JPH08510004A - Detection of direct lysis buffer and HIV-1 plasma viremia - Google Patents

Detection of direct lysis buffer and HIV-1 plasma viremia

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JPH08510004A
JPH08510004A JP6525476A JP52547694A JPH08510004A JP H08510004 A JPH08510004 A JP H08510004A JP 6525476 A JP6525476 A JP 6525476A JP 52547694 A JP52547694 A JP 52547694A JP H08510004 A JPH08510004 A JP H08510004A
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ヘンラード，デニス・アール
フイリツプス，ジヤツク
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アボツト・ラボラトリーズ
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Abstract

(57)【要約】 ビリオンの直接溶解ならびに逆転写およびＰＣＲによるＨＩＶ−１ｃＤＮＡの複製の簡略化した方法と組み合わせた血漿ＨＩＶ−１の免疫捕獲は、ＨＩＶ−１感染症の進行をモニターする迅速で高感度の方法である。また、この方法は、定量的培養法よりも時間が短く、作業があまり大変でない。さらに、免疫捕獲したビリオンを直接溶解する方法および簡略化された一段階の逆転写（ＲＴ）／ＰＣＲ法の開発により、有機溶媒抽出の必要がなくなり、工程数が減少した。直接溶解緩衝液は、ＲＴおよびＰＣＲ反応で直接使用するための血漿ＨＩＶ−１ ＲＮＡが単離されるように調製し、こうして、有機溶媒抽出びエタノール沈澱の必要がなくなった。この結果、アッセイの完了に必要な時間がかなり短縮され、ＰＣＲ反応に関連する汚染の可能性がかなり減少した。免疫捕獲−ＲＴ／ＰＣＲアッセイを使用して、ＨＩＶ−１の母親からその子供への垂直感染がウィルス負荷以外の因子にかなり依存することを示した。逆に、血漿ウィルス負荷は、輸血に関連したＨＩＶ−１感染において重要な役割を果たす。最後に、免疫捕獲−ＲＴ／ＰＣＲによる血漿関連ウィルス負荷の検出および定量は、病気の進行の別のマーカーとなり、種々のＨＩＶ治療の効力の測定に役立つと考えられる。   (57) [Summary] Immunocapture of plasma HIV-1 in combination with direct lysis of virions and a simplified method of HIV-1 cDNA replication by reverse transcription and PCR is a rapid and sensitive method to monitor the progression of HIV-1 infection. . Also, this method is shorter in time and less labor intensive than the quantitative culture method. Furthermore, the development of a method for direct lysis of immunocaptured virions and a simplified one-step reverse transcription (RT) / PCR method eliminated the need for organic solvent extraction and reduced the number of steps. The direct lysis buffer was prepared so that plasma HIV-1 RNA was isolated for direct use in RT and PCR reactions, thus eliminating the need for organic solvent extraction and ethanol precipitation. As a result, the time required to complete the assay was significantly reduced and the potential for contamination associated with the PCR reaction was significantly reduced. An immunocapture-RT / PCR assay was used to show that vertical transmission of HIV-1 mothers to their offspring is highly dependent on factors other than viral load. Conversely, plasma viral load plays an important role in transfusion-related HIV-1 infection. Finally, the detection and quantification of plasma-associated viral load by immunocapture-RT / PCR may be another marker of disease progression and help measure the efficacy of various HIV therapies.

Description

【発明の詳細な説明】 直接溶解緩衝液およびＨＩＶ−１血漿ウィルス血症の検出発明の分野 本発明は、ビリオンを崩壊し、ウィルスの核酸を単離する方法に関する。特に 、本発明は、核酸を単離するための、洗剤およびプロテアーゼＫを含む直接溶解 （direct lysis）緩衝液を提供する。発明の背景 後天性免疫不全（ＡＩＤＳ）の最初の事例が１９８１年に記載されたとき、そ の病気の原因物質は未知であった。１９８３年に、モンタニエ（Luc Montagnier ）を長とするフランスの研究所は、ヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）と して現在知られているその原因ウィルスを単離した。同じ頃、米国国立衛生研究 所（ＮＩＨ）のギャロ（Robert Gallo）は、その仲間と、ＡＩＤＳの原因物質を 単離したことを報告した。２年以内に診断測定法が開発され、ＨＩＶ−１に感染 した人の確認に使用された。感度および特異性の両方とも高く開発されたこれら の測定法は、血清または血漿中のＨＩＶ−１に対する抗体の有 無を検出するものであった。 疫学研究により、ＨＩＶ−１ウィルスは、同性愛者および血友病患者などの特 定の集団ではほとんど検出され、主な感染ルートは、性接触または感染した血液 製剤の使用によることが分かった。後に、ＩＶ薬物使用者は、針を使用して分け 合う習慣のために（すなわち、血液のクロス汚染）、ＨＩＶ感染の危険性が高い 集団であることが分かった。 ＨＩＶの感染と感染した血液への接触または感染血液製剤の使用との間の相関 関係は、ウィルス感染の拡大を減少・抑制するために、血液バンクの強制的なス クリーニングの開始を促した。年間２０００万単位の供血および血液製剤の全て のテストを実行するシステムが確立された。この日常的テストにより、輸血また は血液製剤の使用によるＨＩＶ−１関連の感染の数はかなり減少した。現在、輸 血によるＨＩＶ感染の危険は、約１：２５０，０００と推定される。 ＨＩＶの輸血による感染の数は減少したが、ＡＩＤＳ関連の感染の数は世界中 で増加が続いている。１９９２年の場合、米国および世界中でＨＩＶ−１ウィル スに感染した人の推定数は、各々、１００万および１０００万である。米国のみ では、毎年 ４０，０００人が新たにＨＩＶ−１に感染していると推定される（Centers for Disease Control．HIV Prevalence Estimates And AIDS Case Projections For The United States：Report Based Upon A Workshop．MMWR 39：（no.RR-16）No vember 30,1990）。このうち、女性および青少年は各々、１１．５％および１． ７％である。女性のＨＩＶ感染の大部分は、ＩＶ薬物使用またはＨＩＶに感染し たパートナーとの性接触の結果である。青少年ＨＩＶ−１感染の大部分は、母親 からその子供へのＨＩＶ−１の垂直感染の結果である。世界全体で、ＨＩＶ−１ の垂直感染の割合は、１０％〜４０％の間であると報告されている（The Europe an Collaborative Study．Children Born To Women With HIV-１ Infection：Na tural History And Risk of Transmission．Lancet 1991，337:253-260 および Ryder，R.W.，Nsa．W.N．Hassig，S.E.，Behets，F.，Rayfield，M．and Projec t SIDA，Perinatal Transmission Of The Human Immuno deficiency Virus Type １ Infection To Infants 0f Seropositive Women In Zaire（ザイールにおけ るセロポジティブな女性の子供に対するＨＩＶ−１の周産期感染），N．Engl．J ．Med．1989，320:1637-1642）。米国で毎年新たにＨＩＶ−１に 感染する推定数４０，０００のうち、１５００〜２０００件は、周産期ＨＩＶ− １感染の結果として新生児に発生している。 ＡＩＤＳ関連の事例が毎年増加しているという事実は、一部は、感染の特徴に よるものである。その拡大を減少させる手段を達成しようとする場合、その進行 の制御を測定する方法が重要となる。ＨＩＶ−１遺伝子構造および複製 ＨＩＶはレトロウィルス科に属する。レトロウィルスは、その遺伝物質として ＲＮＡを有し、ＲＮＡゲノムのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）への逆転写を触媒する ユニークな酵素である逆転写酵素（ＲＴ）を含むことを特徴とする。 レトロウィルスには３つの亜科がある。ＨＩＶは、その構造および遺伝特性に 基づいてレンチウィルス亜科に属する。レトロウィルスゲノムは、典型的には９ ，０００〜１０，０００の塩基対から成り、全てのレトロウィルスに特徴的な３ 個の構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。また、調節タンパク質 をコードするｐｏｌおよびｅｎｖの３’末端にはユニークな配列を含む。そのゲ ノムの５’および３’両末端には、ＬＴＲ（long terminal repeat）という２個 の同一配列がある。 ５’ＬＴＲは、宿主細胞転写機構によるプロウィルスＤＮＡの発現に不可欠であ る。 ＨＩＶ−１ＲＮＡゲノムは、９個の遺伝子を表す全部で９，７４９個のヌクレ オチドから成る（Haseltine，W．A.，Wong-Stall，F．The Molecular Biology O f The AIDS Virus．Scientific American 1988，259:52-62）。そのゲノムは、 ３個の特徴的な構造遺伝子と別の６個の調節遺伝子（ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、 ｖｐｒ、ｎｅｆおよびｖｐｕ）を含む。ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質は、全長 転写から翻訳され、ｅｎｖタンパク質は、スプライシングを受けた転写体から翻 訳される。ｇａｇ遺伝子が転写されると全長ＲＮＡになり、翻訳されて前駆体ポ リタンパク質となり、続いて、ウィルスコアの主な構造タンパク質を作る３個の カプシドタンパク質に切断される。ｐｏｌタンパク質は実際は、ｇａｇ−ｐｏｌ 前駆体の一部である。遺伝子のｐｏｌ部分は、ウィルスコア内部のＲＮＡに関連 する酵素（プロテアーゼ、逆転写酵素およびインテグラーゼ）をコードする。逆 転写酵素は実際は、３つの酵素機能を有する。すなわち、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ リメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼ活性であ る。 エンベロープ遺伝子（ｅｎｖ）は、プロテアーゼによって切断されて細胞外糖タ ンパク質ｇｐ１２０およびトランスメンブランタンパク質ｇｐ４１になる前駆体 タンパク質ｇｐ１６０をコードする。ｇｐ１２０タンパク質は、ウィルスの細胞 表面ＣＤ４受容体への結合に関与する。ｇｐ４１タンパク質は、シンシチウムの 形成を媒介し、また、ウィルスコアの細胞内部への侵入を助ける（Sodrowski，J .，Goh，W.C.，Resen，S.，Campbell，K.，and Haseltine，W.A，Role Of The H TLV-III/LAV Envelope In Syncytium Formation And Cytopathicity（シンシチ ウム形成および細胞障害におけるＨＴＬＶ−III／ＬＡＶエンベロープの役割） ．Nature 1986;322:470-474および McCune，J.M.，Rabin，L.B.，Feinburg，M. B.，Lieberman，M.，Kosek，J.C.，Reyes，G.R.，and Weissman，I，L．Endopro teolytic Cleavage Of gp160 Is Required For The Activation of Human Immun odeficiency Virus（ヒト免疫不全ウィルスの活性化には、エンド型タンパク質 分解によるｇｐ１６０の切断が必要である）．Cell 1988;53:55-67）。６個の別 の遺伝子は、ウィルスの複製および組み立てに必要なウィルスタンパク質の産生 を調節する（Haseltine,前出）。 ＨＩＶ−１の構造は、全てのレトロウィルスの構造と似ている。２個のｇａｇ タンパク質から成る円柱形のコアを含む。コアの内部には、２本の同一の一本鎖 ＲＮＡ分子が入っている。そのＲＮＡゲノムに関与するのは、逆転写酵素、プロ テアーゼおよびインテグラーゼである。コアは宿主細胞の形質膜に由来するエン ベロープによって囲まれている。その膜の表面には、ｇｐ４１トランスメンブラ ンタンパク質と非共有的に結合しているＨＩＶ−１の特定タンク質ｇｐ１２０の コピーが点在している。 ＨＩＶ感染サイクルは、ウィルスエンベロープタンパク質が宿主細胞表面上に あるＣＤ４＋分子に結合することから始まる。ＣＤ４＋分子は、典型的には、Ｔ リンパ球およびマクロファージ／単球上に存在する。ウィルスおよび宿主細胞の 膜が融合し、ウィルスのコアが宿主細胞に入り込む。コアが一旦宿主細胞内部に 入ると、ウィルスＲＮＡゲノムがｃＤＮＡコピーに逆転写される。ＲＮＡゲノム は次いで、ＲＴ−関連酵素リボヌクレアーゼＨによって破壊され、ｃＤＮＡコピ ーを鋳型としてもう一本のＤＮＡコピーがポリメラーゼにより作られる。この二 本鎖ウィルスＤＮＡは核に移動し、そこで、ウィルスタンパク質イ ンテグラーゼによって宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたウィルスＤ ＮＡは、プロウィルスと言う。 新しいウィルス粒子の産生、その細胞からの放出、および新しい細胞への感染 によりＨＩＶ感染のサイクルは完了する。新しいウィルス粒子の産生は、最初、 宿主細胞の転写因子の制御下にある。プロウィルスＤＮＡのＲＮＡへの転写は、 ウィルスのＬＴＲ中の配列によって開始される（Tong-Starken，S.E.，Luciw，P .A.，and Peterlin，B.M．Human Immunodeficiency Virus Long Terminal Repea t Responds To T-cell Activation Signal（ヒト免疫不全ウィルスのＬＴＲはＴ −細胞の活性化シグナルに反応する）．Proc．Natl．Acad．Sci．1987;84:6845- 6849）。ＲＮＡ分子のいくつかは、他のＲＮＡ分子がｍＲＮＡとして使用されて 新しいウィルスタンパク質に翻訳されている間、遺伝物質として使用される。ｅ ｎｖタンパク質は、翻訳後に細胞のゴルジ体で処理されて、宿主細胞膜に運搬さ れる。ウィルスのコア構造に使用されるタンパク質は脂肪酸を含み、これらは細 胞膜の内側に結合する。新しいウィルスの成分全部が集まると、それらは互いに 結合して、細胞膜から外に膨れ出る球構造を形成する。２個のＲＮＡ分子が、成 長している ウィルス粒子に入る。最後に、コアに関与する酵素（ＲＴ、インテグラーゼおよ びプロテアーゼ）が翻訳後に処理され、コア前駆体タンパク質がプロテアーゼに より切断される。ウィルスコアタンパク質はウィルスＲＮＡゲノムを取り囲み、 ほぼ完全なウィルスが宿主細胞膜の一部に自らを閉じ込め、最後には、ウィルス が細胞から出芽して放出される。 ＨＩＶまたは他のレンチウィルスによる感染は持続的であり、通常、レベルは 比較的低いが連続したウィルス産生を特徴とする。生産的なウィルスの複製がど んどん増加して、病気が進行していくと考えられる。このことから、研究者らは 、ＨＩＶ−１感染症の進行に関与する生物学的マーカーの探索を行ってきた。ＨＩＶ−１の進行の予後および血清学的マーカー 最近、多くの研究の関心は、ＨＩＶ−１感染者における病気の進行に関与する 特定の生物学的マーカーの確認に集中している。ＨＩＶ−１感染症の進行と相関 するマーカーの確認は、その病気の原因を決定し、理解するのに重要である。さ らに、病気の進行と相関するマーカーの確認は、治療薬の開発およびモニターの 助けになる。 ＨＩＶ−１の病因に関する初期の研究で、ＨＩＶ−１の主な標的細胞はＣＤ４ ＋Ｔ細胞であり、病気が進行すると、その細胞の総数がかなり減少することが分 かった（Schittmann，S.M.，Pallidopoulous，M.C.，Lane，H,C.，Thompson，L. ,Baseler，M.，Massari，F.，Fox，C,H.，Salzman，N,P.，and Fauci,A.S．The Reservoir For HIV-１ In Human Peripheral Blood In A T cell That Maintain s Expression Of CD4（ヒト末梢血中のＨＩＶ−１の受け皿はＣＤ４の発現を維 持するＴ細胞である）．Science 1989;245:305-308および Klatzmann，D.，Cha mpagne，E.，Chamaret，S．T-lymphocyte T4 Molecule Behaves As The Recepto r For Human Retrovirus LAV（Ｔ−リンパ球Ｔ４分子は、ヒトレトロウィルスＬ ＡＶの受容体として挙動する）．Nature 1986;234:1120-1123）。他の研究では 、病気の進行に関与すると考えられ、免疫細胞の活性化に対応するか、ウィルス 産生の増加を反映する可能な血清マーカーの検討が行われた。これらのマーカー として、β2ミクログロブリン、ネオプテリンおよびｐ２４抗原血が挙げられた （Melmed，R.N.，Taylor，J.M.，Detels，R.，Bozorgmehri，M.，and Fahey，J. L．Serum Neopterin Changes In HIV Infected Subjects：Indicator Of Significant Pathology，CD4 T-Cell Changes，And Th e Development Of AIDS（血清ネオプテリンはＨＩＶ感染者において変化する： 重要な病因、ＣＤ４Ｔ−細胞の変化およびエイズの発症の指標）．J．Acquired Immune Deficiency Syndrome 1989;2:7076）。 β2ミクログロブリンは、組織適合性複合体（ＨＬＡ）の一部であり、免疫活 性化および細胞の代謝回転の際にＴ細胞から放出される。健康な人の正常レベル は、１．９μｇ／μｌ未満である（Hofmann，B.，Wang，Y.，Cumberland，W.G. ，Detels，R.，Bozorgmehri，M.，and Fahey，J.L．Serum β2-microglobulin L evel Increases In HIV Infection：Relation To Seroconversion，CD4 T-cell Fall and Prognosis（血清β2ミクログロブリンレベルはＨＩＶ感染において増 加する：セロコンバージョン、ＣＤ４ Ｔ−細胞の減少および予後との関連）． AIDS 1990;4:207-214）。ネオプテリンは、これらの細胞がγ−インターフェロ ンによって刺激を受けるときのマクロファージ活性化産物であり、免疫の活性化 を反映する。健康な人の正常レベルは、６．６２ナノモル／ｌ以下である（Fuch s，D.，Hausen，A.，Reibnegger，G.，Werner，E.R.， Dierich，M.P.，and Wachter，H．Neopterin As A Marker For Activated Cell- Mediated Immunlty：Application In HIV Infection（活性化細胞によって媒介 される免疫のマーカーとしてのネオプテリン：ＨＩＶ感染における応用）．Immu no．Today 1988;9:150-154）。各マーカーの正常なレベル以上の増加は、リンパ 球およびマクロファージの活性化を表す。ＨＩＶ−１ ｐ２４が陽性である場合 は、ウィルス活性および産生の増加を表し、予後がよくないことに関与すること が示された（Allain，J.P.，Laurian，Y.，Paul，D.A.，Verroust，F.，Leuther ，M.，Gazengel，C.，Senn D.，Larrieu，M.J.，and Bosser，C．Long-Term Eva luation Of HIV Antigen And Antibodies To p24 And gp41 In Patients With H emophilia（血友病患者におけるｐ２４およびｇｐ４１に対する抗体およびＨＩ Ｖ抗原の長期的評価）．N．Engl．J．Med．1987;317:1114-1121）。 全体として、絶対値として表されるＣＤ４＋リンパ球の減少が、ＨＩＶ−１の 進行を示す最良の予報値であることが分かった。ネオプテリンまたはβ2ミクロ グロブリンのレベルがこの後に続き、最後がｐ２４抗原であった（Fahey，J.L. ，Taylor， L.M.，Detel，R.，Hofmann，B.，Melmed，R.，Nishanian，P.，and Giorgi，J． V．The Prognostic Value Of Cellular And Serological Markers In Infection With Human Immunodeficiency Virus Type１（ＨＩＶ−１感染における細胞お よび血清学的マーカーの予後評価）．N．Engl．J．Med．1990;322:166-172）。 ごく最近、細胞および血漿のウィルス負荷の増加が、ＨＩＶ−１感染症の臨床 上の発現と関連し、ＣＤ４＋細胞数の減少と相関があることが示された（Venet ，A.，Lu，W.，Beldjord，K.，and Andrieu，J.M．Correlation Between CD4 Ce ll Count And Cellular and Plasma Viral Load In HIV-１ Seropositive Indiv iduals（ＨＩＶ−１セロポジティブな人におけるＣＤ４細胞数と細胞および血漿 のウィルス負荷との相関性）．AIDS 1991;5:283-288）。感染者から単離した末 梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または血漿を必要とする培養技術を使用してウィルス 負荷が測定された（Ho，D．D.，Moudgil，T.，and Alam，M．Quantitation Of H uman Immunodeficiency Virus Type １ In The Blood Of Infected Persons（感 染者の血液におけるＨＩＶ−１の定量）．N．Engl．J．Med．1989;321:1621-162 5； Coombs，R.W.，Collier，A.C.，Allain，J.P.，Nikora，B.，Leuther，M.，Gjer set，G.F.，and Corey，L．Plasam Viremia In Human Immunodeficiency Virus Infection（ＨＩＶ感染における血漿ウィルス血症）．N，Engl．J．Med．1989;3 21:1626-1631）。しかし、この方法を使用すると、作業がかなり大変であり、完 了までにかなり時間を要することが分かった。後に、ウィルスＲＮＡの遠心分離 法または直接抽出法を使用して血漿からウィルス粒子またはＲＮＡを直接単離す る方法が使用された。ウィルス負荷の測定は、ウィルスＲＮＡをｃＤＮＡコピー に逆転写し、ｃＤＮＡをＰＣＲ法を使用して増幅することにより行った（Bagnar elli，P.，Memzo，S.，Manzin，A.，Giacca，M.，Emanuele，V.，and Clementi ，M．Detection of Human Immunodeficiency Virus Type １ Genomic RNA In Pl asma Samples By Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction（逆転写 ＰＣＲによる血漿サンプル中のＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの検出）．J．Med．Viro logy 1991;34:89-95）。この結果、測定時間はかなり減少し、感度はかなり増加 した。 血漿中のＨＩＶ−１ウィルス負荷の測定は、病気の進行および治療効力のモニ ターにおいてかなり密接な関係を有する。血 漿のウィルス負荷の直接測定は、活性ウィルス複製のレベルを示す。病気の進行 に関する他のマーカーと組み合わせてウィルス複製をモニターすると、ＨＩＶ− １感染症の病因のより精確な指標となり、病気の進行のより良好な予報値になる と考えられる。セロポジティブな患者に治療を施すのに最適な時期を決定するた めの手段としても役立つ可能性がある。発明の要旨 血漿ＨＩＶ−１ウィルス血症のモニターを、逆転写および増幅工程を一本のチ ューブで行う免疫捕獲−ｃＤＮＡ／ＰＣＲにより行った。本発明の直接溶解緩衝 液は、酵素反応を阻害することなく、ＲＴおよびＰＣＲ反応で直接使用するため の血漿ＨＩＶ−１ ＲＮＡが単離されるように調製した。こうして核酸の単離に 通常必要な有機溶媒抽出およびエタノール沈澱を省いた。この結果、測定の完了 までに必要な時間がかなり短縮され（約１６時間の短縮）、処理工程の減少によ り汚染の可能性も減少したと考えられる。 ＨＩＶ−１のｇｐ４１およびｇｐ１２０エンベロープタンパク質に特異的なモ ノクローナル抗体で被覆されたラテックス微粒子（０．１μｍ）を含むウィルス 捕獲アッセイを使用して、 血清／血漿から細胞遊離ビリオンを捕獲した。そのアッセイの標準的パラメータ では、血漿サンプルを微粒子の存在下で３時間インキュベートすることが必要で ある。この実験では、インキュベーションの時間がアッセイの感度を低下させる ことなく短縮できるかどうかを測定するために、インキュベーションの時間を変 化させた。 ＨＩＶ−１ＲＮＡをウィルスタンパク質から抽出・精製する通常の方法は、最 後に一夜エタノール沈澱する工程を除くと、数時間を要する。その方法はまた、 チューブを多数回変える必要があり、それは、比較的汚染を招きがちである。有 機溶媒抽出およびエタノール沈澱の工程を省くために、本発明は、粒子に結合し たＨＩＶ−１ビリオンを直接溶解するための一連の緩衝液および条件を含む。直 接溶解緩衝液成分と逆転写酵素およびＰＣＲ酵素との相容性が主な問題点であり 、この要件を満たす緩衝液の組成物に特に注意を払った。溶解緩衝液に、単一の 洗剤を種々の濃度で含めた。イオン性および非イオン性洗剤を直接溶解緩衝液の 成分として検討した。また、低濃度のプロテイナーゼＫを種々の洗剤と組み合わ せて添加したときの有効性も調べた。直接溶解緩衝液の組成物がいったん決定さ れると、 ウィルス膜の破壊に必要な時間および温度条件を測定した。 ＨＩＶ−１ＲＮＡをｃＤＮＡコピーに逆転写するために使用される標準方法お よびＰＣＲによるその増幅は、二つの別々の操作を必要とする。最大の感度は、 二つの操作で使用されるアッセイ成分（すなわち、緩衝液、塩、プライマー、ｄ ＮＴＰおよび酵素の濃度）を最適化することにより得られた。しかし、二つの操 作を一緒にすると、アッセイ感度および時間においてかなり有利になると考えら れた。逆転写および増幅操作を一緒にして一つの操作にすることができるかどう かを調べるために、一連の実験を行った。直接溶解緩衝液とＲＴおよびＰＣＲア ッセイ成分との相容性は保持した。アッセイ感度は、ＭｇＣｌ2およびｄＮＴＰ 濃度ならびに必要であれば他の成分を最適化することにより保持した。 本文の内容は次のとおりである。 Ｉ．背景 歴史的バックグランド ＨＩＶ−１の遺伝子構造および複製 ＨＩＶ−１の進行に対する予後および血清学的マーカー II．要旨 図面の簡単な説明 III．詳細な説明 ＨＩＶ−１感染した妊婦の血漿ウィルス負荷 ＨＩＶ−１感染した血液ドナーのウィルス負荷 II．材料および方法 逆転写コントロール 増幅コントロール 免疫捕獲コントロール アッセイ間およびアッセイ内の汚染コントロール プライマーおよびプローブの調製 粒子の調製 ＳＫ１９プローブの標識化 ウィルス捕獲 逆転写 ＰＣＲ 液体ハイブリッド形成およびオートラジオグラフィー オートラジオグラフの定量 III．結果 アッセイコントロールの解析 直接溶解緩衝液 直接溶解緩衝液のインキュベーション時間および温度 ウィルス捕獲時間 単独添加ＲＴ／ＰＣＲ セロポジティブな妊婦における血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡの検出 セロポジティブな血液ドナーにおける血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡの検出 IV．考察 Ｖ．参考文献 VI．請求の範囲図面の簡単な説明 図１は、アッセイコントロールを示し、Ａ）免疫捕獲コントロール、Ｂ）逆転 写コントロール、およびＢ）増幅コントロールを示す。オートラジオグラフィー を−８０℃で３時間行った（Ｎｅｇ、ＲｎおよびＤｎは、各々、捕獲、ＲＮＡお よびＤＮＡの陰性コントロールを表す。）。 図２は、種々の洗剤濃度の検出感度に対する影響を示す。各 洗剤濃度の評価を、各々、ＲＮＡコントロールＲ−５およびＲ−６を使用して行 った。評価には、標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用した。ＲＮＡコントロールは、標準 抽出法を使用して処理した。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った 。 図３は、直接溶解緩衝液の免疫コントロールに対する影響を示し、Ａ）有機溶 媒抽出、Ｂ）０．００５％のTriton Ｘ−１００を含む直接溶解緩衝液、Ｃ）０ ．００４５％のTween２０を含む直接溶解緩衝液、Ｄ）０．００１％のＳＤＳを 含む直接溶解緩衝液を示す。プロテイナーゼＫを指示したように含めた。標準Ｒ Ｔ／ＰＣＲ法を使用した。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った。 図４は、直接溶解時間および温度の最適化を示す。直接溶解緩衝液および標準 ＲＴ／ＰＣＲ法を使用して血漿コントロールの評価を行った。オートラジオグラ フィーを−８０℃で３時間行った。 図５は、ウィルス捕獲時間の最適化を示す。捕獲時間を血漿コントロールを使 用して測定し、直接溶解緩衝液および標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用して評価した。 オートラジオグラフィーを−８０℃で４時間行った。 図６は、ｄＮＴＰ濃度が５０ｍＭであるときの一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対する ＭｇＣｌ2濃度の影響を示す。標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用してコントロールのア ッセイを行った。ＭｇＣｌ2濃度の範囲は１．５〜２．０ｍＭであった。オート ラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った。 図７は、ｄＮＴＰ濃度が１００μＭであるときの一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対す るＭｇＣｌ2濃度の影響を示す。標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用してコントロールの アッセイを行った。ＭｇＣｌ2濃度の範囲は１．５〜２．０ｍＭであった。オー トラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った。 図８は、ｄＮＴＰ濃度が２００μＭであるときの一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対す るＭｇＣｌ2濃度の影響を示し、Ａ）逆転写、Ｂ）増幅、Ｃ）免疫捕獲を示す。 標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用してコントロールのアッセイを行った。テストしたＭ ｇＣｌ2濃度は１．７５ｍＭであった。オートラジオグラフィーを−８０℃で３ 時間行った。 図９は、一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対するアッセイ体積の影響を示し、Ａ）５０ μｌ法、Ｂ）１００μｌ法を示す。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間 行った。発明の詳細な説明 病気の感染および進行に関係する因子の決定が、ＨＩＶ−１研究における主な 関心事である。最近、いくつかの研究が、ＨＩＶ−１の感染に対応すると考えら れる因子の確認に集中して行われた。これに関しては、ＨＩＶ−１ウィルス負荷 と感染との相関が重要であると考えられる。ＨＩＶ−１感染の二つの型として、 母親から子供への感染（垂直）と血液ドナーから受血者への感染（水平）がある 。ＨＩＶ−１の母親から子供への垂直感染による感染数は米国では比較的少ない が、毎年、新たな感染者の約２％が垂直感染によるものである。同様に、輸血に 関連するＨＩＶ−１感染の現在の数は極めて少ない。しかし、これら二つのケー スでＨＩＶ−１ウィルス負荷とＨＩＶ−１の感染の間に相関があるかどうかを調 べることは、ＨＩＶ−１の原因の理解を深めることになるであろう。ＨＩＶ−１に感染した妊婦の血漿ウィルス負荷 自分の乳児の１５か月後のＨＩＶ−１抗体の減少または存続により回顧的に測 定した伝染および非伝染妊婦からサンプルを集めた（Case Western Reserve Uni versity and the University of Washington，Seattle提供）。各サンプルのウ ィルス捕獲およびＲＴ／ＰＣＲを、コード化したサンプルに対して二重に行った 。認識された半定量的値（３＋、２＋、１＋、陰性）で評価した。半定量的血漿 ＲＮＡウィルス負荷を伝染に対する他の可能なウィルス学的マーカー（ｐ２４抗 原血、ＣＤ４＋の数およびβ2ミクログロブリンレベル）と比較して、ＨＩＶ− １垂直感染の予知に対する臨床上の有用性を検討した。ＨＩＶ−１に感染した血液ドナーの血漿ウィルス負荷 ＨＩＶ−１セロポジティブな血液ドナーの血漿サンプルを得て（Transfusion Safety Study Repository，San Francisco，CA）、ＨＩＶ−１血漿ウィルス負荷 を回顧的に測定した。サンプルの選択は、受血者を感染させたことが分かってい る７８個のサンプルおよび受血者を感染させなかった１２個のサンプルのプール から行った。全部で２２個のサンプルをテストし、受血者を感染させたドナーお よび受血者を感染させなかったドナーからのサンプル数を同じにした。各サンプ ルに対して、ウィルス捕獲およびＲＴ／ＰＣＲを二重に行った。認識された半定 量的値で評価した。半定量的血漿ＲＮＡウィルス負荷を伝染に対する他の可能な ウィルス学的マーカー（ｐ２４抗原血、ＣＤ４＋の数およびβ2ミクログロブリ ンレベル）と比較して、 ＨＩＶ−１の輸血関連感染におけるＨＩＶ−１ウィルス負荷の関与を検討した。材料および方法 コントロールの調製 逆転写コントロール：逆転写操作の効率をモニターするために、一組の検定し たＲＮＡサンプルを、ＨＩＶ−１ IIIＢに慢性的に感染したＨ９細胞系から調 製した（Abbott Laboratories）。細胞の全核酸をチオシアン酸グアニジンで抽 出し、ＲＮＡを、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）クッションを通して遠心により精製 した（Chirgwin，J.M.，Prsybla，G.，MacDonald，P.J.，and Rutter，W.J．Iso lation Of Total Cellular RNA（総細胞ＲＮＡの単離）．Biochem．1979;18:529 4-5299）。ＲＮＡペレットをｄｄＨ2Ｏを用いて溶解して０．５μｇ／ｍｌにし 、２０μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡを含むｄｄＨ2Ｏで連続的に１０倍希釈を行っ た（GIBC0-BRL,Gaithersburg，MD）。１０5および１０6倍に希釈したサンプル（ Ｒ-5およびＲ-6と言う。）が、逆転写および増幅後に一貫して陽性の結果を与え た二つの最も低い希釈であった。これらのサンプルをコントロールとして使用し た。 増幅コントロール：細胞１個につきプロウィルスＨＩＶ−１の一つのコピーを 含むＨＩＶ−１ＬＡＶ感染細胞系８Ｅ５（Memorial Sloan Kettering Institute ，New York）を使用して増幅コントロールを調製した。１０6個の細胞の全ゲノ ムＤＮＡ（１０6ＨＩＶ−１コピーという。）を、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８． ３）、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Promega，Madison，WI）および０ ．２５％のＳＤＳ（Sigma，St．Louis，MO）を含む５００μｌの溶液中、５６℃ で１時間抽出した。次いで、溶解産物を同量のフェノール（ｐＨ７．０）、次い でクロロホルム（０．３ＭのＮａＯＡｃに調整）で抽出した後、−２０℃で１６ 時間、２倍体積の無水エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを１０，０００ｒｐｍで １０分間遠心（Hill Scientific mv13）し、上清を除去し、ペレットを氷冷した ７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレットを０．５ｍｌの１０ｍＭトリス（ ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌに溶解した。約１０6ＨＩＶ−１プロウィ ルスコピーに対応する精製したＤＮＡを２０μｇ／ｍｌの鮭の精子ＤＮＡ（Sigm a，St．Louis，MO）を含むｄｄＨ2Ｏで連続的に１０倍希釈した。５０μｌの１ ０-3および１０-4希釈（各々、１００および１０ 個のＨＩＶ−１プロウィルスコピーに対応する。）を増幅コントロールとして使 用した。 免疫捕獲コントロール：ウィルス捕獲操作により再現性のある結果が得られる ことを立証するために、一組の検定された血漿コントロールを調製した。慢性的 にＨＩＶ−１ IIIＢに感染したＨ９細胞（Abbott Laboratories）の上清を得て 、セロネガティブ血漿で連続的に１０倍希釈した。希釈物をウィルス捕獲、次い でＲＴ／ＰＣＲによりテストし、最も低い二つの陽性希釈物（ＭＫ-4およびＭＫ-5 という）を陽性コントロールとして使用した。測定間および測定内汚染コントロール ＰＣＲ操作における擬陽性の最も普通の原因は、先に増幅されたＤＮＡの持ち 込み（carryover）であるが、サンプル間の汚染もその問題の一因である。サン プル取扱い中およびＰＣＲ操作中の汚染可能性を最小にするために、一連の工程 を型にはめて行った。 試薬の調製には、プラスチック製で使い捨ての単独用途のビーカーを使用した 。全ての試薬の調製は、ＲＮａｓｅを含まない瓶入りの蒸留水（Abbott Laborat ory，Catalog #NDC 0074- 7139-09）を使用して行った。全試薬を単独用途のチューブに分けて入れ、使用 するまで−２０℃で保存した。 サンプルの取扱い、増幅および検出は、３か所の別々の実験室で行った。サン プルの取扱いは、層流フード中で行った。常にラテックスの手袋をはめ、測定中 に何度も取り替えた。各実験室には、独立した一組のピペットマンがあり、操作 中はバリアピペットチップを使用した。増幅は、アクリル製の生物学的に安全な キャビネット中で行った。生物学的に安全なキャビネットには、ＰＣＲ実験室と 同様に、紫外線源を備え、可能なＲＮＡ／ＤＮＡ汚染を制御するために、毎週、 紫外線滅菌（American Ultraviolet Company，Murry Hills，NJ）を行った。各 測定に、免疫捕獲、逆転写およびＰＣＲの陰性コントロールを含めた。３個の陰 性コントロールのいずれか一つが陽性の結果になった場合は、測定を無効とした 。プライマーおよびプローブのオリゴヌクレオチドの調製 プライマーＳＫ３８／ＳＫ３９（各々、ヌクレオチド１５５１〜１５７８およ び１６３８〜１６６５を表す）およびＨＩＶ−１（ＨＩＶＳＦ２，Genebank Ｋ ０２００７）ｇａｇ領域のヌクレオチド１５９７〜１６３５を表すプローブＳＫ １９を、Applied Biosciences，Inc．380 Synthesizer（Foster City，CA）を使 用してAbbott Laboratoriesで合成し、Waters Photodioarray 990（Milford，MA ）によりＨＰＬＣ精製を行った。粒子の調製 カルボキシ化されたラテックス微粒子（直径０．１〜０．３μｍ、Seradyn In c.，Indianapolis，IN）を、１−エチル−３，３−（ジメチルアミノプロピル） カルボジイミド化学（ＥＤＣ）（Sondergard-Anderson，J.，Lauritzen，E.，Li nd，K.，and Holm，A．Covalently Linked Peptides For Enzyme-Linked Immuno sorbent Assay．J．Immuno Methods 1990;131:99-104）を使用して、ＨＩＶ−１ モノクローナル抗−ｇｐ１２０および抗−ｇｐ４１ ＩｇＧ（Abbott Laborator ies）と共有的に結合させた。結合後、微粒子を１７，０００ｘｇ（Beckman J2- 21M）で３０分間遠心し、上清を捨てた。微粒子を同量の洗浄緩衝液（２％のTwe en20を含むＰＢＳ）で２回洗浄した後、被覆緩衝液（１５０ｍＭのトリス（ｐＨ ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％の豚皮ゼラチン、０．１％のＴｗｅ ｅｎ２０、９．５％のショ糖および０．０２％のＮａＮ3）により 再懸濁した。被覆緩衝液中、４５℃で１６時間インキュベートした後、微粒子を ペレット化し、上清を捨てた。微粒子を保存緩衝液（６５．５ｍＭのトリス、８ ４．５ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．４Ｍの ショ糖、１％の豚皮ゼラチンおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０）により再懸濁し て、最初の体積の５０％にし、固体の割合を、希釈画分のＡ500を公知固体の標 準曲線と比較することにより求めた。微粒子は、保存緩衝液により、予め決めた 割合の固体になるように調整し、使用するまで２〜８℃で保存した。ＳＫ１９プローブの標識化 ＳＫ１９オリゴヌクレオチド（５’−ＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡ ＡＴＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣ）の５’末端をＴ４ポリヌクレ オチドキナーゼを使用して32ＰＯ4で標識化した。反応物は、５．０ｍＭのトリ スＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ2、５．０ｍＭのＮａＣｌ、１ ．０μｇのＳＫ１９、５０μＣｉのγ32Ｐ ＡＴＰ（Amersham，３０００Ｃｉ／ ミリモル）および１０ＵのＴ４キナーゼ（New England BioLabs，Beverly，MA） で構成され、全体積は１０μｌであった。反応を３７℃で３０分行い、次いで、 Ｔ４キナーゼの不活性化を９５℃で５分行った。標識したプローブを未混入の32 Ｐ ＡＴＰから分離するために、反応混合物を、２００Ｖで１時間、１０％ポリ アクリルアミドゲル（２９．２５ｍｌのＨ2Ｏ、２．２５ｍｌの１０×ＴＢＥ〔S ondergard-Anderson，J，Lauritzen，E.，Lind，K.，and Holm，A．Covalently Linked Peptides For Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（酵素結合免疫測定 法用の共有結合ペプチド）．J．Immuno．Methods 1990;131:99-104〕、１１．５ ｍｌのポリアクリルアミド：ビス（１９：１）、３０μｌの１０％過硫酸アンモ ニウムおよび３０μｌのＴＥＭＥＤ）による電気泳動にかけた。ＤＮＡを０．５ μｇ／ｍｌの臭化エチジウム／ｄｄＨ2Ｏで５分間染色し、長波長ＵＶ照射（LKB 2011 Macrovue）を使用して可視化した。標識化したプローブを表すバンドを切 り取って、０．５ｍｌのＳＴＥ（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐ Ｈ８．０）および１ｍＭのＥＤＴＡ）を含む１．５ｍｌのエッペンドルフチュー ブに入れた。ゲル画分からプローブを溶離するために、チューブを室温で１６時 間回転させた（Labquake Shaker，Berkley，CA）。溶離された３μｌのプローブ は約６．０ｎｇに対応し、これを使 用して標識化効率を測定した。標識化ＳＫ１９プローブの特異的活性は、通常、 １×１０7〜２×１０7ｃｐｍ／μｇであった。その標識化プローブを使用するま で−２０℃で保存した。ウィルス捕獲 ＨＩＶ−１ビリオンの免疫捕獲をリン酸塩緩衝食塩水（１５０μｌ；ＰＢＳ， １３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１． ７６ｍＭのＫＨ2ＰＯ4）、抗ＨＩＶ−１抗体を被覆した微粒子（５０μｌ）およ び血漿（５０μｌ）を含む１．５ｍｌのエッペンドルフチューブで行った。混合 物を、揺れる台（２０ｒｐｍ，Thermolyne VariMix）の上で３時間、室温でイン キュベートした後、５０００ｒｐｍで１０分遠心し、上清は取っておくか捨てる かした。プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ溶液（２００μｌ；１０ｍＭのトリス（ｐＨ ７．４）、０．２５％ＳＤＳ）０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫおよび１０ ｐｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ）の添加によりゲノムＨＩＶ−１ＲＮＡを抽出して、 さらにインキュベートした（５６℃で１時間）。同量のフェノールで抽出した後 、同量のクロロホルム（０．３ＭのＮａＡＯｃに調整）で抽出することによりＨ ＩＶ−１ＲＮＡを精製し、−２０℃で １６時間、２倍体積の無水エタノールで沈澱させた。ＲＮＡを１２，０００ｒｐ ｍで１０分間、遠心（Hill Scientific mv 13）によりペレット化し、上清を捨 てた。ＲＮＡペレットを氷冷した７０％エタノールで洗浄し、前記と同様に遠心 し、上清を捨てて、ＲＮＡを３０μｌのｄｄＨ2Ｏに溶解した。逆転写 ウィルスＲＮＡを、Avian Myeloblastosis Virus（AMV-RT，Gibco-BRL）由来 の逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに逆転写した。単離したＨＩＶ−１ゲノムＲＮ Ａのアリコート（１５μｌ）を５．０μｌのＲＴ混合物を含む０．５ｍｌ遠心チ ューブに入れたものを二つ用意した。最終のＲＴ反応物は、１０ｍＭのトリス（ ｐＨ８．３）、２ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、０ ．００１％のゼラチン、各２５μＭのｄＮＴＰ（Pharmacia，Piscataway，NJ） および２５ｎｇのＳＫ３８／ＳＫ３９プライマー（ＳＫ３８ ５’−ＡＴＡＡＴ ＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴ、ＳＫ３９ ５’−ＴＴＴＧ ＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ）を含んでいた。チューブ を５分間９５℃に加熱し、遠心して、８．０ＵのＲＮａｓｉｎ（Promega，Madis on，WI）を含む 逆転写酵素（２．０Ｕ；Gibco-BRL）を添加した。ＲＴ反応は、４２℃で３０分 行った。次いで、３０μｌの水および２滴の鉱物油（Sigma，St．Louis，MO）を 添加し、逆転写酵素を９５℃で５分間加熱して不活性化した。ＰＣＲ ＨＩＶ−１ＤＮＡの増幅は、５０μｌのＰＣＲ混合物を各サンプルに添加する ことにより進行させた。最終のＰＣＲ反応物は、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３ ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、０．００１％のゼラチン、各 ５０μＭのｄＮＴＰ、５０ｎｇのＳＫ３８／ＳＫ３９プライマーおよび１．０Ｕ のＴａｑポリメラーゼ（Cetus，Normalk，CT）を含んでいた。各測定には、既知 量のＨＩＶ−１プロウィルスを表す一組のＤＮＡコントロールが含まれており、 測定はそれと比較して定量化することができた。増幅は、９４℃で１分の変性お よび５６℃で２分のアニーリング／伸長の３５サイクル分をプログラムしたPerk in Elmer Cetus 480型Thermocyclerを用いて行った。増幅フラグメントの検出 液体ハイブリッド形成およびオートラジオグラフィー：増幅 したＨＩＶ−１ＤＮＡを、５μｌの32ＰＳＫ１９プローブ（２．５μｌのプロー ブ＋２．５μｌのＲ３緩衝液〔５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍ ＭのＭｇＣｌ2、１００ｍＭのＮａＣｌ〕）（１〜２×１０7ｃｐｍ／μｇ）を１ ５μｌの増幅物質にハイブリッド形成させることにより検出した。増幅した物質 およびプローブを混合し、１００℃で１０分加熱し（二本鎖増幅フラグメントを 分離するため）、遠心して濃縮物をチューブの底部に戻し、５６℃で３０分間ア ニーリングさせた。５μｌの充填染料（０．２５％のブロモフェニルブルー、４ ０％のショ糖）を各サンプルに添加し、その全量を１０％ポリアクリルアミドゲ ルに載せた。電気泳動を１５０Ｖで３０分、次いで２５０Ｖで１．５時間行った 。ゲルをワットマンブロットペーパー上に置き、プラスチックのラップで覆い、 増感板（DuPont Cronex）を使用して−８０℃で１時間および４時間オートラジ オグラフィーにかけた。オートラジオグラフの現像は、Kodak M35A X-OMATプロ セッサーを使用して行った。 オートラジオグラフの定量：サンプル結果を血漿および既知ＤＮＡコピー数の コントロールと直接比較することにより、結果の定量化を行った。いくつかの場 合は、デンシトメーターの 読み取りの精確な比較を使用して結果を定量化した。結果 アッセイコントロールの解析 免疫捕獲、逆転写および増幅操作の効率を特定のコントロールを使用してモニ ターした。免疫捕獲コントロールは、ＨＩＶ−１ IIIＢ感染Ｈ９細胞系由来の 組織培養上清を段階希釈して、できるだけ希釈した二つの陽性希釈物から構成し た。逆転写コントロールは、ＨＩＶ−１ IIIＢ感染Ｈ９細胞系から抽出し、精 製して調製したＲＮＡを段階希釈して得られた最も希釈された二つの陽性希釈物 からなる。増幅コントロールは、細胞１個につきＨＩＶ−１コピーを一つ含むＨ ＩＶ−１ ＬＡＶ感染８Ｅ５細胞系から得た精製ＤＮＡからなる。 ３種類のコントロールにより得られた特定の増幅産物を図１に示す。通常、各 組のコントロールの検出は、アッセイ間で一致し、アッセイの感度が証明された 。さらに、免疫捕獲、逆転写および増幅操作の陰性コントロールを各アッセイに 含めて、特異性を証明した。アッセイパラメータの最適化 ウィルス捕獲アッセイでは、ＨＩＶ−１のｇｐ４１および ｇｐ１２０エンベロープタンパク質に特異的なモノクローナル抗体と共有結合さ せた、血清／血漿中の細胞非含有のビリオンを捕獲するラテックス微粒子（０． １μｍ）を使用する。免疫捕獲の当初のプロトコールでは、３時間のインキュベ ーション、プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ消化、フェノール−クロロホルム抽出、ウ ィルスＲＮＡを精製するためのエタノール沈澱、逆転写およびＰＣＲによる増幅 を含んでいた。アッセイのこの部分を完了するのに要する時間は合計５〜７時間 であった。さらに、増幅した物質の検出には、液体ハイブリッド形成、ゲル電気 泳動およびオートラジオグラフィーが必要であった。 このプロトコールにおける工程の多くは経験的に決められたので、操作全体を 簡潔にし、要する時間および汚染の可能性を少なくするために、検出前の工程の 一部または全部の改善が求められた。 直接溶解緩衝液： フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によ るウィルスＲＮＡの精製は、作業が大変で、時間のかかるものである。しかし、 この精製を行うと、ＰＣＲにおけるＳＤＳの阻害作用を克服し、アッセイを妨害 する可能性がある過剰のプロテイナーゼＫを除去するのに都合 がよい（Erlich，H.A，PCR Technology．Principles and Applications for DNA Amplification，Stockton Press，1989.new York．pp.17-22）。有機溶媒の使 用およびエタノール沈澱の必要性を省くために、一連の直接溶解緩衝液を調べた 。その目的は、標準的な消化／抽出操作に匹敵する結果が得られながら、逆転写 および増幅操作に適合する緩衝液を作ることであった。 細胞膜およびウィルス膜の破壊に最も一般的に使用される試薬は、イオン性洗 剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）並びに非イオン性洗剤のTriton Ｘ−１ ００およびTween２０である。プロテイナーゼＫは、核酸と会合している可能性 があるタンパク質を消化するために、これらの洗剤と一緒に使用された。 Trito n Ｘ−１００およびTween２０の濃度は０．１〜０．５％の範囲であった。これ ら二つの試薬を０．５％以下の濃度で使用すると、増幅操作の際にＴａｑポリメ ラーゼを妨害しない。他方、ＳＤＳは、０．１％および０．０１％の濃度で存在 させると、ＰＣＲを各々９９％および９０％阻害する。ＳＤＳは、０．００１％ 以下の濃度で使用すると、Ｔａｑポリメラーゼを阻害しない（Erlich，H.A.，前 出）。 ウィルス膜の標準的溶解に使用される成分は、０．２５％のＳＤＳおよび５０ ０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含んでいた。しかし、上述のように、直接溶 解緩衝液中でウィルス膜を溶解し、かつ、逆転写／増幅において適合する濃度は 、かなり低下させる必要があると考えられる。この点に関して、低濃度のTriton Ｘ−１００、Tween２０またはＳＤＳを含む溶解緩衝液を評価した。さらに、低 濃度のプロテイナーゼＫを低濃度の洗剤を含む溶解緩衝液に添加した。この場合 、ＲＴおよびＰＣＲ操作を開始する前に溶解緩衝液を９５℃で１０分加熱してプ ロテイナーゼＫを不活性化した。緩衝系を与えるために、１０ｍＭのトリス（ｐ Ｈ７．０）を選択して、調べた全溶解緩衝液に含めた。 検討した種々の直接溶解緩衝液の組成を表１に示す。最初にＲＮＡおよびＤＮ Ａコントロールを使用する標準的アッセイを使用して、５６℃、１時間のインキ ュベーション温度および時間で溶解緩衝液の評価を行った。 １０ｍＭのトリスおよび種々の濃度のTriton Ｘ−１００を含む緩衝液は、標 準的方法によって得られるシグナルと同様のシグナルを生じた。同様に、種々の 濃度のTween２０を含む緩衝液も、標準的方法によって得られるシグナルと同様 のシグナ ルを生じた。１０ｍＭのトリスおよび種々の濃度のＳＤＳを含む３種類の溶解緩 衝液のうち、０．００１％のＳＤＳを含むものだけが、通常の方法と同じ結果に なった。０．１％および０．０１％のＳＤＳを含む溶解緩衝液はシグナルを生じ なかった。このことから、ＳＤＳがＴａｑポリメラーゼに対して阻害作用をする ことが確認された。同様に、ＳＤＳおよび１μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含 む溶解緩衝液も、ＳＤＳ濃度が０．００１％以上に増加すると、感度が低下する ことが示された。０．００１％のＳＤＳを含む溶解緩衝液のみが、標準的方法に 匹敵する結果を示した（図２）。 種々の溶解緩衝液が免疫粒子の存在下でＨＩＶ−１ビリオンを破壊する効率お よびＲＴ／ＰＣＲ反応における緩衝液の影響を、免疫捕獲コントロールを使用し て測定した。分析は、酵素反応に対する可能な逆効果を最小にするために、洗剤 濃度を最小にしたものに限定して行った。 図３に示すように、３種類の洗剤のいずれかと１μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ Ｋを含む直接溶解緩衝液は、コントロールと同じシグナルを生じた。直接溶解緩 衝液からプロテイナーゼＫを除くと、シグナルはかなり減少した。 ３種類の洗剤のいずれかを使用すると、ＨＩＶ−１ビリオンが効率的に溶解さ れ、いずれも酵素反応に対する影響はなかったと考えられる。一例として、１０ ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）、０．００１％のＳＤＳおよび１．０μｇ／ｍｌの プロテイナーゼＫを含む溶解緩衝液を使用してアッセイを行った。 要約すると、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）、０．００１％のＳＤＳおよび １μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む緩衝液を使用して直接溶解を行うと、０ ．２５％のＳＤＳおよび５００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む標準的な消 化緩衝液に匹敵する結果が得られた（図３と５Ｄ）。従来の消化緩衝液と違って 、この組成物では、ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの全濃度が対数的に２倍減少 （two log decrease）し、酵母ｔＲＮＡは除去された。 直接溶解緩衝液のインキュベーション時間および温度：ウィルス膜の破壊およ びゲノムＲＮＡの核タンパク質からの放出に要する最小の時間および温度を、直 接溶解緩衝液を使用して測定した。標準的方法のパラメータである５６℃および １時間をコントロールとして使用した。二つの条件をテストした。すなわち、５ ６℃で３０分のインキュベーションおよび３７℃で ３０分のインキュベーションである。直接溶解緩衝液の使用によるアッセイ感度 に対する時間および温度の結合効果を図４に示す。３７℃で３０分間直接溶解緩 衝液を使用して行ったＲＮＡ検出の感度は、標準的方法の場合と同じであった。 バンドの強度におけるわずかな違いはよく見られることであり、酵素反応のアッ セイ間での可変性を表す。すなわち、これらのパラメータを選択してその後の全 てのアッセイに使用した。 ウィルス捕獲時間：抗ＨＩＶ−１抗体で被覆した微粒子による血漿関連ビリオ ンの免疫捕獲に要する最小時間を測定した。室温で、３時間から２時間および１ 時間に短縮した場合の効果を評価した。１時間捕獲を行った後に得られた効果は 、標準的方法によって得られる効果と同じであった（図５）。従って、続く全て のアッセイは、免疫捕獲を１時間にして行った。 ＲＴ／ＰＣＲ緩衝液の単独添加：標準的な逆転写工程では、１５μｌのサンプ ルを５μｌのＲＴ緩衝液に添加した。熱変性の後、１μｌの逆転写酵素／ＲＮａ ｓｉｎを添加し、逆転写を４２℃で３０分行った。その後、３０μｌのｄｄＨ2 Ｏおよび２滴の鉱物油を添加し、混合物を９５℃で５分加熱した。増幅のための 全ての成分を含むＴａｑ混合物を添加し、増幅を開始 した。各アッセイチューブに対するこれらの合わせて６回に及ぶ複数の添加は、 操作全体を煩雑にし、隣のチューブからの持ち込みによる汚染の危険性を高めて いた。最近、ゲノムＨＣＶ ＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲを、緩衝液および酵素の１回 の添加により一本のチューブで行う方法が記載された（Lin，H.J.，Naiyi，S.， Mizokami，M.，and Hollinger，F.B．Polymerase Chain Reaction Assay for He patitis C Virus RNA Using A Single Tube For Reverse Transcription And Se rial Rounds Of Amplification With Nested Primer Pairs（逆転写およびネス テッドプライマー対による連続ラウンドの増幅を１本のチューブを使用して行う Ｃ型肝炎ウィルスのＰＣＲアッセイ）．J．of Med．Virology 1992;38:220-225 ）。この種の方法がＨＩＶ−１ウィルスＲＮＡの逆転写および増幅に使用できる かどうかを調べるために、単独添加によるいくつかのＲＴ／ＰＣＲ法をテストし た。ＨＩＶ−１単独添加ＲＴ／ＰＣＲ法の最終体積は１００μｌになるように選 択した。これは、標準的方法で使用した体積である。アッセイで１５μｌのサン プルを使用したので、ＲＴおよびＰＣＲ操作に必要な全成分を含む８５μｌをさ らに添加しなければならなかった。 同一の一般的アッセイ様式を一段階ＲＴ／ＰＣＲ法で使用した。直接溶解の後 、１５μｌのサンプルを０．５ｍｌの遠心チューブに入れ、５分間９５℃に加熱 してプロテイナーゼＫの変性をその溶解緩衝液中で行い、遠心して、８５μｌの 増幅混合物、次いで２滴の鉱物油を添加した。逆転写を４２℃で４５分間行い、 次いで、逆転写酵素の変性を９５℃で３分間行った。増幅は、標準パラメータを 使用して直接開始した。各サンプルのアッセイは二重に行い、ＲＴおよびＰＣＲ 操作はともに熱サイクラーを使用して行った。 標準的方法に匹敵する感度を達成するために、単独添加アッセイの成分濃度を 最適化しなければならなかった。トリス、ＫＣｌ、ゼラチンおよびＤＴＴ濃度は 、標準のＲＴおよびＰＣＲ法ともに同一であり、それらの濃度を単独添加法用に 選択した。従って、それらは変更しなかった。逆転写および増幅操作の感度に影 響を及ぼす最も決定的な二つのパラメータは、ＭｇＣｌ2およびｄＮＴＰ濃度で ある（Yong，W.H.，Wyman，S.，and Levy，J,A．Optimal Condition For Synthe sizing Complementary DNA In The HIV-1 Endogenous Reverse Transcriptase r eaction（ＨＩＶ−１内因性逆転写酵素反応 において相補的ＤＮＡを合成するための最適条件）．AIDS 1990;4:199-206）。 標準的なＲＴおよびＰＣＲ工程の最適なＭｇＣｌ2濃度は、各々、２．５ｍＭお よび１．５ｍＭであった。標準的なＲＴおよびＰＣＲ工程の最適なｄＮＴＰ濃度 は、各々、２５μＭおよび５０μＭである。ＲＴおよびＰＣＲ工程はともに、試 薬を単独添加して行うことになっていたので、これら二つの成分濃度は再び最適 化しなければならなかった。 最適の感度を調べるために使用したＭｇＣｌ2濃度は、１．５、１．７５およ び２．０ｍＭであった。テストしたｄＮＴＰ濃度は、５０、１００および２００ μＭであった。 ５０μＭのｄＮＴＰ濃度でＭｇＣｌ2濃度を変化させると、全てのシグナル強 度はテストしたコントロールにおいてかなり減少した（図６）。さらに、ＭｇＣ ｌ2濃度を上げると、シグナル強度は低下した。２．０ｍＭのＭｇＣｌ2では、Ｒ Ｔおよび増幅コントロールは、弱いが検出可能なシグナルを生じた。これに対し て、免疫捕獲コントロールの場合は、検出可能なシグナルを生じなかった。従っ て、５０μＭのｄＮＴＰ濃度は、一段階ＲＴ／ＰＣＲでの最適な検出には低すぎ ると考えられた。 ｄＮＴＰ濃度を１００μＭに上げて、同じ濃度のＭｇＣｌ2 で評価を行った。図７に示すように、ＭｇＣｌ2濃度を上げると、ＲＴおよび増 幅コントロールのシグナルはわずかに減少した。しかし、先の実験と同様に増幅 コントロールシグナルがかなり減少したようには見えなかった。 ＭｇＣｌ2濃度を上げ、ｄＮＴＰ濃度を１００μＭにしたときに生じたＲＴお よび増幅コントロールシグナルの減少は、ｄＮＴＰ濃度がいくらか律速的である 可能性があることを示す。ＭｇＣｌ2を最低の最適濃度にし（１．７５ｍＭ）、 ｄＮＴＰ濃度を上げて（２００μＭ）実験を行い、これらの濃度が標準方法に匹 敵するシグナルを生じることを確かめた。 図８に示すように、一段階ＲＴ／ＰＣＲ法（１．７５ｍＭのＭｇＣｌ2および ２００μＭのｄＮＴＰを含む）は、標準法と同様のコントロールシグナルを生じ た。ｄＮＴＰ濃度が律速的でないことを確かめるために、その最終濃度を２００ μＭとし、ＭｇＣｌ2濃度を１．７５ｍＭにセットした。１００μｌの最終体積 における一段階ＲＴ／ＰＣＲ法を最適化した後は、試薬の使用を節約するために 、最終体積を５０μｌに減少させることを目的とした。５０μｌ法は、ＲＮＡお よびＤＮＡの両方のコントロールをテストしたとき、優れた結果が得られた（図 ９）。しかし、血漿コントロールのテストでは、シグナルは得られなかった。３ 組の血漿コントロールを実際に評価した。６個のＭＫ-4反応のうち、３個が極め て弱いシグナルてあり、残りの３個は陰性であった。ＭＫ-5コントロールは、い ずれもシグナルを生じなかった。従って、１００μｌの最終体積を一段階ＲＴ／ ＰＣＲ法に対して選択した。 要約すると、一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対する最終の増幅混合物は、１００μｌ の最終体積中に１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの ＤＴＴ、０．００１％のゼラチン、１．７５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００ｎｇのプ ライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ＵのＲＮａｓｉｎ、２．５ＵのＡＭＶ ＲＴおよび１ＵのＴａｑポリメラーゼを含んでいた。この増幅混合物により、 標準法に匹敵する結果が得られた。感度に対する影響はなく、混合物は実際には 、標準法よりもわずかに強いコントロールシグナルを生じたように思われる。最 終のアッセイ法は、次のように確立された。 ａ）室温で１時間ウィルス捕獲； ｂ）５０００ｒｐｍで１０分の遠心、上清を捨てる、１５０μｌのＰＢＳで洗浄 、前記と同様の遠心、および上清を捨てる； ｃ）３０μｌの直接溶解緩衝液の添加、簡単な攪拌、および３７℃で３０分間の インキュベーション； ｄ）２個の１５μｌのアリコートを別々の０．５ｍｌの遠心チューブに入れる、 および９５℃で５分間加熱； ｅ）８５μｌの増幅緩衝液の添加、２滴の油、４２℃で４５分間の逆転写、熱変 性、および増幅セロポジティブな妊婦における血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡの検出 感染した母親からその子供へのＨＩＶ−１の垂直感染に影響を及ぼす因子は分 かっていないが、予備的証拠はウィルス負荷が重要な役割を果たしている可能性 があることを示唆している。母親のＨＩＶ−１血漿ウィルス負荷が高いことと垂 直感染の可能性の増加とに相関関係があるかどうかを調べるために、下記実験を 試みた。米国およびウガンダ（アフリカ）で開始された研究から選択した４９人 のセロポジティブな妊婦の分娩時に、コード化された血漿サンプルを得た。血漿 サンプルは、自分の子供へのＨＩＶ−１感染があったか否かが分かっている母親 から選択した。全体的には、子供へのＨＩＶ−１感染があった母親が２１人で、 感染がなかった母親が２８人であった。米国の集団は、感染組が４人で非感染組 が１６人であった。ウガンダ の集団は、ＨＩＶ−１の感染組が１７人で非感染組が１２人であった。さらに、 米国およびウガンダの母親に対して利用できる血清学的データは、ＣＤ４の数お よびβ2ミクログロブリンのレベルであった。分娩時に、全ての母親は、臨床上 、無症候であった。 母親の血漿におけるＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出とＨＩＶの垂直感染との間には あまり関連がなかった。全体的に、テストした２２個の感染組の母親サンプル中 、４個がＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性であることがわかり、一方、２７個の非感染組の 母親サンプル中、１１個がＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性であった（表２）。 米国のグループ（表３Ａ）では、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ陽性だった感染組と非感 染組の母親の割合は同じであった（各々、４０および３８％）。予想されたよう に、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ陽性は、ＣＤ４＋の数が低いことと相関性があった。検 出可能なＨＩＶ−１ ＲＮＡを有する女性のＣＤ４＋の中央値は２５７／ｍｍ3 （四部位数間領域：１６１〜４１８／ｍｍ3）であり、検出可能なＨＩＶ−１ ＲＮＡがない女性のＣＤ４＋の中央値は９６６／ｍｍ3（四部位数間領域：５９ １〜１１１３／ｍｍ3）であった。しかし、４人の女性は、ＣＤ４＋が５００／ ｍｍ3より少なく、検出可能なＨＩＶ−１ ＲＮＡを有していたが、自分の子供 へのウィルスの感染はなかった。さらに、一人の女性はＣＤ４＋数が１１１３／ ｍｍ3であり、検出可能な血漿ＨＩＶ−１ ＲＮＡを有していなかったが、連続 した２回の妊娠の間にウィルスの感染があった。 ウガンダの母親（表３Ｂ）の場合、感染組の１２％の母親は、検出可能なＨＩ Ｖ−１ ＲＮＡを有していた（非感染組は４２％）。β2ミクログロブリンのレ ベルは、二つのグループ間であまり違いがなかった（感染組および非感染組で各 々、１．６６および１．６０μｇ／μｌであった。）。 セロポジティブな血液ドナーのＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出 血液ドナーの血漿におけるＨＩＶ−１ウィルス負荷は、ＨＩＶ−１の輸血に関 連した感染において重要な役割を果たすと考えられる。これを調べるために、Tr ansfusion Salety Study Repository（San Francisco，CA）から得た血漿サンプ ルのＨＩＶ−１ウィルス負荷を測定した。７８個の感染サンプルおよび１２個の 非感染サンプルのプールから２２個のサンプルを選択した。選択した２２個のセ ロポジティブなサンプルのうち、１１個は輸血に関連した感染があり、１１個は 非感染であった（表４）。ＣＤ４＋リンパ球の数は、最初のサンプルでは測定で きなかったが、採取の約１年後の平均ＣＤ４＋リンパ球数は、感染組および非感 染組のドナーに対して各々、４７０および７４６／μｌであった。 全体的に、２２個の血漿サンプルのうち７個がＨＩＶ−１ ＲＮＡ陽性である ことがわかった。１１個の感染性献血のうち、７個はＨＩＶ−１ ＲＮＡ陽性で あったが、１１個の非感染性献血はいずれもＨＩＶ−１ ＲＮＡ陽性ではなかっ た。従って、感染性とドナーサンプル中のＨＩＶ−１ ＲＮＡの有無の間には強 い相関性があった。考察 ＨＩＶ−１感染の検出は、ウィルス拡散の制御の大きな要因である。現在、Ｈ ＩＶ−１感染を確認するために、抗体ＥＩＡおよびウェスタンブロット試験が使 用されている。最近、ＨＩＶ感染の進行およびＨＩＶ感染者の治療に対する反応 のモニターに関心が集まっている。ＨＩＶ−１疾患の進行をモニターするために 、主にｐ２４抗原の検出、培養および核酸の増幅に基づく多くの方法が開発され ている。 定量的な細胞および血漿の培養により、末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）およ び血漿からＨＩＶ−１感染タイターを測定することができる。感染したＰＢＭＣ の数は、個々の臨床段階に応じて変化し、無症候の１：５０，０００〜エイズ患 者の１：４００（感染：正常）の範囲であることが研究により分かって いる（Ho，C.D.，Moudhil，T.，and Alam，M．Quantitation Of Human Immunode ficiency Virus Type １ In The Blood of Infected Persons（感染者の血液中 のＨＩＶ−１の定量）．N．Engl，J，Med．1989;321:1621-1625）。同様に、血 漿中の細胞非含有ウィルスの検出も、感染の臨床段階を表すことが分かっている （Coombs，R.W.，Collier，A.C.，Allain，J.P.，Nikora，B.，Leuther，M.，Gj erset，G．F.，and Corey，L．Plasma Viremla In Human Immunodeficiency Vir us Infection（ＨＩＶ感染における血漿ウィルス血症）．N．Engl．J．Med．198 9;321:1626-1631）。しかし、どちらの方法も、特別な設備を必要とし、かなり 高価で、時間もかかる。さらに、細胞培養は単離細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化 が必要であるが、これは、実際のｉｎ ｖｉｖｏの状況を表さない可能性がある 。また、血漿培養の感度は、既知感染の大半を検出するのに充分ではなく、その 再現性は、アッセイで使用する刺激したドナー細胞に依存する（Eschaich，S.， Rilter，J,，Rougler，P.，Lepot，D.，Lamelin，J.P.，Sepetjan，M.，and Tre po，C．Plasma Viremia As A Marker Of Viral Replication In HIV Infected I ndividuals（ＨＩＶ感染者におけるウィルス複製の マーカーとしての血漿ウィルス血症）．AIDS 1991;5:1189-1194）。 感染したＰＢＭＣに存在するＨＩＶ−１ ＤＮＡまたはウィルス関連ＨＩＶ− １ ＲＮＡの検出にはＰＣＲが使用されている。ＰＢＭＣから単離されたプロウ ィルスＨＩＶ−１ ＤＮＡの定量的検出は非常に感度が高い。しかし、測定した ＨＩＶ−１ ＤＮＡの全てが転写的に活性なＤＮＡに対応するかどうかは分かっ ていない。血漿ＨＩＶ−１ ＲＮＡウィルス負荷の増加が病気の進行の良好な予 報値であることが研究により分かっている。すなわち、ウィルス関連ＨＩＶ−１ ＲＮＡのＰＣＲによる測定は極めて感度が高く、有用であるはずである。しか し、血漿からのウィルスの単離は、遠心またはイソチオシアン酸グアニジン抽出 のいずれかを必要とする（Aoki-Sei，S.，Yarchoan，R.，Kageyama，S.，Hoekze ma，D.T.，Pluda，J.M.，Wyvill，K.M.，Broder，S.，and Milsuya，H．Plasma HIV-１ Viremia In HIV-１ Infected Individuals Assessed By Polymerase Cha in Reaction（ＰＣＲにより評価されたＨＩＶ−１感染者の血漿ＨＩＶ−１ウィ ルス血症）．AIDS Res．and Human Retro．1992;8:1263-1270；Scadden，D.T.， Wang，Z.，and Groopman，J.E．Quantitation Of Plasma Human Immunodeficiency Virus Type １ RNA By Competitve Polymerase Chain Reaction（競合ＰＣＲによる血漿ＨＩ Ｖ−１ＲＮＡの定量）．J，Inlect．Diseases 1992;165:1119-1123;Holodniy，M .，katzenstein，D．A.，Sengupta S.，Wang，A．M.，Casipit，C.，Schwartz， D．H.，Konrad，M.，Groves，E.，and Merigan，T.C．Detection And Quantific ation Of Human Immunodellciency Virus RNA In Patient Serum By Use Of The Polymerase Chain Reaction（ＰＣＲの使用による患者の血清のＨＩＶ ＲＮＡ の検出および定量）．J．Infect．Diseases 1992;163:862 866）。培養技術と同 様に、これらの方法は、作業が大変で、完了までにかなりの時間と専門的技術が 必要である。 本発明は、ＨＩＶ−１複製（ウィルス血症）の直接測定に対する血漿関連ＨＩ Ｖ−１ビリオンの免疫捕獲を使用するアッセイに有用である。この種のアッセイ は、培養技術や煩雑な化学抽出操作を必要とすることなく、血漿関連ＨＩＶ−１ ウィルスを測定するための、高感度で特異的な方法である。直接溶解緩衝液は、 ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの簡素化された逆転写および増幅法に関して直接使用さ れるように作った。これらの変更に より、ＨＩＶ−１ウィルス負荷をモニターするのに必要な時間がかなり短縮され た。 単位体積当たりに得られる全体的な表面積の増加のために、０．１〜０．３μ の粒子サイズを選択した。理論的には、これにより、粒子に結合する抗体の量が 最大になり、その結果、免疫捕獲の感度が増加するはずである。 感度を最大にするために、ポリクローナル抗体よりも高い親和性を有するモノ クローナル抗体を使用してＨＩＶ−１ビリオンの捕獲を行った。ｇｐ１２０およ びｇｐ４１タンパク質はともにウィルスの外膜の成分であり、全ての感染性ＨＩ Ｖ−１ウィルス粒子に存在する。すなわち、抗ｇｐ１２０および抗ｇｐ４１特異 的モノクローナル抗体を免疫捕獲用に選択した。 抗体を粒子に結合させる方法は、アッセイの感度および特異性の両方に影響を 及ぼすと考えられる。抗体を固体マトリックスに結合させるために使用される二 つの決まりきった方法がある。第一の方法は、おそらく最も簡単な方法であるが 、受動的な吸着であり、第二の方法は、共有結合である。抗体の特異的結合は、 粒子の化学組成に依存する。受動的な吸着は、粒子と抗体の間のイオン的・疎水 的相互作用によって達成される。共 有結合は、粒子および抗体の間に共有結合が生じることに基づいている。モノク ローナル抗体の共有結合にはカルボキシル化粒子を使用した。ＥＤＣの助けによ って、粒子のカルボキシル基と抗体のアミノ基との間に共有結合が生じる。両方 の方法とも、感度がかなり高いことが分かっている。粒子に結合した抗体の全て が共有結合的であるとは限らないが、この方法は安定性に優れており、このため 、抗体の共有的結合法を使用した。 アッセイ法をかなり簡素化するために、一連の最適化工程の探索を行った。こ れらの最適化には、直接溶解緩衝液の開発、免疫捕獲時間の短縮、直接溶解に要 する時間および温度の減少（低下）ならびに試薬の単独添加による逆転写および 増幅の実施が含まれた。 ゲノムＲＮＡを単離するための当初の方法は、通常の分子生物学的技術を使用 したので、煩雑であり、時間がかかった。免疫捕獲の後、比較的高濃度のＳＤＳ を使用してウィルス膜を破壊した。ウィルスＲＮＡと会合したタンパク質の消化 のために、プロテイナーゼＫを使用した。ＨＩＶ−１ ＲＮＡの精製は、有機溶 媒抽出、続く一夜のエタノール沈澱を組み合わせて行った。 直接溶解緩衝液は、無傷のビリオンからゲノムＨＩＶ−１ ＲＮＡを抽出し、 それによって逆転写および増幅操作にゲノムＨＩＶ−１ ＲＮＡが直接使用でき るように調製した。これによって、通常の操作では必要な有機溶媒抽出およびエ タノール沈澱の両方の操作が取り除かれた。有機溶媒抽出操作を使用しないこと により、アッセイ時間が少なくとも合わせて１６時間短縮された。 直接溶解に必要な試薬の量を決定するために、等量の細胞およびウィルス物質 を破壊するのに必要な適切な洗剤および／またはプロテイナーゼＫの濃度を測定 した。典型的には、１０6個のヒトの細胞の破壊に、０．２５％のＳＤＳおよび ０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶液１ｍｌが必要である（１９）。 免疫粒子の理論的な結合容量は約１０，０００ビリオンであることが先の研究で 測定された（Henrard，D,R.，Mehaffey，W.F.，and Allain，J.P．A Sensitive Viral Capture Assay For The Detection Of Plasma Viremaia In HIV Infected Individuals（ＨＩＶ感染者における血漿ウィルス血症の検出のための感度の高 いウィルス捕獲アッセイ）．AIDS Res．Human Retro．1992;8:45-51）。すなわ ち、１０6個の細胞を溶 解するのに必要なＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの濃度は、１０，０００個のビ リオンを溶解するのに必要な濃度よりも少なくとも１００倍大きいはずである。 さらに、細胞の体積は、ウィルスの約１０００倍大きい（すなわち、細胞および ウィルスのの平均直径は、各々３μおよび０．１μである。）。従って、等量の ウィルス物質の溶解には、洗剤およびプロテイナーゼＫの量を合わせて１０5倍 少なくした量で充分であるはずである。しかし、免疫捕獲されたビリオンに添加 される直接溶解緩衝液の体積は３０μｌで、これは、細胞の溶解に必要な量と比 較すると、洗剤およびプロテイナーゼＫの合計量を３３倍少なくした量に相当す る。このことは、１０，０００個のビリオンを破壊するのに必要な洗剤および／ またはプロテイナーゼＫの濃度の３０００倍の減少を示唆し（１０5÷３３）、 これは、各々、約０．０００１％および０．１６７μｇ／ｍｌのＳＤＳおよびプ ロテイナーゼＫの濃度に相当する。これらの濃度は、有機抽出法に匹敵する結果 を与えた実際のテスト濃度より１０倍小さい。すなわち、ＨＩＶ−１ビリオンの 破壊に使用したＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの濃度は、これらの計算に基づい て必要とされる濃度より少なくとも１０倍大きかった。 逆転写も増幅も、溶解緩衝液がTriton Ｘ−１００、Tween２０または低濃度の ＳＤＳを含む場合は、阻害されなかった。０．５％のTriton Ｘ−１００または ０．４５％のTween２０を含む溶解緩衝液では、阻害効果は見られなかった。興 味深いことに、ＳＤＳは、０．００７％より大きい濃度の場合に逆転写反応を阻 害すると考えられた。検討した直接溶解緩衝液の洗剤濃度が０．０１％である場 合、逆転写反応中のその最終濃度は０．００７％であった。この濃度は、ＰＣＲ 反応中にさらに０．００１４７％に減少した。上記で述べたように、ＳＤＳは、 ０．００１％以下の濃度ではＰＣＲを阻害しなかった。０．００１４７％のＳＤ Ｓが反応を阻害するかどうかは測定しなかったが、この増加がＰＣＲ反応に驚く べき影響を及ぼすようには考えられない。その代わり、陽性結果の不足は、逆転 写が阻害されたことを示唆する。これは、低濃度のＳＤＳが逆転写酵素に対して 阻害効果を有するという報告がなかったので、予想していなかった。この濃度の ＳＤＳがどういうわけかＲＴと錯体を形成し、それによってｃＤＮＡの完全また は充分な産生を阻害することが考えられる。あるいは、ＳＤＳが、たぶん逆転写 酵素の活性部位の構造に間接的に影響を及ぼすことによ り、逆転写酵素自体を阻害する可能性がある。ＲＴ反応のいずれかの部分の阻害 は、ｃＤＮＡ鋳型なしにはＰＣＲ産物が得られないので、ＨＩＶ−１ ｃＤＮＡ の最終増幅に大きな影響を及ぼすであろう。 プロテイナーゼＫの直接溶解緩衝液への添加は、酵素反応のいずれかに逆効果 を及ぼすことはなかった。事実、テストした各洗剤を含む緩衝液に１μｇ／ｍｌ を添加しても、有機抽出法と同様の結果が得られた。 直接溶解に必要な免疫捕獲時間および温度を下げても、アッセイの感度に対す る逆効果はなかった。捕獲時間が３時間から１時間に短縮することができたので 、使用するモノクローナル抗体は、ビリオンと会合したｇｐ１２０およびｇｐ４ １に対して極めて高い親和性を有するのが好ましい。ＨＩＶビリオンの破壊およ びＨＩＶ−１ ＲＮＡの単離には、低温で短時間のインキュベーションで充分で あった。これは、溶解が非常に速く、無傷のビリオンからＨＩＶ ＲＮＡを完全 に解離するには、選択した洗剤およびプロテイナーゼＫの濃度で充分であること を示す。 逆転写および増幅操作を一緒にして一つのアッセイにしても、 アッセイの感度に対する逆効果はなかった。他の標的（すなわち、ＨＣＶ）の場 合と同じように、試薬の単独添加によるＲＴおよびＰＣＲ反応の実施は、アッセ イにおける成分濃度のいくつかを最適化することにより達成された。しかし、驚 くべきことに、５０μｌの一段階ＲＴ／ＰＣＲ法は、サンプルをアッセイする際 には作用しなかった。ＲＮＡおよびＤＮＡコントロールの測定の場合は、５０μ ｌの方法で、同等の測定シグナルが得られた。最終のＳＤＳおよびグリセロール 濃度を除く全ての成分濃度は、両方の方法において同じままであった。ＳＤＳ濃 度は、最終のアッセイ体積が５０μｌの場合は２倍にした（０．０００１５％か ら０．０００３％にした）。しかし、この濃度でＴａｑポリメラーゼ酵素が阻害 を受けるという報告はされていない。さらに、ストック酵素の添加の結果生じる グリセロールの濃度は、５０μｌの方法の場合、１００μｌの方法の場合の２倍 以上に増加した（２．２％対０．９７％）。製造者によれば、グリセロール濃度 がこの範囲である場合、酵素に対する阻害の影響はあまりない。しかし、アッセ イ体積が減少すると、免疫捕獲に関連する粒子の高濃度化が生じた。酵素反応は 、どうも粒子によって妨害または阻害を受けたと考えられ る。 免疫捕獲法の最適化により得られる最も重要な二つの利点は、恐らく、関与す る全工程数の減少およびアッセイの完了までに要する時間の短縮であった。アッ セイ法におけるこれらの変化は、サンプルの持ち込みによる汚染の危険性をかな り少なくすると考えられる。表５に、通常の方法と本発明の操作の違いを詳しく 記載する。直接溶解緩衝液の使用、有機溶媒抽出操作の削除および一段階ＲＴ／ ＰＣＲ法の全てにより、各アッセイチューブを開けなければならない回数がかな り減少した。例えば、免疫捕獲工程後に各チューブを開けなければならなかった 実際の回数は、標準法での１０回から改良法での３回になった。さらに、アッセ イチューブから試薬を除去または試薬を添加する回数は、標準法での１５回から 改良法での４回になった。標準アッセイ法および改良法（一段階ＲＴ／ＰＣＲ） の完了に必要な実際の実験時間の主な違いは、一夜行うＲＮＡ沈澱工程にある。 この工程を改良法から除去すると、少なくとも１５時間の短縮になった。全体的 に、改良法は、免疫捕獲時間を２時間、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの溶解および単 離時間を１５時間、逆転写およびＰＣＲ混合物を作る時間をさらに１時間短縮し た。 標準法を使用すると、サンプルの結果を得るのに少なくとも２日間を要したが、 改良法を使用すると同じ結果を得るのにほんの９時間であった。 偽陽性反応の発生の抑制は、汚染コントロール操作に対する完全な固執が助け となった。これは、３個の別々の実験室を使用してサンプルの調製、ＰＣＲおよ び検出を行うことにより達成した。各実験室には、別々の装置セットがあった。 増幅産物による汚染を少なくし、可能な限り除去するために、バリアピペットチ ップおよびＵＶ安定化の通常の使用も行った。汚染をコントロールするためにか なりの測定を行ったが、偽陽性反応は、約５００回のテストで１回の割合で生じ た。これは、ＰＣＲアッセイの高い特異性を維持するめためには、汚染コントロ ール操作への固執が重要であることを示す。 次いで、簡略化した免疫捕獲−ｃＤＮＡ／ＰＣＲを使用して、ＨＩＶ−１血漿 ウィルス負荷と垂直または水平ＨＩＶ−１感染との間に関連があるかどうかを測 定した。ＨＩＶ−１垂直感染の実験に含まれる女性は比較的健康で、病気の症状 を示さなかった。彼女らの平均ＣＤ４＋値は高く（１７８〜１１１３ｍｍ3）、 β2ミクログロブリンレベルは正常値内（平均１．６４μｇ／ｍｌ）であり、こ れは、その実験に含まれる女性が比較的健康であることを示唆した。ＨＩＶ−１ ＲＮＡ陽 性（血漿ウィルス血症）は、ＣＤ４＋値が低いことと相関性があった。このこと は、ＣＤ４＋値と血漿ウィルス血症の増加との間の相関性があることを示した初 期の研究と一致した（Saag，M.S.，Crain，M．J.，Decker，W．D.，Camplell-Hi ll，S.，Robinson，S.，Brown，W．E.，Leuther，M.，Whitley，R．J.，Hahn，B ．H.，and Shaw．G.M．High-Level Viremia In Adulls And Children Infected With Human Immunodeficiency Virus：Relation To Disease Stage And CD4+ Ly mphocytes Levels（ＨＩＶに感染した大人と子供における高レベルなウィルス血 症：病気の進行段階およびＣＤ４＋リンパ球レベルとの関係）．J．Infect．Dis ．1991;164:72-80）。反対に、血漿ＨＩＶ−１ウィルス負荷のレベルと垂直感染 との間には相関性が見られなかった。他の報告では、垂直感染のある母親には血 漿ウィルス血症がないことが示された（Ariyoshi，K.，Weber，J.，and Walters ，S．Contribution Of Maternal Viral Load TO HIV-１ Transmission（母親の ウィルス負荷のＨＩＶ−１感染に対する寄与）．Lancet 1992;340;Puel，J,，Iz opet，J.，Lheritier，D.，Briant，I.，Guyader，M.，Tricoire，J．and Berre bi，A．Viral Load And Mother To Infant HIV Transmis sion（ウィルス負荷と母親から乳児へのＨＩＶ感染）．Lancet 1992;340:859-86 0）。母親における複製の速い有毒のＨＩＶ変異体の発生（Grunter，R.A.，Terp stra，F.G.，De Goede，R,，Mulder，J．W.，De Wolf，F.，Schellekens，P.，V an Lier，R.，Termette，M.，and Miedema，F．Immunological And Virologic M arkers In Individuals Progressing From Seroconversion To AIDS（セロコン バージョンからエイズに進行した患者の免疫学的およびウィルス学的マーカー） ．AIDS 1991;5:837-844）、母親の変異体の選択的感染（Wolinsky，S．M,，Wike ，C，A.，Korber，B.，Hutto，C.，Pparks，W．P.，Rosenblum L．L.，Kunstman ，K．J.，Furtado，M．R.，and Munoz，J.L．Selective Transmission Of Human Immunodeficiency Virus Type-１ Variants From Mothers To Infants（ＨＩＶ −１変異体の母親から乳児への選択的感染）．Science 1992;255:1134-1137）、 および他の微生物との共感染（Holme，W．Vertical Transmission Of HIV（ＨＩ Ｖの垂直感染）．Lancet 1991;337:793-794）は、ＨＩＶ−１の母親からその子 供への感染における重要な可変因子であると考えられる。本発明者らの結果はま た、ウィルス負荷以外の因子がＨＩＶ−１の垂直感 染に寄与している可能性があることを示唆するものである。胎盤への外傷の結果 、発達している胎児に細胞およびウィルスの両方が入り込む可能性がある。子供 が産道を通る際の感染の可能性も、分娩中に存在する母親の血液量に依存して、 もっともと思われる。ウィルスは、食物接種、涙液腺、または分娩中に生じた可 能性がある小さな傷を通して子供に入り込むことができたかもしれない。そのよ うな場合は、分娩中に失われた母親の血液量が実際のウィルス負荷よりも重要で あると考えられる。ウィルス負荷は低いが、血液の損失は大きい女性の場合は、 ウィルス負荷は高いが、分娩中の血液の損失は最小である女性よりも、ＨＩＶ感 染の可能性が大きいかもしれない。このことは、本発明者らの実験において、末 梢血に検出可能なＨＩＶＲＮＡが認められず、ＣＤ４＋は非常に高い無症候の母 親がなぜその子供にＨＩＶ−１を感染することができたかの説明になると考えら れる。 ＨＩＶ−１の垂直感染とは違って、ＨＩＶ−１の血液ドナーから受血者への水 平感染は、血漿ウィルス血症とかなり相関性があった。この実験では、２２人全 ての受血者に、ＨＩＶ−１セロポジティブな血液が移された。受血者にＨＩＶ− １感染を 招いたドナーサンプルのかなりの割合（６４％）において検出可能なＨＩＶ−１ ウィルス血症が認められ、一方、受血者を感染させなかったドナーには検出可能 なＨＩＶ−１ウィルス血症が認められなかった。これらの結果は、ＨＩＶ感染が 、主に輸血前後における血漿ウィルス血症のレベルに依存することを示唆する。 ＨＩＶ−１感染者の数が増加するにつれて、感染の経過中の症状のモニターが より重要になりつつある。病気の進行を迅速かつ効率的に確認することができる アッセイが開発されれば、感染および種々の治療の効果のモニターに役立つであ ろう。かなり高感度の免疫捕獲ｃＤＮＡ／ＰＣＲアッセイは、これらの目的に特 に有用であると考えられる。本明細書に記載するアッセイは、血漿ＨＩＶ−１ウ ィルス負荷において対数的相違を生じさせることができ、現在は、血漿ＨＩＶ− １ウィルス血症のレベルを検出・定量するより精確な方法の開発に尽力している 。これらには、ＰＣＲ以外の増幅系に基づく定量的検出系の開発が含まれる。 ＰＣＲの他に、標的ＤＮＡの増幅に現在使用されている二つの方法が文献に記 載されている。一つは、自立持続的配列複製 （３ＳＲ）と言い、他方は、リガーゼ速鎖反応（ＬＣＲ）である（Bush，C.E.， Donovan，R.M.，Peterson，W.R.，Jennings，M.B.，Bolton，V.，Sherman，D.G, ，Vanden Brink，K.M.，Beninsig，L.A.，and Godsey，J.H．Detection Of Huma n Immunodeficiency Virus Type １ RNA In Plasma Samples From High Risk Pe diatric Patients By Using The Self Sustained Sequence Replication Reatio n（自立持続的配列複製（３ＳＲ）反応の使用による危険性の高い小児患者の血 漿サンプルにおけるＨＩＶ−１ＲＮＡの検出）．J．Clin．Micro．1992;30:281- 286；Wu，D.Y．and Wallance，R.B．The Ligation Amplification Reaction（LA R）-AmPlification Of Specific DNA Sequences Using Sequential Rounds Of T emplate-Dependent Ligation（連結増幅反応（ＬＡＲ）−連続するラウンドの鋳 型特異性連結による特定のＤＮＡ配列の増幅）．Genomics 1989;4:560-569;Barr inger，K.J.，Orgel，L.，Wahl，G.，and Gingeras，T.R，Blunt-end And Singl e Strand Ligations By Escherichia coli Ligase：Influence On An In Vitro Amplification Scheme（大腸菌リガーゼによる平滑末端と一本鎖の連結：ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法に対する影響）．Gene 1990;89:117- 122）。ＬＣＲは、熱安定ＤＮＡリガーゼを使用して、標的ＤＮＡと相補的であ るオリゴプライマーの隣接する３’ヒドロキシおよび５’ホスホリル末端を共有 結合するものであり、Ｔａｑポリメラーゼは必要としない。ＬＣＲは、ＰＣＲの ように、一連のアニーリングおよび変性工程により標的ＤＮＡを増幅させる。各 ラウンドで得られたオリゴヌクレオチド産物は、続く各ラウンドの基質として作 用する。こうして、ＤＮＡの標的分子の数を１０5倍以上増加させることができ る。ＬＣＲの産物を検出するために、プライマーは、発蛍光剤を含むように改良 する。次いで、２４個のサンプルが４５分で処理できる自動蛍光アッセイ系を使 用する。 下記の文献は明細書中に引用されたものである： Detailed Description of the Invention    FIELD OF THE INVENTION Direct Lysis Buffer and Detection of HIV-1 Plasma Viremia   The present invention relates to methods of disrupting virions and isolating viral nucleic acids. In particular The present invention provides a direct lysis method for the isolation of nucleic acids, comprising detergent and protease K. Provide a (direct lysis) buffer.Background of the Invention   When the first case of acquired immunodeficiency (AIDS) was described in 1981, The causative agent of the disease was unknown. In 1983, Luc Montagnier ) Is a French research institute that has identified human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) as Then, the currently known causative virus was isolated. Around the same time, the US National Health Study Robert Gallo of NIH, together with his friends, is the causative agent of AIDS. It was reported that it was isolated. Diagnostic assay developed within 2 years and infected with HIV-1 It was used to identify who did. These are highly developed for both sensitivity and specificity The method for measuring the amount of antibodies to HIV-1 in serum or plasma is It was to detect nothing.   Epidemiological studies have shown that the HIV-1 virus is characteristic of homosexual and hemophiliacs. It is mostly detected in certain populations, and the main route of infection is sexual contact or infected blood. It was found to be due to the use of the formulation. Later, IV drug users may High risk of HIV infection due to fitting habits (ie blood cross-contamination) It turned out to be a group.   Correlation between HIV infection and contact with infected blood or use of infected blood products The relationship is a compulsory scan of blood banks to reduce and control the spread of viral infections. Prompted to start cleaning. All 20 million units of blood donation and blood products per year A system was established to carry out the tests. This daily test will help The number of HIV-1 related infections due to the use of blood products was significantly reduced. Currently The risk of HIV infection with blood is estimated to be about 1: 250,000.   The number of HIV transfusion-related infections decreased, but the number of AIDS-related infections worldwide Has continued to increase. HIV-1 Will in the United States and around the world in 1992 The estimated number of people infected with Susu is 1 million and 10 million, respectively. US only Then every year An estimated 40,000 new HIV-1 infections (Centers for Disease Control. HIV Prevalence Estimates And AIDS Case Projections For The United States: Report Based Upon A Workshop. MMWR 39: (no.RR-16) No vember 30,1990). Of these, 11.5% and 1. 7%. Most HIV infections in women are caused by IV drug use or HIV. Is the result of sexual contact with a partner. The majority of adolescent HIV-1 infections are mothers To the child from HIV-1 vertical transmission. HIV-1 worldwide The rate of vertical transmission of corn is reported to be between 10% and 40% (The Europe an Collaborative Study. Children Born To Women With HIV-1 Infection: Na tural History And Risk of Transmission. Lancet 1991, 337: 253-260 and Ryder, R.W., Nsa. W.N. Hassig, S.E., Behets, F., Rayfield, M.D. and Projec t SIDA, Perinatal Transmission Of The Human Immuno deficiency Virus Type  1 Infection To Infants 0f Seropositive Women In Zaire HIV-1 perinatal infection of children of seropositive women. Engl. J ． Med. 1989, 320: 1637-1642). New HIV-1 in the United States every year Of the estimated 40,000 infected, 1500-2000 are perinatal HIV- 1 has occurred in newborns as a result of infection.   The fact that the number of AIDS-related cases is increasing each year is partly due to the characteristics of the infection. It is due to. If you try to achieve the means to reduce its expansion, its progress How to measure the control of is important.HIV-1 gene structure and replication   HIV belongs to the retrovirus family. The retrovirus is as its genetic material Having RNA and catalyzing reverse transcription of RNA genome into DNA copy (cDNA) It is characterized by including a reverse transcriptase (RT) which is a unique enzyme.   Retroviruses have three subfamilies. HIV has the structural and genetic characteristics Based on the Lentivirus subfamily. The retrovirus genome is typically 9 3,000 to 10,000 base pairs, characteristic of all retroviruses 3 , Including structural genes (gag, pol and env). Also regulatory proteins The 3'ends of pol and env coding for include a unique sequence. That Two LTRs (long terminal repeats) at the 5'and 3'ends of the nom Have the same sequence. The 5'LTR is essential for the expression of proviral DNA by the host cell transcription machinery. It   The HIV-1 RNA genome represents a total of 9,749 nucleotides representing 9 genes. It consists of ochido (Haseltine, W.A., Wong-Stall, F. The Molecular Biology O f The AIDS Virus. Scientific American 1988, 259: 52-62). Its genome is 3 characteristic structural genes and 6 other regulatory genes (tat, rev, vif, vpr, nef and vpu). gag and pol proteins are full length Translated from the transcript, the env protein is transcribed from the spliced transcript. Be translated. When the gag gene is transcribed, it becomes full-length RNA, which is translated and translated into the precursor 3 proteins that make up the major structural proteins of the viral core Cleaved into capsid proteins. The pol protein is actually gag-pol It is part of the precursor. The pol part of the gene is related to RNA inside the virus core Encoding enzymes (proteases, reverse transcriptases and integrases). Reverse Transcriptase actually has three enzymatic functions. That is, RNA-dependent DNA Limericase, DNA-dependent DNA polymerase and ribonuclease activities It The envelope gene (env) is cleaved by a protease to produce an extracellular glycoprotein. Precursors to protein gp120 and transmembrane protein gp41 It encodes the protein gp160. gp120 protein is a viral cell Involved in binding to the surface CD4 receptor. gp41 protein is a syncytial It mediates the formation and assists the entry of the viral core inside the cell (Sodrowski, J ., Goh, W.C., Resen, S., Campbell, K., and Haseltine, W.A, Role Of The H TLV-III / LAV Envelope In Syncytium Formation And Cytopathicity Role of HTLV-III / LAV Envelope in Umogenesis and Cytotoxicity) ． Nature 1986; 322: 470-474 and McCune, J.M., Rabin, L.B., Feinburg, M. B., Lieberman, M., Kosek, J.C., Reyes, G.R., and Weissman, I, L. Endopro teolytic Cleavage Of gp160 Is Required For The Activation of Human Immun odeficiency Virus (human immunodeficiency virus activation is an Cleavage of gp160 by degradation is required). Cell 1988; 53: 55-67). 6 different Is a gene that produces viral proteins required for viral replication and assembly. (Haseltine, supra).   The structure of HIV-1 is similar to that of all retroviruses. 2 gag It contains a cylindrical core of protein. Inside the core, two identical single strands Contains RNA molecules. Involved in the RNA genome is the reverse transcriptase, the pro Theases and integrases. The core is an enzyme derived from the plasma membrane of the host cell. Surrounded by bellows. The surface of the membrane has a gp41 transmembrane Of a specific tank quality gp120 of HIV-1 that is non-covalently bound to Copies are scattered.   During the HIV infection cycle, the viral envelope protein is located on the host cell surface. It begins by binding to a CD4 + molecule. The CD4 + molecule is typically a T Present on lymphocytes and macrophages / monocytes. Viral and host cell The membrane fuses and the viral core enters the host cell. Once the core is inside the host cell Upon entry, the viral RNA genome is reverse transcribed into a cDNA copy. RNA genome Is then destroyed by the RT-related enzyme ribonuclease H and the cDNA copy Another template is used as a template to make another DNA copy by the polymerase. This two The double-stranded viral DNA translocates to the nucleus, where the viral protein It is integrated into the host cell DNA by the integrase. Embedded virus D NA is called provirus.   Production of new viral particles, release from their cells, and infection of new cells Completes the cycle of HIV infection. The production of new viral particles It is under the control of transcription factors of the host cell. Transcription of proviral DNA into RNA Initiated by sequences in the viral LTR (Tong-Starken, S.E., Luciw, P .A., And Peterlin, B.M. Human Immunodeficiency Virus Long Terminal Repea t Responds To T-cell Activation Signal (LTR of human immunodeficiency virus is T -In response to cell activation signals). Proc. Natl. Acad. Sci. 1987; 84: 6845- 6849). Some of the RNA molecules have other RNA molecules used as mRNA Used as genetic material while being translated into new viral proteins. e The nv protein is processed by the Golgi apparatus of the cell after translation and is transported to the host cell membrane. Be done. The proteins used in the viral core structure contain fatty acids, which are It binds to the inside of the alveolar membrane. When all the components of the new virus come together, they They combine to form a sphere structure that bulges out of the cell membrane. Two RNA molecules are Long Enter the virus particle. Finally, the enzymes involved in the core (RT, integrase and And protease) are processed post-translationally, and the core precursor protein becomes a protease. More disconnected. The viral core protein surrounds the viral RNA genome, A nearly complete virus traps itself in a portion of the host cell membrane, and eventually the virus Are sprouting from the cells and released.   Infection with HIV or other lentiviruses is persistent and usually at levels It is characterized by relatively low but continuous virus production. How productive virus replication is It is thought that the disease will increase and the disease will progress. From this, the researchers , Have been searching for biological markers involved in the progression of HIV-1 infection.HIV-1 progression prognosis and serological markers   Recently, much research interest is involved in disease progression in HIV-1 infected individuals Focused on identifying specific biological markers. Correlation with progression of HIV-1 infection Identification of the markers that do this is important in determining and understanding the cause of the disease. It In addition, identification of markers that correlate with disease progression has been linked to therapeutic drug development and monitoring. Help.   In early studies on the pathogenesis of HIV-1, the primary target cell of HIV-1 was CD4 It is a + T cell, and when the disease progresses, the total number of the cells decreases considerably. It was (Schittmann, S.M., Pallidopoulous, M.C., Lane, H, C., Thompson, L. , Baseler, M., Massari, F., Fox, C, H., Salzman, N, P., and Fauci, A.S. The Reservoir For HIV-1 In Human Peripheral Blood In A T cell That Maintain s Expression Of CD4 (The HIV-1 receptor in human peripheral blood maintains the expression of CD4. Have T cells). Science 1989; 245: 305-308 and Klatzmann, D., Cha. mpagne, E., Chamaret, S. T-lymphocyte T4 Molecule Behaves As The Recepto r For Human Retrovirus LAV (T-lymphocyte T4 molecule is a human retrovirus LAV Behaves as a receptor for AV). Nature 1986; 234: 1120-1123). In other studies Is thought to be involved in the progression of the disease, responds to activation of immune cells, or A study of possible serum markers reflecting increased production was performed. These markers As β2Microglobulin, neopterin and p24 antigen blood were mentioned (Melmed, R.N., Taylor, J.M., Detels, R., Bozorgmehri, M., and Fahey, J. L. Serum Neopterin Changes In HIV Infected Subjects: Indicator Of Significant Pathology, CD4 T-Cell Changes, And Th e Development Of AIDS (Serum neopterin is altered in HIV-infected individuals: Significant etiology, changes in CD4 T-cells and indicators of the onset of AIDS). J. Acquired Immune Deficiency Syndrome 1989; 2: 7076).   β2Microglobulin is part of the histocompatibility complex (HLA) and It is released from T cells during sexualization and cell turnover. Normal levels in healthy people Is less than 1.9 μg / μl (Hofmann, B., Wang, Y., Cumberland, W.G. , Detels, R., Bozorgmehri, M., and Fahey, J.L. Serum β2-microglobulin L evel Increases In HIV Infection: Relation To Seroconversion, CD4 T-cell Fall and Prognosis (serum β2Microglobulin levels are elevated in HIV infection Add: seroconversion, reduction of CD4 T-cells and association with prognosis). AIDS 1990; 4: 207-214). Neopterin is found in these cells by γ-interferon. Is a macrophage activation product when stimulated by To reflect. Normal levels in healthy people are below 6.62 nmol / l (Fuch s, D., Hausen, A., Reibnegger, G., Werner, E.R., Dierich, M.P., and Wachter, H.M. Neopterin As A Marker For Activated Cell- Mediated Immunlty: Application In HIV Infection (mediated by activated cells As a marker of immune response: Application in HIV infection). Immu no. Today 1988; 9: 150-154). An increase above the normal level of each marker is Represents activation of spheres and macrophages. When HIV-1 p24 is positive Is associated with poor prognosis, which represents increased viral activity and production (Allain, J.P., Laurian, Y., Paul, D.A., Verroust, F., Leuther , M., Gazengel, C., Senn D., Larrieu, M.J., and Bosser, C.I. Long-Term Eva luation Of HIV Antigen And Antibodies To p24 And gp41 In Patients With H Emophilia (antibodies to p24 and gp41 and HI in hemophilia patients Long-term evaluation of V antigen). N. Engl. J. Med. 1987; 317: 1114-1121).   Overall, the reduction of CD4 + lymphocytes, expressed as absolute values, was associated with HIV-1 It was found to be the best forecast value to show progress. Neopterin or β2micro This was followed by globulin levels, the last being the p24 antigen (Fahey, J.L. ， Taylor ， L.M., Detel, R., Hofmann, B., Melmed, R., Nishanian, P., and Giorgi, J.M. V. The Prognostic Value Of Cellular And Serological Markers In Infection  With Human Immunodeficiency Virus Type 1 (Cells in HIV-1 infection And prognosis of serological markers). N. Engl. J. Med. 1990; 322: 166-172).   Most recently, increased cellular and plasma viral loads have been clinically associated with HIV-1 infection. It was shown to be associated with the above expression and correlated with a decrease in the number of CD4 + cells (Venet , A., Lu, W., Beldjord, K., and Andrieu, J.M. Correlation Between CD4 Ce ll Count And Cellular and Plasma Viral Load In HIV-1 Seropositive Indiv iduals (CD4 cell counts and cells and plasma in HIV-1 seropositive individuals Correlation with virus load). AIDS 1991; 5: 283-288). Powder isolated from infected person Viruses using culture techniques that require top blood mononuclear cells (PBMC) or plasma The load was measured (Ho, DD, Moudgil, T., and Alam, M. Quantitation Of H uman Immunodeficiency Virus Type 1 In The Blood Of Infected Persons Determination of HIV-1 in the blood of dyers). N. Engl. J. Med. 1989; 321: 1621-162 Five; Coombs, R.W., Collier, A.C., Allain, J.P., Nikora, B., Leuther, M., Gjer set, G.F., and Corey, L. Plasam Viremia In Human Immunodeficiency Virus Infection (plasma viremia in HIV infection). N, Engl. J. Med. 1989; 3 21: 1626-1631). However, using this method, the work is quite difficult and It turns out that it will take quite a while to complete. Later, centrifugation of viral RNA Virus particles or RNA directly from plasma using direct or direct extraction methods Method was used. To measure viral load, copy viral RNA into cDNA Reverse transcription and amplification of the cDNA using the PCR method (Bagnar elli, P., Memzo, S., Manzin, A., Giacca, M., Emanuele, V., and Clementi , M. Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Genomic RNA In Pl asma Samples By Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Detection of HIV-1 genomic RNA in plasma samples by PCR). J. Med. Viro logy 1991; 34: 89-95). As a result, the measurement time is considerably reduced and the sensitivity is considerably increased. did.   Measurement of HIV-1 viral load in plasma is a measure of disease progression and therapeutic efficacy. Have a fairly close relationship in Tar. blood A direct measurement of serum viral load indicates the level of active viral replication. Disease progression Monitoring viral replication in combination with other markers for HIV- 1 It will be a more accurate indicator of the etiology of infectious diseases, and a better forecast value of the progress of the disease. it is conceivable that. To determine the best time to treat seropositive patients It can also serve as a means to help.Summary of the invention   Plasma HIV-1 viremia is monitored in a single reverse transcription and amplification step. Immunocapture performed in tubes-cDNA / PCR. Direct lysis buffer of the invention The solution is used directly in RT and PCR reactions without interfering with enzymatic reactions Plasma HIV-1 RNA was prepared to be isolated. Thus for the isolation of nucleic acids The normally required organic solvent extraction and ethanol precipitation were omitted. As a result, the measurement is completed The time required to complete the process is considerably shortened (about 16 hours), and the number of processing steps is reduced. It is considered that the possibility of pollution was reduced.   Specific models for the HIV-1 gp41 and gp120 envelope proteins. Virus containing latex microparticles (0.1 μm) coated with noclonal antibody Using the capture assay, Cell free virions were captured from serum / plasma. Standard parameters for the assay Requires the plasma sample to be incubated for 3 hours in the presence of microparticles. is there. In this experiment, the time of incubation reduces the sensitivity of the assay The incubation time to see if it can be shortened without Made into   The usual method for extracting and purifying HIV-1 RNA from viral proteins is It takes several hours, except for the step of ethanol precipitation that follows overnight. The method is also The tube has to be changed many times, which is relatively prone to contamination. Existence In order to eliminate the steps of organic solvent extraction and ethanol precipitation, the present invention binds particles. A series of buffers and conditions for the direct dissolution of HIV-1 virions. straight The main problem is the compatibility of the lysis buffer component with the reverse transcriptase and PCR enzyme. , Special attention was paid to buffer compositions that met this requirement. A single lysis buffer Detergent was included at various concentrations. Directly dissolve ionic and non-ionic detergents in buffer Considered as an ingredient. Also, combine low concentrations of proteinase K with various detergents. Then, the effectiveness of the addition was also investigated. Once the composition of the direct lysis buffer was determined When The time and temperature conditions required to break the viral membrane were measured.   Standard methods used to reverse transcribe HIV-1 RNA into cDNA copies. And its amplification by PCR requires two separate operations. The maximum sensitivity is Assay components used in the two procedures (ie buffers, salts, primers, d NTP and enzyme concentration). However, two operations It is believed that the work together would provide significant advantages in assay sensitivity and time. It was Whether reverse transcription and amplification operations can be combined into one operation A series of experiments were conducted to find out. Direct lysis buffer and RT and PCR Compatibility with essay ingredients was retained. Assay sensitivity is MgCl2And dNTP It was kept by optimizing the concentration as well as other components if necessary.   The contents of the text are as follows. I. background   Historical background   HIV-1 gene structure and replication   Prognosis and serological markers for HIV-1 progression II. Gist   Brief description of the drawings III. Detailed description   Plasma viral load in pregnant women infected with HIV-1   Viral load of HIV-1 infected blood donors II. Materials and methods   Reverse transcription control   Amplification control   Immune capture control   Contamination control between and within assays   Preparation of primers and probes   Preparation of particles   Labeling of SK19 probe   Virus capture   Reverse transcription   PCR   Liquid hybridization and autoradiography   Autoradiographic quantification III. result   Assay control analysis   Direct lysis buffer   Incubation time and temperature of direct lysis buffer   Virus catch time   Single addition RT / PCR   Detection of plasma HIV-1 RNA in seropositive pregnant women   Detection of plasma HIV-1 RNA in seropositive blood donors IV. Consideration V. References VI. The scope of the claimsBrief description of the drawings   Figure 1 shows assay controls, A) immunocapture control, B) reversal. Photograph control and B) amplification control. Autoradiography Was carried out for 3 hours at −80 ° C. (Neg, Rn and Dn were respectively captured, RNA and RNA. And represents a negative control for DNA. ).   FIG. 2 shows the effect of different detergent concentrations on detection sensitivity. each The detergent concentration was evaluated using RNA controls R-5 and R-6, respectively. It was. The standard RT / PCR method was used for evaluation. RNA control is standard Processed using extraction method. Autoradiography was performed at -80 ° C for 3 hours .   Figure 3 shows the effect of direct lysis buffer on immune control. Medium extraction, B) Direct lysis buffer containing 0.005% Triton X-100, C) 0 ． Direct lysis buffer containing 0045% Tween 20, D) 0.001% SDS The direct lysis buffer containing is shown. Proteinase K was included as indicated. Standard R The T / PCR method was used. Autoradiography was performed at -80 ° C for 3 hours.   FIG. 4 shows direct dissolution time and temperature optimization. Direct lysis buffer and standards Plasma control was assessed using the RT / PCR method. Auto radio Fees were carried out at −80 ° C. for 3 hours.   FIG. 5 shows optimization of virus capture time. Use the plasma control for the capture time. And measured using direct lysis buffer and standard RT / PCR methods. Autoradiography was performed at -80 ° C for 4 hours.   FIG. 6 is for the one-step RT / PCR method when the dNTP concentration is 50 mM. MgCl2The effect of concentration is shown. Control RT using standard RT / PCR method I made a essay. MgCl2The concentration range was 1.5-2.0 mM. Auto Radiography was performed at −80 ° C. for 3 hours.   FIG. 7 shows the one-step RT / PCR method when the dNTP concentration is 100 μM. MgCl2The effect of concentration is shown. Control using standard RT / PCR method The assay was performed. MgCl2The concentration range was 1.5-2.0 mM. Oh Tradiography was performed at -80 ° C for 3 hours.   FIG. 8 shows the one-step RT / PCR method when the dNTP concentration is 200 μM. MgCl2The effect of concentration is shown, A) reverse transcription, B) amplification, C) immunocapture. Control assays were performed using standard RT / PCR methods. Tested M gCl2The concentration was 1.75 mM. Autoradiography 3 at -80 ° C I went on time.   Figure 9 shows the effect of assay volume on the one-step RT / PCR method, A) 50 μl method, B) 100 μl method. Autoradiography at -80 ° C for 3 hours went.Detailed Description of the Invention   Determining the factors involved in disease transmission and progression is a major factor in HIV-1 research. It is of interest. Recently, several studies have considered that HIV-1 infection may be addressed. The focus was on confirming the factors that were identified. In this regard, HIV-1 viral load Correlation between infection and infection is considered to be important. As two types of HIV-1 infection, Infection from mother to child (vertical) and from blood donor to recipient (horizontal) . Vertical transmission of HIV-1 mother-to-child transmission is relatively low in the United States However, about 2% of new infections are caused by vertical transmission each year. Similarly, for blood transfusion The current number of associated HIV-1 infections is extremely low. But these two cases To determine if there is a correlation between HIV-1 viral load and HIV-1 infection. Evidence will increase our understanding of the causes of HIV-1.Plasma viral load in pregnant women infected with HIV-1   Retrospectively measured by reduction or persistence of HIV-1 antibody after 15 months in your infant Samples were collected from defined infectious and non-infectious pregnant women (Case Western Reserve Uni provided by versity and the University of Washington, Seattle). C of each sample Virus capture and RT / PCR were performed in duplicate on the encoded samples . It was evaluated by the recognized semi-quantitative value (3+, 2+, 1+, negative). Semi-quantitative plasma Another possible virological marker for the transmission of RNA viral load (p24 anti- Blood, CD4 + count and β2HIV- compared to microglobulin levels) 1. Clinical utility for predicting vertical infection was examined.Plasma viral load of blood donors infected with HIV-1   Obtain plasma samples of HIV-1 seropositive blood donors (Transfusion Safety Study Repository, San Francisco, CA), HIV-1 plasma viral load Was retrospectively measured. Sample selection is known to have infected the recipient Pool of 78 samples and 12 samples that did not infect recipients I went from A total of 22 samples were tested and donors infected with the recipient And the number of samples from donors that did not infect the recipients. Each sump Virus capture and RT / PCR were performed in duplicate on the cells. Recognized semi-definite It was evaluated by a quantitative value. Other potential for transmission of semi-quantitative plasma RNA viral load Virological markers (p24 antigen blood, number of CD4 + and β2Micro globules Level), The involvement of HIV-1 viral load in HIV-1 transfusion-related infection was examined.Materials and methods Control preparation   Reverse transcription control: A set of assays to monitor the efficiency of the reverse transcription procedure. RNA samples prepared from H9 cell line chronically infected with HIV-1 IIIB. Manufactured (Abbott Laboratories). Extract all cellular nucleic acids with guanidine thiocyanate. And purify the RNA by centrifugation through a cesium chloride (CsCl) cushion. (Chirgwin, J.M., Prsybla, G., MacDonald, P.J., and Rutter, W.J. Iso Relation Of Total Cellular RNA. Biochem. 1979; 18: 529 4-5299). Add RNA pellet to ddH2Dissolve to 0.5 μg / ml using O , DdH containing 20 μg / ml yeast tRNA2Dilute 10 times continuously with O (GIBC0-BRL, Gaithersburg, MD). 10FiveAnd 106Sample diluted twice ( R-FiveAnd R-6Say ) Gives consistently positive results after reverse transcription and amplification There were two lowest dilutions. Use these samples as controls It was   Amplification control: One copy of provirus HIV-1 per cell HIV-1LAV infected cell line 8E5 (Memorial Sloan Kettering Institute , New York) was used to prepare amplification controls. 106The whole geno of individual cells DNA (106It is called HIV-1 copy. ) To 10 mM Tris (pH 8. 3), 0.5 mg / ml proteinase K (Promega, Madison, WI) and 0 ． 56 ° C. in 500 μl of solution containing 25% SDS (Sigma, St. Louis, MO) It was extracted for 1 hour. The lysate was then mixed with an equal volume of phenol (pH 7.0), then After extraction with chloroform (adjusted to 0.3M NaOAc) at 16 ° C., 16 at −20 ° C. Time was precipitated with 2 volumes of absolute ethanol. DNA at 10,000 rpm After centrifugation for 10 minutes (Hill Scientific mv13), the supernatant was removed, and the pellet was ice-cooled. It was washed with 70% ethanol. DNA pellet was added to 0.5 ml of 10 mM Tris ( It was dissolved in 100 mM NaCl, pH 8.0). About 106HIV-1 Prowi 20 μg / ml salmon sperm DNA (Sigm a, St. DdH including Louis, MO)2Diluted with O serially 10-fold. 50 μl of 1 0-3And 10-FourDilution (100 and 10 respectively) Corresponding to one HIV-1 provirus copy. ) As an amplification control I used it.   Immune capture control: Virus capture operation gives reproducible results To demonstrate, a set of calibrated plasma controls was prepared. Chronic To obtain the supernatant of H9 cells (Abbott Laboratories) infected with HIV-1 IIIB. , Serially diluted 10-fold with seronegative plasma. Virus capture the dilution, then The lowest two positive dilutions (MK-FourAnd MK-Five Was used as a positive control.Inter- and intra-measurement contamination control   The most common cause of false positives in PCR procedures is the presence of previously amplified DNA. Contamination between samples also contributes to the problem, although it is a carryover. Sun A series of steps to minimize potential contamination during pull handling and PCR operations I put it in the mold.   A plastic, disposable, single-use beaker was used to prepare the reagents . All reagents were prepared in bottled distilled water (Abbott Laborat) without RNase. ory, Catalog #NDC 0074- 7139-09). Put all reagents in tubes for single use and use It was stored at −20 ° C. until   Sample handling, amplification and detection were performed in 3 separate laboratories. Sun Pull handling was done in a laminar flow hood. Always wear latex gloves and measure I replaced it many times. Each laboratory has an independent set of Pipetman A barrier pipette tip was used inside. Amplification made of acrylic biologically safe Went in the cabinet. Biologically safe cabinet with PCR lab Similarly, with a UV source, weekly to control possible RNA / DNA contamination, Ultraviolet sterilization (American Ultraviolet Company, Murry Hills, NJ) was performed. each Measurements included negative controls for immunocapture, reverse transcription and PCR. Three shades If any one of the sex controls gave a positive result, the measurement was invalidated. .Preparation of primer and probe oligonucleotides   Primers SK38 / SK39 (nucleotides 1551 to 1578 and And 1638 to 1665) and HIV-1 (HIVSF2, Genebank K 02007) Probe SK representing nucleotides 1597 to 1635 of the gag region 19, Applied Biosciences, Inc. 380 Synthesizer (Foster City, CA) Synthesized at Abbott Laboratories using Waters Photodioarray 990 (Milford, MA ) Was performed for HPLC purification.Preparation of particles   Carboxylated latex particles (0.1-0.3 μm diameter, Seradyn In c., Indianapolis, IN) with 1-ethyl-3,3- (dimethylaminopropyl) Carbodiimide Chemistry (EDC) (Sondergard-Anderson, J., Lauritzen, E., Li nd, K., and Holm, A. Covalently Linked Peptides For Enzyme-Linked Immuno sorbent Assay. J. Immuno Methods 1990; 131: 99-104). Monoclonal anti-gp120 and anti-gp41 IgG (Abbott Laborator ies). After binding, 17,000 xg of fine particles (Beckman J2- It was centrifuged at 21 M) for 30 minutes, and the supernatant was discarded. Use the same amount of microparticles as wash buffer (2% Twe After washing twice with PBS containing en20, coating buffer (150 mM Tris (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.5% pig skin gelatin, 0.1% Twe en20, 9.5% sucrose and 0.02% NaN3) Resuspended. After incubating in coating buffer at 45 ° C. for 16 hours, the microparticles were Pelletized and discarded supernatant. Store the microparticles in storage buffer (65.5 mM Tris, 8 4.5 mM Tris HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.4 M Resuspended with sucrose, 1% pig skin gelatin and 0.1% Tween20) To 50% of the original volume, and adjust the solids ratio to500A known solid mark It was determined by comparison with a quasi curve. The microparticles were predetermined by the storage buffer It was adjusted to a proportion of solids and stored at 2-8 ° C until use.Labeling of SK19 probe   SK19 oligonucleotide (5'-ATCCTGGGATTAAAATAAA ATAGAAGAATGTATAGCCCTAC) to the T4 polynucleotide Using Otidokinase32POFourLabeled with. The reaction was 5.0 mM Tri HCl (pH 8.0), 1.0 mM MgCl2, 5.0 mM NaCl, 1 ． 0 μg SK19, 50 μCi γ32PATP (Amersham, 3000 Ci / Mmol) and 10 U of T4 kinase (New England BioLabs, Beverly, MA) And the total volume was 10 μl. The reaction is carried out at 37 ° C. for 30 minutes, then Inactivation of T4 kinase was performed at 95 ° C for 5 minutes. Unlabeled labeled probe32 In order to separate it from PATP, the reaction mixture was treated with 200% for 1 hour at 10% poly. Acrylamide gel (29.25 ml H2O, 2.25 ml of 10 × TBE [S ondergard-Anderson, J, Lauritzen, E., Lind, K., and Holm, A. Covalently Linked Peptides For Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Covalently bound peptides for the method). J. Immuno. Methods 1990; 131: 99-104], 11.5 ml polyacrylamide: bis (19: 1), 30 μl 10% ammonium persulfate Chromium and 30 μl TEMED). 0.5 DNA μg / ml ethidium bromide / ddH2Stain with O for 5 minutes, and irradiate with long wavelength UV (LKB  Visualization using 2011 Macrovue). Cut off the band representing the labeled probe Remove 0.5 ml STE (100 mM NaCl, 10 mM Tris (p 1.5 ml Eppendorf Chu containing H8.0) and 1 mM EDTA) I put it in the bag. To elute the probe from the gel fraction, place the tube at room temperature at 16 h Spinning (Labquake Shaker, Berkley, CA). 3 μl of eluted probe Corresponds to about 6.0 ng, Was used to measure the labeling efficiency. The specific activity of the labeled SK19 probe is usually 1 × 107~ 2 x 107It was cpm / μg. Until the labeled probe is used And stored at -20 ° C.Virus capture   Immunocapture of HIV-1 virions was treated with phosphate buffered saline (150 μl; PBS, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 12 mM Na2HPOFour1. 76 mM KH2POFour), Anti-HIV-1 antibody-coated microparticles (50 μl) and And plasma (50 μl) in a 1.5 ml Eppendorf tube. mixture Place the object on a rocking table (20 rpm, Thermolyne VariMix) for 3 hours at room temperature. After incubating, centrifuge at 5000 rpm for 10 minutes, and save or discard the supernatant. I did it. Proteinase K / SDS solution (200 μl; 10 mM Tris (pH 7.4), 0.25% SDS) 0.5 mg / ml proteinase K and 10 genomic HIV-1 RNA is extracted by addition of pg / ml yeast tRNA), Further incubation (1 hour at 56 ° C). After extracting with the same amount of phenol , H by extracting with the same amount of chloroform (adjusted to 0.3M NaAOc) IV-1 RNA was purified and at -20 ° C It was precipitated with 2 volumes of absolute ethanol for 16 hours. 12,000 rp of RNA Pellet by centrifugation (Hill Scientific mv 13) for 10 minutes and discard the supernatant. I was Wash the RNA pellet with ice-cold 70% ethanol and centrifuge as before. And discard the supernatant and add RNA to 30 μl of ddH2Dissolved in O.Reverse transcription   Viral RNA derived from Avian Myeloblastosis Virus (AMV-RT, Gibco-BRL) Was reverse transcribed into cDNA using the reverse transcriptase enzyme. Isolated HIV-1 genomic RN Aliquot (15 μl) of A into a 0.5 ml centrifuge tube containing 5.0 μl of RT mixture. I prepared two things in the tube. The final RT reaction was 10 mM Tris ( pH 8.3), 2 mM MgCl 22, 50 mM KCl, 20 mM DTT, 0 ． 001% gelatin, 25 μM each dNTP (Pharmacia, Piscataway, NJ) And 25 ng of SK38 / SK39 primer (SK38 5'-ATAAT CCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT, SK39 5'-TTTG GTCCTTGTCTTATTGTCCAGAATGC). tube Was heated to 95 ° C for 5 minutes, centrifuged, and centrifuged to remove 8.0 U of RNasin (Promega, Madis on, WI) included Reverse transcriptase (2.0 U; Gibco-BRL) was added. RT reaction at 42 ° C for 30 minutes went. Then 30 μl water and 2 drops mineral oil (Sigma, St. Louis, MO) Add and inactivate reverse transcriptase by heating at 95 ° C. for 5 minutes.PCR   For amplification of HIV-1 DNA, add 50 μl PCR mix to each sample It was made to progress. The final PCR reaction was 10 mM Tris (pH 8.3). ), 1.5 mM MgCl 22, 50 mM KCl, 0.001% gelatin, each 50 μM dNTP, 50 ng SK38 / SK39 primer and 1.0 U Taq polymerase (Cetus, Normalk, CT). Known for each measurement A set of DNA controls representing a quantity of HIV-1 provirus was included, The measurement could be quantified in comparison with it. Amplification is performed by denaturing at 94 ° C for 1 minute. And Perk programmed for 35 cycles of 2 minutes annealing / extension at 56 ° C It was performed using an in-Elmer Cetus Model 480 Thermocycler.Detection of amplified fragments   Liquid hybridization and autoradiography:amplification 5 μl of the HIV-1 DNA prepared32PSK19 probe (2.5 μl probe Bu + 2.5 μl R3 buffer [50 mM Tris HCl (pH 8.0), 10 m MgCl of M2, 100 mM NaCl]) (1-2 x 1071 cpm / μg) Detected by hybridizing to 5 μl of amplified material. Amplified material And the probe are mixed and heated at 100 ° C. for 10 minutes (double-stranded amplified fragment (For separation), centrifuge the concentrate back to the bottom of the tube and store at 56 ° C for 30 min Kneeled. 5 μl of filled dye (0.25% bromophenyl blue, 4 0% sucrose) was added to each sample and the total amount was adjusted to 10% polyacrylamide gel. I put it on the le. Electrophoresis was performed at 150V for 30 minutes and then at 250V for 1.5 hours . Place the gel on Whatman blot paper, cover with plastic wrap, Autoradiation for 1 hour and 4 hours at -80 ℃ using intensifying screen (DuPont Cronex) I went to ography. Autoradiograph development is done with the Kodak M35A X-OMAT Pro This was done using a sessor.   Autoradiographic quantification: Sample results for plasma and known DNA copy number Results were quantified by direct comparison with controls. Some places The densitometer Results were quantified using exact comparisons of readings.result Assay control analysis   The efficiency of immunocapture, reverse transcription and amplification operations was monitored using specific controls. I started Immune capture controls were derived from the HIV-1 IIIB infected H9 cell line. Serially dilute the tissue culture supernatant to consist of two positive dilutions diluted as much as possible. It was Reverse transcription controls were extracted from HIV-1 IIIB infected H9 cell line and purified. Two most diluted positive dilutions obtained by serially diluting prepared RNA Consists of. Amplification controls are H containing one HIV-1 copy per cell. It consists of purified DNA obtained from the IV-1 LAV infected 8E5 cell line.   The specific amplification products obtained by the three types of controls are shown in FIG. Usually each Detection of paired controls was consistent between assays, demonstrating assay sensitivity . In addition, negative controls for immunocapture, reverse transcription, and amplification procedures are included in each assay. Including, proved the specificity.Assay parameter optimization   In a virus capture assay, HIV-1 gp41 and covalently linked to a monoclonal antibody specific for the gp120 envelope protein Latex particulates (0. 1 μm) is used. The initial protocol for immunocapture was a 3-hour incubator. Solution, proteinase K / SDS digestion, phenol-chloroform extraction, Ethanol precipitation, reverse transcription and amplification by PCR to purify virus RNA Was included. 5-7 hours total to complete this part of the assay Met. In addition, liquid hybridization, gel electrophoresis, and Migration and autoradiography were required.   Many of the steps in this protocol were empirically determined, so To simplify, reduce the time required and the potential for contamination, Some or all improvements were required.   Direct lysis bufferBy phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation Purification of viral RNA is difficult and time-consuming. But, This purification overcomes the inhibitory effect of SDS in PCR and interferes with the assay Convenient to remove excess proteinase K that may Good (Erlich, H.A, PCR Technology. Principles and Applications for DNA  Amplification, Stockton Press, 1989.new York. pp.17-22). Use of organic solvent A series of direct lysis buffers were examined to eliminate the need for bleeding and ethanol precipitation . Its purpose is to provide reverse transcription with results comparable to standard digestion / extraction procedures. And to make a buffer compatible with the amplification procedure.   The most commonly used reagents for disrupting cell and viral membranes are ionic wash Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) and Nonionic Detergent Triton X-1 00 and Tween 20. Proteinase K may be associated with nucleic acids There were used with these detergents to digest proteins. Trito The concentrations of nX-100 and Tween 20 ranged from 0.1-0.5%. this If the two reagents are used at a concentration of 0.5% or less, the Taq polymer will be used during the amplification operation. Does not interfere with Rhase. On the other hand, SDS is present at concentrations of 0.1% and 0.01% PCR is inhibited by 99% and 90%, respectively. SDS is 0.001% It does not inhibit Taq polymerase when used at the following concentrations (Erlich, H.A., supra) Out).   The components used for standard lysis of viral membranes are 0.25% SDS and 50 It contained 0 μg / ml proteinase K. However, as mentioned above, The concentration that dissolves the viral membrane in the unfolding buffer and is compatible with reverse transcription / amplification is It seems that it needs to be lowered considerably. In this regard, low concentrations of Triton  Lysis buffer containing X-100, Tween 20 or SDS was evaluated. Furthermore, low A concentration of proteinase K was added to the lysis buffer containing a low concentration of detergent. in this case Heat the lysis buffer at 95 ° C for 10 minutes before starting the RT, PCR procedure. Rotainase K was inactivated. To provide a buffer system, 10 mM Tris (p H7.0) was selected and included in all lysis buffers examined.   The compositions of the various direct lysis buffers studied are shown in Table 1. RNA and DN first Ink at 56 ° C. for 1 hour using standard assay with A control The lysis buffer was evaluated at the incubation temperature and time.   Buffers containing 10 mM Tris and various concentrations of Triton X-100 were used as standard. A signal similar to that obtained by the quasi method was produced. Similarly, various Buffer containing Tween 20 at a concentration similar to the signal obtained by standard methods Cigna Has occurred. Three types of lysing buffer containing 10 mM Tris and various concentrations of SDS Only the one containing 0.001% SDS among the buffers gave the same results as the conventional method. became. Lysis buffer containing 0.1% and 0.01% SDS gave a signal There wasn't. From this, SDS has an inhibitory effect on Taq polymerase. It was confirmed. Similarly, SDS and 1 μg / ml proteinase K were included. The lysis buffer also decreases in sensitivity when the SDS concentration is increased to 0.001% or more. Was shown. Only lysis buffer containing 0.001% SDS was the standard method. Comparable results were shown (Fig. 2).   The efficiency and efficiency of various lysis buffers in destroying HIV-1 virions in the presence of immune particles. And the effect of buffer on the RT / PCR reaction, using an immunocapture control Measured. The analysis should be carried out in order to minimize possible adverse effects on the enzymatic reaction. The concentration was limited to the minimum.   As shown in FIG. 3, one of the three detergents and 1 μg / ml of proteinase Direct lysis buffer with K gave the same signal as the control. Direct dissolution When proteinase K was removed from the buffer, the signal was significantly reduced.   HIV-1 virions can be effectively dissolved using any of the three detergents. It is considered that there was no effect on the enzyme reaction in either case. As an example, 10 mM Tris (pH 7.0), 0.001% SDS and 1.0 μg / ml Assays were performed using lysis buffer containing proteinase K.   In summary, 10 mM Tris (pH 7.0), 0.001% SDS and Direct lysis using a buffer containing 1 μg / ml proteinase K resulted in 0 ． Standard enzyme containing 25% SDS and 500 μg / ml proteinase K Results comparable to the lysis buffer were obtained (FIGS. 3 and 5D). Unlike traditional digestion buffers , The total concentration of SDS and proteinase K was logarithmically reduced 2-fold in this composition (Two log decrease), and yeast tRNA was removed.   Incubation time and temperature of direct lysis buffer: Destruction of virus membrane and And the minimum time and temperature required for release of genomic RNA from nuclear proteins The measurement was performed using a contact lysis buffer. 56 ° C., which is a standard method parameter, and One hour was used as a control. Two conditions were tested. That is, 5 30 minutes incubation at 6 ° C and 37 ° C 30 minutes incubation. Assay sensitivity using direct lysis buffer The combined effect of time and temperature on the is shown in FIG. Direct dissolution at 37 ° C for 30 minutes The sensitivity of RNA detection performed using the buffer was the same as for the standard method. Subtle differences in band intensities are common, and do not improve the enzymatic reaction. Represents the variability between sei. That is, select these parameters and Used in all assays.   Virus catch time: Plasma-associated virion with microparticles coated with anti-HIV-1 antibody The minimum time required for immunocapture of the protein was measured. 3 hours to 2 hours and 1 at room temperature The effect of shortening the time was evaluated. The effect obtained after capturing for 1 hour is , The effect obtained by the standard method was the same (Fig. 5). So all that follows The assay was carried out with an immunocapture of 1 hour.   Single addition of RT / PCR buffer: 15 μl sample for standard reverse transcription process Was added to 5 μl of RT buffer. After heat denaturation, 1 μl of reverse transcriptase / RNa Sin was added and reverse transcription was performed at 42 ° C. for 30 minutes. Then 30 μl of ddH2 O and 2 drops of mineral oil were added and the mixture was heated at 95 ° C for 5 minutes. For amplification Add Taq mixture containing all components and start amplification did. These multiple additions to each assay tube, up to a total of 6 times, It complicates the whole operation and increases the risk of contamination caused by bringing in from the next tube. I was there. Recently, RT / PCR of genomic HCV RNA was performed once with buffer and enzyme. A method was described in which a single tube was added by adding (Lin, H.J., Naiyi, S., Mizokami, M., and Hollinger, F.B. Polymerase Chain Reaction Assay for He patitis C Virus RNA Using A Single Tube For Reverse Transcription And Se rial Rounds Of Amplification With Nested Primer Pairs Consecutive rounds of amplification with a pair of Ted primers in a single tube Hepatitis C virus PCR assay). J. of Med. Virology 1992; 38: 220-225 ). This type of method can be used for reverse transcription and amplification of HIV-1 viral RNA To see if it tested several RT / PCR methods with single addition It was Select the final volume of the RT / PCR method with HIV-1 alone to 100 μl. I chose. This is the volume used in the standard method. 15 μl of sample in assay Since the pull was used, add 85 μl containing all components needed for RT and PCR operations. Had to be added.   The same general assay format was used in the one-step RT / PCR method. After direct dissolution Add 15 μl of sample to a 0.5 ml centrifuge tube and heat to 95 ° C for 5 minutes. The proteinase K was then denatured in its lysis buffer and centrifuged to give 85 μl The amplification mixture was added, followed by 2 drops of mineral oil. Reverse transcription is performed at 42 ° C for 45 minutes, Then, denaturation of reverse transcriptase was performed at 95 ° C. for 3 minutes. Amplification with standard parameters Started using directly. Assay each sample in duplicate, RT and PCR Both operations were performed using a thermal cycler.   To achieve sensitivities comparable to standard methods, the component concentrations of the single spike assay were Had to optimize. Tris, KCl, gelatin and DTT concentrations are , The standard RT and PCR methods are identical, and their concentrations are Selected. Therefore, they did not change. It affects the sensitivity of reverse transcription and amplification operations. The two most decisive parameters affecting the sound are MgCl2And dNTP concentration Yong, W.H., Wyman, S., and Levy, J, A. Optimal Condition For Synthe sizing Complementary DNA In The HIV-1 Endogenous Reverse Transcriptase r eaction (HIV-1 endogenous reverse transcriptase reaction Optimal conditions for synthesizing complementary DNA in. AIDS 1990; 4: 199-206). Optimal MgCl for standard RT and PCR steps2The concentration is 2.5 mM each. And 1.5 mM. Optimal dNTP concentration for standard RT and PCR steps Are 25 μM and 50 μM, respectively. Both RT and PCR steps are Since the drug was to be added alone, the concentration of these two components would be optimal again. Had to turn into.   MgCl used to determine optimal sensitivity2The concentrations are 1.5, 1.75 and And 2.0 mM. DNTP concentrations tested were 50, 100 and 200 μM.   MgCl at a dNTP concentration of 50 μM2When the concentration is changed, all the signal strength is increased. The degree was significantly reduced in the controls tested (Figure 6). Furthermore, MgC l2The signal intensity decreased with increasing concentration. 2.0 mM MgCl2Then R The T and amplification controls gave weak but detectable signals. On the other hand Thus, the immunocapture control gave no detectable signal. Follow Thus, a 50 μM dNTP concentration is too low for optimal detection in one-step RT / PCR Was thought to be.   Raise the dNTP concentration to 100 μM to obtain the same concentration of MgCl 2.2 It was evaluated by. As shown in FIG.2If the concentration is increased, RT and increase The width control signal was slightly reduced. However, amplification similar to the previous experiment The control signal did not appear to be significantly reduced.   MgCl2When the concentration was increased and the dNTP concentration was 100 μM, the RT and And the decrease in amplification control signal is somewhat rate limiting in dNTP concentration Indicates the possibility. MgCl2To the lowest optimal concentration (1.75 mM), Experiments were performed with increasing dNTP concentrations (200 μM) and these concentrations were comparable to the standard method. It was confirmed to generate an enemy signal.   As shown in FIG. 8, one-step RT / PCR method (1.75 mM MgCl 22and 200 μM dNTPs) produced a control signal similar to the standard method. It was To make sure that the dNTP concentration is not rate limiting, the final concentration is 200 μM, MgCl2The concentration was set to 1.75 mM. 100 μl final volume After optimizing the one-step RT / PCR method in , Aimed at reducing the final volume to 50 μl. The 50 μl method is Excellent results were obtained when both the DNA and DNA controls were tested (Figure 9). However, no signal was obtained in the plasma control test. Three A set of plasma controls was actually evaluated. 6 MK-FourOf the reactions, three are the best Weak signal and the remaining 3 were negative. MK-FiveControl yes The shift did not produce a signal either. Therefore, a final volume of 100 μl was used for one step RT / Selected for the PCR method.   In summary, the final amplification mix for the one-step RT / PCR method was 100 μl In a final volume of 10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 5 mM DTT, 0.001% gelatin, 1.75 mM MgCl2, 200ng Limer, 200 μM of each dNTP, 10 U of RNasin, 2.5 U of AMV   It contained RT and 1 U of Taq polymerase. With this amplification mixture, Results comparable to the standard method were obtained. There is no effect on sensitivity, the mixture is actually , Appears to give a slightly stronger control signal than the standard method. Most The final assay was established as follows. a) Virus capture for 1 hour at room temperature; b) Centrifuge at 5000 rpm for 10 minutes, discard the supernatant, wash with 150 μl PBS , Centrifuge as above, and discard the supernatant; c) Add 30 μl of direct lysis buffer, briefly stir and at 37 ° C. for 30 minutes incubation; d) Place two 15 μl aliquots in separate 0.5 ml centrifuge tubes, And heating at 95 ° C for 5 minutes; e) Addition of 85 μl amplification buffer, 2 drops of oil, reverse transcription for 45 minutes at 42 ° C., thermal change Sex, and amplificationDetection of plasma HIV-1 RNA in seropositive pregnant women   What factors affect the vertical transmission of HIV-1 from an infected mother to her child? Although not positive, preliminary evidence suggests that viral load may play a significant role Suggest that there is. High HIV-1 plasma viral load in mothers To determine if there is a correlation with the increased likelihood of direct infection, perform the experiments below. I tried. 49 selected from studies initiated in the US and Uganda (Africa) Encoded plasma samples were obtained at the delivery of seropositive pregnant women. plasma The sample is a mother who knows if her child had an HIV-1 infection. Selected from. Overall, 21 mothers had HIV-1 infections in their children, There were 28 uninfected mothers. In the US population, there are four infected groups and non-infected groups. Was 16 people. Uganda The population of 17 was HIV-1 infected and 12 uninfected. further, Serological data available for US and Uganda mothers include CD4 counts and And β2It was at the level of microglobulin. At delivery, all mothers are clinically , Asymptomatic.   Between HIV-1 RNA detection in maternal plasma and vertical HIV infection It wasn't very relevant. Overall, in mother samples of 22 infected groups tested 4 were found to be HIV-1 RNA positive, while 27 of the uninfected set Of the mother samples, 11 were HIV-1 RNA positive (Table 2).   In the US group (Table 3A), HIV-1 RNA-positive infected groups and nonsensitivity The percentage of mothers in Someumi was the same (40 and 38%, respectively). As expected In addition, HIV-1 RNA positivity was correlated with low CD4 + numbers. Inspection Median CD4 + in women with accessible HIV-1 RNA is 257 / mm3 (Area between four parts: 161-418 / mm3) And detectable HIV-1 Median CD4 + in women without RNA is 966 / mm3(Area between four parts: 59 1-1113 / mm3)Met. However, four women had a CD4 + of 500 / mm3Had less, detectable HIV-1 RNA, but had own child Was not infected with the virus. Furthermore, one woman has a CD4 + count of 1113 / mm3And had no detectable plasma HIV-1 RNA, but was There was a viral infection between the two pregnancies.   In the case of Uganda mothers (Table 3B), 12% of mothers in the infected group had detectable HI. It had V-1 RNA (42% in the uninfected set). β2Microglobulin Bell did not differ much between the two groups (each in the infected and uninfected groups). Respectively 1.66 and 1.60 μg / μl. ). Detection of HIV-1 RNA in seropositive blood donors   The HIV-1 viral load in blood donor plasma is related to HIV-1 transfusion. It is thought to play an important role in successive infections. To find out this, Tr Plasma samples obtained from the ansfusion Salety Study Repository (San Francisco, CA) HIV-1 viral load was measured. 78 infected samples and 12 Twenty-two samples were selected from the pool of uninfected samples. 22 selected cells Of the ropositive samples, 11 had transfusion-related infections and 11 had It was uninfected (Table 4). The number of CD4 + lymphocytes was measured in the first sample The mean number of CD4 + lymphocytes about 1 year after the collection was 470 and 746 / μl for the dye set donors, respectively.   Overall, 7 out of 22 plasma samples are HIV-1 RNA positive I understand. Of the 11 infectious blood donations, 7 were HIV-1 RNA positive However, none of the 11 non-infectious blood donations were HIV-1 RNA positive It was Therefore, there is a strong relationship between infectivity and the presence or absence of HIV-1 RNA in donor samples. There was a good correlation.Consideration   Detection of HIV-1 infection is a major factor in controlling viral spread. Currently H Antibody EIA and Western blot tests were used to confirm IV-1 infection. Have been used. Recent progress in HIV infection and response to treatment of HIV infected individuals Are interested in the monitor. To monitor the progression of HIV-1 disease , Many methods have been developed, mainly based on the detection of p24 antigen, culture and amplification of nucleic acids. ing.   By quantitatively culturing cells and plasma, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and HIV-1 infection titer can be measured from blood plasma. Infected PBMC , Depending on the individual clinical stage, from 1: 50,000 asymptomatic to AIDS patients. Research shows that it is in the range of 1: 400 (infected: normal) (Ho, C.D., Moudhil, T., and Alam, M. Quantitation Of Human Immunode ficiency Virus Type 1 In The Blood of Infected Persons Of HIV-1). N. Engl, J, Med. 1989; 321: 1621-1625). Similarly, blood Detection of cell-free virus in serum has also been shown to represent a clinical stage of infection (Coombs, R.W., Collier, A.C., Allain, J.P., Nikora, B., Leuther, M., Gj erset, G. F., and Corey, L. Plasma Viremla In Human Immunodeficiency Vir us Infection (plasma viremia in HIV infection). N. Engl. J. Med. 198 9; 321: 1626-1631). However, both methods require special equipment and Expensive and time consuming. In addition, cell culture can be used to activate isolated cells in vitro. Is required but this may not represent the actual in vivo situation . Also, the sensitivity of plasma cultures is not sufficient to detect most known infections, Reproducibility depends on the stimulated donor cells used in the assay (Eschaich, S., Rilter, J ,, Rougler, P., Lepot, D., Lamelin, J.P., Sepetjan, M., and Tre po, C. Plasma Viremia As A Marker Of Viral Replication In HIV Infected I ndividuals (of viral replication in HIV infected Plasma viremia as a marker). AIDS 1991; 5: 1189-1194).   HIV-1 DNA or virus-associated HIV-present in infected PBMC 1 PCR has been used to detect RNA. Plow isolated from PBMC Quantitative detection of virus HIV-1 DNA is very sensitive. But measured It is unknown whether all of the HIV-1 DNA corresponds to transcriptionally active DNA. Not not. Increased plasma HIV-1 RNA viral load is a good predictor of disease progression Studies have shown that it is a reported value. That is, virus-related HIV-1   The measurement of RNA by PCR is extremely sensitive and should be useful. Only Virus isolation from plasma by centrifugation or guanidine isothiocyanate extraction (Aoki-Sei, S., Yarchoan, R., Kageyama, S., Hoekze) ma, D.T., Pluda, J.M., Wyvill, K.M., Broder, S., and Milsuya, H.M. Plasma HIV-1 Viremia In HIV-1 Infected Individuals Assessed By Polymerase Cha in Reaction (plasma of HIV-1 infected persons evaluated by PCR HIV-1 virus Rhusemia). AIDS Res. and Human Retro. 1992; 8: 1263-1270; Scadden, D.T., Wang, Z., and Groopman, J.E. Quantitation Of Plasma Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA By Competitve Polymerase Chain Reaction (plasma HI by competitive PCR Quantification of V-1 RNA). J, Inlect. Diseases 1992; 165: 1119-1123; Holodniy, M ., Katzenstein, D. A., Sengupta S., Wang, A. M., Casipit, C., Schwartz, D. H., Konrad, M., Groves, E., and Merigan, T.C. Detection And Quantific ation Of Human Immunodellciency Virus RNA In Patient Serum By Use Of The  Polymerase Chain Reaction (HIV RNA of patient's serum by using PCR Detection and quantification). J. Infect. Diseases 1992; 163: 862 866). Same as culture technology As such, these methods are labor intensive and require considerable time and expertise to complete. is necessary.   The present invention provides plasma-related HI for direct measurement of HIV-1 replication (viremia). Useful for assays that use immunocapture of V-1 virions. This type of assay Plasma-associated HIV-1 without the need for culturing techniques or complicated chemical extraction procedures. It is a sensitive and specific method for measuring viruses. Direct lysis buffer Used directly for a simplified reverse transcription and amplification method for HIV-1 genomic RNA. I made it so that To these changes Significantly reduces the time required to monitor HIV-1 viral load It was   0.1-0.3μ due to the increase in overall surface area available per unit volume Particle size was selected. Theoretically, this would increase the amount of antibody bound to the particles. It should be maximized, resulting in increased sensitivity of immune capture.   Monomers with higher affinities than polyclonal antibodies to maximize sensitivity Capture of HIV-1 virions was performed using a clonal antibody. gp120 and And gp41 protein are components of the outer membrane of the virus, and all infectious HI Present in V-1 virus particles. Ie, anti-gp120 and anti-gp41 specific Monoclonal antibodies were selected for immunocapture.   The method of binding the antibody to the particles affects both the sensitivity and specificity of the assay. It is thought to affect. The antibody used to attach the antibody to the solid matrix. There are three routine methods. The first method is probably the easiest , Passive adsorption and the second method is covalent bonding. The specific binding of an antibody is It depends on the chemical composition of the particles. Passive adsorption is ionic and hydrophobic between particles and antibodies It is achieved by social interaction. Both Coupling is based on the formation of covalent bonds between the particles and the antibody. Monoku Carboxylated particles were used for covalent attachment of the lonal antibody. With the help of EDC Thus, a covalent bond is formed between the carboxyl group of the particle and the amino group of the antibody. Both Both methods have been found to be quite sensitive. All of the antibody bound to the particles Is not necessarily covalent, but this method is very stable and therefore The antibody covalent method was used.   A series of optimization steps were explored to considerably simplify the assay. This These optimizations require direct lysis buffer development, shorter immunocapture time, and direct lysis. The reverse transcription and Implementation of amplification was included.   The original method for isolating genomic RNA used conventional molecular biology techniques. It was complicated and time consuming. Higher concentration of SDS after immunocapture Was used to destroy the viral membrane. Digestion of proteins associated with viral RNA For this, proteinase K was used. HIV-1 RNA is purified by A combination of media extraction followed by overnight ethanol precipitation was performed.   Direct lysis buffer extracts genomic HIV-1 RNA from intact virions, It allows the direct use of genomic HIV-1 RNA for reverse transcription and amplification operations. Was prepared. This ensures that the organic solvent extraction and extraction required for normal operation is Both operations of tanol precipitation were eliminated. Do not use organic solvent extraction procedure Reduced assay time by at least 16 hours.   To determine the amount of reagents needed for direct lysis, use equal amounts of cellular and viral material. The appropriate concentration of detergent and / or proteinase K needed to destroy water did. Typically 106For the destruction of individual human cells, 0.25% SDS and 1 ml of solution containing 0.5 mg / ml proteinase K is required (19). Previous studies have shown that the theoretical binding capacity of immunoparticles is approximately 10,000 virions. Measured (Henrard, D, R., Mehaffey, W.F., and Allain, J.P. A Sensitive Viral Capture Assay For The Detection Of Plasma Viremaia In HIV Infected  High sensitivity for detection of plasma viremia in individuals infected with HIV Virus capture assay). AIDS Res. Human Retro. 1992; 8: 45-51). Sanawa Then 106Lyse individual cells The concentration of SDS and proteinase K required to resolve was 10,000 It should be at least 100 times greater than the concentration needed to dissolve the lion. Moreover, the volume of cells is approximately 1000 times larger than that of viruses (ie, cells and The average diameters of the viruses are 3μ and 0.1μ, respectively. ). Therefore, the equivalent To dissolve viral substances, combine detergent and proteinase K in amounts of 10FiveDouble The reduced amount should be sufficient. However, added to immunocaptured virions The volume of direct lysis buffer used was 30 μl, which is comparable to the volume required for cell lysis. By comparison, the total amount of detergent and proteinase K is 33 times smaller. It This means that the detergent and / or necessary to destroy 10,000 virions Or suggesting a 3000-fold decrease in proteinase K concentration (10Five÷ 33), This is approximately 0.0001% and 0.167 μg / ml of SDS and probing, respectively. Corresponds to the concentration of Rotainase K. These concentrations are comparable to organic extraction methods Is 10 times smaller than the actual test concentration given. That is, of the HIV-1 virion The concentrations of SDS and proteinase K used for disruption were based on these calculations. Was at least 10 times greater than the required concentration.   For both reverse transcription and amplification, the lysis buffer was Triton X-100, Tween 20 or low concentration. It was not inhibited when SDS was included. 0.5% Triton X-100 or No inhibitory effect was seen with the lysis buffer containing 0.45% Tween20. Entertainment Interestingly, SDS blocks reverse transcription at concentrations greater than 0.007%. Thought to do harm. If the detergent concentration of the examined direct lysis buffer is 0.01% In that case, its final concentration in the reverse transcription reaction was 0.007%. This concentration is PCR It was further reduced to 0.00147% during the reaction. As mentioned above, SDS PCR was not inhibited at a concentration of 0.001% or less. 0.00147% SD We did not determine if S inhibited the reaction, but this increase was surprising for the PCR reaction. It cannot be thought to have a positive effect. Instead, the lack of positive results reversed It suggests that the copying was blocked. This is because low concentrations of SDS It was not expected because there was no report that it had an inhibitory effect. Of this concentration SDS somehow forms a complex with RT, which allows May inhibit sufficient production. Alternatively, SDS is probably the reverse transcription By indirectly affecting the structure of the active site of the enzyme Therefore, it may inhibit the reverse transcriptase itself. Inhibition of any part of RT reaction PCR product cannot be obtained without cDNA template, so HIV-1 cDNA Will have a major impact on the final amplification of   The addition of proteinase K to the direct lysis buffer had an adverse effect on any of the enzymatic reactions. Did not affect. In fact, 1 μg / ml in buffer containing each detergent tested The same result as in the organic extraction method was obtained by adding.   Decreasing the immunocapture time and temperature required for direct lysis still affects assay sensitivity. There was no adverse effect. Because the capture time could be shortened from 3 hours to 1 hour, , The monoclonal antibodies used were gp120 and gp4 associated with virions. It is preferred to have a very high affinity for 1. Destruction of HIV virions and Incubation at low temperature for a short time is sufficient for the isolation of HIV-1 and HIV-1 RNA. there were. It dissolves very quickly and completes HIV RNA from intact virions. Detergent and proteinase K concentrations selected are sufficient to dissociate into Is shown.   Combine the reverse transcription and amplification operations into one assay, There was no adverse effect on assay sensitivity. Other targets (ie HCV) As in the case of performing RT and PCR reactions by adding reagents alone, It was achieved by optimizing some of the component concentrations in B. But surprise Best of all, 50 μl of the one-step RT / PCR method is used when assaying samples. Did not work. 50μ for RNA and DNA control measurements An equivalent measurement signal was obtained by the method of l. Final SDS and glycerol All component concentrations except the concentration remained the same in both methods. SDS concentration The degree was doubled when the final assay volume was 50 μl (0.00015% From 0.0003%). However, Taq polymerase enzyme was inhibited at this concentration. There have been no reports of receiving it. In addition, it results from the addition of stock enzymes Glycerol concentration is twice as much for the 50 μl method as for the 100 μl method This is an increase (2.2% vs. 0.97%). According to the manufacturer, glycerol concentration Within this range, the effect of inhibition on the enzyme is negligible. But Asse B. A decrease in volume resulted in a higher concentration of particles associated with immune capture. Enzyme reaction Thought to have been hindered or blocked by particles, It   The two most important advantages of optimizing the immunocapture method are probably related. The total number of steps and the time required to complete the assay were shortened. Up These changes in the security method pose a risk of contamination due to sample introduction. It is thought to be less. Table 5 details the difference between the conventional method and the operation of the present invention. Enter. Use of direct lysis buffer, elimination of organic solvent extraction procedure and one-step RT / With all of the PCR methods, the number of times each assay tube must be opened Decreased. For example, each tube had to be opened after the immunocapture step The actual number of times changed from 10 times in the standard method to 3 times in the improved method. In addition, The number of times to remove or add the reagent from the tube is 15 times in the standard method. It became 4 times by the improved method. Standard Assays and Modifications (One Step RT / PCR) The main difference in the actual experimental time required for the completion of the RNA was the overnight RNA precipitation step. Removing this step from the improved method resulted in a reduction of at least 15 hours. Overall In addition, the improved method has an immunocapture time of 2 hours, lysis of HIV-1 genomic RNA, and simple isolation. The release time was reduced to 15 hours and the time to make the reverse transcription and PCR mixture was further reduced by 1 hour. It was Using the standard method, it took at least 2 days to get the sample results, It took only 9 hours to achieve the same results using the modified method.   Controlling the occurrence of false-positive reactions is aided by complete adherence to contamination control procedures. Became. This uses sample preparation, PCR and PCR using 3 separate laboratories. And detection. Each laboratory had a separate set of devices. In order to reduce contamination by amplification products and to remove as much as possible, barrier pipette The usual use of top-up and UV stabilization was also made. To control pollution I made some measurements, but a false positive reaction occurred at a rate of 1 in about 500 tests. It was In order to maintain the high specificity of the PCR assay, this is a Indicates that sticking to the rules operation is important.   HIV-1 plasma was then analyzed using simplified immunocapture-cDNA / PCR. Determine if there is an association between viral load and vertical or horizontal HIV-1 infection Decided Women included in the HIV-1 vertical transmission experiment were relatively healthy and had symptoms of illness. Did not show. Their average CD4 + value is high (178-1113mm3), β2Microglobulin levels are within normal values (mean 1.64 μg / ml) This suggested that the women included in the experiment were relatively healthy. HIV-1   RNA positive Gender (plasma viremia) was correlated with low CD4 + levels. this thing First showed that there was a correlation between CD4 + levels and increased plasma viremia (Saag, M.S., Crain, M.J., Decker, WD, Camplell-Hi) ll, S., Robinson, S., Brown, W. E., Leuther, M., Whitley, R. J., Hahn, B ． H., and Shaw. G.M. High-Level Viremia In Adulls And Children Infected With Human Immunodeficiency Virus: Relation To Disease Stage And CD4 + Ly mphocytes Levels (high levels of viral blood in HIV-infected adults and children Disease: relationship with the stage of disease and CD4 + lymphocyte levels). J. Infect. Dis ． 1991; 164: 72-80). Conversely, plasma HIV-1 viral load levels and vertical transmission No correlation was found between and. Other reports indicate that mothers with vertical transmission have blood The absence of serous viremia was shown (Ariyoshi, K., Weber, J., and Walters , S. Contribution Of Maternal Viral Load TO HIV-1 Transmission Contribution of viral load to HIV-1 infection). Lancet 1992; 340; Puel, J ,, Iz opet, J., Lheritier, D., Briant, I., Guyader, M., Tricoire, J.M. and Berre bi, A. Viral Load And Mother To Infant HIV Transmis sion (viral load and HIV transmission from mother to baby). Lancet 1992; 340: 859-86 0). Generation of a fast replicating toxic HIV mutant in mothers (Grunter, R.A., Terp) stra, F.G., De Goede, R ,, Mulder, J. W., De Wolf, F., Schellekens, P., V an Lier, R., Termette, M., and Miedema, F.M. Immunological And Virologic M arkers In Individuals Progressing From Seroconversion To AIDS Immunological and virological markers of patients who have progressed from version to AIDS) ． AIDS 1991; 5: 837-844), selective infection of mutants of the mother (Wolinsky, SM, Wike) , C, A., Korber, B., Hutto, C., Pparks, W. P., Rosenblum L. L., Kunstman , K. J., Furtado, M. R., and Munoz, J.L. Selective Transmission Of Human  Immunodeficiency Virus Type-1 Variants From Mothers To Infants (HIV -1 mutant selectively transmitted from mother to infant). Science 1992; 255: 1134-1137), And co-infection with other microorganisms (Holme, W. Vertical Transmission Of HIV (HI V vertical transmission). Lancet 1991; 337: 793-794) is an HIV-1 mother to her offspring. It is considered to be an important variable factor in the infection of the sardine. The results of the inventors Factors other than viral load are the vertical sensations of HIV-1 It suggests that it may have contributed to the dyeing. Consequences of trauma to the placenta , Both cells and viruses can enter the developing fetus. children The possibility of infection when passing through the birth canal depends on the blood volume of the mother present during labor, It seems reasonable. The virus can occur during food inoculation, tear glands, or during labor. It could have been able to get into the child through a small, capable wound. That's it In such cases, the maternal blood volume lost during labor is more important than the actual viral load. It is believed that there is. For women with low viral load but high blood loss, HIV sensitivity is higher than in women with high viral load but minimal blood loss during labor. The possibility of dyeing may be great. This is the result of our experiments. CD4 + is very high in asymptomatic mother with no detectable HIV RNA in treetop blood It could explain why parents were able to infect their children with HIV-1 Be done.   Unlike vertical transmission of HIV-1, water from HIV-1 blood donors to recipients Common infections were highly correlated with plasma viremia. In this experiment, all 22 people HIV-1 seropositive blood was transferred to all recipients. HIV-for blood recipients 1 infection Detectable HIV-1 in a significant proportion (64%) of the donor samples involved Viralemia is detected, but can be detected in donors who did not infect the recipient No HIV-1 viremia was observed. These results show that HIV infection , Mainly depending on the level of plasma viremia before and after transfusion.   As the number of HIV-1 infected people increases, monitoring of symptoms during the course of infection becomes It is becoming more important. You can check the progress of the disease quickly and efficiently Once an assay is developed, it will help monitor the effects of infections and various treatments. Let's do it. A fairly sensitive immunocapture cDNA / PCR assay is specialized for these purposes. Thought to be useful for. The assay described herein uses plasma HIV-1 It is possible to make a logarithmic difference in virus load, and now plasma HIV- 1) We are working to develop a more accurate method for detecting and quantifying the level of viremia. . These include the development of quantitative detection systems based on amplification systems other than PCR.   In addition to PCR, two methods currently used to amplify target DNA are described in the literature. It is listed. One is self-sustaining sequence replication (3SR) and the other is ligase fast chain reaction (LCR) (Bush, C.E., Donovan, R.M., Peterson, W.R., Jennings, M.B., Bolton, V., Sherman, D.G, , Vanden Brink, K.M., Beninsig, L.A., and Godsey, J.H. Detection Of Huma n Immunodeficiency Virus Type 1 RNA In Plasma Samples From High Risk Pe diatric Patients By Using The Self Sustained Sequence Replication Reatio n (Blood in pediatric patients at high risk due to the use of the autonomous continuous sequence replication (3SR) reaction) Detection of HIV-1 RNA in serum samples). J. Clin. Micro. 1992; 30: 281- 286; Wu, D.Y. and Wallance, R.B. The Ligation Amplification Reaction (LA R) -AmPlification Of Specific DNA Sequences Using Sequential Rounds Of T emplate-Dependent Ligation (Link Amplification Reaction (LAR) -Continuous round casting Amplification of specific DNA sequences by type-specific ligation). Genomics 1989; 4: 560-569; Barr inger, K.J., Orgel, L., Wahl, G., and Gingeras, T.R, Blunt-end And Singl e Strand Ligations By Escherichia coli Ligase: Influence On An In Vitro Amplification Scheme (E. coli ligase ligation of blunt end and single strand: in Effect on in vitro amplification method). Gene 1990; 89: 117- 122). LCR is complementary to the target DNA using a thermostable DNA ligase. Share adjacent 3'hydroxy and 5'phosphoryl ends of oligo-primers It binds and does not require Taq polymerase. LCR is for PCR As such, the target DNA is amplified by a series of annealing and denaturation steps. each The oligonucleotide products obtained in each round serve as substrate for each subsequent round. To use. Thus, the number of target molecules of DNA is 10FiveCan be increased more than double It To detect the LCR product, the primer was modified to include a fluorophore To do. Then use an automated fluorescence assay system that can process 24 samples in 45 minutes. To use. The following documents are cited in the description:

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 洗剤およびプロテイナーゼＫを逆転写および核酸増幅法で使用する酵素反 応に適合する濃度で含み、該洗剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton Ｘ−１ ００およびTween２０から成る群から選択されることを特徴とする溶解試薬。 ２． 該洗剤が、０．００１％以下の濃度のドデシル硫酸ナトリウムであること を特徴とする請求項１に記載の試薬。 ３． 該洗剤が、０．１〜０．５％の範囲の濃度のTriton Ｘ−１００およびTwe en２０から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の試薬。 ４． 核酸の単離における直接溶解緩衝液として使用するための、緩衝液、０． ００１％のドデシル硫酸ナトリウムおよび１μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含 む組成物。 ５． 該緩衝液が１０ｍＭトリス（ｐＨ７．０）であることを特徴とする請求項 ４に記載の組成物。[Claims] 1. Enzyme reaction using detergent and proteinase K in reverse transcription and nucleic acid amplification methods The concentration of the detergent is sodium dodecyl sulfate, Triton X-1. A lysis reagent selected from the group consisting of 00 and Tween20. 2. The detergent is sodium dodecyl sulfate having a concentration of 0.001% or less. The reagent according to claim 1, wherein: 3. The detergent comprises Triton X-100 and Twe at concentrations ranging from 0.1 to 0.5%. The reagent according to claim 1, wherein the reagent is selected from the group consisting of en20. 4. A buffer, for use as a direct lysis buffer in the isolation of nucleic acids, 0. Containing 001% sodium dodecyl sulfate and 1 μg / ml proteinase K. Composition. 5. The buffer is 10 mM Tris (pH 7.0). The composition according to 4.
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