【発明の詳細な説明】
組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素および
該酵素をコードするｃＤＮＡ
政府の利益の記述
本発明は、NMRDC許可番号N0014-90-J-1638により米国政府の援助を受けてなさ
れたものである。従って、米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
関連出願に関する記述
本出願は１９９２年１０月２２日に出願され、「亜Ａ型およびＡＢ型赤血球の
変換のための酵素の調製」と題された米国特許出願第07/964,756号の一部継続出
願である。
発明の分野
本発明は、血液産物中の細胞の表面からのＡ型抗原の除去に使用する組換え酵
素に関するものであり、本発明により、ある種の亜Ａ型血液産物をＯ型血液産物
に、そしてある種のＡＢ型血液産物をＢ型血液産物に変換する。さらに、本発明
は前記酵素のクローニングおよび発現方法に関する。より詳細には、本発明は、
組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素、前記組換えα
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素のクローニングおよび発現方法、およ
び前記組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を用い、該酵素を血液
産物と接触させて該血液産物中の（例えば赤血球のような）細胞の表面からＡ抗
原決定基の末端部位を除去しつつ血液産物中の細胞の構造および機能を無傷のま
ま保たせることにより、Ａ型およびＡＢ型血液産物中の細胞の表面からＡ型抗原
を除去する方法に関する。本発明の組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダー
ゼ酵素は、Ａ型およびＡＢ型血液産物中の細胞の表面からのＡ型抗原の除去に使
用されることができ、そのまま使用可能であり、かつ費用効率に優れた酵素を提
供する。本発明の組換え酵素を用いた、ある種の亜Ａ型血液産物の処理は、Ａ抗
原を有しない細胞の供給源を提供するので、その血液産物はＯ型血液産物と同様
に輸血治療に有用なものとなる。
発明の背景
本明細書において、「血液産物」という術語は、全血、ならびに赤血球および
血小板を含む、血液から誘導される細胞成分を包含する。
血液型群（血液型）は３０種類以上存在するが、最も重要なのはＡＢＯ式血液
型である。この血液型はＡ抗原および／またはＢ抗原の存在または不在に基づい
ている。これらの抗原は赤血球の表面上、ならびに全ての内皮細胞および多くの
上皮細胞の表面上に見出されている。主要な輸血用血液産物は赤血球であるが、
これはヘモグロビンを含む赤色血液細胞であり、その主たる機能は酸素の運搬で
ある。Ａ型血液はその赤血球上にＡ抗原を含んでいる。同様に、Ｂ型血液はその
赤血球上にＢ抗原を含んでいる。ＡＢ型血液は両方の抗原を含んでおり、そして
Ｏ型血液はどちらも含んでいない。
血液型構造物は糖蛋白質または糖脂質であるが、Ａ型およびＢ型の決定基また
は抗原を形作る特異的構造物を同定するために種々の研究がなされている。血液
型の特異性は炭水化物鎖の末端部の単糖類の性質および結合により決定されてい
ることが判明した。炭水化物鎖は、細胞膜の脂質二重層中に包埋されたペプチド
または脂質骨格に付着させられている。最も重要な糖（主要抗原決定基）は、Ａ
型抗原においてはＮ−アセチルガラクトサミンであり、そしてＢ型抗原において
はガラクトースであることが判明した。
Ａ型血液の主要な亜型は３種類が認められている。これらの亜型はＡ1型、Ａ
中間型（Ａint）、およびＡ2型として知られている。これら３種類の亜型を区別
する量的差異および質的差異が共に存在する。量的には、Ａ1赤血球はＡint赤血
球よりも多くの抗原性Ａ部位、即ちＮ−アセチルガラクトサミン末端残基を有し
ており、そしてＡint赤血球はＡ2赤血球よりも多くの抗原性Ａ部位を有して
いる。質的には、Ａ抗原の形成に関与する転移酵素が、Ａ1、ＡintおよびＡ2の
それぞれの間で異なっている。Ａ1細胞において見られる幾つかのＡ抗原は２つ
のＡ抗原性部位を含んでいる。
Ａ型血液はＢ抗原に対する抗体を含んでいる。反対に、Ｂ型血液はＡ抗原に対
する抗体を含んでいる。ＡＢ型血液はどちらも含んでおらず、そしてＯ型血液は
両方の抗体を有している。抗Ａまたは抗Ｂ抗体のどちらか（あるいは両方）を含
む血液を有するヒトは、対応する不適合抗原を含む血液の輸血を受けられない。
不適合血液型の輸血を受けると、受血者の抗体が輸血された不適合血液型を被覆
して、輸血された赤血球の凝集を引き起こすか、あるいは共に固着（stick）す
る。その結果は、輸血副作用および／または溶血（赤血球の崩壊）であろう。
赤血球凝集、輸血副作用および溶血を回避するために、輸血血液型は受血者の
血液型に対して交叉試験される。例えば、Ａ血液型の受血者が安全に輸血され得
るのは、適合抗原を含むＡ型血液である。Ｏ型血液はＡ抗原またはＢ抗原を全く
含まないので、全ての血液型の受血者、即ちＡ型、Ｂ型、ＡＢ型またはＯ型の受
血者に輸血されることができる。従って、Ｏ型血液は「万能（universal）」で
あり、全ての輸血に使用可能であると考えられている。故に、大量のＯ型血液を
保持することは、血液銀行にとって望ましいことである。従って、Ａ型、Ｂ型お
よびＡＢ型血液をＯ型血液に変換して万能血液産物を大量に保持することは有用
である。
Ｏ型血液の供給を増加させるある試みにおいて、ある種のＡ型、Ｂ型およびＡ
Ｂ型血液をＯ型血液に変換させる方法が開発されている。例えば、「ある種の亜
Ａ型およびＡＢ型赤血球の酵素的変換」と題され、その教示がここに参考として
取り入れられる米国特許第4,609,627号明細書（「'627特許明細書」）は、Ａint
および（Ａ2Ｂを含む）Ａ2赤血球を、Ｈ抗原型の赤血球、ならびに処理前にはそ
の赤血球表面上にＡ抗原とＢ抗原の両方を含んでいた、Ａ抗原を欠くＢ型赤血球
の組成物に変換するプロセスに関するものである。前記'627特許明細書に記載さ
れた、ＡintおよびＡ2赤血球をＨ抗原型の赤血球に変換するプロセスは、ある種
の亜Ａ型またはＡＢ型赤血球を平衡させる工程；平衡させられた赤血球を、精製
されたニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素と、Ａ抗原
をＨ抗原に変換するに充分な時間接触させる工程；赤血球から酵素を除去し、赤
血球を再度平衡させる工程を包含する。前記'627特許明細書に記載されている通
り、鳥類の肝臓（特にニワトリの肝臓）から得られるα−Ｎ−アセチルガラクト
サミニダーゼは、Ａ抗原性部位の酵素的変換または開裂において優れた活性を有
している。
本発明がなされるまでは、供給源である鳥類の肝臓から前記酵素を精製するこ
とが必要であったが、そのプロセスは時間が掛かり、かつ費用のかさみがちなも
のであった。故に、より容易に利用し得る酵素の供給源を開発する必要が生じて
いた。さらに、血液産物の変換に有用であり、費用効果に優れた酵素を開発する
必要が生じていた。
単純化された精製プロセスは、１９９２年１０月２２日に出願され、「亜Ａ型
およびＡＢ型赤血球の変換のための酵素の調製」と題された、本願の関連出願で
ある米国特許出願第07/964,756号明細書に記載されている。このプロセスは、前
記関連出願明細書に記載されている通り、ニワトリの肝臓を酵素の供給源として
利用するために多数の精製工程を必要とする。この単純化されたプロセスにもか
かわらず、より容易に利用可能であり、かつ制御された酵素の供給源、即ちクロ
ーニングされ、かつ発現される酵素の提供が依然として望まれている。そのよう
な酵素は、より均質であり、かつさらに減少した精製工程数でより少ない費用に
て容易に精製される、酵素供給源を提供する。さらに、組換えられ、クローニン
グされた酵素は、特定蛋白質配列の改変を可能にするが、そのような改変は、最
適化された特異的活性、基質特異性およびｐＨ範囲を有する酵素を生成すること
を可能にする。
α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン
糖基（sugar group）を開裂する能力により特徴付けられている（そしてそれに
より名付けられている）。これらの酵素の単離または同定において、それらの能
力は合成基質の開裂を評価することにより実験室にて評価される。この合成基質
は前記酵素により開裂される糖基を擬態しており、標的糖基のｐ−ニトロフェニ
ルグリコピラノシド誘導体が汎用されている。酵素の同定および単離手順におい
て非常に有用ではあるが（これらの合成基質の量的開裂は異なる供給源から単離
された酵素を容易に区別する（そしてそれにより同定する）ことに使用されるこ
とができる）、これらの合成基質は、構造的に単純であり、サイズも小さく、か
つ元来関係している天然の糖蛋白質および糖脂質構造（これらが細胞表面上のＡ
抗原である）の一部だけを擬態するものである。
最初にヒツジ赤血球から単離された天然糖脂質基質は、フォルスマン抗原（グ
ロボペンタグリコシルセラミド）である。フォルスマン抗原基質は、天然Ａ抗原
糖脂質基質を適当に擬態するので、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素
のＡ抗原基質に対する活性を予測することに利用される。単離されたフォルスマ
ン抗原糖脂質は、血清補体の存在下に、免疫ウサギ抗Ａ血清によるヒツジ赤血球
の溶血を阻害することが示されている。
α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、（上記した）ニワトリ肝臓以
外に、細菌、軟体類、ミミズおよびヒト肝臓を含む多数の供給源から単離されて
いる。ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、精製され、配列決定
され、クローニングされ、そして発現されている。例えば、ワンらの論文［Wang
etal.，Human α-N-Acetylgalactosaminidase - Molecular Cloning，Nucleotid
e Sequence and Expression of a Full-length cDNA，The Journal ofBiologica l Chemistry
，vol.265，No.35，pages 21859-21866（December 15，1990）］に
おいて、ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼをコードするｃＤＮＡの配
列が決定されている。また、ツジらの論文［Tsuji et al.，MolecularCloning o
f a Full-Length cDNA for Human α-N-Acetylgalactosaminidase（α-Galactos
idase B），Biochemical And Biophysical Research Communications，vol.163
，No.3，pages 1498-1504（September 29，1989）］において、ヒトα−Ｎ−ア
セチルガラクトサミニダーゼをコードするｃＤＮＡの配列が決定されている。ヒ
トα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配
列の双方がそれらの論文により公表されている。さらに、国際特許出願第92/079
36号明細書は、ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼをコードするｃＤＮ
Ａのクローニングおよび発現を開示している。
ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、精製され、配列決定され、ク
ローニングされ、そして発現されてはいるが、それは血液産物中の細胞の表面か
らのＡ抗原の除去に使用するに適したものではない。酵素が細胞表面からのＡ抗
の除去に使用するに適しているか否かを決定するに際しては、次のような酵素特
性を考慮しなければならない：即ち、基質特異性、特異的活性または基質開裂反
応の速度、および至適ｐＨである。基質特異性はＫｍ値により測定されるが、こ
の値は特定の基質に対する酵素の結合定数または親和性を測定したものである。
Ｋｍ値が低いほど、酵素はその基質と強く結合している。酵素開裂反応の速度は
、基質の飽和濃度における反応速度であるＶmaxにより測定される。より高いＶm
axはより速い開裂速度を示す。これら２種類の変数の比率、Ｖmax／Ｋｍは与え
られた基質との反応（開裂）における酵素の総合的な効率の測定値である。より
高いＶmax／Ｋｍはより高い酵素効率を示す。好結果を生み、かつ臨床的に適用
可能な細胞表面からのＡ抗原の除去のためには、酵素は、処理される細胞が維持
され得るｐＨまたはそれ以上のｐＨにおいて充分に活性でなければならない。上
記'627特許明細書に記載された手順は、細胞の処理がｐＨ５.６またはそれ以上
であることを要求している。従って、適当な酵素の至適ｐＨは、このｐＨにおい
て充分な酵素活性を備えていなければならない。ヒトα−Ｎ−アセチルガラクト
サミニダーゼにおけるこれらの特定の特性（Ｖmax／Ｋｍ、Ｖmax、Ｋｍおよび至
適ｐＨ）は、ディーンらの論文［Dean et al.，Studies on Human Liver α-gal
actosidases，The Journal of Biological Chemistry，vol.254，No.20，pages
10001-10005（1979）］において報告されている。
ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼのフォルスマン抗原に対するＶma
x／Ｋｍ値は０.４６であり、ニワトリ肝臓酵素のＶmax／Ｋｍ値である５.０と比
較すると、効率において約１０倍の差があることを示している。ニワトリ肝臓酵
素では、ヒト酵素と比較して、Ｋｍが低く、かつＶmaxが高い。さらに、ヒトα
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼはフォルスマン抗原に対して３.９という
至適ｐＨを有しているが、ニワトリ肝臓のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダー
ゼでは４.７である。これらの酵素特性の全てにおいて、ニワトリ肝臓の酵素と
比較すると特に、ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素はＡ抗原の除
去には適していない。
結果として、血液産物中の細胞の表面からＡ抗原を除去することが可能な酵素
であって、容易に利用可能かつ費用効果に優れた酵素を開発する必要が依然とし
て存在した。
従って、本発明の目的は、血液産物中の細胞の表面からのＡ抗原の除去に使用
するための組換え酵素を提供することである。
本発明の別の目的は、血液産物中の細胞の表面からのＡ抗原の除去に使用する
ための組換え酵素であって、容易に利用可能であり、かつ費用効果に優れた条件
で製造され得る酵素を提供することである。
本発明のさらなる目的は、血液産物中の細胞の表面からのＡ抗原の除去に有用
な組換え酵素をクローニングする方法および該酵素を発現する方法を提供するこ
とである。
本発明のさらに別の目的は、組換え酵素を用いて血液産物中の細胞の表面から
Ａ抗原を除去する方法を提供することである。
図面の簡単な説明
上記した簡単な記述、ならびに本発明のさらなる目的および特徴は、説明のた
めの、本発明の現時点における好ましい実施例の下記の詳細な記述を、添付図面
と関連づけて参照することによって、より完全に理解されるであろう。添付図面
について述べる。
図１は、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼｃＤＮＡのクロ
ーニングおよび配列決定に用いた戦術の線図を表している。
図２は、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼｃＤＮＡのクロ
ーンの核酸配列および推定アミノ酸配列を表している。
図３は、ウエスターンブロットにより示した、細菌およびウサギ網赤血球溶解
物におけるニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの発現を表して
いる。
図４は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとα−ガラクトシダーゼとの
間での相同比較を表している。
そして、図５は、ウエスターンブロットにより示した、酵母におけるニワトリ
肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの発現を表している。
発明の概要
本発明は、組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素に
関するが、該酵素は約４５ｋＤａの分子量を有し、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミニダーゼに特異的な抗体と免疫反応性であり、かつまたヒトα−
Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素と約８０％相同であるアミノ酸配列を有
するものである。本発明の組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼ酵素は、図２に描かれた、アミノ酸番号１からアミノ酸番号４０６までの
アミノ酸配列を有する。本発明は、さらに、組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミニダーゼ酵素のクローニング方法および該酵素の発現方法、なら
びに該酵素を用いて血液産物中の細胞の表面からＡ抗原を除去してある種の亜Ａ
型の前記血液産物をＯ型に変換させ、それによりその血液産物を輸血治療用とし
て万能とするための、該酵素の使用方法に関する。
発明の詳細な説明
本発明は、血液産物中の細胞の表面からＡ抗原を除去して、それによりある種
の亜Ａ型血液産物をＯ型血液産物に変換し、そしてある種の亜ＡＢ型血液産物を
Ｂ型血液産物に変換するために使用する組換え酵素に関する。本発明の組換えニ
ワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、約４５ｋＤａの分子
量を有し、かつニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに特異的な
抗体と免疫反応性である。さらに、本発明の組換え酵素は、ヒトα−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミニダーゼ酵素と約８０％相同であるアミノ酸配列を有する。本発
明の組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、下記の
核酸配列および推定アミノ酸配列を有する。
ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼをコードする配列を含む
ＤＮＡベクターは、ブダペスト条約に従い、１９９３年３月１７日に、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（The American Type Culture Collecti
on，Rockville，Maryland）に寄託され、１９９３年３月２２日に試験されて生
存可能であることが確認され、そしてＡＴＣＣ番号７５４３４としてカタログに
掲載されている。
本発明の組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、
クローニングおよび発現されることができるので、血液産物中の細胞の表面から
のＡ抗原の除去に使用するために容易に利用可能である。本発明の酵素は、次の
ようにしてクローニングおよび発現されることができる。即ち、ニワトリ肝臓ｃ
ＤＮＡのライブラリーをスクリーニングしてニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラ
クトサミニダーゼをコードするｃＤＮＡ配列を入手し、それが特定されたならば
該酵素をコードするｃＤＮＡの配列を決定し、該ｃＤＮＡをクローニングし、そ
してクローニングされたｃＤＮＡから得られるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼを発現させる。これは、次のようにして実施され得る。即ち、スクリーニ
ングプローブとして使用可能な増幅されたヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼ断片を入手し、例えば上記の如きニワトリ肝臓ｃＤＮＡのライブラリーを
前記増幅されたヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ断片をプローブとし
て用いてスクリーニングすることにより、ニワトリ肝臓ｃＤＮＡのライブラリー
の、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼをコードするｃＤＮＡ
配列を入手し、その酵素をコードするｃＤＮＡの配列を決定し、該ｃＤＮＡをク
ローニングし、そしてクローニングされたｃＤＮＡから得られるニワトリ肝臓α
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を発現させる。あるいは、スクリーニ
ングは、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを認識する抗体を
用いて実施されることもできる。
当業者に周知の方法が発現ベクターの構築に使用され得るが、そのベクターは
、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼをコードする配列を、前
記
酵素発現のための適当な転写シグナル／翻訳シグナルと共に、対応する発現系内
に含む。適当な生物、細胞株および発現系は次のものを含む：ウサギ網赤血球溶
解物のような非細胞系、大腸菌（E．coli）のような原核細菌、酵母、昆虫細胞
、（ヒト肝細胞または成体チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む）
ほ乳類細胞、植物細胞または植物体（systems）等の真核細胞、ならびに卵母細
胞および遺伝子導入動物を含む動物体。
ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ全体をコードする配列ま
たはその機能的等価物の機能性断片が、機能的に活性な酵素を対応する発現系内
で生産するための上記発現ベクターを構築するために使用されることができる。
ＤＮＡコードの縮重のために、実質的に同一のアミノ酸配列をコードする別のＤ
ＮＡ配列が使用され得ることが予想される。さらに、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセ
チルガラクトサミニダーゼ酵素のアミノ酸配列を変え、機能的に活性な酵素の発
現をもたらす変化が、ＤＮＡをコードする配列に対して導入され得る。特に、置
き換えられるアミノ酸との類似、とりわけ電荷、極性、疎水性、親水性およびア
ミノ酸側鎖のサイズの類似に基づくアミノ酸置換が、導入され得る。
一旦、組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素がクロ
ーニングされ、そして発現されたならば、該酵素を用いて血液産物中の細胞の表
面からＡ抗原を除去することができる。ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクト
サミニダーゼを利用して赤血球表面からＡ抗原を除去する方法は、「ある種の亜
Ａ型およびＡＢ型赤血球の酵素的変換」と題され、１９８６年９月２日にゴール
ドシュタイン（Goldstein）に対して認可された米国特許第4,609,627号明細書中
に見出され、その教示がここに参考として取り入れられる。赤血球表面からＡ抗
原を除去するに充分な期間にわたり、赤血球を本発明の組換えニワトリ肝臓α−
Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素と接触させることにより、亜Ａ型抗原を
赤血球表面から除去することができる。
実施例
ニワトリ肝臓ｃＤＮＡクローンの単離および特性付け
ニワトリ肝臓のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを精製して均質にした
。
この酵素は、８０ｋＤａの分子量を有する糖蛋白質であり、そしてｐＨ７.５に
おいて２つの相同なサブユニットに解離した。合成基質であるｐ−ニトロフェニ
ル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−ピラノシドの開裂のための至適ｐＨは
３.６５であり、その活性はｐＨが７を越えると急激に下降した。精製したニワ
トリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼから得たＮ−末端配列は、ツジ
ら（Tsuji et al.）およびワンら（Wang et al.）の論文に記載されたヒトのα
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼｃＤＮＡのクローンから推定される対応配
列と高い相同を示した。
ニワトリ肝臓のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに対するｃＤＮＡのク
ローンを単離および特性付けするために、上述のワンらの論文に記載のヒトα−
Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ配列の６８８〜７０５番および１２１９〜１
２３６番のヌクレオチドに相当する２つのオリゴヌクレオチドを合成した。テン
プレートとしてヒト胎盤のｍＲＮＡ（Clontech製）を用い、下流の（Ｃ−末端）
オリゴヌクレオチドから特異的ｃＤＮＡを作製した。次いで、ヒトα−Ｎ−アセ
チルガラクトサミニダーゼの６８８〜１２３６番の残基に相当するＤＮＡ断片を
、前記ｃＤＮＡから、ホットスタートＰＣＲ法（hot-start PCR technique）に
より増幅した。ＰＣＲ反応混合物を９５℃で５分間予熱し、そしてＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（Promega製）を添加してそれよりも低い温度下で生じたかもしれ
ない非特異的アニーリングを減少させる間、８０℃に維持した。その後、３５サ
イクルの増幅を次の如くして実施した：９４℃に１分間、５０℃に２分間そして
７２℃に３分間。後記の全ての実験において、同一のＰＣＲ条件を適用した。
次に、ＰＣＲにより増幅した断片を、放射能標識プローブとして、相同ハイブ
リダイゼーションに基づくニワトリ肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene製）
のスクリーニングに用いた。このライブラリーを含むフィルターと前記プローブ
とのハイブリダイゼーションを、４２℃で一晩、５０％ホルムアミド、５倍濃度
のSSPE、５倍濃度のデンハート液（Denhardt's）、０.１％ＳＤＳおよび０.１mg
/mlサーモン精子ＤＮＡの溶液中で行った。次いで、フィルターを次のようにし
て洗浄した。
１． ３倍濃度のＳＳＣと０.１％ＳＤＳで２０分間、室温
２． ２倍濃度のＳＳＣと０.１％ＳＤＳで２０分間、室温
３． １倍濃度のＳＳＣと０.１％ＳＤＳで２０分間、５６℃
４． １倍濃度のＳＳＣと０.１％ＳＤＳで２０分間、５６℃
このフィルターを−７０℃で一晩、オートラジオグラフィーに供した。陽性ク
ローンを選抜して、同一の手順により引き続き実施した２回目のスクリーニング
に供した。全体として、３回の連続的なスクリーニングを実施して充分に単離さ
れた陽性クローンを得た。
スクリーニングされた約百万のプラークから、１つの陽性クローンをうまく単
離した。配列決定のデータは、このクローンが、１.２ｋｂの３'−非翻訳領域と
、ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼと高度に均質である０.７ｋｂの
コード領域からなることを示した。失われたコード配列を得るために、この１.
９ｋｂのｃＤＮＡクローンをプローブとして用いて、前記ライブラリーを再度ス
クリーニングした。しかし、この方法では陽性クローンは同定されなかった。
そこで、２個目のニワトリ肝臓ｃＤＮＡのライブラリー（Clontech製）の多重
増幅（multipe amplifacion）（ネストＰＣＲ法：the nested PCR technique）
を実施して上流部分のｃＤＮＡ配列を入手した。図１は、ニワトリ肝臓α−Ｎ−
アセチルガラクトサミニダーゼｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定に用いた
戦術の線図を表している。ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ
をコードするｃＤＮＡは、１.２ｋｂのコード領域（斜線部分）と１.２ｋｂの３
'−非翻訳領域とを含んでいた。線図底部の矢印は配列決定戦術を示している。
ＣＬ１、ＣＬ２およびＣＬ３はネストＰＣＲのためのプライマーとして使用した
オリゴヌクレオチドである。ＣＬ１およびＣＬ２はそれぞれ、９２４−９４１ｎ
ｔおよび７３６−７５３ｎｔ部位に位置している（図２参照）。天然のニワトリ
肝臓酵素の配列に従い、オリゴヌクレオチドＣＬ３［5'-CTGGAGAAC(T)GGA(GC)CT
GGCT(CA)CG］を、ニワトリのコドン使用法および「最善の推測」を勘案して設計
した。
１回目のＰＣＲ増幅では、１種類の特異的プライマー（ＣＬ１）（図１参照）
とライブラリーベクターから誘導された１種類の万能プライマー（5'-CTGGTAATG
GTAGCGACC）の存在下に、ｃＤＮＡライブラリー全体をテンプレートとして用い
た。上記反応からの少量のアリコートを取り、直ぐに、別のプライマーの組合せ
を用いた２回目の増幅に供した。プライマーＣＬ２はＣＬ１の上流に位置する配
列を有するものであり（図１参照）、そして第２のプライマーであるＣＬ３は精
製されたニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼから得られたＮ−
末端アミノ酸配列に基づいて設計したものであった。７５０ｂｐ断片の配列を決
定して、存在するかもしれないＰＣＲ人工産物を排除した。この７５０ｂｐ断片
は、ライブラリーのスクリーニングにより単離された１.９ｋｂのクローンと部
分的に重複していたので、これらの２つの断片をＰＣＲにより互いに結合させて
ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼをコードするｃＤＮＡを再
構築した。このＤＮＡの配列決定を標準的な手順に従い実施し、かつそのコード
領域を両方の方向から配列決定した。
ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼをコードする
クローンＤＮＡ
ｃＤＮＡの信頼性を、推定アミノ酸配列と、精製したニワトリ肝臓α−Ｎ−ア
セチルガラクトサミニダーゼからのＮ−末端配列およびＣＮＢｒ−切断ペプチド
配列との共直線性により確かめた。図２は、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラ
クトサミニダーゼｃＤＮＡのクローンの核酸配列および推定アミノ酸配列を表し
ている。図２中の下線領域は、ニワトリ肝臓から精製した酵素のＮ−末端断片お
よびＣＮＢｒ−誘導断片から得られた配列と一致した。サブクローン中に最上流
の３つのヌクレオチドATGを添加して、蛋白質発現のための翻訳開始コドンとし
て与えた。２２９９−２３０４ｎｔ部位のポリアデニル化信号（AATAAA）に、二
重下線を付した。線で囲った配列は、Ｎ−グリコシル化に関与すると思われる部
位を示している。ｃＤＮＡによれば４０５アミノ酸からなる成熟蛋白質は約４５
ｋＤａの分子量を有しているが、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた評価による精
製酵素のそれと一致する。クローニング法を適用したので、ｃＤＮＡの５'末端
配列はニワトリ肝臓から単離した成熟酵素のＮ−末端配列に対応していた。
ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼをウサギ網赤血球溶解物
中で発現させるために、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを
コードする領域を含む、１番から１２６０番までのヌクレオチドを有する配列を
、この挿入配列の上流にＴ７プロモーターが位置する方向で、ベクタ−PCR-II（
Invitrogen製）内にサブクローニングした。成熟蛋白質のＮ−末端部はロイシン
から始まるので、サブクローン構築中に、翻訳開始コドンであるATGを添加した
。次に、構築物を、転写−翻訳を結合させたシステムであるＴＮＴシステム（Pr
omega製）においてテンプレートとして使用し、製造者の推奨する手順に従って
蛋白質を発現させた。
α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを細菌内で大量に生産し、１工程でそ
の酵素を精製するために、ｃＤＮＡをpTrchisベクター（Invitrogen製）のEcoRI
認識部位にサブクローンして、大腸菌（E．coli）内で発現させた。ベクターの
有する配列に起因して、発現した酵素はそのＮ−末端部にポリヒスチジン−タグ
を含んでいた。これは、アフィニティークロマトグラフィーを用いた１工程の精
製による粗細胞溶解物からの酵素の精製を可能にする。
図３は、ウエスターンブロットにより示した、細菌およびウサギ網赤血球溶解
物におけるニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの発現を表して
いる。レーン１〜４は、ウサギ網赤血球溶解物における発現結果を示している。
この発現は、発現プラスミドと共に（レーン１）またはこれを同伴せずに（レー
ン２）、35Ｓ−メチオニンの存在下に溶解物中で実施した。次いで、５μｌの反
応試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動ゲルを乾燥させ、２時間オート
ラジオグラフィーにかけ、そして約４５ｋＤａの見かけ上の分子量のバンドを発
現プラスミド（レーン１、図３参照）で視覚化した。発現蛋白質の信頼性を確認
するために、ニワトリ肝臓から精製したα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ
に対して誘発したポリクローナル抗体を用いて、ウエスターンブロットを実施し
た。標識メチオニンの代わりに非標識メチオニンを用いて同じ発現反応を行い、
そのウエスターンブロット（Promega製）の結果をレーン３および４に示した。
レーン３は発現プラスミドを伴い、そしてレーン４は発現プラスミドを伴ってい
なかった。図３に示した如く、抗体は、発現プラスミドとの反応によるバンドを
特異的に認識した（レーン３）が、対照においては認識しなかった（レーン４）
。レーン５は、蛋白質が細菌内で発現し、そしてウエスターンブロットにおいて
前
記と同一の抗体により認識されたことを示している。レーン６は、陽性対照とし
て、ニワトリ肝臓から精製したα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを示して
いる。分子量サイズマーカー（ｍ）を図中左部に示した。これらのことより、単
離したｃＤＮＡクローンがニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ
をコードしていることが確認された。
ニワトリ肝臓配列のクローンと他の酵素配列との比較
ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ配列を、α−ガラクトー
ス糖基を開裂する、他のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラ
クトシダーゼの公表された配列と、比較した。図４は、種々のα−Ｎ−アセチル
ガラクトサミニダーゼとα−ガラクトシダーゼとの間での相同比較を表している
。位置合わせ（alignment）は、コンピュータープログラムＰＲＯＳＩＳ（Hitac
hiSoftware Engineering Corp.，Ltd.製）および手動調整の双方を用いて行った
。アミノ酸配列はｃＤＮＡから推定した。配列ＩおよびIIは、それぞれニワトリ
肝臓およびヒト胎盤からのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの配列である
。配列III、IV、VおよびVIは、それぞれヒト、酵母、グアー（Cyamopsis terrag onoloba
）および黒麹菌（Aspergillusn iger）からのα−ガラクトシダーゼの配
列を示している。配列IVおよびVIは、★★により示される如く、Ｃ−末端部で短
縮されている。並べた蛋白質配列の中で、同一または控えめに置換されたアミノ
酸残基（５/６以上）を線で囲んだ。配列上部の番号は各ペプチド配列の相対位
置を示している。
ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼｃＤＮＡから推定された
アミノ酸配列は、ＰＲＯＳＩＳによる測定で、ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサ
ミニダーゼと約８０％の相同を示した。この相同は、ヒト酵素とニワトリ肝臓酵
素との同族性を示しているが、特にフォルスマン抗原の開裂の点において、既述
の如く、酵素の種に特有な性質は異なっている。また、ニワトリ肝臓α−Ｎ−ア
セチルガラクトサミニダーゼ酵素に対して誘発したポリクローナル抗体はヒト酵
素と交叉反応しない。これらのことは、上記相違に関与する特定のアミノ酸の存
在により説明される。
ヤマチら（Yamachi et al.，1990）は、ＣＯＳ細胞内における一過性発現研究
において、図４中の番号３７６に相当する位置に７０ｂｐの挿入を有するヒトα
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは酵素的に活性ではないことを報告してい
る。このデータは、分子のＣ−末端部分における前記挿入に起因するオープンリ
ーディングフレームのシフトが、酵素活性の喪失に関与していることを示唆して
いるが、これは、Ｃ−末端領域のアミノ酸がα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダ
ーゼ酵素活性にとって決定的である可能性を示すものである。
利用可能な蛋白質データベースの配列類似性探索（BLAST）（Altschul et al.
，1990）およびそれに続くＰＲＯＳＩＳコンピュータープログラムおよび手動調
整を用いた配列の位置合わせにより、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが
、ヒト、酵母、グアー（Cyamopsis terragonoloba）および黒麹菌（Aspergillus niger
）からのα−ガラクトシダーゼと高度に相同である（アミノ酸レベルで５
５〜６８％の範囲）ことが判明した。このアミノ酸相同の程度は、図４に示すと
おり、これら２つの機能的に特異なグリコシダーゼが共通の祖先遺伝子から進化
したであろうことを示唆している。類似性の高さおよびそれらの酵素の基質の性
質を考慮すると、これら２つのエキソグリコシダーゼが類似の触媒機構を共有し
、そして双方の活性部位内に必須なアミノ酸残基はよく保存されている可能性が
ある。ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼｃＤＮＡをこのファ
ミリーへ入れることにより、基質結合特異性および酵素活性にとって重要な分子
領域に対する、さらに深い考察が可能になる。多数の供給源からのクローン酵素
が本発明により利用可能となるので、ｃＤＮＡ欠失法および位置指定突然変異導
入法の手段を用いることにより、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素お
よびα−ガラクトシダーゼ酵素の活性部位および触媒機構が研究可能となる。
活性α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの酵母内における発現
シグナルペプチド配列に相当する、ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダー
ゼｃＤＮＡ最上流の４８ヌクレオチド（Wang et al.，1990）を、クローニング
したニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼコード領域に、ＰＣＲ
法により結合させた。ＰＣＲによる増幅産物をそのままベクターPCR-II（Invit
rogen製）にサブクローンした。挿入物の側面に位置する２つのEcoRI認識部位を
用いてα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼｃＤＮＡ全体を酵母発現ベクター
pYES2（Invitrogen製）にサブクローンしたが、その際、挿入部の向きは、挿入
物の上流部にＧＡＬ１プロモーターが位置する向きとした。ＧＡＬ１プロモータ
ーは、酵母内でガラクトースが誘導される生長条件下で、挿入されたｃＤＮＡク
ローンを発現させた。
酵母ベクター構築物を標準的な手順で導入してINVSCI酵母株（Invitrogen製）
を形質転換させた。酵母におけるニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼの発現を確認するために、細胞抽出液および培養懸濁液から全ての蛋白質
を収集し、それを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして精製したニワト
リ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに対して誘発したポリクローナル
抗体を用いた（標準的条件の）ウエスターンブロットに供した。形質転換した酵
母細胞は、ウラシルを含まない培地（Bio 101，Inc.製）中で生長した。０.２％
ガラクトースに感応させた後、細胞を遠心分離に供し、そして蛋白質抽出液をガ
ラスビード分断法を用いて調製した。培養懸濁液中の分泌蛋白質をセントリコン
−３０（Centricon-30，Amicon Division，W.R．Grace & Co．製）を用いて濃縮
した。ウエスターンブロットの結果を図５に示す。
図５のレーン１および８は、ニワトリ肝臓から精製したα−Ｎ−アセチルガラ
クトサミニダーゼを示している。レーン２〜４は、３つの異なるpYES2構築物で
形質転換された酵母からの細胞抽出物であり、それぞれの構築物は、ベクター単
独（レーン２）、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼｃＤＮＡ
コード領域（レーン３）、およびレーン３のコード領域にシグナル配列を加えた
もの（レーン４）である。レーン５は、レーン４に用いた形質転換酵母からの培
養抽出物である。レーン７は分子量標準を示している。図５に示したとおり、シ
グナルペプチドを有しない蛋白質は酵母細胞内で発現された（レーン３）一方、
シグナルペプチド配列を有する蛋白質は殆ど培地中に分泌された（レーン５）。
ウエスターンブロット上で観察された、より高分子量の分泌蛋白質は、酵母にお
けるグアーα−ガラクトシダーゼの発現に関して観察された（Fellinger，et al
.，1991）ように、恐らくは過剰なグリコシル化に起因するものであろう。
発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを精製するために、濃縮し
た培養懸濁液を、アミノカプロイルガラクトシルアミンアガロースを含有するア
フィニティーカラムに供した。カラムを洗浄した後、結合画分を５０ｍＭ Ｎ−
アセチルガラクトサミンを含有する緩衝液で溶離した。この溶離液は発現された
α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを含むが、この発現物は、図５中のレー
ン６に明示したとおり、ニワトリ肝臓から精製した酵素の分子量と類似の分子量
である。
カラムから溶離された発現酵素は、ｐＨ３.６において、合成基質であるｐ−
ニトロフェニル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルピラノシドに対する活性を
示す。重度にグリコシル化された酵素はアフィニティーカラムに結合せず、かつ
合成基質に対する活性も全く示さなかった。データ全てを合わせると、酵母細胞
において酵素的に活性なニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの
生産、分泌および精製が示されている。
本明細書において、本発明は限られた数の実施態様に沿って記述されているが
、これらの実施態様は本発明の種々の主題を単に説明するだけのものであること
をご理解いただきたい。従って、上記の説明のための実施態様に種々の改変がな
され得ること、および本発明の主題から離れることなく別の翻案を工夫し得るこ
とをご理解いただきたい。
配列表
（１）一般的情報
（i）出願人：アレック スチュー
ジャック ゴールドシュタイン
（ii）発明の名称：組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素およ
び該酵素をコードするｃＤＮＡ
（iii）配列の数：７
（iv）連絡先：
（A）宛先：アムスター、ロシュスタイン＆アインシュタイン
（B）番地：９０パークアベニュー
（C）市町村：ニューヨーク
（D）州：ニューヨーク
（E）国：米国
（F）郵便番号：10016
（v）コンピューター読み取り様式：
（A）媒体型式：３.５インチ１.４４Ｍｂ容量フロッピーディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換
（C）オペレーティングシステム：ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウエア：ワードプロセッサー（アスキー）
（vi）現出願データ：
（A）出願番号：未確定
（B）出願日：未確定
（C）分類：未確定
（vii）先願データ：なし
（viii）弁理士／代理人情報：
（A）姓名：パスクァリーニ パトリシア A.
（B）登録番号：34,894
（C）参照／事件番号：63475/12
（ix）電話連絡情報：
（A）電話番号：(212)697-5995
（B）テレファックス番号：(212)286-0854または286-0082
（C）テレックス番号：ＴＷＸ 710-581-4766
（２）配列番号１の情報：
（i）配列の特性：
（A）長さ：2319
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（A）記載：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：Yes
（v）フラグメント型：
（vi）起源：
（A）生物名：ニワトリ肝臓
（B）株名：
（C）個体・単離クローン名：
（D）分化の程度：
（E）ハプロタイプ：
（F）組織の種類：
（G）細胞の種類：
（H）セルライン：
（I）オルガネラ名：
（vii）直接の起源：ライブラリー
（viii）ゲノム内での位置：不明
（A）染色体／セグメント名：
（B）染色体上の位置：
（C）単位
（ix）配列の特徴：
（A）名前／特徴を表す記号：ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ニダーゼ
（B）存在位置：
（C）特徴を決定した方法：
（D）他の情報：
（x）公表情報：
（A）著者：
（B）標題：
（C）雑誌名：
（D）巻番号：
（F）頁番号：
（G）発刊日：
（H）書類番号：
（I）提出日：
（J）公表日：
（K）その他の関係事項：
（xi）配列：配列番号１：
（３）配列番号２の情報：
（i）配列の特性：
（A）長さ：406
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（A）記載：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：Yes
（v）フラグメント型：
（vi）起源：
（A）生物名：ニワトリ肝臓
（B）株名：
（C）個体・単離クローン名：
（D）分化の程度：
（E）ハプロタイプ：
（F）組織の種類：
（G）細胞の種類：
（H）セルライン：
（I）オルガネラ名：
（vii）直接の起源：ライブラリー
（viii）ゲノム内での位置：不明
（A）染色体／セグメント名：
（B）染色体上の位置：
（C）単位：
（ix）配列の特徴：
（A）名前／特徴を表す記号：ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ニダーゼ
（B）存在位置：
（C）特徴を決定した方法：
（D）他の情報：
（x）公表情報：
（A）著者：
（B）標題：
（C）雑誌名：
（D）巻番号：
（F）頁番号：
（G）発刊日：
（H）書類番号：
（I）提出日：
（J）公表日：
（K）その他の関係事項：
（xi）配列：配列番号２：
（４）配列番号３の情報：
（i）配列の特性：
（A）長さ：411
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（A）記載：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：Yes
（v）フラグメント型：
（vi）起源：
（A）生物名：ヒト
（B）株名：
（C）個体・単離クローン名：
（D）分化の程度：
（E）ハプロタイプ：
（F）組織の種類：
（G）細胞の種類：
（H）セルライン：
（I）オルガネラ名：
（vii）直接の起源：ライブラリー
（viii）ゲノム内での位置：不明
（A）染色体／セグメント名：
（B）染色体上の位置：
（C）単位：
（ix）配列の特徴：
（A）名前／特徴を表す記号：ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ
（B）存在位置：
（C）特徴を決定した方法：
（D）他の情報：
（x）公表情報：
（A）著者：Wanetal.
（B）標題：Human α-N-Acetylgalactosaminidase Molecular Cloning，
Nucleotide Sequence，and Expression of a Full-Length cDNA
（C）雑誌名：Journal of Biological Chemistry
（D）巻番号：265
（F）頁番号：21859-21866
（G）発刊日：1990
（H）書類番号：
（I）提出日：
（J）公表日：
（K）その他の関係事項：
（xi）配列：配列番号３：
（５）配列番号４の情報：
（i）配列の特性：
（A）長さ：429
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（A）記載：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：Yes
（v）フラグメント型：
（vi）起源：
（A）生物名：ヒト
（B）株名：
（C）個体・単離クローン名：
（D）分化の程度：
（E）ハプロタイプ：
（F）組織の種類：
（G）細胞の種類：
（H）セルライン：
（I）オルガネラ名：
（vii）直接の起源：ライブラリー
（viii）ゲノム内での位置：不明
（A）染色体／セグメント名：
（B）染色体上の位置：
（C）単位：
（ix）配列の特徴：
（A）名前／特徴を表す記号：ヒトα−ガラクトシダーゼ
（B）存在位置：
（C）特徴を決定した方法：
（D）他の情報：
（x）公表情報：
（A）著者：Calhoun et al.
（B）標題：Fabry Disease：Isolation of a cDNA Clone Encoding Human
α-galactosidase A
（C）雑誌名：Proceedings of the National Academy of Science USA
（D）巻番号：82
（F）頁番号：7364-7368
（G）発刊日：1985
（H）書類番号：
（I）提出日：
（J）公表日：
（K）その他の関係事項：
（xi）配列：配列番号４：
（６）配列番号５の情報：
（i）配列の特性：
（A）長さ：438
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（A）記載：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：Yes
（v）フラグメント型：
（vi）起源：
（A）生物名：酵母（Saccharomyces cerevisiae）
（B）株名：
（C）個体・単離クローン名：
（D）分化の程度：
（E）ハプロタイプ：
（F）組織の種類：
（G）細胞の種類：
（H）セルライン：
（I）オルガネラ名：
（vii）直接の起源：ライブラリー
（viii）ゲノム内での位置：不明
（A）染色体／セグメント名：
（B）染色体上の位置：
（C）単位：
（ix）配列の特徴：
（A）名前／特徴を表す記号：酵母α−ガラクトシダーゼ（MEL1）
（B）存在位置：
（C）特徴を決定した方法：
（D）他の情報：
（x）公表情報：
（A）著者：Liljestrom
（B）標題：The Nucleotide Sequence of the Yeast MEL1 Gene
（C）雑誌名：Nucleic Acids Research
（D）巻番号：13
（F）頁番号：7257-7268
（G）発刊日：1985
（H）書類番号：
（I）提出日：
（J）公表日：
（K）その他の関係事項：
（xi）配列：配列番号５：
（７）配列番号６の情報：
（i）配列の特性：
（A）長さ：411
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（A）記載：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：Yes
（v）フラグメント型：
（vi）起源：
（A）生物名：グアー（Cyamopsis tetragonoloba）
（B）株名：
（C）個体・単離クローン名：
（D）分化の程度：
（E）ハプロタイプ：
（F）組織の種類：
（G）細胞の種類：
（H）セルライン：
（I）オルガネラ名：
（vii）直接の起源：ライブラリー
（viii）ゲノム内での位置：不明
（A）染色体/セグメント名：
（B）染色体上の位置：
（C）単位：
（ix）配列の特徴：
（A）名前／特徴を表す記号：グアー α−ガラクトシダーゼ
（B）存在位置：
（C）特徴を決定した方法：
（D）他の情報：
（x）公表情報：
（A）著者：Overbeeke et al.
（B）標題：Cloning and Nucleotide Sequence of the α-galactosidase
cDNA From Cyamopsis tetragonoloba（guar）
（C）雑誌名：Plant Molecular Biology
（D）巻番号：13
（F）頁番号：541-550
（G）発刊日：1989
（H）書類番号：
（I）提出日：
（J）公表日：
（K）その他の関係事項：
（xi）配列：配列番号６：
（８）配列番号７の情報：
（i）配列の特性：
（A）長さ：447
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（A）記載：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：Yes
（v）フラグメント型：
（vi）起源：
（A）生物名：黒麹菌（Aspergillus niger）
（B）株名：
（C）個体・単離クローン名：
（D）分化の程度：
（E）ハプロタイプ：
（F）組織の種類：
（G）細胞の種類：
（H）セルライン：
（I）オルガネラ名：
（vii）直接の起源：ライブラリー
（viii）ゲノム内での位置：不明
（A）染色体／セグメント名：
（B）染色体上の位置：
（C）単位：
（ix）配列の特徴：
（A）名前／特徴を表す記号：黒麹菌α−ガラクトシダーゼ
（B）存在位置：
（C）特徴を決定した方法：
（D）他の情報：
（x）公表情報：
（A）著者：den Herder et al.
（B）標題：Cloning and Expression of a Member of the Aspergillus
niger Gene Family Encoding α-galactosidase
（C）雑誌名：Molecular and General Genetics
（D）巻番号：233
（F）頁番号：404-410
（G）発刊日：1992
（H）書類番号：
（I）提出日：
（J）公表日：
（K）その他の関係事項：
（xi）配列：配列番号７：
Detailed Description of the Invention
Recombinant α-N-acetylgalactosaminidase enzyme and
CDNA encoding the enzyme
Description of government interests
This invention was made with US Government support under NMRDC Grant No. N0014-90-J-1638.
It was the one. Accordingly, the US Government has certain rights in this invention.
Description of related application
This application was filed on October 22, 1992, and is entitled "Sub-A and AB red blood cells.
Continuation of US patent application Ser. No. 07 / 964,756 entitled "Preparation of Enzymes for Conversion"
I wish.
Field of the invention
The present invention provides a recombinant enzyme for use in the removal of type A antigen from the surface of cells in blood products.
According to the present invention, certain subtype A blood products can be converted into type O blood products.
And convert certain AB blood products to B blood products. Furthermore, the present invention
Relates to a method for cloning and expressing said enzyme. More specifically, the present invention provides
Recombinant chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme, said recombinant α
-N-acetylgalactosaminidase enzyme cloning and expression method, and
And the recombinant α-N-acetylgalactosaminidase enzyme described above,
The A-antibody from the surface of cells (eg red blood cells) in the blood product in contact with the product.
The structure and function of cells in blood products are intact while removing the terminal sites of the original determinants.
To maintain the A-type antigen from the surface of cells in the A-type and AB-type blood products.
On how to remove. Recombinant α-N-acetylgalactosaminider of the present invention
Enzymes are used to remove type A antigens from the surface of cells in type A and type AB blood products.
Enzyme that can be used, is ready to use, and is cost-effective.
To serve. Treatment of certain subtype A blood products with the recombinant enzymes of the present invention is
The blood product is similar to the O-type blood product because it provides a source of non-primitive cells.
It will be useful for blood transfusion treatment.
Background of the Invention
As used herein, the term "blood product" refers to whole blood, as well as red blood cells and
It includes cell components derived from blood, including platelets.
There are more than 30 types of blood group (blood type), but the most important one is ABO blood
It is a type. This blood group is based on the presence or absence of A and / or B antigens
ing. These antigens are found on the surface of red blood cells, as well as on all endothelial cells and many
It is found on the surface of epithelial cells. The main blood product for transfusion is red blood cells,
It is a red blood cell containing hemoglobin, whose main function is oxygen transport.
is there. Type A blood contains the A antigen on its red blood cells. Similarly, type B blood
It contains B antigen on erythrocytes. AB blood contains both antigens, and
Type O blood contains neither.
Blood group structures are glycoproteins or glycolipids, but the determinants of type A and type B
Have been extensively studied to identify specific structures that form antigens. blood
Type specificity is determined by the nature and binding of the monosaccharides at the end of the carbohydrate chain.
It turned out that Carbohydrate chains are peptides embedded in the lipid bilayer of the cell membrane.
Or attached to the lipid skeleton. The most important sugar (major antigenic determinant) is A
In type A antigen it is N-acetylgalactosamine and in type B antigen
Was found to be galactose.
Three major subtypes of type A blood have been identified. These subtypes are A1Mold, A
Intermediate type (Aint), And A2Known as type. Distinguish between these three subtypes
There are both quantitative and qualitative differences. Quantitatively, A1Red blood cell is AintRed blood
Has more antigenic A-sites than spheres, ie N-acetylgalactosamine terminal residues
And AintRed blood cell is A2Has more antigenic A sites than red blood cells
There is. Qualitatively, the transferase involved in the formation of A antigen is1, AintAnd A2of
Each is different. A1Some A antigens found in cells are two
A antigenic site of
Type A blood contains antibodies against B antigen. On the other hand, type B blood is paired with A antigen.
It contains an antibody that AB blood does not contain either, and O blood does
It has both antibodies. Contains either (or both) anti-A or anti-B antibodies
Humans with empty blood do not receive transfusions of blood containing the corresponding incompatible antigen.
When receiving an incompatible blood type transfusion, the recipient antibody covers the incompatible blood type.
To cause agglutination of transfused red blood cells or to stick together.
It The result may be transfusion side effects and / or hemolysis (red blood cell breakdown).
To avoid hemagglutination, transfusion side effects and hemolysis, the transfused blood type of the recipient
Cross tested against blood type. For example, recipients of blood type A may be safely transfused
It is type A blood containing compatible antigens. O blood has no A or B antigens
As a result, it does not include all blood type recipients, that is, A, B, AB or O type recipients.
Can be transfused to a blood person. Therefore, type O blood is "universal".
Yes, and is believed to be usable for all blood transfusions. Therefore, a large amount of O-type blood
Retaining is desirable for blood banks. Therefore, type A, type B
And it is useful to convert type AB blood to type O blood to retain a large amount of universal blood products
Is.
In one attempt to increase the supply of O blood, certain A, B and A
Methods have been developed to convert B blood to O blood. For example, "some sort of
Entitled "Enzymatic Conversion of Type A and Type AB Red Blood Cells", the teachings of which are hereby incorporated by reference.
The incorporated US Pat. No. 4,609,627 (“'627 patent specification”) isint
And (A2Including B) A2Erythrocytes are the H antigen type erythrocytes, and before treatment
Type B erythrocytes lacking A antigen, which contained both A and B antigens on the red blood cell surface
Of the composition of the present invention. Described in the '627 patent specification
It was AintAnd A2The process of converting red blood cells to H antigen type red blood cells is
Equilibrating sub-A or AB red blood cells;
Chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme and A antigen
Contact with H antigen for a sufficient time to remove the enzyme from red blood cells
Re-equilibrating the blood cells. In the '627 patent specification,
, Α-N-acetylgalacto obtained from avian liver (especially chicken liver)
Saminidase has excellent activity in enzymatic conversion or cleavage of the A antigenic site.
are doing.
Until the present invention was made, it was possible to purify the enzyme from the source avian liver.
Was required, but the process was time consuming and costly.
It was. Therefore, it became necessary to develop a source of enzyme that could be used more easily.
I was there. In addition, develop cost-effective enzymes that are useful for blood product conversion
There was a need.
A simplified refining process was filed on October 22, 1992, entitled "Sub-A
And the preparation of enzymes for the conversion of type AB erythrocytes "in the related application of the present application.
It is described in certain US patent application Ser. No. 07 / 964,756. This process is
As described in the related application, chicken liver is used as a source of enzyme.
Requires multiple purification steps to utilize. In this simplified process
Nevertheless, it is a more readily available and controlled source of enzymes,
It remains desirable to provide an enzyme that is both tuned and expressed. Like that
Enzymes are more homogeneous and cost less with a reduced number of purification steps
To provide an enzyme source that is easily purified. In addition, recombined and clonin
The engineered enzymes allow modification of specific protein sequences, but such modifications are
Producing enzymes with optimized specific activity, substrate specificity and pH range
To enable.
The α-N-acetylgalactosaminidase enzyme is N-acetylgalactosamine.
Characterized by the ability to cleave sugar groups (and
More named). Their ability to isolate or identify these enzymes
Force is evaluated in the laboratory by assessing the cleavage of synthetic substrates. This synthetic substrate
Mimics a sugar group that is cleaved by the above-mentioned enzyme.
Luglycopyranoside derivatives are widely used. Enzyme identification and isolation procedures
Very useful (quantitative cleavage of these synthetic substrates can be isolated from different sources).
Used to easily distinguish (and thereby identify) the identified enzymes.
These synthetic substrates are structurally simple, small in size,
Natural glycoprotein and glycolipid structures that are originally related (these are the
(It is an antigen) that mimics only part of it.
The natural glycolipid substrate, originally isolated from sheep erythrocytes, is the Forssmann antigen (group
Lobopentaglycosylceramide). Forssman antigen substrate is the natural A antigen
The α-N-acetylgalactosaminidase enzyme is suitable because it mimics a glycolipid substrate appropriately.
Is used to predict the activity of A against the A antigen substrate. Isolated Forsuma
Antigen glycolipids were produced by sheep rabbit erythrocytes by immunized rabbit anti-A serum in the presence of serum complement.
Has been shown to inhibit hemolysis of.
The α-N-acetylgalactosaminidase enzyme is used in chicken liver (described above)
Externally isolated from numerous sources including bacteria, mollusks, earthworms and human liver
There is. The human α-N-acetylgalactosaminidase enzyme has been purified and sequenced.
Has been cloned, and expressed. For example, Wang et al.'S paper [Wang
et al., Human α-N-Acetylgalactosaminidase-Molecular Cloning, Nucleotid
e Sequence and Expression of a Full-length cDNA,The Journal of Biologica l Chemistry
, Vol.265, No.35, pages 21859-21866 (December 15, 1990)]
The cDNA encoding human α-N-acetylgalactosaminidase
The columns have been determined. Also, Tsuji et al.'S paper [Tsuji et al., Molecular Cloning o
f a Full-Length cDNA for Human α-N-Acetylgalactosaminidase (α-Galactos
idase B),Biochemical And Biophysical Research Communications， Vol.163
, No. 3, pages 1498-1504 (September 29, 1989)].
The sequence of the cDNA encoding cetylgalactosaminidase has been determined. Hi
Nucleotide sequence and amino acid sequence of α-N-acetylgalactosaminidase
Both columns are published by those articles. Further, International Patent Application No. 92/079
No. 36 is a cDNA encoding human α-N-acetylgalactosaminidase.
The cloning and expression of A is disclosed.
Human α-N-acetylgalactosaminidase was purified, sequenced and cloned.
Although it has been rolled and expressed, is it the surface of cells in blood products?
Are not suitable for use in the removal of these A antigens. The enzyme is anti-A from the cell surface
To determine whether it is suitable for use in the removal of
Must be considered: substrate specificity, specific activity or substrate cleavage reaction.
The reaction speed and the optimum pH. Substrate specificity is measured by Km value.
The value of is a measure of the binding constant or affinity of the enzyme for a particular substrate.
The lower the Km value, the more bound the enzyme is to its substrate. The rate of enzymatic cleavage reaction
, Vmax, which is the reaction rate at the saturated concentration of the substrate. Higher Vm
ax indicates a faster cleavage rate. The ratio of these two variables, Vmax / Km, is given
It is a measure of the overall efficiency of the enzyme in reacting (cleaving) with a given substrate. Than
High Vmax / Km indicates higher enzyme efficiency. Good results and clinical application
For possible removal of A antigen from the cell surface, the enzyme is maintained by the treated cells.
It must be sufficiently active at or above which it can be. Up
The procedure described in the '627 patent describes that the treatment of cells should be at pH 5.6 or above.
Is required. Therefore, the optimum pH of a suitable enzyme is at this pH.
Must have sufficient enzyme activity. Human α-N-acetylgalacto
These particular properties in saminidase (Vmax / Km, Vmax, Km and
The optimum pH is determined by Dean et al., Studies on Human Liver α-gal.
actosidases,The Journal of Biological Chemistry， Vol.254 ， No.20 ， pages
10001-10005 (1979)].
Vma of human α-N-acetylgalactosaminidase against Forssman antigen
The x / Km value is 0.46, which is in comparison with the Vmax / Km value of chicken liver enzyme, which is 5.0.
By comparison, there is a difference of about 10 times in efficiency. Chicken liver fermentation
The enzyme has a low Km and a high Vmax as compared with the human enzyme. Furthermore, human α
-N-acetylgalactosaminidase is 3.9 against Forsman antigen
Α-N-acetylgalactosaminider from chicken liver, which has an optimum pH
ZE is 4.7. In all of these enzymatic properties, with chicken liver enzymes
By comparison, in particular, the human α-N-acetylgalactosaminidase enzyme removes the A antigen.
Not suitable for leaving.
As a result, an enzyme capable of removing A antigen from the surface of cells in blood products
However, there is still a need to develop enzymes that are readily available and cost effective.
Existed.
Therefore, the object of the present invention is to use for the removal of A antigen from the surface of cells in blood products.
To provide a recombinant enzyme for
Another object of the invention is the use in the removal of A antigen from the surface of cells in blood products.
Conditions that are readily available and cost-effective as a recombinant enzyme for
It is to provide an enzyme that can be produced in.
A further object of the invention is useful for the removal of A antigen from the surface of cells in blood products.
Provide a method for cloning a recombinant enzyme and a method for expressing the enzyme
And.
Yet another object of the present invention is to use recombinant enzymes from the surface of cells in blood products.
It is to provide a method for removing A antigen.
Brief description of the drawings
The above brief description, as well as further objects and features of the present invention, are set forth in the description.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The following detailed description of the presently preferred embodiments of the present invention for
It will be more fully understood by reference in connection with. Attached drawings
I will describe.
FIG. 1 shows the cloning of chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase cDNA.
Shows a diagram of the tactics used for training and sequencing.
FIG. 2 shows the cloning of chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase cDNA.
The nucleic acid sequence and the deduced amino acid sequence of the sequence are shown.
FIG. 3 shows bacterial and rabbit reticulocyte lysis as shown by Western blot.
Expression of chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase
There is.
FIG. 4 shows the relationship between α-N-acetylgalactosaminidase and α-galactosidase.
Represents a homology comparison between.
And FIG. 5 shows chickens in yeast as shown by Western blot.
7 shows expression of liver α-N-acetylgalactosaminidase.
Summary of the invention
The present invention provides a recombinant chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme.
The enzyme has a molecular weight of approximately 45 kDa, and chicken liver α-N-acetyl
Is immunoreactive with an antibody specific for lugalactosaminidase, and also human α-
It has an amino acid sequence that is approximately 80% homologous to the N-acetylgalactosaminidase enzyme.
To do. Recombinant chicken liver α-N-acetylgalactosamini of the present invention
The dase enzyme has amino acid numbers 1 to 406 shown in FIG.
It has an amino acid sequence. The invention further provides recombinant chicken liver α-N-acetyl.
A method for cloning a lugalactosaminidase enzyme and a method for expressing the enzyme,
And some of the sub-A that has been used to remove the A antigen from the surface of cells in blood products.
Type of said blood product is converted to type O, thereby making said blood product for transfusion therapy
And a method of using the enzyme to make it universal.
Detailed Description of the Invention
The present invention removes the A antigen from the surface of cells in blood products, thereby allowing certain
Of the sub-A blood product of Escherichia coli
It relates to a recombinant enzyme used for converting to a B blood product. The recombinant d of the present invention
The chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme is a molecule of approximately 45 kDa.
And specific for chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase
It is immunoreactive with antibodies. Furthermore, the recombinant enzyme of the present invention comprises human α-N-acetyl
It has an amino acid sequence that is approximately 80% homologous to the enzyme galactosaminidase. Departure
The recombinant chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme of Ming is described below.
It has a nucleic acid sequence and a deduced amino acid sequence.
Includes a sequence encoding chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase
The DNA vector is used in the United States of America on March 17, 1993, in accordance with the Budapest Treaty.
The American Type Culture Collecti
on Rockville, Maryland) and tested on March 22, 1993
Is confirmed to exist and is cataloged as ATCC No. 75434
It is posted.
The recombinant chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme of the present invention is
From the surface of cells in blood products as they can be cloned and expressed
Is readily available for use in the removal of the A antigen of The enzyme of the present invention has the following
Thus can be cloned and expressed. That is, chicken liver c
Screening a library of DNA for chicken liver α-N-acetylgala
Once you have the cDNA sequence encoding the ctosaminidase and it has been identified
The cDNA encoding the enzyme was sequenced, the cDNA cloned, and
Α-N-acetylgalactosamini obtained from cloned cDNA
Expresses a dase. This can be done as follows. I.e. screenini
Amplified human α-N-acetylgalactosamini that can be used as a probe
Obtaining the dase fragment, for example, a library of chicken liver cDNA as described above is prepared.
Using the amplified human α-N-acetylgalactosaminidase fragment as a probe
Library of chicken liver cDNA by screening using
Of chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase
Obtain the sequence, sequence the cDNA encoding the enzyme, and clone the cDNA.
Chicken liver α obtained from the cloned and cloned cDNA
-Express the N-acetylgalactosaminidase enzyme. Or screenini
Is an antibody that recognizes chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase.
It can also be implemented using.
Methods well known to those skilled in the art can be used to construct the expression vector,
, A sequence encoding the chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase,
Record
In the corresponding expression system, with appropriate transcription / translation signals for enzyme expression
Included in. Suitable organisms, cell lines and expression systems include: Rabbit reticulocyte lysate
Non-cellular system like lysate, E. coli (E. coli) Like prokaryotic bacteria, yeast, insect cells
, (Including human hepatocytes or adult Chinese hamster ovary (CHO) cells)
Eukaryotic cells such as mammalian cells, plant cells or systems, and oocytes
Animals including cells and transgenic animals.
The entire coding sequence for chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase.
Or a functional fragment of its functional equivalent is a functionally active enzyme in the corresponding expression system.
Can be used to construct the above expression vector for production in.
Due to the degeneracy of the DNA code, another D encoding a substantially identical amino acid sequence
It is anticipated that NA sequences may be used. Furthermore, chicken liver α-N-acetate
Change the amino acid sequence of the tilgalactosaminidase enzyme to produce a functionally active enzyme.
Constituting changes can be introduced into the DNA coding sequence. In particular,
Similar to the amino acids that are replaced, especially charge, polarity, hydrophobicity, hydrophilicity and
Amino acid substitutions based on the size similarity of the mino acid side chains can be introduced.
Once the recombinant chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme was cloned,
Once it has been expressed and expressed, the enzyme is used to display the surface of cells in blood products.
The A antigen can be removed from the surface. Chicken liver α-N-acetylgalacto
A method of removing A antigen from the surface of red blood cells using saminidase is described in "Some Subtypes".
Entitled "Enzymatic Conversion of Type A and Type AB Red Blood Cells," Goal on September 2, 1986.
U.S. Pat. No. 4,609,627 granted to Goldstein
, The teachings of which are incorporated herein by reference. From the surface of red blood cells
The erythrocytes are treated with the recombinant chicken liver α-of the invention for a period sufficient to remove the raw material.
By contacting with N-acetylgalactosaminidase enzyme, the subtype A antigen
It can be removed from the surface of red blood cells.
Example
Isolation and characterization of chicken liver cDNA clones
Purification and homogenization of chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase
.
This enzyme is a glycoprotein with a molecular weight of 80 kDa and has a pH of 7.5.
It dissociated into two homologous subunits. Synthetic substrate p-nitropheny
The optimum pH for the cleavage of le-α-N-acetylgalactosaminyl-pyranoside is
It was 3.65, and its activity dropped sharply when the pH exceeded 7. Purified croquettes
The N-terminal sequence obtained from avian liver α-N-acetylgalactosaminidase is
Human α described in the papers of Tsuji et al. And Wang et al.
-A corresponding sequence deduced from a clone of N-acetylgalactosaminidase cDNA
It showed a high homology with the row.
The cDNA clone for α-N-acetylgalactosaminidase in chicken liver.
To isolate and characterize the loan, the human α- described in Wan et al., Supra.
688-705 and 1219-1 of N-acetylgalactosaminidase sequence
Two oligonucleotides corresponding to nucleotide 236 were synthesized. Ten
Using human placenta mRNA (manufactured by Clontech) as a plate, the downstream (C-terminal)
A specific cDNA was made from the oligonucleotide. Then human α-N-acetate
A DNA fragment corresponding to residues 688 to 1236 of tilgalactosaminidase was prepared.
, From the above cDNA to hot-start PCR technique
More amplified. The PCR reaction mixture was preheated at 95 ° C for 5 minutes and Taq DNA
It may have occurred at a lower temperature with the addition of polymerase (Promega)
Maintained at 80 ° C while reducing non-specific annealing. After that, 35
Acre amplification was performed as follows: 94 ° C. for 1 minute, 50 ° C. for 2 minutes and
72 ° C for 3 minutes. The same PCR conditions were applied in all the experiments described below.
Next, the fragment amplified by PCR was used as a radiolabeled probe for homologous hybridization.
Chicken liver cDNA library based on redidation (Stratagene)
Was used for screening. Filter containing this library and the probe
Hybridization with 42 ° C overnight, 50% formamide, 5 times concentration
SSPE, 5-fold concentrated Denhardt's solution, 0.1% SDS and 0.1 mg
/ ml salmon sperm DNA solution. Then use the filter
Washed.
1. 20 minutes at room temperature with 3x SSC and 0.1% SDS
2. 20 minutes at room temperature with 2x SSC and 0.1% SDS
3. 20 minutes at 1x SSC and 0.1% SDS at 56 ℃
4. 20 minutes at 1x SSC and 0.1% SDS at 56 ℃
The filter was subjected to autoradiography at -70 ° C overnight. Positive
A second screening in which the loan was selected and the same procedure was followed.
I went to Overall, three consecutive screens were performed to ensure adequate isolation.
Positive clones were obtained.
One positive clone was successfully isolated from approximately one million plaques screened.
Released. Sequencing data showed that this clone had a 1.2 kb 3'-untranslated region.
, 0.7 kb, which is highly homogeneous with human α-N-acetylgalactosaminidase
It was shown to consist of a code region. To get the lost coding sequence, 1.
The library was re-screened using a 9 kb cDNA clone as a probe.
I cleaned it. However, no positive clones were identified by this method.
Therefore, the second chicken liver cDNA library (Clontech) was multiplexed.
Amplification (multipe amplifacion) (the nested PCR technique)
Was performed to obtain the cDNA sequence of the upstream portion. FIG. 1 shows chicken liver α-N-
Used for cloning and sequencing of acetylgalactosaminidase cDNA
It shows a diagram of tactics. Chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase
The cDNA coding for is a 1.2 kb coding region (shaded area) and a 1.2 kb 3 region.
'-Includes an untranslated region. The arrows at the bottom of the diagram indicate sequencing tactics.
CL1, CL2 and CL3 were used as primers for nested PCR
It is an oligonucleotide. CL1 and CL2 are respectively 924-941n
It is located at the t and 736-753 nt sites (see Figure 2). Natural chicken
According to the sequence of liver enzyme, oligonucleotide CL3 [5'-CTGGAGAAC (T) GGA (GC) CT
GGCT (CA) CG] designed with chicken codon usage and "best guess" in mind
did.
In the first PCR amplification, one kind of specific primer (CL1) (see FIG. 1)
And one universal primer derived from the library vector (5'-CTGGTAATG
GTAGCGACC) and use the entire cDNA library as a template
It was Take a small aliquot from the above reaction and immediately add another primer combination.
Was subjected to a second amplification using. Primer CL2 is located upstream of CL1.
Lanes (see Figure 1), and the second primer, CL3,
N- obtained from chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase produced
It was designed based on the terminal amino acid sequence. Determine the sequence of the 750 bp fragment
As a result, PCR artifacts that may be present were excluded. This 750 bp fragment
Is a 1.9 kb clone and part isolated by screening the library.
Since these were partially overlapping, we ligated these two fragments together by PCR.
The cDNA encoding chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase was regenerated.
It was constructed. Sequencing of this DNA was performed according to standard procedures and the code
Regions were sequenced from both directions.
Encodes chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase
Cloned DNA
The reliability of the cDNA was evaluated using the deduced amino acid sequence and purified chicken liver α-N-amino acid.
N-terminal sequence and CNBr-cleaving peptide from cetylgalactosaminidase
Confirmed by co-linearity with the sequence. FIG. 2 shows chicken liver α-N-acetylgala.
Represents the nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of a clone of the ctosaminidase cDNA.
ing. The underlined region in Fig. 2 represents the N-terminal fragment of the enzyme purified from chicken liver.
And the sequences obtained from the CNBr-derived fragment. Top stream in subclone
The three nucleotides ATG are added as the translation initiation codon for protein expression.
I gave it. 2299-2304 nt site polyadenylation signal (AATAAA)
It is underlined. The sequence surrounded by a line is a region that is thought to be involved in N-glycosylation.
Shows the rank. According to the cDNA, the mature protein consisting of 405 amino acids is about 45
Although it has a molecular weight of kDa, it can be purified by SDS-PAGE.
Matches that of the enzyme made. Since the cloning method was applied, the 5'end of the cDNA
The sequence corresponded to the N-terminal sequence of the mature enzyme isolated from chicken liver.
Rabbit reticulocyte lysate from chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase
Chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase for expression in
A sequence having nucleotides 1 to 1260 including the coding region
, In the direction in which the T7 promoter is located upstream of this insertion sequence, vector-PCR-II (
(Invitrogen). Leucine is the N-terminal part of the mature protein
Since it begins with, the translation initiation codon ATG was added during the construction of the subclone.
. Next, the construct is transferred to the TNT system (Pr
omega) as a template and follow the manufacturer's recommended procedure
The protein was expressed.
α-N-acetylgalactosaminidase is produced in large quantities in bacteria, and it is produced in one step.
In order to purify the enzyme of Escherichia coli, the cDNA was used as EcoRI of pTrchis vector
Subcloning into the recognition siteE. coli). Vector
Due to the sequence possessed, the expressed enzyme has a polyhistidine-tag at its N-terminal part.
Was included. This is a one-step procedure using affinity chromatography.
Allows purification of the enzyme from crude cell lysate by production.
FIG. 3 shows bacterial and rabbit reticulocyte lysis as shown by Western blot.
Expression of chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase
There is. Lanes 1-4 show expression results in rabbit reticulocyte lysates.
This expression was performed either with or without the expression plasmid (lane 1) (relay).
2),35Performed in lysates in the presence of S-methionine. Then 5 μl
The reaction sample was subjected to 12% SDS-PAGE. Dry electrophoretic gel and automatize for 2 hours
Radiographed and emits a band of apparent molecular weight of approximately 45 kDa.
Visualization with the current plasmid (lane 1, see FIG. 3). Confirm the reliability of the expressed protein
Α-N-acetylgalactosaminidase purified from chicken liver for
Western blot was performed using a polyclonal antibody elicited against
It was Perform the same expression reaction using unlabeled methionine instead of labeled methionine,
The results of the Western blot (Promega) are shown in lanes 3 and 4.
Lane 3 is with the expression plasmid, and lane 4 is with the expression plasmid.
There wasn't. As shown in FIG. 3, the antibody showed a band due to the reaction with the expression plasmid.
It was specifically recognized (lane 3) but not in the control (lane 4).
. Lane 5 shows that the protein is expressed in bacteria and in a Western blot
Before
It shows that it was recognized by the same antibody as described above. Lane 6 served as a positive control
Showing α-N-acetylgalactosaminidase purified from chicken liver
There is. The molecular weight size marker (m) is shown in the left part of the figure. From these things,
The isolated cDNA clone is chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase.
It is confirmed that the code is.
Comparison of chicken liver sequence clones with other enzyme sequences.
The chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase sequence was labeled with α-galactose.
Other α-N-acetylgalactosaminidases and α-galls that cleave sugar groups
A comparison was made with the published sequence of ctosidase. FIG. 4 shows various α-N-acetyl
Represents a homology comparison between galactosaminidase and α-galactosidase
. Alignment is performed by the computer program PROSIS (Hitac
hiSoftware Engineering Corp., Ltd.) and manual adjustment.
. The amino acid sequence was deduced from the cDNA. Sequences I and II are respectively chicken
Sequence of α-N-acetylgalactosaminidase from liver and human placenta.
. Sequences III, IV, V and VI are human, yeast and guar (Cyamopsis terrag onoloba
) And Aspergillus niger (Aspergillusn iger) From α-galactosidase
Shows the columns. Sequences IV and VI are short at the C-terminus as indicated by ★★.
It is curtailed. Identical or sparingly substituted amino acids in aligned protein sequences
The acid residue (5/6 or more) is surrounded by a line. The number above the sequence is the relative position of each peptide sequence
Shows the location.
Inferred from chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase cDNA
The amino acid sequence is human α-N-acetylgalactosa as determined by PROSIS.
It showed about 80% homology with minidase. This homology is due to the human enzyme and chicken liver fermentation.
Although it shows homology with prime, it has been described above, especially in terms of cleavage of Forssmann antigen.
As described above, the characteristics peculiar to the species of the enzyme are different. Also, chicken liver α-N-a
Polyclonal antibodies elicited against the cetylgalactosaminidase enzyme are human
Does not cross react with the element. These facts indicate the existence of specific amino acids involved in the above differences.
Explained by
Yamachi et al. (1990) studied transient expression in COS cells.
In FIG. 4, human α having a 70 bp insertion at the position corresponding to the number 376 in FIG.
-N-acetylgalactosaminidase has been reported not to be enzymatically active.
It This data shows that the open readings resulting from the insertion in the C-terminal part of the molecule
Suggesting that the shifting of the reading frame is involved in the loss of enzyme activity
This is because the amino acids in the C-terminal region are α-N-acetylgalactosaminida.
It has the potential to be decisive for the enzyme activity.
Sequence similarity search (BLAST) of available protein databases (Altschul et al.
, 1990) and subsequent PROSIS computer programs and manual adjustments.
By aligning the sequences using alignment, α-N-acetylgalactosaminidase
, Human, yeast, guar (Cyamopsis terragonoloba) And Aspergillus niger (Aspergillus niger
Highly homologous to the α-galactosidase from (5) at the amino acid level.
5 to 68% range). The degree of this amino acid homology is shown in FIG.
And these two functionally unique glycosidases evolved from a common ancestor gene
Suggests that you would have done so. High similarity and sex of substrates of those enzymes
Considering quality, these two exoglycosidases share a similar catalytic mechanism.
, And essential amino acid residues in both active sites may be well conserved
is there. The chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase cDNA was cloned into this library.
By entering into Millie, molecules important for substrate binding specificity and enzymatic activity
It enables deeper consideration of the area. Clonal enzymes from multiple sources
Is made available by the present invention.
The α-N-acetylgalactosaminidase enzyme and
And the active site and catalytic mechanism of the α-galactosidase enzyme can be studied.
Expression of active α-N-acetylgalactosaminidase in yeast
Human α-N-acetylgalactosaminider corresponding to the signal peptide sequence
Cloning of 48 nucleotides (Wang et al., 1990), the most upstream ze cDNA.
PCR was performed on the chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase coding region.
Were combined by the method. Amplification products obtained by PCR are directly used for vector PCR-II (Invit
rogen). Two EcoRI recognition sites on the side of the insert
Using the entire α-N-acetylgalactosaminidase cDNA as a yeast expression vector
I subcloned into pYES2 (Invitrogen), but the orientation of the insertion part was
The orientation was such that the GAL1 promoter was located upstream of the product. GAL1 promoter
Is the inserted cDNA clone under the growth conditions in which galactose is induced in yeast.
Expressed the loan.
INVSCI yeast strain (Invitrogen) by introducing the yeast vector construct using standard procedures
Was transformed. Chicken liver α-N-acetylgalactosamini in yeast
In order to confirm the expression of the dase, all proteins were extracted from the cell extract and the culture suspension.
Collected, which was separated by 12% SDS-PAGE and purified chicken
Polyclonal induced against α-N-acetylgalactosaminidase in liver
The antibody was subjected to Western blotting (under standard conditions). Transformed fermentation
The mother cells were grown in uracil-free medium (Bio 101, Inc.). 0.2%
After sensitizing to galactose, the cells are centrifuged and the protein extract is
It was prepared using the Rasbead fragmentation method. Centricon secreted protein in culture suspension
Concentrate using -30 (Centricon-30, Amicon Division, W.R. Grace & Co.)
did. The results of Western blot are shown in FIG.
Lanes 1 and 8 of FIG. 5 show α-N-acetylgala purified from chicken liver.
Shows Kutosaminidase. Lanes 2-4 contain 3 different pYES2 constructs
Cell extracts from transformed yeast, each construct containing vector
Germany (lane 2), chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase cDNA
A signal sequence was added to the coding region (lane 3) and the coding region of lane 3.
(Lane 4). Lane 5 is the culture from the transformed yeast used in Lane 4.
It is a nutrient extract. Lane 7 shows the molecular weight standard. As shown in FIG.
The protein without gnal peptide was expressed in yeast cells (lane 3),
Most of the protein having the signal peptide sequence was secreted into the medium (lane 5).
The higher molecular weight secreted proteins observed on the Western blot were
Was observed with respect to the expression of guar α-galactosidase (Fellinger, et al.
., 1991), probably due to excessive glycosylation.
In order to purify the expressed α-N-acetylgalactosaminidase, it was concentrated
The prepared culture suspension was added to agarose containing aminocaproylgalactosylamine agarose.
It was applied to a finity column. After washing the column, the bound fraction was washed with 50 mM N-
Elution with a buffer containing acetylgalactosamine. This eluent was expressed
Although it contains α-N-acetylgalactosaminidase, this expression product is expressed by the plasmid in FIG.
As shown in 6, the molecular weight was similar to that of the enzyme purified from chicken liver.
Is.
The expressed enzyme eluted from the column was p-, which was a synthetic substrate, at pH 3.6.
Activity against nitrophenyl-α-N-acetylgalactosaminylpyranoside
Show. The heavily glycosylated enzyme does not bind to the affinity column and
It also showed no activity on synthetic substrates. When all the data are combined, yeast cells
Of enzymatically active chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase in
Production, secretion and purification are shown.
Although the invention is described herein in accordance with a limited number of embodiments,
, These embodiments are merely illustrative of various subject matter of the invention.
Please understand. Accordingly, various modifications may be made to the above illustrative embodiments.
And that other adaptations may be devised without departing from the subject matter of the invention.
Please understand that.
Sequence listing
(1) General information
(I) Applicant: Alec Stu
Jack goldstein
(Ii) Title of the invention: recombinant α-N-acetylgalactosaminidase enzyme and
And a cDNA encoding the enzyme
(Iii) Number of sequences: 7
(Iv) Contact:
(A) Address: Amster, Rochestein & Einstein
(B) Street: 90 Park Avenue
(C) Municipalities: New York
(D) State: New York
(E) Country: USA
(F) Zip code: 10016
(V) Computer-readable format:
(A) Medium type: 3.5 inch 1.44Mb capacity floppy disk
(B) Computer: IBM PC compatible
(C) Operating system: MS-DOS
(D) Software: Word processor (ASCII)
(Vi) Current application data:
(A) Application number: Not confirmed
(B) Filing date: Not confirmed
(C) Classification: Not determined
(Vii) Prior application data: None
(Viii) Patent Attorney / Attorney Information:
(A) First and Last Name: Pasqualini Patricia A.
(B) Registration number: 34,894
(C) Reference / Case number: 63475/12
(Ix) Telephone contact information:
(A) Phone number: (212)697-5995
(B) Telefax number: (212)286-0854 or 286-0082
(C) Telex number: TWX 710-581-4766
(2)Information for SEQ ID NO: 1:
(I) Array characteristics:
(A) Length: 2319
(B) type: nucleic acid
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Ii) Sequence type:
(A) Description: cDNA to mRNA
(Iii) Hypothetical array: No
(Iv) Antisense: Yes
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(A) Organism name: chicken liver
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(C) Individual / isolated clone name:
(D) Degree of differentiation:
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(F) Type of organization:
(G) Cell type:
(H) Cell line:
(I) Organelle name:
(Vii) Direct Origin: Library
(Viii) Location in genome: unknown
(A) Chromosome / segment name:
(B) Position on chromosome:
(C) Unit
(Ix) Sequence features:
(A) Name / Symbol indicating characteristics: chicken liver α-N-acetylgalactosami
Nidase
(B) Location:
(C) How the features were determined:
(D) Other information:
(X) Published information:
(A) Author:
(B) Title:
(C) Magazine name:
(D) Volume number:
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(K) Other related matters:
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 1:
(3)Information for SEQ ID NO: 2:
(I) Array characteristics:
(A) Length: 406
(B) type: amino acid
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Ii) Sequence type:
(A) Description: cDNA to mRNA
(Iii) Hypothetical array: No
(Iv) Antisense: Yes
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(A) Organism name: chicken liver
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(C) Individual / isolated clone name:
(D) Degree of differentiation:
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(F) Type of organization:
(G) Cell type:
(H) Cell line:
(I) Organelle name:
(Vii) Direct Origin: Library
(Viii) Location in genome: unknown
(A) Chromosome / segment name:
(B) Position on chromosome:
(C) Unit:
(Ix) Sequence features:
(A) Name / Symbol indicating characteristics: chicken liver α-N-acetylgalactosami
Nidase
(B) Location:
(C) How the features were determined:
(D) Other information:
(X) Published information:
(A) Author:
(B) Title:
(C) Magazine name:
(D) Volume number:
(F) Page number:
(G) Publication date:
(H) Document number:
(I) Submission date:
(J) Date of publication:
(K) Other related matters:
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 2:
(4)Information for SEQ ID NO: 3:
(I) Array characteristics:
(A) Length: 411
(B) type: amino acid
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(D) Topology: linear
(Ii) Sequence type:
(A) Description: cDNA to mRNA
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(Iv) Antisense: Yes
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(A) Organism name: human
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(C) Individual / isolated clone name:
(D) Degree of differentiation:
(E) Haplotype:
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(G) Cell type:
(H) Cell line:
(I) Organelle name:
(Vii) Direct Origin: Library
(Viii) Location in genome: unknown
(A) Chromosome / segment name:
(B) Position on chromosome:
(C) Unit:
(Ix) Sequence features:
(A) Name / Character indicating characteristics: human α-N-acetylgalactosaminidase
(B) Location:
(C) How the features were determined:
(D) Other information:
(X) Published information:
(A) Author: Wanetal.
(B) Title: Human α-N-Acetylgalactosaminidase Molecular Cloning,
Nucleotide Sequence, and Expression of a Full-Length cDNA
(C) Magazine name: Journal of Biological Chemistry
(D) Volume number: 265
(F) Page number: 21859-21866
(G) Publication date: 1990
(H) Document number:
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(J) Date of publication:
(K) Other related matters:
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 3:
(5)Information of SEQ ID NO: 4:
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(A) Length: 429
(B) type: amino acid
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Ii) Sequence type:
(A) Description: cDNA to mRNA
(Iii) Hypothetical array: No
(Iv) Antisense: Yes
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(A) Organism name: human
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(C) Individual / isolated clone name:
(D) Degree of differentiation:
(E) Haplotype:
(F) Type of organization:
(G) Cell type:
(H) Cell line:
(I) Organelle name:
(Vii) Direct Origin: Library
(Viii) Location in genome: unknown
(A) Chromosome / segment name:
(B) Position on chromosome:
(C) Unit:
(Ix) Sequence features:
(A) Name / Symbol indicating characteristics: human α-galactosidase
(B) Location:
(C) How the features were determined:
(D) Other information:
(X) Published information:
(A) Author: Calhoun et al.
(B) Title: Fabry Disease: Isolation of a cDNA Clone Encoding Human
α-galactosidase A
(C) Magazine name: Proceedings of the National Academy of Science USA
(D) Volume number: 82
(F) Page number: 7364-7368
(G) Publication date: 1985
(H) Document number:
(I) Submission date:
(J) Date of publication:
(K) Other related matters:
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 4:
(6)Information of SEQ ID NO: 5:
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(A) Length: 438
(B) type: amino acid
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Ii) Sequence type:
(A) Description: cDNA to mRNA
(Iii) Hypothetical array: No
(Iv) Antisense: Yes
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(A) Organism name: yeast (Saccharomyces cerevisiae)
(B) Share name:
(C) Individual / isolated clone name:
(D) Degree of differentiation:
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(G) Cell type:
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(Vii) Direct Origin: Library
(Viii) Location in genome: unknown
(A) Chromosome / segment name:
(B) Position on chromosome:
(C) Unit:
(Ix) Sequence features:
(A) Name / Symbol indicating characteristics: Yeast α-galactosidase (MEL1)
(B) Location:
(C) How the features were determined:
(D) Other information:
(X) Published information:
(A) Author: Liljestrom
(B) Title: The Nucleotide Sequence of the Yeast MEL1 Gene
(C) Magazine name: Nucleic Acids Research
(D) Volume number: 13
(F) Page number: 7257-7268
(G) Publication date: 1985
(H) Document number:
(I) Submission date:
(J) Date of publication:
(K) Other related matters:
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 5:
(7)Information of SEQ ID NO: 6:
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(A) Length: 411
(B) type: amino acid
(C) Number of chains: double-stranded
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(A) Description: cDNA to mRNA
(Iii) Hypothetical array: No
(Iv) Antisense: Yes
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(A) Organism name: Guar (Cyamopsis tetragonoloba)
(B) Share name:
(C) Individual / isolated clone name:
(D) Degree of differentiation:
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(F) Type of organization:
(G) Cell type:
(H) Cell line:
(I) Organelle name:
(Vii) Direct Origin: Library
(Viii) Location in genome: unknown
(A) Chromosome / segment name:
(B) Position on chromosome:
(C) Unit:
(Ix) Sequence features:
(A) Name / Symbol indicating characteristics: guar α-galactosidase
(B) Location:
(C) How the features were determined:
(D) Other information:
(X) Published information:
(A) Author: Overbeeke et al.
(B) Title: Cloning and Nucleotide Sequence of the α-galactosidase
cDNA FromCyamopsis tetragonoloba(Guar)
(C) Journal name: Plant Molecular Biology
(D) Volume number: 13
(F) Page number: 541-550
(G) Publication date: 1989
(H) Document number:
(I) Submission date:
(J) Date of publication:
(K) Other related matters:
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 6:
(8)Information of SEQ ID NO: 7:
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(A) Length: 447
(B) type: amino acid
(C) Number of chains: double-stranded
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(A) Description: cDNA to mRNA
(Iii) Hypothetical array: No
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(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(A) Organism name: Aspergillus niger (Aspergillus niger)
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(C) Individual / isolated clone name:
(D) Degree of differentiation:
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(F) Type of organization:
(G) Cell type:
(H) Cell line:
(I) Organelle name:
(Vii) Direct Origin: Library
(Viii) Location in genome: unknown
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(B) Position on chromosome:
(C) Unit:
(Ix) Sequence features:
(A) Name / Symbol indicating characteristics: Aspergillus niger α-galactosidase
(B) Location:
(C) How the features were determined:
(D) Other information:
(X) Published information:
(A) Author: den Herder et al.
(B) Title: Cloning and Expression of a Member of theAspergillus
niger Gene Family Encoding α-galactosidase
(C) Magazine name: Molecular and General Genetics
(D) Volume number: 233
(F) Page number: 404-410
(G) Publication date: 1992
(H) Document number:
(I) Submission date:
(J) Date of publication:
(K) Other related matters:
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 7:
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９５年５月３日
【補正内容】
補正書の翻訳文
請求の範囲
１． ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素をコードする、
精製および単離された核酸。
２． 図２に含まれているアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の核酸。
３． 図２に含まれているヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸。
４． ＡＴＣＣ受託番号７５４３４として寄託されているベクターに含まれてい
る、請求項１に記載の核酸。
５． ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素をコードする核
酸を含むベクター。
６． 前記核酸が図２に含まれているアミノ酸配列をコードしている、請求項５
に記載のベクター。
７． 前記核酸が図２に含まれているヌクレオチド配列を有している、請求項５
に記載のベクター。
８． 前記核酸がＡＴＣＣ受託番号７５４３４として寄託されているベクターに
含まれている、請求項５に記載のベクター。
９． ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素をコードする核
酸を含むベクターで形質転換された細胞。
１０． 前記核酸が図２に含まれているアミノ酸配列をコードしている、請求項
９に記載の細胞。
１１． 前記核酸が図２に含まれているヌクレオチド配列を有している、請求項
９に記載の細胞。
１２． 前記核酸がＡＴＣＣ受託番号７５４３４として寄託されているベクター
に含まれている、請求項９に記載の細胞。
１３． ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素をコードする
核酸を含むベクターで形質転換された細胞を培養する工程、ならびに該培養物か
らα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを回収する工程を含む、組換えニワト
リ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの製造方法。
１４． 前記核酸が図２に含まれているアミノ酸配列をコードしている、請求項
１３に記載の方法。
１５． 前記核酸が図２に含まれているヌクレオチド配列有している、請求項１
３に記載の方法。
１６． 前記核酸がＡＴＣＣ受託番号７５４３４として寄託されているベクター
に含まれている、請求項１３に記載の方法。
１７． 活性なニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を前記
培養物からアフィニティーカラムにより精製する工程をさらに含む、請求項１３
に記載の方法。
１８． 前記アフィニティーカラムがアミノカプロイルガラクトシルアミン ア
ガロースである、請求項１７に記載の方法。[Procedure amendment] Article 184-8 of the Patent Act [Submission date] May 3, 1995 [Amendment content] Scope of claim for translation of amendment 1. A purified and isolated nucleic acid encoding a chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme. 2. The nucleic acid according to claim 1, which encodes the amino acid sequence contained in FIG. 3. The nucleic acid of claim 1 having the nucleotide sequence contained in FIG. 4. 2. The nucleic acid of claim 1 contained in a vector deposited under ATCC Deposit No. 75434. 5. A vector containing a nucleic acid encoding a chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme. 6. The vector according to claim 6, wherein the nucleic acid encodes the amino acid sequence contained in FIG. 7. The vector of claim 7, wherein the nucleic acid has the nucleotide sequence contained in FIG. 8. 6. The vector of claim 5, wherein the nucleic acid is contained in a vector deposited under ATCC Deposit No. 75434. 9. A cell transformed with a vector containing a nucleic acid encoding a chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme. 10. 10. The cell of claim 9, wherein the nucleic acid encodes the amino acid sequence contained in Figure 2. 11. 10. The cell of claim 9, wherein the nucleic acid has the nucleotide sequence contained in Figure 2. 12. 10. The cell of claim 9, wherein the nucleic acid is contained in a vector deposited under ATCC Deposit No. 75434. 13. A group comprising culturing cells transformed with a vector containing a nucleic acid encoding a chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme, and recovering α-N-acetylgalactosaminidase from the culture Altered method for producing chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase. 14. 14. The method of claim 13, wherein the nucleic acid encodes the amino acid sequence contained in Figure 2. 15. The method of claim 13, wherein the nucleic acid has the nucleotide sequence contained in FIG. 16. 14. The method of claim 13, wherein the nucleic acid is contained in a vector deposited under ATCC Deposit No. 75434. 17． The method of claim 14, further comprising the step of purifying active chicken liver α-N-acetylgalactosaminidase enzyme from the culture by affinity column. 18. 18. The method of claim 17, wherein the affinity column is aminocaproylgalactosylamine agarose.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 9/40
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(72)発明者 ゴールドスタイン、ジャック
アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10021、
ニューヨーク、イースト・シックスティサ
ード・ストリート 450─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI C12R 1:19) (C12N 9/40 C12R 1: 865) (72) Inventor Goldstein, Jack New York, USA 10021, New York, East Sixth Street 450