【発明の詳細な説明】
治療剤および治療方法
〔発明の技術分野〕
本発明は、特に哺乳類新生児における胃腸病を治療または子防するための方法
および組成物に関する。
〔発明の背景および従来技術〕
胃腸病は、ヒトおよび家畜、特に生後数週間の新生児における重要な病因およ
び死因である。胃腸感染は乳幼児の高い入院率をもたらし、迅速な脱水を生じて
死亡に至り得ることが示されている。家畜、特に集中的飼育条件下の家畜におい
て、胃腸感染は著しく迅速に広がり、成育不良をもたらし、しばしば死亡するに
至る。これらの症状は、特にブタおよびトリ（家禽）の生産に破壊的な影響を与
える。
ヒト患者での治療は、経口的または非経腸的な水補給療法に依存するが、飼育
場の環境において胃腸感染を牽制することは、飼料または水の中に大量の抗生物
質を与えることに大きく依存する。これは非常にコストがかさみ、また原因微生
物の抗生物質に対する耐性が生じ易く、より危険な微生物にまで広がり得る危険
がある。ここで、ワクチンは信頼性がないことが証明されている。
胃腸炎の原因微生物は、その細胞表面に腸粘膜に結合するためのレセプターを
有しているので、感染の予防を試みるために、パパインまたはブロメラインのよ
うな酵素の投与が提案されている。
殆どの家畜において、母体の抗生物質は初乳（colostrum）を介して子孫に移
行する。若年動物が集中的に飼育され、その母親と一緒に飼育されない状況にお
いては、受動免疫を与える試みとして、種々の人為的な哺乳製品が用いられてい
る。例えば、ビクトリア社農業部門による商品名「ガンマサウ（Gamma Sow）」
の製品およびバイエル社により製造されている商品名「リバイブ（Revive）」で
あり、両者共に屠殺した雌ブタ由来の免疫血清を利用している。海外から人手可
能な他の製品は、初乳、ミルクまたはホエイ（whey）から得た免疫グロブリンを
用いている。しかしながら、これら製品の殆どは著しく高価であるか、或いはオ
ーストラリア国内では入手できない。
ロタウイルス下痢の場合、最も重要な保護因子は小腸の体腔内における特異的
抗体の存在である。ロタウイルス下痢に対する防御は、ＩｇＧ（同種または異種
の何れであろうとも）の経口投与によって達成され得る（Snodgrass D.R．et al
.,Infect.Immun.,1977,16,268-270 ；Barnes，G.L．et al.,Lancet 1982,1,1371
-1373）。しかしながら、これらの文献からは、ＩｇＧは精製されなければなら
ず、またはミルク中ではなく初乳中に存在しなければならないことが明らかであ
る。また、不活性化したウシ・ロタウイルスで免疫感作された雌ウシは、初乳を
介してその子ウシに受動抗体を与えることが示された（Mebus，C.A．et al.，J.
A.Vet.Med.Assoc,,1973,163,880-883）。続いて、免疫感作された雌ウシ由来の
ウシ初乳を、ヒト新生児に対して経口投与することは、ロタウイ
ルス下痢の防御に有効であることが示された（Hilpert H．et al.,J.Infect,Dis
.,1987,709-712）。
完全な初乳抗体は、胃炎および消化性潰瘍に関連したヘリコバクター．ビロリ
（Helicobacer pylori infections）感染の治療に効果的であることが分かって
いる。ヘリコバクター・ピロリは、以前はキャンピロバクター・ピロリ（Campyl
obacter pylori）として知られていた。この方法は、「胃炎疾病の治療方法」と
いう名称のアボットラボラトリーズ社によるオストラリア特許出願第80207/91号
の主題であり、その開示の全体が参照として本明細書の一部をなす。この方法の
効果は、完全な初乳ホエーの正常な摂取によって得られる。この明細書では、ヘ
リコバクター・ピロリで免疫感作する方法、並びにヘリコバクター・ピロリで免
疫感作した動物の乳腺分泌物（ミルクおよび初乳ホエーを含む）、特にウシ初乳
ホエーから特異的な抗体を単離および濃縮する方法の詳細を説明する。
種々の微生物に対する特異性をもった免疫グロブリンを哺乳動物から製造する
方法が、米国特許第3128230号および同第4051231号に開示されている。オースト
ラリア特許出願第644468号（82527/91）には、免疫初乳または高度免疫初乳に適
用され得る噴霧乾燥された初乳製品の製造方法が開示されており、そこでは乳幼
児におけるロタウイルス感染の治療または予防に有用であると述べられている。
免疫グロブリンは、多量体に会合し得るＹ字形の分子からなっている。これら
の基本単位はプロテアーゼ（タンパク分
解酵素）に攻撃されると、Ｆabフラグメント（抗原結合部位）とＦcフラグメン
ト（定常部位）とに容易に開裂する。Ｆab部分は、特異的な抗原結合部分として
作用する相補性決定領域を含んでいる。またＦc部分は、所定のホスト細胞表面
への結合（通常は抗原結合に続いて起きる分子コンホメーション変化後）、およ
び袖体の結合に関与する。Ｆcの結合は、多くの下流免疫反応を開始させ、この
反応によって最終的にはホストの体内から抗原が除去される。
バクテリア、マイコプラズマ、ウイルスおよび原生動物を含む多くの微生物は
、遊離のＦc領域に結合するレセプターを有している。細胞表面における微生物
Ｆcレセプターの存在は、病原性および毒性に関連しており、またホストの免疫
応答の抑制にも関係している（Widders,P,R.；Bacterial Immunoglobulin-Bindi
ng Proteins，Vol.1（Academic Press），1990,pp.375-395）。Ｆcレセプターは
微生物表面に固定されて残存し得、或いは脱落して「可溶性」のＦc受容体にな
り得る。強力な推定証拠は、微生物Ｆcレセプターが、オプソニン作用およびフ
ァゴサイトーシス作用の低下、補体活性の低下、抗体に依存した細胞媒介性の細
胞毒性および突然変異誘発を含む種々のメカニズムを介して、哺乳動物ポストに
おける微生物の持続に有利に働くことを示している。
Ｙ字形基本単位の五量体である１ｇＭのＦc部分は、前初乳段階（pre-colostr
al）の新生子ブタにおける大腸菌株055のクリアランスを増大することが示され
ている（Zikan,J．and Miller,I.，Immunochemistry 1975,12,813-815）。これ
らのバクテリアについてはＦcレセプターの存在は検出されていないが、ＩｇＭ
のペプシン消化によって得られるＦabフラグメントは、親分子がもっている補体
との共同殺菌活性を保持する一方、該Ｆcフラグメントはオブソニン作用によっ
て大腸菌をクリアする親分子の能力を保持した。
経口投与されたプロテアーゼは単独で、微生物付着および微生物毒素に対する
レセプターを分解することによって、小腸の微生物定着能力に影響することが示
されている（Chandler,D.S.，Ph.D.Thesis，La Trobe University 1986；Mynott
et al.,Infection and Immunity,1991,59,3708-3714）。
胃腸疾患を引き起こす微生物に対して向けられる高度免疫初乳抗体は、疾病抑
制に有効であることが認識されている（Tackett et al.,New England J．Med.,1
988,318,1240-1243；Hilpert et al.,J．Infect．Dis.,1987,156-158,Ebina et
al,,Med，Microbiol．Immunol.,1985,174-177，Davison et al,,Lancet,1989,23
,September,709-712）。
上記のように、ペプシンおよびパパインのようなプロテアーゼによる免疫グロ
ブリン分子の制限消化によって、該免疫グロブリンは開裂されてＦabまたはＦ（
ab）2フラグメントが形成されるが、これは制限消化によってのみ起こるので、
制御された条件下で行われなければならない。もし条件を慎重に制御しなければ
、幾つかのプロテアーゼは抗体を完全にバラバラに分解してしまい、その活性を
破壊してしまう。
我々は今回、驚くべきことに、胃腸疾患を予防または緩和するために、プロテ
アーゼ処理された抗体の投与を組み合わ
せることによって、改善された応答を得られることを見出した。プロテアーゼ処
理された抗体を投与すること、或いは抗体と共にプロテアーゼを投与することに
よって、各成分がその別々の作用を発揮することが可能になり、また特異的抗体
の少なくとも一部分が影響されることをも確実にする。これは、発生段階的な未
成熟のために胃および腸のタンパク分解活性が低い新生児においで特に有益であ
り（Moughan P.I．et al.,In．Nutritional Triggers for Health and in Disea
se；Simopoulos A.P．（ED）Worlds Rev．Nutr．Diet．Basel，Karger,67,40-11
3）、また胃停滞が摂取された抗体の一体性保持を阻害し得る成人において有益
である。
新生児においては、胃および膵臓の分泌活性が完全には発達しておらず、加え
て胃液のｐＨは比較的高い；従って、膵臓酵素の放出をトリガーせず、ｐＨはペ
プシンが活性化されるには高すぎる。更に、発生の際、酵素キモシンはペプシン
の前に出現する；キモシンはミルクを凝集できるが、抗体を開裂できない。従っ
て、新生児初乳抗体は分解することなく胃を通過するであろうと思われる。ペプ
シンが遅く出現する（生後約１週間に開始する）ことは、抗体が胃内で破壊され
ないので従来は利点であると考えられていた（Foltman,B.，1975，In．Proc．3r
d Int．Semin．Dig．Physiol．Pig.，Iust，jorgensen，Fernandez（Eds）,120-
123，National Institute of Animal Science，Copenhagen）。従って、特に驚
くべきことに、我々は、タンパク分解酵素で処理した初乳抗体の投与が、新生児
子ブタにおいて有用な効果を有することを
見出した。
ペプシン消化した抗体での処理に続いて、明らかに有利な胃腸管内のグラム陽
性フローラ（ラクトバチルス類、ストレプトコッカス類またはその両者）が発達
するから、本発明は、これら微生物の外因性培養体をプロテアーゼ処理した抗体
と共に投与すると、定着する機会が向上するであろうことを提案する。ラクトバ
チルス類およびストレプトコッカス類の培養体は、成功する場合は限られている
が、コブタおよび他の種における下痢性疾患を抑制するために現在商業的に使用
されている。これらの培養体は共生剤（probiotics）と称されている。共生剤の
治療的機能に伴う主な問題は、これらの株をＧＩＴ中で樹立することの困難性で
ある（Cain,C.,1988，Observations of indigenous and non-indigenous lactic
acid bacteria as potential Probiotic organisms in pigs.，Masters Thesis
，School of Agriculture，La Trobe University）。
本発明は、共生株による腸管の定着を改善して、抗体の経口投与によって与え
られる疾患保護の期間を延長するための手段を提供することである。ペプシン処
理した抗体を新生児に使用すること、並びに未消化の抗体を共生剤と共に成体に
使用することは、胃および腸の両方の感染を治療するために用いることがでぎる
。抗体および適切な共生剤の組み合わせによって、連続的な抗体療法の必要性は
大幅に低減されるであろう。
〔発明の概要〕
一つの側面において、本発明は動物における胃腸疾患を治療または子防する方
法であって、このような治療を必要とする動物に対して、適切なタンパク分解酵
素で処理された有効量の抗体を投与し、または有効量の抗体と共にタンパク分解
酵素を投与するするステップを具備した方法を提供する。
本発明は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、トリおよびヒトを含む広範な動物の治
療に適用することができる。新生児動物および新生児ヒトの治療に特に適してい
る。治療または予防され得る胃腸疾患の原因微生物には、ヘリコバクターピロリ
、大腸菌（Escherichia coli）およびロタウイルスが含まれるが、これらに限定
されるものではない。
本発明に川いるのに適した抗体は精製する必要がなく、また免疫血清または免
疫初乳から、或いは免疫感作されたトリの卵黄から誘導され得るし、モノクロー
ナル抗体または生物工学的に加工された抗体であってもよい。唯一の要件は、病
原物質に対する抗体特異性である。免疫感作された酪農動物（dairy animal）、
例えばウシ、ヒツジまたはヤギから得た初乳は、本発明に用いるのに特に適して
いる。抗体はＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭであり得るが、好ましくはＩｇＧ1で
あり、また最も好ましくはウシＩｇＧ1である。抗体が卵黄から誘導されなら、
好ましくはＩｇγである。
本発明に用いるのに適したタンパク分解酵素には、ペプシン、パパイン、ブロ
メライン、真菌プロテアーゼおよびトリプシンである。消化（開裂）反応を制御
するのが容易であり、また安価かつ強力であることから、ペプシンが好ましい。
抗
体が全体的に分解される程には、タンパク分解酵素の濃度が高くてはならず、或
いは消化時間が長くなってはいけない；当業者は、通常のトライ・アンド・エラ
ーの実験によって適切な濃度を決定することができるであろう。
別の側面において、本発明は動物における胃腸疾患を治療または予防する方法
であって、このような治療を必要とする動物に対して、共生微生物と組み合わせ
て、タンパク分解酵素で処理された有効量の抗体を投与し、または有効量の抗体
と共にタンパク分解酵素を投与するするステップを具備した方法を提供する。こ
の共生微生物は、治療すべき動物種の健康な固体の粘膜フローラに固有的なメン
バーでないものであってもよいが、適切には、この動物種に生来存在する微生物
である。好ましくは、この共生微生物はラクトバチルスまたはストレプトコッカ
スである。二以上の共生微生物の混合物を川いてもよい。
何れの側面においても、本発明の方法は、抗生物質療法のような他の治療と組
み合わせて用いてもよい。
病原微生物とホストとの間の化学的相互作用に有利な粘膜の性質に影響を及ぼ
すために、任意に、更なるプロテアーゼを別に投与してもよい。
本明細書の目的において、「タンパク分解酵素」および「プロテアーゼ」の用
語は同義に解釈されべきものである。胃腸疾患について本発明を詳細に説明した
が、本発明は、当該疾患に罹患した動物の胃腸管に由来する微生物によって引き
起こされる、他の部位での疾患の治療または予防に適用可
能であることが明瞭に理解されるであろう。
免疫グロブリンの前処理に用いられるプロテアーゼの活性のタイプによっては
、抗体およびプロテアーゼは別々に投薬されなければならないかもしれない。
本発明の方法は、ＡＩＤＳ関連合併症もしくはＡＩＤＳの患者または広範囲の
火傷もしくは熱傷の患者ような、特に感染し易い免疫無防備状態の患者の治療の
治療、或いは胃腸管吸収不良症候群の患者の治療に適している。
また、本発明の方法は、例えばタガメット（Tagamet）のような、胃内の酸分
泌を阻害するＨ2レセプター拮抗剤の投薬を受けており、副作用として下痢を呈
している患者の治療に適している。
第二の側面において、本発明は、動物の胃腸疾患を治療または予防するための
組成物であって、
ａ）タンパク分解酵素で前処理された有効量の抗体、
または
ｂ）有効量の抗体と一緒のタンパク分解酵素
の何れか一方と、
任意に、薬学的に許容可能な担体と共に、共生微生物とを含有する組成物を提
供する。
成人患者への投与に適した好ましい態様において、この製剤は、プロテアーゼ
が腸溶性のコーティングまたは緩衝材が施され（enteric coated or buffered）
、抗体と共にまたは夫々別々に緩衝性液体賦形済中に懸濁された、二成分系液体
処方（two-part liquid formal）を提供する。
別の態様において、この製剤は、任意に腸溶性コーティングが施された多層錠
剤であって、酵素が最内層を形成し、抗体が外層を形成して好ましくは酵素から
隔離されている多層錠剤であり得る。慣用的な充填剤、顆粒化剤および賦形済が
存在していてもよい。変形は当業者に明らかであろう。
また、本発明は上記の方法に用いるための製剤を提供する。個々の剤形は抗体
およびプロテアーゼのタイプに依存するであろうし、また公知の製剤化原理およ
び普通のトライ・アンド・エラーの実験によって考案することができる。
〔発明の詳細な説明〕
以下、実施例に従って本発明を例示するが、これら実施例は本発明を限定する
ものではない。
例 １：ブタの下痢疾患を抑制するためのペプシン消化された抗体の使用
この実験は、病原性大腸菌による攻撃の際の子ブタの受動免疫保護が、子ブ
タに用いるために特に処方された高エネルギー初乳代替物に含まれる、初乳の同
じバッチから精製された完全抗体、または精製された抗体製剤のペプチド消化物
としての、完全な抗体を用いて最良に達成されたか否かを研究するためのもので
あった。
〈材料および方法〉
抗体治療
これらは、略６時間の間隔で子ブタに与えられる６×２０ｍｌの投与からなる
。初乳代替物グループの子ブタは、ＲｅＳｕｓ（Nufarm Animal Healthy Pty Lt
d.）の投与を受けた。
ＲｅＳｕｓは、多価全細胞およびピリ線毛ワクチンを用いて、子ブタに感染する
タイプの大腸菌に対して免疫感作されたウシに由来する、高度免疫ウシ初乳を含
有する商業的な初乳代替物である。第二治療グループの子ブタは、同一のバルク
バッチの初乳に由来するウシ初乳抗体の投与を受けたが、この場合の抗体は、脂
肪除去および酸カゼイン沈降（acid casein precipitation）によって、ベース
初乳（base colostrum）から除去されたものである。次に、抗体含首溶液をＢａ
Ｃｌ2溶液に添加したときに沈殿が生じなくなるまで、この抗体を（ＮＨ4）2Ｓ
Ｏ4沈殿および蒸留水に対する徹底的透析によって更に精製した。第三治療グル
ープの子ブタに用いるための抗体の抗体のペプチド消化は、抗体５部に対して１
部の比率で商業的ペプシンを用いることによって、３７℃で一晩行われた（Fang
,W.D．and Mukkur,T,K,S,,Biocchem.J.,1976,155,25）。全ての抗体含有治療剤
は、使用する前に、ＥＬＩＳＡブロック検定で試験したときに同じ力価のブロッ
キング活性（ＲｅＳｕｓに見られる活性と同じ）を有するように調節された。こ
の試験は、固相上にＫ８８*大腸菌を固定し、被検抗体および抗−Ｋ８８複合体
と、酵素基質を添加することからなる。第四（対照）グループの子ブタには、抗
生物質治療を施した子ブタと同じレジメに従って、抗Ｋ８８抗体を含まない等容
量の商業的ミルク代替物を与えた。治療剤は、口腔−胃チューブ（oro-gastric
tube）によって投与された。また、商業的なミルク代替物（新生児子ブタについ
て製造業者が推奨する量）およびバクテリアの抗原投与もまた、口腔
−胃チューブによって与えられた。
子ブタの管理
３匹の雌ブタから生まれた子ブタを、授乳機会が与えられる前に、誕生時に取
り上げた。これらの子ブタを直ちに計量し、重量によってランク付けし、体重に
マッチした四つの治療グループに分けた。個々に番号を付した彩色耳タグを用い
て、子ブタを個々に区別し、また治療グループによって区別した。次いで、これ
ら子ブタを体重が略等しい２匹づつを対にして、加熱した檻にランダムに割り当
てた。生後約２時間の時点で、子ブタに第一の治療剤量を与え、続いて３０分後
に１０10個の溶血性Ｋ８８+大腸菌株WG,0149；K91；K88ac；H10からなるバクテ
リア抗原投与量を与えた（Tzipori et al,Aust.Vet.J.,1980,56,274）。第二回
目の同様の抗原投与量を２４時間後に与えた。生後４８時間の時点で、バルビツ
レート（barbiturate）の過剰投与によって全ての子ブタを屠殺した。
微生物学的評価
死亡直後に、胃から並びに小腸の三つの部位から、腸のスクレーピング（inte
stinal scrapings）を採取した。胃は大湾部（greater curvature）周囲の途中
を採取する一方、小腸は両端から200mmおよびその途中を採取した。これらの部
位は、それぞれ部位１（十二指腸端）、部位３および部位２と名付けた。各部位
の粘膜１cm2からのスクレーピングを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ7.2，0.
1M）中に懸濁させた。対で、マイルスおよびミスラ（Miles and Misra，1932）
の方
法に従い、好気的に３７℃で一晩インキュベートしたヒツジ血液およびマッコン
キー（MacConkey）寒天、並びにロゴサ（Rogosa）およびトリプチカーゼ・ソヤ
・寒天（Trypticase Soya Ager；ＴＳＫ）を用いてバクテリアの計数を行った；
３７℃で４８時間、好気的および嫌気的にインキュベートした。血液寒天上の溶
血性の大コロニー（その幾つかは、スライド凝集によって抗原投与株であること
が確認された）および小コロニー（ストレプトコッカスと思われる）の計数を行
なった。マッコンキー寒天上の大腸菌型の計数（ラクトース発酵および非発酵）
が行われ、またロゴサ寒天からラクトバチルスの計数が行われた。全バクテリア
数を評価するためにＴＳＡを用いた。好気的または嫌気的にインキュベートした
ときのロゴサ計数値およびＴＳＡ計数値は同様であった。好気的にインキュベー
トしたプレートから全数を評価した。
統計的分析
対数変換されたバクテリア計数値は、各治療群について均一な分散（variance
）を有することが分った。従って、これらは分散解析（Analysis of Variance）
および空間解析（spacial analysis）によって分析された（２Ｄ，農業のＮＳＷ
部門）。
〈結果および考察〉
バクテリア計数値の分析結果は表１−３に示されている。この結果は、病原体
インジケータ（溶血性または大腸菌型の計数値）が高く、また全ての部位でラク
トバチルスまたはストレプトコッカスの「望ましい」ポピュレーションが低い点
において、対照グループのブタの特性が劣っていることを示
している。これは、初乳保護をなくした子ブタについて予想された通りである。
一般に、バクテリア計数値は胃で高く小腸では低いが、病原性株の計数値は対照
グループの子ブタの小腸上部でも高い。対照グループの子ブタにおいて腸の病原
体計数値が高いことの影響は、これら子ブタについて記録された適切な条件およ
び糞スコア値にも反映された（データは示していない）。ストレプトコッカスお
よびラクトバチルスは、一般には良好な健康に関係するＧＩＴのバクテリアポピ
ュレーションである。これらのバクテリアの計数値は、抗体治療を受けた全ての
子ブタにおいて高かった。表１は、その結果の範囲内において、特にペプシン消
化された抗体の投与を受けている子ブタにおいて、病原体計数値が低く且つＧＩ
Ｔ内の全体に亘って「望ましいフローラ」計数値が高いという傾向があるにもか
かわらず、精製抗体の計数値は商業的な初乳代替物に比較して有意に改善されな
かったことを示している。望ましいポピュレーション：望ましくないポピュレー
ションの比（表２）としてこれら計数値を分折すると、ペプシン消化された抗体
治療についでの比が未消化の（精製された）抗体で得られる比よりも改善される
こと、即ち、溶血性：ラクトバチルスの比については２８．２％、また溶血性：
ストレプトコッカスの比については２１．２％改善されることが示される。表３
は、部位：部位とブタ：ブタの計数の間の高い変動性を一般的に示している。ペ
プシン消化された抗体の投与を受けている子ブタにおいて、非病原体の計数値に
対して病原体の計数値が低いという傾向は一貫したパターンで
あるが、殆どのＧＩＴ部位（１６のうちの１２）において明らかである。表２お
よび表３において、夫々の治療について処理済と対照との間の差は、それが５％
のＬＳＤよりも大きければ有意である。これらの結果は、ペプシン消化された抗
体治療は、病原体ポピュレーションの抑制を維持または改善する一方で、粘膜表
面でのグラム陽性ポピュレーションの発達には有利に働くことを支持している。
この試験で得られた知見は、Ｆab抗体フラグメントの特異的抗原結合特性によっ
て病原体ポピュレーションの抑制が効果的に達成される一方、消化された抗体プ
レパレーション中で優勢な遊離のＦcフラグメントは、グラム陽性（Ｆcレセプタ
ーを有する）の粘膜フローラの発達に百利であろうとの仮説と一致する。
例 ２：カプセル殻内の二種類のマイクロカプセルとしての剤形
本発明に従う剤形は、次の（ａ）（ｂ）の二種類のマイクロカプセルを含有す
るカプセル殻を具備しており、
（ａ）結合剤と共に、腸溶性コーティング剤でコートされた直径約750μの
コアとして存在する、ブロメライン、ペプシンまたはパパインから選択されるプ
ロテアーゼ；
（ｂ）ウシ初乳と共に、好ましくは非タンパク基材中にマイクロカプセル化
されたウシＩｇＧのような抗体であって、このマイクロカプセルは250μ未満の
直径を有する。
適切な結合剤には、澱粉、カルボキシメチルセルロース、ポビドン、ラクトー
スおよびデキストロースが含まれる。適切な腸溶性コーティング剤には、トリア
セチン又はグリセリンのような適切な膜軟化剤と共に用いられる、セルロースア
セテートフタレートが含まれる。この微小球は、ロタ・プロセッサ（Rota-proce
ssor，Acromatic A.G,）のような標準装置を用いて形成され、次いでウルトラコ
ータ（Ultra Coater；Acromatic A.G.）を用いてコートされ得る。同様に、抗体
微小球はロタ・プロセッサ中で形成され、ウシ初乳のコーティングがトップスプ
レーコーティングによって塗布される。
この例で形成された微小球は、澱粉ベースの錠剤として製剤化してもよい。
例 ３：成人患者に特に適した錠剤処方
別の三つの錠剤処方は次の通りである。
（ａ）澱粉充填剤を含むブロメファインのコアを、セルロースアセテートフタ
レートでコートし、次いで初乳および卵アルブミンを含む抗体層でコーティング
する。
（ｂ）ブロメライン、抗体、澱粉および卵アルブミンのコアを、初乳の層でコ
ートし、次いでセルロースアセテートフタレートの層でコートする。
（ｃ）ブロメライン、抗体、澱粉および卵アルブミンのコアを、セルローサセ
テートフタレートでコートし、次いで初乳の外層でコートする。
例 ４：
例２、３（ｂ）および３（ｃ）に従う処方において、ブロメラインおよび抗
体を、タンパク分解酵素で前処理された抗体で置き換えてもよい。
本発明が、その一般的な側面においては上記で述べた特定の態様に限定されな
いことについては、明瞭に理解されるであろう。Detailed Description of the Invention Therapeutic agent and method TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to methods and compositions for treating or controlling gastrointestinal disease, especially in neonatal mammals. BACKGROUND OF THE INVENTION AND PRIOR ART Gastrointestinal disease is an important cause and cause of death in humans and livestock, especially newborns in the first few weeks of life. It has been shown that gastrointestinal infections result in high hospitalization rates for infants and can result in rapid dehydration and death. Gastrointestinal infections spread remarkably quickly, lead to stunting and often death in livestock, especially in livestock conditions. These conditions have a destructive effect, especially on the production of pigs and birds (poultry). Treatment in human patients relies on oral or parenteral water-supplementation therapy, but controlling gastrointestinal infections in farm settings involves feeding large amounts of antibiotics in feed or water. Heavily dependent. This is very costly, the resistance of the causative microorganism to antibiotics is likely to develop, and there is a risk that it can spread to more dangerous microorganisms. Here, the vaccine has proven unreliable. Since the causative microorganism of gastroenteritis has a receptor on its cell surface for binding to intestinal mucosa, administration of an enzyme such as papain or bromelain has been proposed in an attempt to prevent infection. In most livestock, maternal antibiotics are transferred to the offspring via colostrum. In the situation where young animals are intensively bred and are not bred with their mother, various artificial feeding products have been used in an attempt to give passive immunity. For example, the product name “Gamma Sow” by Victoria Agricultural Division and the product name “Revive” manufactured by Bayer, both of which utilize immune sera from slaughtered sows. ing. Other products that are manufacturable from abroad use immunoglobulins obtained from colostrum, milk or whey. However, most of these products are extremely expensive or not available in Australia. In the case of rotavirus diarrhea, the most important protective factor is the presence of specific antibodies within the body cavity of the small intestine. Protection against rotavirus diarrhea can be achieved by oral administration of IgG (whether homologous or heterologous) (Snodgrass DR. Et al., Infect. Immun., 1977, 16, 268-270; Barnes, GL. Et. al., Lancet 1982,1,1371 -1373). However, it is clear from these references that IgG must be purified or must be present in colostrum but not in milk. Cows immunized with inactivated bovine rotavirus have been shown to give passive antibodies to their calves via colostrum (Mebus, CA. et al., JAVet. Med. Assoc ,, 1973, 163, 880-883). Subsequently, oral administration of bovine colostrum from the immunized cow to human newborns was shown to be effective in protecting against rotavirus diarrhea (Hilpert H. et al., J. Infect, Dis., 1987, 709-712). Complete colostral antibody is associated with gastritis and peptic ulcer Helicobacter. It has been found to be effective in treating Helicobacer pylori infections infections. Helicobacter pylori was formerly known as Campylobacter pylori. This method is the subject of Ostralian Patent Application No. 80207/91 by Abbott Laboratories, Inc., entitled “Method of Treating Gastritis Disease”, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. The effect of this method is obtained by the normal intake of whole colostrum whey. In this specification, a method for immunizing with Helicobacter pylori, and mammary gland secretions (including milk and colostrum whey) of Helicobacter pylori-immunized animals, in particular bovine colostrum whey, are used to identify specific antibodies. The details of the method for isolation and concentration will be described. Methods for producing immunoglobulins from mammals with specificity for various microorganisms are disclosed in US Pat. Nos. 3,128,230 and 4,051,231. Australian Patent Application No. 644468 (82527/91) discloses a method of producing a spray-dried colostrum product that can be applied to immune colostrum or hyperimmune colostrum, wherein rotavirus infection in infants It is said to be useful for treatment or prevention. Immunoglobulins consist of Y-shaped molecules that can associate into multimers. When these basic units are attacked by a protease (proteolytic enzyme), they are easily cleaved into a Fab fragment (antigen-binding site) and an Fc fragment (constant site). The Fab portion contains a complementarity determining region which acts as a specific antigen binding portion. The Fc portion is also involved in binding to the surface of a given host cell (usually after a change in molecular conformation that occurs following antigen binding), and sleeve binding. The binding of Fc initiates a number of downstream immune reactions that ultimately remove the antigen from the host body. Many microorganisms, including bacteria, mycoplasmas, viruses and protozoa, have receptors that bind to the free Fc region. The presence of microbial Fc receptors on the cell surface is associated with pathogenicity and toxicity and also with suppression of host immune responses (Widders, P, R .; Bacterial Immunoglobulin-Binding Proteins, Vol. 1 (Academic Press), 1990, pp.375-395). The Fc receptor can be immobilized and remain on the surface of the microorganism, or it can be shed to the "soluble" Fc receptor. Strong putative evidence suggests that the microbial Fc receptor is mediated by various mechanisms including decreased opsonization and phagocytosis, decreased complement activity, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and mutagenesis. It has been shown to favor the persistence of microorganisms in the mammalian post. The pentameric Fc portion of the Y-shaped building block, 1 gM, has been shown to increase clearance of E. coli strain 055 in pre-colostral neonatal pigs (Zikan, J. et al. and Miller, I., Immunochemistry 1975, 12, 813-815). Although the presence of the Fc receptor has not been detected in these bacteria, the Fab fragment obtained by digestion of IgM with pepsin retains its co-bactericidal activity with the complement possessed by the parent molecule, while the Fc fragment has an obsonate action. Retained the ability of the parent molecule to clear E. coli. Orally administered proteases alone have been shown to affect microbial colonization in the small intestine by degrading microbial adhesions and receptors for microbial toxins (Chandler, DS, Ph.D. Thesis, La Trobe University). 1986; Mynott et al., Infection and Immunity, 1991, 59, 3708-3714). Hyperimmune colostral antibodies directed against gastrointestinal disease-causing microorganisms are recognized to be effective in disease control (Tackett et al., New England J. Med., 1 988,318,1240-1243; Hilpert et al., J. Infect. Dis., 1987, 156-158, Ebina et al ,, Med, Microbiol. Immunol., 1985, 174-177, Davison et al ,, Lancet, 1989, 23, September, 709-. 712). As noted above, the immunoglobulins are cleaved to Fab or F (ab) by restriction digestion of immunoglobulin molecules with proteases such as pepsin and papain. 2 Fragments are formed, which must be done under controlled conditions, as this only occurs by restriction digestion. If the conditions are not carefully controlled, some proteases will break down the antibody completely and destroy its activity. We have now surprisingly found that an improved response can be obtained by combining the administration of protease-treated antibodies in order to prevent or ameliorate gastrointestinal disorders. By administering a protease-treated antibody, or by administering a protease with an antibody, it is possible for each component to exert its separate action, and it is also possible that at least part of the specific antibody is affected. Assure. This is especially beneficial in neonates with low gastric and intestinal proteolytic activity due to developmental immaturity (Moughan PI. Et al., In. Nutritional Triggers for Health and in Disea se; Simopoulos AP. (ED) Worlds Rev. Nutr. Diet. Basel, Karger, 67, 40-113), and also in adults where gastric stasis can inhibit the retention of the integrity of the ingested antibody. In the newborn, gastric and pancreatic secretory activity is not fully developed, plus the pH of the gastric juice is relatively high; therefore, it does not trigger the release of pancreatic enzymes, which results in pepsin activation. Is too expensive. Furthermore, during development, the enzyme chymosin appears before pepsin; chymosin can aggregate milk but cannot cleave antibodies. Therefore, neonatal colostral antibodies are likely to pass through the stomach without degradation. The late appearance of pepsin (starting approximately 1 week after birth) was previously considered an advantage because the antibody was not destroyed in the stomach (Foltman, B., 1975, In. Proc. 3rd Int). Semin.Dig.Physiol.Pig., Iust, jorgensen, Fernandez (Eds), 120-123, National Institute of Animal Science, Copenhagen). Therefore, particularly surprisingly, we have found that the administration of proteolytic enzyme-treated colostrum antibodies has a beneficial effect in neonatal piglets. Since treatment with pepsin-digested antibodies develops a distinctly beneficial gastrointestinal gram-positive flora (Lactobacillus, Streptococcus, or both), the present invention provides that exogenous cultures of these microorganisms are treated with proteases. It is proposed that administration with a treated antibody will improve the chances of colonization. Cultures of Lactobacillus and Streptococcus, although with limited success, are currently used commercially to control diarrheal disease in piglets and other species. These cultures are called probiotics. A major problem with the therapeutic function of probiotic agents is the difficulty of establishing these strains in GIT (Cain, C., 1988, Observations of indigenous and non-indigenous lactic acid bacteria as potential Probiotic organisms). in pigs., Masters Thesis, School of Agriculture, La Trobe University). The present invention provides a means to improve colonization of the intestinal tract by symbiotic strains and prolong the duration of disease protection afforded by oral administration of antibodies. The use of pepsin-treated antibodies in newborns and the use of undigested antibodies in adults with probiotic agents can be used to treat both gastric and intestinal infections. The combination of antibody and a suitable probiotic agent will greatly reduce the need for continuous antibody therapy. SUMMARY OF THE INVENTION In one aspect, the present invention is a method of treating or controlling gastrointestinal disorders in an animal, wherein the animal in need of such treatment has been treated with a suitable proteolytic enzyme. There is provided a method comprising the step of administering an effective amount of antibody or administering a proteolytic enzyme together with an effective amount of antibody. The present invention is applicable to the treatment of a wide range of animals including pigs, cows, sheep, horses, birds and humans. It is particularly suitable for the treatment of newborn animals and humans. Microorganisms responsible for gastrointestinal disorders that can be treated or prevented include, but are not limited to, Helicobacter pylori, Escherichia coli, and rotavirus. Antibodies suitable for use in the present invention need not be purified and can be derived from immune serum or immune colostrum, or from the immunized avian yolk, or as monoclonal antibodies or bioengineered. Antibody may be used. The only requirement is antibody specificity for the pathogen. Colostrum obtained from immunized dairy animals such as cows, sheep or goats are particularly suitable for use in the present invention. The antibody may be IgG, IgA or IgM, but is preferably IgG 1 And most preferably bovine IgG 1 Is. If the antibody is derived from egg yolk, it is preferably Igγ. Suitable proteolytic enzymes for use in the present invention are pepsin, papain, bromelain, fungal proteases and trypsin. Pepsin is preferred because it is easy to control the digestion (cleavage) reaction and is inexpensive and powerful. The concentration of proteolytic enzyme should not be so high or the digestion time should be long enough that the antibody is totally degraded; those skilled in the art will be familiar with routine trial and error experiments. The concentration could be determined. In another aspect, the invention is a method of treating or preventing gastrointestinal disorders in an animal, wherein an effective amount of a proteolytic enzyme treated in combination with a symbiotic microorganism is administered to an animal in need of such treatment. Or a proteolytic enzyme together with an effective amount of the antibody. The commensal microorganism may not be a member unique to the healthy solid mucosal flora of the animal species to be treated, but is suitably a microorganism naturally present in this animal species. Preferably, this commensal microorganism is Lactobacillus or Streptococcus. A mixture of two or more symbiotic microorganisms may be flowed. In any aspect, the methods of the invention may be used in combination with other treatments such as antibiotic therapy. Optionally, additional proteases may be separately administered to affect the mucosal properties that favor chemical interactions between the pathogenic microorganism and the host. For the purposes of this specification, the terms "proteolytic enzyme" and "protease" should be interpreted synonymously. Although the present invention has been described in detail with respect to gastrointestinal diseases, the present invention is applicable to the treatment or prevention of diseases at other sites caused by microorganisms derived from the gastrointestinal tract of animals affected by the diseases. It will be clearly understood. Depending on the type of activity of the protease used for immunoglobulin pretreatment, the antibody and protease may have to be dosed separately. The method of the invention is for the treatment of the treatment of immunocompromised patients particularly susceptible to infection, such as patients with AIDS-related complications or AIDS or patients with extensive burns or burns, or the treatment of patients with gastrointestinal malabsorption syndrome. Is suitable. In addition, the method of the present invention uses H that inhibits acid secretion in the stomach, such as Tagamet. 2 It is suitable for the treatment of patients who have diarrhea as a side effect because they are receiving a receptor antagonist. In a second aspect, the invention provides a composition for treating or preventing gastrointestinal disorders in an animal, comprising: a) an effective amount of antibody pretreated with a proteolytic enzyme, or b) an effective amount of the antibody. Compositions containing either of the proteolytic enzymes together and, optionally, a symbiotic microorganism in association with a pharmaceutically acceptable carrier are provided. In a preferred embodiment suitable for administration to adult patients, the formulation is such that the protease is enteric coated or buffered and suspended in a buffered liquid dosage form with or separately from the antibody. A turbid, two-part liquid formal is provided. In another embodiment, the formulation is a multi-layer tablet optionally coated with an enteric coating, wherein the enzyme forms the innermost layer and the antibody forms the outer layer, preferably isolated from the enzyme. possible. Conventional fillers, granulating agents and shaping agents may be present. Variations will be apparent to those of skill in the art. The invention also provides a formulation for use in the above method. The particular dosage form will depend on the type of antibody and protease, and can be devised by known formulation principles and routine trial and error experiments. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be illustrated according to examples, but these examples do not limit the present invention. Example 1: Use of pepsin-digested antibody to suppress diarrheal disease in pigs This experiment shows that passive immunoprotection of piglets upon challenge with pathogenic E. coli was specifically formulated for use in piglets. Investigate whether whole antibodies purified from the same batch of colostrum contained in an energy colostrum substitute, or as the peptide digest of a purified antibody preparation, were best achieved with whole antibodies It was for. <Materials and methods> Antibody therapy These consist of 6 x 20 ml doses given to piglets at intervals of approximately 6 hours. Piglets in the colostrum substitute group received ReSus (Nufarm Animal Healthy Pty Lt d.). ReSus is a commercial colostrum containing hyperimmune bovine colostrum derived from cattle immunized against a type of E. coli that infects piglets with multivalent whole cell and pili pili vaccines. It is an alternative. Piglets in the second treatment group received bovine colostrum antibodies derived from the same bulk batch of colostrum, where the antibodies were based on fat removal and acid casein precipitation. It was removed from colostrum. Next, the antibody-containing solution was mixed with BaCl. 2 This antibody (NH 3) is added until no precipitation occurs when added to the solution. Four ) 2 S O Four Further purification by precipitation and exhaustive dialysis against distilled water. Antibody peptide digestion of antibodies for use in piglets of the third treatment group was performed overnight at 37 ° C by using commercial pepsin at a ratio of 1 part to 5 parts antibody (Fang, WD. And Mukkur, T, K, S ,, Biocchem.J., 1976, 155, 25). All antibody-containing therapeutics were adjusted to have the same potency of blocking activity (the same activity found in ReSus) when tested in an ELISA block assay prior to use. This test uses K88 on a solid phase. * It consists of fixing Escherichia coli and adding a test antibody, anti-K88 complex, and an enzyme substrate. Piglets in the fourth (control) group were given an equal volume of commercial milk replacer without anti-K88 antibody, following the same regime as piglets treated with antibiotics. The therapeutic agent was administered by an oro-gastric tube. Also, commercial milk substitutes (manufacturer recommended amounts for newborn piglets) and bacterial challenge were given by oral-gastric tube. Piglet management Piglets born from three sows were picked at birth before the opportunity to breastfeed. The piglets were immediately weighed, ranked by weight, and divided into four weight-matched treatment groups. Pigments were individually distinguished by treatment with individually numbered colored ear tags and by treatment group. The piglets were then paired in pairs of approximately equal body weight and randomly assigned to heated cages. Approximately 2 hours after birth, piglets were given the first therapeutic dose, followed by 10 minutes after 30 minutes. Ten Hemolytic K88 + E. coli strain WG, 0149; K91; K88 ac A bacterial antigen dose of H10 was given (Tzipori et al, Aust. Vet. J., 1980, 56, 274). A second similar dose of antigen was given 24 hours later. At 48 hours of age, all piglets were sacrificed by overdose of barbiturates. Microbiological evaluation Immediately after death, intestinal scrapings were collected from the stomach as well as from three sites in the small intestine. The stomach was sampled midway around the greater curvature, while the small intestine was sampled 200 mm from both ends and midway. These sites were named site 1 (duodenal end), site 3 and site 2, respectively. 1 cm of mucosa at each site 2 The scraping from was suspended in sterile phosphate buffered saline (pH 7.2, 0.1 M). Pairwise, sheep blood and MacConkey agar were incubated aerobically at 37 ° C overnight according to the method of Miles and Misra, 1932, and Rogosa and Trypticase Trypticase. Bacteria were counted using Soya Ager; TSK); incubated aerobically and anaerobically at 37 ° C for 48 hours. Counts of large hemolytic colonies on blood agar (some of which were confirmed to be challenged by slide aggregation) and small colonies (likely Streptococcus) were performed. E. coli type counts (lactose fermentation and non-fermentation) on MacConkey agar were performed, and Lactobacillus counts from Rogosa agar. TSA was used to assess total bacterial count. Logosa and TSA counts were similar when aerobically or anaerobically incubated. Total numbers were evaluated from plates aerobically incubated. Statistical analysis The log transformed bacterial counts were found to have a uniform variance for each treatment group. Therefore, they were analyzed by Analysis of Variance and spatial analysis (2D, NSW Division of Agriculture). <Results and Discussion> The results of analysis of bacterial counts are shown in Table 1-3. The results indicate that the pigs in the control group were inferior in that they had high pathogen indicators (hemolytic or E. coli counts) and low "desirable" populations of Lactobacillus or Streptococcus at all sites. Is shown. This is as expected for piglets without colostrum protection. In general, bacterial counts are high in the stomach and low in the small intestine, but counts for pathogenic strains are also high in the upper small intestine of control piglets. The effect of high gut pathogen counts in control piglets was also reflected in the appropriate conditions and faecal score values recorded for these piglets (data not shown). Streptococcus and Lactobacillus are bacterial populations of GIT that are generally associated with good health. Counts of these bacteria were high in all piglets that received antibody treatment. Table 1 shows that, within the results, low pathogen counts and high "desired flora" counts throughout GIT, particularly in piglets receiving pepsin-digested antibody. Despite the trend, purified antibody counts were shown to be not significantly improved compared to commercial colostrum substitutes. Fractionation of these counts as a ratio of desired population: undesired population (Table 2) improves the ratio following pepsin-digested antibody treatment over that obtained with undigested (purified) antibody. That is, the hemolytic: lactobacillus ratio is improved by 28.2% and the hemolytic: streptococcus ratio is improved by 21.2%. Table 3 generally shows high variability between site: site and pig: pig counts. In piglets receiving pepsin-digested antibody, the trend towards lower pathogen counts versus non-pathogen counts is a consistent pattern, but most GIT sites (12 of 16) Is clear in. In Tables 2 and 3, the difference between treated and control for each treatment is significant if it is greater than 5% LSD. These results support that pepsin-digested antibody therapy favors development of Gram-positive populations on mucosal surfaces while maintaining or improving suppression of pathogen populations. The findings obtained in this study indicate that suppression of pathogen population is effectively achieved by the specific antigen binding properties of Fab antibody fragments, while the predominant free Fc fragment in digested antibody preparations is Consistent with the hypothesis that it would be beneficial to the development of positive (with Fc receptors) mucosal flora. Example 2: Dosage form as two kinds of microcapsules in capsule shell A dosage form according to the present invention comprises a capsule shell containing the following two kinds of microcapsules (a) and (b): ) A protease selected from bromelain, pepsin or papain, which is present as a core of about 750μ in diameter coated with an enteric coating together with a binder; (b) with bovine colostrum, preferably in a non-protein matrix. An antibody such as encapsulated bovine IgG, the microcapsules having a diameter of less than 250μ. Suitable binders include starch, carboxymethyl cellulose, povidone, lactose and dextrose. Suitable enteric coatings include cellulose acetate phthalate, used with suitable film softeners such as triacetin or glycerin. The microspheres can be formed using standard equipment such as a Rota-procesor, Acromatic AG, and then coated using an Ultra Coater; Acromatic AG. Similarly, antibody microspheres are formed in the Rota Processor and a coating of bovine colostrum is applied by top spray coating. The microspheres formed in this example may be formulated as starch-based tablets. Example 3: Tablet Formulation Particularly Suitable for Adult Patients Three other tablet formulations are as follows. (A) A core of bromefine containing starch filler is coated with cellulose acetate phthalate and then with an antibody layer containing colostrum and ovalbumin. (B) Cores of bromelain, antibody, starch and ovalbumin are coated with a layer of colostrum followed by a layer of cellulose acetate phthalate. (C) Cores of bromelain, antibody, starch and ovalbumin are coated with cellulosate phthalate and then with the outer layer of colostrum. Example 4: In the formulations according to Examples 2, 3 (b) and 3 (c), the bromelain and the antibody may be replaced by an antibody pretreated with a proteolytic enzyme. It will be clearly understood that the invention is not limited, in its general aspect, to the particular embodiments described above.
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＹＤ
ＡＤＹ 9455−4Ｃ 37/54 ＡＣＪ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI A61K 39/395 9284-4C A61K 39/395 ADYD ADY 9455-4C 37/54 ACJ