JPH08511165A

JPH08511165A - Mengovirus as a vector for expression of foreign polypeptides

Info

Publication number: JPH08511165A
Application number: JP7501922A
Authority: JP
Inventors: アルトメーヤー，ラルフ; ヴァン・デル・ウエルフ，シルビー; ジラール，マルク; パーメンバーク，アン・シー
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1993-06-03
Filing date: 1994-06-03
Publication date: 1996-11-26
Also published as: WO1994029472A3; WO1994029472A2; EP0702724A1; CA2164297A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、非相同アミノ酸配列を発現する弱毒化組換えメンゴウイルスに関する。組換えメンゴウイルスは、種々のウイルス病原体のエピトープを含むアミノ酸配列を発現することができ、これらの病原体に対するヒト及び動物のための生ワクチンとして有用である。結果として、本発明は、これらの組換えメンゴウイルス又はそのタンパク質を含むワクチン、組換えメンゴウイルスに感染した細胞、組換えメンゴウイルスに由来する核酸、及び免疫応答を誘発する方法にも関する。本発明は、ＨＩＶ−ＩのＭＮ分離株のｇｐ１２０のアミノ酸２９９〜４６６を含む組換えメンゴウイルスによって例示される。 (57) [Summary] The present invention relates to attenuated recombinant Mengovirus expressing heterologous amino acid sequences. Recombinant Mengovirus is capable of expressing amino acid sequences containing epitopes of various viral pathogens and is useful as a live vaccine for humans and animals against these pathogens. As a result, the invention also relates to vaccines containing these recombinant Mengoviruses or proteins thereof, cells infected with recombinant Mengoviruses, nucleic acids derived from recombinant Mengoviruses and methods of eliciting an immune response. The present invention is exemplified by a recombinant Mengovirus comprising amino acids 299-466 of gp120 of an HIV-I MN isolate.

Description

【発明の詳細な説明】外来性ポリペプチドの発現のためのベクターとしてのメンゴウイルス関連出願との前後参照本出願は、１９９３年６月３日に出願された米国出願番号第０８／０９０，５３１号の部分継続出願である。この出願の開示全体が、依拠され、参照によりここに明白に包含される。発明の背景本発明は、免疫学的及び非免疫学的目的のための１つ以上の外来性ポリペプチドをコードする核酸を含有するよう改変されたメンゴウイルス（mengoviruses）に関する。本発明の改変メンゴウイルスは、組換えウイルス及び／又はキメラウイルスであることができる。メンゴウイルスは、カルディオウイルス（cardiovirus）属に属するピコルナウイルスの一種である。メンゴウイルスの自然宿主はマウスであり、感染により急性マウス髄膜脳炎をもたらすが、メンゴウイルスは広い宿主範囲を有する。マウスに加えて、メンゴウイルスは、ブタ、ゾウを含む種々の動物種及びヒトを含む霊長類に感染することもできる。ピコルナウイルスは、病原性ウイルスの科である。ピコルナウイルスの例としては、一般的な風邪の原因となるライノウイルス、手足口病（foot and mouse d isease）ウイルス（ＦＭＤＶ）、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、及びメンゴウイルス及び脳心筋炎ウイルスを含むマウスのカルディオウイルスが挙げられる。ピコルナウイルスは、小さい正鎖（＋）センスＲＮＡゲノムを含むエンベロープを欠いたキャプシドを有する。全てのピコルナウイルスのキャプシドは、５：３：２の正２０面体対称を有する６０サブユニットのタンパク質の殻から構成され、各サブユニットは４つの同一でないポリペプチド鎖（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４）を含んでいる。この殻は、単一コピーの正鎖センスＲＮＡゲノムを包んでいる。メンゴウイルスの三次元構造は、Ｘ線結晶解析により原子の解像度で決定されている。Luo et al.，Science 235:182-191（1987）。メンゴウイルスのウイルスゲノムは、長さ約７，８００ヌクレオチドの正鎖ＲＮＡ分子である。ゲノムは、その３′末端でポリアデニル化されており、その５ ′末端で共有結合により小さいウイルスポリペプチドＶＰｇに連結している。メンゴウイルスゲノムは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子の形態でクローニングされている。ゲノムは、ウイルスのポリタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含む。ウイルスタンパク質は、ポリタンパク質のＮ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３の順でポリタンパク質内に位置している。ポリタンパク質は、一連の切断事象によりプロセシングされ、全ての構造及び非構造タンパク質を与える。このプロセシングの詳細は、Ann C．Palmenbergにより、「ピコルナウイルスポリタンパク質のタンパク分解的プロセシング（Proteolytic Processing ofPicorna viral Polyprotein ）」、44 Ann．Rev．Microbiol．603 （1990）に論評されており、この文献は参照によりここに包含されるものとする。Ｌは、カルディオウイルス及びアフトウイルスに存在するリーダーポリペプチドを表す。Ｐ１は、構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４（これらはそれぞれ１Ｄ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ａとも特定される）の前駆体である。Ｐ２及びＰ３は、ウイルスＲＮＡの複製及びポリタンパク質のプロセシングに必要な非構造ウイルスタンパク質の前駆体である。このウイルスＲＮＡは、感染性である。これは、許容細胞へ導入されると、それが、感染性ウイルスを再生する完全なウイルス増殖サイクルを開始することができる、ということである。完全長のウイルスｃＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼによりインビトロ（invitro）で合成されたＲＮＡ転写物も、感染性であることが示された。Duke et al.，J．Viol.，63：1822（1989）を参照されたい。メンゴウイルス及び脳心筋炎ウイルスのようなマウスのカルディオウイルス、ならびにアフトウイルスは、その５′非コーディング配列内に長いホモポリマー状ポリ（Ｃ）トラクトが存在することにより、他の正鎖ＲＮＡウイルスから区別することができる。その長さ（一般に６０〜３５０塩基である）、及びしばしばこのホモポリマー状配列を中断する配列の不連続性（例えばウリジン残基）は、天然のウイルス分離株を特徴づけるために役立ってきたが、このポリ（Ｃ）領域の正確な生物学的機能は明らかではない。メンゴウイルスポリ（Ｃ）トラクトの、ｃＤＮＡ媒介性の短縮は、マウスにおけるこのウイルスの病原性を弱毒化する。Duke et al.，Nature343：474（1990）を参照されたい。メンゴウイルスの弱毒株であるｖＭ１６は、Duke et al.，「５′非コーディングポリ（Ｃ）トラクトの遺伝子工学によるメンゴウイルスの弱毒化（Attenuat ion of Mengovirus through Genetic Engineering of the 5'Non-coding Poly（ C）Tract）」、Nature343：474（1990）（これは参照によりここに包含されるものとする）、及びDuke及びPalmenberg，「短い別個のポリ（Ｃ）トラクトを含む感染性カルディオウイルスＲＮＡのクローニング及び合成（Cloning and Synthe sis of Infectious Cardiovirus RNAs Containing Short，Discrete Poly（C）T racts）」、J．Virol.，63：1822（1989）（これも参照によりここに包含されるものとする）により記載されている。この弱毒株は、そのゲノムの５′非コーディング領域のポリ（Ｃ）トラクト中に欠失を有している。この弱毒株は、毒性（ virulent）メンゴウイルス及び脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を用いる抗原投与からマウスを保護する。組換えＤＮＡ技術の進歩は、生の組換えワクチンの開発を可能にしている。ヒト又は動物の病原体のポリペプチド及び／又はエピトープもしくは抗原を包含させることができ、ワクチンに用いることができる改変生ウイルスを生じうる好適なベクターが、当業界で必要とされている。発明の概要本発明は、特に、メンゴウイルスの構造又は非構造タンパクが非相同アミノ酸配列を含む、生存可能な改変弱毒メンゴウイルス、上記生存可能な改変メンゴウイルスの融合タンパク、上記生存可能な改変メンゴウイルスに感染した許容細胞、上記改変メンゴウイルスの全長配列を含む組換え核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）、ワクチン、及び免疫応答を誘発する方法を提供することにより、当業界の上記の要望を満足することを助けるものである。本発明は、中でも、弱毒株であり、非相同ヌクレオチド配列を含む、生存可能な改変メンゴウイルスに関する。本発明のある態様は、弱毒株であり、非相同ペプチド又はタンパク質をコードする非相同ヌクレオチド配列を含む、生存可能な改変メンゴウイルスに関する。さらなる態様においては、生存可能な改変メンゴウイルスは、メンゴウイルスのゲノムの５′非コーディング領域のポリ（Ｃ）トラクトに突然変異又は欠失を有する弱毒株である。特に、本発明のある態様は、メンゴウイルスのゲノムの５′非コーディグ領域のポリ（Ｃ）トラクトに欠失を有する弱毒株であり、かつ、この組換えメンゴウイルスのリーダーポリペプチドが完全長のものであって非相同アミノ酸を含む、生存可能な組換えメンゴウイルスに関する。本発明のある特定の態様においては、組換えメンゴウイルスは、リーダーポリペプチドのアミノ酸６の後に挿入された、ＨＩＶ−ＩのＭＮ分離株のｇｐ１２０のアミノ酸２９９〜４６６を含む。本発明の別の態様は、非相同アミノ酸配列が挿入されている、弱毒メンゴウイルス株の全長リーダーポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。さらなる態様においては、本発明は、本発明の組換えメンゴウイルスに感染した許容細胞に関する。特定の態様においては、許容細胞は、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ２１、及びＰ８１５細胞である。本発明のさらなる態様は、メンゴウイルス核酸配列及び非相同核酸配列を含む組換え核酸分子（ＲＮＡ又はＤＮＡ）に関する。好ましくは、非相同配列は、全長リーダーポリペプチドをコードするメンゴウイルス配列内に挿入されている。より好ましくは、組換え核酸分子は、全長の弱毒メンゴウイルス配列、及び全長リーダーポリペプチド配列内に挿入された非相同配列を含む。さらに別の態様においては、本発明は、本発明の組換えメンゴウイルスのウイルスゲノムに関する。本発明の別の態様は、本発明の組換えメンゴウイルスを含むワクチンに関する。特定の態様においては、ワクチンは、医薬的に許容可能な担体と混合された組換えメンゴウイルスを含む。本発明のさらなる態様は、免疫応答を誘発しようとするヒト又は動物のような生物に、非経口又は経口ルートで本発明の組換えメンゴウイルスを投与することを含む、免疫応答の誘発方法に関する。本発明は、免疫原性組成物にも関する。このような組成物は、医薬的に許容可能な担体と混合された組換えメンゴウイルスを含む。本発明のさらなる態様は、非相同アミノ酸配列とリーダーポリペプチドとの間にプロテアーゼ切断部位をさらに含む、本発明の生存可能な組換えメンゴウイルスに関する。本発明の特定の態様においては、プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼ３Ｃ切断部位である。さらに別の態様においては、本発明は、本発明の生存可能な組換えメンゴウイルスに感染した許容細胞に関し、この許容細胞は、ネイティブな形態で非相同アミノ酸配列を発現する。図面の簡単な説明図１は、メンゴウイルスゲノムの編成の模式図である。図２は、いくつかの制限部位、Ｔ７プロモーターの位置（矢印）、ならびにｐ BluescribeＭ１３（＋）から由来する配列（ｐＢＳと表す、細線）及びメンゴウイルスから由来するｃＤＮＡ配列（太線）を描いた、ｐＭ１６のプラスミド地図である。図３は、ｐ０５１５６Ｓのプラスミド地図である。図４は、ｐＭＲＡ−１のプラスミド地図である。太線はメンゴウイルスからのＤＮＡ配列を表す。細線はｐBluescribeＭ１３（＋）からの配列を表す。矢印はＴ７プロモーターを表す。種々の制限部位が同定されている。ヌクレオチドの番号付けは、組換えプラスミドにおけるヌクレオチドの位置を表す。図５は、ｐＭＲＡ−２のプラスミド地図である。太線はメンゴウイルスから由来するＤＮＡ配列を表す。細線はｐBluescribeＭ１３（＋）からの配列を表す。矢印はＴ７プロモーターを表す。太い斜線はΔｇｐ１２０−ＶＣＮの配列を表す。種々の制限部位が同定されている。ヌクレオチドの番号付けは、組換えプラスミドにおけるヌクレオチドの位置を表す。図６は、ｐＭＲＡ−３のプラスミド地図である。太線はメンゴウイルスから由来するＤＮＡ配列を表す。細線はｐBluescribeＭ１３（＋）からの配列を表す。矢印はＴ７プロモーターを表す。太い斜線はΔｇｐ１２０−ＶＣＮの配列を表す。種々の制限部位が同定されている。ヌクレオチドの番号付けは、組換えプラスミドにおけるヌクレオチドの位置を表す。図７は、ｖＭＬＮ４５０遺伝子の編成及び組換えＬタンパクの配列のダイアグラムである。メンゴウイルス由来のアミノ酸（ａａ）は平常文字で書かれ、ＨＩＶｇｐ１２０由来のアミノ酸は太字で書かれている。リンカー由来のアミノ酸に下線を付してある。図８は、プラークアッセイの結果を示している。図８ａはｖＭ１６のプラーク表現型であり、図８ｂは７２時間後に染色されたｖＭＬＮ４５０のプラーク表現型である。図９は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示している。ＲＴ−ＰＣＲは、レーンａ〜ｅについてはオリゴヌクレオチド対Ｍ−ＶＤＷ−１／３′ＶＣＮを用い、レーンｇ〜ｋについてはオリゴヌクレオチド対Ｍ−ＶＤＷ−１／Ｍ−１０９４を用いて行った。反応に用いた鋳型は、ａ）ｖＭＬＮ４５０ＲＮＡ、ｂ）ｖＭ１６ＲＮＡ、ｃ）陰性対照、ｄ）ｐＭ１６、ｅ）ｐＭＲＡ−３、ｇ）ｖＭＬＮ４５０ＲＮＡ、ｈ）ｖＭ１６ＲＮＡ、ｉ）陰性対照、ｊ）ｐＭ１６、及びｋ）ｐＭＲＡ−３であった。レーンｆは、ＨｉｎｄIIIで切断したバクテリオファージラムダＤＮＡを含む。図１０は、ＤＮＡレベルでのΔｇｐ１２０−ＶＣＮ領域の配列（正鎖）及びｖＭＬＮ４５０ＲＮＡ由来のＰＣＲ産物をシークエンシング（配列決定）するために用いたオリゴヌクレオチドを描いている。四角で囲った配列はＮｃｏＩ制限部位である。図１１は、ａ）偽感染ＨｅＬａ細胞、ｃ）ｖＭ１６感染ＨｅＬａ細胞、ｅ）ｖＭＬＮ４５０感染ＨｅＬａ細胞の細胞質抽出物の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。ＭＡｂ５０．１を用いた細胞質抽出物の免疫沈降物を、偽感染細胞についてはレーンｂ）、ｖＭ１６感染細胞についてはレーンｄ）、そしてｖＭＬＮ４５０感染細胞についてはレーンｆ）に示す。図１２ａは、抗原としてｇｐ１６０ＭＮ−ＬＡＩを用いた、ｖＭＬＮ４５０、ｖＭ１６で感染させたマウス及びウイルス非含有対照から得られた血清についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を描いている。図１２ｂは、抗原としてｇｐ１６０ＬＡＩを用いた、ｖＭＬＮ４５０、ｖＭ１６で感染させたＢａ１ｂ／ｃマウス及びウイルス非含有対照から得られた血清についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を描いている。ｇｐ１６０ＬＡＩを用いての初回免疫の２週間後（ぬりつぶした棒：左）及び第２回目の免疫の２週間後（点彩した棒：右）のＢａ１ｂ／ｃ血清の反応性を示す。力価（タイター）は、４９０nmでＯＤ値１を与える血清希釈率の逆数の値として与えられている。図１２ｃは、抗原としてｇｐ１６０ＬＡＩを用いた、ｖＭＬＮ４５０、ｖＭ１６で感染させたＣＢＡマウス及びウイルス非含有対照から得られた血清についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を描いている。ｇｐ１６０ＬＡＩを用いての初回免疫の２週間後（ぬりつぶした棒：左）及び第２回目の免疫の２週間後（点彩した棒：右）のＣＢＡ血清の反応性を示す。力価（タイター）は、４９０nmでＯＤ値１を与える血清希釈率の逆数の値として与えられている。図１２ｄは、抗原としてｇｐ１６０ＬＡＩを用いた、ｖＭＬＮ４５０、ｖＭ１６で感染させたカニクイザル（Cynomolgus monkey）及びウイルス非含有対照から得られた血清についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を描いている。ｇｐ１６０ＬＡＩとの、カニクイザルの免疫前血清（ぬりつぶした棒：左）及び免疫後４週間の血清（点彩した棒：右）の反応性を示す。力価は、４９０ nmでＯＤ値１を与える血清希釈度の逆数値として与えられている。図１３は、Ｌ−ＶＰ４接合部（ジャンクション）でのプロテアーゼ３Ｃ切断部位を示す、メンゴウイルスポリタンパク質のダイアグラムである。図１４は、ｖＭＱＧ−１及びｖＭ１６についてのΔｇｐ１２０−ＱＧ−Ｌ接合部のアミノ酸配列を示す、組換えメンゴウイルスｖＭＱＧ−１のポリタンパク質のダイアグラムである。図１５は、ｐＭＲＡ−５を構築するために用いた手順の流れ図である。図１６は、ｐＭ１６の核酸配列を描いている。ウイルス配列は、Ｕを用いて（すなわち、ＲＮＡ配列として）示し、プラスミド配列は、Ｔを用いて（すなわち、ＤＮＡ配列として）示してある。ｐＭ１６は、ＤＮＡプラスミドである。図１７は、ｐＭ１６−１の核酸配列を描いている。この配列の最初の塩基が、最初のウイルスの塩基である。ウイルス配列は、Ｕを用いて（すなわち、ＲＮＡ配列として）示し、プラスミド配列は、Ｔを用いて（すなわち、ＤＮＡ配列として）示してある。ｐＭ１６−１は、ＤＮＡプラスミドである。図１８は、ｐＭ１６とｐＭ１６−１の配列の比較である。図１９は、ｐＭＬＮ４５０の構築を描いている。ＨＩＶ−ＩＭＮｇｐ１２０のアミノ酸２９９〜４４５をコードするｃＤＮＡ配列は、ウイルスポリタンパク質のオープンリーディングフレームの始まりでｐＭ１６ｃＤＮＡのＬポリペプチドのアミノ酸５と６との間に挿入されている（ａ）。結果として得られる融合タンパク質Δｇｐ１２０−Ｌの配列を（ｂ）に示す。リーダーアミノ酸は通常のタイプで、ｇｐ１２０アミノ酸は太字で表す。ＤＮＡリンカーによりコードされる付加的な残基に下線を付してある。図２０は、ｖＭ１６（ａ）及びｖＭＬＮ４５０（ｂ）ウイルスのプラーク表現型を示している。ＨｅＬａ細胞単層培養上に形成された親ウイルス、及び組換えウイルスのプラークを、３７℃で７２時間インキュベートした後に染色した。各ウェルの直径は３．５cmである。図２１は、ｖＭＬＮ４５０感染細胞におけるΔｇｐ１２０−Ｌの発現を示している。偽感染（レーンＡ、Ｂ）、ｖＭ１６感染（レーンＣ、Ｄ）及びｖＭＬＮ４５０（レーンＥ、Ｆ）感染ＨｅＬａ細胞を、³⁵Ｓ−メチオニンで標識した。細胞質抽出物を、感染後７時間の時点で調製し、既に記載されているように（１２）１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。いくつかの試料（レーンＢ、Ｄ、Ｆ）は、ゲルに載せる前に２μg/mlのＭＡｂ５０．１で免疫沈降させた（１３）。メンゴウイルスマーカータンパク質の移動を示す。図２２は、ｐＬＣＭＧ４の構築を描いている。図２２ａは、ｐＭＣＳのタンパク質配列の一部及び対応するＤＮＡ配列である。図２２ｂは、ｐＬＣＭＧ４のタンパク質配列の一部及び対応するＤＮＡ配列である。オープンリーディングフレームの始まりにあるリーダーペプチド領域の配列を表す。制限部位を示す。ＬＣＭＮＮＰ配列をコードするｃＤＮＡ配列（四角で囲った配列）は、プラスミドｐＭＣＳのＳｎａＢＩ部位及びＮｈｅＩ部位の間に挿入されている。下線を付した配列は、ＤＮＡリンカーから生じている。図２３は、ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションにより生じるｖＭ１６及びｖＬＣＭＧ４ウイルスのプラーク表現型を示している。細胞は、３．５cmウェル中で生育させ、４８時間後に染めた。図２４は、制限部位ＸｈｏＩ、ＳｎａＢＩ、及びＮｈｅＩを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを描いている。図２５は、ｐＭ１６のＬ−コーディング領域のｃＤＮＡ配列及びタンパク質配列を描いている。ＸｈｏＩ部位の位置が示されている。図２６は、ＰＭＣＳのＬ−コーディング領域を描いている。新しい制限部位を示す。ＤＮＡリンカーから生じる非メンゴウイルスアミノ酸を四角で囲んである。図２７は、細胞質抽出物及び放射性免疫沈降物を示している。レーン１は、モノクローナル抗体ＲＶ２−２２Ｃ５を用いた、ｖＭＧ−２４感染細胞質抽出物の放射性免疫沈降物である。レーン２は、ｖＭＧ−５−２４感染細胞の細胞質抽出物である。レーン３は、ｖＭ１６感染細胞の放射性免疫沈降物（ｍＡｂＲＶ２ −２２Ｃ５）である。レーン４は、ｖＭ１６感染細胞の細胞質抽出物である。レーン５は、偽感染細胞の放射性免疫沈降物（ｍＡｂＲＶ２−２２Ｃ５）である。レーン６は、偽感染細胞の細胞質抽出物である。発明の詳細な説明本書で記載され、特許請求される発明がより充分に理解されうるように、本発明の態様の詳細な説明を以下に与える。本説明においては、当業界の種々の用語が用いられる。これらの用語は、その通常の、よく認知された意味において一般に用いられている。本説明を通じて用いられる種々の用語を、以下で定義する。本書で用いる場合、「組換えウイルス」という用語は、遺伝的に改変されたウイルスをいう。組換えウイルスは、少なくとも１つの他の生物からのタンパク質又は核酸を含みうる。したがって、組換えウイルスは、非構造非相同ポリペプチドを発現するウイルス、ならびに構造要素として非相同ポリペプチドを含むウイルスを指すことができる。さらに、組換えウイルスは、キメラウイルスであることができる。本書で用いる場合、「弱毒株」という用語は、低下した疾患生成能及び／又は病原性を有する株をいう。本書で用いる場合、「ゲノム」という用語は、ある１つの種の全ての遺伝子を含む核酸をいう。ゲノムを作り上げている核酸は、その種の性質によって、ＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。例えば、ピコルナウイルス又は他のＲＮＡウイルスのゲノムは、ＲＮＡで構成されているが、一方、ヒトのゲノムはＤＮＡで構成されている。本書で用いる場合、「非相同（性）」という用語は、ある与えられた種に天然には見出されない物質をいう。例えば、特定のウイルスを指して用いる場合の「非相同アミノ酸配列」という用語は、そのウイルス、例えばそのウイルスのタンパク質に見出されないアミノ酸配列を指す。本書で用いる場合、「ヌクレオチド又は核酸配列」という用語は、隣り合うヌクレオチドの３′及び５′炭素間の共有結合により連結されたヌクレオチドの線状の連なりをいう。ヌクレオチド又は核酸配列は、ＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列であってよい。本書で用いる場合、「アミノ酸配列」という用語は、共有結合により連結されたアミノ酸の線状の連なりをいう。本書で用いる場合、「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、１つのアミノ酸配列が通常は天然にそれ以外のアミノ酸配列と一緒には見出されないものをいう。例えば、メンゴウイルス融合タンパク質は、非相同アミノ酸配列に共有結合により連結されたメンゴウイルスアミノ酸配列を含むことができる。本書で用いる場合、「エピトープ」という用語は、タンパク質におけるアミノ酸のコンフィギュレーション（形状）であって、そのアミノ酸のコンフィギュレーションが免疫応答と関連しているものをいう。例えば、エピトープは、抗体により認識され、免疫応答を誘発しうる抗原性モチーフにより定義されることができる。エピトープは、アミノ酸配列の線状配列であってよいが、それに限定されない。本書で用いる場合、「許容細胞」という用語は、ウイルスによって生産的に感染されうる細胞をいう。したがって、メンゴウイルスの許容細胞は、メンゴウイルスにより感染されうる細胞である。本書で用いる場合、「組換え核酸分子」という用語は、インビトロの操作によって一緒に配置された少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドヌクレオチド配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）又はそのクローンをいう。本書で用いる場合、「ｃＤＮＡ」という用語は、相補的ＤＮＡをいう。ゲノムがＤＮＡで構成されている生物の場合、ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡ又はそのフラグメントに対して相補的である。ゲノムがＲＮＡで構成されている生物の場合には、ｃＤＮＡは、その生物のゲノム又はそのフラグメントに対して相補的である。本書で用いる場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸の線状の連なりをいう。「ポリペプチド」という用語はタンパク質を含むが、それに限定されない。本書で用いる場合、「発現」という用語は、構造遺伝子からポリペプチドが産生される課程をいう。本書で用いる場合、「ポリタンパク質」という用語は、２つ以上のタンパク質を含む、共有結合により連結されたアミノ酸の線状の連なりをいう。ある場合には、ポリタンパク質を構成しているタンパク質は、特異的プロテアーゼによる内的タンパク分解的切断により遊離されうる。メンゴウイルスのゲノム編成を図１に示す。この図は、ゲノムへのウイルスポリペプチドのマッピング、ならびにウイルスの成熟成分へのポリタンパク質のプロセシングにおける種々の中間体を描いている。ポリ（Ｃ）領域も、図１において確認される。Duke et al.（前出）、及びDuk e及びPalmenberg（前出）により記載されているように、この領域における欠失は、弱毒表現型に関連している。結果として、ポリ（Ｃ）領域に突然変異（例えば置換及び欠失）を有するメンゴウイルスのゲノムのｃＤＮＡを含むプラスミドは、弱毒表現型を呈する組換えメンゴウイルスに関する本発明の種々の態様の構築のための、メンゴウイルスＤＮＡの供給源として用いることができる。本発明の好ましい態様においては、メンゴウイルス核酸の好適な供給源は、プラスミドｐＭ１６である。ｐＭ１６は、フランスのパリにあるthe Collection N ationale de Cultures de Micro-organismes（ＣＮＣＭ）に、受託番号Ｉ−１３１３として１９９３年６月２日付で寄託されている。ｐＭ１６の部分的プラスミド地図を図２に示し、ｐＭ１６の配列を図１６に示す。このプラスミドは、突然変異したポリ（Ｃ）トラクト、Ｃ₁₃ＵＣ₁₀をコードするが、それ以外は、二本鎖複製型ベクターｐBluescribeＭ１３（＋）のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限部位の間に挿入されたメンゴウイルスの全長ゲノムに相当するＤＮＡ配列を含む。結果として、このプラスミドは、Ｔ７プロモーターの下流にメンゴウイルスｃＤＮＡを含んでいる。本発明の他の態様においては、メンゴウイルス核酸の好適な供給源はｐＭ１６−１である。ｐＭ１６−１もまた、１９９３年６月２日に受託番号Ｉ−１３１２としてＣＮＣＭに寄託されている。ｐＭ１６−１の配列を図１７に示す。本発明の他の態様においては、他のプラスミドをメンゴウイルス核酸の供給源として用いてもよい。例えば、Ｃ₈ポリ（Ｃ）トラクトをコードするｐＭ１８、又はＣ₁₂ポリ（Ｃ）トラクトをコードするｐＭ１９、又はポリ（Ｃ）トラクトの完全な欠失を有するプラスミドを用いることができる。弱毒表現型が必要とされない場合には、野生型のポリ（Ｃ）トラクトであるＣ₅₀ＵＣ₁₀をコードするｐＭ_wt を用いることができる。これらのプラスミドの各々がポリ（Ｃ）トラクトの外にメンゴウイルスゲノムに相補的なＤＮＡを含むので、種々のインビトロ操作によって、あるメンゴウイルスプラスミド（又は野生型メンゴウイルスＤＮＡ）から別のプラスミドを構築することができる。１つの可能性は、あるプラスミドからのポリ（Ｃ）トラクトを含むＥｃｏＲＶ−ＡｖｒII制限フラグメントを、構築すべきプラスミドの適切なＥｃｏＲＶ−ＡｖｒIIフラグメントで置換することである。ＤＮＡ形態の弱毒メンゴウイルスゲノムをコードするベクターがいったん得られると、組換えメンゴウイルスにより発現されるべきアミノ酸配列をコードする非相同ヌクレオチド配列を、そのメンゴウイルスゲノムのコーディング領域内に挿入することができる。本発明の特定の態様においては、その核酸配列は非相同抗原又はエピトープをコードする。非相同ヌクレオチド配列を挿入する部位は、制限部位であることができる。本発明の特定の態様においては、この部位は、メンゴウイルスゲノムのヌクレオチド７２９にわたるＮｃｏＩ制限部位である。非相同ヌクレオチド配列を制限部位に挿入する場合、メンゴウイルスＤＮＡベクターを適切な酵素で制限消化し、ＤＮＡベクターを切断する。次いで、非相同ＤＮＡ配列を制限消化したメンゴウイルスベクターに連結し、メンゴウイルスゲノムを含む組換えＤＮＡ分子（今や非相同ヌクレオチド配列を含んでいる）を生成する。非相同ヌクレオチド配列を制限部位に挿入しない場合、当業者は、その挿入部位を含むＤＮＡベクターの制限フラグメントを選択することができる。次に、選択した制限フラグメントに対応するが、望ましい部位に挿入された非相同ヌクレオチド配列をさらに含む、合成ＤＮＡフラグメントを合成することができる。この合成ＤＮＡフラグメントは、選択した制限フラグメントのかわりにＤＮＡベクターに挿入し、組換えメンゴウイルスゲノムｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子を生成することができる。非相同ヌクレオチド配列は、様々な方法で調製することができる。例えば、配列は、組換えメンゴウイルスにより発現されるべき非相同ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを特異的に切断することによって得てもよい。例えば、これは適切な制限酵素を用いて達成してもよい。あるいは、非相同ヌクレオチド配列は、当業界において周知の方法を用いて化学的に合成することができる。望ましい非相同ポリペプチド（例えば抗原又はエピトープ）を含む組換えメンゴウイルス及びそのタンパク質もしくは発現産物は、組換えメンゴウイルスゲノム中に挿入された非相同ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子からＲＮＡ転写物を生成することによって得ることができる。例えば、ｐＭ１６及びｐＭ１６−１の場合には、ＲＮＡ転写物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで産生させることができる。代替的なプロモーター及び対応するポリメラーゼで置き換えることもできる。転写混合物のアリコートを、許容細胞をトランスフェクトするために使用することができる。例えば、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、ポリ−オルニチン、電気穿孔法、及び合成トランスフェクション剤を用いて、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ２１、及びＰ８１５のような哺乳類細胞をトランスフェクトすることができる。子孫ウイルスの産生は顕微鏡により監視することができ、ウイルスは、細胞破砕の周知の方法、例えば凍結解凍により放出させることができる。本発明の特定の態様においては、非相同ポリペプチドはリーダーポリペプチド（Ｌ）中に挿入される。メンゴウイルスポリタンパク質のＮ末端から６アミノ酸のところでの外来性エピトープの挿入は、Ｌを機能的でなくすることがなく、したがって、インビトロでもインビボでもウイルスの増殖に干渉しないことがわかった。他の挿入部位は、挿入物（インサート）がウイルスの生活環に重要な機能と干渉しない位置での挿入のために、ウイルスゲノム内で選んでもよい。好適な挿入部位に制限部位がない場合には、例えば、部位特異的突然変異誘発によりそれらを導入することができる。したがって、原理的には、よく定義された機能的領域、例えば、３Ｃの触媒性３つ組（トリアッド）を除き、ゲノム内の全ての制限部位及び他の位置を、挿入のために考慮することができる。好ましい部位としては、ゲノムの非構造領域、例えば、Ｐ２、Ｐ３及び／又はウイルスタンパク質のＮもしくはＣ末端に相当する領域が挙げられる。抗原又はエピトープのような外来性ポリペプチドを含む融合タンパク質を製造するために、外来性ヌクレオチド配列を、リーディングフレームを保存するような方法で、メンゴウイルスｃＤＮＡ中にＬポリペプチドをコードする配列内に挿入する。そうすると、組換えウイルスは、ウイルスポリタンパク質の一部として外来性配列を発現することができる。ポリタンパク質は、特に、挿入された非相同ポリペプチドを含むＬポリペプチドを有する融合タンパク質の形態にプロセシングされる。融合タンパク質は、次いで、感染細胞の細胞質から得ることができる。本発明に関しては、メンゴウイルスベクターに挿入される非相同ＤＮＡ配列は、いかなるアミノ酸配列をコードすることもできる。本発明のある種の態様においては、アミノ酸配列は、非相同エピトープを含む。これらの態様においては、非相同アミノ酸配列は、いくつかの外来性エピトープ又は単一の外来性エピトープを含むことができ、あるいは他のアミノ酸、例えば、メンゴウイルスアミノ酸と一緒にエピトープを定義することもできる。他の態様においては、アミノ酸配列は、実質的に非相同エピトープからなることができる。一例として、本発明の種々の態様のアミノ酸配列を表１に列挙する。本発明の態様においては、挿入されるべき非相同ＤＮＡ配列は、一般に約７００〜１，１００塩基の範囲にある。表１に与えられている配列は、本発明の組換えメンゴウイルスの構築のための非相同配列の例である。この表に与えられていない種の非相同配列を含む組換えメンゴウイルスは、本書に示すようにして構築することができる。非相同配列が、大きすぎてメンゴウイルスにおいて発現させることができない場合には、各々が与えられたタンパク質の一部を発現する組換えメンゴウイルスのセットを構築することができる。本発明の非相同ＤＮＡ配列は、２つ以上のポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、互いに直接連結することもでき、あるいは連結配列によって分離することもできる。特定の態様においては、これらの連結配列は切断部位をコードすることができる。本発明の態様においては、組換えウイルスのＬポリペプチドは、ＨＩＶ−Ｉのｇｐ１２０のセグメントを含む。特定の態様においては、Ｌポリペプチドは、ＨＩＶ−ＩのＭＮ株のｇｐ１２０のアミノ酸２９９〜４４６を含む。より特定の態様においては、ＨＩＶ−ＩのＭＮ株のｇｐ１２０のアミノ酸２９９〜４４６は、Ｌポリペプチドのアミノ酸６の後に挿入されている。このＨＩＶ配列は、主要中和決定基（ＰＮＤ）を構成するＶ３ループをコードする配列及びｇｐ１２０分子のＣＤ４レセプターに対する結合に関与する下流配列を含む。結果として得られる組換えメンゴウイルスは、ＨＩＶ−Ｉ特異的抗体により認識される、抗ＨＩＶ −Ｉ抗体を動物に誘起する、ＨＩＶ−Ｉｇｐ１２０−メンゴウイルスＬ融合タンパク質を発現する。ＨＩＶ−Ｉｇｐ１２０−メンゴウイルスＬ融合タンパク質は、動物においてｇｐ１２０特異的細胞毒性免疫応答をも誘発する。抗原性については、外来性エピトープを含むＬ融合タンパク質は、ネイティブなタンパク質配列に対する抗体を誘起し、それに結合する能力を保持することができる。それゆえ、この戦略は目的の抗原性特性を呈するいかなる外来性タンパク質にも適用しうる。結果として、単一のよく定義された短いエピトープの場合には、これらのエピトープをより大きいタンパク質中に含む組換えメンゴウイルスの構築が、選択すべき戦略である。本発明の組換えウイルスは、マウス及びカニクイザルにおいて抗体を誘起し、これが、その外来性配列が由来するタンパク質と結合する、及び／又は病原体を中和する、ということが示されている。したがって、メンゴウイルスに感染しうる他の動物種、例えばヒトにおける免疫応答の誘発は、得られたインビトロ及びインビボの結果に基づいて予測される。したがって、防御免疫応答は、本発明の組換えウイルスにより誘起することができる。例えば、狂犬病のＧタンパク質の配列を発現する組換えウイルスは、マウスを含む動物におけるワクチンとしての使用のために、本発明にしたがって工学的に作製することができる。同様に、ＨＴＬＶ−Ｉの糖タンパク質からの配列を発現する組換えウイルスを、マカク、他の霊長類、又はヒトでの使用のために得ることができる。組換えメンゴウイルスにより発現される外来性エピトープを含むタンパク質の免疫原性及び抗原性は、種々の方法により改良することができる。外来性エピトープをコードする非相同ヌクレオチド配列のサイズは、最大約３５０アミノ酸の大きさまでの外来性抗原のより大きいセグメント（又は抗原全体）を発現させるように増大させることができ、外来性抗原は、融合タンパク質としてよりもネイティブな形態で発現させることもでき、そして、融合タンパク質の抗原性及び／又は免疫原性に重要であり得るグリコシル化のような翻訳後修飾を可能にするために、適切な細胞区画（コンパートメント）に対する外来性抗原の選択的ターゲティングを達成することができる。本発明の態様においては、組換えメンゴウイルスは、１つのタンパク質の複数の配列を発現することができる。その上、組換えメンゴウイルスは、異なるタンパク質からの複数の配列を含むことができる。したがって、本発明は、複数の病原体に対して同時に免疫する、又は免疫応答を誘導する、ということを可能にする。本発明のある種の態様においては、非相同ポリペプチドは、その非相同ポリペプチドのアミノ酸配列とメンゴウイルス配列との間にプロテアーゼ切断部位を入れることによって、ネイティブな形態で発現させることができる。本発明の好ましい態様においては、メンゴウイルスプロテアーゼ３Ｃ切断部位を用いる。内在性メンゴウイルスプロテアーゼ３Ｃは、メンゴウイルスポリタンパク質のほとんどの切断に関与する。例えば、プロテアーゼ３Ｃは、前駆体タンパク質Ｌ−Ｐ１−２ＡをＱ−Ｇアミノ酸連結で特異的に切断することにより、ＬペプチドとＶＰ４（１Ａ）との間の切断を媒介し、遊離のＬペプチド及びＰ１− ２Ａを生じる。図１３は、示されているこのプロテアーゼ３Ｃ切断部位を有するメンゴウイルスゲノムの図である。図１３のアミノ酸配列は、プロテアーゼ３Ｃによる切断の充分な基質である。Parks et al.，J.Viro1. 63:1054 （1989）を参照されたい。この文献の開示全体が、参照によりここに包含されるものとする。本発明の態様においては、プロテアーゼ３Ｃ切断部位をコードするＤＮＡ配列は、挿入されるべき非相同ＤＮＡ配列の各々の末端に入れることができる。その上、ウイルスタンパク質２Ａ及び２Ｂの間の切断部位であるAsn-Pro- Gly-Pro配列を用いることもできる。２Ａと２Ｂとの間の切断は、自己触媒的メカニズムによりグリシン−プロリン結合を切ることによって起こる、という証拠がある。このような非相同ＤＮＡ配列を、組換えメンゴウイルスを構築するために用いる場合、結果として得られる非相同ポリペプチドは、感染の間に自己触媒的切断によってメンゴウイルスポリペプチドから遊離させることができる。非相同ポリペプチドは、特定の細胞区画に対してターゲティングすることができる。例えば、ＳＶ４０のＴ抗原のもののような核局在性配列を包含させることにより、タンパク質が核へターゲティングされることになる。これに対して、β −２−ミクログロブリンのもののようなシグナル配列は、ポリペプチドを小包体へと向かわせ、グリコシル化のような翻訳後修飾及び培地中への分泌を可能にすることになる。さらに、ＨＩＶ−Ｉのｇｐ４１の膜貫通配列のような配列は、アンカー配列として用いて、ポリペプチドを細胞膜の中に挿入させることを可能にすることができる。さらなる態様においては、２以上の異なるタンパク質を、２以上の組換えウイルスによる標的細胞の同時トランスフェンクションにより、同じ細胞において同時発現させてもよい。これは、同時トランスフェクションを受けた標的細胞における種々の分子間相互作用を可能にすることができる。本発明の組換えメンゴウイルスは、ワクチンとして、又は免疫原性組成物の一部として使用することができる。ワクチン接種されるべき対象としては、人体、霊長類、ヒト以外の霊長類、哺乳類、マウス、又はメンゴウイルスウイルスに感染しうる他のあらゆる動物を挙げることができる。本発明の態様においては、組換えメンゴウイルスは、医薬的に許容可能な担体と混合された状態でワクチン又は免疫原性組成物中に存在する。好適な担体の例としては、ウイルスの安定性を支持し、動物又はヒトにおいての使用に許容されうるあらゆる緩衝剤が挙げられる。生ワクチンには、アジュバントは不要である。本発明の他の態様においては、ワクチン又は免疫原性組成物は、本発明のメンゴウイルス融合タンパク質を、医薬的に許容可能な担体との混合物の状態で含み、その融合タンパク質は抗原を含む非相同アミノ酸配列を含む。メンゴウイルスは、以下の特性により、広い潜在能力を有する生ワクチン又は免疫原として特に魅力的である。１．本書に記載したｖＭ１６株及び他の弱毒株は、その弱毒化が欠失に起因するため、容易には毒性に復帰しにくい。本発明の文脈において、ポリ（Ｃ）トラクト全体が欠失している遺伝子工学的に作製されたメンゴウイルスを用いることが可能である。２．メンゴウイルスの広い宿主範囲は、医学的又は獣医学的に重要な多様な病原体に対する多くの異なる動物種におけるワクチン又は免疫原としてのその利用を可能にし、例えば、ＨＡＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、狂犬病、ＦＭＤＶ、ウシのようなコロナウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹、ムンプス（おたふくかぜ）及びレスピラトリーシンシチアルウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。３．非経口又は経口投与後に生体内で複製することができる生ワクチンの形態でのワクチンにおけるメンゴウイルスの利用は、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方、特に細胞傷害性Ｔ細胞応答の誘発を可能にすることになる。４．経口免疫後に腸において増殖するメンゴウイルスの能力は、全身性の一般的免疫応答及び局所的な粘膜応答の両方の誘発を可能にする。これは、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶ、ＴＧＥＶ又はロタウイルスのような病原体の場合に、特に適切である。本発明の組換えウイルスは、種々の非免疫学的方法において用いることができる。例えば、組換えウイルスは、大量の目的核酸又はタンパク質を産生させるために、例えば組織培養において、クローニング又は発現ベクターとして用いることができる。組換えメンゴウイルスに感染した細胞において発現される非相同タンパク質は、感染細胞から大量に精製することができる。その上、本発明の組換えウイルスは、種々の病原体、又は疾患に関与する細胞機能の特異的阻害剤を、種々の細胞位置又は細胞以下の位置に送り込むために用いることができる。以下の例は、本発明のよりよい理解を容易にするための説明の方法として与えるものであり、本発明を制限することを意図するものではない。さらに、詳細な説明は、本発明の好ましい態様を示しつつも、説明の方法としてのみ与えられていることも、理解されるべきである。これは、本発明の精神及び範囲内における種々の変更及び改変は、詳細な説明から当業者には明白になるであろうためである。実施例材料と方法ｖＭＬＮ４５０の構築全てのＤＮＡ操作は標準的手順（７）にしたがって行った。Ｔ７プロモーター（５）の下流にｖＭ１６メンゴウイルスｃＤＮＡを含むプラスミドｐＭ１６からの５．８kbのＳｐｈＩ−ＳｐｈＩフラグメント（プラスミド塩基１９２８〜７７７５）の欠失によって、サブクローンｐＭＲＡ１を生成した。ＨＩＶ−ＩＭＮｇｐ１２０特異的ＤＮＡを、オリゴヌクレオチド５′ＶＣＮ（ATATGTTGACCATGGA ACAAATTAATTGTACAAGACCC）及び３′ＶＣＮ（TAATCCATGGCGGTCAACGTGGGTGCTACTCC TAATGG）を用いて、M.P．Kieny氏から好意により提供されたプラスミドｐＴＧ５１５６（Transgene SA，ストラスブール）からＰＣＲにより増幅させた。まず、ＰＣＲフラグメントを、ＮｃｏＩ部位（ウイルス塩基７２９）でｐＭＲＡ１にクローニングし、結果としてプラスミドｐＭＲＡ２を得た。ｐＭＲＡ２のＳｐｈＩ部位にｐＭ１６の５．８kbフラグメントをトランスファーすることによって、全長ｃＤＮＡを再度確立し、プラスミドｐＭＲＡ３を得た。ＰＣＲにより、クローニングされた配列の正しい方向性を決定し、E．coli ＤＨ５α（Promega）においてプラスミドを増幅させた。ｐＭＲＡ３から由来する感染性のＲＮＡの転写物を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて調製し、記述されているとおりに（５）ＨｅＬａ細胞にこれをトランスフェクションし、その結果、組換えメンゴウイルスｖＭＬＮ４５０を得た。ＨｅＬａ細胞での継代によりｖＭ１６及びｖＭＬＮ４５０のストックを作成し、記述されているとおりに（８）滴定し、これを、メンゴウイルス特異的オリゴヌクレオチドである５′１９４−（TAGGCCGCGGAATAAGGCCGGTGTGC）及び３′１０９４− （GGAGCATGTTCGAGAAAGCATTGAC）を用いて、挿入されたＨＩＶ−Ｉ配列の存在についてＲＴ−ＰＣＲにより分析した。免疫及びＥＬＩＳＡ試験１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目及び５６日目の２回、ＰＢＳ中の１０⁶pfu（プラーク形成単位）のｖＭＬＮ４５０又は１０⁶pfuのｖＭ１６を用いて、腹腔内で免疫した。対照動物には、ＰＢＳを単独で与えた。成体カニクイザルは、ＰＢＳ中の１０⁶pfuのｖＭＬＮ４５０又はｖＭ１６を用いて、筋内で免疫した。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc Maxisorb）を１ウェルにつき５０ngの精製した組換えｇｐ１６０ＬＡＩ又はｇｐ１６０ＭＮ−ＬＡＩ（Transgene）でコーティングし、血清の段階希釈液を用いてインキュベートし、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Diagnostics Pa steur）又はウサギ抗サルＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Nordic）と共にインキュベートした。ＥＬＡＶＩＡ試験（Diagnostics Pasteur）は、メーカーのプロトコールにしたがって実施した。ＨＩＶ−ＩＭＮ中和検定は、３．５×１０⁵のＭＴ４細胞を用いて、記述されたとおり（９）に行った。６日目と１０日目の間、融合細胞（シンシチウム）形成を監視した。例１ｐＭＲＡ−３の構築メンゴウイルスｃＤＮＡのＮｃｏＩ部位７２９へのクローニングを容易にするため、２つのＮｃｏＩ部位を含む５．８kbのＳｐｈＩ（１９２８）−ＳｐｈＩ（７７７５）フラグメントを削除することによって、ｐＭ１６の欠失クローンを構築した。結果として得られたｐＭＲＡ−１と呼称されるクローン（図４）は、位置７２９に唯一のＮｃｏＩ部位を含んでいる。以下のオリゴヌクレオチドを用い、プラスミドｐ０５１５６Ｓからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、４７８bpのＨＩＶ−Ｉ−ＭＮ特異的ＤＮＡフラグメントを生成した：プラスミドｐ０５１５６Ｓは図３に描かれており、Trangene S.A.（フランス、ストラスブール）から入手した。ｐ０５１５６Ｓについては、特許出願ＷＯ９２／１９７４２の中で記述されている。ゲノムのＭＮ配列は、Gurgo et al.，19 88，Virology 164：531-536（1988）によって公開されており、この文献は参照により本書に包含されるものとする。増幅された配列Δｇｐ１２０−ＶＣＮは、ＨＩＶ−Ｉ−ＭＮの糖タンパク質（ｇｐ）１２０のアミノ酸２９９〜４４６に対応する。 Δｇｐ１２０−ＶＣＮを、５ngの鋳型上で約１００mMの濃度のオリゴヌクレオチド５′ＶＣＮ及び３′ＶＣＮを用いて生成し、ｐ０５１５６Ｓを、Stratageneから入手したＰＦＵポリメラーゼを用い、同じくstratageneから得たＰＦＵ増幅緩衝液を用いて、標準的温度サイクル条件で生成した。その後、Δｇｐ１２０−ＶＣＮフラグメントをｐＭＲＡ−１のＮｃｏＩ部位７２９にクローニングして、ｐＭＲＡ−２を生成した。ｐＭＲＡ−２は図５に描かれている。ｐＭＲＡ−２内のΔｇｐ１２０−ＶＣＮインサートの正しい配向及び長さは、オリゴヌクレオチドＭ−１０９４、５′ＶＣＮ及び３′ＶＣＮを用いて、ＰＣＲにより確認した。Ｍ−１０９４のオリゴヌクレオチド配列は次のとおりである：正しいクローンは、Ｍ−１０９４及び５′ＶＣＮで８００bpのＰＣＲフラグメントを生じ、Ｍ−１０９４及び３′ＶＣＮでは増幅されたＤＮＡを全く生じなかったが、一方、正しくない方向性でΔｇｐ１２０−ＶＣＮを含むクローンは、反対の結果を示した。ｐＭ１６からの５．８kbのＳｐｈＩ（１９２８）−ＳｐｈＩ（７７７５）フラグメントをｐＭＲＡ−２へクローニングして戻すことにより、全長ｃＤＮＡを再構築し、その結果、プラスミドｐＭＲＡ−３を得た。ｐＭＲＡ−３は、図６に描かれている。このプラスミドは、メンゴウイルスｃＤＮＡのＬ−ペプチドコーディング領域内にフレーム内で挿入された付加的な４５９bpを含んでおり、２５．８kDの融合タンパク質ＬＮ４５０をコードする（図７）。ｐＭＲＡ−３内のｐＭ１６の５．８kbのＳｐｈＩ（１９２８）−ＳｐｈＩ（７７７５）フラグメントの正しい方向性は、ＢａｍＨＩ（Boehringer Mannheim）及びＨｉｎｄIII（Boehringer Mannheim）での二重制限消化によって確認した。正しい方向性にあるプラスミドのこの二重制限消化は、結果として３０塩基及び１１３５６塩基の２つのＤＮＡフラグメントをもたらす。一方、正しくないクローンは、長さ５８２１塩基及び５５６５塩基の２つのＤＮＡフラグメントを示す。例２ｖＭＬＮ４５０の生育特性ｖＭＬＮ４５０及びｖＭ１６ｃＤＮＡの感染性ＲＮＡ転写物を、ＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＭ１６及びｐＭＲＡ−３とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ Pharmacia）を適当な緩衝液中でインキュベートすることによって、インビトロで産生させた。この転写混合物のアリコートを、１mg/ml ＤＥＡＥデキストランに調整し、その後、Sylvie van der Werf et al.の「精製されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる感染性ポリオウイルスＲＮＡの合成」，Proc.Natl．Acad．Sci．（USA）83：2330（1986）により記述されているとおりに、単層細胞上でこの溶液を３０分間インキュベートすることによってＨｅＬａ細胞にこのアリコートをトランスフェクションした。上記文献の開示全体が、参照により本書中に包含されるものとする。ＨｅＬａ細胞内へのプラスミドｐＭＲＡ−３から由来するＲＮＡのトランスフェクションは、結果としてウイルスｖＭＬＮ４５０の産生をもたらした。後代ウイルスの産生は、顕微鏡で監視した。ストック（保存）ウイルスは、感染多重度（ＭＯＩ）１でＨｅＬａ細胞の集密（コンフルエント）単層を感染させることによって生育させた。完全なｃｐｅ（細胞変性効果）の後、ウイルスを収獲した。細胞内ウイルスは、細胞を３回凍結及び解凍させ、遠心分離により細胞砕片及び核をペレット化することによって放出させた。完全なｃｐｅは、ｐＭ１６ＲＮＡで細胞をトランスフェクションした場合の４８時間に比べて、７２時間後に観察された。ｖＭＬＮ４５０は高い力価まで生育するが、ｖＭ１６に比べると約３分の１〜４分の１である。組換えウイルスのプラーク表現型を試験した。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）無しでダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でウイルス原液を希釈し、ＨｅＬａ細胞の集密性単層を感染させるためにこれを用いた。３０分のインキュベーションの後、０．９％の軟寒天を含むＤＭＥＭで細胞をカバーした。次に細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、無傷の（インタクトな）細胞を０．２％のクリスタルバイオレット溶液で染色した。培養上清から収獲した組換えウイルスのプラーク表現型は、野生型ウイルスプラークのものの約６５％の平均直径をもつ中サイズのプラークを示す（図８）。例３ｖＭＬＮ４５０の遺伝的安定性ｖＭＬＮ４５０を含むトランスフェクション上清を、ＨｅＬａ細胞上で３回継代し、ウイルスＲＮＡを抽出した。組換えウイルスｖＭＬＮ４５０の継代３からのウイルスＲＮＡを、オリゴヌクレオチド５′ＶＣＮ、３′ＶＣＮ、Ｍ−１０９４及びＭ−ＶＤＷ−１を用いてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）により分析した。オリゴヌクレオチドＭ−ＶＤＷ−１の配列は以下のとおりである： Adams及びBlakesley，Focus 13：56-57（1991）及びAdams及びBlakesley，Foc us 14：31-33（1992）によって記述されている、サンガーのジデオキシ配列決定方法から誘導されたＰＣＲ配列決定方法により、ＲＴ−ＰＣＲ産物について配列分析を行った。低融点アガロースゲルからＰＣＲフラグメントを抽出し、各々異なる濃度のｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰ、及び４pmolの³²Ｐ−末端標識プライマーを含む４つの反応混合物の各々に、約２００ngのＤＮＡを添加した。反応は、ＴＡＱポリメラーゼ（Amersham）を添加することによって開始し、標準的温度サイクル条件で２０回の増幅の間インキュベートした。配列決定反応は、標準的条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。オリゴヌクレオチド対Ｍ−ＶＤＷ−１／Ｍ−１０９４及び５′ＶＣＮ／Ｍ−１０９４での分析は、それぞれ１，３８２bp及び９３２bpの特異的ＤＮＡフラグメントがｖＭＬＮ４５０のＲＮＡから増幅されうることを明らかにした。これらのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＭＲＡ−３から生成されたＤＮＡフラグメントとの間には、明らかなサイズの差はなかった。これらの実験の結果を図９に示す。ｖＭ１６様のウイルスへの復帰突然変異を示す野生型サイズのフラグメントは全く検出できなかった。１，３８２bpのフラグメントを部分的に配列決定して、非特異性をさらに排除した。ｖＭＬＮ４５０について得られた部分配列は、図１０に下線の付された配列として示されており、これは当初のインサートのものとの差異を全く示していない。例４ＨｅＬａ細胞におけるＬＮ４５０の発現融合タンパク質ＬＮ４５０の発現を分析するために、単層のＨｅＬａ細胞をＭＯＩ１０のｖＭＬＮ４５０に感染させ、基本的に参照により本書に包含されるLe e及びWimmerのVirology 166：405（1988）に記述されているとおりに、感染から５¹/₂〜７¹/₂時間後に³⁵Ｓメチオニンで標識した。感染後７時間で、細胞をＮＰ４０で溶解させ、細胞質抽出物を、参照により本書に包含されるHarber et al. ，Journal of Virology 65：326（1991）に記述されているとおりに調製した。その後、³⁵Ｓメチオニンで標識されたタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィは、標準的条件にしたがって実施した。ＨｅＬａ細胞をｖＭＬＮ４５０及びｖＭ１６それぞれで感染させ、ウイルスタンパク質を³⁵Ｓ−メチオニンで標識した。感染後７¹/₂時間に細胞質抽出物を調製し、その後、アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ｖＭＬＮ４５０に感染した細胞は、ｖＭ１６感染又は偽感染細胞（図１１、ａ、ｃ）には存在しない２６kDaの見かけの分子量をもつ単一の付加的なタンパク質の存在を示す（図１１、ｅ）。このタンパク質の分子量は、ＬＮ４５０について予想されるサイズに相当する。例５抗原性ＬＮ４５０の抗原特性を、モノクローナル抗体５０．１（Repligenから入手）を用いて、免疫沈降法により検定した。³⁵Ｓメチオニンで標識したｖＭＬＮ４５０感染細胞のライセートのアリコートを、１μｇのＭＡｂ５０．１を用いて、４ ℃で１時間インキュベートし、その後、同量のプロテインＡ−セファロース懸濁液を加え、混合物を１時間インキュベートした。プロテインＡ−セファロース複合体をペレット化し、３回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続いてのオートラジオグラフィにより分析した。ｖＭＬＮ４５０、ｖＭ１６感染及び偽感染ＨｅＬａ細胞の細胞抽出物を、モノクローナル抗体５０．１（ＭＡｂ５０．１）で免疫沈降させた。この抗体は、ＨＩＶ−Ｉ−ＭＮの主要な中和決定基であるＨＩＶ−ＩのＭＮ株のＶ３ループを認識する。図１１、ｂ）、ｄ）及びｆ）に示すデータは、ｖＭＬＮ４５０感染細胞中で産生される２６kDのタンパク質のみがＭＡｂ５０．１で免疫沈降しうることを明らかにし、ＬＮ４５０としての２６kdタンパク質の同一性（正体）を確認している。例６免疫原性１つの実験において、１０週齢のＢａｌｂ／ｃ又はＣＢＡマウスを、ＰＢＳ中の１０⁶pfuのｖＭＬＮ４５０（Ｂａｌｂ／ｃについては４匹、ＣＢＡについては５匹）又は１０⁶pfuのＭ１６（Ｂａｌｂ／ｃについては４匹、ＣＢＡについては２匹）を用いて、腹腔内で免疫した。３匹（Ｂａｌｂ／ｃ）又は２匹（ＣＢＡ）の動物には、ウイルス無しの対照としてＰＢＳを与えた。動物に、等用量のウイルスを用いて、初回免疫から８週間後に追加免疫を施した。免疫後１４日に血液試料を採取し、血清を調製した。ＰＢＳ中のｖＭＬＮ４５０（動物３匹）又はｖＭ１６（動物１匹）約４×１０⁵ pfuを用いて、カニクイザル（Macaca fascicularis）を筋内で免疫した。免疫から２８日後に血液試料を採取し、血清を調製した。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc Maxisorb）を、１ウェルにつき１００μｌの組換えｇｐ１６０ＭＮ−ＬＡＩ又はｇｐ１６０ＬＡＩ（ＰＢＳ中、５００ng/ml）でコーティングした。ｇｐ１６０ＭＮ−ＬＡＩは、ＭＮウイルス株からのｇｐ１２０部分とIIIＢ（ＬＡＩ）株からのｇｐ４１とを含む融合タンパク質である。プレートを洗浄し、マウス又はサルの血清の段階希釈液を用いてインキュベートした。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体［抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ Diagnostics Pasteur）又は抗サルＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Nordic Immunology）］を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最終的洗浄の後、ＯＰＤ（６７０ μg/ml）、Ｈ₂Ｏ₂（０．０４２％）溶液を添加することによって、試験を発色させた。４ＮＨ₂ＳＯ₄を添加することにより反応を停止し、Dynatech ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０nmでＯＤを読み取った。マウス血清の１／１００希釈液から出発した２中１の段階希釈液を、融合細胞阻害検定で試験した。融合細胞形成を誘発する最低の濃度でＨＩＶ−Ｉ−ＭＮを含むウイルス溶液に、希釈した血清を添加した。混合物を１時間インキュベートし、３．５×１０⁵のＭＴ４細胞の懸濁液を添加した。細胞を４８ウェルのプレート中で生育させ、３日目に４中１の割合で希釈し、６日目と１０日目の間で融合細胞形成を監視した。Ｂａｌｂ／ｃマウス、ＣＢＡマウス又はカニクイザルを、マウスの場合には１０⁶pfuのｖＭＬＮ４５０もしくはサルの場合には２×１０⁵pfuのｖＭＬＮ４５０、１０⁶pfuのｖＭ１６又はウイルス無しの対照のいずれかを用いて免疫した。免疫から２週間後及び免疫から１０週間後（追加免疫から２週間後）にマウスを採血した。血清を、抗原として組換えｇｐ１６０ＭＮ−ＬＡＩ又はｇｐ１６０ＬＡＩを用いて、ＥＬＩＳＡにより分析した。サルは、免疫から４週間後に採血し、同様に分析した。図１２及び表３に示すデータは、特異的抗ＨＩＶ抗体が、ｖＭＬＮ４５０に感染させたマウスからの血清中にのみ検出されたことを明らかにしている。抗ＨＩＶ−Ｉ力価は、動物をｖＭＬＮ４５０で追加免疫した後、約３５倍に上昇し、２回目の免疫の後少なくとも１０週間は高いレベルにとどまった。ＣＢＡマウスを用いても同様の結果が得られた。ＭＴ４細胞及びＨＩＶ−Ｉ−ＭＮを用いた中和検定において分析した場合（表２）、免疫から２週間後に得られた４つのＢａｌｂ／ｃ血清のうちの２つは、１００中１の希釈度で、ウイルスに誘発される融合細胞形成を完全に阻害した。ＨＩＶ−Ｉ中和抗体力価を、ＨＩＶ−ＩＭＮを用いて融合細胞形成阻害検定で決定した（９）。中和力価は、ｖＭＬＮ４５０で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスからの７０日目の血清では１：１００〜１：４００の範囲内にあったが、一方、対照血清についての値は１：１００未満であった。動物におけるＶ３特異的応答は、現在測定中である。カニクイザルを用いて、匹敵する実験を行った。１０⁶pfuの生きたｖＭ１６又はｖＭＬＮ４５０を１回筋内注射して、動物を免疫した。ＨＩＶ−Ｉ特異的抗体を、１ヵ月後に、精製された組換えｇｐ１６０ＭＮ−ＬＡＩ（表４）又は市販のＥＬＩＳＡキット（ＥＬＡＶＩＡ）のいずれかを用いて（データ示さず）、ＥＬＩＳＡにより測定した。両方の試験共、ｖＭＬＮ４５０で免疫したサルには上昇したｇｐ１６０特異的抗体が存在したが、一方、ｖＭ１６で免疫した動物は全く反応性を示さなかったことを明らかにした。例７ｇｐ１２０特異的細胞傷害性免疫応答Ｂ細胞及びＴ−ヘルパー細胞エピトープに加えて、ＨＩＶ−ＩＭＮのｇｐ１２０のＶ３ループ配列は、Ｈ−２^dハプロタイプ（１０）でマウスで認識されるＭＨＣクラスＩに制限された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含むことが示されてきた。したがって、我々は、ｖＭＬＮ４５０で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、このエピトープに対する細胞傷害性細胞性免疫応答の存在について調べた。免疫したマウスからの脾細胞を、インビトロでＰ１８−ＭＮペプチドで刺激し、Ｖ３ＣＴＬエピトープ配列（１０）を含むペプチドＰＩ８− ＭＮでパルスされた同系の標的細胞（Ｐ８１５）に対する細胞傷害活性について検定した。表５に示されているとおり、ｖＭＬＮ４５０で免疫した動物においては、２５：１というエフェクター対標的比で、明らかなＨＩＶ−ＩＭＮ特異的細胞傷害活性を立証することができたが、親であるｖＭ１６で免疫した動物では立証できなかった。この活性はＭＨＣクラスＩの制限を受けていた。参考文献１１を参照のこと。ｖＭ１６又はｖＭＬＮ４５０で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細胞をプールし、その後、「材料及び方法」の中で記述したとおりにインビトロで再刺激した。細胞溶解活性は、２５：１というエフェクター：標的比率で、Ｐ１８−ＭＮペプチドでパルスされた又はされていないＰ８１５細胞に対して測定した。細胞傷害性検定は以下のとおりに行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目及び２１日目に、１０⁶pfuのｖＭ１６又はｖＭＬＮ４５０を用いて腹腔内で免疫した。１ロットにつき３匹のマウスからの脾細胞を１０日後に回収し、プールし、７日間Ｐ１８−ＭＮペプチド（１０）で、次に５日間、成長因子供給源としての５％コンカナバリンＡ上清含有培地の存在下の、Ｐ１８−ＭＮペプチドでインビトロで再刺激した。刺激を受けた脾細胞の細胞溶解活性を、５ｈ⁵¹Ｃｒ−放出検定によって決定した。標的細胞はペプチドによるパルスを受けた、⁵¹Ｃｒで標識されたＰ８１５腫瘍細胞であった。特異的⁵¹Ｃｒの放出の百分率は、〔（実験上の放出−自然発生的放出）／（最大放出−自然発生的放出）］×１００として計算した。自然発生的放出は、１％トリトンＸ− １００とのインキュベーションによって得られた最大放出の２０％未満であった。例８ｖＭＱＧ−１の構築この構築において使用したＨＩＶ−Ｉ−ＭＮｇｐ１２０配列は、ｖＭＬＮ４５０構築の説明の中で前述したとおりに生成した。ただし、アミノ酸配列は、ＨＩＶインサートのＣ末端及びＬ−ペプチドのＮ末端で、図１４に記述されているとおりに変更した。Ｌ−ペプチドのＮ末端に非相同短縮型ｇｐ１２０又はそのフラグメントを含み、かつ例えば３Ｃのようなプロテアーゼ切断部位（単数又は複数）によってＬペプチドから分離された組換えメンゴウイルスｖＭＱＧ−１の生成は、ｖＭＬＮ４５０に比べて、ｇｐ１２０配列の発現及び免疫原性を増大させる潜在的可能性を秘めている。ｇｐ１２０のフラグメントは、動物における免疫応答を惹起するよう選択する。特定の態様においては、これらのフラグメントは２０〜１００個のアミノ酸のペプチドで構成されている。ｖＭＱＧ−１のｃＤＮＡであるｐＭＲＡ−５の構築の流れ図を、図１５に表す。図１５中の合成二本鎖オリゴヌクレオチドで標識されたＬＱＧｄ／ｓの配列は、以下のとおりである：簡単に言うと、ＰＣＲで増幅された配列Δｇｐ１２０−ＶＣＮをＨｉｎｃII及びＮｃｏＩで制限消化し、４５１bpのフラグメントを分離した。このフラグメントを、３Ｃ切断部位をコードする合成二本鎖オリゴヌクレオチドＬＱＧｄ／ｓに連結した。結果として得られた連結されたフラグメントをＮｃｏＩで制限し、ｐＭＲＡ−１のＮｃｏＩ制限部位に挿入した。結果として得られたプラスミドをｐＭＲＡ−４と名付けた。上述のｐＭ１６の５．８kbのＳｐｈＩフラグメントをＳｐｈＩ（１９２６）でｐＭＲＡ−４に挿入して全長メンゴウイルス配列を回復させ、ｐＭＲＡ−５を作成する。ｐＭＲＡ−５をインビトロで転写させ、結果として得られるＲＮＡを用いてＨｅＬａ細胞に感染させ、ウイルスを生成させる。ｖＭＱＧ−１の場合において、メンゴウイルスゲノム中への４８６の付加的な塩基の挿入は、ｖＭＬＮ４５０の場合に４５９塩基の挿入が完全に生存可能な組換えメンゴウイルスを生み出したことから、ウイルスの生存可能性と干渉する確率は低い。非相同アミノ酸配列とＬペプチドとの間への３Ｃ切断部位の導入と共に、図１４に示されているメンゴウイルスＬの突然変異体Ｌ^*のＮ末端にミリスチル化シグナルを保持させた。さらに、Ｌ^*内のＮ末端アミノ酸配列の変化は、この変更がアミノ酸配列ＧＮＳによる最初の２つのアミノ酸（ＭＡ）の置換しか含んでいないことから、Ｌ^*ペプチドの機能に干渉しないものと予想される。Ｎ末端アミノ酸の同様の欠失及び非相同アミノ酸との融合は、ｖＭＬＮ４５０の場合、ウイルスの生存可能性に対する劇的な効果を全くもたないことが示された。ｖＭＱＧ−１タンパク質の発現は、プロテアーゼ３Ｃによるタンパク質分解的切断の後にタンパク質Δｇｐ１２０−Ｑ及びＬ^*を生じるはずである。ｇｐ１２０−Ｑとｇｐ１２０−ＶＣＮとの差は、タンパク質のＣ末端にある。 Δｇｐ１２０−Ｑの全配列は、以下のとおりである： Δｇｐ１２０−Ｑの細胞での局在は、細胞質であり、Ｌ^*ペプチドの局在とは無関係であると予想されている。さらに、この戦略は、Δｇｐ１２０配列のＮ末端におけるシグナル配列又はその他のあらゆる非相同インサートのクローニングに適用可能であるという情報を提供し、外来性インサートの分泌を導く免疫原性の増大を結果としてもたらす可能性が高い。例９メンゴウイルスＤＮＡの供給源としてのｐＭ１６−１メンゴウイルス核酸供給源としてプラスミドｐＭ１６−１を用いても、前述の例を実施することができる。ｐＭ１６−１は、プラスミド領域内にヌクレオチド１０，９３１〜１０，９５０の欠失を含んでおり、その転写物の感染力の増大という結果がもたらされている。ｐＭ１６−１の配列を、図１７に示し、ｐＭ１６とｐＭ１６−１の配列比較を図１８に示す。ｖＭＬＮ４５０のような組換えウイルスの構築のために、ｐＭ１６−１又はメンゴウイルスｃＤＮＡのその他のあらゆるバージョンを使用することが可能である。例１０組換えメンゴウイルスを用いたリンパ球脈絡髄膜炎感染からのマウスの防御１つのモデルとして、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）核タンパク質（ＮＰ）からの充分に特徴づけされた免疫優性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを使用した。ワクチニアウイルスへのこのエピトープの導入がＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^α）マウスにおける致死的ＬＣＭＶ感染に対する防御免疫の誘発を可能にする、ということは以前に示されている。J.C．Whitton et al.，J.Vir ology 67：348-356（1993）。９アミノ酸（ａａ）のＣＴＬエピトープ；Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Glyを含むＬＣＭＶＮＰの１４個のアミノ酸を発現するメンゴウイルスキメラｖＬＣＭＧ４を構築した。材料と方法ｖＬＣＭＧ４の構築と産生ＤＮＡ操作、転写、トランスフェクション、ＨｅＬａ細胞の組織培養、及びメンゴウイルスの産生は、上述のとおりに実施した。細胞傷害性検定基本的に、P.L．Gossens，H．JOUIN及びG．Milon，「マウスのリステリア症の間に肝臓に動員されるリンパ球及び炎症性細胞の動力学」，J．Immunol.，147， 3514-3520により記述されているとおりに、免疫した動物からの肝臓中で、ＬＣＭＶに対する一次的細胞傷害性活性を調べた。各々の肝臓を、１０mlのＨＢＳＳ＋抗生物質を含む陶工用ガラス粉砕機中でホモジナイズし、ナイロンふるいにかけ、４℃において１５０ｇで１０分間遠心分離した。各ペレットを、０．０３％トリプシン及び３３μg/ml ＤＮＡｓｅ−１に調整した４５mlのＨＢＳＳ中に再懸濁させた。混合物を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）に調整する前に、細胞を、穏やかに振とうしながら３７℃で４５分間インキュベートした。細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、最終ペレットを、１mlの完全ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、４×１０^-5Mの β−メルカプトエタノール）中に再懸濁させた。細胞を計数し、ＣＴＬ検定のため適当な濃度に調整した。感染を受けていない又はＬＣＭＶで感染させたＪ７７４標的細胞を、３７℃で１時間、２００μCiの⁵¹Ｃｒで放射線標識し、洗浄し、希釈されたエフェクター細胞を含む、１ウェル当り１０⁵細胞／１００μｌの割合で、９６ウェルプレートに分配した。プレートを、３７℃での４時間のインキュベーションの前に、２分間１００ｇの遠心分離に付した。もう１回遠心分離した後、上清を集め、ガンマカウンターで計数した。特異的細胞傷害性は、実験上の放出−自然発生的放出／最大放出−自然発生的放出、という公式にしたがって計算した。なお、ここで、自然発生的放出は、エフェクター細胞の不在下で決定し、１００％の放出は、１％トリトンの存在下で決定した。免疫 Iffa-Credoから得た８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０．２mlのＰＢＳ又は異なる用量のｖＭ１６、ｖＬＣＭＧ４、もしくはＬＣＭＶのアームストロング株（ＬＣＭＶ−ＡＲＭ；Scripps Research Institu te，ラ・ホーヤ、米国のOldstone博士から入手した）のいずれかを用いて、腹腔内で免疫した。ＬＣＭＶ−ＡＲＭは、American Type Culture Collection（米国基準株収集機関）12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852に受託番号ＡＴＣＣＶＲ−１３４として寄託されている。免疫後（ｐ．ｉ．）１０日目に、一次防御応答について試験するため、そしてｐ．ｉ．４３日又は４５日目に、記憶応答について試験するため、３０μｌ中の１０^2.8pfuのＬＣＭＶ−ＡＲＭを用いて、マウスに頭蓋内抗原投与した。結果ｖＬＣＭＧ４の構築及び生育特性１１７〜１３０としてＬＣＭＶＮＰをコードする二本鎖合成オリゴヌクレオチドを、メンゴウイルスｃＤＮＡｐＭＣＳの制限部位ＳｎａＢＩ（７４７）とＮｈｅＩ（７５４）との間で、フレーム内に挿入し、プラスミドｐＬＣＭＧ４を生成した（図１）。プラスミドＤＮＡを、突然変異を受けた領域を通して配列決定した。ｐＬＣＭＧ４のＲＮＡ転写物をＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、組換えウイルスｖＬＣＭＧ４を生成した。トランスフェクション及び感染の上清からのウイルスは、親であるｖＭ１６又はｖＭＣＳと同じプラーク表現型を示した（図２）。ＨｅＬａ細胞における継代後、ｖＬＣＭＧ４は、ｖＭ１６又はｖＭＣＳに匹敵する高い力価まで生育する。ＬＣＭＶ特異的細胞傷害性ＰＢＳ及びｖＭ１６で免疫した動物が同系のＬＣＭＶ感染を受けたＪ７７５標的細胞に対していかなる溶解活性も示さないのに対して、ＬＣＭＶ及びｖＬＣＭＧ４で免疫した動物は、低いエフェクター／標的比においてさえ特異的な細胞傷害性を示す（表６）。ＬＣＭＶ抗原投与に対するＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種単一用量による免疫１０⁶pfuのｖＭ１６又はｖＬＣＭＧ４、２×１０⁵pfuのＬＣＭＶ−ＡＲＭ、又はウイルス無しの対照としての組織培養培地を用いて、腹腔内でマウスを免疫した。「材料と方法」の中で記述されているとおりに１０日目又は４３日目にＬＣＭＶの頭蓋内注射により、動物に抗原投与した。死亡は、全て１０日目以前に起こった。ｖＭ１６又は培地を与えた動物については、防御は全く得られず、一方、ＬＣＭＶ及びｖＬＣＭＧ４で免疫した動物については完全な防御が観察された（表７）。用量依存性防御ｖＬＣＭＧ４での有効なワクチン接種のための最小必要用量を評価するために、異なる用量のｖＬＣＭＧ４を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。１００％の防御は、免疫から１０日後に１００pfuという低い用量で観察でき、１０pfuで動物を免疫した場合、防御は、なお６０％（５匹のうち２匹死亡）であった。免疫から４５日後で、防御レベルは非常に高い状態にとどまり、１０、１０³及び１０⁴pfuで単一の死亡例が見られた（表８）。考察及び結論Ｍｅｎｇｏ−ＬＣＭＶ組換え体ｖＬＣＭＧ４について得られた結果は、ＨＩＶ組換え体ｖＭＬＮ４５０について得られた結果を確認し、拡張している。すなわち、１）１４アミノ酸の外来性配列がメンゴウイルスゲノムに挿入されたが、生存可能性の損失はなかった。ｖＬＣＭＧ４はｖＭ１６及びｖＭＣＳに匹敵する高い力価まで生育し、プラーク表現型は親ウイルスについてと同じものである。２）ＬＣＭＶに対してｖＬＣＭＧ４で免疫された動物において、特異的免疫応答を誘発することができる。インビトロでのエフェクター細胞の二次抗原刺激なしに、免疫された動物の肝臓中に、ＬＣＭＶ感染標的細胞に対して強い一次ＣＴＬ活性を検出することができる。外来性抗原に対する体液性応答を誘発するメンゴウイルスの能力に加えて、この結果は、非相同配列に対する細胞性免疫応答を誘発するためのベクターとしてメンゴウイルスを使用する可能性を確認するものである。３）ｖＬＣＭＧ４での免疫の後、動物は、致死用量のＬＣＭＶ抗原投与に対して防御された。考察ポリオウイルス、ライノウイルス又はメンゴウイルスのようなピコルナウイルスは、そのＲＮＡゲノムが感染を受けた細胞の細胞質内で排他的に発現されることから、組換えワクチンの開発にとって魅力あるモデルである。我々は、新しいウイルスベクターとしてのメンゴウイルスを開発した。メンゴウイルスは、カルディオウイルスであり、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、コロンビアＳＫ及びMaus-Elberfeld ウイルスと同じ血清型を共有している（１、２）。メンゴウイルスは、霊長類を含む広範囲の動物種の体内で複製することができる（３、４）。遺伝子工学は、メンゴウイルスの病原性能力がゲノムの５′非コーディング領域内のホモポリマー状ポリ（Ｃ）トラクト（Ｃ₅₀ＵＣ₁₀）により支配されるということを示してきた（５、６）。ポリ（Ｃ）トラクトの短縮又は欠失は、細胞培養で容易に増殖でき、復帰突然変異に対して高い耐性をもつ、安定した形で弱毒化されたメンゴウイルス株を導く。全てのピコルナウイルスと同様に、メンゴウイルスゲノムは、一連の成熟した構造及び非構造タンパク質へとタンパク質分解によって切断される大きいポリタンパク質をコードする（２）。エンテロウイルス及びライノウイルスとは異なり、カルディオウイルス及びアフトウイルスのＰ１キャプシド領域には、リーダー（Ｌ）ポリペプチドが先行している。メンゴウイルスＬポリペプチドの長さは、６７アミノ酸である。ウイルスに対するその機能的関連性は、それがアフトウイルスにおけるＬタンパク質のようなプロテアーゼではないことから、わかっていない。ポリタンパク質からのＬの遊離には、ウイルスゲノム内で下流にコードされる酵素であるウイルスプロテアーゼ３Ｃによるタンパク質分解が必要とされる。弱毒化されたメンゴウイルスが、ウイルスベクターとして使用されうるか否か、そして組換え生ワクチンとして役立つ潜在能を有するか否か、を見極めるために、我々は、ＬポリペプチドをコードするｖＭ１６ゲノムの領域へとＨＩＶ−ＩＭＮｇｐ１２０のＶ３−Ｃ４ドメインをコードするセグメントを工学処理した。結果として得られた組換えウイルスは、正常なメンゴウイルスタンパク質と共にｇｐ１２０−Ｌ融合タンパク質を発現し、免疫された動物においてＨＩＶ−Ｉに対する強い体液性ならびに細胞性免疫応答を惹起した。我々はここで、メンゴウイルスを免疫原性の外来性タンパク質配列の発現のためのベクターとして使用できるということを実証してきた。この場合、ＨＩＶ− ＩＭＮｇｐ１２０からの１４７のアミノ酸を、メンゴウイルスのｖＭ１６株のＬポリペプチドのＮ末端へとフレーム内で融合させた。組換え体は、ｖＭ１６に比べて幾分か小さいプラークサイズ及び低いウイルス収量を示すものの、生存可能であった。ｖＭＬＮ４５０ウイルスは、ＨＩＶ−Ｉ配列を完全に保持しながら細胞培養で少なくとも４サイクルについて安定した形で継代され得た。ポリオウイルスゲノムのサイズを組換えバイシストロン構造の中で最高１７％まで増大させ、生存可能性は減少するものの、それでもなお包膜させることができる、ということが報告されていた。野生型に比べて３１％長いポリオウイルスゲノムは、包膜されない（１３）。ｖＭＬＮ４５０のビリオンはＨＩＶ−Ｉ／メンゴ組換え体ＲＮＡゲノムを担持するが、ウイルスキャプシドは親メンゴウイルスのものと同一である。ＨＩＶ−Ｉ配列は、その他のメンゴ非構造タンパク質について標準的であるように、感染中にのみ複製及び発現される。融合タンパク質とＰ１領域との間のウイルス３Ｃ切断部位は、通常の要領で認識され、プロセシングされる。５′非コーディングＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）により誘導されるポリタンパク質の翻訳（１４〜１６）も同様に正常であり、融合タンパク質配列の適切なＡＵＧで開始される。多種多様な非相同タンパク質配列の効率的な翻訳を誘導するこのＩＲＥＳの能力は、すでに十分立証されている（１３、１７）。例えば、我々は最近、狂犬病特異的抗体により免疫沈降され得るΔＧ−Ｌ融合タンパク質を発現する、狂犬病ウイルスＧタンパク質の一部分をコードする新しいメンゴウイルス組換え体を構築した。我々は同様に、弱毒化メンゴウイルスゲノムのＬタンパク質領域内へのほぼ全ての抗原コーディングｃＤＮＡセグメントの挿入を可能にするベクターカセットをも工学的に作成した。ピコルナウイルスの感染サイクルの細胞質という場所、及びピコルナウイルスのゲノミックＲＮＡが逆転写を受けないという事実は、組換え生ワクチンとして使用するためのあらゆるウイルス発現ベクターについて望ましい特徴である。ｖＭ１６系は、潜在的に、さまざまな哺乳動物宿主において広い応用性と安全性を示すことができる。この最新の研究において報告されている満足のいく、かつ予想外の側面は、弱毒化メンゴウイルスに対する免疫原性応答が、ウイルスによってその制限された複製中に担持され発現される非相同抗原にまで明らかに拡がっている、という点にある。細胞内で合成されたΔｇｐ１２０−Ｌタンパク質は、天然の抗原特性を保持し、ｇｐ１２０Ｖ３ループ特異的モノクローナル抗体により認識され得た。ｖＭＬＮ４５０でのマウス又はサルの感染は、ＨＩＶ− Ｉｇｐ１６０と反応する高力価のポリクローナル血清を産生した。応答の効力は、融合タンパク質が、免疫学的に適切な形状で効率良く発現されたということを意味している。高いＨＩＶ特異的中和力価を達成するのに最適な抗原提示を決定するためには、非融合グリコシル化ｇｐ１２０セグメントの発現のような異なる発現モードを調べる必要がある。メンゴウイルスの宿主範囲が広く、その非構造タンパク質により標準的に惹起される体液性応答が強いことから、適切な非相同抗原を発現するｖＭ１６ベースの組換え体が、数多くの異なる動物宿主においてさまざまな病原体に対する高い力価の防御応答を誘発する確率は高い。例１１リーダーペプチドのＮ末端でのクローニングを容易にするメンゴウイルスｃＤＮＡ、ｐＭＣＳの構築本発明の実施態様においては、メンゴウイルスゲノムのＬコーディング領域内のＮｃｏＩ７２９部位におけるメンゴウイルスゲノム内への外来性配列のクローニングには、ｐＭＲＡ３／ｖＭＬＮ４５０の構築のために実施したとおりの２段階クローニング手順が関与する。まず第一に、ある配列をサブクローンｐＭＲＡ１にクローニングし、その後、単一部位へのクローニングでは適正な方向性ならびに逆方向での挿入が可能であることから、インサートの方向性を確認する。リーダーペプチド内への外来性配列のクローニングを加速するため、我々は、酵素ＸｈｏＩ、ＳｎａＢＩ及びＮｈｅＩのための制限部位を含む、ＮｃｏＩ部位７２９の部位の合成オリゴヌクレオチドを工学的に作成した。これらの制限部位は、メンゴウイルスｃＤＮＡ内には発生せず、メンゴウイルスｃＤＮＡ内への容易な１段階クローニングを可能にする。その上、インサート配列の各々の末端について異なる酵素が選択される場合、つまり例えばインサートの５′末端がＳｎａＢＩ部位を担持し、３′末端がＮｈｅＩ部位を担持する場合、メンゴウイルスゲノム内へのインサート配列の連結／挿入が方向づけ／強制されることになり、方向性についてのスクリーニングは必要とされない。ｃＤＮＡｐＭＣＳを含むカセットの生成：制限部位ＸｈｏＩ、ＳｎａＢＩ及びＮｈｅＩを含む二本鎖オリゴヌクレオチド（図２４）を、ｐＭＲＡ１の位置７２９でＮｃｏＩ部位に挿入し、ｐＭΔＬＦＵＳＬを得た。その後、ｐＭ１６の５．８kbのＳｐｈＩ−ＳｐｈＩフラグメントをｐＭΔＬＦＵＳＬのＳｐｈＩ部位１９２８へ移入し、結果としてプラスミドｐＭＣＳ（図２６）を得た。全てのＤＮＡ操作は、標準的手順にしたがって実施した（参考文献１１、４３頁）。オリゴヌクレオチドリンカー配列は、非メンゴアミノ酸をコードする（図２６）。ｐＭＣＳから由来し、許容ＨｅＬａ細胞にトランスフェクションされたＲＮＡは、親ｖＭ１６ＲＮＡのように大きなサイズのプラークを示す。ｐＭＣＳの有用性は、ＬＣＭＶエピトープの挿入により実証され、致死的ＬＣＭＶ感染に対するマウスの防御免疫応答を誘発することができる組換えメンゴウイルス、ｖＬＣＭＧ４の生成を可能にした。結論メンゴウイルスｃＤＮＡｐＭＣＳは、メンゴウイルスリーダーペプチドのＮ末端における外来性配列の容易でかつ方向づけ／強制されたクローニングを可能にする。メンゴ−ＬＣＭＶ組換え体ｖＬＣＭＧ４の構築によって立証されるように、生存可能な組換えメンゴウイルスをｐＭＣＳから生成することが可能である。例１２狂犬病ウイルス糖タンパク質のセグメントをコードする組換えメンゴウイルスの構築狂犬病ウイルスＰＶ分離株の糖タンパク質の線状中和エピトープＧ５−２４［ B．Dietzschold et al.，J．Virol．64：3804-3809（1990）］のための配列を含むプラスミドｐＲｂ５６［W．Tordo et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）8 3，3914-3918（1986）を参照されたい］から、３５０塩基対のＰＣＲフラグメントを生成した。増幅されたＤＮＡは、５′末端にＸｈｏＩ部位を、３′末端にＳｎａＢＩ部位を担持している。ＰＣＲフラグメント及びｐＭＣＳプラスミドを制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｎａＢＩで消化し、標準的手順（参考文献１１、４３頁）にしたがって精製し、連結した。結果として得られたプラスミドｐＭＧ５−２４を、上述のとおりに、トランスフェクションのためのＲＮＡを調製するのに使用した。組換えゲノムは、約２０kDaの予想されたサイズのＬ−ΔＧ融合タンパク質をコードする。ｐＭＧ５−２４ＲＮＡのトランスフェクションの後、生存可能な組換えウイルスを得た。ウイルスストックを調製し、前述のとおり、³⁵Ｓメチオニンの存在下でＨｅＬａ細胞に感染させるために用いた。ｖＭＧ５−２４に感染した細胞は、ｖＭ１６感染又は偽感染細胞には存在しない２２〜２５kDaの見かけの分子量をもつ付加的なタンパク質の存在を示す（図２７）。このタンパク質の正体を同定するために、前述のとおり、細胞質抽出物を狂犬病Ｇ５−２４特異的モノクローナル抗体ＲＶ２−２２Ｃ５で免疫沈降させた。H．Burschoten et al.，J．Gen．Virol．70：291-298（1989）を参照されたい。この２２〜２５kDaのタンパク質は、ｖＭＧ５−２４感染細胞からの細胞質抽出物から免疫沈降させることができた。これらの結果は、メンゴウイルスゲノムから付加的な外来性配列を抗原的に発現させることができる、ということを立証している。本明細書において言及、参照又は引用されているあらゆる刊行物、特許及び特許出願は、このような刊行物、特許及び特許出願が参照により包含されるべく、具体的に、かつ個別に示されているのと同じように、明らかに、参照により本書中に包含されるものである。Detailed Description of the Invention Mengovirus as a vector for expression of foreign polypeptides Before and after references to related applications This application is filed on June 3, 1993 in US Application Serial No. 08 / 090,5. It is a partial continuation application of No. 31. The entire disclosure of this application is relied upon and hereby incorporated by reference. Explicitly included here. Background of the Invention The present invention relates to one or more exogenous polypeptide for immunological and non-immunological purposes. Mengoviruses modified to contain nucleic acid encoding About. The modified Mengovirus of the present invention is a recombinant virus and / or chimeric virus. Can be Ils. Mengovirus is a picorna belonging to the genus cardiovirus It is a type of virus. The natural host for Mengovirus is the mouse, and Although it causes acute murine meningoencephalitis, mengovirus has a broad host range. Ma In addition to Us, mengoviruses include various animal species including pigs, elephants and humans. It can also infect primates. Picornaviruses are a family of pathogenic viruses. As an example of picornavirus Rhinovirus, a common cause of colds, and foot and mouse d isease) virus (FMDV), coxsackie virus, hepatitis A virus, and And mouse cardiovirus including Mengovirus and encephalomyocarditis virus Get angry It Picornavirus is an envelope containing a small positive-strand (+) sense RNA genome. It has a capsid lacking a cap. All picornavirus capsids are 5: Consists of a protein shell of 60 subunits with icosahedral symmetry of 3: 2 And each subunit has four non-identical polypeptide chains (VP1, VP2, VP 3 and VP4). This shell is a single-copy positive-sense RNA genome Is wrapped around. The three-dimensional structure of Mengovirus is resolved by X-ray crystallography. It is decided by the degree. Luo et al.,Science 235: 182-191 (1987). The Mengovirus viral genome has a positive strand R of approximately 7,800 nucleotides in length. It is an NA molecule. The genome is polyadenylated at its 3'end, It is covalently linked at its' end to the smaller viral polypeptide VPg. Me The Ngovirus genome is cloned in the form of complementary DNA (cDNA) molecules. Have been. The genome is a single open library that encodes a viral polyprotein. Including boarding frame. The viral protein is L-P1-P from N-terminal to C-terminal of the polyprotein. They are located within the polyprotein in the order 2-P3. Polyprotein is a series of Processed by cleavage events to give all structural and nonstructural proteins. This For details on the processing of Ann C. By Palmenberg, "Picornavirus Poly Proteolytic processing of proteins (Proteolytic Processing of Picorna viral Polyprotein ) ”, 44 Ann. Rev. Microbiol. 603 (1990), which is hereby incorporated by reference. . L is a leader polypeptid present in cardiovirus and aphthovirus Represents the P1 is a structural protein VP1, VP2, VP3 and VP4 (these are Are also identified as 1D, 1B, 1C and 1A, respectively). P2 and And P3 are non-requisites for viral RNA replication and polyprotein processing. It is a precursor of structural viral proteins. This viral RNA is infectious. When it is introduced into permissive cells, it It is possible to initiate a complete viral replication cycle that reproduces the infectious virus It means that you can. RNA polymerase from full-length viral cDNA By in vitro (in vitroRNA transcript synthesized in) is also infectious It has been shown. Duke et al.,J. Viol., 63: 1822 (1989). Mouse cardiovirus, such as mengovirus and encephalomyocarditis virus, And aphthovirus has a long homopolymer within its 5'non-coding sequence. Presence of the poly (C) -like tract distinguishes it from other positive-strand RNA viruses can do. Its length (typically 60-350 bases), and often Sequence discontinuities that interrupt this homopolymeric sequence (eg, uridine residues) are This poly (C) region has been used to characterize natural virus isolates. The exact biological function of is not clear. Mengovirus poly (C) tract , CDNA-mediated shortening attenuates the pathogenicity of this virus in mice . Duke et al.,Nature343: 474 (1990). VM16, an attenuated strain of Mengo virus, was identified by Duke et al., “5 ′ non-cody. Attenuat of Mengovirus by genetic engineering of ngpoli (C) tract (Attenuat ion of Mengovirus through Genetic Engineering of the 5'Non-coding Poly ( C) Tract) ",Nature343: 474 (1990), which is also incorporated herein by reference. , And Duke and Palmenberg, “comprising a short, distinct poly (C) tract. Cloning and Syntheses of Infectious Cardiovirus RNA sis of Infectious Cardiovirus RNAs Containing Short, Discrete Poly (C) T racts) ",J. Virol., 63: 1822 (1989) (also incorporated herein by reference) Shall be described). This attenuated strain is a 5'non-cord of its genome. It has a deletion in the poly (C) tract of the ing region. This attenuated strain is virulent ( virulent) Mengovirus and encephalomyocarditis virus (EMCV) challenge Protect your mouse from. Advances in recombinant DNA technology have enabled the development of live recombinant vaccines. Encapsulating a human or animal pathogen polypeptide and / or epitope or antigen Can result in a modified live virus that can be included and used in vaccines Suitable vectors are needed in the art. Summary of the invention The present invention is particularly directed to the case where the Mengovirus structural or nonstructural proteins are heterologous amino acids. A viable modified attenuated Mengo virus comprising a sequence, the viable modified Mengo virus Irs fusion protein, viable above Permissive cells infected with the modified mengovirus, the full-length sequence of the modified mengovirus Recombinant nucleic acid (RNA or DNA) containing, vaccine, and method of eliciting an immune response To help meet the above needs of the industry. . The present invention is, among other things, an attenuated strain, which comprises a heterologous nucleotide sequence and is viable. Modified Mengo virus. One aspect of the invention is an attenuated strain, which is a heterologous peptide. Viable, containing non-homologous nucleotide sequences encoding peptides or proteins It relates to a modified Mengo virus. In a further aspect, a viable modified Mengo The virus is a poly (C) gene in the 5'noncoding region of the Mengovirus genome. It is an attenuated strain that has a mutation or deletion in the lacto. In particular, one aspect of the invention is the 5 ′ non-coding region of the Mengovirus genome. And a recombinant attenuated strain having a deletion in the poly (C) tract of The Ilus leader polypeptide is full-length and contains non-homologous amino acids, Viable recombinant Mengo virus. In certain aspects of the invention, , A recombinant mengovirus is inserted after amino acid 6 of the leader polypeptide It also contains amino acids 299-466 of gp120 of the HIV-I MN isolate. Another aspect of the invention is an attenuated Mengowi which has a heterologous amino acid sequence inserted. A fusion protein comprising the full-length leader polypeptide of Ruth strain. In a further aspect, the invention is infected with the recombinant mengovirus of the invention. Permissible cells. In certain aspects, acceptable The cells are HeLa, VERO, BHK21, and P815 cells. A further aspect of the invention comprises Mengovirus nucleic acid sequences and heterologous nucleic acid sequences. Recombinant nucleic acid molecule (RNA or DNA). Preferably, the heterologous sequence is the entire Inserted within the Mengovirus sequence encoding the long leader polypeptide. More preferably, the recombinant nucleic acid molecule comprises a full length attenuated Mengovirus sequence and a full length It contains a heterologous sequence inserted within the leader polypeptide sequence. In yet another aspect, the invention provides a recombinant Mengovirus virus of the invention. Regarding the Rus Genome. Another aspect of the invention relates to a vaccine comprising the recombinant mengovirus of the invention. . In a particular embodiment, the vaccine is in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. Includes replacement Mengo virus. A further aspect of the invention is such as a human or animal seeking to elicit an immune response. Administration of the recombinant Mengovirus of the present invention to an organism by the parenteral or oral route And a method for inducing an immune response. The present invention also relates to immunogenic compositions. Such a composition is a recombinant Mengooil mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. Including A further aspect of the invention is between the heterologous amino acid sequence and the leader polypeptide. A viable recombinant mengoyl of the present invention further comprising a protease cleavage site at About Su In a particular aspect of the invention, the protease cleavage site is a protein It is an ase3C cleavage site. In yet another aspect, the invention provides a viable recombinant of the invention. Regarding permissive cells infected with Mengo virus, the permissive cells are Express a heterologous amino acid sequence. Brief description of the drawings FIG. 1 is a schematic diagram of the organization of the Mengo virus genome. FIG. 2 shows several restriction sites, the location of the T7 promoter (arrow), and p Sequence derived from Bluescribe M13 (+) (denoted as pBS, thin line) and barley Plasmid map of pM16 depicting the cDNA sequence (bold line) derived from Ils Is. FIG. 3 is a plasmid map of p05156S. FIG. 4 is a plasmid map of pMRA-1. Thick line from Mengo virus Represents a DNA sequence. The thin line represents the sequence from pBluescribeM13 (+). Arrow Represents the T7 promoter. Various restriction sites have been identified. Nucleotide turn The numbering indicates the nucleotide position in the recombinant plasmid. FIG. 5 is a plasmid map of pMRA-2. The thick line is due to the Mengo virus Represents the incoming DNA sequence. The thin line represents the sequence from pBluescribeM13 (+). The arrow represents the T7 promoter. Thick diagonal lines represent the sequence of Δgp120-VCN. . Various restriction sites have been identified. Nucleotide numbering is recombination plus Represents the position of the nucleotide in the mid. FIG. 6 is a plasmid map of pMRA-3. The thick line is due to the Mengo virus Represents the incoming DNA sequence. The thin line represents the sequence from pBluescribeM13 (+). The arrow represents the T7 promoter. Thick diagonal lines represent the sequence of Δgp120-VCN. . Various restriction sites have been identified Have been. Nucleotide numbering refers to nucleotides in recombinant plasmids Represents the position of. FIG. 7 is a diagram showing the organization of the vMLN450 gene and the sequence of the recombinant L protein. It's lamb. The amino acid (aa) derived from Mengo virus is written in normal characters and Amino acids from V gp120 are in bold. Amino acid derived from linker Is underlined. FIG. 8 shows the results of plaque assay. Figure 8a shows vM16 plaques. Phenotype, Figure 8b plaque representation of vMLN450 stained after 72 hours. It is a type. FIG. 9 shows the results of reverse transcription PCR (RT-PCR). RT-PCR , For lanes a-e oligonucleotide pair M-VDW-1 / 3'VCN Used and for lanes gk oligonucleotide pair M-VDW-1 / M-10. 94 was used. The template used in the reaction was a) vMLN450 RNA, b) vM16 RNA, c) negative control, d) pM16, e) pMRA-3, g) vM LN450 RNA, h) vM16 RNA, i) negative control, j) pM16, and And k) pMRA-3. Lane f: HindIII cleaved bacterio Contains phage lambda DNA. FIG. 10 shows the sequence (positive chain) and v of the Δgp120-VCN region at the DNA level. PCR products derived from MLN450 RNA were sequenced. The oligonucleotide used for this purpose is drawn. Sequences boxed are NcoI restricted It is a part. FIG. 11 shows a) mock-infected HeLa cells, c) vM16-infected HeLa cells, e) v. MLN450-infected HeLa cell cytoplasmic extract 12% SDS-PAGE gel. Immunity of cytoplasmic extract using MAb50.1 Epidemiological sediment was collected in lane b) for mock-infected cells and for vM16-infected cells. D), and vMLN450 infected cells in lane f). FIG. 12a shows vMLN450 with gp160 MN-LAI as antigen. , Sera from mice infected with vM16 and virus-free controls. The results of all ELISA assays are depicted. FIG. 12b shows vMLN450, vM with gp160 LAI as antigen. Sera obtained from Ba1b / c mice infected with 16 and virus free controls 7 depicts the results of an ELISA assay for. with gp160 LAI 2 weeks after the first immunization (filled bar: left) and 2 weeks after the second immunization The reactivity of the Ba1b / c serum (dotted bar: right) is shown. The titer is It is given as the reciprocal of the serum dilution giving an OD value of 1 at 490 nm. Figure 12c shows vMLN450, vM using gp160 LAI as antigen. Sera obtained from CBA mice infected with 16 and virus free controls The results of all ELISA assays are depicted. First with gp160 LAI Two weeks after the second immunization (filled bar: left) and two weeks after the second immunization (dotted circle) Shown bar: right) shows reactivity of CBA serum. Titer is O at 490nm It is given as the reciprocal value of the serum dilution that gives a D value of 1. FIG. 12d shows vMLN with gp160 LAI as antigen. Cynomolgus monkey and virus infected with 450, vM16 Figure 9 depicts the results of an ELISA assay on sera obtained from non-containing controls. It Cynomolgus pre-immune serum with gp160 LAI (filled bar: left ) And serum 4 weeks after immunization (spotted bar: right). The titer is 490 It is given as the reciprocal of the serum dilution giving an OD value of 1 in nm. FIG. 13 is a protease 3C cleavage site at the L-VP4 junction (junction). 3 is a diagram of the Mengovirus polyprotein showing positions. FIG. 14 shows the Δgp120-QG-L junction for vMQG-1 and vM16. Of the recombinant Mengo virus vMQG-1 showing the amino acid sequence of the region Is a diagram of. FIG. 15 is a flow chart of the procedure used to construct pMRA-5. FIG. 16 depicts the nucleic acid sequence of pM16. For viral sequences, use U ( That is, shown as an RNA sequence, and the plasmid sequence is shown using T (ie , As a DNA sequence). pM16 is a DNA plasmid. FIG. 17 depicts the nucleic acid sequence of pM16-1. The first base of this sequence is It is the first virus base. The viral sequence uses U (ie RNA The plasmid sequence is shown using T (ie, as a DNA sequence). It is shown. pM16-1 is a DNA plasmid. FIG. 18 is a comparison of the sequences of pM16 and pM16-1. FIG. 19 depicts the construction of pMLN450. HIV-IMN gp120 The cDNA sequence encoding amino acids 299-445 is a viral polyprotein. At the beginning of the open reading frame of pM16 cDNA L polypeptid It is inserted between amino acids 5 and 6 of amino acid (a). The resulting fusion tag The sequence of the protein Δgp120-L is shown in (b). Leader amino acids are normal In IPS, the gp120 amino acid is shown in bold. Encoded by a DNA linker Additional residues are underlined. FIG. 20. Plaque representation of vM16 (a) and vMLN450 (b) viruses. Shows the type. Parent virus formed on HeLa cell monolayer culture, and recombination Viral plaques were stained after incubation at 37 ° C for 72 hours. each The diameter of the well is 3.5 cm. FIG. 21 shows the expression of Δgp120-L in vMLN450 infected cells. There is. Mock infection (lanes A, B), vM16 infection (lanes C, D) and vMLN4. 50 (lanes E, F) infected HeLa cells³⁵Labeled with S-methionine. cell Quality extracts were prepared at 7 hours post infection and as previously described (12). It was analyzed by 12% SDS-PAGE. Some samples (lanes B, D, F) Were immunoprecipitated with 2 μg / ml MAb 50.1 before loading on gel (13). Me 3 shows migration of Ngovirus marker protein. FIG. 22 depicts the construction of pLCMG4. Figure 22a shows the tamper of pMCS. Part of the protein sequence and the corresponding DNA sequence. Figure 22b is a partial protein sequence of pLCMG4 and the corresponding DNA sequence. It Sequence of the leader peptide region at the beginning of the open reading frame Represents Indicates the restriction site. CDNA sequence encoding the LCMNNP sequence (in square (Enclosed sequence) is between the SnaBI and NheI sites of plasmid pMCS. Has been inserted. The underlined sequence results from the DNA linker. FIG. 23 shows vM16 and vM generated by transfection of HeLa cells. 3 shows the plaque phenotype of LCMG4 virus. Cells are in a 3.5 cm well The plants were grown in and dyed after 48 hours. FIG. 24 is a double-stranded oligo containing the restriction sites XhoI, SnaBI, and NheI. Draws a nucleotide. FIG. 25 shows the cDNA sequence and protein sequence of the L-coding region of pM16. Drawing a row. The location of the XhoI site is indicated. FIG. 26 depicts the L-coding region of PMCS. New restriction site Show. Non-Mengovirus amino acids originating from the DNA linker are boxed . FIG. 27 shows cytoplasmic extracts and radioimmunoprecipitates. Lane 1 is Of vMG-24-infected cytoplasmic extract using noclonal antibody RV2-22C5 Radioimmunoprecipitate. Lane 2 is cytoplasmic extraction of vMG-5-24 infected cells Things. Lane 3 is a radioimmunoprecipitate (mAb R V of vM16 infected cells. 2-22C5). Lane 4 is a cytoplasmic extract of vM16 infected cells Is. Lane 5 is a radioimmunoprecipitate (mAb RV2-22C5) of mock-infected cells. ). Lane 6 is a cytoplasmic extract of mock-infected cells. Detailed Description of the Invention In order that the invention described and claimed herein may be better understood. A detailed description of the obvious aspects is given below. In this description, various terms in the art are used. These terms are It is commonly used in its ordinary, well-recognized meaning. For use throughout this description The various terms that may be mentioned are defined below. As used herein, the term "recombinant virus" refers to genetically modified viruses. Says Irus. Recombinant virus is a protein from at least one other organism. Or it may contain nucleic acid. Therefore, the recombinant virus is a nonstructural heterologous polypeptide. Virus which expresses a virus, as well as a virus containing a heterologous polypeptide as a structural element. Can point to Ruth. Furthermore, the recombinant virus must be a chimeric virus. You can As used herein, the term "attenuated strain" refers to reduced disease-producing capacity and / or A strain having pathogenicity. As used herein, the term "genome" refers to all genes of a given species. Nucleic acid containing. The nucleic acids that make up the genome are RNs, depending on the nature of the species. It may be A or DNA. For example, picornavirus or other RNA viruses The human genome is composed of RNA, while the human genome is composed of DNA. Have been. As used herein, the term “heterologous” means that a given species is naturally A substance that is not found in. For example, when pointing to a specific virus and using The term "heterologous amino acid sequence" refers to the virus, eg, the virus Refers to an amino acid sequence not found in the protein. As used herein, the term "nucleotide or nucleic acid sequence" refers to adjacent nucleotides. A line of nucleotides linked by a covalent bond between the 3'and 5'carbons of the cleotide. A series of shapes. A nucleotide or nucleic acid sequence is an RNA or DNA sequence. You can As used herein, the term "amino acid sequence" is covalently linked. A linear sequence of amino acids. As used herein, the term "fusion protein" refers to at least two amino acids. A protein containing a no acid sequence, in which one amino acid sequence is Refers to something that is not found with the outside amino acid sequence. For example, Mengo virus The fusion protein is a Mengowi that is covalently linked to a heterologous amino acid sequence. A loose amino acid sequence can be included. As used herein, the term "epitope" refers to an amino acid in a protein. Acid configuration, which is the amino acid configuration Is associated with the immune response. For example, the epitope is It can be better recognized and defined by antigenic motifs that can elicit an immune response. Wear. The epitope may be, but is not limited to, a linear sequence of amino acid sequences. Absent. As used in this document, the term "permissive cell" means that the virus is productive. A cell that can be dyed. Therefore, the permissive cells for Mengovirus are Mengowi These are cells that can be infected by Ruth. As used herein, the term "recombinant nucleic acid molecule" refers to in vitro manipulation. A hybrid nucleic acid comprising at least two nucleotide sequences arranged together Cletide sequence (RNA or DNA) or a clone thereof. As used herein, the term "cDNA" refers to complementary DNA. genome When the organism is composed of DNA, cDNA is mRNA or its fragment. It is complementary to the In the case of an organism whose genome is composed of RNA, The cDNA is complementary to the genome of the organism or fragment thereof. As used herein, the term “polypeptide” is linked by peptide bonds. A linear sequence of linked amino acids. The term "polypeptide" Including but not limited to proteins. As used herein, the term "expression" refers to the production of a polypeptide from a structural gene. It is a course that is born. As used herein, the term "polyprotein" refers to two or more proteins. Is a linear sequence of covalently linked amino acids. In some cases The proteins that make up the polyprotein are Can be released by proteolytic cleavage. The genomic organization of Mengo virus is shown in FIG. This figure is for the genome Of viral polypeptides of Escherichia coli, and It depicts various intermediates in protein processing. Poly (C) regions are also identified in FIG. Duke et al. (Supra) and Duk Deletions in this region, as described by e and Palmenberg (supra). Is associated with an attenuated phenotype. As a result, mutations in the poly (C) region (eg Plasmids containing the cDNA of the Mengovirus genome (for example, substitutions and deletions) Is a composition of various aspects of the invention relating to recombinant Mengoviruses that exhibit an attenuated phenotype. It can be used as a source of Mengovirus DNA for construction. In a preferred embodiment of the invention, a suitable source of Mengovirus nucleic acid is Rasmid pM16. pM16 is the Collection N in Paris, France ationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), accession number I-13 13 was deposited on June 2, 1993. Partial plasmid of pM16 The map is shown in FIG. 2, and the sequence of pM16 is shown in FIG. This plasmid suddenly Mutated poly (C) tract, C₁₃UC_Ten, But otherwise double-stranded EcoRI and BamHI restriction sites of the replication vector pBluescribeM13 (+) It contains a DNA sequence corresponding to the full-length genome of Mengo virus inserted between. Conclusion As a result, this plasmid has the Mengovirus cDNA downstream of the T7 promoter. Contains A. In another aspect of the invention, a suitable supply of Mengovirus nucleic acid The source is pM16-1. pM16-1 also has accession number on June 2, 1993 Deposited with CNCM as I-1312. Figure 17 shows the sequence of pM16-1 Show. In another aspect of the invention, another plasmid is used as the source of Mengovirus nucleic acid. You may use as. For example, C₈PM18 encoding a poly (C) tract, Or C₁₂PM19 encoding a poly (C) tract, or poly (C) tract A plasmid with a complete deletion can be used. An attenuated phenotype is needed If not, C, which is a wild-type poly (C) tract₅₀UC_TenPM that encodes_wt Can be used. Each of these plasmids is outside the poly (C) tract. Since it contains DNA complementary to the Mengovirus genome, it can be used for various in vitro manipulations. Therefore, is it a Mengovirus plasmid (or wild-type Mengovirus DNA)? Another plasmid can be constructed. One possibility is a plasmid The EcoRV-AvrII restriction fragment containing the poly (C) tract of By substituting the appropriate EcoRV-AvrII fragment of the plasmid to be is there. Once a vector encoding the attenuated Mengovirus genome in DNA form was obtained Encodes an amino acid sequence to be expressed by recombinant Mengovirus A heterologous nucleotide sequence within the coding region of the Mengovirus genome Can be inserted. In a particular aspect of the invention, the nucleic acid sequences are heterologous. It encodes an antigen or an epitope. The site for inserting a heterologous nucleotide sequence must be a restriction site Can be. In a particular aspect of the invention, this site is the Mengovirus genome. NcoI restriction site spanning nucleotides 729 of When inserting a heterologous nucleotide sequence into a restriction site, the Mengovirus DNA vector The vector is digested with the appropriate enzymes to cut the DNA vector. Then heterologous The DNA sequence was ligated to the restriction-digested Mengovirus vector, Produce recombinant DNA molecule containing nom, which now contains a heterologous nucleotide sequence To achieve. If the non-homologous nucleotide sequence is not inserted at the restriction site, the person skilled in the art will A restriction fragment of the DNA vector containing the position can be selected. Next, select A heterologous nucleotide corresponding to the selected restriction fragment but inserted at the desired site. Synthetic DNA fragments can be synthesized that further include an otido sequence. This The synthetic DNA fragments of The recombinant DNA molecule containing the recombinant Mengovirus genomic cDNA. Can be generated. Heterologous nucleotide sequences can be prepared in a variety of ways. For example, Sequence encodes a heterologous polypeptide to be expressed by recombinant Mengovirus May be obtained by specifically cleaving the cDNA for For example, this is appropriate May be achieved using various restriction enzymes. Alternatively, the heterologous nucleotide sequence is It can be chemically synthesized using methods well known in the art. Recombinant men containing the desired heterologous polypeptide (eg, antigen or epitope) Goviruses and their proteins or expression products are Recombination involving heterologous nucleotide sequences inserted in the recombinant Mengovirus genome It can be obtained by producing an RNA transcript from a DNA molecule. example For example, in the case of pM16 and pM16-1, the RNA transcript is T7 RNA It can be produced in vitro using a enzyme. Alternative promoters and And the corresponding polymerase. Aliquot of the transfer mixture , Can be used to transfect permissive cells. For example, DE AE dextran, calcium phosphate, poly-ornithine, electroporation, and HeLa, VERO, BHK21, and P using adult transfection agents Mammalian cells such as 815 can be transfected. Offspring virus Production can be monitored by microscopy and the virus is a well-known method of cell disruption. , For example, by freeze-thawing. In certain aspects of the invention, the heterologous polypeptide is a leader polypeptide. (L) is inserted. 6 amino acids from the N-terminus of Mengovirus polyprotein The insertion of the exogenous epitope at Therefore, it was found that it does not interfere with the growth of the virus in vitro or in vivo. It was. At other insertion sites, the insert has important functions and functions in the viral life cycle. It may be chosen within the viral genome for insertion at non-interfering positions. Suitable insertion If there are no restriction sites at the site, they can be Can be introduced. Therefore, in principle, a well-defined functional area , Within the genome, except for the catalytic triad of 3C, for example. Restriction sites and other locations can be considered for insertion. With the preferred site Include non-structural regions of the genome such as P2, P3 and / or viral proteins The region corresponding to the N- or C-terminus of the quality is included. Producing fusion proteins containing foreign polypeptides such as antigens or epitopes In order to preserve the reading frame of the exogenous nucleotide sequence. In the sequence encoding the L polypeptide in the Mengovirus cDNA. Enter. Then the recombinant virus will become part of the viral polyprotein. Foreign sequences can be expressed. Polyproteins are especially Processed in the form of a fusion protein having an L polypeptide containing the same polypeptide. Be used. The fusion protein can then be obtained from the cytoplasm of infected cells It In the context of the present invention, the heterologous DNA sequence inserted into the Mengovirus vector is , Any amino acid sequence can be encoded. In certain aspects of the invention In addition, the amino acid sequence contains a heterologous epitope. In these aspects, Heterologous amino acid sequences are used to identify several foreign epitopes or single foreign epitopes. Or other amino acids, eg, Mengovirus amino acids The epitope can also be defined together with. In other embodiments, the amino acid sequence The rows can consist of substantially heterologous epitopes. As an example of the present invention The amino acid sequences of various embodiments are listed in Table 1. In aspects of the invention, the heterologous DNA sequence to be inserted is generally about 70 It is in the range of 0 to 1,100 bases. The sequences given in Table 1 are the recombinants of the invention. It is an example of a heterologous sequence for the construction of the Mengo virus. Given in this table Contains non-homologous sequences of non-species Recombinant mengovirus can be constructed as shown herein. Heterologous If the sequence is too large to be expressed in Mengovirus, , A set of recombinant mengoviruses, each expressing a portion of a given protein Can be built. The heterologous DNA sequences of the present invention can encode more than one polypeptide. Wear. The DNA sequences encoding the polypeptides may also be directly linked to each other. Alternatively, they can be separated by a connecting sequence. In a particular embodiment, this These joining sequences can code for a cleavage site. In an aspect of the invention, the recombinant viral L polypeptide is HIV-I. Includes a segment of gp120. In a particular embodiment, the L polypeptide is H It contains amino acids 299-446 of gp120 of the MN strain of IV-I. More specific state , Amino acids 299-446 of gp120 of the MN strain of HIV-I, It is inserted after amino acid 6 of the L polypeptide. This HIV sequence is Sequence and gp120 molecule coding for V3 loop constituting a sum determinant (PND) Contains downstream sequences involved in binding to the CD4 receptor. As a result Recombinant mengovirus is an anti-HIV which is recognized by an HIV-I specific antibody. HIV-I gp120-Mengovirus L fusion tag that induces -I antibody in animals Express protein. The HIV-I gp120-Mengovirus L fusion protein is found in animals It also elicits a gp120-specific cytotoxic immune response. For antigenicity, the L fusion protein containing the foreign epitope is native To elicit antibodies to various protein sequences and retain their ability to bind to them it can. Therefore, this strategy uses any foreign tamper that exhibits the desired antigenic properties. It can also be applied to quality. As a result, in the case of a single well-defined short epitope Contain recombinant epitopes containing these epitopes in a larger protein. Building a strategy is the strategy of choice. The recombinant virus of the present invention induces antibodies in mice and cynomolgus monkeys, This binds to the protein from which the exogenous sequence is derived, and / or the pathogen It has been shown to neutralize. So get infected with Mengo virus The induction of an immune response in other animal species, such as Predicted based on in vivo results. Therefore, a protective immune response is It can be induced by a recombinant virus. For example, the G protein of rabies Recombinant virus expressing sequences can be used as vaccines in animals, including mice It can be engineered according to the invention for use. Similarly, H Recombinant viruses expressing sequences from the TLV-I glycoprotein have been described as macaques, et al. Can be obtained for use in primates, or humans. Of proteins containing foreign epitopes expressed by recombinant Mengovirus Immunogenicity and antigenicity can be improved by various methods. Foreign epitome The size of the heterologous nucleotide sequence encoding the Express larger segments of foreign antigen up to size (or whole antigen) So increased Exogenous antigen can be present in its native form rather than as a fusion protein. , And the antigenicity and / or immunogenicity of the fusion protein To allow post-translational modifications such as glycosylation, which may be important for Achieves selective targeting of foreign antigens to cell compartments Can be made. In an aspect of the invention, the recombinant mengovirus comprises a plurality of single proteins. Can be expressed. Moreover, recombinant mengoviruses are Multiple sequences from the protein can be included. Therefore, the present invention provides for multiple diseases. Allows simultaneous immunization or induction of an immune response against the drug substance It In certain aspects of the invention, the heterologous polypeptide is a heterologous polypeptide thereof. Insert a protease cleavage site between the peptide amino acid sequence and the Mengovirus sequence. It can be expressed in a native form. In a preferred embodiment of the present invention, the Mengovirus protease 3C cleavage site To use. Endogenous Mengovirus Protease 3C is Mengovirus Polytan Involved in most amputations of the pak. For example, protease 3C is a precursor By specifically cleaving the protein L-P1-2A with a Q-G amino acid linkage, Mediates cleavage between the peptide and VP4 (1A), free L peptide and P1- Yields 2A. Figure 13: Mengoyl with this protease 3C cleavage site shown It is a figure of the genome. The amino acid sequence in FIG. It is a sufficient substrate for cleavage by thease 3C. Parks et al.,J.Viro1. 63: 1054 (1989). The entire disclosure of this document is hereby incorporated by reference. I shall. In an aspect of the invention, it encodes a protease 3C cleavage site A DNA sequence can be placed at each end of the heterologous DNA sequence to be inserted. Wear. Moreover, the cleavage site between viral proteins 2A and 2B, Asn-Pro- Gly-Pro sequences can also be used. The cleavage between 2A and 2B is an autocatalytic mechanism. Evidence that it occurs by breaking the glycine-proline bond by canism There is. Such a heterologous DNA sequence is used to construct a recombinant Mengovirus. The resulting heterologous polypeptide, when used in Can be released from the Mengovirus polypeptide by mechanical cleavage. Heterologous polypeptides can target to specific cell compartments. Wear. Including a nuclear localization sequence such as that of the SV40 T antigen Will cause the protein to be targeted to the nucleus. On the other hand, β -2- A signal sequence, such as that of microglobulin, allows the polypeptide to be packaged And allow post-translational modifications such as glycosylation and secretion into the medium Will be. In addition, sequences such as the HIV-I gp41 transmembrane sequence are Can be used as a marker sequence to insert a polypeptide into the cell membrane can do. In a further aspect, two or more different proteins are combined with two or more recombinant viruses. For co-transfection of target cells with Ruth Therefore, they may be co-expressed in the same cell. This is a cotransfection Can allow various intermolecular interactions in targeted cells . The recombinant Mengovirus of the present invention may be used as a vaccine or in an immunogenic composition. Can be used as a part. The subjects to be vaccinated are the human body, Sensitive to primates, non-human primates, mammals, mice, or mengovirus Mention may be made of any other animal which can be dyed. In an aspect of the invention, The recombinant mengovirus is mixed with the vaccine or vaccine in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. Is present in the immunogenic composition. Examples of suitable carriers include viral stability. Includes any buffering agent that is supportive and acceptable for use in animals or humans. It Live vaccines do not require adjuvants. In another aspect of the invention, The vaccine or immunogenic composition comprises the Mengovirus fusion protein of the invention, The fusion protein contains the antigen in a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier. Contains heterologous amino acid sequences. Mengovirus is a live vaccine or Particularly attractive as an immunogen. 1. The vM16 strain and other attenuated strains described herein are due to the attenuation resulting from the deletion. Therefore, it is difficult to return to toxicity easily. In the context of the present invention, poly (C) tiger Using a genetically engineered Mengo virus that is deleted in the whole Is possible. 2. The broad host range of Mengovirus is due to a variety of medically or veterinarily important diseases. Vaccines in many different animal species against drug substances or Enables its use as an immunogen, eg HAV, HIV, HTLV, madness Canine disease, FMDV, bovine coronavirus, herpes virus, measles, moon Pus and respiratory syncytial virus (RSV) You can 3. Form of live vaccine capable of replicating in vivo after parenteral or oral administration Use of Mengovirus in Vaccines in Vaccines in the Humoral Immune Response and Cellular Immunity It will allow both of the responses, in particular the induction of cytotoxic T cell responses. 4. The ability of mengovirus to grow in the intestine after oral immunization is It allows for the induction of both focal immune responses and local mucosal responses. This is HIV, Particularly suitable in the case of pathogens such as HPV, HTLV, TGEV or rotavirus. I'm sorry. The recombinant virus of the present invention can be used in various non-immunological methods. It For example, recombinant viruses produce large amounts of the nucleic acid or protein of interest. To be used as a cloning or expression vector in, for example, tissue culture. You can Heterologous proteins expressed in cells infected with recombinant mengovirus Proteins can be purified in large quantities from infected cells. Moreover, the recombinant virus of the present invention can be used for various pathogens or cells involved in diseases. Used to deliver specific inhibitors of function to various cellular or subcellular locations Can be The following example is given as a method of explanation to facilitate a better understanding of the invention. However, it is not intended to limit the present invention. In addition, detailed The description sets forth the preferred embodiments of the invention. Also, it should be understood that it is given only as a method of explanation. This Various changes and modifications within the spirit and scope of the present invention should be understood from the detailed description. This will be obvious to those skilled in the art. Example Materials and methods Construction of vMLN450 All DNA manipulations were done according to standard procedure (7). T7 promoter From plasmid pM16 containing vM16 Mengovirus cDNA downstream of (5) 5.8 kb SphI-SphI fragment (plasmid bases 1928-77 75) deletion resulted in subclone pMRA1. HIV-IMN The gp120-specific DNA was labeled with the oligonucleotide 5'VCN (ATATGTTGACCATGGA ACAAATTAATTGTACAAGACCC) and 3'VCN (TAATCCATGGCGGTCAACGTGGGTGCTACTCC) TAATGG) and using M.P. Plasmid pTG5 kindly provided by Kieny Amplified by PCR from 156 (Transgene SA, Strasbourg). First, The PCR fragment was cloned into pMRA1 at the NcoI site (viral base 729). After roning, the plasmid pMRA2 was obtained as a result. SphI of pMRA2 By transferring the 5.8 kb fragment of pM16 to the site The long cDNA was reestablished and the plasmid pMRA3 was obtained. By PCR, claw Determine the correct orientation of the trained sequence,E. coli For DH5α (Promega) To amplify the plasmid. The transcript of infectious RNA derived from pMRA3 was cloned into T7 RNA polymerase. Prepared in E. coli and transduced into (5) HeLa cells as described. As a result, recombinant Mengo virus vMLN450 was obtained. He Described by making stocks of vM16 and vMLN450 by passage in La cells (8) Titrate as described, and use this for the Mengovirus-specific oligonuclides. Ochido 5'194- (TAGGCCGCGGAATAAGGCCGGTGTGC) and 3'1094- (GGAGCATGTTCGAGAAAGCATTGAC) to determine the presence of the inserted HIV-I sequence. It was analyzed by RT-PCR. Immunity and ELISA test 10-week-old BALB / c mice were treated twice on day 0 and day 56 with 1 in PBS. 0⁶vMLN450 or 10 of pfu (plaque forming unit)⁶With pfu vM16 , Immunized intraperitoneally. Control animals received PBS alone. Adult cynomolgus monkey Is 10 in PBS⁶Immunize intramuscularly with pfu vMLN450 or vM16 It was ELISA plate (Nunc Maxisorb) was purified at 50 ng per well Coat with recombinant gp160LAI or gp160MN-LAI (Transgene) And incubated with serial dilutions of serum, followed by horseradish Hyperoxidase-conjugated sheep anti-mouse IgG (H + L) antibody (Diagnostics Pa steur) or rabbit anti-monkey IgG (H + L) antibody (Nordic) I got it. ELAVIA test (Diagnostics Pasteur) is a manufacturer's protocol It was carried out according to Le. HIV-I MN Neutralization Assay Is 3.5 × 10^FiveMT4 cells were used as described in (9). Between days 6 and 10, fused cell (syncytium) formation was monitored. Example 1 Construction of pMRA-3 Facilitates cloning of Mengo virus cDNA into NcoI site 729 Therefore, a 5.8 kb SphI (1928) -SphI (containing two NcoI sites 7775) construct a deletion clone of pM16 by deleting the fragment. Built The resulting clone designated pMRA-1 (FIG. 4) was It contains a unique NcoI site at position 729. From the plasmid p05156S using the following oligonucleotide HIV-I-MN specific DNA flag of 478 bp by ze chain reaction (PCR) Generated a statement: Plasmid p05156S is depicted in Figure 3 and is shown in Trangene S.A. (France). , Strasbourg). For p05156S, see patent application WO9 2/19742. The MN sequence of the genome is Gurgo et al., 19 88, Virology 164: 531-536 (1988), see this document. Are included in this document. The amplified sequence Δgp120-VCN is the HIV-I-MN glycoprotein ( gp) 120 corresponding to amino acids 299-446. Δgp120-VCN was added to 5 ng template at a concentration of about 100 mM oligonucleotid. P05156S was generated using Stratagene. Using the PFU polymerase obtained from the same company, the PFU amplification strain obtained from stratagene was also used. It was produced under standard temperature cycling conditions using a buffer. Then, the Δgp120-VCN fragment was added to the NcoI site 7 of pMRA-1. Cloned into 29 to generate pMRA-2. pMRA-2 is depicted in Figure 5. Have been. Correct orientation of the Δgp120-VCN insert in pMRA-2 and Length was determined using oligonucleotides M-1094, 5'VCN and 3'VCN , Confirmed by PCR. The oligonucleotide sequence of M-1094 is as follows: Is: The correct clone is a PCR fragment of 800 bp at M-1094 and 5'VCN. And no amplified DNA at M-1094 and 3'VCN. However, clones containing Δgp120-VCN in the wrong orientation were Paired results are shown. The 5.8 kb SphI (1928) -SphI (7775) fragment from pM16. The full-length cDNA was reconstituted by cloning the fragment back into pMRA-2. It was constructed, and as a result, the plasmid pMRA-3 was obtained. pMRA-3 is depicted in Figure 6. Has been. This plasmid is the L-peptide code for Mengovirus cDNA. Includes an additional 459 bp inserted in the frame within the reading region. It encodes the 8 kD fusion protein LN450 (Fig. 7). The 5.8 kb SphI (1928) -SphI (7 of pM16 in pMRA-3 775) The correct orientation of the fragment is BamHI (Boehringer Mannheim) And by double restriction digest with HindIII (Boehringer Mannheim). This double restriction digestion of the plasmid in the correct orientation results in 30 bases and This results in two DNA fragments of 11356 bases. On the other hand, incorrect black Shows two DNA fragments of 5821 and 5565 bases in length. . Example 2 Growth characteristics of vMLN450 Infectious RNA transcripts of vMLN450 and vM16 cDNA were cloned into BamHI. Digested with pM16 and pMRA-3 and T7 RNA polymerase ( In vitro by incubating Pharmacia) in a suitable buffer. Was produced in. An aliquot of this transfer mixture was added to 1 mg / ml DEAE dextran. And then "purified T7 RNA poly of Sylvie van der Werf et al. Synthesis of Infectious Poliovirus RNA by Melase ", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 2330 (1986), this lysis on monolayer cells. HeLa cells were aliquoted with this aliquot by incubating the solution for 30 minutes. Transfected. The entire disclosure of the above documents is incorporated herein by reference. Shall be provided. RNA derived from plasmid pMRA-3 into HeLa cells Transfection results in the production of viral vMLN450 did. Progeny virus production was monitored microscopically. Stock (preserved) viruses Infect confluent monolayers of HeLa cells at multiplicity of infection (MOI) 1 Were allowed to grow. Virus after complete cpe (cytopathic effect) Harvested. Intracellular virus is obtained by freezing and thawing the cells three times and centrifugation. Cell debris and nuclei were released by pelleting. The complete cpe is p 72 compared to 48 hours when cells were transfected with M16 RNA Observed after hours. vMLN450 grows to high titers, but compared to vM16 The slippage is about one third to one fourth. The plaque phenotype of the recombinant virus was tested. Without fetal calf serum (FCS) Dilute virus stock in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) and It was used to infect a confluent monolayer of a cells. 30 minutes of incubation The cells were then covered with DMEM containing 0.9% soft agar. Next, 3 cells Incubate for 72 hours at 7 ° C to remove intact (intact) cells from 0.2% It was stained with a listal violet solution. The plaque phenotype of recombinant virus harvested from the culture supernatant was Shown are medium sized plaques with an average diameter of about 65% of that of the larks (Figure 8). Example 3 Genetic stability of vMLN450 The transfection supernatant containing vMLN450 was added to HeLa cells. Viral RNA was extracted by subculturing 3 times on the cell. Recombinant virus vMLN450 Viral RNA from passage 3 of the oligonucleotides 5'VCN, 3'VCN , M-1094 and M-VDW-1 by RT-PCR (reverse transcription PCR). Analyzed. The sequence of oligonucleotide M-VDW-1 is as follows: Adams and Blakesley, Focus 13: 56-57 (1991) and Adams and Blakesley, Foc Sanger dideoxy sequencing as described by us 14: 31-33 (1992). Sequences for RT-PCR products by PCR sequencing methods derived from the method. Analysis was carried out. PCR fragments were extracted from the low melting point agarose gel and Different concentrations of dNTP and ddNTP, and 4 pmol³²P-end labeled primer About 200 ng of DNA was added to each of the four reaction mixtures containing. The reaction is TA Start by addition of Q polymerase (Amersham) and perform standard temperature cycling. Incubation was carried out for 20 times under amplification conditions. Sequencing reactions are performed under standard conditions It was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at. Oligonucleotide pair M-VDW-1 / M-1094 and 5'VCN / M-1 Analysis at 094 showed specific DNA fragments of 1,382 bp and 932 bp, respectively. It was revealed that the components can be amplified from the RNA of vMLN450. these DNA fragment produced from DNA fragment and plasmid pMRA-3 There was no apparent difference in size between the two. The results of these experiments are shown in Figure 9. You A wild-type size fragment showing a vM16-like back mutation to the virus is It could not be detected at all. The 1,382 bp fragment was partially sequenced and Further non-specificity was eliminated. The partial sequence obtained for vMLN450 is shown in FIG. It is shown as an underlined sequence at 0, which is the same as that of the original insert. No difference is shown. Example 4 Expression of LN450 in HeLa cells To analyze the expression of the fusion protein LN450, monolayer HeLa cells were Infected with vMLN450 of OI10, Le which is basically incorporated herein by reference. From infection as described in e and Wimmer's Virology 166: 405 (1988). 5¹/₂~ 7¹/₂After hours³⁵Labeled with S-methionine. 7 hours after infection, NP the cells Lysed at 40 and the cytoplasmic extracts are collected by Harber et al. , Journal of Virology 65: 326 (1991). afterwards,³⁵The protein labeled with S methionine was labeled with SDS polyacrylamide gel. Analysis by SDS-PAGE. Gel electrophoresis and autoradiation Ography was performed according to standard conditions. HeLa cells were infected with vMLN450 and vM16, respectively, and Quality³⁵Labeled with S-methionine. 7 after infection¹/₂Prepare cytoplasmic extract in time Made and then aliquots were analyzed by SDS-PAGE. vMLN450 Cells present in vM16-infected or mock-infected cells (FIG. 11, a, c) Absent Shows the presence of a single additional protein with an apparent molecular weight of 26 kDa (Fig. 1 1, e). The molecular weight of this protein is similar to that expected for LN450. Equivalent to. Example 5 Antigenic Antigenic properties of LN450, monoclonal antibody 50.1 (obtained from Repligen) Was assayed by immunoprecipitation method.³⁵VMLN45 labeled with S-methionine Aliquots of lysates of 0 infected cells were treated with 1 μg of MAb50.1 for 4 Incubate at ℃ for 1 hour, then suspend the same amount of Protein A-Sepharose Liquid was added and the mixture was incubated for 1 hour. Protein A-Sepharose compound The coalesced pellets and washed 3 times, followed by SDS-PAGE followed by auto It was analyzed by geography. Cell extracts of vMLN450, vM16-infected and mock-infected HeLa cells were used as monolayers. Immunoprecipitation with clonal antibody 50.1 (MAb50.1). This antibody is Confirms the V3 loop of the MN strain of HIV-I, which is the major neutralizing determinant of IV-I-MN. To know. The data shown in Figures 11, b), d) and f) are for vMLN450 infected cells. That only the 26 kD protein produced in is immunoprecipitable with MAb 50.1 And confirmed the identity (identity) of the 26 kd protein as LN450. ing. Example 6 Immunogenicity In one experiment, 10-week old Balb / c or CBA mice 10 in PBS⁶pfu vMLN450 (4 for Balb / c, CB 5 for A) or 10⁶pfu M16 (4 for Balb / c, CB (2 animals for A) were used to immunize intraperitoneally. 3 (Balb / c) or 2 Animals (CBA) received PBS as a virus-free control. To animals, A booster was given 8 weeks after the first immunization with an equal dose of virus. After immunization Blood samples were taken on day 14 to prepare serum. VMLN450 (3 animals) or vM16 (1 animal) approximately 4 x 10 in PBS^Five Using pfu, cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) Was immunized intramuscularly. Immunity After 28 days, blood samples were taken and serum was prepared. Recombination of ELISA plate (Nunc Maxisorb) with 100 μl per well E gp160MN-LAI or gp160 LAI (500 ng / ml in PBS) Coated with. gp160MN-LAI is gp1 from the MN virus strain. It is a fusion protein containing 20 parts and gp41 from the IIIB (LAI) strain. Wash plate and incubate with serial dilutions of mouse or monkey serum did. After incubating for 2 hours at 37 ° C, wash the plate and Shuperoxidase-conjugated monoclonal antibody [anti-mouse IgG (H + L) ( Diagnostics Pasteur) or anti-monkey IgG (H + L) (Nordic Immunology)] Add and incubate at 37 ° C. for 1 hour. After the final wash, OPD (670 μg / ml), H₂O₂The test was developed by adding (0.042%) solution. I let you. 4 NH₂SO_FourBy adding Stop the reaction and read the OD at 490 nm with a Dynatech ELISA plate reader. It was. 1 in 2 serial dilutions starting from 1/100 dilution of mouse serum Tested by inhibition assay. HIV-I-MN at the lowest concentration that induces fusion cell formation The diluted serum was added to the containing virus solution. Incubate the mixture for 1 hour And 3.5 x 10^FiveOf MT4 cells were added. 48 wells of cells Growth in an autoclave, dilute at a ratio of 1 in 4 on the 3rd day, and melt between the 6th and 10th days. Joint cell formation was monitored. Balb / c mouse, CBA mouse or cynomolgus monkey, 1 in the case of mouse 0⁶2 x 10 in case of pfu vMLN450 or monkey^Fivepfu vMLN450 10,⁶Immunizations were performed with either pfu vM16 or no virus controls. Exemption Mice were collected 2 weeks after the epidemic and 10 weeks after the immunization (2 weeks after the booster immunization). I got blood. Recombinant gp160 MN-LAI or gp160 using serum as an antigen Analyzed by ELISA using LAI. Blood samples from monkeys 4 weeks after immunization And analyzed in the same manner. The data shown in FIG. 12 and Table 3 show that the specific anti-HIV antibody Clearly found only in serum from mice infected with vMLN450 I have to. Anti-HIV-I titers increased approximately 35-fold after boosting animals with vMLN450. He rose and remained high for at least 10 weeks after the second immunization. CBA Similar results were obtained using mice. When analyzed in a neutralization assay using MT4 cells and HIV-I-MN (Table 2), 2 out of 4 Balb / c sera obtained 2 weeks after immunization A dilution of 1 in 00 completely inhibited virus-induced fusion cell formation. The HIV-I neutralizing antibody titer was determined by a fusion cell formation inhibition assay using HIV-IMN. It was decided (9). Neutralization titers were BALB / c mice immunized with vMLN450 Their 70-day serum was in the range of 1: 100 to 1: 400, while The value for litera was less than 1: 100. V3-specific responses in animals , Currently being measured. A comparable experiment was performed using cynomolgus monkeys. 10⁶pfu live vM16 Immunized animals with a single intramuscular injection of vMLN450. HIV-I specific antibody After 1 month, purified recombinant gp160MN-LAI (Table 4) or commercially available EL using one of the ELISA kits (ELAVIA) (data not shown) It was measured by ISA. Both trials increase in monkeys immunized with vMLN450 Gp160-specific antibodies were present, whereas animals immunized with vM16 showed no It was revealed that no reactivity was exhibited. Example 7 gp120-specific cytotoxic immune response HIV-IMN gp1 in addition to B-cell and T-helper cell epitopes 20 V3 loop sequences are H-2^dRecognized by mouse with haplotype (10) Contains MHC class I restricted cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitopes Has been shown. Therefore, we have immunized BALB with vMLN450. Of a cytotoxic cellular immune response against this epitope in / c mice I checked about. Splenocytes from immunized mice were in vitro transfected with P18-MN peptides. Peptide PI8-stimulated with peptide and containing the V3 CTL epitope sequence (10) Synthetic target cells pulsed by MN Cells (P815) were assayed for cytotoxic activity. As shown in Table 5 And the effector of 25: 1 in vMLN450 immunized animals A clear HIV-IMN-specific cytotoxic activity can be demonstrated in the target-to-target ratio However, it could not be proved in animals immunized with the parent vM16. This activity is MH I was restricted by C Class I. See reference 11. Splenocytes from BALB / c mice immunized with vM16 or vMLN450 were And then restimulated in vitro as described in Materials and Methods. did. The cytolytic activity is P18-M at an effector: target ratio of 25: 1. It was measured on P815 cells pulsed or not pulsed with N peptide. The cytotoxicity assay was performed as follows. BALB / c mice on day 0 and On the 21st day, 10⁶Immunized intraperitoneally with pfu vM16 or vMLN450 . Splenocytes from 3 mice per lot were harvested after 10 days, pooled, 7 P18-MN peptide (10) for 5 days followed by 5 days as a growth factor source In vitro with P18-MN peptide in the presence of medium containing% concanavalin A supernatant I re-stimulated in Russia. Determine the cytolytic activity of stimulated splenocytes for 5 h⁵¹Cr-release assay Determined by The target cells are Received a pulse,⁵¹They were P815 tumor cells labeled with Cr. Specific⁵¹C The percentage release of r is [(experimental release-spontaneous release) / (maximum release-spontaneous release) Spontaneous release)] x 100. Spontaneous release is 1% Triton X- Less than 20% of the maximal release obtained by incubation with 100 . Example 8 Construction of vMQG-1 The HIV-I-MN gp120 sequence used in this construction was vMLN4. 50 generated as described above in the construction description. However, the amino acid sequence is H The C-terminus of the IV insert and the N-terminus of the L-peptide are described in Figure 14. Changed as follows. A non-homologous truncated gp120 or fragment thereof at the N-terminus of the L-peptide , And by the protease cleavage site (s), eg 3C, The production of recombinant mengovirus vMQG-1 isolated from the peptide is vMLN4 The potential to increase expression and immunogenicity of the gp120 sequence compared to 50. I have a secret. Fragments of gp120 elicit an immune response in animals Select In a particular embodiment, these fragments are between 20 and 100 It is composed of amino acid peptides. A flow chart of the construction of pMRA-5, the vMQG-1 cDNA, is presented in FIG. . The sequence of LQGd / s labeled with the synthetic double-stranded oligonucleotide in FIG. 15 is , Is as follows: Briefly, PCR amplified sequence Δgp120-VCN was cloned into HincII and And NcoI, and a 451 bp fragment was isolated. This Fragment To a synthetic double-stranded oligonucleotide LQGd / s encoding a 3C cleavage site. Connected. Restrict the resulting ligated fragment with NcoI, p It was inserted into the NcoI restriction site of MRA-1. The resulting plasmid is p It was named MRA-4. The 5.8 kb SphI fragment of pM16 described above was transformed into S pI (1926) was inserted into pMRA-4 to restore full-length Mengovirus sequences. And pMRA-5 is prepared. pMRA-5 was transcribed in vitro, resulting in The resulting RNA is used to infect HeLa cells to generate virus. In the case of vMQG-1, an additional 486 in the Mengovirus genome In the case of vMLN450, the insertion of bases is a set in which the insertion of 459 bases is completely viable. It has been confirmed that it will interfere with the viability of the virus because The rate is low. Incorporation of a 3C cleavage site between the heterologous amino acid sequence and the L peptide The mutant L of Mengovirus L shown in FIG.^*On the N-terminal of The chilling signal was retained. Furthermore, L^*Changes in the N-terminal amino acid sequence in This change only replaces the first two amino acids (MA) with the amino acid sequence GNS. Since it does not include L^*It is not expected to interfere with the function of the peptide. N Similar deletions of terminal amino acids and fusions with non-homologous amino acids were used in vMLN450. They were shown to have no dramatic effect on virus viability. Expression of vMQG-1 protein is proteolytic by protease 3C. After cleavage the proteins Δgp120-Q and L^*Should occur. gp12 The difference between 0-Q and gp120-VCN is at the C-terminus of the protein. The entire sequence of Δgp120-Q is as follows: The localization of Δgp120-Q in the cell is cytoplasmic and L^*What is peptide localization? Expected to be irrelevant. Furthermore, this strategy uses a signal sequence or its sequence at the N-terminus of the Δgp120 sequence. Information applicable to cloning any other heterologous insert in May result in increased immunogenicity, leading to the secretion of foreign inserts. Highly efficient. Example 9 PM16-1 as a source of Mengovirus DNA Using the plasmid pM16-1 as the Mengovirus nucleic acid source, An example can be implemented. pM16-1 is a nucleotide in the plasmid region It contains a deletion of 10,931 to 10,950 and increases the infectivity of the transcript. The result has been brought. The sequence of pM16-1 is shown in FIG. 18 shows the sequence comparison between pM16-1 and pM16-1. Recombinant virus such as vMLN450 For the construction of the lus, pM16-1 or Mengovirus cDNA Any other version can be used. Example 10 Using recombinant mengovirus Protection of mice from lymphocytic choriomeningitis infection Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) nucleoprotein as a model Well-characterized immunodominant cytotoxic T lymphocytes (CTL) from (NP) Epitope was used. Introduction of this epitope into the vaccinia virus is BAL B / c (H-2^α) Induction of protective immunity against lethal LCMV infection in mice Has been previously shown. J.C. Whitton et al., J. Vir ology 67: 348-356 (1993). 9 amino acid (aa) CTL epitope; Pro Gln Expression of 14 amino acids of LCMV NP containing Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Mengovirus chimera vLCMG4 was constructed. Materials and methods Construction and production of vLCMG4 DNA manipulation, transcription, transfection, tissue culture of HeLa cells, and media Ngovirus production was performed as described above. Cytotoxicity assay Basically, P.L. Gossens, H. JOUIN and G. Milon, “For Listeriosis in Mice Of lymphocytes and inflammatory cells that are recruited to the liver during the procedure ", J. Immunol., 147, LC in the liver from immunized animals as described by 3514-3520. Primary cytotoxic activity against MV was examined. Each liver was phosphated in a potter's glass crusher containing 10 ml of HBSS + antibiotics. Modify, screen through a nylon sieve, and centrifuge for 10 minutes at 150g at 4 ° C. Released. Each pellet was treated with 0.03% trypsin and 33 μg / ml DNAse-1. Resuspended in 45 ml of HBSS adjusted to. Mix the mixture with 10% fetal bovine serum ( Before adjusting to FCS), incubate the cells for 45 minutes at 37 ° C with gentle shaking. Incubated. The cells were washed twice with HBSS and the final pellet was washed with 1 ml of complete RPMI 1640 medium (10% FCS, 1% L-glutamine, 4 x 10^-FiveM's β-mercaptoethanol). Count cells and perform CTL assay Therefore, the concentration was adjusted to an appropriate level. J77 uninfected or LCMV infected 4 target cells at 37 ° C. for 1 hour at 200 μCi⁵¹Radiolabeled with Cr, washed, 10 per well containing diluted effector cells^FiveCells / 100 μl Combined, distributed in 96 well plate. Ink the plate for 4 hours at 37 ° C. Prior to incubation, it was subjected to 100 g centrifugation for 2 minutes. Centrifuge once more After that, the supernatant was collected and counted with a gamma counter. Specific cytotoxicity is experimentally Release-spontaneous release / maximum release-spontaneous release I calculated. Note that here spontaneous release is determined in the absence of effector cells. However, 100% release was determined in the presence of 1% Triton. Immunity Eight week old female BALB / c mice from Iffa-Credo were treated with 0.2 ml of PBS or Different doses of vM16, vLCMG4, or LCMV Armstrong strain (LCMV-ARM; Scripps Research Institu te, La Jolla, obtained from Dr. Oldstone, USA). Immunized within. LCMV-ARM is the American Type Culture Collection (US Reference stock collection institution) 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 with accession number AT Deposited as CC VR-134. 10 days after immunization (pi), To test for next protective response, and p. i. Remember on the 43rd or 45th day 10 in 30 μl to test for response^2.8Using pfu's LCMV-ARM The mice were then intracranially challenged. result Construction and growth characteristics of vLCMG4 Double-stranded synthetic oligonucleosides encoding LCMV NP as 117-130 Tide with the restriction site SnaBI (747) of Mengovirus cDNA pMCS. In-frame with NheI (754) and insert plasmid pLCMG4 Generated (FIG. 1). Sequence the plasmid DNA through the mutated region Decided Transfection of pLCMG4 RNA transcript into HeLa cells , Recombinant virus vLCMG4 was generated. On transfection and infection The virus from Qing shows the same plaque phenotype as its parent vM16 or vMCS. (Fig. 2). After passage in HeLa cells, vLCMG4 was expressed as vM16 or v It grows to high titers comparable to MCS. LCMV-specific cytotoxicity J775 control in which animals immunized with PBS and vM16 received syngeneic LCMV infection LCMV and vLCM, while not showing any lytic activity on specific cells Animals immunized with G4 show specific cytotoxicity even at low effector / target ratios Shows toxicity (Table 6). Vaccination of BALB / c mice against LCMV challenge by single dose Immunity 10⁶pfu vM16 or vLCMG4, 2x10^FiveLCMV-ARM of pfu, or Immunize mice ip with tissue culture medium as a virus-free control. It was LC on day 10 or 43 as described in Materials and Methods Animals were challenged by intracranial injection of MVs. All deaths occurred before the 10th day. It's confused. No protection was obtained for animals fed vM16 or medium, whereas Complete protection was observed for animals immunized with, LCMV and vLCMG4 (Table 7). Dose-dependent protection To assess the minimum required dose for effective vaccination with vLCMG4 , BALB / c mice were immunized with different doses of vLCMG4. 100% Protection can be observed at doses as low as 100 pfu 10 days after immunization at 10 pfu When the animals were immunized, the protection was still 60% (2 out of 5 died). Exemption Forty-five days after the epidemic, the defense level remained very high at 10, 10³as well as 10^FourA single death was seen in pfu (Table 8). Discussion and conclusion The results obtained for the Mengo-LCMV recombinant vLCMG4 are HIV The results obtained with recombinant vMLN450 have been confirmed and expanded. Sanawa Chi, 1) A 14-amino acid exogenous sequence was inserted into the Mengovirus genome but survived. There was no loss of ability. vLCMG4 is as powerful as vM16 and vMCS Growing to valency, the plaque phenotype is the same as for the parental virus. 2) Specific immune response in animals immunized with vLCMG4 against LCMV Can be triggered. No secondary antigen stimulation of effector cells in vitro In addition, strong primary CTLs against LCMV-infected target cells in the liver of immunized animals The activity can be detected. Mengo induces a humoral response to foreign antigens In addition to the ability of the virus, this result elicits a cellular immune response to heterologous sequences. To confirm the possibility of using Mengovirus as a vector for delivery is there. 3) Following immunization with vLCMG4, animals were challenged with a lethal dose of LCMV challenge. Was defended. Consideration Picornails such as poliovirus, rhinovirus or mengovirus The RNA genome is exclusively expressed in the cytoplasm of infected cells. Therefore, it is an attractive model for the development of recombinant vaccines. We are new We developed Mengo virus as a viral vector. Mengovirus is Cal Diouill Encephalomyocarditis virus (EMCV), Columbia SK and Maus-Elberfeld It shares the same serotype as the virus (1, 2). Mengo virus causes primates It can replicate in the body of a wide range of animal species, including (3,4). Genetic engineering The pathogenic potential of Mengovirus is a homopolymer within the 5'noncoding region of the genome. -Shaped poly (C) tract (C₅₀UC_Ten) Has been shown to be dominated by (5, 6). Shortening or deletion of the poly (C) tract allows easy growth in cell culture. Stable and attenuated bark that is highly resistant to back mutations Lead the Ils strain. Like all picornaviruses, the mengovirus genome has a series of mature Large Politas Proteolytically Cleaved into Structural and Nonstructural Proteins Code quality (2). Unlike enteroviruses and rhinoviruses, cardioviruses and The P1 capsid region of Phtvirus is preceded by a leader (L) polypeptide ing. Mengovirus L polypeptide is 67 amino acids in length. Will Its functional relevance to the It is not known because it is not such a protease. From polyprotein L is released by the viral progeny, an enzyme encoded downstream in the viral genome. Proteolysis by thease 3C is required. Attenuated Mengooil Whether it can be used as a viral vector, and In order to determine whether it has the potential to Of the HIV-IMN gp120 into the region of the vM16 genome that encodes The segment encoding the V3-C4 domain was engineered. As a result Recombinant virus together with the normal Mengovirus protein together with gp120-L fusion protein. Strong humoral response to HIV-I in immunized animals expressing synthetic protein And elicited a cellular immune response. We hereby present the expression of an immunogenic foreign protein sequence for Mengovirus. It has been demonstrated that it can be used as a vector for In this case, HIV- 147 amino acids from IMN gp120 were added to the vM16 strain of Mengo virus. In-frame fusion to the N-terminus of the L polypeptide. The recombinant is vM16 Viable with slightly smaller plaque size and lower virus yield It was Noh. The vMLN450 virus retains the complete HIV-I sequence It could be stably passaged for at least 4 cycles in cell culture. Up to 17% of the size of the poliovirus genome among recombinant bicistronic structures Can be increased and the viability is reduced, but it can still be enveloped. It was reported that it was possible. 31% longer poliovirus than wild type The genome is not enveloped (13). The virions of vMLN450 are HIV-I / Me It carries a recombinant RNA genome, but the viral capsid is the parent mengovirus. It is the same as that of Su. The HIV-I sequence is linked to other Mengo nonstructural proteins. It is only replicated and expressed during infection, as is standard. Fusion protein The viral 3C cleavage site between the P1 region and the P1 region is recognized and processed normally. Be used. 5'non-cor Polyproteins induced by ding IRES (internal ribosome entry site) Translation (14-16) is also normal, and the appropriate AUG of the fusion protein sequence Started at. This induces efficient translation of a wide variety of heterologous protein sequences The capabilities of IRES have already been well documented (13,17). For example, we Recently expressed a ΔG-L fusion protein that can be immunoprecipitated by a rabies-specific antibody , A new mengovirus encoding a part of the rabies virus G protein Recombinant was constructed. We also like the L protein of the attenuated Mengovirus genome Allows the insertion of almost any antigen-encoding cDNA segment into the cytoplasmic region The vector cassette was also engineered. The location of the cytoplasm of the picornavirus infectious cycle and the picornavirus The fact that genomic RNA of E. coli does not undergo reverse transcription This is a desirable feature for any viral expression vector for use. v The M16 system potentially has wide applicability and safety in various mammalian hosts. Can be shown. The satisfactory and unexpected aspects reported in this latest study are: The virus limited its immunogenic response to virulent mengovirus It clearly extends to heterologous antigens that are carried and expressed during replication. It is in. Intracellularly synthesized Δgp120-L protein exhibits natural antigenic properties. Retained and could be recognized by a gp120 V3 loop-specific monoclonal antibody . Infection of mice or monkeys with vMLN450 resulted in HIV- High titers of polyclonal sera that react with I gp160 were produced. Response efficacy Means that the fusion protein was efficiently expressed in an immunologically appropriate shape. Means Determine optimal antigen presentation to achieve high HIV-specific neutralizing titers To determine the expression of the unfused glycosylated gp120 segment. It is necessary to investigate the expression mode that Mengovirus has a wide host range and its Because of the strong humoral response that is normally elicited by protein-forming proteins, VM16-based recombinants expressing the same antigen were found in many different animal hosts. Are likely to elicit high titer protective responses against various pathogens. Example 11 Facilitates cloning of the leader peptide at the N-terminus Construction of Mengovirus cDNA, pMCS In an embodiment of the invention, within the L coding region of the Mengovirus genome Of the foreign sequence into the Mengovirus genome at the NcoI 729 site of For learning, 2 as performed for the construction of pMRA3 / vMLN450. A step cloning procedure is involved. First of all, a sequence is Cloning into A1 and subsequent single site cloning Check the orientation of the insert as it can be inserted in the opposite direction. To accelerate the cloning of foreign sequences into the leader peptide, we have: NcoI site, including restriction sites for the enzymes XhoI, SnaBI and NheI Synthetic oligonucleotide at site 729 Was engineered. These restriction sites occur within the Mengovirus cDNA. No, allowing easy one-step cloning into Mengo virus cDNA. Moreover, if a different enzyme is selected for each end of the insert sequence, For example, the 5'end of the insert carries the SnaBI site and the 3'end is Nhe Ligation / insertion of the insert sequence into the Mengovirus genome when carrying an I site Will be directed / forced and screening for direction is necessary Not taken Generation of a cassette containing cDNA pMCS: Double-stranded oligonucleotide containing restriction sites XhoI, SnaBI and NheI (FIG. 24) was inserted into the NcoI site at position 729 of pMRA1 to generate pMΔLFU. I got SL. Then, the 5.8 kb SphI-SphI fragment of pM16 was Transferred to the SphI site 1928 of pMΔLFUSL, resulting in plasmid pM CS (FIG. 26) was obtained. All DNA manipulations were performed according to standard procedures (Reference 11, p. 43). The oligonucleotide linker sequence encodes a non-Mengo amino acid (Figure 26). ). RN derived from pMCS and transfected into permissive HeLa cells A shows large size plaques like the parent vM16 RNA. The utility of pMCS was demonstrated by insertion of LCMV epitopes, lethal LC Recombinant Mongolia capable of eliciting a protective immune response in mice against MV infection Ils allowed the production of vLCMG4. Conclusion Mengovirus cDNA pMCS is the N of the mengovirus leader peptide. Allows easy and directed / forced cloning of foreign sequences at the ends To As demonstrated by the construction of Mengo-LCMV recombinant vLCMG4 It is possible to produce viable recombinant mengovirus from pMCS . Example 12 Rabies virus glycoprotein segment Construction of recombinant Mengovirus encoding Linear neutralizing epitope G5-24 of glycoprotein of rabies virus PV isolate [ B. Dietzschold et al., J. Virol. 64: 3804-3809 (1990)]. Mu plasmid pRb56 [W. Tordo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 8 3, 3914-3918 (1986)], the PCR fragment of 350 base pairs Generated. The amplified DNA has an XhoI site at the 5'end and an Sho at the 3'end. It carries the naBI site. Control PCR fragment and pMCS plasmid Digestion with the restriction enzymes XhoI and SnaBI and standard procedure (Ref. 11, p. 43) Purified and ligated according to. The resulting plasmid pMG5-24 Was used to prepare RNA for transfection as described above. did. The recombinant genome contains an L-ΔG fusion protein of the expected size of approximately 20 kDa. Code quality. Viable recombinant virus after transfection of pMG5-24 RNA I got a su. Prepare a virus stock and proceed as described above. ,³⁵Used to infect HeLa cells in the presence of S-methionine. Cells infected with vMG5-24 are not present in vM16 infected or mock-infected cells. Shows the presence of additional proteins with an apparent molecular weight of 22-25 kDa (Fig. 27). To identify the identity of this protein, as described above, cytoplasmic extract Were immunoprecipitated with rabies G5-24 specific monoclonal antibody RV2-22C5 It was H. Burschoten et al., J. Gen. Virol. 70: 291-298 (1989). Yes. This 22-25 kDa protein is cytoplasmic from vMG5-24 infected cells. It could be immunoprecipitated from the extract. These results antigenically generate additional foreign sequences from the Mengovirus genome. It proves that it can be revealed. All publications, patents and patents mentioned, referenced or cited in this specification. Permit applications are intended to include such publications, patents and patent applications by reference, As is specifically and individually shown, this document is expressly incorporated by reference. It is included in.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/155 8517−4ＨＣ０７Ｋ 14/155 19/00 8517−4Ｈ 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 8931−4ＢＣ１２Ｎ 7/00 7/00 9452−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ジラール，マルクフランス国、エフ―75015 パリ、リュー・セザール―フランク、６ (72)発明者パーメンバーク，アン・シーアメリカ合衆国、ウィスコンシン 53711、マディソン、マナー・クロス 5010─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI C07K 14/155 8517-4H C07K 14/155 19/00 8517-4H 19/00 C12N 5/10 8931-4B C12N 7/00 7/00 9452-4B C12P 21/02 C C12P 21/02 9281-4B C12N 5/00 B // (C12P 21/02 C12R 1:91) (72) Inventor Girard, Marc F, France ―75015 Paris, Liu Cesar-Frank, 6 (72) Inventor Permemberc, Ann Sea USA, Wisconsin 53711, Madison, Manor Cross 5010

Claims

[Claims] 1. A viable modified Mengovirus which is an attenuated strain having a deletion in the poly (C) tract of the 5'non-coding region of the Mengovirus genome and which comprises a heterologous nucleotide sequence. 2. A viable recombinant Mengovirus, wherein said recombinant Mengovirus is an attenuated strain having a deletion in the poly (C) tract of the 5'non-coding region of the Mengovirus genome; The recombinant mengovirus, wherein the Mengovirus leader polypeptide L comprises a heterologous amino acid sequence; and-the leader polypeptide is full-length. 3. The recombinant Mengo virus according to claim 2, wherein the heterologous amino acid sequence is inserted after amino acid 6 of the leader polypeptide L. 4. 4. The recombinant mengovirus according to claim 3, wherein the cells infected with the recombinant mengovirus express a fusion protein comprising a heterologous amino acid sequence covalently linked to a mengovirus leader polypeptide. 5. The recombinant mengovirus according to claim 4, wherein the cell is of human origin. 6. The recombinant Mengovirus according to claim 4, wherein the heterologous amino acid sequence comprises at least one epitope of HAV, HIV, rabies virus, FMDV, coronavirus, herpes virus, measles virus, mumps virus or RSV. 7. 7. The recombinant Mengovirus according to claim 6, wherein the heterologous amino acid sequence comprises at least one epitope of HIV gp120. 8. 8. The recombinant mengovirus according to claim 7, wherein the heterologous amino acid sequence comprises amino acids 299 to 466 of gp120 of the HIV-I MN isolate. 9. A fusion protein comprising a full-length leader polypeptide of an attenuated Mengovirus strain having a heterologous amino acid sequence inserted. Ten. The fusion protein according to claim 9, wherein the heterologous amino acid sequence is inserted after amino acid 6 of the Mengovirus leader polypeptide. 11. 11. The fusion protein of claim 10, wherein the heterologous amino acid sequence comprises at least one epitope of HAV, HIV, rabies virus, FMDV, coronavirus, herpes virus, measles virus, mumps virus or RSV. 12. The fusion protein has the following sequence: The fusion protein according to claim 11, which comprises: 13. A permissive cell infected with the recombinant mengovirus according to claim 2. 14. The permissive cell according to claim 13, wherein the permissive cell is a cell of human origin. 15. The permissive cell according to claim 14, wherein the permissive cell is a HeLa cell. 16． A recombinant nucleic acid molecule comprising a Mengovirus nucleic acid sequence and a heterologous nucleotide sequence inserted in a sequence encoding the full length leader polypeptide of the Mengovirus nucleic acid sequence. 17. 17. A recombinant nucleic acid molecule according to claim 16, wherein a heterologous nucleic acid sequence is inserted at the NcoI restriction site at position 729 of the sequence encoding the full length leader polypeptide. 18. 18. The recombinant nucleic acid molecule of claim 17, wherein the heterologous nucleic acid sequence comprises a sequence encoding at least one epitope of HAV, HIV, rabies virus, FMDV, coronavirus, herpes virus, measles virus, mumps virus or RSV. 19. 19. A recombinant nucleic acid molecule according to claim 18, wherein the heterologous nucleic acid sequence comprises a sequence encoding at least one epitope of HIV gp120. 20. 20. The recombinant nucleic acid molecule of claim 19, wherein the heterologous nucleic acid sequence encodes amino acids 299-446 of gp120 of the HIV-I MN isolate. twenty one. The viral genome of the recombinant mengovirus according to claim 2. twenty two. A vaccine comprising the recombinant mengovirus according to claim 2. twenty three. The vaccine according to claim 22, wherein the recombinant mengovirus is in a state of being mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. twenty four. A vaccine comprising the fusion protein of claim 9 in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. twenty five. A method for inducing an immune response, which comprises administering the recombinant mengovirus according to claim 2 to an organism in which an immune response is to be induced by a parenteral or oral route. 26. 26. The method of eliciting an immune response according to claim 25, wherein the recombinant mengovirus is administered orally. 27. The viable recombinant Mengovirus according to claim 2, wherein the Mengovirus further comprises a protease cleavage site between the heterologous amino acid sequence and the leader polypeptide. 28. 28. The viable recombinant mengovirus according to claim 27, wherein the protease cleavage site is a protease 3C cleavage site. 29. 28. A permissive cell infected with a viable recombinant mengovirus according to claim 27, wherein the permissive cell expresses said heterologous amino acid sequence in native form. 30. 17. The recombinant nucleic acid molecule of claim 16, wherein the recombinant nucleic acid molecule further comprises a nucleic acid sequence encoding a protease cleavage site between the heterologous sequence and the Mengovirus sequence. 31. pMRA-5. 32. vMLN450. 33. pMRA-3. 34. The recombinant Mengo virus according to claim 4, wherein the heterologous amino acid sequence comprises at least one epitope of lymphocytic choriomeningitis virus. 35. The above epitope has an amino acid sequence: 35. The recombinant mengovirus according to claim 34, which comprises: 36. 11. The fusion protein of claim 10, wherein the heterologous amino acid sequence comprises at least one epitope of lymphocytic choriomeningitis virus. 37. The above heterologous amino acid sequence has the amino acid sequence: 37. The fusion protein of claim 36, which comprises: 38. 18. The recombinant nucleic acid molecule of claim 17, wherein the heterologous sequence comprises a sequence encoding at least one epitope of lymphocytic choriomeningitis virus. 39. The above epitope has an amino acid sequence: 39. The recombinant nucleic acid molecule of claim 38, which comprises. 40. A vaccine comprising the recombinant mengovirus according to claim 35. 41. 41. The vaccine of claim 40, wherein the recombinant Mengo virus is in a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier. 42. The recombinant mengovirus according to claim 4, wherein the heterologous amino acid sequence comprises at least one epitope of rabies virus. 43. 43. The recombinant mengovirus according to claim 42, wherein the epitope is the glycoprotein of the rabies virus PV isolate and the linear neutralizing epitope G5-24. 44. 11. The fusion protein of claim 10, wherein the heterologous amino acid sequence comprises at least one epitope of rabies virus. 45. 45. The fusion protein of claim 44, wherein the epitope is a PV isolate of rabies virus glycoprotein and the linear neutralizing epitope G5-24. 46. 18. The recombinant nucleic acid molecule according to claim 17, wherein the heterologous sequence comprises a sequence encoding at least one epitope of rabies virus. 47. 47. The recombinant nucleic acid molecule of claim 46, wherein said epitope is a PV isolate of rabies virus glycoprotein and the linear neutralizing epitope G5-24. 48. A vaccine comprising the recombinant mengovirus according to claim 43. 49. 49. The vaccine of claim 48, wherein the recombinant mengovirus is in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. 50. The recombinant nucleic acid molecule according to claim 16, wherein the recombinant nucleic acid is DNA. 51. A recombinant nucleic acid molecule comprising a Mengovirus nucleic acid sequence and an oligonucleotide comprising a plurality of restriction sites, wherein the oligonucleotide is inserted in a nucleic acid encoding the Mengovirus leader polypeptide. Altered nucleic acid molecule. 52. 52. The recombinant nucleic acid molecule of claim 51, wherein said restriction site is selected from the group consisting of XhoI, SnaBI, NheI and said oligonucleotide is inserted at the NcoI site at position 729. 53. 53. The recombinant nucleic acid molecule of claim 52, wherein the recombinant nucleic acid is pMCS.