JPH08508296A - Method of using insulin-like growth factor binding protein - Google Patents

Method of using insulin-like growth factor binding protein

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JPH08508296A
JPH08508296A JP6522477A JP52247794A JPH08508296A JP H08508296 A JPH08508296 A JP H08508296A JP 6522477 A JP6522477 A JP 6522477A JP 52247794 A JP52247794 A JP 52247794A JP H08508296 A JPH08508296 A JP H08508296A
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コツクス，ジヨージ・エヌ
ラツセル，デボラ・エー
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アムジエン・ブルダー・インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、治療薬としてＩＧＦＢＰ−１又はその改変体を含むインシュリン様成長因子結合タンパク質（「ＩＧＦＢＰ」）の使用法に関する。改変体は、ポリマーに結合したＩＧＦＢＰ−１又はポリマーの対向末端に結合した２個のＩＧＦＢＰ−１分子を含む。該方法は、ＩＧＦ関連症状を有する患者に、治療効果を発生させるに十分なＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−１の改変体を含むＩＧＦＢＰを投与することを含む。本発明はさらに、該方法に有用な非リン酸化ＩＧＦＢＰにも関する。   (57) [Summary] The present invention relates to the use of insulin-like growth factor binding protein (“IGFBP”) containing IGFBP-1 or a variant thereof as a therapeutic agent. Variants include IGFBP-1 attached to a polymer or two IGFBP-1 molecules attached to opposite ends of the polymer. The method comprises administering to a patient having an IGF-related condition an IGFBP containing sufficient IGFBP-1 or a variant of IGFBP-1 to produce a therapeutic effect. The invention also relates to non-phosphorylated IGFBPs useful in the method.

Description

【発明の詳細な説明】 インシュリン様成長因子結合タンパク質の使用方法 発明の分野 本発明は、インシュリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１もしく はＢＰ−１）の治療薬としての使用に係わる。発明の背景 循環インシュリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）は、 構造において互いに関連し、かつインシュリンに関連する７ｋＤａタンパク質で ある。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは身体のほとんどの細胞にとっての成長及び 分化因子であり、血清中に高濃度で存在する（ＩＧＦ−Ｉで約３００ｎｇ／ｍｌ 、ＩＧＦ−ＩＩで１０００ｎｇ／ｍｌ）。ＩＧＦ−Ｉの循環レベルは主として、 肝臓を剌激してＩＧＦ−Ｉを産生させる成長ホルモン（ＧＨ）によって決定され る。成長ホルモンの成長促進作用のほとんどはＩＧＦ−Ｉによって媒介されると 考えられる。 組織ＩＧＦも存在する。組織ＩＧＦ−Ｉは、ゲルクロマトグラフィーで確認し て明らかに循環ＩＧＦより大きい分子量（約２６ｋＤａ）を有する。Ｗ．Ｎ．Ｒ ｏｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２，ｐｐ．１６ ８５−１６９３，１９８８参照。 ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは多数の疾患状態において役割を果たすことが判 明している。それらの疾患状態には、例えば乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、骨肉 腫、神経膠腫、肝癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、再発狭窄症、先端巨大症、肥満症 、腫瘍誘発性低血糖症、肺線維症、糖尿病性ネフロパシー及び糖尿病性網膜障害 が含まれる。 インシュリン様成長因子のヒト腫瘍における役割はＤａｕｇｈａｄａｙ，Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２７ ，ｐｐ．１−４，１９９０に検討されている。例えば 、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩはＣｕｌｌｅｎ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ ｉｇａｔｉｏｎ ９ ，ｐｐ．４４３−４５４，１９９１に報告されているように 、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、ウィルムス 腫及び横紋筋肉腫を含めた様々なヒト癌のオートクリンまたはパラクリン成長因 子として機能すると考えられる。きわめて様々な原発腫瘍がＩＧＦ−ＩまたはＩ ＧＦ−ＩＩを過剰に発現させ、かつ当該成長因子のレセプターを発現させること は、Ｙｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８，ｐｐ．６６９１−６６９６，１９ ８８及 びＯｓｂｏｒｎｅ等，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３，ｐｐ．１７０１−１ ７０９，１９８９に報告されているように既に判明している。多くのｉｎ ｖｉ ｔｒｏ 研究によって、先に挙げた癌のうちの幾つかに由来するヒト細胞系がＩＧ Ｆ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩに応答して増殖することが判明した。幾つかの事例では 、細胞系がＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを産生し、かつＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ −ＩＩのための細胞表面レセプターを有することが判明した。場合によっては、 特に乳癌では腫瘍を囲繞する支質細胞がＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩを分泌し、 その結果としてパラクリン成長関係が生じることも判明している。 乳癌、肺癌及び結腸癌の３種は、米国では５００，０００人近くが罹患してい る最も普通の癌である。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩがこれらの癌の成長におい て果たす役割の最強の証拠は、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対する抗体が上記種類の ヒト腫瘍に由来する幾つかの細胞系によるヌードマウスでの腫瘍形成を遮断する ことを示す実験から得られる。 Ｔｒｉｃｏｌｉ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｓｅａｒｃｈ ４６，ｐｐ．６１６９− ６１７３，１９８６に報告さ れているヒト結腸癌由来の生検試料の分析は、分析した腫瘍の４０％においてＩ ＧＦ−ＩＩが１０〜５０倍過剰に発現されたことを示した。ＩＧＦ−ＩＩ過剰発 現レベルは腸壁浸潤の程度と相関した。 ＩＧＦ−Ｉは、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２， ｐｐ．３５４−３５９，１９８８に報告されているように、ヒト小細胞肺癌細胞 系ＮＣＩ−Ｈ３４５及びＮＣＩ−Ｎ４ １７のオートクリン増殖を媒介し得る。 卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−７及びＰＥＯ４はＩＧＦ−Ｉ ｍ ＲＮＡを発現させる。Ｙｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１，ｐｐ．５１０７ −５１１２，１９９１に報告されているように、一次及び転移卵巣癌組織もＩＧ Ｆ−Ｉ ｍＲＮＡと、Ｉ型ＩＧＦレセプターｍＲＮＡとを発現させる。 Ｂｌａｔｔ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１ ２３ ，ｐｐ．３７３−３７６，１９８４及びＣａｎａｌｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ ｎｖｅｓｔ．６６ ，ｐｐ．７０９−７１９，１９８０によれば、骨細胞は正常な ものと腫瘍性のものとの両 方がＩＧＦ−Ｉを分泌し、かつＩＧＦ−Ｉに応答する。 ＩＧＦ−ＩＩ ｍＲＮＡ発現は肝臓組織において発生的に調節される。Ｃａｒ ｉａｎｉ等，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １３，ｐｐ．２２０−２２６，１９９ ０に報告されているように、ウッドチャック、ヒト及びラットの肝癌においてＩ ＧＦ−ＩＩ ｍＲＮＡレベルの上昇が検出されている。 三つのヒト前立腺癌細胞系ＰＣ−３、ＤＵ−１４５及びＬＮＣａ．ＦＧＣは相 当量のＩＧＦ−Ｉを産生し、かつ自己リン酸化したＩＧＦ−Ｉレセプターを継続 的に出現させる。Ｚ．Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉ等，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒ ｃｈ ５３ ，ｐｐ．１１０２−１１０６，１９９３参照。Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓ ｋｉ等は、上記三つの細胞系のいずれの成長もＩＧＦ−ＩレセプターＲＮＡに対 するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによって、またはＩＧＦ−Ｉの、 ＩＧＦ−Ｉレセプターに結合するＩＧＦ−Ｉと競合するペプチド類似体によって 阻害されたことを報告している。 横紋筋肉腫はごく一般的な小児期の軟組織肉腫であり、発生する横紋筋形成細 胞から発症すると考えられる。Ｅ１ −Ｂａｄｒｙ等，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏ ｎ １ ，ｐｐ．３２５−３３１，１９９０に開示されているように、横紋筋肉腫 腫瘍に高レベルのＩＧＦ−ＩＩ ｍＲＮＡが存在することが報告されている。 先に触れたように、インシュリン様成長因子は、例えば先端巨大症及び再発狭 窄症のような癌以外の障害にも関係付けられている。先端巨大症は成長ホルモン （ＧＨ）の産生過剰に起因する。成長ホルモンはＩＧＦ−Ｉ産生を刺激すること によって機能する。即ち、先端巨大症はＩＧＦ−Ｉレベルの上昇と関係付けられ ている。 動脈の反復閉塞である再発狭窄症は、血管形成手術を受けた患者の約２５〜５ ５％に６ヵ月以内に出現する。動脈内膜層の肥厚が再発狭窄症の主因である。内 膜の肥厚は、平滑筋細胞の増殖及び細胞外マトリックス成分の分泌の結果として 生起する。Ｃｅｒｃｅｋ等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６ ，ｐｐ．１７５５−１７６０，１９９０に報告されているように、血管形成手術 後の表皮剥離動脈ではＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現が通常の９倍誘導されることが判 明している。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子発 現の時期及びレベルは平滑筋細胞増殖のそれにきわめて近似する。Ｋｈｏｒｓａ ｎｄｉ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，ｐｐ．１９２６−１９３１，１ ９９２の報告によれば、分裂平滑筋細胞はＩＧＦ−Ｉ遺伝子発現の増加を示す細 胞であることがハイブリダイゼーション研究によって示唆されている。Ｋｈｏｒ ｓａｎｄｉ等，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ９３，ｐｐ．１５−１２２， １９９２に報告された別の研究は、（下垂体の除去に起因して）循環ＩＧＦ−Ｉ レベルの低い動物では血管形成手術後の内膜肥厚が著しく減少したことを示して いる。 或る種の腫瘍に関連する低血糖症は以前から知られている。再発性低血糖症患 者から除去した平滑筋肉腫において、ＩＧＦ−ＩＩ ｍＲＮＡ及びＩＧＦ−ＩＩ 免疫反応ペプチドが異常に高いレベルで観察されている。Ｗ．Ｈ．Ｄａｕｇｈａ ｄａｙ等，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ，Ｖｏ１．３１９，Ｎｏ．２２，ｐｐ．１４３４−１４４０，１９８８参照。平 滑筋肉腫の除去後、低血糖症は沈静化した。上掲文献参照。腫瘍誘発性低血糖症 の他の研究者は、腫瘍治療前 に高い血漿ＩＧＦ−ＩＩレベルを見出したこと、及び腫瘍治療後にＩＧＦ−ＩＩ レベルが急速に低下し、低血糖症が消散したことを報告している。Ｌ．Ａｘｅｌ ｒｏｄ及びＤ．Ｒｏｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅ ｄｉｃｉｎｅ ，Ｖｏｌ．３１９，Ｎｏ．２２，ｐｐ．１４７７−１４７９，１９ ８８参照。 ＩＧＦ−Ｉのｉｎ ｖｉｖｏ投与も低血糖症を誘発する恐れが有る。Ｍ．Ｓ． Ｌｅｗｉｔｔ等，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２９，Ｎｏ．４，ｐ ｐ．２２５４−２２５６，１９９１参照。Ｌｅｗｉｔｔ等は、ラット脂肪組織の 脂肪酸へのグルコース付加によってＩＧＦＢＰ−１が阻害されることがｉｎ ｖ ｉｔｒｏ 研究によって判明したことも報告している。 肺線維症では、活性化された肺胞マクロファージの数が増し、肺胞壁において 線維芽細胞の病的大量集積が起こる。線維芽細胞は細胞外コラーゲン性マトリッ クスを分泌する。線維芽細胞及びマトリックス分泌物は肺胞壁を肥厚させ、肺胞 −毛細血管単位の消失を招く。活性化された肺胞マクロファージは線維芽細胞の 複製を知らせるＩＧＦ−Ｉを放出することが判明している。Ｗ．Ｎ．Ｒｏｍ等，Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２ ，ｐｐ．１６８５−１６９３，１９８８参照。間 質性肺障害の患者に由来する肺胞マクロファージは上記のようなＩＧＦ−Ｉを自 発的に分泌することも判明している。上掲文献；Ｐ．Ｂ．Ｂｉｔｔｅｒｍａｎ等 ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２，ｐｐ．１８０１−１８１３，１９８３参 照。癌性及び非癌性障害の現行の治療法には、手術、放射線照射、化学療法及び ホルモン療法が含まれる。例えば、乳癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌及び骨肉腫など の様々な癌が手術、放射線照射及び化学療法薬で治療される。上記のような癌の 治療に用いられる化学療法薬にフルオロピリミジン類及びアルキル化剤類が含ま れる。これらの物質群はいずれも、例えば脊髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓ ｓｉｏｎ）、免疫抑制、好中球減少症、胃腸毒性、腎臓毒性及び末梢神経障害を 含めた甚だしい毒性を示す。加えて、肝癌の治療に有効である既知の化学療法薬 は存在しない。手術はきわめて危険でかつ結果の予測がつかず、放射線照射は定 位の点で非特異的である。ホルモン療法には、不要の毛髪成長及び気分変化など の望ましくない副作用が有る。 Ｉ型ＩＧＦ−Ｉレセプターに対する抗体はｉｎ ｖｉｔ ｒｏ でＩＧＦ−Ｉ応答性癌細胞系の成長を遮断することが判明している。Ａｒｔ ｅａｇａ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４，ｐｐ．１４ １８−１４２３ ，１９８９及びＺｉａ等，Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｃａｎｃ ｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：２７０ ，Ａｂｓｔｒａｃｔ １６１６，１９９ ２に報告された研究は、免疫不全ヌードマウスに移植した或る種の乳癌及び肺癌 の成長をＩＧＦ−Ｉレセプターに対する抗体が遮断することを示した。 Ｔｒｏｊａｎ等，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８９ ，ｐｐ．４８７４−４８７８， １９９２に述べられているように、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子に対するアンチセンス配列 はラットに移植された悪性ラット神経膠腫細胞系の成長を遮断することが判明し ている。しかし、遺伝子治療のためにアンチセンス配列を用いることはなお早期 開発段階に有る。 このように、先に挙げた癌及び疾患状態においてＩＧＦの作用を抑制する薬剤 が必要とされている。本発明はそのような抑制薬、即ち上記疾患状態においてＩ ＧＦの不適当 な作用を抑制するＩＧＦＢＰ−１を提供する。発明の概要 本発明は、インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）を、ＩＧＦ 関連状態を治療または予防する治療薬として用いる方法に係わる。本発明の特定 例において、結合タンパク質は“ＢＰ−１”とも呼称されるＩＧＦＢＰ−１であ る。本発明は、改変形態のＩＧＦＢＰを治療薬として用いる方法にも係わる。例 えば、改変形態のＩＧＦＢＰ−１にはポリマーに結合させたＩＧＦＢＰ−１、ま たはポリマーに結合させた２個以上のＩＧＦＢＰ−１分子が含まれる。上記方法 は、ＩＧＦ関連状態を有する患者に、例えばＩＧＦＢＰ−１または改変形態のＩ ＧＦＢＰ−１を含めたＩＧＦＢＰを治療効果の実現に十分な量で投与することを 含む。ＩＧＦＢＰ−１の場合、ＩＧＦＢＰ−１の循環レベルを患者の血流中で約 ０．１〜約３００μｇ／ｍｌとすれば治療効果を上げることができると考えられ る。ＩＧＦＢＰ、特にＩＧＦＢＰ−１の投与が有用であり得るのは、乳癌、結腸 癌、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、神経膠腫、肝癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、再発狭窄 症、先端巨大症、肥満症、腫瘍誘発性低血糖症、肺線維症、糖尿病性ネフロパシ ー及 び糖尿病性網膜障害を治療または予防する場合などである。本発明は、ＩＧＦＢ Ｐ、特にＩＧＦＢＰ−１または改変形態のＩＧＦＢＰ−１を含有する医薬組成物 、及び該医薬組成物を用いてＩＧＦ関連状態を治療または予防する方法にも係わ る。発明の詳細な説明 ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの不適当な発現または利用は多くの疾患状態の 一要因となる。ＩＧＦＢＰ、特にＩＧＦＢＰ−１の投与は、ＩＧＦ、特にＩＧＦ −ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの不適当な発現または利用に関連する疾患状態の有用な 治療法であり得ると考えられる。即ち本発明は、ＩＧＦＢＰ−１または改変形態 のＩＧＦＢＰ−１を含めたＩＧＦＢＰを治療効果の実現に十分な量で投与するこ とによってＩＧＦ関連状態を有する患者を治療するか、またはＩＧＦ関連状態を 予防する方法を提供する。 本明細書中の用語を次のように定義する。 “許容可能な医薬用キャリヤ”という語は、生理的に適合可能な水性または非 水性溶媒を意味する。 “ＩＧＦ−Ｉ”という語は特に断らないかぎり、天然ＩＧＦ−Ｉと同じアミノ 酸配列を有するタンパク質、または Ｎ末端メチオニンを付加した天然ＩＧＦ−Ｉと同じアミノ酸配列を有するタンパ ク質（ｍｅｔ−ＩＧＦ−Ｉ）を意味する。 “ＩＧＦ”という語は、例えばＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、（ｄｅｓ１−３） ＩＧＦ−Ｉ、ｍｅｔ−ＩＧＦ−Ｉ、インシュリン、及びＩ型レセプターに結合す る任意の活性フラグメントを含めた、Ｉ型ＩＧＦレセプターに結合する任意のポ リペプチドを意味する。このホルモン群はＢｌｕｎｄｅｌｌ及びＨｕｍｂｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２８７ ，ｐｐ．７８１−７８７，１９８０に記載されている。 “ＩＧＦ関連状態”という語は、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質もしくはＩＧ Ｆレセプターの産生過剰または産生低下、結合タンパク質またはレセプターへの ＩＧＦの不適当または不十分な結合、及びＩＧＦＢＰ、特にＩＧＦＢＰ−１の投 与によって症状が軽減または縮小される任意の疾患に起因または関連する既存の 、または潜在的な有害生理状態を意味する。ＩＧＦ関連状態はまた、通常の患者 へのＩＧＦＢＰ−１を含めたＩＧＦＢＰの投与が所望の効果を有する状態も意味 する。ＩＧＦ関連状態の例には、乳癌、結腸癌、骨肉腫、神経膠腫、肺癌、横紋 筋肉腫、卵巣癌、 肝癌、先端巨大症、肥満症、腫瘍誘発性低血糖症、肺線維症、再発狭窄症、糖尿 病性ネフロパシー及び糖尿病性網膜障害が含まれる。 “患者”という語は、ＩＧＦ関連状態の治療を必要とするヒトを含めた任意の 動物を意味する。 “ＩＧＦＢＰ”という語は、６種の既知ＩＧＦ結合タンパク質のうちのいずれ か、または前記結合タンパク質のＩＧＦに結合するフラグメントを意味する。Ｉ ＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは血中を、現在６種が既知である特異的結合タンパク 質に結合して循環する。結合タンパク質は血中のＩＧＦの９５％以上と結合する 。一理論によれば、結合タンパク質によって結合された場合、ＩＧＦ−Ｉ及びＩ ＧＦ−ＩＩはその生物機能を媒介する幾つかの細胞表面レセプターとの相互作用 を妨げられる。 ＩＧＦ結合タンパク質−１は２３ｋＤａのＩＧＦ結合タンパク質である。ＩＧ ＦＢＰ−１はｉｎ ｖｉｖｏにおいて成長停止（例えば飢餓及び糖尿病）の期間 に発現され、このことはＩＧＦＢＰ−１がＩＧＦ−Ｉ阻害剤であることを示唆し ている。Ｏｈ等，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３２，ｐｐ．１３３７−１３４４， １９９３は、ＩＧ Ｆ−ＩとＩＧＦ−ＩＩとがＩＧＦＢＰ−１への親和性において実質的に等しい能 力を有することを報告している。 羊水はＩＧＦＢＰ−１の天然源であり、この結合タンパク質のリン酸化形態と 非リン酸化形態との両方を含有する。Ｊ．Ｉ．Ｊｏｎｅｓ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８ ，ｐｐ．７４８１−７４８５，１９９１参照。リン 酸化ＢＰ−１は非リン酸化形態よりもＩＧＦ−Ｉへの親和性が高い。Ｊ．Ｉ．Ｊ ｏｎｅｓ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２，ｐｐ．１１２５−１１３１ ，１９９３参照。Ｊｏｎｅｓ等によれば、ＢＰ−１のリン酸化形態は細胞成長抑 制性であるが、非リン酸化ＢＰ−１は細胞成長剌激性である。細菌において発現 された組み換え産生ＢＰ−１はリン酸化されず、ＩＧＦ−Ｉの作用を増強するこ とが判明している。Ｄ．Ｌａｄｉｎ等，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １７Ｅ，ｐ．１２７，１９９３参照。 しかし、本明細書中に用意したデータは、非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１もｉｎ ｖｉｔｒｏ 及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞成長抑制性であり得ることを示して いる。特に、 細菌由来の組み換えＢＰ−１は幾つかのＩＧＦ関連状態に付随する有害な細胞成 長を抑制することが明らかとなった。 従って、本発明の方法に有用なＩＧＦＢＰ−１はリン酸化または非リン酸化形 態であり得る。即ち、本発明に有用なＢＰ−１は羊水などの天然源から精製する か、または当業者に良く知られた組み換え操作に従い作製することが可能である 。成熟ＩＧＦＢＰ−１のアミノ酸配列は （配列番号１）である。 シグナル配列のアミノ酸配列はＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ −Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ −Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号２）である。 配列番号１の配列を用いて、当業者はＩＧＦＢＰ−１をコードするＤＮＡを化 学的に合成し得る。あるいは他の場合には、当業者は配列番号１の配列に基づき オリゴヌクレオチドプローブを設計してゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、 かつｃＤＮＡを発生させることができる。ＩＧＦＢＰ−１をコードするＤＮＡは 、組み換え産生のために宿主を形質転換するのに用い得る。 例えば、ＢＰ−１は大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ３においてＴ７プロモーター系を用 いて、封入体中の不溶性タンパク質として発現させ得る。ＢＬ２１／ＤＥ３はＦ ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ及びＢ．Ｍｏｆｆａｔｔによって、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．１８９ ，ｐｐ．１１３−１３０，１９８６に説明されている。あるいは他の場 合には、ＴＡＣプロモーター系を用い得る。大腸菌において、組み換え発現され たＢＰ−１は不溶性フラクションに含まれる。不溶性タンパク質は不適正に折り 畳まれ、不活性である。タ ンパク質を６Ｍグアニジン及び還元剤に溶解させ、混合物を１０倍に稀釈し、か つ一晩放置してＢＰ−１を復元させることにより、ＢＰ−１を変性させ、かつ折 り畳んでその適正構造とすることができる。ＩＧＦＢＰ−１は１８個のシステイ ン残基を有し、これらは総てジスルフィド架橋の形成に関与すると考えられる。 ＢＰ−１中に多数のシステイン残基が存在するにもかかわらず、タンパク質はた だ１個の大型種に復元される。復元タンパク質は、連続するＱ−セファロース及 びブチル−セファロースカラムを用いて精製し得る。精製ＢＰ−１の、１０１の 発酵槽での１回の操作当たりの収量は約１．５ｇである。 ＩＧＦＢＰ−１は、いずれも特に本明細書中に参考として含まれるＪ．Ｉ．Ｊ ｏｎｅｓ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，ｐｐ．７４８１− ７４８５，１９９１及びＪ．Ｉ．Ｊｏｎｅｓ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６ ８：２ ，ｐｐ．１１２５−１１３１，１９９３に提示されている哺乳動物発現系 においても発現され得る。哺乳動物系での発現のためには、成熟タンパク質とシ グナル配列との両方をコードするＤＮＡを用いるべきである。当業者は任意の適 当なベ クター及び発現系を所望どおりに選択し得る。 ＩＧＦＢＰ−１を含めたＩＧＦＢＰの治療有用性は、その循環半減期を延長す ることによって高め得る。タンパク質の分子量を、例えばタンパク質にポリエチ レングリコール（ＰＥＧ）などの不活性ポリマー鎖を共有結合させることによっ て大きくすると、身体中でのタンパク質の循環半減期が長くなることが知られて いる。例えば、Ｄａｖｉｓ等，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｐｏ ｌｙｍｅｒｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｕｓｅ，ｐｐ．４４ １−４５１，１９８ ０を参照されたい。タンパク質へのＰＥＧの共有結合を、本明細書中では“ＰＥ Ｇ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）”と呼称する。“ＰＥＧ化した”という語はポリ マーに結合させたことを意味する。 有用な或るＰＥＧ化法は、チオール特異的な反応性基で活性化したポリマーへ の結合に有効なシステイン残基を有するムテインを創出することを含む。ムテイ ンは、当業者に良く知られた突然変異誘発技術を用いて調製可能である。例えば 、１個以上の特定アミノ酸をシステイン残基で置換 することによって、またはアミノ酸間やＮもしくはＣ末端にシステイン残基を挿 入することによってＩＧＦＢＰ−１ムテインを創出する。上記のような非天然シ ステイン残基は“自由”である、即ち分子内ジスルフィド結合に関与しないと予 測される。非天然システイン残基はＩＧＦＢＰ−１分子の、タンパク質表面に露 出し、かつレセプター結合もしくはＩＧＦへの結合に関与しない領域において置 換または挿入可能である。システインの挿入または置換のための部位の一つはＢ Ｐ−１タンパク質の中央に存在し得る。システインは、配列番号１の配列に基づ く残基ナンバリングで６０〜１８０の番号を有するアミノ酸において置換または 挿入可能であると考えられる。特に有用なムテインは、天然のタンパク質ではセ リンが位置する９８位及び１０１位にシステイン残基を有する。 １個以上のＩＧＦＢＰ−１分子への不活性ポリマー鎖分子の結合は更に別の改 変形態のＩＧＦＢＰ−１、即ち“ＰＥＧ化したＩＧＦＢＰ−１”とも呼称するＩ ＧＦＢＰ−１−ポリマー結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をもたらす。チオール特 異的反応性基のポリマーへの結合は、本明細書に参考として含まれる国際特許出 願公開第９２／１６２２１ 号に検討されている。システインムテインがポリマーにチオール特異的反応性基 を介して結合する場合、形成された結合体は前記タンパク質の非天然システイン 残基に結合すると予測される。しかし、ムテインの復元の際に非天然システイン はジスルフィド結合に関与するようになり、それによって天然システインをＰＥ Ｇ化のために解放するかもしれない。そのような場合、ポリマーは天然システイ ン残基に結合する。ペプチドマッピングを用いれば、特異的ＰＥＧ化部位を決定 することができる。 ２個のＩＧＦＢＰ−１分子がポリマー分子の両端に１個ずつ位置する“ダンベ ル形”分子も予測される。 当業者が通常の方法を用い、かつ本明細書に参考として含まれる国際特許出願 公開第９２／１６２２１号の教示及び本明細書の教示に従えば、上述のような改 変形態を有するＩＧＦＢＰ−１を含めたＩＧＦＢＰの製造に有用である適当なｐ Ｈ、タンパク質濃度及びタンパク質対ポリマー比は容易に決定できる。 本発明は、ＩＧＦＢＰ−１を含めたＩＧＦＢＰを許容可能な医薬用キャリヤ中 に存在させて含有する医薬組成物も提供する。キャリヤの一つに生理的食塩液が 有るが、その 他の許容可能な医薬用キャリヤを用いることも可能であると予測される。一具体 例では、キャリヤ及びＩＧＦＢＰ−１は生理適合性の徐放製剤を構成すると考え られる。その際、キャリヤ中の主要な溶媒は水性であっても非水性であってもよ い。加えて、キャリヤは製剤のｐＨ、オスモル濃度、粘度、清澄度、色、無菌性 、安定性、溶解速度または臭気を変更または維持する、医薬に許容可能な他の賦 形剤も含有し得る。同様に、キャリヤはＩＧＦＢＰ−１の安定性、溶解速度、放 出性または吸収性を変更または維持する、医薬に許容可能な更に別の賦形剤も含 有し得る。このような賦形剤は、単位投与形態または多投与形態での投与用に調 剤するのに普通習慣的に用いられる物質である。 調製した治療用組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、または脱水も しくは親液化粉末として滅菌バイアル内に貯蔵し得る。上記のような製剤はその まま用い得る形態でも、あるいはまた投与の直前に再構成を必要とする形態でも 貯蔵可能である。上記製剤の好ましい貯蔵は、少なくとも４℃、好ましくは−７ ０℃もの低温で行なう。ＩＧＦＢＰ−１を含有する上記製剤を生理的ｐＨかまた はその近似ｐＨにおいて貯蔵及び投与することも好ましい。現在、 高いｐＨ値（即ち９を上回る）または低いｐＨ値（即ち４を下回る）での製剤の 貯蔵及び投与は望ましくないと考えられている。 本発明の医薬組成物は静脈内、非経口、筋肉内、皮下、関節内注射もしくは注 入によって、または吸入ミスト、経口活性製剤もしくは坐剤の形態で投与し得る 。ＩＧＦＢＰ−１の所望投与量を達成し、かつ維持するべく、一回量を反復投与 することが可能である。この方法は、予め選択した範囲内のＩＧＦＢＰ−１濃度 を患者の血流中に実現するためのものである。血流中でのＩＧＦＢＰ−１の循環 濃度を０．１〜３００μｇ／ｍｌに維持することはＩＧＦ関連状態の治療に有効 であり得ると考えられる。投与頻度は、用いる製剤中のＩＧＦＢＰ−１の薬物動 力学的パラメーターに依存する。 本発明の方法は、後出の実施例に述べた実験に一部基づく。手短に言えば、本 発明者等はＩＧＦＢＰ−１が、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩがｉｎ ｖｉｔｒｏ で乳癌、結腸癌及び骨肉腫癌細胞に及ぼすマイトジェン作用を妨げることを発見 した。エストロゲンは、細胞にＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを分泌させること によって少なくとも部分的 に乳癌の成長を刺激する。 結腸癌の成長を抑制するには１〜１０μｇ／ｍｌのＢＰ−１濃度が必要であっ た。或る結腸癌細胞系は無血清含有培地中で成長したが、これはおそらくその細 胞系が該細胞系自体の成長因子を産生したからである。無血清培地中での上記細 胞系の成長は、高濃度のＢＰ−１で少なくとも５０％抑制された。 本発明者等は、ＩＧＦＢＰ−１がＩＧＦ−Ｉの骨肉腫細胞へのマイトジェン作 用を抑制することを証明した。５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉがラット骨肉腫細胞 に及ぼすマイトジェン作用の５０％を約１２倍モル過剰量のＩＧＦＢＰ−１が抑 制した。 ＩＧＦＢＰ−１はＩＧＦ−Ｉに対する平滑筋細胞の増殖応答を抑制することも 判明した。ラットにおいて血管形成後に投与したＩＧＦＢＰ−１は、平滑筋増殖 及び細胞外マトリックス付着に起因する内膜肥厚を著しく抑制した。このような 結果は、ＩＧＦＢＰ−１が再発狭窄症の治療または予防に有用であることを示し ている。 下垂体切除したラットにおいて、ＩＧＦＢＰ−１はＩＧＦ−Ｉ及び成長ホルモ ンの成長促進作用を抑制した。加え て、ＩＧＦＢＰ−１、そのムテイン、及びＰＥＧ化したＩＧＦＢＰ−１はマウス ３Ｔ３線維芽細胞の成長のＩＧＦ−Ｉ剌激を抑制した。 以下の実施例によって、本発明を非限定的に詳述する。 実施例１ Ａ．ＩＧＦＢＰ−１の精製および復元 ＩＧＦＢＰ−１を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉ ｓ，ｐＨ７．５，２０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＤＴＴ）中に、細胞ペースト １０ｇ当たり４０ｍｌの濃度で懸濁させ、フレンチプレスセルを使用して１８０ ０ｐｓｉで破壊した。懸濁液を２０，０００×ｇで３０分間遠心し、ペレット及 び上清のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＩＧＦＢＰ−１に対 応する主要バンドはペレット中には存在したが、上清中には存在しなかった。ペ レットを緩衝液Ａ（細胞ペースト１０ｇ当たり４０ｍｌ）中に懸濁させ、２０， ０００×ｇで３０分間再度遠心した。この洗浄プロセスを２回繰返した。ＩＧＦ ＢＰ−１を含む最終ペレットを、粉砕ガラスホモジナイザーを使用して６Ｍグア ニジン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，６ｍＭ ＤＴＴ（細胞１０ｇ当たり ２５ｍｌ）中に懸濁させた。懸濁液を室温で１５分間インキュベートした。溶解 しなかったタンパク質を、２０，０００×ｇで３０分間遠心することにより除去 した。ＩＧＦＢＰ−１の終濃度は１．０ｍｇ／ｍｌであった。ペレット及び上清 の ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、ＩＧＦＢＰ−１は上清中にのみ存在することが判っ た。 変性及び還元したＩＧＦＢＰ−１に３ステップからなる復元処理を実施した。 ａ）混合ジスルフィド生成試薬（ＧＳＳＧ）である酸化グルタチオンを上清に 終濃度２５ｍＭに添加し、室温で１５分間インキュベートした。 ｂ）次いで溶液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ９．７で徐々に１０倍に希釈し、 フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭに添加した。タンパク質の終濃 度は１００μｇ／ｍｌであった。 ｃ）復元混合物を４℃で一晩インキュベートした後、２０，０００×ｇで１５ 分間遠心した。ペレット及び上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、上清は比較的均 一なＩＧＦＢＰ−１からなることが確認された。 上清のアリコート（５０μｌ）を緩衝液Ｃ（０．０５％ＴＦＡ）で２００μｌ に希釈し、逆相カラム（ＲＰ−４，１×２５０ｍｍ，Ｓｙｎｃｈｒｏｍ）に注入 し、８０％アセトニトリル、０．０４２％ＴＦＡ（緩衝液Ｄ）を用い、直線濃度 勾配（１分間に緩衝液Ｄ濃度の１％増加）にて流 量０．１ｍｌ／分で溶出した。 復元されたＩＧＦＢＰ−１を表わす単一主要ピークは６８分に溶出した。５Ｍ グアニジン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＤＴＴ中で完全に 還元され変性された後では、復元ＩＧＦＢＰ−１の保持時間は７１．０分にシフ トした。これらの結果は、ＩＧＦＢＰ−１が記載の条件下で単一優勢種に折り畳 まれたことを示している。６８．０分に溶出したＩＧＦＢＰ−１のＮ末端配列分 析からは配列Ｍｅｔ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒ ｏ・・・（配列番号３）が得られたが、これは、組換えタンパク質のＮ末端には 追加メチオン残基があることを除き、ヒトＩＧＦＢＰ−１のＮ末端アミノ酸配列 （配列番号１）と一致する。 Ｂ．復元ＩＧＦＢＰ−１の単離 正しく復元されたＩＧＦＢＰ−１を含むＥ．ｃｏｌｉペースト５９０ｇから調 製した復元混合物（１５０００ｍｌ）を１８００ｍｌに濃縮し、２０ｍＭリン酸 ナトリウム，ｐＨ６．０に対して透析し、１０，０００×ｇで３０分間遠心する ことで沈殿したＥ．ｃｏｌｉタンパク質を除去し、同じ緩衝液で予め平衡化して おいたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラム（５．０ ×６０ｃｍ）に添加した。結合したタンパク質を、０．５Ｍ ＮａＣｌまでの直 線濃度勾配をを持つ５０００ｍｌを用い、流量２０ｍｌ／分で溶出し、２５ｍｌ フラクションを回収した。単一主要ピークは０．３〜０．４Ｍ ＮａＣｌのとき 溶出した。各フラクションのアリコート１００μｌを逆相クロマトグラフィーカ ラム（ＲＰ−４ １×２５０ｍｍ Ｓｙｎｃｈｒｏｍ）によって個々に分析した 。（ＲＰ−４分析から判断して）主に正しく復元されたＩＧＦＢＰ−１を含むフ ラクションをプール（９００ｍｌ）し、ｐＨを７．５に調整し、導電率を１ｍＭ ＮａＣｌ（９５ｍΩ）に調整し、２０ｍｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，１．０ Ｍ ＮａＣｌで予め平衡化しておいたＴｏｙｏｐｅａｒｌ ｂｕｔｙｌ−６５０ Ｓ疎水性相互作用カラム（５×５ｃｍ）（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎ ｔｅ，ＰＡ）に流量３０ｍｌ／分で添加した。 タンパク質を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５までの直線濃度勾配を持つ １５００ｍｌを用い、流量４０ｍｌ／分で溶出した。単一広域ピークが５〜１５ ％エタノールで溶出した。各ピークフラクションのアリコート（１０μｌ） をＲＰ−４逆相クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。純 粋な（９５％）正しく復元されたＩＧＦＢＰ−１を含むフラクションをプールし 、６〜８ｍｇ／ｍｌに濃縮し、生物活性を分析した。ＩＧＦＢＰ−１を使用する 下記の実験の全てにおいて、組換えＥ．ｃｏｌｉ発現ＩＧＦＢＰ−１を使用した 。 実施例２ ラットにおけるＩＧＦ−Ｉ及び成長ホルモンの成長促進作用のＩＧＦＢＰ−１に よる阻害 下垂体摘除（下垂体の除去）により個体から成長ホルモン源を除去すると、成 長が停止する。下垂体摘除した被検動物にＳｃｈｏｅｎｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ， ２９６：２５２−２５３（１９８２）に記載のごとく外来成長ホルモンまたはＩ ＧＦ−Ｉを注射すると、当該動物の成長を刺激させ得る。このモデルにおいてＩ ＧＦ−１及び成長ホルモン刺激による成長に及ぼす皮下投与ＩＧＦＢＰ−１の作 用を試験した。成長は、体重増加及び脛骨骨端幅を測定することにより評価した 。Ａ．ＩＧＦ−Ｉ実験 外科手術によって下垂体を摘除した体重１２０〜１３０ ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを市販業者（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉ ｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。下垂体摘除の完全性を検 証するため、実験を開始する前にラットの体重を２〜３週間モニターした。体重 が１週間に２ｇ以上増加したラットは実験に使用しなかった。ラットに、０．２ ｍｌのビヒクル溶液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）、ＩＧＦ −Ｉ（８０μｇ）のみ、ＩＧＦＢＰ−１のみ、または種々のモル比のＢＰ−１と 組合わせたＩＧＦ−Ｉ（８０μｇ）を、首筋に１日２回、８日間続けて皮下注射 した。試験したＩＧＦＢＰ−１：ＩＧＦ−Ｉのモル比は０．０４：１〜５：１で あった。体重は毎日測定した。最後の注射を行ってから１２時間後にラットを殺 した。Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，４５：４５５−４６ ３（１９４９）に記載のごとく、左右の脛骨を摘出し、ホルマリンで固定し、矢 状平面の遠位端部で裂開し、硝酸銀で染色した。石灰化した組織は暗褐色に染色 され、軟骨の増殖域は鮮明な白帯として現れた。軟骨骨端板を、校正接眼マイク ロメーターを備えた実体顕微鏡で測定した。各骨端に対して、おおよそ１０個の 読取り値を得た。ラットごとに、左 右の脛骨の読取り値を合わせて平均を計算した。 数回の実験の結果を表１にまとめて示す。ビヒクルで処理したラットは８日間 の試験期間中に体重増加を示さなかったが、ＩＧＦ−Ｉで処理したラットはこの 間に１ラット当たり平均約６ｇの体重増加を示した。ＩＧＦＢＰ−１：ＩＧＦ− Ｉが５：１のグループのラットは有意な体重増加を示さず、このことから、この モデルにおいては過剰量のＩＧＦＢＰ−１がＩＧＦ−Ｉの成長促進作用を妨げた ことが判る。ＩＧＦＢＰ−１をＩＧＦ−Ｉに対してモル比１：１〜０．２：１で 投与すると、ＩＧＦ−Ｉ剌激による成長が５０〜７５％阻害された。ＩＧＦＢＰ −１を投与したグループにおいて、ＩＧＦ−Ｉのみの刺激成長率より高い成長を 示したグループはなかった。更に、ＩＧＦＢＰ−１のみを投与した場合も有意な 成長促進作用は見られなかった。ＩＧＦ−Ｉ剌激による脛骨骨端幅の拡大に関し て、ＩＧＦＢＰ−１をＩＧＦ−Ｉに対してモル比５：１〜１：１で投与した場合 に統計的に有意な阻害が生じた（表１）。これらのデータから、ＩＧＦＢＰ−１ はＩＧＦ−Ｉ剌激による骨及び軟骨の成長を阻害することが判る。 Ｂ．成長ホルモン実験 この実験の方法はＩＧＦ−Ｉの実験と同様であるが、但し、ラットにＩＧＦ− Ｉではなくて成長ホルモンを投与した。成長ホルモンとＩＧＦＢＰ−１とを別々 の注射部位に 皮下注射した。ＩＧＦＢＰ−１は、１回の注射で、上述の実験において５：１の モル過剰比で投与したものに相当する１０ｍｇ／ｋｇの用量を、１日２回投与し た。ヒト下垂体誘導成長ホルモン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ ｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１５ｍＵ／注射の量で１日２回投与した。こ の成長ホルモンの用量により、ラットにおいて、先の実験で使用したＩＧＦ−Ｉ の投与より強力な成長応答が剌激された。成長ホルモンで処理したラットは、６ 日間の投与期間中に１ラット当たり平均１２ｇの体重増加を示した（表２）。Ｉ ＧＦＢＰ−１で処理したラットにおいては体重増加が約７５％阻害された。脛骨 骨端幅の成長ホルモン刺激による増加は、ビヒクル処理被検動物と比較して約２ 倍であった（表２）。脛骨骨端幅の成長ホルモン刺激による増加は、ＩＧＦＢＰ −１を同時投与することで約７５％阻害された（表２）。 上記実験から、ＩＧＦＢＰ−１は、ラットにおいてＩＧＦ−Ｉ及び成長ホルモ ン両方の成長促進作用を阻害し得ることが判る。 実施例３ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト乳癌細胞系増殖のＩＧＦ−Ｉによる阻害 ヒト乳癌細胞系において、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦＢＰ−１の生 物学的作用を評価した。ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ７を、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ にあるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎか ら入手した（カタログ番号ＨＴＢ ２２）。細胞を、１０％ウシ胎児血清、１０ μｇ／ｍｌインシュリン、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ ００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び非必須ア ミノ酸（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むイーグル最少必須培地（ Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡから入手可能）中に維持した。細胞 増殖アッセイのため、ＭＣＦ７を、トリプシン及びＥＤＴＡで簡単に処理するこ とによりプレートから取り出した。細胞を９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓ ｔａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）において無血清 培地（１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸 ナトリウム、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシ ン及び非必須アミノ酸を含むイーグル最少必須培地）中で２×１０4／ウェルで 平板培養した。種々の希釈濃度のＩ ＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦＢＰ−１をウェルに終容積２００μｌまで 添加した。３７℃で４日後、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２− イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能，カタログ番号Ｍ５６５５）の５ｍｇ／ｍ ｌ溶液２０μｌを各ウェルに添加し、細胞を３７℃で更に６時間インキュベート した。５０％ジメチルホルムアミド、２０％ドデシル硫酸ナトリウム，ｐＨ４． ７の溶液５０μｌを添加することにより、細胞及び加水分解されたＭＴＴを可溶 化した。３７℃で一晩インキュベートした後、ＶＭＡＸ速度マイクロプレートリ ーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａ ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用い、５７０ｎｍにおける液体の光学濃度を測定し、 ６５０ｎｍ光学濃度バックグラウンドを差し引くことにより、加水分解されたＭ ＴＴを定量した。 細胞培養液の光学濃度の増加によって立証されるように、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧ Ｆ−ＩＩはいずれもＭＣＦ７細胞の増殖を惹起した（表３）。ＭＣＦ７細胞増殖 の剌激において、ＩＧＦ−ＩはＩＧＦ−ＩＩより約５倍強力であった。ＭＣ Ｆ７細胞の増殖は、約１〜１２０ｎｇ／ｍｌの範囲のＩＧＦ−Ｉ濃度、及び約１ ０〜１２００ｎｇ／ｍｌの範囲のＩＧＦ−ＩＩ濃度で生じた。ＩＧＦＢＰ−１は 、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの刺激によるＭＣＦ７細胞増殖を用量に応じて阻 害した（表４及び５）。これは、ＭＣＦ７細胞を、６０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ または３００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−ＩＩと一緒に増加量のＩＧＦＢＰ−１の存在 下でインキュベートすることにより確認された。使用した組織培地は細胞を維持 するのに使用したものと同じであったが、但し、血清もインシュリンも含んでい なかった。 ＩＧＦ−Ｉに対しては、試験したＩＧＦＢＰ−１濃度は６〜１３，６００ｎｇ ／ｍｌの範囲であった。ＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−１のモル比が約１：１に相当 する約１８０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−１濃度で約５０％の増殖阻害が起こった （表４）。約２０倍モル過剰量のＩＧＦＢＰ−１に相当する４０００ｎｇ／ｍｌ を超えるＩＧＦＢＰ−１濃度で増殖は実質的に完全に阻害された。 ＩＧＦ−ＩＩに対して試験したＩＧＦＢＲ−１濃度は約３０ｎｇ／ｍｌ〜約２ ３，０００ｎｇ／ｍｌの範囲であった。ＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−１のモル比が １：１より僅 かに大きくなる約８４０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−１濃度で、ＩＧＦ−ＩＩ増殖 応答が約５０％阻害された（表５）。２０倍を僅かに超えるモル過剰量のＩＧＦ ＢＰ−１に相当する２２，０００ｎｇ／ｍｌを超えるＩＧＦＢＰ−１濃度で増殖 は実質的に完全に阻害された。 実施例４ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト結腸癌細胞系増殖のＩＧＦＢＰ−１による阻害 多数のヒト結腸癌細胞系においてＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−１の生物学的作 用を試験した。６種のヒト結腸癌細胞系をＲｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤにあるＡｍ ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した 。これらの細胞系はＳＫ−ＣＯ−１（ＨＴＢ ３９）、ＬＳ １７４Ｔ（ＣＬ １８８）、ＤＬＤ−１（ＣＣｌ ２２１），ＨＴ−２９（ＨＴＢ ３８）、ＣＯ ＬＯ−２０５（ＣＣＬ ２２２）及びＣａｃｏ−２（ＨＴＢ３７）であった。か っこ内の記号はＡＴＣＣカタログ番号を指す。これらの細胞系を選択した理由は 、これら全てがＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎカタログ中の記載によればヌードマウスにおいて腫瘍を形成するからであ る。細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシ リン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むイーグル最少必須培地（Ｍ ｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中に維持した。 これら６種の結腸癌細胞系に及ぼすＩＧＦ−Ｉの作用を以下のように評価した 。細胞が９０〜１００％集密に達したならば、細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡで 簡単に処理することによりプレートから取り出した。細胞を数回洗浄し、カウン トし、無血清培地（２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００ μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むイーグル最少必須培地）中に１×１０5／ ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液１００μｌを９６ウェル組織培養プレー ト（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）の 各ウェルに添加した。種々の量のＩＧＦ−Ｉを含む無血清培地１００μｌをウェ ルに添加し、培地をピペットで吸引することにより静かに混合した。プレートを ３７℃で３日間インキュベートした。この時点で、クリスタルバイオレット染色 アッセイを使用して細胞数を定量した。培地を細胞から吸い取り、１５０μｌの クリスタルバイオレット染料［２ｇのクリスタルバイオレット（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉ） を２７０ｍｌの３７％ホルムアルデヒド及び２０ｍｌのリン酸カリウムｐＨ７． ０に溶解したもの］を各ウェルに添加した。 ２０分後、液体を吸い取り、ウェルをリン酸緩衝塩類溶液で３回洗浄した。２０ ０μｌの抽出緩衝液（５０％エタノール、０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ４． ２）を各ウェルに添加し、プレートを室温で一晩放置した。翌日、マイクロプレ ートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ Ａ）を使用して５７０ｎｍにおけるウェルの光学濃度を測定した。 細胞培養物の光学濃度の増加により立証されるように、６種の細胞系の全てが ＩＧＦ−Ｉに応答して増殖した（表６及び７）。Ｃａｃｏ−２細胞系は無血清培 地においてよく増殖しており、このことから、それが１種以上の外来増殖因子を 産生していることが判る。無血清培地におけるＣａｃｏ−２細胞系の増殖はＩＧ Ｆ−Ｉによって増強された（表６）。試験した他の結腸癌細胞系は、試験条件下 の無血清培地中では有意な細胞増殖を示さなかった。しかしながら、これらは全 てが、培養物の光学濃度の増加によって立証されるように、ＩＧＦ−Ｉに応答し て増殖した（表６及び７）。 次いで、ＩＧＦＢＰ−１がこれらの細胞系の増殖に及ぼす作用を調べた。ＩＧ ＦＢＰ−１がＩＧＦ−Ｉ剌激による細胞増殖に及ぼす作用を調べるよりもむしろ 、ＩＧＦＢＰ−１が血清の存在下で細胞増殖を阻害し得るかの判定の方がｉｎ ｖｉｖｏ 状況を表し得るため、これを調べた。簡単なトリプシン／ＥＤＴＡ処理 によりプレートから細胞を取り出し、洗浄し、４％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタ ミン、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを 含むイーグル最少必須培地に１×１０5個 ／ｍｌの濃度で再度懸濁させ、１００μｌの細胞懸濁液を、９６ウェル細胞組織 培養プレートの各ウェルに添加した。ＩＧＦＢＰ−１を、２ｍＭグルタミン、１ ００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む無血 清イーグル最少必須培地で異なる濃度に希釈し、１００μｌの混合物を９６ウェ ルプレートの各ウェルに添加した。細胞培養物を軽くピペットで取って混合し、 ３７℃で３日間インキュベートした。最終血清濃度は２％であった。この時点で 、前述のクリスタルバイオレット染色アッセイを用いて細胞数を定量した。ＩＧ ＦＢＰ−１は、２％血清の存在下で４つの細胞系（Ｃａｃｏ−２，ＣＯＬＯ−２ ０５，ＨＴ−２９及びＳＫ−ＣＯ−１）の増殖応答をかなり阻害した（表８及び 表９）。ＩＧＦＢＰ−１のレベルが数百ｎｇ／ｍｌに達するまでは増殖阻害はほ とんど見られなかった。観察された最大の増殖阻害は、３０％〜１００％（ＩＧ ＦＢＰ−１レベル：１０〜２０μｇ／ｍｌ）であった。ＩＧＦＢＰ−１は、ＬＳ １７４Ｔ及びＤＬＤ−１細胞系の血清刺激増殖にはほとんど作用しなかった（ １０〜２０μｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−１でのそれぞれの最大阻害率は９％及び２ ２％）。血清中の遊離ＩＧＦ−Ｉ及び ＩＧＦ−ＩＩ濃度は測定しなかった。 実施例５ ｉｎ ｖｉｔｒｏ におけるＩＧＦＢＰ−１によるヒト骨肉腫細胞系の増殖阻害 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏ ｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手したラット骨肉腫細胞系ＵＭＲ−１０６（ＣＲ Ｌ １６６１） を用いて、骨肉腫のＩＧＦ−Ｉ剌激増殖に対するＢＰ−１の阻害能力を調べた。 これらの細胞を、７％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭグルタミンを含むハムＦ１２培地（Ｍｅｄ ｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ製）中に維持した。細胞は、４８ウェル組 織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ，ＭＡ）のウェルでＩＧＦ−Ｉに応答して増殖する。（３７℃で約３日間の後に ）細胞が集密状態になると、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄し、 ウシ胎児血清を含まない前記培地で２４時間プレインキュベートした。プレイン キュベートした後に、培地を除去し、系列希釈のＩＧＦ−Ｉ（１〜１，０００ｎ ｇ／ｍｌ）を含む無血清ハムＦ１２培地０．５ｍｌに代えた。プレートを３７℃ で更に２０〜２４時間インキュベートした。次いで、各ウェルに０．５μＣｉの3 Ｈ−チミジン（ＮＥＮ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｄｕｐｏｎｔ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＮＡ）を３７℃で４時間パルスし、次いで冷ＰＢＳで ３度洗浄した。７％冷トリクロロ酢酸（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｉｎｃ．，Ｐｈｉ ｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）を細胞 に添加して、ＤＮＡを沈殿させた。９５％エタノールで濯いだ後に、０．３Ｍ ＮａＯＨを添加して、細胞を可溶化した。アリコートを除去し、シンチレーショ ンカウンターでカウントして、ＤＮＡ中に取り込まれた3Ｈ−チミジンの量を定 量した。全てのアッセイは３度実施した。 表１０に示すように、ＩＧＦ−Ｉは 、ＤＮＡ中に取り込まれる3Ｈ−チミジンを用量に応じて増加させた。最大応答 は、ＩＧＦ−Ｉの不在下で見られるレベルの約６倍であった。異なる実験でのＩ ＧＦ−ＩのＥＤ50は４〜２０ｎｇ／ｍｌであった。 前述のアッセイを用いて、ＩＧＦＢＰ−１がＵＭＲ−１０６細胞のＩＧＦ−Ｉ 刺激増殖に及ぼす作用を調べた。但し、以下の点が前述のアッセイとは異なる。 プレインキュベーション段階の後に、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉ及び 濃度の異なるＢＰ−１（２００〜１６，０００ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清ハムＦ １２培地と共にインキュベートした。培地は更に、２ｍＭグルタミン、１００単 位／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含んでいた。 ３７℃で２０〜２４時間の後に、細胞に０．５μＣｉの3Ｈ−チミジンを４時間 パルスし、冷ＰＢＳで３度濯ぎ、７％冷トリクロロ酢酸でＤＮＡを沈殿させた。 細胞を９５％エタノールで濯ぎ、０．３Ｍ ＮａＯＨで可溶化し、シンチレーシ ョンカウンターでアリコートをカウントした。 ３回の実験のうちの１回の結果を表１１に示す。データは、ＩＧＦＢＰ−１が ＩＧＦ−Ｉの骨肉腫細胞への分裂誘発作用を阻害することを示している。約１２ 倍モル過剰のＩＧＦＢＰ−１（２，０００ｎｇ／ｍｌ）が、５０ｎｇ／ｍｌ Ｉ ＧＦ−Ｉの分裂誘発作用を５０％阻害した。５０〜１００倍モル過剰のＩＧＦＢ Ｐ−１（８，０００〜１６， ０００ｎｇ／ｍｌ）で、５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉの分裂誘発作用が殆ど完全 に阻害された。これらの実験でＩＧＦ−Ｉの作用を阻害するのに必要なＩＧＦＢ Ｐ−１の量は、他の実験や、他の細胞系を用いて観察された量よりも多い。これ は恐らく、５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉがこの実験で最大の分裂誘発応答をもた らたという事実による。 実施例６ ＩＧＦＢＰ−１による平滑筋細胞の増殖阻害 ＩＧＦＢＰ−１を試験して、ＩＧＦＢＰ−１がＩＧＦ−Ｉに対する平滑筋細胞 の増殖性応答を阻害し得るかを調べた。ラット平滑筋細胞様細胞系Ａ１０をＲｏ ｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ ｌｅｃｔｉｏｎから入手した（カタログ＃ＣＲＬ １４７６）。Ａ１０細胞系の 特徴は、Ｂ．Ｗ．Ｋｉｍｅｓ及びＢ．Ｌ．Ｂｒａｎｄｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，９８：３４９−３６６（１９７６）に記載 されている。細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍ ｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（イ ーグル培地のダルベッコ変形、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｈｅｒｎｄｏｎ， ＶＡ製）中に維持した。増殖アッセイのために、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶 液で簡単に処理してプレートから取り出し、血清含有培地で１度、無血清培地で ２度洗浄し、血球計を用いてカウントした。細胞を、２ｍＭグルタミン、１００ 単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む無血清Ｄ ＭＥＭ培地に２×１０5個／ｍｌの濃度で再度懸濁させた。９６ウェル組織培養 プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓ ｓ Ｗｏｒｋｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）の各ウェルに、１００μｌの細胞 懸濁液のアリコートを添加した。１００ｐｌの無血清培地を、培地中のＩＧＦ− Ｉ量を増加しながら（０、２、２０、２００又は２０００ｎｇ／ｍｌ）適切なウ ェルに添加し、プレートを３７℃で３日間インキュベートした。この時点で、実 施例３に記載のクリスタルバイオレット染色アッセイを用いて細胞数を定量した 。 ＩＧＦ−Ｉは、ウェルの光学濃度測定の増加から分かるように、細胞数を用量 に応じて増加させた（表１２）。１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ濃度で、最大の 増殖性応答が生じた。 前述の細胞増殖アッセイを用いて、組換えＩＧＦＢＰ−１がＡ−１０細胞のＩ ＧＦ−Ｉ剌激増殖に及ぼす作用を調べた。試験ウェルが１００ｎｇ／ｍｌのＩＧ Ｆ−Ｉを含んでいることを除き、アッセイは同一方法で実施した。数個のウェル には更に、１〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＧＦＢＰ−１を含ませた。 ＩＧＦＢＰ−１は、細胞培養物の光学濃度の減少から明白なように、細胞数を 用量に応じて減少させた（表１３）。１０００ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＧＦＢＰ−１ では、細胞数は、外因性ＩＧＦ−Ｉを用いないで観察されるレベル（基準増殖） まで低下した。１０μｇ／ｍｌ濃度のＩＧＦＢＰ−１では、細胞数は、無血清培 地で観察されるよりも低いレベルまで低下し、このことは、ラットＡ−１０細胞 が内因性ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−IIを生成することを示唆している。これらのデ ータは更に、ＩＧＦＢＰ−１がＩＧＦ−Ｉに対するラット平滑筋細胞の増殖性応 答を阻害することを示している。 実施例７ ＩＧＦＢＰ−１ムテインの調製 Ａ．ＩＧＦＢＰ−１ムテインの構築 プラスミドｐＪＵ１０２１．（ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６７７３０）に含まれるＩ ＧＦＢＰ−１ ＤＮＡ配列を突然変異誘発させて、２種のＩＧＦＢＰ−１ムテイ ンＣ９８及びＣ１０１を構築した。Ｃ９８ムテインでは、成熟タンパク質配列の ９８位のセリンがシステイン残基に置換していた。Ｃ１０１ムテインでは、成熟 タンパク質配列の１０１位の セリンがシステイン残基に置換していた。残基の番号付けは配列番号１に基づく 。突然変異誘発は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実施した。 プラスミドＴ８８ＩＱ：ＩＧＦＢＰ−１ ＤＮＡを出発鋳型ＤＮＡとして用い て、Ｃ９８ムテインを調製した。プラスミドｐＴ８８：ＩＧＦＢＰ−１は、プラ スミドｐＴ８８ＩＱ中に野生型ＩＧＦＢＰ−１コード配列を含んでいる。 発現ベクターｐＴ８８ＩＱは、発現ベクターｐＴ３ＸＩ−２の誘導体である。 ベクターｐＴ３ＸＩ−２は以下の方法で構築した。この構築のための出発プラス ミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入したプラスミドｐＫＫ２２３−３であった 。プラスミドｐＫＫ２２３−３は、テトラサイクリン耐性のための部分遺伝子を 保有する。この非機能的遺伝子を、プラスミドｐＢＲ３２２上に含まれる完全テ トラサイクリン耐性遺伝子に置換した。プラスミドｐＫＫ２２３−３を、Ｓｐｈ Ｉで完全に消化し、ＢａｍＨＩで部分消化した。４．４ｋｂ対断片をゲル精製し 、合成アダプター（配列番号４）： 及びｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子のＣ１ａＩ，ＳｐｈＩ消化物に 由来するＤＮＡの５３９塩基対断片（ＰＬ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，２７− ４８９１−０１）と合わせた。得られたプラスミドをｐＣＪ１と名付けた。 次に、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ ａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入したＸｈｏＩリンカーを、プラスミドｐＣＪ１の ＰｖｕII部位に挿入して、プラスミドｐＣＪＸ−１を生成した。この挿入により 、プラスミドコピー数を制御するｒｏｐ遺伝子が破壊した。次に、ｌａｃＩ遺伝 子を含むＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＭＣ９（Ｃａｌｏｓ等、１９８３）から 精製し、次いでＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩアダプターと共にＸｈｏＩ部位に挿入した 。次に、ＥｃｏＲＩ及びｐｓｔＩ（配列番号５）： で切断して、プラスミドｐＫＫ２２３−３のポリリンカー領域を、付加的部位を 含むポリリンカーに代えた。このよ うにして得られたプラスミドベクターをｐＣＪＸＩ−１と称する。 最後に、テトラサイクリン耐性遺伝子を、ビスルファイト突然変異誘発によっ て破壊された制限酵素ＨｉｎｄIII、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩに対する認識部位 を有する類似遺伝子に代えた。以下の手順を使用して、ｐＢＲ３２２のテトラサ イクリン耐性遺伝子を突然変異させた。プラスミドｐＢＲ３２２をＨｉｎｄIII で切断し、次いで重亜硫酸ナトリウムで突然変異を誘発した（Ｓｈｏｒｔｌｅ及 びＢｏｔｓｔｅｉｎ，１９８３）。突然変異の発生したＤＮＡを結合して、環状 ＤＮＡを生成し、次いでＨｉｎｄIIIで切断して、突然変異誘発を逸れたプラス ミドを線状化した。この消化混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｙ ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、１９８５）を形質転換した。テトラサイクリン 耐性コロニーを単離し、プラスミドのテトラサイクリン耐性遺伝子中のＨｉｎｄ III部位が損失していることをチェックした。うまく突然変異したプラスミドを ｐＴ１と称する。同様の手順を実施して、ｐＴ１中のＢａｍＨＩ部位を突然変異 誘発して、プラスミドｐＴ２を得た。このプラスミドｐＴ２を突然変異誘発して 、ＳａｌＩ 部位を除去し、プラスミドｐＴ３を生成した。突然変異したテトラサイクリン耐 性遺伝子を保有するｐＴ３のＣｌａＩ−ＳｔｙＩ断片を単離し、これを使用して 、ｐＣＪＸＩ−１の同種断片を置換してｐＴ３ＸＩ−２を生成した。突然変異し たテトラサイクリン耐性遺伝子は尚、機能タンパク質をコードする。ｔａｃプロ モーター領域の下流で、とりわけ、以下で説明するＥ．ｃｏｌｉでの発現用クロ ーニング遺伝子として有用なＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限部位を含んでいるポリ リンカーを導入した。 ｐＴ３ＸＩ−２と同様に、ｐＴ８８ＩＱベクターを含むクローン化した遺伝子 の発現を、ｔａｃプロモーターにより行う。翻訳は、単一のＮｄｅＩ認識配列Ｃ ＡＴＡＴＧ（この出発部位ＮｄｅＩの配列が単一になるように下流ＮｄｅＩ部位 を除去した）のＡＴＧで開始する。所望の遺伝子の挿入を容易にするために、Ｎ ｄｅＩ部位の下流にポリリンカーがある。更には、ｌａｃＩ領域を含むＸｈｏＩ 断片を、端を切り取った断片に代える。この断片には、ｌａｃＺプロモーター、 及びｌａｃレプレッサー用結合部位であるオペレーター領域が含まれていない。 置換されるｌａｃＩ領域はｌａｃＩｑ突然変異−単一塩基置換をも有する ため、ｌａｃレプレッサーの生成が増加する（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ等，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ５９：１２５９−１２ ６４（１９６８））。 ｐＴ３ＸＩ−２とｐＴ８８ＩＱとの明白な相違を以下に示す： １．クローニング部位領域。 ポリリンカー上流のＥｃｏＲＩ部位とポリリンカー下流末端のＨｉｎｄIII部 位との間で、以下の１３５マー配列（配列番号６）： を置換した。 この配列は、発現用出発コドンでのＮｄｅＩ部位（下線）と、ＢａｍＨＩ、Ｘ ｍａＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｔＢＩ、ＳｐｅＩ及びＳａｃII用 認識部位を含むポリリンカーとを含んでいる。 ２．下流ＮｄｅＩ部位。 クローニング領域の約２．４Ｋｂ下流のｐＴ３ＸＩ−２ にはＮｄｅＩ部位がある。この部位は、前述の出発コドンのＮｄｅＩ部位がｐＴ ８８ＩＱで単一となるように除去されている。ＮｄｅＩ認識配列を除去すること により、前記部位は５’＞ＣＡＴＡＴＧ＞３’から５’＞ＣＡＴＡＴＡＴＧ＞３ ’に変化した。 ３．ｌａｃＩｑ領域。 ｌａｃＩ領域を含む２つのＸｈｏＩ部位間にあるｐＴ３ＸＩ−２の領域を、以 下に示す１２３０塩基配列： ｐＴ８８ＩＱのｌａｃＩｑ配列（１２３０ＢＰ）（配列番号７） で置換した。 この置換領域は、ｌａｃＺプロモーター、及びｌａｃレプレッサー用結合部位 であるオペレーター領域を含まない。 この領域は更に、ｌａｃレプレッサー合成の増加を引き起こすｌａｃＩｑ突然 変異を含んでいる（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ等、上掲）。 プラスミドｐＪＵ１０２１を制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄIIIで消化して、 ＩＧＦＢＰ−１ ＤＮＡ配列を単離し、ＮＡ−４５ペーパー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ ｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を製造業者の指示に従って用い、 アガロースゲル電気泳動により精製した。単離したＩＧＦＢＰ−１ ＤＮＡ断片 を、前述のようにＸｂａＩ及びＨｉｎｄIIIで消化してゲル精製したプラスミド ｐＴ８８ＩＱ内にクローニングした。正確に再構築されたプラスミドをｐＴ８８ ＩＱ：ＩＧＦＢＰ−１と名付けた。ＰＣＲ突然変異誘発反応で使用した５’オリ ゴヌクレオチドプライマ リゴヌクレオチドプライマー（ＩＧＦＢＰ−１−Ｃ９８） １０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣＬ、２．５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ2、０．００１％ゼラチン、そ れぞれ５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰ、それぞれ３０ピ コモルのＩＧＦＢＰ−１−５’及びＩＧＦＢＰ−１−Ｃ９８プライマー、１〜１ ０ｎｇのｐＴ８８ＩＱ：ＩＧＦＢＰ−１プラスミドＤＮＡ、並びに５単位の“Ａ ｍｐｌｉＴａｑ”Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃ ｅｔｕｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒ ａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ製）を含む５０μｌの反応混合物でＰＣＲを実施した。 ＰＣＲ条件は、最初９６℃で３分間のインキュベーション、次いで（９６℃で１ 分間、６６℃で１分間、７２℃で１．５分間）を３５サイクル、最後に７２℃で １０分間のインキュベーションであった。 野生型ＩＧＦＢＰ−１コード配列を含むアガロースゲル精製ＤＮＡ断片を出発 鋳型ＤＮＡとして用いて、Ｃ１０１ムテインを調製した。プラスミドｐＪＵ０１ ２０をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、約０．８ｋｂ ＩＧＦＢＰ−１コー ドＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製して、ＩＧＦＢＰ−１コード配列 を得た。ＰＣＲ突然変異誘発反応で使用した５’オリゴヌクレオチドプライマー は、Ｓ９８Ｃムテインの構築に使用したプライマー（ＩＧＦＢＰ− １−５’）と同一であった。３’オリゴヌクレオチドプラ ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０． ００１％ゼラチン、それぞれ２００ｕＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴ ＴＰ、２０ピコモルのＩＧＦＢＰ−１−５’及びＩＧＦＢＰ−１−Ｃ１０１プラ イマー、並びに２．５単位の“ＡｍｐｌｉＴａｑ”Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ を含む１００ｕｌの反応混合物中でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件は、（９５℃ で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１．５分間）を３０サイクル、次いで７２ ℃で１０分間のインキュベーションであった。 ＰＣＲの後に、反応混合物を、ＣｈｒｏｍａＳｐｉｎ１００カラム（Ｃｌｏｎ Ｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，カタログ番号Ｋ１３３２−２）に通して 、ヌクレオチドと取り込まれなかったＤＮＡプライマーとを除去した。ＤＮＡ断 片をＸｂａＩ及びＳａｃＩで消化し、正確な寸法（約０．４３ｋｂ）のバンドを 前述のアガロースゲル電気 泳動で精製した。精製したＤＮＡ断片を、ＸｂａＩ＋ＳａｃＩで消化したｐＴ８ ８ＩＱ：ＩＧＦＢＰ−１プラスミドＤＮＡに結合した。結合混合物を使用して、 （ＣｌｏｎＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔ ｏ，ＣＡ製）Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αを形質転換し、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシ リンを含むＬＢ寒天プレート上で平板培養した。各形質転換で得られた数個のコ ロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、挿入領域の両方の鎖について配列を決定 した。各ムテインについて、正確な配列を有するプラスミドを選択した。これら を、クローンＣ１０１−３（Ｃ１０１ムテイン）及びＣ９８−１２（Ｃ９８ムテ イン）と名付けた。 次いで、突然変異ＩＧＦＢＰ−１遺伝子をプラスミドｐＴ５Ｔ（Ｅｉｓｅｎｂ ｅｒｇ，Ｓ．Ｐ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３４１−３４６（１９９０））内 に戻した。この処理は、クローンＣ１０１−３及びＣ９８−１２由来のプラスミ ドＤＮＡをＮｄｅＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、突然変異体ＩＧＦＢＰ−１遺伝 子を含む約８００ｂｐバンドをゲル精製し、これを、同一の制限酵素で消化した ｐＴ５ＴプラスミドＤＮＡに結合して実施した。結合混合物を使用 して、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１／ＤＥ３を形質転換し、５０ｕｇ／ｍｌのアンピ シリンを含むＬＢ寒天プレート上で平板培養した。各形質転換で得られた数個の コロニーから、プラスミドＤＮＡを産生した。正確な配列を有するクローンをｐ Ｔ５Ｔ：ＩＧＦＢＰ−１−Ｃ９８（Ｃ９８ムテイン）及びｐＴ５Ｔ：ＩＧＦＢＰ −１−Ｃ１０１（Ｃ１０１ムテイン）と名付けた。 Ｂ．洗浄封入体の調製 Ｃ９８又はＣ１０１ムテインを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１０Ｌの発酵機 内で増殖させた。発酵機から得られた細胞を、細胞１ｇ当たり緩衝液６ｍｌの割 合で、破壊（breaking）緩衝液（５０ｍＭトリス、２５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ジチオトレイトール（“ＤＴＴ”）ｐＨ７．５）に再度懸濁させた。フレンチ圧 力セルを用いて、細胞を１０，０００ＰＳＩで破砕した。懸濁液を１７，７００ ×ｇで３０分間遠心分離にかけた。封入体を含むペレットを破壊緩衝液中に再度 懸濁させて洗浄し、１７，７００×ｇで再度遠心分離にかけた。洗浄し、再度遠 心分離にかけたペレットを処理するまで冷凍保存することができる。ペレット中 に含まれるタンパク質の約８０％がムテインであった。 Ｃ．ムテインの復元 先ず、細胞ホモジナイザーを用い、ペレットを６ＭのグアニジンＨＣｌ、５０ ｍＭのトリス、６ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．５）（１０ｍｌの各緩衝液につきペレ ット１ｇ）に溶解して、各ムテインを変性させた。 溶解したペレットに酸化グルタチオン（「ＧＳＳＧ」）を２３ｍＭの最終濃度 になるように加えて復元を開始した。溶液を室温で１５分間インキュベートし、 次いで５０ｍＭのトリス（ｐＨ９．７）を用いて徐々に希釈して、１００μｇ／ ｍｌの最終タンパク質濃度及び０．６Ｍの最終グアニジン濃度にした。クーマシ ーブルータンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により タンパク質濃度を測定した。次いで、システイン及びフェニルメタンスルホニル フルオリドを加えて、それぞれ５．６ｍＭ及び１ｍＭの最終濃度にした。復元溶 液を４℃で一晩インキュベートした。 復元溶液の１００μｌアリコートをＣ４逆相カラム（ＲＰ−４ １×２５０ｍ ｍ，Ｓｙｎｃｈｒｏｍ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｉｎ）上で分析して復元を監視し た。Ｃ４カラムを２％のアセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）、０．０５％の トリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）で平衡にした。復元溶液の１００μｌアリコー トを平衡カラムに注入し、６０％のＣＨ3ＣＮ、０．０５％のＴＦＡまでの線勾 配で、０．２５ｍｌ／分の流速を用い、緩衝液Ｂを２％／分で変えて溶離した。 各ムテインについて、復元タンパク質は、還元、変性しているが復元されていな いタンパク質より、約２分早く急なピークをなして溶離した。 Ｄ．復元ムテインの精製 ３ｋＤａカットオフ（ＷＲ Ｇｒａｃｅ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのＡｍｉｃｏｎ部門）を有するＡｍｉｃｏｎ Ｓ１ ０Ｙ３メンブランを用いて復元溶液を約１０倍に濃縮し、２０ｍＭのリン酸ナト リウム（ｐＨ６．０）中に透析した。透析溶液を１７，７００×ｇで３０分間遠 心し、０．２ミクロンのフィルターを介して上清を濾過した。濾過したタンパク 質を２０ｍｌ／分で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で既に平衡に してあったＱ−セファロースアニオン交換カラム（５×３０ｃｍ，Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に装填した。結合タン パク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａ Ｃｌ（ｐＨ６．０）までの線勾配（５カラム容量）を用い、２０ｍｌ／分の流速 で溶離した。２５ｍｌの画分を分取した。各ムテインは約０．２〜０．２５Ｍの ＮａＣｌで溶離した。復元監視用の上記条件と同じ条件を用いてＣ４逆相カラム （ＲＰ−４ １Ｘ２５０ｍｍ，Ｓｙｎｃｈｒｏｍ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ） 上で、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより画分を分析した。 復元ムテインを含む画分（画分は０．２〜０．２５ＭＮａＣｌで溶離）をプー ルし、２０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中に透析した。 透析した物質を、２５ｍｌ／分で、既に２０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ＭのＮａＣ ｌ（ｐＨ７．５）で平衡にしてあるブチルセファロース（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅ ｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ）疎水性相互作用カラム（５×８ｃｍ Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に装填した。２０ｍＭの トリス、０のＮａＣｌ、２５％のエタノール（ｐＨ７．５）までの線勾配（１０ 〜１５カラム容量）を用い、２０ｍｌ／分の流速で結合タンパク質を溶離した。 各ムテインは、約１５〜２０％のエタノールで、非対称のピークとして溶離した 。 復元監視用の上記条件と同じ条件を用いて、Ｃ４逆相カラム（ＲＰ−４ １× ２５０ｍｍ，Ｓｙｎｃｈｒｏｍ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｉｎ）上で、又はＳＤＳ −ＰＡＧＥによりタンパク質含有画分（１５〜２０％エタノールで溶離）の１０ ０μｌアリコートを分析した。精製されたムテインを含む画分をプールし、約０ ．８ｍｇ／ｍｌに濃縮し、２０ｍＭのトリス、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７． ４）中に透析した。精製された復元ムテインを実施例９に記載のように生物学的 活性について検定した。 実施例８ ＩＧＦＢＰ−１ムテインのＰＥＧ化 Ｃ９８及びＣ１０１ムテインを、平均分子量が２０ｋＤａで、チオール特異性 マレイミド反応性基（ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2−Ｎ） 〔式中、ｎは単量体単位の数である〕が結合したモノメトキシ−ＰＥＧを用いて ＰＥＧ化した。他の適当なＰＥＧ−マレイミド試薬の製造及び使用は、本明細書 に参考文献として含むものとするＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９２／１６２２１号明 細書に記載されている。 復元の間に、置換されたシステイン残留物（それぞれＣ ９８及びＣ１０１中のＣＹＳ９８又はＣＹＳ１０１）は、グルタチオンとの混合 ジスルフィドを形成して、Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−ＧＳＨを形成するか、又はシステイ ンとの混合ジスルフィドを形成してＣｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓを形成し得る。従っ て、ＰＥＧ試薬との反応に使用し得る遊離チオールは存在し得ない。従って、精 製されたムテインはＰＥＧ試薬との反応の前に部分還元された。 部分還元は、５．６２５対１のＤＴＴとタンパク質とのモル比で精製ムテイン とＤＴＴとを、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭのＮａＣｌ中、室 温で２時間反応させて行った。ｐＨ５．５に酸性化して還元を停止した。ＤＴＴ を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中に透析して除去した。 部分還元したムテインをそれぞれＰＥＧ試薬と、４対１モル比のＰＥＧとタン パク質（最終タンパク質濃度は０．３３ｍｇ／ｍｌ）で、１５ｍＭの酢酸ナトリ ウム、２６ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１２０ｍＭのＮａＣｌ中、 室温で４時間反応させた。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、部分還元 されたタンパク質の約５０％が、約６７ｋＤａの近似見かけ分子量を有するモノ ＰＥ Ｇ化種（Ｃ９８−ＰＥＧ，Ｃ１０１−ＰＥＧ）に変換されたことが示された。見 かけ分子量が大きいのは、一部にはＰＥＧがゲルと相互作用することによるもの であった。 反応混合物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）に調整した。Ｑ− Ａ Ｑセファロースアニオン交換カラム（５×１０ｃｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を２０ｍＭのリン酸ナトリウム （ｐＨ６．５）で平衡にし、反応混合物を２０ｍｌ／分で装填した。結合タンパ ク質を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．５）までの線勾 配（１０カラム容量）を用いて２０ｍｌ／分の流速で溶離した。Ｃ９８及びＣ１ ０１ＰＥＧ化ムテインは約０．２ＭのＮａＣｌで溶離した。２５ｍｌの画分を分 取し、アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＰＥＧ化ムテインに対応 する非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ上に単一の優勢なバンドを示したＰＥＧ化Ｃ９８又 はＣ１０１を含む画分をプールし、実施例９に記載のようにして生物学的活性に ついて検定した。 実施例９ ＩＧＦＢＰ−１及びそのムテインは３ＴＳ細胞のＩＧＦ− １賦活化増殖を阻害する 細胞増殖の測定にクリスタルバイオレット染料アッセイを用いた。９６ウエル のゼラチンコーティングプレート中でアッセイを行った。２００μｌの無血清Ｄ ＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ ’ｓ ｍｅｄｉａ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）及び０〜８５ ０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１に２５，０００細胞／ウエルでＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３線 維芽細胞を入れた。細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。この時点で、 中間層を１５０μｌの０．２％クリスタルバイオレット、１０％ホルムアルデヒ ド、１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）と交換した。室温で２０分インキ ュベートした後、ウエルをリン酸緩衝塩水（「ＰＳＢ」）で３回洗浄し、２００ μｌ／ウエルの５０％エタノール／０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．２ ）と共にインキュベートして細胞結合染料を遊離させた。翌日、５７０ｎｍでの 吸光度を読み取った。表１３に示されている結果は、組換えＩＧＦ−１が用量依 存性の３Ｔ３線維芽細胞の増殖を剌激することを示している。最大増殖は、約２ ０〜６０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１濃度で起こった。ＥＤ50 は約５〜２０ｎｇ／ｍｌであった。 細胞を設定量のＩＧＦ−１及び増大量の結合タンパク質とコインキュベートし て、３Ｔ３線維芽細胞のＩＧＦ−１賦活化増殖に関するＩＧＦＢＰ−１、Ｃ９８ 及びＣ１０１ムテイン並びにＰＥＧ化ムテインの作用を測定した。Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３線維芽細胞を、２１ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、変動量のＩＧＦＢＰ−１及 び種々のムテイン（０ｎｇ／ｍｌ〜１１， ５２０ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清Ｄ ＭＥＭ２００μｌ中に２５，０００細胞／ウエルで入れた。細胞をさらに７２時 間インキュベートし、上記のようにプロセシングした。 その結果は、非ＰＥＧ化並びにＰＥＧ化されたＣ９８及びＣ１０１ムテインの 生物学的活性が共に野生型組換えＩＧＦＢＰ−１の活性に匹敵することを示して いる（表１４〜１８）。上記条件下に２１ｎｇ／ｍｌＩＧＦ−１の活性を５０％ 阻害するのに必要なＩＧＦＢＰ−１の濃度（ＩＣ50）は、野生型ＩＧＦＢＰ−１ 、ＩＧＦＢＰ−１ムテイン及びＰＥＧ化ＩＧＦＢＰ−１については約２００〜３ ００ｎｇ／ｍｌである。 実施例１０ ＩＧＦＢＰ−１及びＰＥＧ化ＩＧＦＢＰ−１の薬物動態学 薬物動態学パラメーターの測定に４匹のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット を用いた。２匹のラットには１ｍｇ／ｋｇの組換えヒトＩＧＦＢＰ−１の濃縮塊 を静脈注射し、２匹のラットに１ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化ＩＧＦＢＰ−１Ｃ１０１ ムテインの濃縮塊を静脈注射した。Ｃ１０１ムテイ ンを調製して、実施例７及び８に記載のようにしてＰＥＧ化しておいた。注射の ０．０１６、０．０８３、０．０３３、０．０７５、１．５、２、３、５、６、 ８、１０、１２、２４及び４８時間後に尾部の血管の血液試料を採取した。血液 をＥＤＴＡコーティング管に採取し、遠心して、血漿画分を分取した。Ｍｅｄｉ ｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ（Ｋａｕｎｉａｉｎｅｎ，Ｆｉｎｌａｎｄ）ＩＧＦｂ ｐ−１試験キット（カタログ番号１０８３１ＥＴＭＢ）を用い、ＥＬＩＳＡによ り、血漿試料中のＩＧＦＢＰ−１の濃度を測定した。 各試験グループの２匹のラットの血漿濃度を平均し、ＲｓｔｒｉｐII（Ｍｉｃ ｒｏｍａｔｈ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ） を用い、２又は３指数曲線に適合させた。適合曲線からのデータを表２０に示す 。ＥＬＩＳＡ検出性血漿ＩＧＦＢＰ−１は、それぞれ野生型ＩＧＦＢＰ−１及び ＰＥＧ化Ｃ１０１ムテインの注射後に３指数関数的及び２指数関数的に消滅した 。 適合曲線を用い、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｇｉｂａｌｄｉ，Ｍ． 及びＰｅｒｒｉｅｒ，Ｄ．；Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ編，１９７５に記載されている ようにして、 標準薬物動態学パラメーターを計算した。これらのパラメーターを表２１に示す 。その結果は、ＰＥＧ化すると、血漿のクリアランスが減少するために循環時間 が増大してＩＧＦＢＰ−１の薬物動態学的性能が改善されることを示している。 実施例１１ ＩＧＦＢＰ−１がラットの再発狭窄症を阻害する バルーン血管形成後の頚動脈における増殖応答を改変する能力についてＩＧＦ ＢＰ−１を試験した。体重が約３７５ｇの１９匹のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅ ｙラットに右頚静脈に頚静脈カテーテルの移植手術を施した。１週間後、カテー テルの開通性を試験し、係留注入装置を介して生理食塩水連続注入を開始した。 係留注入装置は、Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｐ．Ｃ．ら，“ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｉｎ ｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｓｈｅｒ３４４ ｒａｔｓ ｆｏｒ Ｓｉｘ Ｍｏｎｔｈｓ： Ａ Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ Ｓｔｕｄｙ ，”Ｔｏｘｉｃｏ ｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ，第２巻，１−１３ページ（１９９２）に記載されて おり、該文献は本明細書に参考文献として特に含むものとする。３日後、Ｅｄｅ ｌｍａｎ，Ｅ．Ｒ．及びＫａｒｎｏｖｓｋｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ ｎ ，第８９巻，第２号，７７０−７７６ページ（１９９４）（本明細書に参考文 献として特に含むものとする）に記載のようにして、左外頚静脈の動脈切開によ り、全動物にバルーン血管形成手術を施した。２Ｆ Ｆｏｇａｒｔｙバルーンカ テーテル（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｄｗａｒｄｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓ ａｎｔａ Ａｎａ， Ｃａｌｉｆ．）を大動脈弓まで進め、抵抗を生成させ且つ 内皮を剥落させるに十分な程度にバルーンを空気で膨張させ引き戻した。血管壁 における増殖応答を誘発させるのに必要な動脈に対する十分な損傷を確実にする ために上記手順を６回繰り返した。次いで外頚動脈を結紮した。動物を２つのグ ループに分け、血管形成直後に処理を開始し、１４日間処理を継続した。第１グ ループ（Ｎ＝９）は等張食塩水（０．２５ｍｌ／時間）を静脈注入した対照動物 からなるものであった。第２グループ（ｎＮ＝１０）の動物は、ＩＧＦＢＰ−１ を１７９μｇ／ｋｇ／時間で連続静脈 注入して処理した。ＩＧＦＢＰ−１の血漿レベルを測定するために、血管形成の ３、９及び１４日後に血液試料を尾部の血管から採取した。Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａ（Ｋａｕｎｉａｉｎｅｎ，Ｆｉｎｌａｎｄ）ＩＧＦｂｐ−１試験 キット（カタログ番号１０８３１ＥＴＭＢ）を用い、ＥＬＩＳＡにより、血漿試 料中のＩＧＦＢＰ−１の濃度を測定した。血液採取の時点（約１５〜３０分）で 注入を停止した。 １４日目の実験停止時に、Ｆｒａｎｃｉｓらが記載しているブレビタル試験に より、カテーテルの開通性を確認した。アセプロマジン、Ｒｏｍｐｕｎ及びケタ ミンの組み合わせを用いて動物を麻酔し、心臓穿刺により１０％の中性緩衝ホル マリンを用いて潅流した。両頚動脈を除去し、パラフィン包埋のためのプロセシ ングの前にさらに２日間ホルマリンに入れた。病変部のほぼ全長にわたる頚動脈 の３つの切片を各動物から包埋して、組織の全領域の評価を確実にした。組織学 的評価のために、全動物から追加の組織（肺、心臓、腎臓、肝臓、脾臓及び副腎 ）を採取して、ＩＧＦＢＰ−１の連続注入の全身的作用（作用があれば）を測定 した。頚動脈切片をヘマトキシリン及びエオシン、Ｍ ａｓｓｏｎのトリクローム及びトルイジンブルーで染色した。他の組織はヘマト キシリン及びエオシンのみで染色した。 実験の停止時のＩＧＦＢＰ−１の平均血漿レベルは、３．６９±０．６４μｇ ／ｍｌであった。 動物をＩＧＦＢＰ−１で処理した場合の効果を、総合評点（gross scoring） により、及び新脈管内膜〔μｍ及びピクセル（pixels）〕、新脈管内膜＋中間層 （media）（ピクセル）及び中間層（ピクセル）の測定により測定した。新脈管 内膜（ピクセル）と中間層（ピクセル）との比率も計算した。これらの評点及び 測定を表２２に示す。これら６種の応答計測のそれぞれについてＷｉｌｃｏｘｏ ｎ Ｒａｎｋ−Ｓｕｍ（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ）試験を行い、Ｎａｔｒ ｅｌｌａ，Ｍ．Ｇ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｎａ ｔｉｏｎａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ９１，Ｔ−８０ページ（１９６７）に記載されている表を用いてｐ値を測定した 。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｒａｎｋ−Ｓｕｍ（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ）試験 からのｐ値を以下に示す。該データは、ＩＧＦＢＰ−１がラットの再発狭窄症を 著しく減少させることを示している。 病変した頚動脈に、０は見るべき厚化が見られず、４は顕著な厚化が見られる ことを表す０、１、２、３又は４の評点を割り当てることにより、処理関連作用 の総合評価を行った。処理動物及び対照動物からの平均評点（±標準誤差）はそ れぞれ１．５±０．２７及び２．６７±０．２４であった。これらの値は極めて 満足すべきもの（ｐ＜０．０５）であることが判明した。この総合評価において 、ＩＧＦＢＰ−１処理動物における厚化の阻害は４４％であった。 新脈管内膜も測定した。新脈管内膜の内側から新脈管内膜の内腔までの間隔を 、互いに対向し且つ垂直な４つの点で測定し、３つの切片の平均値を測定した。 処理動物及び対照動物についての新脈管内膜の平均±ＳＥ（μｍ）は、それぞれ ７８．５０±１０．６８及び１３９．３３±８．９１であった（ｐ＜０．０１） 。この測定によって、ＩＧＦＢＰ−１処理動物において厚化の４４％阻害も示さ れた。 Ｉｍａｇｅ １ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓ＆Ｍ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃｏｌｏｒ ａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＯから入手し得る）を用いたイメージ分析により、 処理動物及び 対照動物の新脈管内膜＋中間層、新脈管内膜のみ及び中間層のみの領域（３切片 ／動物）を測定した。処理動物及び対照動物について新脈管内膜＋中間層の領域 （ピクセル）（平均±ＳＥ）は、それぞれ２５，１６０．３０±１，８１７．４ ２及び３５，２７１．１１±１，４０３．１６（ｐ＜０．０１）であった。この 分析を用いると、ＩＧＦＢＰ−１で処理することにより、新脈管内膜の厚さが２ ９％減少した。新脈管内膜のみの平均領域（ピクセル）は、処理動物については １４，０１５．４０±１，８３４．２４であり、対照動物については２３，１１ ９．１１±１，２００．３９、即ち、ＩＧＦＢＰ−１処理動物において厚化が３ ９％阻害された（ｐ＜０．０１）。 最後に、新脈管内膜と中間層の比率を計算した。このパラメーターも、ＩＧＦ ＢＰ−１による処理の有利な効果を示した。処理動物における比率は１．２５± ０．１７であり、対照動物においては１．９１±０．１３であった。この比率を 用いると、再発狭窄症の阻害は３５％（ｐ＜０．０５）であった。新脈管内膜と 中間層の該比率は一般にこのラットモデルにおける処理関連効果を評価する最も 容認された方法である〔Ｅｄｅｌｍａｎ及びＫａｒｎｏｖｓｋ ｙ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，第８９巻，第２号（１９９４）〕。 本発明を特定の実施態様に関して説明したが、本発明は該実施態様に限定され るものではなく、当業者により行われる変更も本発明の範囲内に包含されるもの とする。Detailed Description of the Invention      Method of using insulin-like growth factor binding protein Field of the invention   The present invention relates to insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP-1 or Relates to the use of BP-1) as a therapeutic agent.Background of the Invention   Circulating insulin-like growth factors I and II (IGF-I and IGF-II) A 7 kDa protein that is related in structure to each other and to insulin is there. IGF-I and IGF-II are growth and It is a differentiation factor and is present in serum at high concentrations (about 300 ng / ml for IGF-I). , 1000 ng / ml with IGF-II). Circulating levels of IGF-I are primarily Determined by growth hormone (GH), which stimulates the liver to produce IGF-I It Most of the growth promoting action of growth hormone is mediated by IGF-I Conceivable.   Tissue IGF is also present. Tissue IGF-I was confirmed by gel chromatography And clearly has a higher molecular weight than circulating IGF (about 26 kDa). W. N. R om,J. Clin. Invest. 82, Pp. 16 85-1693, 1988.   IGF-I and IGF-II have been shown to play a role in many disease states. I have revealed. These disease states include, for example, breast cancer, colon cancer, lung cancer, ovarian cancer, bone and meat. Tumor, glioma, liver cancer, prostate cancer, rhabdomyosarcoma, restenosis, acromegaly, obesity , Tumor-induced hypoglycemia, pulmonary fibrosis, diabetic nephropathy and diabetic retinopathy Is included.   The role of insulin-like growth factor in human tumors is Daughaday,En docrinol. 127 , Pp. 1-4, 1990. For example , IGF-I and IGF-II are described by Cullen et al.,Cancer Invest igation 9 , Pp. As reported in 443-454, 1991. , Breast cancer, colon cancer, lung cancer, ovarian cancer, osteosarcoma, neuroblastoma, glioma, Wilms Causes of Autocrine or Paracrine Growth in Various Human Cancers, Including Tumor and Rhabdomyosarcoma It is thought to function as a child. A wide variety of primary tumors have IGF-I or I Overexpressing GF-II and expressing the receptor for the growth factor Is Yee et al.,Cancer Res. 48, Pp. 6691-6696, 19 88 and And Osborne,Mol. Endocrinol. Three, Pp. 1701-1 709, 1989, as already reported. manyin vi tro Studies have shown that human cell lines derived from some of the cancers listed above are IG It was found to proliferate in response to FI and IGF-II. In some cases , The cell line produces IGF-I or IGF-II, and IGF-I and IGF -It was found to have a cell surface receptor for II. In some cases, Particularly in breast cancer, the stroma cells surrounding the tumor secrete IGF-I and IGF-II, It has also been found that as a result, a paracrine growth relationship occurs.   Breast, lung and colon cancers affect nearly half a million people in the United States. Is the most common cancer. IGF-I and IGF-II affect the growth of these cancers The strongest evidence of this role is that antibodies to the IGF-I receptor Blocks tumorigenesis in nude mice by several cell lines derived from human tumors It is obtained from an experiment showing that.   Tricoli et al.Cancer Rsearch 46, Pp. 6169- Reported in 6173,1986 Analysis of existing biopsy samples from human colon cancer showed that in 40% of the analyzed tumors I It was shown that GF-II was overexpressed 10 to 50 times. Excessive IGF-II The current level correlated with the degree of intestinal wall invasion.   IGF-I is described in Nakanishi et al.,J. Clin. Invest. 82, pp. 354-359, 1988, human small cell lung cancer cells. It may mediate autocrine proliferation of the lines NCI-H345 and NCI-N417.   The ovarian cancer cell lines OVCAR-3, OVCAR-7 and PEO4 are IGF-I m Express RNA. Yee, etc.Cancer Res. 51, Pp. 5107 -5112, 1991, primary and metastatic ovarian cancer tissues also contain IG. FI mRNA and type I IGF receptor mRNA are expressed.   Blatt et al.Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 23 , Pp. 373-376, 1984 and Canalis,J. Clin. I nvest. 66 , Pp. 709-719, 1980 show that bone cells are normal. Both tumorous and neoplastic One secretes IGF-I and responds to IGF-I.   IGF-II mRNA expression is developmentally regulated in liver tissue. Car iani et al.,J. Hepatology 13, Pp. 220-226,199 0 in woodchuck, human and rat liver cancer, as reported in Elevated levels of GF-II mRNA have been detected.   The three human prostate cancer cell lines PC-3, DU-145 and LNCa. FGC is a phase Producing an equivalent amount of IGF-I and continuing the autophosphorylated IGF-I receptor To appear. Z. Pietrzkowski et al.,CancerResearch ch 53 , Pp. See 1102-1106, 1993. Pietrzkows Ki et al. reported that the growth of any of the above three cell lines was associated with IGF-I receptor RNA. Antisense oligodeoxynucleotides, or of IGF-I, By a peptide analogue that competes with IGF-I for binding to the IGF-I receptor Reported that it was inhibited.   Rhabdomyosarcoma is a very common childhood soft tissue sarcoma that develops rhabdomyoblastic cells. It is thought that it develops from the cyst. E1 -Badry et al.,Cell Growth & Differentiation n 1 , Pp. Rhabdomyosarcoma as disclosed in 325-331, 1990. High levels of IGF-II mRNA have been reported to be present in tumors.   As mentioned previously, insulin-like growth factors are associated with, for example, acromegaly and recurrent narrowing. It is also associated with disorders other than cancer, such as stenosis. Acromegaly is a growth hormone Due to overproduction of (GH). Growth hormone stimulates IGF-I production Works by. That is, acromegaly is associated with elevated IGF-I levels. ing.   Recurrent stenosis, which is a repeated occlusion of an artery, occurs in approximately 25 to 5 patients with angioplasty Appears in 5% within 6 months. Thickening of the intimal layer is the main cause of restenosis. Within Membrane thickening is a result of smooth muscle cell proliferation and secretion of extracellular matrix components. Occur. Cercek et al.,Circulation Research 66 , Pp. 1755-1760, 1990, angioplasty surgery. It was found that the expression of the IGF-I gene was induced 9 times more than usual in the posterior epidermal artery. I have revealed. IGF-I gene The current time and level closely approximate that of smooth muscle cell proliferation. Khorsa ndi, etc.,J. Clin. Invest. 90, Pp. 1926-1931, 1 992 reported that dividing smooth muscle cells show increased expression of IGF-I gene. Cells have been suggested by hybridization studies. Khor sandi et al.,Atherosclerosis 93, Pp. 15-122, Another study, reported in 1992, was circulating IGF-I (due to removal of the pituitary gland). Showing that intimal thickening after angioplasty was significantly reduced in low-level animals There is.   Hypoglycemia associated with certain tumors has long been known. Recurrent hypoglycemia IGF-II mRNA and IGF-II in leiomyosarcoma removed from a subject Immunoreactive peptides have been observed at abnormally high levels. W. H. Daugha day, etc.,New England Journal of Medicine , Vo1.319, No. 22, pp. See 1434-1440, 1988. flat After removal of the synovial myoma, the hypoglycemia subsided. See references above. Tumor-induced hypoglycemia Other researchers in Found high plasma IGF-II levels and IGF-II after tumor treatment Levels dropped rapidly and hypoglycemia resolved. L. Axel rod and D.D. Ron,New England Journal of Me dicine , Vol. 319, no. 22, pp. 1477-1479, 19 See 88.   IGF-Iin vivoAdministration can also induce hypoglycemia. M. S. Lewitt et al.Endocrinology, Vol. 129, no. 4, p p. 2254-2256, 1991. Lewitt et al. Inhibition of IGFBP-1 by glucose addition to fatty acidsin v intro It also reports what the study found.   In pulmonary fibrosis, the number of activated alveolar macrophages increases and in the alveolar wall A pathological mass accumulation of fibroblasts occurs. Fibroblasts are extracellular collagenous matrices. Secretes couscous. Fibroblasts and matrix secretions thicken the alveolar wall, -Leading to the loss of capillary units. Activated alveolar macrophages are fibroblastic It has been found to release IGF-I which signals replication. W. N. Rom, etc.J. Clin. Invest. 82 , Pp. See 1685-1693, 1988. while The alveolar macrophages derived from patients with interstitial lung injury are self-treated with IGF-I as described above. It is also known to secrete spontaneously. References; P. B. Bitterman, etc. ,J. Clin. Invest. 72, Pp. See 1801-1813, 1983 Teru. Current treatments for cancerous and non-cancerous disorders include surgery, radiation, chemotherapy and Includes hormone therapy. For example, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, colon cancer and osteosarcoma Various types of cancer are treated with surgery, radiation and chemotherapeutic drugs. Of the above cancers Chemotherapeutic agents used for treatment include fluoropyrimidines and alkylating agents Be done. Each of these substance groups is, for example, myelosuppress sion), immunosuppression, neutropenia, gastrointestinal toxicity, nephrotoxicity and peripheral neuropathy It shows a great toxicity including. In addition, known chemotherapeutic agents that are effective in treating liver cancer Does not exist. Surgery is extremely dangerous, the outcome is unpredictable, and radiation is routine. It is nonspecific in terms of position. Hormone therapy includes unwanted hair growth and mood changes There are unwanted side effects of.   Antibodies to the type I IGF-I receptor areinvit ro Have been shown to block the growth of IGF-I responsive cancer cell lines. Art eaga, etc.J. Clin. Invest. 84, Pp. 14 18-1423 , 1989 and Zia et al.,Proc. Amer. Assoc. for Canc er Research 33: 270 , Abstract 1616,199 The study reported in 2 showed certain breast and lung cancers transplanted into immunodeficient nude mice. It was shown that the antibody against the IGF-I receptor blocked the growth of Escherichia coli.   Trojan et al.,Proceedings of the National Academy of Science 89 , Pp. 4874-4878, Antisense sequences to the IGF-I gene, as described in 1992. Was found to block the growth of malignant rat glioma cell lines implanted in rats ing. However, it is still early to use antisense sequences for gene therapy. It is in the development stage.   Thus, agents that suppress the action of IGF in the cancer and disease states listed above Is needed. The present invention provides such inhibitors, i.e. in the above disease states Inadequate GF IGFBP-1 which suppresses various actions is provided.Summary of the invention   The present invention provides insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) It relates to a method for use as a therapeutic agent for treating or preventing a related condition. Identification of the present invention In the example, the binding protein is IGFBP-1, also referred to as "BP-1" It The invention also relates to methods of using modified forms of IGFBPs as therapeutic agents. An example For example, a modified form of IGFBP-1 may be conjugated to a polymer, IGFBP-1, or Or two or more IGFBP-1 molecules attached to a polymer. Above method In patients with an IGF-related condition, such as IGFBP-1 or a modified form of I. IGFBPs including GFBP-1 should be administered in an amount sufficient to achieve a therapeutic effect. Including. In the case of IGFBP-1, the circulating level of IGFBP-1 is about It is thought that the therapeutic effect can be improved by adjusting the dose to 0.1 to about 300 μg / ml. It Administration of IGFBPs, especially IGFBP-1, may be useful in breast cancer, colon Cancer, lung cancer, ovarian cancer, osteosarcoma, glioma, liver cancer, prostate cancer, rhabdomyosarcoma, restenosis , Acromegaly, obesity, tumor-induced hypoglycemia, pulmonary fibrosis, diabetic nephropathy -And And when treating or preventing diabetic retinopathy. The present invention relates to IGFB Pharmaceutical composition containing P, especially IGFBP-1 or a modified form of IGFBP-1 And a method of treating or preventing an IGF-related condition using said pharmaceutical composition ItDetailed Description of the Invention   Inappropriate expression or utilization of IGF-I or IGF-II is associated with many disease states. It becomes one factor. Administration of IGFBPs, especially IGFBP-1, Useful for disease states associated with inappropriate expression or utilization of -I or IGF-II It could be a cure. That is, the present invention relates to IGFBP-1 or modified form IGFBPs, including IGFBP-1, are administered in an amount sufficient to achieve a therapeutic effect. Treat a patient having an IGF-related condition by or Provide a way to prevent.   The terms used in this specification are defined as follows.   The term “acceptable pharmaceutical carrier” means a physiologically compatible aqueous or non-aqueous It means an aqueous solvent.   Unless otherwise specified, the term "IGF-I" is the same amino acid as natural IGF-I. A protein having an acid sequence, or Tamper having the same amino acid sequence as natural IGF-I with an N-terminal methionine added Quality (met-IGF-I).   The term "IGF" refers to, for example, IGF-I, IGF-II, (des1-3). Binds to IGF-I, met-IGF-I, insulin, and type I receptors Any active binding fragment, including any active fragment that binds to the type I IGF receptor. It means a polypeptide. This hormone group consists of Blundell and Humbel,Nature 287 , Pp. 781-787, 1980.   The term "IGF-related condition" refers to IGF, IGF binding protein or IG Overproduction or underproduction of F receptor, binding to binding protein or receptor Inadequate or inadequate binding of IGF and throwing of IGFBPs, especially IGFBP-1 Pre-existing cause or associated with any disease whose symptoms are reduced or diminished by , Or potentially harmful physiological condition. IGF-related conditions are also common in patients Means that the administration of IGFBPs including IGFBP-1 has the desired effect To do. Examples of IGF-related conditions include breast cancer, colon cancer, osteosarcoma, glioma, lung cancer, rhabdomular. Myoma, ovarian cancer, Liver cancer, acromegaly, obesity, tumor-induced hypoglycemia, pulmonary fibrosis, restenosis, diabetes Includes pathological nephropathy and diabetic retinopathy.   The term "patient" refers to any person, including a human, in need of treatment for an IGF-related condition. Means an animal.   The term "IGFBP" refers to any of the six known IGF binding proteins. Or a fragment of the binding protein that binds to IGF. I GF-I and IGF-II are specific binding proteins of which 6 are known in the blood. It circulates in combination with quality. Binding protein binds to over 95% of IGF in blood . According to one theory, IGF-I and I when bound by a binding protein GF-II interacts with several cell surface receptors that mediate its biological functions Is disturbed.   IGF binding protein-1 is a 23 kDa IGF binding protein. IG FBP-1in vivoPeriod of growth arrest (eg starvation and diabetes) in , Which suggests that IGFBP-1 is an IGF-I inhibitor. ing. Oh,Endocrinol. 132, Pp. 1337-1344 1993 is IG The ability of FI and IGF-II to have substantially equal affinity for IGFBP-1 It has the power to report.   Amniotic fluid is a natural source of IGFBP-1 and is a phosphorylated form of this binding protein. It contains both the non-phosphorylated form. J. I. Jones et al.Proc. Nat l. Acad. Sci. 88 , Pp. See 7481-7485, 1991. Rin Oxidized BP-1 has a higher affinity for IGF-I than the unphosphorylated form. J. I. J ones,J. Biol. Chem. 268: 2, Pp. 1125-1131 , 1993. According to Jones et al., The phosphorylated form of BP-1 suppresses cell growth. Although antagonizing, non-phosphorylated BP-1 is cell growth stimulatory. Expressed in bacteria The produced recombinantly produced BP-1 is not phosphorylated and may enhance the action of IGF-I. Is known. D. Ladin et al.,J. Cellular Biochem istry , Supplement 17E, p. 127, 1993.   However, the data provided herein also shows that non-phosphorylated IGFBP-1 alsoin vitro as well asin vivoShowing that it may be cytostatic in There is. Especially, Bacterial-derived recombinant BP-1 is associated with adverse IGF-related conditions It became clear that the length was suppressed.   Therefore, IGFBP-1 useful in the methods of the invention is in its phosphorylated or unphosphorylated form. It can be a state. That is, BP-1 useful in the present invention is purified from natural sources such as amniotic fluid. Alternatively, it can be prepared according to a recombinant procedure well known to those skilled in the art. . The amino acid sequence of mature IGFBP-1 is (SEQ ID NO: 1).   The amino acid sequence of the signal sequence is Ser-Glu-Val. -Pro-Val-Ala-Arg-Val-Trp-Leu-Val-Leu -Leu-Leu-Leu-Thr-Val-Gln-Val-Gly-Val -Thr-Ala-Gly (SEQ ID NO: 2).   A person skilled in the art can use the sequence of SEQ ID NO: 1 to generate DNA encoding IGFBP-1. Can be chemically synthesized. Alternatively, in other cases, the skilled artisan Design oligonucleotide probes to isolate genomic DNA or mRNA, And cDNA can be generated. The DNA encoding IGFBP-1 is , Can be used to transform a host for recombinant production.   For example, BP-1 uses the T7 promoter system in E. coli BL21 / DE3 And can be expressed as an insoluble protein in inclusion bodies. BL21 / DE3 is F ． W. Studio and B.C. By Moffatt,J. Mol. Biol . 189 , Pp. 113-130, 1986. Or elsewhere If so, the TAC promoter system may be used. Recombinantly expressed in E. coli BP-1 is included in the insoluble fraction. Insoluble proteins fold incorrectly It is folded and inactive. Ta The protein was dissolved in 6M guanidine and a reducing agent, and the mixture was diluted 10 times. Denaturation of BP-1 by allowing it to stand overnight and restoring BP-1 and folding It can be folded to obtain the proper structure. IGFBP-1 has 18 cysties Residues, all of which are believed to be involved in the formation of disulfide bridges. Despite the large number of cysteine residues present in BP-1, the protein It is restored to one large species. The reconstituted protein is a continuous Q-sepharose and And butyl-Sepharose column. Of purified BP-1, 101 The yield per operation in the fermentor is about 1.5 g.   All of IGFBP-1 are described in J. Pat. I. J ones,Proc. Natl. Acad. Sci. 88, Pp. 7481- 7485, 1991 and J. I. Jones et al.J. Biol. Chem. 26 8: 2 , Pp. Mammalian expression system presented in 1125-1131, 1993 Can also be expressed in. For expression in mammalian systems, the mature protein and DNA encoding both the gnul sequence should be used. Those of ordinary skill in the art Appropriate The vector and expression system can be chosen as desired.   The therapeutic utility of IGFBPs, including IGFBP-1, prolongs their circulating half-life It can be increased by The molecular weight of a protein can be By covalently attaching an inert polymer chain such as ren glycol (PEG) Is known to increase the circulating half-life of proteins in the body. There is. For example, Davis et al., Biomedical Polymers: Po. Lymeric Materials and Pharmaceuticals s for Biomedical Use, pp. 44 1-451,198 See 0. The covalent attachment of PEG to proteins is referred to herein as "PE The term "PEGylation" refers to the term "PEGylated". Means bound to Mar.   One useful method of PEGylation is to polymer activated with thiol-specific reactive groups. Creating a mutein having a cysteine residue effective for the binding of Mutei Can be prepared using mutagenesis techniques well known to those skilled in the art. For example Replace one or more specific amino acids with cysteine residues Or by inserting a cysteine residue between amino acids or at the N- or C-terminus. Creating an IGFBP-1 mutein by entering. Non-natural Stain residues are presumed to be “free”, ie not involved in intramolecular disulfide bonds. Measured. Unnatural cysteine residues are exposed on the protein surface of the IGFBP-1 molecule. And in a region not involved in receptor binding or binding to IGF It can be replaced or inserted. One of the sites for cysteine insertion or substitution is B It may be in the center of the P-1 protein. Cysteine is based on the sequence of SEQ ID NO: 1 Substitution at amino acids numbered 60-180 in residue numbering or It is considered to be insertable. A particularly useful mutein is one that is found in the native protein. It has cysteine residues at positions 98 and 101 where phosphorus is located.   Attachment of an inert polymer chain molecule to one or more IGFBP-1 molecules is a further modification. A variant of IGFBP-1, i.e. also called "PEGylated IGFBP-1" This results in a GFBP-1-polymer conjugate. Thiol special The attachment of differentially reactive groups to polymers has been described in international patent publications incorporated herein by reference. Application Publication No. 92/16221 Is being considered in the issue. Cysteine mutein is a thiol-specific reactive group on the polymer When coupled via the, the conjugate formed is a non-natural cysteine of the protein. Predicted to bind to residues. However, the unnatural cysteine during mutein restoration Becomes involved in disulfide bonds, which allows PE It may be released for G-change. In such cases, the polymer is a natural cystein. Bind to a residue. Determine specific PEGylation sites using peptide mapping can do.   Two IGFBP-1 molecules, one at each end of the polymer molecule "Ruform" molecules are also predicted.   International patent application used by those of ordinary skill in the art and included herein by reference In accordance with the teachings of Publication No. 92/16221 and the teachings herein, there is an Suitable ps useful for the production of IGFBPs, including IGFBP-1 having a variant H, protein concentration and protein to polymer ratio can be easily determined.   The present invention relates to a pharmaceutical carrier that can accept IGFBPs, including IGFBP-1. Also provided is a pharmaceutical composition containing and present in. Physiological saline is one of the carriers There is that It is anticipated that other acceptable pharmaceutical carriers may be used. One concrete In the example, the carrier and IGFBP-1 are considered to constitute a biocompatible sustained release formulation. Can be The main solvent in the carrier may be aqueous or non-aqueous. Yes. In addition, the carrier should be pH, osmolality, viscosity, clarity, color, sterility of the formulation. , Other agents that are pharmaceutically acceptable, that alter or maintain stability, dissolution rate or odor. Molding agents may also be included. Similarly, the carrier should be stable, soluble, and free of IGFBP-1. It also contains additional pharmaceutically acceptable excipients that modify or maintain release or absorption. Can have. Such excipients are prepared for administration in unit or multiple dosage forms. It is a substance that is commonly used to administer.   The prepared therapeutic composition may be a solution, suspension, gel, emulsion, solid, or dehydrated. Alternatively, it can be stored in sterile vials as a lyophilic powder. Formulations such as In a form that can be used as it is, or in a form that requires reconstitution immediately before administration It can be stored. A preferred storage of the above formulation is at least 4 ° C, preferably -7 Perform at temperatures as low as 0 ° C. The above-mentioned preparation containing IGFBP-1 was treated at physiological pH or It is also preferred to store and administer at about its pH. Current, Of formulations at high pH values (ie above 9) or low pH values (ie below 4) Storage and administration are considered undesirable.   The pharmaceutical composition of the present invention may be administered intravenously, parenterally, intramuscularly, subcutaneously, intraarticularly or by injection. May be administered by injection or in the form of an inhalation mist, orally active preparation or suppository . Repeated doses to achieve and maintain the desired dose of IGFBP-1 It is possible to This method uses IGFBP-1 concentrations within a preselected range. Is realized in the bloodstream of the patient. Circulation of IGFBP-1 in the bloodstream Maintaining a concentration of 0.1-300 μg / ml is effective in treating IGF-related conditions It is possible that The frequency of administration depends on the pharmacokinetics of IGFBP-1 in the formulation used. Depends on mechanical parameters.   The method of the present invention is based in part on the experiments described in the examples below. In short, books The inventors have found that IGFBP-1, IGF-I and IGF-IIin vitro Found to block mitogenic effects on breast, colon and osteosarcoma cancer cells did. Estrogen causes cells to secrete IGF-I or IGF-II By at least partially To stimulate breast cancer growth.   A BP-1 concentration of 1-10 μg / ml was required to suppress colon cancer growth. It was Some colon cancer cell lines grew in serum-free medium, which probably Cell line produced growth factors for the cell line itself. The above cells in serum-free medium Cell line growth was inhibited by at least 50% at high concentrations of BP-1.   The present inventors have found that IGFBP-1 produces mitogens of IGF-I on osteosarcoma cells. It proved to suppress the use. 50 ng / ml IGF-I is rat osteosarcoma cells 50% of the effect of mitogen on IGFBP-1 was suppressed by a 12-fold molar excess. Controlled.   IGFBP-1 also inhibits smooth muscle cell proliferative response to IGF-I found. IGFBP-1 administered post-angiogenically in rat induces smooth muscle proliferation And the intimal thickening caused by extracellular matrix attachment was significantly suppressed. like this The results show that IGFBP-1 is useful in treating or preventing restenosis. ing.   In hypophysectomized rats, IGFBP-1 is associated with IGF-I and growth hormone. The growth-promoting effect of the In addition IGFBP-1, its mutein, and PEGylated IGFBP-1 are Suppressed IGF-I stimulation of 3T3 fibroblast growth.   The invention is illustrated in a non-limiting manner by the following examples.                               Example 1 A. Purification and reconstitution of IGFBP-1   Express IGFBP-1E. FIG. coliThe cells were treated with buffer A (50 mM Tri s, pH 7.5, 20 mM NaCl and 1 mM DTT). Suspend at a concentration of 40 ml per 10 g and 180 using a French press cell. Destroyed at 0 psi. Centrifuge the suspension at 20,000 xg for 30 minutes to pellet and And an aliquot of the supernatant was analyzed by SDS-PAGE. Pair with IGFBP-1 The corresponding major band was present in the pellet but not in the supernatant. Bae Ret is suspended in buffer A (40 ml per 10 g of cell paste), 20, Centrifuged again at 000 × g for 30 minutes. This washing process was repeated twice. IGF The final pellet containing BP-1 was added to 6M guar using a ground glass homogenizer. Nidin, 50 mM Tris, pH 7.5, 6 mM DTT (per 10 g of cells 25 ml). The suspension was incubated at room temperature for 15 minutes. Dissolution Remove unreacted proteins by centrifugation at 20,000 xg for 30 minutes did. The final concentration of IGFBP-1 was 1.0 mg / ml. Pellet and supernatant of SDS-PAGE analysis showed that IGFBP-1 was only present in the supernatant. It was   The denatured and reduced IGFBP-1 was subjected to a three-step restoration process.   a) Oxidized glutathione, which is a mixed disulfide generating reagent (GSSG), is added to the supernatant. It was added to a final concentration of 25 mM and incubated at room temperature for 15 minutes.   b) Then dilute the solution gradually with 50 mM Tris, pH 9.7 10-fold, Phenylmethylsulfonyl fluoride was added to a final concentration of 1 mM. Protein concentration The degree was 100 μg / ml.   c) Incubation of the reconstitution mixture at 4 ° C. overnight followed by 15 at 20,000 × g Centrifuge for minutes. SDS-PAGE analysis of the pellet and supernatant showed that the supernatant was relatively uniform. It was confirmed that it consists of a single IGFBP-1.   Aliquot (50 μl) of the supernatant in 200 μl with buffer C (0.05% TFA) And inject into reverse phase column (RP-4, 1 x 250mm, Synchrom). Using 80% acetonitrile and 0.042% TFA (buffer solution D) Run on a gradient (1% increase in buffer D concentration for 1 minute) Elution was performed at a volume of 0.1 ml / min.   The single major peak representing the reconstituted IGFBP-1 eluted at 68 minutes. 5M Completely in guanidine, 50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM DTT After reduction and denaturation, the retention time of reconstituted IGFBP-1 shifts to 71.0 minutes. I got it. These results indicate that IGFBP-1 folds into a single dominant species under the described conditions. It is rare. N-terminal sequence of IGFBP-1 eluted at 68.0 minutes From the analysis, the sequence Met Ala Pro Trp Gln Cys Ala Pr o ... (SEQ ID NO: 3) was obtained, which is at the N-terminus of the recombinant protein. N-terminal amino acid sequence of human IGFBP-1 except that there are additional methionine residues It corresponds to (SEQ ID NO: 1). B. Isolation of reconstituted IGFBP-1   Includes correctly restored IGFBP-1E. FIG. coliStarting from 590g of paste The prepared reconstitution mixture (15000 ml) was concentrated to 1800 ml, and 20 mM phosphoric acid was added. Dialyze against sodium, pH 6.0 and centrifuge at 10,000 xg for 30 minutes. Settled inE. FIG. coliRemove protein and pre-equilibrate with the same buffer Oita Q-Sepharose (Pharmacia / LKB, Piscataway, NJ) column (5.0 X 60 cm). The bound protein was directly transferred to 0.5M NaCl. Elute at a flow rate of 20 ml / min using 5000 ml with a linear concentration gradient to obtain 25 ml The fraction was collected. Single major peak is 0.3-0.4M NaCl It eluted. A 100 μl aliquot of each fraction was applied to a reverse-phase chromatography column. Individually analyzed by ram (RP-4 1 x 250 mm Synchrom) . Primarily (judging from RP-4 analysis) a frame containing correctly restored IGFBP-1 Lacton is pooled (900 ml), pH is adjusted to 7.5, and conductivity is 1 mM.   Adjusted to NaCl (95mΩ), 20mm HEPES, pH 7.5, 1.0 Toyopearl butyl-650 pre-equilibrated with M NaCl   S hydrophobic interaction column (5 x 5 cm) (Supelco, Bellefon te, PA) at a flow rate of 30 ml / min.   Protein has a linear concentration gradient up to 20 mM HEPES, pH 7.5 Elution was performed with 1500 ml at a flow rate of 40 ml / min. 5-15 single wide peaks Elute with% ethanol. Aliquots of each peak fraction (10 μl) Were analyzed by RP-4 reverse phase chromatography and SDS-PAGE. Pure Pool the fractions containing the trendy (95%) correctly restored IGFBP-1 , 6-8 mg / ml and analyzed for biological activity. Use IGFBP-1 Recombination in all of the following experimentsE. FIG. coliExpression IGFBP-1 was used .                               Example 2 On the IGFBP-1 of growth promoting action of IGF-I and growth hormone in rat Inhibition   Removal of the growth hormone source from an individual by pituitary ablation (removal of the pituitary gland) results in The long stop. Schoenle et al.Nature, 296: 252-253 (1982) exogenous growth hormone or I. Injecting GF-I can stimulate growth in the animal. I in this model Production of subcutaneously administered IGFBP-1 on growth stimulated by GF-1 and growth hormone Tested. Growth was assessed by measuring weight gain and tibial epiphyseal width .A. IGF-I experiment   Weight 120-130 with pituitary gland removed by surgery g male Sprague Dawley rats were purchased from a commercial supplier (Charles Ri Ver., Wilmington, MA). Check the completeness of the pituitary resection To demonstrate, the body weight of the rats was monitored for 2-3 weeks before the start of the experiment. body weight Rats whose body weight increased by 2 g or more per week were not used in the experiment. 0.2 for rat ml vehicle solution (40 mM HEPES, 100 mM NaCl), IGF -I (80 μg) alone, IGFBP-1 alone, or various molar ratios of BP-1 Subcutaneous injection of the combined IGF-I (80 μg) into the scruff twice a day for 8 consecutive days did. The molar ratio of IGFBP-1: IGF-I tested was 0.04: 1 to 5: 1. there were. Body weight was measured daily. Kill the rat 12 hours after the last injection did. Greenspan,Endocrinology, 45: 455-46 3 (1949), remove the left and right tibias, fix with formalin, and It was cleaved at the distal end of the plane and stained with silver nitrate. Calcified tissue stained dark brown The cartilage growth area appeared as a clear white band. Cartilage end plate, calibrated eyepiece microphone It was measured with a stereomicroscope equipped with a lometer. Approximately 10 for each epiphysis The reading was taken. Left for each rat The right tibia readings were combined and the average calculated.   The results of several experiments are summarized in Table 1. 8 days for vehicle-treated rats Rats showed no weight gain during the study period, but rats treated with IGF-I In the meantime, it showed an average weight gain of about 6 g per rat. IGFBP-1: IGF- Rats in the I: 1 5: 1 group did not show significant weight gain, indicating that this Excessive amount of IGFBP-1 interfered with the growth promoting effect of IGF-I in the model I understand. IGFBP-1 to IGF-I in a molar ratio of 1: 1 to 0.2: 1. When administered, IGF-I stimulation-induced growth was inhibited by 50-75%. IGFBP In the group administered -1, the growth rate higher than the stimulated growth rate of IGF-I alone was observed. No group was shown. Furthermore, it is also significant when IGFBP-1 alone is administered. No growth promoting effect was observed. Regarding the expansion of the tibial epiphyseal width due to IGF-I stimulation When IGFBP-1 was administered to IGF-I at a molar ratio of 5: 1 to 1: 1 Resulted in a statistically significant inhibition (Table 1). From these data, IGFBP-1 Are found to inhibit bone and cartilage growth due to IGF-I stimulation. B. Growth hormone experiment   The method of this experiment was similar to that of IGF-I except that rat was treated with IGF-I. Growth hormone was administered instead of I. Separate growth hormone and IGFBP-1 At the injection site of Injected subcutaneously. IGFBP-1 was 5: 1 in a single injection in the above experiment. A dose of 10 mg / kg equivalent to that given in molar excess was administered twice a day It was Human Pituitary Induced Growth Hormone (Sigma Chemical Compa ny, St. Louis, MO) was administered twice daily at a dose of 15 mU / injection. This IGF-I used in previous experiments in rats at different growth hormone doses A stronger growth response than the administration of was stimulated. 6 rats treated with growth hormone There was an average weight gain of 12 g per rat during the daily dosing period (Table 2). I Weight gain was inhibited by about 75% in GFBP-1 treated rats. tibia Growth of epiphyseal width due to growth hormone stimulation was about 2 compared to vehicle-treated test animals. Doubled (Table 2). Growth hormone-stimulated increase in tibial epiphyseal width is associated with IGFBP Co-administration of -1 resulted in about 75% inhibition (Table 2).   From the above experiments, IGFBP-1 was associated with IGF-I and growth form in rats. It can be seen that both growth-promoting actions can be inhibited.                               Example 3 Inhibition of human breast cancer cell line proliferation in vitro by IGF-I   Production of IGF-I, IGF-II and IGFBP-1 in human breast cancer cell lines Physical effects were evaluated. The human breast cancer cell line MCF7 was modified by Rockville, MD The American Type Culture Collection in (Catalog number HTB 22). Cells were treated with 10% fetal bovine serum, 10 μg / ml insulin, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 1 00 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and non-essential Eagle's minimum essential medium containing mino acid (Irvine Scientific) ( (Available from Mediatech, Herndon, VA). cell For proliferation assay, MCF7 can be treated briefly with trypsin and EDTA. Removed from the plate by and. 96-well tissue culture plate (Cos free in Tar Corporation, Cambridge, MA) Medium (1 mg / ml bovine serum albumin, 2 mM glutamine, 1 mM pyruvate Sodium, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml Streptomyces 2 × 10 in Eagle's minimum essential medium containing amino acids and non-essential amino acids)Four/ By well Plated. I at various dilution concentrations GF-I, IGF-II or IGFBP-1 in wells up to a final volume of 200 μl Was added. After 4 days at 37 ° C, MTT (3- [4,5-dimethylthiazole-2- Il] -2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma Chemi 5 mg / m, available from Cal Company, Catalog No. M5655) 20 μl of 1 solution was added to each well and the cells were incubated at 37 ° C. for another 6 hours did. 50% dimethylformamide, 20% sodium dodecyl sulfate, pH 4. Soluble cells and hydrolyzed MTT by adding 50 μl of solution 7 Turned into After overnight incubation at 37 ° C, VMAX velocity microplate (Molecular Devices Corporation, Pa Lo Alto, CA) and measuring the optical density of the liquid at 570 nm, Hydrolyzed M by subtracting the 650 nm optical density background TT was quantified.   IGF-I and IG, as evidenced by the increase in optical density of cell culture medium. Both F-II induced proliferation of MCF7 cells (Table 3). MCF7 cell proliferation IGF-I was about 5 times more potent than IGF-II in the stimulation. MC F7 cell proliferation was at IGF-I concentrations in the range of about 1-120 ng / ml, and about 1 It occurred at IGF-II concentrations ranging from 0 to 1200 ng / ml. IGFBP-1 , IGF-I and IGF-II stimulated MCF7 cell proliferation in a dose-dependent manner. Damaged (Tables 4 and 5). This used MCF7 cells at 60 ng / ml of IGF-I. Or the presence of increasing amounts of IGFBP-1 with 300 ng / ml IGF-II Confirmed by incubating below. Tissue medium used maintains cells Was the same as that used for the treatment, except that it contained neither serum nor insulin. There wasn't.   For IGF-I, the tested IGFBP-1 concentration was 6-13,600 ng / Ml range. Corresponds to a molar ratio of IGF-I: IGFBP-1 of about 1: 1 Inhibition of growth of about 50% occurred at an IGFBP-1 concentration of about 180 ng / ml. (Table 4). 4000 ng / ml corresponding to about 20-fold molar excess of IGFBP-1 Growth was substantially completely inhibited at IGFBP-1 concentrations above.   IGFBR-1 concentrations tested against IGF-II range from about 30 ng / ml to about 2 The range was 3,000 ng / ml. The molar ratio of IGF-I: IGFBP-1 is Less than 1: 1 IGF-II proliferation at an IGFBP-1 concentration of about 840 ng / ml The response was inhibited by about 50% (Table 5). IGF in a molar excess of slightly over 20 times Proliferate at IGFBP-1 concentrations above 22,000 ng / ml, corresponding to BP-1 Was virtually completely inhibited.                               Example 4 Inhibition of human colon cancer cell line growth in vitro by IGFBP-1   Biological production of IGF-I and IGFBP-1 in a number of human colon cancer cell lines Tested. Six Human Colon Cancer Cell Lines in Rockville, MD Am Obtained from erican Type Culture Collection . These cell lines were SK-CO-1 (HTB 39), LS 174T (CL 188), DLD-1 (CCl 221), HT-29 (HTB 38), CO LO-205 (CCL 222) and Caco-2 (HTB37). Or The symbol in parentheses indicates the ATCC catalog number. The reason for choosing these cell lines is , All of these are American Type Culture Collect Because it forms tumors in nude mice according to the description in the Lion catalog. It Cells were treated with 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 units / ml penicillate. Eagle's minimum essential medium containing phosphorus and 100 μg / ml streptomycin (M editech, Herndon, VA).   The effect of IGF-I on these six colon cancer cell lines was evaluated as follows. . Once the cells reach 90-100% confluence, treat the cells with trypsin / EDTA. It was removed from the plate by simple processing. Wash cells several times and Serum-free medium (2 mM glutamine, 100 units / ml penicillin and 100 1 × 10 in Eagle's minimum essential medium containing μg / ml streptomycin)Five/ Resuspended at a concentration of ml. 100 μl of cell suspension is added to 96-well tissue culture plate Of Corning Glass Works, Rochester, NY Added to each well. 100 μl of serum-free medium containing various amounts of IGF-I was weighed. And gently mixed by aspirating the medium with a pipette. Plate Incubated at 37 ° C for 3 days. At this point, crystal violet stain The number of cells was quantified using an assay. Aspirate medium from cells and remove 150 μl Crystal Violet Dye [2g of Crystal Violet (Aldrich   Chemical Company, Inc. , Milwaukee, Wi) 270 ml 37% formaldehyde and 20 ml potassium phosphate pH 7. Dissolved in 0] was added to each well. After 20 minutes, the liquid was blotted and the wells were washed 3 times with phosphate buffered saline. 20 0 μl extraction buffer (50% ethanol, 0.1 M sodium citrate pH 4. 2) was added to each well and the plate was left overnight at room temperature. The next day, micro pre Leader (Molecular Devices, Palo Alto, C The optical density of the wells at 570 nm was measured using A).   All six cell lines, as evidenced by the increase in optical density of the cell culture, Proliferated in response to IGF-I (Tables 6 and 7). Caco-2 cell line is serum-free It proliferates well in the ground, which suggests that it may contain one or more exogenous growth factors. You can see that they are producing. Growth of the Caco-2 cell line in serum-free medium is IG Enhanced by FI (Table 6). Other colon cancer cell lines tested were tested under the conditions Did not show significant cell proliferation in the serum-free medium of. However, these are all Respond to IGF-I as evidenced by an increase in the optical density of the culture. Grew (Tables 6 and 7).   The effect of IGFBP-1 on the proliferation of these cell lines was then investigated. IG Rather than investigating the effect of FBP-1 on cell proliferation by IGF-I stimulation , Determination of whether IGFBP-1 can inhibit cell growth in the presence of serumin vivo This was investigated because it could represent the situation. Simple trypsin / EDTA treatment The cells were removed from the plate by washing, washed, 4% fetal bovine serum, 2 mM gluta Min, 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin 1 x 10 in minimum essential eagle mediumFiveIndividual Resuspend at 100 μl / ml and add 100 μl of cell suspension to 96-well cell tissue Added to each well of the culture plate. IGFBP-1 with 2 mM glutamine, 1 Blood free containing 00 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin Dilute different concentrations in clear eagle minimal essential medium and add 100 μl of the mixture to 96 wells. Added to each well of the plate. Pipet the cell culture gently to mix, Incubated at 37 ° C for 3 days. The final serum concentration was 2%. at this point Cell numbers were quantified using the Crystal Violet Staining Assay described above. IG FBP-1 has four cell lines (Caco-2, COLO-2 in the presence of 2% serum. 05, HT-29 and SK-CO-1) significantly inhibited the proliferative response (Table 8 and Table 9). Until the level of IGFBP-1 reaches several hundred ng / ml, the growth inhibition is almost zero. I couldn't see it at all. The maximum growth inhibition observed was 30% -100% (IG FBP-1 level: 10-20 μg / ml). IGFBP-1 is LS   It had little effect on serum-stimulated growth of the 174T and DLD-1 cell lines ( The respective maximum inhibition rates at 10 to 20 μg / ml of IGFBP-1 are 9% and 2 respectively. 2%). Free IGF-I in serum and IGF-II concentration was not measured.                               Example 5 in vitro Of human osteosarcoma cell line growth by IGFBP-1 in mice   American Type Culture Collection (Ro rat osteosarcoma cell line UMR-106 (CR L 1661) Was used to examine the ability of BP-1 to inhibit the proliferation of IGF-I in osteosarcoma. These cells were treated with 7% fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin, 100 μg Ham's F12 medium containing 1 / ml streptomycin and 2 mM glutamine (Med itech, Herdon, VA). 48-well set of cells Woven culture plate (Costar Corporation, Cambridge , MA) in response to IGF-I. (After about 3 days at 37 ℃ ) When the cells become confluent, wash the cells twice with phosphate buffered saline (PBS), It was pre-incubated for 24 hours in the above medium without fetal bovine serum. Plain After cubating, the medium was removed and serially diluted IGF-I (1-1,000 n). (g / ml) was replaced with 0.5 ml of serum-free Ham's F12 medium. Plate at 37 ° C The cells were further incubated for 20 to 24 hours. Then add 0.5 μCi to each well3 H-thymidine (NEN research products, Dupont   Co. , Boston, NA) for 4 hours at 37 ° C, then with cold PBS. It was washed 3 times. 7% cold trichloroacetic acid (JT Baker Inc., Phi cells (llipsburg, NJ) Was added to precipitate the DNA. 0.3M after rinsing with 95% ethanol The cells were solubilized by adding NaOH. Remove aliquot and scintillate Incorporated into DNA by counting with a counter3Determine the amount of H-thymidine Weighed All assays were performed in triplicate. As shown in Table 10, IGF-I , Incorporated into DNA3H-thymidine was dose-dependently increased. Maximum response Was about 6 times the level seen in the absence of IGF-I. I in different experiments ED of GF-I50Was 4-20 ng / ml.   Using the assay described above, IGFBP-1 induces IGF-I in UMR-106 cells. The effect on stimulated proliferation was investigated. However, the following points differ from the above-mentioned assay. After the pre-incubation step, cells were treated with 50 ng / ml IGF-I and Serum-free ham F containing BP-1 (200 to 16,000 ng / ml) having different concentrations Incubated with 12 medium. The medium was further supplemented with 2 mM glutamine, 100 units. Position / ml penicillin, and 100 μg / ml streptomycin. After 20-24 hours at 37 ° C., 0.5 μCi was added to the cells.3H-thymidine for 4 hours Pulsed, rinsed 3 times with cold PBS, and precipitated DNA with 7% cold trichloroacetic acid. Rinse cells with 95% ethanol, solubilize with 0.3 M NaOH and scintillate. I counted aliquots at the counter.   The results of one out of three experiments are shown in Table 11. IGFBP-1 is the data It has been shown to inhibit the mitogenic effect of IGF-I on osteosarcoma cells. About 12 A 2-fold molar excess of IGFBP-1 (2,000 ng / ml) It inhibited the mitogenic effect of GF-I by 50%. 50-100 fold molar excess of IGFB P-1 (8,000-16, 000 ng / ml), the mitogenic effect of 50 ng / ml IGF-I was almost complete. Was hindered by. IGFB required to inhibit the action of IGF-I in these experiments The amount of P-1 is higher than that observed with other experiments and other cell lines. this Is probably 50 ng / ml IGF-I had the greatest mitogenic response in this experiment. Due to the fact that                               Example 6 Inhibition of smooth muscle cell proliferation by IGFBP-1   IGFBP-1 was tested to find that IGFBP-1 is a smooth muscle cell against IGF-I. It was investigated whether it could inhibit the proliferative response of E. coli. Rat smooth muscle cell-like cell line A10 ckville, MD's American Type Culture Col Obtained from collection (catalog #CRL 1476). Of the A10 cell line The characteristics are as follows. W. Kimes and B.C. L. Brandt,Experiment al Cell Research , 98: 349-366 (1976). Has been done. Cells are 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 units / m DMEM medium containing 1 penicillin and 100 μg / ml streptomycin (a) Dulbecco's variant of Eagle's medium, Mediatech, Inc. Herndon, VA). Cells were trypsin / EDTA lysed for proliferation assay. Easily treat with liquid and remove from plate, once with serum-containing medium, with serum-free medium It was washed twice and counted using a hemocytometer. Cells were treated with 2 mM glutamine, 100 Serum-free D containing unit / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin 2 x 10 in MEM mediumFiveResuspended at a concentration of 4 cells / ml. 96-well tissue culture Plate (Corning Glass sWorks, Rochester, NY), 100 μl of cells in each well An aliquot of suspension was added. 100 pl of serum-free medium was added to IGF- While increasing the amount of I (0, 2, 20, 200 or 2000 ng / ml), Wells and the plates were incubated at 37 ° C for 3 days. At this point, the real Cell number was quantified using the crystal violet staining assay described in Example 3. .   IGF-I dosed cell numbers as shown by the increase in optical density measurements in the wells. It was increased (Table 12). At an IGF-I concentration of 100 ng / ml, the maximum A proliferative response occurred.   Using the cell proliferation assay described above, recombinant IGFBP-1 induces I-10 in A-10 cells. The effect on GF-I hyperproliferation was examined. IG with 100 ng / ml test well The assay was performed in the same manner except that it contained FI. Several wells Was further included with IGFBP-1 at a concentration of 1 to 10,000 ng / ml.   IGFBP-1 increased cell number as evidenced by the decrease in optical density of cell culture. The dose was decreased (Table 13). IGFBP-1 at a concentration of 1000 ng / ml , The cell number is the level observed without exogenous IGF-I (basal proliferation) Fell to. With IGFBP-1 at a concentration of 10 μg / ml, the cell number was Decreased to levels lower than those observed in the ground, which indicates that rat A-10 cells Produce endogenous IGF-I or IGF-II. These de In addition, IGFBP-1 further responded to IGF-I by the proliferative response of rat smooth muscle cells. It shows that it inhibits the answer.                               Example 7                 Preparation of IGFBP-1 mutein A. Construction of IGFBP-1 mutein   Plasmid pJU1021. I included in (ATCC Contract No. 67730) The GFBP-1 DNA sequence was mutagenized to produce two IGFBP-1 mutants. C98 and C101 were constructed. In the C98 mutein, the mature protein sequence The serine at position 98 had been replaced with a cysteine residue. C101 mutein matures At position 101 of the protein sequence Serine had been replaced with a cysteine residue. Residue numbering is based on SEQ ID NO: 1 . Mutagenesis was performed using the polymerase chain reaction (PCR) technique.   Using plasmid T88IQ: IGFBP-1 DNA as starting template DNA C98 mutein was prepared. Plasmid pT88: IGFBP-1 is a plasmid It contains the wild type IGFBP-1 coding sequence in Smid pT88IQ.   Expression vector pT88IQ is a derivative of expression vector pT3XI-2. The vector pT3XI-2 was constructed by the following method. Departure plus for this build The mid was plasmid pKK223-3 purchased from Pharmacia. . The plasmid pKK223-3 contains a partial gene for tetracycline resistance. Possess. This non-functional gene was cloned into the complete vector contained on plasmid pBR322. It was replaced with the tracycline resistance gene. Plasmid pKK223-3 was added to Sph It was completely digested with I and partially digested with BamHI. The 4.4 kb pair fragment was gel purified , Synthetic adapter (SEQ ID NO: 4): And the C1aI and SphI digestion products of the tetracycline resistance gene of pBR322 A 539 base pair fragment of the derived DNA (PL Biochemicals, 27- 4891-01). The resulting plasmid was named pCJ1.   Next, New England Biolabs (Beverly, Mass) XhoI linker purchased from Achusetts) was added to plasmid pCJ1. Insertion into the PvuII site generated plasmid pCJX-1. This insertion Control plasmid copy numberropThe gene has been destroyed. Next, lacI inheritance An EcoRI fragment containing the offspring from the plasmid pMC9 (Calos et al., 1983). Purified and then inserted at the XhoI site with the XhoI-EcoRI adapter . Next, EcoRI and pstI (SEQ ID NO: 5): Digestion with the polylinker region of plasmid pKK223-3 at the additional site It was replaced with a polylinker containing. This The plasmid vector thus obtained is called pCJXI-1.   Finally, the tetracycline resistance gene was modified by bisulfite mutagenesis. Sites for the restriction enzymes HindIII, BamHI and SalI destroyed by Was replaced by a similar gene. Using the following procedure, the tetrasa of pBR322 The Iclin resistance gene was mutated. Plasmid pBR322 was replaced with HindIII And then mutagenized with sodium bisulfite (Shortle and And Botstein, 1983). Circular by binding the mutated DNA Generating DNA then cleaving with HindIII to prevent mutagenesis The amide was linearized. Using this digestion mixture,E. FIG. coli  JM109 (Y anisch-Perron et al., 1985). tetracycline A resistant colony was isolated and Hind in the tetracycline resistance gene of the plasmid was isolated. I checked that the III site was missing. Successfully mutated plasmid It is called pT1. A similar procedure was performed to mutate the BamHI site in pT1. Upon induction, the plasmid pT2 was obtained. By mutagenizing this plasmid pT2 , SalI The site was removed to generate plasmid pT3. Mutated tetracycline resistance The ClaI-StyI fragment of pT3 carrying the sex gene was isolated and used to , A homologous fragment of pCJXI-1 was replaced to generate pT3XI-2. Mutated The tetracycline resistance gene still encodes a functional protein. tac pro Downstream of the motor area, among other things, E. Expression for E. coli A poly containing BamHI and KpnI restriction sites useful as a burning gene A linker was introduced.   Similar to pT3XI-2, cloned gene containing pT88IQ vector Is driven by the tac promoter. Translation is a single NdeI recognition sequence C ATATG (downstream NdeI site so that the sequence of this starting site NdeI is single Be removed). To facilitate the insertion of the desired gene, N There is a polylinker downstream of the deI site. Furthermore, XhoI containing the lacI region Replace fragment with truncated fragment. This fragment contains the lacZ promoter, And the operator region, which is the binding site for the lac repressor, is not included. The lacI region to be replaced also has a lacIq mutation-single base substitution Therefore, the production of the lac repressor is increased (Muller-Hill et al.,Pr oc. Nat'l Acad. Sci. (U.S.A.) 59: 1259-12 64 (1968)).   The apparent differences between pT3XI-2 and pT88IQ are shown below:   1. Cloning site region.   EcoRI site upstream of polylinker and HindIII site downstream of polylinker The following 135-mer sequence to and from the position (SEQ ID NO: 6): Was replaced.   This sequence includes an NdeI site (underlined) at the start codon for expression, BamHI, X for maI, KpnI, SalI, SacI, BstBI, SpeI and SacII And a polylinker containing a recognition site.   2. Downstream NdeI site.   PT3XI-2 approximately 2.4 Kb downstream of the cloning region Has an NdeI site. This site has pT at the NdeI site of the above-mentioned start codon. It has been removed to be single at 88 IQ. Removing the NdeI recognition sequence Thus, the site is 5 '> CATATG> 3' to 5 '> CATATG> 3. ’   3. lacIq region.   The region of pT3XI-2 between the two XhoI sites containing the lacI region was The 1230 base sequence shown below: The lacIq sequence (1230BP) of pT88IQ (SEQ ID NO: 7) Replaced with.   This replacement region is a binding site for the lacZ promoter and the lac repressor. The operator area is not included.   This region is further lacIq abruptly causing an increase in lac repressor synthesis. It contains mutations (Muller-Hill et al., Supra).   Restriction enzyme for plasmid pJU1021XbaI andHinDigest with dIII, The IGFBP-1 DNA sequence was isolated and analyzed on NA-45 paper (Schleich er and Schuell, Keene, NH) according to the manufacturer's instructions, Purified by agarose gel electrophoresis. Isolated IGFBP-1 DNA fragment As aboveXbaI andHinGel-purified plasmid digested with dIII It was cloned into pT88IQ. Correctly reconstructed plasmid was designated pT88 It was named IQ: IGFBP-1. 5'ori used in PCR mutagenesis reaction Gonucleotide primer Rigonucleotide primer (IGFBP-1-C98) 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCL, 2.5 mM Mg Cl2, 0.001% gelatin, 500 μM each of dATP, dCTP, dGTP and TTP, 30 pins each Comole IGFBP-1-5 'and IGFBP-1-C98 primers, 1-1 0 ng of pT88IQ: IGFBP-1 plasmid DNA, and 5 units of "A mpliTaq "Taq DNA polymerase (Perkin-Elmer C etus, Roche Molecular Systems, Inc. , Br PCR was performed with 50 μl of the reaction mixture containing anchburg, NJ). The PCR conditions were: first incubation at 96 ° C for 3 minutes, then (1 hour at 96 ° C. Min, 66 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1.5 minutes) for 35 cycles, and finally at 72 ° C. It was a 10 minute incubation.   Starting agarose gel purified DNA fragment containing wild type IGFBP-1 coding sequence The C101 mutein was prepared using as template DNA. Plasmid pJU01 20NdeI andHinDigested with dIII to give approximately 0.8 kb IGFBP-1 The purified DNA fragment was purified by agarose gel electrophoresis to give the IGFBP-1 coding sequence. Got 5'oligonucleotide primer used in PCR mutagenesis reaction Is a primer (IGFBP- 1-5 '). 3'oligonucleotide plastic Su-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0. 001% gelatin, 200 uM each of dATP, dCTP, dGTP and T TP, 20 picomoles of IGFBP-1-5 'and IGFBP-1-C101 plastic Immers and 2.5 Units of "AmpliTaq" Taq DNA Polymerase PCR was performed in a 100 ul reaction mixture containing PCR conditions are (95 ℃ For 1 minute, 50 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1.5 minutes) for 30 cycles, then 72 Incubation was at 10 ° C for 10 minutes.   After PCR, the reaction mixture was loaded onto a ChromaSpin 100 column (Clon). Tech, Palo Alto, CA, Catalog No. K1332-2) , Nucleotides and unincorporated DNA primers were removed. DNA break A pieceXbaI andSacDigested with I to give a band of the correct size (about 0.43 kb) The agarose gel electricity mentioned above Purified by electrophoresis. The purified DNA fragmentXbaI +SacPT8 digested with I 8IQ: ligated to IGFBP-1 plasmid DNA. Using the binding mixture, (ClonTech Laboratories, Inc., Palo Alt. o, made in CA)E. FIG. coliStrain DH5α was transformed to 50 ug / ml Ampic Plated on LB agar plates containing phosphorus. Several clones obtained from each transformation Prepare plasmid DNA from Ronnie and sequence on both strands of the insertion region did. For each mutein, the plasmid with the correct sequence was selected. these To clones C101-3 (C101 mutein) and C98-12 (C98 mutein). In).   Then, the mutant IGFBP-1 gene was cloned into the plasmid pT5T (Eisenb). erg, S.E. P. etc,Nature, 343: 341-346 (1990)). Returned to. This treatment was performed on the plasmids derived from clones C101-3 and C98-12. De DNANdeI andHinMutant IGFBP-1 inheritance digested with dIII The approximately 800 bp band containing the offspring was gel-purified and digested with the same restriction enzymes. It was carried out by ligating to pT5T plasmid DNA. Use binding mixture do it,E. FIG. coliStrain BL21 / DE3 was transformed to give 50 ug / ml ampicillin. Plated on LB agar plates containing sillin. Several obtained from each transformation Plasmid DNA was produced from the colonies. P with a clone having the correct sequence T5T: IGFBP-1-C98 (C98 mutein) and pT5T: IGFBP It was named -1-C101 (C101 mutein). B. Preparation of washed inclusions   E. coli expressing the C98 or C101 muteins. E. coli cells with 10 L fermentor Propagated in. The cells obtained from the fermentor were treated with 6 ml of buffer solution per 1 g of cells. In combination, a breaking buffer (50 mM Tris, 25 mM NaCl, 1 mM It was resuspended in dithiothreitol ("DTT") pH 7.5). French pressure Cells were disrupted at 10,000 PSI using a force cell. 17,700 suspension Centrifuged at xg for 30 minutes. Re-load the pellet containing inclusion bodies in disruption buffer. It was suspended, washed and centrifuged again at 17,700 xg. Wash and back again The pellets subjected to heart separation can be stored frozen until processed. In pellets Approximately 80% of the proteins contained in were muteins. C. Restoring muteins   First, using a cell homogenizer, pellet the pellet with 6M guanidine HCl, 50 mM Tris, 6 mM DTT (pH 7.5) (per well for 10 ml of each buffer). 1 g) to denature each mutein.   Oxidized glutathione (“GSSG”) was added to the dissolved pellet at a final concentration of 23 mM. In addition to that started restoration. Incubate the solution at room temperature for 15 minutes, Then dilute slowly with 50 mM Tris (pH 9.7) to 100 μg / There was a final protein concentration of ml and a final guanidine concentration of 0.6M. Coomassie -By blue protein assay (Pierce, Rockford, IL) The protein concentration was measured. Then cysteine and phenylmethanesulfonyl Fluoride was added to a final concentration of 5.6 mM and 1 mM, respectively. Restoration The solution was incubated overnight at 4 ° C.   A 100 μl aliquot of reconstitution solution was applied to a C4 reverse phase column (RP-4 1 × 250 m m, Synchrom, Lafayette, In) and monitor the restoration. It was The C4 column was loaded with 2% acetonitrile (CH3CN), 0.05% Equilibrated with trifluoroacetic acid ("TFA"). 100 μl aliquot of reconstitution solution Is injected into the equilibrium column and 60% CH3CN, line gradient up to 0.05% TFA Buffer B was eluted using a flow rate of 0.25 ml / min with buffer B varying at 2% / min. For each mutein, the restored protein is reduced and denatured but not restored. The protein was eluted with a sharp peak about 2 minutes earlier than the protein. D. Purification of restored muteins   3 kDa cutoff (WR Grace and Co., Beverly Amicon S1 (with Amicon division of Massachusetts) The reconstitution solution was concentrated about 10 times using the 0Y3 membrane, and 20 mM sodium phosphate was added. It was dialyzed into Lithium (pH 6.0). Dialyzed solution at 17,700 xg for 30 minutes The supernatant was filtered and the supernatant was filtered through a 0.2 micron filter. Filtered protein The quality was already equilibrated with 20 mM sodium phosphate (pH 6.0) at 20 ml / min. Q-Sepharose anion exchange column (5 x 30 cm, Pharma) Cia Biotech, Piscataway, NJ). Combined tongue Protein is 20 mM sodium phosphate, 0.5M Na Flow rate of 20 ml / min using a linear gradient to Cl (pH 6.0) (5 column volumes) Eluted with. A 25 ml fraction was collected. Each mutein is about 0.2-0.25M Elute with NaCl. C4 reverse phase column using the same conditions as above for recovery monitoring (RP-4 1X250mm, Synchrom, Lafayette, IN) Fractions were analyzed above or by SDS-PAGE.   Pool the fractions containing reconstituted mutein (fractions elute with 0.2-0.25 M NaCl) And dialyzed into 20 mM Tris HCl, 1 M NaCl, pH 7.5. The dialyzed material was added at 25 ml / min to 20 mM Tris HCl, 1 M NaC. Butyl Sepharose (Supelco, Be) equilibrated with 1 (pH 7.5). llefonte, Pa) Hydrophobic interaction column (5 x 8 cm Pharmac) ia Biotech, Piscataway, NJ). 20 mM Tris, 0 NaCl, 25% ethanol (pH 7.5) linear gradient (10 (~ 15 column volumes) was used to elute the bound protein at a flow rate of 20 ml / min. Each mutein eluted at approximately 15-20% ethanol as an asymmetric peak. .   Using the same conditions as above for recovery monitoring, a C4 reverse phase column (RP-4 1x 250 mm, Synchrom, Lafayette, In) or SDS -10 of the protein-containing fractions (eluted with 15-20% ethanol) by PAGE A 0 μl aliquot was analyzed. Fractions containing purified mutein were pooled to approximately 0 ． Concentrated to 8 mg / ml, 20 mM Tris, 250 mM NaCl (pH 7. 4) was dialyzed into. The purified reconstituted mutein was treated biologically as described in Example 9. Assayed for activity.                               Example 8               PEGylation of IGFBP-1 mutein   C98 and C101 muteins with an average molecular weight of 20 kDa and thiol specificity Maleimide reactive group (CH3O- (CH2CH2O)n-NHCOCH2CH2-N) [Wherein n is the number of monomer units] bonded to monomethoxy-PEG PEGylated. The manufacture and use of other suitable PEG-maleimide reagents is described herein. PCT Application Publication No. WO92 / 16221, which is incorporated herein by reference. It is described in the detailed book.   During reconstitution, the substituted cysteine residues (each C 98 and CYS98 in C101 or CYS101) mixed with glutathione. Forming a disulfide to form Cys-S-S-GSH, or Cys-S-S-Cys can be formed by forming mixed disulfides with benzene. Follow Thus, there may be no free thiols available for reaction with the PEG reagent. Therefore, The mutein produced was partially reduced prior to reaction with the PEG reagent.   Partial reduction is a purified mutein with a molar ratio of DTT to protein of 5.625 to 1. And DTT in 20 mM Tris (pH 7.4), 250 mM NaCl, The reaction was performed for 2 hours at a temperature. The reduction was stopped by acidification to pH 5.5. DTT Was dialyzed into 10 mM sodium acetate (pH 5.5) and removed.   Partially reduced mutein was treated with PEG reagent and 4: 1 molar ratio of PEG and tan, respectively. Protein (final protein concentration 0.33 mg / ml), 15 mM sodium acetate Um, in 26 mM sodium phosphate (pH 7.0), 120 mM NaCl, The reaction was carried out at room temperature for 4 hours. SDS-PAGE analysis of the reaction mixture showed partial reduction Approximately 50% of the expressed protein is mono with an approximate apparent molecular weight of approximately 67 kDa. PE It was shown that it was converted to G-modified species (C98-PEG, C101-PEG). You see The high applied molecular weight is due in part to the interaction of PEG with the gel. Met.   The reaction mixture was adjusted to 20 mM sodium phosphate, pH 6.5. Q- A Q Sepharose anion exchange column (5 x 10 cm, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 20 mM sodium phosphate Equilibrated (pH 6.5) and loaded the reaction mixture at 20 ml / min. Combined tamper The linearity of the protein up to 20 mM sodium phosphate, 1M NaCl (pH 6.5) Elution was performed with a flow rate (10 column volumes) at a flow rate of 20 ml / min. C98 and C1 The 01 PEGylated mutein eluted at about 0.2 M NaCl. Fraction of 25 ml Aliquots were taken and analyzed by SDS-PAGE. Compatible with PEGylated muteins PEGylated C98 which also showed a single predominant band on non-reducing SDS PAGE Fractions containing C101 were pooled and subjected to biological activity as described in Example 9. I tested it.                               Example 9 IGFBP-1 and its mutein are IGF- of 3TS cells. 1 Inhibits activated proliferation   The crystal violet dye assay was used to measure cell proliferation. 96 well Assays were performed in gelatin-coated plates of. 200 μl serum-free D MEM (Dulbecco's modification of Eagle) 'S media, Mediatech, Herndon, VA) and 0-85. Balb / c3T3 line at 25,000 cells / well in 0 ng / ml IGF-1. I added fibroblasts. The cells were incubated at 37 ° C for 72 hours. at this point, 150 µl of 0.2% crystal violet, 10% formaldehyde And exchanged with 10 mM potassium phosphate (pH 7.0). 20 minutes ink at room temperature After incubation, the wells were washed 3 times with phosphate buffered saline (“PSB”) and washed with 200 μl / well of 50% ethanol / 0.1 M sodium citrate (pH 4.2) ) Was released to release the cell-bound dye. Next day at 570 nm The absorbance was read. The results shown in Table 13 indicate that recombinant IGF-1 was dose dependent. It has been shown to stimulate the proliferation of viable 3T3 fibroblasts. Maximum growth is about 2 Occurred at IGF-1 concentrations of 0-60 ng / ml. ED50 Was about 5-20 ng / ml.   Co-incubating cells with a set amount of IGF-1 and increasing amounts of binding protein , IGFBP-1, C98 for IGF-1 activated proliferation of 3T3 fibroblasts The effects of C101 and C101 muteins and pegylated muteins were measured. Balb / c 3T3 fibroblasts were treated with 21 ng / ml of IGF-1, varying amounts of IGFBP-1 and And serum-free D containing various muteins (0 ng / ml to 11, 520 ng / ml) 25,000 cells / well in 200 μl MEM. Cells at 72 o'clock And incubated as above and processed as described above.   The results show that non-PEGylated and PEGylated C98 and C101 muteins Show that both biological activities are comparable to that of wild type recombinant IGFBP-1 (Tables 14 to 18). Under the above conditions, the activity of 21 ng / ml IGF-1 was 50%. The concentration of IGFBP-1 required to inhibit (IC50) Is wild type IGFBP-1 , About 3 to about 3 for IGFBP-1 mutein and PEGylated IGFBP-1 It is 00 ng / ml.                             Example 10 Pharmacokinetics of IGFBP-1 and PEGylated IGFBP-1   4 Sprague Dawley rats for determination of pharmacokinetic parameters Was used. Concentrated mass of 1 mg / kg recombinant human IGFBP-1 in 2 rats Was injected intravenously into 2 rats at 1 mg / kg PEGylated IGFBP-1C101. A concentrated mass of mutein was injected intravenously. C101 Mutei Were prepared and PEGylated as described in Examples 7 and 8. Injection 0.016, 0.083, 0.033, 0.075, 1.5, 2, 3, 5, 6, Blood samples of tail vessels were taken after 8, 10, 12, 24 and 48 hours. blood Was collected in an EDTA-coated tube and centrifuged to collect a plasma fraction. Medi x Biochemica (Kauniainen, Finland) IGFb Using the p-1 test kit (catalog number 10831ETMB) by ELISA Then, the concentration of IGFBP-1 in the plasma sample was measured.   The plasma concentrations of 2 rats in each test group were averaged, and RstripII (Mic romath Software, Salt Lake City, Utah) Was used to fit a 2 or 3 exponential curve. Data from the fitted curve are shown in Table 20. . ELISA-detectable plasma IGFBP-1 is the wild-type IGFBP-1 and Disappeared 3 and 2 exponentially after injection of PEGylated C101 mutein .   Using a fitted curve,Pharmacokinetics, Gibaldi, M .; And Perrier, D .; Swarbrick, 1975. Like this Standard pharmacokinetic parameters were calculated. These parameters are shown in Table 21. . The result is that PEGylation reduces plasma clearance due to decreased plasma clearance. Is shown to improve the pharmacokinetic performance of IGFBP-1.                             Example 11     IGFBP-1 inhibits restenosis in rats   IGF for its ability to modify the proliferative response in the carotid artery after balloon angioplasty BP-1 was tested. 19 Sprague Dawles weighing about 375g y Rats underwent transplantation surgery of a jugular vein catheter into the right jugular vein. 1 week later, cutie The patency of the tell was tested and a continuous saline infusion was initiated via a tethered infusion device. Mooring injectors are described in Francis, P .; C. Et al., “Continuous In travenous Infusion in Fisher 344 rats   for Six Months: A Feasibility Study 、 ”Toxico logy Methods , Vol. 2, pp. 1-13 (1992). Which is specifically incorporated herein by reference. 3 days later, Ede lman, E .; R. And Karnovsky, M .; J. ,Circulatio n , Vol. 89, No. 2, pp. 770-776 (1994). As described in (1), the left external jugular vein is subjected to arteriotomy. All animals underwent balloon angioplasty surgery. 2F Fogarty balloon Theters (American Edwards Laboratories, S antana Ana, Calif. ) To the aortic arch, creating resistance and The balloon was inflated with air enough to pull back the endothelium and pulled back. Blood vessel wall Ensuring Sufficient Damage to Arteries Necessary to Induce a Proliferative Response in Rats The above procedure was repeated 6 times for this purpose. The external carotid artery was then ligated. Two animals The process was divided into loops, the treatment was started immediately after angiogenesis, and the treatment was continued for 14 days. First group Loop (N = 9) is a control animal injected with isotonic saline (0.25 ml / hour) intravenously. It consisted of Animals in the second group (nN = 10) were IGFBP-1. Continuous vein at 179 μg / kg / hour Injected and processed. To measure plasma levels of IGFBP-1, angiogenic Blood samples were taken from tail veins after 3, 9 and 14 days. Medix Bio Chemica (Kauniainen, Finland) IGFbp-1 study Plasma assay by ELISA using the kit (catalog number 10831ETMB) The concentration of IGFBP-1 in the material was measured. At the time of blood collection (about 15-30 minutes) The injection was stopped.   When the experiment was stopped on the 14th day, the brevital test described by Francis et al. The patency of the catheter was confirmed. Acepromazine, Rompun and digit Animals were anesthetized with a combination of mins and 10% neutral buffer buffer was performed by cardiac puncture. Perfusion with marine. Both carotid arteries were removed and processed for paraffin embedding. They were placed in formalin for an additional 2 days before pouring. Carotid artery over almost the entire length of the lesion Three sections were embedded from each animal to ensure evaluation of the entire area of tissue. Histology Additional tissues from all animals (lung, heart, kidney, liver, spleen and adrenal glands for clinical evaluation) ) Is collected to measure the systemic effect (if any) of continuous infusion of IGFBP-1 did. Carotid artery sections with hematoxylin and eosin, M Stained with trichrome and toluidine blue from asson. Other organizations are hemat Staining with xylin and eosin only.   The mean plasma level of IGFBP-1 at the end of the experiment was 3.69 ± 0.64 μg. / Ml.   The effect of treating animals with IGFBP-1 was evaluated by the overall score (gross scoring). By, and neointimal membrane [μm and pixels], neointimal membrane + middle layer (Media) (pixels) and interlayer (pixels). New blood vessel The ratio of intima (pixel) to intermediate layer (pixel) was also calculated. These scores and The measurements are shown in Table 22. For each of these six types of response measurements, Wilcoxo n Rank-Sum (Mann-Whitney U) test performed, and Natr ella, M .; G. ,Experimental Statistics, Na regional Bureau of Standards Handbook 91, p-80 (1967). . Wilcoxon Rank-Sum (Mann-Whitney U) test The p-values from are shown below. The data show that IGFBP-1 induces restenosis in rats. It shows a significant reduction.   In the lesioned carotid artery, 0 has no visible thickening and 4 has significant thickening By assigning a score of 0, 1, 2, 3 or 4 representing Was evaluated comprehensively. Mean scores (± standard error) from treated and control animals are The values were 1.5 ± 0.27 and 2.67 ± 0.24, respectively. These values are extremely It was found to be satisfactory (p <0.05). In this comprehensive evaluation , Inhibition of thickening in IGFBP-1 treated animals was 44%.   The neointima was also measured. The distance from the inside of the neointima to the lumen of the neointima , At four points facing each other and perpendicular to each other, and the average value of three sections was measured. Mean ± SE (μm) of neointimal for treated and control animals are respectively 78.50 ± 10.68 and 139.33 ± 8.91 (p <0.01) . This measurement also showed 44% inhibition of thickening in IGFBP-1 treated animals. It was   Image 1 System (S & M Microscopy, Color image analysis using (available from ado Springs, CO) Treated animals and Region of control animal neointima + intermediate layer, neointimal only and intermediate layer only (3 sections) / Animal). Treated and control animals, neointima + intermediate layer region (Pixel) (mean ± SE) is 25, 160.30 ± 1, 817.4, respectively 2 and 35,271.11 ± 1,403.16 (p <0.01). this Using analysis, treatment with IGFBP-1 resulted in a neointimal thickness of 2 9% reduction. The average area (pixels) of the neointimal only is 14,015.40 ± 1,834.24, 23,11 for control animals 9.11 ± 1,200.39, ie 3 thickenings in IGFBP-1 treated animals 9% inhibition (p <0.01).   Finally, the ratio of neointimal to intermediate layer was calculated. This parameter is also IGF The beneficial effect of treatment with BP-1 was shown. The ratio in treated animals is 1.25 ± 0.17 and 1.91 ± 0.13 in control animals. This ratio When used, inhibition of restenosis was 35% (p <0.05). With the neointima The ratio of the middle layer is generally the most important for assessing treatment-related effects in this rat model. Accepted method [Edelman and Karnovsk y,Circulation, Vol. 89, No. 2 (1994)].   Although the invention has been described with respect to particular embodiments, it is not limited thereto. However, modifications made by those skilled in the art are also included in the scope of the present invention. And

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI C12N 15/09 9162-4B C12N 15/00 A (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:19) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, LU, LV, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE SK, UA, US, UZ, V N

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．治療上有効量のＩＧＦＢＰ−１又はその改変体を投与することを含むＩＧＦ 関連症状を有する患者の治療法。 ２．前記患者にＩＧＦＢＰ−１を投与することを含む請求項１に記載の方法。 ３．患者の血流１ｍｌ当たり約０．１〜約３００μｇの範囲のＩＧＦＢＰ−１濃 度を得るのに十分な量のＩＧＦＢＰ−１を患者に投与する請求項２に記載の方法 。 ４．前記患者にＩＧＦＢＰ−１の改変体を投与することを含む請求項１に記載の 方法。 ５．ＩＧＦＢＰ−１の改変体がポリマーに結合したＩＧＦＢＰ−１である請求項 ４に記載の方法。 ６．前記ポリマーがポリエチレングリコールである請求項５に記載の方法。 ７．ＩＧＦＢＰ−１の改変体が、２つのＩＧＦＢＰ−１分子を含み、前記第１の ＩＧＦＢＰ−１がポリマーの一方の末端に結合しており、前記第２のＩＧＦＢＰ −１が該ポリマーの対向末端に結合している請求項４に記載の方法。 ８．ＩＧＦ関連症状が、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、卵巣ガン、骨肉腫、神経膠 腫、肝ガン、横紋筋肉腫、再発狭窄 症、先端巨大症、肥満症、糖尿病性腎臓病及び糖尿病性網膜症からなる群から選 択される請求項１に記載の方法。 ９．ＩＧＦ関連症状が乳ガンである請求項８に記載の方法。 １０．ＩＧＦ関連症状が結腸ガンである請求項８に記載の方法。 １１．ＩＧＦ関連症状が骨肉腫である請求項８に記載の方法。 １２．ＩＧＦ関連症状が先端巨大症である請求項８に記載の方法。 １３．ＩＧＦ関連症状が再発狭窄症である請求項８に記載の方法。 １４．許容可能な医薬キャリヤ中のＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−１の改変体 を含む医薬組成物。 １５．許容可能な医薬キャリヤ中のＩＧＦＢＰ−１を含む請求項１４に記載の医 薬組成物。 １６．許容可能な医薬キャリヤ中のＩＧＦＢＰ−１の改変体を含む請求項１４に 記載の医薬組成物。 １７．ＩＧＦＢＰ−１の改変体が不活性ポリマー鎖に結合したＩＧＦＢＰ−１で ある請求項１６に記載の医薬組成物。 １８．不活性ポリマー鎖がポリエチレングリコールである 請求項１７に記載の医薬組成物。 １９．ＩＧＦＢＰ−１の改変体が不活性ポリマー鎖の対向末端に結合したＩＧＦ ＢＰ−１である請求項１６に記載の医薬組成物。 ２０．再発狭窄症の治療を必要とする患者に、治療上有効量のＩＧＦ結合性タン パク質を投与することを含む再発狭窄症を治療又は予防する方法。 ２１．前記タンパク質がＩＧＦＢＰ−１である請求項２０に記載の方法。 ２２．前記タンパク質がＩＧＦＢＰ−１の改変体である請求項２１に記載の方法 。 ２３．前記タンパク質がポリマーに結合したＩＧＦＢＰ−１である請求項２２に 記載の方法。 ２４．ポリマーがポリエチレングリコールである請求項２３に記載の方法。 ２５．ＩＧＦＢＰ−１の改変体が、２つのＩＧＦＢＰ−１分子を含み、前記第１ のＩＧＦＢＰ−１がポリマーの一方の末端に結合しており、前記第２のＩＧＦＢ Ｐ−１がポリマーの対向末端に結合している請求項２３に記載の方法。 ２６．ＩＧＦＢＰ−１がリン酸化されていない請求項１に 記載の方法。 ２７．ＩＧＦＢＰ−１がリン酸化されていない請求項２１に記載の方法。 ２８．ＩＧＦＢＰ−１がＥ．ｃｏｌｉにおいて組換えにより産生される請求項２ ６に記載の方法。 ２９．ＩＧＦＢＰ−１がＥ．ｃｏｌｉにおいて組換えにより産生される請求項２ ７に記載の方法。 ３０．リン酸化されておらず且つＩＧＦの作用を阻害し得るインシュリン様成長 因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）。 ３１．ＩＧＦＢＰがＥ．ｃｏｌｉにおいて組換えにより産生される請求項３０に 記載のＩＧＦＢＰ。 ３２．前記ＩＧＦＢＰがＩＧＦＢＰ−１又はその改変体である請求項３０に記載 のＩＧＦＢＰ。[Claims] 1. IGF comprising administering a therapeutically effective amount of IGFBP-1 or a variant thereof Treatment of patients with related symptoms. 2. The method of claim 1, comprising administering IGFBP-1 to the patient. 3. Concentration of IGFBP-1 in the range of about 0.1 to about 300 μg per 1 ml of patient's blood flow The method of claim 2, wherein the patient is administered with IGFBP-1 in an amount sufficient to achieve . 4. 2. The method of claim 1, comprising administering a variant of IGFBP-1 to the patient. Method. 5. The modified form of IGFBP-1 is polymer-bound IGFBP-1. The method according to 4. 6. The method of claim 5, wherein the polymer is polyethylene glycol. 7. A variant of IGFBP-1 comprises two IGFBP-1 molecules, said first IGFBP-1 is attached to one end of the polymer, and the second IGFBP-1 The method of claim 4, wherein -1 is attached to opposite ends of the polymer. 8. IGF-related symptoms include breast cancer, colon cancer, lung cancer, ovarian cancer, osteosarcoma, and glia. Tumor, liver cancer, rhabdomyosarcoma, restenosis Disease, acromegaly, obesity, diabetic kidney disease and diabetic retinopathy. The method of claim 1, wherein the method is selected. 9. The method of claim 8, wherein the IGF-related condition is breast cancer. 10. 9. The method of claim 8, wherein the IGF-related condition is colon cancer. 11. The method according to claim 8, wherein the IGF-related condition is osteosarcoma. 12. The method according to claim 8, wherein the IGF-related condition is acromegaly. 13. 9. The method according to claim 8, wherein the IGF-related condition is restenosis. 14. IGFBP-1 or variants of IGFBP-1 in an acceptable pharmaceutical carrier A pharmaceutical composition comprising: 15. 15. The physician of claim 14 comprising IGFBP-1 in an acceptable pharmaceutical carrier. Medicinal composition. 16. 15. The method of claim 14 comprising a variant of IGFBP-1 in an acceptable pharmaceutical carrier. The described pharmaceutical composition. 17． A modified version of IGFBP-1 bound to an inactive polymer chain 17. The pharmaceutical composition of claim 16, which is certain. 18. Inert polymer chain is polyethylene glycol The pharmaceutical composition according to claim 17. 19. IGF in which a modified version of IGFBP-1 is bound to opposite ends of an inactive polymer chain The pharmaceutical composition according to claim 16, which is BP-1. 20. For patients in need of treatment for restenosis, a therapeutically effective amount of IGF-binding T A method for treating or preventing restenosis, which comprises administering a protein. 21. 21. The method of claim 20, wherein the protein is IGFBP-1. 22. 22. The method of claim 21, wherein the protein is a variant of IGFBP-1. . 23. 23. The protein according to claim 22, which is IGFBP-1 bound to a polymer. The method described. 24. 24. The method of claim 23, wherein the polymer is polyethylene glycol. 25. A variant of IGFBP-1 comprises two IGFBP-1 molecules, said first IGFBP-1 of the above is attached to one end of the polymer, and the second IGFB of 24. The method of claim 23, wherein P-1 is attached to opposite ends of the polymer. 26. The method according to claim 1, wherein IGFBP-1 is not phosphorylated. The method described. 27. 22. The method of claim 21, wherein IGFBP-1 is not phosphorylated. 28. IGFBP-1 is an E. 3. Recombinantly produced in E. coli. The method according to 6. 29. IGFBP-1 is an E. 3. Recombinantly produced in E. coli. 7. The method according to 7. 30. Insulin-like growth that is not phosphorylated and can inhibit the action of IGF Factor binding protein (IGFBP). 31. IGFBP is E. 31. Recombinantly produced in E. coli. The described IGFBP. 32. 31. The IGFBP is IGFBP-1 or a modified form thereof, according to claim 30. IGFBP.
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