【発明の詳細な説明】
農業用生体制御剤
発明の分野
この発明は農業用生体制御剤（biocontrol agent）に関する。
従来技術
園芸用の常套の生体制御剤については、ホイップス（Ｊ．Ｍ．Whipps）の論文
「園芸における生物的感染制御の現状」［Biocontrol Sci ＆ Technol、第２巻
、第３頁〜第２４頁（１９９２年）］に要約されている。この論文においては、
野菜、果物、観賞植物、花および保護農作物を含む園芸植物に生物的感染制御剤
を使用することに関する研究が強調されている。
この論文においては、次の３つの主要な直接的生体制御機構が確立されている
：
（ｉ） ある生体の別の生体による寄生または捕食、
（ii） 植物病原菌に対して有害な代謝産物をアンタゴニストが分泌する抗生
作用、
および
（iii）需要（demand）が栄養素またはスペースの直接的供給を越える競争。
これらの作用は、植物の内外部でおこる。その他の機構には、植物にその後の
攻撃に対する耐性をもたらす非病原性またはわずかに病原性のある微生物の植物
への接種を含む交差保護（cross protection）または誘導耐性（induced resist
ance）の発生が含まれる。また、二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡプラスミドを有す
る低病原性の病原菌を植物に接種することによって、全病原菌の菌力（virulenc
e）を低下させてもよい。
しかしながら、この論文においては、土壌中または自然環境下で成長する植物
の表面上または内部で作用がおこるまで、上記の機構のいずれかの重要性が検討
されなければならない。
全ての生体制御剤に関連する主要な問題は、ポウェル（Ｐowell）とフォール
（Ｆaull）の論文「植物の成長を改良するための真菌の生物工学」（ケンブリッ
ジ大学プレス、第２５９頁〜第２７５頁（１９８９年）に記載の全ての条件下で
の化学的方
法による効力に匹敵するような効力が一般にこれらの生体制御剤に期待されるこ
とである。このことは、ホイップスの論文においても、常に可能であるとは限ら
ない目的として指摘されている。この例としては特異的な抑制性土壌の存在によ
って、土壌条件を生体制御的にする作用が説明されることが挙げられる。同様に
、病原菌の接種原能力は達成される生体制御の程度にとって重要なものであるが
、次の文献に記載のように、しばしば無視されている：マクイルケン（McQuilke
n）ら、Plant Pathology、第３９巻、第４５２頁〜第４６２頁（１９９０年）；
バッジ（Budge）およびホイップス、Plant Pathology、第４０巻、第５９頁〜第
６６頁（１９９１年）。
上記のホイップスの論文に記載のように、植物の成長前、成長中または成長後
に、生体制御剤を気生、根生または土壌生のミクロバイオーム（microbiome）に
直接適用することも試みられているが、これらの技法のうちのほんのわずかのも
のが実用化されているにすぎない。
即ち、園芸の分野における生体制御法は実用的には成功しておらず、この理由
の一つは、試験管内の試験と実際の試験との間に再現性がないことである。また
、薬剤に比べて、生物的方法は接種原の調製、塗布およびコストの点で問題があ
る。薬剤は、環境または接種原の能力にかかわらず、一般に効能を発揮するので
、効力の点で好ましい場合が多い。薬剤は対象植物に塗布するのが容易であり、
また、広範囲に存在する病原菌を制御できる。
しかしながら、殺菌剤のような薬剤を、例えば特異的な植物病原菌によって引
き起こされる果物や野菜の貯蔵腐敗病の抑制に使用する方法は、ヒトの健康に対
する有害性と環境汚染の観点から問題があるために一般的な方法とはなっていな
い。この問題は、Agricultural Research、１９９０年４月号において特に議論
されている。この文献には、果物の腐敗病の抑制に使用してもよいイーストの菌
株が記載されている。しかしながら、この種の生体制御剤は、該制御剤の発見と
効能確認に要する時間、労力および費用の見地から実用化は困難である。
ウイリアムソン（Williamson）らの文献［Neth．Ｊ．Ｐ１．Path第９１巻、第
２６５頁〜第２６７頁（１９８５年）］には、トウモロコシの病原菌コレトトリ
ク
ム・グラミニコラ（Colletotrichum graminicola）を抑制するために、生体制御
剤として、イースト［スポロボロミセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）
およびクリプトコッカス・ラウレンチイ・ヴァル・フラベスセンス（Cryptococc
us laurentii var flavescens）］を使用する方法が記載されている。これらの
イーストによって、コレトトリクム・グラミニコラによる病斑密度と壊死が約５
０％低減されることが判明した。この文献には、自然に発生するイーストの集団
が、特に選択された真菌と結合することによって、トウモロコシの炭痘病に適度
な効能を発揮するという観察結果が記載されている。しかしながら、この場合に
も、生体制御剤に関連する前記と同様の問題がある。
米国特許第５，０４１，３８４号明細書には、柑橘類の表面から分離されたピ
キア・グイリエルモンジ（Pichia guilliermondi）の種々の菌株が、種々の果物
の果実腐敗病の病原菌の抑制に有用であることが記載されている。
天然源から得られるイーストもしくは真菌またはバクテリアの利用に関する他
の文献としては次のものが例示される：
（ｉ） ヨーロッパ特許第４８５４４０号明細書（柑橘類の表面から分離され
た新規なイースト株を果実腐敗病の病原菌の抑制に使用する技術が開示されてい
る）、
（ii） 米国特許第５,０４７,２３９号および同第４,７６４,３７１号各明細
書（枯草菌を果実腐敗病の生体制御に使用する方法が記載されている）、
（iii）米国特許出願明細書第４,３７７,５７１号［オランダニレ病の処置に
シュードモナス・シリンガユー（Pseudomonas syringae）を使用する方法が記載
されている］、
（iv） 米国特許出願明細書第４,９５０,４７２号［ナシ状果の灰色かび病感
染の抑制にアクレモニウム・ブレーベ（Acremonium breve）を使用する方法が記
載されている］、および
（ｖ） 米国特許出願第４,９７５,２７７号［果物の収穫後の病気を抑制する
ためにシュードモナス・セバシア（Pseudomonas cepacia）を使用する方法が記
載されている］。
日本国特許第３０７７８０３号明細書には、土壌性の病気の抑制にシュードモ
ナス属のバクテリア、即ち、セパシア、グラジオリ（gladioli）、ボランス（vo
rans）およびジムナタ（dimunata）並びにバシラス属のバクテリア、即ち、セレ
ウス（cereus）、ミコイデス（mycoides）、アントラシス（anthracis）および
スリンギエンシス（thuringiensis）を使用する方法が記載されている。
米国特許第４,８７８,９３６号明細書には、フィトフェラ・メガスペルマ（Ph
ytophera megasperma）に対して活性な殺菌剤を生産し、生体制御活性を有する
バシラス・セレウス（ＡＴＣＣ ５３５２２）の使用が記載されている。
ロシア国特許第２３７４８０号明細書には、植物を昆虫から保護するための生
体制御剤として有用なバシラス・セレウスの菌株が開示されている。
米国特許第４,６６１,３５１号明細書には、バシラス属のバクテリア、即ち、
スリンギエンシス、スファエリカス（sphaericus）、ポピリアエ（popilliae）
、セレウス、レンチモルバス（lentiimorbus）およびフリボウンゲンシス（frib
oungensis）から生合成的に得られる殺虫性物質を含有する組成物が記載されて
いる。これらのバクテリアは、ヨーロッバ特許第１４５０８７号明細書に記載の
ように、低融点のポリエステルが供給されていてもよい。
日本国特許第５９０８２０８５号明細書には、枯草菌、バシラス・コアグラン
ス（coagulans）、ミクロコッカス・ルテウス（luteus）、バシラス・ステアロ
テルモフィルス（stearothermophilus）、クロストリジウム・パステウリアナム
（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム・アミノバレリカム（aminov
alericum）、クロストリジウム・テルモサッカロリチウム（thermosaccharolyti
cum）およびテルモアクチノミセス・ブルガリス（Thermoactinomyces vulgaris
）を含有する生体制御剤を使用することによって有害な昆虫を抑制する方法が開
示されている。
ブロードベント（Broadbent）らの文献「オーストラリアの土壌中の菌根病原
菌に対して拮抗的なバクテリアと放線菌類」には、生体制御活性を有する菌類と
して次のものが開示されている：枯草菌、バシラス・メガテリウム（megaterium
）、ストレプトマイセス種、バシラス・セレウス、バシラス・プミルス（pumilu
s）、
バシラス・ポリニキサ（polynyxa）、バシラス・バジウス（badius）、シュード
モナス・プチダ（putida）、シュードモナス・フルオレスセンス（fluorescens
）およびシュードモナス種。
ヴィサー（Visser）らの報文［Applied and Environmental Microbiology）第
５２巻、第５５２頁〜第５５５頁（１９８６年）］には、植物病原体キサントモ
ナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、エルウイニア・カトトボラ
（Erwinia catotovola）およびシュードモナス・シリンガエに対して拮抗的であ
って、植物の表面および植物関連生成物から分離された種々の乳酸バクテリアが
開示されている。ポット試験において、シュードモナス・シリンガエを接種する
前に、ラクトバシラス・プラネタリウム（Lactobacillus planetarium）を用い
てマメ科の植物を処理することによって病気の発生率は著しく低減した。
前記の先行技術を概観することにより、次のことが明らかとなった。即ち、果
物の葉の表面上に存在することもある天然の分離物を採取し、該分離物を穀物も
しくは果物および他の植物に塗布する生体制御剤として利用するために該分離物
を培養することは周知である。天然の分離物は葉の表面から採取し、適当な培地
中で培養してもよい。場合によっては、培養培地は乾燥し、キャリヤー中に配合
する前に粉末に粉砕してもよく、あるいは、培養培地をワックス、例えば、水性
ワックスまたはパラフィン／鉱物油性基剤と混合してもよい。あるいは、感染し
た果物を該天然分離物を含有する溶液中に浸漬してもよい。
しかしながら、天然分離物を利用する場合の一つの重大な難点は、該分離物を
無作為に採取する場合が多く、しかも関連する拮抗体を同定しなければならず、
また、野外で使用する前に分離しなければならないことである。さらに、天然分
離物を商業的規模で採用した実績はない。
また、生体制御剤、例えば、バシラス・スリンギエンシスを利用する場合の主
要な欠点は、薬剤に比べてコストが高い場合が多いだけでなく、比較的短時間に
効能が失われることである。
さらに、遺伝子工学の技法を用いて生産される生体制御剤、例えば、組換菌株
または組換菌株から得られるタンパク質を利用する方法の場合には、コストが非
常に高くなるだけでなく、規制当局、例えば米国食品医薬品局から認可を受ける
までは製品を販売できないという問題がある。また、商業的な評価を受ける前に
広範な野外試験をおこなうことが必要である。
発明の概要
本発明の目的は、前記の従来技術の諸問題を解消し得る生体制御剤を提供する
ことである。
本発明による生体制御剤は下記の成分（ｉ）および（ii）を含有するか、これ
らの成分から誘導される：
（ｉ）イースト成分およびバクテリア成分の混合培養、および
（ii）該混合培養に対する基質。
イースト成分は、穀粉（例えば、ライムギ粉）がパンイーストよりも乳酸バク
テリアによって発酵される生地である発酵生地（sourdough）において発酵作用
またはふくらし作用をもたらすのに有用である。発酵生地は、例えばオウラ（Ou
ra）らの論文、即ち、「Economic Microbiology」、第７巻［ローズ（Ａ．Ｈ．R
ose）編］、第１２３頁〜第１３４頁に集録されている「発酵食品類」に記載さ
れている。この種のイーストは、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、サッ
カロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・エキシグス（exiguss）およびピ
キア・サイトイ（saitoi）から選択してもよい。しかしながら、適当なバクテリ
ア成分と基質と共働することによって、発酵生地の発酵の特徴である乳酸、エタ
ノールおよび二酸化炭素を主生成物として生成するのに有効なイーストはいずれ
も使用できる。発酵生地の発酵においては、アルドラーゼを経由する同種発酵性
乳酸バクテリア系並びにホスホケトラーゼを経由するグルコースおよびペントー
スの異種発酵性乳酸バクテリア系によって解糖系が特徴づけられる。
サッカロミセス・エキシグスはトルロプシス・ホルミイ（Torulopsis holmii
）としても知られている。使用し得る別のイーストにはサッカロミセス属のイー
スト、例えば、セレビシアエ、エキシグス、イヌシタツスおよびウバルムが含ま
れる。
共生混合培養のバクテリア成分は乳酸桿菌属、ロイコノストク属（Leuconosto
c）、ペジオコッカス属（Pediococcus）およびストレプトコッカス族のストレプ
トコッカス属のバクテリアから選択してもよい。異なる基質を使用するためには
、バクテリアの能力に応じて乳酸桿菌属の異なるバクテリアを使用してもよい。
代表的な乳酸バクテリアは次のものから選択してもよい：ラクトバシラス・プラ
ンタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス・カセイ（casei）、ラ
クトバシラス・デルブレウッキイ（delbreuckii）、ラクトバシラス・レイヒマ
ンニイ（leichmannii）、ラクトバシラス・ブレビス（brevis）［特に、バール
・リンドネリ（var lindneri）］、ラクトバシラス・フェルメンタム（fermentu
m）、ラクトバシラス・パストリアヌス（pastorianus）、ラクトバシラス・ブチ
ェリ（bucheri）、ラクトバシラス・アシドフィルス（acidophilus）、ラクトバ
シラス・ファルシミニス（farciminis）、ラクトバシラス・アリメンタリウス（
alimentarius）、ラクトバシラス・フルクチボランス（fructivorans）、ラクト
バシラス・ビリデスセンス（viridescens）、ラクトバシラス・セロビオサス（c
ellobiosus）およびラクトバシラス・ソリバリウス（solivarius）。使用しても
よい別のバクテリアにはペジオコッカス・セレビシアエ、ペジオコッカス・アシ
ジラクチシ（acidilactici）並びにシトロバクテル（Citrobacter）種およびミ
クロコッカス種のバクテリアが含まれる。
本発明による生体制御剤に用いる特に好ましいバクテリアは、サンフランシス
コ生地を用いるフランスパンの製造に使用されているラクトバシラス・サンフラ
ンシスコである。これらのバクテリアは酸素には無関係であり、炭素源としては
、マルトース以外の炭水化物は用いない。ラクトバシラス・サンフランシスコは
、主として発酵作用をするサッカロミセス・エキシグスと共生関係を形成する。
生地培養に関するその他の情報は下記の文献から得ることができる：
（ｉ） ノート（Nout）、Int．Ｊ．of Food Microbiology、第１２巻、第２１
７頁〜第２２４頁（１９９１年）、
（ii） ノートら、Ｊ．of Applied Bacteriology Symposium Supplement、第
７３巻、第１３６５頁〜第１４７５頁（１９９２年）、
（iii）ソンダース（Saunders）ら、Cereal Chemistry、第４９巻、第８６頁
〜第９１頁（１９７２年）、
（iv）クック（Cooke）ら、ＦＥＭＳ Microbiology Reviews、第３６９頁〜第
３７９頁（１９８７年）、
（ｖ）スリラーンガンタン（Sriraanganthan）ら、Applied Microbiology、第
２５巻、第４６１頁〜第４７０頁（１９７３年）
（vi）クリン（Kline）およびスギハラ（Sugihara）、App1ied Microbiology
、第２１巻、第４５９頁〜第４６５頁（１９７１年）、および
（vii） ヌグ（Ng）、Ａpplied and Environmental Microbiology、第３１巻
、第３９５頁〜第３９８頁（１９７６年）。
以下に詳述するように、オーストリア国立分析研究所に寄託されている本発明
による生体制御剤の特殊な形態のもの（以下、ＳＤＢＳという）においては、寄
託された混合培養中に含まれるラクトバシルス属のバクテリアには、次の（ｉ）
〜（iii）のバクテリアが含まれる：（ｉ）フィリップス（Ｐhillips）とコリン
ズ（Ｃollins）によって１９８８年に特性が明らかにされたラクトバシラス・パ
ラブクネリ、（ii）ラクトバシラス・パラブクネリ／ブレビス菌株、および（ii
i）ロゴス（Rogose）らによって１９５３年に特性が明らかにされたラクトバシ
ラス・カセイ種カセイ。しかしながら、ラクトバシラス・ブクネリとラクトバシ
ラス・パラブクネリを区別することは非常に困難であり、本発明の範囲内におい
ては、ラクトバシラス・パラブクネリの替りにラクトバシラス・ブルネリを含む
か、または、例えば、ラクトバシラス・カセイ種カセイの替りにラクトバシラス
・カセイの他の菌株を含む混合接種物培養（mixed starter culture）が提供さ
れる。ラクトバシラス・パラブクネリまたはラクトバシラス・ブクネリとラクト
バシラス・ブレビスとの区別も非常に困難であり、ラクトバシラス・ブレビスは
ラクトバシラス・パラブクネリまたはラクトバシラス・ブクネリの替りに使用し
てもよい。
混合培養の試料は、デルフト工科大学（オランダ）のクルイフェルテクノロジ
ー研究所（Kluyver Laboratory of Technology）に送付されており、ラクトバシ
ラス菌株（ｉ）、（ii）および（iii）が同定されている。混合培養のイースト
成分は、ＣＢＳイースト同定サービス（デルフト、オランダ）により、サッカロ
ミセス・セレビシアエ[ハンセン（Hansen）の製品Meyen］であることが決定され
た。
混合培養に用いられる基質は穀類、例えば小麦粉、特に、ライムギまたは無漂
白の白コムギ粉を含んでいてもよい白コムギ粉から誘導される製品を含有してい
てもよい。基質としては糖密を用いてもよい。
基質は水と混合してもよい。水は瓶詰め雨水または殺菌したMilli−Ｑ濾過水
を含む純水を用いるのが適当である。
混合接種物のpＨは３．０〜６．０、特に３．０〜４．５が適当である。
発酵は、等量の穀粉と水を混合してペーストを形成させ、これを適当な割合、
例えば１：１で接種物培養へ添加することによって開始させてもよい。インキュ
ベーションは５〜４８時間おこなってもよいが、２４時間が適当である。
常套の殺虫剤や従来の生体制御剤に比べて、本発明による生体制御剤が優れて
いる点は次の通りである：
（ｉ） 混合培養の成分は比較的長い間にわたって食品の製造に利用されてい
るので、殺虫剤としての登録が容易である。
（ii） バクテリア成分、例えば、ラクトバシラスは、これらを消費する生物
体にプロビオチック効果（probiotic effect）をもたらす。このことは、消化管
内のバクテリアとイーストもしくは微小植物（microflora）のバランスを改良す
ることによって健康が増進されることを意味する。
（iii）本発明による生体制御生成物は持続農業と適合性があり、前述のよう
に常套の薬剤または抗生作用を有する殺菌剤を用いる場合に問題となる健康に対
する危険性もない。なお、このような問題は次の（a）〜（c）の理由から不都合
である：
（a）腫瘍形成の高い危険性、
（b）多くの病原菌が殺菌剤耐性のある菌株を発生させることによる有用
性の喪失、および
（c）環境に対する危険性と持続性作物系の開発のために毒性薬剤への依
存性の低下に対する環境グループからの圧力。
本発明による生体制御剤は、所望の用途における作用を促進するような他の成
分を含んでいてもよい。
一方の成分は、標的表面上に生体制御微生物の拮抗性集団を形成維持させるの
を補助するキャリヤーを含有していてもよい。このキャリヤーは液体、例えば液
状ワックス、オイル（例えば、ココナツ油、植物油、オリーブ油、カノラ油）、
エマルション（例えば、魚油エマルション）であってもよい。上記基準に従うよ
うな懸濁液またはスラリーを用いてもよい。一つの適当なキャリヤーは、市販の
乳化植物油「ＣＯＤＡＣＩＤＥ」である。他の液状キャリヤーは市販品「ＮＵ−
ＦＩＬＭ１７」である。この種の液状キャリヤーは分散性を高めるために使用し
てもよく、あるいは、標的表面に対する接着剤として使用してもよい。
使用してもよい別の成分は増粘剤であり、増粘剤としてはゴム、例えば天然も
しくは変性ゴム（例えば、アルギン、カラギーナン、キサンタン、トラガカント
ゴム）が適当である。ゴムは乳化剤または安定化剤として使用してもよい。
本発明による生体制御剤で処理してもよい穀類の植物または生産物の気生表面
の病原菌には主として真菌性病原菌、即ち、コレトトリクム（Colletotrichum）
（炭疸病）、セルコスポラ（Cercospora）（斑点病および葉枯れ病）、ボトリチ
ス（Botrytis）（灰色かび病および腐敗病）、アルテルナリア（Alternaria）（
病斑）、モニリニア（Monilinia）（灰星病）、ペニシリウム（Penicillium）（
青かび病）およびリゾプス（Rhizopus）（軟腐病）が含まれる。
本発明による生体制御剤に含有させてもよい別の成分としては、ＭｇＯ、Ｍｇ
ＣＯ3および／またはＣａＣｌ2を含有していてもよい微生物の拮抗エンハンサー
（enhancer）、ティーポリフェノール（特にエピカテキンガレートおよびエピガ
ロカテキンガレート）を含有していてもよい病原インヒビター、抗酸化剤、およ
び生体制御剤の製造、貯蔵および／または使用を容易にする物質が例示される。
本発明による発酵生地の生体制御生成物は実用的な目的のためにいずれかの適
当な方法で配合し、凍結乾燥して貯蔵寿命を改良してもよい。
本発明による生体制御剤は標的植物の収穫前、収穫中および収穫後に該植物に
適用してもよい。
実施例
発酵
ＳＤＢＳ接種物培養は使用前、４℃で貯蔵した。再活性化するために、有機栽
培した無漂白小麦粉「Kialla」および「Milli−Ｑ濾過水」を等量ずつ混合して
なめらかなペーストを調製した。このペーストを接種物培養と１：１の割合で混
合した。接種物培養の上部に蓄積する酢酸、乳酸およびエタノールの透明層が全
体積の１／３以上になったときに、該透明層を接種物の上部から完全にデカント
する操作をときどきおこなった。ゆるく蓋をした広口瓶内に培養を入れ、室温（
２３〜３０℃）において５日間（大抵の場合は２４時間）までインキュベートし
た。
マンゴー
試験１においては、自然に感染した緑色果実を脱果汁処理に付した後、病斑密
度に応じて２つのグループ、即ち、軽度感染グループと重度感染グループに分け
た。試験２においては、自然に感染した果実を脱果汁処理に付した後、感染度に
応じて分別した。果実は６つのグループに分けた。各グループは、類似の範囲に
ある感染度を有する３個の果実から成る。
処理
試験１および２でおこなった処理を表１にまとめて示す。両方の試験において
は、果実をMilli−Ｑ濾過水（対照）またはＳＤＢＳ（処理／±添加剤）に１分
間浸漬させた後、実験室内（室温：２３℃）において、自己排水棚の上で６日間
（試験２）または７日間（試験１）インキュベートした。果実を浸漬処理に３回
付した試験２aにおいては、浸漬処理は、試験の初日、２日目および３日目にお
こなった。試験２bにおいては、添加剤として、「Nufilm１７」［Miller Chemic
al and Fertiliser Corporation（米国）製］および「Codacide」（Spraytech A
ustralasia Pty．Ltd．製）を、使用説明書において推奨されている添加速度と
添加方法に従って、浸漬混合物に添加した。
病気の評価
果実に発現した炭疸病は、次の評価尺度に従って、６日後（試験２）または７
日後（試験１）に評価した。
病気の評価度 果実表面の感染率（％）
１ ０〜２５
２ ２６〜５０
３ ５１〜７５
４ ７６〜１００
結果
試験１（図１）においては、マンゴーの軽度感染グループと重度感染グループ
において発現した炭疸病の発生量は、ＳＤＢＳ処理によって病気の評価度は１ラ
ンク低減した。さらに、ＳＤＢＳで処理したマンゴーの場合には、病斑は一般的
には局在化して壊死をもたらした。これに対して、対照果実の場合には病斑は内
部まで進行すると共に広く散在した。
試験の最初の３日間において浸漬を繰り返すことによって（試験２a）、病気
の評価度は３から１に低下し、果実は自然感染による局在化した壊死病斑のみを
有する状態で熟した。
試験２aにおいては、ＳＤＢＳを用いる浸漬処理に１回付すことによって、マ
ンゴーの炭疸病の評価度は１ランク低下した。Nufilm１７とCodacideとの展着剤
−固着剤配合物の添加によって、病気の評価度は２ランク低下し（図２）、浸漬
処理を３回おこなった場合と同じランクの評価度が得られた。ＳＤＢＳとNufilm
１７を用いることによって、最も安定で最良の病気抑制効果が得られた。
処理した果実からＳＤＢＳ混合物を洗い流した後、洗浄した果実を研究室内の
室温においてさらに３日間インキュベートしたところ、対照果実の場合と同じ炭
疸病の評価度が得られた。
ＳＤＢＳ混合物は真菌増殖抑止的な作用をすることによって、自然に感染した
普通のマンゴーの果実に発生する炭疸病を阻害または遅延させるものと考えられ
る。上記の処理による真菌増殖抑止効果は、ＳＤＢＳ混合物を果実の表面から洗
い流すと消失する。この効果は、浸漬を繰り返すことによって、有効な成長をも
たらす湿潤混合物と長時間接触させるか、またはNufilm１７とCodacideとの展着
剤−固着剤配合物の添加によって高めることができる。
ＳＤＢＳ調製品はオーストラリア国立分析研究所（スアキンストリート、ピン
ブル、ニューサウスウォールズ、オーストラリア）に登録番号Ｎ９３／９５７８
として１９９３年３月５日に寄託されている。ＳＤＢＳ接種物培養１g中には、
穀粉０.３７g、水０.６３g、ラクトバシラス菌１０12cfu／gまでのラクトバシラ
ス菌および２×１０3cfu／gのサッカロミセス・セレビシアエが含まれる。
このＳＤＢＳ接種物培養は、エディス・アイルワード夫人（Mrs Edith Aylwar
d）（ロイスロード、パームウッズ、クウィーンズランド、オーストラリア）に
よって開発された生地接種物から得たものである。アイルワード夫人によってお
こなわれたパンの製造過程においては、最初に接種物にカベルネ品種のブドウ混
合物およびドイツにおいてライムギパンの製造に使用されていた市販の接種物「
ＢＡＣＫ ＦＥＲＭＥＮＴ」を含有させ、該市販の接種物に等容量の水と有機栽
培した無漂白の小麦粉（「ＫＩＡＬＬＡ」）を混合した。発酵が開始した後、発
酵容器にゆるく蓋をし、室温で７日間放置した。発泡または泡立ちが認められた
後、発酵物は、デカンテーション処理に付してブドウの皮と茎を除去し、密閉広
口瓶に移し、４℃の冷蔵庫内で１〜２日間静置した。次いで、調製品の５０％を
イースト、塩および小麦粉と混合してパンの製造に使用し、残りの調製品に小麦
粉と水を補充し、次の発酵に使用するまで４℃の冷蔵庫内に保存した。一週間前
の培養を含む無漂白小麦粉の発酵による接種物の増殖は、完全な非無菌状態で５
年間にわたって一週間毎におこなわれたので、該接種物は小麦粉から導入された
微生物も含有すると考えられる。、アイルワード夫人は、上記の製造過程から、
風味、きめおよび香りの変化しない発酵生地のパンを製造した。
ＳＤＢＳの特性−混合物中の微生物の相対密度
プレート上のＳＤＢＳ接種物培養中のラクトバシラスの異なる種を区別するこ
とは不可能である。本発明者は単離した全ての該種についてＭＲＳ上で常に最良
の増殖を得たので、この培地を全ラクトバシラスのカウント（count）に使用し
た。ラクシバシラス・カセイ種カセイはラクトースＬＢ培地上で良好な増殖を示
したが、他の分離物はこの培地上においては、増殖しないか、または非常に遅い
速度でわずかに増殖するにすぎなかった。本発明者はこの培地を使用することに
よって、全カウント中のラクトバシラス・カセイ種カセイの割合を評価した。
表２のデータは、ラクトバシラスの総数が、インキュベーションを２４時間お
こなった後、発酵物１ｍｌあたり約１００万から最高で約７００万に増加するこ
とを示す。全バクテリア数はさらに２４時間インキュベートしてもこの値のレベ
ルに維持されるものと考えられる。
これらの実験で測定されたラクトバシラス・カセイの集団の大きさから、該菌
株がこの混合物中の重要な成分であることが判明した。しかしながら、ラクトバ
シラス・パラブクネリとラクトバシラス・パラブクネリ／ブレビス菌株を区別す
るのに適した培地を見出すことはできなかった。
後述するように、イースト集団の増殖は、酸素の有効利用性および有機酸とエ
タノールの濃度によって大きな影響を受ける。発酵開始時の接種物中のイースト
成分の濃度が低い場合には（本発明者の経験によれば、嫌気性条件下での長時間
の増殖および／または貯蔵に起因する）、イーストの集団は増加せず、非常に少
量のエタノールが生成する。相当数（＞１０3／ｍｌ）のイーストが存在する場
合には、イーストの集団はエタノールを生成する発酵の最初の２４時間以内にお
いては活性である。このことは、発酵混合物が非常に泡立つことから確認される
。発酵の進行に伴い、酸の蓄積と酸素の消費によってイーストの増殖と活性は制
限される。このような状態になると、混合物中の泡立ちは停止し、混合物は静止
する。
イーストの数は実験によって非常に相違する。表２の実験２の後でイースト数
が非常に少なくなったとき、発酵条件をより好気性に変化させることによってイ
ーストの増殖を促進させた。３回の実験におけるイースト数の安定した増加は、
イーストの活性が発酵物の酸性度とエタノール濃度の増加によって抑制される前
に、発酵条件を初期の好ましい好気条件にすることによって増殖が進行すること
を提案する。
表３はＳＤＢＳの分離物が純粋培養として増殖する培地を示す。表３において
、ＬＬＡ培地は乳酸塩を用いた乳酸バクテリア培地を含む。この培地は、Ｔｗｅ
ｅｎ ８０ ０.０３％、新鮮なイースト抽出物１.５％、トリプトン０.６％お
よびラクトース２.０％含有し、ｐＨは寒天によって５.４５に調整した。ＳＬＡ
培地は、ラクトースの代わりにスクロースを同じ濃度で添加する以外はＬＬＡ培
地
と同様である。ＭＬＳ培地は、ラクトースの代わりにマルトースを同じ濃度で添
加する以外はＬＬＡ培地と同様である。
ＲＳＹＭ培地は未精製糖１０％、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4 ０.０５％、新鮮なイー
スト抽出物１.５％および寒天２％含有する。残部は水であり、ｐＨは１ＮのＨ
Ｃｌを用いて６に調整した。この培地は使用前にオートクレーブで処理した。Ｓ
ＹＭ培地は、未精製糖の代わりにスクロースを用いる以外はＲＳＹＭと同様であ
る。ＭＥＡはオキソイド・オーストラリア（Oxoid Australia）から入手した常
套の麦芽抽出物培地である。ＰＤＡはオキソイド・オーストラリアから入手した
常套のジャガイモデキストロース培地である。ＲＡＡはオキソイド・オーストラ
リアから入手した常套のロゴサ寒天培地である。糖密培地は水中に糖密を１％、
２％、５％、１０％または２０％含有する培地であって、使用前にオートクレー
ブで処理した。ＭＲＳ培地はオキソイド・オーストラリアから入手したものであ
り、ＭＲＳブロス５２ｇをMilli-Ｑ水１０００ｍｌに溶解させ、これに寒天を２
０ｇ添加して調製した培地である。この培地は１２１℃で１５分間、オートクレ
ーブ内で処理した。表４に示す発酵過程においては、ラクトバシラス・カセイと
イーストの総数は、インキュベーションを４８時間おこなった後の４種の混合物
の場合とほぼ同じレベルまで復帰したが、ラクトバシラスの総数は十分に回復し
なかった。
標準的な発酵においては、混合物の５０％は接種物培養である。表５に示すよ
うに、接種物培養成分の量を２０％、１０％または５％に低減させて発酵をおこ
なったところ、２４時間後、標準的な量のエタノール、乳酸および酢酸が生成し
た。２４時間後、ｐＨは幾分高くなる傾向を示したが、全ての発酵において、２
４時間後のｐＨは標準的な値となった。
表６は３０℃での標準的な発酵におけるｐＨブロフィールを示す。
全てのデータは、３種の試料につき、２回または３回発酵を繰り返しおこなっ
た場合の平均値である。エタノール、酢酸および乳酸の測定は、ベーリンガー・
マンハイム社（Boehringer Mannheim）製のテストキットおよびＨＰＬＣ［バイ
オラート・アミネックス社（Biorad Aminex）製ＨＰＸ−８７Ｈカラム］を用い
ておこなった。
表６において、混合溶媒のｐＨは、調製直後は約３.８であるが、４８時間後
には約３.４となった。小麦粉基質を用いた場合の最低のｐＨは３.２であった。
エタノール生成の代表的なプロフィールを示す表７の場合、接種物からの混合
物中の残存エタノールが２ｇ／Ｌのときに発酵が開始した。生成ピークは２４時
間後、約７ｇ／Ｌのときにみられたが、酸の濃度が高くなるにつれて低減した。
エタノールの生成は混合物中のイーストの密度と直接関係する。実験１と２場
合には、発酵開始時のイースト数は非常にすくなかった。
表８の発酵は、接種物からの残存酢酸が約１ｇ／Ｌのときに開始し、酢酸は、
その濃度が１７時間後にかなり低下し、４８時間後には元の値までゆっくりと増
加したので代謝したものと考えられる。
表９の接種物中の乳酸の残存量は比較的多く（約３.５ｇ／Ｌ）、発酵過程に
おいて一様に増加し、４８時間後には、実験開始時の量の２倍となった。
発酵後、粘質物が最終生成物として生成した。
表７〜１０に示す発酵をおこなうための標準的なプロトコールにおいては、標
準的混合物（接種物培養１部：小麦粉−水ペースト１部）２００ｍｌをパイレッ
クス（pyrex）製瓶（２５０ｍｌ）内で調製し、暗所において、３０℃で４８時
間インキュベートした（試料瓶は３本づつ調製した）。試料瓶にはアルミニウム
箔でゆるく蓋をし、好気発酵をおこなった。
０時間、１７時間、２４時および４８時間後、各々の発酵物のｐＨをデジタル
式スティックｐＨメーター［ハンナ・インストゥルメンツ社（Hanna Instrument
s）製］を用いて測定した。エタノールと有機酸のプロフィールは、下記のＵＶ
法による測定キットを用い、使用説明書に従って測定した：
１．エタノール…ベーリンガー・マンハイム社製のエタノールテストキット（
No.176290）
２．酢酸…ベーリンガー・マンハイム社製の酢酸テストキット（No.148261）
３．乳酸…ベーリンガー・マンハイム社製の乳酸テストキット（No.1112821）
酢酸と乳酸の濃度は、ウォーターズ／アプライド・バイオシステムズ社（Wate
rs／Applied Biosystems）製ＨＰＬＣ［バイオラート・アミネックス社（Biorad
Aminex）製ＨＰＸ−８７Ｈカラムを使用］を用い、使用説明書に従って確認し
た。
表４および表５に示す発酵に関連して、前記と同様の操作をおこなった。但し
、この場合には、混合物中の接種物の濃度を、混合物の全体積の５％、１０％、
２０％または５０％にした（５０％は標準混合物である）。
表２および表４に示す発酵に関連して、各々の発酵試料を殺菌水を用いて希釈
した一連の希釈試料について密度測定をおこなった。微小植物の生菌数の測定は
１６０,０００倍希釈試料を用いておこなった。イーストの数は、希釈試料１０
０μlをＤＲＢＣプレート上に接種することによって評価した（オキソイド・オ
ーストラリアから入手したＤＲＢＣ培地にクロロムフェニコールを０.１ｇ／Ｌ
添加したプレートを使用した）。ラクトバシラスの総数は、希釈試料５０μlを
ＭＲＳ培地上に接種することによって測定した。ラクトバシラス・カセイの数は
、希釈試料５０μlをラクトースＬＢ培地に接種することによって測定した。
接種したプレートは３０℃の暗所において約５日間インキュベートした。
各々の接種実験は３回づつおこなった。データは３つのプレート上での増殖数
から計算した各々の微生物の平均数［cfu／発酵物１ml］で表示する。
表１０および表１１は、表１の場合と類似のプロトコールに従っておこなった
実験の結果を示す。表１０は、炭疸病の自然に感染したマンゴーの果実上の病斑
の直径を、表１に対応するプロトコールによって調製した本発明による生体制御
剤を用いて処理した後、１７日間にわたって測定した値の平均値を示す。表１１
は、自然に感染したマンゴーの果実の病斑密度が処理後１７日間にわたって増大
することを示す。
表１２は、収穫後のマンゴーとアボカドの炭疸病の発現が、ＳＤＢＳを用いる
処理によって抑制されることを示す。
図面の簡単な説明
図１は、自然に感染したマンゴーを表１に関して説明したようにして室温で７
日間インキュベートした後の炭疸病の発現に関する。
図２は、自然に感染した普通のマンゴーの炭疸病の発現に対する粘着剤−展着
剤の効果を示すグラフである。
図３は、本発明による生体制御剤を商業的規模で製造する方法例を示すフロー
チャートである。
図４は、表１１および表１２に示すデータをグラフ化したものである。
図５は、表６〜９に示すデータをグラフ化したものである。
上記の説明から明らかなように、本発明によれば、発酵生地接種物配合物は特
に植物の真菌性の病気に関して優れた生体制御効果を発揮する。このことは、本
発明による生体制御剤を、コレクトリカム・グロエオスポリオイデス（gloeospo
rioides）およびコレクトリカム・アクタツム（acutatum）で感染したマンゴー
とアボカドに適用することによって示される。
本発明の別の観点によれば、次の（i）〜（iv）の過程を含む、果物または植
物の真菌性の病気を生体制御するために使用する生体制御剤の製造法が提供され
る：
（ｉ） イースト成分とバクテリア成分を含有する発酵接種物培養を調製し、
（ii） 該接種物培養を発酵基質に添加して発酵ブロスを調製し、
（iii）該発酵ブロスを、望ましくは１２〜４８時間インキュベートし、次い
で、
（iv） 該発酵ブロスからの液体を生体制御配合物とし、所望により、展着剤
もしくは粘着剤、分散剤、増粘剤、乳化剤または安定化剤を含むか、またはこれ
らの添加剤から選択される適当なキャリヤーを該配合剤に添加する。
図面の補足説明
図１…収穫後の自然に感染したマンゴーをＳＤＢＳを用いる浸漬処理に付して
室温で７日間インキュベートしたときの炭疸病の発現に対するＳＤＢＳの効果。
（a）軽度自然感染
（b）重度自然感染
図２…自然に感染した普通のマンゴーの炭素病の発現に対する３回浸漬と粘着
剤−展着剤の効果。
図３…発酵プロセスの模式的表示。
図４…３０℃での標準的発酵におけるｐＨと有機酸のプロフィール（発酵を３
回おこなったときの平均値、実験２Ｎ）。
図５…自然に乾染したマンゴー果実の処理後１７日間経過後における炭疸病斑
の平均直径（１回の処理あたり１５個の果実の各々の平均病斑数：２０）。
Detailed Description of the Invention
Biocontrol agent for agriculture
Field of the invention
This invention relates to agricultural biocontrol agents.
Conventional technology
For conventional biocontrol agents for horticulture, see the article by JM Whipps.
"Current status of biological infection control in horticulture" [Biocontrol Sci & Technol, Volume 2]
, Pp. 3-24 (1992)]. In this paper,
Biological control agents for horticultural plants including vegetables, fruits, ornamentals, flowers and protected crops
Studies on the use of are highlighted.
In this paper, the following three major direct biological control mechanisms have been established:
:
(I) Parasitism or predation of one organism by another,
(Ii) Antibiotics whose antagonist secretes metabolites harmful to plant pathogens
Action,
and
(Iii) Competition where the demand exceeds the direct supply of nutrients or space.
These actions occur inside and outside the plant. Other mechanisms include
Plants of non-pathogenic or slightly pathogenic microorganisms that confer resistance to attack
Cross protection, including inoculation, or induced resist
ance) occurrence is included. Also has a double-stranded RNA or DNA plasmid
By inoculating the plant with a low pathogenic fungus, the virulence of all pathogens (virulenc
e) may be reduced.
However, in this paper, plants growing in soil or in natural environments
The importance of any of the above mechanisms is considered until it acts on or inside the
It must be.
The main problem associated with all biocontrol agents is Powell and fall.
(Faull), "Fungal Bioengineering to Improve Plant Growth"
Under all conditions described in The University Press, pp. 259-275 (1989).
The chemical one
Efficacy comparable to that of the law is generally expected for these biocontrol agents.
And. This is not always possible, even in the Whips article.
It is pointed out as no purpose. An example of this is the presence of a specific inhibitory soil.
Thus, the action of making the soil condition biocontrollable can be explained. As well
, The inoculum capacity of pathogens is important for the degree of biocontrol achieved
Is often ignored, as described in the following article: McQuilke
n) et al., Plant Pathology, 39, 452-462 (1990);
Badge and Whips, Plant Pathology, Volume 40, pp. 59-
66 pages (1991).
As described in the Whips article above, the plants may be pre-, post- or post-growth.
Biocontrol agents into aerial, root or soil microbiomes
Direct application has also been tried, but only a few of these techniques
Has only been put to practical use.
That is, the biological control method in the field of horticulture has not been practically successful.
One is that there is no reproducibility between the in vitro test and the actual test. Also
However, compared to drugs, biological methods have problems in terms of inoculum preparation, application and cost.
It Because the drug generally works, regardless of the environment or the capacity of the inoculum,
In many cases, it is preferable in terms of efficacy. The drug is easy to apply to the target plant,
In addition, it is possible to control a wide range of pathogenic bacteria.
However, agents such as fungicides can be attracted by, for example, specific plant pathogens.
The methods used to control the resulting storage rot of fruits and vegetables are related to human health.
It is not a common practice due to problems in terms of hazard and environmental pollution
Yes. This issue is discussed specifically in the April 1990 issue of Agricultural Research.
Has been done. This document describes yeast fungi that may be used to control fruit rot.
The strain is listed. However, this type of biological control agent is
Practical application is difficult from the viewpoint of time, labor and cost required for confirmation of efficacy.
Williamson et al. [Neth. J. P1. Path Volume 91, Vol.
Pp. 265-267 (1985)], corn pathogenic fungus
Ku
Biological control to suppress Mulle graminicola
As an agent, yeast [Sporobolomyces roseus]
And Cryptococcus laurentii Val flavescens (Cryptococc
us laurentii var flavescens)] is described. these
By yeast, lesion density and necrosis caused by Choletotrichum graminicola are about 5
It was found to be reduced by 0%. This document describes a naturally occurring population of yeast.
However, by combining with a specially selected fungus, it is suitable for anthracnose of corn.
It has been described that the observation results show that it exerts various effects. However, in this case
However, there are the same problems as described above related to the biocontrol agent.
U.S. Pat. No. 5,041,384 describes a pigment separated from a citrus surface.
Different strains of Pichia guilliermondi produce different fruits
It is described that it is useful for controlling the pathogen of the fruit rot disease of.
Other uses of yeast or fungi or bacteria derived from natural sources
Examples of documents include:
(I) EP 485440 (separated from the surface of citrus
A technique for using a novel yeast strain for controlling pathogens of fruit rot has been disclosed.
),
(Ii) US Pat. Nos. 5,047,239 and 4,764,371
Book (describes how to use Bacillus subtilis for biocontrol of fruit rot),
(Iii) US Patent Application No. 4,377,571 [for treatment of Dutch elm disease
Describes how to use Pseudomonas syringae
Has been done],
(Iv) US Patent Application No. 4,950,472 [Gray mold sensation of pome fruit
A method of using Acremonium breve to suppress dyeing is described.
Listed], and
(V) U.S. Patent Application No. 4,975,277 [Suppressing post-harvest disease of fruits
Describes how to use Pseudomonas cepacia for
It is listed].
Japanese Patent No. 3077803 discloses a pseudo-moiety for controlling soil-borne diseases.
Bacteria of the Solanum genus, namely cepacia, gladioli, borance (vo
rans) and dimunata and Bacillus bacteria,
Cereus, mycoides, anthracis and
Methods using Thuringiensis have been described.
U.S. Pat. No. 4,878,936 describes Phytofera megasperma (Ph
ytophera megasperma) produces biocide active and has biocontrol activity
The use of Bacillus cereus (ATCC 53522) is described.
Russian Patent No. 237480 describes a method for protecting plants from insects.
A strain of Bacillus cereus useful as a body control agent is disclosed.
U.S. Pat. No. 4,661,351 discloses a bacterium of the genus Bacillus,
Thuringiensis, sphaericus, popilliae
, Cereus, lentiimorbus and friboungensis (frib
a composition containing an insecticidal substance biosynthetically obtained from
There is. These bacteria are described in European Patent No. 145087.
Thus, a low melting point polyester may be supplied.
Japanese Patent No. 59082085 describes Bacillus subtilis, Bacillus coagulans.
Su (coagulans), Micrococcus luteus (luteus), Bacillus stearro
Thermophilus (stearothermophilus), Clostridium pasteurianum
(Clostridium pasteurianum), Clostridium aminovalericum (aminov
alericum), Clostridium thermosaccharolithium (thermosaccharolyti)
cum) and Thermoactinomyces vulgaris
A method for controlling harmful insects by using a biocontrol agent containing
It is shown.
Broadbent et al., “Mycorrhizal pathogenesis in Australian soils.
"Bacteria and actinomycetes that are antagonistic to fungi" include fungi with bioregulatory activity.
And disclosed the following: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium
), Streptomyces spp., Bacillus cereus, Bacillus pumilus (pumilu
s),
Bacillus polynixa (polynyxa), Bacillus basius (badius), pseudo
Monas putida, Pseudomonas fluorescens
) And Pseudomonas species.
Visser et al. [Applied and Environmental Microbiology]
52, p. 552 to p. 555 (1986)].
Xanthomonas campestris, Erwinia Katobora
(Erwinia catotovola) and Pseudomonas syringae
Therefore, various lactic acid bacteria isolated from the surface of plants and plant-related products
It has been disclosed. Inoculate with Pseudomonas syringae in a pot test
Before, using Lactobacillus planetarium
Treatment of legumes significantly reduced the incidence of disease.
An overview of the above prior art has revealed the following. That is, the result
Natural isolates that may be present on the surface of the leaves of the leaves
The isolate for use as a biocontrol agent for application to fruit or other plants
It is well known to culture. Natural isolates should be collected from the surface of the leaves and placed in a suitable medium.
You may culture in. In some cases, the culture medium is dried and mixed in the carrier.
May be ground to a powder prior to use, or the culture medium may be waxed, eg, aqueous.
It may be mixed with waxes or paraffin / mineral oil bases. Or infected
Fruits may be dipped into a solution containing the natural isolate.
However, one significant difficulty in utilizing natural isolates is that they
Often randomly sampled, and the associated antagonist must be identified,
Also, it must be separated before it can be used outdoors. In addition, natural
There is no record of adopting alien products on a commercial scale.
In addition, when using a biocontrol agent, for example, Bacillus thuringiensis
The major drawback is that the cost is often higher than that of drugs, but it is relatively short.
The effect is lost.
In addition, biocontrol agents produced using genetic engineering techniques, such as recombinant strains
Alternatively, in the case of using a protein obtained from a recombinant strain, the cost is low.
Not only always higher, but also approved by regulatory authorities, such as the US Food and Drug Administration
Until then there is a problem that the product cannot be sold. Also, before being evaluated commercially
Extensive field trials are needed.
Summary of the invention
An object of the present invention is to provide a biocontrol agent capable of solving the above-mentioned problems of the prior art.
That is.
The biocontrol agent according to the present invention contains the following components (i) and (ii), or
Derived from these ingredients:
(I) a mixed culture of yeast components and bacterial components, and
(Ii) A substrate for the mixed culture.
The yeast component is that cereal flour (eg, rye flour) is more lactate than bread yeast.
Fermentation action in sourdough, which is the dough fermented by terrier
It is also useful for producing a bloating effect. Fermented dough is, for example, Ou
ra) et al., "Economic Microbiology", Volume 7 [Rose (AHR
ed.)], pages 123-134, “Fermented Foods”.
Have been. This type of yeast can be found in Candida krusei,
Calomyces cerevisiae, Saccharomyces exiguss and pi
You may choose from Kia Saitoi. However, suitable bacteria
(A) Lactic acid and ethanol
Which yeast is effective in producing the major products of knoll and carbon dioxide?
Can also be used. In fermentation of fermented dough, homofermentability via aldolase
Glucose and pentoses via the lactic acid bacterial system and phosphoketolase
The glycolytic system is characterized by a heterologous fermentative lactic acid bacterium system.
Saccharomyces exigus is Torulopsis holmii
Also known as). Another yeast that may be used is a Saccharomyces spp.
Strikes, such as Cerevisiae, Exigs, Initatus and Ubalm
Be done.
Bacterial components of symbiotic mixed culture are Lactobacillus and Leuconosto.
c), Pediococcus and Streptococcus strep
It may be selected from bacteria of the genus Tococcus. To use different substrates
Alternatively, bacteria belonging to the genus Lactobacillus may be used depending on the ability of the bacteria.
Representative lactic acid bacteria may be selected from: Lactobacillus pla
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, la
C. Bacillus delbreuckii, Lactobacillus reichima
Leichmannii, Lactobacillus brevis [especially Bar
Var lindneri], Lactobacillus fermentum (fermentu)
m), Lactobacillus pastorianus, pastorianus
Bucheri, Lactobacillus acidophilus, Lactoba
Silas farciminis, Lactobacillus Alimentarius (
alimentarius), Lactobacillus fructivorans, Lact
Bacillus viridessense (viridescens), Lactobacillus cellobiosus (c
ellobiosus) and Lactobacillus solivarius. Even if you use
Other good bacteria are Pediococcus cerevisiae and Pediococcus reed
Acidilactici and Citrobacter species and mi
Bacteria of Crococcus species are included.
A particularly preferred bacterium for use in the biocontrol agent according to the present invention is San Francis
Lactobacillus sanfra used to make French bread using co-dough
It is Cisco. These bacteria are not related to oxygen and as a carbon source
, No carbohydrates other than maltose are used. Lactobacillus San Francisco
, Forms a symbiotic relationship with Saccharomyces exigs, which is mainly fermentative.
Additional information on dough culture can be obtained from the following sources:
(I) Note (Nout), Int. J. of Food Microbiology, Volume 12, 21
Pp. 7-224 (1991),
(Ii) Note et al. of Applied Bacteriology Symposium Supplement, No.
73, pp. 1365 to 1475 (1992),
(Iii) Saunders et al., Cereal Chemistry, Vol. 49, page 86.
~ Page 91 (1972),
(Iv) Cooke et al., FEMS Microbiology Reviews, pages 369-
379 pages (1987),
(V) Sriraanganthan et al., Applied Microbiology, No. 1
Volume 25, pp. 461-470 (1973)
(Vi) Kline and Sugihara, App1ied Microbiology
21: 459-465 (1971), and
(Vii) Ng, Applied and Environmental Microbiology, Volume 31
, 395-398 (1976).
The invention, deposited at the Austrian National Institute of Analytical Technology, as detailed below.
In the case of a special form of biological control agent (hereinafter referred to as SDBS) according to
The bacterium belonging to the genus Lactobacillus contained in the entrusted mixed culture includes the following (i)
~ (Iii) bacteria included: (i) Phillips and choline
Lactobacillus pas characterized by Collins in 1988
Rabkuneri, (ii) Lactobacillus parabukuneri / brevis strain, and (ii
i) Lactobacillus characterized by Rogose et al. in 1953
Ras Kasei Seed Kasei. However, Lactobacillus bukuneri and Lactobacillus
It is very difficult to distinguish Ras parabukuneri, and it is within the scope of the present invention.
Include Lactobacillus bruneri instead of Lactobacillus parabukuneri
Or, for example, Lactobacillus instead of Lactobacillus casei
-Provided a mixed starter culture containing other strains of caustic
Be done. Lactobacillus parabukuneri or Lactobacillus bukuneri and lacto
It is very difficult to distinguish it from Bacillus brevis, and Lactobacillus brevis is
Used in place of Lactobacillus parabukuneri or Lactobacillus bucnerii
May be.
Samples from mixed cultures were tested by Kruifer Technology at the Delft University of Technology (Netherlands).
-Sent to the Kluyver Laboratory of Technology
Ras strains (i), (ii) and (iii) have been identified. Mixed culture yeast
Ingredients are saccharoed by CBS East Identification Service (Delft, The Netherlands)
Determined to be Mrs. cerevisiae [Meyen, product of Hansen]
It was
Substrates used for mixed culture are cereals such as flour, especially rye or undried.
Contains products derived from white wheat flour which may contain white white wheat flour
May be. Sugar-concentrate may be used as the substrate.
The substrate may be mixed with water. Water is bottled rainwater or sterile Milli-Q filtered water.
It is suitable to use pure water containing.
The pH of the mixed inoculum is preferably 3.0 to 6.0, particularly 3.0 to 4.5.
For fermentation, an equal amount of flour and water are mixed to form a paste, which is mixed at an appropriate ratio,
It may be initiated, for example, by adding 1: 1 to the inoculum culture. Incu
The basation may be carried out for 5 to 48 hours, but 24 hours is suitable.
The biocontrol agent of the present invention is superior to conventional insecticides and conventional biocontrol agents.
The points are as follows:
(I) The components of the mixed culture have been used for food production for a relatively long time.
Therefore, registration as an insecticide is easy.
(Ii) Bacterial components, such as Lactobacillus, are organisms that consume them.
Produce a probiotic effect on the body. This is the digestive tract
Improve the balance of bacteria and yeast or microflora in the
This means that your health is improved.
(Iii) The bioregulated product according to the present invention is compatible with sustainable agriculture, as described above.
When using conventional drugs or bactericides with antibiotic action for
There is no danger of doing it. In addition, such problems are inconvenient for the following reasons (a) to (c).
Is:
(A) high risk of tumor formation,
(B) Useful by causing many pathogens to generate fungicide-resistant strains
Loss of sex, and
(C) Environmental hazards and reliance on toxic agents for the development of persistent crop systems.
Pressure from environmental groups on diminished viability.
The bioregulatory agent according to the present invention may be used in other ways to promote its action in a desired application.
It may include minutes.
One component is responsible for the formation and maintenance of antagonistic populations of biocontrol microbes on the target surface.
It may contain a carrier which assists. This carrier is a liquid, eg a liquid
Wax, oil (eg coconut oil, vegetable oil, olive oil, canola oil),
It may be an emulsion (eg a fish oil emulsion). I will follow the above criteria
Such suspensions or slurries may be used. One suitable carrier is a commercially available
It is an emulsified vegetable oil "CODACIDE". Other liquid carriers are commercial products "NU-
FILM 17 ". This type of liquid carrier is used to improve dispersibility.
Alternatively, it may be used as an adhesive to the target surface.
Another component that may be used is a thickener, which may be a rubber, such as natural
Or modified rubber (eg, algin, carrageenan, xanthan, tragacanth)
Rubber is suitable. The rubber may be used as an emulsifier or stabilizer.
Aerobic surface of a cereal plant or product that may be treated with a biocontrol agent according to the invention
Are mainly fungal pathogens, namely, Colletotrichum
(Anthrax), Cercospora (spot and leaf blight), Botrych
Botrytis (grey mold and rot), Alternaria (
Lesions), Monilinia (breast disease), Penicillium (
Blue mold) and Rhizopus (soft rot).
Other components that may be contained in the bioregulator according to the present invention include MgO and Mg.
CO3And / or CaCl2Microorganism antagonistic enhancer that may contain
(Enhancer), tea polyphenols (especially epicatechin gallate and epiga)
(Locatechin gallate), which may contain pathogen inhibitors, antioxidants, and
And substances that facilitate the production, storage and / or use of biocontrol agents.
The bioregulated product of the fermented dough according to the present invention is suitable for any practical purpose.
It may be formulated in a conventional manner and lyophilized to improve shelf life.
The biocontrol agent according to the present invention is applied to a target plant before, during and after harvesting of the plant.
You may apply.
Example
fermentation
SDBS inoculum cultures were stored at 4 ° C before use. Organic plant to reactivate
Mix equal amounts of unbleached wheat flour “Kialla” and “Milli-Q filtered water” that have been cultivated.
A smooth paste was prepared. Mix this paste with the inoculum culture at a 1: 1 ratio.
It matched. The total clear layer of acetic acid, lactic acid and ethanol that accumulates at the top of the inoculum culture
Completely decant the clear layer from the top of the inoculum when it is over 1/3 of the volume
I did some operations from time to time. Place the culture in a loosely-capped wide-mouthed bottle at room temperature (
Incubate at 23-30 ° C. for up to 5 days (usually 24 hours)
It was
mango
In Test 1, the naturally infected green fruits were subjected to dejuice treatment, and then diseased
According to the degree, it is divided into two groups, namely a mildly infected group and a heavily infected group.
It was In Test 2, the naturally infected fruits were subjected to fruit juice treatment and
Sorted accordingly. The fruits were divided into 6 groups. Each group has a similar range
It consists of three fruits with a certain degree of infection.
processing
Table 1 summarizes the treatments performed in tests 1 and 2. In both tests
For 1 minute, the fruit was added to Milli-Q filtered water (control) or SDBS (treatment / ± additive).
For 6 days in the laboratory (room temperature: 23 ° C) after self-drainage.
(Test 2) or 7 days (Test 1) were incubated. Dip the fruit 3 times
In the attached test 2a, the immersion treatment was performed on the first day, the second day and the third day of the test.
I'm sorry In Test 2b, as an additive, "Nufilm 17" [Miller Chemic
al and Fertiliser Corporation (USA)] and "Codacide" (Spraytech A
ustralasia Pty. Ltd. Product) with the addition rate recommended in the instruction manual.
It was added to the dipping mixture according to the method of addition.
Disease assessment
The anthrax disease developed in the fruit was evaluated after 6 days (Test 2) or 7 according to the following evaluation scale.
Evaluation was made after a day (Test 1).
Disease rating Infection rate on fruit surface (%)
10-25
2 26-50
3 51-75
4 76-100
result
In Study 1 (Figure 1), the mango mildly infected and heavily infected groups
The amount of anthrax disease expressed in the
Reduced. Furthermore, lesions are common in SDBS-treated mangos.
Localized to and necrotic. On the other hand, in the case of the control fruit, the lesion is
As it progressed to the club, it was widely scattered.
By repeating the immersion in the first 3 days of the test (Test 2a), the disease
Was reduced from 3 to 1, and the fruit had only localized necrotic lesions due to natural infection.
Ripe in a state of having.
In test 2a, a single immersion treatment with SDBS was used to
Ngo's rating for anthrax has dropped by one rank. Spreading agent for Nufilm 17 and Codacide
-Due to the addition of the fixative formulation, the illness rating was reduced by 2 ranks (Fig. 2) and immersion.
The same degree of evaluation as in the case where the treatment was performed three times was obtained. SDBS and Nufilm
By using 17, the most stable and best disease control effect was obtained.
After washing the SDBS mixture from the treated fruits, the washed fruits were placed in the laboratory.
Incubation at room temperature for an additional 3 days showed the same charcoal as the control fruit.
The grade of morbidity was obtained.
SDBS mixture naturally infected by acting as a fungal growth inhibitor
It is thought to inhibit or delay anthrax disease that occurs in ordinary mango fruit
It The fungal growth inhibitory effect of the above treatment is that the SDBS mixture is washed from the fruit surface.
It disappears when washed away. This effect also produces effective growth by repeated immersion.
Contact with wet mixture for a long time or spreading of Nufilm 17 and Codacide
It can be enhanced by the addition of agent-sticker formulations.
SDBS preparations are available from the Australian National Institute for Analytical Research (Suakin Street, Pin
Bull, New South Walls, Australia) with registration number N93 / 9578
Was deposited on March 5, 1993. In 1 g of SDBS inoculum culture,
Flour 0.37 g, water 0.63 g, Lactobacillus 1012Lactobacillus up to cfu / g
Subtilis and 2 × 103Includes cfu / g of Saccharomyces cerevisiae.
This SDBS inoculum culture was developed by Mrs Edith Aylwar.
d) (Royce Road, Palm Woods, Queensland, Australia)
It is derived from the developed dough inoculum. By Mrs. Isleward
In the process of making smashed bread, the inoculum is first mixed with grapes of the Cabernet variety.
Compound and a commercial inoculum used in the production of rye bread in Germany
BACK FERMENT ”is added to the commercially available inoculum to prepare an equal volume of water and organic plant.
The unbleached wheat flour ("KIALLA") cultivated was mixed. After fermentation starts
The fermentation vessel was loosely capped and left at room temperature for 7 days. Foaming or foaming was observed
After that, the fermented product is subjected to decantation to remove grape skins and stems, and then sealed and spread.
The mixture was transferred to a mouth bottle and allowed to stand in a refrigerator at 4 ° C for 1 to 2 days. Then 50% of the preparation
It is mixed with yeast, salt and flour and used to make bread and the rest of the preparation is wheat.
It was supplemented with flour and water and stored in a refrigerator at 4 ° C. until it was used for the next fermentation. one week before
Growth of the inoculum by fermentation of unbleached wheat flour, including the cultivation of
The inoculum was derived from flour as it was done weekly over the year
It is considered to also contain microorganisms. Mrs. Isleward, from the above manufacturing process,
Breads of fermented dough were produced with unchanged flavor, texture and aroma.
SDBS Properties-Relative Density of Microorganisms in Mixtures
Distinguishing between different species of Lactobacillus during SDBS inoculum culture on plates
Is impossible. The inventor has always found the best on MRS for all such isolated species
This growth medium was used for total Lactobacillus count.
It was Lactobacillus casei shows good growth on lactose LB medium.
However, other isolates do not grow or are very slow on this medium
It grew only slightly at the rate. The inventor decided to use this medium
Therefore, the proportion of Lactobacillus casei in the total count was evaluated.
The data in Table 2 shows that the total number of Lactobacillus was measured after 24 hours of incubation.
After that, the fermented product can increase from about 1 million per ml to a maximum of about 7 million.
And indicates. Even if the total number of bacteria was incubated for another 24 hours,
It is thought to be maintained.
From the size of the Lactobacillus casei population measured in these experiments,
The strain was found to be an important ingredient in this mixture. However, Lactoba
Distinguish between Shirasu parabukuneri and Lactobacillus parabukuneri / Brevis strains
It was not possible to find a suitable culture medium.
As described below, the growth of yeast populations depends on the effective utilization of oxygen and organic acids and energy.
It is greatly affected by the concentration of tanol. Yeast in the inoculum at the start of fermentation
When the concentration of the component is low (according to the experience of the present inventor,
Due to the growth and / or storage of the yeast), the yeast population did not increase and
A quantity of ethanol is produced. Considerable number (> 10)3/ Ml) yeast is present
In this case, the yeast population will produce ethanol within the first 24 hours of fermentation.
And is active. This is confirmed by the fact that the fermentation mixture is very frothy
. As fermentation progresses, yeast growth and activity is controlled by acid accumulation and oxygen consumption.
Limited When this happens, the bubbling in the mixture will stop and the mixture will stand still.
To do.
The number of yeasts varies greatly from experiment to experiment. Number of yeasts after experiment 2 in Table 2
When the fermentation is very low, the fermentation conditions are changed to be more aerobic.
The growth of the yeast was promoted. A stable increase in yeast count in the three experiments was
Before yeast activity is suppressed by increasing fermentate acidity and ethanol concentration
In addition, the progress of growth by setting the fermentation conditions to favorable initial aerobic conditions
To propose.
Table 3 shows the medium in which the SDBS isolate grows as a pure culture. In Table 3
, LLA media include lactic acid bacteria media with lactate. This medium is Twe
en 80 0.03%, fresh yeast extract 1.5%, tryptone 0.6%.
And 2.0% lactose, and the pH was adjusted to 5.45 with agar. SLA
The medium was LLA culture except that sucrose was added at the same concentration instead of lactose.
Ground
Is the same as. The MLS medium contains maltose at the same concentration instead of lactose.
It is the same as the LLA medium except that it is added.
RSYM medium contains 10% unpurified sugar, (NHFour)2HPOFour 0.05%, fresh y
St. extract contained 1.5% and agar 2%. The balance is water and the pH is 1N H
Adjusted to 6 with Cl. This medium was autoclaved before use. S
YM medium is similar to RSYM except that sucrose is used instead of unpurified sugar.
It MEA is normally obtained from Oxoid Australia.
It is a conventional malt extract medium. PDA obtained from Oxoid Australia
This is a conventional potato dextrose medium. RAA is Oxoid Austra
It is a conventional Rogosa agar medium obtained from the rear. Sugar-tight medium is 1% sugar-tight in water,
Medium containing 2%, 5%, 10% or 20%, autoclaved before use
It was treated with bubu. MRS medium was obtained from Oxoid Australia
Dissolve 52 g of MRS broth in 1000 ml of Milli-Q water, add 2 agar to it.
This is a medium prepared by adding 0 g. This medium is kept at 121 ° C for 15 minutes and autoclaved.
Processed in the oven. In the fermentation process shown in Table 4, Lactobacillus casei
The total number of yeasts is the mixture of 4 kinds after 48 hours of incubation.
Although it returned to almost the same level as in the case of, the total number of Lactobacillus recovered sufficiently.
There wasn't.
In standard fermentations, 50% of the mixture is inoculum culture. Shown in Table 5
Fermented by reducing the amount of inoculum culture components to 20%, 10% or 5%.
However, after 24 hours, standard amounts of ethanol, lactic acid and acetic acid were produced.
It was After 24 hours, the pH tended to be somewhat higher, but in all fermentations 2
The pH after 4 hours became a standard value.
Table 6 shows the pH brofil in a standard fermentation at 30 ° C.
All data are from 2 or 3 fermentations repeated for 3 samples
It is the average value when For the measurement of ethanol, acetic acid and lactic acid, Boehringer
Boehringer Mannheim test kit and HPLC
HPRA-Aminex HPX-87H column]
It was done.
In Table 6, the pH of the mixed solvent is about 3.8 immediately after the preparation, but after 48 hours.
It was about 3.4. The minimum pH was 3.2 with the flour substrate.
In the case of Table 7 showing a representative profile of ethanol production, mixing from inoculum
Fermentation started when the residual ethanol in the product was 2 g / L. Generation peak is 24:00
After a while, it was observed at about 7 g / L, but it decreased as the acid concentration increased.
The production of ethanol is directly related to the density of yeast in the mixture. Experiments 1 and 2
In that case, the number of yeasts at the start of fermentation was very low.
The fermentation in Table 8 started when the residual acetic acid from the inoculum was about 1 g / L and the acetic acid
Its concentration dropped significantly after 17 hours and slowly increased to its original value after 48 hours.
It is considered that it was metabolized because it was added.
The residual amount of lactic acid in the inoculum in Table 9 was relatively large (about 3.5 g / L),
The amount increased uniformly at 50 ° C., and after 48 hours, it was twice the amount at the start of the experiment.
After fermentation, a mucilage was produced as the final product.
In the standard protocols for performing fermentations shown in Tables 7-10, the standard
Add 200 ml of the quasi mixture (1 part inoculum culture: 1 part flour-water paste) to a pellet.
Prepared in a pyrex bottle (250 ml) and stored in the dark at 30 ° C for 48 hours.
Incubation (sample bottles were prepared in triplicate). Aluminum in the sample bottle
The lid was loosely covered with foil and aerobically fermented.
After 0 hours, 17 hours, 24 hours and 48 hours, the pH of each fermented product was digitally displayed.
Type stick pH meter [Hanna Instrument
s) ”]. The profile of ethanol and organic acid is UV below.
The measurement was performed according to the instruction manual using a measurement kit according to the method:
1. Ethanol: Ethanol test kit from Boehringer Mannheim (
(No.176290)
2. Acetic acid ... Acetic acid test kit from Boehringer Mannheim (No.148261)
3. Lactic acid: Lactic acid test kit manufactured by Boehringer Mannheim (No.1112821)
The concentrations of acetic acid and lactic acid are based on Waters / Applied Biosystems (Wate
rs / Applied Biosystems) HPLC [Biorad Aminex (Biorad
Aminex) HPX-87H column]
It was
With respect to the fermentation shown in Tables 4 and 5, the same operation as described above was performed. However
, In this case the concentration of the inoculum in the mixture is 5%, 10% of the total volume of the mixture,
20% or 50% (50% is the standard mixture).
In connection with the fermentations shown in Tables 2 and 4, each fermentation sample was diluted with sterile water.
Density measurement was performed on the series of diluted samples. To measure the viable cell count of a microplant
This was carried out using a 160,000-fold diluted sample. Number of yeast is 10
Evaluated by inoculating 0 μl onto DRBC plates (Oxoid
-Chlorumphenicol was added to DRBC medium obtained from Australia at 0.1 g / L.
The added plate was used). The total number of Lactobacillus is 50 μl of diluted sample
It was measured by inoculation on MRS medium. The number of Lactobacillus casei
, 50 μl of the diluted sample was measured by inoculating lactose LB medium.
The inoculated plates were incubated in the dark at 30 ° C for about 5 days.
Each inoculation experiment was performed three times. Data is the number of growth on 3 plates
The average number [cfu / fermented product 1 ml] of each microorganism calculated from
Tables 10 and 11 were performed according to a protocol similar to that of Table 1.
The results of the experiment are shown. Table 10 shows lesions on naturally infected anthracnose mango fruit.
Control of the present invention, the diameter of which was adjusted by the protocol corresponding to Table 1
The average value of the values measured over 17 days after the treatment with the agent is shown. Table 11
Increased the lesion density of naturally infected mango fruit for 17 days after treatment.
Indicates that
Table 12 shows that the expression of anthrax of mango and avocado after harvest uses SDBS.
It is suppressed by processing.
Brief description of the drawings
FIG. 1 shows naturally infected mangoes at room temperature as described in connection with Table 1.
Regarding the development of anthrax after incubation for days.
Figure 2 Adhesive-spreading on the development of anthrax in naturally infected common mango.
It is a graph which shows the effect of an agent.
FIG. 3 is a flow chart showing an example of a method for producing a biocontrol agent according to the present invention on a commercial scale.
It is a chart.
FIG. 4 is a graph of the data shown in Tables 11 and 12.
FIG. 5 is a graph of the data shown in Tables 6-9.
As is apparent from the above description, according to the present invention, the fermented dough inoculum formulation is characterized by:
In addition, it exerts an excellent biocontrol effect on fungal diseases of plants. This is the book
The biocontrol agent according to the invention can be applied to collectoculum gloeospoioides (gloeospo).
rioides) and mango infected with collectricum acutatum
And by applying to avocado.
According to another aspect of the present invention, a fruit or plant comprising the following steps (i) to (iv):
A method for producing a biocontrol agent used for biocontrol of a fungal disease of an object is provided.
RU:
(I) preparing a fermentation inoculum culture containing a yeast component and a bacterial component,
(Ii) adding the inoculum culture to a fermentation substrate to prepare a fermentation broth,
(Iii) Incubate the fermentation broth for 12 to 48 hours, then
so,
(Iv) The liquid from the fermentation broth is made into a biocontrol formulation and, if desired, a spreading agent.
Or contains an adhesive, dispersant, thickener, emulsifier or stabilizer, or this
A suitable carrier selected from these additives is added to the formulation.
Supplementary explanation of drawings
Fig. 1 ... Naturally infected mango after harvest was subjected to immersion treatment using SDBS
Effect of SDBS on the development of anthrax when incubated at room temperature for 7 days.
(A) Mild natural infection
(B) Severe natural infection
Figure 2 ... Three dips and sticks to the manifestation of carbon disease in naturally infected ordinary mango.
Agent-effect of a spreading agent.
Figure 3 ... Schematic representation of the fermentation process.
Figure 4 ... pH and organic acid profiles in standard fermentation at 30 ° C (3 fermentations
Average value when repeated, experiment 2N).
Figure 5: Anthracnose lesion after 17 days of treatment of naturally dry-stained mango fruit
Average diameter (average number of lesions on each of 15 fruits per treatment: 20).
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ
，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，
ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ
Ｋ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 アイルワード、ジェームズ・ハリソン
オーストラリア連邦4067クイーンズラン
ド、セント・ルシア、カーモディー・ロー
ド63番─────────────────────────────────────────────────── ───
Continued front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M
C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG
, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN,
TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY,
CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, G
B, GE, HU, JP, KG, KP, KR, KZ, LK
, LU, LV, MD, MG, MN, MW, NL, NO,
NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, S
K, UA, US, UZ, VN
(72) James Harrison, inventor Isleward
Australian Federation 4067 Queens Run
De, St. Lucia, Carmody Law
No. 63