ（好塩基性白血球）、ＢＦＵ−Ｅ（赤血球）、そしてＢＦＵ−ＭＫ（巨 大核細胞）のような骨髄祖細胞、そしてＣＦＵ−Ｌ（リンパ球）、ＣＦＵ−Ｂ（ Ｂ細胞）そしてＣＦＵ−Ｔ（Ｔ細胞）のようなリンパ性祖細胞を含む。また有用 なのはＴリンパ球、Ｂリンパ球及びそれらに分化する前駆体からなる標的細胞群 である。巨大核細胞（血小板）、赤血球、顆粒細胞、マクロファージ、単球、好 塩基性白血球、好酸球及びそれらに分化する前駆細胞もまた、単独で若しくは他 の標的細胞との混合物として、望ましい標的である。 造血系再生における使用の観点から特に興味あるのはＣＤ３４抗原として表さ れる細胞である。ＣＤ３４＋細胞は初原的なＣＤ３４＋リンパ細胞やＣＤ３４＋ ＣＤ３８−ＣＤ４５−ＤＲ−ＲＨＯ１２３（Ｄｌｌ）と特定されるより初原的な 細胞を含むことができる。また、免疫不全及び疾患を治療する場合に興味あるこ とはＣＤ３、ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞）及びＣＤ８（サプレッサーＴ細胞）のよ うなＴ細胞抗原を発現している細胞である。赤血球はまた移植療法における細胞 群として使用するためにもヘモグロビンの製造に使用するためにも望ましい標的 細胞である。 当業者はどの標的細胞及び標的細胞混合物がここに記した応用のためにそして 特に調製した細胞群を用いる他の応用のために有用であるかを認識するだろう。 本発明の方法によって作られる細胞及び細胞群は形態学的に、抗体的にそして 機能的に解析される。まず、選択的に増殖された細胞群は大きさ、顆粒の存在若 しくは非存在のような特徴、そして全体的な様子が顕微鏡的に調べられる。幹細 胞及び他の相対的に未分化の細胞は、小さくはっきりした膜を持っているが、よ り分化した細胞は一般にもっと大きい。第二に、幹細胞は抗原−特定のモノクロ ーナル抗体を用いたＥＬＩＳＡやＲＩＡといったアッセイで検出可能である特徴 的な抗原を発現しておりＦＡＣＳ技術により分けることができる。これらの抗原 −結合アッセイからの結果は細胞系統の発生地図を提供する。最後に、細胞はま たそれらのコロニーを作る及び／又はインビトロで他の生物学的機能を演ずる能 力によって機能的に分析される。 ２．第一細胞群の選択 本発明の好ましい態様においては、所期の標的細胞の増殖と富化とを優先的に 便宜を計る特定の刺激及び阻害効果のバランスのとれた細胞因子の混合物から成 るＢＳＦＭを製造するように、第一細胞群が選択され誘導される。これらの第一 細胞群はヒト若しくは非ヒトの血液、骨髄、体組織、好ましくは哺乳類の組織、 若しくは確立された細胞系統の初代培養細胞から成る。この第一細胞群は、要求 される標的細胞と同じ細胞型であることができ、標的細胞の型の細胞を含むこと ができ、標的細胞の型の細胞若しくは標的細胞の型とは完全に異なった型である 細胞へ分化する細胞を含むことができる。本発明の１つの態様においては、この 第一細胞群は以下に記載するように最終的に増殖させる細胞群であることができ る。 しかしながら、最終的に増殖させるのと同じ型の分離細胞群を用いることが一 般的に好ましい。このように、造血細胞群のためには、血液に基礎を置く細胞試 料が都合よく用いられることができる。しばしば第一細胞群が以下に述べるよう に増殖すべき細胞群の部分若しくは副群からなることが好ましい。しかしながら 、非造血由来の組織細胞を、造血細胞の第一群を組織内で標的細胞を選択的に増 殖できるＢＳＦＭを製造するように誘導することによって増殖させることができ る、ということが予想される。 造血系に関しては、特定の標的−特定のＢＳＦＭを好適に製造するのに有用な 第一細胞群は末梢血液細胞、臍帯血細胞及び骨髄細胞から選択される。多くの臨 床的な優位点のために、末梢血液細胞群の選択が好ましい。第一に、末梢血液は 相対的に非侵襲的な手段（針でさす）で得るのが容易である。病院での滞在は要 求されず、感染の危険は非常に小さく、そしてその手順はたいていの保険看護作 業者によって行なわれ得る。第二に、末梢血液試料は個々人の健康には殆ど配慮 しなくてよい。なぜなら患者の血液の損失は全身的な影響はほんんど無いかない しは皆無だからである。第三に、末梢血液は多くの医療アッセイの原料として既 に使われている。標準的な処置と供給がどの医療施設においても現在間に合わせ ることができる。 出発時の第一細胞群として有用な末梢血液群には末梢全血（例えば、採取した ままの試料(as-removed blood sample)）及び末梢血液単核細胞（ＰＢＭＮＣ） を含めることができる。ＰＢＭＮＣの源は既知の収集及び分離技術の生成物を含 められる。例えば、粗遠心分離からの白血球層はＦＩＣＯＬＬのような特定の重 力に基づいた系からのより細かい分離物と同じく用いられる。第一細胞群として 高度に精製されたＰＢＭＮＣ類或いは親和性に基づいた分離技術を用いることに より特定の細胞の型（例えば、Ｔ−リンパ球）を有するその特定の下部群を用い ることは可能である。以下に述べるように、有用なアクセサリー細胞を含んおり 高度に処理された細胞よりもダメージが少ないので最小の分離手順を受けたＰＢ ＭＮＣ類を用いることはしばしば有用である。細胞の第一群は収集及び分離の後 すぐに用いることができる。若しくは後の使用のために冷蔵若しくは冷凍保管す ることができる。 ３．第一細胞群の誘導 本発明の重要な面は、ＢＳＦＭの存在下で細胞群において標的細胞を増殖し富 化することが選択的にできることである。このＢＳＦＭの製造は好ましくは、上 述の第一細胞群をこの標的特異的因子の混合物を作成するべく誘導することによ って達成される。斯様に、誘導工程は要求されるＢＳＴＭを製造するように制御 されなければならない。誘導工程は、以下に述べる第二細胞群が第一細胞群と同 じであるときに標的細胞増殖工程の一部分として或いは一つの独立の工程中で第 一細胞群において行なわれることが出来る。好適な態様においては第一細胞群を 加えられた誘導試薬によって誘導し、又、培養の間に該細胞によって製造された 因子により、例えばカスケード的に、更に誘導されてよい。 好適な態様において、標的細胞特異的ＢＳＦＭの性質は物理学的、化学的そし て生物学的パラメーターの組み合わせによって影響を及ぼされる。とりわけ重要 な一つのそのようなパラメーターは、以下に述べるように、加えられた誘導試薬 の性質である。標的細胞を変化させるために可変である他のパラメーターは、上 述したように、第一細胞群の性質である。出願人は例えば、造血細胞では、白血 球搬出法処理から得られたもののような、相対的に処理されていない、粗に分離 されたＰＢＭＮＣがＣＤ３４＋細胞のような幹／祖細胞を標的とするＢＳＦＭを 製造するということを発見した。ＢＳＦＭ誘導工程に影響を及ぼすことができる 他の因子は、例えば、培地、温度、時間、ｐＨなどの培養条件を含んでいる。 ひとつの好適な態様において誘導工程は、誘導剤を添加した白血球の成長を支 持する培地中で、選択された第一細胞群を培養することで行なわれる。培地は血 清が存在しないほうがよく、間質細胞を要求しない。好ましい培地の型はニュー ハンプシャー、レバノンのヴェラックス社(Verax Corporation)によって製造さ れるＤＭＥＭ改良ＩＳＣＯＶＥＳ、ＲＰＭＩ１６４０、及びＣＣＭ−２を含む。 一般に好ましい態様によって有用である加えられた誘導試薬は第一細胞群の細 胞型にマイトジェン効果を有する材料から成る。マイトジェンは種々の細胞型の ものに対して知られ、種々の因子においてそのようなマイトジェンの効果は造血 細胞について観察されている。Ｔ細胞マイトジェンはしばしばこの工程に用いら れる。 マイトジェンのクラスの中で造血細胞からＢＳＦＭの誘導を誘導若しくは促進 するのに有用なものは、植物レクチン、Ｔ細胞マイトジェン、及びモノクローナ ル抗体である。要求されるマイトジェン活性を有する特定の植物レクチンは以下 のものから誘導されるものを含む： レクチン源 Phaseolus vulgaris（ＰＨＡＮ フィトヘマグルチニン） Dolichos biflorus Solanum tuberosum Sophora japonica Haclura pomifera Pisum sativum Ulex europeus（ＵＥＡ−Ｉ、U.europeusアグルチニンＩ） Ulex europeus（ＵＥＡ−ＩＩ、U.europeusアグルチニンＩＩ） Arachis hypogaea Glycine max Canavalia ensiformis（Ｃｏｎ Ａ、コンカナバリンＡ） Triticum culgaris（ＷＧＡ、小麦麦芽アグルチニン） ricinus communis（ＲＣＡ−Ｉ、R.communisアグルチニンＩ） Lycopersicon esculentum Phytolacca americana（ＰＷＭ、ヨウシュヤマゴボウマイトジェン） Listeria monocytogenes（ＬＰＳ、リボポリサッカライド） 植物由来マイトジェンの特に有用な群にはＰＨＡ、ＣｏｎＡ、メゼレイン（Ｍ ＺＮ）及びＴＰＡ（及び関連したジテルペンエステル）が含まれる。ＴＰＡとそ の関連化合物の幾つかを以下に示す： Phorbol 12-myristate-13-acetate（TPA） Phorbol（4-0-methyl）12-myristate-13-acetate Phorbol（20-oxo-20-deoxy）12-myristate-13-acetate Phorbol 12-monomyristate Phorbol 12,13-didecanoate Phorbol 12,13-dibutyrate Phorbol 12,13-dibenzoate Phorbol 12,13-diacetate Staphylococcal enterotoxin A(SEA)、Streptococcal protein A、ガラクトー スオキシダーゼ及びＯＫＴ３のようなＴ細胞抗体など非植物起源のマイトジェン も又有用である。幹細胞増殖因子（ＳＣＰＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、いずれ かの成長因子そして骨形態形成プロテイン（ＢＭＰｓ）の他にインターフェロン −アルファ（ＩＦＮα）及びＩＦＮβも又幾つかの状況において誘導試薬として 用いることが出来る。 好適な誘導工程において、上述されたように選択された第一細胞群は実際の誘 導工程に先だって増強（,i.e．薬効増加）試薬の存在下で培養される。誘導を増 強するのに有用な試薬はＴＰＡ（若しくは関連したホルボールエステル）ＭＺＮ 、ＩＦＮα及びＩＦＮβを含む。この工程にはそれから培養物への上述した誘導 物質の添加が続く。最も好適な組み合わせはＩＦＮαとＩＦＮβの使用、そして 増強剤としてＭＺＮ、そして誘導物質としてＰＨＡ、ＣｏｎＡ若しくはＯＫＴ３ を含む。 ＢＳＦＭは処理された細胞から上清として好適に分離されるので、上に掲げた 試薬若しくはそれらの既知の等価物からの誘導物質及び／又は増強剤の選択はそ れらの細胞障害性若しくは腫瘍形成性特性に関すること無しに為される。この工 程は、ＢＳＦＭがいかなる有害な残渣のマイトジェンもしくはその副生成物で汚 染されはしないということを確実にする方法で行なわれることが出来る。ＩＮＦ やＴ細胞抗体のような誘導若しくは増強試薬が用いられる場合、細胞若しくは細 胞生成物／残骸からのＢＳＦＭの分離は必要でなくてもよい。 用いられる誘導試薬の量及び処理の長さは処理された各々の特定の細胞培養物 によって経験的に決定されてよい。用いられる誘導試薬の好適な量は約５μｇ／ ｍｌ培地乃至約１００μｇ／ｍｌ培地である。更に好ましくは、記述した増結細 胞誘導工程のためには、全血若しくは分画血の第一細胞群を処理するとき誘導試 薬は約５μｇ／ｍｌ乃至５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０μｇ／ｍｌ乃至 ５０μｇ／ｍｌの量で加えることが出来る。薬効増強剤／増強剤を用いた場合に おいては、培地に約５ｎｇ／ｍｌ乃至５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍ ｌ乃至５０ｎｇ／ｍｌ、そして最も好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ乃至２０ｎｇ／ｍ ｌのレベルで培地に加えることが出来る。処理時間は時間乃至日、好ましくは約 １日乃至１０日、最も好ましくは２日乃至５日であることができる。或いは処理 は、より長い時間に亙って複数の処理を若しくはより強度の処理をより短い時間 で伴うことができる。 当業者は、標的細胞効果に伴う初期条件の変更を相関させるべく、ここに含ま れた教示及び単純な実験に基づいて要求された誘導条件、試薬及び出発細胞群を 選択することができる。本発明は、陽性及び陰性の効果の両方のバランスがとれ た誘導因子混合物（ＢＳＦＭ）を用いると、求められるあらゆる数の標的細胞群 の制御された選択的増殖を許容するという発見に少なくとも幾分か基づいている 。。 誘導工程は好ましいインビトロ方式で記述してきたが、ある状況においてはこ の工程をインビボで行なうことが可能である。斯様に、細胞群（循環しているか 静的な）は他の点では患者に対して有毒ではない誘導試薬で処理できるという場 合において、ＢＳＦＭはインビボで発生させることができ、さらにエクスビボで 使用するために患者から集められるか又は選択された標的細胞群をインビボ、例 えば組織修復若しくは再生のサイトで増殖させるため患者内に留めるかされる。 インビボで利用される誘導試薬は患者内に注射又は注入されてよく、経口で与え られるか或いは、例えば経皮的パッチで治療されるべき細胞上に直接置かれても よい。そして単独の治療や多重治療にかかわることができる。 ４．均衡化選択的因子混合物 本発明は、それぞれ決まった第２の細胞群に特有の方法で作用して望みの標的 細胞の増殖と富化を起こさせるＢＳＦＭの一群を提供する。ＢＳＦＭはすべて、 選んだ標的細胞の増殖に選択的に有利に働く、刺激効果と阻害効果のバランスが とれた細胞因子の混合物であるという特徴を有する。従来の方法は一般に、狭い 範囲の細胞系とそれに対応する特定の増殖（刺激）因子を用いてこれらの因子ま たはそれらを組み合わせたものの有効性を調べるのに重点がおかれていた。本発 明の方法論は入り組んだポジティブ因子とネガティブ因子のバランスおよび自然 と同じようなフィードバックループを用いることに基づいている。その結果この 方法は強力であると同時に簡単である。 限定することなく説明すると、ＰＢＭＮＣ中のＣＤ３４＋細胞を選択的に増殖 させるＢＳＦＭは、好ましい態様によれば末梢血の白血球搬出画分をＭＺＮとｃ ｏｎＡで誘導することにより得られる。このＢＳＦＭはこれまで部分的に性質が 明らかにされており、以下の既知の細胞因子を含むことがわかっている。 サイトカイン 生産細胞 ＩＬ−１ マクロファージ ＩＬ−２ Ｔ−リンパ球 ＩＬ−３ Ｔ−リンパ球 ＩＬ−４ Ｔ−リンパ球 ＩＬ−５ Ｔ−リンパ球 ＩＬ−６ Ｔ−リンパ球、マクロファージ 、リンパ性細胞、単球 ＩＬ−８ 単球 ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ） Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、 マクロファージ、単球 ＩＮＦ−γ Ｔ−リンパ球 ＴＮＦ（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β） Ｔ−リンパ球、マクロファージ 、好中球 これらのサイトカインのいくつかについては濃度も決定されている。例えば、 ＩＦＮ−γとＩＬ−２の濃度はそれぞれ約１０，０００−２０，０００ＩＵ／ｍ １及び約２０００−５０００ＩＵ／ｍｌである。そのほかのここにあげたサイト カインの濃度も、ＥＬＩＺＡ検定などの市販のアッセイキット及び／または方法 を用いて容易に決定することができる。その他のサイトカインとしてＥＰＯ、Ｓ ＣＰＦ、ＳＣＦ、すべての成長因子、及びＢＭＰ等があげられる。 本発明の開示があれば、当業者はこのＢＳＦＭに含まれる因子を完全に明らか にし、望みのＣＤ−３４＋細胞を増やすのに最も適した既知の活性因子（刺激と 阻害の両方）の性質と量を決定することができる。従って、このような最適化さ れ、限定されたＢＳＦＭの合成は本発明の範囲内にある。更に、本発明は、標的 細胞の増殖や標的細胞系の維持に有用または重要な新規なサイトカインを単離し 同定する方法を提供するものである。たとえば、イムノアフィニティの手法を用 いて既知のサイトカインをすべて除いたのち、残りの成分について標的細胞の増 殖及び／または分化を助ける能力を生物学的に試験をする。さらには組成のわか ったＢＳＦＭを既知の成分から再構成し、それが誘導ＢＳＦＭと同じ結果をもた らすかどうかを試験することができる。同じ結果が得られない場合には当業者は 何が足りないのかを決めることができる。 単離された「未知の」成分もまた従来技術で分析し精製することができ、蛋白 性成分のアミノ酸配列を決定し、従来の組換え手法によりそれらの成分の遺伝子 を単離し、配列決定することができる。従ってこれらの蛋白質は組換え生産する ことができる。 本発明の別の態様として、ポジティブ因子やネガティブ因子を加えたり取り除 いたりしてあるＢＳＦＭを改変し、別の標的細胞の選択的増殖に適した第２のＢ ＳＦＭを作ることがある。別のあるいは更なる標的細胞を増殖させ富化（割合を 増やす）ことができるＢＳＦＭを得るにはいくつかのアプローチがある。まずＢ ＳＦＭ標品中の一つまたはそれ以上の因子を、好ましくはアフィニティクロマト グラフィで取り除くことである。特定のサイトカインに対する抗体を有するアフ ィニティマトリックスは市販されている。例えば、ＩＬ−２を除去するアフィニ ティカラムを通過させたＢＳＦＭは、もはやリンパ系統細胞型を増殖させ富化さ せることができない。プラスチック表面に吸着させることによりマクロファージ を除くと、残りの細胞群はＢＳＦＭ中にＩＬ−１またはＣＳＦを全くまたはほと んど生産しなくなる。更にＢＳＦＭ中の既知の因子を単離せずに因子に特異的な モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いて選択的に不活性化することが できる。ポジティブ及び／またはネガティブアプローチを用いることにより、Ｂ ＳＦＭの改変型を望みの標的細胞を増殖させるために作成することができる（図 ２参照）。あるいは、サイトカイン誘導のカイネティクスに基づき、誘導後回収 する時間を変えて組成の異なるＢＳＦＭを得ることもできる。例えば、ＩＬ−２ はＩＦＮ−γより先に誘導される。９６時間で回収されたＢＳＦＭ標品は４８時 間で回収されたものよりもＩＦＮ−γの濃度は高い。一方ＩＬ−２濃度はどちら のＢＳＦＭ標品でも同じになる。 ５．標的細胞の増殖 本発明の方法の次の工程は所期の標的細胞を選択するＢＳＦＭの存在下で第２ の細胞群の標的細胞を選択的に増殖させることである。すでに述べたように、第 ２の細胞群は第１の細胞群と同じ細胞型でも違う型であってもよい。多くの場合 、元の細胞群を細胞群構成が同じ２つの群に分け、ＢＳＦＭの生産とその使用に 用いる。場合によっては第１と第２の細胞群が同一である、即ち同一の細胞をま ず誘導にかけ、それから（分離工程を経てあるいは経ずに）増殖させる。 所期の標的細胞が何であるかによりのぞましい第２の細胞群の選択が決まる。 標的細胞はこの細胞群中にある細胞型であるか、それから派生するものでなけれ ばならない。一般に第１の細胞群について上でのべた細胞型と同じ種類の細胞型 が第２の細胞群に使用することができる。 標的細胞の選択的増殖はＢＳＦＭの性質と量を変えることによりまた培養条件 を変えることにより、コントロールすることができる。ＢＳＦＭを選ぶ基準は上 に論じた。培養工程は限定されたサイトカインを添加することができる適当な基 礎培地中で行うのが好ましい。個々の細胞型に対する培養条件は変えることがで きるが、標準的組織培養条件が培養処理の基礎となる。一般的には細胞を５％Ｃ Ｏ2インキュベーター中３７℃、培地中でインキュベートする。細胞の型によっ ては特定の化学薬品、蛋白、インシュリンや血漿のような培地成分や成長因子、 コ ロニー刺激因子（ＣＳＦ）が細胞の維持に必要となる。これらの必要条件は業界 で知られているか、当業者が決定できるものである。制限することなく説明する と、ＣＤ３４＋細胞群の増殖に有利なＢＳＦＭはＣＣＭ−２のような無血清培地 中で培養できる。 ＢＳＦＭは、所期の標的細胞の増殖／富化を達成するのに十分な量を培地に加 える。添加量はＢＳＦＭの性質、第２の細胞群の構成と培養条件により異なる。 実際には、添加量は約１％から１０％、好ましくは２％から５％である。 培養工程の長さは、標的細胞の選択的増殖を促進するために変えることができ る。細胞群が異なる分化の経路にある、またはその経路に入るように誘導された 細胞を含んでいる場合、最終的な標的細胞の割合の増加は培養をいつ終わらせる かにかかっている。通常、例をあげると、目的の富化の程度にもよるがＣＤ３４ ＋細胞に富んだ細胞群は５から２０日培養するのが最もよく、好ましくは約５か ら１０日である。 いったん所期の増殖標的細胞群が得られれば、細胞をすぐに用いてもよいし、 冷蔵あるいは冷凍して将来の使用に備えることができる。別の態様では、標的細 胞群を第２の標的細胞を多く含むように改変することができる。例えばＣＤ３４ ＋／好リンパ系細胞混合物を、Ｔ細胞の祖細胞がリンパ系統に分化していくのを 促進することが知られている因子とインキュベートすることによりＴリンパ球に 富んだ細胞群に変換することができる。また標的細胞を長期間培養する、あるい は培地に標的細胞を所期の細胞群及び／また所期の分化段階にまで持っていく因 子を補充するなど、細胞の培地を変えることもできる。そのような因子の例とし て、ＩＬ−２、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ刺激因 子（Ｍ−ＳＣＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン（ＩＦＮ） 、レチノイン酸、ＳＣＰＦ、ＳＣＦやＢＭＰ、神経細胞成長因子（ＮＧＦ）、上 皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞由来成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成 長因子（ＰＤＧＦ）などのすべての成長因子がある。この工程では培養細胞の培 地はＢＳＦＭをふくんでいてもよいし、含んでいなくてもよい。 様々な臨床応用に向けた標的細胞を得ることの他に、本発明のもう一つの利点 は細胞増殖の間に腫瘍細胞が本来的に除かれることにある。慢性の骨髄性白血病 のいくつかについては細胞の数が長期培養の間に急速に減少することが報告され ている。本発明によれば増殖中の腫瘍細胞の除去は、例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ 、活性化マクロファージのような腫瘍細胞に抗増殖作用及び／または細胞毒性を 有するサイトカインや細胞が存在することにより促進される。 誘導工程の場合と同じく、増殖工程もインビボまたはインビトロで行うことが できる。インビボでの適用は循環している細胞群のためにＢＳＦＭを血流中に導 入すること、あるいは特定の組織細胞に導入することを含む。あるいは、細胞を ＢＳＦＭと一緒に、またはＢＳＦＭで処理してから体に戻して、システム、組織 、器官の修復、再建、再生を図るものである。 別の態様によれは、本発明はインビボの生物における「自然」のコントロール をまねて、細胞培養のホメオスタシスを確立することを目指すものである。ホメ オスタシスの定義は、ここでは特定の培養条件の下での細胞／細胞、及び細胞／ 因子の相関の結果確立された動的平衡に限定される。ホメオスタシスは平衡のと れた因子の混合物と種々の細胞型からなる培養物を供給することにより達成され る。均衡のとれた因子の混合物を外部から加えると、更なる因子はデノボで培養 中に誘導されるてくる。例えば、ＩＦＮ−γ及び／またはＴＮＦ−αを培養に加 えると単球とマクロファージからＣＳＦが生産されてくる。特定の細胞／細胞、 細胞／シグナル間の相互作用の結果、標的細胞型細胞群数の増加及び／または分 化にとって好ましい刺激と阻害の均衡がとれた環境が作られる。この動的平衡は 細胞群が標的細胞型の増殖と富化の結果変化するのに従い変化できる。従って当 初の刺激と阻害が均衡がとれた環境は、標的細胞の連続的増殖を維持するために 変えることができる。 ６．増殖細胞群 本発明の増殖した細胞群は、最終的に当初の細胞群に比べ標的細胞の数が多く （増殖）、標的細胞のパーセントが高い（富化）。例えば、幹細胞のように非常 にその数と割合が低い細胞を増殖させ富化して標的細胞の細胞群数を約５％以上 、好ましくは約２０％、最も好ましくは約５０％以上にすることができる。当初 から多数存在する細胞、あるいは高い分画細胞数が必要とされる場合（たとえば ヘモグロビン生産のための赤血球）、本発明によれば増殖した細胞群が少なくと も ５０％の標的細胞、好ましくは少なくとも８０％の標的細胞を有することが可能 である。これらの新しい細胞群においては、標的細胞は少なくともほぼ５００倍 、好ましくはほぼ１０００倍、最も好ましくはほぼ１０，０００倍に増えること ができる。 例をあげると、本発明により富化された細胞群としてほぼ３０％のＣＤ３４＋ 細胞からなる造血細胞群がある。この細胞群は約７．５％のＣＤ３４＋ＣＤ３８ −ＣＤ４５−ＤＲ−Ｒｈｏ１２３（Ｄｕｌｌ）細胞をも有する。これらの細胞群 では正常の末梢血標品の約１５００倍にまでＣＤ３４＋細胞が富化されている。 ７．増殖細胞群の使用 本願発明の方法により作られた増殖標的細胞群は、細胞移植、骨髄置換の如き 臓器或いは細胞系の再生を含む組織再生、特定の細胞移入の如き補足的療法、及 び感染又は疾患の治療或いは防御用手段として有用である。 好ましくは、本願発明の標的細胞は幹細胞、祖細胞或いは前駆細胞である。幹 細胞、祖細胞及び前駆細胞はより分化した細胞を作り出すに容易に利用され、一 方、その逆は真実でない。一実施態様において、標的細胞は造血系、又はリンパ 系或いは骨髄系のみの細胞の如き、完全な細胞系の再生又は置換に使用される。 赤血球標的細胞群は貯蔵或いは保存でき輸血に使用できる。また、赤血球細胞は ヘモグロビンの如き大量の赤血球細胞発現生成物の発生に使用できる。リンパ性 細胞はブルートン無ガンマグロブリン血症（Ｂ細胞欠乏症）、デイジョージシン ドローム（胸腺形成不全症）、ＳＣＩＤ（アデノシンデアミナーゼ欠損症）、ビ スコットーアルドリッチシンドロームの如き血小板減少症、及びその他の免疫不 全疾患の治療に使用できる。 一般に、本願発明にかかる末梢血幹細胞移植療法はボーンマロー移植及び末梢 血移植の如き現在使用されている移植手法に変わることができる。これらの手法 のどちらに関しても、大量のボーンマロー或いは末梢血が必要であり、収集手法 は患者に非常に侵襲性のものであり、幹細胞は精製に広範な処理を必要とするの で非常に品質が劣るものである。 反対に、本願発明の末梢血移植はそのような欠点はない。第一に、少量の末梢 血のみが必要であり、このことは非常に低い侵襲的手法により得られるものであ る。第二に、精製工程を全く必要としない。自家幹細胞の濃縮した群が単一培養 で生ずる。更に、生じた細胞は必要とされる特異的な適合性を有し或いは完全な 造血系を再構成できる。これらの長所の組み合わせは現在入手可能な工学技術を 使用しても不可能なことである。 本願発明に従えば、造血系の標的細胞群は療法として或いはしばしばある種の 疾患の治療として使用できる。簡単にいえば、所望の細胞の試料は患者から得る ことができる。任意に、試料をＧ−ＣＳＦ或いは化学療法剤の如き感作剤を投与 して得る前に患者を感作してもよい。これらの細胞を必要であればいずれかの疾 患細胞を除去するために処理し、そして本願発明の方法に従って培養する。次い で体から全ての疾患細胞を破壊するために例えば高量の化学療法或いは放射線処 理により患者を処理し、その後培養細胞を再導入する。患者から全ての疾患組織 を浄化できるならば、短期間でも疾患細胞系或いは臓器の完全な破壊又は除去が 実施可能な選択である。 特定の細胞タイプ或いは細胞群に集中する感染及び疾患も本願発明により処置 できる。これらの疾患は、赤細胞膜疾患の如き貧血、赤細胞酵素欠損症、ヘマト グロビン合成疾患、同種血球凝集素、胎児赤芽球症、マラリア、赤血球細胞への 機械的或いは化学的外傷、脾機能亢進症、シデロブラスト貧血、慢性感染に関連 する貧血、及び骨髄浸潤による骨髄ろう貧血がある。更に、胞状リンパ腫、バー キットリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病、及びリンパ腫を含む非−ホドキンスリンパ 腫及び急性白血病の如き免疫系の疾患がある。更に、本願発明の方法により処置 可能な疾患としては、新形成種、例えば肺細胞癌、睾丸細胞癌、固形癌、神経芽 細胞腫、神経線維腫、色素細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、胃ガン、大腸癌、 骨癌、側頭鱗細胞癌、腺癌、前立腺癌、及び網膜芽腫、さらに吸収不良シンドロ ーム、ビタミン欠乏症及び肥満症の如き栄養疾患がある。 前記したように、本願発明は非造血細胞系にも同様に適用できる。本願発明に より生じる標的細胞は組織再生、臓器置換或いは補足、細胞移植、或いは疾患及 び感染に対する予防或いは治療として使用できる。例えば、組織再生においては 、特定の組織の未分化細胞の標的細胞群を作ることができる。肝臓、腎臓、神経 、膵臓、皮膚及び骨細胞を大量に容易及び迅速に生じさせる。第一に、ＢＳＦＭ を 細胞群で培養し初期幹細胞群を作る。次いでこれらの初期細胞を特定の因子、例 えば神経成長因子、繊維芽細胞誘導成長因子、ＧＭ−ＣＳＦ或いはエリスロポエ チン、及び所望の組織を発生させる他の試薬で処理する。 本願発明の方法による１実施態様において、皮膚を効果的に及び安全に発生で きそして患者に移植できる。第一に、健常な上皮細胞の少量試料を外科的に患者 から取り除き組織培養に入れる。次に、ＢＳＦＭをこの同じ細胞試料から、別の 上皮試料又は前もって同一の患者から取り出した別の組織試料から、或いは別の 源から得られた細胞培養物から調製する。次いで患者の上皮試料を効果的量のＢ ＳＦＭの存在下で培養する。得られる豊富で増殖した培養物から、大量の上皮前 駆細胞を増殖でき患者に植皮される天然皮膚を発生できる。患者自身の細胞を試 料として使用した場合、拒絶の危険性は非常に低いか或いは全くなく、そして新 しい上皮細胞は非常に急速に発生する。そのような療法を必要とする患者、例え ばやけどした患者、に対しては、生命を脅かす二次的感染の危険性が全く厳格で あるので迅速さが本質的なものである。 別の実施態様において、祖細胞から完全な臓器系を創製できることである。例 えば、膵臓細胞の少量の試料は患者或いは健常で免疫的に適合したドナーから得 られる。ＢＳＦＭ組成物はランゲルハンス島細胞、上皮膵臓細胞、造血細胞或い は他の源からの細胞である少量の膵臓細胞試料を使用して調製される。次いで、 膵臓細胞を幹、祖、前駆或いは分化膵臓細胞において培養物を増殖及び豊富にす る効果的量のＢＳＦＭで処理する。これらの細胞から、膵臓、或いは少なくとも 膵臓の部分（例えば、Ａ，Ｂ，Ｄ及びＰＰ細胞を含有するランゲルハンス細胞） を再創製できそして外科的に患者に再導入できる。これらの細胞は免疫的に拒絶 されず天然細胞として同様な方法で機能しインシュリンを発生するであろう。結 局、本願発明の方法を使用して、ある場合においては、Ｉ型糖尿病（インシュリ ン依存性糖尿病）は治療でき、そして少なくともＩＩ型糖尿病に帰する合併症（ インシュリン抵抗性糖尿病）は軽減できる。この方法は更にインシュリン発生の 制御下で機能する移植装置に組み込むための島細胞群を発生させるために使用で きる。 本願発明の方法により発生する細胞群は更に、腎臓、肝臓、胆嚢、大腸、肺、 選択的筋組織、神経、選択的血管、動脈及び毛細管、腱及び靭帯更に胃腸系の細 胞の如き細胞系補足、再植或いは全体的な再創製に使用できる。本願発明の一面 においては、創製した細胞及び細胞群は、ここで引用例として特に組み込んだ米 国特許５、０３２、５０８での開示の如く当業者に現在入手可能で公知な方法を 利用して臓器全体の再構成に利用することができる。 本願発明にかかる細胞群は更に疾患或いは感染に対する治療剤として使用する ことができる。移植されるべき細胞群は、細胞内で利用され得ない手法を使用し て効果的及び完全に除去できるウイルス及び細菌の如き感染に対して検定及び処 理できる。例えば、感染した細胞を含有する患者の体液或いは組織の少量試料を 感染から追放できＢＳＦＭでの培養により細胞数が拡大される。移植療法におい て疾患細胞を選択的に破壊するための細胞外手法が知られている。手短に言えば 、細胞試料を培養に入れ、そして例えば逆転写酵素阻害剤（例えば３’−アジド −３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ））の如き抗ウイルス剤で処理する。ＢＳＦ Ｍ処置は抗ウイルス剤処理の前、後或いは同時に行える。別法として、細胞をク ローン化し、個々に未感染細胞の選別を検定しそして得られる群を増殖させる。 同時に、患者を高量の化学試薬、薬剤或いは放射線で処理し体中の全ての感染細 胞を除去する。疾患が増殖細胞試料及び患者から除去されれば次に増殖細胞試料 を患者に再注入し、全体的或いは部分的細胞系を再創製させる。 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ Ｖ）の如きウイルスにより発生する感染はこの手法で処理できる。少量の血液試 料を取り除きそのＴ細胞群を本願発明の方法に従って増殖させる。次いで全ての 微量ウイルスを当業界で周知の手法を使用して試料から除去し、そして患者を高 量の抗ウイルス剤（例えば（ＡＺＴ））で処理し全てのウイルス粒子を破壊し、 必要であれば他の試薬でウイルス感染した細胞を破壊する。これらの工程は現在 の移植技術を使用しても不可能なものである、なぜならば移植した細胞が確立し 機能する前に二次的感染が起こり患者を殺すからである。本願発明の方法に従え ば、患者は十分量で多種の細胞を注入でき活性な免疫系を再構成できる。別法と して、ＡＩＤＳ感染患者に、患者の血液試料からウイルスを浄化し本願発明の方 法に従い増殖させた未感染Ｔ細胞のＡＩＤＳ感染患者への新鮮な提供により連続 的に処理できる。この方法はウイルスを除去しないが、患者においてＡＩＤＳ関 連合併症が決して展開せず、兆候もなく、比較的正常な生命に導くことができる 。更に、患者が強靭な肉体状態であれば感染を浄化するより果敢な療法処置を許 容することができる。 別の実施態様において、本願発明の方法により調整した細胞群は疾患或いは感 染に対し予防的に使用できる。例えば、血液試料を患者から取り出し幹/前駆細 胞群を増殖するために処理できる。次いでこれらの細胞を骨髄中で処理し前Ｂ細 胞群の増殖のために選別する。インフルエンザ、ヘルペス、単一ウイルスＩ又は ＩＩ、サイトメガロウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（例えばＨＩＶ）、ポ リオウイルス、ライノウイルス、呼吸器シンシチウムウイルス、Ａ、Ｂ及びＣ型 肝炎ウイルス、風疹ウイルス、及びＪＣウイルスからのウイルス性感染、スタフ ィロコッカス、ストレプトコッカス、マイコバクテリウム、クロストリジウム、 ナイセリア、エンテロバクター、シュードモナス、サルモネラ、トレポネマ、キ ャンデイダ、及びアスペルギラスの如き生物体からの細菌性或いは真菌性感染、 アメーバ症、肺炎菌症、マラリア、トリパノソーマ症、ぜん虫病及びサルコイド ーシスの如き寄生虫感染であるような特定の疾患に対する抗原でこれらの前Ｂ細 胞を処理する。 標的細胞を抗原特異的抗体産生刺激手法により抗原で処理し、標的細胞を同一 或いは異なった患者に再注入する。この患者は決して感染或いは予防接種に曝さ れることなく選択した特定の疾患に抵抗する抗体を有するであろう。同様な手法 で、免疫系のいずれの細胞タイプも処理でき感染或いは疾患に抵抗する細胞質又 は体液を発生させる。別法として、この方法を使用してこれら同様な疾患及び感 染を処理することができる。 本願発明の別の実施態様は遺伝子療法に対する効果的な手段を提供する手法に 関するものである。細胞群を取り除き培養できることが比較的容易であることに 鑑み、当業者は更に患者に再導入する前に遺伝子成分を細胞に導入することがで きる。このことは単一欠失或いは欠損遺伝子成分に帰する多くの欠損疾患を治療 できる。更に、造血幹細胞は体の種々の部分に欠失生産物を拡散するための媒介 物としてそれ自体非常によく役立つものである。本願発明により先産される造血 幹細胞及び他の細胞は更に特定のリコンビナント生産物を患者の体の特定領域に 標的するために使用でき、例えば、抗ガン剤を肝臓の一次癌を有する患者の肝細 胞に標的させることにより、癌抑制遺伝子生産物を網膜芽腫の患者の特定細胞に 標的することにより、或いは抗血小板形成酵素をアテローム性動脈硬化症の患者 の造血細胞に標的することにより達成される。 本願発明の方法による遺伝子療法の他の候補となる疾患の例としては、血友病 Ａ（グルコース６−ホスフェートハイドロゲナーゼ欠損症）、家族性高コレステ ロール血症（例えば、コレステロール７−アルファーヒドロキシラーゼ欠損症） 、グリコーゲン及びリソゾーム性蓄積症（例えば、スフィンゴ脂質症、ムコ脂質 症、ウルマン病、ポンペ病、ゴーシェ病）及びＳＣＩＤ等がある。 遺伝子療法のための手法は当業界で公知である。手短に言えば、細胞試料を患 者から取り出し本願発明の方法に従い培養物中に入れる。この試料は本願発明に 従う方法で処理した培養物中に維持し、幹細胞を含有する細胞群の分画の増殖に 有利である。次いで、これらの細胞を使用して遺伝子成分の導入及び安定な組み 込み技術を行う。遺伝子成分の導入は本願発明の方法による細胞増殖の前、間中 、或いは後に達成させる。増殖中の遺伝子成分の組み込みはある場合には好まし い。これらの技術の例としては、カルシウム介在或いはミクロソーム介在トラン スフェクションの如きトランスフェクション、細胞融合、エレクトロポレーショ ン、ミクロ注入、或いはリコンビナントワクシニアウイルス又はレトロウイルス ベクターを使用する感染がある。これらのベクターはＳＣＩＤ処理用アデノシン デアミナーゼの如き生成物を発現する機能的な遺伝子成分を含んでいる。遺伝子 成分を必要とする細胞を選別し、更に増殖し患者に再導入する。これらの細胞派 体全体に循環しアデノシンデアミナーゼを供給し、或いは必要である他の生成物 を供給する。 このアプローチの他の好ましい態様は糖尿病の処置及び可能であれば治療であ る。インシュリン依存性糖尿病患者からの膵臓組織の試料に生検を実施し組織培 養に入れる。この試料をＢＳＦＭで培養し選択的に幹細胞、祖細胞、前駆細胞或 いは分化した膵臓細胞を増殖する。次いでこれらの細胞をインシュリン発現をコ ードする遺伝子でトランスフェクトする。好ましくは遺伝子を天然インシュリン プロモータである天然インシュリン遺伝子と類似或いは同一の手法で転写及び翻 訳制御されているプロモーターの制御下で行う。次いでこれらのリコンビナント 細胞を糖尿病患者の膵臓に注入し外科的に移植する。リコンビナント細胞は膵臓 に組み込まれ、インシュリンの血流への必要な供給となる膵臓Ｂ細胞の機能が完 成される。この処理は必要であれば繰り返すことができ、しかしながら生検を実 施すれば膵臓細胞は患者から連続的に取り出せないが培養物中に維持或いは後の 使用のために貯蔵（例えば低温保存）できる。このことは現在の入手可能な技術 によっては想像できない著しい有利点である。 本願発明の別の実施態様は細胞質移植による感染の治療のための遺伝子治療に 向けられている。例えば、標的細胞、好ましくは造血細胞は本願発明の方法によ り調製できる。これらの細胞は治療的生産物を発現するリコンビナントＤＮＡ配 列を使用してトランスフェクト或いは感染され、宿主の接種して治療効果を示す 。有用な治療的生産物は抗生物質、化学療法剤を含む抗ガン剤、ペプチド及び細 胞毒性化合物、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイムの如き発現生産物である。特 に有用な生産物は、患者の造血細胞に組み込んだ場合、ある種の癌の処理におい てより高量で結果としてより効果的な用量の化学療法剤の使用を許容する多薬剤 耐性（ＭＤＲ）遺伝子の発現生産物である。本願発明の方法が選択的に所望の細 胞群を増殖できるという事実に鑑み、薬剤及び他の試薬が最小の副作用で最大の 治療的効果を与えるためにある種の組織及び臓器に優先的に標的化することがで きる。更に、これらと同様な手法は遺伝子成分を細胞に導入するために利用でき 、予防的処置として疾患或いは感染に抵抗性を与えることができる。これらの処 置形態は現在の技術によっては不可能である。 別法として、標的細胞は抗原性或いは免疫原性生成物を発現する遺伝子成分と 融和できる。細胞が患者に戻されると免疫応答は感染生物体の如き抗原を発現す るいずれの物質に対して抗原特異性抗体及び細胞の循環の創製を発生させる。事 実、そのようなリコンビナント細胞は感染生物体に対するワクチンを構成するで あろう。 別の実施態様において、種々の特異的細胞列に分化できる本願発明により発生 する幹細胞、祖細胞或いは前駆細胞の多群からなる細胞培養物のバンクを提供す る。この細胞バンクは単一個体を創製でき長時間、例えば低温保存のように貯蔵 できる。手短に言えば、個体の種々の臓器及び細胞系から細胞の試料が得られ、 選別されたＢＳＦＭを使用する本願発明の方法によりＨＬＡ分類され、培養され る。展開する標的細胞群は増殖され、遠心分離により球粒化され、ジメチルスル ホキシド（ＤＭＳＯ）の如き低温保存メヂウム中で懸抱くし、試料に分けられ、 十分凍結される。試料は解凍でき、必要な場合、例えば患者が細胞移植療法を必 要とする場合に培養物中で増殖することができる。別法として、試料は細胞バン クの創製のために凍結でき、必要な場合にのみ後に解凍し本願発明の方法により 増殖させることができる。これらのアプローチは現在の技術を使用しても不可能 なことである、なぜならば大量の未分化細胞は培養物中で維持或いは増殖できな いからである。 同様な方法で、標的細胞群は、自家或いは同種移植療法における使用のための 、例えばヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の完全或いは部分的スペクトラムに表される 幹、祖及び前駆細胞の異なった個体の創製バンクから貯蔵することができる。こ れらの細胞バンクはそれぞれの臓器、組織及び組織系のために維持或いは低温保 存できる。ヒト以外のそのような細胞バンクの確立のための候補となる疾患は畜 牛、羊、ブタ及び馬の如き経済的に高価なほ乳類、犬及び猫の如き飼い慣らされ た動物、種々のサル及び他の霊長類の如き動物園及び野生動物がある。分類され た試料が必要となるまで凍結され次いで本願発明の方法を使用して増殖されるＨ ＬＡ−型血液及び/又は組織試料バンクも確立することが可能である。 別の実施態様において、胎児遺伝子検定を本願発明の方法により実施すること ができる。第一に、末梢血の試料を少量の胎児細胞を含有する妊婦から取り出す 。胎児細胞は本願発明の方法により増殖される。妊産婦細胞からの胎児細胞の分 離は、所望により増殖の前或いは後のどちらかで、ＦＡＣＳ方法或いは類似の方 法により行うことができる。得られる胎児細胞の増殖した群は公知で現在入手可 能な手法、例えば羊水穿刺により容易かつ信頼性のある遺伝的検定を行うことが できる。 以下、本発明の実施例を記載する。これらは本発明の範囲を限定するものでは ない。実施例 実施例１ ＣＤ３４＋細胞の増殖 Ａ． ＢＳＦＭの製造 白血球搬出法によって得られた末梢血細胞をヘパリンの２０単位／mlを含有す る培地ＣＣＭ−２（Verax Corporation）で１：１０に希釈した。等量の希釈血 液 サンプルを２％酢酸と混合しそして単核細胞の総数を血球計数器を使用して推 定した。一般に、１つの白血球搬出ユニットからの単核細胞の総数はおよそ３０ 乃至５０ｘ１０6細胞／mlである。 ＢＳＦＭを誘導するため、末梢血細胞をヘパリン２０単位／mlを含有する無血 清ＣＣＭ−２で約４ｘ１０6単核細胞／mlの最終濃度まで希釈した。Ｔ−１５０ フラスコ内の総量８０mlの細胞懸濁液を調湿した５％ＣＯ2培養器の中で３７℃ の温度で約２時間mezereinの１０ｎｇ／mlを加えて予備培養した。Concanavalin -Aを最終濃度が２０μｇ／mlになるまで添加して３７℃で約４日間培養した。上 澄み液を採集しそして細胞破片を遠心分離により除去した。清澄上澄み液を使用 するまで４℃で保存するかまたは−２０℃で凍結乾燥した。 Ｂ． ＢＦＳＭ添加レベルの最適化 この実施例では実施例１Ａで製造されたＢＳＦＭを使用して末梢血細胞群の増 殖のためのＢＳＦＭの最適ポテンシャルレベルを推定した。未分画およびフィコ ール分画末梢血細胞を使用した。フィコール分画血細胞は白血球搬出ユニットか らの末梢血１０mlをヘパリンの２０単位／mlと１０％全仔ウシ血清を含有するＣ ＣＭ−２培地２０mlで希釈して製造された。この希釈血液サンプルの１５mlを無 菌５０ml培養管内のFicoll-Hypaque１０ml上に装填した。細胞を卓上遠心分離器 内で室温（２５℃）、４００ｘｇで３０分間遠心分離した。水性フィコール中間 相から細胞を採取しそして１０％ウシ胎児血清を含有するＣＣＭ−２培地で２回 洗浄した。この細胞を使用前に無血清ＣＣＭ−２培地または１０％ＦＣＳを含む ＣＣＭ−２培地に再懸濁した。 未分画細胞を上記の１乃至５％ＢＳＦＭ含有ＣＣＭ−２培地中ウシ胎児血清の 存在または不存在下に約２ｘ１０5／mlの最終細胞濃度まで希釈した。２４穴の 培養プレートの１穴あたり１．５mlの細胞懸濁物を入れて５％ＣＯ2培養器内で ３７℃の温度で培養した。５日間にわたり毎日その細胞の個数と生存率を測定し た。表１に示されているように、最高の増殖率は５％ＢＳＦＭを含有するＣＣＭ −２培地で観察された。別の研究でも５％ＢＳＦＭ含有ＣＣＭ−２培地で細胞増 殖率はピークとなることが確認された。５％ＢＳＦＭ含有培地と１０％ＢＳＦＭ 含有培地とでは細胞増殖率に差異はなかった。さらに、無血清培地でも血清含有 培地でも同等によく細胞が増殖することが観察された。５％ＢＳＦＭ含有ＣＣＭ −２培地がフィコール分画ＰＢＭＮＣの増殖を支援する能力は未分画ＰＢＭＮＣ の場合と同等であった。 Ｃ． 末梢血単核細胞の増殖 未分画細胞と分画細胞の両者を２４穴培養プレートで、５％ＢＳＦＭ、組替え ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）１０ng/ml、組替えヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ） １単位／mlを含有するＣＣＭ−２培地により培養することによってＰＢＭＮＣ細 胞の増殖を調べた。各穴に１乃至２ｘ１０5単核細胞／mlの細胞濃度をもつ細胞 懸濁物１．５mlを接種した。５乃至６日培養後に細胞個数と生存率を算定した。 培養の終期に、同じ培養条件で１乃至２ｘ１０5細胞／mlの接種密度でさらに５ 乃至６日間継代培養した。最初の細胞培養から、細胞を２回継代培養した。表２ に示したように細胞個数の増加倍率は２継代１６日間で、未分画細胞培養でも分 画細胞培養でも６００倍を超えた。 Ｄ．増殖中の細胞群の分析 次の３つの方法によって全細胞群の中の増血細胞の組成を分析した： 表現表面マーカーたとえばＣＤ３４を判定するＦＡＣＳ分析； 細胞群中の前駆細胞、特にＢＦＵ−ＥとＣＦＵ−ＧＭの総数を算定するコロニー 形成検定；および 光学顕微鏡による形態学的分析。 ＦＡＣＳ分析のために使用される表面マーカーのリストを表３に示す。多くの 場合、培養中のＣＤ３４＋細胞サブ群の識別のためには三色染色を使用した（表 ４）。たとえば、３種の個別抗体対各々ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲがＣ Ｄ３４＋細胞サブ群を認識する手段として表に記載のいずれかのマーカーを表現 する細胞型判定ために使用された。他の組合わせの例はリンパ球と骨髄系統細胞 への分化を監視するためのＣＤ３４、ＣＤ３３、ＣＤ３の組合わせである。 培養で得られた前駆ＣＦＵ−ＧＭ細胞の総数を決定するため、１ｘ１０5単核 細胞を２０％のＦＣＳ、０．９％のメチルセルロース、１０ng/mlの組替えヒト ＧＭ−ＣＳＦを含有するＣＣＭ−２培地１ml中に懸濁しそして格子付き３５mm組 織培養皿に塗布した。５％ＣＯ2培養器中３７℃の温度で１４日間培養後、形成 されたコロニーを数えて記録した。赤芽祖細胞、ＢＦＵ−Ｅの数を調べるため、 １ｘ１０5単核細胞をＣＦＵ−ＧＭ検定に関して記載したものと同様な、ただし 組替えＧＭ−ＣＳＦを組替えヒトエリトロポエチンの１単位／mlに変更した培地 にまいた。そして、同じく１４日培養後光学顕微鏡で総コロニー形成単位を判定 した。細胞形態を調べるため、cytospin染色技術を使用した。簡単にいうと、細 胞を遠心濃縮しそして細胞塗沫標本がWright's染色で染色される。細胞形態を光 学顕微鏡で分析した。 Ｅ．骨髄および赤芽祖細胞の増殖 ２４穴プレート培養器に、フィコール分画ＰＢＭＮＣを約２ｘ１０5/mlの細胞 密度かつ１．５ml／穴で接種した。５％ＢＳＦＭ、１０ng/mlの組替えヒトＳＣ Ｆおよび組替えヒトエリトロポエチンの１単位／mlを含有するＣＣＭ−２培地の 中で５日間培養した。前記に説明したコロニー形成検定を使用して、培養０日目 と培養５日目のＣＦＵ−ＧＭ細胞とＢＦＵ−Ｅ細胞の総数を計算した。代表的Ｃ ＦＵ−ＧＭコロニーとＢＦＵ−Ｅコロニーを図３と図４にそれぞれ示す。表５に 示したように、培養５日後にはＣＦＵ−ＧＭ祖細胞で３２．３倍の増加そしてＢ ＦＵ−Ｅ祖細胞で２３７．５倍の増加があった。この実施例の場合、培養の全細 胞は培養５日後約５倍まで増大し、ＣＦＵ−ＧＭとＢＦＵ−Ｅ細胞またはそのＣ Ｄ３４＋前駆細胞の優先的増大を示していた。 Ｆ．ＣＤ３４＋細胞の増殖 実施例１Ａに記載のごとく製造された選択されたＢＳＦＭがリンパ系統分化を 好むＣＤ３４＋細胞の増殖を意図して使用された。このために、未分画およびフ ィコール分画ＰＢＭＮＣが前記のごとき２４穴プレート内の、５％ＢＳＦＭ、１ ０ng/mlの組替えヒトＳＣＦおよび組替えヒトエリトロポエチンの１単位／mlを 含有するＣＣＭ−２培地の中で培養された。５日目と１１日目に細胞を継代培養 しそして０日目、５日目、１１日目、１６日目に採集された細胞のＦＡＣＳ分析 によって表面マーカー、ＣＤ３４を判定した。表６に示されているように、ＣＤ ３４＋細胞は細胞群の０．５％以下から７０％以上まで増加した。図５は未分画 細胞についての１日目の培養をそして図６は３日目の培養を示す。図７は分画細 胞についての１日目の培養をそして図８は３日目の培養を示す。 Ｇ．ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３＋細胞のサブ群の分析 ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３＋細胞サブ群を分析するために別の試験において、未 分画および分画細胞を前記のごとく２４穴プレート内の、５％ＢＳＦＭ、１０ng ／mlの組替えヒトＳＣＦおよびエリトロボエチン１単位／mlを含有するＣＣＭ− ２培地の中で５日および６日間それぞれ培養した。ＰＢＭＮＣ増殖の率を表７に まとめて示す。 ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３＋細胞のサブ群の両者を調べるため、次の表面マーカ ーに基づくＦＡＣＳ分析を未分画および分画ＰＢＭＮＣの両者について行った： ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ８。分析 の結果を表８にまとめて示す。未分画細胞培養中の全ＣＤ３４＋細胞は全細胞群 の２８．２％そして分画細胞培養中のそれは３６．５％である。さらに、ＣＤ３ ８、ＤＲ、ＣＤ３表面マーカーに基づいて、培養中によりプリミティブなものか らよりコミットされた祖細胞までの範囲にわたるＣＤ３４＋細胞サブ群の列を得 た。いくつかの代表的ＦＡＣＳ分析を図９と図１０に示す。 実施例２ 修飾ＢＳＦＭの製造 実施例１Ａ記載のプロトコールによって修飾ＢＳＦＭを得た。この修飾ＢＳＦ Ｍの５mlを１mlのマトリックスを含有する抗IL-2親和性カラムに通じた。流通留 分（修飾ＢＳＦＭ）を骨髄系細胞増殖のための培地の製造のために使用した。こ の培地はＣＣＭ−２培地、５％修飾ＢＳＦＭ、１０ng／ml組替えヒトＳＣＦおよ び１単位／mlの組替えヒトエリトロポエチンを含有する。 ２４穴プレートに１穴につき細胞培養１．５mlずつ２ｘ１０5ＰＢＭＮＣ／ml を接種した。細胞を各５乃至６日間２代継代培養した。それぞれ培養５乃至６日 の終わりに、全細胞数と生存率を算定した。ＣＤ３４、ＣＤ３３、ＣＤ１９、Ｃ Ｄ３マーカーの表現に関連した細胞群の組成をＦＡＣＳにより分析した。さらに 、培養から得られた細胞に対してコロニー形成検定を実施した。それらの結果は ＣＤ３４＋細胞の増殖、その細胞の群が主として各種分化度の骨髄系細胞（ＣＤ ３３＋）からなることを示した。 実施例３ リンパ系細胞の増殖 ２４穴プレートで未分画および分画ＰＢＭＮＣを培養してリンパ系細胞の増殖 を調べた。培養条件と培地は共に実施例１に記載したものと同じであった。培養 は２継代、全部で１６日間実施された。０日目、５日目、１１日目および１６日 目にＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞群をＦＡＣＳによって分析した。表９に 示されているように、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞群は増大しそして維持 された。培養１６日後において、未分画細胞培養と分画細胞培養の両方の全細胞 群は６００倍以上に増大していた。 未分画と分画の両者の細胞培養の１６日後のＣＤ３＋細胞をさらにＦＡＣＳで 分析してＣＤ４マーカーとＣＤ８マーカーに関してＣＤ３＋細胞のサブ群を調べ た。分析の結果は表１０にまとめられており、培養中それら細胞群は増大かつ維 持されたことを示している。 実施例４ 赤芽系細胞の増殖 ２４穴プレートに２ｘ１０5細胞／mlの細胞密度の未分画と分画ＰＢＭＮＣを 使用して１穴あたり培養液１．５mlで接種した。培養培地は実施例２に記載のＢ ＳＦＭ、１０ng/mlの組替えヒトＳＣＦおよび１単位／mlの組替えヒトエリトロ ポエチンを含有するＣＣＭ−２培地と５０ミリモルのクエン酸第二鉄から構成さ れた。 細胞は３７℃の温度で培養され、そして各５乃至６日で継代された。５乃至６ 日の培養の終わりにそれぞれ細胞総個数と生存率を測定した。細胞群はＦＡＣＳ と光学顕微鏡による形態観察によって分析された。分析結果は前赤芽細胞、赤芽 細胞および高度に分化した赤芽細胞を含む細胞集団へと導く赤芽系細胞の増大を 示した。 実施例５ 造血系の再構成 増殖により得られたＣＤ３４＋細胞の造血系再構成能力を試験するため、未分 画ならびに分画ＰＢＭＮＣを、実施例１に記載のごとく、５％ＢＳＦＭ、１０ng ／mlの組替えヒトＳＣＦおよび１単位／mlの組替えヒトエリトロポエチンを含有 するＣＣＭ−２培地で５日間培養した。細胞を採集してそして卓上遠心分離器を 使用して室温で２０分間２００ｘｇの力で遠心分離した。未分画細胞培養と分画 細胞培養のそれぞれからの、pH７．４のリン酸塩緩衝食塩水の０．１乃至０．２ ml中の約５ｘ１０6細胞をＳＣＩＤマウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。注射２週 間後、そのＳＣＩＤマウス体内の腎嚢下からの細胞を特異細胞挿入の証拠を調べ るためＦＡＣＳによって分析した。分析結果は培養されたＣＤ３４＋細胞がＳＣ ＩＤマウス内で完全に機能するヒト造血系を移植できることを示した。 実施例６ ＢＳＦＭの製造 リンパ系統分化の方向に向かうＣＤ３４＋の増殖に好ましいＢＳＦＭを誘導す るための実施例１に記載したもの以外のポテンシェーターとインデューサーを例 証するため、４ｘ１０6単核細胞／mlを３００ＩＵ／mlのIFN-βで２時間前処理 した。これらの細胞を、ＰＨＡの１０μｇ／mlを添加後、更に４日間培養した。 ＢＳＦＭのＰＢＭＮＣ増殖能を２４穴プレート培養により実施例１に記載のごと く試験した。試験結果は実施例１で使用されたものとは異なるポテンシェーター ／インデューサーを使用して得られたＢＳＦＭが対応するＣＤ３４＋細胞群を支 援し増大させることを示した。 実施例７ 小島細胞の増殖 ブタのすい（膵）島を単離しそしてしフィコールを使用して密度勾配遠心分離 によって約１５０μの平均直径を有する多数の小島を得た。コラーゲンマトリッ クスの１mlの存在または不存在下で６０ｍｍのペトリ皿に約１０，０００の小島 を塗布する。培養培地はＤＭＥＭ、ウマ血清の２０％、実施例１記載のＢＳＦＭ の５％および視床下部抽出物の１％からなるものである。回転プラットフォーム 上３７℃の温度で細胞を培養する。培養０日目、７日目、１４日目および２１日 目に重複ペトリ皿からコラーゲンマトリックスの存在または不存在下で培養され たそれら小島細胞を採取して全細胞個数と生存率を調べた。さらに、培養培地中 のインスリンとグルカゴンの濃度をＡ細胞とＢ細胞の増殖を実証する手段として 放射線免疫検定法によって測定した。その結果は小島細胞の増殖ならびにインス リンとグルカゴンの産生により示されるＡ細胞とＢ細胞の両者の完全機能性を示 した。 実施例８ 異なるドナーからの細胞を使用した細胞増殖 ６個体のヒトドナーからＰＢＭＮＣを別々に集めそして実施例１Ｂに記載した プトコールを使用して特別にフィコール分画した。ＢＳＦＭを実施例１Ａに記載 したプロトコールによって得た。 各ドナーからの細胞を２４穴プレートの中で、４ｘ１０5および１ｘ１０6の初 期接種密度により１穴について細胞懸濁物１．５mlを使用して培養した。培養は ５％ＣＯ2培養器中３７℃の温度で５乃至７日間実施された。 各ドナーからの細胞を、ＣＣＭ−２基本培地に２％ＢＳＦＭ及び／又は血漿、 及び／又は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および／または選択されたサイトカ イン：１単位／mlの組替えヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ）、１０ｎｇ／mlの組 替えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０ｎｇ／mlの組替えヒトインターロイキン− ３（ＩＬ−３）、１０ｎｇ／mlの組替えヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６） を加えてつくられた培地調合物に懸濁した。使用された培地調合物を表１１に示 す。 各ドナーの細胞について、培養５乃至７日後に細胞数と生存率を測定した。各 培養の初めと終わりに実施例１Ｄに記載した方法によりＣＦＵ−ＧＭ細胞および ＢＦＵ−ＥプラスＣＦＵ−Ｅ細胞の総数を算定した。 ６種のドナー細胞の各培地組成物における平均全細胞増加（および標準偏差） を表１２に示す。 ＣＦＵ−ＧＭ祖細胞の平均増加は表１３にそしてＢＦＵ＋ＣＦＵ−Ｅ祖細胞の 平均増加は表１４にそれぞれ示されている。 表１２、１３、１４において、標準偏差の数値が平均値に比較して大きい場合 には、その標準偏差値は１個体ドナー（複数ドナーの平均値よりも２倍乃至４倍 大きいドナー）のデータによってゆがめられている。 実施例９ 細胞サイズ分布の分析 ＰＢＭＮＣを白血球搬出によって得、そして実施例１Ａに記載したごとくＢＳ ＦＭを製造した。修飾ＢＳＦＭがＢＳＦＭに血漿を添加（２％血漿）することに よって製造された。Ficoll-Hypaque分画された細胞が製造されそしてＣＣＭ−２ 基本培地（ＦＣＳを含まない）プラス１０ｎｇ／mlの組替えヒト幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）と１単位／mlの組替えヒトエリトロポエチンを使用して、実施例１Ｂに記 載のごとく培養された。 ５乃至６日培養の終わりに細胞数と生存率を測定し、ＦＡＣＳによって細胞を 分析して細胞サイズならびにＣＤ３４＋細胞のサブ群を調べた。 代表的ＦＡＣＳ分析前方光散乱（ＦＳ）と側方光散乱（ＳＳ）がＢＳＦＭに血 漿を添加して培養された細胞と添加されないで培養された細胞について図１１と 図１２にそれぞれ示されている。ＢＳＦＭに血漿を添加されなかった場合には、 図１２に見られるように、細胞サイズ分布が２つの明瞭なサブ群の中に存在して いる。下側の細胞のＦＳサブ群はサイズの小さい細胞でありそしてこのサブ群は ＣＤ３４陽性である細胞を優勢的に含んでいる。ＢＳＦＭに血漿が添加された場 合では、小さい細胞サイズのサブ群中の細胞は無視しうるほどでありそしてＣＤ ３４陽性細胞の個数は顕著に減少している。 本発明の他の実施態様または用法は本明細書に開示された発明の説明と常用技 術とを考慮すれば当技術分野に通常の知識を有する者にとっては自明であろう。 したがって、上記の説明と実施例はもっぱら例示のためになされたものであり、 本発明の真の範囲と精神は以下の請求の範囲によって示されるものであることが 理解される。Detailed Description of the Invention                             Selective cell growthReference to related applications   This application is a continuation-in-part of US application 08 / 009,593 filed January 27, 1993.Background of the Invention 1. Field of the invention   The present invention provides methods and compositions for producing and using desired or targeted cell populations. About things. The target cell population includes a hematopoietic system that gives rise to lymphoid cells and bone marrow cells, and Different groups of stem cells of different systems, such as organ systems, tissues, and supporting cell substrates There is a group of progeny. The target cell population of the present invention can be used for cell transplantation, diseases or Reconstruction of deficient or defective cell populations as a therapeutic or preventive agent against infectious diseases In addition, as a means of introducing genetic information into patients, congenital or acquired genetic defects and It is useful as a therapeutic agent for abnormalities. 2. Description of related technology   The hematopoietic system supplies all of the cells of the human blood system that are morphologically and functionally recognizable Have the ability to Fully mature cells of the blood circulation are found in red blood cells, platelets, neutrophils Granulocytes, monocytes, eosinophilic granulocytes, basophilic granulocytes, B-lymphocytes and T-phosphorus Including puffball. A prominent feature of blood cells is that they have a relatively short life span. Therefore one Regeneration of the entire blood pool throughout life must be constant.   Used by the body to continuously generate many distinct blood cell morphologies The current accepted model of physiological system is the hematopoietic stem cell model. In this model, fully mature cells are recognizable by morphology on demand. It replaces the proliferating progenitor cells. Progenitor cells are erythroblasts in the erythroid lineage, promyelocytic lineage For myeloblasts, for platelets and for megakaryocytes for platelets There is a separate system. Progenitor cells are classified into progenitor cells and stem cells Derived from more early cells. This definition refers to a cell lineage in which cells are more differentiated It is based on the functional property that it has the ability to produce. these Cells of, for example, burst forming units-red blood cells (BFU-E) and Burst forming unit-like erythroid progenitor cells called giant nuclear cells (BFU-MK), It is a progenitor cell of one distinct lineage. Other cells are granulocytes and histiocytes (macrophages). Colony forming unit, which is the origin of lineage cells-granulocyte / histiosphere (CFU-GM) Colony-forming units that give rise to both T- and B- lymphocyte lineage cells-lymphocytes (C FU-L) is a multifunctional cell. A systematic map of the hematopoietic system is shown in FIG.   As recently discussed, hematopoiesis is ultimately associated with undifferentiated cells called stem cells. Originated from the pool. The earliest stem cells are defined by two functional features. Be done. It has the ability to self-renew and maintain a stem cell pool, and all single cells. Progeny, a precursor that is directed to differentiate into single and complex hematopoietic lineages geny). Considered the earliest stem cells to be extremely rare available. 10 in bone marrow cellsFourLess than 1 out of 10 and most often 106Rarer than 1 out of Is. Therefore, the entire pool of earliest pluripotent stem cells is often 1-2 x 106Below the cells. This pool of undifferentiated stem cells divides and differentiates It gives rise to differentiated bone marrow stem cells and progenitor cells and progenitor cells. Morphologically with stem cells Indistinguishable progenitor cells differentiate into one or more specific cell lineages and become progenitors. Cells differentiate into specific cell lineages. After all, due to the sequence of proliferation and differentiation , These rare stem cells regenerate the entire hematopoietic system. This process is endless For as long as 10 days per adult adult11Produces more cells To live.   Stem cells and progenitor cells are both important cells of total nucleated cells in bone marrow, spleen, and blood. To make up a small proportion. These cells are in the spleen rather than in the bone marrow It is about 10 times less frequent and even less frequent in blood. Single in blood The majority of nuclear cells (MNCs), so-called white blood cells, consist of more than about 92% of MNCs. With neutrophils (the majority) and lymphocytes. 7.5 x 10 for 1 liter of blood9White blood Sphere and about 240 × 109Contains platelets.   The membrane of hematopoietic cells distinguishes between distinct cell types in terms of morphological and functional phenotype. , Containing different receptor proteins used to identify them. Many of these membranes Receptors have been identified and used as antigens for specific monoclonal antibodies You It was Many of these antigens are only found on cells of one particular lineage. Special In addition, a specific combination of antigens can induce specific cells and cells of specific lineages in cell morphology. And / or has been found useful in identifying in correlation with function. one The first antigen, CD34, is found in both bone marrow and blood Found on cells and stem cells (US Pat. No. 4,714,680). This antigen is at the developmental stage Floor-specific and lineage independent. The antigen is on the bone marrow and blood cells of normal persons. , On the granulocyte-histiocyte-colony forming cells (CFU-GM) On adult cells (BFU-E), on eosinophils-colony forming cells (CFU-Eo), on granulocytes-histiocytes -On megakaryocytes-multifunctional colony forming cells (CFU-GEMM) and on premature lymphoid cells Appears on the cells. In human bone marrow, this antigen contains approximately 1.8% normal bone marrow cells and approximately 0%. Appears on .2% of normal peripheral blood cells. CD34 is lymphoid in normal, mature individuals Does not appear on cells or bone marrow cells. Therefore, the CD34 antigen is used in the early human hematopoietic system. It is useful for identifying progenitor cells and stem cells. Antigens useful for diagnosis and classification of hematopoietic system Below are some tips.   Since the hematopoietic progenitor cell group and stem cell group express the CD34 antigen, The primary antibody was used to select a subgroup of hematopoietic cells for research and therapeutic purposes. C Whereas transplants containing D34 antigen-deficient (CD-) bone marrow cells cannot establish It was found that transplantation of a small amount of CD34 + cells was established. Bone marrow and lymphatic system Generally, using antigen-specific antibodies and other antigens expressed on cells that are directed toward differentiation, 3 Groups of cells that are not only 4+ but also lineage negative (lin-) were included. 34 in bone marrow The + / lin-cell population occupies less than 0.5% of the total mononuclear cell population, and is not Very few. HLA-DR (DR-) without dyeing with the dye Rhodamine 123 (Rho dull) ), CD38 (38-) and CD45 (45-) are not isolated. By selecting a smaller portion of the 34+ cells, the most primitive stem Cells are obtained. These cells mean approximately 0.01% to 0.1% bone marrow mononuclear cells, Perhaps the proportion in peripheral blood seems to be even lower. Morphologically small hypogranular lymph Appears as a sphere. Cells with these attributes generally enter the Go phase of the cell cycle. Yes, in severe combined immunodeficiency (SCID) mouse models and in other animal systems Exhibits the ability to differentiate into cells of myeloid and lymphoid lineages that can be recognized in vitro. .   Several techniques identify cell types in clinical and research laboratories, Used to select a subpopulation of cells. One technology is fluorescence activated cells It is a type (FACS). In this technology, a multicolor flow cytometer has fluorescent light The antibody binds to a specific antigen that can identify hematopoietic cells in the developmental or lineage stage. Used to detect and separate isolated cells (see Figure 1). Briefly, detectable A fluorescent signal is applied to the cells by a laser beam as they pass through the flow sheath. Caused by. The non-fluorescent forward scatter signal is used to indicate volume Scatter signals detect cytoplasmic tissue and particle size. Fluorescent color used to bind antibody The prime color signal detects cell-specific antigens. FACS analysis is generally two or three It is possible to analyze three colors at the same time. Generates contour plots, dot plots, and histograms for statistical analysis, etc. . Some flow cytometers were analyzed with greater than 95% purity There is the ability to physically isolate and gate subgroups of cells from the sample. Most The flow cytometer can analyze small particles as small as 0.5 μm, and about 20 cells per cell. 00 The molecular concentration of cell membrane receptors can be detected. 34+ by such means Detect cell groups and subgroups such as 34 + / DR- / 33- / 19- / 3- / 38- It can be known and analyzed, which results in both long-term colonization and short-term hematopoietic recovery. To identify the most effective cell-rich stem / progenitor cell transplants to secure .   Other techniques also use the physical separation technique of immunoseparation to generate 34+ and 34+ cells. + Used to isolate subgroups. Immunize with antibodies against specific receptor molecules Immobilize cells with specific target receptors by fixing them on an affinity column or culture vessel. Used to combine. In that case, cells that theoretically do not have the target receptor bind It remains untouched. Cells use the physical fluid shear force from the antibody complex Are physically separated by. For affinity columns, wash cells from the column into the separation vessel. On the other hand, in the case of a culture device, unbound cells should first be washed off from the device. Bound cells are physically washed into the separator by fluid shear forces. Such a hand Depending on the step, select specific cell groups such as 34 + / lin- that are particularly desirable for stem cell transplantation. The concentration can be increased. However, the nonspecificity of the cells for the affinity antibody Binding results in contamination of unwanted cell types with populations of cells, increasing the efficiency of cell selection. Will decrease.   Stem cell transplants are used for hematopoietic malignancies, malignant solid tumors of non-hematopoietic origin, immune disorders and A large group of diseases consisting of dysfunction / malfunction of normal blood cells / maturation Used to treat a number of diseases and illnesses. Some of these include severe combined immunodeficiency (SCID), Wiscott-Aldrich syndrome, Fanconyl anemia, congenital Erythrocytic aplasia, lymphosomal storage disease, cartilage hair hypoplasia, severe thalassemia, Aplastic anemia, acute lymphocytic leukemia (ALL), acute myelogenous leukemia (AML) , Chronic myelogenous leukemia (CML), and other hematological melanomas, multiple myeloma, hair Solid tumors such as Riesle leukemia, malignant histiocytosis, myelodysplasia, breast carcinoma, And congenital diseases including neuroblastoma.   Three sources of hematopoietic cells are used for therapeutic stem cell transplantation. Bone marrow, peripheral Blood and cord blood. The most commonly used implants are high dose chemotherapy and / or Or in patients with cancer or defective blood formation who receive ablation radiotherapy. Bone marrow transplant for blood recovery. Peripheral blood transplants are an alternative to bone marrow transplants , It is currently being advanced as a low-cost, low-invasive technology.   Umbilical cord blood is also due to the remodeling of the hematopoietic system in infants with fatal hematopoietic deficiency. It has been used recently and has been successful. Cord blood is usually discarded in newborns Obtained from the umbilical cord and placental blood. Cord blood is an adult per unit number of mononuclear cells It contains about the same number of progenitor cells as bone marrow contains (US Pat. No. 5,0046,811).   There are three types of stem / progenitor cell transplants: syngeneic (monozygotic twin) transplant, allogeneic transplant, And autologous transplantation using the recipient's own cells has been used. Syngeneic transplant rejected anti There is no response and it does not cause graft-versus-host disease (GVHD). Normal human Allogeneic transplants taken from donors with the same leukocyte antigen (HLA) are appropriate donors. It is the most common type of transplant used in about 30-40% of patients with cancer. table Present-matched identical parental or related donors that are HLA-A, -B or -A patient who received a transplant from an inconsistent only D locus had siblings with the same HLA. Has a transplant outcome comparable to the patient who received the transplant from his sister. Transplant more than 2 HL Less success with recipients inconsistent with the A locus. Few patients are unrelated HLA-receives a transplant from the same donor. In North America, HLA aligned siblings Less than 30% of patients can find a relative with one locus inconsistent Only 3% to 5% of patients suffer. As a result, many patients using allogeneic transplants , HLA-Must find unrelated volunteers. Recent Unrelated Donor Transplantation Have found that even single base pair mismatches in DNA coding for the HLA locus Have also been shown to lead to clinical medical complications. Polymerase chain reaction (PCR) test Method is currently being investigated as a means by which a true and appropriate HLA-match can be determined. Has been done. Autologous bone marrow transplantation does not have HLA identical siblings or is appropriate HLA-sometimes used to treat patients who cannot find a matched donor It   Traditional bone marrow transplantation (BMT) is a cure for bone marrow disorders including leukemia and aplastic anemia. As medical treatment, it first developed. At one time, bone marrow is the only tissue where pluripotent stem cells are present. Therefore, bone marrow transplantation may involve radiation therapy and / or high dose chemistries. Necessary to replace these cells if the treatment is lethal to remove the bone marrow. Was considered important. Currently, it is known that these stem cells are also present in peripheral blood. Have been.   Bone marrow is collected by invasive surgical procedures that require general anesthesia. About 1 2 liters of bone marrow is inserted into large bones, usually away from the iliac crest of the pelvis It is removed using a needle with a large hole made. Usually 100 times or more independent It is necessary to suck in. After purification, the bone marrow is frozen and reconstituted for future BMT. Stored for injection.   In the case of bone marrow transplantation for the treatment of malignant tumors, the extraction procedure should remove all tumor cells. Thus, the patient undergoes ablation chemotherapy and / or ablation radiation therapy. The cells are often It is often treated with a cytotoxic agent chosen to specifically kill the tumor cells. This operation In production, the patient's bone marrow cells are fundamentally killed, leaving the patient in a hematopoietic condition. The patient's own bone marrow is then thawed and reinjected. In the case of allogeneic transplant, the donor himself Bone marrow is used and infused. The bone marrow then usually settles within 3-4 weeks and undergoes hematopoiesis. Establish. Prevent recurrent bleeding disorders caused by thrombocytopenia during this period Because of repeated platelet transfusions, patients need intensive and expensive hospital care Becomes In addition, during this period, patients were severely and occasionally fatal due to neutropenia. Susceptible to life-threatening infections.   Significant complications often result from transplant treatment, in addition to side effects, resulting in morbidity and mortality. Leads to a rate. For bone marrow transplants, approximately 200 ml of total bone marrow is injected into the patient's circulatory system. Be done. This large amount of hemoglobinuria, red urine, nausea, high blood pressure, fever, chills, vomiting Causes side effects to the patient, including Chemotherapy is an early complication of bone marrow transplantation And radiation toxicity, graft rejection, GVHD, immunosuppression, infection and interstitial pneumonia Mu. Interstitial pneumonia is also similar to opportunistic infections resulting from immunosuppression after transplantation In addition, it is caused by the toxicity of drugs and radiation. Opportunistic infections with bacteria and fungi also It is a comorbidity. A major concern in autologous transplantation is malignancy with cryopreserved bone marrow. The possibility of tumor cell reintroduction. Density centrifugation, monocoulomb antibodies and drugs Removal of tumor cells from bone marrow prior to injection using different methods, including physical techniques Is being tried.   Morbidity and mortality from GVHD is a major problem. In allogeneic transplant, When the T cells of the gnar recognize the recipient cells as foreign enemies and attack them, G VHD occurs. Transplantation using drugs (methotrexate, cyclosporine A) Subsequent immunosuppressive treatment is administered to suppress or minimize GVHD. Before transplantation Ex vivo removal of cells is sometimes used to prevent GVHD. This 'S approach reduces the risk of GVHD, but it also reduces graft dysfunction and re-leukemia. Associated with increased incidence.   Therapeutic application to separate stem / progenitor cells from extracted bone marrow instead of injecting whole bone marrow Roach was recently developed. In this case, only a very small number of stem / progenitor cells is about 1 Inject into a volume of 0 ml. Use this technique to reduce the amount of cells reinjected to 1 It can be reduced by as much as 00-fold, greatly reducing the morbidity associated with whole bone marrow transplants. Wear.   In peripheral blood transplantation, stem cell separation is used to increase the number of stem / progenitor cells in the transplant. Have been used. Peripheral blood stem cell transplant is less invasive to patients than bone marrow aspiration Yes. Cells are collected from the patient by leukapheresis while the patient is in use It is connected to a centrifuge to separate white blood cells and red blood cells and platelets are continuously affected. Returned to the person. Peripheral blood also has a size of G-CSF or GM-CSF before extraction. Stem / progenitor cells by activating progenitor cells in the patient's blood using tocaine May be increased. By these means, the levels are similar to those found in the bone marrow. It is possible to supply progenitor stem cell levels in fresh peripheral blood. Isolation of progenitor cells / One of the advantages of peripheral blood stem cells prepared with enhancement is the suppressive T in allografts. The ability to sort out cells and reduce GVHD. In addition, all That most or most tumor cells are not believed to be part of the stem / progenitor population There is also the advantage that active selection of progenitor cells improves tumor cell clearance. It   In a medical setting, progenitor / stem cell levels are usually colonies for lineage progenitor cells. Assayed using the formation assay. The most common assay is colony forming unit granules Leukocyte macrophage (CFU-GM) and burst forming unit erythrocyte (B FU-E). Successful colonization using CFU-GM and BFU-E test Determine the number of progenitor stem cells needed to obtain the desired transplant. Reviewing the literature is a successful move. Plants have been shown to correlate with CFU-GM (US Pat. No. 5,0046,811). . The range of CFU-GM per transplant is 2-425 × 10Four/ Kg body weight . Huh The minimum acceptable level is 10 x 10 5 per implant.FourCFU-GM / Kg body Bigger than heavy.   Energetic studies have been conducted on the proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells, CD34 + cells, and It has been successful in many ways. The basic approach in most of these studies Is (a) CD34 + with a purity of> 80% using positive and / or negative absorption. (B) Basal medium enriching cells, eg RPMI-164 containing calf serum Cell culture in stromal layer in modified DMEM of 0 or Iscove and as feeder cells Nourishment, and (c) IL-1, IL-3, IL-6 colony stimulating factors (CSFs), Cytokines including erythropoiesis promoting factor (EPO) and stem cell factor (SCF) The supply of mixture is wrapped.   Many observations have been made on the basis of these studies. First, CD34 + and ancestor There is proliferation of cells. Reported that cell proliferation up to 100 times occurs in 12-14 days Has been done. Variations in cell growth are donor-dependent. Second, the bone marrow in culture Has been shown to differentiate into the lineage of the become. Finally, the percentage of CD34 + cells in the total cell population was about 14-21 of the culture. During the day, it fell sharply to less than 1 percent. These results are The ability of CD34 + cells, which differentiate towards the lineage of the bone marrow, to proliferate under conditions So far it has been shown to be limited.Summary of the invention   The present invention overcomes the problems and shortcomings associated with current strategies and designs and provides the desired and Alternatively, it provides a new method for rapidly producing a target cell group.   Using the method of the present invention, targeting from a very low sample of cells or tissue Many populations of cells can be easily, cheaply and rapidly produced. Target details The cells are maintained in medium or stored for later use, and if necessary , Can be stimulated for further differentiation. The procedure described here is short and easy. It can be applied to many different cell types. Target cells are useful for transplantation therapy And also has many advantages over current procedures. Donor cells can be And is currently needed to enrich the stem / progenitor cell population in the inoculum. It Neither are many of the separation procedures described. In addition, for most special organizations Many stem cells, progenitor cells and progenitor cells can be produced. These cells are transplanted Most useful for medical treatment.   Briefly described herein, the present invention is directed to growth involving an increased fraction of a desired cell population. And a method for producing a cultured cell culture. Regarding the propagated target cell population. Cell cultures are equilibrated selection factors in the target cell fraction. It can be increased by culturing in the presence of the mixture (BSFM). BSFM is the target It provides a balanced stimulatory and inhibitory effect that promotes cell population growth. It Target groups include primitive stem cells, progenitor cells, progenitor cells, and intermediate stages of differentiation. Cells, terminally differentiated cells, or a mixture thereof. These target cells are As a result, it is useful for transplantation treatment.   The present invention also provides a balanced stimulation and stimulation that promotes the growth of desired cell populations. It relates to a BSFM composition comprising a mixture of cellular factors having an inhibitory effect. This composition Is preferably produced by treating the cell population with an inducer containing a mitogen. To be done. Useful mitogens include phytohemagglutin (PHA) or conca Plant lectins such as navarin A (ConA), T cells such as TPA or mezerein Mitogens and T cell monoclonal antibodies such as OKT3 are included. on the other hand , BSFM can be produced from many different starting cell populations, these being BSFM-1, BSFM-2 and the like have specificity for different target cell groups.   In another aspect, the present invention relates to a transplant treatment method. Where the primitive feeding Cells of the same class (eg, from blood, other body fluids or tissues) with BSFM Incubate by the method described above. The resulting expanded target cell population can be used later. Therefore, keep it as it is, store it frozen, or treat it with transplantation, or other Immediately transferred to the patient for use in the treatment or prevention of. Target cells are transplanted Can be used to treat or create new organ systems or new organs. To replace existing, diseased or damaged organs, tissues and cell lines Can be used to On the other hand, the target cells are hemoglobin from red blood cells. Can be used to produce useful cell products such as   Further, in another aspect, the present invention provides a gene therapy method. Target details Cells are produced by the method of the present invention and the gene sequence is directly transferred or Infect a recombinant viral vector containing the child sequence. Adjust and arrange appropriately Expressed cells are selected, separated and cultured in vitro. Then these Transfer the recombinant cells to the patient. Genes useful in gene therapy are expressed in patients Genes lacking or defective products, and expression Included are genes and other gene sequences that have a beneficial effect.   Further, one aspect of the present invention provides a method for transplant treatment or prevention. Is. There, patients are treated with BSFM in vivo to select specific target groups of the body. Propagate selectively. Are ill, may be, or have been damaged In order to create or repair an organ or cell line that may or may be affected, BS FM therapy can be adopted in vivo. This form of treatment is relatively non-invasive However, it is currently unavailable for such a wide range of cells.Brief description of the drawings Fig. 1 Diagram showing specific hematopoietic linkage and developmental antigens Figure 2 Diagram showing the method used to produce diverse populations of target cells in BSFM. Figure 3 Representative microscope showing colony forming units of BSFM treated PBMNC cultures.       Microscopic picture Figure 4 Representative microscope showing burst forming units of BSFM-treated PBMNC cultures.       Microscopic picture Figure 5 Representative photomicrograph (10x) of unfractionated cells one day after BSFM treatment. Figure 6 Representative micrograph (10x) of unfractionated cells 3 days after BSFM treatment. Figure 7 Representative photomicrographs of fractionated cells 1 day after BSFM treatment (10x). Figure 8 Representative micrograph of fractionated cells after 3 days of BSFM treatment (10x). Figure 9 CD34 + from unfractionated PBMNC cultures after 6 days of incubation.       Representative FACS analysis of CD38DR Figure 10. CD3 + C from unfractionated PBMNC cultures after 5 days of incubation.       Representative FACS analysis of D33CD34Description of the invention   Current techniques for stem cell transplants are sufficient to replenish a patient's exhausted or defective cell lines. Invasive and expensive methods are required to provide sufficient amounts of stem / progenitor cells to construct. I need it. By using the method of the present invention, a large amount can be obtained in a very short time and at low cost. A number of cells can be created. This is a complete cell line that is exhausted or lacking Multiple reconfigurations or multiple cycles if one is not enough Allows the flexibility of having enough cells to allow specific treatment. or, Current technology usually requires purification of cells from a very large pool of biological fluid . The method of the invention is used to produce large numbers of cells from very small samples of biological fluids. Rukoto can. It uses an inefficient separation technique to enrich target cells Saving the cost and time of doing so, one of the many samples used to create the pool Eliminates the risk that stem cells rarely gather from there because there is contamination on the one hand And, more importantly, those skilled in the art to obtain the desired production at the highest level. Provides a solid source of change. 1. Target cell selection   The method of the present invention is broadly applicable to the selective expansion of highly diverse cell types. Therefore, the first step in this method is the desired target cell or mixture of target cells. Composed of a selection of things. In practicing the methods described herein, one or more cell types Preferentially expanded to enrich the fraction of target cells in the expanded cell population Can be Thus, it is present at very low levels in normal cell samples One cell type preferentially increases its fraction in the expanded population. Can be propagated. During this selective growth and enrichment, non-target cells in the population Can be left to die and are either non-propagated or propagated cultures. Fall in number and / or rate in the nutrient. Important clinical advantages of the method of the invention One of the points is that cell populations with a high proportion of selected target cells can be Requires no purification steps or the addition of separate and expensive cytokines Can be manufactured in many cases of. In some cases, A higher percentage of target cells than the physiological sample, or a specific target cell ratio The desired proliferating cell population, which has been modified to be suitable, may contain many cell types. It Hematopoietic reconstitution, for example, is the goal, and essentially stems to provide long-term colonization. Cells that are rich in cells and progenitors also give short-term positive effects May contain specially prepared fractions of progenitor cells and ultimately differentiated cells. Yes.   Substrates containing a substantial fraction of cell types not present in the starting cell population using the method of the invention. It is also possible to produce cell populations. This is along their known path of differentiation By providing conditions that favor cell differentiation or dedifferentiation. You can   The target cell can be selected from any mammalian cell and is preferably primary It can be selected from mammalian cells in culture, more preferably human cells in primary culture. Wear. The target cell population or the mammalian cell population from which it is selected can be any cell lineage, organ , Or an organ system containing stem, progenitor and progenitor cells of that system. Then that Examples of tissues and organs from which such a cell group can be selected are hematopoietic cells, hepatocytes, pancreatic cells, Kidney cells, brain cells, nerve cells, heart cells, lymph gland cells, thymocytes, spleen cells, Bone marrow cells, bone cells, chondrocytes, muscle cells, endothelial cells, epithelial cells and the like. Preferred The target cells are hematopoietic cells. The purpose of the expanded cell population is tissue repair or Is a mixture of cells normally found in such tissues, if regenerating Can be a target cell mixture, or can be prepared separately and used in vivo or in vivo. Nbitro may be tailored to achieve such objectives. Preferred approach In H., the target cell population is the stem / cell during the preparation of the expanded cell population or during its use. Stem cells and / or progenitor cells that can supply cells that differentiate along the pathway of the progenitor cell lineage Including.   In the hematopoietic system, the required target cells are progenitor cells, progenitor cells, and intermediate stages of differentiation. Cells and finally differentiated cells or a mixture thereof Types of pluripotent stem cells can be included. These cells are CFU-G (granular cells). Cells), CFU-GM (granular cells / macrophages), CFU-GEMM (granular cells) Cells / red blood cells / macrophages / monocytes), CFU-E (red blood cells), CFU-MK ( Mononuclear cells), CFU-M (macrophages), CFU-Eo (eosinophils), CFU -Ba (basophil leukocytes), BFU-E (red blood cells), and BFU-MK (giant Bone marrow progenitor cells such as macronuclear cells, and CFU-L (lymphocytes), CFU-B ( B cells) and lymphoid progenitor cells such as CFU-T (T cells). Also useful The target cell group consists of T lymphocytes, B lymphocytes and precursors that differentiate into them. Is. Megakaryocytes (platelets), red blood cells, granule cells, macrophages, monocytes, Basic leukocytes, eosinophils and progenitor cells that differentiate into them can also be used alone or in others. As a mixture with the target cells of.   Of particular interest from the point of view of use in hematopoietic regeneration is the expression as the CD34 antigen. It is a cell. CD34 + cells are primary CD34 + lymphocytes and CD34 + A more primitive version identified as CD38-CD45-DR-RHO123 (Dll) Cells can be included. There is also interest in treating immunodeficiency and diseases. Is CD3, CD4 (helper T cells) and CD8 (suppressor T cells) It is a cell expressing such a T cell antigen. Red blood cells are also cells in transplantation therapy A desirable target for use both as a group and in the production of hemoglobin Is a cell.   Those of skill in the art will understand which target cells and target cell mixtures for the applications described herein and It will be appreciated that it will be useful for other applications, especially with the prepared cell populations.   The cells and cell populations produced by the methods of the invention are morphologically, antibodyically and Functionally analyzed. First of all, the selectively expanded cell populations are large and Features such as absent or absent, and the overall appearance are examined microscopically. Fineness Cells and other relatively undifferentiated cells have small, well-defined membranes, but Redifferentiated cells are generally much larger. Second, stem cells are antigen-specific monochromatic Features detectable by assays such as ELISA and RIA using internal antibodies Specific antigens are expressed and can be separated by FACS technology. These antigens -The results from the binding assay provide a developmental map of the cell lineage. Finally, the cells Ability to colonize them and / or perform other biological functions in vitro. Functionally analyzed by force. 2. Selection of first cell group   In a preferred embodiment of the present invention, desired growth and enrichment of target cells are preferentially performed. Conveniently composed of a mixture of cellular factors with specific stimulating and inhibitory effects. The first population of cells is selected and induced to produce a BSFM. The first of these The cell population is human or non-human blood, bone marrow, body tissue, preferably mammalian tissue, Alternatively, it consists of primary cultures of established cell lines. This first cell group requires Can be of the same cell type as the target cell being And is of a completely different type from the target cell type or the target cell type It can include cells that differentiate into cells. In one aspect of the invention, The first cell population can be the cell population that is ultimately expanded as described below. It   However, it is wise to use the same type of isolated cell population that is ultimately expanded. Generally preferred. Thus, for hematopoietic cell populations, blood-based cell tests Fees can be conveniently used. Often the first cell population is It is preferably composed of a part or subgroup of the cell group to be proliferated. However , Non-hematopoietic tissue cells, the first group of hematopoietic cells to selectively increase target cells in the tissue Can be propagated by inducing to produce fertile BSFM It is expected that   As for the hematopoietic system, specific target-useful in favorably producing a specific BSFM The first cell population is selected from peripheral blood cells, cord blood cells and bone marrow cells. Many subs The selection of peripheral blood cell populations is preferred because of their bedside advantages. First, the peripheral blood It is easy to obtain by a relatively non-invasive means (pointing with a needle). Staying in a hospital required Unsolicited, the risk of infection is very small, and the procedure is common for most insurance It can be done by a vendor. Secondly, peripheral blood samples are mostly concerned with individual health You don't have to. Because the patient's blood loss has little systemic effect Because there is nothing. Third, peripheral blood is already a raw material for many medical assays. Is used for. Standard procedures and supplies are now on time for any healthcare facility Can be   Peripheral blood that is useful as a starting first cell population includes peripheral whole blood (eg, collected As-removed blood sample) and peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) Can be included. Sources of PBMNC include products of known collection and separation techniques. Can be For example, the white blood cell layer from the crude centrifuge may have a specific weight such as FICOLL. Also used as a finer isolate from force-based systems. As the first cell group Using highly purified PBMNCs or affinity-based separation techniques With that particular subgroup having a more specific cell type (eg, T-lymphocytes) It is possible. Contains useful accessory cells, as described below PB that has undergone minimal separation procedures because it is less damaged than highly treated cells It is often useful to use MNCs. First group of cells after collection and separation Can be used immediately. Or store in a refrigerator or frozen for later use. Can be 3. Induction of the first cell population   An important aspect of the present invention is the proliferation and enrichment of target cells in a population of cells in the presence of BSFM. It is possible to make it selective. The manufacture of this BSFM is preferably By inducing the first population of cells described above to create this mixture of target-specific factors. Will be achieved. Thus, the induction process is controlled to produce the required BSTM. It must be. In the induction step, the second cell group described below is the same as the first cell group. As part of the target cell expansion process, or in an independent process. It can be done in one cell population. In a preferred embodiment, the first cell population is Induced by the added inducing reagent and produced by the cells during culture It may be further induced by factors, eg in a cascade.   In a preferred embodiment, the target cell-specific BSFM properties are physical and chemical. And is influenced by the combination of biological parameters. Especially important One such parameter is the added induction reagent, as described below. Is the nature of. Other parameters that are variable to change target cells are: As mentioned, this is the property of the first cell group. Applicants, for example, in hematopoietic cells, white blood Relatively untreated, coarsely separated, such as that obtained from the ball export method PBMNC targeted BSFM targeting stem / progenitor cells such as CD34 + cells I discovered that it would be manufactured. Can influence the BSFM induction process Other factors include culture conditions such as media, temperature, time, pH, etc.   In one preferred embodiment, the inducing step supports the growth of leukocytes to which an inducer is added. It is carried out by culturing the selected first cell group in the culture medium it holds. Blood medium Bacteria should not be present and do not require stromal cells. The preferred medium type is New Manufactured by Verax Corporation of Lebanon, Hampshire. DMEM modified ISCOVES, RPMI 1640, and CCM-2.   The added inducer reagents useful by the generally preferred embodiment are those of the first cell population. It consists of a material that has a mitogenic effect on the cell type. Mitogens of various cell types The effects of such mitogens on various factors known to Observed for cells. T cell mitogens are often used in this process. Be done.   Induction or promotion of BSFM induction from hematopoietic cells in the mitogen class Useful to do so are plant lectins, T cell mitogens, and monoclonals. Antibody. Specific plant lectins with the required mitogenic activity are: Including those derived from:     Lectin source Phaseolus vulgaris (PHAN phytohemagglutinin) Dolichos biflorus Solanum tuberosum Sophora japonica Haclura pomifera Pisum sativum Ulex europeus (UEA-I, U. europeus agglutinin I) Ulex europeus (UEA-II, U. europeus agglutinin II) Arachis hypogaea Glycine max Canavalia ensiformis (Con A, Concanavalin A) Triticum culgaris (WGA, wheat malt agglutinin) ricinus communis (RCA-I, R. communis agglutinin I) Lycopersicon esculentum Phytolacca americana (PWM, pokeweed mitogen) Listeria monocytogenes (LPS, ribopolysaccharide)   Particularly useful groups of plant-derived mitogens include PHA, ConA, mezerein (M ZN) and TPA (and related diterpene esters). TPA and so Some of the related compounds of Phorbol 12-myristate-13-acetate (TPA) Phorbol (4-0-methyl) 12-myristate-13-acetate Phorbol (20-oxo-20-deoxy) 12-myristate-13-acetate Phorbol 12-monomyristate Phorbol 12,13-didecanoate Phorbol 12,13-dibutyrate Phorbol 12,13-dibenzoate Phorbol 12,13-diacetate   Staphylococcal enterotoxin A (SEA), Streptococcal protein A, galacto Mitogens of non-plant origin such as soxidase and T cell antibodies such as OKT3 Is also useful. Stem cell growth factor (SCPF), stem cell factor (SCF) Growth factors and bone morphogenetic proteins (BMPs) as well as interferons -Alpha (IFNα) and IFNβ are also inducing agents in some situations Can be used.   In the preferred induction step, the first population of cells selected as described above will not actually be induced. It is cultured in the presence of an enhancement (, i.e. drug efficacy increase) reagent prior to the induction step. Increase induction Reagents useful for strengthening are TPA (or related phorbol ester) MZN , IFNα and IFNβ. This step is then followed by the induction described above into the culture. The addition of substances follows. The most preferred combination is the use of IFNα and IFNβ, and MZN as enhancer and PHA, ConA or OKT3 as inducer including.   BSFM is preferably separated as a supernatant from the treated cells and is therefore listed above. The choice of inducer and / or enhancer from reagents or their known equivalents is not It is done without regard to their cytotoxic or tumorigenic properties. This work To the extent that BSFM is contaminated with any harmful residual mitogens or their by-products. It can be done in a way that ensures that it is not dyed. INF If an inducing or enhancing reagent, such as Separation of BSFM from cell product / debris may not be necessary.   The amount of induction reagent used and the length of treatment depend on each particular cell culture treated. May be empirically determined by. The preferred amount of induction reagent used is about 5 μg / ml medium to about 100 μg / ml medium. More preferably, the described extension For the cell induction step, an induction test should be performed when processing the first cell population of whole blood or fractionated blood. The drug is about 5 μg / ml to 50 μg / ml, most preferably about 20 μg / ml to It can be added in an amount of 50 μg / ml. When using efficacy enhancers / enhancing agents In the medium, about 5 ng / ml to 500 ng / ml, preferably 5 ng / ml 1 to 50 ng / ml, and most preferably 10 ng / ml to 20 ng / m It can be added to the medium at a level of l. Treatment time is from hours to days, preferably about It can be 1 to 10 days, most preferably 2 to 5 days. Or processing For more than one process over a longer period of time Can be accompanied by   Those skilled in the art have included here to correlate changes in initial conditions associated with target cell effects. The required induction conditions, reagents and starting cell populations based on the teachings given and simple experiments. You can choose. The present invention balances both positive and negative effects. Of the desired number of target cell populations using a mixed inducer mixture (BSFM) Based at least in part on the finding that it allows controlled selective growth of . .   Although the induction process has been described in the preferred in vitro format, in some circumstances this The steps of can be performed in vivo. Thus, the cell population (whether it is circulating Static) can be treated with induction reagents that are otherwise non-toxic to the patient. In combination, BSFM can be generated in vivo and further ex vivo. Target cell populations collected or selected from a patient for use in vivo, eg For example, it may be retained in the patient for growth at the site of tissue repair or regeneration. Induction reagents utilized in vivo may be injected or infused into the patient and given orally. Or placed directly on the cells to be treated, for example with a transdermal patch Good. And can be involved in single or multiple treatments. 4. Balanced selective factor mixture   The present invention operates in a manner unique to the second cell group, each of which has a desired target. It provides a group of BSFMs that cause cell proliferation and enrichment. All BSFMs A balance of stimulatory and inhibitory effects that selectively favors the growth of selected target cells It is characterized by being a mixture of taken cellular factors. Traditional methods are generally narrow A range of cell lines and their corresponding specific growth (stimulating) factors are used to Emphasis was placed on examining the effectiveness of these or combinations of them. Departure Ming's methodology is a complex balance of positive and negative factors and nature It is based on using a feedback loop similar to. As a result this The method is both powerful and simple.   Explaining Without Limitation, Selectively Proliferates CD34 + Cells in PBMNC According to a preferred embodiment, the BSFM to be used is one in which the leukocyte export fraction of peripheral blood is mixed with MZN and c It is obtained by inducing with onA. This BSFM has been partially characterized so far It has been clarified and is known to contain the following known cellular factors.       Cytokine producing cells         IL-1 macrophage         IL-2 T-lymphocyte         IL-3 T-lymphocyte         IL-4 T-lymphocyte         IL-5 T-lymphocyte         IL-6 T-lymphocyte, macrophage                                               , Lymphoid cells, monocytes         IL-8 monocytes         CSF (GM-CSF, G-CSF) T-lymphocytes, B-lymphocytes,                                               Macrophage, monocyte         INF-γ T-lymphocytes         TNF (TNF-α, TNF-β) T-lymphocyte, macrophage                                               , Neutrophils   Concentrations have also been determined for some of these cytokines. For example, The concentrations of IFN-γ and IL-2 are about 10,000-20,000 IU / m, respectively. 1 and about 2000-5000 IU / ml. Other sites listed here The concentration of kine is also determined by a commercially available assay kit and / or method such as ELIZA assay. Can be easily determined. EPO and S as other cytokines CPF, SCF, all growth factors, BMP and the like.   Given the disclosure of the present invention, one of ordinary skill in the art would be fully aware of the factors involved in this BSFM. And the most known known activator (stimulatory and stimulatory) to expand the desired CD-34 + cells. Both the nature and amount of inhibition) can be determined. Therefore, such optimization And limited synthesis of BSFM is within the scope of the present invention. Further, the present invention provides a target Isolates new cytokines that are useful or important for cell growth and maintenance of target cell lines It provides a method of identification. For example, using the immunoaffinity method And remove all known cytokines, then increase the number of target cells for the remaining components. Biologically tested for ability to aid in breeding and / or differentiation. Furthermore, the composition Was reconstituted from known components, which had the same results as the derived BSFM. You can test whether or not it is light. If you don't get the same results, You can decide what you are missing.   Isolated "unknown" components can also be analyzed and purified by conventional techniques, The amino acid sequences of the sex components are determined and the genes of those components are analyzed by conventional recombination techniques. Can be isolated and sequenced. Therefore these proteins are produced recombinantly be able to.   Another aspect of the invention is the addition or removal of positive or negative factors. A second B that modifies one or more BSFMs and is suitable for selective growth of another target cell May create an SFM. Another or further target cells are grown and enriched (ratio There are several approaches to getting a BSFM that can be increased. First B One or more factors in the SFM preparation, preferably affinity chromatography It is to remove it with a graphic. Af having antibodies against specific cytokines Infinity Matrix is commercially available. For example, Affini that removes IL-2 BSFM that has passed through T-column no longer proliferates and enriches lymphoid lineage cell types. I can't let you. Macrophages by adsorbing on plastic surface , The rest of the cell populations contained no or almost no IL-1 or CSF in the BSFM. It will not be produced anymore. Furthermore, without isolating the known factor in BSFM, Selective inactivation using monoclonal or polyclonal antibodies it can. By using a positive and / or negative approach, B Modified versions of SFM can be made to grow desired target cells (Figure 2). Alternatively, post-induction recovery based on the kinetics of cytokine induction It is also possible to obtain a BSFM having a different composition by changing the heating time. For example, IL-2 Is induced before IFN-γ. The BSFM sample collected in 96 hours was 48:00 The concentration of IFN-γ is higher than that recovered in between. On the other hand, what is the IL-2 concentration? The same applies to the BSFM standard. 5. Target cell proliferation   The next step of the method of the invention is the second step in the presence of BSFM which selects for the desired target cells. Is to selectively grow target cells of the cell group of. As already mentioned, The second cell group may be of the same cell type as the first cell group or a different cell type. In many cases , Divide the original cell group into two groups with the same cell group composition for BSFM production and use To use. In some cases, the first and second cell populations are the same, that is, they contain the same cells. Induction, and then propagated (with or without separation step).   What the desired target cells are will determine the desired selection of the second group of cells. The target cell must be of a cell type in or derived from this group of cells I have to. Generally the same cell types as those listed above for the first group of cells Can be used for the second cell population.   Selective growth of target cells can also be achieved by changing the nature and amount of BSFM and culture conditions. It can be controlled by changing. The criteria for choosing BSFM is above Discussed in. The culturing process is a suitable group to which limited cytokines can be added. It is preferably carried out in the foundation medium. Culture conditions for individual cell types can vary. However, standard tissue culture conditions form the basis of the culture process. Generally, cells are 5% C O2Incubate in medium at 37 ° C in an incubator. Depending on cell type Specific chemicals, proteins, media components such as insulin and plasma, growth factors, Ko Ronnie stimulating factor (CSF) is required for cell maintenance. These requirements are industry Known or can be determined by one of ordinary skill in the art. Explain without limitation And BSFM, which is advantageous for the growth of CD34 + cells, is a serum-free medium such as CCM-2. Can be cultured in   BSFM adds sufficient amount to the medium to achieve the desired target cell growth / enrichment. Get The amount to be added depends on the nature of BSFM, the composition of the second cell group and the culture conditions. In practice, the loading is about 1% to 10%, preferably 2% to 5%.   The length of the culture process can be varied to promote selective growth of target cells. It The cell population is in a different differentiation pathway or is induced to enter that pathway When cells are included, the final increase in target cell percentage will terminate the culture It depends on you. Usually, for example, CD34 depends on the degree of enrichment desired. Cell populations enriched in + cells are best cultured for 5 to 20 days, preferably about 5 10 days from now.   Once the desired proliferation target cell population is obtained, the cells may be used immediately, Can be refrigerated or frozen for future use. In another aspect, the target cell The cell population can be modified to be enriched for second target cells. For example CD34 + / The lymphoid cell mixture is allowed to differentiate into the lymphoid lineage of T cell progenitor cells. Incubate with T lymphocytes by incubating with factors known to promote It can be transformed into a rich cell population. Also, cultivate the target cells for a long time, or Is a factor that brings the target cells into the culture medium to the desired cell population and / or to the desired differentiation stage. The medium of the cells can be changed, such as supplementing the offspring. As an example of such factors IL-2, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage stimulating factor Offspring (M-SCF), erythropoietin (EPO), interferon (IFN) , Retinoic acid, SCPF, SCF and BMP, nerve cell growth factor (NGF), above Skin cell growth factor (EGF), fibroblast-derived growth factor (FGF), platelet-derived growth There are all growth factors such as long factor (PDGF). In this process, culture cells are cultivated. The ground may or may not include BSFM.   Besides obtaining target cells for various clinical applications, another advantage of the present invention Is that tumor cells are naturally eliminated during cell growth. Chronic myelogenous leukemia For some of them, the number of cells was reported to decrease rapidly during long-term culture. ing. Removal of proliferating tumor cells in accordance with the present invention may be performed, for example, with IFN-γ, TNF , Antiproliferative and / or cytotoxic to tumor cells such as activated macrophages It is promoted by the presence of the cytokines and cells that it has.   As with the induction step, the expansion step can be performed in vivo or in vitro. it can. In vivo application guides BSFM into the bloodstream due to circulating cell populations. Including or introducing into specific tissue cells. Alternatively, the cells System, tissue with or with BSFM and then returned to body , Repair, reconstruction and regeneration of organs.   According to another aspect, the present invention provides a "natural" control of an in vivo organism. It aims to establish homeostasis of cell culture by imitating. Home The definition of ostasis is here defined as cells / cells, and cells / cells under specific culture conditions. Limited to the dynamic equilibrium established as a result of factor correlation. Homeostasis is balanced Achieved by supplying a culture consisting of various cell types with a mixture of selected factors. It When a balanced mixture of factors is added externally, additional factors are cultured de novo. You will be guided inside. For example, IFN-γ and / or TNF-α was added to the culture. Then, CSF is produced from monocytes and macrophages. Specific cells / cells, As a result of the cell / signal interaction, the number and / or fraction of the target cell type cell population increases. An environment is created in which stimuli and inhibitions that are favorable for sexualization are balanced. This dynamic equilibrium It can change as the cell population changes as a result of the growth and enrichment of the target cell type. Therefore A balanced environment of initial stimulation and inhibition is needed to maintain continuous growth of target cells. Can be changed. 6. Proliferating cell group   The expanded cell population of the present invention finally has a larger number of target cells than the original cell population. (Proliferation), high percentage of target cells (enrichment). For example, as in stem cells, The number of target cells is approximately 5% or more by proliferating and enriching the cells whose number and ratio are low. %, Preferably about 20%, most preferably about 50% or more. Initially When there are a large number of cells, or when a high fractional cell number is required (for example, Erythrocytes for the production of hemoglobin), according to the invention, a reduced number of proliferated cells Also It is possible to have 50% target cells, preferably at least 80% target cells Is. In these new cell populations, the target cells are at least about 500 times Preferably about 1000 times, most preferably about 10,000 times Can be.   By way of example, almost 30% of the cells enriched by the present invention are CD34 +. There is a hematopoietic cell group composed of cells. This cell population is approximately 7.5% of CD34 + CD38 -Has also CD45-DR-Rho123 (Dull) cells. These cell groups Shows that CD34 + cells are enriched up to about 1500 times that of a normal peripheral blood preparation. 7. Use of proliferating cells   The proliferative target cell group produced by the method of the present invention can be used for cell transplantation, bone marrow replacement, etc. Tissue regeneration, including regeneration of organs or cell lines, complementary therapies such as specific cell transfer, and It is also useful as a means for treating or preventing infections or diseases.   Preferably, the target cells of the present invention are stem cells, progenitor cells or progenitor cells. stem Cells, progenitor cells and progenitor cells are readily available to produce more differentiated cells, On the other hand, the opposite is not true. In one embodiment, the target cells are hematopoietic, or lymphoid. Used to regenerate or replace whole cell lines, such as cells of lineage or myeloid only. The erythrocyte target cell population can be stored or preserved and used for blood transfusion. Also, red blood cells It can be used to generate large amounts of red blood cell expressed products such as hemoglobin. Lymphatic The cells are Bruton's agammaglobulinemia (B-cell deficiency), DeGeorgin Drome (thymic hypoplasia), SCID (adenosine deaminase deficiency), bi Thrombocytopenia, such as Scott-Aldrich syndrome, and other immune disorders It can be used to treat all diseases.   Generally, the peripheral blood stem cell transplantation therapy according to the present invention includes bone marrow transplantation and peripheral It can replace the currently used transplantation techniques such as blood transplantation. These techniques In both cases, a large amount of bone marrow or peripheral blood is required, and the collection method Is highly invasive to patients and stem cells require extensive processing for purification. And the quality is very poor.   On the contrary, the peripheral blood transplant of the present invention does not have such a defect. First, a small amount of peripheral Only blood is needed, which is a very low invasive technique. It Secondly, no purification step is required. Monoculture of enriched group of autologous stem cells Occurs in. In addition, the resulting cells have the required specific compatibility or complete integrity. The hematopoietic system can be reconstructed. The combination of these strengths makes the currently available engineering technologies It is impossible to use.   In accordance with the present invention, target cells of the hematopoietic system may be used as a therapy or often in certain types. Can be used as a treatment for disease. Briefly, a sample of desired cells is obtained from the patient be able to. Optionally, the sample is administered with a sensitizing agent such as G-CSF or a chemotherapeutic agent The patient may be sensitized before being obtained. If these cells are needed, either Treated to remove diseased cells and cultured according to the methods of the invention. Next In order to destroy all diseased cells from the body, for example, high doses of chemotherapy or radiation By reason, the patient is treated and then the cultured cells are reintroduced. Patient to all diseased tissue If it can be purified, complete destruction or removal of diseased cell lines or organs can be achieved in a short period of time. This is a viable option.   Infections and diseases focused on specific cell types or groups of cells are also treated by the present invention. it can. These diseases include anemia such as red cell membrane disease, red cell enzyme deficiency, and hematosis. To globin synthesis disease, allogeneic hemagglutinin, fetal erythroblastosis, malaria, red blood cells Associated with mechanical or chemical trauma, hypersplenism, sideroblast anemia, chronic infection Anemia of bone marrow and bone marrow fistula anemia due to bone marrow infiltration. In addition, hydatidiform lymphoma, bar Non-Hodkins lymphoma including kit lymphoma, adult T-cell leukemia, and lymphoma There are diseases of the immune system such as tumors and acute leukemia. Further, the method of the present invention Possible diseases include neoplasias such as lung cell carcinoma, testicular cell carcinoma, solid tumors, neuroblastoma. Cell tumor, neurofibroma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, liver cancer, gastric cancer, colon cancer, Bone cancer, temporal cell carcinoma, adenocarcinoma, prostate cancer, and retinoblastoma, as well as malabsorption syndrome There are nutritional disorders such as worms, vitamin deficiency and obesity.   As mentioned above, the present invention is applicable to non-hematopoietic cell lines as well. In the present invention The resulting target cells are tissue regeneration, organ replacement or supplementation, cell transplantation, or disease It can be used as a prophylaxis or a cure for infections. For example, in tissue regeneration , It is possible to make a target cell group of undifferentiated cells of a specific tissue. Liver, kidneys, nerves , Easily and quickly produce large amounts of pancreas, skin and bone cells. First, BSFM To Culture in cells to make early stem cells. These early cells are then assigned to specific factors, eg For example nerve growth factor, fibroblast-derived growth factor, GM-CSF or erythropoie. Treat with tin and other reagents to generate the desired tissue.   In one embodiment according to the method of the present invention, skin is effectively and safely generated. And can be transplanted to the patient. First, surgically remove a small sample of healthy epithelial cells Remove from tissue and place in tissue culture. Next, the BSFM is separated from this same cell sample by another From an epithelial sample or another tissue sample previously taken from the same patient, or another Prepare from cell culture obtained from source. The patient's epithelial sample is then treated with an effective amount of B Culture in the presence of SFM. From the abundant and expanded cultures obtained, a large amount of pre-epithelial It is capable of proliferating cartilage cells and producing natural skin that is grafted to the patient. Try the patient's own cells When used as a fee, the risk of rejection is very low or no, and new New epithelial cells develop very rapidly. Patients in need of such therapy, eg The risk of a life-threatening secondary infection is quite severe for burned patients. Because there is speed, it is essential.   In another embodiment, a complete organ system can be created from progenitor cells. An example For example, a small sample of pancreatic cells was obtained from a patient or a healthy, immunologically matched donor. To be The BSFM composition may be Langerhans islet cells, epithelial pancreatic cells, hematopoietic cells or Is prepared using a small sample of pancreatic cells that are cells from other sources. Then Expand and enrich cultures in stem, progenitor, progenitor or differentiated pancreatic cells Treat with an effective amount of BSFM. From these cells, the pancreas, or at least Part of the pancreas (eg, Langerhans cells containing A, B, D and PP cells) Can be recreated and surgically reintroduced into the patient. These cells are immunologically rejected Instead, it will function in a similar way as a natural cell and produce insulin. Conclusion In some cases, using the method of the present invention, type I diabetes (insulin -Dependent diabetes mellitus) is treatable and at least complications resulting from type II diabetes ( Insulin resistant diabetes) can be reduced. This method also produces insulin Can be used to generate islet cell populations for incorporation into transplant devices that function under control Wear.   Cell groups generated by the method of the present invention further include kidney, liver, gallbladder, large intestine, lung, Selective muscle tissue, nerves, selective blood vessels, arteries and capillaries, tendons and ligaments, and even gastrointestinal system cells. It can be used to supplement, repopulate or totally recreate cell lines such as cells. One aspect of the present invention In, the created cells and cell populations are Methods currently available and known to those of ordinary skill in the art, such as those disclosed in US Pat. No. 5,032,508, It can be used to reconstruct the entire organ.   The cell group according to the present invention is further used as a therapeutic agent for diseases or infections. be able to. The population of cells to be transplanted uses techniques that are not available intracellularly. Assay and treatment for infections such as viruses and bacteria that can be removed effectively and completely I can handle it. For example, a small sample of body fluid or tissue from a patient containing infected cells It can be expelled from the infection and the number of cells can be expanded by culturing in BSFM. Smell of transplantation therapy An extracellular method is known for selectively destroying diseased cells. In short , The cell sample is placed in culture, and, for example, a reverse transcriptase inhibitor (eg 3'-azide Treat with an antiviral agent such as 3'-deoxythymidine (AZT). BSF M treatment can be performed before, after, or simultaneously with the antiviral treatment. Alternatively, you can Lone, individually screen uninfected cell sorts and grow the resulting groups. At the same time, the patient is treated with high doses of chemical reagents, drugs or radiation to treat all infectious agents in the body. Remove the cells. If the disease is removed from the proliferating cell sample and the patient then the proliferating cell sample Are reinjected into the patient to recreate the whole or partial cell line.   Human immunodeficiency virus (HI) causing acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) Infections caused by viruses such as V) can be treated in this way. Small blood test The material is removed and the T cell population is expanded according to the method of the present invention. Then all Trace viruses are removed from the sample using techniques well known in the art and the patient is Treatment with an amount of antiviral agent (eg (AZT)) destroys all viral particles, If necessary, destroy the virus-infected cells with other reagents. These processes are currently Using transplantation techniques is not possible because the transplanted cells This is because secondary infections occur and kill the patient before it can function. According to the method of the present invention For example, patients can inject large numbers of different cells to reconstitute an active immune system. Alternative Then, for AIDS-infected patients, the virus of the present invention was purified from the blood sample of the patient. Continuously providing fresh uninfected T cells grown according to the method to AIDS-infected patients Can be processed as desired. Although this method does not remove the virus, it does not eliminate AIDS in patients. Consecutive complications never develop and can lead to a relatively normal life without any signs. . In addition, if the patient is in a tough physical condition, a more aggressive therapeutic procedure to clear the infection is allowed. Can be accepted.   In another embodiment, the cell population prepared by the method of the present invention has a disease or susceptibility. Can be used as a preventive against dyeing. For example, a blood sample is taken from a patient and stem / progenitor Cells can be treated to grow. These cells are then treated in the bone marrow and treated with pre-B cells. Cells for proliferation. Influenza, herpes, single virus I or II, cytomegalovirus, human T cell leukemia virus (eg HIV), po Rio virus, rhinovirus, respiratory syncytial virus, A, B and C types Viral infections from hepatitis virus, rubella virus, and JC virus, stuff Irococcus, Streptococcus, Mycobacterium, Clostridium, Neisseria, Enterobacter, Pseudomonas, Salmonella, Treponema, Ki Bacterial or fungal infections from organisms such as Candida and Aspergillus, Amebiasis, pneumococcal disease, malaria, trypanosomiasis, helminthosis and sarcoids These pre-B antigens are antigens for certain diseases such as parasitic infections such as Process the cells.   Target cells are treated with an antigen by the antigen-specific antibody production stimulation method to make the target cells identical Or re-inject into a different patient. This patient is never exposed to infection or vaccination Will have antibodies that resist the particular disease of choice without being killed. Similar method It can treat any cell type of the immune system and resists infection or disease. Produces body fluids. Alternatively, this method can be used to The dye can be treated.   Another embodiment of the present invention provides a method for providing an effective means for gene therapy. It is related. It is relatively easy to remove cells and culture In view of this, one of skill in the art can further introduce the genetic component into the cell prior to reintroduction into the patient. Wear. This treats many defective diseases that are attributed to single deletions or defective gene components it can. In addition, hematopoietic stem cells are the mediators for spreading deletion products to various parts of the body. It is very useful as an object in itself. Hematopoiesis pretermed by the present invention Stem cells and other cells also direct specific recombinant products to specific areas of the patient's body. It can be used to target, for example, anti-cancer drugs to the liver of patients with primary cancer of the liver. Targeting the tumor cells to target tumor suppressor gene products to specific cells in patients with retinoblastoma Patients with atherosclerosis by targeting or with antiplatelet-forming enzymes It is achieved by targeting the hematopoietic cells of.   Examples of other candidate diseases for gene therapy by the method of the present invention include hemophilia A (glucose 6-phosphate hydrogenase deficiency), familial high cholesterol Roremia (eg, cholesterol 7-alpha hydroxylase deficiency) , Glycogen and lysosomal storage diseases (eg sphingolipidosis, mucolipids) , Ullmann's disease, Pompe disease, Gaucher's disease) and SCID.   Techniques for gene therapy are known in the art. In short, the cell sample It is taken out from a person and placed in a culture according to the method of the present invention. This sample is Maintained in culture according to the method described below and used to grow a fraction of the cell population containing stem cells. It is advantageous. These cells are then used to introduce and stabilize the genetic components. Perform intricate technology. The introduction of the gene component is carried out before and during the cell growth by the method of the present invention. Or later. Incorporation of genetic components during growth is preferred in some cases Yes. Examples of these techniques include calcium- or microsome-mediated transfection. Transfection such as transfection, cell fusion, electroporation , Microinjection, or recombinant vaccinia virus or retrovirus There is an infection that uses the vector. These vectors are adenosine for SCID processing It contains a functional genetic component that expresses products such as deaminase. gene Cells that require the components are sorted, expanded and reintroduced into the patient. These cell groups Other products that circulate throughout the body to supply adenosine deaminase, or are needed Supply.   Another preferred embodiment of this approach is the treatment of diabetes and possibly therapy. It Biopsy was performed on a sample of pancreatic tissue from an insulin-dependent diabetic patient to obtain tissue culture. Feed. This sample was cultured in BSFM to selectively select stem cells, progenitor cells, progenitor cells or Or, proliferate differentiated pancreatic cells. These cells were then tested for insulin expression. Transfecting gene. Preferably the gene is a natural insulin Transcription and transcription by a method similar or identical to the natural insulin gene that is a promoter This is done under the control of a controlled promoter. Then these recombinants Cells are injected into the pancreas of a diabetic patient and surgically transplanted. Recombinant cells are pancreas Functioning as a necessary supply of insulin to the bloodstream to complete the function of pancreatic B cells. Is made. This process can be repeated if desired, however biopsy is performed. If given, pancreatic cells cannot be continuously removed from the patient, but can be maintained in culture or It can be stored (eg cryopreserved) for use. This is the current available technology This is a significant advantage that some cannot imagine.   Another embodiment of the invention is the use of gene therapy for the treatment of infection by cytoplasmic transplant. It is directed. For example, target cells, preferably hematopoietic cells, can be treated by the method of the present invention. Can be prepared. These cells contain recombinant DNA expressing a therapeutic product. Transfected or infected using rows and vaccinated host to show therapeutic effect . Useful therapeutic products include antibiotics, anticancer drugs including chemotherapeutic agents, peptides and drugs. Expression products such as cytotoxic compounds, antisense RNA and ribozymes. Special A product useful for the treatment of certain cancers when incorporated into the hematopoietic cells of patients Multidrugs that allow the use of higher and consequently more effective doses of chemotherapeutic agents It is an expression product of the resistance (MDR) gene. The method of the present invention can selectively In view of the fact that it is possible to grow cell populations, drugs and other reagents It can be preferentially targeted to certain tissues and organs to provide a therapeutic effect. Wear. Moreover, techniques similar to these can be used to introduce genetic components into cells. As a preventive treatment, resistance to a disease or infection can be given. These places Configuration is not possible with current technology.   Alternatively, the target cells may be genetically engineered to express an antigenic or immunogenic product. Can be integrated. Immune response expresses antigens such as infectious organisms when cells are returned to the patient The generation of antigen-specific antibodies and the circulation of cells to any substance. Thing In fact, such recombinant cells could form a vaccine against infectious organisms. Ah   In another embodiment, according to the present invention capable of differentiating into various specific cell lines To provide a bank of cell cultures consisting of multiple populations of stem cells, progenitor cells or progenitor cells It This cell bank can create a single individual and store it for a long time, such as cryopreservation. it can. In short, samples of cells can be obtained from various organs and cell lines of an individual, HLA classified and cultured by the method of the present invention using the sorted BSFM It The expanding target cells are expanded, spheronized by centrifugation, and Suspend in a cryopreserved medium such as Hoxide (DMSO), divide into samples, Freeze enough. The sample can be thawed and, if necessary, for example, the patient must undergo cell transplantation therapy. Can be grown in culture as needed. Alternatively, the sample can be It can be frozen for the creation of Can be propagated. These approaches are not possible using current technology This is because large numbers of undifferentiated cells cannot be maintained or expanded in culture. Because it is.   In a similar manner, the target cell population will be used for autologous or allograft therapy. , Represented by the complete or partial spectrum of human leukocyte antigen (HLA) It can be stored from a creative bank of different individuals of stem, progenitor and progenitor cells. This These cell banks are maintained or cryopreserved for each organ, tissue and tissue system. I can exist. Diseases other than humans that are candidates for the establishment of such cell banks Economically expensive mammals such as cows, sheep, pigs and horses, domesticated like dogs and cats There are live animals, zoos and wildlife such as various monkeys and other primates. Classified H that has been frozen until needed and then grown using the method of the invention. LA-type blood and / or tissue sample banks can also be established.   In another embodiment, performing a fetal gene assay by the method of the invention. Can be. First, a sample of peripheral blood is taken from a pregnant woman containing small amounts of fetal cells . Fetal cells are grown by the method of the present invention. The amount of fetal cells from maternal cells Separation may be done either before or after growth, as desired, by FACS method or similar method. Can be done by law. The proliferated population of fetal cells obtained is known and currently available It is possible to perform an easy and reliable genetic test by an effective technique such as amniocentesis. it can.   Examples of the present invention will be described below. These do not limit the scope of the invention. Absent.Example                                     Example 1                               Proliferation of CD34 + cells A.Manufacturing of BSFM   Peripheral blood cells obtained by the leukopheresis method contain 20 units / ml of heparin Diluted 1:10 with CCM-2 (Verax Corporation). Equal volume of diluted blood liquid   The sample was mixed with 2% acetic acid and the total number of mononuclear cells was estimated using a hemocytometer. Decided Generally, the total number of mononuclear cells from one leukocyte export unit is approximately 30. Through 50x106Cells / ml.   Blood-free peripheral blood cells containing 20 units / ml heparin to induce BSFM About 4 x 10 with Sei CCM-26Diluted to a final concentration of mononuclear cells / ml. T-150 A total of 80 ml of cell suspension in a flask was conditioned with 5% CO237 ° C in an incubator At the temperature of about 2 hours, 10 ng / ml of mezerein was added and precultured. Concanavalin -A was added to a final concentration of 20 μg / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C. for about 4 days. Up The supernatant was collected and cell debris was removed by centrifugation. Use clear supernatant Stored at 4 ° C until freeze or lyophilized at -20 ° C. B.Optimization of BFSM addition level   In this example, the BSFM produced in Example 1A was used to expand the peripheral blood cell population. The optimal potential level of BSFM for breeding was estimated. Unfractionated and Fico Fractionated peripheral blood cells were used. Is the Ficoll fractionated blood cell a leukocyte export unit? C. containing 10 ml of peripheral blood and 20 units / ml of heparin and 10% whole calf serum It was prepared by diluting with 20 ml of CM-2 medium. 15 ml of this diluted blood sample Bacteria were loaded onto 10 ml Ficoll-Hypaque in a 50 ml culture tube. Tabletop centrifuge It was centrifuged at room temperature (25 ° C.) at 400 × g for 30 minutes. Aqueous Ficoll Intermediate The cells are harvested from the phase and twice with CCM-2 medium containing 10% fetal calf serum. Washed. The cells contain serum-free CCM-2 medium or 10% FCS before use Resuspended in CCM-2 medium.   Unfractionated cells were treated with fetal calf serum in CCM-2 medium containing 1 to 5% BSFM as described above. About 2x10 in presence or absenceFiveDiluted to a final cell concentration of / ml. 24 holes Add 1.5 ml of cell suspension per well of culture plate to obtain 5% CO2In the incubator Incubated at a temperature of 37 ° C. Measure the number and viability of the cells daily for 5 days It was As shown in Table 1, the highest growth rate was CCM containing 5% BSFM. -2 was observed in medium. In another study, cells were expanded in CCM-2 medium containing 5% BSFM. It was confirmed that the breeding rate reached a peak. Medium containing 5% BSFM and 10% BSFM There was no difference in the cell growth rate from the containing medium. In addition, serum-free medium It was observed that the cells grew equally well in the medium. CCM containing 5% BSFM -2 medium has the ability to support the growth of Ficoll-fractionated PBMNC unfractionated PBMNC It was equivalent to the case of. C.Peripheral blood mononuclear cell proliferation   Both unfractionated cells and fractionated cells in a 24-well culture plate, 5% BSFM, recombinant Human stem cell factor (SCF) 10 ng / ml, recombinant human erythropoietin (EPO) PBMNC cells were prepared by culturing in CCM-2 medium containing 1 unit / ml. The growth of vesicles was examined. 1 to 2x10 in each holeFiveCells with cell concentration of mononuclear cells / ml 1.5 ml of suspension was inoculated. After culturing for 5 to 6 days, cell number and viability were calculated. 1 to 2 × 10 under the same culture conditions at the end of the cultureFive5 more at an inoculum density of cells / ml Subcultured for up to 6 days. From the initial cell culture, cells were subcultured twice. Table 2 As shown in, the fold increase in the number of cells was 16 days for 2 passages, and even in unfractionated cell culture. The cell culture also exceeded 600 times.   D.Analysis of proliferating cells   The composition of hematopoietic cells in the total cell population was analyzed by three methods: FACS analysis to determine expressed surface markers such as CD34; Colony counting the total number of progenitor cells, especially BFU-E and CFU-GM in a cell population Formation test; and Morphological analysis by light microscopy.   A list of surface markers used for FACS analysis is shown in Table 3. many In some cases, trichrome staining was used to identify CD34 + cell subgroups in culture (Table 4). For example, the three individual antibody pairs are C34, CD38, and HLA-DR, respectively. Expression of any of the markers listed in the table as means for recognizing D34 + cell subgroup It was used for cell type determination. Examples of other combinations are lymphocytes and myeloid lineage cells Is a combination of CD34, CD33, CD3 to monitor differentiation into.   To determine the total number of progenitor CFU-GM cells obtained in culture, 1x10FiveMononuclear Cells are 20% FCS, 0.9% methylcellulose, 10 ng / ml recombinant human 35 mm set suspended in 1 ml of CCM-2 medium containing GM-CSF and gridded It was applied to a woven culture dish. 5% CO2Formation after culturing in an incubator at 37 ° C for 14 days The colonies formed were counted and recorded. To examine the number of erythroblast progenitor cells, BFU-E, 1x10FiveMononuclear cells similar to those described for the CFU-GM assay, except Medium in which recombinant GM-CSF was changed to 1 unit / ml of recombinant human erythropoietin I lost it. Also, after culturing for 14 days, the total colony forming unit was determined by an optical microscope. did. The cytospin staining technique was used to examine cell morphology. To put it simply, The cells are spun down and the cell smears are stained with Wright's stain. Light cell morphology It was analyzed by a scientific microscope.   E. FIG.Proliferation of bone marrow and erythroblast progenitor cells   Approximately 2 x 10 of Ficoll fractionated PBMNC in a 24-well plate incubatorFivecells / ml Seed at a density of 1.5 ml / well. 5% BSFM, 10 ng / ml recombinant human SC Of CCM-2 medium containing F and 1 unit / ml of recombinant human erythropoietin Incubated for 5 days. Day 0 of culture using the colony formation assay described above. The total number of CFU-GM cells and BFU-E cells on the 5th day of culture was calculated. Representative C The FU-GM colony and the BFU-E colony are shown in FIGS. 3 and 4, respectively. In Table 5 As shown, CFU-GM progenitor cells had a 32.3-fold increase and B after 5 days in culture. There was a 237.5 fold increase in FU-E progenitor cells. In the case of this example, Vesicles increased to about 5-fold after 5 days in culture, and CFU-GM and BFU-E cells or their C It showed a preferential expansion of D34 + progenitor cells.   F.Proliferation of CD34 + cells   Selected BSFM, produced as described in Example 1A, undergo lymphoid lineage differentiation. Used with the intention of expanding CD34 + cells of choice. For this reason, unfractionated and Equal fraction PBMNC in a 24-well plate as described above, 5% BSFM, 1 0 ng / ml recombinant human SCF and 1 unit / ml recombinant human erythropoietin Cultured in CCM-2 medium containing. Subculture cells on days 5 and 11 And FACS analysis of cells collected on days 0, 5, 11, 16 The surface marker, CD34, was determined by. As shown in Table 6, CD 34+ cells increased from less than 0.5% to over 70% of the cell population. Figure 5 is unfractionated Day 1 culture for cells and Figure 6 shows day 3 culture. Figure 7 is a fractional detail Day 1 culture for vesicles and Figure 8 shows day 3 culture.   G.Analysis of subgroups of CD34 + cells and CD3 + cells   In another study to analyze CD34 + cells and CD3 + cell subgroups, Fractions and fractionated cells in 5% BSFM, 10 ng in 24-well plates as described above. / Ml recombinant human SCF and CCM-containing 1 unit / ml of erythrobotin The cells were cultured in 2 medium for 5 days and 6 days, respectively. Table 7 shows the rate of PBMNC proliferation. Shown together.   To investigate both CD34 + cells and subgroups of CD3 + cells, the following surface markers -Based FACS analysis was performed on both unfractionated and fractionated PBMNC: CD34, CD38, HLA-DR, CD3, CD33, CD4, CD8. analysis The results are shown in Table 8. All CD34 + cells in unfractionated cell culture are the whole cell population Of 28.2% and that in fractionated cell culture is 36.5%. In addition, CD3 8, more primitive in culture, based on DR, CD3 surface markers To obtain an array of CD34 + cell subpopulations ranging from to more committed progenitor cells It was Some representative FACS analyzes are shown in Figures 9 and 10.                                     Example 2                               Manufacture of modified BSFM   Modified BSFM was obtained by the protocol described in Example 1A. This modified BSF 5 ml of M was passed through an anti-IL-2 affinity column containing 1 ml matrix. Distribution Min (modified BSFM) was used for the production of medium for myeloid cell growth. This Is CCM-2 medium, 5% modified BSFM, 10 ng / ml recombinant human SCF and And 1 unit / ml recombinant human erythropoietin.   2x10 1.5ml cell culture per well on a 24-well plateFivePBMNC / ml Was inoculated. The cells were subcultured twice for 5 to 6 days each. 5 to 6 days in culture At the end of, total cell number and viability was calculated. CD34, CD33, CD19, C The composition of cell populations related to the expression of the D3 marker was analyzed by FACS. further A colony formation assay was performed on cells obtained from the culture. Those results are Proliferation of CD34 + cells, the group of which is mainly myeloid cells of various degrees of differentiation (CD 33+).                                     Example 3                               Proliferation of lymphoid cells   Proliferation of lymphoid cells by culturing unfractionated and fractionated PBMNC in 24-well plates I checked. Both the culture conditions and the medium were the same as those described in Example 1. culture Was carried out for 2 passages for a total of 16 days. Days 0, 5, 11 and 16 The CD3 +, CD4 +, CD8 + cell populations in the eyes were analyzed by FACS. In Table 9 As shown, CD3 +, CD4 +, CD8 + cell populations are expanded and maintained Was done. After 16 days in culture, whole cells in both unfractionated cell culture and fractionated cell culture The group had expanded more than 600-fold.   After 16 days of culture of both unfractionated and fractionated cells, CD3 + cells were further subjected to FACS. Analyze and examine subgroups of CD3 + cells for CD4 and CD8 markers It was The results of the analysis are summarized in Table 10 and show that these cell populations increased and maintained in culture. It has been held.                                     Example 4                                 Proliferation of erythroid cells   2x10 on a 24-hole plateFiveUnfractionated and fractionated PBMNC with cell density of cells / ml Used and inoculated with 1.5 ml culture per well. The culture medium was B as described in Example 2. SFM, 10 ng / ml recombinant human SCF and 1 unit / ml recombinant human erythro Consists of CCM-2 medium containing poetin and 50 mM ferric citrate It was   Cells were cultured at a temperature of 37 ° C and passaged every 5-6 days. 5 to 6 At the end of the day's culture, total cell number and viability were measured respectively. Cell group is FACS And analyzed by morphological observation with a light microscope. Analysis results are pre-erythroblasts, erythroblasts Expansion of erythroid cells leading to cell populations including cells and highly differentiated erythroblasts Indicated.                                     Example 5                                 Reconstitution of hematopoietic system   To test the hematopoietic reconstitution ability of CD34 + cells obtained by expansion, Fractions as well as fractionated PBMNC as described in Example 1 with 5% BSFM, 10 ng / Ml recombinant human SCF and 1 unit / ml recombinant human erythropoietin CCM-2 medium for 5 days. Collect the cells and place in a tabletop centrifuge It was used and centrifuged at room temperature for 20 minutes at a force of 200 × g. Unfractionated cell culture and fractionation 0.1 to 0.2 of pH 7.4 phosphate buffered saline from each of the cell cultures About 5x10 in ml6Cells were injected intraperitoneally (IP) into SCID mice. 2 weeks after injection After a while, the cells from the subrenal capsule in SCID mice were examined for evidence of specific cell insertion. Therefore, it was analyzed by FACS. The analysis result shows that cultured CD34 + cells are SC It has been shown that a fully functional human hematopoietic system can be transplanted in ID mice.                                     Example 6                                 Manufacturing of BSFM   Induces a preferred BSFM for CD34 + proliferation towards lymphoid lineage differentiation Examples of potentiators and inducers other than those described in Example 1 for 4x10 to prove6Pretreatment of mononuclear cells / ml with 300 IU / ml IFN-β for 2 hours did. These cells were further cultured for 4 days after adding 10 μg / ml of PHA. The PBMNC proliferative capacity of BSFM was determined by 24-well plate culture as described in Example 1. Tested well. The test results are different from those used in Example 1 / The BSFM obtained using the inducer supports the corresponding CD34 + cell population. It has been shown to support and increase.                                     Example 7                                 Proliferation of islet cells   Isolation of porcine pancreatic islets and density gradient centrifugation using Ficoll Yielded a large number of islets with an average diameter of about 150μ. Collagen matrix About 10,000 islets in a 60 mm Petri dish with or without 1 ml of couscous Apply. The culture medium was DMEM, 20% of horse serum, BSFM described in Example 1. 5% and 1% of the hypothalamic extract. Rotating platform Incubate the cells at a temperature of 37 ° C above. 0th, 7th, 14th and 21st day of culture Eyes cultured from duplicate Petri dishes in the presence or absence of collagen matrix The islet cells were collected and the total cell number and viability were examined. Furthermore, in the culture medium Insulin and glucagon concentrations as a means of demonstrating A and B cell proliferation It was measured by radioimmunoassay. The result is the proliferation and insularity of islet cells. Shows full functionality of both A and B cells as shown by the production of phosphorus and glucagon did.                                     Example 8                   Cell proliferation using cells from different donors   PBMNCs were separately collected from 6 human donors and described in Example 1B. Special Ficoll fractionation was performed using Ptocor. BSFM described in Example 1A It was obtained by the following protocol.   4x10 cells from each donor in 24-well platesFiveAnd 1x106First Cultures were carried out using 1.5 ml of cell suspension per well depending on the inoculum density. Culture 5% CO2It was carried out in an incubator at a temperature of 37 ° C. for 5 to 7 days.   Cells from each donor were added to CCM-2 basal medium with 2% BSFM and / or plasma, And / or 10% fetal bovine serum (FBS) and / or selected cytokine In: 1 unit / ml recombinant human erythropoietin (EPO), 10 ng / ml set Recombinant human stem cell factor (SCF), 10 ng / ml recombinant human interleukin- 3 (IL-3), 10 ng / ml recombinant human interleukin-6 (IL-6) Was suspended in the medium formulation prepared by adding The media formulations used are shown in Table 11. You   For each donor cell, the cell number and viability were measured after 5 to 7 days of culture. each At the beginning and end of the culture CFU-GM cells and by the method described in Example 1D The total number of BFU-E plus CFU-E cells was calculated.   Mean total cell increase (and standard deviation) in each media composition of 6 donor cells Is shown in Table 12.   The average increase in CFU-GM progenitor cells is shown in Table 13 and for BFU + CFU-E progenitor cells. The average increases are shown in Table 14, respectively.   In Tables 12, 13, and 14, when the standard deviation value is larger than the average value Has a standard deviation of 1 individual donor (2-4 times more than the average of multiple donors). Distorted by data from large donors).                                     Example 9                               Cell size distribution analysis   PBMNC were obtained by leukapheresis, and the BS as described in Example 1A. FM was produced. Modified BSFM adds plasma to BSFM (2% plasma) It was manufactured accordingly. Ficoll-Hypaque Fractionated Cells Produced and CCM-2 Basic medium (without FCS) plus 10 ng / ml recombinant human stem cell factor (S CF) and 1 unit / ml of recombinant human erythropoietin, as described in Example 1B. It was cultured as shown.   At the end of 5 to 6 days of culture, the number of cells and the viability were measured, and the cells were analyzed by FACS. Analyzed to determine cell size as well as subgroup of CD34 + cells.   Typical FACS analysis forward light scatter (FS) and side light scatter (SS) are detected in the BSFM. FIG. 11 shows cells cultured with and without serum, and cells cultured without addition. Each is shown in FIG. If no plasma was added to the BSFM, As can be seen in Figure 12, the cell size distribution is present in two distinct subgroups. There is. The FS subgroup of lower cells are the small cells and this subgroup It contains predominantly cells that are CD34 positive. When plasma is added to BSFM In combination, cells in the small cell size subgroup are negligible and CD The number of 34-positive cells is significantly reduced.   Other embodiments or uses of the invention include the description and routine techniques of the invention disclosed herein. It will be obvious to a person having ordinary skill in the art in view of the technique. Therefore, the above description and examples are made solely for the purpose of illustration, The true scope and spirit of the invention may be indicated by the following claims. To be understood.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/78 7431−4Ｃ Ａ６１Ｋ 35/78 Ｊ 38/00 8314−4Ｃ 48/00 38/21 ＡＤＺ 9455−4Ｃ 37/46 38/22 9455−4Ｃ 37/50 ＡＤＹ 38/36 9455−4Ｃ 37/66 ＡＤＺＧ 38/44 ＡＤＹ 9455−4Ｃ 37/02 48/00 9455−4Ｃ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI A61K 35/78 7431-4C A61K 35/78 J 38/00 8314-4C 48/00 38/21 ADZ 9455-4C 37/46 38/22 9455-4C 37/50 ADY 38/36 9455-4C 37/66 ADZG 38/44 ADY 9455-4C 37/02 48/00 9455-4C 37/24 (81) Designated country EP (AT , BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN) , ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, HU, JP, KP , KR, KZ, LK, LU, LV, G, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SK, UA, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．造血連鎖中の所望の階層に位置する少なくとも１種の造血系標的細胞画分に 富む細胞群を生産する方法において： ａ）造血系細胞を含む第１の細胞群を処理して、該第１の細胞群から得られ る細胞因子の混合物を含み、該標的細胞の増殖を優先的に促すべく平衡化された 刺激及び抑制作用を有する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）を該第１の細胞 群に生産させ； ｂ）造血系細胞を含む第２の群を十分量の該ＢＳＦＭの存在下に十分な時間 培養して、該標的細胞を優先的に増殖させ、該第２の細胞群中の該標的細胞画分 を富化させることからなることを特徴とする方法。 ２．該標的細胞が分化多能幹細胞である請求項１記載の方法。 ３．該標的細胞が始祖細胞である請求項１記載の方法。 ４．該始祖細胞が骨髄始祖細胞である請求項３記載の方法。 ５．該骨髄始祖細胞がＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭ Ｍ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＭＫ、ＣＦＵ−Ｅｏ、ＣＦＵ−Ｂａ、ＢＦＵ−Ｅ及び ＢＦＵ−ＭＫからなる群より選択される請求項４記載の方法。 ６．該始祖細胞がリンパ性始祖細胞である請求項３記載の方法。 ７．該リンパ性始祖細胞がＣＦＵ−Ｂ、ＣＦＵ−Ｔ及びＣＦＵ−Ｌからなる群よ り選択される請求項６記載の方法。 ８．該標的細胞がＢリンパ球及びこれに分化する前駆細胞からなる群より選択さ れる請求項１記載の方法。 ９．該標的細胞がＴリンパ球及びこれに分化する前駆細胞からなる群より選択さ れる請求項１記載の方法。 １０．該標的細胞が赤血球及びこれに分化する前駆細胞からなる群より選択され る請求項１記載の方法。 １１．該標的細胞が血小板、顆粒球、マクロファージ、好塩基球及び好酸球、並 びにそれらに分化する前駆細胞からなる群より選択される請求項１記載の方法。 １２．少なくとも２種の造血系標的細胞画分に富む細胞群を生産する請求項１記 載の方法において、該標的細胞が分化多能幹細胞及び始祖細胞を含む方法。 １３．さらに標的細胞として骨髄細胞及びリンパ性細胞を含む請求項１２記載の 方法。 １４．該標的細胞がＣＤ３４＋細胞である請求項１記載の方法。 １５．該ＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４＋１ｉｎ−である請求項１４記載の方法。 １６．該ＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５−ＤＲ−ＲＨＯ１２３ （Ｄｕｌｌ）である請求項１４記載の方法。 １７．該ＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４＋ＤＲ−ＣＤ３３−ＣＤ１９−ＣＤ３−ＣＤ ３８−である請求項１４記載の方法。 １８．該標的細胞がＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ１９＋細 胞、ＣＤ３３＋細胞、ＣＤ３８＋細胞及びＤＲ＋細胞からなる群より選択される 請求項１記載の方法。 １９．該培養された第２の群中の標的細胞に富む画分が少なくとも約５％の該標 的細胞を含む請求項１記載の方法。 ２０．該培養された第２の群中の標的細胞に富む画分が少なくとも約２０％の該 標的細胞を含む請求項１記載の方法。 ２１．該培養された第２の群中の標的細胞に富む画分が少なくとも約５０％の該 標的細胞を含む請求項１記載の方法。 ２２．該培養された第２の群中の標的細胞に富む画分が少なくとも約８０％の該 標的細胞を含む請求項１記載の方法。 ２３．該第１の細胞群が全末梢血を含む請求項１記載の方法。 ２４．該第１の細胞群が末梢血単核細胞を含む請求項１記載の方法。 ２５．該末梢血単核細胞が白血球層画分を含む請求項２４記載の方法。 ２６．該末梢血単核細胞が白血球搬出画分を含む請求項２４記載の方法。 ２７．該末梢血単核細胞がＦＩＣＯＬＬ分離画分を含む請求項２４記載の方法。 ２８．該末梢血単核細胞が免疫分離画分を含む請求項２４記載の方法。 ２９．該第１の細胞群が新たに採取された細胞及び予め冷凍保存された細胞から なる群より選択される末梢血単核細胞を含む請求項１記載の方法。 ３０．該第１及び第２の細胞群が異種の細胞である請求項１記載の方法。 ３１．該第１及び第２の細胞群が同種の細胞である請求項１記載の方法。 ３２．該第１の細胞群が骨髄細胞を含む請求項１記載の方法。 ３３．該第１の細胞群が臍帯血細胞を含む請求項１記載の方法。 ３４．該第２の細胞群が全末梢血を含む請求項１記載の方法。 ３５．該第２の細胞群が末梢血単核細胞である請求項１記載の方法。 ３６．該末梢血単核細胞が白血球層画分を含む請求項３５記載の方法。 ３７．該末梢血単核細胞が白血球搬出画分を含む請求項３５記載の方法。 ３８．該末梢血単核細胞がＦＩＣＯＬＬ分離画分を含む請求項３５記載の方法。 ３９．該末梢血単核細胞が免疫分離画分を含む請求項３５記載の方法。 ４０．該第２の細胞群が新たに採取された細胞及び予め冷凍保存された細胞から なる群より選択される末梢血単核細胞を含む請求項１記載の方法。 ４１．該第２の細胞群が骨髄細胞を含む請求項１記載の方法。 ４２．該第２の細胞群が臍帯血細胞を含む請求項１記載の方法。 ４３．該第１及び第２の細胞群が同一のドナーに由来する請求項１記載の方法。 ４４．該第１及び第２の細胞群が該ドナーからの単一の血液試料に由来する請求 項４３記載の方法。 ４５．該第１及び第２の細胞群が異なるドナーに由来する請求項１記載の方法。 ４６．第１の細胞群を処理する工程が該第１の細胞群を該第１の細胞群に該ＢＳ ＦＭを生産させるための誘導剤と接触させることを含む請求項１記載の方法。 ４７．該誘導剤がマイトジェンを含む請求項４６記載の方法。 ４８．該マイトジェンが植物レクチンである請求項４７記載の方法。 ４９．該レクチンがファセオルス・ヴルガリス、ドリコス・ビフロルス、ソラヌ ム・ツベロスム、ソフォラ・ジャポニカ、マクルラ・ポミフェラ、ピスム・サチ ヴム、ウレクス・エウロペウス、アラキス・ヒポゲア、グリシネ・マクス、カナ ヴァリア・エンシフォルミス、トリチクム・ヴルガリス、リコペルシコン・エス クレンツム、フィトラッカ・アメリカナ、及びリステリア・モノシトゲネスから なる群より選択される植物に由来する請求項４８記載の方法。 ５０．該植物レクチンがＰＨＡ叉はＣｏｎＡである請求項４８記載の方法。 ５１．該マイトジェンがＴ細胞マイトジェンである請求項４７記載の方法。 ５２．該Ｔ細胞マイトジェンがスタフィロコッカル・エンテロトキシンＡ、ガラ クトースオキシダーゼ、ストレプトリシンＯプロテインＡ、及び１２−Ｏ−テト ラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）からなる群より選択され る請求項５１記載の方法。 ５３．該誘導剤がＴ細胞に対するモノクローナル抗体である請求項４６記載の方 法。 ５４．該モノクローナル抗体がＯＫＴ３である請求項５３記載の方法。 ５５．該誘導剤がジテルペンエステルである請求項４６記載の方法。 ５６．該ジテルペンエステルが１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボル−１３−ア セテート（ＴＰＡ）である請求項５５記載の方法。 ５７．該ジテルペンエステルがホルボル（４−Ｏ−メチル）１２−ミリステート −１３−アセテート、ホルボル（２０−オキソ−２０−デオキソ）１２−ミリス テート−１３−アセテート、ホルボル１２−モノミリステート、ホルボル１２， １３−ジデカノエート、ホルボル１２，１３−ジブチレート、ホルボル１２，１ ３−ジベンゾエート、及びホルボル１２，１３−ジアセテートからなる群より選 択される請求項５５記載の方法。 ５８．該誘導剤がメゼレイン（ＭＺＮ）である請求項４６記載の方法。 ５９．該第１の細胞群を促進剤で前処理した後で該誘導剤と接触させる請求項４ ６記載の方法。 ６０．該促進剤がＴＰＡ，ＭＺＮ、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、及びイ ンターフェロンβ（ＩＦＮ−β）からなる群より選択される請求項５９記載の方 法。 ６１．該誘導剤がＰＨＡであり該促進剤がＴＰＡである請求項６０記載の方法。 ６２．該標的細胞がＣＤ３４＋であり、該第１の細胞群をＴＰＡ、ＭＺＮ、ＩＦ Ｎ−α、ＩＦＮ−β及びそれらの混合物からなる群より選択される促進剤で前処 理した後でＰＨＡ、ＯＫＴ３、ＣｏｎＡ及びそれらの混合物からなる群より選択 される誘導剤と接触させる請求項１記載の方法。 ６３．該誘導剤と該第１の細胞群とを生育培地中で合わせ、約１乃至１０日間培 養する請求項４６記載の方法。 ６４．生育培地に該誘導剤を培地１ｍＬ当たり約５乃至１０μｇ加える請求項６ ３記載の方法。 ６５．該第１の細胞群をインビトロで処理して該ＢＳＦＭを生産させる請求項１ 記載の方法。 ６６．該第１の細胞群をインビボで処理して該ＢＳＦＭを生産させる請求項１記 載の方法。 ６７．該生育培地が規定無血清培地である請求項６３記載の方法。 ６８．該第２の細胞群を規定無血清培地で培養する請求項１記載の方法。 ６９．該第２の細胞群を該培地中約１乃至約１０体積％の該ＢＳＦＭの存在下に 培養する請求項６８記載の方法。 ７０．該規定無血清培地に少なくとも１種のサイトカインをさらに添加する請求 項６８記載の方法。 ７１．該第２の細胞群を約５乃至約２０日間培養し、該標的細胞がＣＤ３４＋細 胞を含む請求項１記載の方法。 ７２．さらに該富化された第２の細胞群の培養の生育力を維持する工程を含む請 求項１記載の方法。 ７３．さらに該富化された第２の細胞群の培養を冷凍保存する工程を含む請求項 １記載の方法。 ７４．該第２の細胞群をインビトロで培養する請求項１記載の方法。 ７５．該第２の細胞群をインビボで培養する請求項１記載の方法。 ７６．該ＢＳＦＭを宿主に導入することにより該インビボ培養を行う請求項７５ 記載の方法。 ７７．該第２の細胞群を該ＢＳＦＭと接触させた後で該細胞群を宿主に導入する ことにより該インビボ培養を行う請求項７５記載の方法。 ７８．該ＢＳＦＭがＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｉ Ｌ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＳＦ−Ｇ、ＣＳＦ−ＧＭ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ −β、ＴＧＦ−β、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＳＣＰＦ及びＢＭＰからなる群より選択さ れる少なくとも２種の因子の混合物を含む請求項１記載の方法。 ７９．造血連鎖中の所望の階層に位置する少なくとも１種の造血系標的細胞画分 に富む細胞群を生産する方法において： ａ）造血系細胞を含む第１の細胞群を処理して、該第１の細胞群から得られ る細胞因子の混合物を含み、分化多能幹細胞の増殖を優先的に促すべく平衡化さ れた刺激及び抑制作用を有する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）を該第１の 細胞群に生産させ； ｂ）該ＢＳＦＭの組成を修正して、該標的細胞の増殖を優先的に促すべく新 たに平衡化された刺激及び抑制作用を有する、修正平衡化選択因子混合物を作製 し、 ｃ）造血系細胞を含む第２の細胞群を十分量の該修正ＢＳＦＭの存在下に十 分な時間培養して、該標的細胞を優先的に増殖させ、該第２の細胞群中の該標的 細胞画分を富化させることからなることを特徴とする方法。 ８０．造血連鎖中の所望の階層に位置する少なくとも１種の造血系標的細胞画分 に富む細胞群を生産する方法において： ａ）造血系細胞を含む第１の細胞群を処理して、該第１の細胞群から得られ る細胞因子の混合物を含み、分化多能幹細胞、始祖細胞及びそれらの混合物から なる群より選択される少なくとも１種の中間標的細胞の増殖を優先的に促すべく 平衡化された刺激及び抑制作用を有する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）を 該第１の細胞群に生産させ； ｂ）造血系細胞を含む第２の細胞群を十分量の該ＢＳＦＭの存在下に十分な 時間培養して、該中間標的細胞を優先的に増殖させ、該第２の細胞群中の該中間 標的細胞画分を富化させ； ｃ）該富化細胞群を該標的細胞を増殖させる条件下に培養して、該標的細胞 画分が富化された増殖細胞群を生産することを特徴とする方法。 ８１．ＣＤ３４＋抗体を発現する幹細胞／始祖細胞を少なくとも約２０％含む増 殖造血系細胞群を、ドナー末梢血の原試料から生産する方法において： ａ）該原試料からの第１の細胞群をＴ細胞マイトジェンで処理して、該第１ の細胞群から得られる細胞因子の混合物を含み、ＣＤ３４＋細胞の増殖を優先的 に促すべく平衡化された刺激及び抑制作用を有する、平衡化選択因子混合物 （ＢＳＦＭ）を該第１の細胞群に生産させ； ｂ）該原試料からの第２の細胞群を十分量の該ＢＳＦＭの存在下に十分な時 間培養して、ＣＤ３４＋細胞の数を優先的に少なくとも５００倍に増加させ、Ｃ Ｄ３４＋細胞を少なくとも約２０％含む富化細胞群にすることを特徴とする方法 。 ８２．宿主の造血系を折衷造血系を用いて再構成する方法において、請求項２の 方法で生産される選択標的細胞に富む増殖造血系細胞群を該宿主に移植すること からなることを特徴とする方法。 ８３．移植される細胞群が該宿主の造血系を折衷する以前の該宿主に由来する請 求項８２記載の方法。 ８４．移植される細胞群が適合したＨＬＡ型を有するドナーに由来する請求項８ ２記載の方法。 ８５．移植される細胞群が分化多能幹細胞、始祖細胞又はそれらの混合物を含む 請求項８２記載の方法。 ８６．移植される細胞群がＣＤ３４＋細胞を含む請求項１記載の方法。 ８７．該宿主からの造血系細胞の採取に先立ち、該宿主を循環末梢血単核細胞数 を増加させる剤で処理する請求項８２記載の方法。 ８８．請求項１の方法で生産された富化細胞群。 ８９．請求項７９の方法で生産された富化細胞群。 ９０．請求項８０の方法で生産された富化細胞群。 ９１．請求項８１の方法で生産された富化細胞群。 ９２．造血系細胞群から得られる細胞因子の混合物を含み、分化多能幹細胞の培 養を優先的に増殖及び富化する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）。 ９３．造血系細胞群から得られる細胞因子の混合物を含み、骨髄始祖細胞、リン パ性始祖細胞及びそれらの混合物からなる群より選択される細胞の培養を優先的 に増殖及び富化する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）。 ９４．造血系細胞群から得られる細胞因子の混合物を含み、Ｔ細胞、Ｂ細胞、赤 血球、単球、血小板、顆粒球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、それらに分 化する前駆細胞、及びそれらの混合物からなる群より選択される細胞の培養 を優先的に増殖及び富化する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）。 ９５．該分化多能幹細胞がＣＤ３４＋である請求項９２のＢＳＦＭ． ９６．該Ｔ細胞がＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞からなる群より 選択される請求項９４記載のＢＳＦＭ。 ９７．該細胞因子がＩＦＮ−γ８、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、 ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＦＳ−Ｇ、ＣＦＳ−ＧＭ、ＴＮＦ−α、ＴＮ Ｆ−β、ＴＧＦ−β、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＳＣＰＦ及びＢＭＰからなる群より選択 される少なくとも２種の因子を含む請求項９２記載のＢＳＦＭ。 ９８．さらに該赤血球を培養して該赤血球により生産されるヘモグロビンを回収 する工程を含む請求項１０記載の方法。 ９９．造血連鎖中の所望の階層に位置する少なくとも１種の造血系標的細胞画分 に富む細胞群を生産する方法において、造血系細胞群を請求項９２のＢＳＦＭ組 成物の活性因子を有する十分量の平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）の存在下に 十分な時間培養して、該標的細胞を優先的に増殖させ、該造血系細胞群中の該標 的細胞画分を富化させることからなることを特徴とする方法。 １００．造血連鎖中の所望の階層に位置する少なくとも１種の造血系標的細胞画 分に富む細胞群を生産する方法において、造血系細胞群を十分量の平衡化選択因 子混合物（ＢＳＦＭ）の存在下に十分な時間培養して、該標的細胞を優先的に増 殖させ、該細胞群中の該標的細胞画分を富化させることからなり、該ＢＳＦＭが 該標的細胞の増殖を優先的に促すべく平衡化された刺激及び抑制作用を有する細 胞因子の混合物を含み、また該ＢＳＦＭが第１の造血系細胞群をマイトジェンで 処理して該標的細胞を優先的に増殖させる細胞因子の混合物を該第１の細胞群に 生産させることにより調製される組成物の活性因子を有することを特徴とする方 法。 １０１．初代培養の動物細胞群を選択的に増殖させて所定の細胞型の標的細胞画 分を富化させる方法において： ａ）第１の初代培養細胞群を処理して、該第１の細胞群から得られ該標的細 胞の増殖を優先的に促すべく平衡化された刺激及び抑制作用を有する細胞因子の 混合物を含む平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）を該第１の細胞群に生産さ せる工程；及び ｂ）第２の初代培養細胞群を十分量のＢＳＦＭの存在下に十分な時間培養し て、該標的細胞を優先的に増殖させ、該第２の初代培養細胞群中の該標的細胞画 分を富化させる工程からなることを特徴とする方法。 １０２．該第１の初代培養動物細胞が造血系細胞、肝細胞、すい臓細胞、皮膚細 胞、脳細胞、神経細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、脾臓細胞、心臓細胞、骨髄細 胞、骨細胞、軟骨細胞、内皮細胞、腎細胞、筋肉細胞及び上皮細胞からなる群よ り選択される請求項１０１記載の方法。 １０３．該第１の初代培養細胞群を処理する工程が、該第１の細胞群を該第１の 細胞群のためのマイトジェンと接触させることからなる請求項１０１記載の方法 。 １０４．該処理及び培養工程をインビトロで行う請求項１０１記載の方法。 １０５．該処理工程をインビボで行う請求項１０１記載の方法。 １０６．該培養工程をインビボで行う請求項１０１記載の方法。 １０７．該インビボ培養が組織再生を含む請求項１０６記載の方法。 １０８．ヒト幹細胞バンクを創製する方法において、 ａ）既知のＨＬＡ型の第１のドナーから造血系細胞試料を採取する工程； ｂ）請求項２の方法により分化多能幹細胞に富む該造血系細胞の増殖培養を 調製する工程； ｃ）該増殖培養を冷凍保存する工程；及び ｄ）各既知のＨＬＡ型の個々のドナーについて、工程ａ）乃至ｃ）を繰り返 す工程からなることを特徴とする方法。 １０９．同種幹細胞移植を行う方法において、適当なＨＬＡ型について請求項１ ０８の方法で生産された冷凍保存増殖培養を解凍することにより得られる幹細胞 群を患者に導入することからなることを特徴とする方法。 １１０．将来的に幹細胞移植が必要となりうる患者による使用に必要な量の健康 なヒト幹細胞の入手可能性を確保する方法において： ａ）該患者が健康なうちに請求項２の方法により分化多能幹細胞に富む造血 系細胞の増殖培養を調製する工程；及び ｂ）該患者による将来の使用のために該富化培養を冷凍保存する工程からな ることを特徴とする方法。 １１１．何らかの異常な又は病気の造血系細胞を該移植の前に該細胞群から除去 する請求項８２記載の方法。 １１２．損傷を受けたヒト組織を修復する方法において、請求項１０１の方法で 調製した、該損傷を受けた組織と同じ型の増殖初代培養細胞群を患者に移植する 工程からなることを特徴とする方法。 １１３．ヒト器官を再生する方法において、請求項１０１の方法により調製され た１種以上の増殖初代培養細胞群を適当な構造基質中に導入することからなるこ とを特徴とする方法。 １１４．胎児の遺伝的異常の非侵襲的判断方法において： ａ）循環胎児細胞を含有する造血系細胞群を含む末梢血の試料を妊婦から採 取する工程； ｂ）該造血系細胞群を増殖させ、請求項１の方法で胎児及び母体細胞画分を 富化する工程； ｃ）該胎児細胞を該母体細胞から分離する工程；及び ｄ）該胎児細胞について遺伝的解析を行う工程からなることを特徴とする方 法。 １１５．造血系細胞の予防的治療を患者に提供する方法において： ａ）予防的観点からの標的細胞に富む増殖造血系細胞群を請求項１の方法で 調製する工程；及び ｂ）予防的に有効な量の該細胞群を該患者に導入する工程からなることを特 徴とする方法。 １１６．該予防的観点からの標的細胞がＴ細胞を含む請求項１１５記載の方法。 １１７．該Ｔ細胞がＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞からなる群より選択される請 求項１１６記載の方法。 １１８．患者を治療する方法において： ａ）造血系細胞を含む原細胞群を用意する工程； ｂ）該原細胞群の少なくとも一部を造血系細胞を含む第２の細胞群で処理す ることにより調製される細胞因子の混合物を含む平衡化選択因子混合物（ＢＳＦ Ｍ）の存在下に十分な時間培養して、造血連鎖中の所望の階層に位置する少なく とも１種の標的細胞の増殖を優先的に促すべく平衡化された刺激及び抑制因子を 有し、該標的細胞を優先的に増殖させ該原細胞群中の該標的細胞画分を富化する のに十分な量の該ＢＳＦＭを該第２の細胞群に生産させる工程；及び ｃ）該富化細胞群の少なくとも一部を該患者に導入する工程からなることを 特徴とする方法。 １１９．該原細胞群及び該第２の細胞群が同じ患者からのものである請求項１１ ８記載の方法。 １２０．該第２の細胞群が該同じ患者からの原細胞群の一部である請求項１１９ 記載の方法。 １２１．該第２の細胞群が異なる人からのものである請求項１１８記載の方法。 １２２．該異なる人が該第１の人と双子である請求項１２１記載の方法。 １２３．該異なる人が該第１の人と適合するＨＬＡ型を有する請求項１２１記載 の方法。 １２４．該患者が免疫系の異常を有する請求項１１８記載の方法。 １２５．該患者が免疫不全である請求項１１８記載の方法。 １２６．該免疫不全が遺伝的欠陥による請求項１２５記載の方法。 １２７．該遺伝的欠陥がＳＣＩＤを生ずる請求項１２６記載の方法。 １２８．該免疫不全が病原性感染による請求項１２５記載の方法。 １２９．該患者がＨＩＶに感染している請求項１２８記載の方法。 １３０．該免疫不全が切除的化学療法又は放射線療法を伴う患者の治療による請 求項１２５記載の方法。 １３１．該患者が自己免疫異常を有する請求項１２４記載の方法。 １３２．該患者が溶血性異常を有する請求項１１８記載の方法。 １３３．該患者が先天性造血系異常を有する請求項１１８記載の方法。 １３４．該患者が遺伝的欠陥を有する請求項１３３記載の方法。 １３５．該患者がファンコーニ貧血、重症サラセミア及びリソソーム貯蔵疾患か らなる群より選択される異常を有する請求項１３３記載の方法。 １３６．該患者が再生不良性貧血を有する請求項１３２記載の方法。 １３７．該患者が悪性腫瘍異常を有する請求項１１８記載の方法。 １３８．該患者が造血系悪性腫瘍を有する請求項１３７記載の方法。 １３９．該患者が白血病、リンパ腫及び骨髄腫からなる群より選択される異常を 有する請求項１３８記載の方法。 １４０．該患者が固形腫瘍を有する請求項１３７記載の方法。 １４１．該患者が乳癌、神経癌、卵巣癌及び精巣癌からなる群より選択される腫 瘍を有する請求項１４０記載の方法。 １４２．該治療が該導入細胞群の少なくとも一部のゲノム中に治療的遺伝子産物 の発現をコードする遺伝子配列を安定して導入する工程をさらに含む請求項１１ ８記載の方法。 １４３．該治療的遺伝子産物が欠陥遺伝子の欠陥部分を供給する請求項１４２記 戦の方法。 １４４．該治療的遺伝子産物が感染を起こす病原体に有毒である請求項１４２記 載の方法。 １４５．該遺伝子配列が望ましくない遺伝子産物の発現にアンチセンスであって 発現を妨げる請求項１４２記載の方法。 １４６．該原細胞群が末梢血単核細胞、骨髄細胞及び臍帯血単核細胞からなる群 より選択される請求項１１８記載の方法。 １４７．該標的細胞が分化多能幹細胞、始祖細胞、前駆細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、 単核球、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、好酸球、好塩基球及びそれ らの混合物からなる群より選択される請求項１１８記載の方法。 １４８．該培養工程がインビトロで行われる請求項１１８記載の方法。 １４９．該原細胞群が該患者から採取した細胞である請求項１１８記載の方法。 １５０．該原細胞群又は該富化細胞群の少なくとも一部を冷凍保存し使用前にそ れを解凍する工程をさらに含む請求項１１８記載の方法。[Claims] 1. At least one hematopoietic target cell fraction located in a desired hierarchy in the hematopoietic chain In a method of producing an enriched cell population:     a) obtained by treating a first cell population containing hematopoietic cells, Containing a mixture of cellular factors that were equilibrated to preferentially promote the growth of the target cells. The first cell is a balanced selection factor mixture (BSFM) having stimulatory and inhibitory effects. Let the herd produce it;     b) a second group containing hematopoietic cells for a sufficient time in the presence of a sufficient amount of the BSFM. The target cell fraction in the second cell population is cultured to preferentially proliferate the target cells. A method comprising: enriching the. 2. The method according to claim 1, wherein the target cells are pluripotent stem cells. 3. The method of claim 1, wherein the target cells are progenitor cells. 4. The method of claim 3, wherein the progenitor cells are bone marrow progenitor cells. 5. The bone marrow progenitor cells are CFU-G, CFU-M, CFU-GM, CFU-GEM M, CFU-E, CFU-MK, CFU-Eo, CFU-Ba, BFU-E and The method of claim 4 selected from the group consisting of BFU-MK. 6. The method of claim 3, wherein the progenitor cells are lymphoid progenitor cells. 7. The lymphoid progenitor cells are CFU-B, CFU-T and CFU-L. 7. The method according to claim 6, which is selected again. 8. The target cells are selected from the group consisting of B lymphocytes and progenitor cells that differentiate into them. The method according to claim 1, wherein 9. The target cell is selected from the group consisting of T lymphocytes and progenitor cells that differentiate into them. The method according to claim 1, wherein 10. The target cells are selected from the group consisting of red blood cells and progenitor cells that differentiate into them The method according to claim 1, wherein 11. The target cells are platelets, granulocytes, macrophages, basophils and eosinophils, The method according to claim 1, which is selected from the group consisting of progenitor cells that differentiate into them. 12. A cell population rich in at least two hematopoietic target cell fractions is produced. The method of the above, wherein the target cells include pluripotent stem cells and progenitor cells. 13. The target cell further comprises a bone marrow cell and a lymphoid cell. Method. 14. The method of claim 1, wherein the target cells are CD34 + cells. 15. 15. The method of claim 14, wherein the CD34 + cells are CD34 + 1in-. 16. The CD34 + cells are CD34 + CD38-CD45-DR-RHO123. 15. The method according to claim 14, which is (Dull). 17． The CD34 + cells are CD34 + DR-CD33-CD19-CD3-CD The method according to claim 14, which is 38-. 18. The target cells are CD3 + cells, CD4 + cells, CD8 + cells, CD19 + cells. Cells, CD33 + cells, CD38 + cells and DR + cells The method of claim 1. 19. The fraction enriched in the target cells in the second cultured group is at least about 5%. The method according to claim 1, which comprises a target cell. 20. The fraction enriched in target cells in the second cultured group is at least about 20% The method of claim 1, comprising target cells. 21. The fraction enriched in the target cells in the second cultured group is at least about 50%. The method of claim 1, comprising target cells. 22. The fraction enriched in target cells in the second cultured group is at least about 80%. The method of claim 1, comprising target cells. 23. The method of claim 1, wherein the first cell population comprises whole peripheral blood. 24. The method of claim 1, wherein said first cell population comprises peripheral blood mononuclear cells. 25. 25. The method of claim 24, wherein the peripheral blood mononuclear cells contain a leukocyte layer fraction. 26. 25. The method of claim 24, wherein said peripheral blood mononuclear cells comprise leukocyte export fraction. 27. 25. The method of claim 24, wherein the peripheral blood mononuclear cells comprise the FICOLL separated fraction. 28. 25. The method of claim 24, wherein the peripheral blood mononuclear cells comprise an immunoseparated fraction. 29. The first cell group from newly collected cells and cells previously cryopreserved The method of claim 1, comprising peripheral blood mononuclear cells selected from the group consisting of: 30. The method according to claim 1, wherein the first and second cell groups are heterogeneous cells. 31. The method according to claim 1, wherein the first and second cell groups are cells of the same species. 32. The method of claim 1, wherein the first cell population comprises bone marrow cells. 33. The method of claim 1, wherein the first cell population comprises cord blood cells. 34. The method of claim 1, wherein said second cell population comprises whole peripheral blood. 35. The method according to claim 1, wherein the second cell group is peripheral blood mononuclear cells. 36. 36. The method of claim 35, wherein the peripheral blood mononuclear cells comprise a leukocyte layer fraction. 37. 36. The method of claim 35, wherein said peripheral blood mononuclear cells comprise leukocyte export fraction. 38. 36. The method of claim 35, wherein the peripheral blood mononuclear cells comprise the FICOLL separated fraction. 39. 36. The method of claim 35, wherein said peripheral blood mononuclear cells comprise an immunoseparated fraction. 40. The second cell group from newly harvested cells and cells previously cryopreserved The method of claim 1, comprising peripheral blood mononuclear cells selected from the group consisting of: 41. The method of claim 1, wherein the second population of cells comprises bone marrow cells. 42. The method of claim 1, wherein the second population of cells comprises cord blood cells. 43. The method of claim 1, wherein the first and second cell populations are from the same donor. 44. The first and second cell populations are derived from a single blood sample from the donor. Item 43. The method according to Item 43. 45. The method of claim 1, wherein the first and second cell populations are from different donors. 46. The step of treating the first cell group includes converting the first cell group into the first cell group. The method of claim 1, comprising contacting with an inducer to produce FM. 47. 47. The method of claim 46, wherein the inducer comprises mitogen. 48. 48. The method of claim 47, wherein the mitogen is a plant lectin. 49. The lectins are Phaseolus vulgaris, Dorikos Biflorus, Soranu Mu Tsuberosum, Sophora Japonica, Mackulla Pomifera, Pisum Sachi Vum, Urex Europeus, Arakis Hippoea, Glicine Max, Cana Varia Enciformis, Trichicum Vrugalis, Rico Persicon S From Krentsum, Fitracka americana, and Listeria monocytogenes 49. The method of claim 48, which is derived from a plant selected from the group consisting of: 50. 49. The method of claim 48, wherein the plant lectin is PHA or ConA. 51. 48. The method of claim 47, wherein the mitogen is a T cell mitogen. 52. The T cell mitogen is Staphylococcal enterotoxin A, Gala Lactose oxidase, streptolysin O protein A, and 12-O-teto Selected from the group consisting of radicanoyphorphorbol-13-acetate (TPA) 52. The method of claim 51, wherein 53. 47. The method according to claim 46, wherein the inducer is a monoclonal antibody against T cells. Law. 54. 54. The method of claim 53, wherein said monoclonal antibody is OKT3. 55. 47. The method of claim 46, wherein the inducer is a diterpene ester. 56. The diterpene ester is 12-O-tetradecanoylphorbol-13-a. 56. The method of claim 55, which is Cate (TPA). 57. The diterpene ester is phorbol (4-O-methyl) 12-myristate. -13-acetate, phorbol (20-oxo-20-deoxo) 12-myris Tate-13-acetate, phorbol 12-monomyristate, phorbol 12, 13-didecanoate, phorbol 12,13-dibutyrate, phorbol 12,1 Selected from the group consisting of 3-dibenzoate and phorbol 12,13-diacetate. 56. The method of claim 55 selected. 58. 47. The method of claim 46, wherein the inducer is mezerein (MZN). 59. 5. The pre-treatment of the first population of cells with an enhancer followed by contact with the inducer. 6. The method according to 6. 60. The promoter is TPA, MZN, interferon α (IFN-α), and 60. The method of claim 59, selected from the group consisting of interferon β (IFN-β). Law. 61. 61. The method of claim 60, wherein the inducer is PHA and the accelerator is TPA. 62. The target cells are CD34 + and the first cell population is TPA, MZN, IF Pretreated with a promoter selected from the group consisting of N-α, IFN-β and mixtures thereof. After treatment, selected from the group consisting of PHA, OKT3, ConA and mixtures thereof. 2. The method of claim 1 wherein the inducing agent is contacted. 63. The inducer and the first cell population are combined in a growth medium and cultured for about 1 to 10 days. 47. The method of claim 46, wherein the feeding is performed. 64. 7. The growth medium is added with about 5 to 10 μg of the inducer per mL of the medium. 3. The method described in 3. 65. 2. The in vitro treatment of the first cell population to produce the BSFM. The method described. 66. 2. The first cell population is treated in vivo to produce the BSFM. How to list. 67. 64. The method of claim 63, wherein the growth medium is a defined serum-free medium. 68. The method according to claim 1, wherein the second cell group is cultured in a defined serum-free medium. 69. The second cell population in the presence of about 1 to about 10% by volume of the BSFM in the medium. 69. The method according to claim 68, which comprises culturing. 70. At least one cytokine is further added to the defined serum-free medium Item 68. The method according to Item 68. 71. The second cell population is cultured for about 5 to about 20 days and the target cells are CD34 + cells. The method of claim 1, wherein the method comprises a cell. 72. Further, a contract including the step of maintaining the viability of the culture of the enriched second cell group. The method according to claim 1. 73. The method further comprising a step of cryopreserving the culture of the enriched second cell group. The method described in 1. 74. The method according to claim 1, wherein the second cell population is cultured in vitro. 75. The method of claim 1, wherein said second cell population is cultured in vivo. 76. 76. The in vivo culture is performed by introducing the BSFM into a host. The method described. 77. Introducing the cell population into a host after contacting the second cell population with the BSFM 76. The method of claim 75, wherein said in vivo culture is performed. 78. The BSFM is IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, I L-5, IL-6, IL-8, CSF-G, CSF-GM, TNF-α, TNF Selected from the group consisting of -β, TGF-β, SCF, EPO, SCPF and BMP. The method of claim 1 comprising a mixture of at least two factors that are 79. At least one hematopoietic target cell fraction located in a desired hierarchy in the hematopoietic chain In a method of producing a cell population rich in:     a) obtained by treating a first cell population containing hematopoietic cells, Containing a mixture of cellular factors that are equilibrated to preferentially promote the proliferation of pluripotent stem cells. A balanced selection factor mixture (BSFM) having a stimulated and inhibitory effect on the first Let a group of cells produce it;     b) The composition of the BSFM is modified so as to preferentially promote the growth of the target cells. Creating a modified balanced selection factor mixture with uniquely balanced stimulatory and inhibitory effects Then     c) adding a second cell population containing hematopoietic cells in the presence of a sufficient amount of the modified BSFM. The target cells in the second cell population by preferentially proliferating the target cells by culturing for a sufficient period of time. A method comprising enriching a cell fraction. 80. At least one hematopoietic target cell fraction located in a desired hierarchy in the hematopoietic chain In a method of producing a cell population rich in:     a) obtained by treating a first cell population containing hematopoietic cells, Containing pluripotent stem cells, progenitor cells and mixtures thereof. To preferentially promote the growth of at least one intermediate target cell selected from the group A balanced selection factor mixture (BSFM) with balanced stimulatory and inhibitory effects Producing in the first cell population;     b) adding a second cell population containing hematopoietic cells in the presence of a sufficient amount of the BSFM. Culturing for a period of time to preferentially grow the intermediate target cells to produce the intermediate cells in the second cell population. Enrich the target cell fraction;     c) culturing the enriched cell population under conditions for growing the target cell to obtain the target cell A method comprising producing a proliferating cell population enriched in a fraction. 81. An increase comprising at least about 20% stem / progenitor cells expressing a CD34 + antibody In a method for producing a hematopoietic cell population from an original sample of donor peripheral blood:     a) treating a first cell population from the original sample with a T cell mitogen, Containing a mixture of cell factors obtained from a cell population of Balanced selection factor mixture with balanced stimulatory and inhibitory effects (BSFM) produced in the first cell population;     b) when the second cell population from the original sample is sufficient in the presence of a sufficient amount of the BSFM. Interculturing to preferentially increase the number of CD34 + cells by at least 500-fold, C A method comprising enriching cell populations containing at least about 20% D34 + cells . 82. A method of reconstructing a host hematopoietic system using an eclectic hematopoietic system, comprising: Transplanting proliferating hematopoietic cells enriched in selected target cells produced by the method into the host A method comprising: 83. A contract derived from the host before the transplanted cell population compromises the hematopoietic system of the host. The method according to claim 82. 84. The cell group to be transplanted is derived from a donor having a matched HLA type. 2. The method described in 2. 85. The transplanted cell population contains pluripotent stem cells, progenitor cells or mixtures thereof 83. The method of claim 82. 86. The method of claim 1, wherein the transplanted cell population comprises CD34 + cells. 87. Prior to collecting hematopoietic cells from the host, the host is circulated in the peripheral blood mononuclear cell count 83. The method of claim 82, wherein the method is treated with an agent that increases a. 88. An enriched cell population produced by the method of claim 1. 89. An enriched cell population produced by the method of claim 79. 90. Enriched cell population produced by the method of claim 80. 91. 82. An enriched cell population produced by the method of claim 81. 92. Contains pluripotent stem cell cultures containing a mixture of cell factors from hematopoietic cells. A balanced selection factor mixture (BSFM) that preferentially grows and enriches in nutrients. 93. It contains a mixture of cellular factors from hematopoietic cells, including bone marrow progenitor cells, phosphorus Preferentially culturing cells selected from the group consisting of parasite progenitor cells and mixtures thereof A balanced selection factor mixture (BSFM) that grows and enriches in. 94. It contains a mixture of cell factors obtained from hematopoietic cells, including T cells, B cells, and red cells. Blood cells, monocytes, platelets, granulocytes, macrophages, basophils, eosinophils, Culture of cells selected from the group consisting of proliferating progenitor cells and mixtures thereof A balanced selection factor mixture (BSFM) that preferentially grows and enriches. 95. 93. The BSFM. Of claim 92, wherein the pluripotent stem cells are CD34 +. 96. The T cells are selected from the group consisting of CD3 + cells, CD4 + cells and CD8 + cells. 95. The BSFM of claim 94, selected. 97. The cellular factors are IFN-γ8, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, CFS-G, CFS-GM, TNF-α, TN Selected from the group consisting of F-β, TGF-β, SCF, EPO, SCPF and BMP 93. The BSFM of claim 92, which comprises at least two factors that are: 98. Further, the red blood cells are cultured to recover the hemoglobin produced by the red blood cells. The method according to claim 10, further comprising the step of: 99. At least one hematopoietic target cell fraction located in a desired hierarchy in the hematopoietic chain 102. The method of producing a cell population rich in hematopoietic cells, wherein the hematopoietic cell population is the BSFM set of claim 92. In the presence of a sufficient amount of equilibrated selection factor mixture (BSFM) with product activators After culturing for a sufficient time, the target cells are preferentially proliferated, and the target cells in the hematopoietic cell population are A method comprising the step of: enriching a selective cell fraction. 100. At least one hematopoietic target cell fraction located in a desired hierarchy in the hematopoietic chain Of hematopoietic cells in the method for producing abundant cell populations The target cells are preferentially enriched by culturing in the presence of the progeny mixture (BSFM) for a sufficient time. And enriching the target cell fraction in the cell population, the BSFM comprising A cell having a stimulatory and inhibitory effect balanced to preferentially promote the proliferation of the target cell. Of the first hematopoietic cell population with a mitogen containing a mixture of blast factors. A mixture of cellular factors that is treated to preferentially grow the target cells into the first population of cells A person characterized by having an active factor of a composition prepared by producing Law. 101. Target cell fraction of a given cell type by selectively growing animal cells in primary culture In the way to enrich the minutes:     a) treating the first primary cell population to obtain the target cell population obtained from the first cell population. Of cellular factors with stimulatory and inhibitory effects balanced to preferentially promote cell proliferation A balanced selection factor mixture (BSFM) containing a mixture was produced in the first population of cells. The step of:     b) culturing the second primary cell population in the presence of a sufficient amount of BSFM for a sufficient time To preferentially grow the target cells to obtain the target cell fraction in the second primary culture cell group. A method comprising the step of enriching a component. 102. The first primary culture animal cells are hematopoietic cells, hepatocytes, pancreatic cells, skin cells. Cells, brain cells, nerve cells, lymph node cells, thymocytes, spleen cells, heart cells, bone marrow cells Cells, osteocytes, chondrocytes, endothelial cells, kidney cells, muscle cells and epithelial cells. 102. The method of claim 101, which is reselected. 103. The step of treating the first primary cultured cell population comprises treating the first primary culture population with the first primary cell population. 102. The method of claim 101, comprising contacting with a mitogen for the cell population. . 104. 102. The method of claim 101, wherein said treating and culturing step is performed in vitro. 105. 102. The method of claim 101, wherein said treating step is performed in vivo. 106. 102. The method of claim 101, wherein said culturing step is performed in vivo. 107. 107. The method of claim 106, wherein said in vivo culture comprises tissue regeneration. 108. In the method of creating a human stem cell bank,     a) collecting a hematopoietic cell sample from a first donor of known HLA type;     b) Proliferating culture of the hematopoietic cells enriched in pluripotent stem cells by the method of claim 2. Preparing;     c) cryopreserving the growth culture; and     d) Repeat steps a) to c) for each individual donor of each known HLA type. A method comprising the steps of: 109. A method for performing allogeneic stem cell transplantation, which is suitable for HLA type. Stem cells obtained by thawing a cryopreserved growth culture produced by the method of No. 08 A method comprising introducing a group into a patient. 110. The amount of health needed for use by patients who may need stem cell transplant in the future In a method to ensure availability of various human stem cells:     a) Hematopoiesis enriched in pluripotent stem cells by the method of claim 2 while the patient is healthy Preparing a growth culture of lineage cells; and     b) comprising cryopreserving the enriched culture for future use by the patient. A method characterized by: 111. Removal of any abnormal or diseased hematopoietic cells from the population prior to the transplant 83. The method according to claim 82. 112. 102. A method of repairing damaged human tissue according to claim 101. Transplant prepared proliferating primary culture cells of the same type as the damaged tissue into a patient A method comprising the steps of: 113. A method of regenerating human organs, prepared by the method of claim 101. It also comprises the introduction of one or more primary cell populations for growth into a suitable structural substrate. And a method characterized by: 114. In the non-invasive method for determining fetal genetic abnormalities:     a) A sample of peripheral blood containing hematopoietic cells containing circulating fetal cells is collected from a pregnant woman. Process of taking;     b) The hematopoietic cell population is expanded and the fetal and maternal cell fractions are obtained by the method of claim 1. Enrichment process;     c) separating the fetal cells from the maternal cells; and     d) A method characterized by comprising a step of performing a genetic analysis on the fetal cells Law. 115. In a method of providing a patient with prophylactic treatment of hematopoietic cells:     a) A proliferative hematopoietic cell population enriched in target cells from the viewpoint of prevention is obtained by the method of claim 1. Preparing; and     b) comprising the step of introducing a prophylactically effective amount of said cell population into said patient. How to collect. 116. 116. The method of claim 115, wherein the target cells from a prophylactic perspective include T cells. 117. A contract wherein the T cells are selected from the group consisting of CD4 + cells and CD8 + cells. The method according to claim 116. 118. In the method of treating a patient:     a) a step of preparing a progenitor cell group containing hematopoietic cells;     b) treating at least a part of the original cell population with a second cell population containing hematopoietic cells A balanced selection factor mixture (BSF) containing a mixture of cellular factors prepared by M) in the presence of sufficient time to locate the desired hierarchy in the hematopoietic chain. And a balanced stimulatory and inhibitory factor to preferentially promote the growth of one target cell And preferentially proliferate the target cells to enrich the target cell fraction in the progenitor cell population Causing the second cell population to produce an amount of the BSFM sufficient to:     c) comprising the step of introducing at least a portion of the enriched cell population into the patient. How to characterize. 119. 12. The original cell population and the second cell population are from the same patient. 8. The method according to 8. 120. 119. The second population of cells is part of a population of progenitor cells from the same patient. The method described. 121. 118. The method of claim 118, wherein said second cell population is from a different person. 122. 122. The method of claim 121, wherein the different person is a twin with the first person. 123. 123. The different person has an HLA type compatible with the first person. the method of. 124. 118. The method of claim 118, wherein said patient has an abnormality of the immune system. 125. 119. The method of claim 118, wherein said patient is immunocompromised. 126. 126. The method of claim 125, wherein said immunodeficiency is due to a genetic defect. 127. 127. The method of claim 126, wherein said genetic defect results in SCID. 128. 126. The method of claim 125, wherein said immunodeficiency is due to a pathogenic infection. 129. 129. The method of claim 128, wherein said patient is infected with HIV. 130. Contract by treatment of a patient whose immunodeficiency is associated with ablative chemotherapy or radiation therapy The method according to claim 125. 131. 125. The method of claim 124, wherein said patient has an autoimmune disorder. 132. 119. The method of claim 118, wherein said patient has a hemolytic abnormality. 133. 118. The method of claim 118, wherein said patient has a congenital hematopoietic abnormality. 134. 138. The method of claim 133, wherein said patient has a genetic defect. 135. Whether the patient is Fanconi anemia, severe thalassemia and lysosomal storage disease 138. The method of claim 133, having an abnormality selected from the group consisting of: 136. 133. The method of claim 132, wherein said patient has aplastic anemia. 137. 118. The method of claim 118, wherein the patient has a malignant tumor abnormality. 138. 138. The method of claim 137, wherein said patient has a hematopoietic malignancy. 139. The patient has an abnormality selected from the group consisting of leukemia, lymphoma and myeloma 138. The method of claim 138, having. 140. 138. The method of claim 137, wherein said patient has a solid tumor. 141. Tumor selected from the group consisting of breast cancer, nerve cancer, ovarian cancer and testicular cancer 141. The method of claim 140, which has a ulcer. 142. The treatment is a therapeutic gene product in the genome of at least part of the introduced cell population 12. The method further comprising the step of stably introducing a gene sequence encoding the expression of Escherichia coli. 8. The method according to 8. 143. 143. The method of claim 142, wherein the therapeutic gene product supplies the defective portion of the defective gene. Way of war. 144. 143. The method of claim 142, wherein said therapeutic gene product is toxic to the pathogen causing the infection. How to list. 145. The gene sequence is antisense to the expression of an unwanted gene product, 143. The method of claim 142, which prevents expression. 146. The group of said progenitor cells consists of peripheral blood mononuclear cells, bone marrow cells and cord blood mononuclear cells 118. The method of claim 118 selected from: 147. The target cells are pluripotent stem cells, progenitor cells, progenitor cells, B cells, T cells, Mononuclear cells, granulocytes, erythrocytes, platelets, macrophages, eosinophils, basophils and their 118. The method of claim 118, selected from the group consisting of these mixtures. 148. 118. The method of claim 118, wherein said culturing step is performed in vitro. 149. 118. The method of claim 118, wherein the progenitor cell population is cells harvested from the patient. 150. At least a part of the original cell population or the enriched cell population is frozen and stored before use. 118. The method of claim 118, further comprising the step of thawing it.
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