JPH08507549A

JPH08507549A - Water-soluble non-immunogenic polyamide crosslinker

Info

Publication number: JPH08507549A
Application number: JP7518149A
Authority: JP
Inventors: ヘイ，トム，ザット; ネルソン，ディアンナ，ジェイ; ペレイラ，デイビッド，ユージーン
Original assignee: バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド
Priority date: 1993-12-27
Filing date: 1994-12-20
Publication date: 1996-08-13
Also published as: WO1995017886A1; EP0702553A4; AU1444095A; CA2156924A1; EP0702553A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、水溶性の非免疫原性のポリアミド架橋剤及び、タンパク質、ポリヌクレオチドその他の生物学的基質を架橋し、ポリマー化し、修飾し、及び接合して実質的に非免疫原性の水溶性製造物を形成するための、それらの使用に関する。本発明はまた、実質的に非免疫原性の製造物を形成するために水溶性ポリアミドで架橋され、接合され、ポリマー化され又は修飾された、タンパク質、ポリヌクレオチドその他の生物学的基質にも関する。 (57) [Summary] The present invention provides a water-soluble, non-immunogenic polyamide cross-linking agent and a substantially non-immunogenic, water-soluble agent for cross-linking, polymerizing, modifying and conjugating proteins, polynucleotides and other biological substrates. Their use for forming sexual products. The invention also relates to proteins, polynucleotides and other biological substrates that have been crosslinked, conjugated, polymerized or modified with water soluble polyamides to form a substantially non-immunogenic product. Concerned.

Description

【発明の詳細な説明】水溶性の非免疫原性ポリアミド架橋剤発明の分野本発明は、水溶性の、実質的に非免疫原性のポリアミド架橋剤に関する。本発明はまた、実質的に非免疫原性の水溶性製品を形成するための、タンパク質、ポリヌクレオチドその他の生物学的基質への、水溶性ポリアミドの共有結合に関する。本発明は、実質的に非免疫原性の製品を得るために水溶性ポリアミドで架橋され、接合され、ポリマー化され又は修飾された、タンパク質、ポリヌクレオチドその他の生物学的基質にも関する。発明の背景架橋剤は、種々の巨大分子物質の空間的配列及び機能の研究、リガンドに対する結合部位（レセプター）の同定、親和性マトリックスの製造、及び多様な巨大分子構造物の変性及び安定化を含む種々の目的に使用されている（Enzymology， Vol．91，p．580-609（1983）。静電的電荷を保存するため、静電的電荷を変化させるため、免疫原性を変化させるため、タンパク質分解に対する感受性を増大又は減少させるため、蛍光標識、スピン標識、放射性標識、及び電子密度の高い基質を誘導するために、数種の異なったタイプの炭水化物部分を取り付けるために、酵素特異性を変化させるために、そして分子内及び／又は分子間架橋を導入するために、架橋剤が、既に関連した分子種を連結させるためにも及び双方の性質を単一の分子内へ組み込むためにも設計されてきた（G.E．Means and R.E．Fe en ey，Bioconjugate Chemistry，Vo．1，p.2-12（1990））。これらの及び他の種々の目的のために多数の架橋剤が開発されてきた。これらの試薬の多くは、商業的に入手できる。タンパク質の安定性又はタンパク質中の特定の立体配置関係の安定性を高めるために、２種又はより多くの異なったタンパク質を連結させるために、特定のタンパク質−タンパク質相互作用の性質及び程度を同定し又は特徴付けるために、又はタンパク質サブユニット内の若しくはサブユニット間の反応性の基の間の距離を測定するために、タンパク質の架橋及び不溶性支持体への取り付けその他の種々の方法によるそれらの固定化が、用いられてきた。タンパク質は、それらの使用や他の製品からのそれらの分離を容易にするために、固定化することができる。治療的タンパク質又はポリペプチドを架橋することは、免疫原性を減少させ且つ該架橋された製品の血中における寿命を延長させることが示されている。一般に、架橋剤は、活性化させた末端の間の有機の架橋よりなる。該末端は、生物学的巨大分子に結合して架橋を形成する。ペプチド、炭水化物（例えば、デキストラン、澱粉、及びヒドロキシエチル澱粉）、脂肪酸、ポリグリコリド、ポリペプチド（例えば、ゼラチン又はコラーゲン）、ポリアルキレン単位、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコール（ポリオキシエチレンとしても知られている）のようなポリマーを含む、種々の有機架橋が当該分野において知られている。商業的に入手できるホモ２官能性のヘテロ２官能性の架橋剤は、そのサイズが約６乃至16Åにわたっている。それらの水溶性は鎖の長さと共に減少する。しかし、立体障害が減少することから、架橋の効率は鎖の長さと共に増大する。３乃至９個のアミノ酸残基を含むペプチドが、架橋剤として一般に使用されている。しかしながら、これらには次の欠点かある。すなわち、ペプチド合成に用いられる化学が、官能基の選択的なブロッキング及び脱ブロッキング及び特定の連結条件を伴う複雑なものであることである。アミノ酸成分をラセミ化させないように注意をしなければならない。ペプチドは、生物学的活性を有しないように注意深く選択しなければならない。最後に、それらは、酵素的加水分解を受けなければならず、そのことは、特にin vivoでの循環中において、それらの利用性である期間を限定する。架橋剤としての使用のために、合成ポリマーが開発されつつある。合成ポリマー架橋剤は、望ましくは次の特徴を有する。すなわち、（１）該ポリマーは、水溶性であり且つ狭い、定義された分子量分布を示すものでなければならない。（２）それは、取り付け／遊離部位を提供するか又はそのような部位の導入の可能性を提供するものでなければならない。（３）該ポリマーは、生物学的環境と適合性で、すなわち、無毒で、非抗原性で、そして他の如何なる面においても刺激性のないものであるべきである。（４）それは生分解性であるか又は機能を果たした後は生体より排除されるものであるべきである（Duncan and Kopecek，Adva nces in Polymer Science，Vol．97，p．53-101（1984）。生物学的に活性なポリペプチドとＰＥＧのような水溶性ポリマーとの接合は、周知である。ＰＥＧ及び類似の水溶性ポリマーへの生物学的に活性の及び薬剤的に活性のペプチド及びポリペプチドの連結は、Davis等の米国特許第4,179,377号に開示されている。ＰＥＧで変性されたポリペプチドは、免疫原性及び抗原性の劇的な減少を示すものとして開示されている。ＰＥＧ接合体はまた、広範囲の可溶性及び毒性の低さをも示し、そして対応する天然の化合物に比して相当長くに血中に止まることが示されており、しかも容易に排泄される。ＰＥＧ接合体はまた、血中における酵素活性と、又は接合させたポリペプチドのコンフォメーションと、干渉しないことも示されている。従って、タンパク質の生理学的活性を実質的部分を保持しつつ免疫原性及び抗原性の減少並びにより長いクリアランス時間を示す、治療的タンパク質の多くのＰＥＧ接合体が開発されてきた。治療的薬物とＰＥＧとの接合体にも注意が集められてきた。Granov等、（“Ma cromolcules，”17，p．945-952（1984））は、種々の薬物へのＰＥＧの取り付けが、薬理学的活性の延長をもたらすことを観察した。 Zalipskyの米国特許第5,122,614号は、架橋剤としてのポリエチレングリコールの使用を記述している。Bieniarzの米国特許第5,053,520号は、水溶性でない、ポリアミドに基づく連結試薬を記述している。Hornの米国特許第4,182,695号は、ポリアミドへ結合させたタンパク質を記述している。ロシア特許出願No．SU 1659433は、鎖中に化学発光性の基を備えた水溶性ポリアミドを開示している。 Dellacherieの米国特許第5,110,909号は、ヘモグロビンの水溶性巨大分子接合体を開示している。CargillのＰＣＴ特許出願WO 92/08790は、タンパク質に結合させた連結基に結合させたポリアミドポリマーの使用を開示している。多くの潜在的に治療的なタンパク質が、in vivoにおける短い半減期、乏しい可溶性、in vivoにおける酵素的分解の受けやすさ、又は免疫原性等のような望ましくない性質を有する。本発明のポリアミドは、そのようなタンパク質に連結させたとき、これらの欠点を克服する。発明の要約本発明は、１モルあたり約300乃至約20000ｇの平均分子量を有する、水溶性の、実質的に非免疫原性のポリアミドであり、該アミド反復単位は、（ii）少なくとも１つの第１級アミノ基及び該ポリアミド中のアミド官能基を分離している15 個又はそれより少ない原子を有する水溶性の有機アミンサブユニットに、アミドとして共有結合により連結させた、（ｉ）少なくとも１つのカルボキシラート基及び該ポリアミドのアミド官能基を分離している15個またはそれより少ない原子を有する水溶性の有機酸サブユニットよりなる。換言すると、本発明のポリアミドは、次式Ｉ、II、及びIIIより選ばれる、水溶性の、実質的に非免疫原性のポリアミドである。ＩＹ−Ａ−Ｘ−Ｙ II Ｚ−Ｂ−Ｘ−Ｚ III Ｙ−Ｘ−Ｚ〔（ｉ）ここに末端Ｙは、ＯＨ又はカルボキシル性の連結基であり、（ii）ここに末端Ｚは、水素であるか又はアミノ基に取り付けられた連結基であり、そして（iii）ここにＸは、（Ｂ−Ａ）ｎ、（Ａ−Ｂ）ｎ、（Ｂ−Ａ’）ｎ又は（Ａ’−Ｂ）ｎ、並びに中央のポリ酸、ポリアミン又はポリアミノ酸に（Ｂ−Ａ）ｎ、（Ａ−Ｂ）ｎ、（Ｂ−Ａ’）ｎ又は（Ａ’−Ｂ）ｎを繋くことによって形成した分枝のあるポリアミド、よりなる群より選ばれるポリアミドであり、そして（iv）ここにＡはα，ω−ジ酸であり、Ｂはα，ω−ジアミンであり、Ａ’は、式〔ここにＹ₁は、式、 −ＯＣ−（ＣＨ₂）ｐ−ＮＨ− を有し、ここにｐは、１乃至約４であり、ｍは、約２乃至約４であり、Ｘ₁及びＸ₂は、独立して、カルボキシル又はカルボニルのＯ以外のＯ、Ｓ、Ｐ又は第３級のＮよりなる群より選ばれるヘテロ原子であり、そしてＲ₃は、約１乃至約２個の炭素原子を有する低級アルキルであり、ｎは、該ポリアミド中のアミド反復単位の数である。〕を有するα，ω−アミノ酸であり、そして（ｖ）ここに該アミド反復単位の酸サブユニットは、（ａ）鎖中に15個又はより少ない原子を有し且つ、該鎖上の置換基として又は該鎖中の原子として存在する、カルボキシル又はカルボニル以外のＯ、Ｓ、Ｐ又は第３級のＮよりなる群より選はれる１つ又はより多くのヘテロ原子を有する有機酸であるか、又は（ｂ）水溶性の有機ジアミンによって架橋された２つ又はより多くのそのような有機酸であり、そして（vi）ここに該アミド反復単位中のアミンサブユニットは、少なくとも１つの第１級アミノ基を有し且つ鎖中に15個又はより少ない原子を有し且つ該鎖上の置換基として又は該鎖中の原子として存在する、カルボキシル又はカルボニル以外のＯ、Ｓ、Ｐ又は第３級のＮよりなる群より選ばれる１つ又はより多くのヘテロ原子を有する、有機の、水溶性のアミンであり、そして（vii）ここにｎは、２乃至約100である。〕本発明は、タンパク質、抗体、ハプテン、ポリペプチド、ポリヌクレオチドその他の生物学的基質を架橋し、接合させ、修飾し又はポリマー化させるために使用される、１つ又はより多くのそのようなポリアミドを含む。その架橋された、接合させた、ポリマー化した又は修飾した生成物は、水溶性であり、実質的に非免疫原性であり、且つ該基質の生理学的活性の全て又は有用な部分を保持している。図面の簡単な記述図１は、エチレングリコールビス（メトキシカルボニルメチルエーテル）及び１，４−ジアミノブタンのポリ縮合を示す。図２は、図１に示された反応の、反応条件、生成物特性、及び反応収率を示す。図３は、ＰＡＳ−2400でポリマー化及び修飾したジアスピリン架橋ヘモグロビンの酸素結合機能を含む、実験データを示す。図４は、ＰＡＳ−2400でポリマー化及び修飾したジアスピリン架橋ヘモグロビンのサイズ排除クロマトグラフィープロフィールを示す。図５は、ＰＡＳ−2400でポリマー化及び修飾したジアスピリン架橋ヘモグロビンの逆相ＨＰＬＣプロフィールを示す。図６は、ポリアミド合成の成分を描く。図７は、ＢＭＤＡＢ（ポリアミド成分の一つ）の合成を描く。図８は、ポリアミドを形成するための、ＢＭＤＡＢとジアミンとのポリ縮合を描く。図９は、ポリアミド活性化エステルＰＡＳ−3037及びＰＡＳ−4200の合成を描く。図１０は、ＰＡＭ−4080と名付けた、マレイミドでキャップしたポリアミドの合成を描く。図１１は、ＰＡＳ−3037によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化の後の、サイズ排除のプロフィールを描く。図１２は、ＰＡＳ−14200によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化の後の、サイズ排除のクロマトグラフィープロフィールを描く。図１３は、ＰＡＳ−4200によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化の後の、逆相ＨＰＬＣプロフィールを描く。図１４は、ＰＡＭ−4080によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化の後の、サイズ排除クロマトグラフィープロフィールを描く。図１５は、ＰＡＭ−4080によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化の後の、逆相ＨＰＬＣを描く。図１６は、ＰＡＳ−3070によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化の後の、実験データを示す。図１７は、ＰＡＳ−4080によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化の後の、実験データを示す。図１８は、ＰＡＭ−4080によるジアスピリン架橋ヘモグロビンのポリマー化の後の、実験データを示す。発明の詳細な記述本発明のポリアミドは、１モルあたり約300乃至約20000ｇの数平均分子量を有する、実質的に非免疫原性の、水溶性ポリアミドである。これらのポリアミドのアミド反復単位は、少なくとも１つのアミノ基及び該ポリマー中のアミド官能基を分離している15個またはそれより少ない原子を有する水溶性の有機アミンサブユニットに共有結合によりアミドとして連結させた、少なくとも１つのカルボキシラート基及び該ポリマーのアミド官能基を分離している15個またはそれより少ない原子を有する水溶性の有機酸サブユニットより構成される。水溶性で、実質的に非免疫原性であり且つ当該基質の生理学的活性の全て又はその有用な部分を保持する生成物を与えるために、これらのポリアミドは、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ハプテン、炭水化物又はポリヌクレオチド等のような生物学的基質を、架橋し、接合させ、ポリマー化させ及び／又は修飾する目的で、直接に又は活性化後に使用できる。それらはまた、基質を検出試薬又は固体マトリックスに取り付けるためにも使用できる。術語「実質的に非免疫原性」は、該ポリアミドがin vivoでもin vitroでも液性又は細胞性免疫応答を誘発しないことを示す。術語「水溶性」は、該ポリアミドが100ｍｌあたり500ｍｇを超える水溶性を有することを示す。該術語はまた、該ポリアミドが界面活性剤として働かないこと及び水中においてミセルのような凝集物を形成しないことをも示す。術語「活性化」は、ポリアミド末端に位置する基をより反応性の連結基へと変換することを意味する。該ポリアミドは、鎖状であっても分枝していてもよい。術語「基質」は、本発明のポリアミドを結合させる分子を意味する。基質には、酵素、増殖因子、抗体又は血液タンパク質のようなタンパク質、ｃＤＮＡのようなフラグメント、ステロイド及びホルモン、免疫接合体、炭水化物、及びこれらの基質の如何なる接合体も含まれるが、それらに限定されない。該基質はまた、固体支持体又はビーズであってもよい。基質には、治療上有用な生物学的活性を有する分子が含まれる。ここに用いられるものとして、「基質」は、複数のポリアミドが、各ポリアミドの１つの末端によって該基質に結合し且つ該ポリアミドの他の末端のいずれも異なった基質分子に結合していないときに、「修飾された」といわれる。本発明の水溶性ポリアミドは、当該分野で既知の方法によって製造できる。ポリアミドの製造のための既知の諸方法を、本発明のポリアミドの製造のための有用な方法として参照することによりここに導入する。N．Ogata et al.，Polymer Journal，Vol．5，p．186ff（1973）、及びN．Ogata and Y．Hosoda，Journal Polymer Science，Polymer Letter．Ed.，Vol．12，p．355ff（1974）は、エーテル又はヒドロキシル基によって活性化されたジエステルの、ジアミンとのポリ縮合を記述している。N．Ogata et al.，Journal Polymer Science，Polymer Ch emistry Ed.，Vol．14，p．783ff（1976）、N．Ogata et al.，Polymer Jouranl ，Vol．11，p．827-833（1979）、及びH．Sato et al.，Makromol Chemistry，V ol．182，p．755-762（1982）は、エーテル、チオエーテル又はヒドロキシル基を含んだ活性化されたジエステルの、ジアミンとのポリ縮合を記述している。D ．Kieley and T-H．Linもまた、ポリヒドロキシポリアミド及びその製造方法（米国特許第4,833,230号）を記述している。N．Ogata and Y ．Hosoda，Journal Polymer Science，Po1ymer Chemistry Ed.，Vol．18，p．11 59-1162（1978）は、エチレングリコールジメトキシカルボキシメチルエーテルとヘキサメチレンジアミンの溶液中でのポリ縮合による、水溶性ポリアミドの合成を記述している。該アミド反復単位の該酸サブユニットは、該鎖中に15個又はそれより少ない原子を有し且つ該鎖上の置換基として又は該鎖中の原子として、ヘテロ原子（Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｎ）を有する、有機酸よりなる群より選ばれる。代わりとして、該アミド反復単位の該酸サブユニットは、架橋している水溶性の、有機ジアミンに結合させた２つ又はそれより多くのそのような有機酸よりなるものであることができる。該アミド反復単位のアミンサブユニットは、該鎖中に15個又はそれより少ない原子を有し且つ該鎖上の置換基として又は該鎖中の原子として、ヘテロ原子（Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｎ）を有する、有機アミンよりなる群より選ばれる。類似の及び／又は類似しないポリアミド構造を、中央のポリ酸、ポリアミン又はポリアミノ酸によって連結して、分枝のある水溶性ポリアミドを形成することもできる。本発明の一具体例においては、Ｘは、（Ｂ−Ａ）ｎ、（Ａ−Ｂ）ｎ、並びに、中央のポリ酸、ポリアミン又はポリ（アミノ酸）に（Ｂ−Ａ）ｎ又は（Ａ−Ｂ）ｎを連結させることによって形成した分枝のあるポリアミド、よりなる群より選ばれる。この具体例においては、該ポリアミド反復単位の酸サブユニットは、各有機酸が、鎖中に15個又はそれより少ない原子を有し且つ式−ＮＨ−Ｒ₁−ＮＨ −を有する（ここにＲ₁は、約４個乃至約５個の炭素原子を有する置換された又は無置換の脂肪族鎖である）水溶性ジアミンによって架橋された該鎖上の置換基として又は該鎖中の原子として存在するカルボキシル又はカルボニルのＯ以外のＯ、Ｓ、Ｐ又は第３級のＮよりなる群より選はれる１個又はそれより多くのヘテロ原子を有するものである、２個又はそれより多くの有機酸である。本発明の好ましい一具体例においては、該式−ＮＨ−Ｒ₁−ＮＨ−を有するジアミンは、１，４−ジアミノブタンである。Ｘが（Ｂ−Ａ）ｎ又は（Ａ−Ｂ）ｎより選はれる分枝のある又は分枝のないポリアミドである本発明の別の一具体例においては、該アミド反復単位の酸サブユニットは、〔ここにｍは、約２乃至約４であり、Ｘ₁及びＸ₂は、独立して、カルボキシル又はカルボニルのＯ以外のＯ、Ｓ、Ｐ又は第３級のＮよりなる群より選ばれるヘテロ原子であり、そしてＲ₂は、水素又はアセタミドである。〕を有する有機酸である。これらのポリアミドにおいては、該イオウ基は、各末端カルボキシル基に対しγ位に位置する。本発明の好ましい一具体例においては、Ｘ₁及びＸ₂は、共にＯである。本発明のより好ましい一具体例においては、Ｘ₁及びＸ₂は、共にＯであり、ｍは２である。本発明のこの面による化合物は、治療的な生物学的作用のある基質について用いるとき、幾つかの有利な特徴を有する。これらの化合物は、反応性が一層低く、活性化後、加水分解を最小限にするための一層大きな制御を許容する。これは、今度は、タンパク質基質との連結を最適化する。これらのポリアミドはまた、酸素ラジカル抑制剤としても有効である。酸Ｘが、式（Ｂ−Ａ’）ｎ又は（Ａ’−Ｂ）ｎを有する分枝のある又は分枝のないポリアミドである本発明の尚も別の一具体例においては、アミド反復単位の酸サブユニットは、式〔ここにＹ₁は、式、 −ＯＣ−（ＣＨ₂）ｐ−ＮＨ− を有し、ここにｐは、１乃至４であり、ｍは、約２乃至約４であり、Ｘ₁及びＸ₂は、独立して、カルボキシル又はカルボニルのＯ以外のＯ、Ｓ、Ｐ又は第３級のＮよりなる群より選ばれるヘテロ原子であり、そしてＲ₃は、約１乃至約２個の炭素原子を有する低級アルキルである。〕を有する有機酸である。本発明の好ましい一具体例においては、Ｘ₁及びＸ₂が共にＯである。本発明の一層好ましい一具体例においては、Ｘ₁及びＸ₂が共にＯであり、ｍが２であり、そしてＲ₃がメチルである。本発明によれば、Ａ’は、式Ｙ₁−Ａ−Ｙ₁を有するα，ω−ジ酸であり、ここにＹ₁は式−ＯＣ（ＣＨ₂）ｐ−ＮＨ−を有し、Ａは上記のα，ω−ジ酸である。基質を修飾し、連結し、ポリマー化し及び／又は接合させるために本発明のポリアミドを活性化するために、既知の如何なるカップリング化学をも用いることができる。そのようなカップリング化学の多くの例が、“Chemistr y of Protein Cnjugation and Cross-linking，”S．Wong，CRC Press，Inc．（ 1991）に与えられており、これを参照によりここに導入する。そのような化学は、該ポリアミドを、ジアルデヒド類、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、官能化されたアセタール、ビスマレイミド類、２官能性イミノエステル類、ジエポキシド類、及びジカルボン酸塩化物等のような２または多官能性タンパク質試薬と反応させることを伴う。カップリング化学の選択は、架橋、接合、ポリマー化及び／又は修飾される基質分子に依存するであろう。カップリング化学は、基質分子の生物学的又は化学的活性を変化させないように選択すべきである。一般に、基質分子を修飾するためには、約４乃至50モルのポリアミドを基質１モルあたりに使用する必要がある。基質分子がより大きいと、ポリアミドの一層大きな比率が必要であろう。修飾することなく基質を主として接合、架橋又はポリマー化させることは、当業者である化学者の、カップリング剤の化学、特定の基質上の反応性の基、基質のサイズ、ポリアミドのサイズ、基質濃度、及び一般的な反応パラメーターについての知識を必要とする。当業者に直ちに認識されるであろうように、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、薬剤、及び診断剤等のような基質は、ポリアミド基本骨格及びその官能性化誘導体の未反応の官能基と共有結合できる官能基を有する。この開示の利益を得た当業者は、ポリアミドと基質とを共有結合により連結するために用いることのできる合成アプローチを理解するであろう。反応の順序は重要でない。ポリアミドの未反応の官能基は、必要ならば適当に活性化でき、そして基質に取り付けられる。同様に、基質も、必要なら適当に活性化させてポリアミドに取り付けることができる。例えば、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、カルボキシル又はチオール置換基は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び診断剤化合物の構造の一部として一般に見出される。更には、ポリアミドは、これらの基質のような反応性の末端を導入するように、合成することができる。基質は、下記の化学又はその他の、Bodanszky and Bodanszky，“The Practice of Peptide Synthesis”，Springer-Verlag，New York（1984）、Lundblad，“Chem ical Reagents for Protein Modification，”CRC Press，Boca Raton，Florida （1991）、Mosbach，“Methods in Enzymology，Volume XLIV，Immobilized Enz ymes”，Academic Press，New York（1976）、又はUhlmann and Peyman，“Anti sense Oligonucleotides：A New Therapeutic Princip1e”，Chemical Review， Vol．90，No．4，p．543-585（June 1990）に開示されているような化学によって、ポリアミドに結合させることができる。例えば、ビオチンは、アビジンとの複合体形成により選択的に保持される診断プローブとして認識されている。ビオチンは、スクシンイミジルエステルとして活性化できアミノ末端を有するポリアミドに取り付けることができるカルボキシル基を含む。ビオチンへの共有結合による結合の前又は後のいずれかに、ポリアミドの他の末端をペプチド、タンパク質その他の生物化学的薬剤に共有結合によって結合させることができる。これらの条件下においては、該ポリアミドは、同時に生成物の水溶性を維持又は増大させるスペーサー基として働く。生物化学的薬剤は、それによりアビジンとの相互作用を容易にするために、ポリアミドスペーサーの一端に配置された診断プローブによって標識される。同様に、デフェロキサミンは、鉄中毒の解毒剤として治療に使用される薬剤である。腎臓を介して速やかに排泄されるため、デフェロキサミンの治療作用の持続時間は短い。もしもデフェロキサミンがデキストラン又はアルブミン等のようなより大きな分子量を有する物質に接合されたなら血管循環中に一層長い時間保持されるであろう、ということが認識されている。本発明によれば、ポリアミドが、同時に生成物の水溶性を維持又は増大するスペーサー基として使用できる。ポリアミドの一端がカルボニル官能基へと変換されて還元的アミノ化によってデフェロキサミンのアミノ置換基に取り付けられることができ、そしてポリアミドの他端は、活性化エステル（例えば、スクシンイミジルエステル）へと変換されてアルブミンに取り付けるることができる。この接合によって、該接合されたデフェロキサミンの血管循環の持続性は延長され、且つ該薬剤はそのキレート能力を維持している。本発明のポリアミドの全ての成分は、水溶性を保存するように選択される。それらは水溶性で、鎖全体にわたって親水性である。ポリアミドの長さは、基質とポリアミドとの間の相互作用を容易にするように選択される。２つの大きな基質分子の間の立体障害を最小限にすることから、大きな基質の架橋には一層長いポリアミドが必要であろう。免疫原性基質は、一般に高度に修飾される必要があり、比較的長鎖のポリアミドを有する必要がある。酵素等のような生物学的に活性な基質に本発明のポリアミドを反応させるにおいては、その基質の活性を破壊するのを回避するよう注意しなければならない。当業者は、修飾及び／又はポリマー化の程度を変化させることによって、有用な生物学的活性を有する生成物を調製することが許容される、ということを当業者は理解するであろう。本発明のポリアミドは、α−アミノ酸のポリマーではなく、そのため酵素加水分解を受けない。加えて、本発明のポリアミドは、メタノール、エタノール又はアセトニトリル等のような有機溶媒に基質を可溶性にするために使用することができる。本発明のポリアミドは、ポリマー化剤として使用することができる。以下に完全に記述されている一例においては、ポリアミドの末端は、タンパク質のチオール基との反応に適したマレイミド基として変性されている。タンパク質のシステイン−β93チオール基を介してヒトのヘモグロビンをポリマー化させるのに、ビス（マレイミド）ポリアミドが用いられた。同様に、以下の別の一具体例においては、ポリアミドの末端は、タンパク質のアミノ基との反応に適したビス（スクシンイミジル）エステル又はビスアルデヒドへと変換された。ビス（スクシンイミジル）ポリアミド及びビスアルデヒドポリアミド共に、タンパク質のリジン残基のα−アミノ基を介してヒトのヘモグロビンをポリマー化させるのに用いられた。別の一具体例においては、本発明のポリアミドは、検出すべき基質にプローブ（例えば、蛍光，放射性等）を連結させるために使用することができる。以下の実施例において、我々は我々のポリアミドにつき次の命名法を用いた。すなわち、基本骨格がポリアミドであることから、文字ＰＡが適用される。カップリング基を示す文字がこれに続く、すなわち、マレイミドについてはＭであり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドについてはＳである。ハイフンが、アルファベット式コードをおよその分子量から分離する。本発明の好ましい一具体例においては、該ポリアミドは、ビス（マレイミドアシル）ポリアミドである。本発明の一層好ましい一具体例においては、該ポリアミドは、ビス（マレイミドグリシル）ポリアミドである。こうして、ＰＡＭ−3800として同定されるポリアミドは、約3800ダルトンの分子量を有するポリアミドビス（マレイミド）である。ポリアミドの設計及び合成以下の実施例においては、ポリアミド縮合生成物は、３通りの方法で特徴づけられる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析は、Superose^TM 12カラム及び、50ｍＭリン酸塩（ｐＨ6.5）の、流速0.4ｍｌ／分で流される移動相を用い、220ｎｍで検出することにより行う。この分析は、ポリマー化生成物が形成されたことを確認し、そして生成物混合物中の成分の分子量及び分子量範囲の近似値を与える。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析は、生成物混合物中の末端官能基の分離と特徴付けを許容する。各成分の構造は、相対的移動（Ｒｆ）とニンヒドリンスプレー試薬に対する反応性に基づいて割り当てられる。ＴＬＣ条件下においては、ジエステル末端基を有するポリアミドが、最も大きいＲｆを有し、モノエステル／モノアミン末端基を有する成分が、そしてジアミン末端基を有する成分が順次これに続く。アミン末端基を有する成分のみが、ニンヒドリンに対して反応性である。モノ−及びジエステルの構造は、塩基触媒加水分解及びその生成物のＴＬＣによって確認される。これらの条件下においては、エステルは酸へと加水分解され、該材料のＲｆは低下する。最後に、分子量が、フルオレスカミンを用いたアミノ末端分析により評価される。精密且つ正確に秤量されたポリアミドサンプルを、メタノール／リン酸緩衝液に溶解させ、アセトンに溶解したフルオレスカミンを加えて誘導体とし、次いで蛍光検出器を備えたＨＰＬＣシステムに注入することによって分析する。等価量は、メタノール／リン酸緩衝液中のジアミノヘキサン／ＰＥＧ／酢酸エチルの標準溶液に対する応答との比較により決定される。等価量は、分子あたりのアミンの平均数に基づいて数平均分子量へと変換される。代わりとして、ポリアミドの数平均分子量を推定するために、次のようにＮＭＲスペクトルを用いることができる。すなわち、最初のステップは、ポリアミドの構造を末端基と反復単位とに分けることである。次いで、各部分の分子量が計算される。次に、各部分にある独特の成分を同定し、そして該成分についての対応するＮＭＲ共鳴を相関づける。ポリアミドは、特定の官能基と相関づけることのできる多数のよく分解された共鳴を有する。例えば、ＰＡＳ−4200中のスクシナート基上の２つの水素の２つの対は、約2.53及び2.92ｐｐｍに、それぞれ積分値2.197及び2.605単位を有する（トリプレット）共鳴を生じる。同様に、ブタンジアミン残基の内部メチレン基は、1.5ｐｐｍに16.034単位の積分面積を有する広い共鳴を生じる。ポリアミド誘導体の末端基には２つのスクシンイミド残基がある。従って、約 2.53ｐｐｍにおける共鳴及び2.92ｐｐｍにおけるそれは、各々４つの水素から生じたものである。平均の面積応答は、各スクシナート上の４個の水素あたり（2. 197＋2.605）／２すなわち2.401単位である。同様に、ブタンジアミン残基の内部メチレン基は、４個の水素を含む。後者の共鳴の積分面積（16.034単位）が各タイプのスクシナート水素についての４個の水素の共鳴よりも大きいという観察結果は、該ポリマーの反復単位中に多数のブタンジアミン残基があるということを示している。積分面積の比（16.034／2.14,01すなわち約７）をとることにより、その倍数の値を推定することができる。従って、該ポリマー中には７個の反復基が存在する。該ポリアミドの分子量は各末端基の分子量（それぞれ、416.44 及び198.14）と反復単位の分子量の７倍（７×504.57すなわち3532）の和である。該和は4146.57すなわち約4200ダルトンである。この値はまた、フルオレスカミンを用いた、ＰＡＳ−4200のポリアミドのビスアミン前駆体の末端基分析によっても独立に得られる。ＰＡＳ−2400の合成実施例１（ａ）エチレングリコールビス（メトキシカルボニルメチル）及び１，４−ジアミノブタンのポリ縮合エチレングリコールビス（メトキシカルボニルメチル）エーテル（ＥＤＥ）（これは、各エステル基に対してα位に置換基としてエーテル基を有する）を、１，４−ジアミノブタン（ＤＡＢ）と縮合させてポリアミドを製造した。図１を参照。２通りのポリ縮合方法を用いた。すなわち溶液法と溶融法である。一般に、ポリ縮合は、次の通りにして達成された。溶液法の場合、望みのモル比のＥＤＥ及びＤＡＢをメタノールに溶解させ、溶液を30℃に72時間、又は65℃ に24時間加熱した。溶媒を蒸発させ、残渣をアセトンで処理し、残存のメタノールを除去するために繰り返し蒸発させた。残渣のアセトンによる粉砕は、固体を与えた。溶融法の場合、ＥＤＥとＤＡＢの混合物を、メタノールを除去するためにマグネティックスターラーで攪拌しつつ真空下に120℃に加熱した。１乃至２時間の後、混合物をメタノールに溶解させた。溶液を蒸発乾固させ、そして残渣をアセトンで粉砕してポリアミド生成物を得た。ＳＥＣによる反応混合物の分析は、ポリマー化生成物が形成されたことを確認した。生成物のＴＬＣ分析（固定相：シリカゲル、溶出液：２−プロパノール／ＮＨ₄ＯＨ／Ｈ₂Ｏ、体積で７：１：２）は、それぞれＲｆ値0.1、0.4及び0.7を有する３つのスポットを示した。対応するポリアミドの構造は、ニンヒドリン及び塩基に対する反応性に基づいて、それぞれα，ω−ジアミノポリアミド（図においてＩとして示されている）、α−アミノ−ω−エステルポリアミド（IIとして示されている）、及びα，ω−ジエステルポリアミド（IIIとして示されている）に割り当てた（図１）。加えて、生成物IIIはニンヒドリン陰性である一方、生成物Ｉ及びIIはニンヒドリン陽性でありこれらの生成物は少なくとも１個の第１級アミノ基を有することを示した。最後に、生成物II及びIIIは、薄いＮａＯＨ水溶液で加水分解され、これに対してＩは加水分解されず、生成物II及びII Iが少なくとも１個のエステル基を有することを示した。これらの生成物の収率は、ＤＡＢとＥＤＥのモル比に依存する。モル比１は、Ｉを主生成物として与える。ＤＡＢ／ＥＤＥのモル比が１より大きいと、ポリアミドIIを主生成物として与える。対照的に、IIIは、ＤＡＢ／ＥＤＥのモル比が１より小さいときに主生成物となった。ＥＤＥとＤＡＢのポリ縮合の結果は、図２に纏められている。該実験データは、30℃における溶液法では、約2400ダルトンの数平均分子量（ＭＷ）を有するα−アミノ−ω−エステルポリアミドIIが最もよく製造されたことを示している。ＭＷを1300乃至1500ダルトンの範囲に有するα，ω−ジアミノポリアミドＩは、ＤＡＢ／ＥＤＥモル比1.3乃至1.5を用いて溶媒法又は溶融法のいずれによっても製造できた。α，ω−ジエステルポリアミドIIIは、当モルのＥＤＥ及びＤＡＢを用いた溶融法によって良好な収率で得られた。ＤＡＢは揮発性の化合物であるから、溶融法が用いられる場合ＤＡＢは反応混合物から徐々に除去され、ＥＤＥを大過剰に残す。従って、IIIが主生成物として得られる。実施例１（ｂ）活性化された架橋剤へのポリアミドIIIの変換ＥＤＥとＤＡＢの縮合によって得られた粗ジエステルIII（図１）を、希水酸化ナトリウムにより、対応するジ酸へと加水分解した。加水分解後、反応混合物をAG50W-X8樹脂（BioRad）で処理してナトリウムイオン及び副生成物であるＩ及びIIを除去した。該ジ酸は、ＴＬＣによる判断によれば、純粋な状態で得られた。該ジ酸を、クロロホルム中ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びＮ −ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で処理して、対応するポリアミドビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＰＡＳ−2400と命名）へと変換した。実施例２ＰＡＳ−2400によるヘモグロビンのポリマー化ＰＡＳ−2400によるジアスピリン架橋ヘモグロビン（ＤＣＬＨｂと命名）の典型的なポリマー化は、次の通りにして達成した。ＤＣＬＨｂは、米国特許第5,12 8,452号に記述されている方法に従って製造した。ｐＨ約７乃至８の0.1ＭのＨＥＰＥＳ中のＤＣＬＨｂの溶液を、室温における１時間半の連続的真空／窒素サイクルによって脱酸素した。ＰＡＳ−2400を、脱酸素した水に溶解させ、溶液をＤＣＬＨｂ溶液に直ちに加えた。反応混合物を室温にて窒素下に攪拌し、TSK-G400 0SWブランドのカラム及びTSK-G3000SWブランドのカラムを一列に繋ぎ、ｐＨ6.5 の２−プロパノール／50ｍＭリン酸緩衝液（１：９，ｖ／ｖ）よりなる移動相を１ｍｌ／分の流速で流し、280ｎｍにおける検出を用いた、サイズ排除クロマトグラフィーにより反応をモニターした。この後者の方法は、ポリマー化が30分未満で完了したこと及びポリマー化に修飾が伴っていることを明らかにした。溶液を５℃まで冷却し、ＩＭのＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）（ＮＡＣ／Ｈｂのモル比約５：１）溶液を加えた。窒素雰囲気下に溶液を５℃にて終夜攪拌し、次いで乳酸リンゲル溶液に対して透析して最終生成物を得た。実験データは、図３、４及び５に纏められている。注：数字のうちＮＨＳ−ＰＡ６は、ＰＡＳ−2400の別名である。このデータは、次のことを示している。オリゴマーの収率は、ＤＣＬＨｂに対するＰＡＳ−2400の比の増大につれて増大する。ＤＣＬＨｂモノマーのＳＥＣ溶出時間は、ＰＡＳ−2400のモル比の増大につれて減少し、このことは、ＰＡＳ−2400がＤＣＬＨｂを修飾することを示している。ポリマー化は迅速であり、30分未満で完了した。しかしながら、ポリマー化剤の競合的加水分解もまた迅速である。溶液のｐＨを上昇させると、高分子量ポリマーの収率の増加が得られる。例えば、ＰＡＳ−2400の５当量は、ｐＨ7.0、7.5、及び 8.0において、それぞれ７％、17％、及びゲルの、高分子量ポリマーを与える。ＰＡＳ−2400でポリマー化されたＤＣＬＨｂのＰ₅₀値及びｎ値は、それぞれ、 29乃至33ｍｍＨｇ及び1.8乃至2.1である。Ｐ₅₀は、ヘモグロビンが半分飽和されるときの酸素分圧であり、「ｎ」値は、酸素結合の協同性の尺度である。赤血球中のヒトのヘモグロビンのP₅₀は、約28である。従って、これらのポリマーにおいては卓越した酸素結合機能が維持されている。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析（図５）は、αα−及びβ鎖が変性されていることを示している。しかしながら、β鎖は、 αα鎖よりも高度に変性されているようである。このように、ＰＡＳ−2400は、修飾されたポリマー化されたＤＣＬＨｂを製造するのに用いることができる。この短い反応時間（30分）は、大規模合成には好都合である。ｐＨ7.0における２乃至４当量のＰＡＳ−2400が、ポリマー化には適している。該ヘモグロビンは、生物学的活性すなわち酸素運搬性を維持しており、且つ以下に示すように非免疫原性である。実施例３より長いポリアミドの合成のための方法成分である酸及びアミンの長さを増加させれば、より長いポリアミドが得られる。すなわち、アジピン酸（炭素６個）又は１，６−ヘキサンジアミン（炭素６個）とのポリマー化は、コハク酸（炭素４個）又は１，４−ブタンジアミン（炭素４個）とのポリマー化で得られるよりも長いポリマーを与える。しかしながら、炭化水素成分を用いて鎖の長さを増加させれは、タンパク質の水溶性を低下させることになろう。このことを念頭において、我々は、ジエステルであるＥＤＥと、２種の一層長いジアミンすなわち、エチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル（ＥＧＢＥ；ＭＷ176）及びジエチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル（ＤＧＢＥ；ＭＷ220）の各々とから、ポリアミドを合成した。図６を参照。各ポリアミドについてのＳＥＣの保持時間は、これらの生成物がより大きな分子量を有することを示唆したが、しかしこれらの生成物はろう状であり低い融点を有していた。結晶化によるそのような生成物の精製は、極度に困難である。これらの欠点を最小限にするため、我々は、より長いポリアミドの合成に適した活性化エステルを選択するための３つの発想を組み合わせた。第１に、我々は、β−エーテル結合を有するジ酸である成分を同定した。これらのジ酸は、活性化ジエステルへと容易に変換される。われわれの最初に選んだジ酸は、ジグリコール酸であった。第２に、我々は、ジ酸２当量をジアミン１当量と反応させることによって、このジ酸の一端をアミドへと変換した。これは、一層長いポリアミドのための成分として用いることのできる新たな一層長いジ酸を生成させた。我々が第１に選択したジ酸は、１，４−（カルボキシメトキシアセタミド）ブタンであり、それを活性化メチルジエステルＢＭＤＡＢ（ＭＷ348）として用いた。メチレン（炭化水素）基の挿入は、結晶性固体とするに十分に分子の柔軟性を減少させ、且つエーテル結合の保持は水に対する可溶性を保存した。第３に、我々は、水溶性を維持する方法でジアミン成分の長さを増加させた。すなわち、我々は、ポリアミド合成におけるジアミン成分として、エチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル（ＥＧＢＥ）及びジエチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル（ＤＧＢＥ）を用いた。活性化させたジエステル構築ブロック、ＢＭＤＡＢは、２つのステップで得られた（図７）。ＤＡＢ（１，４−ジアミノブタン）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中において２当量の無水グリコール酸と反応させて、殆ど定量的収率でＢＣＤＡＢ〔１，４−ビス（カルボキシメトキシアセタミド）ブタン〕を得た。後者を、水性ＨＣｌ又はジオキサン溶液中ＨＣｌの存在下、メタノール中でエステル化した。溶液中のＨＣｌを用いることの利点は、特に大規模合成において反応の実施が容易なこと、及び副生成物の形成を回避するために正確な量のＨＣｌを用いることができることである。気体ＨＣｌを試みたが、生成物混合物中に、副生成物が検出された。溶液法によるＥＤＥとＤＡＢのポリ縮合（それはＥＤＥ：ＤＡＢのモル比１を用いたときにα−メチルエステル−ω−アミノプロピルアミドを主生成物として与える）とは対照的に、ＢＭＤＡＢとＥＧＢＥ又はＤＧＢＥの等当量の、又はＢＭＤＡＢ：ＤＧＢＥのモル比が１より大きいときのポリ縮合は（図８）、実質的な量の３種の生成物の混合物を与えた。すなわち、α−エステル−ω−アミン（ニンヒドリンに反応性；塩基により加水分解）：α，ω−ジアミン（ニンヒドリンに反応性）、及びα，ω−ジエステル（ニンヒドリンに反応しない）である。残念なことに、大量の他の生成物の存在が、望みの生成物の精製をやっかいなものとした。しかしながら、我々は、過剰のジアミンの使用（例えば、ジアミン／ＢＭＤＡＢのモル比が1.3）が、モノアミン副生成物の量を非常に僅かしか含まずにα，ω−ビスアミンポリアミドを主生成物として与えることを発見した。この後者の方法は、従って、ポリマー化試薬のポリアミド基本骨格を製造するのに好ましい。実施例４活性化されたポリマー化試薬であるポリアミドビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステルへの変換：ポリアミドビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル（ＰＡＳ−3070と命名）を合成する最初の試みは、ＢＭＤＡＢとＥＧＢＥからの３段階合成であった（図９）。第１に、ＥＧＢＥとＢＭＤＡＢをモル比1.3乃至1.0で、溶媒としてメタノールを用いて溶液法により65℃にて24時間縮合させ、僅かに橙色の溶液を得た。該生成物は、脱色活性炭（Norit^TM）を溶液に加え、濾過し、そして蒸発乾固させることにより、脱色することができた。2700のＭＷを有する白色の生成物（図９，２ａ）が、メタノール−アセトンからの結晶化により単離された。この生成物は安定でなく、貯蔵中に黄変した。第２に、この白色の生成物の、対応するビス（２−カルボキシエチルカルボニル）ポリアミド（図９、３ａ）への変換は、ＤＭＦ（２ａの溶解性を高めるための少量のメタノールを加えた）中において無水コハク酸と（２ａ）を反応させることによって完了した。この反応は、ビス（２−カルボキシエチルカルボニル）ポリアミド（３ａ）を主生成物として含み２つの主要でない副生成物〔（２ａ）のメチルエステル及び、ＴＬＣにより同定されたところによれば３個の遊離のアミノ基を有する未知の副生成物〕を含んだ、黄色の生成物混合物を与えた。従って、該メチルエステルをビス（２−カルボキシエチルカルボニル）ポリアミド（３ａ）へと変換するために混合物を水酸化ナトリウムで処理し、次いでポリアミドアミン副生成物を吸収させるためにイオン交換樹脂（AG5OW-X8）と共に攪拌した。樹脂を濾過によって除去した後、濾液（これは、ＴＬＣによれば単一の生成物を含んでいた）を、濃縮した。純粋な生成物、ビス（２−カルボキシエチルカルボニル）ポリアミド（３ａ）が、メタノール／アセトンからの結晶化により得られた。第３に、この純粋な生成物の、活性化されたジエステル（４ａ）（ＰＡＳ−3070と命名）への変換は、ＤＭＦ中においてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下にＮ−ヒドロキシスクシンイミドで処理することによって達成された。このポリアミドビス（スクシンイミドエステル）は、水溶性であったが、カップリング基は徐々に加水分解された。従って、この活性化されたポリマー化剤は、水に溶解させたときには直ちに使用した。上記の合成は、幾つかの欠点を有する。例えば、単離された白色の生成物（２ａ）が、安定でない。それは、貯蔵中に酸化されて、結晶化によっては容易には除去できない未知の黄色の生成物となる。更には、メタノール／アセトン中におけるビス（２−カルボキシエチルカルボニル）ポリアミド（３ａ）の再結晶が、該ジ酸の幾らかを、対応するメチルエステルへと変換してしまう。これらの欠点を回避するために、我々が優先させた合成戦略は次の通りである。第１に、ステップ１及び２（図９）を、図９のNoritＡ処理により得られる生成物３を単離せずに直ちに無水コハク酸を反応させて、有色化合物へと酸化される傾向のあるアミノ基をマスクするものである、一体化した工程として行った。そのような「ワンポット」合成は、単離された50〜60％の生成物２の代わりに上記の方法で変換された全ての粗製の２が第２のステップに用いられることから、図９における３の収率を高めた。加えて、３のための結晶化溶媒としてのメタノールの使用が排除されて、３のメチルエステルの形成が回避された。実施例５ＰＡＳ−4200の合成ＰＡＳ−4200（図９、４ｂ）は、上記の一体化アプローチを用いて製造した。実施例６活性化されたポリマー化剤であるポリアミドビス（マレイミドプロピオナート）への変換ポリアミドビス（マレイミドプロピオナート）（ＰＡＭ−4080と命名）の合成は、図１０に纏められている「ワンポット」の２ステップ合成として達成した。ＢＭＤＡＢ及びＤＧＢＥを還流メタノール中にて24時間加熱し、次いでNoritＡで脱色することにより粗製のポリアミドビスアミン（図１０，２Ｂ）が得られ、それを直ちにＮ−ヒドロキシスクシンイミド−３−マレイミドプロピオナート（ＳＭＰ、図１０、５）で処理して６ｂを得た。トリエチルアミンの存在下にクロロホルム中、モル比１：２で２ｂと５とを混合することによる後のステップを行う最初の試みは、高分子量生成物を与えた。ＳＭＰは２官能性の架橋剤であることから、それはこれらの条件下では２ｂをポリマー化し得た。ＳＭＰ／２ｂのモル比を4.5に増大させること及びクロロホルム中のＳＭＰ溶液へのトリエチルアミン含有クロロホルム中の２ｂのゆっくりした添加は、ＳＭＰによる２ｂのポリマー化をなくした。こうして、この手順で得られた粗製の６ｂを、未反応のポリアミドアミンを除去するために陽イオン交換樹脂（AG 50W-X8）と混合し、そしてこの精製されたポリアミドポリマー化剤６ｂ（ＰＡＭ −4080と命名）が、メタノール／アセトンから粗製の生成物を結晶化させることによって得られた。ＰＡＳ誘導体とは対照的に、ＰＡＭ誘導体は水中において安定である。実施例７ポリアミドポリマー化試薬によるＤＣＬＨｂのポリマー化ＤＣＬＨｂの、実施例４及び５に記載のタイプのＰＡＳ誘導体との、又は上記実施例６に記載のタイプのＰＡＭ誘導体との典型的なポリマー化は、次の通りにして達成した。ＤＣＬＨｂの溶液（ＰＡＳ用には10g／ｄｌ、ＰＡＭ用には20g／ｄｌ）を、室温にて1.5時間の連続的真空／窒素サイクルにより脱酸素した。脱酸素した水中のポリアミド試薬を、このＤＣＬＨｂ溶液に直ちに加えた。反応混合物を室温にて窒素下に攪拌し、反応の進行をＳＥＣにより追跡した。ポリマー化は、ＰＡＳ誘導体については２乃至３時間で完了し、ＰＡＭ誘導体については終夜で完了した。反応混合物を５℃まで冷却し、１モルのＨＥＰＥＳ（ｐＨ9.0 ）で溶液のｐＨを8.0に調節し、ｐＨ9.0の１ＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ／ＤＣＬＨｂのモル比は５）の溶液を加えた。溶液を窒素下に室温にて終夜攪拌し、乳酸リンゲル溶液に対して透析して、最終生成物を得た。実験結果は図１１乃至１８に纏められている。活性化エステルＰＡＳ誘導体によるＤＣＬＨｂのポリマー化は、次の通りに纏めることができる。（ａ）ポリマー化の程度及びオリゴマーの収率は、用いたＰＡＳのモル比と共に増加した。（ｂ）用いたＰＡＳのモル比の増大と同時に、ＤＣＬＨｂモノマーの溶出時間が短縮し、そのことは、ＰＡＳによるＤＣＬＨｂの修飾が起こっていることを示唆している。（ｃ）ポリマー化は迅速であり、２乃至３時間以内に完了した。（ｄ）ＰＡＳ−3070の５当量とＰＡＳ−4200の３当量を用いることによって得られたポリマー化生成物のＳＥＣプロフィールは、非常に類似している。このことは、長い試薬ほどＤＣＬＨｂのポリマー化を容易にするということを明らかにしている。（ｅ）ＰＡＳ−3070の４当量及びＰＡＳ−42 00の2.5当量は、これらの実験条件において最良の生成物混合物を与えた。（ｆ）ＰＡＳ誘導体は、ＤＣＨＬｂのP₅₀値に影響を与えない。すなわち、ポリマー化生成物のＰ₅₀値は29乃至36ｍｍＨｇの範囲であった。（ｇ）ＲＰ−ＨＰＬＣ分析（図１３）は、β−及びαα鎖の双方がＰＡＳによって変性されるがαα鎖は β鎖よりその程度が低い、ということを示している。ＰＡＭ誘導体のＤＣＬＨｂポリマー化もまた要約できる。（ａ）ＰＡＳ誘導体について真であったように、オリゴマーの収率は、用いたＰＡＭのモル当量数とともに増大する。（ｂ）モノマーの溶出時間は、用いたＰＡＭのモル当量数と共に減少した。従って、ＰＡＭによるＤＣＬＨｂの修飾が起こっているらしい。（ｃ）ＰＡＭの２当量が、最良の生成物混合物を与える。（ｄ）ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィール（図１５）は、試薬が特異的に反応したことを示唆している。明確な β’−ピーク（それは変性されたβ−ピークであり得る）が、ＰＡＭの試験した全比率において検出された。該サブユニットとの特異的な反応はまた、滴定可能なチオール残基の減少によっても支持されている。試薬ＰＡＭは、システイン− β93残基に特異的に結合すると予想され、１及び２当量のＰＡＭを用いたとき、それぞれ約65及び90％のチオール基が変性される。（ｅ）ＰＡＭのシステイン残基への結合は、ポリマー化された生成物のＰ₅₀値の18乃至20ｍｍＨｇへの低下をもたらす。（ｆ）αα鎖もまた修飾されるが、β鎖よりも遥に程度が低い。生物学的試験実施例８乃至１２において、我々は、ポリアミドＰＡＭ−4200をＮ−アセチル −Ｌ−システインとの反応によって抑制し、そして乳酸リンゲル溶液中の無菌の、非パイロージェン性のポリアミド（ＰＡＭ−4080）溶液を試験した。ポリアミド濃度は溶液中５ｇ／ｄｌであった。該ポリアミド溶液のｐＨは、生理学的値に調節した。該溶液の浸透圧は生理学的範囲内であった。該ポリアミドの濃度は、計画される使用レベルを少なくとも一桁の大きさだけ上回るように選択した。実施例８単離された哺乳類細胞のin vitro暴露 CCL 1 NCTC 929（マウス結合組織Ｌ細胞株のクローン）を、滅菌培地中でコンフルエントになるまで無菌的に培養した。L-929細胞の濃度は、約1.3×10⁵個／ｍｌに調節し、部分量を組織培養プレートのウェルへ移した。プレートを覆い、約24時間インキュベートした。次いで、培養培地を各ウェルから吸引し、試験品目溶液の部分量及び、2. 5及び１ｇ／ｄｌのＰＡＭ−4080濃度を有する希釈液を、準備されたプレートのそれぞれ２つずつのウェルに加えた。約48時間の該プレートのインキュベーションの後、ウェルを２％クリスタルバイオレット染色で染色した。０から４＋までにの段階に毒性を等級づけた。ここに等級０は、分離した細胞質内顆粒の存在及び細胞溶解の無いことに対応し、等級４＋は、細胞層の殆ど完全な破壊に対応した。最高濃度において、中等度の毒性等級である２＋が当てはまった。２つの低いほうの濃度においては、０という毒性等級が当てはまった、すなわち、該ポリアミドは、有害な生物学的応答を引き起こさなかった。これら低い方の投与量では毒性は観察されず、最高の投与量において中等度の毒性が観察された。従って、本発明のポリアミドは、治療上有用な基質の接合体として投与したとき、無毒であると予想される。実施例９げっ歯類における急性毒性雄性Sprague-Dawleyラットの尾静脈に、抑制したＰＡＭ−4080の500又は1500 ｍｇ／ｋｇ体重を、１ｍｌ／ｋｇ／分の速度で注入した。各試験群は６匹の動物よりなり、６匹の無投与の動物を対照とした。全ての動物を、明白な毒性の兆候につき72時間モニターしたが、何ら観察されなかった。動物を屠殺した。剖検時において毒性の証拠は見られなかった。肝臓、腎臓、肺からの組織を、組織病理学分析に付した。有害な組織病理学的所見は認められなかった。実施例１０ヒト赤血球との適合性ヒト赤血球とのＰＡＭ−4080の生体適合性を判定するため、ポリアミド原液を、乳酸リンゲル溶液で５倍希釈した。この調製物のある量を、等量のヘパリン処理ヒト血液と混合し、穏やかに攪拌し、そしてインキュベーター（37℃）内に終夜入れた。16時間のインキュベーション時間の後、上澄の100μｌの部分量を試験サンプルの最上部から採取した。下方にある沈降した赤血球をかき乱さないよう注意を払った。該部分量を5000μｌのＳＥＣ移動層と混合し、0.2μｍポアサイズのフィルターを通して濾過し、天然ヘモグロビンのＳＥＣ分析のために、Su perose^TM12カラムに注入した。この実験データは、0.1％未満の溶血が起こったことを示した。この量は無視し得ると見なした。実施例１１ヒト末梢血単核球（単球）との適合性白血球活性化を引き起こすＰＡＭ−4080の潜在能力を評価した。ポリアミド原液を乳酸リンゲル溶液で５倍希釈した。この調製物のある量を、等量の末梢血単核球調製物と混合し、穏やかに攪拌した。この試験調製物の部分量を採取して、トリパンブルーで希釈した。色素を排除できなくなっている細胞を顕微鏡で検出することにより、毒性を判定した。生細胞／死細胞比によって、パーセント生存性を測定した。ＰＡＭ−4080は、生存性を何ら低下させなかった。残りの試験調製物を、インキュベーター（37℃）中に終夜入れておいた。16時間のインキュベーション時間の後、サンプルの部分量をピペットでマイクロタイターウェル内へ入れてＥＬＩＳＡによって定量することによって、サイトカイン類を分析した。測定された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキンー１β及ひインターロイキンー６の濃度は、ヒト単球を乳酸リンゲル溶液に暴露することにより見出される濃度と差がなかった。従って、ＰＡＭ−4080は、ヒト単球と適合性である。実施例１２ヒト末梢血単核球（単球）とのＰＡ−ＤＣＬＨｂの適合性ヒトの単球によるサイトカイン産生に対する、ポリアミド修飾及びポリマー化ＤＣＬＨｂ（ＰＡ−ＤＣＬＨｂ）の潜在能力を評価した。乳酸リンゲル溶液を、対照品目として用いた。試験品目は、乳酸リンゲル溶液中のＰＡ−ＤＣＬＨｂの７通りの異なった調製物であった。試験及び対照溶液は、試験品及び対照品の各々の部分量を、等量の末梢血単核球調製物と混合することにより作った。得られた試験及び対照溶液を37℃にて約16時間インキュベーションした後、各サンプルの部分量を別個のマイクロタイタープレートのウェルに移し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１β及びインターロイキン−６の濃度を、ＥＬＩＳＡにより定量した。測定した各サイトカインの濃度は、下の表に示されている。この実験データは、ＴＮＦ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の誘導が低く、場合によってはリンゲルと同等であることを示している。纏めると、ＰＡ−ＤＣＬＨｂは、ヒト単球と非常に適合性があるようである。実施例１３ＰＡＳ−ＤＣＬＨｂによるサイトカインの誘導６通りのＰＡＳ−ＤＣＬＨｂ生成物混合物をサイトカイン試験に付した。選んだ生成物は、ｐＨ7.0における0.1ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中での３ｇ／ｄｌのＤＣＬＨｂのポリマー化によって製造した。各サンプルを約１ｇ／ｄｌのＤＣＬＨｂ濃度に希釈し、END-X^TMエンドトキシン除去フィルターに通した。実施例１２に記述した方法を用いて濾液を、サイトカイン誘導について試験した。ＰＡＳ−ＤＣＬＨｂ（３：１）は、修飾とポリマー化の最も少ない生成物混合物であり、対して、ＰＡＳ−ＤＣＬＨｂ（10：１）は、最も広範に修飾及びポリマー化された生成物混合物である。修飾とポリマー化の度合は、用いたＰＡＳのモル比と共に増大した。しかしながら、ＰＡＳ−Ｈｂ生成物は、修飾及びポリマー化の程度に関わりなく、何れもＴＮＦ応答及びＩＬ−１応答が低かった。サンプルの何れも、ＩＬ−６応答を示さなかった。実施例１４チオ含有ポリアミドの合成この仕事の一部として５つの実験パラメーターを研究した。すなわち（１）モノマー（ジエステル及びアミン）のモル比、溶媒、反応温度、混合の順序、及び生成物の単離方法、である。これらの研究の目的は、特定の分子量を有するポリマーの収率を再現可能に最大にする反応条件を同定することであった。ジエステルのジアミンに対するモル比は、１：１から１：1.4まで変化させた。試験した溶媒には、クロロホルム及びＤＭＦが含まれた。塩基性触媒は、２，６−ルチジン（中等度の塩基）からトリエチルアミン（強い塩基）まで、そして触媒無添加まで変化させた。温度は、−50℃から室温（約23℃）までに及んだ。ジエステルをアミンに加え、又は逆とした。混合の速度は、溶液の攪拌の速度を変化させることによって、添加の速度を変化させることによって、又は成分のうちの一つ（ジエステル）の溶解性を制御することによって、制御した。ポリアミドビス（ジアミン）のポリアミドビス（スクシナート）への変換によって生成物の単離が容易になりポリマーの収率が改善される、ということが見出された。この研究の結果、ＴＢＢ（３，３−チオジプロピオナート活性エステル）のＤＧＢＥ〔ジエチレングリコールビス（３−アミノプロピルエーテル）；ジアミン〕との、表に記されている条件下でのポリ縮合によって、約2800及び5700の分子量を有する水溶性ポリアミドが選択的に製造されることが見出された。いずれの場合においても、ポリ縮合反応は、規模に応じて４〜24時間を要し、ポリアミドの収率は、ほぼ50％又はそれより大きかった。表．特定の分子量を有する水溶性ポリアミドを得るためのＴＢＢとＤＧＢＥのポリ縮合のための最適条件ジフェニル（２，３−ヒジドロ−２−チオキソ−３−ベンゾキサゾイル）ホスホナート（ＤＤＴＢＰ）の合成１ｌのトルエン中の２−メルカプトベンゾキサゾール（251.6ｇ、1.66mole）及びトリエチルアミン（191.4ｇ，1.89mole）の溶液に、室温にて攪拌しつつ、4 00ｍｌのトルエン中のジフェニルクロロホスフェート（505.1ｇ，1.88mole）の溶液に加えた。添加が終了した後、溶液を更に1.5時間攪拌し、その間に沈殿が生じた。反応混合物の薄層クロマトグラフィー分析（ＴＬＣ；シリカゲル；溶離液：エチルエーテル／ヘキサン，１：１，ｖ／ｖ）は、反応の完了を示した。濾過により固形物を除去し、トルエンで洗浄した（３×100ｍｌ）。濾液を合わせ、油状物にまで蒸発させた。この油状物を500ｍｌのクロロホルムに溶かし、得られた溶液を還流温度に約１時間加熱した。溶液を、シリカゲルのパッドに通した。そのパッドを、濾液のＴＬＣ分析がシリカゲルから該生成物が完全に溶出したことを示すまで、クロロホルムで洗浄した。このクロロホルム溶液を蒸発させると、望みの生成物が固体として残った。ヘキサン（1.5ｌ）加え、その固体を濾過によって収集し、そして真空下に乾燥させた。頭文字ＤＤＴＢＰにより同定されるこの生成物である582.0ｇの白色固体は、融点80〜83℃（未補正）及び次のＮＭＲ共鳴によって特徴づけられた。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：7.21（m,4），7.35（m,9）及び7.91（m，1）ppm ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：109.9（s，C9），114.8（s，C8），120.1-120.3 （重なり合ったシングレット，C2），125.5（s，C7），126.3（s，C10），129.9 -130.0（重なり合ったシングレット，C3），147.5（s，C5），149.5（s，C1）及び180.2（s，C11）ppm ³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：-16.17ppm（-8.9ppmに主要でない不純物を伴う）Ｎ，Ｎ’−（３，３’−チオジプロピオニル）ビス（ベンゾキサゾリン−２ −チオン）（ＴＢＢ）の合成クロロホルム（20ｍｌ）中の３，３’−チオジプロピオン酸（891ｍｇ，５mmo l）及びトリエチルアミン（1.5ｍｌ）の攪拌溶液に、ＤＤＴＢＰ（4.22g，11mmo l）を加えた。室温にて溶液を攪拌し、ＴＬＣ（シリカゲル；溶離液：エチルエーテル／ヘキサン、１：１、ｖ／ｖ）でモニターした。時間とともに、生成物が溶液から沈殿しはじめた。生成物の完全な沈殿を容易にするために、メタノール（100ｍｌ）を加え、濾過により単離して風乾した。約1.7ｇ（理論量の76％）の生成物、Ｎ，Ｎ’−（３，３’−チオジプロピオニル）ビス（ベンゾキサゾリン−２−チオン）すなわちＴＢＢが、融点147〜149℃（未補正）を有する白色固体として得られた。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：3.07（t，H1），3.89（t，H2），7.27，7.32，7.37 （H4，H5，H6）及び8.08（t，H3）ppm ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：22.65（C2），39.91（C1），109.58，116.4（C4 ，C5），125.5，126.7（C3，C6），129.6（C8），146.41（C7），172.22（C10）及び178.46（C9）約2800ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリアミドであるＰＡＴＳ− 2800の合成クロロホルム12ｍｌ中のＤＧＢＥ（3.17g，1.4mmol；ＴＢＢに対するモル比1. 2：１）の溶液を加えながら、60ｍｌのクロロホルム中のＴＢＢ（5.34ｇ，12mmo l）のスラリーを、外部氷浴中で０℃まで冷却しつつ中等度の速度で攪拌した。得られた混合物を、０〜５℃にて15分間攪拌し、次いで氷浴を除去した。室温にて終夜攪拌を続けた。薄層クロマトグラフィーは、ポリアミドビス（アミン）が形成されたことを示した。薄層クロマトグラフィー分析が全てのポリアミドビス（アミン）が対応するポリアミドビス（カルボン酸）へ変換されたことを示すまで、３ｍｌのＤＭＦ中の無水コハク酸の溶液（850ｍｇ）を、ポリマー溶液に加えた。真空下に蒸発乾固させることにより反応混合物から揮発性の材料を除去し、そして残渣を20ｍｌのＤＭＦに溶かした。真空下に蒸発させることによって揮発性材料を除去した。残渣を第２の、ＤＭＦの20ｍｌの部分に溶解させた。得られた溶液に酢酸エチルをゆっくりと加えた。約300ｍｌの酢酸エチルの添加後は生成物の沈殿が完了したようであった。濾過により生成物を集め、酢酸エチルで洗い、そして高真空下に乾燥させた。2800ダルトンの数平均分子量（ＮＭＲ解析に基づく）を有し且つサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）保持時間38.8分を有する、約2.27ｇ（理論量の47％）の水溶性ポリアミド（頭文字ＰＡＴＳで示した）が得られた。約2800ダルトンの数平均分子量を有する活性化された水溶性ポリアミドであるＰＡＴＳＳ−2800の合成 10ｍｌのＤＭＦと30ｍｌのクロロホルムの混合液中のＰＡＴＳ−2800（1.96ｇ，0.7mmol）の攪拌溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（1.18 ｇ，6.42mmol）を加えた。室温にて混合物を攪拌し、反応をＴＬＣ（シリカゲル；溶離液：ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ／ＮＨ₄ＯＨ／Ｈ₂Ｏ，体積で、10：3：0.2：0.2 、）により追跡した。3.5時間後、反応混合物を濾過して不溶性の材料を除去した。濾液を真空下に濃縮乾固させた。残渣を15mｌのＤＭＦに溶解させ、溶液を酢酸エチル（300ｍｌ）でゆっくりと希釈して、生成物であるビス（Ｎ−オキシスクシンイミジル）ポリアミドジカルボキシラートを沈殿させた。これは頭文字ＰＡＴＳＳ−2800によって同定される。この生成物（1.52ｇ，収率77％）を、濾過により単離し、真空下に乾燥させた。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：1.71（m，Hb）；2.89（m，Hg）；2.52（t，Hs又はH t）；2.76（m）;2.78（Hf，Hh）；2.90（t,Hs又はHt）；3.27（m，Ha）;3.47-3. 57（m，Hc，Hd）；6.78（CONH）ppm ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：25.5（Cr）；26.7；30.3（Cs，Ct）；27.7（Cg ）；28.9（Cb）；36.4（Cf）；37.5（Ca）；69.5；69.9；70.3（Cc，Cd）；168. 1，169.0；169.8；及び171.2（C=0）ppm （注：全ての共鳴が特定の構造的部位に相関づけられてはいない。）吸収の割当は、該ポリマーの数平均分子量が約2800ダルトンであることを示した。約5700ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリアミドであるＰＡＴＳ− 5700の合成中程度に遅い速度で攪拌されている60ｍｌのＤＭＦ中のＴＢＢ（5.34ｇ，12mm ol）のスラリーに、６ｍｌのＤＭＦ中のＤＧＢＥ（3.44ｇ，1.68mmol，ＴＢＢに対して1.3：１のモル比）の溶液を加えた。固形物が徐々に溶解し、混合物が温まった。得られた溶液を室温にて終夜攪拌した。溶液から沈殿が徐々に分離した。沈殿（2.44ｇ、理論量の約47％）を濾過により単離し、約35.8分のＳＥＣ保持時間を有することが見出され、そしてＴＬＣにより、平均分子量約5700ダルトンを有するポリアミドモノアミンモノカルボキシラートと特徴づけられた。濾液は、約38.6分のＳＥＣ保持時間を有するポリマー（1.14ｇ，理論量の22％）を含有することが見出された。（すなわち、ポリアミドビス（アミン）は約2800ダルトンの数平均分子量を有していた。）約2800ダルトンの数平均分子量を有する活性化された水溶性ポリアミドであるＰＡＴＳＳ−5700の合成上記の沈殿（2.44ｇ）を、60ｍｌのクロロホルムに溶解させ、そして完全な溶解を保証するために約３ｍｌのメタノールを加えた。残存ＤＭＦの完全な除去を保証するために、揮発性成分を真空下に除去した。固形物を第２のクロロホルムの60ｍｌ部分に溶解させた。得られた溶液に、１ｍｌのＤＭＦ中の無水コハク酸（108ｍｇ）を加えた。反応をＴＬＣでモニターした。ポリアミドアミンのすべてがポリアミドビス（カルボン酸）へと変換されるまで攪拌を続けた。この溶液に、トリエチルアミン（約400μｌ）、10ｍｌのＤＭＦ及び730ｍｇのＮ，Ｎ’− ジスクシンイミジルカルボナートを順次加えた。混合物を室温にて攪拌し、反応をＴＬＣで追跡した。2.5時間後、揮発性材料を真空下に除去し、残った固形物を10ｍｌのＤＭＦに溶解させた。この溶液を酢酸エチル（100ｍｌ）でゆっくりと希釈して生成物であるビス（Ｎ−オキシスクシンイミジル）ポリアミドジカルボキシラートを沈殿させた。これは頭文字ＰＡＴＳＳ−5700によって同定される。生成物の約2.36ｇが、濾過と真空乾燥によって単離された。 ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：25.5（Cr）；26.8；30.4（Cs，Ct）；27.7（Cg ）；29.0（Cb）；36.5（Cf）；37.6（Ca）；69.6；70.0；70.4（Cc，Cd）；168. 2，169.1；169.9；及び171.3（C=0）ppm （注：全ての共鳴が特定の構造的部位に相関づけられてはいない。）吸収の割当は、該ポリマーの数平均分子量が約5700ダルトンであることを示した。直ちに認識されるであろうように、請求の範囲に提示された本発明から逸脱することなく、上に提示された本発明の非常に多くの変形及び組み合わせを用いることができる。そのような変形の全ては、以下の請求の範囲に包含されることが意図されている。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to water-soluble, substantially non-immunogenic polyamide cross-linkers. The present invention also relates to the covalent attachment of water-soluble polyamides to proteins, polynucleotides and other biological substrates to form water-soluble products that are substantially non-immunogenic. The invention also relates to proteins, polynucleotides and other biological substrates that have been cross-linked, conjugated, polymerized or modified with water-soluble polyamides to obtain a substantially non-immunogenic product. Background of the Invention Crosslinking agents allow the study of the spatial arrangement and function of various macromolecular substances, the identification of binding sites (receptors) for ligands, the production of affinity matrices, and the denaturation and stabilization of diverse macromolecular structures. It is used for various purposes including (Enzymology, Vol.91, p.580-609 (1983). In order to preserve electrostatic charge, to change electrostatic charge, to change immunogenicity. Enzyme specificity to attach several different types of carbohydrate moieties to induce fluorescent labels, spin labels, radiolabels, and electron-dense substrates to increase or decrease susceptibility to proteolysis. In order to change the molecular weight and to introduce intra- and / or inter-molecular cross-links, a cross-linking agent is used to link already related molecular species and both properties into a single molecule. It has also been designed for inclusion (GE. Means and RE. Feeney, Bioconjugate Chemistry, Vo. 1, p. 2-12 (1990)). Cross-linking agents have been developed.Many of these reagents are commercially available.To enhance the stability of the protein or of certain conformational relationships in the protein, two or more different To link proteins, to identify or characterize the nature and extent of specific protein-protein interactions, or to measure the distance between reactive groups within or between protein subunits. , Cross-linking of proteins and attachment to insoluble supports and their immobilization by various other methods have been used, proteins facilitate their use and their separation from other products. The cross-linking of therapeutic proteins or polypeptides has been shown to reduce immunogenicity and prolong the life of the cross-linked product in the blood. Generally, cross-linking agents consist of organic cross-links between activated ends that bind to biological macromolecules to form cross-links. Peptides, carbohydrates (eg, dextran, starch, and hydroxy). Polymers such as ethyl starch), fatty acids, polyglycolides, polypeptides (eg gelatin or collagen), polyalkylene units, poly (vinyl alcohol), polyvinylpyrrolidone and polyethylene glycol (also known as polyoxyethylene). Various organic cross-links are known in the art, including. Commercially available homobifunctional heterobifunctional crosslinkers range in size from about 6 to 16Å. Their water solubility decreases with chain length. However, the efficiency of cross-linking increases with chain length because of reduced steric hindrance. Peptides containing 3 to 9 amino acid residues are commonly used as crosslinkers. However, these have the following drawbacks. That is, the chemistry used for peptide synthesis is complex, involving selective blocking and deblocking of functional groups and specific ligation conditions. Care must be taken not to racemize the amino acid component. Peptides must be carefully selected so that they have no biological activity. Finally, they must undergo enzymatic hydrolysis, which limits the period of their availability, especially during circulation in vivo. Synthetic polymers are being developed for use as crosslinkers. The synthetic polymeric crosslinker desirably has the following characteristics. That is, (1) the polymer must be water-soluble and exhibit a narrow, defined molecular weight distribution. (2) It must provide an attachment / release site or the possibility of introducing such a site. (3) The polymer should be compatible with the biological environment, ie non-toxic, non-antigenic, and non-irritating in any other respect. (4) It should be biodegradable or eliminated from the body after it has performed its function (Duncan and Kopecek, Advances in Polymer Science, Vol. 97, p. 53-101 (1984). The conjugation of biologically active polypeptides with water-soluble polymers such as PEG is well known to those skilled in the art of biologically active and pharmaceutically active peptides and PEG to PEG and similar water soluble polymers. Linkage of polypeptides is disclosed in Davis et al., US Patent No. 4,179,377. PEG-modified polypeptides are disclosed as exhibiting a dramatic reduction in immunogenicity and antigenicity. The PEG conjugates also exhibit a wide range of solubility and low toxicity, and have been shown to stay in the blood considerably longer than the corresponding natural compounds and are easily excreted. The zygote is also an enzyme in the blood It has also been shown not to interfere with activity or with the conformation of the conjugated polypeptide, thus reducing immunogenicity and antigenicity as well as longer clearance while retaining a substantial portion of the physiological activity of the protein. Many PEG conjugates of therapeutic proteins have been developed that show time.Consideration has also been focused on conjugates of therapeutic drugs with PEG.Granov et al. ("Macromolcules," 17, p. 945-952 (1984) observed that attachment of PEG to various drugs resulted in prolongation of pharmacological activity Zalipsky US Pat. No. 5,122,614 describes the use of polyethylene glycol as a cross-linking agent. Biniarz, U.S. Pat. No. 5,053,520, describes a polyamide-based ligation reagent that is not water soluble, and Horn, U.S. Pat. No. 4,182,695, describes conjugation to polyamides. Russian patent application No. SU 1659433 discloses a water-soluble polyamide with chemiluminescent groups in the chain Dellacherie US Pat. No. 5,110,909 describes the water-solubility of hemoglobin. Disclosed macromolecular conjugates Cargill's PCT patent application WO 92/08790 discloses the use of polyamide polymers attached to protein-attached linking groups. Proteins have undesirable properties such as short half-life in vivo, poor solubility, susceptibility to enzymatic degradation in vivo, or immunogenicity. The polyamides of the present invention overcome these drawbacks when linked to such proteins. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is a water-soluble, substantially non-immunogenic polyamide having an average molecular weight of about 300 to about 20000 g per mole, wherein the amide repeat unit comprises (ii) at least one second (I) at least one covalently linked as an amide to a water-soluble organic amine subunit having 15 or fewer atoms separating the primary amino group and the amide functional group in the polyamide. It consists of a water-soluble organic acid subunit having 15 or fewer atoms separating the carboxylate group and the amide function of the polyamide. In other words, the polyamide of the present invention is a water-soluble, substantially non-immunogenic polyamide selected from the following formulas I, II and III. I Y-A-X-Y II Z-B-X-Z III Y-X-Z [(i) where the terminal Y is an OH or a carboxyl linking group, (ii) where the terminal Z is , Hydrogen or a linking group attached to an amino group, and (iii) where X is (BA) n, (AB) n, (BA ') n or (A '-B) n, as well as connecting (BA) n, (AB) n, (BA') n or (A'-B) n to the central polyacid, polyamine or polyamino acid. A branched polyamide formed by, a polyamide selected from the group consisting of: (iv) where A is α, ω-diacid, B is α, ω-diamine and A ′ is formula [Y here ₁ Is the formula, -OC- (CH ₂ ) P-NH-, wherein p is from 1 to about 4, m is from about 2 to about 4, and X is ₁ And X ₂ Are independently heteroatoms selected from the group consisting of O, S, P or tertiary N other than O of carboxyl or carbonyl, and R ₃ Is lower alkyl having from about 1 to about 2 carbon atoms, and n is the number of amide repeat units in the polyamide. And (v) the acid subunit of the amide repeat unit has (a) 15 or fewer atoms in the chain and a substituent on the chain An organic acid having one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, S, P or tertiary N other than carboxyl or carbonyl, which is present as or as an atom in the chain, or Or (b) two or more such organic acids bridged by a water-soluble organic diamine, and (vi) where the amine subunit in the amide repeat unit is at least one primary O, S, P or tertiary other than carboxyl or carbonyl having an amino group and having 15 or fewer atoms in the chain and being present as a substituent on the chain or as an atom in the chain Selected from the group consisting of N Having one or more heteroatoms, organic, water-soluble amine, and (vii) n herein is 2 to about 100. The invention is directed to one or more such proteins used to crosslink, conjugate, modify or polymerize proteins, antibodies, haptens, polypeptides, polynucleotides and other biological substrates. Including polyamide. The cross-linked, conjugated, polymerized or modified product is water-soluble, substantially non-immunogenic and retains all or a useful part of the physiological activity of the substrate. ing. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows the polycondensation of ethylene glycol bis (methoxycarbonyl methyl ether) and 1,4-diaminobutane. FIG. 2 shows reaction conditions, product characteristics, and reaction yields for the reaction shown in FIG. FIG. 3 shows experimental data, including the oxygen binding function of diaspirin-crosslinked hemoglobin polymerized and modified with PAS-2400. FIG. 4 shows a size exclusion chromatography profile of diaspirin cross-linked hemoglobin polymerized and modified with PAS-2400. FIG. 5 shows the reverse phase HPLC profile of diaspirin cross-linked hemoglobin polymerized and modified with PAS-2400. FIG. 6 depicts the components of polyamide synthesis. FIG. 7 depicts the synthesis of BMDAB (one of the polyamide components). FIG. 8 depicts the polycondensation of BMDAB and diamine to form a polyamide. FIG. 9 depicts the synthesis of polyamide activated esters PAS-3037 and PAS-4200. Figure 10 depicts the synthesis of a maleimide-capped polyamide named PAM-4080. FIG. 11 depicts a size exclusion profile after polymerization of diaspinline-crosslinked hemoglobin by PAS-3037. FIG. 12 depicts a chromatographic profile of size exclusion after polymerization of diaspinline-crosslinked hemoglobin by PAS-14200. FIG. 13 depicts a reverse-phase HPLC profile after polymerisation of diaspirin-bridged hemoglobin with PAS-4200. FIG. 14 depicts the size exclusion chromatography profile after polymerization of diaspinline-crosslinked hemoglobin with PAM-4080. FIG. 15 depicts reverse phase HPLC after polymerization of diaspirin-bridged hemoglobin with PAM-4080. FIG. 16 shows experimental data after polymerization of diaspirin cross-linked hemoglobin by PAS-3070. FIG. 17 shows experimental data after polymerisation of diaspirin cross-linked hemoglobin by PAS-4080. FIG. 18 shows experimental data after polymerization of diaspirin-bridged hemoglobin with PAM-4080. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The polyamide of the present invention is a substantially non-immunogenic, water-soluble polyamide having a number average molecular weight of about 300 to about 20000 g per mole. The amide repeat unit of these polyamides is covalently linked as an amide to a water-soluble organic amine subunit having at least one amino group and 15 or fewer atoms separating the amide functional groups in the polymer. Of at least one carboxylate group and a water-soluble organic acid subunit having 15 or fewer atoms separating the amide functionality of the polymer. These polyamides are used to provide products that are water-soluble, substantially non-immunogenic, and retain all or a useful portion of the physiological activity of the substrate, such as proteins, polypeptides, antibodies, haptens. , Biological substances such as carbohydrates or polynucleotides etc. can be used directly or after activation for the purpose of cross-linking, conjugating, polymerizing and / or modifying. They can also be used to attach substrates to detection reagents or solid matrices. The term "substantially non-immunogenic" indicates that the polyamide does not elicit a humoral or cellular immune response in vivo or in vitro. The term "water soluble" indicates that the polyamide has a water solubility of greater than 500 mg per 100 ml. The term also indicates that the polyamide does not act as a surfactant and does not form micelle-like aggregates in water. The term "activating" means converting the group located at the end of the polyamide into a more reactive linking group. The polyamide may be linear or branched. The term "substrate" means a molecule to which the polyamide of the invention is attached. Substrates include, but are not limited to, enzymes, growth factors, proteins such as antibodies or blood proteins, fragments such as cDNAs, steroids and hormones, immunoconjugates, carbohydrates, and any conjugates of these substrates. Not done. The substrate may also be a solid support or beads. Substrates include molecules that have therapeutically useful biological activity. As used herein, a "substrate" is when a plurality of polyamides are bound to the substrate by one end of each polyamide and none of the other ends of the polyamide are bound to different substrate molecules. , "Qualified". The water-soluble polyamide of the present invention can be produced by a method known in the art. The known methods for the production of polyamides are introduced here by reference as useful methods for the production of the polyamides according to the invention. N. Ogata et al., Polymer Journal, Vol. 5, p. 186ff (1973), and N.M. Ogata and Y. Hosoda, Journal Polymer Science, Polymer Letter. Ed., Vol. 12, p. 355ff (1974) describes the polycondensation of diesters activated by ether or hydroxyl groups with diamines. N. Ogata et al., Journal Polymer Science, Polymer Chemistry Ed., Vol. 14, p. 783ff (1976), N.M. Ogata et al., Polymer Jouranl, Vol. 11, p. 827-833 (1979), and H.M. Sato et al., Makromol Chemistry, Vol. 182, p. 755-762 (1982) describes the polycondensation of activated diesters containing ether, thioether or hydroxyl groups with diamines. D. Kieley and TH. Lin also describes polyhydroxypolyamides and methods for their preparation (US Pat. No. 4,833,230). N. Ogata and Y. Hosoda, Journal Polymer Science, Po1ymer Chemistry Ed., Vol. 18, p. 11 59-1162 (1978) describes the synthesis of water-soluble polyamides by polycondensation of ethylene glycol dimethoxycarboxymethyl ether and hexamethylenediamine in solution. The acid subunit of the amide repeat unit has 15 or fewer atoms in the chain and as a substituent on the chain or as an atom in the chain, a heteroatom (O, S, P, N), selected from the group consisting of organic acids. Alternatively, the acid subunit of the amide repeat unit can consist of two or more such organic acids linked to a water-soluble, organic diamine that is cross-linked. The amine subunit of the amide repeat unit has 15 or fewer atoms in the chain and as a substituent on the chain or as an atom in the chain, a heteroatom (O, S, P, N ) With an organic amine. Similar and / or dissimilar polyamide structures can also be linked by central polyacids, polyamines or polyamino acids to form branched water-soluble polyamides. In one embodiment of the present invention, X is (BA) n, (AB) n, and (BA) n or (A- in the central polyacid, polyamine or poly (amino acid). B) selected from the group consisting of branched polyamides formed by linking n. In this embodiment, the acid subunit of the polyamide repeat unit is such that each organic acid has 15 or fewer atoms in the chain and has the formula -NH-R ₁ Have —NH— (where R ₁ Is a substituted or unsubstituted aliphatic chain having about 4 to about 5 carbon atoms) as a substituent on the chain bridged by a water-soluble diamine or as an atom in the chain Two or more organic acids having one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, S, P or tertiary N other than O of carboxyl or carbonyl is there. In a preferred embodiment of the invention said formula -NH-R ₁ The diamine with -NH- is 1,4-diaminobutane. In another embodiment of the invention, wherein X is a branched or unbranched polyamide selected from (BA) n or (AB) n, the acid subunit of the amide repeat unit Is [Where m is about 2 to about 4 and X is ₁ And X ₂ Is independently a heteroatom selected from the group consisting of O, S, P or tertiary N other than O of carboxyl or carbonyl, and R ₂ Is hydrogen or acetamide. ] Is an organic acid. In these polyamides, the sulfur groups are located in the γ position with respect to each terminal carboxyl group. In a preferred embodiment of the invention, X ₁ And X ₂ Are both O. In a more preferred embodiment of the present invention, X ₁ And X ₂ Are both O 2 and m is 2. The compounds according to this aspect of the invention have several advantageous characteristics when used with therapeutic biologically active substrates. These compounds are less reactive and, after activation, allow greater control to minimize hydrolysis. This in turn optimizes ligation with protein substrates. These polyamides are also effective as oxygen radical inhibitors. In a still further embodiment of the invention where the acid X is a branched or unbranched polyamide having the formula (BA ') n or (A'-B) n, an amide repeat unit The acid subunit of the formula [Y here ₁ Is the formula, -OC- (CH ₂ ) P-NH-, wherein p is from 1 to 4 and m is from about 2 to about 4; ₁ And X ₂ Is independently a heteroatom selected from the group consisting of O, S, P or tertiary N other than O of carboxyl or carbonyl, and R ₃ Is lower alkyl having about 1 to about 2 carbon atoms. ] Is an organic acid. In a preferred embodiment of the invention, X ₁ And X ₂ Are both O. In a more preferred embodiment of the present invention, X ₁ And X ₂ Are both O, m is 2, and R ₃ Is methyl. According to the invention, A ′ is of the formula Y ₁ -A-Y ₁ Is an α, ω-diacid having Y ₁ Is the formula -OC (CH ₂ ) P-NH-, where A is the above α, ω-diacid. Any known coupling chemistry can be used to activate the polyamides of the invention for modifying, linking, polymerizing and / or conjugating substrates. Many examples of such coupling chemistry are given in "Chemistry of Protein Cnjugation and Cross-linking," S. Wong, CRC Press, Inc. (1991), which is hereby incorporated by reference. Such chemistries include synthesizing the polyamides such as dialdehydes, N-hydroxysuccinimide esters, functionalized acetals, bismaleimides, difunctional iminoesters, diepoxides, and dicarboxylic acid chlorides. It involves reacting with a bi- or polyfunctional protein reagent. The choice of coupling chemistry will depend on the substrate molecule being cross-linked, conjugated, polymerized and / or modified. The coupling chemistry should be chosen so that it does not alter the biological or chemical activity of the substrate molecule. Generally, it is necessary to use about 4 to 50 moles of polyamide per mole of substrate to modify the substrate molecule. Larger substrate molecules would require a larger proportion of polyamide. Predominantly conjugating, cross-linking or polymerizing substrates without modification is the chemistry of chemists skilled in the art to understand the chemistry of coupling agents, reactive groups on a particular substrate, substrate size, polyamide size, substrate Knowledge of concentration and general reaction parameters is required. As will be readily appreciated by one of ordinary skill in the art, substrates such as amino acids, peptides, proteins, nucleotides, polynucleotides, drugs, diagnostic agents, etc., can have unreacted functionalities of the polyamide backbone and its functionalized derivatives. It has a functional group capable of covalently bonding to a group. One of ordinary skill in the art having the benefit of this disclosure will understand synthetic approaches that can be used to covalently link a polyamide to a substrate. The order of reactions is not important. The unreacted functional groups of the polyamide can be activated appropriately if necessary and attached to the substrate. Similarly, the substrate can be attached to the polyamide with appropriate activation if necessary. For example, amino, hydroxy, carbonyl, carboxyl or thiol substituents are commonly found as part of the structure of amino acids, peptides, proteins, nucleotides, polynucleotides, and diagnostic compounds. Furthermore, polyamides can be synthesized to introduce reactive ends such as these substrates. Substrates are as follows: Bodanszky and Bodanszky, “The Practice of Peptide Synthesis”, Springer-Verlag, New York (1984), Lundblad, “Chemical Reagents for Protein Modification,” CRC Press, Boca Raton, Florida. (1991), Mosbach, "Methods in Enzymology, Volume XLIV, Immobilized Enz ymes", Academic Press, New York (1976), or Uhlmann and Peyman, "Anti sense Oligonucleotides: A New Therapeutic Princip1e", Chemical Review, Vol. 90, No. 4, p. Polyamides can be attached by chemistry as disclosed in 543-585 (June 1990). For example, biotin has been recognized as a diagnostic probe that is selectively retained by complex formation with avidin. Biotin contains a carboxyl group that can be activated as a succinimidyl ester and attached to a polyamide with an amino terminus. The other end of the polyamide can be covalently attached to a peptide, protein or other biochemical agent either before or after covalent attachment to biotin. Under these conditions, the polyamide simultaneously acts as a spacer group that maintains or increases the water solubility of the product. The biochemical agent is labeled with a diagnostic probe located at one end of the polyamide spacer, thereby facilitating interaction with avidin. Similarly, deferoxamine is a drug used therapeutically as an antidote to iron poisoning. Due to its rapid excretion via the kidneys, deferoxamine has a short duration of therapeutic action. It is recognized that if deferoxamine is conjugated to a substance with a higher molecular weight such as dextran or albumin, it will be retained in the vascular circulation for a longer period of time. According to the invention, polyamides can be used as spacer groups which at the same time maintain or increase the water solubility of the product. One end of the polyamide can be converted to a carbonyl function and attached to the amino substituent of deferoxamine by reductive amination, and the other end of the polyamide converted to an activated ester (eg, succinimidyl ester). It can be attached to albumin. This conjugation prolongs the vascular circulation persistence of the conjugated deferoxamine and the drug retains its chelating ability. All components of the polyamide of the present invention are selected to preserve water solubility. They are water soluble and hydrophilic throughout the chain. The length of the polyamide is chosen to facilitate the interaction between the substrate and the polyamide. Longer polyamides will be needed for cross-linking large substrates as it minimizes steric hindrance between the two large substrate molecules. Immunogenic substrates generally need to be highly modified and have relatively long chain polyamides. In reacting the polyamides of the present invention with biologically active substrates such as enzymes, care must be taken to avoid destroying the activity of the substrate. One of ordinary skill in the art will appreciate that varying degrees of modification and / or polymerization will allow the preparation of products with useful biological activity. The polyamides of the present invention are not polymers of α-amino acids and therefore do not undergo enzymatic hydrolysis. In addition, the polyamides of the present invention can be used to solubilize substrates in organic solvents such as methanol, ethanol or acetonitrile and the like. The polyamide of the present invention can be used as a polymerizing agent. In one example, which is fully described below, the ends of the polyamide are modified with maleimide groups suitable for reaction with thiol groups of proteins. Bis (maleimide) polyamide was used to polymerize human hemoglobin via the cysteine-β93 thiol group of the protein. Similarly, in another embodiment below, the ends of the polyamide were converted to bis (succinimidyl) esters or bisaldehydes suitable for reaction with amino groups of proteins. Both bis (succinimidyl) polyamide and bisaldehyde polyamide were used to polymerize human hemoglobin via the α-amino group of lysine residues of proteins. In another embodiment, the polyamides of the present invention can be used to attach a probe (eg, fluorescent, radioactive, etc.) to a substrate to be detected. In the examples below we have used the following nomenclature for our polyamides. That is, the letter PA is applied because the basic skeleton is polyamide. This is followed by the letter indicating the coupling group, i.e., M for maleimide and S for N-hydroxysuccinimide. The hyphen separates the alphabetic code from the approximate molecular weight. In a preferred embodiment of the invention, the polyamide is a bis (maleimidoacyl) polyamide. In a more preferred embodiment of the invention, the polyamide is bis (maleimidoglycyl) polyamide. Thus, the polyamide identified as PAM-3800 is a polyamide bis (maleimide) having a molecular weight of about 3800 daltons. Polyamide Design and Synthesis In the following examples, polyamide condensation products are characterized in three ways. Size exclusion chromatography (SEC) analysis is based on Superose ^TM It is carried out by using 12 columns and a mobile phase of 50 mM phosphate (pH 6.5) which is flown at a flow rate of 0.4 ml / min, and detection is performed at 220 nm. This analysis confirmed that a polymerized product was formed and gives an approximation of the molecular weight and molecular weight range of the components in the product mixture. Thin layer chromatography (TLC) analysis allows the separation and characterization of terminal functional groups in the product mixture. The structure of each component is assigned based on relative migration (Rf) and reactivity to ninhydrin spray reagents. Under TLC conditions, polyamides with diester end groups have the highest Rf, followed by components with monoester / monoamine end groups, followed by components with diamine end groups. Only components with amine end groups are reactive towards ninhydrin. The mono- and diester structures are confirmed by base-catalyzed hydrolysis and TLC of the product. Under these conditions, the ester is hydrolyzed to the acid and the Rf of the material is reduced. Finally, the molecular weight is evaluated by amino-terminal analysis with fluorescamine. Precisely and accurately weighed polyamide samples are analyzed by dissolving them in methanol / phosphate buffer, adding fluorescamine in acetone to derivatize and then injecting into an HPLC system equipped with a fluorescence detector. . Equivalent amounts are determined by comparison with the response to a standard solution of diaminohexane / PEG / ethyl acetate in methanol / phosphate buffer. Equivalent weights are converted to number average molecular weights based on the average number of amines per molecule. Alternatively, the NMR spectrum can be used to estimate the number average molecular weight of the polyamide as follows. That is, the first step is to divide the structure of the polyamide into end groups and repeating units. The molecular weight of each part is then calculated. The unique component in each portion is then identified and the corresponding NMR resonance for that component is correlated. Polyamides have a large number of well-resolved resonances that can be correlated with specific functional groups. For example, two pairs of two hydrogens on the succinate group in PAS-4200 give rise to (triplet) resonances with integrals of 2.197 and 2.605 units at about 2.53 and 2.92 ppm, respectively. Similarly, the internal methylene group of the butanediamine residue gives rise to a broad resonance at 1.5 ppm with an integrated area of 16.034 units. There are two succinimide residues at the end groups of the polyamide derivative. Thus, the resonance at about 2.53 ppm and that at 2.92 ppm each originated from four hydrogens. The average area response is (2.197 + 2.605) / 2 or 2.401 units per 4 hydrogens on each succinate. Similarly, the internal methylene group of the butanediamine residue contains 4 hydrogens. The observation that the integrated area of the latter resonance (16.034 units) is greater than the four hydrogen resonances for each type of succinate hydrogen indicates that there are a large number of butanediamine residues in the repeating unit of the polymer. Shows. By taking the ratio of the integrated areas (16.034 / 2.14,01 or about 7), the value of the multiple can be estimated. Therefore, there are 7 repeating groups in the polymer. The molecular weight of the polyamide is the sum of the molecular weight of each end group (416.44 and 198.14, respectively) and 7 times the molecular weight of the repeating unit (7 x 504.57 or 3532). The sum is 4146.57 or about 4200 daltons. This value was also independently obtained by end group analysis of the bisamine precursor of PAS-4200 polyamide with fluorescamine. Synthesis of PAS-2400 Example 1 (a) Polycondensation of ethylene glycol bis (methoxycarbonylmethyl) and 1,4-diaminobutane Ethylene glycol bis (methoxycarbonylmethyl) ether (EDE) (This is for each ester group And having an ether group as a substituent at the α-position) was condensed with 1,4-diaminobutane (DAB) to produce a polyamide. See FIG. Two polycondensation methods were used. That is, a solution method and a melting method. Generally, polycondensation was accomplished as follows. For the solution method, the desired molar ratios of EDE and DAB were dissolved in methanol and the solution was heated to 30 ° C. for 72 hours or 65 ° C. for 24 hours. The solvent was evaporated, the residue treated with acetone and repeatedly evaporated to remove residual methanol. Trituration of the residue with acetone gave a solid. For the melting method, the mixture of EDE and DAB was heated to 120 ° C. under vacuum with magnetic stirring to remove the methanol. After 1-2 hours, the mixture was dissolved in methanol. The solution was evaporated to dryness and the residue was triturated with acetone to give a polyamide product. Analysis of the reaction mixture by SEC confirmed that a polymerized product had formed. TLC analysis of the product (stationary phase: silica gel, eluent: 2-propanol / NH _Four OH / H ₂ O, 7: 1: 2 by volume) showed three spots with Rf values of 0.1, 0.4 and 0.7 respectively. The structures of the corresponding polyamides are based on their reactivity towards ninhydrin and base, respectively, α, ω-diaminopolyamides (designated I in the figure), α-amino-ω-ester polyamides (designated II). ), And α, ω-diester polyamide (shown as III) (FIG. 1). In addition, product III was ninhydrin negative, while products I and II were ninhydrin positive, indicating that these products have at least one primary amino group. Finally, the products II and III were hydrolyzed with dilute aqueous NaOH, whereas I was not hydrolyzed, indicating that the products II and II I have at least one ester group. The yields of these products depend on the molar ratio of DAB and EDE. A molar ratio of 1 gives I as the main product. A DAB / EDE molar ratio of greater than 1 gives polyamide II as the main product. In contrast, III became the major product when the DAB / EDE molar ratio was less than 1. The results of polycondensation of EDE and DAB are summarized in FIG. The experimental data show that the solution method at 30 ° C. produced the best α-amino-ω-ester polyamide II with a number average molecular weight (MW) of about 2400 daltons. The α, ω-diaminopolyamide I having a MW in the range of 1300 to 1500 daltons can be prepared by either the solvent method or the melting method using a DAB / EDE molar ratio of 1.3 to 1.5. The α, ω-diester polyamide III was obtained in good yield by the melting method with equimolar EDE and DAB. Since DAB is a volatile compound, DAB is gradually removed from the reaction mixture when the melting method is used, leaving a large excess of EDE. Therefore, III is obtained as the main product. Example 1 (b) Conversion of Polyamide III to Activated Crosslinker The crude diester III (FIG. 1) obtained by condensation of EDE and DAB was hydrolyzed to the corresponding diacid with dilute sodium hydroxide. did. After hydrolysis, the reaction mixture was treated with AG50W-X8 resin (BioRad) to remove sodium ions and byproducts I and II. The diacid was obtained in pure form as judged by TLC. The diacid was treated with dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) in chloroform to convert to the corresponding polyamide bis (N-hydroxysuccinimide ester) (named PAS-2400). Example 2 Polymerization of Hemoglobin with PAS-2400 A typical polymerisation of diaspirin cross-linked hemoglobin (designated DCLHb) with PAS-2400 was achieved as follows. DCLHb was made according to the method described in US Pat. No. 5,12,452. A solution of DCLHb in 0.1 M HE PES, pH about 7-8, was deoxygenated by continuous vacuum / nitrogen cycle at room temperature for 1.5 hours. PAS-2400 was dissolved in deoxygenated water and the solution was immediately added to the DCLHb solution. The reaction mixture was stirred at room temperature under nitrogen, the TSK-G400SW brand column and the TSK-G3000SW brand column were connected in a row, and the pH 6.5 2-propanol / 50 mM phosphate buffer (1: 9, v / V) was run at a flow rate of 1 ml / min and the reaction was monitored by size exclusion chromatography with detection at 280 nm. This latter method revealed that the polymerization was completed in less than 30 minutes and that the polymerization was accompanied by modifications. The solution was cooled to 5 ° C. and IM NAC (N-acetyl-L-cysteine) (NAC / Hb molar ratio about 5: 1) solution was added. The solution was stirred overnight at 5 ° C. under nitrogen atmosphere and then dialyzed against Ringer's lactate solution to give the final product. The experimental data are summarized in Figures 3, 4 and 5. Note: Among the numbers, NHS-PA 6 is another name for PAS-2400. This data shows that: The yield of oligomers increases with increasing ratio of PAS-2400 to DCLHb. The SEC elution time of DC LHb monomer decreased with increasing molar ratio of PAS-2400, indicating that PAS-2400 modifies DCLHb. Polymerization was rapid and was completed in less than 30 minutes. However, the competitive hydrolysis of polymerizing agents is also rapid. Increasing the pH of the solution results in an increase in the yield of high molecular weight polymer. For example, 5 equivalents of PAS-2400 give high molecular weight polymers of 7%, 17% and gel at pH 7.0, 7.5 and 8.0, respectively. DCLHb P polymerized with PAS-2400 ₅₀ The values and n values are 29 to 33 mmHg and 1.8 to 2.1, respectively. P ₅₀ Is the oxygen partial pressure when hemoglobin is half saturated, and the “n” value is a measure of oxygen binding cooperativity. P of human hemoglobin in erythrocytes ₅₀ Is about 28. Therefore, the excellent oxygen binding function is maintained in these polymers. RP-HPLC analysis (FIG. 5) shows that the αα- and β chains are denatured. However, the β chain appears to be more highly denatured than the αα chain. Thus, PAS-2400 can be used to produce modified polymerized DCLHb. This short reaction time (30 minutes) is convenient for large-scale synthesis. Two to four equivalents of PAS-2400 at pH 7.0 are suitable for polymerisation. The hemoglobin retains its biological activity, ie oxygen transport, and is non-immunogenic as shown below. Example 3 Method for Synthesis of Longer Polyamides Increasing the length of the components acid and amine gives longer polyamides. That is, polymerization with adipic acid (6 carbons) or 1,6-hexanediamine (6 carbons) is performed with succinic acid (4 carbons) or 1,4-butanediamine (4 carbons). Gives a longer polymer than that obtained in. However, increasing the chain length with the hydrocarbon component would reduce the water solubility of the protein. With this in mind, we have found that EDE, a diester, and two longer diamines, ethylene glycol bis (3-aminopropyl) ether (EGBE; MW176) and diethylene glycol bis (3-aminopropyl) ether (DGBE). A MW220) and a polyamide were synthesized. See FIG. The retention time of the SEC for each polyamide suggested that these products had higher molecular weights, but these products were waxy and had a low melting point. Purification of such products by crystallization is extremely difficult. To minimize these drawbacks, we combined three ideas for choosing an activated ester suitable for the synthesis of longer polyamides. First, we have identified a component that is a diacid with a β-ether bond. These diacids are easily converted to activated diesters. Our first choice of diacid was diglycolic acid. Second, we converted one end of this diacid to the amide by reacting 2 equivalents of the diacid with 1 equivalent of the diamine. This has produced new longer diacids that can be used as components for longer polyamides. The first diacid we chose was 1,4- (carboxymethoxyacetamide) butane, which was used as the activated methyl diester BMDAB (MW348). The insertion of methylene (hydrocarbon) groups reduced the flexibility of the molecule sufficiently to make it a crystalline solid, and the retention of ether bonds preserved the solubility in water. Third, we increased the length of the diamine component in a way that kept it water soluble. That is, we used ethylene glycol bis (3-aminopropyl) ether (EGBE) and diethylene glycol bis (3-aminopropyl) ether (DGBE) as diamine components in polyamide synthesis. The activated diester building block, BMDAB, was obtained in two steps (Figure 7). DAB (1,4-diaminobutane) was reacted with 2 equivalents of glycolic anhydride in N, N-dimethylformamide (DMF) to give BCAB [1,4-bis (carboxymethoxyacetic acid) in almost quantitative yield. Cetamide) butane] was obtained. The latter was esterified in methanol in the presence of aqueous HCl or HCl in dioxane solution. The advantage of using HCl in solution is that the reaction is easy to carry out, especially in large-scale synthesis, and that the correct amount of HCl can be used to avoid the formation of by-products. Gaseous HCl was tried but by-products were detected in the product mixture. In contrast to the polycondensation of EDE and DAB by the solution method, which gives α-methyl ester-ω-aminopropylamide as the main product when using a molar ratio of EDE: DAB of 1, BMDAB and EGBE or Polycondensation in equimolar amounts of DGBE or when the molar ratio of B MDAB: DGBE was greater than 1 (FIG. 8) gave a substantial amount of the mixture of three products. That is, α-ester-ω-amine (reactive to ninhydrin; hydrolyzed by base): α, ω-diamine (reactive to ninhydrin) and α, ω-diester (not reactive to ninhydrin). Unfortunately, the presence of large amounts of other products complicates purification of the desired product. However, we have found that the use of excess diamine (eg, a diamine / BMDAB molar ratio of 1.3) has the α, ω-bisamine polyamide as the major product with very little amount of monoamine by-product. Found to give. This latter method is therefore preferred for producing the polyamide backbone of the polymerizing reagent. Example 4 Conversion to Activated Polymerization Reagent Polyamide Bis (N-hydroxysuccinimide) Ester: The first attempt to synthesize polyamide bis (N-hydroxysuccinimide) ester (designated PAS-3070) was BMDAB. And a three-step synthesis from EGBE (Fig. 9). First, EGBE and BMDAB were condensed at a molar ratio of 1.3 to 1.0 by methanol using a solvent method at 65 ° C. for 24 hours to obtain a slightly orange solution. The product is decolorized activated carbon (Norit ^TM Was added to the solution, filtered, and evaporated to dryness to allow decolorization. A white product with a MW of 2700 (Fig. 9, 2a) was isolated by crystallization from methanol-acetone. The product was not stable and turned yellow during storage. Second, conversion of this white product to the corresponding bis (2-carboxyethylcarbonyl) polyamide (Figure 9, 3a) was performed with DMF (with a small amount of methanol added to enhance the solubility of 2a). Completed by reacting succinic anhydride with (2a) in. This reaction comprises bis (2-carboxyethylcarbonyl) polyamide (3a) as the major product and two minor by-products [methyl ester of (2a) and three, as identified by TLC. An unknown byproduct with a free amino group] was included to give a yellow product mixture. Therefore, the mixture is treated with sodium hydroxide to convert the methyl ester to the bis (2-carboxyethylcarbonyl) polyamide (3a) and then an ion exchange resin (AG5OW-) to absorb the polyamidoamine by-product. X8) and stirred. After removing the resin by filtration, the filtrate, which contained a single product by TLC, was concentrated. The pure product, bis (2-carboxyethylcarbonyl) polyamide (3a), was obtained by crystallization from methanol / acetone. Third, conversion of this pure product to the activated diester (4a) (designated PAS-3070) is treated with N-hydroxysuccinimide in the presence of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in DMF. Achieved by This polyamide bis (succinimide ester) was water-soluble, but the coupling group was gradually hydrolyzed. Therefore, the activated polymerizing agent was used immediately when dissolved in water. The above synthesis has several drawbacks. For example, the isolated white product (2a) is not stable. It is oxidized during storage to an unknown yellow product that cannot be easily removed by crystallization. Furthermore, recrystallization of bis (2-carboxyethylcarbonyl) polyamide (3a) in methanol / acetone will convert some of the diacid to the corresponding methyl ester. To avoid these drawbacks, our preferred synthetic strategy is as follows. First, steps 1 and 2 (FIG. 9) were carried out by immediately reacting succinic anhydride without isolating the product 3 obtained by the Norit A treatment of FIG. 9 to give an amino acid which tends to be oxidized to a colored compound. It was carried out as an integrated process, which masks the substrate. Such a “one-pot” synthesis is shown in FIG. 9 because all crude 2 converted in the above manner is used in the second step instead of the isolated 50-60% product 2. The yield of 3 was increased. In addition, the use of methanol as the crystallization solvent for 3 was eliminated, avoiding the formation of the methyl ester of 3. Example 5 Synthesis of PAS-4200 PAS-4200 (FIGS. 9, 4b) was prepared using the integration approach described above. Example 6 Conversion to Activated Polymerizing Agent Polyamide Bis (Maleimide Propionate) The synthesis of polyamide bis (maleimide propionate) (designated PAM-4080) is summarized in FIG. Achieved as a one-step, two-step synthesis. BMDAB and DGBE were heated in refluxing methanol for 24 hours and then decolorized with Norit A to give crude polyamide bisamine (FIGS. 10 and 2B), which was immediately converted into N-hydroxysuccinimide-3-maleimide propionate. Treatment with (SMP, FIGS. 10, 5) provided 6b. The first attempt to carry out a subsequent step by mixing 2b and 5 in chloroform in the presence of triethylamine in a molar ratio of 1: 2 gave a high molecular weight product. Since SMP is a bifunctional crosslinker, it was able to polymerize 2b under these conditions. Increasing the molar ratio of SMP / 2b to 4.5 and slow addition of 2b in chloroform containing triethylamine to the SMP solution in chloroform eliminated the polymerization of 2b by SMP. Thus, the crude 6b obtained in this procedure was mixed with a cation exchange resin (AG 50W-X8) to remove unreacted polyamidoamine, and this purified polyamide polymerizing agent 6b (PAM- 4080) was obtained by crystallizing the crude product from methanol / acetone. In contrast to PAS derivatives, PAM derivatives are stable in water. Example 7 Polymerization of DCLHb with Polyamide Polymerization Reagent A typical polymerization of DCLHb with a PAS derivative of the type described in Examples 4 and 5 or with a PAM derivative of the type described in Example 6 above is , Achieved as follows. A solution of DCLHb (10 g / dl for PAS, 20 g / dl for PAM) was deoxygenated by a continuous vacuum / nitrogen cycle for 1.5 hours at room temperature. The polyamide reagent in deoxygenated water was immediately added to this DCLHb solution. The reaction mixture was stirred at room temperature under nitrogen and the reaction progress was followed by SEC. Polymerization was completed in 2-3 hours for the PAS derivative and overnight for the PAM derivative. The reaction mixture was cooled to 5 ° C., the pH of the solution was adjusted to 8.0 with 1 mol of HEPES (pH 9.0), and the pH of 1M N-acetyl-L-cysteine (NAC / DCLHb molar ratio was 5). ) Solution was added. The solution was stirred under nitrogen at room temperature overnight and dialyzed against Ringer's lactate solution to give the final product. The experimental results are summarized in Figures 11-18. Polymerization of DCLHb with an activated ester PAS derivative can be summarized as follows. (A) The degree of polymerization and the yield of oligomers increased with the molar ratio of PAS used. (B) At the same time as the molar ratio of the PAS used was increased, the elution time of the DCLHb monomer was shortened, which suggests that the modification of DCLHb by PAS is occurring. (C) Polymerization was rapid and was completed within 2-3 hours. (D) The SEC profiles of the polymerized products obtained by using 5 equivalents of PAS-3070 and 3 equivalents of PAS-4200 are very similar. This reveals that longer reagents facilitate the polymerisation of DCLHb. (E) 4 equivalents of PAS-3070 and 2.5 equivalents of PAS-4200 gave the best product mixture in these experimental conditions. (F) PAS derivative is P of DCHLb ₅₀ Does not affect the value. That is, P of the polymerized product ₅₀ Values ranged from 29 to 36 mmHg. (G) RP-HPLC analysis (FIG. 13) shows that both β- and αα chains are denatured by PAS, but αα chains are less so than β chains. DCLHb polymerisation of PAM derivatives can also be summarized. (A) As was true for PAS derivatives, the yield of oligomers increases with the number of molar equivalents of PAM used. (B) The elution time of the monomer decreased with the number of molar equivalents of PAM used. Therefore, it seems that modification of DCLHb by PAM is occurring. (C) Two equivalents of PAM give the best product mixture. (D) The RP-HPLC profile (Figure 15) suggests that the reagents reacted specifically. A distinct β'-peak, which may be the modified β-peak, was detected in all tested proportions of PAM. The specific reaction with the subunit is also supported by the reduction of titratable thiol residues. The reagent PAM is expected to bind specifically to the cysteine-β93 residue, and when 1 and 2 equivalents of PAM are used, about 65 and 90% of the thiol groups are denatured, respectively. (E) The attachment of PAM to cysteine residues is linked to the polymerized product P ₅₀ Results in a reduction of the value to 18-20 mm Hg. (F) The αα chain is also modified, but to a much lesser extent than the β chain. BIOLOGICAL TESTS In Examples 8 to 12, we inhibit the polyamide PAM-4200 by reaction with N-acetyl-L-cysteine, and a sterile, non-pyrogenic polyamide (PAM- 4080) The solution was tested. The polyamide concentration was 5 g / dl in the solution. The pH of the polyamide solution was adjusted to physiological values. The osmolarity of the solution was within the physiological range. The concentration of the polyamide was chosen to be at least an order of magnitude greater than the planned use level. Example 8 In vitro exposure of isolated mammalian cells CCL 1 NCTC 929 (a clone of the mouse connective tissue L cell line) was aseptically cultured in sterile medium until confluent. The concentration of L-929 cells is about 1.3 × 10 ^Five Cells / ml and transferred aliquots to wells of tissue culture plates. The plate was covered and incubated for about 24 hours. The culture medium was then aspirated from each well and a partial volume of the test item solution and dilutions with PAM-4080 concentrations of 2.5 and 1 g / dl were added to each two wells of the prepared plate. It was After incubation of the plates for approximately 48 hours, wells were stained with 2% crystal violet stain. Toxicity was graded on a scale of 0 to 4+. Here a grade of 0 corresponded to the presence of separated intracytoplasmic granules and the absence of cell lysis, and a grade of 4+ corresponded to almost complete destruction of the cell layer. At the highest concentration, a moderate toxicity grade of 2+ was met. At the two lower concentrations, a toxicity rating of 0 was met, that is, the polyamide did not provoke an adverse biological response. No toxicity was observed at these lower doses and moderate toxicity was observed at the highest dose. Thus, the polyamides of the present invention are expected to be non-toxic when administered as a conjugate of therapeutically useful substrates. Example 9 Acute Toxicity in Rodents Male Sprague-Dawley rats were injected into the tail vein with 500 or 1500 mg / kg body weight of suppressed PAM-4080 at a rate of 1 ml / kg / min. Each test group consisted of 6 animals, 6 untreated animals served as controls. All animals were monitored for over 72 hours for signs of overt toxicity, but none were observed. The animals were sacrificed. No evidence of toxicity was found at necropsy. Tissues from liver, kidney, lung were subjected to histopathological analysis. No adverse histopathological findings were observed. Example 10 Compatibility with human erythrocytes To determine the biocompatibility of PAM-4080 with human erythrocytes, a polyamide stock solution was diluted 5-fold with Ringer's lactate solution. An aliquot of this preparation was mixed with an equal volume of heparinized human blood, gently agitated, and placed in an incubator (37 ° C) overnight. After a 16 hour incubation time, a 100 μl aliquot of the supernatant was taken from the top of the test sample. Care was taken not to disturb the sedimented red blood cells below. The aliquot was mixed with 5000 μl of SEC moving layer, filtered through a 0.2 μm pore size filter and Su perose for SEC analysis of native hemoglobin. ^TM 12 columns were injected. This experimental data showed that less than 0.1% hemolysis occurred. This amount was considered negligible. Example 11 Compatibility with Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (Monocytes) The potential of PAM-4080 to induce leukocyte activation was evaluated. The polyamide stock solution was diluted 5 times with the Ringer's lactate solution. An aliquot of this preparation was mixed with an equal volume of peripheral blood mononuclear cell preparation and gently stirred. Aliquots of this test preparation were taken and diluted with trypan blue. Toxicity was determined by microscopically detecting cells that were unable to eliminate the dye. Percent viability was measured by the live / dead cell ratio. PAM-4080 did not reduce any viability. The rest of the test preparation was placed in an incubator (37 ° C) overnight. After a 16 hour incubation period, cytokines were analyzed by pipetting aliquots of the sample into microtiter wells and quantifying by ELISA. The measured concentrations of tumor necrosis factor (TNF), interleukin-1β and interleukin-6, did not differ from those found by exposing human monocytes to Ringer's lactate solution. Therefore, PAM-4080 is compatible with human monocytes. Example 12 Compatibility of PA-DCLHb with human peripheral blood mononuclear cells (monocytes) The potential of polyamide modified and polymerized DCLHb (PA-DCLHb) for cytokine production by human monocytes was evaluated. Lactated Ringer's solution was used as a control item. The test items were seven different preparations of PA-DCLHb in Ringer's lactate solution. Test and control solutions were made by mixing aliquots of each of the test and control products with an equal volume of peripheral blood mononuclear cell preparation. After incubating the resulting test and control solutions at 37 ° C. for about 16 hours, aliquots of each sample were transferred to wells of separate microtiter plates for tumor necrosis factor (TNF), interleukin-1β and interleukin. The concentration of -6 was quantified by ELISA. The measured concentrations of each cytokine are shown in the table below. This experimental data shows that TNF, interleukin-1 (IL-1), and interleukin-6 (IL-6) have low induction and in some cases are comparable to Ringer. Taken together, PA-DCLHb appears to be very compatible with human monocytes. Example 13 Induction of Cytokines by PAS-DCLHb Six PAS-DCLHb product mixtures were subjected to cytokine testing. The selected product was prepared by polymerizing 3 g / dl DC LHb in 0.1 M HEPES buffer at pH 7.0. Each sample was diluted to a DCLHb concentration of approximately 1 g / dl and END-X ^TM It was passed through an endotoxin removal filter. The filtrate was tested for cytokine induction using the method described in Example 12. PAS-DCLHb (3: 1) is the least modified and polymerized product mixture, whereas PAS-DCLHb (10: 1) is the most extensively modified and polymerized product mixture. . The degree of modification and polymerisation increased with the molar ratio of PAS used. However, both PAS-Hb products had low TNF and IL-1 responses regardless of the extent of modification and polymerization. None of the samples showed an IL-6 response. Example 14 Synthesis of Thio-Containing Polyamide Five experimental parameters were investigated as part of this work. That is, (1) molar ratio of monomers (diester and amine), solvent, reaction temperature, order of mixing, and method for isolating product. The purpose of these studies was to identify reaction conditions that reproducibly maximize the yield of polymers with a particular molecular weight. The molar ratio of diester to diamine varied from 1: 1 to 1: 1.4. Solvents tested included chloroform and DMF. The basic catalyst was varied from 2,6-lutidine (moderate base) to triethylamine (strong base) and without catalyst. The temperature ranged from -50 ° C to room temperature (about 23 ° C). The diester was added to the amine or vice versa. The rate of mixing was controlled by varying the rate of stirring the solution, by varying the rate of addition, or by controlling the solubility of one of the components (the diester). It has been found that the conversion of polyamide bis (diamine) to polyamide bis (succinate) facilitates product isolation and improves polymer yield. As a result of this study, polycondensation of TBB (3,3-thiodipropionate active ester) with DGBE [diethylene glycol bis (3-aminopropyl ether); diamine] under the conditions listed in the table was carried out. , Water soluble polyamides having molecular weights of about 2800 and 5700 have been found to be selectively produced. In each case, the polycondensation reaction took 4 to 24 hours, depending on the scale, and the yield of polyamide was almost 50% or higher. table. Optimal Conditions for Polycondensation of TBB and DGBE to Obtain Water-Soluble Polyamide with Specific Molecular Weight Synthesis of Diphenyl (2,3-hydridro-2-thioxo-3-benzoxazoyl) phosphonate (DDTBP) 1 l in toluene To a solution of 2-mercaptobenzoxazole (251.6g, 1.66mole) and triethylamine (191.4g, 1.89mole) at room temperature with stirring, diphenyl chlorophosphate (505.1g, 1.88mole) in 400ml of toluene was added. Added to the solution. After the addition was complete, the solution was stirred for an additional 1.5 hours, during which time precipitation occurred. Thin layer chromatographic analysis (TLC; silica gel; eluent: ethyl ether / hexane, 1: 1, v / v) of the reaction mixture showed the reaction was complete. Solids were removed by filtration and washed with toluene (3 x 100 ml). The filtrates were combined and evaporated to an oil. This oil was dissolved in 500 ml of chloroform and the resulting solution was heated to reflux temperature for about 1 hour. The solution was passed through a pad of silica gel. The pad was washed with chloroform until TLC analysis of the filtrate showed complete elution of the product from silica gel. Evaporation of this chloroform solution left the desired product as a solid. Hexane (1.5 l) was added, the solid was collected by filtration and dried under vacuum. This product, 582.0 g of a white solid identified by the acronym DDTBP, was characterized by a melting point of 80-83 ° C. (uncorrected) and the following NMR resonances. ¹ H-NMR (CDCl ₃ ): 7.21 (m, 4), 7.35 (m, 9) and 7.91 (m, 1) ppm ¹³ C-NMR (CDCl ₃ ): 109.9 (s, C9), 114.8 (s, C8), 120.1-120.3 (overlapping singlets, C2), 125.5 (s, C7), 126.3 (s, C10), 129.9 -130.0 (overlapping singlets, C3) ), 147.5 (s, C5), 149.5 (s, C1) and 180.2 (s, C11) ppm ³¹ P-NMR (CDCl ₃ ):-16.17 ppm (with minor impurities at -8.9 ppm) Synthesis of N, N '-(3,3'-thiodipropionyl) bis (benzoxazoline-2-thione) (TBB) in chloroform (20 ml) DDTBP (4.22 g, 11 mmol) was added to a stirred solution of 3,3'-thiodipropionic acid (891 mg, 5 mmol) and triethylamine (1.5 ml). The solution was stirred at room temperature and monitored by TLC (silica gel; eluent: ethyl ether / hexane, 1: 1, v / v). Over time the product began to precipitate out of solution. Methanol (100 ml) was added to facilitate complete precipitation of the product, isolated by filtration and air dried. About 1.7 g (76% of theory) of the product, N, N '-(3,3'-thiodipropionyl) bis (benzoxazoline-2-thione) or TBB, melting point 147-149 ° C (uncorrected) Was obtained as a white solid with. ¹ H-NMR (CDCl ₃ ): 3.07 (t, H1), 3.89 (t, H2), 7.27, 7.32, 7.37 (H4, H5, H6) and 8.08 (t, H3) ppm ¹³ C-NMR (CDCl ₃ ): 22.65 (C2), 39.91 (C1), 109.58, 116.4 (C4, C5), 125.5, 126.7 (C3, C6), 129.6 (C8), 146.41 (C7), 172.22 (C10) and 178.46 (C9) approx. Synthesis of PATS-2800, a water soluble polyamide having a number average molecular weight of 2800 daltons. While adding a solution of DGBE (3.17 g, 1.4 mmol; molar ratio to TBB 1.2: 1) in 12 ml of chloroform in 60 ml of chloroform. Of TBB (5.34 g, 12 mmol) was stirred at moderate speed while cooling to 0 ° C. in an external ice bath. The resulting mixture was stirred at 0-5 ° C for 15 minutes, then the ice bath was removed. Stirring was continued overnight at room temperature. Thin layer chromatography showed that polyamide bis (amine) had formed. A solution of succinic anhydride (850 mg) in 3 ml DMF was added to the polymer solution until thin layer chromatographic analysis showed that all the polyamide bis (amine) had been converted to the corresponding polyamide bis (carboxylic acid). It was Volatile materials were removed from the reaction mixture by evaporation to dryness under vacuum and the residue was dissolved in 20 ml DMF. Volatile material was removed by evaporation under vacuum. The residue was dissolved in a second, 20 ml portion of DMF. Ethyl acetate was slowly added to the resulting solution. Precipitation of the product appeared complete after the addition of about 300 ml of ethyl acetate. The product was collected by filtration, washed with ethyl acetate and dried under high vacuum. About 2.27 g (47% of theory) of a water-soluble polyamide (indicated by the acronym PATS) having a number average molecular weight of 2800 daltons (based on NMR analysis) and a size exclusion chromatography (SEC) retention time of 38.8 minutes. Was obtained. Synthesis of activated water-soluble polyamide PATSS-2800 having a number average molecular weight of about 2800 daltons. To a stirred solution of PATS-2800 (1.96 g, 0.7 mmol) in a mixture of 10 ml DMF and 30 ml chloroform, N, N'-Disuccinimidyl carbonate (1.18 g, 6.42 mmol) was added. The mixture was stirred at room temperature and the reaction was TLC (silica gel; eluent: CHCl. ₃ / MeOH / NH _Four OH / H ₂ O, by volume, 10: 3: 0.2: 0.2,). After 3.5 hours, the reaction mixture was filtered to remove insoluble material. The filtrate was concentrated to dryness under vacuum. The residue was dissolved in 15 ml DMF and the solution was slowly diluted with ethyl acetate (300 ml) to precipitate the product bis (N-oxysuccinimidyl) polyamide dicarboxylate. It is identified by the acronym PATSS-2800. The product (1.52 g, 77% yield) was isolated by filtration and dried under vacuum. ¹ H-NMR (CDCl ₃ ): 1.71 (m, Hb); 2.89 (m, Hg); 2.52 (t, Hs or Ht); 2.76 (m); 2.78 (Hf, Hh); 2.90 (t, Hs or Ht); 3.27 (m , Ha); 3.47-3. 57 (m, Hc, Hd); 6.78 (CONH) ppm ¹³ C-NMR (CDCl ₃ ): 25.5 (Cr); 26.7; 30.3 (Cs, Ct); 27.7 (Cg); 28.9 (Cb); 36.4 (Cf); 37.5 (Ca); 69.5; 69.9; 70.3 (Cc, Cd); 168.1 , 169.0; 169.8; and 171.2 (C = 0) ppm (Note: not all resonances have been correlated to a particular structural site.) The absorption assignment is based on a number average molecular weight of the polymer of about 2800 daltons. Showed that there is. Synthesis of PATS-5700, a water soluble polyamide having a number average molecular weight of about 5700 daltons. To a slurry of TBB (5.34 g, 12 mmol) in 60 ml of DMF, stirred at a moderately slow rate, in 6 ml of DMF. Of DGBE (3.44 g, 1.68 mmol, 1.3: 1 molar ratio to TBB) was added. The solid gradually dissolved and the mixture warmed. The resulting solution was stirred at room temperature overnight. A precipitate gradually separated from the solution. The precipitate (2.44 g, about 47% of theory) was isolated by filtration and found to have a SEC retention time of about 35.8 minutes and was found by TLC to yield a polyamide monoamine monocarboxylate having an average molecular weight of about 5700 daltons. Was characterized. The filtrate was found to contain a polymer with a SEC retention time of about 38.6 minutes (1.14 g, 22% of theory). (Ie, the polyamide bis (amine) had a number average molecular weight of about 2800 daltons.) Synthesis of PATSS-5700, an activated water soluble polyamide having a number average molecular weight of about 2800 daltons. 2.44 g) was dissolved in 60 ml chloroform and about 3 ml methanol was added to ensure complete dissolution. Volatile components were removed under vacuum to ensure complete removal of residual DMF. The solid was dissolved in a second 60 ml portion of chloroform. To the resulting solution was added succinic anhydride (108 mg) in 1 ml DMF. The reaction was monitored by TLC. Stirring was continued until all of the polyamidoamine was converted to polyamidobis (carboxylic acid). To this solution, triethylamine (about 400 μl), 10 ml DMF and 730 mg N, N′-disuccinimidyl carbonate were added sequentially. The mixture was stirred at room temperature and the reaction was followed by TLC. After 2.5 hours, the volatile materials were removed under vacuum and the remaining solid was dissolved in 10 ml DMF. The solution was slowly diluted with ethyl acetate (100 ml) to precipitate the product bis (N-oxysuccinimidyl) polyamide dicarboxylate. It is identified by the acronym PATSS-5700. About 2.36 g of product was isolated by filtration and vacuum drying. ¹³ C-NMR (CDCl ₃ ): 25.5 (Cr); 26.8; 30.4 (Cs, Ct); 27.7 (Cg); 29.0 (Cb); 36.5 (Cf); 37.6 (Ca); 69.6; 70.0; 70.4 (Cc, Cd); 168.2 , 169.1; 169.9; and 171.3 (C = 0) ppm (Note: not all resonances have been correlated to a particular structural site.) The absorption assignment is based on a number average molecular weight of the polymer of about 5700 daltons. Showed that there is. As will be immediately appreciated, numerous variations and combinations of the invention presented above can be used without departing from the invention presented in the claims. All such modifications are intended to be included within the scope of the following claims.

Claims

[Claims] 1. formula, I Y-A-X-Y II Z-B-X-Z III Y-X-Z [(A) Here, the terminal Y is OH or a carboxylic connecting group, (B) where the terminal Z is hydrogen or is a linking group attached to an amino group. Yes, and (C) where X is (BA) n, (AB) n, and the central polyacid, poly Formed by linking (BA) n or (AB) n to an amine or polyamino acid A branched polyamide formed, a polyamide selected from: (D) where A is α, ω-diacid, B is α, ω-diamine, and n is Is the number of amide repeat units in the polyamide, and (E) where the acid subunit of the amide repeat unit has the formula —NH—R₁-NH- [R here₁Is a substituted or unsubstituted fat having from about 4 to about 5 carbon atoms. It is an aliphatic chain. ] Crosslinked by a water-soluble diamine each having 15 in the chain Having one or fewer atoms and being present as a substituent on or in the chain From a group consisting of O, S, P or tertiary N other than carboxyl, carboxyl or carbonyl Two or more organics with one or more heteroatoms selected Is an acid, and (F) where the amine subunit in the amide repeat unit is Has at least one primary amino group and has 15 or fewer atoms in the chain and A carboxyl or carboxylic acid present as a substituent on the chain or as an atom in the chain. One or more heptagons selected from the group consisting of O, S, P or N other than rubonyl. An organic, water-soluble amine having a terror atom, and (G) Here, n is 2 to about 100. ] Water-soluble selected from the group consisting of Sexually, substantially non-immunogenic polyamides. 2. The formula-NH-R₁The water-soluble diamine having —NH— is 1,4-diamino The polyamide of claim 1, which is butane. 3. The central polyacid, polyamid, forms a branched, water-soluble polyamide. Or two or more of claims 1 or 2 linked by an amino acid or a polyamino acid. Many polyamides. 4. Proteins, polypeptides, polynucleosides including enzymes, haptens and antibodies Diagnostic or therapeutic life selected from the group consisting of tides, steroids, and carbohydrates The polyamide of claim 1 or 2 reacted with a substrate having physical activity, comprising: The products of the reaction are water-soluble, substantially non-immunogenic and biological of the substrate. A polyamide which retains a diagnostically or therapeutically useful amount of activity. 5. Contains proteins, polypeptides, including enzymes, haptens and antibodies A diagnostic or therapeutic agent selected from the group consisting of A polyamide according to claim 1 or 2 which is modified with a biologically active substrate. , The product of said modification is water-soluble, substantially non-immunogenic and the organism of said substrate Having a diagnostically or therapeutically useful amount of biological activity, a polyamide . 6. Contains proteins, polypeptides, including enzymes, haptens and antibodies A diagnostic or therapeutic agent selected from the group consisting of The method according to claim 1 or 2, wherein two or more biologically active substrates are cross-linked. A polyamide, the product of said cross-linking being water-soluble, substantially non-immunogenic And that retains a diagnostically or therapeutically useful amount of the biological activity of the substrate Is a polyamide. 7. Contains proteins, polypeptides, including enzymes, haptens and antibodies A diagnostic or therapeutic agent selected from the group consisting of A polymerized polymer of three or more biologically active substrates. Is a polyamide of 2, wherein the product of the polymerisation is water-soluble and substantially immiscible. Epidemiological and retains a diagnostically or therapeutically useful amount of the biological activity of the substrate Polyamide is what we are doing. 8. A polyamide according to claim 1 or 2 which modifies the product of claim 7. 9. A polyamide according to claim 1 or 2 which modifies the product of claim 6. 10. The substrate is a hemoglobin molecule and the polyamide is bis (maleimide). The product of claim 7, which is an acyl) polyamide. 11. The substrate is a hemoglobin molecule and the polyamide is bis (N-oxa). -A succinimidyl) polyamide. 12. Water soluble, fruit having a number average molecular weight of about 300 to about 20000 g per mole. Qualitatively non-immunogenic branched or linear polyamides Wherein each repeating unit comprises from 1 to about 100 amide repeating units, (A) Formula-NH-R₁-NH- [R here₁Has from about 4 to about 5 carbon atoms A substituted or unsubstituted aliphatic chain. ] With a water-soluble diamine Bridged by, each having 15 or fewer atoms in the chain and substitution on the chain Existing as a group or in the chain, other than carboxyl or carbonyl, O, S, P Or having one or more heteroatoms selected from the group consisting of tertiary N Containing a water-soluble organic acid, and (B) As an amide, (C) separating at least one primary amino group from the amide functional group in the polyamide. Water-soluble organic amine subunits having 15 or fewer atoms separated Is covalently linked to polyamide. 13. Dialdehyde, N-hydroxysuccinimide ester, activated Ester, functionalized acetal, bismaleimide, difunctional iminoester 2-or multi-functional selected from the group consisting of dicarboxylic acid, diepoxide and dicarboxylic acid chloride By reacting the polyamide with a potent protein reagent, the terminal Y and the terminal The polyamide of claim 1, wherein Z is independently activated. 14. formula, I Y-A-X-Y II Z-B-X-Z III Y-X-Z [(A) Here, the terminal Y is OH or a carboxylic connecting group, (B) where the terminal Z is hydrogen or is a linking group attached to an amino group. Yes, and (C) where X is (BA) n, (AB) n, and the central polyacid, poly Formed by linking (BA) n or (AB) n to an amine or polyamino acid A branched polyamide formed, a polyamide selected from: (D) where A is α, ω-diacid, B is α, ω-diamine, and n is Is the number of amide repeat units in the polyamide, and (E) wherein the acid subunit of the amide repeat unit has the formula: [Where m is about 2 to about 4 and X₁And X₂Independently, carboxyl or A heteroatom selected from the group consisting of O, S, P or N other than rubonyl, Then R₂Is hydrogen or acetamide. ] An organic acid having (F) wherein the amine subunit in the amide repeat unit is at least one Having a primary amino group and having 15 or fewer atoms in the chain and a position on the chain Carboxyl or carbonyl O present as a substituent or as an atom in the chain , Having one or more heteroatoms selected from the group consisting of S, P or N Is an organic, water-soluble amine, and (G) Here, n is 2 to about 100. ] Water-soluble selected from the group consisting of , A substantially non-immunogenic polyamide. 15. The X₁And X₂15. The polyamide of claim 14, wherein both are S. 16. The X₁And X₂15. The polyamide of claim 14 wherein both are O. 17． m is 2 and the X₁And X₂15. The polyre according to claim 14, wherein both are O. Mid. 18. The central polyacid, polyacylamide, forms a dexterous, water-soluble polyamide. Two of claims 14 or 17, linked by a min or polyamino acid, or More polyamide. 19. Proteins, polypeptides, polynucleotides including enzymes, haptens and antibodies Diagnostic or therapeutic selected from the group consisting of octides, steroids, and carbohydrates A polyamide according to claim 14 or 17 reacted with a biologically active substrate. The product of the reaction is water soluble, substantially non-immunogenic and A polyamiine which retains a diagnostically or therapeutically useful amount of a physical activity. De. 20. Proteins, polypeptides, probes including enzymes, haptens and antibodies Diagnostic or therapeutic selected from the group consisting of polynucleotides and carbohydrates 18. A polyamide according to claim 14 or 17, which has been modified with a substrate having different biological activities. Wherein the product of said modification is water-soluble, substantially non-immunogenic and said substrate Of a biologically active substance, which retains a diagnostically or therapeutically useful amount of Amide. 21. Proteins, polypeptides, probes including enzymes, haptens and antibodies Diagnostic or therapeutic selected from the group consisting of polynucleotides and carbohydrates 15. Crosslinking two or more substrates having different biological activities. 17 Polyamides, the product of said cross-linking being water-soluble and substantially non-immunogenic And retains a diagnostically or therapeutically useful amount of the biological activity of the substrate. It is a polyamide. 22. Proteins, polypeptides, probes including enzymes, haptens and antibodies Diagnostic or therapeutic selected from the group consisting of polynucleotides and carbohydrates 3. Polymerizing 3 or more substrates with different biological activities. 4 or 17 polyamide, wherein the product of the polymerisation is water-soluble, substantially Non-immunogenic and diagnostically or therapeutically useful amount of the biological activity of the substrate Is a polyamide that holds. 23. Polyamide according to claim 14 or 17, which modifies the product of claim 22. . 24. Polyamide according to claim 14 or 17, which modifies the product of claim 21. . 25. The substrate is a hemoglobin molecule, and the polyamide is bis (maleimi). 24. The product of claim 23 which is a doacyl) polyamide. 26. The substrate is a hemoglobin molecule and the polyamide is bis (N-oxy). The product of claim 23 which is a succinimidyl) polyamide. 27. It has a number average molecular weight of about 300 to about 20000 g per mole. A water-soluble, substantially non-immunogenic branched or linear polyamide, comprising: 1 to about 100 amide repeat units, each repeat unit comprising: Formula (a) [Where m is about 2 to about 4 and X₁And X₂Independently, carboxyl or A heteroatom selected from the group consisting of O, S, P or N other than rubonyl, Then R₂Is hydrogen or acetamide. ] An organic acid having (B) As an amide, (C) separating at least one primary amino group from the amide functional group in the polyamide. Water-soluble organic amine subunits having 15 or fewer atoms separated Is covalently linked to polyamide. 28. Dialdehyde, N-hydroxysuccinimide ester, activated Ester, functionalized acetal, bismaleimide, difunctional iminoester 2-or multi-functional selected from the group consisting of dicarboxylic acid, diepoxide and dicarboxylic acid chloride By reacting the polyamide with a potent protein reagent, the terminal Y and the terminal 18. The polyamide of claim 14 or 17, wherein Z is independently activated. 29. formula, I Y-A-X-Y II Z-B-X-Z III Y-X-Z [(A) Here, the terminal Y is OH or a carboxylic connecting group, (B) where the terminal Z is hydrogen or is a linking group attached to an amino group. Yes, and (C) where X is (B-A ') n, (A'-B) n, and the central polyacid, To connect (B-A ') n or (A'-B) n to a polyamine or polyamino acid Thus a branched polyamide formed, a polyamide selected from the group consisting of And (D) where B is α, ω-dimian and n is the amide repeat in the polyamide Is the number of units, and A'is an expression, [Y here₁Is the expression, -OC- (CH₂) P-NH- (Where p is 1 to about 4), m is about 2 to about 4 and X₁And X₂Are independently carboxyl or cal Heteroatoms selected from the group consisting of O, S, P other than O of bonyl or tertiary N And R₃Is lower alkyl having from about 1 to about 2 carbon atoms . ], Α-ω-di Is an acid, (E) wherein the amine subunit in the amide repeat unit is at least one Having a primary amino group and having 15 or fewer atoms in the chain and a position on the chain Other than carboxyl or carbonyl, present as a substituent or as an atom in the chain Having one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, S, P or N of Is an organic, water-soluble amine, and (F) where n is 2 to about 100. ] Water-soluble selected from the group consisting of A substantially non-immunogenic polyamide. 30. The X₁And X₂Are both O, m is 2, and R₃Is methyl 30. The polyamide of claim 29. 31. The central polyacid, polyacylamide, forms a branched, water-soluble polyamide. 31. The two or more of claim 29 or 30, linked by a min or poly amino acid. Is more polyamide. 32. Proteins, polypeptides, polynucleotides including enzymes, haptens and antibodies Diagnostic or therapeutic selected from the group consisting of octides, steroids, and carbohydrates 31. The polyamide of claim 29 or 30 reacted with a biologically active substrate. The product of the reaction is water soluble, substantially non-immunogenic and A polyamiine which retains a diagnostically or therapeutically useful amount of a physical activity. De. 33. Proteins, polypeptides, probes including enzymes, haptens and antibodies Diagnostic or therapeutic selected from the group consisting of polynucleotides and carbohydrates 31. The polyamide according to claim 29 or 30, which has been modified with a substrate having various biological activities. The product of the modification is , Water-soluble, substantially non-immunogenic and diagnostic of the biological activity of the substrate. Is a polyamide that retains a therapeutically useful amount. 34. Proteins, polypeptides, probes including enzymes, haptens and antibodies Diagnostic or therapeutic selected from the group consisting of polynucleotides and carbohydrates 30. Crosslinking two or more substrates having different biological activities. 30 polyamides, the product of said cross-linking being water-soluble and substantially non-immunogenic And retains a diagnostically or therapeutically useful amount of the biological activity of the substrate. It is a polyamide. 35. Proteins, polypeptides, probes including enzymes, haptens and antibodies Diagnostic or therapeutic selected from the group consisting of polynucleotides and carbohydrates 3. Polymerizing 3 or more substrates with different biological activities. 9 or 30 polyamides, the product of the polymerisation being water-soluble, substantially Non-immunogenic and diagnostically or therapeutically useful amount of the biological activity of the substrate Is a polyamide that holds. 36. The polyamide of claim 29 or 30, which modifies the product of claim 35. . 37. 35. The polyamide of claim 29 or 30, which modifies the product of claim 34. . 38. The substrate is a hemoglobin molecule and the polyamide is bis (maleimide). 36. The product of claim 35 which is an acyl) polyamide. 39. The substrate is a hemoglobin molecule and the polyamide is bis (N-oxa). -Succinimidyl) polyamide. Product of. 40. Water soluble, fruit having a number average molecular weight of about 300 to about 20000 g per mole. Qualitatively non-immunogenic branched or linear polyamide, 1 to about 100 Amide repeating units of Formula (a) [Y here₁Is the expression, -OC- (CH₂) P-NH- (Where p is 1 to about 4), m is about 2 to about 4 and X₁And X₂Are independently carboxyl or cal Heteroatoms selected from the group consisting of O, S, P other than O of bonyl or tertiary N And R₃Is lower alkyl having from about 1 to about 2 carbon atoms . ] Containing a water-soluble organic acid, (B) As an amide, (C) separating at least one primary amino group from the amide functional group in the polyamide. Water-soluble organic amine subunits having 15 or fewer atoms separated Is covalently linked to polyamide. 41. Dialdehyde, N-hydroxysuccinimide ester, Activated ester, functionalized acetal, bismaleimide, difunctional Selected from the group consisting of iminoesters, diepoxides and dicarboxylic acid chlorides By reacting the polyamide with a 2- or polyfunctional protein reagent, 31. The polya according to claim 29 or 30, wherein the end Y and the end Z are independently activated. Mid. 42. formula, I Y-A-X-Y II Z-B-X-Z III Y-X-Z [(A) Here, the terminal Y is OH or a carboxylic connecting group, (B) where the terminal Z is hydrogen or is a linking group attached to an amino group. Yes, and (C) where X is (B-A ') n, (A'-B) n, and the central polyacid, To connect (B-A ') n or (A'-B) n to a polyamine or polyamino acid Thus, a branched polyamide formed, a polyamide selected from the group consisting of And (D) where B is α, ω-diamine and n is the amide repeat in the polyamide Is the number of units, and A'is an expression, Y₁-A-Y₁ [Y here₁Is of the formula -OC- (CH₂) P-NH- (where p is from 1 to about 4) ), And A is an acid subunit of an amide repeat unit of the formula- NH-R₁-NH- (R here₁Is substituted having from about 4 to about 5 carbon atoms Or unsubstituted aliphatic chain Is. Crosslinked by a water-soluble diamine with 15 each in the chain or Cal, which has fewer atoms and is present as a substituent on or in the chain. Selected from the group consisting of O, S, P or tertiary N other than voxyl or carbonyl Having two or more organic acids having one or more heteroatoms It is a subunit that does. [Alpha], [omega] -diacid having (E) wherein the amine subunit in the amide repeat unit is at least one Having a primary amino group and having 15 or fewer atoms in the chain and a position on the chain Other than carboxyl or carbonyl, present as a substituent or as an atom in the chain Having one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, S, P or N of Is an organic, water-soluble amine, (F) where n is 2 to about 100. ] Water-soluble selected from the group consisting of Sexually, substantially non-immunogenic polyamides.